CN107603961B - 双羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents

双羰基还原酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107603961B
CN107603961B CN201711040940.3A CN201711040940A CN107603961B CN 107603961 B CN107603961 B CN 107603961B CN 201711040940 A CN201711040940 A CN 201711040940A CN 107603961 B CN107603961 B CN 107603961B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
val
gly
leu
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711040940.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107603961A (zh
Inventor
洪浩
詹姆斯·盖吉
高峰
刘立辉
于文燕
刘芳
郭莉娜
张娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asychem Pharmaceuticals Tianjin Co ltd
Asymchem Laboratories Fuxin Co Ltd
Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Original Assignee
Asychem Pharmaceuticals Tianjin Co ltd
Asymchem Laboratories Fuxin Co Ltd
Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd
Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asychem Pharmaceuticals Tianjin Co ltd, Asymchem Laboratories Fuxin Co Ltd, Asymchem Laboratories Tianjin Co Ltd, Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd, Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd filed Critical Asychem Pharmaceuticals Tianjin Co ltd
Priority to CN201711040940.3A priority Critical patent/CN107603961B/zh
Publication of CN107603961A publication Critical patent/CN107603961A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107603961B publication Critical patent/CN107603961B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01184—Carbonyl reductase (NADPH) (1.1.1.184)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及双羰基还原酶突变体及其应用。具体而言，本发明利用定点饱和突变获得了催化活性等性质得到改进的双羰基还原酶突变体，并利用所述突变体制备3R，5S‑双羟基化合物，所获得的3R，5S‑二羟基化合物的ee值大于99％，de值为90％左右。本发明的双羰基还原酶突变体为关键的药物中间体，尤其是他汀类药物的手性二羟基己酸链的合成提供了高效的催化剂，使3R，5S‑二羟基化合物的工业生产成本得到大幅度降低。

Description

双羰基还原酶突变体及其应用
本申请是申请号为201410196920.5，申请日为2014年5月9日，发明名称为“双羰基还原酶突变体及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及双羰基还原酶突变体及其应用，具体而言，本发明涉及利用定点饱和突变获得的催化活性等性质得到改进的双羰基还原酶突变体即利用所述双羰基还原酶突变体制备3R，5S-双羟基化合物的应用。
背景技术
羰基还原酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，羰基还原酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。而双羰基还原酶能够立体选择性地将二酮酸酯的两个羰基同时还原为相应羟基，可以用于合成关键的药物中间体，尤其是合成他汀类药物的手性二羟基己酸链，如世界上畅销的降胆固醇药物阿托伐他汀(Atorvastatin，立普妥)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)。
目前已知的双羰基还原酶可以作为生物催化剂，一步还原二酮底物，制备得到近乎单一光学纯度的他汀类降血脂药物关键手性中间体3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如酶催化活性较低，使酶液的用量较大，且使反应体系总体积增加，导致了生产批次和生产成本的增加。这些问题可以通过酶分子进化，提高双羰基还原酶(DKR)的自身催化活性来解决。酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。
理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directedMutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。
定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。
因此，如果能够利用定点饱和突变技术改造双羰基还原酶，提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性，就可以解决现有技术中如酶液用量较大、生产成本高等问题。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于利用定点饱和突变技术改造双羰基还原酶，提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性。
本发明的第一方面涉及一种双羰基还原酶突变体，其含有选自如下所示的氨基酸序列之一：
a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；
b)与a)中所示序列具有至少70％同一性且具有改进的双羰基还原酶活性的序列；或
c)a)中的序列经删除、添加和/或替换一个或多个氨基酸残基而得到且具有改进的双羰基还原酶活性的序列，
其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO：7所示的序列。
在一个实施方案中，所述的双羰基还原酶突变体含有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述的双羰基还原酶突变体含有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述的双羰基还原酶突变体含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面涉及如上所述的双羰基还原酶突变体的核苷酸编码序列，其中该核苷酸编码序列不含有SEQ ID NO：8所示的序列。
在一个实施方案中，所述核苷酸编码序列含有如下所示的序列：
a)SEQ ID NO：9-14所示的序列；
b)与a)所述的序列具有至少70％同一性且编码具有改进的双羰基还原酶活性的蛋白质的序列；或
c)与a)所述的序列在高严谨条件杂交且编码具有改进的双羰基还原酶活性的蛋白质的序列。
本发明的第三方面涉及一种含有如上所述的核苷酸编码序列的表达盒。
本发明的第四方面涉及一种含有有效连接其中的如上所述的核苷酸编码序列的重组载体，优选地，所述重组载体是重组表达载体。
本发明的第五方面涉及一种含有如上所述的重组载体的宿主细胞。
本发明的第六方面涉及一种生产3R,5S-二羟基化合物的方法，其包括步骤：将如上所述的双羰基还原酶突变体或如上所述的核苷酸编码序列编码的蛋白质或利用如上所述的表达盒或如上所述的重组载体或如上所述的宿主细胞获得的蛋白质与二酮类化合物在使所述双羰基还原酶发挥作用的条件下接触一段时间，
其中二酮类化合物为已经在市场上商业化的原料或者容易制备的通式I的酮类化合物：
Figure BDA0001451460340000031
其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
在一个实施方案中，所述二酮类化合物选自6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸甲酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸乙酯。
换言之，本发明以红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)基因(如SEQ ID NO：7所示)为出发基因，进行基因突变，通过定向筛选的方法获得酶活性提高的双羰基还原酶突变体。
本发明的来源于红串红球菌SK121菌株的双羰基还原酶的突变体的氨基酸序列含有如下序列：
(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：突变位点为F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(3)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+V151Q+F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(4)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列：突变位点为V239I+R257K：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDIVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(5)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列：突变位点为V151Q+R257K：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；或
(6)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+V151Q：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
上述双羰基还原酶突变体的编码DNA序列包含以下DNA序列：
(1)SEQ ID NO：9，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG；
(2)SEQ ID NO：10，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG；
(3)SEQ ID NO：11，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG；
(4)SEQ ID NO：12，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第715-717bp的GTC突变为ATT、ATC或ATA，且第769-771bp的CGC突变为AAA或AAG；
(5)SEQ ID NO：13，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG，且第769-771bp的CGC突变为AAA或AAG；或
(6)SEQ ID NO：14，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG。
利用本发明上述突变体制备3R，5S-双羟基化合物，所获得的3R，5S-二羟基化合物的ee值大于99％，de值为90％左右。本发明的双羰基还原酶突变体为关键的药物中间体，尤其是他汀类药物的手性二羟基己酸链的合成提供了高效的催化剂，使3R，5S-二羟基化合物的工业生产成本得到大幅度降低。
附图说明
图1为本发明所涉及合成3R，5S-双羟基化合物的化学反应过程。
图2为本发明所涉及合成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯的化学反应方程式。
图3为本发明所涉及合成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯的化学反应方程式。
图4为结合NAD的双羰基还原酶的三维结构模拟图。
图5为标出有效突变位点的双羰基还原酶的三维结构模拟图。
具体实施方式
本申请采用定点饱和突变的方法对双羰基还原酶(DKR)的基因进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到酶活性大幅度提高的双羰基还原酶突变体，酶活提高为双羰基还原酶母本的2倍以上，甚至是3倍，从而大幅度降低了3R,5S-二羟基化合物工业生产中的成本。在某些实施方案中，得到的产品的ee值大于99％，de值为90％左右。
根据本发明的一个实施方案，本发明的突变体在3R，5S-双羟基化合物转化反应中，其双羰基还原酶突变体的用量仅为出发基因编码的双羰基还原酶用量的34％，适用于工业应用。
在一个实施方案中，本发明使用定点饱和突变技术，以来源于红串红球菌SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)基因为出发基因，进行基因突变，通过定向筛选的方法获得酶活性提高的双羰基还原酶突变体。本发明的双羰基还原酶突变体的突变氨基酸残基位于底物结合位点或与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的的区域，例如I94位于NAD结合区域，V151、F231、V239和R257四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变可能提高了底物结合的特异性，从而使酶的活性得到提高。本发明的实验结果表明，单一的F231W突变即可显著的提高双羰基还原酶的活性。在F231W突变的基础上，进一步引入I94V和/或V151Q突变可以进一步提高双羰基还原酶的活性。R257K的突变与V239I或V151Q的突变组合也可以显著提高双羰基还原酶的活性。
上述得到的双羰基还原酶突变体可以通过基因工程手段，将其基因连接到pET-22b(+)以及其它表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，在30℃，pH6.0条件下，可以一步还原3R，5S-双羟基化合物的制备原料得到光学纯度较高的3R，5S-双羟基化合物。
本发明所述的3R，5S-双羟基化合物的制备原料，可以为已经在市场上商业化的原料或者容易制备的酮类化合物
Figure BDA0001451460340000071
其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。所述的双羟基产物由以下化学通式表达：
Figure BDA0001451460340000072
其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
定义
本文使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有改进的双羰基还原酶活性的活性。本领域技术人员公知如何测定双羰基还原酶的活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。在某些实施方案中，所述双羰基还原酶变体的序列为与SEQ ID No：7或8所示的序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性并具有或编码具有改进的双羰基还原酶活性的氨基酸序列。例如，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基可以进行保守氨基酸的替换，如一个或几个氨基酸残基，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基。氨基酸的保守氨基酸是本领域公知的。
本文使用的术语“改进的双羰基还原酶活性”是指利用定点饱和突变技术获得的双羰基还原酶的生物活性与起始的双羰基还原酶相比有改进，例如催化活性增加、底物谱变广、热稳定增加、pH稳定性增加或表达量增加，例如与起始的双羰基还原酶相比增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％、500％或更多。
本文使用的术语“高严谨条件”可定义为：(1)洗涤使用低离子强度和高温度，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中使用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5X SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.,1％焦磷酸钠，5X Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50g/ml),0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，42℃在O.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，55℃，然后55℃在含有EDTA的0.1XSSC中进行高严谨性洗涤。
本文使用的术语“表达盒”意指线性或环状的核酸分子。涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标多核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
本文使用的术语“有效连接”是指这样的连接方式，其中编码核苷酸置于载体的适当位置，使得所述编码核苷酸正确地、顺利地复制、转录或表达。
本文使用的术语“载体”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达载体，可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选原核表达载体，在某些实施方案中，所述重组载体选自pET-22b(+)，pET-3a(+)，pET-3d(+)，pET-11a(+)，pET-12a(+)，pET-14b(+)，pET-15b(+)，pET-16b(+)，pET-17b(+)，pET-19b(+)，pET-20b(+)，pET-21a(+)，pET-23a(+)，pET-23b(+)，pET-24a(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28a(+)，pET-29a(+)，pET-30a(+)，pET-31b(+)，pET-32a(+)，pET-35b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a(+)，pET-41b(+)，pET-42a(+)，pET-43a(+)，pET-43b(+)，pET-44a(+)，pET-49b(+)，pQE2，pQE9，pQE30，pQE31，pQE32，pQE40，pQE70，pQE80，pRSET-A，pRSET-B，pRSET-C，pGEX-5X-1，pGEX-6p-1，pGEX-6p-2，pBV220，pBV221，pBV222，pTrc99A，pTwin1，pEZZ18，pKK232-18，pUC-18或pUC-19。在某些实施方案中，所述载体是pET-22b(+)。
本文使用的术语“宿主细胞”包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公开可得的。
本文使用的术语“使所述双羰基还原酶发挥作用的条件”是指能使所述双羰基还原酶催化其底物转变为相应产物的条件。在某些实施方案中，所述“使所述双羰基还原酶发挥作用的条件”包括双羰基还原酶、双羰基还原酶的底物、辅酶和合适的缓冲体系。
本文使用的术语“接触一段时间”是指所述双羰基还原酶变体与其反应底物在使所述双羰基还原酶发挥作用的条件下反应足够的时间，以使所述底物至少部分地转变为相应的产物。
本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述多核苷酸时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述多核苷酸两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述多核苷酸的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双特异四价抗体将不能真实地覆盖这些情形。
本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述核苷酸序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例
实施例1：来源于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)(SEQ ID NO：7)的定点饱和突变
将双羰基还原酶(DKR)的氨基酸序列在Swiss-model网站模拟蛋白质的三维结构，然后通过Docking进行底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸(图4)。
根据突变氨基酸及其两侧的碱基序列(突变氨基酸请见表1.中的突变位点)，用Primmer5.0设计相应的突变引物(表1)。以含双羰基还原酶基因的pET22b(+)表达载体(购买于Novagen，产品编号69744)为模版，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DPnⅠ消化除去母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。
表1.点饱和突变引物序列
Figure BDA0001451460340000111
Figure BDA0001451460340000121
实施例2：双羰基还原酶突变体的初筛
根据实施例1所述内容，挑取上述培养皿上的单菌落接种到96深孔板中，每孔预先加入0.5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下进行诱导表达16h，6000g离心10min收集菌体，菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用酶标仪进行活性初筛。向96孔板中加入30μL DMSO，1.5μL主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯(30mg/mL溶于DMSO)，2.5μL NADH(20mg/mL)，216μL磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，于340nm进行本底检测，然后分别向各孔中加入已经制备好的突变体酶液50μL，并立即于30℃检测340nm处吸光光度值的变化。
酶活计算公式：酶活(u/mL)＝(ΔA×60×V1)/(6.22×t×V2)
ΔA:反应过程中的吸光光度值变化；
V1：反应体系的总体积；
6.22：消光系数；
t：ΔA的检测时间；
V1：加入的酶液体积。
实施例3：双羰基还原酶突变体的复筛
将实施例2中酶活高于母本的突变体接种于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用于活性检测。向10ml反应瓶中加入0.05g主原料
Figure BDA0001451460340000131
(6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯)，0.5ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入4.0ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，主原料均匀分散于缓冲液中；加入1.5mg NAD+，20.6mg甲酸铵，10mg辅酶甲酸脱氢酶和0.5ml双羰基还原酶，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温16h后，薄层色谱(TLC)跟踪，选取转化产品点明显、主原料点不明显的体系进行乙酸乙酯萃取，静置分液，取有机相进行HPLC分析。
选取催化活性优于母本的突变体进行测序，分析突变位点，并进行放大培养，复测催化活性确定突变体F231W(SEQ ID NO：1)、I94V+F231W(SEQ ID NO：2)、I94V+V151Q+F231W(SEQ ID NO：3)、V239I+R257K(SEQ ID NO：4)、V151Q+R257K(SEQ ID NO：5)和I94V+V151Q(SEQ ID NO：6)的催化活性比母本显著提高，复筛结果如表2所示。采用软件对双羰基还原酶的三维结构进行计算机模拟分析，其中I94位于NAD结合区域，V151、F231、V239和R257四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变可能提高了底物结合的特异性，从而使酶的活性得到提高(图5)。
表2.双羰基还原酶母本与突变体制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯活性比较
SEQ ID NO 位点 酶量<sup>a</sup> 转化 DE％ EE％
1 F231W 3wt 82.70 87.66 100.00
2 I94V+F231W 2wt 72.91 89.89 100.00
3 I94V+V151Q+F231W 2wt 78.31 89.44 100.00
4 V239I+R257K 2wt 68.26 85.24 100.00
5 V151Q+R257K 2wt 62.27 88.69 100.00
6 I94V+V151Q 3wt 68.46 88.14 100.00
7 母本 6wt 62.26 87.45 100.00
注：a指转化1g底物所需各双羰基还原酶突变体重组细胞的湿重；1wt指转化1g主原料需要1g双羰基还原酶突变体重组湿细胞。
实施例4：双羰基还原酶突变体的克隆与表达
为了便于双羰基还原酶突变体的表达以及鉴定，在其基因的5’和3’末端设计了兼容的限制性酶切位点。可以采用NdeⅠ和XhoⅠ分别将目的基因和pET-22b(+)(其他可在大肠杆菌中表达蛋白质的表达质粒也可使用)分别同时进行酶切，酶切后的目的基因和质粒的较大片段用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。
挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体命名为pET22b(+)-R-M并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。挑取上述培养平板上长出的单菌落并接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用菌落PCR进行鉴定，将含有正确的表达载体的大肠杆菌进行后续的诱导表达。将上述菌液转接于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2～1.0mM，在18～25℃下进行诱导表达10～16h后，取出菌液，6000g离心10min收集菌体，于-20℃冻存备用。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液和沉淀，上清液用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测。表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD。
实施例5：双羰基还原酶突变体I94V+F231W在3R，5S-双羟基化合物制备中的应用
选用符合通式I的二酮化合物
Figure BDA0001451460340000141
(通式I)为初始原料，其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。所述的双羟基产物由以下化学通式II表达：
Figure BDA0001451460340000151
(通式II)，其中R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
(1)双羰基还原酶突变体I94V+F231W在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯制备中的应用
向250ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯：
Figure BDA0001451460340000152
20ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和2wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W的粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，产品3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯：体系中
Figure BDA0001451460340000153
(6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯)的比例为86～91％，收率80～86％，ee值大于99.5％，de值88～95％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：δ7.29(m，5H)，4.54(s，2H)，4.22(m，1H)，4.07(m，1H)，3.45～3.40(m，4H)，2.41(d，2H)，1.65(t，2H)，1.43(S，9H)。
鉴于其他5个双羰基还原酶突变体对主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯的催化活性和反应方法类似，故在此不进行重复叙述。
(2)双羰基还原酶突变体I94V+F231W在3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯制备中的应用
向500ml反应瓶中加入5g主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯：
Figure BDA0001451460340000154
10ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入160ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，将主原料均匀分散于缓冲液中；加入0.15g NAD+，20.6g甲酸铵，0.25g辅酶甲酸脱氢酶和9wt双羰基还原酶突变体I94V+F231W粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h；用200ml乙酸乙酯停止反应，用125g硅藻土过滤，200ml乙酸乙酯萃取两次，静置分液，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品，3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯：体系中
Figure BDA0001451460340000161
(3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸新戊酯)的比例为80～90％，收率75～85％，ee值大于99.3％，de值90～96％。
所得产品的核磁数据如下：400Hz，CDCl3：7.26～7.35ppm(m，5H)，4.56ppm(s，2H)，4.24ppm(m，1H)，4.08ppm(m，1H)，3.79ppm(s，1H)，3.45ppm(d，2H),3.30ppm(d，1H)，2.44ppm(d，2H),1.79ppm(q，2H)，1.60～1.65ppm(dd，2H)，1.43ppm(s，6H)，0.88ppm(t，3H)。
鉴于其他5个双羰基还原酶突变体对主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯的催化活性和反应方法类似，故在此不进行重复叙述。
序列表
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
天津凯莱英制药有限公司
凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司
吉林凯莱英医药化学有限公司
<120> 双羰基还原酶突变体及其应用
<130> LZ135300CN01
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 1
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ile Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Trp Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Arg Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 2
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Trp Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Arg Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 3
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 3
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Gln Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Trp Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Arg Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 4
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 4
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ile Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Phe Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Ile Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Lys Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 5
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 5
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ile Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Gln Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Phe Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Lys Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 6
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体
<400> 6
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Gln Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Phe Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Arg Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 7
<211> 286
<212> PRT
<213> 红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)
<400> 7
Met Thr Glu Leu Lys Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Tyr Gln Thr Ala Cys His Gly Phe Asp Val Val Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Ala Arg Phe Asp
35 40 45
Ser Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Glu Asn Val Glu Gly Ala Lys Glu
50 55 60
Gly Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gln Arg Ile Thr Tyr Ser Tyr Asp Leu
65 70 75 80
Gly Glu Ala Val Ala Lys Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Ile Pro Glu
85 90 95
Asp Ile Ala Ile Lys Arg Asp Thr Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Val Ala
100 105 110
Pro Glu His Thr Val Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser
115 120 125
Asp Leu Lys Glu Phe Thr Gly Arg Pro Glu Lys Phe Leu Ala Leu His
130 135 140
Phe Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr
145 150 155 160
Glu Ser Thr Asp Pro Ala Val Tyr Arg Glu Val Val Glu Phe Ala Lys
165 170 175
Asn Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr
180 185 190
Val Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asn Ala Ala Ser Asp Leu
195 200 205
Leu Ile Asp Gly Ile Ala Asp Pro Asp Met Val Asp Lys Thr Trp Arg
210 215 220
Ile Gly Thr Gly Ala Pro Phe Gly Pro Phe Gln Ile Met Asp Val Val
225 230 235 240
Gly Leu Thr Thr Val Tyr Asn Ile Ser Ser Gln Gly Gly Glu Lys Gln
245 250 255
Arg Glu Phe Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Tyr Ile Asp Glu Gly Lys
260 265 270
Leu Gly Val Ala Val Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Tyr Lys Gly
275 280 285
<210> 8
<211> 861
<212> DNA
<213> 红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)
<400> 8
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcaa ttcccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg gtcaacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg ttcggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagcg cgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 9
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<400> 9
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcaa ttcccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg gtcaacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg tggggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagcg cgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 10
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (282)..(282)
<223> n=a、c、g或t
<400> 10
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcag tncccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg gtcaacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg tggggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagcg cgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 11
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (282)..(282)
<223> n=a、c、g、或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (253)..(253)
<223> r=g或a
<400> 11
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcag tncccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg caraacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg tggggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagcg cgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 12
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (717)..(717)
<223> h=a或c或t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (771)..(771)
<223> r=g或a
<400> 12
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcaa ttcccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg gtcaacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg ttcggcccct tccagatcat ggacathgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagaa rgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 13
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (453)..(453)
<223> r=g或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (771)..(771)
<223> r=g或a
<400> 13
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcaa ttcccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg caraacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg ttcggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagaa rgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 14
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 双羰基还原酶突变体编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (282)..(282)
<223> n=a、c、g、或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (453)..(453)
<223> r=g或a
<400> 14
atgactgaac tgaagcagat caccgttctg ggtaccggag ttctcggctc acagatcgcc 60
tatcagaccg cctgtcacgg tttcgacgtc gtcgcgtacg acatcaacgc cgaggtcatc 120
gaaaaggcca aggctcggtt cgactcgttg gccgcggcct acaaggccga gaacgtcgag 180
ggtgccaagg aaggcaaggc tgacgaagcg ctgcaacgta ttacgtactc gtacgatcta 240
ggcgaagccg tcgccaaggc cgacctggtc atcgaggcag tncccgagga catcgccatc 300
aagcgcgaca cctacgagaa gcttgccacg gttgctcctg agcacacggt gttcgctacc 360
aactcctcga cgctgctgcc gagcgatctc aaggagttca ccggccgtcc cgagaagttc 420
ctcgcactgc acttcgcaaa tcacgtgtgg caraacaaca ctgccgaggt catgggcacc 480
gagtccaccg accccgccgt gtaccgcgag gtcgtcgagt tcgcgaagaa catcggcatg 540
gtgccgatcg aactcaagaa ggagaaggcg ggctacgtac tcaactcgct cctggtcccg 600
ctcctcaacg cggcctccga cctgctgatc gacggcatcg ccgatcccga catggtcgac 660
aagacgtggc gtatcggcac cggagccccg ttcggcccct tccagatcat ggacgtcgtc 720
gggttgacca ccgtctacaa catctcctcc cagggcggcg agaagcagcg cgaattcgcc 780
gactacatca agaagaacta catcgacgag ggcaagctcg gcgttgctgt cggcgacggc 840
ttctacaact acaagggctg a 861
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物I94-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t， g或c
<400> 15
ggtcatcgag gcannncccg aggacatcg 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物I94-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 16
cgatgtcctc gggnnntgcc tcgatgacc 29
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物E96-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n=a、t、g或c
<400> 17
gtcatcgagg caattcccnn ngacatcgcc atcaagcg 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物E96-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(20)
<223> n=a、t、g或c
<400> 18
cgcttgatgg cgatgtcnnn gggaattgcc tcgatgac 38
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物R102-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n=a、t、g或c
<400> 19
gaggacatcg ccatcaagnn ngacacctac gagaagcttg 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物R102-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n=a、t、g或c
<400> 20
caagcttctc gtaggtgtcn nncttgatgg cgatgtcctc 40
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物T124-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 21
ctaccaactc ctcgnnnctg ctgccgagcg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物T124-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 22
cgctcggcag cagnnncgag gagttggtag 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物S123-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 23
cgctaccaac tccnnnacgc tgctgccgag 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物S123-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 24
ctcggcagca gcgtnnngga gttggtagcg 30
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物H148-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n=a、t、g或c
<400> 25
cacttcgcaa atnnngtgtg ggtcaac 27
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物H148-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n=a、t、g或c
<400> 26
gttgacccac acnnnatttg cgaagtgg 28
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V151-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 27
caaatcacgt gtggnnnaac aacactgcc 29
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V151-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n=a、t、g或c
<400> 28
ggcagtgttg ttnnnccaca cgtgatttg 29
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物E156-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 29
caacaacact gccnnngtca tgggcaccg 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物E156-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 30
cggtgcccat gacnnnggca gtgttgttg 29
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物K189-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n=a、t、g或c
<400> 31
gaactcaaga aggagnnngc gggctacgta ctc 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物K189-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n=a、t、g或c
<400> 32
gagtacgtag cccgcnnnct ccttcttgag ttc 33
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物G191-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n=a、t、g或c
<400> 33
gaactcaaga aggagaaggc gnnntacgta ctcaactcgc 40
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物G191-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> n=a、t、g或c
<400> 34
gcgagttgag tacgtannnc gccttctcct tcttgagttc 40
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物L194-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> n=a、t、g或c
<400> 35
cgggctacgt annnaactcg ctcctgg 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物L194-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 36
ccaggagcga gttnnntacg tagcccg 27
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物W223-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 37
ggtcgacaag acgnnncgta tcggcaccgg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物W223-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 38
ccggtgccga tacgnnncgt cttgtcgacc 30
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物F231-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n=a、t、g或c
<400> 39
tatcggcacc ggagccccgn nnggcccctt ccagatcatg 40
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物F231-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n=a、t、g或c
<400> 40
catgatctgg aaggggccnn ncggggctcc ggtgccgata 40
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物M237-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 41
gccccttcca gatcnnngac gtcgtcgggt tg 32
<210> 42
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物M237-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n=a、t、g或c
<400> 42
caacccgacg acgtcnnnga tctggaaggg gc 32
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V239-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> n=a、t、g或c
<400> 43
cttccagatc atggacnnng tcgggttgac cac 33
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V239-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n=a、t、g或c
<400> 44
gtggtcaacc cgacnnngtc catgatctgg aag 33
<210> 45
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V240-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 45
gatcatggac gtcnnngggt tgaccac 27
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物V240-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> n=a、t、g或c
<400> 46
gtggtcaacc cnnngacgtc catgatc 27
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物N247-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 47
gaccaccgtc tacnnnatct cctcccagg 29
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物N247-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 48
cctgggagga gatnnngtag acggtggtc 29
<210> 49
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物Q251-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 49
caacatctcc tccnnnggcg gcgagaagc 29
<210> 50
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物Q251-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n=a、t、g或c
<400> 50
gcttctcgcc gccnnnggag gagatgttg 29
<210> 51
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物R257-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n=a、t、g或c
<400> 51
cccagggcgg cgagaagcag nnngaattcg ccgactacat caag 44
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物R257-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n=a、t、g或c
<400> 52
cttgatgtag tcggcgaatt cnnnctgctt ctcgccgccc tggg 44
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物L273-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> n=a、t、g或c
<400> 53
catcgacgag ggcaagnnng gcgttgctgt c 31
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物L273-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n=a、t、g或c
<400> 54
gacagcaacg ccnnncttgc cctcgtcgat g 31
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物A276-Forward
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(22)
<223> n=a、t、g或c
<400> 55
cgagggcaag ctcggcgttn nngtcggcga cggcttctac 40
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifical Sequence)
<220>
<223> 引物A276-Reverse
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n=a、t、g或c
<400> 56
gtagaagccg tcgccgacnn naacgccgag cttgccctcg 40

Claims (9)

1.一种双羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4-6任一项所示。
2.根据权利要求1所述的双羰基还原酶突变体的核苷酸编码序列，其中该核苷酸编码序列不是SEQ ID NO：8所示的序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸编码序列，其中所述核苷酸编码序列如SEQ ID NO：12-14任一项所示。
4.一种含有权利要求2或3所述的核苷酸编码序列的表达盒。
5.一种含有有效连接其中的权利要求2或3所述的核苷酸编码序列的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其中所述重组载体是重组表达载体。
7.一种含有权利要求5或6所述重组载体的宿主细胞。
8.一种生产3R,5S-二羟基化合物的方法，其包括步骤：将权利要求1所述的双羰基还原酶突变体或权利要求2或3所述的核苷酸编码序列编码的蛋白质或利用权利要求4的表达盒或权利要求5或6的重组载体或权利要求7的宿主细胞获得的蛋白质与二酮类化合物在使所述双羰基还原酶发挥作用的条件下接触一段时间，
其中二酮类化合物为已经在市场上商业化的通式I或者容易制备的通式I：
Figure FDA0002394932710000011
其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
9.根据权利要求8所述的生产3R,5S-二羟基化合物的方法，其中所述二酮类化合物选自6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸新戊酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸甲酯、6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸乙酯。
CN201711040940.3A 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用 Active CN107603961B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711040940.3A CN107603961B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711040940.3A CN107603961B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用
CN201410196920.5A CN103966176B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410196920.5A Division CN103966176B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107603961A CN107603961A (zh) 2018-01-19
CN107603961B true CN107603961B (zh) 2020-04-24

Family

ID=51236183

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711040940.3A Active CN107603961B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用
CN201410196920.5A Active CN103966176B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410196920.5A Active CN103966176B (zh) 2014-05-09 2014-05-09 双羰基还原酶突变体及其应用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10131883B2 (zh)
EP (1) EP3141601B1 (zh)
JP (1) JP6473175B2 (zh)
KR (1) KR102176054B1 (zh)
CN (2) CN107603961B (zh)
ES (1) ES2733948T3 (zh)
WO (1) WO2015168999A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107603961B (zh) 2014-05-09 2020-04-24 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶突变体及其应用
WO2016095223A1 (zh) * 2014-12-19 2016-06-23 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶突变体及其应用
CN104560907B (zh) * 2014-12-19 2017-12-22 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶突变体及其应用
CN108048416B (zh) * 2017-12-25 2021-05-18 吉林凯莱英医药化学有限公司 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用
CN110387359B (zh) * 2018-04-17 2021-04-20 湖州颐盛生物科技有限公司 羰基还原酶突变体及其应用
CN114729374A (zh) * 2019-11-22 2022-07-08 株式会社Api 羰基还原酶、编码该酶的核酸、以及利用它们的光学活性化合物的制造方法
CN113801859B (zh) * 2021-09-29 2023-08-01 山东睿鹰制药集团有限公司 一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277338A (zh) * 2011-08-02 2011-12-14 中国药科大学 双羰基还原酶突变体及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101429514B (zh) 2007-11-08 2011-06-15 陈依军 一种双羰基还原酶、其基因及其应用
CN101880694B (zh) 2009-12-01 2014-06-11 陈依军 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法
CN102517241B (zh) * 2011-12-19 2013-06-19 中国药科大学 一种含有d型氨基酸的双羰基还原酶的突变体的制备方法
CN103937761B (zh) 2014-05-06 2017-03-22 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶、其编码基因及应用
CN103937759B (zh) 2014-05-06 2017-03-22 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶、其编码基因及应用
CN107603961B (zh) 2014-05-09 2020-04-24 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 双羰基还原酶突变体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277338A (zh) * 2011-08-02 2011-12-14 中国药科大学 双羰基还原酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dimerization Interface of 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase Tunes the Formation of Its Catalytic Intermediate;Xu Y等;《PLOS ONE》;20140424;第9卷(第4期);第e95965页 *
Expression and purification of His-tagged rat mitochondrial;Liu XJ等;《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》;20040722;第37卷(第2期);第344-351页 *
Identification of important residues in diketoreductase from Acinetobacter baylyi by molecular modeling and site-directed mutagenesis;Huang Y等;《BIOCHIMIE》;20110830;第94卷(第2期);第471-478页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10131883B2 (en) 2018-11-20
US20170152488A1 (en) 2017-06-01
CN103966176A (zh) 2014-08-06
WO2015168999A1 (zh) 2015-11-12
JP6473175B2 (ja) 2019-02-20
ES2733948T3 (es) 2019-12-03
EP3141601A1 (en) 2017-03-15
KR102176054B1 (ko) 2020-11-09
JP2017518744A (ja) 2017-07-13
EP3141601A4 (en) 2017-09-20
CN103966176B (zh) 2017-12-22
KR20170002619A (ko) 2017-01-06
WO2015168999A8 (zh) 2018-12-06
EP3141601B1 (en) 2019-06-12
CN107603961A (zh) 2018-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107603961B (zh) 双羰基还原酶突变体及其应用
CN108048417B (zh) 酮还原酶突变体及其应用
CN108424900B (zh) 一种腈水解酶突变体及其构建方法和应用
CN108795916B (zh) 一种赖氨酸脱羧酶突变体、其编码基因及其表达和应用
CN108048416B (zh) 改进的酮还原酶突变体及其制备方法和应用
CN107454915B (zh) L-岩藻糖的生物催化生产方法
You et al. Characterization of a prodigiosin synthetase PigC from Serratia marcescens jx-1 and its application in prodigiosin analogue synthesis
US11162081B2 (en) Ketoreductase mutant and application thereof
Cheng et al. Recombinant expression and molecular insights into the catalytic mechanism of an NADPH-dependent conjugated polyketone reductase for the asymmetric synthesis of (R)-pantolactone
CN109072215B (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
WO2016095223A1 (zh) 双羰基还原酶突变体及其应用
CN111100851B (zh) 醇脱氢酶突变体及其在手性双芳基醇化合物合成中的应用
CN115747183A (zh) 一种酮还原酶突变体及其应用
CN113249349B (zh) 突变型醇脱氢酶、重组载体及其制备方法和应用
JP5332277B2 (ja) Ｎａｄｈの製造方法及びギ酸脱水素酵素の製造方法
CN110713990B (zh) 一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用
CN110951711B (zh) 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用
CN111004794A (zh) 一种热稳定性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用
CN110846289A (zh) 一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用
KR101564315B1 (ko) 신규 포름산 탈수소효소 및 이를 이용한 포름산의 생산방법
CN104928265B (zh) 一种酮还原酶突变体及其制备和应用
CN114807066A (zh) 一种酮还原酶突变体
CN114807246A (zh) 一种生产手性醇的方法
CN112646791A (zh) 一种突变体及其构建方法和应用
CN117511907A (zh) 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant