CN105441401B

CN105441401B - 一种单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用

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Publication number: CN105441401B
Application number: CN201410441595.4A
Authority: CN
Inventors: 罗煜; 丁时澄; 瞿旭东; 钱龙
Original assignee: Shanghai Yi Ke Lai Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2034-09-01
Also published as: CN105441401A

Abstract

本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺氧化酶，以及使用该酶进行酶催化合成(1S,2S,5R)‑6,6‑二甲基‑2‑取代‑3‑氮杂双环[3.1.0]己烷或(1S,3aR,6aS)‑1‑取代‑八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成(1S,2S,5R)‑6,6‑二甲基‑3‑氮杂双环[3.1.0]己烷‑2‑腈及其水解产物(1S,2S,5R)‑6,6‑二甲基‑3‑氮杂双环[3.1.0]己烷‑2‑甲酸甲酯，或进一步合成(1S,3aR,6aS)‑八氢环戊[c]吡咯‑1‑腈的酶‑化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法。本发明的单胺氧化酶可以分别接受3并5和5并5等两种大小不同的氮杂环戊胺体系，生成相应亚胺；亚胺产物可接受氰化物的加成，因此可以在酶催化体系中加入氰化物，加成产物直接在盐酸‑醇溶液中醇解得到氨基酸甲酯的盐酸盐，从而实现一锅法投料，简化了反应工艺，更加适合工业化生产的进行。

Description

一种单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种单胺氧化酶，含有该酶编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该单胺氧化酶作为催化剂在合成博西普韦中间体中的应用。

背景技术

博昔普韦(boceprevir)及特拉匹韦(telaprevir)是丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂，其化学结构式如下所示：

Ⅲ期SPRINT-2研究显示，与标准治疗相比，24周的博昔普韦标准治疗可提高HCV基因1型初治患者的SVR率。博昔普韦标准治疗24周与博昔普韦标准治疗44周的抗病毒疗效相似。

片段A是合成博昔普韦的关键中间体之一，片段A的结构如下：

目前关于片段A主要有如下合成路线：

路线1：WO2007075790公开了利用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮将内酯内酰胺化、羰基还原、还原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的盐，具体反应路线如下所示：

由于此路线中的氰基加成利用了硝酸银、氰化钾和盐酸，成本较高，对于后处理和三废处理也带来了很大困难，不利于工业化生产。

路线2：文献(Journal of Medicinal Chemistry,2006,Vol.49,No.20,6074-6086)中公开了一种以3-苯基四氢吡咯[1,2-c]恶唑-5(1H)-酮为原料，经过去氢、环丙烷化、开环、还原、氧化等一系列反应得到关键片段A，具体反应路线如下所示：

由于此路线中的还原反应采用了氢化锂铝和钯碳，反应条件苛刻，后处理较为繁琐，也不利于工业化生产。

路线3：WO2004113295公开了使用6,6-二甲基-3-氧杂双环[3.1.0]己烷-2,4-二酮为原料，经过醇解、酰胺化、还原酰胺基和酯基、将氨基保护后氧化醇成醛、成环、氰基化、水解、去保护得到片段A的盐酸盐，具体反应路线如下：

虽然此路线具有起始原料价廉易得优点，但该路线在制备(1R,3S)-3-氨甲基-2,2-二甲基环丙烷基甲醇时需采取二级还原反应，即，首先利用选自铝烷、在三甲基硅烷基氯存在下的硼氢化锂或硼氢化钠还原酯基，再使用氢化铝锂或三乙酰氧基硼氢化钠还原酰胺基，上述还原反应条件剧烈，温度要求苛刻，反应时间较长，后处理繁琐，安全性低，以致影响了该路线的工业化应用。

路线4：文献(J.Am.Chem.Soc.2012,134,6467-6472)公开了利用来自黑曲霉(Aspergillus niger)的单胺氧化酶的消除-加成反应制备(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂-双环[3.1.0]己烷-2-腈的方法，如下所示：

该方法通过单胺氧化酶将前手性的胺氧化为手性亚胺，在NaHSO₃存在的条件下生成加成产物；后者与NaCN反应得到手性的亚胺加成产物(如上图)，后者甲醇解得到氨基酸甲酯盐酸盐。该法立体选择性地构建了3个手性中心，比化学方法简便、易于操作、对环境友好；但是亚胺产物易挥发且闪点较低，需要额外加入NaHSO₃，步骤较为繁琐。

片段B是合成特拉匹韦的关键中间体之一，片段B的结构如下：

目前关于片段B的合成路线主要有如下路线：

路线1：EP0600741公开了如下路线：

由于由该路线合成得到的目标物存在于油状混合物中，需经过硅胶柱层析分离才能得到纯品，不仅后处理繁琐，而且无法实现规模化生产。

路线2：WO0218369公开了如下路线：

由于该路线采用DIBAL-H还原，不仅试剂成本较高，而且制备条件苛刻(需在-78℃下反应)，因此此路线也不适合于工业化生产要求。

路线3：CN101463001中公开了如下路线：

该路线使用了剧毒的羰基钴，不仅成本太高，而且无法满足环保要求，因此该路线也不能满足产业化要求。

路线4：WO2008090819公开了如下路线：

由于该路线的起始原料难以合成、不能批量购得，因此也不适合工业化生产要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的制备博西普韦中间体片段A和特拉匹韦中间体片段B的反应中收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者对环境不友好等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的单胺氧化酶进行酶催化合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮杂双环[3.1.0]己烷或(1S,3aR,6aS)-1-取代-八氢环戊[c]吡咯，进而进一步合成(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-腈及其水解产物(1S,2S,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或进一步合成(1S,3aR,6aS)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈的酶-化学合成方法。还提供了编码该单胺氧化酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该单胺氧化酶在催化胺氧化反应中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种分离的单胺氧化酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质由来源于环境的DNA编码，具有单胺氧化酶的功能，是一种新的单胺氧化酶。

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有单胺氧化酶活性的蛋白质。

其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明人发现这样的融合蛋白同样具有单胺氧化酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有单胺氧化酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持单胺氧化酶活性。

(c)与(a)的氨基酸序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有单胺氧化酶活性的蛋白质。

发明人将SEQ ID NO:2所示的单胺氧化酶序列与其他已知单胺氧化酶进行序列比对，与土曲霉(Aspergillus terreus)单胺氧化酶之间的同一性为93％，与来自黑曲霉(A.niger)的单胺氧化酶的同一性低于80％。本发明的单胺氧化酶与已知单胺氧化酶的氨基酸序列具有显著差异性。

在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。

本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的单胺氧化酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的。

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从土壤中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明的单胺氧化酶基因命名为BYK-MAON，其编码序列(CDS)长1479bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，全长编码序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID NO:1。本发明的单胺氧化酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQ ID NO:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ ID NO:1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白质的表达水平。

SEQ ID NO:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO:1所示序列的多聚核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1:20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的第三个方面提供了一种包含本发明所述的编码单胺氧化酶的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码单胺氧化酶或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的单胺氧化酶基因的重组表达质粒pET28a-BYK-MAON或含有其突变基因的重组表达质粒。

本发明的第四个方面提供了一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的单胺氧化酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)或E.coli DH5α。将前述重组表达质粒pET28a-BYK-MAON或其突变体转化至E.coliBL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。

本发明的第五方面提供一种重组单胺氧化酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组单胺氧化酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的单胺氧化酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的单胺氧化酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵生产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET28a-BYK-MAON或其突变体)接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地是0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～37℃(更佳地是25℃)，即可高效表达本发明所述重组单胺氧化酶。

本发明中催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物的催化剂，可以是上述产生的重组单胺氧化酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的单胺氧化酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的第六个方面提供了一种本发明所述的单胺氧化酶或重组单胺氧化酶在催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物中的应用。

上述应用中，所述的氧化-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的前手性化合物为氮杂双环化合物，即式I所示的化合物：

其中，R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；，n选自0～5的整数。

所述的前手性化合物氮杂双环化合物在单胺氧化酶作用下与氧化剂发生氧化反应，然后与MR发生加成反应生成(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物，即式II所示的化合物：

其中，

R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；，n选自0～5的整数；

R选自-CN，-SCN、-SO₃Na，-SO₃H；

M选自碱金属、碱土金属、H。

本发明所述的消除-加成反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳的，所述的应用包括下述步骤：在本发明所述的单胺氧化酶和过氧化氢酶的催化下，所述的前手性氮杂双环化合物和MR在pH5.0～8.0的水溶液中，与氧化剂进行不对称氧化-加成反应，形成光学手性纯的取代产物。

其中，所述的前手性氮杂双环化合物在反应液中的较佳浓度为10～200mmol/L。本发明的单胺氧化酶用量为催化有效量，较佳地为0.1～10g/L。过氧化氢酶的用量为催化有效量，较佳为0.01～0.1g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5.0～8.0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸氢二钠缓冲液；磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的消除-加成反应较佳地是在振荡或搅拌条件下进行。所述的氧化-加成反应的温度较佳地为20～50℃，更佳地为30～40℃。所述的氧化-加成反应的时间较佳地以底物剩余浓度低于5％为准。氧化-加成反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(1S,2S,5R)-氮杂-双环化合物。

本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的单胺氧化酶可以分别接受3并5和5并5等两种大小不同的氮杂环戊胺体系，生成相应亚胺；亚胺产物可接受氰化物的加成，因此可以在酶催化体系中加入氰化物，加成产物直接在盐酸-醇溶液中醇解得到氨基酸甲酯的盐酸盐，从而实现一锅法投料，简化了反应工艺，更加适合工业化生产的进行。

附图说明

图1单胺氧化酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增的单胺氧化酶基因。

图2单胺氧化酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为全菌蛋白裂解液。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1单胺氧化酶的酶活力测定

5mmol/L苄胺溶于50mmol/L磷酸盐缓冲液得到底物溶液，取1mL加入10μL酶液，30℃反应20min，加入400μL二硝基苯肼(1mmol/L，溶于3M HCl)，再加入2.4mL1.25M NaOH，反应5min，在450nm波长下检测吸光值。

光学纯度：Agilent1260系列HPLC，手性柱为ChiralpakAD-H(4.6×250mm,DiacelChemical Ind.Ltd.)，25℃进行分析，流动相为90％正庚烷，10％乙醇，0.1％三氟乙酸，流速为1mL/min，检测波长为220nm。S-构型产物保留时间为7.4min，R-构型产物保留时间为8.9min。

实施例2筛选单胺氧化酶

从武汉大学的校园采集土壤样品DNA(Chroma Spin TE-1000,ClontechLaboratories,Inc.USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集1～4kb的片段，回收并连接到pUC19的BamHI位点，得到质粒文库；将文库转化到E.coli DH10b，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500μL LB(100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔板，37℃培养4小时后加1mmol/L IPTG诱导，30℃继续培养过夜，然后各取10μL深孔培养物到含有50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)的新的96孔板，-80℃反复冻融使细菌裂解，加入5mmol/L苄胺，30℃温浴30分钟，随后加入400μL二硝基苯肼(1mmol/L，溶于3M HCl)，再加入2.4mL1.25M NaOH，反应5min，在450nm波长下检测吸光值，挑取吸光度最高的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序，用NCBI的ORF Finder分析其开放读码框(ORF)，得到序列SEQ ID NO:1，其编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

实施例3单胺氧化酶重组菌的构建和表达

采用引物PF(核苷酸序列为SEQ ID NO:3)和PR(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)PCR扩增单胺氧化酶全长基因(结果见图1)，PCR产物用NdeI/XhoI酶切后连接到pET28，并转化到E.coli BL21(DE3)，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板培养，挑选阳性菌落到100mL液体LB培养基进行培养，过夜培养物转入新鲜的1L LB培养液培养到OD₆₀₀至0.6～0.8，加入IPTG200μM诱导蛋白表达，降温至30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0.2MpH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次，1g菌体重悬于上述5mL磷酸盐缓冲液，超声波破碎后，SDS-PAGE检验表达水平。

实施例4：单胺氧化酶的高密度发酵

将实施例2获得的重组大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，硫酸钠0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，六水氯化镁0.41g/L)中，在25～-35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD₆₀₀达到20～40时，添加0.1～1mmol/LIPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体，均质后得到粗酶液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(结果见图2)。

实施例5单胺氧化酶的生物催化

在50mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中加入终浓度为100mmol/L的前手性化合物(见表1)，加入100mL水，加入终浓度为110mmol/L的MR(见表1)，氧气保护下密封搅拌30分钟，加入根据实施例4制备的单胺氧化酶的粗酶液至蛋白质终浓度为10g/L，加入终浓度为0.1g/L过氧化氢酶，控制pH值，30～50℃反应，薄层层析监测反应进程，底物剩余低于5％时视为反应结束。反应结束后用10mL的30％次氯酸钠淬灭反应，调pH至10～11，用叔丁基甲醚萃取，旋干得粗产物。结果见表1。

表1单胺氧化酶催化氧化-取代反应的结果

Claims

1.一种单胺氧化酶在催化前手性化合物进行氧化-加成反应形成手性加成产物中的应用，其特征在于单胺氧化酶由SEQ ID No：2所示氨基酸序列组成，其中所述的前手性化合物为式I所示的化合物：

其中，R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；n选自0～5的整数。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述前手性化合物在单胺氧化酶作用下与氧化剂发生氧化反应，然后与MR发生加成反应生成式II所示的化合物：

其中，

R1和R2独立地选自H、C1～C5烷基；A为亚甲基；n选自0～5的整数；

R选自-CN，-SCN，-SO₃Na，-SO₃H；

M选自碱金属、碱土金属、H。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用包括下述步骤：在权利要求1所述的单胺氧化酶，以及过氧化氢酶的催化下，所述的前手性化合物和MR在pH 5.0～8.0的水溶液中与氧化剂进行不对称氧化-加成反应，形成式II所示的手性取代产物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的单胺氧化酶为0.1～10g/L；MR的用量为10～400mmol/L；过氧化氢酶的用量为0.01～0.1g/L；所述的水溶液为pH范围在5.0～8.0的缓冲液，所述缓冲液的浓度为0.05-0.1mol/L；所述的氧化-加成反应在振荡或搅拌条件下进行；所述的氧化-加成反应的反应温度为20～50℃。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于：所述的前手性化合物在反应液中的浓度为10～200mmol/L。

6.一种合成(1S,2R,5R)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己-2-腈的方法，包括使用权利要求1所述的单胺氧化酶催化6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷进行氧化-取代反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，反应液中含有10～200mmol/L6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷、0.1～10g/L单胺氧化酶、10～400mmol/LMCN，反应在氧化剂存在下进行，反应温度为20～50℃，其M选自碱金属、碱土金属、H。

8.一种合成(1S,2aR,5aR)-八氢环戊[c]吡咯-1-腈的方法，包括使用权利要求1所述的单胺氧化酶催化八氢环戊[c]吡咯进行氧化-取代反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，反应液中含有10～200mmol/L5,5-二甲基-八氢环戊[c]吡咯、0.1～10g/L单胺氧化酶、10～400mmol/LMCN，反应在氧化剂存在下进行，反应温度为20～50℃，其M选自碱金属、碱土金属、H。