CN103627776A - 一种制备s-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法。该方法以消旋体对硝基溴代苯乙酮为原料，经过化学合成法，双酶偶联反应，最终经超滤和过硅胶柱得到高纯度的S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。这种制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，所用酶酶活高，时间短，成本底，S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷纯度高，反应条件温和，具有很好的工业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，属于生物催化不对称制备医药手性中间体技术领域。
背景技术
光学纯的环氧化物作为合成化学中重要的手性砌块可以进一步转化成许多具有生物活性的化合物，如白三烯、昆虫信息素、甾类物质，肾上腺素阻断剂、神经保护剂和艾滋病毒蛋白酶抑制剂等，在医药、农药和化妆品等行业中具有非常广阔的应用前景。
目前根据文献报道S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的制备方法主要有化学合成法和生物酶法。化学合成法以对硝基溴代苯乙酮(CAS：99-81-0)为底物，以硼氢化钠为还原剂，在适量甲醇中反应。产物经过萃取，过硅胶柱分离得到消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷，再经过手性制备柱得S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。该反应会生成其它大量副反应，工业生产和环保难度大，工业手性制备柱成本高，产品得率低。目前生物酶法制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷都是直接以消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷为底物，用环氧化物水解酶催化从消旋体得到光学纯的2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。这种方法虽然简单，但是消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷本身价格不低且在市场上不易买到，对硝基溴代苯乙酮(CAS：99-81-0)则非常便宜，每10g只有100元左右。相比之下双酶法生产成本低，同时减去了消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的提取过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接以消旋体对硝基溴代苯乙酮(CAS：99-81-0)为原料，先利用化学合成法合成消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇：消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(7：3)的混合物，再利用卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶双酶催化制备高纯度的S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法。该工艺省去了消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇(CAS：19922-82-8)，消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的分离提取过程，减少了酸碱消耗和设备投资，符合绿色环保和清洁生产的要求，效果突出，具有很好的应用价值。
本发明的技术方案：本发明以消旋体对硝基溴代苯乙酮为底物，以化学合成法合成消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇和消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的混合物(如图1)，卤代醇脱卤酶转化消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷，消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷为环氧化物水解酶的反应底物，通过串联反应制备了S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(如图2)。具体步骤如下：
(1)分别将具有卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶活性的菌株，在培养基中培养产生高活性的卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶；
(2)将消旋体对硝基溴代苯乙酮，硼氢化钠溶于甲醇中，搅绊子搅动，冰浴环境下反应3h。反应结束后加入适量水，用乙酸乙酯对反应物进行萃取，保留有机相。MgSO4干燥后经旋转蒸发仪蒸发得的橘色固体为消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇：消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(7：3)的混合物。
(3)以N，N-二甲基甲酰胺为溶液溶解上述混合物，将具有卤代醇脱卤酶活性和环氧化物水解酶活性的湿菌体或粗酶液按一定时间顺序加入此混合物溶液，反应体系中同时含有大量的pH6.8-8.0的磷酸盐缓冲液。在25～45℃之间进行双相酶促反应，最后经过超滤和过硅胶柱相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。
上述步骤(1)中的具有卤代醇脱卤酶活性的菌株为E.coli BL21／pET28a-SyHheCM，由本实验室构建和保藏。具有环氧化物水解酶活性的菌株为E.coli BL21／pET28a-Eh，由本实验室构建和保藏。
上述步骤(1)中的培养基采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和／或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和／或豆饼水解液，培养基中总氮量为1～30g／L。
上述步骤(2)中消旋体对硝基溴代苯乙酮在甲醇中浓度为100g/L。硼氢化钠在甲醇中浓度为20g／L。
上述步骤(3)所述的消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇，消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷在N，N-二甲基甲酰胺中浓度为20～60g／L，双相溶液中浓度为2～6g/L。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用了高活性的卤代醇脱卤酶菌株E.coli／SyHheCM和高活性的环氧化物水解酶菌株E.coli／Eh。优选的培养基可高效表达卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶，使双酶偶联合成S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷有较高的催化速率和产率，S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷e.e.值达98％以上。
(2)本发明利用消旋体对硝基溴代苯乙酮为原料，降低了成本，每10g消旋体对硝基溴代苯乙酮100元左右。双酶偶联生产加快了生产速率，具有良好的经济效益，环保效益和社会效益。
(3)本发明以化学合成法的混合产物为双酶偶联反应的底物，同时以卤代醇脱卤酶反应产物直接作为环氧化物水解酶的底物，省去了消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇，消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的提取过程，大幅度减少酸碱消耗，方便快捷，符合绿色环保和清洁生产的要求，实施效果突出，具有很好的应用价值。
(4)酶法合成S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，适合工业化生产。
附图说明
图1：化合物的化学合成
图2：酶的生物催化过程
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇和2-(4-硝基苯基)环氧乙烷混合物的化学合成
将5g的消旋体对硝基溴代苯乙酮，1g的硼氢化钠溶于50mL的甲醇中，用搅拌子搅拌，在冰浴环境中反应3h后加入50mL水，同时再加入300mL乙酸乙酯于分液漏斗中摇匀，保留有机相，有机相经MgSO4干燥，再用旋转蒸发仪旋干得消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇：消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(7：3)的混合物固体4g。
实施例2S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的酶催化的生成
将100mL发酵液离心得到卤代醇脱卤酶湿体菌1.5g加入到1000mL转化液中，转化液中含有4g/L上述混合物，100mL N，N-二甲基甲酰胺，900mL磷酸盐缓冲液，pH8.0，反应1h。然后加入100mL发酵液，离心得到的环氧化物水解酶湿菌体1.5g，反应30min，GC气相检测确定反应终点。反应结束后转化液中S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷浓度为1.3g／L。
实施例3S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的分离纯化
将转化液4000rpm离心15min去除菌体，上清液中加入100mL乙酸乙脂摇匀后保留有机相，经旋转蒸发得固体1.2g。固体物质上经硅胶柱，以乙酸乙酯：石油醚(1：7)混合液洗脱目的物质。洗脱液经旋转蒸发仪得纯度较高的S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷固体1.0g。
Claims (2)
1.一种制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)分别将具有卤代醇脱卤酶活性和环氧化物水解酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的卤代醇脱卤酶和环氧化物水解酶；
(2)将消旋体对硝基溴代苯乙酮，硼氢化钠溶于甲醇中，搅绊子搅动，冰浴环境下反应3h。反应结束后加入适量水，用乙酸乙酯对反应物进行萃取，保留有机相。MgSO4干燥后经旋转蒸发仪蒸发得的橘色固体为消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇：消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(7：3)的混合物。
(3)以N，N-二甲基甲酰胺为溶液溶解上述混合物，将具有卤代醇脱卤酶活性和环氧化物水解酶活性的湿菌体或粗酶液按一定时间顺序加入此混合物溶液，反应体系中同时含有大量的pH6.8-8.0的磷酸盐缓冲液。在25～45℃之间进行双相酶促反应，最后经过超滤和萃取相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷。
2.根据权利要求1所述的一种制备S-2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的方法，其特征在于步骤(3)所述的消旋体2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇：消旋体2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(7：3)的混合物。在N，N-二甲基甲酰胺中浓度为20～60g/L，双相溶液中浓度为2～6g/L。
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