CN109762801A - 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性药物中间体中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)‑环氧氯丙烷中的应用。所述突变的位点为第85位。通过卤醇脱卤酶进行改造获得突变体，对手性环氧氯丙烷的不对称合成具有高立体选择性与活性，在磷酸盐缓冲体系中，以1,3‑二氯‑2‑丙醇为底物，能够获得光学纯度(e.e.值)大于99％的(S)‑ECH，产率达87％以上，具有极高的应用价值。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制 备(S)-环氧氯丙烷中的应用。
(二)背景技术
手性环氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)作为一种高附加值的手性 合成前体模块，被广泛应用于手性药物、农药以及精细化工等领域。传统 的(S)-ECH化学合成工艺从外消旋环氧氯丙烷出发，通过Salan试剂催化 水解外消旋环氧氯丙烷，可以得到e.e.值为99％，但是，(S)-环氧氯丙烷 的产率为43％，且所使用的催化剂存在着价格昂贵、重复性不理想、环 境不友好、理论收率只有50％等问题，极大提高了手性药物生产的成本。 生物酶法能够绿色高效地催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-环氧氯丙烷且理论 收率达100％，但是，利用卤醇脱卤酶直接不对称合成手性环氧氯丙烷的 文献较少。Xue等筛选到来自Tistrella mobilis ZJB1405的HHDHTM菌株， 其催化1,3-DCP生成(S)-环氧氯丙烷时e.e.值超过60％(CN104263713A)。 Xue等通过对来自Agrobacterium radiobacterstrain AD1的HheC进行改造 获得突变株HheC P175S/W249P其催化1,3-DCP生成(S)-环氧氯丙烷时， 转化率达93.7％，e.e.为95.3％。在催化过程中，因其催化体系中生成的 Cl-反作用于(S)-环氧氯丙烷本身，致使(S)-环氧氯丙烷发生开环反应，造 成(S)-环氧氯丙烷的酶促水解，从而严重制约了生物催化的工厂化应用。
当前卤醇脱卤酶催化制备手性ECH技术存在着产物光学纯度低，反 应过程中手性ECH消旋或水解等问题，限制了酶法合成手性ECH的开发 与应用。
(三)发明内容
本发明目的即是提供一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体及 以该突变体制备高产率和e.e.值的(S)-ECH应用，本发明通过对其卤素结 合域处蛋白进行改造，获得了能够催化1,3-DCP获得高光学纯和高产的 (S)-ECH的突变体。
本发明采用的技术方案是：
一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，由序列如SEQ ID NO： 2所示的氨基酸经定点饱和突变而来，所述突变的位点为第85位。
优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第85位 谷氨酸突变为丙氨酸(即突变体E85A)、缬氨酸(即突变体E85V)、亮 氨酸(即突变体E85L)、脯氨酸(即突变体E85P)、色氨酸(即突变体 E85W)、酪氨酸(即突变体E85Y)、天冬酰胺(即突变体E85N)、赖氨酸(即突变体E85K)、亮氨酸(即突变体E85L)、苏氨酸(即突变体E85T) 而得。
更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示(突变体 E85P)。
本发明还涉及所述的卤醇脱卤酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应 用。
具体的，所述应用为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工 程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为 催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介 质，在600rpm、37℃条件下进行反应，反应结束后，将反应分离纯化， 获得(S)-手性环氧氯丙烷。
所述卤醇脱卤酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO：12(SEQ ID NO. 4的编码基因序列)所示。
催化剂的用量以湿菌体重量计为5～100g/L缓冲液，所述底物的初始 浓度为5～200mM。
所述湿菌体可按如下方法制备：将含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重 组基因工程菌接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培 养12h，获得种子液；再以体积浓度1％的接种量将种子液接种到新鲜的 含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体。
所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体用200mM，pH 8.0的磷酸 盐缓冲液重悬(wt/vol＝1:10)，将重悬后的菌液在50％的功率下破碎 30min。
所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体用200mM，pH 8.0的磷酸 盐缓冲液重悬(wt/vol＝1:10)，将重悬后的菌液在50％的功率下破碎 30min。
本发明以含有卤醇脱卤酶基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示) 的表达载体为模板，利用定点饱和突变以及迭代饱和突变技术进行突变， 扩增产物转化宿主细胞，构建突变库。将突变体诱导表达后进行筛选，从 而获得了高e.e.值，且保持(S)-ECH高稳定性的卤醇脱卤酶突变体，这些 突变体能以1,3-二氯-2-丙醇为底物，高效生物催化生产e.e.值大于99％的 (S)-ECH并且转化率大于87％。
本发明获得了多种卤醇脱卤酶突变体，以说明书所附的序列2为参考 序列，优选来自第85位的一个突变，并且以1,3-二氯-2-丙醇为底物其具 有e.e.值大于达99％，转化率大于87％。优选的是，所述亲本序列中的第 85位的谷氨酸(Glu)突变成脯氨酸(Pro)。
本发明所述的卤醇脱卤酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可 以是经部分纯化的和完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本 领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶和者 固定化细胞形式的固化酶。
通过将该含有全长突变的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导 表达、筛选出具有高e.e.值的阳性突变子。最后从阳性突变子中抽提出质 粒DNA，进行DNA测序分析，以确定突变体的突变信息。在本发明卤 醇脱卤酶突变体的制备方法中，可以采用pET28b(+)载体和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞。在本发明制备的卤醇脱卤酶突变体的方法中，所获 得的卤醇脱卤酶突变体基因可以在原核细胞和真核细胞胞内表达，也可以 采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞和真核细胞胞外表 达。
本申请文本中所用的术语“亲本”系指来自于Agrobacterium radiobacterAD1ZJB15067的卤醇脱卤酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本申请文本中所用的术语“卤醇脱卤酶突变体”是指这样一种以序列 表中SEQ IDNO：2表示氨基酸序列为参考序列，存在来自第85位的九 个突变体，并且以1,3-二氯-2-丙醇为底物其具有e.e.值大于99％，转化率 大于87％的酶。因此，在本申请中，所述卤醇脱卤酶突变体的变体，包 括对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中除第85位的其他位点的保守取代形式、增加和缺失一个和几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端 截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
本申请中SEQ ID NO:12表示的序列为参考序列，本序列中针对第 253-255位核苷酸在内的能够编码脯氨酸的全部密码子。
在本申请文本中所用的氨基酸三字母和单字母表达方式，采用 IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138:9-37,1984)。
与现有技术相比，本发明有益效要体现在：通过卤醇脱卤酶进行改造 获得的突变体，对手性ECH合成的立体选择性优于现有卤醇脱卤酶。在 磷酸盐缓冲体系中，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，首次获得光学纯(e.e. 值>99％)的(S)-ECH，产率达87％以上，反应至24h后，(S)-ECH仍保持 较高水平，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1卤醇脱卤酶催化1,3-二氯-2-并处合成(S)-ECH。
图2亲本与优选突变株蛋白表达情况。M:Marker；第1泳道：亲本菌株； 第2泳道：E85P。
图3为优选菌株与亲本菌株之间对于(S)-ECH稳定性反应进程比较。 Treatment1:10mL 200mM磷酸缓冲液加入(S)-ECH(20mM)；Treatment 2:10mL 200mM磷酸盐缓冲液。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)； Treatment 3:0.2g亲本菌株用10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入 (S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)；Treatment 4:0.2g E85P细胞用 10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20 mM)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：卤醇脱卤酶定点饱和突变文库的构建
根据GenBank AAK92099基因序列设计引物(见表1)。分别以引物 E85X-F、E85X-R，对亲本的HheC基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所 示)进行定点饱和突变实验。50μL PCR反应体系：25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP，1μL P1(50μM)和P2(50μM)，2μL(100-200ng)亲 本质粒模板，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase，19μL去 离子水。PCR程序：95℃预变性3min，30个循环：95℃15s，分别 在合适退火温度保持15s，72℃3min30s，最后在72℃延伸10min。PCR 产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCR cleanupKit对产物进行纯化。 经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μL，加入1 μL DpnI，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受 态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那抗性(50mg/L)的LB平板。
实施例2：卤醇脱卤酶单点饱和突变文库的筛选
挑取单菌落克隆子(由实施列1构建的突变库)在2mL的深96孔 板中培养，含有1mLLB和50μg/mL卡那抗性。同时挑取三个亲本作为 对照。2mL的深96孔板置于37℃条件培养5h，然后取100μL菌液到 另外一个无菌的2mL 96孔板，并向其中加入100μL、30％(wt/vol)的无 菌甘油。向剩余的900μL 菌液中加入100μL含50μg/mL卡那抗性和1 mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)LB培养基，置于28℃诱导 12-14h，诱导后的菌株在3,000×g和4℃条件下离心30min，弃上清， 收集菌体。500μL 反应体系(200mM磷酸盐缓冲液、1.3-二氯-2-丙醇) 加入每个孔，将菌体进行重悬，然后置于37℃和150rpm的条件下反应 1h。用1mL乙酸乙酯萃取，后于1,2000rpm下离心1min，将上清液转入 含有无水Na2SO4的2mL EP管中做吸水处理，后用气相检测。
气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序 是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt (S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的量和 e.e.值作为对照。获得了优良突变体菌株，记为突变体E85A，突变体E85V， 突变体E85L，突变体E85P，突变体E85W，突变体E85Y，突变体E85N， 突变体E85T，突变体E85K。
表1：引物
| Primer Name | Primer Sequence 5'-3' |
| E85X-F | ATTTTCGCGCCGNNSTTCCAGCCGATC |
| E85X-R | GATCGGCTGGAASNNCGGCGCGAAAAT |
实施例3：卤醇脱卤酶优势菌株复筛
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例2制备的9种卤醇脱卤酶突变体湿菌 体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率 超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。 采用粗酶液催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH(反应式参见图1)，并比较 它们的e.e.值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应5min后，取500μL反应液， 加入1000μL 乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析 条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min， 10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5 min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的e.e.值作为对照，e.e. 值计算公式：[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]。卤醇脱卤酶突变株的e.e.值和 转化率见表2。
表2：卤醇脱卤酶生成(S)-ECH的e.e.值和转化率比较
| 卤醇脱卤酶 | e.e.值(％) | 转化率(％) |
| 亲本 | 95.3 | 93.7 |
| E85A | >95.3 | 73.1 |
| E85V | >95.3 | 69.2 |
| E85L | >95.3 | 72.38 |
| E85P | >99 | 87 |
| E85W | >95.3 | 71.2 |
| E85Y | >95.3 | 74.4 |
| E85N | >95.3 | 74.0 |
| E85T | >95.3 | 76.1 |
| E85K | >95.3 | 76.0 |
实施例4：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体催化1,3-二氯-2-丙醇 合成(S)-ECH的e.e.值稳定性比较
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例3确定的最优卤醇脱卤酶突变体湿 菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功 率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶 液。采用粗酶液催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e.值。 该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入1,3- 二氯-2-丙醇，进行反应。反应6h后，取500μL反应液，加入1000μL 乙 酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890 GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升 温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6 min。以亲本生产的(S)-ECH的e.e.值作为对照，e.e.值计算公式：[e.e.(％) ＝(S-R)/(S+R)×100]。几种卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表3。
表3：卤醇脱卤酶生成(S)-ECH e.e.值稳定性比较
| 卤醇脱卤酶 | 对应氨基酸序列号 | e.e.值(％) |
| 亲本 | SEQ ID NO.2 | -8.54 |
| E85P | SEQ ID NO.4 | >50 |
实施例5：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体维持(S)-ECH稳定性 的探究
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例3确定的一种卤醇脱卤酶突变体湿 菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功 率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶 液。采用粗酶液催化(S)-ECH，并比较它们的(S)-ECH稳定性。该体系在 600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入(S)-ECH和NaCl， 进行反应。于反应过程中取样监测，取500μL反应液，加入1000μL 乙 酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890 GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升 温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6 min。以亲本生产的(S)-ECH的剩余量作为对照。结果如图3所示。
实施例6：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体催化不同浓度1,3-二 氯-2-丙醇合成(S)-ECH的e.e.值比较
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例3确定的1种卤醇脱卤酶突变体湿菌 体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率 超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。 采用粗酶液催化不同浓度1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e. 值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入 5-200mM的1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应过程中取样500μL反应液， 加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析 条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min， 10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5 min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的量作为对照。几种 卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表4。
表4：卤醇脱卤酶生成(S)-ECH的e.e.值比较
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性药物中间体中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> Agrobacterium radiobacterstrain
<400> 1
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
attttcgcgc cggaattcca gccgatcgat aaatatgctg tggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> Agrobacterium radiobacterstrain
<400> 2
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn Asp
65 70 75 80
Ile Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Val Glu Asp
85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile Ile
115 120 125
Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro Trp
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala Leu
195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260
<210> 3
<211> 786
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
attttcgcgc cgcctttcca gccgatcgat aaatatgctg tggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 4
<211> 262
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
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195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260
Claims (7)
1.一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第85位经定点饱和突变而来。
2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于所述突变体由序列如SEQ IDNO：2所示的氨基酸第85位谷氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、亮氨酸或苏氨酸而得。
3.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
4.权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在600rpm、37℃条件下进行反应，反应结束后，将反应分离纯化，获得(S)-手性环氧氯丙烷。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于卤醇脱卤酶突变体编码基因序列如SEQ IDNO.3所示。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于催化剂的用量以湿菌体重量计为5～100g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为5～200mM。
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