CN114634918A - 一种d-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用，属于生物技术领域。D‑氨基酸氧化酶基因来源于胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第54位、第58位、第213位、第223位、第225位发生单突变或多位点突变获得的。本发明构建的D‑氨基酸氧化酶变体工程菌株，配合稳定剂的使用，有效提高了草酰乙酸的稳定性和得率，产物浓度最高可达34.7g/L，转化率最大可达87.4%。

Description

一种D-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
技术领域
本发明涉及D-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用，属于生物技术领域。
背景技术
α-酮酸是一类双官能团有机化合物，是有机合成、药物合成及生物合成的重要中间体，已广泛应用于食品、化妆品、药物及有机合成中。如草酰乙酸用作聚烯烃、PVC塑料的爽滑剂、抗静电剂、脱模剂，颜料、染料等分散剂，印刷油墨的添加剂。草酰乙酸（oxaloacetate，oxaloacetic acid，OAA）是一种四碳小分子，参与许多的代谢过程包括糖原异生、三羧酸循环、尿素循环和氨基酸的代谢等，是产生ATP、维持三羧酸循环和电子传递链所必不可少的成分。除了参与体内众多的代谢过程外，草酰乙酸还具有促进线粒体发生，促进糖酵解和呼吸作用，减少外周和脑内的谷氨酸，抗氧化，抗炎等药理作用，可应用于许多疾病的治疗。草酰乙酸是一类不稳定化合物，容易脱羧基、脱羰基、氧化等，发生分解，不稳定，传统化学合成上有一定难度，且反应条件苛刻、产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险。
D-氨基酸氧化酶，是一种以黄素腺嘌呤（FAD）为辅基的典型黄素蛋白酶类，可以氧化D-氨基酸生成相应的酮酸和氨。Ｄ-氨基酸氧化酶对催化反应底物有高度的立体异构选择性和广谱性，可被广泛用于Ｄ-氨基酸的定性定量分析、生物传感器、Ｌ-氨基酸和α-酮酸的生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种产D-氨基酸氧化酶突变体、重组菌及其全细胞作为催化剂，用于草酰乙酸的合成。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了一种D-氨基酸氧化酶突变体，D-氨基酸氧化酶基因来源于胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第54位、第58位、第213位、第223位、第225位发生单突变或多位点突变获得的；
所述D-氨基酸氧化酶突变体为下列之一：第54位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-N54Q；或第213位蛋氨酸突变为丝氨酸及第223位酪氨酸突变为苯丙氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-M213S - Y223F；或第213位蛋氨酸突变为丙氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-M213A；或第58位苯丙氨酸突变为酪氨酸及225位异亮氨酸突变为赖氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体F58Y -I225K。
本发明还涉及一种所述D-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。
本发明提供含有所述编码基因的工程菌。
本发明还提供一种所述D-氨基酸氧化酶突变体在催化D-氨基酸合成草酰乙酸中的应用。
进一步，所述的应用方法为以含D-氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以D-天冬氨酸为底物，加入400U/mL的过氧化氢酶（市售），1g/L的稳定保护剂的转化体系中，氨水调节pH为7.5，通气控制溶氧浓度为10-20%，温度30～40℃的条件下反应2～4h生产草酰乙酸。
进一步，所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～20g/L，底物D-天冬氨酸浓度为10～40g/L。
进一步，含D-氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌按如下方法制备：将含D-氨基酸氧化酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～16h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养4～8h；3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比1～10%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～50%空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在6.5～7.2，37℃培养4～12 h后加入IPTG至终浓度为0.5mM～1mM并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在1～5g/L发酵结束后10000 r/min、4 ℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得D-氨基酸氧化酶突变体全细胞催化剂。
进一步，所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，氨苄西林 100mg/L，琼脂 20 g/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，氨苄西林100mg/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：甘油10 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉 10 g/L，MgSO4 2 g/L，KH2PO4 15 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，大豆蛋白胨 2 g/L，CaCl2 1g/L，FAD50μg/L， pH6.7～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的稳定保护剂为亚硫酸钠、半胱氨酸和EDTA中的一种或多种组合使用。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明采用易错PCR技术成功突变来源于胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的D-氨基酸氧化酶并构建工程菌株，筛选到的突变体酶活较原始最高提高362.5%，并用于草酰乙酸的酶法合成，通过稳定剂的配合使用，有效提高了草酰乙酸的稳定性，产物浓度最高可达34.7g/L，转化率最大可达87.4%。同时本发明所述的生产方法所使用的原料廉价易得，且生产工艺简单易行、生产成本较低。建立的全细胞转化体系，解决了化学法合成草酰乙酸的反应条件苛刻、且产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险的问题，实现了高产率绿色生产草酰乙酸。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1：表达载体和工程菌构建
通过文献报道和基因序列同源性，在NCBI数据库中查询并选择胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）ATCC 26217 的D-氨基酸氧化酶（GenBank: KAG0664436.1），全基因合成D-氨基酸氧化酶DAAO(基因序列为SEQ ID No .1，氨基酸序列为SEQ ID No.2)，设计引物，利用同源重组进行PCR扩增，亚克隆到载体pET32a的相应位点，获得重组质粒pET32a-DAAO。通过热激转化E. coli BL21(DE3)，得到表达D-氨基酸氧化酶的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO。
以重组载体pET32a- DAAO作为模板，利用易错PCR技术构建随机突变文库。正向引物DAAO-F为5’-taccgacgacgacgacaaggccatgactcaggacaagcgcgtc-3’（下划线为同源臂），反向引物DAAO-R为5’-agtggtggtggtggtggtgctcgagctagagcttggcgaggtgccg-3’（下划线为同源臂）。易错PCR的反应体系为：PCR Grade Water 39μL，10×TITANIUM Taq Buffer 5μL，MnSO4 (8 mM) 1μL，dGTP (2 mM) 1μL，50×Diversify dNTP Mix 1μL，Primer mix 1μL，模板 1μL，TITANIUM Taq Polym 1μL，共50μL体系（其中反应体系中的Primer mix为所述上下游引物各0.5μL的混合溶液）。易错PCR反应条件为：94℃ 30s，1个循环；94℃ 30s，68℃1min30s，25个循环；68℃ 1min，1个循环。将易错PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的片段与双酶切的载体pET32a（Nco I和Xho I）进行同源重组反应，反应体系为：4μL 5×CE II Buffer，2μL Exase II，用ddH2O补齐20μL。混匀后37℃，融合30min，立即置于冰上冷却10min，然后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态。并置于37℃，200r/min条件下培养1h进行活化，将活化后重组细胞涂布于含100mg/L氨苄西林抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得D-氨基酸氧化酶突变体表达文库。
从获得的D-氨基酸氧化酶突变体表达文库菌落中利用高通量筛选方法，从这些单菌落中筛选高活性突变体菌株。其具体筛选方法为：从平板上随机挑取1500个单菌落，接入96深孔板，培养基为LB液体培养基，37℃，180r/min培养9h后，离心收集菌体，去掉上清培养基后加入发酵培养基，37℃，220r/min培养6h后加入IPTG至终浓度为0.5mM并降温至25℃诱导表达；离心收集菌体，测定酶活。标准酶活检测体系：10g/L湿菌体、50mM底物D-天冬氨酸、400U/mL 过氧化氢酶，反应介质为pH 8.0的磷酸盐缓冲液，总体系为1mL。单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol 草酰乙酸所需要的酶量为一个酶活单位U。筛选得到4株高活性D-氨基酸氧化酶突变菌株，经测序，分别为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第54位天冬酰胺突变为谷氨酰胺（DAAO-N54Q）、及第213位蛋氨酸突变为丝氨酸及第223位酪氨酸突变为苯丙氨酸（DAAO-M213S - Y223F）、第213位蛋氨酸突变为丙氨酸（DAAO-M213A）、或第58位苯丙氨酸突变为酪氨酸及225位异亮氨酸突变为赖氨酸（F58Y -I225K）的D-氨基酸氧化酶突变体，对应的工程菌株分别为E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO -N54Q、E.coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO -M213S -Y223F、E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO -M213A、E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO-F58Y -I225K。各突变株酶活如表1所示。
表1 D-氨基酸氧化酶突变体酶活
D-氨基酸氧化酶工程菌 相对酶活（%）
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO 100
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO-N54Q 155.7
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO-M213S -Y223F 362.5
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO-M213A 197.6
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO- F58Y -I225K 220.3
实施例2：利用重组菌发酵生产D-氨基酸氧化酶突变体及酶法转化D-天冬氨酸生产草酰乙酸
(1)将DAAO各突变株接入LB斜面培养基37℃培养14h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养6h；3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比5%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在30%左右空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在7.0，37 ℃培养8 h后加入IPTG至终浓度为0.5mM并降温至25℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在2g/L发酵结束后10000 r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，分别得到D-氨基酸氧化酶突变体全细胞催化剂。
(2)利用D-氨基酸氧化酶突变体全细胞催化生产草酰乙酸，其转化条件为：配制10g/L的D-天冬氨酸，加入400U/mL的过氧化氢酶（市售），1g/L的稳定保护剂亚硫酸钠的转化体系中，氨水调节pH为7.5，最后分别加入10g/L的DAAO突变体湿细胞作为催化剂，通气控制溶氧浓度为20%，温度37℃的条件下反应2h。结果如表2所示，其中E. coli BL21(DE3)/pET32a-DAAO- M213S -Y223F作为催剂，草酰乙酸浓度为9.5g/L，摩尔转化率为95.7%。E.coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO- F58Y -I225K次之，草酰乙酸浓度为7.8g/L，摩尔转化率为98.5%。
表2 DAAO突变株转化D-天冬氨酸生产草酰乙酸
DAAO突变株 草酰乙酸（g/L） 转化率（%）
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO-N54Q 4.1 41.3
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO- M213S -Y223F 9.5 95.7
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO- M213A 6.3 63.4
E. coli BL21(DE3)/ pET32a-DAAO- F58Y -I225K 7.8 78.5
实施例3：利用重组菌发酵生产D-氨基酸氧化酶突变体（DAAO- M213S -Y223F）及酶法转化D-天冬氨酸生产草酰乙酸
(1)将DAAO突变体DAAO- M213S -Y223F接入LB斜面培养基37℃培养16h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养5h；3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比5%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25%左右空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在7.0，37 ℃培养6h后加入IPTG至终浓度为1mM并降温至25℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在2g/L发酵结束后10000 r/min、4 ℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，分别得到D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- M213S -Y223F全细胞催化剂。
(2)利用D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- M213S -Y223F全细胞催化生产草酰乙酸，其转化条件为：配制20g/L的D-天冬氨酸，加入400U/mL的过氧化氢酶（市售），1g/L的稳定保护剂亚硫酸钠的转化体系中，氨水调节pH为7.5，最后分别加入10g/L的DAAO突变体湿细胞作为催化剂，通气控制溶氧浓度为20%，温度37℃的条件下反应3.5h。反应结束后草酰乙酸浓度为18.6g/L，摩尔转化率为93.7%。
实施例4：利用重组菌发酵生产D-氨基酸氧化酶突变体（DAAO- F58Y -I225K）及酶法转化D-天冬氨酸生产草酰乙酸
(1)将DAAO突变体DAAO- F58Y -I225K接入LB斜面培养基37℃培养14h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养6h；3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比10%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25%左右空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6h后加入IPTG至终浓度为0.8mM并降温至25℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在3g/L发酵结束后10000r/min、4 ℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，分别得到D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- F58Y -I225K全细胞催化剂。
(2)利用D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- F58Y -I225K全细胞催化生产草酰乙酸，其转化条件为：配制20g/L的D-天冬氨酸，加入400U/mL的过氧化氢酶（市售），1g/L的稳定保护剂半胱氨酸的转化体系中，氨水调节pH为8.0，最后分别加入10g/L的DAAO突变体湿细胞作为催化剂，通气控制溶氧浓度为20%，温度37℃的条件下反应3.5h。反应结束后草酰乙酸浓度为15.2g/L，摩尔转化率为76.5%。
实施例5：利用重组菌发酵生产D-氨基酸氧化酶突变体（DAAO- M213S -Y223F）及酶法转化D-天冬氨酸生产草酰乙酸
(1)将DAAO突变体DAAO- M213S -Y223F接入LB斜面培养基37℃培养16h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养5h； 3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比5%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在25%左右空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在6.8，37 ℃培养7h后加入IPTG至终浓度为1mM并降温至20℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在2g/L发酵结束后10000 r/min、4 ℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，分别得到D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- M213S -Y223F全细胞催化剂。
(2)利用D-氨基酸氧化酶突变体DAAO- M213S -Y223F全细胞催化生产草酰乙酸，其转化条件为：配制40g/L的D-天冬氨酸，加入400U/mL的过氧化氢酶（市售），1g/L的稳定保护剂EDTA的转化体系中，氨水调节pH为7.5，最后分别加入15g/L的DAAO突变体湿细胞作为催化剂，通气控制溶氧浓度为20%，温度37℃的条件下反应4h。反应结束后草酰乙酸浓度为34.7g/L，摩尔转化率为87.4%。
SEQ ID No .1:
atgactcaggacaagcgcgtcgttgtactcggctcgggagttatcgggttgtcttgcgccctggcactcgcgcagaagggctacaaggtgcatgtcgttgcccgcgatttgccagaagacaccgtcgcgcagacgtttgcgagcccgtgggcgggtgctaattggacaccgttcatgtcgaaagaagccggtccgaggcaagcaaagtgggaggaagcgacgttcaagcaatgggtcgaccttgtcccgcaaggtctcgcaatgtggctcaaggggacccggcggttcgcagagaacgaggccgatctgctcggccactggtacaaagatatcgttccgaactaccgacacttgaacccgtccgactgccctcccggcgcgatcggcgtcacgtacgacaccctctcggtcaatgctccaaagttctgtcaatacctccaacgcgagggacagaagctcggcgtcacgttcgagcgaaggctcgtcacttcgctcgagcagattgcagacggtgccgatctcatcgtcaacgcgaccgggctcggtgccaagtctatcgccggcgtggaagaccaagaggttgaaccgatccgaggccagactgttctcgtcaaatccaactgcaagcgctgcacgatggattcttcggacccgaaaagcccggcttacatcattcctcggcctggtggcgaagtcatctgcggcggtacctatctcgttggcaactatgacctttctgtcgacccggcgaccatcccccggatcctcaaacactgcctccgcctcgacccctccatctcgaccgacgggacgctcgaagggatcgaaatcctccgccacaatgtcggactccgccccgcccgccgcggcggtccccgcgtcgaactcgaacgcgtctcgctcccgctcaagcggggtcagtcgctcctcgcgctcgggacggcaaaggctgccgagggcaaagcgccacggacggtgcccgtcgtgcacgcttacgggttctccagcgcgggttaccagcagggctggggcgccgcgctcgaggtgcgagacttggtcgatcaggcgatcgggtcttcctcctcttcctcgagtgggcggcacctcgccaagctctag；
SEQ ID No .2：
MTQDKRVVVLGSGVIGLSCALALAQKGYKVHVVARDLPEDTVAQTFASPWAGANWTPFMSKEAGPRQAKWEEATFKQWVDLVPQGLAMWLKGTRRFAENEADLLGHWYKDIVPNYRHLNPSDCPPGAIGVTYDTLSVNAPKFCQYLQREGQKLGVTFERRLVTSLEQIADGADLIVNATGLGAKSIAGVEDQEVEPIRGQTVLVKSNCKRCTMDSSDPKSPAYIIPRPGGEVICGGTYLVGNYDLSVDPATIPRILKHCLRLDPSISTDGTLEGIEILRHNVGLRPARRGGPRVELERVSLPLKRGQSLLALGTAKAAEGKAPRTVPVVHAYGFSSAGYQQGWGAALEVRDLVDQAIGSSSSSSSGRHLAKL。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种D-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1119
<212> DNA
<213> 胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)
<400> 1
atgactcagg acaagcgcgt cgttgtactc ggctcgggag ttatcgggtt gtcttgcgcc 60
ctggcactcg cgcagaaggg ctacaaggtg catgtcgttg cccgcgattt gccagaagac 120
accgtcgcgc agacgtttgc gagcccgtgg gcgggtgcta attggacacc gttcatgtcg 180
aaagaagccg gtccgaggca agcaaagtgg gaggaagcga cgttcaagca atgggtcgac 240
cttgtcccgc aaggtctcgc aatgtggctc aaggggaccc ggcggttcgc agagaacgag 300
gccgatctgc tcggccactg gtacaaagat atcgttccga actaccgaca cttgaacccg 360
tccgactgcc ctcccggcgc gatcggcgtc acgtacgaca ccctctcggt caatgctcca 420
aagttctgtc aatacctcca acgcgaggga cagaagctcg gcgtcacgtt cgagcgaagg 480
ctcgtcactt cgctcgagca gattgcagac ggtgccgatc tcatcgtcaa cgcgaccggg 540
ctcggtgcca agtctatcgc cggcgtggaa gaccaagagg ttgaaccgat ccgaggccag 600
actgttctcg tcaaatccaa ctgcaagcgc tgcacgatgg attcttcgga cccgaaaagc 660
ccggcttaca tcattcctcg gcctggtggc gaagtcatct gcggcggtac ctatctcgtt 720
ggcaactatg acctttctgt cgacccggcg accatccccc ggatcctcaa acactgcctc 780
cgcctcgacc cctccatctc gaccgacggg acgctcgaag ggatcgaaat cctccgccac 840
aatgtcggac tccgccccgc ccgccgcggc ggtccccgcg tcgaactcga acgcgtctcg 900
ctcccgctca agcggggtca gtcgctcctc gcgctcggga cggcaaaggc tgccgagggc 960
aaagcgccac ggacggtgcc cgtcgtgcac gcttacgggt tctccagcgc gggttaccag 1020
cagggctggg gcgccgcgct cgaggtgcga gacttggtcg atcaggcgat cgggtcttcc 1080
tcctcttcct cgagtgggcg gcacctcgcc aagctctag 1119
<210> 2
<211> 372
<212> PRT
<213> 胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)
<400> 2
Met Thr Gln Asp Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ala Leu Ala Leu Ala Gln Lys Gly Tyr Lys Val His Val
20 25 30
Val Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Thr Val Ala Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Ser Lys Glu Ala Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ala Thr Phe Lys Gln Trp Val Asp
65 70 75 80
Leu Val Pro Gln Gly Leu Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
85 90 95
Ala Glu Asn Glu Ala Asp Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Val
100 105 110
Pro Asn Tyr Arg His Leu Asn Pro Ser Asp Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val Asn Ala Pro Lys Phe Cys Gln
130 135 140
Tyr Leu Gln Arg Glu Gly Gln Lys Leu Gly Val Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
Leu Val Thr Ser Leu Glu Gln Ile Ala Asp Gly Ala Asp Leu Ile Val
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Val Glu Asp Gln
180 185 190
Glu Val Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Asn Cys
195 200 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Lys Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Leu Val
225 230 235 240
Gly Asn Tyr Asp Leu Ser Val Asp Pro Ala Thr Ile Pro Arg Ile Leu
245 250 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Thr Asp Gly Thr Leu
260 265 270
Glu Gly Ile Glu Ile Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu Arg Val Ser Leu Pro Leu Lys
290 295 300
Arg Gly Gln Ser Leu Leu Ala Leu Gly Thr Ala Lys Ala Ala Glu Gly
305 310 315 320
Lys Ala Pro Arg Thr Val Pro Val Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser
325 330 335
Ala Gly Tyr Gln Gln Gly Trp Gly Ala Ala Leu Glu Val Arg Asp Leu
340 345 350
Val Asp Gln Ala Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Arg His
355 360 365
Leu Ala Lys Leu
370
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccgacgac gacgacaagg ccatgactca ggacaagcgc gtc 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtggtggtg gtggtggtgc tcgagctaga gcttggcgag gtgccg 46

Claims (10)

1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，所述D-氨基酸氧化酶的基因来源于胶红酵母，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其特征在于所述D-氨基酸氧化酶突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第54位、第58位、第213位、第223位、第225位发生单突变或多位点突变获得；
所述D-氨基酸氧化酶突变体为下列之一：第54位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-N54Q；或第213位蛋氨酸突变为丝氨酸及第223位酪氨酸突变为苯丙氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-M213S - Y223F；或第213位蛋氨酸突变为丙氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体DAAO-M213A；或第58位苯丙氨酸突变为酪氨酸及225位异亮氨酸突变为赖氨酸，为D-氨基酸氧化酶突变体F58Y -I225K。
2.一种基因，其特征在于所述基因编码权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体。
3.一种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求2所述基因。
4.一种应用，其特征在于所述应用为利用权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体催化D-氨基酸合成草酰乙酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为以含D-氨基酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵、离心、收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以D-天冬氨酸为底物，加入400U/mL的过氧化氢酶、1g/L的稳定保护剂的转化体系中，使用氨水调节pH为7.5，通气控制溶氧电极上显示的溶氧浓度为10-20%，在温度30～40℃的条件下反应2～4h生产草酰乙酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～20g/L，底物D-天冬氨酸浓度为10～40g/L。
7.权利要求3所述的工程菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将含D-氨基酸氧化酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～16h；接斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养4～8h；3L发酵罐中装入2.0 L培养基，以体积比1～10%接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～50%空气饱和度，用质量体积比为25%氨水调节pH值稳定在6.5～7.2，37℃培养4～12 h后加入IPTG至终浓度为0.5mM～1mM并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在1～5g/L发酵结束后10000 r/min、4 ℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得D-氨基酸氧化酶突变体全细胞催化剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的LB斜面培养基的制备方法：含有终浓度为5 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、5 g/LNaCl 、100mg/L氨苄西林和琼脂 20 g/L的混合溶液，调节其pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min；所述的LB液体种子培养基的制备方法：含有终浓度为5 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、5 g/LNaCl 和100mg/L氨苄西林的混合溶液，调节其pH为7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基的制备方法：含有终浓度为10 g/L甘油、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母浸粉，2 g/LMgSO4，15 g/LKH2PO4，2 g/L(NH4)2SO4，2 g/L大豆蛋白胨，1 g/LCaCl2和50 μg/LFAD的混合溶液，调节其pH至6.7～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的稳定保护剂为亚硫酸钠、半胱氨酸和EDTA中的一种或多种组合使用。
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