CN116284282A - tkt基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了tkt基因突变体及其在制备L‑赖氨酸中的应用。本发明公开的tkt基因突变体为序列表中SEQ ID No.3、5、7、9、11、13所示的DNA分子，编码SEQ ID No.4、6、8、10、12、14所示的蛋白质，野生型tkt基因为SEQ ID No.1所示的DNA分子，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。实验证明，本发明的tkt基因及其突变体均可提高L‑赖氨酸产量，可用于生产L‑赖氨酸，并具有很好的应用前景。

Description

tkt基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，tkt基因突变体及其在制备L-赖氨酸中的应用。
背景技术
L-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，L-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是赖氨酸的重要生产菌株。L-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。
对发酵法生产L-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供可以用于生产L-赖氨酸的蛋白质，所述蛋白质其名称为tkt蛋白质，tkt蛋白质为如下A1)或A2)或A3)：
A1)含有(或为)SEQ ID No.2所示的蛋白质，或将SEQ ID No.2的第327位丙氨酸残基突变为苏氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基得到的突变蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质除第327位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在其氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，为与A1)蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13或SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.1所示的DNA分子分别编码SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14和SEQ IDNo.2所示的蛋白质。
本发明还提供了与tkt蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码tkt蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)-b19)中的任一种：
b11)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
b12)序列表中SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b13)序列表中SEQ ID No.7所示的DNA分子；
b14)序列表中SEQ ID No.9所示的DNA分子；
b15)序列表中SEQ ID No.11所示的DNA分子；
b16)序列表中SEQ ID No.13所示的DNA分子；
b17)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
b18)与b11)-b17)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码tkt蛋白质的DNA分子；
b19)在严格条件下与b11)-b18)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码tkt蛋白质的基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码tkt蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的tkt蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码tkt蛋白质且具有tkt蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码tkt蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码tkt蛋白质的核酸分子的表达盒(tkt基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达tkt蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动tkt基因转录的启动子，还可包括终止tkt基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，B2)所述表达盒中的启动子可为SEQ ID No.15的第35-437位所示的DNA分子。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pXMJ19或pK18mobsacB质粒。
B3)所述重组载体可为pXMJ19-tkt、pXMJ19-tktA327T、pXMJ19-tktA327S、pXMJ19-tktA327C、pXMJ19-tktA327P、pXMJ19-tktA327N、pXMJ19-tktA327Q或pK18-tktA327T。
pXMJ19-tkt为将pXMJ19的Xbal I和BamHI识别序列间的DNA片段替换为SEQ IDNo.15所示的DNA片段得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327T与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327T为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.3所示的基因得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327S与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327S为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.5所示的基因得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327C与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327C为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.7所示的基因得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327P与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327P为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.9所示的基因得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327N与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327N为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.11所示的基因得到的重组载体；
pXMJ19-tktA327Q与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327Q为将pXMJ19-tkt中的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.13所示的基因得到的重组载体；
pK18-tktA327T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.6所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌、泛菌(Pantoea)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、短杆菌(Bacillus brevis)、乳酸短杆菌或黄色短杆菌。所述酵母可为酿酒酵母或毕赤酵母。
在本发明的一个实施例中，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
B4)所述重组微生物可为将含有SEQ ID No.1所示的tkt基因的微生物中的tkt基因替换为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.13得到的重组微生物，或向微生物中导入B1)所述核酸分子并使其得到表达得到的重组微生物。
在本发明的实施例中，所述重组微生物为重组菌ATCC13032-pXMJ19-tktA327T、ATCC13032-pXMJ19-tktA327S、ATCC13032-pXMJ19-tktA327C、ATCC13032-pXMJ19-tktA327P、ATCC13032-pXMJ19-tktA327N、ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q、YPL-tkt-1、tkt-1、YPL-tkt-2、YPL-tkt-3、tkt-2、tkt-3、YPL-tkt-4、tkt-4、YPL-tkt-5或tkt-5。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327T为将pXMJ19-tktA327T导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
ATCC13032-pXMJ19-tktA327S为将pXMJ19-tktA327S导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
ATCC13032-pXMJ19-tktA327C为将pXMJ19-tktA327C导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
ATCC13032-pXMJ19-tktA327P为将pXMJ19-tktA327P导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
ATCC13032-pXMJ19-tktA327N为将pXMJ19-tktA327N导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q为将pXMJ19-tktA327Q导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
YPL-tkt-1与谷氨酸棒状杆菌YP097158的区别仅在于：YPL-tkt-1为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ IDNo.3所示的基因，并保持其他序列不变得到的菌株；
tkt-1与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的区别仅在于：tkt-1为将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的SEQ ID No.1所示的基因替换为SEQ ID No.3所示的基因，并保持其他序列不变得到的菌株。
YPL-tkt-2是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为序列表中SEQ ID No.16所示的DNA片段，保持其它核苷酸不变得到的重组菌；
YPL-tkt-3是将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为序列表中SEQ ID No.17所示的DNA片段，保持其它核苷酸不变得到的重组菌；
tkt-2是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为序列表中SEQ ID No.16所示的DNA片段，保持其它核苷酸不变得到的重组菌；
tkt-3是将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为序列表中SEQ ID No.17所示的DNA片段，保持谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌；
YPL-tkt-4为将pXMJ19-tkt导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158得到的重组菌；
YPL-tkt-5为将pXMJ19-tktA327T导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)YP097158得到的重组菌；
tkt-4为将pXMJ19-tkt导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌；
tkt-5为将pXMJ19-tktA327T导入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032得到的重组菌。
本发明还提供了一种一种制备L-赖氨酸的方法，所述方法包括：使受体生物细胞中表达tkt蛋白质，或提高受体生物细胞中tkt蛋白质的含量或活性，或提高受体生物细胞中SEQ ID No.4或SEQ ID No.6或SEQ ID No.8或SEQ ID No.10或SEQ ID No.12或SEQ IDNo.14或SEQ ID No.2所示蛋白质的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-赖氨酸。
上述方法中，所述生物细胞可为能合成L-赖氨酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。
所述生物细胞为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。
上述方法中，所述细菌可为谷氨酸棒杆菌。
本发明的细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，任何含有序列表中SEQ ID No.1所示的tkt基因且可以合成L-赖氨酸均可利用本发明的SEQ IDNo.2、4、6、8、10、12或14所示的tkt突变蛋白质及其相关生物材料来生产L-赖氨酸，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌、泛菌(Pantoea)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、短杆菌(Bacillus brevis)、乳酸短杆菌或黄色短杆菌。所述酵母可为酿酒酵母或毕赤酵母。
在本发明的一个实施例中，所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YP097158或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
上述方法方法可通过向所述受体生物细胞中导入tkt蛋白质的编码基因并使其得到表达实现，或向所述受体生物细胞中导入SEQ ID No.4或SEQ ID No.6或SEQ ID No.8或SEQ ID No.10或SEQ ID No.12或SEQ ID No.14或SEQ ID No.2所示蛋白质的编码基因并使其得到表达实现；
或，所述受体生物细胞中含有SEQ ID No.1所示的DNA分子，所述方法通过将所述受体生物细胞中SEQ ID No.1所示的DNA分子替换为SEQ ID No.3或SEQ ID No.5或SEQ IDNo.7或SEQ ID No.9或SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示的DNA分子实现。
上述方法中，培养所述重组生物细胞可采用能使所述重组生物细胞生长的培养基进行；
和/或，培养所述重组生物细胞采用能使所述重组生物细胞生长的条件进行。
所述重组生物细胞可为上文所述重组微生物。
本发明还提供了一种用于制备L-赖氨酸的产品，所述产品含有(或其活性成分为)tkt或所述生物材料。
tkt或所述生物材料在生产L-赖氨酸中的应用，或在制备用于生产L-赖氨酸产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
tkt或所述生物材料或所述制备L-赖氨酸的方法或所述用于制备L-赖氨酸的产品在制备含有L-赖氨酸的食品、饲料或药品中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明的tkt与其生物材料可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸，所生产的产物还可为谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。
实验证明，本发明的蛋白质及其相关生物材料可提高L-赖氨酸产量，可用于生产L-赖氨酸，具有很好的应用前景。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
生物材料保藏说明
分类命名：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)
菌株编号：YP097158
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101
保藏日期：2016年8月16日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12856
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、构建包含tkt基因突变体的ATCC13032菌株
一、tkt基因突变体质粒的构建
首先将野生型tkt基因(序列如SEQ ID No.1)及其启动子克隆到表达载体pXMJ19中。以NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032基因组序列为模板，以引物tkt-F/tkt-R进行PCR扩增，获得野生型tkt启动子及编码区片段2689bp(序列如SEQ ID No.15)。该片段回收后与经Xbal I和BamH I酶切回收的表达载体pXMJ19(TaKaRa公司，含有氯霉素抗性)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养12h，对培养长出的单克隆用引物tkt-F/tkt-R进行PCR鉴定，PCR能扩增出大小为2689bp片段的为含tkt启动子及编码区序列的阳性转化子pXMJ19-tkt。
为了获得编码tkt基因的突变体，使用随机诱变试剂盒(Agilent Technologies,USA)制备tkt突变型基因质粒。以上述构建好的质粒pXMJ19-tkt为模板，引物tkt-F/tkt-R进行PCR扩增，获得了包含随机点突变的tkt基因编码区及启动子区片段(序列如SEQ IDNo.15，但tkt编码区存在随机点突变)。
回收的DNA片段与经Xbal I和BamH I酶切回收的表达载体pXMJ19(TaKaRa公司，含有氯霉素抗性)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养12h。对培养长出的单克隆用引物tkt-F/tkt-R进行PCR鉴定，PCR能扩增出大小为2689bp(序列如SEQ ID No.15，但tkt编码区存在随机点突变)片段的为含tkt基因随机突变的pXMJ19-tkt-MT阳性转化子。
其中，SEQ ID No.15的第35-437位所示为tkt基因启动子。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
tkt-F:5'-CAGAATAATTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTTCACAGCGGACGATTTC-3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19同源序列)，
tkt-R:5'-CCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGAGCTCGGTACCAGGCAAGTAAGGGATGTGC-3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19同源序列)。
二、含突变型tkt基因质粒的菌株的构建
为了鉴定步骤一中构建的突变载体pXMJ19-tkt-MT在L-氨基酸中的生产性能，具体地，将步骤一中构建的不同的tkt随机突变质粒通过电击转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株中(具体转化方法参见WO2014121669A1)，通过引物tkt-F/tkt-R进行PCR鉴定，PCR能扩增出大小为2689bp的为阳性转化子。将阳性转化子在氯霉素(34mg/L)的培养平板上(培养基成分和培养条件参见表1)连续传代三次后，接种到装有丰富培养基30mL的500mL三角瓶中30℃摇瓶发酵48h。发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)检测L-氨基酸的浓度，如表2所示，挑选具有比野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032对照的各L-氨基酸生产能力优越的菌株，即为ATCC13032-pXMJ19-tkt突变株。
丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 2g/L，H3PO40.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，甜菜碱0.5g/L，柠檬酸2g/L，VH 20mg/L，VB11.5mg/L，VB3 1.5mg/L VB12 1.5g/L，氢氧化钠调节pH7.0.
表1、培养基的组成和培养条件
Figure BDA0004131376910000071
Figure BDA0004131376910000081
表2、ATCC13032-pXMJ19-tkt突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果
Figure BDA0004131376910000082
如表2中所示，谷氨酸棒杆菌ATCC13032-pXMJ19-tkt突变株具有产部分L-赖氨酸的能力，其中ATCC13032-pXMJ19-tkt突变株3产L-赖氨酸的能力更优越，表明tkt基因突变株3有合成L-赖氨酸的活性。
将ATCC13032-pXMJ19-tkt突变株3提取质粒，对tkt基因进行测序，结果确认为tkt基因编码区核苷酸序列的第979位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)(序列如SEQ ID No.3所示，将含有该突变的基因记为tktA327T基因)，对应氨基酸序列中的第327位丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)(序列如SEQ ID No.4所示，将含有该突变的蛋白质记为tktA327T蛋白质)，将该质粒记为pXMJ19-tktA327T，将含有该质粒的突变株重新命名，即ATCC13032-pXMJ19-tktA327T。
pXMJ19-tktA327T与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327T为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327T基因序列得到的重组载体，pXMJ19-tktA327T能表达tktA327T突变蛋白质；野生型tkt基因与突变型tktA327T基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327T基因的第979-981位为ACT；野生型tkt蛋白质与tktA327T突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327T突变蛋白质的第327位为苏氨酸残基T。
三、tkt基因突变株与重组载体的构建
以随机突变的方式利用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032获得了突变菌株ATCC13032-pXMJ19-tktA327T。为了获得更多tkt突变株以提高其L-赖氨酸的生产能力，构建了与上述tkt突变位置相同而氨基酸不同的突变体。具体地，以步骤二中测序的质粒pXMJ19-tktA327T为模板，构建了其中在tkt第327位氨基酸用不同氨基酸取代的5种突变体，取代的氨基酸均为亲水氨基酸，突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如表3。
表3、tkt突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称
Figure BDA0004131376910000091
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
S-PR-1:5'-CCATGCAGCCTTCTTCTGTGCAGAGCGCTCTG-3'，
S-PR-2:5'-CAGAGCGCTCTGCACAGAAGAAGGCTGCATGG-3'，
C-PR-1:5'-CCATGCAGCCTTCTTCTGTGCACAGCGCTCTG-3'，
C-PR-2:5'-CAGAGCGCTGTGCACAGAAGAAGGCTGCATGG-3'，
P-PR-1:5'-CCATGCAGCCTTCTTCTGTGCAGGGCGCTCTG-3'，
P-PR-2:5'-CAGAGCGCCCTGCACAGAAGAAGGCTGCATGG-3'，
N-PR-1:5'-CCATGCAGCCTTCTTCTGTGCATTGCGCTCTG-3'，
N-PR-2:5'-CAGAGCGCAATGCACAGAAGAAGGCTGCATGG-3'，
Q-PR-1:5'-CCATGCAGCCTTCTTCTGTGCCTGGCGCTCTG-3'，
Q-PR-2:5'-CAGAGCGCCAGGCACAGAAGAAGGCTGCATGG-3'。
以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以表2中的引物tkt-F/S-PR-1和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得一条带有tkt突变碱基的Up DNA片段1405bp；以引物S-PR-2/tkt-R和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得和一条带有tkt突变碱基的DownDNA片段1248bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收，回收后的DNA片段与经Xbal I和BamH I酶切回收的表达载体pXMJ19用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5α，涂布到含有氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养12h。对培养长出的单克隆用引物tkt-F/tkt-R进行PCR鉴定，能扩增出含有大小2689bp片段的为tkt基因编码的蛋白质的第327位丙氨酸突变为色氨酸的阳性转化子ATCC13032-pXMJ19-tktA327S，其它四株菌均以同样的方式进行构建，其中在第327位的丙氨酸用表3中的各氨基酸取代的5种pXMJ19-tkt突变载体与菌株如表3中所列的名称进行命名，得到突变株ATCC13032-pXMJ19-tktA327C、ATCC13032-pXMJ19-tktA327P、ATCC13032-pXMJ19-tktA327N、ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327S含有重组载体pXMJ19-tktA327S，pXMJ19-tktA327S与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327S为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327S基因序列(如SEQ ID No.5所示)得到的重组载体，pXMJ19-tktA327S能表达tktA327S突变蛋白质(如SEQ ID No.6所示)；野生型tkt基因与突变型tktA327S基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327S基因的第979-981位为TCT；野生型tkt蛋白质与tktA327S突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327S突变蛋白质的第327位为丝氨酸残基S。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327C含有重组载体pXMJ19-tktA327C，pXMJ19-tktA327C与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327C为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327C基因序列(如SEQ ID No.7所示)得到的重组载体，pXMJ19-tktA327C能表达tktA327C突变蛋白质(如SEQ ID No.8所示)；野生型tkt基因与突变型tktA327C基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327C基因的第979-981位为TGT；野生型tkt蛋白质与tktA327C突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327C突变蛋白质的第327位为半胱氨酸残基C。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327P含有重组载体pXMJ19-tktA327P，pXMJ19-tktA327P与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327P为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327P基因序列(如SEQ ID No.9所示)得到的重组载体，pXMJ19-tktA327P能表达tktA327P突变蛋白质(如SEQ ID No.10所示)；野生型tkt基因与突变型tktA327P基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327P基因的第979-981位为CCT；野生型tkt蛋白质与tktA327P突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327P突变蛋白质的第327位为脯氨酸残基P。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327N含有重组载体pXMJ19-tktA327N，pXMJ19-tktA327N与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327N为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327N基因序列(如SEQ ID No.11所示)得到的重组载体，pXMJ19-tktA327N能表达tktA327N突变蛋白质(如SEQ ID No.12所示)；野生型tkt基因与突变型tktA327N基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327N基因的第979-981位为AAT；野生型tkt蛋白质与tktA327N突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327N突变蛋白质的第327位为天冬酰胺残基N。
ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q含有重组载体pXMJ19-tktA327Q，pXMJ19-tktA327Q与pXMJ19-tkt的区别在于，pXMJ19-tktA327Q为将pXMJ19-tkt中的野生型tkt基因替换为突变型tktA327Q基因序列(如SEQ ID No.13所示)得到的重组载体，pXMJ19-tktA327Q能表达tktA327Q突变蛋白质(如SEQ ID No.14所示)；野生型tkt基因与突变型tktA327Q基因的区别仅在于，野生型tkt基因的第979-981位为GCT，突变型tktA327Q基因的第979-981位为CAG；野生型tkt蛋白质与tktA327Q突变蛋白质的区别仅在于，野生型tkt蛋白质的第327位为丙氨酸残基A，tktA327Q突变蛋白质的第327位为谷氨酰胺残基Q。
四、tkt突变型菌株产L-赖氨酸能力的检测
为了鉴定步骤三中构建的突变载体对L-赖氨酸的生产性能，具体地，将步骤三中构建的5个重组菌以及步骤二的ATCC13032-pXMJ19-tktA327T分别在氯霉素(34mg/L)的培养平板上连续传代三次后，接种到装有30mL丰富培养基的500mL三角瓶中37℃摇瓶发酵48h，发酵培养结束后采用高效液相色谱法(HPLC)分析L-赖氨酸的浓度，利用野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032作为对照。
结果如表4所示，各突变株的L-赖氨酸产量均显著高于野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，而突变株ATCC13032-pXMJ19-tktA327T产L-赖氨酸的能力比ATCC13032-pXMJ19-tktA327S、ATCC13032-pXMJ19-tktA327C、ATCC13032-pXMJ19-tktA327P、ATCC13032-pXMJ19-tktA327N和ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q更优越，说明tkt蛋白质的第327位丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)更有利于赖氨酸的积累。
表4、W3110-tkt突变株的高效液相色谱法检测L-酪氨酸的结果
菌株 L-赖氨酸(g/100mL)
ATCC13032 0.002
ATCC13032-pXMJ19-tktA327T 0.585
ATCC13032-pXMJ19-tktA327S 0.138
ATCC13032-pXMJ19-tktA327C 0.076
ATCC13032-pXMJ19-tktA327P 0.084
ATCC13032-pXMJ19-tktA327N 0.113
ATCC13032-pXMJ19-tktA327Q 0.071
实施例2、构建包含点突变的tkt基因编码区的重组载体
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增tkt基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)YP097158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355)的tkt基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将tkt基因的核苷酸序列(SEQ IDNo.1)中的第979位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的tkt基因，名称为tktA327T基因)。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质。SEQID No.3所示的DNA分子(tktA327T基因)编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(突变蛋白质名称为tktA327T蛋白质)。突变蛋白质tktA327T氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第327位苏氨酸(T)由丙氨酸(A)突变而来。
采用NEBuilder组装进行重组载体构建，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：
P1:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGTCATTGCTTCTGATGG-3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)，
P2:5'-
Figure BDA0004131376910000112
，/>
P3:5'-
Figure BDA0004131376910000111
，
P4:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGGAGAAGATGAGGAAGGTTC-3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为514bp和482bp的tkt基因编码区的DNA片段(tktUp和tktDown)。
将上述两条DNA片段(tktUp和tktDown)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(Xbal I/BamHI)后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用引物P1/P4进行PCR鉴定，能扩增出大小为964bp片段的为阳性重组载体pK18-tktA327T，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。将酶切正确的重组载体pK18-tktA327T送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(G979A)的重组载体pK18-tktA327T保存备用。
此重组载体pK18-tktA327T含有突变位点(G979A)，将导致菌株谷氨酸棒杆菌YP097158中tkt基因(SEQ ID No.1)编码区的第979位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白的第327位丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。
所述重组载体pK18-tktA327T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamHI识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.6所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体，所述重组载体pK18-tktA327T含有SEQ ID No.3所示的突变基因tktA327T的突变位点(G979A)。
实施例3、构建包含基因tktA327T的工程菌株
将实施例2中构建好的等位替换质粒(pK18-tktA327T)通过电击转化入谷氨酸棒状杆菌菌株YP097158中(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的tkt基因编码区)及野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032中，在含卡那霉素(50mg/L)的固体培养平板上培养40h。对培养产生的单菌落分别通过实施例2中的引物P1/P4进行鉴定，能扩增出964bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上(该培养基是将表1中的培养基中蔗糖的浓度提高至150g/L得到的培养基)划线培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用引物P1/P4进行PCR扩增，将得到的多个DNA片段(964bp)进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(G979A)的菌株为等位替换成功的阳性菌株。将由谷氨酸棒状杆菌YP097158及野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032得到的阳性菌株分别命名为YPL-tkt-1、tkt-1。
重组菌YPL-tkt-1和tkt-1均含有SEQ ID No.3所示的突变的基因tktA327T，并均能表达SEQ ID No.4所示的tktA327T蛋白质。重组菌YPL-tkt-1与谷氨酸棒状杆菌YP097158的区别仅在于：YPL-tkt-1为将谷氨酸棒状杆菌YP097158的tkt基因替换为tktA327T基因，并保持其他序列不变得到的菌株；重组菌tkt-1与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的区别仅在于：tkt-1为将野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的tkt基因替换为tktA327T基因，并保持其他序列不变得到的菌株。含有突变的tktA327T基因的重组菌可以显著和稳定地提高tktA327T基因的表达量。
实施例4、构建基因组上过表达tkt基因或tktA327T基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及tkt或tktA327T基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中插入tkt或tktA327T基因拷贝。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P5:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列),
P6:5'GAAATCGTCCGCTGTGAAGTGCACCGAGAACAGATG3',
P7:5'CATCTGTTCTCGGTGCACTTCACAGCGGACGATTTC3',
P8:5'GATTTAATTGCGCCATCTGAGGCAAGTAAGGGATGTGC3',
P9:5'GCACATCCCTTACTTGCCTCAGATGGCGCAATTAAATC3',
P10:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物P5/P6，P7/P8，P9/P10进行PCR扩增，获得上游同源臂片段763bp(对应于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032NCgl1740部分编码区以及NCgl1741基因及其启动子区)，tkt基因及其启动子片段2621bp(序列如SEQ ID No.16所示)及下游同源臂片段596bp(对应于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032NCgl1742基因部分编码区)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I和BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用引物M13F/M13R经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，所得重组载体为pK18-tktOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。SEQ ID No.16中，第1-403位为tkt基因的启动子，第404-2506位为tkt基因。
M13F：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，
M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。
以谷氨酸棒状杆菌YPL-tkt-1为模板，分别以引物P5/P6，P7/P8，P9/P10进行PCR扩增，获得上游同源臂片段763bp(对应于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 NCgl1740部分编码区以及NCgl1741基因及其启动子区)，tktA327T基因及其启动子片段2621bp(序列如SEQ ID No.17所示)及下游同源臂片段596bp(对应于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032 NCgl1742基因部分编码区)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I和BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用引物M13F/M13R经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，所得重组载体为pK18-tktA327TOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。SEQ ID No.17中，第1-403位为tktA327T基因的启动子，第404-2506位为tktA327T基因。
将测序正确的整合质粒(pK18-tktOE、pK18-tktA327TOE)分别电转化入谷氨酸棒状杆菌菌株YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中培养30h，对培养产生的单菌落通过P11/P12引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1559bp片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的固体培养平板上划线培养30h，对培养产生的单菌落进一步采用P13/P14引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1559bp的菌为tkt或tktA327T基因及其启动子整合到谷氨酸棒状杆菌基因组上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区上的阳性菌株。将以谷氨酸棒状杆菌YP097158为出发菌获得的菌株分别命名为YPL-tkt-2(不含突变点)和YPL-tkt-3(含突变点)；将以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌获得的菌株分别命名为tkt-2(不含突变点)和tkt-3(含突变点)。
重组菌YPL-tkt-2含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的tkt基因；具体地，重组菌YPL-tkt-2是将谷氨酸棒状杆菌YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为SEQ ID No.16所示的DNA片段(SEQ ID No.16的第1-403位所示为启动子，第404-2506位所示为tkt基因)，保持谷氨酸棒状杆菌YP097158的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝tkt基因的重组菌可以显著和稳定地提高tkt基因的表达量。
重组菌tkt-2含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的tkt基因；具体地，重组菌tkt-2是将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为SEQ ID No.16所示的DNA片段，保持谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝tkt基因的重组菌可以显著和稳定地提高tkt基因的表达量。
重组菌YPL-tkt-3含有SEQ ID No.3所示的突变的tktA327T基因；具体地，重组菌YPL-tkt-3是将谷氨酸棒状杆菌YP097158的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为SEQ ID No.17所示的DNA片段(SEQ ID No.17的第1-403位所示为启动子，第404-2506位所示为tktA327T基因)，保持谷氨酸棒状杆菌YP097158的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌tkt-3含有SEQ ID No.3所示的突变的tktA327T基因；具体地，重组菌tkt-3是将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组中上同源臂NCgl1741和下同源臂NCgl1742的间隔区替换为SEQ ID No.17所示的DNA片段，保持谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
PCR鉴定引物如下所示：
P11:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(对应上同源臂NCgl1740的外侧)，
P12:5'GCCACAAGAAAGAACGAAG 3'(对应tkt基因内部)，
P13:5'CATCCTCAACGGCATTTC 3'(对应tkt基因内部)，
P14:5'TGGTCGTTGGAATCTTGC 3'(对应下同源臂NCgl1742的外侧)。
实施例5、构建质粒上过表达tkt基因或tktA327T基因的工程菌株
将实施例1中构建成功的pXMJ19-tkt和pXMJ19-tktA327T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YP097158及野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中(培养基成分参见表1)培养30h，对培养产生的单菌落通过引物tkt-F/tkt-R进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小2689bp片段(序列如SEQ ID No.15所示)的为阳性菌株。以谷氨酸棒状杆菌YP097158为出发菌获得的菌株分别被命名为YPL-tkt-4(含质粒pXMJ19-tkt)和YPL-tkt-5(含质粒pXMJ19-tktA327T)；以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌获得的菌株分别命名为tkt-4(含质粒pXMJ19-tkt)和tkt-5(含质粒pXMJ19-tktA327T)。
重组菌YPL-tkt-4和tkt-4含有SEQ ID No.1所示的tkt基因的质粒，可以显著和稳定地提高tkt基因的表达量。
重组菌YPL-tkt-5和tkt-5含有SEQ ID No.3所示的突变的tktA327T基因的质粒，可以显著和稳定地提高tkt基因的表达量。
实施例6、构建基因组上缺失tkt基因的工程菌株
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增tkt基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P15:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGAAATAGATGGGTGTAGACG 3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)，
P16:5'GCAAGGAACGGAAACAACGCCTTCAGGTCATCCATCTC3'，
P17:5'GAGATGGATGACCTGAAGGCGTTGTTTCCGTTCCTTGC3'，
P18:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATCAACCTTTGCCCACAG 3'(带下划线的核苷酸序列为pK18上的序列)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物P15/P16和P17/P18进行PCR扩增，获得敲除tkt的上游同源臂片段772bp及下游同源臂片段824bp。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(Addgene公司)用NEBuilder酶(NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用引物M13F/M13R经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-Δtkt，该质粒含有卡那霉素抗性作为筛选标记，将该质粒送测序。
将测序正确的敲除质粒pK18-Δtkt电转化入谷氨酸棒杆菌YP097158和野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，在培养基中培养30h，对培养产生的单菌落通过引物P15/P18进行PCR鉴定：同时能扩增出大小为1596bp及3106bp条带的菌株为阳性菌株，只扩增出3106bp条带的菌株为原菌。将阳性菌株在15％蔗糖固体培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养30h，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用引物P15/P18进行PCR鉴定，扩增出大小为1596bp条带的菌株为tkt基因部分编码区被敲除的阳性菌株。再次通过P15/P18引物PCR扩增阳性菌株tkt片段进行测序，将测序正确的菌株命名为YPL-tkt-6(谷氨酸棒状杆菌YP097158基因组上的tkt基因被敲除)和tkt-6(野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的tkt基因被敲除)。
实施例7、L-赖氨酸发酵实验
将实施例2-6中构建的菌株和谷氨酸棒状杆菌原始菌株YP097158和野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以表5所示的培养基和表6所示的控制工艺进行发酵实验，发酵结束后采用茚三酮比色法检测L-赖氨酸产量，每个菌株重复三次，结果如表7所示。
表5、发酵培养基配方
Figure BDA0004131376910000151
Figure BDA0004131376910000161
表6、发酵控制工艺
Figure BDA0004131376910000162
表7、tkt工程菌株的L-赖氨酸产量以及显著性分析
Figure BDA0004131376910000163
结果如表7所示，在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中对tkt基因编码区进行点突变(G979A)及过表达tkt或者tktA327T基因，均有助于L-赖氨酸产量的提高；而对tkt基因进行弱化或敲除，则不利于L-赖氨酸的积累。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
本发明所涉及序列如下：
SEQ ID No.1：tkt基因野生型ORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000171
SEQ ID No.2：tkt蛋白序列(即SEQ ID No.1编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000172
SEQ ID No.3：基因突变型tktA327TORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000173
/>
Figure BDA0004131376910000181
SEQ ID No.4：基因突变型tktA327T蛋白序列(即SEQ ID No.3编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000182
SEQ ID No.5：基因突变型tktA327SORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000183
/>
Figure BDA0004131376910000191
SEQ ID No.6：基因突变型tktA327S蛋白序列(即SEQ ID No.5编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000192
SEQ ID No.7：基因突变型tktA327C ORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000193
SEQ ID No.8：基因突变型tktA327C蛋白序列(即SEQ ID No.7编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000194
SEQ ID No.9：基因突变型tktA327P ORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000195
Figure BDA0004131376910000201
SEQ ID No.10：基因突变型tktA327P蛋白序列(即SEQ ID No.9编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000202
SEQ ID No.11：基因突变型tktA327NORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000203
Figure BDA0004131376910000211
SEQ ID No.12：基因突变型tktA327N蛋白序列(即SEQ ID No.11编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000212
SEQ ID No.13：基因突变型tktA327QORF(CDS)序列(核苷酸序列2103bp)
Figure BDA0004131376910000213
SEQ ID No.14：基因突变型tktA327Q蛋白序列(即SEQ ID No.13编码的氨基酸序列700aa)
Figure BDA0004131376910000214
SEQ ID No.15：引物tkt-F/tkt-R扩增序列(大小2689bp)
Figure BDA0004131376910000215
/>
Figure BDA0004131376910000221
SEQ ID No.16：基因组整合的P7/P8tkt及其启动子序列(2621bp)
Figure BDA0004131376910000222
Figure BDA0004131376910000231
SEQ ID No.17：基因组整合的P7/P8 tktA327T及其启动子序列(2621bp)
Figure BDA0004131376910000232
/>

Claims (10)

1.蛋白质，为如下A1)或A2)或A3)：
A1)包含SEQ ID No.2所示的蛋白质，或将SEQ ID No.2的第327位丙氨酸残基突变为苏氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、苯丙氨酸残基、亮氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、天冬氨酸残基、甲硫氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酸残基、甘氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、色氨酸残基或酪氨酸残基得到的突变蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质除第327位外的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)-b19)中的任一种：
b11)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
b12)序列表中SEQ ID No.5所示的DNA分子；
b13)序列表中SEQ ID No.7所示的DNA分子；
b14)序列表中SEQ ID No.9所示的DNA分子；
b15)序列表中SEQ ID No.11所示的DNA分子；
b16)序列表中SEQ ID No.13所示的DNA分子；
b17)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
b18)与b11)-b17)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
b19)在严格条件下与b11)-b18)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的基因组DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：B2)所述表达盒中的启动子为SEQID No.15的第35-437位所示的DNA分子；
B4)所述重组微生物为将含有SEQ ID No.1所示的tkt基因的微生物中的tkt基因替换为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13得到的重组微生物，或向微生物中导入B1)所述核酸分子并使其得到表达得到的重组微生物。
5.一种制备L-赖氨酸的方法，包括：使受体生物细胞中表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体生物细胞中权利要求1所述蛋白质的含量或活性，或提高受体生物细胞中SEQ IDNo.4或SEQ ID No.6或SEQ ID No.8或SEQ ID No.10或SEQ ID No.12或SEQ ID No.14或SEQID No.2所示蛋白质的含量或活性，得到重组生物细胞；培养所述重组生物细胞，得到L-赖氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为能合成L-赖氨酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述细菌为谷氨酸棒杆菌。
8.一种用于制备L-赖氨酸的产品，含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料。
9.权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在生产L-赖氨酸中的应用，或在制备用于生产L-赖氨酸产品中的应用。
10.权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料或权利要求5-7中任一所述方法或权利要求8所述产品在制备含有L-赖氨酸的食品、饲料或药品中的应用。
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