CN116064446A - 一种d-氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一种d-氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种D‑氨基酸氧化酶突变体及其编码基因，以及利用该突变体构建的基因工程菌在酶法拆分外消旋型草铵膦生成PPO的应用。所述D‑氨基酸氧化酶突变体当与包含SEQ ID NO.1所示序列的D‑氨基酸氧化酶的氨基酸序列比对时，所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列包含对应于第54位，第213位，第233位，第335位和/或第341位的氨基酸残基的替换，并且所述D‑氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的同一性。本发明构建的基因工程菌具有高产D‑氨基酸氧化酶的性质，用于催化D‑PPT的氧化反应，可在6h内达到49.5％的转化率，转化效率远高于野生型DAAO的转化效率，可用于微生物酶法拆分外消旋型草铵膦。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
草铵膦铵盐(简称PPT)是1986年由德国赫斯特公司开发的一种非选择性除草剂，其化学名为2-氨基-4-(羟甲基膦基)丁酸，是一种亲水性的氨基酸类除草剂，具有活性高、有效用量少、杀草迅速、作用杂草种类多、在土壤中易降解、对于周边环境的压力小等优点。是目前用量仅次于草甘膦的世界第二大转基因作物耐受除草剂，其市场需求量随着转基因作物的快速发展而大大增加。草铵膦分子内有一个手性碳原子(C2)，其具有两种不同的构型，其中只有L-草铵膦具有除草活性，且在土壤中易分解，对环境的压力较小。商业化应用的草铵膦除草剂通常由D，L-草铵膦的外消旋混合物组成，其中含有50％的D-草铵膦无除草活性，因此通过将D-草铵膦转化为L-草铵膦，能够减少草铵膦除草剂一半的用量，这对于降低应用成本，提高原子经济性以及减轻环境压力具有重要意义。
目前的L-草铵膦主流制备方法包括化学法和生物催化法。由于化学法存在步骤繁琐、成本偏高、产品光学纯度偏低以及用到大量有机试剂或剧毒试剂，安全性较差且环境不友好等缺点。目前精草铵膦生产厂家基本都采用生物法生产。生物催化法生产草铵膦具有反应条件温和、立体选择性高、收率高等优点，是工业化制备L-草铵膦的重要趋势。主要包括酶法合成法和酶法拆分法两类：
(1)酶法合成法主要以以L-草铵膦的衍生物(如N-苯乙酰-D,L-草铵膦或草铵膦腈胺)为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。
(2)酶法拆分法利用外消旋的D,L-草铵膦为底物，通过两步酶法进行选择性拆分，将D型草铵膦通过D-氨基酸氧化酶(DAAO)转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)，并进一步还原为L-草铵膦，同时保留原有质量分数为50％的L-草铵膦。该法具有原料简单易得，成本较低，工艺简单以及绿色环保等优势，具有较高的工业化应用价值。但由于D-草铵膦属于非天然底物，野生型D-氨基酸氧化酶无法识别，导致催化效率低下，限制了其工业应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种D-氨基酸氧化酶的突变体、表达载体、基因工程菌及其构建方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种D-氨基酸氧化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在同一个技术构思下，本发明还提供一种D-氨基酸氧化酶突变体的表达载体包含编码所述D-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸。
在同一个技术构思下，本发明还提供一种D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌由所述表达载体通过常规转化或转染技术引入宿主细胞后获得。
优选的，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)中的至少一种。
在同一个技术构思下，本发明还提供一种所述D-氨基酸氧化酶突变体基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)参照SEQ ID NO.1所示的D-氨基酸氧化酶氨基酸序列，确定D-氨基酸氧化酶突变位点为如SEQ ID NO:3所示的D-氨基酸氧化酶序列的第54位的氨基酸残基的替换为N54T，第213位的氨基酸残基的替换为M213T，第223位的氨基酸残基的替换为Y223F，第335位的氨基酸残基的替换为S335Q，第341位的氨基酸残基的替换为S341G，设计突变引物，进行突变PCR；(2)将PCR得到的产物中进行酶切处理，结束后将产物转化至感受态细胞，培养并提取重组表达载体；所述表达载体可以是可方便地进行重组DNA程序并且可引起D-氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸表达的任何载体(例如质粒或病毒)。优选的，步骤(2)所述的表达载体可以采用pET28、pET29、pET30系列载体中的其中一种。(3)将重组表达载体转入表达到宿主细胞中，获得D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。
在一些实施方式中，所述重组宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞属于酵母属(Saccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏杆菌属(Escherichia)；优选地属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)中的至少一种。
优选的，步骤(1)所述PCR扩增采用以下定点突变引物：
1)N54T-f的引物序列：5’-gggccggtgcaacctggacccctcagatgaccctgacc-3’；
2)N54T-r的引物序列：5’-ggggtccaggttgcaccggcccacggacttgcaaaagtc-3’；
3)M213T-f的引物序列：5’-cgttgtacaaccgatagcagcgatccagcaagcccg-3’；
4)M213T-r的引物序列：5’-gctgctatcggttgtacaacgtttacacgggcttttaac-3’；
5)S335Q-f的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgca-3’；
6)S335Q-r的引物序列：5’-gataaccggcctggctaaaaccgtatgcatgaac-3’。
7)Y223F-f的引物序列：5’-caagcccggcatttattattcctcgtccgggtggtgaag-3’；
8)Y223F-r的引物序列：5’-gaggaataataaatgccgggcttgctggatcgctgctatc-3’；
9)S341G-f的引物序列：5’-gttatcagcagggttggggtgcagcagaagatgttg-3’；
10)S341G-r的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgc-3’。
可以通过常规转化或转染技术将本申请的表达载体引入原核或真核细胞中。在本文中使用时，术语“转化”和“转染”是指在用于将外来核酸(例如DNA)引入本领域技术人员公知的宿主细胞中的多种本领域公认的技术。
本申请所述的“D-氨基酸氧化酶突变体”具有D-氨基酸氧化酶活性，即将D-氨基酸转化成酮酸(酮酸种类由D-氨基酸底物决定)、氨和过氧化氢的活性，特别地，本申请所述的D-氨基酸氧化酶突变体具有将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)的活性。
在同一个技术构思下，本发明还提供一种D-氨基酸氧化酶突变体在酶法拆分外消旋D,L-草铵膦中的应用。
优选的，所述D-氨基酸氧化酶突变体生产L-草铵膦将D-草铵膦转化为生产L-草铵膦的关键中间体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时保留原有外消旋D,L-草铵膦中质量分数占比为40-60％的L-草铵膦。
在一些实施方式中，所述D-草胺膦最初存在于D-和L-草胺膦或其盐的外消旋混合物中。外消旋的草胺膦起始原料可以以多种形式提供。可使用外消旋草胺膦的各种盐，诸如铵盐和盐酸盐，或两性离子。
优选的，具体包括以下步骤：
在多酶催化体系下通过使用D-氨基酸氧化酶使外消旋D，L-草铵膦中的D-草铵膦发生氧化转化反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，拆分后保留的L-草铵膦在底物D,L-草铵膦中的质量分数占比为40-60％；并使用过氧化氢酶使副产物过氧化氢分解为水和氧气。
在一些实施方式中，所述酶催化体系中还包括过氧化氢酶。所述过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢以防止过氧化氢的积累对酶催化剂造成的毒害作用。过氧化氢酶可以为本领域已知的任何具有过氧化氢酶活性的酶，例如购自上海源叶生物科技有限公司，商品编号为CAS9001-05-2的过氧化氢酶。
优选的，所述多酶催化体系包括：用于将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体，用于将副产物过氧化氢转化为水和氧气的过氧化氢酶。
优选的，所述酶催化体系中的每种酶的形式各自独立地选自：游离酶和/或引入酶的表达载体的宿主细胞。
优选的，其中，以湿菌体重量计，所述引入酶的表达载体的宿主细胞的总添加量为1-200g/L反应液。
优选的，所述酶催化转化反应在pH为7-10的反应液体系中进行，优选地，所述反应体系的pH为8-9。
优选的，所述D-氨基酸氧化酶突变体催化的D，L-PPT的氧化反应的反应温度为25-45℃，时间为6-24h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请所述D-氨基酸氧化酶突变体具有更高的催化效率，具有对D-草铵膦较高的催化活性，能够应用于生物酶法去消旋化制备L-草铵膦。当使用外消旋型D,L-草铵膦为底物进行催化转化反应时，转化率远高于野生型，PPO产率也大幅提升，同时保留了底物中原有的L-草铵膦，提高了底物利用率，大幅降低成本。
本申请中所用的术语“催化效率”是指D-氨基酸氧化酶允许其将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的性质。在一个实施方案中，与野生型或参照D-氨基酸氧化酶相比，本申请的D-氨基酸氧化酶突变体的催化效率得以增强。
在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸序列与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，所述D-氨基酸氧化酶突变体包含与野生型酶相比具有一个或几个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸替换、缺失和/或插入的氨基酸序列和/或与野生型酶相比具有一个或多个截短的氨基酸序列。
(2)在多酶催化体系去消旋拆分D，L-草铵膦，液相检测PPO的生成量，计算获得底物的转化率如图1所示。制备的PPO，底物转化率≥49.95％，反应步骤简单，反应条件温和，原料价格低廉，产物分离简便，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。
(3)本申请所述的方法用于在同一个反应容器中进行，同时产物的产率可以通过本领域已知的任何方法测量，如通过高效液相色谱(HPLC)来测量所获得的产物中PPO的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1、对比例1、对比例2中测定PPO的生成量来比较D-氨基酸氧化酶与其突变体的催化效率；
图2是实施例1、对比例1、对比例2中多酶催化体系去消旋拆分D，L-草铵膦的机理示意图；
图3为D-氨基酸氧化酶SDS-PAGE图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
(1)基因工程菌的构建。
将来源于纤细红酵母(Rhodotorulagracilis)的D-氨基酸氧化酶(DAAO，GenBank号：Z71657.1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)的基因序列送往北京擎科生物科技有限公司进行全基因合成后，克隆到表达质粒pET-30a(+)上，得到pET-30a-daao，并插入酶切位点为BamHI和XhoI。测序验证无误后将pET-30a-daao转入表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中用于后续重组D-氨基酸氧化酶的表达及后续突变体的构建。
(2)工程菌体的培养
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min待用。LB液体固体培养基组成(平板)：在LB液体培养基的基础上加入琼脂粉2％w/v，115℃灭菌30min，冷却至50-60℃，加入100mg/mL卡那霉素(Kan)，使其终浓度达50μg/ml，倒入培养皿中，冷却凝固后封存于4℃冰箱待用。TB液体培养基组成：胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO412.54g/L，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min待用。
将上述重组基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a-DAAO经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的10mLLB液体培养基中，37℃，230rpm震荡过夜培养。按2％的接种量转接至10mLTB液体培养基中，37℃，230rpm震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为1％w/v的乳糖，25℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
(3)D-氨基酸氧化酶(DAAO)突变体的构建
针对(1)中所述野生型DAAO序列突变了第54位，第213位和第335位(具体为N54T/M213T/S335Q)。以该核苷酸序列为模板设计定点突变引物，如下方表1所示：
表1：第54位，第213位和第335位核苷酸序列定点突变引物
PCR扩增体系(50μL)如下：
10×KOD-plus-neo缓冲液5μL，dNTPs5μL，MgSO43μL，上下游引物各1μL，模板DNA1μL，KOD-plus-neo1μL，加入ddH2O使终体系为50μL。
PCR扩增条件(两步法)：
194℃预变性2min，②98℃变性10秒，③68℃延伸4min，30个循环，④72℃延伸7min，
⑤4℃保存。
PCR结束后取1μL产物进行核酸凝胶电泳分析，得到的目标条带清晰，向剩余产物加入0.5μLDpnI核酸内切酶，于37℃下消化模板DNA2h，再于80℃下失活20min。
酶切结束后将产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，于37℃过夜培养。挑单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10mL LB液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，经测序鉴定后提取质粒，转化进入E.coli BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，于37℃过夜培养，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10mL LB液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，获得突变体转化子。按照(2)中所述获得产D-氨基酸氧化酶突变体的E.coli BL21(DE3)菌体。该DAAO突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
(4)针对(3)中所述DAAO突变体序列突变了第223位和第341位(具体为Y223F/S341G)。以该核苷酸序列为模板设计迭代定点突变引物，如下方表2所示：
表2：第223位和第341位核苷酸序列定点突变引物
PCR扩增体系(50μL)如下：
10×KOD-plus-neo缓冲液5μL，dNTPs 5μL，MgSO43μL，上下游引物各1μL，模板DNA1μL，KOD-plus-neo 1μL，加入ddH2O使终体系为50μL。
PCR扩增条件(两步法)：
①94℃预变性2min，②98℃变性10秒，③68℃延伸4min，30个循环，④72℃延伸7min，⑤4℃保存。
PCR结束后取1μL产物进行核酸凝胶电泳分析，得到的目标条带清晰，向剩余产物加入0.5μL Dpn I核酸内切酶，于37℃下消化模板DNA 2h，再于80℃下失活20min。
酶切结束后将产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，于37℃过夜培养。挑单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10mL LB液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，经测序鉴定后提取质粒，转化进入E.coli BL21(DE3)，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，于37℃过夜培养，挑取单菌落于含有50μg/ml卡那霉素的10mL LB液体培养基，在37℃，230rpm条件下过夜培养，获得突变体转化子。按照(2)中所述获得产D-氨基酸氧化酶突变体的E.coli BL21(DE3)菌体。该DAAO突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
(5)D-氨基酸氧化酶粗酶液制备及纯化
将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液洗涤菌体两次后重悬，超声破碎菌悬液，12000rpm离心5min去除沉淀，取上清液，即为重组D-氨基酸氧化酶的粗酶液。
将粗酶液与经过Binding/Wash buffer(含有8M尿素，500mM NaCl，5mM咪唑，20mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液)平衡过的Ni亲和层析树脂结合后，再用Wash buffer(含有8M尿素，500mM NaCl，5mM咪唑，20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)冲洗至流传液在280nm处吸光度接近基线，随后以Elution buffer(含有8M尿素，500mM NaCl，500mM咪唑，20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)洗脱并收集目的蛋白，取截留液采用BCA法测定蛋白含量为0.377mg/mL，通过SDS-PAGE电泳分析鉴定，结果如附图3所示，M：标准蛋白分子量，泳道1：野生型D-氨基酸氧化酶BL21(DE3)/pET30a-DAAO粗酶液，泳道2：野生型D-氨基酸氧化酶BL21(DE3)/pET30a-DAAO纯酶，泳道3：D-氨基酸氧化酶突变体BL21(DE3)/pET30a-DAAO-N54T/M213T/Y223G/S335Q/S341G粗酶液。泳道4：D-氨基酸氧化酶突变体BL21(DE3)/pET30a-DAAO-N54T/M213T/Y223G/S335Q/S341G纯酶。纯化酶液按1：1比例加入30％甘油，分装后冻存于-80℃，即获得重组D-氨基酸氧化酶纯酶液。
(6)D-氨基酸氧化酶突变体催化能力测定
如图2所示，通过测定PPO的生成量来比较D-氨基酸氧化酶突变体的催化效率。反应体系为：50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液，100mM外消旋草铵膦铵盐，5g/L D-氨基酸氧化酶或其突变体冻干细胞，60U/mL过氧化氢酶。30℃反应6h后，取反应液样品进行处理，使用HPLC测定PPO的浓度并计算转化率(产物PPO浓度/底物D-PPT浓度×100％)，具体如下方表3所示：
表3：野生型/突变型D-氨基酸氧化酶转化率
(7)如图2所示的方法，多酶催化体系去消旋拆分D，L-草铵膦
按照(2)中方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶的基因工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET-30a-DAAO(N54T/M213T/Y223F/S335Q/S341G)，离心收集菌体细胞并冻干。
分别在3L反应器中，向1800mL含有400mM D,L-PPT，8000U/L过氧化氢酶，1％(v/v)消泡剂的Tris-HCl缓冲液(pH8.0，50mM)体系中加入20g/L E.coli BL21(DE3)/pET-30a-DAAO-WT，E.coli BL21(DE3)/pET-30a-DAAO(N54T/M213T/S335Q)和E.coli BL21(DE3)/pET-30a-DAAO(N54T/M213T/Y223F/S335Q/S341G)菌体通过加入氨水控制pH7.5-8.5，在温度25-35℃条件下反应24小时。定时取样，使用高效液相色谱测定样品中2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的含量，计算转化率，结果如图1所示。
由图1可以看出，当使用实施例1所述D-氨基酸氧化酶突变体做为催化剂进行催化反应时，随着时间推移，D-草铵膦的浓度逐渐降低，PPO的浓度逐渐升高，反应结束后，液相检测PPO的浓度大于190mM，几乎无法检测到D-PPT的存在，产品PPO的转化率最高可达49.5％，且反应最快可在6h内完成。
所得突变体的转化效率均高于野生型DAAO的转化效率。其中，转化率最高的为实施例1的DAAO突变体3，其突变位点为第54位的氨基酸残基N替换为T，第213位的氨基酸残基M替换为T，第223位的氨基酸残基Y替换为F，第335位的氨基酸残基S替换为Q，第341位的氨基酸残基N替换为G。
对比例1：
采用实施例1步骤(6)的方法，通过测定PPO的生成量来比较野生型D-氨基酸氧化酶(E.coliBL21(DE3)/pET-30a-DAAO)的催化效率，结果如表3所示。
可以看出野生型D-氨基酸氧化酶的催化效率较低，反应结束时反应液中PPO含量较少，仅4mM，转化率仅8.0％，显示其对非天然底物D-PPT的活力较低，难以用于D,L-草铵膦的酶法拆分。
采用实施例1步骤(7)的方法，如图2所示，通过测定PPO的转化率来比较野生型D-氨基酸氧化酶在多酶催化体系去消旋拆分D，L-草铵膦的催化效率，结果如图1所示。
野生型D-氨基酸氧化酶在反应进行24h后所得PPO的转化率仍低于10％，表明其在高底物浓度下较低的催化效率，无法应用于大规模D,L-草铵膦的酶法拆分中。
对比例2：
采用实施例1步骤(6)的方法，通过测定PPO的生成量来比较N54T/M213T/S335Q突变型D-氨基酸氧化酶的催化效率，结果如表3所示。
由表3可以看出对比例2所得D-氨基酸氧化酶突变体具有较高的催化效率，能够在低底物浓度(本例中为100mM)下高效催化D-草铵膦的氧化反应并生成PPO，显示出其对非天然底物D-PPT较高的催化活力，有望应用于大规模D,L-草铵膦的酶法拆分中。
采用实施例1步骤(7)的方法，如图2所示，通过测定PPO的转化率来比较N54T/M213T/S335Q突变型D-氨基酸氧化酶在多酶催化体系去消旋拆分D，L-草铵膦的催化效率，结果如图1所示。
Claims (14)
1.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含编码所述D-氨基酸氧化酶突变体的核苷酸。
3.一种如权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由如权利要求2所述的表达载体通过常规转化或转染技术引入宿主细胞后获得。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)中的至少一种。
5.一种如权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定D-氨基酸氧化酶突变位点为如SEQ ID NO:4所示的D-氨基酸氧化酶序列的第54位的氨基酸残基由天冬酰胺替换为苏氨酸，第213位的氨基酸残基由甲硫氨酸替换为苏氨酸，第223位的氨基酸残基由酪氨酸替换为苯丙氨酸，第335位的氨基酸残基由丝氨酸替换谷氨酸，第341位的氨基酸残基由丝氨酸替换为甘氨酸，设计突变引物，进行突变PCR；
(2)将PCR得到的产物中进行酶切处理，结束后将产物转化至感受态细胞，培养并提取重组表达载体；
(3)将重组表达载体转入表达到宿主细胞中，获得D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增采用以下定点突变引物：
1)N54T-f的引物序列：5’-gggccggtgcaacctggacccctcagatgaccctgacc-3’；
2)N54T-r的引物序列：5’-ggggtccaggttgcaccggcccacggacttgcaaaagtc-3’；
3)M213T-f的引物序列：5’-cgttgtacaaccgatagcagcgatccagcaagcccg-3’；
4)M213T-r的引物序列：5’-gctgctatcggttgtacaacgtttacacgggcttttaac-3’；
5)S335Q-f的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgca-3’；
6)S335Q-r的引物序列：5’-gataaccggcctggctaaaaccgtatgcatgaac-3’；
7)Y223F-f的引物序列：5’-caagcccggcatttattattcctcgtccgggtggtgaag-3’；
8)Y223F-r的引物序列：5’-gaggaataataaatgccgggcttgctggatcgctgctatc-3’；
9)S341G-f的引物序列：5’-gttatcagcagggttggggtgcagcagaagatgttg-3’；
10)S341G-r的引物序列：5’-ggttttagccaggccggttatcagcagtcatggggtgc-3’。
7.一种如权利要求1所述D-氨基酸氧化酶突变体在酶法拆分外消旋D,L-草铵膦中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体将外消旋D,L-草铵膦中的D-草铵膦转化为生产L-草铵膦的关键中间体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时保留原有外消旋D,L-草铵膦中质量分数占比为40-60％的L-草铵膦。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下步骤：
在多酶催化体系下通过使用D-氨基酸氧化酶突变体使外消旋D，L-草铵膦中的D-草铵膦发生氧化转化反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，拆分后保留的L-草铵膦在底物D,L-草铵膦中的质量分数占比为40-60％。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多酶催化体系包括：用于将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体，以及用于将副产物过氧化氢分解的过氧化氢酶。
11.根据权利要求8-10任一项中所述的应用，其特征在于，所述多酶催化体系中的每种酶的形式各自独立地选自：游离酶和/或引入酶的表达载体的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，其中，以湿菌体重量计，所述引入酶的表达载体的宿主细胞的添加量与多酶催化体系的总反应液的比例为1-200g/L。
13.根据权利要求8-10任一项中所述的应用，其特征在于，所述多酶催化体系的转化反应在pH为7-10的反应液体系中进行。
14.根据权利要求8-10任一项中所述的应用，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体催化的D，L-PPT的氧化反应的反应温度为25-45℃，时间为6-24h。
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