CN113621592B

CN113621592B - 一种转氨酶突变体及其编码基因与应用

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Publication number: CN113621592B
Application number: CN202110560336.3A
Authority: CN
Inventors: 金利群; 申屠俊康; 刘汉林; 柳志强; 薛亚平; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113621592A

Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体以及其编码基因，以及其在微生物催化2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L‑草铵膦中的应用。所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，其突变体是将SEQ ID:1所示的氨基酸序列的第138和141位中的一个进行单位点突变或组合突变获得的。本发明实现了高转化率转氨酶活力突变体基因的高效表达，酶活最高可达3827U/g。本发明转氨酶突变体在温度40℃，以pH 8.0缓冲液为反应介质进行生物催化反应获得L‑草铵膦，收率高达99％，产物e.e.值达到99％，具有较好应用前景。

Description

一种转氨酶突变体及其编码基因与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种转氨酶突变体以及其编码基因，以及其在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L-草铵膦中的应用。

(二)背景技术

草铵膦(Phosphinothricin，PPT)作为一种非天然氨基酸除草剂，与百草枯、草甘膦名列世界三大除草剂。因为其高效和低毒的非选择性而被广泛使用，最早是由德国的Bayer科研团队从吸水链霉菌的发酵液中发现的，具有良好的除草效果，它主要作用是抑制植物体内的谷氨酰胺合成酶(GS)，使其氮代谢紊乱，导致植物发生铵中毒而死，同时也影响了植物的光合作用，无法合成叶绿素，最后植物逐渐枯黄死去。

目前市售的草铵膦均为外消旋混合物，外消旋PPT具有L型和D型两种构型，但其中只有L构型的具有除草效果，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。如果草铵膦产品能够以L-构型生产和销售的话，对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要的意义。

目前报道生产光学纯L-草铵膦主要有化学合成法、手性拆分法以及生物催化合成法。

化学合成法主要有低温定向合成法、手性辅基法、天然氨基酸合成法、不对称催化合成法，不对称合成又包括不对称催化加氢合成法、不对称Michael加成方法等。目前化学法合成面临反应路线繁琐，对反应条件比较苛刻，后期污染较严重，且不对称合成试剂价格昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。

手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，分离D型和L型异构体，从而得到光学纯的L-草铵膦。但是使用此法需要用到昂贵的手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低并且工艺比较复杂。

生物催化合成法具有反应条件温和、催化效率和立体选择性高、产物易于分离纯化、环保零污染等优点，并逐渐成为当前研究热点。L-草铵膦的生物酶法合成研究具有重要的意义和经济价值。生物合成L-PPT主要有酶水解法、酶选择性拆分法和酶的不对称合成法，其中涉及到的酶类主要有：蛋白酶、酰胺酶、脱乙酰基酶、转氨酶。

在诸多草铵膦的酶法合成路线中，不对称合成法具有立体选择性严格、反应条件温和，收率高以及容易分离纯化等优点，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线，催化此类反应的酶主要包括谷氨酸脱氢酶和转氨酶，底物为草铵膦前体酮(2-羰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-丁酸，PPO)。谷氨酸脱氢酶催化时，需要使用昂贵的NAD(P)H作为辅助因子，催化成本过高。

转氨酶(Transaminase,TA,EC 2.6.1.X)作为磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)依赖型酶，能催化胺类化合物上的氨基转移到潜手性的酮类化合物上，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸。转氨酶普遍存在于微生物、动物和植物组织中，并在胞内氮代谢过程中起着重要的转氨作用。转氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，这些手性化合物常作为药品的活性成分或主要中间体被使用，例如，广谱触杀型除草剂草铵膦、治疗糖尿病药物的西他列汀及抗生素青霉素等，在制药工业、农业、化工业都有重要的作用。

根据催化过程中氨基被转移到底物羧基位置的不同，可以将其分为α-转氨酶和ω-转氨酶两大类。α-转氨酶需要羰基官能团上的α位存在羧基，因此α-转氨酶只能够允许α-氨基酸的生成，即α-转氨酶只能同时用α-氨基酸和α-酮酸作为底物，例如，天冬氨酸TA(EC 2.6.1.1)、酪氨酸TA(EC 2.6.1.5)、支链氨基酸TA(EC 2.6.1.11)等,其余的可划分ω-转氨酶，分类较广，如4-氨基丁酸：丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.19)、β-丙氨酸：丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.18)。在一般情况下，所有的转氨酶还都可以根据在其可逆反应中所利用的氨基酸底物进行分类，由其催化的底物氨基酸的活力对该转氨酶进行命名，如可以催化底物天冬氨酸和苯丙氨酸的两个酶分别为天冬氨酸转氨酶和苯丙氨酸转氨酶。

目前，已有一些TA制备L-PPT的报道。Bartsch等人从土壤中筛选得到天冬氨酸转氨酶并应用于制备L-PPT，当以天冬氨酸为氨基供体，底物浓度为40mM时转化率最高可以达到75％，底物浓度为100mM时转化率为59％(K.Bartsch,Process for the preparation ofL-phosphinothricine by enzymatic transamination with aspartate,U.S.Patent(2005)6936444.)。中国专利CN107119084A报道了杨立荣等以PPO为底物，丙氨酸作为氨基供体，当底物PPO浓度为100mM时，加入400mM丙氨酸和1mM PLP，反应19h，其PPO转化率可达100％。现有的转氨酶工艺存在的问题是酶源少、酶活性低、底物耐受性差、产物转化率低。

在此背景下，本发明提出通过基因挖掘技术筛选新型转氨酶重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，将优势突变体催化剂用于不对称合成制备L-PPT，对于改善TA在制备L-PPT过程中底物耐受性差、酶活低具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可应用于制备L-草铵膦优良催化活力和底物耐受性、利用廉价氨基供体的新型转氨酶突变体，以及在不对称合成L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种转氨酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的转氨酶第138和141位氨基酸经单点突变或双突变而得。

SEQ ID NO：1序列如下：

MNTNNALMQRRHNAVPRGVGQIHPIFAERAENCRVWDVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPGIVSAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLALCERMNQKVPGDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGAIAFSGAYHGRTHYTLSLTGKVHPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPLHNISDDDAIASIERIFKNDAAPEDIAAIIIEPVQGEGGFYAASPAFMQRLRALCDQHGIMLIADEVQSGAGRTGTLFAMEQMGVAADITTFAKSIAGGFPLAGVTGRADVMDAIAPGGLGGTYAGNPIACAAALAVLDIFEQENLLQKANTLGNTLRDGLMEIAETHREIGDVRGLGAMIAIELFENGDPGKPNAALTADIVTRAREKGLILLSCGPYYNILRILVPLTIEASQIRQGLEIIAQCFDEAKQA

其编码基因为(SEQ ID NO：2)：

atgaacaccaacaacgctctgatgcagcgtcgtcacaacgctgttccgcgtggtgttggtcagatccacccgatcttcgctgaacgtgctgaaaactgccgtgtttgggacgttgaaggtcgtgaatacctggacttcgctggtggtatcgctgttctgaacaccggtcacctgcacccgggtatcgtttctgctgttgaagctcagctgaaaaaactgtctcacacctgcttccaggttctggcttacgaaccgtacctggctctgtgcgaacgtatgaaccagaaagttccgggtgacttcgctaaaaaaaccctgctggttaccaccggttctgaagctgttgaaaacgctgttaaaatcgctcgtgctgctaccaaacgttctggtgctatcgctttctctggtgcttaccacggtcgtacccactacaccctgtctctgaccggtaaagttcacccgtactctgctggtatgggtctgatgccgggtcacgtttaccgtgctctgtacccgtgcccgctgcacaacatctctgacgacgacgctatcgcttctatcgaacgtatcttcaaaaacgacgctgctccggaagacatcgctgctatcatcatcgaaccggttcagggtgaaggtggtttctacgctgcttctccggctttcatgcagcgtctgcgtgctctgtgcgaccagcacggtatcatgctgatcgctgacgaagttcagtctggtgctggtcgtaccggtaccctgttcgctatggaacagatgggtgttgctgctgacatcaccaccttcgctaaatctatcgcgggcggcttcccgctggctggcgttaccggtcgtgctgacgttatggacgctatcgctccgggtggtctgggtggtacctacgctggtaacccgatcgcttgcgctgctgctctggctgttctggacatcttcgaacaggaaaacctgctgcagaaagctaacaccctgggtaacaccctgcgtgacggtctgatggaaatcgctgaaacccaccgtgaaatcggtgacgttcgtggtctgggtgctatgatcgctatcgaactgttcgaaaacggtgacccgggtaaaccgaacgctgctctgaccgctgacatcgttacccgtgctcgtgaaaaaggtctgatcctgctgtcttgcggtccgtactacaacatcctgcgtatcctggttccgctgaccatcgaagcttctcagatccgtcagggtctggaaatcatcgctcagtgcttcgacgaagctaaacaggctctcgagcaccaccaccaccaccac

优选的，所述转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(第138位的酪氨酸取代为苯丙氨酸(Y138F)，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO：3序列如下：

MNTNNALMQRRHNAVPRGVGQIHPIFAERAENCRVWDVEGREYLDFAGGIAVLNTGHLHPGIVSAVEAQLKKLSHTCFQVLAYEPYLALCERMNQKVPGDFAKKTLLVTTGSEAVENAVKIARAATKRSGAIAFSGAFHGRTHYTLSLTGKVHPYSAGMGLMPGHVYRALYPCPLHNISDDDAIASIERIFKNDAAPEDIAAIIIEPVQGEGGFYAASPAFMQRLRALCDQHGIMLIADEVQSGAGRTGTLFAMEQMGVAADITTFAKSIAGGFPLAGVTGRADVMDAIAPGGLGGTYAGNPIACAAALAVLDIFEQENLLQKANTLGNTLRDGLMEIAETHREIGDVRGLGAMIAIELFENGDPGKPNAALTADIVTRAREKGLILLSCGPYYNILRILVPLTIEASQIRQGLEIIAQCFDEAKQALEHHHHHH

其编码基因为(SEQ ID NO：4)：

atgaacaccaacaacgctctgatgcagcgtcgtcacaacgctgttccgcgtggtgttggtcagatccacccgatcttcgctgaacgtgctgaaaactgccgtgtttgggacgttgaaggtcgtgaatacctggacttcgctggtggtatcgctgttctgaacaccggtcacctgcacccgggtatcgtttctgctgttgaagctcagctgaaaaaactgtctcacacctgcttccaggttctggcttacgaaccgtacctggctctgtgcgaacgtatgaaccagaaagttccgggtgacttcgctaaaaaaaccctgctggttaccaccggttctgaagctgttgaaaacgctgttaaaatcgctcgtgctgctaccaaacgttctggtgctatcgctttctctggtgctttccacggtcgtacccactacaccctgtctctgaccggtaaagttcacccgtactctgctggtatgggtctgatgccgggtcacgtttaccgtgctctgtacccgtgcccgctgcacaacatctctgacgacgacgctatcgcttctatcgaacgtatcttcaaaaacgacgctgctccggaagacatcgctgctatcatcatcgaaccggttcagggtgaaggtggtttctacgctgcttctccggctttcatgcagcgtctgcgtgctctgtgcgaccagcacggtatcatgctgatcgctgacgaagttcagtctggtgctggtcgtaccggtaccctgttcgctatggaacagatgggtgttgctgctgacatcaccaccttcgctaaatctatcgcgggcggcttcccgctggctggcgttaccggtcgtgctgacgttatggacgctatcgctccgggtggtctgggtggtacctacgctggtaacccgatcgcttgcgctgctgctctggctgttctggacatcttcgaacaggaaaacctgctgcagaaagctaacaccctgggtaacaccctgcgtgacggtctgatggaaatcgctgaaacccaccgtgaaatcggtgacgttcgtggtctgggtgctatgatcgctatcgaactgttcgaaaacggtgacccgggtaaaccgaacgctgctctgaccgctgacatcgttacccgtgctcgtgaaaaaggtctgatcctgctgtcttgcggtccgtactacaacatcctgcgtatcctggttccgctgaccatcgaagcttctcagatccgtcagggtctggaaatcatcgctcagtgcttcgacgaagctaaacaggctctcgagcaccaccaccaccaccac

由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述转氨酶突变体的编码基因。

优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的突变体可以是生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变编码氨基酸的功能。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组菌。

本发明关键在于新型高活力转氨酶及其突变位点的选择，在已知所述新型高活力转氨酶序列及其突变体位点的前提下，本领域普通技术人员可根据SEQ ID NO.1的TA基因(ABAT2)，设计定点突变的突变引物，以携带转氨酶的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pET28b或能表达该酶的载体为表达载体，将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，高通量筛选验证后的阳性单克隆进行培养，获得含有本发明突变体的重组菌湿菌体。

述转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L-草铵膦中的应用。

所述应用为：含所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，镍柱纯化后作为酶源，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸为氨基供体，在pH6.0～10.0缓冲液，20～75℃、400～600r/min条件下反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。

反应体系中，底物初始浓度为20～500mM，湿菌体用量为10～100g/L(优选优选20g/L)，辅酶用量为0～1mM(优选0.1mM)。

优选的，所述反应在38～45℃(更优选40℃)下进行。

具体的，所述湿菌体可按如下方法制备：构建含有所述优良催化活力和底物耐受性的TA突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至E.coli中，获得的重组基因工程菌进行诱导表达，取培养液分离得到湿菌体细胞。具体为：将含有转氨酶突变体基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养9h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃、150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值7.0。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的转氨酶及其高活力突变体，该突变体对草铵膦前体酮PPO具有较高的催化活力(最高可达3827U/g)，其最适反应温度40℃，在温度40℃下以pH 8.0缓冲液为反应介质进行生物催化反应获得L-草铵膦，收率高达99％，产物e.e.值达到99％，具有较好应用前景。

(四)附图说明

图1为转氨酶的凝胶电泳图：泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为转氨酶ABAT2，泳道2为转氨酶突变体ABAT2-Y138F。

图2为纯化后转氨酶的SDS-PAGE图：泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为转氨酶ABAT2，泳道2为纯化后的转氨酶突变体ABAT2，泳道3为转氨酶突变体ABAT2-Y138F，泳道4为纯化后的转氨酶突变体ABAT2-Y138F。

图3为转氨酶突变体的最适温度示意图。

图4为转氨酶突变体的最适pH示意图。

图5为金属离子转氨酶突变体的影响示意图。

图6为L-草铵膦合成方程式。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

实施例1：转氨酶基因ABAT2的扩增

假单胞杆菌是从土壤中分离得到的，保存在中国典型培养物保藏中心(保藏编号CCTCC NO:M2012539，已在专利申请中公开，申请号CN 201210593105.3，公开(公告)号CN103131649A)。

根据Genbank收录的来自假单胞杆菌(WP_076423369.1)的转氨酶基因测序信息为依据，用核酸快速提取仪提取假单胞杆菌(菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(5’-ATGAACACCAACAACGCTC-3’)、引物2(5’-TTAAGCCTGTTTAGCTTC-3’)的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度均为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNA Polymerase 1μL，无核酸水40μL。

采用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4 DNA连接酶作用下将该片段同pMD18-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-ABAT2。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为1275bp(ABAT2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例2：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-ABAT2的构建

根据实施例1中的ABAT2基因序列设计引物3(5’-CCGCATATGAACACCAACAAC-3)、引物4(5’-TTGCTCGAGTTAAGCCTGTTTAGC-3’)，并分别在引物3和引物4中引入了Nde I和Xho I限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，以重组质粒pMD18-T-ABAT2为模板(实施例1中获得)，获ATA3基因序列，测序后利用Nde I和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28b-ABAT2。将构建的表达载体pET28b-ABAT2转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-ABAT2的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-ABAT2。

实施例3：转氨酶的诱导表达

将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-ABAT2接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28b-ABAT2湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。

实施例4：转氨酶突变体的构建与筛选

根据转氨酶(ABAT2来源于Salmonella enterica，Genbank accessionNo.CP026235.1)序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/ABAT2为模板，对第138位引入定点突变突变，引物为：

正向引物TTTCTCTGGTGCTNNKCACGGTCGT(下划线为突变碱基)

反向引物GGGTACGACCGTGMNNAGCACCAGA(下划线为突变碱基)

PCR反应体系(总体积50μL)：10×DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTPmixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度均为50μM的正向引物、反向引物各1μL，模板DNA 1μL，DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 40μL。

采用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

取3μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却2min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，取100μL上述菌液涂板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h。

实施例5：基因突变体文库筛选获得突变体ABAT2-Y138F

将实施例4中含有50μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上挑取单克隆8000个，分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中进行诱导表达，诱导条件如实施例1，获得8000个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌体。

得到含有突变蛋白的大肠杆菌后，对0.36g草胺磷前体酮PPO进行生物催化，催化体系(10mL)终浓度组成及催化条件如下：突变体湿菌体0.075g，Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，磷酸吡哆醛0.1mM，L-丙氨酸70mM，20mM 2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。反应条件：温度40℃、搅拌速度150r/min，反应时间24h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以含空载体的大肠杆菌湿菌体代替上述突变体湿菌体作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(50:50乙腈：水，10mM乙酸铵，0.8mL/min流速，268nm检测波长)，从8000个突变蛋白中，有6298个突变蛋白的活力低于原始蛋白，1661个突变蛋白的活力与原始蛋白相当，仅41个突变蛋白的活力显著高于原始蛋白(增加20％)，其中底物转化率最高的一个突变体pET28b-ABAT2-Y138F，转化率为96％，ee>99％。突变体pET28b-ABAT2-Y138F的氨基酸序列与核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸第138位的酪氨酸取代为苯丙氨酸。

实施例6：重组大肠杆菌发酵产酶

将实施例5的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-ABAT2-Y138F接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养OD₆₀₀约0.6-0.8，获得种子液；将种子液以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD₆₀₀至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1M的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，用0.85％的生理盐水清洗两遍湿菌体，并收集湿菌体，备用。

实施例7：转氨酶及其突变体酶活测定

收集实施例6制备的湿菌体在40W条件下超声破碎6min后，将破碎混合液，在4℃、8000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液使用镍柱进行纯化，用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，根据紫外检测器的信号响应，收集相应的洗脱液，即为转氨酶突变体纯酶液。酶活检测标准条件：20mM PPO，70mM L-alaine，0.1mM PLP，40℃，pH 8.0(0.05M的Tris-HCl缓冲液)保温5min，然后加入适量酶液，于40℃、600rpm反应5min，用6M的HCl终止反应，接着加入6M的NaOH将反应体系的pH调回。样品经离心(12,000rpm、1min)、超纯水稀释后进行衍生化反应，然后经0.22μm膜过滤后进行HPLC分析。

酶活定义：在酶活测定条件下，每分钟每生成1μmol L-PPT所需的酶量定义为一个酶活单位U。

比酶活定义:每毫克蛋白所具有的的酶活单位数，记为U/mg。

表1：转氨酶酶活测定

实施例8：确定催化转氨酶突变体的最适温度

将实施例7中的纯酶液作为催化用酶，测定酶的最适温度。具体操作如下：50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、70mM L-丙氨酸、0.1mM PLP和适量纯酶液。分别于不同催化温度：20-75℃测定TA活力(方法同实施例7)，结果见图3。转氨酶突变体pET28b-ABAT2-Y138F的最适温度为40℃。

实施例9：确定催化转氨酶突变体的最适pH

将实施例7中的纯酶液作为催化用酶，测定酶的最适pH。具体操作如下：50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入20mM PPO、70mM L-丙氨酸、0.1mM PLP和适量纯酶液。通过测定乙酸-乙酸钠(Acetate buffer,pH 5.0-6.0)，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液(PBbuffer,pH 6.0-8.0)，Tris-盐酸缓冲液(Tris-HCl buffer,pH 8.0-9.0)三种不同pH(5.0-10.0)缓冲液下的酶活进行探究测定TA活力(方法同实施例7)。结果见图4。转氨酶突变体pET28b-ABAT2-Y138F的最适pH为8.0。

实施例10：确定金属离子对转氨酶突变体的酶活影响

将实施例7中的纯酶液作为催化用酶，测定金属离子对转氨酶突变体的酶活影响。具体操作如下：将纯酶置于pH 8.0的Tris-HCl buffer中，向其中分别加入不同的金属离子(K⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Li⁺、Co²⁺和Mg²⁺)、EDTA(终浓度1mM)，0℃保温30min，测定TA活力(方法同实施例5)，结果见图5。Co²⁺、Ba²⁺和Fe³⁺三种金属离子对突变体的酶活有小幅的促进作用，除此之外，其余金属离子都对酶活有明显的抑制作用，特别是Ni²⁺和Cu²⁺的抑制作用最强。

实施例11：转氨酶突变体合成L-草铵膦反应进程

催化体系(10mL)：20mM PPO，70mM L-丙氨酸，加入0.1mM PLP，Tris-HCl缓冲体系，pH 8.0，湿菌体量为20g/L，在40℃、600rpm下反应不同时间(1～24h)，定时取样分析，转化率结果如表2所示。

表2：不同反应时间对转化率的影响

实施例12：反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲液，pH8.0，100mM PPO，350mM L-丙氨酸，加入1mM PLP，湿菌体量为20g/L，40℃、600rpm下反应24h，转化率为99.24％。

实施例13：反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲液，pH8.0，200mM PPO，700mM L-丙氨酸，加入1mM PLP，湿菌体量为20g/L，40℃、600rpm下反应24h，转化率为91.02％。

实施例14：反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲液，pH8.0，300mM PPO，1050mM L-丙氨酸，加入1mM PLP，湿菌体量为20g/L，40℃、600rpm下反应24h，转化率为88.03％。

实施例15：反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲液，pH8.0，400mM PPO，1400mM L-丙氨酸，加入1mM PLP，湿菌体量为20g/L，40℃、600rpm下反应24h，转化率为87.02％。

实施例16：反应体系(10mL)：Tris-HCl缓冲液，pH8.0，500mM PPO，1750mM L-丙氨酸，加入1mM PLP，湿菌体量为20g/L，40℃、600rpm下反应24h，转化率为86.32％。

由以上实验结果可知，本发明得到的含有转氨酶基因的重组大肠杆菌具有较强的转氨能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者催化反应，可以利用2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸为底物，进行生物催化不对称合成高光学纯的农药——L-草铵膦。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种转氨酶突变体及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Asn Thr Asn Asn Ala Leu Met Gln Arg Arg His Asn Ala Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Glu Arg Ala Glu Asn

20 25 30

Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly

35 40 45

Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Gly Ile Val Ser

50 55 60

Ala Val Glu Ala Gln Leu Lys Lys Leu Ser His Thr Cys Phe Gln Val

65 70 75 80

Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Cys Glu Arg Met Asn Gln Lys

85 90 95

Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser

100 105 110

Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Ala Ile Ala Phe Ser Gly Ala Tyr His Gly Arg Thr His Tyr

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Thr Gly Lys Val His Pro Tyr Ser Ala Gly Met Gly

145 150 155 160

Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His

165 170 175

Asn Ile Ser Asp Asp Asp Ala Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ile Phe Lys

180 185 190

Asn Asp Ala Ala Pro Glu Asp Ile Ala Ala Ile Ile Ile Glu Pro Val

195 200 205

Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Phe Met Gln Arg

210 215 220

Leu Arg Ala Leu Cys Asp Gln His Gly Ile Met Leu Ile Ala Asp Glu

225 230 235 240

Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln

245 250 255

Met Gly Val Ala Ala Asp Ile Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly

260 265 270

Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Asp Val Met Asp Ala

275 280 285

Ile Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Asn Pro Ile Ala

290 295 300

Cys Ala Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ile Phe Glu Gln Glu Asn Leu

305 310 315 320

Leu Gln Lys Ala Asn Thr Leu Gly Asn Thr Leu Arg Asp Gly Leu Met

325 330 335

Glu Ile Ala Glu Thr His Arg Glu Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly

340 345 350

Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asn Gly Asp Pro Gly Lys Pro

355 360 365

Asn Ala Ala Leu Thr Ala Asp Ile Val Thr Arg Ala Arg Glu Lys Gly

370 375 380

Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Arg Ile Leu

385 390 395 400

Val Pro Leu Thr Ile Glu Ala Ser Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Ile

405 410 415

Ile Ala Gln Cys Phe Asp Glu Ala Lys Gln Ala

420 425

<210> 2

<211> 1305

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgaacacca acaacgctct gatgcagcgt cgtcacaacg ctgttccgcg tggtgttggt 60

cagatccacc cgatcttcgc tgaacgtgct gaaaactgcc gtgtttggga cgttgaaggt 120

cgtgaatacc tggacttcgc tggtggtatc gctgttctga acaccggtca cctgcacccg 180

ggtatcgttt ctgctgttga agctcagctg aaaaaactgt ctcacacctg cttccaggtt 240

ctggcttacg aaccgtacct ggctctgtgc gaacgtatga accagaaagt tccgggtgac 300

ttcgctaaaa aaaccctgct ggttaccacc ggttctgaag ctgttgaaaa cgctgttaaa 360

atcgctcgtg ctgctaccaa acgttctggt gctatcgctt tctctggtgc ttaccacggt 420

cgtacccact acaccctgtc tctgaccggt aaagttcacc cgtactctgc tggtatgggt 480

ctgatgccgg gtcacgttta ccgtgctctg tacccgtgcc cgctgcacaa catctctgac 540

gacgacgcta tcgcttctat cgaacgtatc ttcaaaaacg acgctgctcc ggaagacatc 600

gctgctatca tcatcgaacc ggttcagggt gaaggtggtt tctacgctgc ttctccggct 660

ttcatgcagc gtctgcgtgc tctgtgcgac cagcacggta tcatgctgat cgctgacgaa 720

gttcagtctg gtgctggtcg taccggtacc ctgttcgcta tggaacagat gggtgttgct 780

gctgacatca ccaccttcgc taaatctatc gcgggcggct tcccgctggc tggcgttacc 840

ggtcgtgctg acgttatgga cgctatcgct ccgggtggtc tgggtggtac ctacgctggt 900

aacccgatcg cttgcgctgc tgctctggct gttctggaca tcttcgaaca ggaaaacctg 960

ctgcagaaag ctaacaccct gggtaacacc ctgcgtgacg gtctgatgga aatcgctgaa 1020

acccaccgtg aaatcggtga cgttcgtggt ctgggtgcta tgatcgctat cgaactgttc 1080

gaaaacggtg acccgggtaa accgaacgct gctctgaccg ctgacatcgt tacccgtgct 1140

cgtgaaaaag gtctgatcct gctgtcttgc ggtccgtact acaacatcct gcgtatcctg 1200

gttccgctga ccatcgaagc ttctcagatc cgtcagggtc tggaaatcat cgctcagtgc 1260

ttcgacgaag ctaaacaggc tctcgagcac caccaccacc accac 1305

<210> 3

<211> 435

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Asn Thr Asn Asn Ala Leu Met Gln Arg Arg His Asn Ala Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Val Gly Gln Ile His Pro Ile Phe Ala Glu Arg Ala Glu Asn

20 25 30

Cys Arg Val Trp Asp Val Glu Gly Arg Glu Tyr Leu Asp Phe Ala Gly

35 40 45

Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Gly Ile Val Ser

50 55 60

Ala Val Glu Ala Gln Leu Lys Lys Leu Ser His Thr Cys Phe Gln Val

65 70 75 80

Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Cys Glu Arg Met Asn Gln Lys

85 90 95

Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Thr Gly Ser

100 105 110

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115 120 125

Ser Gly Ala Ile Ala Phe Ser Gly Ala Phe His Gly Arg Thr His Tyr

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Met Pro Gly His Val Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Leu His

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Phe Met Gln Arg

210 215 220

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Val Gln Ser Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Leu Phe Ala Met Glu Gln

245 250 255

Met Gly Val Ala Ala Asp Ile Thr Thr Phe Ala Lys Ser Ile Ala Gly

260 265 270

Gly Phe Pro Leu Ala Gly Val Thr Gly Arg Ala Asp Val Met Asp Ala

275 280 285

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290 295 300

Cys Ala Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ile Phe Glu Gln Glu Asn Leu

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

Ala Met Ile Ala Ile Glu Leu Phe Glu Asn Gly Asp Pro Gly Lys Pro

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435

<210> 4

<211> 1305

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

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cagatccacc cgatcttcgc tgaacgtgct gaaaactgcc gtgtttggga cgttgaaggt 120

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ctgatgccgg gtcacgttta ccgtgctctg tacccgtgcc cgctgcacaa catctctgac 540

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gctgacatca ccaccttcgc taaatctatc gcgggcggct tcccgctggc tggcgttacc 840

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ttcgacgaag ctaaacaggc tctcgagcac caccaccacc accac 1305

Claims

1. 一种转氨酶突变体，其特征在所述转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述转氨酶突变体的基因。

3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组菌。

5.权利要求1所述转氨酶突变体在微生物催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物不对称合成L-草铵膦中的应用。

6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：含所述转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，镍柱纯化后作为酶源，以草铵膦前体酮PPO为底物，以磷酸吡哆醛为辅酶，以天然氨基酸为氨基供体，在pH6.0~10.0缓冲液，20~75 ℃、400~600 r/min条件下反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到L-草铵膦。

7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于反应体系中，底物初始浓度为20~500 mM，湿菌体用量为10~100 g/L，辅酶用量为0.1~1 mM。