CN111996178A - 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用 - Google Patents

一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111996178A
CN111996178A CN202010962107.XA CN202010962107A CN111996178A CN 111996178 A CN111996178 A CN 111996178A CN 202010962107 A CN202010962107 A CN 202010962107A CN 111996178 A CN111996178 A CN 111996178A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
phosphate aminotransferase
concentration
histidinol phosphate
histidinol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010962107.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111996178B (zh
Inventor
王东阳
廖佳伟
陈正
张娟
冯志彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Original Assignee
Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Yangcheng Biotech Co ltd filed Critical Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority to CN202111495917.XA priority Critical patent/CN114015669B/zh
Priority to CN202010962107.XA priority patent/CN111996178B/zh
Priority to CN202111495918.4A priority patent/CN114015670B/zh
Priority to CN202111495932.4A priority patent/CN114015671B/zh
Priority to PCT/CN2020/118927 priority patent/WO2022052191A1/zh
Publication of CN111996178A publication Critical patent/CN111996178A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111996178B publication Critical patent/CN111996178B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01009—Histidinol-phosphate transaminase (2.6.1.9)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用，属于生物技术领域。组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的。本发明构建的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体工程菌株，配合充氮保护和稳定剂的使用，有效提高了3‑吲哚丙酮酸的稳定性，产物浓度最高可达179.8mM，转化率大于89％，且原料廉价易得，生产工艺简单易行、生产成本较低，实现了高产率绿色生产3‑吲哚丙酮酸。

Description

一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用
技术领域
本发明涉及组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用，属于生物技术领域。
背景技术
3-吲哚丙酮酸(IPA)是重要的中间体化合物，是制造3-吲哚乙酸(植物生长激素)、3-吲哚乙醇、DL-色氨酸及D-色氨酸等物质的关键前体，且自身也是神经系统的治疗药物，在农业、食品及医药领域具有广泛用途，应用前景广阔。传统化学法合成IPA需要耗用大量的碱和吡啶醛，价格昂贵，且反应条件苛刻、产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险。利用L-氨基酸氧化酶氧化脱氨也是一种合成IPA的重要方法，但副产物过氧化氢会导致IPA的降解，收率及纯度均难以保证。专利CN200880104143.X利用大肠杆菌工程表达来源于雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)AJ2770菌株的氨基酸氧化酶，转化L-色氨酸生产IPA，200mmol/L底物色氨酸反应体系中，IPA的最高浓度仅为129mM，且产物得率较低。
转氨酶(Transaminase)又称氨基转移酶(Aminotransferase)，催化氨基和酮基之间的氨基转移转氨酶，可以利用廉价原料L-色氨酸通过转氨基作用生产IPA，反应过程中无需通氧，亦不产生破坏酮酸稳定性的副产物(如过氧化氢)，极具应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、重组菌及其全细胞作为催化剂，用于3-吲哚丙酮酸的合成。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61(Streptomyces luteoverticillatus)CGMCC15060，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的。
进一步，所述突变体为下列之一，第66位缬氨酸突变为异亮氨酸(hisC-V66I)、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺(hisC-N138Q)、第197位丝氨酸突变为组氨酸(hisC-S197H)或第226位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸(hisC-P226F-R311Y)的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，更优选突变体为hisC-P226F-R311Y。
本发明还涉及一种所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体的编码基因。
本发明提供含有所述编码基因的工程菌。
本发明还提供一种所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体在催化L-色氨酸合成3-吲哚丙酮酸中的应用。
进一步，所述的应用方法为以含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以L-色氨酸为底物，以L-色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸为氨基受体，加入25mg/L的辅酶磷酸吡哆醛，1g/L的稳定保护剂的转化体系中，氨水调节pH为7.5，通氮气驱氧，温度30～40℃的条件下反应生产3-吲哚丙酮酸。
进一步，所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～40g/L，底物浓度为50～200mM，丙酮酸浓度为60～240mM。
进一步，含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌按如下方法制备：将含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～18h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养4～10h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比2～12％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4～12h后加入乳糖至终浓度为1～5g/L并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得组氨醇磷酸氨基转移酶突变体全细胞催化剂。
进一步，所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，氨苄西林100mg/L，琼脂20g/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；
进一步，所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；
进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：甘油20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 2g/L，KH2PO4 12.5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，柠檬酸1g/L，玉米浆干粉3g/L，CaCl21g/L，D-生物素20μg/L，pH6.7～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的稳定保护剂为亚硫酸钠、植酸中的一种或组合使用。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明采用易错PCR技术成功突变来源于藤黄轮丝链霉菌的组氨醇磷酸氨基转移酶并构建工程菌株，筛选到的突变体酶活较原始最高提高120％，并用于3-吲哚丙酮酸的酶法合成，通过充氮保护和稳定剂的配合使用，有效提高了3-吲哚丙酮酸的稳定性，产物浓度最高可达179.8mM，转化率最大可达89.9％。同时本发明所述的生产方法所使用的原料廉价易得，且生产工艺简单易行、生产成本较低。建立的全细胞转化体系，解决了化学法合成IPA的反应条件苛刻、且产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险的问题及L-氨基酸氧化酶副产物过氧化氢对产物的破坏影响，实现了高产率绿色生产IPA。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1：表达载体和工程菌构建
根据藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，生物保藏号为CGMCC 15060(该菌株在申请日之前已经进行生物保藏并在专利2018100327172中公开)基因hisC序列(SEQ ID No.1)设计含有NcoI酶切位点的上游引物hisC-NcoI-F：5′-aaccatggcaatgacgcgattacacgagctcc-3′，和含有Xho I酶切位点的下游引物hisC-XhoI-R：
5′-aactcgagtcaggcggccgccggtccggcg-3′，黑色斜体为酶切位点。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到藤黄轮丝链轮丝菌基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括2×GC Buffer I 25μL，dNTP Mix8μL，TaKaRaLATaq0.5μL，模板0.5μL，上下游引物各1.0μL，用dd H2O补足至50μL。PCR反应参数为：94℃1min，1个循环；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min，1个循环。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化目标DNA片段。用Nco I和Xho I分别酶切载体pET32a及片段，然后用T4 DNA连接酶将hisC片段与载体连接并转化E.coli DH5α。阳性克隆利用菌落PCR和进行酶切鉴定验证正确后，获得pET32a-hisC重组载体。
以重组载体pET32a-hisC作为模板，利用易错PCR方法进行扩增。易错PCR的反应体系为：PCR Grade Water 39μL，10×TITANIUM Taq Buffer 5μL，MnSO4(8mM)1μL，dGTP(2mM)1μL，50×Diversify dNTP Mix 1μL，Primer mix 1μL，模板1μL，TITANIUM Taq Polym1μL，共50μL体系(其中反应体系中的Primer mix为实例1中所述上下游引物各0.5μL的混合溶液)。易错PCR反应条件为：94℃30s，1个循环；94℃30s，68℃1min30s，25个循环；68℃1min，1个循环。将易错PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。用Nco I和Xho I分别酶切载体pET32a及扩增产物，然后用T4 DNA连接酶将扩增产物与载体连接，将连接后的重组载体热击转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并置于37℃，200r/min条件下培养1h进行活化，将活化后重组细胞涂布于含0.1mg/mL氨苄西林抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得组氨醇磷酸氨基转移酶突变体表达文库。
从获得的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体表达文库菌落中利用高通量筛选方法，从这些单菌落中筛选高活性突变体菌株。其具体筛选方法为：从平板上随机挑取600个单菌落，接入96深孔板，培养基为LB液体培养基，37℃，180r/min培养9h后，离心收集菌体，去掉上清培养基后加入发酵培养基，37℃，220r/min培养6h后加入乳糖至终浓度为2g/L并降温至20℃诱导表达；离心收集菌体，测定酶活。标准酶活检测体系：25g/L湿菌体、50mM底物L-色氨酸、25mg/L辅酶磷酸吡哆醛、60mM丙酮酸，反应介质为pH 7.5的磷酸盐缓冲液，总体系为1mL。单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol 3-吲哚丙酮酸所需要的酶量为一个酶活单位U。筛选得到4株高活性组氨醇磷酸氨基转移酶突变菌株，经测序，分别为SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第66位缬氨酸突变为异亮氨酸(hisC-V66I)、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺(hisC-N138Q)、第197位丝氨酸突变为组氨酸(hisC-S197H)、第266位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸(hisC-P226F-R311Y)的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，对应的工程菌株分别为E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-V66I、E.coliBL21(DE3)/pET32a-hisC-N138Q、E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-S197H、E.coliBL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y。其中活性最高的是工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y(表1)。
表1组氨醇磷酸氨基转移酶突变体酶活
Figure BDA0002680935470000061
实施例2：利用重组菌发酵生产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-N138Q、hisC-P226F-R311Y)及酶法转化L-色氨酸生产IPA
(1)分别将E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-N138Q、E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y接入LB斜面培养基37℃培养18h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养9h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比4％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养6h后加入乳糖至终浓度为2g/L并降温至20℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，分别得到E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-N138Q、E.coliBL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y的全细胞催化剂。
(2)利用组氨醇磷酸氨基转移酶突变体全细胞催化生产3-吲哚丙酮酸，其转化条件为：配制50mM L-色氨酸溶液2L，加入色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸和25mg/L的磷酸吡哆醛，1g/L的植酸，氨水调节pH为7.5，加入湿菌体10g，以0.5L/min的流速通氮气驱氧15min，维持温度35℃，在3L发酵罐上转化3h，以E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-N138Q为催化剂的IPA浓度为45.7mM，摩尔转化率为91.4％；以E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y为催化剂的IPA浓度为47.6mM，摩尔转化率为95.2％。
实施例3：利用重组菌发酵生产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)及酶法转化L-色氨酸生产IPA
(1)将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y接入LB斜面培养基37℃培养15h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养10h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比5％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4h后加入乳糖至终浓度为1g/L并降温至22℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L，发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得全细胞催化剂。
(2)利用组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)全细胞催化生产3-吲哚丙酮酸，其转化条件为：配制100mM L-色氨酸溶液2L，加入色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸和25mg/L的磷酸吡哆醛，1g/L的亚硫酸钠，氨水调节pH为7.5，加入湿菌体20g，以0.5L/min的流速通氮气驱氧15min，维持温度35℃，在3L发酵罐上转化5h，IPA浓度为87.4mM，摩尔转化率为87.4％。
实施例4：利用重组菌发酵生产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)及酶法转化L-色氨酸生产IPA
(1)将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y接入LB斜面培养基37℃培养15h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养10h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比5％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4h后加入乳糖至终浓度为1g/L并降温至22℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L，发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得全细胞催化剂。
(2)利用组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)全细胞催化生产3-吲哚丙酮酸，其转化条件为：配制100mM L-色氨酸溶液2L，加入色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸、25mg/L的磷酸吡哆醛，1g/L的亚硫酸钠、1g/L的植酸，氨水调节pH为7.5，加入湿菌体20g，以0.5L/min的流速通氮气驱氧15min，维持温度35℃，在3L发酵罐上转化5h，IPA浓度为92.2mM，摩尔转化率为92.2％。实施例5：利用重组菌发酵生产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)及酶法转化L-色氨酸生产IPA
(1)将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-hisC-P226F-R311Y接入LB斜面培养基37℃培养14h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养8h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比5％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4h后加入乳糖至终浓度为4g/L并降温至20℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L，发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得全细胞催化剂。
(2)利用组氨醇磷酸氨基转移酶突变体(hisC-P226F-R311Y)全细胞催化生产3-吲哚丙酮酸，其转化条件为：配制200mM L-色氨酸溶液2L，加入色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸、25mg/L的磷酸吡哆醛，1g/L的亚硫酸钠、1g/L的植酸，氨水调节pH为7.5，加入湿菌体30g，以0.5L/min的流速通氮气驱氧15min，维持温度37℃，在3L发酵罐上转化12h，IPA浓度为179.8mM，摩尔转化率为89.9％。
SEQ ID No.1:
Atgacgcgattacacgagctccggctgcacctcaacgagaacccctacccgccactgcccgaggtccgcgaggccctcgcggcgcagctggacgcggtcaaccgctatccggagttcaccccggtcacgctcgtcgggatgatcgccgactggctgggggtcgcccgtgaggcggtggcggtcggcaacggttcggtcgggatcgcgctccaggtcctcgacctgtgcacgggaccgggcgacgaggtggtgtacgggtggcggtcgttcgacgcgtatcccatcatcacgcggatggccggggccgaggccgtgcaggtgccgctgacggccgccggtgagcaggacctcgacggaatgctcgccgcggtcacaccgcggaccagggtcgtggtgctgtgcaacccgcacaacccgacgggcacggtcttcgaccgcatcgcgctgaagtccttcctcgcggccctgccggagcgcgtcacggtcgtcctggacgaggcgtaccacgagttcgcccgcgaccccgggatccccgacgggctggaccacctcgcggaccaccccaacctcctggtcctgcgcaccttctccaaggcctacgggctggccgcgctgcgcgtcggctactgcgtcgcggcgccggagctcgcggggcggctgcgggaggcgtcgctgccgtacggcatcagcccgctcgcccaggtcggggtggcggcgtcgctgggggcgcgggagcagctcacggcgcgcgtcgacgcgatcgtcggcgagcgcgaccggctgcgcgaggggctcgcccgtctcggctggcacagcttcccgagccacggcaacttcctgtggctcggggccggggacgcgagcgagcgcctcgcggcggcgctgggcggggccggggcgctggtgcgctgctacccgggcgaaggcgtgcggctgaccgtgggcctgcccgaggccaacgacctcgtcctgcgcgccgccggaccggcggccgcctga；
SEQ ID No.2：
MTRLHELRLHLNENPYPPLPEVREALAAQLDAVNRYPEFTPVTLVGMIADWLGVAREAVAVGNGSVGIALQVLDLCTGPGDEVVYGWRSFDAYPIITRMAGAEAVQVPLTAAGEQDLDGMLAAVTPRTRVVVLCNPHNPTGTVFDRIALKSFLAALPERVTVVLDEAYHEFARDPGIPDGLDHLADHPNLLVLRTFSKAYGLAALRVGYCVAAPELAGRLREASLPYGISPLAQVGVAASLGAREQLTARVDAIVGERDRLREGLARLGWHSFPSHGNFLWLGAGDASERLAAALGGAGALVRCYPGEGVRLTVGLPEANDLVLRAAGPAAA。
序列表
<110> 山东阳成生物科技有限公司
<120> 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 藤黄轮丝链霉菌菌株HY61(Streptomyces luteoverticillatusHY61)
<400> 1
atgacgcgat tacacgagct ccggctgcac ctcaacgaga acccctaccc gccactgccc 60
gaggtccgcg aggccctcgc ggcgcagctg gacgcggtca accgctatcc ggagttcacc 120
ccggtcacgc tcgtcgggat gatcgccgac tggctggggg tcgcccgtga ggcggtggcg 180
gtcggcaacg gttcggtcgg gatcgcgctc caggtcctcg acctgtgcac gggaccgggc 240
gacgaggtgg tgtacgggtg gcggtcgttc gacgcgtatc ccatcatcac gcggatggcc 300
ggggccgagg ccgtgcaggt gccgctgacg gccgccggtg agcaggacct cgacggaatg 360
ctcgccgcgg tcacaccgcg gaccagggtc gtggtgctgt gcaacccgca caacccgacg 420
ggcacggtct tcgaccgcat cgcgctgaag tccttcctcg cggccctgcc ggagcgcgtc 480
acggtcgtcc tggacgaggc gtaccacgag ttcgcccgcg accccgggat ccccgacggg 540
ctggaccacc tcgcggacca ccccaacctc ctggtcctgc gcaccttctc caaggcctac 600
gggctggccg cgctgcgcgt cggctactgc gtcgcggcgc cggagctcgc ggggcggctg 660
cgggaggcgt cgctgccgta cggcatcagc ccgctcgccc aggtcggggt ggcggcgtcg 720
ctgggggcgc gggagcagct cacggcgcgc gtcgacgcga tcgtcggcga gcgcgaccgg 780
ctgcgcgagg ggctcgcccg tctcggctgg cacagcttcc cgagccacgg caacttcctg 840
tggctcgggg ccggggacgc gagcgagcgc ctcgcggcgg cgctgggcgg ggccggggcg 900
ctggtgcgct gctacccggg cgaaggcgtg cggctgaccg tgggcctgcc cgaggccaac 960
gacctcgtcc tgcgcgccgc cggaccggcg gccgcctga 999
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 藤黄轮丝链霉菌菌株HY61(Streptomyces luteoverticillatusHY61)
<400> 2
Met Thr Arg Leu His Glu Leu Arg Leu His Leu Asn Glu Asn Pro Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Leu Pro Glu Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Gln Leu Asp Ala
20 25 30
Val Asn Arg Tyr Pro Glu Phe Thr Pro Val Thr Leu Val Gly Met Ile
35 40 45
Ala Asp Trp Leu Gly Val Ala Arg Glu Ala Val Ala Val Gly Asn Gly
50 55 60
Ser Val Gly Ile Ala Leu Gln Val Leu Asp Leu Cys Thr Gly Pro Gly
65 70 75 80
Asp Glu Val Val Tyr Gly Trp Arg Ser Phe Asp Ala Tyr Pro Ile Ile
85 90 95
Thr Arg Met Ala Gly Ala Glu Ala Val Gln Val Pro Leu Thr Ala Ala
100 105 110
Gly Glu Gln Asp Leu Asp Gly Met Leu Ala Ala Val Thr Pro Arg Thr
115 120 125
Arg Val Val Val Leu Cys Asn Pro His Asn Pro Thr Gly Thr Val Phe
130 135 140
Asp Arg Ile Ala Leu Lys Ser Phe Leu Ala Ala Leu Pro Glu Arg Val
145 150 155 160
Thr Val Val Leu Asp Glu Ala Tyr His Glu Phe Ala Arg Asp Pro Gly
165 170 175
Ile Pro Asp Gly Leu Asp His Leu Ala Asp His Pro Asn Leu Leu Val
180 185 190
Leu Arg Thr Phe Ser Lys Ala Tyr Gly Leu Ala Ala Leu Arg Val Gly
195 200 205
Tyr Cys Val Ala Ala Pro Glu Leu Ala Gly Arg Leu Arg Glu Ala Ser
210 215 220
Leu Pro Tyr Gly Ile Ser Pro Leu Ala Gln Val Gly Val Ala Ala Ser
225 230 235 240
Leu Gly Ala Arg Glu Gln Leu Thr Ala Arg Val Asp Ala Ile Val Gly
245 250 255
Glu Arg Asp Arg Leu Arg Glu Gly Leu Ala Arg Leu Gly Trp His Ser
260 265 270
Phe Pro Ser His Gly Asn Phe Leu Trp Leu Gly Ala Gly Asp Ala Ser
275 280 285
Glu Arg Leu Ala Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Ala Leu Val Arg Cys
290 295 300
Tyr Pro Gly Glu Gly Val Arg Leu Thr Val Gly Leu Pro Glu Ala Asn
305 310 315 320
Asp Leu Val Leu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Ala Ala
325 330

Claims (10)

1.一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，其特征在于组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的，具体突变为第66位缬氨酸突变为异亮氨酸、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺、第197位丝氨酸突变为组氨酸或第226位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸。
2.一种权利要求1所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的工程菌。
4.权利要求1所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体在催化L-色氨酸合成3-吲哚丙酮酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用方法为以含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以L-色氨酸为底物，以L-色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸为氨基受体，加入25mg/L的辅酶磷酸吡哆醛，1g/L的稳定保护剂的转化体系中，氨水调节pH为7.5，通氮气驱氧，温度30～40℃的条件下反应生产3-吲哚丙酮酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于在转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～40g/L，底物浓度为50～200mM，丙酮酸浓度为60～240mM。
7.权利要求3所述的含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌的制备方法，其特征在于所述方法具体如下：将含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～18h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养4～10h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比2～12％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4～12h后加入乳糖至终浓度为1～5g/L并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得组氨醇磷酸氨基转移酶突变体全细胞催化剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L，琼脂20g/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，氨苄西林100mg/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及终浓度：甘油20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 2g/L，KH2PO4 12.5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，柠檬酸1g/L，玉米浆干粉3g/L，CaCl2 1g/L，D-生物素20μg/L，pH6.7～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；所述的稳定保护剂为亚硫酸钠、植酸中的一种或组合使用。
CN202010962107.XA 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用 Active CN111996178B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111495917.XA CN114015669B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体197、工程菌及应用
CN202010962107.XA CN111996178B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用
CN202111495918.4A CN114015670B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体138、工程菌及应用
CN202111495932.4A CN114015671B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体66、工程菌及应用
PCT/CN2020/118927 WO2022052191A1 (zh) 2020-09-14 2020-09-29 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010962107.XA CN111996178B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111495932.4A Division CN114015671B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体66、工程菌及应用
CN202111495917.XA Division CN114015669B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体197、工程菌及应用
CN202111495918.4A Division CN114015670B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体138、工程菌及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111996178A true CN111996178A (zh) 2020-11-27
CN111996178B CN111996178B (zh) 2022-01-28

Family

ID=73469330

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111495917.XA Active CN114015669B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体197、工程菌及应用
CN202111495932.4A Active CN114015671B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体66、工程菌及应用
CN202111495918.4A Active CN114015670B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体138、工程菌及应用
CN202010962107.XA Active CN111996178B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111495917.XA Active CN114015669B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体197、工程菌及应用
CN202111495932.4A Active CN114015671B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体66、工程菌及应用
CN202111495918.4A Active CN114015670B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体138、工程菌及应用

Country Status (2)

Country Link
CN (4) CN114015669B (zh)
WO (1) WO2022052191A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114634918A (zh) * 2022-05-19 2022-06-17 鲁东大学 一种d-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
WO2022179591A1 (zh) * 2021-02-25 2022-09-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌
CN116286703A (zh) * 2023-05-25 2023-06-23 鲁东大学 L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020106672A1 (en) * 2000-09-09 2002-08-08 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the hisC2 gene
US20030121072A1 (en) * 1998-11-05 2003-06-26 Allen Stephen M. Plant histidinol-phosphate aminotransferase homologs
CN107828753A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 湖北工业大学 组氨醇磷酸氨基转移酶的多克隆抗体及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60332487D1 (de) * 2002-12-12 2010-06-17 Showa Denko Kk Verfahren zur selektion eines ein fremdgen überexprimierenden escherichia coli-stamms, so selektionierte escherichia coli-mutante und verfahren zur herstellung eines enzyms und einer verbindung unter verwendung davon
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
WO2009028338A1 (ja) * 2007-08-24 2009-03-05 Ajinomoto Co., Inc. 新規オキシダーゼ遺伝子、および該遺伝子を利用する３－インドールピルビン酸の製造方法
RU2403286C2 (ru) * 2008-04-04 2010-11-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, днк, кодирующая ее, бактерия, содержащая указанную днк, способ продукции пуриновых нуклеозидов и cпособ продукции пуриновых нуклеотидов
JP5521347B2 (ja) * 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030121072A1 (en) * 1998-11-05 2003-06-26 Allen Stephen M. Plant histidinol-phosphate aminotransferase homologs
US20020106672A1 (en) * 2000-09-09 2002-08-08 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the hisC2 gene
CN107828753A (zh) * 2017-11-30 2018-03-23 湖北工业大学 组氨醇磷酸氨基转移酶的多克隆抗体及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDRA BINTER 等: "Characterization of the PLP-dependent aminotransferase NikK from Streptomyces tendae and its putative role in nikkomycin biosynthesis", 《FEBS JOURNAL》 *
FENG,Z.等: "ACCESSION AZQ75154.1", 《GENBANK》 *
LI WENLI 等: "Cloning, sequencing and function of sanB, a gene related to nikkomycin biosynthesis of Streptomyces ansochromogenes", 《CHINESE SCIENCE BULLETIN》 *
王敏杰等: "瓜类细菌性果斑病菌组氨酸营养缺陷型与致病性相关", 《微生物学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022179591A1 (zh) * 2021-02-25 2022-09-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌
CN114634918A (zh) * 2022-05-19 2022-06-17 鲁东大学 一种d-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
CN114634918B (zh) * 2022-05-19 2022-10-28 鲁东大学 一种d-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
CN116286703A (zh) * 2023-05-25 2023-06-23 鲁东大学 L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用
CN116286703B (zh) * 2023-05-25 2023-08-08 鲁东大学 L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114015669A (zh) 2022-02-08
CN114015671A (zh) 2022-02-08
CN114015669B (zh) 2023-01-03
CN111996178B (zh) 2022-01-28
CN114015670A (zh) 2022-02-08
CN114015671B (zh) 2023-01-03
CN114015670B (zh) 2023-01-03
WO2022052191A1 (zh) 2022-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111996178B (zh) 一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用
CN106754846B (zh) 一种具核梭杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
CN107889504B (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN111321193B (zh) 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法
CN114634918B (zh) 一种d-氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用
CN109735522B (zh) 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
CN113151198B (zh) 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN114438005B (zh) 一种用于合成靛蓝色素重组菌的构建方法及应用
CN108841844B (zh) 一种高效生产苯丙酮酸的方法
CN111808829B (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN113151199A (zh) 一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN113444701B (zh) 酿酒酵母内源角鲨烯单加氧酶突变体及应用
JP7554359B2 (ja) グルタミン酸－システインリガーゼ変異体及びそれを用いたグルタチオン生産方法
CN117904019A (zh) 一种以玉米秸秆水解液为底物发酵生产乙醇酸的方法
CN113564090A (zh) 一种用于产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用
CN116286703B (zh) L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用
CN116478942B (zh) 一种异丁香酚单加氧酶突变体、工程菌及应用
CN114921432B (zh) 一种转氨酶突变体及其工程菌与应用
CN113621592B (zh) 一种转氨酶突变体及其编码基因与应用
TW202202621A (zh) 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法
CN110904086B (zh) 一种色氨酸酶突变体及其应用
CN109576200A (zh) 一种产谷氨酸消旋酶的重组菌及其构建方法和应用
CN114250237B (zh) 一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用
CN107201355B (zh) 一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用
AU2021242116A1 (en) Glutamate-Cysteine Ligase Variant And Method Of Producing Glutathione Using The Same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A histone phosphate aminotransferase mutant, engineering strain and its application

Effective date of registration: 20220530

Granted publication date: 20220128

Pledgee: Shandong juancheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Plaza sub branch

Pledgor: SHANDONG YANGCHENG BIOTECH Co.,Ltd.

Registration number: Y2022980006634