CN104357468A - 食清洁剂细小棒菌zjb14001、卤醇脱卤酶基因、酶、工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种编码卤醇脱卤酶的基因、含有该基因的重组载体、该重组载体构建得到的重组基因工程菌以及提供该基因的新菌株--食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)ZJB14001；重组卤醇脱卤酶作为转化用酶，以催化1,3-二氯-2-丙醇为例合成环氧氯丙烷；以催化CN-介导的(S)-环氧氯丙烷开环反应为例，制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈；以催化1,3-二氯-2-丙醇和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为例，CN-介导开环，分别制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
Description
(一)技术领域
本发明涉及来源于食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans ZJB14001)菌株中的卤醇脱卤酶基因，及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备重组卤醇脱卤酶，制备手性卤代醇、环氧化物和β--取代醇中的应用。
(二)背景技术
卤醇脱卤酶(EC 4.5.1.X)，又称卤醇裂解酶，通过分子内亲核取代机制可催化脂肪族和芳香族的邻卤代醇转化为环氧化物，并释放卤素离子(图1)；同时，在离子亲核试剂(如N3 -、NO2 -、CN-、SCN-和OCN-)存在时，卤醇脱卤酶可以高选择性地催化亲核试剂所介导的环氧化物开环反应，生成对应的光学纯的β-取代醇(图2)，其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体。手性氨基醇是众多医药中间体、精细化学品和生物活性物质的重要前提物质。硫氰酸根和氰酸根拆分环氧化物可获得异硫氰酸和噁唑烷酮，它们在被广泛用于农用化学试剂和高分子化合物的合成。
荷兰学者Janssen依据序列同源性和底物特异性将卤醇脱卤酶分为3类(A、B和C)。卤醇脱卤酶保守的催化三联体Ser-Tyr-Arg参与催化反应，其中Ser与底物羟基氧原子形成氢键，稳定底物与酶的结合，Arg夺取Tyr酚羟基上的一个氢原子，从而降低Tyr的pKa。失去一个氢原子的Tyr酚羟基氧作为亲核试剂，夺取底物羟基上的氢原子，使得底物羟基氧负离子亲核进攻邻位碳卤键，释放卤离子，形成环氧化物。
近年，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，如Agrobacterium radiobacter AD1，Agrobacter sp.AD2，Corynebacterium sp.N-1074，Agrobacterium tumefaciens，Arthrobacter erithii H10a，Alcaligenes sp.DS-K-S38和Pseudomonas sp.DS-k-2DI等。部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆表达和表征，并应用于催化合成环氧化合物及β-取代醇。
美国CODEXIS早在2004年申请的一项专利WO2004/015132A2，发明了通过分子定向进化技术，制备了一系列卤醇脱卤酶的突变体酶，并实现了卤醇脱卤酶在制备阿托伐他汀钙侧链关键中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的工业化应用。巴斯夫欧洲公司在2007年申请的一项专利“利用卤代醇从外销旋环氧化物和氰酸盐制备光学活性的5-取代的2-恶唑烷酮的方法”(CN 101437955A)，利用卤醇脱卤酶作为催化剂，氰酸盐作为亲核试剂，拆分环氧化物制备5-取代的2-恶唑烷酮。国内安琪酵母股份有限公司在2008年申请的一项专利“卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用”(CN 10760468A)，其通过定点突变技术获得一个高活力的卤醇脱卤酶，然后研究确立了该突变体酶的发酵生产的最佳工艺条件。苏州汉酶生物技术有限公司在2012申请的一项专利“一种卤醇脱卤酶的生产方法”(CN 102634502A)，其主要工作是优化了卤醇脱卤酶的发酵条件，将发酵酶活提高到900U/mL，专利中未涉及卤醇脱卤酶基因序列信息。
虽然卤醇脱卤酶在制备许多光学纯的环氧化物和β-取代醇中具有重要的应用价值，但是卤醇脱卤酶基因的稀少大大限制了卤醇脱卤酶的应用。因此，开发研究新型的卤醇脱卤具有重要的理论研究意义和应用价值。
(三)发明内容
卤醇脱卤酶基因序列较少，大部分关于卤醇脱卤酶应用的专利申请都是围绕卤醇脱卤酶HheC。本发明的目的是提供一种卤醇脱卤酶基因及其重组表达载体、基因工程菌，及其在制备卤醇脱卤酶；制备手性卤代醇、环氧化物和β-取代醇中的应用。本发明的主要内容包括克隆表达了一种新型的卤醇脱卤酶基因；构建了该卤醇脱卤酶基因的重组载体，并转化到对应的宿主中获得产卤醇脱卤酶的重组工程菌；发酵生产卤醇脱卤酶并及将其应用于卤代醇、环氧化物和β-取代醇的制备。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)的卤醇脱卤酶HHDH-PL基因，所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。
本发明所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因由如下方法得到：利用微生物筛选技术，经过初筛和复筛，获得一株能够降解1,3-二氯-2-丙醇的菌株，分子鉴定该菌株为Parvibaculum lavamentivorans，命名为ZJB14001。利用PCR技术，克隆表达了6条短链脱氢酶(SDR)基因，通过活力分析发现其中一条SDR基因序列编码的蛋白具有卤醇脱卤酶的活力，我们命名为卤醇脱卤酶HHDH-PL，其基因核苷酸序列(SEQ IDNO：1)为：
1 ATGGCGCGCA GCATTCTCAT CACCGACATA GCGCATTTCGTCGGCGGCCC GTCCGCCCGC
61 GCCCTCCTCG CCGAAGGCGC CCGCATCTAT GGCGTCGATGCAAGCTTCGC GGATGCCGCC
121 GCCCGCGCCG CCTTCGAGAC GAAGATACCC GGCGTGAAAGCACTCTCCGC GCAAGACCCG
181 CGGGAAGCCG TCGCCGCGGT GCTGGAAGCC GAGGGCCGCCTCGACGTCCT CATCAACAAT
241 GATGCCTGGC CCGCTATGCG CGGTCCCGTG GACGAAGCAACCGACAAGGA CCTCCACGAA
301 ACCTTCGAGG CGCTGGTCTT CAAATCCTTC GCCATGACGCGCGCCGCCGT ACCGCAGATG
361 AAAAAGCAGC GCGCGGGAAA AATTCTCTTC CTCTCCTCCGCCGCACCGCT GAACGGCATC
421 CCCAACTACA GCATCTATGC CGCCGCGCGC GGCGCCGCCAATTCGCTCGC GCTGACGCTG
481 GCAAAGGAAC TCGCCCCCTC CAACATCCAG GTGAACGCCCTCGCCTTCAA CTTCATCGAA
541 AGCCCGGACT ACTTCCCCGC ATCGCTCCTT GAAAATCCGAAATCGCGCGA CAAGATATTG
601 TCGAACATTC CGCTCGGCCG CCTCGGCAAG CCGGAAGAAGCCGCCGCCAT CGTCGCCTTC
661 CTCGCCGGCC CGACATCGGA TTTCATCACC GGCCAGTTGATCCCGGTCGC CGGCGGTTGG
721 GCCACCGCGC GCTAG
本发明卤醇脱卤酶HHDH-PL基因编码的酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)为：
1 MARSILITDI AHFVGGPSAR ALLAEGARIY GVDASFADAAARAAFETKIP GVKALSAQDP
61 REAVAAVLEA EGRLDVLINN DAWPAMRGPV DEATDKDLHETFEALVFKSF AMTRAAVPQM
121 KKQRAGKILF LSSAAPLNGI PNYSIYAAAR GAANSLALTLAKELAPSNIQ VNALAFNFIE
181 SPDYFPASLL ENPKSRDKIL SNIPLGRLGK PEEAAAIVAFLAGPTSDFIT GQLIPVAGGW
241 ATAR*
本发明还涉及一种含有所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组载体，以及重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体方法为：
本申请发明人设计卤醇脱卤酶HHDH-PL克隆引物3(CCATGGCGCGCAGCATTCTC)和引物4(CTCGAGCTAGCGCGCGGTGGCCC)，将卤醇脱卤酶HHDH-PL编码基因克隆到载体pMD18-T，转化到大肠杆菌JM109。通过菌落PCR筛选得到阳性克隆子，并经测序分析确认HHDH-PL基因被正确克隆。提取阳性克隆子的质粒，用NcoI和XhoI限制性内切酶酶切，经胶回收获得目的基因片段，然后连接至经同样酶处理的pET32a载体，转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)。本发明将卤醇脱卤酶基因HHDH-PL同表达载体pET32a连接，构建了含有卤醇脱卤酶基因的表达重组基因工程菌pET32a-HHDH-PL(图3)。通过SDS-PAGE分析HHDH-PL蛋白基因在大肠杆菌中成功表达(图5)。
本发明还涉及一种含有所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组载体，以及用所述重组载体构建得到的重组基因工程菌，具体方法为
本申请发明人根据测序结果设计酵母胞外表达引物5(GAATTCATGGCGCGCAGCATTCTC)和引物6(TCTAGACTAGCGCGCGGTGGCCC)，克隆到载体pMD18-T，转化到克隆宿主大肠杆菌JM109。通过菌落PCR和通过DNA测序获得阳性克隆子。提取阳性克隆子的质粒，用EcoRI和XbaI限制性内切酶酶切，经胶回收获得目的基因片段，然后连接至经同样酶处理的pPICZ-A载体，转化到JM109。筛选阳性克隆子，提取质粒pPICZA-HHDH-PL，经SacI酶线性化后，电击转化到毕赤酵母宿主X-33中。阳性克隆经SDS-PAGE电泳验证和活力分析，成功表达卤醇脱卤酶HHDH-PL(图4)。本发明通过pPICZ A质粒，将卤醇脱卤酶HHDH-PL基因整合到酵母基因组中，构建了产卤醇脱卤酶的酵母工程菌X-33/HHDH-PL。
本发明涉及所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因在制备重组卤醇脱卤酶HHDH-PL中的应用，所述应用为下列之一：(1)以pET32a为表达载体，构建含所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建胞内分泌产卤醇脱卤酶HHDH-PL的重组基因工程菌，将获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，获得含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的菌体细胞；(2)以pPICZa-A为穿梭质粒，构建含所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组质粒，将所述重组质粒整合到毕赤酵母X-33，构建胞外分泌产卤醇脱卤酶HHDH-PL的重组基因工程菌，将获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，获得含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的菌体细胞。
本发明提供一种所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在制备环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以卤代醇为底物，以pH 7.5磷酸缓冲液为反应介质，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含环氧化物的混合液，将混合液分离纯化获得环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-1-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇、2,3-二溴-2-丙醇、1-溴-2-丙醇、1-氯-2-丙醇、2-溴乙醇、3-氯-1,2-丙二醇、4-氯-3-羟基丁腈、4-氯-3-羟基丁酸乙酯或2-氯-1-苯乙醇；所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述湿菌体的加入量为20g/L缓冲液，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为5g/L缓冲液。
本发明还提供一种所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在拆分环氧化物制备β-卤代醇中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以(S)-环氧氯丙烷为底物，加入亲核试剂，以pH 7.0磷酸缓冲液为反应介质，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含(S)-4-氯-3-羟基丁腈的混合液，将混合液分离纯化获得(S)-4-氯-3-羟基丁腈；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述亲核试剂的用量为40mmol/L缓冲液，所述湿菌体的加入量为20g/L缓冲液，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为5g/L缓冲液。
本发明提供一种所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在催化卤代醇制备β-取代醇中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以50mMNaH2PO4水溶液为反应介质，加入亲核试剂调节pH值为7.5，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含β-取代醇的混合液，将混合液分离纯化获得(S)-4-氯-3-羟基丁腈；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L反应介质，所述湿菌体的加入量为40g/L反应介质，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为6.7g/L反应介质。
本发明提供一种所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，以50mM NaH2PO4水溶液为反应介质，加入亲核试剂调节pH值为7.5，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的混合液，将混合液分离纯化获得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L反应介质，所述湿菌体的加入量为40g/L反应介质，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为6.7g/L反应介质。
此外，本发明还涉及一株新菌株--食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)ZJB14001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月8日，保藏编号为CCTCC M NO:2014373，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明的有益结果主要体现在：本发明筛选得到一株产卤醇脱卤酶的菌株--食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)ZJB14001，利用基因克隆和测序技术从菌株中提取得到卤醇脱卤酶基因核苷酸序列和氨基酸序列；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET32a-HHDH-PL，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得产卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌。也可通过pPICZ A载体，将HHDH-PL基因克隆到pPICZ A-HHDH-PL载体上，电击转化至毕赤酵母中，构建产卤醇脱卤酶的重组酵母工程菌。利用大肠杆菌重组菌发酵获得的菌体(HHDH-PL在胞内表达)，或者酵母工程菌发酵获得的酶液(HHDH-PL分泌表达至胞外)，进行生物转化与催化。重组卤醇脱卤酶作为转化用酶，以催化1,3-二氯-2-丙醇为例合成环氧氯丙烷；以催化CN-介导的(S)-环氧氯丙烷开环反应为例，制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈；以催化1,3-二氯-2-丙醇和(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为例，CN-介导开环，分别制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。
(四)附图说明
图1为卤醇脱卤酶催化的闭环和开环反应式；
图2为卤醇脱卤酶拆分环氧化物制备β-取代醇反应式；
图3为质粒载体pET32a-HHDH-PL重组质粒物理图谱；
图4为质粒载体pPICZaA-HHDH-PL重组质粒物理图谱；
图5为重组基因工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)表达卤醇脱卤酶HHDH-PL(约42kDa)的SDS-PAGE电泳图，泳道1是HHDH-PL粗酶液；泳道2是经镍柱纯化后的HHDH-PL；泳道M是蛋白标准分子量。
图6为重组基因工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33表达卤醇脱卤酶HHDH-PL(约26kDa)的SDS-PAGE电泳图，泳道1是HHDH-PL胞外分泌表达的酶液；泳道M是蛋白标准分子量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1菌株的筛选及鉴定
采集来自舟山沿海地区的土壤和海水，用富集培养基富集之后，涂布于富集培养基的平板上，30℃培养一周。将分离得到的不同形态的单菌落用发酵培养基(发酵培养基组成：NaCl 5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L,溶剂为去离子水，pH值自然。)在30℃进行培养，获得大量湿菌体。
以0.2g湿菌体为催化剂，以20mmol/L的1,3-二氯丙醇为底物，以50mM、pH7.0的PBS 20ml为反应介质，在37℃进行转化反应30min，反应结束后，取反应液用乙酸乙酯萃取后，取乙酸乙酯层进行GC分析反应液中产物的含量。筛选获得的一株具卤醇脱卤酶活力的菌株(底物转化率为15％)，记为菌株ZJB14001。
菌株ZJB14001经16S分子生物学鉴定(核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示)，与NCBI数据库中食清洁剂细小杆菌(Parvibaculum lavamentivorans)的同源性为99％，将菌株ZJB14001鉴定为食清洁剂细小杆菌(Parvibaculum lavamentivorans)，命名为食清洁剂细小杆菌(Parvibaculum lavamentivorans)ZJB14001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月8日，保藏编号为CCTCC M NO:2014373，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
GC分析条件为：气相柱为BGB175。程序：检测器和进样口温度均为220℃，柱温为90℃保留10min，产物(R)-环氧氯丙烷和(S)-环氧氯丙烷的保留时间分别为5.6和5.8min.。
富集培养基组成为：NaCl 5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
富集培养基的平板是在富集培养基中添加终浓度为20g/L的琼脂。
实施例2食清洁剂细小杆菌ZJB14001的培养条件
(1)斜面培养
将食清洁剂细小杆菌ZJB14001接种至斜面培养基，在30℃培养7天，获得斜面菌体；
斜面培养基成分为：NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，CaCl20.02g/L和琼脂2.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
(2)发酵培养
从斜面菌体挑取菌落接种至发酵培养基，在30℃、150rpm下培养5天，获得含菌发酵液。
发酵培养基成分为：NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，CaCl20.02g/L，溶剂为水，pH值自然。
实施例3：卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的克隆
用核酸快速提取仪(购自eppendorf)提取实施例2获得的Parvibaculumlavamentivorans ZJB14001菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以引物3和引物4作为扩增引物进行PCR。PCR反应体系各组分加入量(总体积100μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 10μL(Mg2+)，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)0.5μL，浓度为50μM的克隆引物3、引物4各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu Taq DNA Polymerase 1μL，无核酸水86.5μL。
引物3：3′-CCATGGCGCGCAGCATTCTC-5′；
引物4：3′-CTCGAGCTAGCGCGCGGTGGCCC-5′
采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃3min，然后进入温度循环94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为8℃。
取10μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp左右出现明显条带。将剩余的90μL电泳进行胶回收目的基因，与PMD18-T载体(购自Takara)连接，得到克隆重组质粒pMD18-HHDH-PL。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑方法进行筛选，随机挑取白色克隆子测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物3和引物4扩增到的核苷酸序列长度为724bp(其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。
实施例4：重组大肠杆菌基因工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)的构建
从实施例3获得的重组菌PMD18-T-HHDH-PL/JM109中提取质粒pMD18-T-HHDH-PL(采用购自AxyGen的质粒提取试剂盒)，载体质粒pET32a(+)(购自Invitrogen公司)。两种质粒经NcoI和XhoI限制性内切酶酶切3h，核酸凝胶电泳，分别回收目的基因和载体pET32a(购自AxyGen的胶回收试剂盒)。利用T4连接酶，将目的基因与载体pET32a连接，16℃连接过夜。将连接产物在65℃灭火30min，取10μL连接产物，加入在预先制备好的化学感受态E.coli BL21(DE3)中，冰浴30min，然后在42℃水浴中热击90s，再次冰浴3-5min。拿出冰浴后的感受态，迅速加入600μL新鲜的无菌LB培养基，在37℃空气摇床上培养复苏1h。然后取200μL涂布于带50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，倒置于37℃培养箱培养过夜。
次日，将长出菌落的平板拿出，随机挑选20个左右的单菌落于无菌的EP管中，加入50μL的无菌水，在沸水浴中煮30min，离心2min，用上清作为质粒模板，用通用的T7和T7ter作为前后引物，菌落PCR筛选阳性克隆子。将阳性克隆子保藏，培养后送上海桑尼测序公司测序，分析比对后，确定HHDH-PL基因正确连入表达载体。获得的阳性重组大肠杆菌基因工程菌命名为pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)，其物质图谱见附图3。同样条件下，构建含空载体的重组大肠杆菌基因工程菌pET32/BL21(DE3)为对照。
实施例5：重组酵母基因工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33的构建
根据实施例3的测序结果设计引物5和引物6，二者分别带有EcoRI和XbaI限制性酶切位点。利用高保真Pfu DNA聚合酶(fermentas)扩增目的基因，胶回收目的基因片段，连入pMD18-T载体，用实施例4中的菌落PCR筛选方法(这里所用的通用引物是M13F和M13R)，筛选阳性克隆子pMD18-HHDH-PL，经质粒测序分析确定阳性克隆子的正确连接。提取阳性克隆子携带目的基因的质粒pMD18-HHDH-PL，载体质粒pPICZ-A(购自购自Invitrogen公司)，两种质粒经限制内切酶EcoRI和XbaI酶切3h后，胶回收对应的目的基因片段和载体片段。用实施例4的方法，用T4连接酶将目的基因HHDH-PL和载体pPICZ-A进行连接，连接产物转化至E.coli JM109感受态，涂布于带有25μg/mL博来霉素LB平板。再次利用菌落PCR的方法筛选阳性克隆子，经测序确定正确连接HHDH-PL基因的重组菌pPICZ-A-HHDH-PL/JM109。提取携带目的基因的质粒pPICZ-A-HHDH-PL，经限制性内切酶SacI线性化处理3h，胶回收酶切的质粒片段。取出预先制备好的毕赤酵母X-33感受态，在冰上融化后，取5μL线性化后的基因，与感受态细胞混匀后，置于无菌的点击杯中，冰浴2min，电击转化5ms，加入1mL无菌的1mol/L的山梨醇，置于30℃摇床温浴3h。涂布于带25μg/ml博莱霉素抗性的YPD平板，在30℃条件下倒置培养3天。随机挑取10个单菌落经诱导表达(诱导表达的方法见实施例7)SDS-PAGE检测，可以表达大约42kDa左右蛋白的菌落为重组酵母基因工程菌pPICZ-A-HHDH-PL/X-33，其物理图谱见附图4。同样条件下以含空载体的重组酵母基因工程菌pPICZ-A/X-33为对照。
引物M13F为：TGTAAA ACGACGGCCA。
引物M13R为：CAGGAA ACAGCTATGACC。
实施例6：重组基因工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)制备卤醇脱卤酶及纯化
将实施例4验证后的含有胞内表达重组质粒pET32-HHDH-PL的重组大肠杆菌BL21/pET32-HHDH-PL接种至含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃培养12h，再以1％(v/v)接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，4℃、10000rpm/min离心10min，收集含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。菌体细胞按照1g湿菌体：1mL蒸馏水的比例，重悬菌体。利用超声破碎仪(功率50％)进行破碎15min左右，高速离心12，000rpm×10min，弃沉淀，收集上清。按照标准的镍柱纯化方法(伯乐低压纯化仪，参考镍柱纯化蛋白说明书，Ni-NTA Purification System)纯化目的蛋白，再经SDS-PAGE验证，见附图5，表明获得了目的蛋白。
实施例7：重组基因工程菌pPICZ-A-HHDH-PL/X-33制备卤醇脱卤酶及纯化
将实施例5验证后的可胞外表达HHDH-PL的重组酵母菌X-33/pPICZ-HHDH-PL在YPD平板上划线，30℃培养获得单菌落。在平板上挑取单菌落，接种于种子培养基，30℃培养24h，离心收集菌体，弃上清。1g菌体用2ml发酵培养基重悬后，以体积浓度5％的接种量接种到BMMY培养基30ml进行扩大培养，并加入终浓度0.5％(v/v)的甲醇诱导3天，培养温度均为30℃，取培养液4℃、10000rpm/min离心10min。弃沉淀，收集上清液28ml，即为胞外分泌表达的脱卤酶酶液。
YPD培养基：1wt％酵母粉，2wt％蛋白胨，2wt％葡萄糖，溶剂为蒸馏水，pH值自然。
每100mL种子培养基组成为：1g酵母粉，2g蛋白胨，0.34g YNB，1mL甘油，4×10-5g生物素，1g(NH4)2SO4，0.1mol/L、pH 6.0磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，加蒸馏水水定容至100mL。
每100mL发酵培养基组成为：1g酵母粉，2g蛋白胨，0.34g YNB，4×10-5g生物素，1g(NH4)2SO4，0.1mol/L、pH 6.0磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，加蒸馏水水定容至100mL。
将收集的酶液，用水膜(滤膜，0.22μm孔径)抽滤除去固体颗粒。滤液用Biomax30超滤膜进行超滤浓缩，除盐。超滤滤液用DEAE离子交换柱进行洗脱。DEAE纯化平衡液BufferA为50mmol Tris-H2SO4，洗脱液BufferB为含1M NaCl的BufferA。Biorad低压蛋白层析仪，流速2ml/min，柱体积约为10ml。穿透峰主要是杂蛋白，洗脱分三个阶段，10％BufferB洗脱液(即体积浓度10％BufferB+体积浓度90％BufferA)除去主要的杂蛋白，30％BufferB(即体积浓度30％BufferB+体积浓度70％BufferA)洗脱为目的蛋白，90％BufferB洗脱液(即体积浓度90％BufferB+体积浓度10％BufferA)为其他杂蛋白。纯化后的蛋白经SDS-PSGE检测，见附图6，获得了与预测分子量大小相符的纯酶。
实施例8：卤醇脱卤酶HHDH-PL制备环氧化物
(1)以实施例6工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)发酵获得的卤醇脱卤酶菌体或者实施例7工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33发酵获得的卤醇脱卤酶酶液为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物制备环氧氯丙烷，同样条件下工程菌pET32/BL21(DE3)发酵培养的菌体和工程菌pPICZ-A/X-33发酵上清液作对照。反应体系为：50mM、pH7.5磷酸缓冲液20ml，温度40℃，转速150rpm/min，加入浓度为20mmol/L缓冲液的底物1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)，实施例6制备的湿菌体加入量为0.4g，实施例7制备的酶液4ml(相当于0.1g湿菌体经发酵培养液获得的上清液)，进行催化反应。底物1,3-DCP和产物环氧氯丙烷(ECH)的检测方法为：采用气相色谱Agilent 7890A测定，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；分析条件：柱温90℃，进样室温度230℃，FID检测器250℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。保留时间：产物ECH为2.93min，底物1,3-DCP为4.18min。转化结果见表1。
(2)同样条件下，以卤醇脱卤酶HHDH-PL对1，3-二氯丙醇的活力为100％，作为对照，考察卤醇脱卤酶对其他卤代醇底物的活力，卤醇脱卤酶对卤代醇底物的相对活力见表2。
表1：HHDH-PL转化1,3-DCP制备ECH
表2：HHDH-PL以卤代醇为底物制备环氧化物
实施例9：卤醇脱卤酶HHDH-PL拆分环氧化物制备β-取代醇
以实施例6工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)发酵获得的卤醇脱卤酶菌体或者实施例7工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33发酵获得的卤醇脱卤酶酶液为催化剂，以(S)-环氧氯丙烷(ECH)为底物，CN-作为亲核试剂，制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈，同样条件下工程菌pET32/BL21(DE3)发酵培养的菌体和工程菌pPICZ A/X-33发酵上清液作对照。
反应体系为：以50mM pH 7.0磷酸缓冲液20ml为反应介质，先向缓冲液中加入终浓度40mmol/L缓冲液的30wt％氰化钠水溶液，用稀硫酸调节pH至7.0，再加入终浓度20mmol/L缓冲液的底物(S)-ECH，然后分别加入实施例6方法获得湿菌体0.4g、实施例7方法获得的酶液4ml(相当于分离前0.1g湿菌体获得的上清液)，在温度40℃，转速150rpm/min条件下进行催化反应，反应完全后，取反应液进行底物和产物检测。底物ECH和产物(S)-4-氯-3-羟基丁腈(BN)的检测方法为：采用气相色谱Agilent 6890N测定，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温60℃保持4min，20℃/min程序升温至160℃，保持2min。进样口温度230℃，FID检测器250℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。保留时间为：底物ECH为4.1min，产物4-氯-3-羟基丁腈为8.5min。转化结果见表3。
表3：HHDH-PL转化环氧氯丙烷制备4-氯-3-羟基丁腈
| 酶 | ECH转化率(％) | BN产率(％) |
| E.coli(pET32a-HHDH-PL) | 100 | 88 |
| E.coli(pET32a) | 3 | 1.2 |
| 毕赤X-33(HHDH-PL)上 | 83 | 68 |
| 清 | ||
| 毕赤X-33上清 | 3 | 1.0 |
实施例10：卤醇脱卤酶HHDH-PL催化卤代醇亲核试剂介导开环制备β-取代醇
以实施例6工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)发酵获得的卤醇脱卤酶菌体或者实施例7工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33发酵获得的卤醇脱卤酶酶液为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)为底物，CN-作为亲核试剂，制备(S)-4-氯-3-羟基丁腈，同样条件下工程菌pET32/BL21(DE3)发酵培养的菌体和工程菌pPICZ A/X-33发酵上清液作对照。
向250mL三口烧瓶中加入150mL、50mM NaH2PO4水溶液作为反应介质，温度升至40℃，用pH电位滴定仪流加30wt％氰化钠溶液调节pH至7.3，加入20mmol/L反应介质1,3-DCP，分别加入实施例6方法获得湿菌体6g、实施例7方法获得的酶液40ml(相当于分离前1g湿菌体获得的上清液)，流加30wt％氰化钠水溶液控制pH在7.5，在40℃、转速150rpm/min条件下进行催化反应，反应完全后，取反应液进行底物和产物检测。底物1,3-DCP和产物(S)-4-氯-3-羟基丁腈的检测方法为：采用气相色谱Agilent 7890A测定，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温60℃保持4min，20℃/min程序升温至160℃，保持2min。进样口温度230℃，FID检测器250℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。底物1,3-DCP保留时间为6.5min，中间物ECH保留时间为4.1min，产物4-氯-3-羟基丁腈保留时间为8.5min。转化结果见表4。
表4：HHDH-PL转化1,3-二氯丙醇制备4-氯-3-羟基丁腈
| 酶 | 1,3-DCP转化率(％) | BN产率(％) |
| E.coli(pET32a-HHDH-PL) | 100 | 88 |
| E.coli(pET32a) | 0 | 0 |
| 毕赤X-33(HHDH-PL)上清 | 65 | 57 |
| 毕赤X-33上清 | 0 | 0 |
实施例11
以实施例6工程菌pET32-HHDH-PL/BL21(DE3)发酵获得的卤醇脱卤酶菌体或者实施例7工程菌pPICZ A-HHDH-PL/X-33发酵获得的卤醇脱卤酶酶液为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)为底物，CN-作为亲核试剂，制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)，同样条件下工程菌pET32/BL21(DE3)发酵培养的菌体和工程菌pPICZ A/X-33发酵上清液作对照。
向250mL三口烧瓶中加入150mL、50mM NaH2PO4水溶液作为反应介质，温度升至40℃，用pH电位滴定仪流加30wt％氰化钠溶液调节pH至7.3，加入50g/L反应介质的(S)-CHBE为底物，分别加入实施例6方法获得湿菌体6g、实施例7方法获得的酶液40ml(相当于分离前1g湿菌体获得的上清液)，流加30wt％氰化钠水溶液控制pH在7.5，在40℃、转速150rpm/min条件进行催化反应，反应完全后，取反应液进行底物和产物检测。底物(S)-CHBE和HN的检测方法为：采用气相色谱Agilent7890A测定，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温120℃保持4min，20℃/min程序升温至180℃，保持1min。进样口温度230℃，FID检测器250℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。底物(S)-CHBE保留时间为4.9min，产物HN的保留时间为6.2min。转化结果见表5。
表5：HHDH-PL转化(S)-CHBE制备HN
Claims (10)
1.一种来源于食清洁剂细小棒菌的卤醇脱卤酶HHDH-PL基因，其特征在于所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.一种权利要求1所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因编码的酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
3.一种含有权利要求1所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组载体。
4.一种用权利要求3所述重组载体转化得到的产卤醇脱卤酶的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因在制备重组卤醇脱卤酶HHDH-PL中的应用，其特征在于所述应用为下列之一：(1)以pET32a为表达载体，构建含所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，构建胞内分泌产卤醇脱卤酶HHDH-PL的重组基因工程菌，将获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，获得含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的菌体细胞；(2)以pPICZa-A为穿梭质粒，构建含所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的重组质粒，将所述重组质粒整合到毕赤酵母X-33，构建胞外分泌产卤醇脱卤酶HHDH-PL的重组基因工程菌，将获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分离，取上清液，获得含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的酶液。
6.一种权利要求2所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在制备环氧化物中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以卤代醇为底物，以pH 7.5磷酸缓冲液为反应介质，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含环氧化物的混合液，将混合液分离纯化获得环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-1-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇、2,3-二溴-2-丙醇、1-溴-2-丙醇、1-氯-2-丙醇、2-溴乙醇、3-氯-1,2-丙二醇、4-氯-3-羟基丁腈、4-氯-3-羟基丁酸乙酯或2-氯-1-苯乙醇；所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述湿菌体的加入量为20g/L缓冲液，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为5g/L缓冲液。
7.一种权利要求2所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在拆分环氧化物制备β-卤代醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以(S)-环氧氯丙烷为底物，加入亲核试剂，以pH 7.0磷酸缓冲液为反应介质，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含(S)-4-氯-3-羟基丁腈的混合液，将混合液分离纯化获得(S)-4-氯-3-羟基丁腈；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述亲核试剂的用量为40mmol/L缓冲液，所述湿菌体的加入量为20g/L缓冲液，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为5g/L缓冲液。
8.一种权利要求2所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在催化卤代醇制备β-取代醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以50mM NaH2PO4水溶液为反应介质，加入亲核试剂调节pH值为7.5，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含β-取代醇的混合液，将混合液分离纯化获得(S)-4-氯-3-羟基丁腈；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L反应介质，所述湿菌体的加入量为40g/L反应介质，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为6.7g/L反应介质。
9.一种权利要求2所述卤醇脱卤酶HHDH-PL在制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶HHDH-PL的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或发酵培养后分离的上清液为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，以50mM NaH2PO4水溶液为反应介质，加入亲核试剂调节pH值为7.5，在40℃、150rpm/min条件下进行转化反应，反应完全后，获得含(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的混合液，将混合液分离纯化获得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述亲核试剂为CN-、N3 -、NO2 -或OCN-；所述底物的初始浓度为20mmol/L反应介质，所述湿菌体的加入量为40g/L反应介质，所述上清液的用量以分离前湿菌体的用量计为6.7g/L反应介质。
10.一种提供权利要求1所述卤醇脱卤酶HHDH-PL基因的菌株，所述菌株为食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)ZJB14001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年8月8日，保藏编号为CCTCC M NO:2014373，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
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Application publication date: 20150218 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |