JP2003286194A - ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 - Google Patents
ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルツハイマー病等の神経変性疾病のインビ
ボ モデリングのための商業的研究用動物としてのトラ
ンスジェニック動物を供給することである。 【解決手段】 ヒトｃｄｋ５遺伝子コード配列のｐ２５
コード配列に操作可能的に連結されるラット ニューロ
ン特異的エノラーゼ プロモーターを含んで成る組換え
ＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類に関
する。
ボ モデリングのための商業的研究用動物としてのトラ
ンスジェニック動物を供給することである。 【解決手段】 ヒトｃｄｋ５遺伝子コード配列のｐ２５
コード配列に操作可能的に連結されるラット ニューロ
ン特異的エノラーゼ プロモーターを含んで成る組換え
ＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類に関
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｐ２５ポリペプチ
ド、すなわちタンパク質キナーゼｃｄｋ５の活性化因子
をコードするトランスジーンを有する、トランスジェニ
ック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細
胞を提供する。本発明はまた、ｐ２５ポリペプチドをコ
ードするトランスジーンを含んで成り、そしてｐ２５の
機能的過剰発現をさらに含んで成る非ヒト動物及び細
胞、そのようなトランスジェニック細胞及び動物を生成
するために使用されるｐ２５トランスジーン及び標的化
構造体、ヒトｐ２５ポリペプチド配列をコードするトラ
ンスジーン、及び医薬スクリーニングにおいて及び神経
変性疾病、たとえばアルツハイマー病及びｐ２５／ｃｄ
ｋ５生化学をインビボ モデリングのための商業的研究
用動物としてトランスジェニック動物を用いるための方
法を提供する。
ド、すなわちタンパク質キナーゼｃｄｋ５の活性化因子
をコードするトランスジーンを有する、トランスジェニ
ック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細
胞を提供する。本発明はまた、ｐ２５ポリペプチドをコ
ードするトランスジーンを含んで成り、そしてｐ２５の
機能的過剰発現をさらに含んで成る非ヒト動物及び細
胞、そのようなトランスジェニック細胞及び動物を生成
するために使用されるｐ２５トランスジーン及び標的化
構造体、ヒトｐ２５ポリペプチド配列をコードするトラ
ンスジーン、及び医薬スクリーニングにおいて及び神経
変性疾病、たとえばアルツハイマー病及びｐ２５／ｃｄ
ｋ５生化学をインビボ モデリングのための商業的研究
用動物としてトランスジェニック動物を用いるための方
法を提供する。
【０００２】本明細書中に、多くの文献が引用されてい
る。それらの文献は完全に引用により組み込まれる。文
献の完全な列挙は明細書後部に示される。
る。それらの文献は完全に引用により組み込まれる。文
献の完全な列挙は明細書後部に示される。
【０００３】
【従来の技術】アルツハイマー病（ＡＤ）は、意識機能
の損失により特徴づけられる進行性神経変性疾患であ
る。ＡＤにおける主要神経病理学的損傷は、アミロイド
局面及び神経細線維錯綜体（ＮＦＴ）である。アミロイ
ド局面は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由
来する、３９〜４２個の長さのアミノ酸のアミロイドβ
（Ａβ）ペプチドから主に構成される（１に参照され
る）。ＮＦＴは、疾病を有さない脳において主にリン酸
化されていない状態で存在するエピトープで高リン酸化
されている微小管結合タンパク質ｔａｕから構成される
（２〜４）。それらの損傷が患者において観察されるニ
ューロン損失及び痴呆において演じるそれぞれの役割
は、論争中のままである。
の損失により特徴づけられる進行性神経変性疾患であ
る。ＡＤにおける主要神経病理学的損傷は、アミロイド
局面及び神経細線維錯綜体（ＮＦＴ）である。アミロイ
ド局面は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由
来する、３９〜４２個の長さのアミノ酸のアミロイドβ
（Ａβ）ペプチドから主に構成される（１に参照され
る）。ＮＦＴは、疾病を有さない脳において主にリン酸
化されていない状態で存在するエピトープで高リン酸化
されている微小管結合タンパク質ｔａｕから構成される
（２〜４）。それらの損傷が患者において観察されるニ
ューロン損失及び痴呆において演じるそれぞれの役割
は、論争中のままである。
【０００４】ＮＦＴ形成の正確な機構は明白ではない
が、しかし多くの実験室からの研究は、ｔａｕの高リン
酸化が重要な現象であり得ることを示唆している。対合
されたらせんフィラメント（ＰＨＦ）が、ＮＦＴの基本
単位である。ｔａｕのアミノ及びカルボキシ末端で集中
されるセリン又はトレオニン残基、続くプロリン残基
（ＳＰ又はＴＰ）エピトープでの高リン酸化は、微小管
のための親和性の損失、及び細胞質ｔａｕの濃度の推定
される同時上昇をもたらす（５〜８）。しかしながら、
続くプロリンではなく、セリン２６２でのｔａｕのリン
酸化はまた、微小管のための親和性を低めることができ
る（９）。精製されたｔａｕによるインビトロ実験は、
内因性カチオン( たとえばｍＲＮＡ、硫酸ヘパリン プ
ロテオグリカン) の存在下で、ｔａｕがＡＤ脳に見られ
るＰＨＦとは区別できない構造を形成するために重合す
ることを示す（１０，１１）。
が、しかし多くの実験室からの研究は、ｔａｕの高リン
酸化が重要な現象であり得ることを示唆している。対合
されたらせんフィラメント（ＰＨＦ）が、ＮＦＴの基本
単位である。ｔａｕのアミノ及びカルボキシ末端で集中
されるセリン又はトレオニン残基、続くプロリン残基
（ＳＰ又はＴＰ）エピトープでの高リン酸化は、微小管
のための親和性の損失、及び細胞質ｔａｕの濃度の推定
される同時上昇をもたらす（５〜８）。しかしながら、
続くプロリンではなく、セリン２６２でのｔａｕのリン
酸化はまた、微小管のための親和性を低めることができ
る（９）。精製されたｔａｕによるインビトロ実験は、
内因性カチオン( たとえばｍＲＮＡ、硫酸ヘパリン プ
ロテオグリカン) の存在下で、ｔａｕがＡＤ脳に見られ
るＰＨＦとは区別できない構造を形成するために重合す
ることを示す（１０，１１）。
【０００５】インビトロでのＰＨＦのカチオン−依存性
形成は、ｔａｕのリン酸化状態に無関係であり、従って
ＰＨＦ形成の開始における許容できるキー現象がｔａｕ
の細胞質濃度の上昇であり得ることを示唆する。この仮
説の支持においては、最近の証拠（１２〜１４）は、前
頭側頭骨痴呆及び染色体１７に連結するパーキンソン病
(FTDP-17）と呼ばれる遺伝された痴呆の形に対する感受
性に関連するｔａｕ遺伝子における突然変異が微小管の
ためのｔａｕの親和性を低めることを示す（１５）。従
って、高リン酸化のようなそれらの突然変異は、細胞質
ｔａｕ濃度の上昇をもたらすことができる。内因性カチ
オンの存在下で、この上昇は、ＰＨＦ形成、続くＮＦＴ
アセンブリー、究極的には、ニューロンの死を可能にす
ると推定される。
形成は、ｔａｕのリン酸化状態に無関係であり、従って
ＰＨＦ形成の開始における許容できるキー現象がｔａｕ
の細胞質濃度の上昇であり得ることを示唆する。この仮
説の支持においては、最近の証拠（１２〜１４）は、前
頭側頭骨痴呆及び染色体１７に連結するパーキンソン病
(FTDP-17）と呼ばれる遺伝された痴呆の形に対する感受
性に関連するｔａｕ遺伝子における突然変異が微小管の
ためのｔａｕの親和性を低めることを示す（１５）。従
って、高リン酸化のようなそれらの突然変異は、細胞質
ｔａｕ濃度の上昇をもたらすことができる。内因性カチ
オンの存在下で、この上昇は、ＰＨＦ形成、続くＮＦＴ
アセンブリー、究極的には、ニューロンの死を可能にす
ると推定される。
【０００６】他のリンタンパク質に関しては、ｔａｕの
リン酸化状態はタンパク質キナーゼ及びタンパク質ホス
ファターゼ活性の合計である。従って、ＡＤにおけるｔ
ａｕの高リン酸化は、キナーゼ活性の上昇又はホスファ
ターゼ活性の低下による。多くのタンパク質キナーゼは
インビトロにおいてＡＤ−関連エピトープでｔａｕをリ
ン酸化するが（１６，１７）、それらのわずか２種、す
なわちＧＳＫ３ｂ及びｃｄｋ５が哺乳類脳から微小管と
共に同時精製されている（１８）。本発明者の知識によ
れば、それらの２種のキナーゼのみが、哺乳類細胞中に
異種的にトランスフェクトされる場合、ｔａｕをリン酸
化するであろう（１９，２４）。本発明者は、ｃｄｋ５
対ＧＳＫ３ｂを選択し、ここで後者はエネルギー代謝に
おいて役割を演じ、そしてすべての細胞において活性形
で発現され、そしてｃｄｋ５はニューロンにおいてのみ
活性である（下記参照のこと）。
リン酸化状態はタンパク質キナーゼ及びタンパク質ホス
ファターゼ活性の合計である。従って、ＡＤにおけるｔ
ａｕの高リン酸化は、キナーゼ活性の上昇又はホスファ
ターゼ活性の低下による。多くのタンパク質キナーゼは
インビトロにおいてＡＤ−関連エピトープでｔａｕをリ
ン酸化するが（１６，１７）、それらのわずか２種、す
なわちＧＳＫ３ｂ及びｃｄｋ５が哺乳類脳から微小管と
共に同時精製されている（１８）。本発明者の知識によ
れば、それらの２種のキナーゼのみが、哺乳類細胞中に
異種的にトランスフェクトされる場合、ｔａｕをリン酸
化するであろう（１９，２４）。本発明者は、ｃｄｋ５
対ＧＳＫ３ｂを選択し、ここで後者はエネルギー代謝に
おいて役割を演じ、そしてすべての細胞において活性形
で発現され、そしてｃｄｋ５はニューロンにおいてのみ
活性である（下記参照のこと）。
【０００７】キナーゼ ｃｄｋ５は、サイクリン−依存
性タンパク質キナーゼ ファミリーのメンバーであり、
そしてほぼすべての細胞において発現される（２５，２
６）。ｃｄｋファミリーの他のメンバーとは異なって、
ｃｄｋ５を活性化する、知られているサイクリンは存在
しない。むしろ、ｃｄｋ５の正のアロステリック レギ
ュレーターは、ｐ３５（２７）、ｐ３５のアミノ末端タ
ンパク質分解フラグメント、たとえばｐ２５、ｐ２３又
はｐ２１（２８，２９）、及びｐ３９（３０）である。
それらのタンパク質はサイクリンに対して最少のアミノ
酸配列相同性を共有するが（２７〜２９）、しかしコン
ピューター モデリング及び生化学実験は、p25/35によ
るｃｄｋ５の活性化の機構がｃｄｋ２のサイクリンＡ活
性化の機構に類似することを示唆する（３１〜３３）。
性タンパク質キナーゼ ファミリーのメンバーであり、
そしてほぼすべての細胞において発現される（２５，２
６）。ｃｄｋファミリーの他のメンバーとは異なって、
ｃｄｋ５を活性化する、知られているサイクリンは存在
しない。むしろ、ｃｄｋ５の正のアロステリック レギ
ュレーターは、ｐ３５（２７）、ｐ３５のアミノ末端タ
ンパク質分解フラグメント、たとえばｐ２５、ｐ２３又
はｐ２１（２８，２９）、及びｐ３９（３０）である。
それらのタンパク質はサイクリンに対して最少のアミノ
酸配列相同性を共有するが（２７〜２９）、しかしコン
ピューター モデリング及び生化学実験は、p25/35によ
るｃｄｋ５の活性化の機構がｃｄｋ２のサイクリンＡ活
性化の機構に類似することを示唆する（３１〜３３）。
【０００８】タンパク質ｐ２５／３５はニューロンにお
いて主に発現され、これはほとんどのｃｄｋ５活性がニ
ューロン構造において濃縮されることを意味する（２
７，２８）。タンパク質ｐ３５は細胞内で比較的短い半
減期を有し、そして急速に、偏在し、このことは、ニュ
ーロンにおけるｃｄｋ５活性の強い調節を示す（３
４）。キナーゼｃｄｋ５は、ｃｄｋ５ノックアウト マ
ウスの異常皮質発生（corticogenesis）及び周期性致死
（３５）、及びニューロン移動における障害及びｃｄｋ
５ノックアウト マウスにおける初期死亡（３６）によ
り明らかなように、ニューロン生長において中枢的役割
を演じる。ゲッ歯動物における生長研究においては、ｃ
ｄｋ５のピーク触媒活性がＥ１１又は１２で生じ、神経
発生におけるｃｄｋ５の役割の更なる支持を導く（３
７，３８）。
いて主に発現され、これはほとんどのｃｄｋ５活性がニ
ューロン構造において濃縮されることを意味する（２
７，２８）。タンパク質ｐ３５は細胞内で比較的短い半
減期を有し、そして急速に、偏在し、このことは、ニュ
ーロンにおけるｃｄｋ５活性の強い調節を示す（３
４）。キナーゼｃｄｋ５は、ｃｄｋ５ノックアウト マ
ウスの異常皮質発生（corticogenesis）及び周期性致死
（３５）、及びニューロン移動における障害及びｃｄｋ
５ノックアウト マウスにおける初期死亡（３６）によ
り明らかなように、ニューロン生長において中枢的役割
を演じる。ゲッ歯動物における生長研究においては、ｃ
ｄｋ５のピーク触媒活性がＥ１１又は１２で生じ、神経
発生におけるｃｄｋ５の役割の更なる支持を導く（３
７，３８）。
【０００９】さらに、一次培養されたニューロンにおい
ては、ｃｄｋ５／ｐ３５が生長錐状体に局在化し、軸索
生長における役割を示唆する（３９）。最近、ｃｄｋ５
活性を調節できるシグナル化経路の証拠が出現してい
る。たとえば、cdk5/p35がＲａｃと相互作用し、そして
ＰＡＫ活性を調節し（４０）、そして小脳ニューロンの
ラミニン増強された生長がｐ３５発現の抑制により中断
され、そしてそれらは軸索生長及び形質膜力学における
推定される役割と一致する。それらは、細胞骨格タンパ
ク質、たとえばｔａｕ（４２〜４５）及び神経フィラメ
ント（４６〜４８）、シナプス小胞タンパク質、たとえ
ばシナプシン及びMunc-18 （４９，５０）、及び網膜芽
タンパク質（５１）を包含する。それにもかかわらず、
cdk5/p35活性を調節するシグナル トランスダクション
経路の明白な情況も、成熟脳における両cdk5/p35の役割
も解明されていない。
ては、ｃｄｋ５／ｐ３５が生長錐状体に局在化し、軸索
生長における役割を示唆する（３９）。最近、ｃｄｋ５
活性を調節できるシグナル化経路の証拠が出現してい
る。たとえば、cdk5/p35がＲａｃと相互作用し、そして
ＰＡＫ活性を調節し（４０）、そして小脳ニューロンの
ラミニン増強された生長がｐ３５発現の抑制により中断
され、そしてそれらは軸索生長及び形質膜力学における
推定される役割と一致する。それらは、細胞骨格タンパ
ク質、たとえばｔａｕ（４２〜４５）及び神経フィラメ
ント（４６〜４８）、シナプス小胞タンパク質、たとえ
ばシナプシン及びMunc-18 （４９，５０）、及び網膜芽
タンパク質（５１）を包含する。それにもかかわらず、
cdk5/p35活性を調節するシグナル トランスダクション
経路の明白な情況も、成熟脳における両cdk5/p35の役割
も解明されていない。
【００１０】ＡＤにおけるｔａｕの高リン酸化を担当す
るタンパク質キナーゼの明白な情況もまた欠失してい
る。しかしながら、ｃｄｋ５が病理学的役割を演じるこ
とができる証拠は累積している。たとえば、インビトロ
研究において、ｃｄｋ５は、ｔａｕの８種までの異なっ
たエピトープ、たとえばＡＤに関連し、そして微小管の
ためのｔａｕの親和性を低めることが知られているをれ
らのエピトープをリン酸化するであろう（４２〜４
５）. さらに、哺乳類細胞中へのｔａｕによるcdk5/p25
の異種同時トランスフェクションもまた、いくつかのそ
れらのエピトープのリン酸化をもたらす（２４）。最終
的に、免疫組織学的証拠は、ｃｄｋ５がＡＤ脳における
ＮＦＴに最も近いことを示唆する（５２，５３）。
るタンパク質キナーゼの明白な情況もまた欠失してい
る。しかしながら、ｃｄｋ５が病理学的役割を演じるこ
とができる証拠は累積している。たとえば、インビトロ
研究において、ｃｄｋ５は、ｔａｕの８種までの異なっ
たエピトープ、たとえばＡＤに関連し、そして微小管の
ためのｔａｕの親和性を低めることが知られているをれ
らのエピトープをリン酸化するであろう（４２〜４
５）. さらに、哺乳類細胞中へのｔａｕによるcdk5/p25
の異種同時トランスフェクションもまた、いくつかのそ
れらのエピトープのリン酸化をもたらす（２４）。最終
的に、免疫組織学的証拠は、ｃｄｋ５がＡＤ脳における
ＮＦＴに最も近いことを示唆する（５２，５３）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】ＡＤ病原に関与する基
礎の生化学的現象をさらに定義するために使用され得る
アルツハイマー病の実験モデルの開発が非常に所望され
る。そのようなモデルは、ＡＤの変性路を変える剤につ
いてスクリーンするために、１回の適用において使用さ
れ得る。たとえば、ＡＤのモデルシステムは、ＡＤの病
原を誘発し又は促進する環境因子についてスクリーンす
るために使用され得る。他方では、実験モデルは、ＡＤ
の進行を阻害し、妨げ又は後退せしめる剤についてスク
リーンするために使用され得る。そのようなモデルは、
ＡＤの防止、抑制又は後退において効果的である医薬を
開発するために使用され得る。
礎の生化学的現象をさらに定義するために使用され得る
アルツハイマー病の実験モデルの開発が非常に所望され
る。そのようなモデルは、ＡＤの変性路を変える剤につ
いてスクリーンするために、１回の適用において使用さ
れ得る。たとえば、ＡＤのモデルシステムは、ＡＤの病
原を誘発し又は促進する環境因子についてスクリーンす
るために使用され得る。他方では、実験モデルは、ＡＤ
の進行を阻害し、妨げ又は後退せしめる剤についてスク
リーンするために使用され得る。そのようなモデルは、
ＡＤの防止、抑制又は後退において効果的である医薬を
開発するために使用され得る。
【００１２】ヒト及び成熟した非ヒト霊長類のみが、Ａ
Ｄのいずれかの病理学的特徴を進行せしめる。霊長類を
使用することの費用及び困難性、及びＡＤ病理学を開発
するために必要とされる時間の長さは、そのような動物
に対する集中的な研究を非常に高価なものにする。ゲッ
歯動物は、極端な年齢でさえ、ＡＤを生長せしめない。
ある処理がｔａｕの高リン酸化及び／又はｔａｕのリン
酸化に関連するニューロンの死をもたらす種々の報告に
もかかわらず、ｔａｕの高リン酸化及び関連するニュー
ロンの死を生成できるトランスジェニック非ヒト動物に
ついての必要性が当業界において存在する。
Ｄのいずれかの病理学的特徴を進行せしめる。霊長類を
使用することの費用及び困難性、及びＡＤ病理学を開発
するために必要とされる時間の長さは、そのような動物
に対する集中的な研究を非常に高価なものにする。ゲッ
歯動物は、極端な年齢でさえ、ＡＤを生長せしめない。
ある処理がｔａｕの高リン酸化及び／又はｔａｕのリン
酸化に関連するニューロンの死をもたらす種々の報告に
もかかわらず、ｔａｕの高リン酸化及び関連するニュー
ロンの死を生成できるトランスジェニック非ヒト動物に
ついての必要性が当業界において存在する。
【００１３】上記に基づいて、ｔａｕの高リン酸化及び
ニューロン細胞の死を生成する非ヒト細胞及び非ヒト動
物についての必要性が存在することは明らかである。従
って、哺乳類細胞、特に胚幹細胞中にトランスジーン及
び相同組換え構造体をトランスファーするための方法及
び組成物を提供することが、本発明の目的である。ｐ２
５、すなわちｃｄｋ５の活性化因子の高められた発現を
もたらすトランスジーンを有するトランスジェニック非
ヒト細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を提供する
ことがまた、本発明の目的である。高リン酸化されたｔ
ａｕ及び関連されたニューロンの死の生成を阻害し又は
妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするた
めにインビボ システムとしてのそのようなトランスジ
ェニック動物の適用が、本発明のさらなる興味ある１つ
である。
ニューロン細胞の死を生成する非ヒト細胞及び非ヒト動
物についての必要性が存在することは明らかである。従
って、哺乳類細胞、特に胚幹細胞中にトランスジーン及
び相同組換え構造体をトランスファーするための方法及
び組成物を提供することが、本発明の目的である。ｐ２
５、すなわちｃｄｋ５の活性化因子の高められた発現を
もたらすトランスジーンを有するトランスジェニック非
ヒト細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を提供する
ことがまた、本発明の目的である。高リン酸化されたｔ
ａｕ及び関連されたニューロンの死の生成を阻害し又は
妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするた
めにインビボ システムとしてのそのようなトランスジ
ェニック動物の適用が、本発明のさらなる興味ある１つ
である。
【００１４】ｔａｕのリン酸化及び関連するニューロン
の死を阻害し又は妨げる能力のための試験化合物をスク
リーニングするための方法及びシステムを提供すること
が所望される。特に、ｃｄｋ５/ ｐ２５の阻害にそのよ
うな方法及びシステムを基づくことが所望され、試験化
合物がｃｄｋ５/ ｐ２５により介在されるｔａｕのリン
酸化を阻止する場合、その試験化合物はまた、ニューロ
ンの死もまた阻止する。そのような方法及びトランスジ
ェニック動物は、多数の試験化合物をスクリーニングす
るための急速で、経済的で且つ適切な手段を提供するは
ずである。
の死を阻害し又は妨げる能力のための試験化合物をスク
リーニングするための方法及びシステムを提供すること
が所望される。特に、ｃｄｋ５/ ｐ２５の阻害にそのよ
うな方法及びシステムを基づくことが所望され、試験化
合物がｃｄｋ５/ ｐ２５により介在されるｔａｕのリン
酸化を阻止する場合、その試験化合物はまた、ニューロ
ンの死もまた阻止する。そのような方法及びトランスジ
ェニック動物は、多数の試験化合物をスクリーニングす
るための急速で、経済的で且つ適切な手段を提供するは
ずである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ｃｄｋ５活
性の上昇がＡＤ―関連エピトープでのｔａｕの高リン酸
化をもたらすかどうか、及びこの高リン酸化がニューロ
ンの死を導くかどうかを決定するために、マウスの脳に
おいてヒトｐ２５を過剰発現した。ｐ２５トランスジェ
ニック マウスの脳においては、ｔａｕ及び神経フィラ
メントの両者が高リン酸化され、そして錯綜体 (tangl
e）−様封入体を有する多くの銀―陽性ニューロンが存
在する。それらの結果は、ｃｄｋ５の活性化因子の過剰
発現が、ＡＤに見出されるそれらに非常に類似する、ｔ
ａｕ及び神経フィラメント リン酸化並びに銀一陽性ニ
ューロンを生成するのに十分であることを示す。ｐ２５
トランスジェニック マウスは、ＡＤに見出される神経
細線維病理及びニューロンのモデルとして作用すること
ができる。
性の上昇がＡＤ―関連エピトープでのｔａｕの高リン酸
化をもたらすかどうか、及びこの高リン酸化がニューロ
ンの死を導くかどうかを決定するために、マウスの脳に
おいてヒトｐ２５を過剰発現した。ｐ２５トランスジェ
ニック マウスの脳においては、ｔａｕ及び神経フィラ
メントの両者が高リン酸化され、そして錯綜体 (tangl
e）−様封入体を有する多くの銀―陽性ニューロンが存
在する。それらの結果は、ｃｄｋ５の活性化因子の過剰
発現が、ＡＤに見出されるそれらに非常に類似する、ｔ
ａｕ及び神経フィラメント リン酸化並びに銀一陽性ニ
ューロンを生成するのに十分であることを示す。ｐ２５
トランスジェニック マウスは、ＡＤに見出される神経
細線維病理及びニューロンのモデルとして作用すること
ができる。
【００１６】１つの態様においては、本発明は、ヒトｃ
ｄｋ５遺伝子コード配列のｐ２５コード配列に作用可能
に連結されたラット ニューロン特異的エノラーゼを含
んで成る組換えＤＮＡに向けられる。好ましい態様にお
いては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコードす
る前記配列がゲノムＤＮＡに向けられる。もう１つの態
様においては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコ
ードする前記配列がｃＤＮＡである組換えＤＮＡに向け
られる。さらにもう１つの好ましい態様においては、本
発明は、前記配列が配列番号４の配列である組換えＤＮ
Ａに向けられる。
ｄｋ５遺伝子コード配列のｐ２５コード配列に作用可能
に連結されたラット ニューロン特異的エノラーゼを含
んで成る組換えＤＮＡに向けられる。好ましい態様にお
いては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコードす
る前記配列がゲノムＤＮＡに向けられる。もう１つの態
様においては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコ
ードする前記配列がｃＤＮＡである組換えＤＮＡに向け
られる。さらにもう１つの好ましい態様においては、本
発明は、前記配列が配列番号４の配列である組換えＤＮ
Ａに向けられる。
【００１７】さらにもう１つの態様においては、本発明
は、本発明の組換えＤＮＡを含んでなるベクターに向け
られる。もう１つの態様においては、本発明は、本発明
の組換えＤＮＡを含んで成る真核細胞系に向けられる。
もう１つの態様においては、本発明は、その生殖細胞及
び体細胞が本発明の組換えＤＮＡを発現する、トランス
ジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。好
ましい態様においては、本発明は、マウスであるトラン
スジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。
さらなる態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝
子のｐ２５フラグメントの発現により特徴づけられる疾
病を有する動物を処理するための方法に向けられ、ここ
で前記方法は、治療的有効量の前記ｐ２５フラグメント
のインヒビターを投与することを含んで成る。
は、本発明の組換えＤＮＡを含んでなるベクターに向け
られる。もう１つの態様においては、本発明は、本発明
の組換えＤＮＡを含んで成る真核細胞系に向けられる。
もう１つの態様においては、本発明は、その生殖細胞及
び体細胞が本発明の組換えＤＮＡを発現する、トランス
ジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。好
ましい態様においては、本発明は、マウスであるトラン
スジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。
さらなる態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝
子のｐ２５フラグメントの発現により特徴づけられる疾
病を有する動物を処理するための方法に向けられ、ここ
で前記方法は、治療的有効量の前記ｐ２５フラグメント
のインヒビターを投与することを含んで成る。
【００１８】もう１つの態様においては、本発明は、ヒ
トｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を阻害す
る化合物の能力を決定するための方法に向けられ、ここ
で前記方法は、 ａ. 前記の組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して
組み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物
を作出し； ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物
に成長せしめ； ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合
物を投与し；そして ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定する；段
階を含んで成る。
トｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を阻害す
る化合物の能力を決定するための方法に向けられ、ここ
で前記方法は、 ａ. 前記の組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して
組み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物
を作出し； ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物
に成長せしめ； ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合
物を投与し；そして ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定する；段
階を含んで成る。
【００１９】さらにもう１つの態様においては、本発明
は、ヒトｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を
阻害する化合物の能力を決定するためのデーターを生成
するための方法に向けられ、この方法は、 ａ. 前記組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して組
み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物を
作出し； ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物
に成長せしめ； ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合
物を投与し； ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定し；そし
て ｅ. 前記阻害に由来するデータを用いて前記ｐ２５フラ
グメントを阻害することができる化合物を合成する；段
階を含んで成る。
は、ヒトｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を
阻害する化合物の能力を決定するためのデーターを生成
するための方法に向けられ、この方法は、 ａ. 前記組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して組
み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物を
作出し； ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物
に成長せしめ； ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合
物を投与し； ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定し；そし
て ｅ. 前記阻害に由来するデータを用いて前記ｐ２５フラ
グメントを阻害することができる化合物を合成する；段
階を含んで成る。
【００２０】
【発明の実施の形態】図１は、（Ａ）ｐ２５及びp35/39
（Ｌ．Ｈ．Tsai, Harvard Medical School Cambridge,
ＭＡの贈与物）に対して特異的な抗体によりプローブさ
れた、３種の野生型マウスからの扁桃（１）、視床
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロット、並びに
（Ｂ）上記と同じ抗体によりプローブされた３種のｐ２
５トランスジェニック マウスからの扁桃（１）、視床
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを示す。
トランスジーンｐ２５の発現は、トランスジェニック
マウスにおいて明らかであるが、しかし野生型マウスに
おいては明らかでない。
（Ｌ．Ｈ．Tsai, Harvard Medical School Cambridge,
ＭＡの贈与物）に対して特異的な抗体によりプローブさ
れた、３種の野生型マウスからの扁桃（１）、視床
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロット、並びに
（Ｂ）上記と同じ抗体によりプローブされた３種のｐ２
５トランスジェニック マウスからの扁桃（１）、視床
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを示す。
トランスジーンｐ２５の発現は、トランスジェニック
マウスにおいて明らかであるが、しかし野生型マウスに
おいては明らかでない。
【００２１】図２は、扁桃の吻部分において特異的なＡ
Ｔ−８（ｔａｕのホスホ−セリン２０２／２０５を特異
的に認識する市販の抗体）に対して免疫陽性の生後４ヶ
月のトランスジェニック マウス脳を示す。付随する軸
索を有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。い
くつかの暗褐色の陽性細胞がこの部分に見出される。図
３は、扁桃の吻部分においてＡＴ−８に対して最小の陽
性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は、二
次抗体のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
Ｔ−８（ｔａｕのホスホ−セリン２０２／２０５を特異
的に認識する市販の抗体）に対して免疫陽性の生後４ヶ
月のトランスジェニック マウス脳を示す。付随する軸
索を有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。い
くつかの暗褐色の陽性細胞がこの部分に見出される。図
３は、扁桃の吻部分においてＡＴ−８に対して最小の陽
性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は、二
次抗体のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
【００２２】図４は、扁桃の吻部分においてPHF-13（ｔ
ａｕのホスホ−セリン３９６／４０４を認識する抗体：
Dr. V. Lee, U.of Pennsylvania からの贈与物）免疫陽
性を示す生後４ヶ月のトランスジェニック マウス脳を
示す。厚くされた軸索（矢印）を有するニューロン細胞
体は陽性である。可能な膨張された／萎縮された軸索を
有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。図５
は、扁桃の吻部分においてPHF-13に対して最小の陽性の
生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は二次抗体
のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
ａｕのホスホ−セリン３９６／４０４を認識する抗体：
Dr. V. Lee, U.of Pennsylvania からの贈与物）免疫陽
性を示す生後４ヶ月のトランスジェニック マウス脳を
示す。厚くされた軸索（矢印）を有するニューロン細胞
体は陽性である。可能な膨張された／萎縮された軸索を
有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。図５
は、扁桃の吻部分においてPHF-13に対して最小の陽性の
生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は二次抗体
のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
【００２３】図６は、扁桃の吻部分（矢印により示され
る）のいくつかの細胞体における全ｔａｕ（Accurate C
hemical and Scientific Corp Westbury, N.Y.から市販
される合計のｔａｕを認識する抗体）に対して免疫陽性
の生後４ヶ月のトランスジェニック マウス脳を示す。
図７は、扁桃の吻部分の軸索においてｔａｕに対して免
疫陽性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。図８は、
SMI-34（リン酸化された神経フィラメントＨタンパク質
を認識する市販の抗体）と反応された生後４ヶ月のトラ
ンスジェニック マウス脳を示す。陽性細胞（矢印）
は、扁桃の吻部分に見出される。図９は、生後４ヶ月の
野生型マウス脳の扁桃の吻部分における最少のＳＭＩ−
３４軸索陽性を示す。
る）のいくつかの細胞体における全ｔａｕ（Accurate C
hemical and Scientific Corp Westbury, N.Y.から市販
される合計のｔａｕを認識する抗体）に対して免疫陽性
の生後４ヶ月のトランスジェニック マウス脳を示す。
図７は、扁桃の吻部分の軸索においてｔａｕに対して免
疫陽性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。図８は、
SMI-34（リン酸化された神経フィラメントＨタンパク質
を認識する市販の抗体）と反応された生後４ヶ月のトラ
ンスジェニック マウス脳を示す。陽性細胞（矢印）
は、扁桃の吻部分に見出される。図９は、生後４ヶ月の
野生型マウス脳の扁桃の吻部分における最少のＳＭＩ−
３４軸索陽性を示す。
【００２４】図１０は、生後４ヶ月のトランスジェニッ
ク マウス脳の扁桃の吻部分における銀一陽性（破壊さ
れた細胞骨格及びニューロン細胞死の表示）細胞体（矢
印）を示す。図１１は、生後４ヶ月の野生型マウスの扁
桃の吻部分における軸索の最小銀陽性を示す。図１２
は、生後５ヶ月のトランスジェニック マウスの脊髄に
おいて銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索（矢印）
を示す。図１３は、生後５ヶ月のトランスジェニック
マウスの脊髄においてSMI-34陽性を示すいくつかの拡張
された軸索（矢印）を示す。図１４は、生後６ヶ月の野
生型マウスの脊髄における正常な軸索がSMI-34に対して
陰性であることを示す。
ク マウス脳の扁桃の吻部分における銀一陽性（破壊さ
れた細胞骨格及びニューロン細胞死の表示）細胞体（矢
印）を示す。図１１は、生後４ヶ月の野生型マウスの扁
桃の吻部分における軸索の最小銀陽性を示す。図１２
は、生後５ヶ月のトランスジェニック マウスの脊髄に
おいて銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索（矢印）
を示す。図１３は、生後５ヶ月のトランスジェニック
マウスの脊髄においてSMI-34陽性を示すいくつかの拡張
された軸索（矢印）を示す。図１４は、生後６ヶ月の野
生型マウスの脊髄における正常な軸索がSMI-34に対して
陰性であることを示す。
【００２５】一般的に、本明細書に使用される命名法、
及び下記に記載される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学
及びハイブリダイゼーション、生化学、組織学及び免疫
細胞化学における実験方法は、当業界においてよく知ら
れており、そして通常に記載されるものである。標準技
法が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培
養、トランスジーン組み込み、ウェスタ−ンブロット、
免疫細胞化学及び組織学的技法、たとえば銀染色のため
に使用される。前記技法及び方法は一般的に、当業界に
おける従来の方法、及び本明細書中に提供される種々の
一般的な引例に従って実施される。そこにおける方法
は、当業界においてよく知られており、そして読者の便
利さのために供給される。そこに含まれるすべての情報
は、引用により本明細書に組み込まれる。
及び下記に記載される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学
及びハイブリダイゼーション、生化学、組織学及び免疫
細胞化学における実験方法は、当業界においてよく知ら
れており、そして通常に記載されるものである。標準技
法が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培
養、トランスジーン組み込み、ウェスタ−ンブロット、
免疫細胞化学及び組織学的技法、たとえば銀染色のため
に使用される。前記技法及び方法は一般的に、当業界に
おける従来の方法、及び本明細書中に提供される種々の
一般的な引例に従って実施される。そこにおける方法
は、当業界においてよく知られており、そして読者の便
利さのために供給される。そこに含まれるすべての情報
は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００２６】前述の目的によれば、本発明の１つの観点
においては、トランスジェニック非ヒト動物において異
種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含ん
で成るトランスジーンの少なくとも１つのコピーを有す
る非ヒト動物が提供される。前記異種ポリペプチドは、
ｐ３５サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）調節タ
ンパク質の切断された部分である（２７，２８）。その
切断された異種ポリペプチドは、除去される最初の９８
個のＮ−末端アミノ酸を有し、そして約25,000ドルトン
の分子量を有する。この新規ポリペプチドは、ｐ２５と
して言及されるであろう。
においては、トランスジェニック非ヒト動物において異
種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含ん
で成るトランスジーンの少なくとも１つのコピーを有す
る非ヒト動物が提供される。前記異種ポリペプチドは、
ｐ３５サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）調節タ
ンパク質の切断された部分である（２７，２８）。その
切断された異種ポリペプチドは、除去される最初の９８
個のＮ−末端アミノ酸を有し、そして約25,000ドルトン
の分子量を有する。この新規ポリペプチドは、ｐ２５と
して言及されるであろう。
【００２７】典型的には、非ヒト トランスジェニック
であり、そして異種遺伝子はヒトｐ２５配列である。ト
ランスジーンは典型的には、ニューロンにおいて細胞型
特異的態様で宿主トランスジェニックの哺乳類において
発現を方向づけるシス−作用性調節配列に作用可能に連
結されているｃＤＮＡ配列である。典型的には、トラン
スジーンは、ランダムな標的化されていない態様で宿主
染色体中に組み込まれるであろう。さらに、本発明は、
染色体位置中に非相同的に又は相同的に組み込まれる、
本発明の異種ｐ２５配列トランスジーン又は遺伝子標的
化ベクターの少なくとも１つのコピーを有する非ヒト
トランスジェニック動物がｐ２５切断されたポリペプチ
ドを発現することを提供する。
であり、そして異種遺伝子はヒトｐ２５配列である。ト
ランスジーンは典型的には、ニューロンにおいて細胞型
特異的態様で宿主トランスジェニックの哺乳類において
発現を方向づけるシス−作用性調節配列に作用可能に連
結されているｃＤＮＡ配列である。典型的には、トラン
スジーンは、ランダムな標的化されていない態様で宿主
染色体中に組み込まれるであろう。さらに、本発明は、
染色体位置中に非相同的に又は相同的に組み込まれる、
本発明の異種ｐ２５配列トランスジーン又は遺伝子標的
化ベクターの少なくとも１つのコピーを有する非ヒト
トランスジェニック動物がｐ２５切断されたポリペプチ
ドを発現することを提供する。
【００２８】トランスジェニック動物は典型的には、１
つの細胞胚の前核中へのマイクロジェクションによるト
ランスジーンの導入、又は胚幹（ＥＳ）細胞のエレクト
ロポレーション、リポフェクション又はウィルストラン
スフェクションによる宿主細胞中への標的化ベクターの
導入により生成される。ｐ２５ポリペプチドを発現する
トランスジェニック動物は、疾病のモデルとしての使
用、及び小分子、タンパク質及びポリヌクレオチドを包
含する可能性ある治療用化合物のスクリーニングへの使
用のために適切である。本発明はまた、確立された細胞
系、又は非ヒトトランスジェニック動物、たとえばニュ
ーロンから直接的に確立された一次細胞系の形質転換に
より誘導される非ヒト又はヒト細胞系を提供する。
つの細胞胚の前核中へのマイクロジェクションによるト
ランスジーンの導入、又は胚幹（ＥＳ）細胞のエレクト
ロポレーション、リポフェクション又はウィルストラン
スフェクションによる宿主細胞中への標的化ベクターの
導入により生成される。ｐ２５ポリペプチドを発現する
トランスジェニック動物は、疾病のモデルとしての使
用、及び小分子、タンパク質及びポリヌクレオチドを包
含する可能性ある治療用化合物のスクリーニングへの使
用のために適切である。本発明はまた、確立された細胞
系、又は非ヒトトランスジェニック動物、たとえばニュ
ーロンから直接的に確立された一次細胞系の形質転換に
より誘導される非ヒト又はヒト細胞系を提供する。
【００２９】トランスジェニック非ヒト動物が、他の疾
病モデル、薬物スクリーン又は他の用途として作用する
新規動物を生成するために、トランスジェニック技術に
より又は他のトランスジェニック又は天然に存在する動
物との従来の対合を通して追加の遺伝子修飾を有するこ
とができることは明白である。これは、ＥＳ細胞におけ
る遺伝子標的化を通してのネズミ内因性ｐ３５遺伝子の
不活性化、及びヒトｐ２５異種ポリペプチドの発現のた
めの好ましい宿主になる、得られるネズミｐ３５−欠失
マウスを包含する。
病モデル、薬物スクリーン又は他の用途として作用する
新規動物を生成するために、トランスジェニック技術に
より又は他のトランスジェニック又は天然に存在する動
物との従来の対合を通して追加の遺伝子修飾を有するこ
とができることは明白である。これは、ＥＳ細胞におけ
る遺伝子標的化を通してのネズミ内因性ｐ３５遺伝子の
不活性化、及びヒトｐ２５異種ポリペプチドの発現のた
めの好ましい宿主になる、得られるネズミｐ３５−欠失
マウスを包含する。
【００３０】そのような異種トランスジーンは、典型的
には前核注入（pronuclear injection）により誘導され
るトランスジェニック動物における非相同染色体位置に
組み込まれ得、又はネズミｐ３５遺伝子を不活性化し、
そして異種ヒトｐ２５配列の発現を方向づけるために、
連結された配列を付加するための方法によるＥＳ細胞に
おける遺伝子標的化により組み込まれ得る。
には前核注入（pronuclear injection）により誘導され
るトランスジェニック動物における非相同染色体位置に
組み込まれ得、又はネズミｐ３５遺伝子を不活性化し、
そして異種ヒトｐ２５配列の発現を方向づけるために、
連結された配列を付加するための方法によるＥＳ細胞に
おける遺伝子標的化により組み込まれ得る。
【００３１】一般的に、本発明は、サイクリン依存性キ
ナーゼ５（ｃｄｋ５）のアロステリック活性化因子であ
る、ヒトｐ２５ポリペプチド、すなわちｐ３５のタンパ
ク質分解フラグメントを発現するトランスジェニック動
物の生成及び特徴化のための方法を包含する。トランス
ジェニック動物は、内因性相同体の存在下でこのヒトタ
ンパク質を発現する。この技法及び方法は、当業界にお
いて通常の方法であると一般的に見なされる確立された
プロトコールに従って実施され、そして引例は本明細書
内に提供される。タンパク質キナーゼｃｄｋ５は、アロ
ステリック活性化因子、たとえばｐ３５又はｐ２５と会
合される場合、インビトロにおいて及び完全な細胞にお
いてｔａｕをリン酸化することが文献に報告されてい
る。
ナーゼ５（ｃｄｋ５）のアロステリック活性化因子であ
る、ヒトｐ２５ポリペプチド、すなわちｐ３５のタンパ
ク質分解フラグメントを発現するトランスジェニック動
物の生成及び特徴化のための方法を包含する。トランス
ジェニック動物は、内因性相同体の存在下でこのヒトタ
ンパク質を発現する。この技法及び方法は、当業界にお
いて通常の方法であると一般的に見なされる確立された
プロトコールに従って実施され、そして引例は本明細書
内に提供される。タンパク質キナーゼｃｄｋ５は、アロ
ステリック活性化因子、たとえばｐ３５又はｐ２５と会
合される場合、インビトロにおいて及び完全な細胞にお
いてｔａｕをリン酸化することが文献に報告されてい
る。
【００３２】このようにして生成されたトランスジェニ
ック マウスは、神経変性状態、たとえばアルツハイマ
ー病、ハンチントン舞踏病、発作、外傷性脳腫瘍、Pick
病、軸索ジストロフィー、多発性硬化症、運動ニューロ
ン病及び旧小脳変性及び神経変性疾患における高リン酸
化されたｔａｕの形成においてヒトｐ２５の役割を確定
する。ヒトｐ２５タンパク質を発現する他のトランスジ
ェニック動物、たとえばラット、ハムスター、テンジュ
クネズミ及びウサギが容易に得られることは明らかであ
る。ヒトｐ２５タンパク質を発現するトランスジェニッ
ク動物は、発現及びｔａｕリン酸化のレベルについてモ
ニターされ得る。
ック マウスは、神経変性状態、たとえばアルツハイマ
ー病、ハンチントン舞踏病、発作、外傷性脳腫瘍、Pick
病、軸索ジストロフィー、多発性硬化症、運動ニューロ
ン病及び旧小脳変性及び神経変性疾患における高リン酸
化されたｔａｕの形成においてヒトｐ２５の役割を確定
する。ヒトｐ２５タンパク質を発現する他のトランスジ
ェニック動物、たとえばラット、ハムスター、テンジュ
クネズミ及びウサギが容易に得られることは明らかであ
る。ヒトｐ２５タンパク質を発現するトランスジェニッ
ク動物は、発現及びｔａｕリン酸化のレベルについてモ
ニターされ得る。
【００３３】異なった条件下で、発現のレベル及びｔａ
ｕリン酸化の程度はそのような動物モデルにおいて阻害
されるであろうことが理解されるであろう。特に、ヒト
ｐ２５タンパク質の活性を阻害する治療剤のスクリーニ
ングは動物モデルにおいて非常に促進されるであろう。
影響されたトランスジェニック動物からの細胞系（たと
えば、ニューロン）の生長が、ヒトｐ２５タンパク質の
生化学的及び薬理学的分析が評価され得る処理量を改良
するであろうことは明らかである。
ｕリン酸化の程度はそのような動物モデルにおいて阻害
されるであろうことが理解されるであろう。特に、ヒト
ｐ２５タンパク質の活性を阻害する治療剤のスクリーニ
ングは動物モデルにおいて非常に促進されるであろう。
影響されたトランスジェニック動物からの細胞系（たと
えば、ニューロン）の生長が、ヒトｐ２５タンパク質の
生化学的及び薬理学的分析が評価され得る処理量を改良
するであろうことは明らかである。
【００３４】ｐ２５過剰発現のための特に好ましい動物
モデルは、上記のようにｐ２５を発現するトランスジェ
ニック動物である。そのようなトランスジェニック動
物、特に本発明のトランスジェニック マウスは、高い
量のｐ２５及び高リン酸化されたｔａｕ、及び本発明の
方法に従って検出され得るニューロンの死を生成する。
本発明によれば、ｐ２５の過剰発現は、そのような動物
において内因性ｐ２５発現に等しいか又はそれよりも高
いであろう。さらに、ｐ２５過剰発現のこのレベルは、
野生型動物において最少であるｔａｕ高リン酸化をもた
らす。そのような高められたｐ２５レベルにより、ｔａ
ｕの高リン酸化及びニューロンの死のモニターは非常に
促進される。特に、ｔａｕリン酸化を阻害するための化
合物及び他の治療剤についてのスクリーニングは、本発
明のｐ２５を過剰発現する動物において非常に単純化さ
れる。
モデルは、上記のようにｐ２５を発現するトランスジェ
ニック動物である。そのようなトランスジェニック動
物、特に本発明のトランスジェニック マウスは、高い
量のｐ２５及び高リン酸化されたｔａｕ、及び本発明の
方法に従って検出され得るニューロンの死を生成する。
本発明によれば、ｐ２５の過剰発現は、そのような動物
において内因性ｐ２５発現に等しいか又はそれよりも高
いであろう。さらに、ｐ２５過剰発現のこのレベルは、
野生型動物において最少であるｔａｕ高リン酸化をもた
らす。そのような高められたｐ２５レベルにより、ｔａ
ｕの高リン酸化及びニューロンの死のモニターは非常に
促進される。特に、ｔａｕリン酸化を阻害するための化
合物及び他の治療剤についてのスクリーニングは、本発
明のｐ２５を過剰発現する動物において非常に単純化さ
れる。
【００３５】トランスジェニック性であり、そしてｐ２
５を過剰発現する試験動物、たとえば試験マウスに剤が
投与される。ｐ２５を過剰発現するトランスジェニック
マウスを生成するための特定の技法は下記に記載され
る。ｐ２５を過剰発現する他のトランスジェニック動
物、たとえばラット、ハムスター、テンジュクネズミ、
ウサギ及び同様のものが容易に達成され得ることが理解
されるであろう。この開示を考慮する場、試験動物にお
けるｔａｕの高リン酸化に対する試験化合物の効果が、
試験動物からの種々の検体において測定され得る。
５を過剰発現する試験動物、たとえば試験マウスに剤が
投与される。ｐ２５を過剰発現するトランスジェニック
マウスを生成するための特定の技法は下記に記載され
る。ｐ２５を過剰発現する他のトランスジェニック動
物、たとえばラット、ハムスター、テンジュクネズミ、
ウサギ及び同様のものが容易に達成され得ることが理解
されるであろう。この開示を考慮する場、試験動物にお
けるｔａｕの高リン酸化に対する試験化合物の効果が、
試験動物からの種々の検体において測定され得る。
【００３６】ｔａｕの高リン酸化に対する試験剤の効果
は、試験動物からの種々の検体において測定され得る。
すべての場合、試験化合物の不在下で試験動物における
ｔａｕリン酸化及びニューロン死のレベル特性を示す対
照値を得ることが必要であろう。動物が殺される場合、
ｐ２５を過剰発現するようトランスジェニック的に修飾
されているが、しかしｔａｕリン酸化又はニューロン死
のレベルに影響を及ぼすことが予測されるいずれかの試
験化合物又はいずれかの他の物質の投与を受けていない
他の試験動物からの平均値又は典型的な値にそのような
対照値を基づかせることが必要であろう。
は、試験動物からの種々の検体において測定され得る。
すべての場合、試験化合物の不在下で試験動物における
ｔａｕリン酸化及びニューロン死のレベル特性を示す対
照値を得ることが必要であろう。動物が殺される場合、
ｐ２５を過剰発現するようトランスジェニック的に修飾
されているが、しかしｔａｕリン酸化又はニューロン死
のレベルに影響を及ぼすことが予測されるいずれかの試
験化合物又はいずれかの他の物質の投与を受けていない
他の試験動物からの平均値又は典型的な値にそのような
対照値を基づかせることが必要であろう。
【００３７】そのような対照レベルが決定されると、試
験化合物が試験動物に投与され、ここで平均対照値から
の偏差は、試験化合物が動物におけるｔａｕリン酸化又
はニューロン死に対する効果を有したことを示す。陽
性、すなわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理において
たぶん有益であると思われる試験物質は、ｔａｕリン酸
化又は、ニューロン死のレベルを、好ましくは少なくと
も２０％及び最も好ましくは８０％低めることができる
ものであろう。さらに、ｐ２５を過剰に発現し、そして
ｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェニック動物におい
て対合されたヘリカル又は直鎖フィラメント形成が存在
する。
験化合物が試験動物に投与され、ここで平均対照値から
の偏差は、試験化合物が動物におけるｔａｕリン酸化又
はニューロン死に対する効果を有したことを示す。陽
性、すなわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理において
たぶん有益であると思われる試験物質は、ｔａｕリン酸
化又は、ニューロン死のレベルを、好ましくは少なくと
も２０％及び最も好ましくは８０％低めることができる
ものであろう。さらに、ｐ２５を過剰に発現し、そして
ｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェニック動物におい
て対合されたヘリカル又は直鎖フィラメント形成が存在
する。
【００３８】それらの場合、試験化合物が試験動物に投
与され、そしてフィラメント形成の低下が化合物への暴
露の結果としてモニターされ得る。さらに、ｐ２５を過
剰発現し、そしてｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェ
ニック動物において行動性変更が存在する。それらの場
合、試験化合物の不在下で試験動物において運動性仕事
（たとえば、運動活動の測定）を実施する生存動物から
対照値を得ることが必要である。野生型マウスとトラン
スジェニック マウスとの間の差異は、化合物の効果の
ための結果基準として作用するであろう。
与され、そしてフィラメント形成の低下が化合物への暴
露の結果としてモニターされ得る。さらに、ｐ２５を過
剰発現し、そしてｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェ
ニック動物において行動性変更が存在する。それらの場
合、試験化合物の不在下で試験動物において運動性仕事
（たとえば、運動活動の測定）を実施する生存動物から
対照値を得ることが必要である。野生型マウスとトラン
スジェニック マウスとの間の差異は、化合物の効果の
ための結果基準として作用するであろう。
【００３９】そのような対照レベルが決定されると、試
験化合物が追加の試験動物に投与され、ここで野生型マ
ウスとトランスジェニック マウスとの間の差異の低下
又は逆転が、試験化合物が測定される運動試験に対し効
果を有することを示唆する。陽性であると思われる、す
なわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理においてたぶん
有益であると思われる試験物質は、好ましくは、トラン
スジェニック動物における運動異常性を野生型マウスに
見出されるレベルに逆転するか又は実質的に逆転する
か、又は、好ましくは変性できるそれらの物質であろ
う。
験化合物が追加の試験動物に投与され、ここで野生型マ
ウスとトランスジェニック マウスとの間の差異の低下
又は逆転が、試験化合物が測定される運動試験に対し効
果を有することを示唆する。陽性であると思われる、す
なわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理においてたぶん
有益であると思われる試験物質は、好ましくは、トラン
スジェニック動物における運動異常性を野生型マウスに
見出されるレベルに逆転するか又は実質的に逆転する
か、又は、好ましくは変性できるそれらの物質であろ
う。
【００４０】試験剤は、細胞培養物又は動物に添加され
る場合、細胞又は動物の生存性に悪影響を与えないであ
ろう、いずれかの小分子、タンパク質、多糖類、デオキ
シまたはリボヌクレオチド、又はいずれかのそれらの組
み合わせとして定義されるであろう。ヒトｐ２５発現及
びｔａｕリン酸化のレベルを変える剤は、可能性ある治
療剤としてのさらなる評価のための候補体として見なさ
れるであろう。試験化合物は、典型的には、１ng／kg〜
１００mg／kg, 通常１０μg ／kg〜３２mg／kgの用量
で、トランスジェニック動物に投与されるであろう。
る場合、細胞又は動物の生存性に悪影響を与えないであ
ろう、いずれかの小分子、タンパク質、多糖類、デオキ
シまたはリボヌクレオチド、又はいずれかのそれらの組
み合わせとして定義されるであろう。ヒトｐ２５発現及
びｔａｕリン酸化のレベルを変える剤は、可能性ある治
療剤としてのさらなる評価のための候補体として見なさ
れるであろう。試験化合物は、典型的には、１ng／kg〜
１００mg／kg, 通常１０μg ／kg〜３２mg／kgの用量
で、トランスジェニック動物に投与されるであろう。
【００４１】ｔａｕのリン酸化を阻害することができる
試験化合物は、動物及びヒトにおいてリン酸化を阻止す
る能力のさらなる決定のための候補体として見なされ
る。ｔａｕリン酸化の阻害は、cdk5/p25活性が少なくと
も一部、阻止され、ｔａｕをリン酸化するために入手で
きるcdk5/p25の量を低めることを示す。
試験化合物は、動物及びヒトにおいてリン酸化を阻止す
る能力のさらなる決定のための候補体として見なされ
る。ｔａｕリン酸化の阻害は、cdk5/p25活性が少なくと
も一部、阻止され、ｔａｕをリン酸化するために入手で
きるcdk5/p25の量を低めることを示す。
【００４２】本発明はさらに、上記方法により選択され
た化合物を組み込み、そして医薬的に許容できるキャリ
ヤーを含む医薬組成物を含んで成る。そのような医薬組
成物は、本発明の方法により同定される少なくとも１つ
の化合物の治療量又は予防量を含むべきである。医薬的
に許容できるキャリヤーは、意図される宿主に化合物を
供給するのに適切ないずれかの適合する非毒性物質であ
り得る。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活
性団体が、キャリヤーとして使用され得る。
た化合物を組み込み、そして医薬的に許容できるキャリ
ヤーを含む医薬組成物を含んで成る。そのような医薬組
成物は、本発明の方法により同定される少なくとも１つ
の化合物の治療量又は予防量を含むべきである。医薬的
に許容できるキャリヤーは、意図される宿主に化合物を
供給するのに適切ないずれかの適合する非毒性物質であ
り得る。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活
性団体が、キャリヤーとして使用され得る。
【００４３】医薬的に許容得きるアジュバンド、緩衝
剤、分散剤、及び同様のものがまた、医薬組成物中に組
み込まれ得る。活性剤を組み込む医薬組成物の調製は、
医学及び化学文献に十分に記載されている。たとえば、
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishi
ng Company, Easton, PA, 16th Ed., 1982（この開示は
引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。上
記医薬組成物は、宿主への全身性投与、たとえば非経
口、局所及び経口投与のために適切である。医薬組成物
は、非経口、すなわち皮下、筋肉内又は静脈内投与され
得る。従って、本発明は、上記のように、許容できるキ
ャリヤーにおける同定された化合物の医薬的に許容でき
る溶液を含んで成る、宿主への投与のための組成物を供
給する。
剤、分散剤、及び同様のものがまた、医薬組成物中に組
み込まれ得る。活性剤を組み込む医薬組成物の調製は、
医学及び化学文献に十分に記載されている。たとえば、
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishi
ng Company, Easton, PA, 16th Ed., 1982（この開示は
引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。上
記医薬組成物は、宿主への全身性投与、たとえば非経
口、局所及び経口投与のために適切である。医薬組成物
は、非経口、すなわち皮下、筋肉内又は静脈内投与され
得る。従って、本発明は、上記のように、許容できるキ
ャリヤーにおける同定された化合物の医薬的に許容でき
る溶液を含んで成る、宿主への投与のための組成物を供
給する。
【００４４】商業的な研究及びスクリーニング使用：ｐ
２５をコードするトランスジーンを含んで成る非ヒト動
物は、ｔａｕのリン酸化及びニューロン死を妨げ又は低
める効果を有する剤についてスクリーンするために商業
的に使用され得る。そのような剤は、他の神経変性疾患
の中でＡＤ及びｔａｕの高リン酸化を処理するための医
薬物質として開発され得る。たとえば、Donehower など
（５４）のｐ５３ノックアウト マウスは、発癌物質の
スクリーニングのための商業的生成物及び同様のものと
して広い許容性を見出した。
２５をコードするトランスジーンを含んで成る非ヒト動
物は、ｔａｕのリン酸化及びニューロン死を妨げ又は低
める効果を有する剤についてスクリーンするために商業
的に使用され得る。そのような剤は、他の神経変性疾患
の中でＡＤ及びｔａｕの高リン酸化を処理するための医
薬物質として開発され得る。たとえば、Donehower など
（５４）のｐ５３ノックアウト マウスは、発癌物質の
スクリーニングのための商業的生成物及び同様のものと
して広い許容性を見出した。
【００４５】本発明のトランスジェニック動物は異常ｔ
ａｕリン酸化をふし、そして医薬スクリーニングのため
に、及び神経変性疾患、及びｃｄｋ５／ｐ２５及びｔａ
ｕ生化学のための疾病モデルとして使用され得る。その
ような動物は、ｔａｕ高リン酸化に影響を及ぼす化合物
を同定するために多くの用途を有するが、但しそれらだ
けには制限されず；１つの変法においては、そりによ
り、剤は候補体医薬剤として同定される。トランスジェ
ニック動物はまた、ｃｄｋ５又はｐ２５の発現及び／又
は安定性を調節する剤を開発するためにも使用され得
る；そのような剤は神経変性疾患を処理するための治療
剤として作用することができる。
ａｕリン酸化をふし、そして医薬スクリーニングのため
に、及び神経変性疾患、及びｃｄｋ５／ｐ２５及びｔａ
ｕ生化学のための疾病モデルとして使用され得る。その
ような動物は、ｔａｕ高リン酸化に影響を及ぼす化合物
を同定するために多くの用途を有するが、但しそれらだ
けには制限されず；１つの変法においては、そりによ
り、剤は候補体医薬剤として同定される。トランスジェ
ニック動物はまた、ｃｄｋ５又はｐ２５の発現及び／又
は安定性を調節する剤を開発するためにも使用され得
る；そのような剤は神経変性疾患を処理するための治療
剤として作用することができる。
【００４６】本発明のｐ２５発現マウスはまた、ｔａｕ
−関連病理（たとえば、ＡＤ，Pick病、パーキンソン
病、染色体１７２関連する前側頭葉痴呆、発作、外傷性
脳損傷、軽い認識障害及び同様のもの）を研究するため
の疾病モデルとしても作用することができる。そのよう
なトランスジェニック動物は、特に、研究者に市販され
得る。一般的な用語で発明を記載してきたが、現在、特
定の例が言及される。それらの例は本発明を制限するも
のではないことが理解されるべきである。
−関連病理（たとえば、ＡＤ，Pick病、パーキンソン
病、染色体１７２関連する前側頭葉痴呆、発作、外傷性
脳損傷、軽い認識障害及び同様のもの）を研究するため
の疾病モデルとしても作用することができる。そのよう
なトランスジェニック動物は、特に、研究者に市販され
得る。一般的な用語で発明を記載してきたが、現在、特
定の例が言及される。それらの例は本発明を制限するも
のではないことが理解されるべきである。
【００４７】
【実施例】プラスミドpNSE-p25（ラット ニューロン特
異的エノラーゼ プロモーター、ヒトｐ２５トランスジ
ーン）は次の４種の異なった源からのＤＮＡ、すなわち
ラット ニューロン特異的エノラーゼ プロモーター；
ｐ３５タンパク質のｐ２５触媒フラグメントのためのヒ
トｃＤＮＡ；ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；及
び市販のプラスミド ベクター、を含む。トランスジー
ンは、pNSE-p25のBam HI制限酵素消化により単離され
る。この制限消化物は、プラスミド クローニング ベ
クター pSP72(2462bp）（Promega, Madison, WI）から
NSE-p25 トランスジーン（3212bp）を開放する。
異的エノラーゼ プロモーター、ヒトｐ２５トランスジ
ーン）は次の４種の異なった源からのＤＮＡ、すなわち
ラット ニューロン特異的エノラーゼ プロモーター；
ｐ３５タンパク質のｐ２５触媒フラグメントのためのヒ
トｃＤＮＡ；ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；及
び市販のプラスミド ベクター、を含む。トランスジー
ンは、pNSE-p25のBam HI制限酵素消化により単離され
る。この制限消化物は、プラスミド クローニング ベ
クター pSP72(2462bp）（Promega, Madison, WI）から
NSE-p25 トランスジーン（3212bp）を開放する。
【００４８】ラット ニューロン特異的エノラーゼ（Ｎ
ＳＥ）プロモーター配列は1826bp（配列番号１）であ
り、そしてトランスジェニック マウスのニューロンに
おいてＤＮＡコード配列を効果的に発現することが示さ
れている（５５）。ヒトｐ２５配列のためのコード領域
は、633bp （配列番号２）である。３−プライム未翻訳
及びＳＶ４０ポリアデニル化配列は、688bp （配列番号
３）である。
ＳＥ）プロモーター配列は1826bp（配列番号１）であ
り、そしてトランスジェニック マウスのニューロンに
おいてＤＮＡコード配列を効果的に発現することが示さ
れている（５５）。ヒトｐ２５配列のためのコード領域
は、633bp （配列番号２）である。３−プライム未翻訳
及びＳＶ４０ポリアデニル化配列は、688bp （配列番号
３）である。
【００４９】マイクロインジェクトされたNSE-p25 トラ
ンスジーンは、3212bp（配列番号４）である。連結、制
限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ合成反応、一本鎖フ
ィルイン反応、及び実施される細菌形質転換を包含す
る、組換えＤＮＡの酵素反応は、Sambrook, J., Fritsc
h, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: Alabo
ratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Pre
ss, New York, 1989により記載されるような十分に確立
された方法である。
ンスジーンは、3212bp（配列番号４）である。連結、制
限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ合成反応、一本鎖フ
ィルイン反応、及び実施される細菌形質転換を包含す
る、組換えＤＮＡの酵素反応は、Sambrook, J., Fritsc
h, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: Alabo
ratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Pre
ss, New York, 1989により記載されるような十分に確立
された方法である。
【００５０】SV40ポリアデニル化配列（配列番号３）
を、Xba I およびBst I 部位で市販のプラスミドpSP72
（配列番号５）中にクローン化した。pSP-SVpAと称する
このプラスミドは、NSE-p25 トランスジーン プラスミ
ドの構成のための主鎖ベクターとして作用した。ヒトｐ
２５触媒性フラグメントのためのｃＤＮＡを、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて誘導した。ヒトｐ３５の
十分な長さのｃＤＮＡを、ｐ２５挿入体の増幅のための
鋳型として使用した。本発明者は、PfizerのDr.David A
uperin からのｐ３５鋳型ＤＮＡを受け；ヒトｐ３５配
列を、Pfast Bac1,すなわちバキュロウィルス発現ベク
ター（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD ）のEcoR I部位中
にクローン化した。
を、Xba I およびBst I 部位で市販のプラスミドpSP72
（配列番号５）中にクローン化した。pSP-SVpAと称する
このプラスミドは、NSE-p25 トランスジーン プラスミ
ドの構成のための主鎖ベクターとして作用した。ヒトｐ
２５触媒性フラグメントのためのｃＤＮＡを、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて誘導した。ヒトｐ３５の
十分な長さのｃＤＮＡを、ｐ２５挿入体の増幅のための
鋳型として使用した。本発明者は、PfizerのDr.David A
uperin からのｐ３５鋳型ＤＮＡを受け；ヒトｐ３５配
列を、Pfast Bac1,すなわちバキュロウィルス発現ベク
ター（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD ）のEcoR I部位中
にクローン化した。
【００５１】ＰＣＲプライマーを、トランスジーン構成
を促進するためにコード配列外にNot I 制限部位を有す
るよう消化した。前方向プライマーはまた、ＧＣＣに隣
接して新規ＡＴＧ開始コドンを導入した（ヒトｐ３５配
列の位置９９でのAla コドン) 。プライマー（５―プラ
イムから３―プライムの配向で提供される）は、ｐ２５
−前方向：GCGGCCGCATGGCCCAGCCCCCACCGGCCCAGCCGCCTGC
A （配列番号６）、及びｐ２５−逆方向：CTCCTCCTAGGC
CTGGAATCGGTGAGGCGGCCGC（配列番号７）であった。
を促進するためにコード配列外にNot I 制限部位を有す
るよう消化した。前方向プライマーはまた、ＧＣＣに隣
接して新規ＡＴＧ開始コドンを導入した（ヒトｐ３５配
列の位置９９でのAla コドン) 。プライマー（５―プラ
イムから３―プライムの配向で提供される）は、ｐ２５
−前方向：GCGGCCGCATGGCCCAGCCCCCACCGGCCCAGCCGCCTGC
A （配列番号６）、及びｐ２５−逆方向：CTCCTCCTAGGC
CTGGAATCGGTGAGGCGGCCGC（配列番号７）であった。
【００５２】ＡＴＧは導入された開始コドンであり、Ｔ
ＧＡは停止コドンであり、そしてGCGGCCGCはＰＣＲプラ
イマーに付加されたNot I 制限部位である。得られるＰ
ＣＲ生成物は、構成されたＡＴＧ開始部位（配列番号
２）Not I クローニング部位の付加からの追加の１５bp
と共に、完全な633bp のヒトp25 cDNA配列を含む648bp
である。その648bp のフラグメントを、最終トランスジ
ーンにおいて挿入体として使用する前、配列の確認のた
めにpCR2.1（Invitrogen, Carisbad, CA）中にサブクロ
ーン化した。
ＧＡは停止コドンであり、そしてGCGGCCGCはＰＣＲプラ
イマーに付加されたNot I 制限部位である。得られるＰ
ＣＲ生成物は、構成されたＡＴＧ開始部位（配列番号
２）Not I クローニング部位の付加からの追加の１５bp
と共に、完全な633bp のヒトp25 cDNA配列を含む648bp
である。その648bp のフラグメントを、最終トランスジ
ーンにおいて挿入体として使用する前、配列の確認のた
めにpCR2.1（Invitrogen, Carisbad, CA）中にサブクロ
ーン化した。
【００５３】確かめられた648bp のNot I フラグメント
を、プラスミドpSP-SVpA:25 を生成するpSP-SVpAのNot
I 制限部位中に連結した。ラット ニューロン特異的エ
ノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターを、Dr. J. G. Sutcli
ffe of the Research Institute of Scripps Clinic (L
a Jolla, CA ）から得られたプラスミドpNSE-lacZ から
単離した。ラットＮＳＥプロモーター配列（配列番号
１）を、ＰＮＳＥ−LacZプラスミドのEcoR I及びHind I
II制限消化により単離した。1.8kb のフラグメントを、
アガロース ゲル電気泳動により抽出し、そして精製し
た。制限酵素により精製された5'―プライム単鎖オーバ
ーハングをクレノウ反応によりフィルインし、二本鎖ブ
ラント末端を有するラットＮＳＥプロモーター フラグ
メントを生成した。
を、プラスミドpSP-SVpA:25 を生成するpSP-SVpAのNot
I 制限部位中に連結した。ラット ニューロン特異的エ
ノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターを、Dr. J. G. Sutcli
ffe of the Research Institute of Scripps Clinic (L
a Jolla, CA ）から得られたプラスミドpNSE-lacZ から
単離した。ラットＮＳＥプロモーター配列（配列番号
１）を、ＰＮＳＥ−LacZプラスミドのEcoR I及びHind I
II制限消化により単離した。1.8kb のフラグメントを、
アガロース ゲル電気泳動により抽出し、そして精製し
た。制限酵素により精製された5'―プライム単鎖オーバ
ーハングをクレノウ反応によりフィルインし、二本鎖ブ
ラント末端を有するラットＮＳＥプロモーター フラグ
メントを生成した。
【００５４】1826bpのラットＮＳＥブラント末端プロモ
ーター フラグメントは、pSP-SVpA:p25のSma 1 制限部
位中に連結されたフラグメント末端であった。pSP-SVp
A:p25内でのラットＮＳＥプロモータの正しい配向を、B
am HI及びＸho Iの二重制限消化物により確かめた。正
しい配向を有するプラスミドを、pNSE-p25として命名し
た。3212bpのNSE-p25 トランスジーン（配列番号４）の
完全な配列を、ＡＢＩにより概略される標準の色素―タ
ーミネーター化学プロトコールを用いて、自動化された
ABI 373 配列決定機（Foster City, CA ）により分析
し、そして確かめた。すべてのプラスミドは、DH5 α細
菌細胞（Gibco BRL Gaithersburg MD ）において増殖さ
れた。
ーター フラグメントは、pSP-SVpA:p25のSma 1 制限部
位中に連結されたフラグメント末端であった。pSP-SVp
A:p25内でのラットＮＳＥプロモータの正しい配向を、B
am HI及びＸho Iの二重制限消化物により確かめた。正
しい配向を有するプラスミドを、pNSE-p25として命名し
た。3212bpのNSE-p25 トランスジーン（配列番号４）の
完全な配列を、ＡＢＩにより概略される標準の色素―タ
ーミネーター化学プロトコールを用いて、自動化された
ABI 373 配列決定機（Foster City, CA ）により分析
し、そして確かめた。すべてのプラスミドは、DH5 α細
菌細胞（Gibco BRL Gaithersburg MD ）において増殖さ
れた。
【００５５】ヒトｐ２５を過剰発現するトランスジェニ
ック マウスの生成：3212bpのNSE-p25 トランスジーン
ＤＮＡフラグメントを、Bam ＨＩ制限エンドヌクレアー
ゼ反応によりpNSE-p25 プラスミドから切除した。3.2 k
bp のフラグメントを、１％のアガロース ゲルにおけ
る電気泳動（FMC Bioproducts, Rockland ME）の後、電
気溶出（５０Ｖ，３時間）により単離した。フラグメン
トをさらに、ネズミ胚へのマイクロインジェクションの
前、ＤＮＡ精製について製造業者により確立されたプロ
トコールに従って、Schleicher and Schuell (Keene, N
H) Elutip-d カラム上で精製した。
ック マウスの生成：3212bpのNSE-p25 トランスジーン
ＤＮＡフラグメントを、Bam ＨＩ制限エンドヌクレアー
ゼ反応によりpNSE-p25 プラスミドから切除した。3.2 k
bp のフラグメントを、１％のアガロース ゲルにおけ
る電気泳動（FMC Bioproducts, Rockland ME）の後、電
気溶出（５０Ｖ，３時間）により単離した。フラグメン
トをさらに、ネズミ胚へのマイクロインジェクションの
前、ＤＮＡ精製について製造業者により確立されたプロ
トコールに従って、Schleicher and Schuell (Keene, N
H) Elutip-d カラム上で精製した。
【００５６】前核マイクロインジェクションによるトラ
ンスジェニック マウスの生成を、Hogan, B. など、Ma
nipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2
nd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New Y
ork, 1994 に概略されるような公開された方法により実
施した。FVB/N 株（Charles River Labs, Wilmington,
MA）のＦ１雌マウスからの前核階段の胚を、妊娠した、
雌馬の血清からの５国際単位（ＩＵ）卵胞刺激ホルモン
（Sigma ST Louis, MO）及び2.5 I.U.のヒト絨毛性性線
刺激ホルモン（Sigma ）による超排卵の後に得た。
ンスジェニック マウスの生成を、Hogan, B. など、Ma
nipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2
nd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New Y
ork, 1994 に概略されるような公開された方法により実
施した。FVB/N 株（Charles River Labs, Wilmington,
MA）のＦ１雌マウスからの前核階段の胚を、妊娠した、
雌馬の血清からの５国際単位（ＩＵ）卵胞刺激ホルモン
（Sigma ST Louis, MO）及び2.5 I.U.のヒト絨毛性性線
刺激ホルモン（Sigma ）による超排卵の後に得た。
【００５７】実際のマイクロインジェクション方法は、
Wagner, T.など、（５６）により記載されるようにして
実施され、但し胚は、胚の生長のために擬似妊娠CD-1受
容体雌（Charles River Laboratories, Wilmington, M
A）に、すぐに移行された、再移植現象に起因するマウ
スを、生後３週で尾の生検から単離されたゲノムＤＮＡ
のＰＣＲ分析によりNSE-p25 トランスジーンの存在につ
いて試験した。ＮＳＥ―ｐ２５トランスジーンの存在に
ついて陽性を示したマウスと、反対の性別の野生型FVB/
N マウス（Charles River Laboratories, Wilmington,
MA）とを支配した。
Wagner, T.など、（５６）により記載されるようにして
実施され、但し胚は、胚の生長のために擬似妊娠CD-1受
容体雌（Charles River Laboratories, Wilmington, M
A）に、すぐに移行された、再移植現象に起因するマウ
スを、生後３週で尾の生検から単離されたゲノムＤＮＡ
のＰＣＲ分析によりNSE-p25 トランスジーンの存在につ
いて試験した。ＮＳＥ―ｐ２５トランスジーンの存在に
ついて陽性を示したマウスと、反対の性別の野生型FVB/
N マウス（Charles River Laboratories, Wilmington,
MA）とを支配した。
【００５８】それらの交配の子孫を、生後３週での尾の
生検から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析又はサザ
ンブロット分析により生殖系伝達について試験した。ト
ランスジェニック系を、７匹の創始体トランスジェニッ
ク マウスから生成し、そしてNSE-p25 トランスジーン
の存在についてＰＣＲ遺伝子分離することによって維持
した。下記実験を、挿入されたトランスジーンのために
ヘテロ接合性のマウスにおいて実施した。それらのマウ
スは、FVB/N 野生型動物とトランスジーン挿入体につい
て陽性のマウスとを交尾し、そしてNSE-p25 トランスジ
ーン配列の存在についてＰＣＲにより子孫をスクリーン
することによって誘導された。
生検から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析又はサザ
ンブロット分析により生殖系伝達について試験した。ト
ランスジェニック系を、７匹の創始体トランスジェニッ
ク マウスから生成し、そしてNSE-p25 トランスジーン
の存在についてＰＣＲ遺伝子分離することによって維持
した。下記実験を、挿入されたトランスジーンのために
ヘテロ接合性のマウスにおいて実施した。それらのマウ
スは、FVB/N 野生型動物とトランスジーン挿入体につい
て陽性のマウスとを交尾し、そしてNSE-p25 トランスジ
ーン配列の存在についてＰＣＲにより子孫をスクリーン
することによって誘導された。
【００５９】ｐ２５タンパク質の過剰発現の検出：
ウェスターンブロット：生後１又は４ヶ月のトランスジ
ェニック（Ｔｇ）及び野生型（ｗｔ）マウスからの完全
な脳を取り出し、そして液体窒素において凍結した。扁
桃、視床及び皮質を切除し、そして１mlの溶解緩衝液に
おいて均質化した（３７に記載のようにして）。サンプ
ルを１０分間、煮沸し、そして次に、13,000rpm で遠心
分離した。その得られる上清液のタンパク質濃度を、Pi
erce BCA法（BCA micro Proteinassay,カタログ番号232
25, Pierce, Rockford ILL ）により決定した。
ェニック（Ｔｇ）及び野生型（ｗｔ）マウスからの完全
な脳を取り出し、そして液体窒素において凍結した。扁
桃、視床及び皮質を切除し、そして１mlの溶解緩衝液に
おいて均質化した（３７に記載のようにして）。サンプ
ルを１０分間、煮沸し、そして次に、13,000rpm で遠心
分離した。その得られる上清液のタンパク質濃度を、Pi
erce BCA法（BCA micro Proteinassay,カタログ番号232
25, Pierce, Rockford ILL ）により決定した。
【００６０】個々のサンプル１０μg を、ＳＤＳポリア
クリルアミド ゲル上で電気泳動（５７）、そしてウェ
スターンブロット分析のためにProBlott タンパク質紙
に移した（Western blotting protocols, ECL Detectio
n, Amergham Life Science Arlington Heights, ILL (1
995)）。非特異的部位を、トリス−緩衝溶液（20mMのト
リス塩基、127 ｍＭのNaCl, 3.8mMno HCl, pH7.6; Sigm
a ）中、５％脱脂粉乳においてブロットをインキュベー
トすることによって阻止した。一次抗体を、５％脱脂粉
乳／TBS-T において希釈した。ブロットを、希釈された
抗体溶液に配置し、そして２３℃で１時間、回転せしめ
た。
クリルアミド ゲル上で電気泳動（５７）、そしてウェ
スターンブロット分析のためにProBlott タンパク質紙
に移した（Western blotting protocols, ECL Detectio
n, Amergham Life Science Arlington Heights, ILL (1
995)）。非特異的部位を、トリス−緩衝溶液（20mMのト
リス塩基、127 ｍＭのNaCl, 3.8mMno HCl, pH7.6; Sigm
a ）中、５％脱脂粉乳においてブロットをインキュベー
トすることによって阻止した。一次抗体を、５％脱脂粉
乳／TBS-T において希釈した。ブロットを、希釈された
抗体溶液に配置し、そして２３℃で１時間、回転せしめ
た。
【００６１】次に、ウェスターンブロットを、TBS-T に
より３０分間、洗浄した。ホースラディシュ ペルオキ
シダーゼ結合された二次抗体を、５％脱脂粉乳／TBS-T
により希釈した。ブロットを、二次抗体溶液と共にイン
キュベートし、そして２３℃で４５分間、回転せしめ
た。次に、ブロットをTBS-T により３０分間、洗浄し
た。等体積のAmersham's ＥＣＬ展開溶液Ａ及びＢを一
緒に混合した。ウェスターンブロットを、その展開溶液
において１分間インキュベートした。ブロットを、Sara
nRラップにより包装し、そしてイメージング フィルム
（Kodak RochesterN.Y. X-OMAT AR, カタログ番号１６
５１４５４）に暴露した。
より３０分間、洗浄した。ホースラディシュ ペルオキ
シダーゼ結合された二次抗体を、５％脱脂粉乳／TBS-T
により希釈した。ブロットを、二次抗体溶液と共にイン
キュベートし、そして２３℃で４５分間、回転せしめ
た。次に、ブロットをTBS-T により３０分間、洗浄し
た。等体積のAmersham's ＥＣＬ展開溶液Ａ及びＢを一
緒に混合した。ウェスターンブロットを、その展開溶液
において１分間インキュベートした。ブロットを、Sara
nRラップにより包装し、そしてイメージング フィルム
（Kodak RochesterN.Y. X-OMAT AR, カタログ番号１６
５１４５４）に暴露した。
【００６２】３匹のマウスからの扁桃（１）、視床
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを、ｐ２
５及びp35/39（L.H. Tsai, Harvard Medical School の
贈与物、図１（Ａ））に対して特異的な抗体によりプロ
ーブした。p35/39の検出は明らかであるが、ｐ２５は野
生型マウスは検出されない。同じ分析がトランスジェニ
ック マウスにおいて行われる場合（図１（Ｂ））、ｐ
３５の構成的発現の他に、ｐ２５の強い発現が検出され
る。それらの結果は、トランスジーンの発現がｐ２５ト
ランスジェニック動物において強いことを確証する。
（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを、ｐ２
５及びp35/39（L.H. Tsai, Harvard Medical School の
贈与物、図１（Ａ））に対して特異的な抗体によりプロ
ーブした。p35/39の検出は明らかであるが、ｐ２５は野
生型マウスは検出されない。同じ分析がトランスジェニ
ック マウスにおいて行われる場合（図１（Ｂ））、ｐ
３５の構成的発現の他に、ｐ２５の強い発現が検出され
る。それらの結果は、トランスジーンの発現がｐ２５ト
ランスジェニック動物において強いことを確証する。
【００６３】銀染色体及びＳＭＩ ３４免疫組織化学：
予定通りに殺されたマウスから集められた組織を１０％
の中性―緩衝化されたホルマリン又は４％のパラホルム
アルデヒドにより現場灌流−固定し、そして死亡したマ
ウスから集められた組織をホルマリンに含浸固定した。
固定化に続いて、整えられた組織を等級化されたアルコ
ールにより脱水し、そしてパラフィンにより埋包した。
脳の標準の断面を、The Mouse Brain in Stereotaxic C
oodinates (Franklin and Paxinos, 1997 ) における図
への類似性により同定した。パラフィン断面（８μｍの
厚さ）を、変性されたBielschowsky銀染色により染色
し、そしてリン酸化された神経フィラメントに対して向
けられた抗体（SMI 34；Stemberger Monoclonals, Inc
Lutherville, MD から市販されている) により免疫組織
化学的に染色した。
予定通りに殺されたマウスから集められた組織を１０％
の中性―緩衝化されたホルマリン又は４％のパラホルム
アルデヒドにより現場灌流−固定し、そして死亡したマ
ウスから集められた組織をホルマリンに含浸固定した。
固定化に続いて、整えられた組織を等級化されたアルコ
ールにより脱水し、そしてパラフィンにより埋包した。
脳の標準の断面を、The Mouse Brain in Stereotaxic C
oodinates (Franklin and Paxinos, 1997 ) における図
への類似性により同定した。パラフィン断面（８μｍの
厚さ）を、変性されたBielschowsky銀染色により染色
し、そしてリン酸化された神経フィラメントに対して向
けられた抗体（SMI 34；Stemberger Monoclonals, Inc
Lutherville, MD から市販されている) により免疫組織
化学的に染色した。
【００６４】免疫組織化学：免疫組織化学研究のため
に、トランスジェニック及び野生型マウスを、ナトリウ
ム ペントソルビタールにより深く麻酔し（60mg/kg,
i.p. ）、そして0.9%のNaClを含む0.1 Ｍのリン酸ナト
リウム（ＰＢＳ, 7.4 ）20ml, 続いて0.1Mのリン酸ナト
リウム（ＰＢ, 7.4 ）緩衝液中、固定剤含有４％パラホ
ルムアルデヒド30mlにより大動脈を通して灌流した。脳
を除去し、ＰＢＳ含有２０％スクロールにおいて４８時
間、凍結保護し、微紛砕されたドライアイスの層におい
て凍結し、そして次に、スライドするミクロトーム上で
３５ミクロンの断片に切断した。１８の連続した断片の
１つを、0.1 ＭのＰＢに集め、そして下記のようにし
て、免疫組織化学のために処理した。
に、トランスジェニック及び野生型マウスを、ナトリウ
ム ペントソルビタールにより深く麻酔し（60mg/kg,
i.p. ）、そして0.9%のNaClを含む0.1 Ｍのリン酸ナト
リウム（ＰＢＳ, 7.4 ）20ml, 続いて0.1Mのリン酸ナト
リウム（ＰＢ, 7.4 ）緩衝液中、固定剤含有４％パラホ
ルムアルデヒド30mlにより大動脈を通して灌流した。脳
を除去し、ＰＢＳ含有２０％スクロールにおいて４８時
間、凍結保護し、微紛砕されたドライアイスの層におい
て凍結し、そして次に、スライドするミクロトーム上で
３５ミクロンの断片に切断した。１８の連続した断片の
１つを、0.1 ＭのＰＢに集め、そして下記のようにし
て、免疫組織化学のために処理した。
【００６５】免疫組織化学のために、断片を、0.9%のNa
Cl及び0.1%のTriton Ｘ−100 を50mMのトリス緩衝液
（ｐＨ7.4 ）(TBS) において１時間インキュベートし
た。次に、断片をＴＢＳにより洗浄し、そして抗体ビー
クル（ＴＢＳ中４％ヤギ又はウマ血清、0.1% Triton X-
100 ）において１時間インキュベートした。ＴＢＳによ
る追加の洗浄の後、断片を一次抗体を含むビークルにお
いて４℃で一晩インキュベートした。
Cl及び0.1%のTriton Ｘ−100 を50mMのトリス緩衝液
（ｐＨ7.4 ）(TBS) において１時間インキュベートし
た。次に、断片をＴＢＳにより洗浄し、そして抗体ビー
クル（ＴＢＳ中４％ヤギ又はウマ血清、0.1% Triton X-
100 ）において１時間インキュベートした。ＴＢＳによ
る追加の洗浄の後、断片を一次抗体を含むビークルにお
いて４℃で一晩インキュベートした。
【００６６】一次抗体における一晩のインキュベーショ
ンに続いて、断片をＴＢＳにより洗浄し、ビオチニル化
されたウマ抗―マウス又はやぎ抗―ウサギ抗体（Vector
Labs, Burlingame, CA による）を含むビークルにおい
て１時間インキュベートし、ＴＢＳにより洗浄し、そし
て次に、ＡＢＣ／ホースラディシュ ペルオキシダーゼ
試薬（Vecter Labs, Burlingame, CA ）を含むＴＢＳに
おいて１時間インキュベートした。
ンに続いて、断片をＴＢＳにより洗浄し、ビオチニル化
されたウマ抗―マウス又はやぎ抗―ウサギ抗体（Vector
Labs, Burlingame, CA による）を含むビークルにおい
て１時間インキュベートし、ＴＢＳにより洗浄し、そし
て次に、ＡＢＣ／ホースラディシュ ペルオキシダーゼ
試薬（Vecter Labs, Burlingame, CA ）を含むＴＢＳに
おいて１時間インキュベートした。
【００６７】ＴＢＳによる追加の洗浄の後、免疫局在化
生成物を、0.04% のジアミノベンジン（ＤＡＢ）及び0.
003%のH2O2を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（pH 7.6）に
おいて３〜５分間、断片を展開することによって可視化
した。続いて、断片をトリス緩衝液により洗浄し、スラ
イド上に固定し、そしてＤＰＸ（Fluka, Ronkokome,N
Y）を用いて、脱水し、そしてカバーガラスにより被覆
した。
生成物を、0.04% のジアミノベンジン（ＤＡＢ）及び0.
003%のH2O2を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（pH 7.6）に
おいて３〜５分間、断片を展開することによって可視化
した。続いて、断片をトリス緩衝液により洗浄し、スラ
イド上に固定し、そしてＤＰＸ（Fluka, Ronkokome,N
Y）を用いて、脱水し、そしてカバーガラスにより被覆
した。
【００６８】抗体：
ＡＴ−８：
１：1,000 (200ng／ml) で使用される；リン酸化された
ヒトｔａｕのser 202及びthr 205 を認識するマウスモ
ノクローナル抗体（Innogenetics, Inc. Zwij+ndrecht
(Beigium) ）。 ＰＨＦ−１３： １：20,000で使用される；リン酸化されたヒトｔａｕの
ser 396 及びthr404を認識するモノクローナル抗体（V.
Lee, University of Pennsylvaniaからの贈与物）。
ヒトｔａｕのser 202及びthr 205 を認識するマウスモ
ノクローナル抗体（Innogenetics, Inc. Zwij+ndrecht
(Beigium) ）。 ＰＨＦ−１３： １：20,000で使用される；リン酸化されたヒトｔａｕの
ser 396 及びthr404を認識するモノクローナル抗体（V.
Lee, University of Pennsylvaniaからの贈与物）。
【００６９】抗−ＴＡＵ：
１：7,000 で使用される；全ｔａｕを認識するウサギ
モノクローナル（Accurate Chemical and Scientific C
orp Westbury, NY）。 ＳＭＩ３４： １：1000で使用される；リン酸化された神経フィラメン
トＨを認識するマウスモノクローナル（Stemberger Mon
oclonals, Inc., Lutherville, MD ）。
モノクローナル（Accurate Chemical and Scientific C
orp Westbury, NY）。 ＳＭＩ３４： １：1000で使用される；リン酸化された神経フィラメン
トＨを認識するマウスモノクローナル（Stemberger Mon
oclonals, Inc., Lutherville, MD ）。
【００７０】生後４ヶ月のトランスジェニック マウス
及び野生型マウスからの脳を、免疫組織化学により、ｔ
ａｕ及び神経フィラメント ホスホエピトープの存在に
ついて比較した。それぞれ、リン酸化されたSer-202 及
びThr-205 、並びにSer-396,404を認識するAT-8及びPHF
-13モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物の
外部カプセル（示されていない）に隣接する、扁桃（そ
れぞれ図２及び４）、視床／視床下部及び皮質における
ニューロンをラベルするが、しかし野生型動物の対応す
る領域におけるニューロンをラベルしなかった（図３及
び５）。
及び野生型マウスからの脳を、免疫組織化学により、ｔ
ａｕ及び神経フィラメント ホスホエピトープの存在に
ついて比較した。それぞれ、リン酸化されたSer-202 及
びThr-205 、並びにSer-396,404を認識するAT-8及びPHF
-13モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物の
外部カプセル（示されていない）に隣接する、扁桃（そ
れぞれ図２及び４）、視床／視床下部及び皮質における
ニューロンをラベルするが、しかし野生型動物の対応す
る領域におけるニューロンをラベルしなかった（図３及
び５）。
【００７１】さらに、全ｔａｕについての染色はｐ２５
トランスジェニック動物における多くの細胞体を示し
（図６）、そして主として軸索及び非常に少数の細胞体
が野生型マウスにおいてラベルされた（図７）。リン酸
化された神経フィラメントＨを認識するモノクローナル
抗体（SMI 34）はまた、トランスジェニック マウスの
それらの３種の脳領域及び脊髄において高められた免疫
染色性を示すが（扁桃が図８に示される）、しかし野生
型においてはそれを示さなかった。それら３種のすべて
のマーカーは、年齢相当の対照に比較して、アルツハイ
マー脳においては高められることが知られている。
トランスジェニック動物における多くの細胞体を示し
（図６）、そして主として軸索及び非常に少数の細胞体
が野生型マウスにおいてラベルされた（図７）。リン酸
化された神経フィラメントＨを認識するモノクローナル
抗体（SMI 34）はまた、トランスジェニック マウスの
それらの３種の脳領域及び脊髄において高められた免疫
染色性を示すが（扁桃が図８に示される）、しかし野生
型においてはそれを示さなかった。それら３種のすべて
のマーカーは、年齢相当の対照に比較して、アルツハイ
マー脳においては高められることが知られている。
【００７２】アルツハイマー脳においては、変更された
ｔａｕタンパク質を含むニューロンにおける病理学的変
化が、銀に基づく染色法を用いて同定されてきた。本発
明は、本発明のトランスジェニック マウスにおいて、
上記と同じ３種の脳領域及び脊髄におけるニューロンが
改良されたBielschowsky 銀染色法を用いて、陽性の標
識を示すことを見出した（扁桃、図１０）。この染色は
再び、野生型対照動物においては不在であった（図１
１）。本発明者はまた、トランスジェニック マウスの
脊髄における明らかな拡大された軸索において、銀染色
し、そしてリン酸化された神経フィラメントＨの上昇を
検出し（それぞれ、図１２及び１３）、ところが野生型
マウスにおいては、軸索は予測される大きさのものであ
り、そして神経フィラメント染色は正常であった（図１
４）。
ｔａｕタンパク質を含むニューロンにおける病理学的変
化が、銀に基づく染色法を用いて同定されてきた。本発
明は、本発明のトランスジェニック マウスにおいて、
上記と同じ３種の脳領域及び脊髄におけるニューロンが
改良されたBielschowsky 銀染色法を用いて、陽性の標
識を示すことを見出した（扁桃、図１０）。この染色は
再び、野生型対照動物においては不在であった（図１
１）。本発明者はまた、トランスジェニック マウスの
脊髄における明らかな拡大された軸索において、銀染色
し、そしてリン酸化された神経フィラメントＨの上昇を
検出し（それぞれ、図１２及び１３）、ところが野生型
マウスにおいては、軸索は予測される大きさのものであ
り、そして神経フィラメント染色は正常であった（図１
４）。
【００７３】ＡＴ−８免疫反応性に関しては、扁桃にお
けるほとんどのラベルされたニューロンは、しばしば膨
張したジストロフィー小丘及びねじ曲げられた軸索を伴
って、十分に定義された、濃く染色する体を示した（図
２）。まれではあるが、同定されていない細胞の拡散ラ
ベリングが見られ、そして時おり、大グリア細胞又は小
グリア細胞形態を有する細胞がラベルされた。外部カプ
セルに隣接する皮質においては、ＡＴ−８染色の大部分
は、断面的に存在する場合、しばしば軸索を付随して、
強くラベルされたニューロン細胞体に見出された。視床
／視床下部染色は、他の断片に見られるような両ニュー
ロン染色と共に、より多様であった。
けるほとんどのラベルされたニューロンは、しばしば膨
張したジストロフィー小丘及びねじ曲げられた軸索を伴
って、十分に定義された、濃く染色する体を示した（図
２）。まれではあるが、同定されていない細胞の拡散ラ
ベリングが見られ、そして時おり、大グリア細胞又は小
グリア細胞形態を有する細胞がラベルされた。外部カプ
セルに隣接する皮質においては、ＡＴ−８染色の大部分
は、断面的に存在する場合、しばしば軸索を付随して、
強くラベルされたニューロン細胞体に見出された。視床
／視床下部染色は、他の断片に見られるような両ニュー
ロン染色と共に、より多様であった。
【００７４】ｐ２５ Tg マウスからの脳及び脊髄の組織
学的試験は、脳又は脊髄のニューロン及び軸索における
変化を示したが（ｎ＝１９）、しかし１０種の年齢相当
の野生型対照からのそれらの組織においては変化を示さ
なかった。軸索変化は、脊髄（頸部及び胸部）において
最も明白であり、そして２０〜５０μｍの直径への軸索
原形質の著しい拡張から構成された。拡張された軸索
は、銀染色し、そしてリン酸化された神経フィラメント
H により満たされた（図１２，１３）。影響された脊髄
の一定の横断面は一般的に、白色質のすべての索間に分
布される１０〜１００の染色は、影響された軸索のエミ
リン鞘の内部部分の溶解を示した（記載されていな
い）。
学的試験は、脳又は脊髄のニューロン及び軸索における
変化を示したが（ｎ＝１９）、しかし１０種の年齢相当
の野生型対照からのそれらの組織においては変化を示さ
なかった。軸索変化は、脊髄（頸部及び胸部）において
最も明白であり、そして２０〜５０μｍの直径への軸索
原形質の著しい拡張から構成された。拡張された軸索
は、銀染色し、そしてリン酸化された神経フィラメント
H により満たされた（図１２，１３）。影響された脊髄
の一定の横断面は一般的に、白色質のすべての索間に分
布される１０〜１００の染色は、影響された軸索のエミ
リン鞘の内部部分の溶解を示した（記載されていな
い）。
【００７５】他の文献
（４５） Baumann, K., E.M. Mandelkow, など. ( 1993
). "Abnormal Alzheimer-like phosphorylation of ta
u-protein by cyclin-dependent kinases cdk5."FEBS L
etters 336 ( 3 ) : 417-24. （３２） Bazan, J.F. ( 1996 ). "Helical fold predi
ction for the cyclin box. "Proteins 24 ( 1 ) : 1-1
7. （９） Biernat, J., N. Gustle. など. "Phosphorylat
ion of Ser262 stronglyreduces binding of tau to mi
crotubules: distinction between PHF-like immunorea
ctivity and microtubule." Neuron 11 ( 1 ) : 163-6
3.
). "Abnormal Alzheimer-like phosphorylation of ta
u-protein by cyclin-dependent kinases cdk5."FEBS L
etters 336 ( 3 ) : 417-24. （３２） Bazan, J.F. ( 1996 ). "Helical fold predi
ction for the cyclin box. "Proteins 24 ( 1 ) : 1-1
7. （９） Biernat, J., N. Gustle. など. "Phosphorylat
ion of Ser262 stronglyreduces binding of tau to mi
crotubules: distinction between PHF-like immunorea
ctivity and microtubule." Neuron 11 ( 1 ) : 163-6
3.
【００７６】（６） Biernat, J., E. M. Mandelkow,
など. "The switch of tau protein toan Alzheimer-li
ke state includes the phosphorylation of two serin
e-proline motifs upstream of the microtubule bindi
ng region." EMBO Journal 11( 4 ) : 1593-7. （１７） Billingsley, M.L. and R.L. Kincaid ( 1997
). "Regulated phosphorylation and dephosphorylati
on of tau protein: effects on microtubule interact
ion, intracellular trafficking and neurodegenerati
on." BiochemicalJournal 323 ( Pt 3 ) : 577-91. （７） Bramblett, G.T., M. Goedert, など. ( 1993
). "Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alz
heiner's disease recapitulates development andcont
ributes to reduced microtubule binding." Neuron 10
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-3 bata influences tau binding to microtubules and
microtubule organisation." Journal of Cell Scienc
e 109 ( Pt 6 ) : 1537-43. 〈５２〉 Yamaguchi, H., K. Ishiguro, など. ( 1996
). "Preferential labeling of Alzheimer neurofibri
llary tangles with ntisera for tau protein kinase
( TPK ) 1/glycogen synthase kinase-3 bata and cycl
in-dependent kinase 5, a component of TPK II." Acl
a Neuropathologica 92 ( 3 ) : 232-41.
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
【配列表】
SEQUENCE
<110> Pfizer Products Inc.
<120> Transgenic Animals Expressing Human p25
<130> PC10142A
<140> JP2000-026792
<141> 2000-02-03
<150> US60/118478
<151> 1999-02-03
<160> 7
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1867
<212> DNA
<213> Rattus rattus
<400> 1
ggatccccaa ttcgagctcc tcctctgctc gcccaatcct tccaaccccc tatggtggta 60
tggctgacac agaaaatgtc tgctcctgta tgggacattt gcccctcttc tccaaatata 120
agacaggatg aggcctagct tttgctgctc caaagtttta aaagaacaca ttgcacggca 180
tttagggact ctaaagggtg gaggaggaat gagggaattg catcatgcca aggctggtcc 240
tcatccatca ctgcttccag ggcccagagt ggcttccagg aggtattctt acaaaggaag 300
cccgatctgt agctaacact cagagcccat tttcctgcgt taacccctcc cgacctcata 360
tacaggagta acatgatcag tgacctgggg gagctggcca aactgcggga cctgcccaag 420
ctgagggcct tggtgctgct ggacaacccc tgtgccgatg agactgacta ccgccaggag 480
gccctggtgc agatggcaca cctagagcgc ctagacaaag agtactatga ggacgaggac 540
cgggcagaag ctgaggagat ccgacagagg ctgaaggagg aacaggagca agaactcgac 600
ccggaccaag acatggaacc gtacctcccg ccaacttagt ggctcctcta gcctgcaggg 660
acagtaaagg tgatggcagg aaggcagccc ccggaggtca aaggctgggc acgcgggagg 720
agaggccaga gtcagaggct gcgggtatct cagatatgaa ggaaagatga gagaggctca 780
ggaagaggta agaaaagaca caagagacca gagaagggag aagaattaga gagggaggca 840
gaggaccgct gtctctacag acatagctgg tagagactgg gaggaaggga tgaaccctga 900
gcgcatgaag ggaaggaggt ggctggtggt atatggagga tgtagctggg ccagggaaaa 960
gatcctgcac taaaaatctg aagctaaaaa taacaggaca cggggtggag aggcgaaagg 1020
agggcagatt gaggcagaga gactgagagg cctggggatg tgggcattcc ggtagggcac 1080
acagttcact tgtcttctct ttttccagga ggccaaagat gctgacctca agaactcata 1140
ataccccagt ggggaccacc gcattcatag ccctgttaca agaagtggga gatgttcctt 1200
tttgtcccag actggaaatc cattacatcc cgaggctcag gttctgtggt ggtcatctct 1260
gtgtggcttg ttctgtgggc ctacctaaag tcctaagcac agctctcaag cagatccgag 1320
gcgactaaga tgctagtagg ggttgtctgg agagaagagc cgaggaggtg ggctgtgatg 1380
gatcagttca gctttcaaat aaaaaggcgt ttttatattc tgtgtcgagt tcgtgaaccc 1440
ctgtggtggg cttctccatc tgtctgggtt agtacctgcc actatactgg aataagggga 1500
cgcctgcttc cctcgagttg gctggacaag gttatgagca tccgtgtact tatggggttg 1560
ccagcttggt cctggatcgc ccgggccctt cccccacccg ttcggttccc caccaccacc 1620
cgcgctcgta cgtgcgtctc cgcctgcagc tcttgactca tcggggcccc cgggtcacat 1680
gcgctcgctc ggctctatag gcgccgcccc ctgcccaccc cccgcccgcg ctgggagccg 1740
cagccgccgc cactcctgct ctctctgcgc cgccgccgtc accaccgcca ccgccaccgg 1800
ctgagtctgc agtcctcgac ctgcaggcat gcaagctggg taccgagctc gaattggtcg 1860
cggccgc 1867
<210> 2
<211> 650
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcggccgcat ggcccagccc ccaccggccc agccgcctgc acccccggcc agccagctct 60
cgggttccca gaccgggggc tcctcctcag tcaagaaagc ccctcaccct gccgtcacct 120
ccgcagggac gcccaaacgg gtcatcgtcc aggcgtccac cagtgagctg cttcgctgcc 180
tgggtgagtt tctctgccgc cggtgctacc gcctgaagca cctgtccccc acggaccccg 240
tgctctggct gcgcagcgtg gaccgctcgc tgcttctgca gggctggcag gaccagggct 300
tcatcacgcc ggccaacgtg gtcttcctct acatgctctg cagggatgtt atctcctccg 360
aggtgggctc ggatcacgag ctccaggccg tcctgctgac atgcctgtac ctctcctact 420
cctacatggg caacgagatc tcctacccgc tcaagccctt cctggtggag agctgcaagg 480
aggccttttg ggaccgttgc ctctctgtca tcaacctcat gagctcaaag atgctgcaga 540
taaatgccga cccacactac ttcacacagg tcttctccga cctgaagaac gagagcggcc 600
aggaggacaa gaagcggctc ctcctaggcc tggatcggtg aggcggccgc 650
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> Rous sarcoma virus
<400> 3
gcggccgcga ctctagagga tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt 60
ggacaaacta cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata 120
atgtgttaaa ctactgattc taattgtttg tgtattttag attccaacct atggaactga 180
tgaatgggag cagtggtgga atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat 240
gccatctagt gatgatgagg ctactgctga ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa 300
gagaaaggta gaagacccca aggactttcc ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc 360
tgtgtttagt aatagaactc ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc 420
actgctatac aagaaaatta tggaaaaata tttgatgtat agtgccttga ctagagatca 480
taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 540
ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 600
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 660
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcc 717
<210> 4
<211> 3218
<212> DNA
<213> Multi organism source
<400> 4
ggatccccaa ttcgagctcc tcctctgctc gcccaatcct tccaaccccc tatggtggta 60
tggctgacac agaaaatgtc tgctcctgta tgggacattt gcccctcttc tccaaatata 120
agacaggatg aggcctagct tttgctgctc caaagtttta aaagaacaca ttgcacggca 180
tttagggact ctaaagggtg gaggaggaat gagggaattg catcatgcca aggctggtcc 240
tcatccatca ctgcttccag ggcccagagt ggcttccagg aggtattctt acaaaggaag 300
cccgatctgt agctaacact cagagcccat tttcctgcgt taacccctcc cgacctcata 360
tacaggagta acatgatcag tgacctgggg gagctggcca aactgcggga cctgcccaag 420
ctgagggcct tggtgctgct ggacaacccc tgtgccgatg agactgacta ccgccaggag 480
gccctggtgc agatggcaca cctagagcgc ctagacaaag agtactatga ggacgaggac 540
cgggcagaag ctgaggagat ccgacagagg ctgaaggagg aacaggagca agaactcgac 600
ccggaccaag acatggaacc gtacctcccg ccaacttagt ggctcctcta gcctgcaggg 660
acagtaaagg tgatggcagg aaggcagccc ccggaggtca aaggctgggc acgcgggagg 720
agaggccaga gtcagaggct gcgggtatct cagatatgaa ggaaagatga gagaggctca 780
ggaagaggta agaaaagaca caagagacca gagaagggag aagaattaga gagggaggca 840
gaggaccgct gtctctacag acatagctgg tagagactgg gaggaaggga tgaaccctga 900
gcgcatgaag ggaaggaggt ggctggtggt atatggagga tgtagctggg ccagggaaaa 960
gatcctgcac taaaaatctg aagctaaaaa taacaggaca cggggtggag aggcgaaagg 1020
agggcagatt gaggcagaga gactgagagg cctggggatg tgggcattcc ggtagggcac 1080
acagttcact tgtcttctct ttttccagga ggccaaagat gctgacctca agaactcata 1140
ataccccagt ggggaccacc gcattcatag ccctgttaca agaagtggga gatgttcctt 1200
tttgtcccag actggaaatc cattacatcc cgaggctcag gttctgtggt ggtcatctct 1260
gtgtggcttg ttctgtgggc ctacctaaag tcctaagcac agctctcaag cagatccgag 1320
gcgactaaga tgctagtagg ggttgtctgg agagaagagc cgaggaggtg ggctgtgatg 1380
gatcagttca gctttcaaat aaaaaggcgt ttttatattc tgtgtcgagt tcgtgaaccc 1440
ctgtggtggg cttctccatc tgtctgggtt agtacctgcc actatactgg aataagggga 1500
cgcctgcttc cctcgagttg gctggacaag gttatgagca tccgtgtact tatggggttg 1560
ccagcttggt cctggatcgc ccgggccctt cccccacccg ttcggttccc caccaccacc 1620
cgcgctcgta cgtgcgtctc cgcctgcagc tcttgactca tcggggcccc cgggtcacat 1680
gcgctcgctc ggctctatag gcgccgcccc ctgcccaccc cccgcccgcg ctgggagccg 1740
cagccgccgc cactcctgct ctctctgcgc cgccgccgtc accaccgcca ccgccaccgg 1800
ctgagtctgc agtcctcgac ctgcaggcat gcaagctggg taccgagctc gaattggtcg 1860
cggccgcatg gcccagcccc caccggccca gccgcctgca cccccggcca gccagctctc 1920
gggttcccag accgggggct cctcctcagt caagaaagcc cctcaccctg ccgtcacctc 1980
cgcagggacg cccaaacggg tcatcgtcca ggcgtccacc agtgagctgc ttcgctgcct 2040
gggtgagttt ctctgccgcc ggtgctaccg cctgaagcac ctgtccccca cggaccccgt 2100
gctctggctg cgcagcgtgg accgctcgct gcttctgcag ggctggcagg accagggctt 2160
catcacgccg gccaacgtgg tcttcctcta catgctctgc agggatgtta tctcctccga 2220
ggtgggctcg gatcacgagc tccaggccgt cctgctgaca tgcctgtacc tctcctactc 2280
ctacatgggc aacgagatct cctacccgct caagcccttc ctggtggaga gctgcaagga 2340
ggccttttgg gaccgttgcc tctctgtcat caacctcatg agctcaaaga tgctgcagat 2400
aaatgccgac ccacactact tcacacaggt cttctccgac ctgaagaacg agagcggcca 2460
ggaggacaag aagcggctcc tcctaggcct ggatcggtga ggcggccgcg actctagagg 2520
atctttgtga aggaacctta cttctgtggt gtgacataat tggacaaact acctacagag 2580
atttaaagct ctaaggtaaa tataaaattt ttaagtgtat aatgtgttaa actactgatt 2640
ctaattgttt gtgtatttta gattccaacc tatggaactg atgaatggga gcagtggtgg 2700
aatgccttta atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa tgccatctag tgatgatgag 2760
gctactgctg actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga agagaaaggt agaagacccc 2820
aaggactttc cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg ctgtgtttag taatagaact 2880
cttgcttgct ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg cactgctata caagaaaatt 2940
atggaaaaat atttgatgta tagtgccttg actagagatc ataatcagcc ataccacatt 3000
tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa 3060
aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 3120
caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 3180
gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcc 3218
<210> 5
<211> 2462
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
gaactcgagc agctgaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc 60
gagctcgaat tcatcgatga tatcagatct gccggtctcc ctatagtgag tcgtattaat 120
ttcgataagc caggttaacc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 180
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 240
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 300
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 360
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 420
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 480
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 540
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 600
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 660
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 720
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 780
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 840
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 900
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 960
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1020
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 1080
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 1140
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 1200
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 1260
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 1320
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 1380
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 1440
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 1500
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 1560
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 1620
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 1680
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 1740
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 1800
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 1860
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 1920
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 1980
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 2040
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 2100
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 2160
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 2220
aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 2280
gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa 2340
ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atggacatat tgtcgttaga 2400
acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta 2460
ta 2462
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gcggccgcat ggcccagccc ccaccggccc agccgcctgc a 41
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctcctcctag gcctggaatc ggtgaggcgg ccgc 34
【図１】これは、（Ａ）ｐ２５及びｐ３５／３９に対し
て特異的な抗体によりプローブされた３種の野生型マウ
スからのウェスターンブロット；（Ｂ）同じ抗体により
プローブされた３種のトランスジェニック マウスから
のウェスターンブロットを示す。
て特異的な抗体によりプローブされた３種の野生型マウ
スからのウェスターンブロット；（Ｂ）同じ抗体により
プローブされた３種のトランスジェニック マウスから
のウェスターンブロットを示す。
【図２】これは、扁桃の吻部分において特異的なＡｔ−
８に対して免疫陽性のトランスジェニック マウス脳を
示す。
８に対して免疫陽性のトランスジェニック マウス脳を
示す。
【図３】これは、扁桃の吻部分においてＡＴ−８に対し
て最小陽性の野生型マウス脳を示す。
て最小陽性の野生型マウス脳を示す。
【図４】これは、扁桃の吻部分においてＰＨＦ―１３に
対して免疫陽性のトランスジェニック マウス脳を示
す。
対して免疫陽性のトランスジェニック マウス脳を示
す。
【図５】これは、扁桃の吻部分においてＰＨＦ―１３に
対して最小陽性の野生型マウス脳を示す。
対して最小陽性の野生型マウス脳を示す。
【図６】これは、扁桃の吻部分のいくつかの細胞体にお
ける全ｔａｕに対して免疫陽性のトランスジェネック
マウス脳を示す。
ける全ｔａｕに対して免疫陽性のトランスジェネック
マウス脳を示す。
【図７】これは、扁桃の吻部分の軸索においてｔａｕに
対して免疫陽性の野生型マウス脳を示す。
対して免疫陽性の野生型マウス脳を示す。
【図８】これは、ＳＭＩ−３４により反応されたトラン
スジェニック マウス脳を示す。
スジェニック マウス脳を示す。
【図９】これは、野生型マウス脳の扁桃の吻部分におけ
る最小のＳＭＩ−３４軸索陽性を示す。
る最小のＳＭＩ−３４軸索陽性を示す。
【図１０】これは、トランスジェニック マウス脳の扁
桃の吻部分における銀−陽性細胞体を示す。
桃の吻部分における銀−陽性細胞体を示す。
【図１１】これは、野生型マウス脳の扁桃の吻部分にお
ける軸索の最小銀陽性を示す。
ける軸索の最小銀陽性を示す。
【図１２】これは、トランスジェニック マウスの脊髄
において銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索を示
す。
において銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索を示
す。
【図１３】これは、トランスジェニック マウスの脊髄
においてＳＭＩ−３４陽性を示すいくつかの拡張された
軸索を示す。
においてＳＭＩ−３４陽性を示すいくつかの拡張された
軸索を示す。
【図１４】これは、野生型マウスの脊髄における正常な
軸索がＳＭＩ−３４に対して陰性であることを示す。
軸索がＳＭＩ−３４に対して陰性であることを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 25/24 Ａ６１Ｐ 25/24
25/28 25/28
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 ジョン ダグラス マックネッシュ
アメリカ合衆国，コネチカット 06340,
グロトン，イースタン ポイント ロー
ド，ファイザー インク
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 EA04
GA12 HA01
4C084 AA02 AA13 AA17 BA35 BA44
CA62 NA14 ZA022 ZA152
ZA162 ZA222 ZA962
Claims (9)
- 【請求項１】 p25ポリペプチドのインヒビターを含ん
で成る、ヒトcdk遺伝子のp25フラグメントの発現により
特徴づけられる疾病を有する動物を処理するための組成
物。 - 【請求項２】 p25ポリペプチドのインヒビターを含ん
で成る、神経変性疾患を有する哺乳類を処理するための
組成物。 - 【請求項３】 前記神経変性疾患がtau−関連疾患であ
る、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 前記神経変性疾患が、アルツハイマー
病、パジェット病、無脊髄側方硬化症、ハンチントン舞
踏病、染色体17関連前側頭葉痴呆、発作、外傷性脳損
傷、ピック病、神経突起ジストロフィー、多発性硬化
症、運動性ニューロン疾患、骨髄小脳変性、又は軽い認
識障害である、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項５】 前記哺乳類がヒトである、請求項１に記
載の組成物。 - 【請求項６】 療法的有効量のp25ポリペプチドのイン
ヒビターを投与することを含んで成る、神経変性疾患を
有する哺乳類の処理方法。 - 【請求項７】 前記神経変性疾患がtau−関連疾患であ
る、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記神経変性疾患が、アルツハイマー
病、パジェット病、無脊髄側方硬化症、ハンチントン舞
踏病、染色体17関連前側頭葉痴呆、発作、外傷性脳損
傷、ピック病、神経突起ジストロフィー、多発性硬化
症、運動性ニューロン疾患、骨髄小脳変性、又は軽い認
識障害である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】 前記哺乳類がヒトである、請求項６に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US11847899P | 1999-02-03 | 1999-02-03 | |
| US60/118478 | 1999-02-03 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000026792A Division JP2000224995A (ja) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | ｐ２５ポリペプチドをコ―ドするトランスジ―ンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003286194A true JP2003286194A (ja) | 2003-10-07 |
Family
ID=22378855
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000026792A Withdrawn JP2000224995A (ja) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | ｐ２５ポリペプチドをコ―ドするトランスジ―ンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 |
| JP2003035757A Pending JP2003286194A (ja) | 1999-02-03 | 2003-02-13 | ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 |
| JP2004244342A Withdrawn JP2005027672A (ja) | 1999-02-03 | 2004-08-24 | ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000026792A Withdrawn JP2000224995A (ja) | 1999-02-03 | 2000-02-03 | ｐ２５ポリペプチドをコ―ドするトランスジ―ンを有するトランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞 |
Family Applications After (1)
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