KR20170135655A - 신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 Thy1 유전자 프로모터 - Google Patents

신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 Thy1 유전자 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로서, 인간과 유사한 동물 모델을 제조함에 있어서 타겟 유전자의 발현 조절에 활용될 수 있다.

Description

신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 Thy1 유전자 프로모터{NEURONAL-SPECIFIC EXPRESSION PORCINE THY1 GENE PROMOTOR}
본 발명은 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터에 관한 것이다.
뇌신경 질환에 대한 새로운 치료법을 발견하기 위해 동물 모델을 이용하는 것은 새로운 치료 표적(therapeutic target)을 발견하고, 전임상 단계에서 약물 검사를 수행하기 위해 필수적인 요소이다. 이러한 동물모델의 연구는 비정상적인 뇌세포의 시공간적 변화과정 및 뇌의 기능장애 기전을 정확히 알아내고, 다양한 새로운 치료 표적들과 새로운 치료법의 효과 검증에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 지금까지는 퇴행성 뇌신경 질환의 약물치료나 기전연구를 위한 질병모델로는 대부분 설치류를 이용해 왔으나, 동물 질환모델의 병리양상과 증상이 사람에서 관찰되는 것과 많은 차이를 보이고 있어 설치류질환모델에서 나온 결과를 토대로 임상시험을 시행할 경우 많은 문제점이 있었다. 따라서, 인간과 유사성이 높은 동물을 이용하여 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 활용할 수 질환모델을 만드는 것이 매우 중요해지고 있다. 하지만, 영장류는 희소성이 높아 사육관리가 어렵고 비용이 많이 들기 때문에 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용될 수 있으므로, 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 활용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.
뇌신경 질환 모델로서의 돼지를 제조하고자 하는 경우, 뇌신경 질환 관련 유전자가 돼지의 뇌 또는 신경에서 특이적으로 발현하는 것이 매우 중요하다. 이러한 조직 특이적 발현을 조절하는 것이 프로모터(promoter)이다. 프로모터는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다. 즉, 뇌 질환 모델 돼지를 제조하는 경우, 질환 관련 유전자가 돼지의 뇌 또는 신경세포에서 특이적 발현하도록 유도할 수 있는 프로모터를 함께 도입해야 유전자 발현 시스템이 잘 작동할 수 있다.
본 발명의 목적은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 형질 전환된 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 형질 전환된 세포주를 이용하여 제조된 뇌 질환 동물 모델을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함할 수 있다.
일실시예에 따르면, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고 제2항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터 및 알츠하이머 질환 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환시킨 포유동물의 체세포를 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물을 제공한다.
일실시예에 따르면, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계; 대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터는, 돼지에서 유래한 것으로서, 뇌 세포 또는 신경세포에서의 활성도가 높으므로 타겟 유전자의 발현 조절에 활용될 수 있다. 특히 설치류인 생쥐와 비교할 때, 돼지는 인간의 유전자와 유사성이 높고 대사 측면에서도 유사한 점이 많으므로, 재조합 벡터로 형질전환 되어 질환 모델로서 사용될 수 있는 바, 본 발명의 프로모터는 이러한 질환 모델 제조에서도 활용될 수 있다.
도 1은, ClustalV 방법을 통한 Thy-1 유전자의 계통발생학적 유사성을 나타낸 것이다.
도 2는, zPicture를 이용하여 인간과 돼지의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 3은, zPicture를 이용하여 돼지와 생쥐의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 4는, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는, luciferase reporter 벡터 제작을 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
도 6은, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferase reporter 벡터의 모식도이다.
도 7은, Luciferase assay를 통하여 측정된 돼지의 Thy1 프로모터의 뇌세포 특이적 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 8은, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 reporter 벡터의 모식도이다.
도 9는, 세포 내 Thy1 프로모터와 CMV 프로모터 활성을 나타낸 형광현미경사진이다.
도 10은, PC12 신경세포주(A), NIH3T3 섬유아세포(B), 293T 배아신장세포(C)에서의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 11은, PC12 세포 내 GFP의 발현 정도를 분석한 그래프(A) 및 사진(B)이다.
도 12는, Luciferase reporter 벡터의 Thy1 프로모터 부위를 나타낸 것이다.
도 13은, 각각의 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 14는, 각각의 벡터를 PC12 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 15는, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조를 나타낸 모식도이다.
도 16은, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 고리형 구조를 나타낸 모식도이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
종래에 주로 사용되었던 생쥐의 Thy1 프로모터는 돼지 또는 인간의 Thy1 프로모터의 유사도가 현저하게 떨어지는 반면에, 돼지의 Thy1 프로모터와 인간의 Thy1 프로모터는 유사도가 매우 높으므로, (실시예 1 참조) 인간 질환 연구에 있어서 돼지의 Thy1 프로모터는 향후 활용될 가능성이 높다. 예를 들면, 뇌 질환 또는 신경질환 모델 돼지를 제조함에 있어서, 뇌세포 또는 신경세포 특이적 발현을 보장할 수 있는 프로모터를 제조하는 것이 매우 중요하며, 특히, 재조합 발현 벡터에 사용될 수 있을 정도의 크기를 가지면서도 활성도가 높은 프로모터 단편은 필수적이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다. 서열번호 1의 염기서열 크기는 500 bp 이지만, 이를 포함하는 염기서열이면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 500 bp 내지 2579bp 크기의 염기서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있다. 일실시예로, 서열번호 4 는, -4858 내지 -2279 위치의 2579bp 크기를 갖는 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다. 서열번호 1과 서열번호 4를 참고하여, 500 bp 내지 2579bp 크기의 염기서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 의 염기 서열과 각각 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이거나, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함할 수 있다. 상기 PBX 및 CREB 전사조절인자는 뇌질환과 관련성이 알려져 있는 전사인자들이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 일측에 따르면, 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고, 서열번호 4의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트가 제공된다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터 및 알츠하이머 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 발현 벡터는, 신경세포에 특이적으로 상기 알츠하이머 관련 단백질을 효율적으로 발현을 유도 하고자 할 때 이용 될 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용가능하나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들면, pTet-CKOS가 사용될 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는, 유전자의 발현을 보다 향상시키기 위하여 인핸서를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, CMV (Cytomegalo virus) 인핸서를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자일 수 있다. 알츠하이머병의 대표적인 원인유전자로 알려진 APP, Tau 및 PS1이 알츠하이머병을 일으키는 병인기전인 이러한 β-아밀로이드의 과발현과 Tau 단백질의 응집에 기여 한다는 것이 알려져 있다. β-아밀로이드는 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 프로테올리시스(proteolysis) 과정을 통해 만들어진다. 전구단백질인 APP는 하나의 트랜스맴브레인 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있는 단백질로 교번 스플리싱(alternative splicing)에 의해 몇 가지 이소타입으로 발현되며 세포 내에서 두 가지 대사경로를 거치는 것으로 알려져 있다. 가족성 알츠하이머병 환자들에서 이 APP 단백질에 돌연변이가 발견된다. 지금까지 발견된 돌연변이는 APP670/671(Swedish), APP672(Flemish), APP716(Florida), APP717 (London) 등이 있으며 이들 돌연변이에서 β-아밀로이드의 형성이 증가하는 것이 밝혀져 있다. 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이를 나타내는 또 다른 한가지의 유전자는 프리세닐린 1(PS1)이다. PS1은 8개의 트랜스맴브레인 도메인을 가진 단백질로서 발생 과정에서 중요한 역할을 하며 γ- 시크리테아제 자체 또는 복합체의 일원으로 작용하는 것으로 알려져 있다. PS1은 단백질 전체에 걸쳐 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이들이 45가지 이상이 보고되어 있으며 이들 돌연변이들 역시 β-아밀로이드의 형성량을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다. 생성된 β-아밀로이드에 의한 알츠하이머병의 발병은 Tau 단백질의 과인산화에 의한 신경세포손상의 과정을 동반하며, 이러한 Tau 단백질의 과인산화에는 몇 가지 인산화효소가 작용하는 것으로 알려져 있다. Tau의 과인산화와 더불어 Tau의 tangle 형성 또한 신경세포를 손상시키는 역할을 하며, 다발 (tangle)이 잘 형성되는 Tau의 돌연변이가 발견되었다.
상기 재조합 발현 벡터는, 상기 APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 및 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자와 상기 타우 돌연변이 유전자 사이에 2A 서열을 더 포함하고, 상기 타우 돌연변이 유전자와 상기 PS1 돌연변이 유전자 사이에 2A 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 2A 유전자서열은 18 내지 22개 아미노산을 코딩하고 있으며 그 중에서 말단에 위치하는 4개의 아미노산 Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), Proline (P)은 종간에 중요하게 보존되어 있는 아미노산이다. 상기 서열은 펩티드로 합성될 때, 자기-분열 (self-cleavage)이 일어나는 경향을 보인다. 이러한 성질로 인하여 리보좀(Ribosome)이 단백질 전사를 진행할 때 2A 서열 말단에 위치한 N, P, G를 암호화한 유전자 코드 (genetic code)에 도달하면, NPG를 차례로 인지하여 펩티드 결합을 만들고 다음 아미노산인 proline 암호화 코드에 Proline 이 결합된 prolyl-tRNA을 가져오는 대신에 방출 요소 (releasing factor: RF) 인자를 가져온다. RF 인자가 결합하고 난 다음에는 앞에서 이미 형성된 펩티드는 더 이상 펩티드 결합을 이어가지 못하고 리보좀에서 방출된다. 그리고 2A 서열 이후에 암호화된 코드는 정상적으로 작동하여 다음 단백질 전사를 진행하게 된다. 결론적으로 2A 서열을 삽입함으로써 하나의 프로모터를 이용하여 여러 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 이러한 2A 서열을 세 유전자들 사이 각각에 삽입함으로써, 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있다. 이러한 돌연변이된 아미노산의 일실시예로서, 상기 APP 돌연변이 유전자는 APP695의 595번 아미노산 Lys 이 Asn 으로 596번 아미노산 Met 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 243번 아미노산 Phe 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있다. 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 146번 아미노산 Met 에서 Leu 으로, 286번 아미노산 Pro 이 Leu 으로 돌연변이된 유전자일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환시킨 포유동물의 체세포를 제공한다. 상기 세포는 포유류에서 비롯된 것이면 인간을 제외하고 제한 없이 사용 가능하다. 하지만 기존에 주로 사용되는 마우스의 경우, 대사가 매우 빠르며 일생의 변화가 인간과 매우 다르기 때문에 정확한 질병모델로 사용하기에 어려운 점이 있다. 따라서 인간의 몸집과 유사한 크기를 갖고 있으며 대사 측면에서 유사한 형태를 가지는 동물이 바람직하며, 그 중에서도 돼지가 가장 바람직하다. 일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란을 제공한다. 일실시예에 따르면, 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물을 제공한다.
일실시예에 따르면, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계; 대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: 계통발생학적 분석 및 zPicture 분석을 이용한 인간, 생쥐, 돼지의 Thy1 유전자 유사성 조사>
Thy1 유전자의 서열을 분석하기 위하여 인간(GeneID: 7070), 생쥐(GeneID: 21838), 돼지(GeneID: 100109488)의 전체 유전자와 프로모터(첫번째 exon에서부터 앞쪽으로 약 2.2~2.6 kb) DNA 서열을 National Center for Biothechnology Information (NCBI)에서 다운로드하였다. DNASTAR Lasergene Megalign 소프트웨어를 사용하여 각 DNA 서열의 계통발생학적 유사성을 조사하였다. Align 방법은 Clustal V 방법을 사용하였다.
도 1은, ClustalV 방법을 통한 Thy-1 유전자의 계통발생학적 유사성을 나타낸 것이다.
도 1을 참고하면, 생쥐의 Thy1 유전자에 비해 사람과 돼지의 Thy1 유저자가 계통수에서 매우 가까운 위치에 있음을 알 수 있다.
Thy1의 종간 유전자의 유사성을 조사하고 유사성이 높은 프로모터의 위치를 파악함으로써 돼지 Thy1의 프로모터 범위와 후보서열을 결정하기 위하여, 인간 대 돼지, 또는 돼지 대 생쥐의 Thy1 유전자 유사성을 상호 비교하였다. 비교도구는 pairwise sequence aligner에 기초한 zPicture 분석 tool을 사용하였다. 인간, 돼지, 생쥐의 Thy1 유전자는 4개의 엑손(exon)으로 구성되어 있고 단백질을 발현을 시작하는 ATG codon은 두 번째 엑손에 위치한다. ATG의 A를 +1위치로 명명하고 그 앞쪽에 위치하는 뉴클레오타이드는 "-번호"로 으로 A의 뒤쪽은 "+번호"로 명명하였다. 사람의 경우, Thy1 유전자가 뇌조직에서 특이적으로 발현할 수 있도록 조절하는 유전자서열이 첫 번째 엑손 앞쪽에서부터 두 번째 엑손 앞(-3463 ~ -1)까지 중요하다.
도 2는, zPicture를 이용하여 인간과 돼지의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이며, 도 3은, zPicture를 이용하여 돼지와 생쥐의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 2를 참고하여, 돼지와 인간의 Thy1 유전자 유사성을 분석해 볼 때, 첫 번째 exon앞쪽으로는 DNA 서열 유사성이 높고 첫 번째 인트론(intro) 서열은 유사성이 떨어진다. 반면에, 도 3을 참고하여, 돼지와 생쥐의 DNA서열을 비교하면, 단백질을 발현하는 coding 서열과 첫 번째 엑손 앞쪽을 제외하고, 전체적으로 DNA 서열 유사성이 떨어진다. 즉, 돼지와 인간의 Thy1 유전자의 유사도가 매우 높으며, 그 중에서도 Thy1의 -4858 ~ -2278 에 위치한 유전자서열이 Thy1 발현조절에 관여할 가능성이 높다.
< 실시예 2: 인간과 돼지 Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 예상 전사조절인자 목록>
인간과 돼지 Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 예상 전사조절인자를 조사하기 위하여 rVista 2.0를 분석도구로 사용하였다.
아래의 표 1은, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자를 나타낸 것이다.
-4858 내지 -3858 -3858 내지 -2858 -2858 내지 -1858
SMAD4 NKX25B EGR2
MAZR TBX5 EGR3
SP1 ARP1 SRF
MAZ CDP LRF
RORA CLOX NFY
HTF PBX CAAT
ER NFY ZIC3
XBP1 AREB6 CHCH
RUSH1 AP2A MTF
LFA1 AP2G ETF
ELK1 CREB
TEF1 HNF4
RBPJK SZF11
STAF
E2F1
HSF1
HSF2
SMAD4
EGR1
도 4는, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자의 위치를 나타낸 것이다.
상기 표 1과 도 4를 참고하면, 돼지 Thy1 유전자의 첫 번째 엑손 앞쪽으로 약 1kb안에 TBX5, PBX, CREB, AREB6, AP2, E2F1, HSF1, SMAD4, EGR1, EGR2, EGR3 등의 전사조절인자가 결합할 수 있는 DNA 서열이 존재한다. 이 중에서도, 특히 PBX 및 CREB 전사조절인자는 뇌질환과 관련성이 알려져 있는 인자들이다. 따라서 -3858 ~ -2858, 특히 -3380부터 -2880의 돼지 Thy1의 프로모터 부위가 뇌조직 특이적으로 Thy1이 발현하는 데 중요하다.
< 실시예 3: 돼지의 Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferase reporter 벡터와 luciferase 분석>
실시예 1 및 2의 분석을 기반으로 실제 세포 내에서 조직특이적인 발현을 유도하는 돼지의 Thy1 프로모터 DNA 서열을 찾기 위하여 Luciferase reporter 벡터를 제작하였다. Thy1 유전자 -4858 ~ -2279을 luciferase cDNA 앞에 삽입한 -4858/-2279_Luc 벡터와 -2578 ~ -40을 삽입한 -2578/-40_Luc 벡터를 만들기 위하여 프라이머를 디자인하였다.
서열번호 7은, Thy1 프로모터 -4858 내지 -2279 위치의 염기서열(2579 bp)을 나타낸 것이며, 서열번호 8은, Thy1 프로모터 -2578 내지 -40 위치의 염기서열(2538 bp)을 나타낸 것이다.
도 5는, luciferase reporter 벡터 제작을 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
돼지에서부터 염색체를 분리한 후, 상기 프라이머를 사용하여 돼지 염색체를 주형으로 PCR하여 -4858 ~ -2279 염기서열 및 -2578 ~ -40 염기서열을 갖는 Thy1 프로모터 DNA를 합성하였고, pTOP TA V2 벡터에 TA 클로닝하였다. 합성한 DNA 서열은 시퀀싱을 통하여 정확하게 합성되었음을 확인하였다.
도 6은, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferase reporter 벡터의 모식도이다.
도 6의 A를 참고하면, Luciferase reporter 벡터에 삽입된 Thy1 프로모터 DNA의 위치를 개략적으로 알 수 있다. -4858/-2279_Luc 벡터를 클로닝하기 위해 SacI/NheI 제한효소를, -2578/-40_Luc 벡터는 KpnI/XhoI의 제한효소를 사용하여 각 Thy1 프로모터를 pTOP에서 잘라 pGL4.10[luc2] 벡터에 삽입하였다. 서열번호 9는, pGL4.10[luc2] 벡터의 염기서열 (4242 bp)을 나타낸 것이다.
도 6의 B와 C는 각각의 벡터와 사용된 제한효소를 나타낸 모식도이다.
합성한 두 개의 Thy1 프로모터가 실제 신경세포 특이적 발현패턴을 보이는 지 조사하기 위하여 luciferase assay를 실행하였다. 대표적인 신경세포주 SH-SY5Y와 PC12에 500 ng의 -4858/-2279_Luc 혹은 -2578/-40_Luc 벡터를 50 ng의 pRL-TK 벡터와 함께 Lipofectamine 2000사용하여 transfection하였다. 대조군으로는 500 ng의 기본 pGL4.10[luc2]를 transfection하였다. 또한 293T 세포를 신경세포에 대한 음성대조군 세포주로 사용하여 프로모터의 활성을 조사하였다.
도 7은, Luciferase assay를 통하여 측정된 돼지의 Thy1 프로모터의 뇌세포 특이적 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7을 참고하면, 비 신경세포주인 293T 세포는 두 가지 Thy1 프로모터의 활성이 낮은 반면, SH-SY5Y와 PC12 신경세포주에서는 -4858/-2279_Luc의 프로모터 활성이 매우 높았다. -2578/-40_Luc의 경우, 프로모터 활성이 신경세포주에 특이적으로 보이지 않는 것으로 보아, 신경세포 특이적 Thy1 발현은 Thy1 프로모터의 -4858~-2279 부위에 존재하는 DNA 서열이 중요하다.
< 실시예 4: 세포 내 돼지의 Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 형광 reporter 벡터와 형광분석>
이미지분석을 통한 Thy1 프로모터의 활성을 측정하기 위하여 Thy1 프로모터 -4858/-2279의 전사조절을 받는 EGFP 발현벡터 및 DsRed2 발현벡터를 제조하였다.
도 8은, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 reporter 벡터의 모식도이다.
도 8을 참고하면, 우선, -4858/-2279_Luc을 주형으로 플라스미드 PCR을 통해 -4858 ~ -2279의 Thy1 프로모터를 합성하였고, AseI과 NheI제한효소로 pEGFP1와 pDsRed2의 CMV 프로모터를 제거한 후, -4858 ~ -2279의 Thy1 프로모터를 삽입하여 pThy1-EGFP 벡터(도 8A)와 pThy1-DsRed2 벡터 (도 8B)를 제조하였다.
서열번호 10은, pThy1-EGFP 벡터의 염기서열 (4733 bp)을 나타낸 것이고, 서열번호 11은, pThy1-DsRed2 벡터의 염기서열(4689 bp)을 나타낸 것이다.
상기 EGFP 발현벡터 및 DsRed2 발현벡터를 제조하기 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다.
F : 5' -( Ase Ⅰ ) ATTAAT TCTAGATGGGGCAACTGGAG - 3'
R : 5' -( Nhe Ⅰ ) GCTAGC GGCCAATCAGAGGCTGAG - 3'
293T 세포에 pEGFP1, pThy1-EGFP, pDsRed2, pThy1-DsRed2, 각각의 벡터를 Lipofectamin2000을 사용하여 transfection하고 이틀 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 9는, 세포 내 Thy1 프로모터와 CMV 프로모터 활성을 나타낸 형광현미경사진이다.
도 9를 참고하면, 293T 세포에서 CMV 프로모터의 조절을 받는 GFP와 DsRed 단백질의 발현이 매우 높은 반면, Thy1 프로모터 영향아래에 있는 GFP와 DsRed 단백질은 상대적으로 낮은 발현률을 나타내었다. 이는 Thy1발현이 없는 293T 세포에는 Thy1 프로모터의 활성화를 위한 전사조절인자가 결핍되어 있기 때문이다.
< 실시예 5: 여러 가지 세포 내 존재하는 Thy1 발현정도 FACS분석 >
293T 배아신장세포, NIH3T3 섬유아세포, PC12 신경세포주에서 기본적으로 발현하는 Thy1 단백질의 정도를 관찰하기 위하여 배양된 세포에 0.25% trypsin-EDTA를 처리하고 단일세포로 떼어낸 후, Thy1에 대한 일차항체(생쥐에서 생산)을 세포에 반응시켰다. FITC가 결합되어 있는 항-생쥐 항체를 반응시키고 flow cytometry 분석을 실시하였다.
도 10은, PC12 신경세포주(A), NIH3T3 섬유아세포(B), 293T 배아신장세포(C)에서의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10을 참고하면, NIH3T3, 293T에서는 Thy1 단백질의 발현이 거의 없었으나, PC12 신경세포에는 Thy1발현이 굉장히 높았다. 즉, PC12 세포에서 Thy1 발현을 위한 전사조절인자의 활성이 높기 때문인 것으로 판단되며, 이는 본 발명의 프로모터가 신경세포 특이적인 발현에 매우 큰 역할을 수행한다는 점을 나타낸다.
< 실시예 6: PC12 세포에 Thy1 프로모터와 EGFP를 결합시킨 벡터를 transfection 후 발현분석>
Thy1 단백질의 발현을 위한 전사조절인자가 풍부한 PC12세포에 pEGFP1 (cmv프로모터)과 pThy1-EGFP (Thy1 프로모터)을 transfection시키고 400 μg/ml의 G418을 약 3주 처리하여 stable 세포를 제작하였다. Flow cytometry 및 형광현미경으로 PC12 세포 내 GFP의 발현을 조사하였다.
도 11은, PC12 세포 내 GFP의 발현 정도를 분석한 그래프(A) 및 사진(B)이다.
도 11을 참고하면, CMV 프로모터의 조절을 받는 GFP 발현 보다 Thy1 프로모터의 조절을 받는 GFP의 발현이 현저히 높음을 확인할 수 있다.
< 실시예 7: Thy1 프로모터의 활성에 있어 중요부위 분석을 위한 Luciferase reporter 분석>
-4858~-2279 Thy1 프로모터의 서열 중 신경세포 특이적 발현을 유도하는 서열이 어느 곳인지 알아보기 위하여 -4858에 가까운 부위부터 절제하여 -3880/-2279, -3380/-2279, -2880/-2279 Thy1 프로모터 부위를 PCR 합성하여 SacI/NheI 제한효소로 자른 후 pGL4.10[luc2]에 클로닝 하였다.
도 12는, Luciferase reporter 벡터의 Thy1 프로모터 부위를 나타낸 것이다.
293T와 PC12 세포에 각각의 luciferase reporter 벡터(500 ng)와 pRL-TK(50 ng)을 lipofectamin2000으로 transfection한 후, luciferase assay를 실행하였다.
도 13은, 각각의 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이며, 도 14는, 각각의 벡터를 PC12 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 13을 참고하면, 293T 세포에서는 프로모터의 활성이 낮는 것으로 분석되었다. 반면에 도 14를 참고하면, PC12 신경세포주에서는 -4858/-2279-Luc, -3880/-2279-Luc, -3380/-2279-Luc의 경우는 Thy1 프로모터의 활성이 매우 높았으나, -2880/-2279-Luc의 경우에는 프로모터의 활성이 현저히 저하되었다. 즉, 이는 신경세포 특이적 발현을 유도하는 Thy1 프로모터의 -3380부터 -2880까지 약 500 bp의 DNA 서열이 중요하다는 것을 나타낸다.
<실시예 8: 알츠하이머병 유전자가 도입된 pTet 레트로바이러스 멀티- 시스트로닉 벡터의 완성>
레트로바이러스의 벡터인 pTet-CKOS 를 이용하여 이 벡터에 존재하는 TRE 미니멀 CMV 프로모터와 CKOS 유전자 클러스터를 제거하였다. 유전자 클로닝에 유리하도록 SwaI, ClaI, PacI 및 NotI 등의 제한효소부위를 갖는 벡터로 수정하였다.
알츠하이머병 돌연변이 유전자 β-아밀로이드의 전구단백질(APP) 유전자(NM_201414.2), 프리세닐린(PS-1) 유전자(NM_000021.3), 타우(Tau) 유전자(NM_016834.4)의 아미노산 변이를 유도하기 위하여 위치선택적 돌연변이 키트 (site-directed mutagenesis kit: Stratagene)를 이용하였다. APP 의 경우에는 뇌신경세포에 발현되는 APP695 타입의 유전자를 이용하였으며 유전자의 알츠하이머병의 가족적 변이 (familial mutation)가 발견된 595번 및 596번 두 군데 이중 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이는 β-아밀로이드 42 형태를 더 많이 만들어 내는 것으로 알려져 있다. 상기 아미노산 변이는 각각 K595N, N596M 으로 명명하였다. 프리세닐린 역시 두 개의 아미노산 돌연변이가 도입되었다. 146번과 286번 아미노산의 돌연변이가 도입되었으며, 각각 M146L, P286L 로 명명되었다. Tau의 경우에는 243번 아미노산 한 개만 변이되었으며 P243L 로 명명되었다.
3개의 유전자는 하나의 mRNA 로 전사가 된 후에, 각각 단백질로 번역이 될때 독립적인 펩타이드로 분리되도록 하기 위해서 2A서열로 서로 연결되도록 하였다.
최종적으로 레트로바이러스 벡터에 SwaI와 ClaI 2개의 제한효소를 이용하여 그 자리에 1079bp 크기의 Thy1 프로모터를 삽입하고, 그 다음으로 세 개의 돌연변이 유전자가 일렬로(tandem) 연결된 pTet-porcine TYH1 pro-APPsw-2A-TAU-2A-PS1-SV40 pA인 최종 재조합 발현벡터를 완성하였다. 완성된 재조합 발현벡터는 염기서열 결정을 통해 전체 13,874bp 의 DNA 서열을 확인하였다.
서열번호 12는, 상기의 완성된 재조합 발현벡터의 염기서열 (13,874bp)을 나타낸 것이다.
도 15는, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 이며, 도 16은, 이의 고리형 구조이다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
<110> JEJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> NEURONAL CELLS SPECIFIC EXPRESSION PROMOTOR <130> APC-2016-0195 <150> KR 10-2016-0067517 <151> 2016-12-20 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 500 <212> DNA <213> Porcine <220> <221> promoter <222> (1)..(500) <223> Thy-1 promoter (-3380/-2880) sequences <400> 1 gaagccacaa ggatgcaaat caatcaaata aacctttgtt caaaaaaatt tatctcacct 60 gtgagtggga gagacaagtc accccagggc ttctggtgac ttcaaattga tagggagaaa 120 atggttgccc caggggatta aaagcttggt atctgctact cctttagagt tggcctgtct 180 cctccacttt cccacaattc caccatttcc ccctcccact gggctgggat gcagctgtgg 240 agtggctcag ctccaaggac taggggctcc acagcccagg tccggcggcc agccctccca 300 cttccagcct ggaagtggga tggggagtgg gatgagatga acccggcaga ttgtagccac 360 agatgtggat gtgcagggtc cagcacaggg cttgggtgag gagggcggca ccccatccct 420 tgtctgaaga ccaagcagac agtactcagg acttgggagg gggttggggg aggaggagtg 480 catgaaactg agaagaacct 500 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying Thy-1 promoter (500bp) <400> 2 gaagccacaa ggatgcaaat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying Thy-1 promoter (500bp) <400> 3 aggttcttct cagtttcatg 20 <210> 4 <211> 2579 <212> DNA <213> Porcine <220> <221> promoter <222> (1)..(2579) <223> Thy-1 promoter (-4858/-2279) sequences <400> 4 tctagatggg gcaactggag atgatgggag aagaaagcct aagggactaa gaggaaagcc 60 acaatctgtc ggtaaatcct gccttgggta gaatcttcta aacctttccc gctttcagca 120 ctcttatcct gtcccacagg caaaggggag tttttaaatc tcctctccat caccatcttg 180 tgttccgccc tggttcctaa ttgtcttact tgagccattc actccatcca gccgagacct 240 tgttttagca gacacacaac tgcctagagt ctacacgccc ctccctttcc caaactaaag 300 tgcttaggga cccagaaaat aggccaggtc ctcgtaacct tatcgaaata gcacagctag 360 gccttccacc caacaacact cagagactgg gccatagggt aggaaacagc atccagagtc 420 ttgtccagac agagcccaga catcttctgt agttaagagc cctctgggta ttctcacgtc 480 ctgccccaaa aaaaggaacc aagcttatct gggggcggtg gggagaaggg ggtgtaagcc 540 aaagctaaag caactaaagc aactgtgttc tgataggaaa gatccctgga ctgagaacaa 600 gaaagctgtt ccgcaggaaa gaacacactg cgtggagtgt cagggaggag gccagcacct 660 ctggaatgcg gcaggaagat gaatgggaaa gatgaggtgg tggtggaggg cagcagccag 720 ggccttcaaa atcatcctcc agacaatgac aagcccggtc acctgatctg tgaagaggga 780 tggtctgcaa tctccaggcc ctcgagcctg tgcaaagggc aggctcaggc agctctgctg 840 ctagactaag gacatcccag gtgggcacgg agagctgcat ttctcgtaaa gcgccctagg 900 agcttctgtt gttcaccaga accacgagcc cctggactgg accgttcaca aggctcgttc 960 cagttagaaa attccatcac tctaagagct gggaggcacc taacctccaa gggagggaga 1020 gggaagtgga tctcccactt gccagcccag ggatgacttc caacagtgcc attacagtaa 1080 tggaaactgc agtgaaggtg ccagggctga cttctgtgaa gaaagaggag gacaggagtt 1140 cccctagtgg ctcatcagaa atgaatctga ctagcatcca tgaggatgca ggttcaatcc 1200 ctggcctcat tcagtggctt aaggatccag cgttgccgag agctgtgatg taggtcacag 1260 acgcggctca gatcccgtgt tgctgttgct gtggctgtgg cataggtcag aagcgacagc 1320 tctgatttga cccctaacct gggaacctcc atatcccgct agtgcggccc ttaaaagaca 1380 aaaagaagga aaagagaaga aaagacatag gcgaacagaa aggcagatga cagggtggca 1440 gggccagcct acacgatggc ccgaccagaa ttcacaaaga agccacaagg atgcaaatca 1500 atcaaataaa cctttgttca aaaaaattta tctcacctgt gagtgggaga gacaagtcac 1560 cccagggctt ctggtgactt caaattgata gggagaaaat ggttgcccca ggggattaaa 1620 agcttggtat ctgctactcc tttagagttg gcctgtctcc tccactttcc cacaattcca 1680 ccatttcccc ctcccactgg gctgggatgc agctgtggag tggctcagct ccaaggacta 1740 ggggctccac agcccaggtc cggcggccag ccctcccact tccagcctgg aagtgggatg 1800 gggagtggga tgagatgaac ccggcagatt gtagccacag atgtggatgt gcagggtcca 1860 gcacagggct tgggtgagga gggcggcacc ccatcccttg tctgaagacc aagcagacag 1920 tactcaggac ttgggagggg gttgggggag gaggagtgca tgaaactgag aagaaccttc 1980 tagctgcctg cgccaggagg tacccgggag ctgaaggaga tggagtgccc cagagcagaa 2040 agcccctgca ggtctggatg ttctaggctg gatgaggggg cgaggcaggc ctggggacct 2100 gggaagacca ggcgcagtac ctgccttgct tctgaaaatg ctgctccaac gtggaaaaac 2160 actcccacca tctttctttg gagaaagcct gtaatattcc aacaccaaaa cctctcacta 2220 gaggttcccg tggagatggg ttccagatga aaagggaagg aggaggcatg ggcgctgcct 2280 aacctccatc ctccattcct tacccctctc ccaccggctt ctgaagccgg ggtcagaaga 2340 aagggttaaa gccttaaaag gggaccgatt ttgcggggct ctgggggtcg gctggcacac 2400 cctgagcggc cccgcccttc tctctagtgt ccagaaccct ccctgccctg cccaggccta 2460 acggccacag ggggagggcc cccctttact gcagaccgcc actctcccac accaatatcg 2520 gaccgcctcc tcctccctct gccacccctt ctcgctcccc actcagcctc tgattggcc 2579 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying Thy-1 promoter (2579bp) <400> 5 tctagatggg gcaactggag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying Thy-1 promoter (2579bp) <400> 6 ggccaatcag aggctgagtg 20 <210> 7 <211> 2579 <212> DNA <213> Porcine <220> <221> promoter <222> (1)..(2579) <223> Thy-1 promoter (-4858/-2279) sequences (2579 bp) <400> 7 tctagatggg gcaactggag atgatgggag aagaaagcct aagggactaa gaggaaagcc 60 acaatctgtc ggtaaatcct gccttgggta gaatcttcta aacctttccc gctttcagca 120 ctcttatcct gtcccacagg caaaggggag tttttaaatc tcctctccat caccatcttg 180 tgttccgccc tggttcctaa ttgtcttact tgagccattc actccatcca gccgagacct 240 tgttttagca gacacacaac tgcctagagt ctacacgccc ctccctttcc caaactaaag 300 tgcttaggga cccagaaaat aggccaggtc ctcgtaacct tatcgaaata gcacagctag 360 gccttccacc caacaacact cagagactgg gccatagggt aggaaacagc atccagagtc 420 ttgtccagac agagcccaga catcttctgt agttaagagc cctctgggta ttctcacgtc 480 ctgccccaaa aaaaggaacc aagcttatct gggggcggtg gggagaaggg ggtgtaagcc 540 aaagctaaag caactaaagc aactgtgttc tgataggaaa gatccctgga ctgagaacaa 600 gaaagctgtt ccgcaggaaa gaacacactg cgtggagtgt cagggaggag gccagcacct 660 ctggaatgcg gcaggaagat gaatgggaaa gatgaggtgg tggtggaggg cagcagccag 720 ggccttcaaa atcatcctcc agacaatgac aagcccggtc acctgatctg tgaagaggga 780 tggtctgcaa tctccaggcc ctcgagcctg tgcaaagggc aggctcaggc agctctgctg 840 ctagactaag gacatcccag gtgggcacgg agagctgcat ttctcgtaaa gcgccctagg 900 agcttctgtt gttcaccaga accacgagcc cctggactgg accgttcaca aggctcgttc 960 cagttagaaa 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gcatttgcaa taggacagca ctgccgtttt 1680 cctcacaccc ttcgctgtgg gccaagtaca atcctacctg gggccccaca catacctgac 1740 gtcatccctg gccacacagt catctaagag aaaggaaatt aatgtttgtg gatcacttac 1800 ttacagtgcc aaatgtttgt catttttctt aatctccatc acggccccgt gttatgtatc 1860 taaagcccag tttcgttcag tatctttcag gcatctgtta tctgccagaa aggtctggcc 1920 atcggggatt ttcttctgaa tacgaaatag gaagtctttg tttaacaggt agagcgtttt 1980 agttttgcag gatgtcaaga gttctggaaa ttggttgcac cacaatgtaa atgaacttaa 2040 cacttctgaa ctgtacactt aaaaatggtt taggagagga gttccctggt ggcctgggag 2100 ttaagaacta ggcattgtca ctgctgtggc tcaggtttga ccctggctgg ggaaattctg 2160 catgccacag gcacagcccc gccaaaaatg gttataataa taaatgttat gttctgcgaa 2220 ttttactaaa aaataggaag tccctatctt cctgaaggga agaggaagtg gtaatttcaa 2280 gacacttact caaagtcacc caactagtaa gcattcagca cagataccca ccaccaaagg 2340 gtatgttctc catccctctt gctttctctg actgggaaga gccgagtgtc tgtcacattc 2400 actgagaggt gggaggggag agggctacag agaggggctt ggatgccccc catggccatt 2460 atggcatgtc tcccaggggc ccccaggcct 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gtaccggatt gcccaagggc 720 gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc 780 ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc 840 ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc 900 ttcgaggagg agctattctt gcgcagcttg caagactata agattcaatc tgccctgctg 960 gtgcccacac tatttagctt cttcgctaag agcactctca tcgacaagta cgacctaagc 1020 aacttgcacg agatcgccag cggcggggcg ccgctcagca aggaggtagg tgaggccgtg 1080 gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc 1140 gccattctga tcacccccga aggggacgac aagcctggcg cagtaggcaa ggtggtgccc 1200 ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac accggtaaga cactgggtgt gaaccagcgc 1260 ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct acgttaacaa ccccgaggct 1320 acaaacgctc tcatcgacaa ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac 1380 gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc tgatcaaata caagggctac 1440 caggtagccc cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc 1500 ggggtcgccg gcctgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc ccgccgcagt 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aggtattgga 4080 caggccgcaa taaaatatct ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat 4140 cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat 4200 aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct ct 4242 <210> 10 <211> 4733 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of pEGFP-N1 vector (4733 bp) <400> 10 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac 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gctcccgcac cccgtccctt ccaaccccac ccacccggga gcccaagaag 6600 gtggcagtgg tccgtactcc acccaagtcg ccgtcttccg ccaagagccg cctgcagaca 6660 gcccccgtgc ccatgccaga cctgaagaat gtcaagtcca agatcggctc cactgagaac 6720 ctgaagcacc agccgggagg cgggaaggtg cagataatta ataagaagct ggatcttagc 6780 aacgtccagt ccaagtgtgg ctcaaaggat aatatcaaac acgtcctggg aggcggcagt 6840 gtgcaaatag tctacaaacc agttgacctg agcaaggtga cctccaagtg tggctcatta 6900 ggcaacatcc atcataaacc aggaggtggc caggtggaag taaaatctga gaagcttgac 6960 ttcaaggaca gagtccagtc gaagattggg tccctggaca atatcaccca cgtccctggc 7020 ggaggaaata aaaagattga aacccacaag ctgaccttcc gcgagaacgc caaagccaag 7080 acagaccacg gggcggagat cgtgtacaag tcgccagtgg tgtctgggga cacgtctcca 7140 cggcatctca gcaatgtctc ctccaccggc agcatcgaca tggtagactc gccccagctc 7200 gccacgctag ctgacgaggt gtctgcctcc ctggccaagc agggtttgga attcggaagc 7260 ggagctacta acttcagcct gctgaagcag gctggagacg tggaggagaa ccctggacct 7320 ctcgagatga cagagttacc tgcaccgttg tcctacttcc agaatgcaca gatgtctgag 7380 gacaaccacc tgagcaatac tgtacgtagc cagaatgaca atagagaacg gcaggagcac 7440 aacgacagac ggagccttgg ccaccctgag ccattatcta atggacgacc ccagggtaac 7500 tcccggcagg tggtggagca agatgaggaa gaagatgagg agctgacatt gaaatatggc 7560 gccaagcatg tgatcatgct ctttgtccct gtgactctct gcatggtggt ggtcgtggct 7620 accattaagt cagtcagctt ttatacccgg aaggatgggc agctaatcta taccccattc 7680 acagaagata ccgagactgt gggccagaga gccctgcact caattctgaa tgctgccatc 7740 atgatcagtg tcattgttgt cctgactatc ctcctggtgg ttctgtataa atacaggtgc 7800 tataaggtca tccatgcctg gcttattata tcatctctat tgttgctgtt ctttttttca 7860 ttcatttact tgggggaagt gtttaaaacc tataacgttg ctgtggacta cattactgtt 7920 gcactcctga tctggaattt tggtgtggtg ggaatgattt ccattcactg gaaaggtcca 7980 cttcgactcc agcaggcata tctcattatg attagtgccc tcatggccct ggtgtttatc 8040 aagtacctcc ctgaatggac tgcgtggctc atcttggctg tgatttcagt atatgattta 8100 gtggctgttt tgtgtccgaa aggtccactt cgtatgctgg ttgaaacagc tcaggagaga 8160 aatgaaacgc tttttccagc tgtcatttac tcctcaacaa tggtgtggtt ggtgaatatg 8220 gcagaaggag 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ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca tgccttacaa ggagagaaaa 9120 agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga tcgtgcctta ttaggaaggc 9180 aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt ccgcattgca gagatattgt 9240 atttaagtgc ctagctcgat acagcaaacg ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca 9300 cctccaagct tgttaattca ccatgtctag actggacaag agcaaagtca taaacggcgc 9360 tctggaatta ctcaatggag tcggtatcga aggcctgacg acaaggaaac tcgctcaaaa 9420 gctgggagtt gagcagccta ccctgtactg gcacgtgaag aacaagcggg ccctgctcga 9480 tgccctgcca atcgagatgc tggacaggca tcatacccac ttctgccccc tggaaggcga 9540 gtcatggcaa gactttctgc ggaacaacgc caagtcattc cgctgtgctc tcctctcaca 9600 tcgcgacggg gctaaagtgc atctcggcac ccgcccaaca gagaaacagt acgaaaccct 9660 ggaaaatcag ctcgcgttcc tgtgtcagca aggcttctcc ctggagaacg cactgtacgc 9720 tctgtccgcc gtgggccact ttacactggg ctgcgtattg gaggaacagg agcatcaagt 9780 agcaaaagag gaaagagaga cacctaccac cgattctatg cccccacttc tgagacaagc 9840 aattgagctg ttcgaccggc agggagccga acctgccttc cttttcggcc tggaactaat 9900 catatgtggc ctggagaaac agctaaagtg cgaaagcggc gggccggccg acgcccttga 9960 cgattttgac ttagacatgc tcccagccga tgcccttgac gactttgacc ttgatatgct 10020 gcctgctgac gctcttgacg attttgacct tgacatgctc cccgggtaac taagtaagga 10080 tcaacatcga attcgatttc tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 10140 agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 10200 atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 10260 tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 10320 tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 10380 ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 10440 cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 10500 gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 10560 acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 10620 ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 10680 ctttgggccg cctccccgcc tgtttcgcct cgggctcaat cactagtgaa ttcgataaaa 10740 taaaagattt tatttagtct ccagaaaaag gggggaatga aagaccccac ctgtaggttt 10800 ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc aaggcatgga aaaatacata actgagaata 10860 gagaagttca gatcaaggtc aggaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata 10920 tctgtggtaa gcagttcctg ccccggctca gggccaagaa cagatggaac agctgaatat 10980 gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc aagaacagat 11040 ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag tttctagaga accatcagat gtttccaggg 11100 tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct 11160 cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga gctcaataaa agagcccaca acccctcact 11220 cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct 11280 cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat 11340 tgactacccg tcagcggggg tctttcattt gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg 11400 cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggct gcctcgcgcg tttcggtgat 11460 gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 11520 gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 11580 gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 11640 cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 11700 ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 11760 tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 11820 aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 11880 gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 11940 aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 12000 ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 12060 tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 12120 tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 12180 ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 12240 tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 12300 ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 12360 tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 12420 aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 12480 aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 12540 aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 12600 ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 12660 acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 12720 ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 12780 gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 12840 taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 12900 tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 12960 gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 13020 cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 13080 aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 13140 cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 13200 tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 13260 gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 13320 tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 13380 gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 13440 ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 13500 cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 13560 agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 13620 gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 13680 tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattcatac 13740 cagatcaccg aaaactgtcc tccaaatgtg tccccctcac actcccaaat tcgcgggctt 13800 ctgcctctta gaccactcta ccctattccc cacactcacc ggagccaaag ccgcggccct 13860 tccgtttctt tgct 13874

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터.
  2. 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함하는 것인, Thy1 유전자 프로모터.
  4. 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  5. 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고 제2항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  6. 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터; 및
    알츠하이머 질환 관련 유전자;를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자인, 재조합 발현 벡터.
  8. 제6항의 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환시킨 포유동물의 체세포.
  9. 제6항의 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란.
  10. 제9항의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물.
  11. 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계;
    제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및
    상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는,
    재조합 발현 벡터 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
    상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계;
    상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계;
    대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계;
    상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 더 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법.
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