JP2707466B2

JP2707466B2 - 遺伝子導入非ヒト動物

Info

Publication number: JP2707466B2
Application number: JP1172965A
Authority: JP
Inventors: 寛芳有賀; 嘉生佐藤; 誠一芝村; 満古沢
Original assignee: 第一製薬株式会社
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1989-07-06
Publication date: 1998-01-28
Anticipated expiration: 2013-01-28
Also published as: JPH02186931A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は自己複製配列含有プラスミドにより遺伝子導
入された遺伝子導入非ヒト動物、その製造方法及びこれ
を用いたペプチド製造方法に関するものである。

（発明の背景）動物胚に組換DNAを導入して形質転換した遺伝子導入
（または移入）動物（トランスジェニック・アニマル,T
ransgenic animal）が知られている。例えば、ヒトグロ
ビン遺伝子を含む遺伝子導入マウス（文献1,2）、ウサ
ギグロビン遺伝子を含む遺伝子導入マウス（文献3,
4）、ニワトリトランスフェリン遺伝子を含む遺伝子導
入マウス（文献５）、機能的に再編成した免疫グロブリ
ン遺伝子を含む遺伝子導入マウス（文献６）、マウスメ
タロチオネイン（MMT）プロモーターにつながれたラッ
ト成長ホルモン遺伝子を含む遺伝子導入マウス（文献
７）、同じくMMTプロモーターにつながれたチミジンキ
ナーゼ遺伝子を含む遺伝子導入マウス（文献８）、同じ
くMMTプロモーターにつながれたヒト成長ホルモン遺伝
子を含む遺伝子導入マウス（文献９）、活性化腫瘍遺伝
子配列を有する非ヒト遺伝子導入動物（文献10）があ
る。また、ミルク蛋白質プロモーターにつないだ外来遺
伝子を有する遺伝子導入哺乳動物も知られている。（文
献11）。

このような遺伝子導入動物を用いれば、従来行なわれ
ているような微生物や動物細胞での組換DNA発現による
目的ペプチドの生産に比べ、はるかに大量の目的ペプチ
ドの生産が可能となり、また一度遺伝子導入動物を得れ
ば、その子孫からも効率よく目的ペプチドが大量生産で
きる。

動物細胞内で複製する複製単位としては、動物細胞由
来のプラスミドは見出されていない。従って動物細胞の
プラスミド・ベクターの構築には、ウイルスゲノムの一
部が用いられている。このためベクターを導入する宿主
の動物の種類は用いるウイルスにより限られている。

また動物細胞内に導入されたプラスミドは、それ自体
はもとより、宿主染色体に組込まれた場合でも、この部
分だけで自律複製することはない。これは従来のプラス
ミド・ベクターがウイルスのOri（複製開始部位）を含
んでいても、動物細胞内にはウイルスDNAの複製に必要
な蛋白質等が存在せずこのOriが働かないためである。
従って導入されたプラスミド・ベクターは宿主染色体に
組込まれて、染色体複製の際にその一部として複製され
ることになる。このため導入遺伝子の複製数はどうして
も少なくなり、その結果導入遺伝子の発現すなわち目的
ペプチドの産生も多くは望めない。また外来遺伝子の宿
主染色体への挿入位置を選ぶことが出来ないので、異常
位置に挿入された場合には、宿主動物の遺伝子異常を来
したりするという不都合もある。

動物の染色体が自己複製する際の複製開始点は自己複
製配列（Autonomously Replicating Sequence,ARS）に
含まれている。このARSは真核生物の細胞内で自律的に
複製して増殖するDNA配列であり、酵母で機能するもの
は報告されていたが（文献12）、高等哺乳動物からは発
見されていなかった。発明者はマウス細胞で機能するマ
ウスDNA由来のARS（pARS65）が初めて見出し（文献1
3）、このARSがラット、ヒトなどの異種細胞でも機能す
ることを報告した（文献14）。さらに発明者はヒト前骨
髄細胞性白血病細胞株HL-60からもc-myc蛋白と結合する
DNA配列がARS（pHLmyc）であること、さらにヒトc-myc
遺伝子上流域のHindIII-PatI領域にARS（pmys（H-P））
が存在し、このARSがマウスARS（pARS65）やヒトARS（p
HLmyc）と相同性があることを明らかにしている（文献1
5）。

今回発明者が動物胚細胞にARS含有プラスミドを導入
したところ、このプラスミドがエピゾーム状態すなわち
染色体に組込まれることなく自律複製して安定に保持さ
れることが見い出された。本発明はこの知見に基づき、
ウイルスベクターによらないプラスミドによる遺伝子導
入非ヒト動物、その製造方法、その利用方法を提供する
ものである。

（発明の目的）すなわち本発明は導入プラスミドの大量複製、目的ペ
プチドの大量発現を可能とし、しかも宿主染色体DNAの
損傷がない遺伝子導入非ヒト動物を提供することを第１
の目的とする。

またその遺伝子導入非ヒト動物の製造方法を提供する
ことを第２の目的とする。

さらに遺伝子導入非ヒト動物を用いて目的ペプチドを
産生させる方法を提供することを第３の目的とする。

（発明の構成）このような本発明の第１の目的は、生殖細胞及び体細
胞内に、哺乳動物細胞の自己複製配列DNAとプロモータ
ー配列とペプチド遺伝子とを含むプラスミドが染色体外
DNAとして自己複製可能に導入されていることを特徴と
する遺伝子導入非ヒト動物により達成される。

第２の発明の目的は、哺乳動物細胞の自己複製配列DN
Aとプロモーター配列とペプチド遺伝子とを含有するプ
ラスミドを胚細胞に導入することを特徴とする遺伝子導
入非ヒト動物の製造方法により達成される。

第３の発明の目的は、遺伝子導入非ヒト動物の体細胞
内で、前記ペプチド遺伝子を発現させることを特徴とす
るペプチド製造方法により達成される。

ARS（自己複製配列）はDNA結合性蛋白と特異的親和性
を有するDNA配列領域として得ることができる。

このDNA結合性蛋白は細胞核内に存在する非ヒストン
蛋白であって、DNAと結合してDNAの機能発現を制御・調
節している。このような蛋白として例えば、c-myc蛋白
（文献16参照）、v-myc蛋白（文献17参照）、N-myc蛋白
（文献18参照）、c-myb蛋白（文献18参照）、v-myb蛋白
（文献18参照）、c-fos蛋白（文献18参照）、v-fos蛋白
（文献18参照）、p53（文献18参照）、RB遺伝子産物
（文献19参照）などのmyc蛋白やmyb蛋白類がある。

ARS取得源としての細胞は特に限定されないが、DNA結
合性蛋白を多量に産生している細胞をARS取得源とする
のが好ましく、例えばヒトHL-60細胞、ヒトIML細胞、ヒ
トRaji細胞、マウスFM3A細胞などがある。またARSはマ
ウス、ヒト由来のものに限られず、ラット、モルモッ
ト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル等の哺乳動物の
ものを用いることができる。

動物細胞のDNAからのARSの取得は特開昭63-185386及
び該出願に対応する欧州特許出願の公開公報EP0254315A
2に記載の方法により行なうことができる。すなわち哺
乳動物細胞より取り出した染色体DNAを適当な制限酵素
で消化して適当な長さのDNAフラグメント（通常1000〜1
0000bp）を得る。これをDNA結合性蛋白とインキュベー
トしてDNA−蛋白結合体を形成させた後、抗DNA結合性蛋
白抗体、プロテインＡを加えて免疫複合体として沈澱さ
せる。この沈澱物よりフェノール抽出によりARSを含む
目的DNAフラグメントを得ることができる。ARS活性が有
ることを確認したDNAフラグメントは、そのまま、或い
は必要に応じて適当な長さのフラグメントにして動物細
胞用ベクターの構築に用いるとができる。

このようなARSとしては例えば、pHLmyc、pmyc（H-
P）、pmyc（H-K）、pIMR-N、pRJ-53、pARS65等の各プラ
スミドに含有されるARS（文献15）を用いることができ
る。

pHLmycは、ヒトHL-60細胞染色体DNAのHindIII-HindII
Iフラグメントからc-myc蛋白と結合するフラグメントを
得てこれをpUC19（ファルマシア社製）に挿入した後菌
内で再編成されたヒトARS含有プラスミドであり、E.col
i K12 C600 ARS-2内で増殖されている（微工研寄託番
号：微工研条寄第1444（FERM BP-1444））。そのポリリ
ンカーHindIIIサイトの99塩基のDNA配列から予想される
二次構造は第５又は第６図に示すよなステムループ構造
であり、塩基12〜59又は塩基17〜74が重要なARSの塩基
配列であると考えられている。

pmyc（H-K）及びpmyc（H-P）は、それぞれヒトc-myc
遺伝子（文献23,第１図参照）の上流域のHindIII-KpnI
領域（約1200bp）及びHindIII-PstI領域（210bp）をプ
ラスミドpUC19（ファルマシア社製）に挿入したプラス
ミドである。何れもARS活性を有することから、ヒトc-m
yc遺伝子上流域のHindIII-PstI領域にARSの中核がある
と思われる。このHindIII-PstI領域の塩基配列は、である。第７図はこの一次構造から予想される推定二次
構造であり、ステムループ構造をとる塩基76〜101、塩
基120〜160、塩基149〜190の部分が重要であると思われ
る。またpmyc（H-P）のARSをマウスARS（pARS65）及び
ヒトARS（pHLmyc）との間で比較すると、第８図に示す
ように高い相同性が認められる。図中星印は一致してい
る箇所である。

pmyc（H-P）を含有するE.coli MV1184の受託番号は微
工研条寄第1932号（FERM BP-1932）である。

またpIMR-NはヒトIMR32細胞の染色体DNAのHindIII-Hi
ndIII領域フラグメントの内、IMR32核抽出液（N-myc蛋
白）と結合するフラグメントを、pRJ-53はヒトRaji細胞
の染色体DNAのHindIII-HindIII領域フラグメントの内、
Raji核抽出液（p53蛋白）と結合するフラグメントを同
様にプラスミドに挿入して得たヒトARS含有プラスミド
である。

また、で表わされる21塩基のDNAもARSとして使用できる。これ
はプラスミドpmyc（H-P）のHindIII-PstI領域内にあるc
-myc蛋白結合領域であり、HindIII-PstIフラグメントの
塩基135〜155に対応する。この21塩基DNAも細胞内でエ
ピゾーム状態で複製可能であり、ARSとして特に重要配
列であると考えられる（特願昭63-284641参照）。従っ
てこの21塩基のARS配列を用いて遺伝子導入動物を作成
することが可能である。

ベクター・プラスミドはARS、プロモーター、発現す
べき目的ペプチドの遺伝子などから構成される。ペプチ
ド遺伝子下流域には翻訳終了用のポリＡシグナルを配列
させるのが好ましい。分泌器官でペプチドを産生、分泌
させるような場合には、シグナル配列を含めたベクター
を構築してもよい。

生産ペプチドは特に限定されず任意のものを選ぶこと
ができるが、インターフェロンやインターロイキンなど
のリンホカイン類、インシュリン、成長ホルモン、ヒト
組織プラスミノーゲン、アクチベーター、その他各種酵
素などのペプチド、蛋白、糖蛋白等の医薬等を挙げるこ
とができる。

遺伝子導入動物の体細胞内で外来ペプチド遺伝子を発
現させるためには宿主の体細胞内に存在する蛋白で発現
調節されることが望ましい。従って、本発明で用いられ
るプロモーターとしては、宿主の体細胞内に存在する蛋
白によりmRNA転写レベルを調節するようなプロモーター
が好ましい。宿主体細胞内に形成される蛋白は臓器、器
官により異なるから、どの臓器・器官で目的ペプチドを
産生させるかにより使用するプロモーターを適宜選択す
る。一般に外分泌系の器官で目的ペプチドを産生させれ
ば最も効率的に目的ペプチドを収集することができる。

例えば、目的ペプチドを乳腺で産生させ乳汁から収集
する場合には以下のプロモーターを使用できる。

カゼイン遺伝子のプロモーター領域（牛、山羊、マウ
ス、ラット等のカゼイン遺伝子の5'上流数kbの塩基配
列）（文献20,21,22,23）、 α−ラクトグロブリン・プロモーター、β−ラクトグ
ロブリン、プロモーターおよび同様のプロモーター機能
を有する種々の制御領域（文献20）、ホエイ・アシッド・プロテイン・プロモーター（WAP
プロモーター）（文献24,25,26）、 MMTVプロモーター（文献27）、同様に、目的ペプチドを、肝臓組織内で産生させるに
は肝炎ウイルスプロモーターまたはSAPプロモーター
（文献28）等を、骨髄で産生させるにはイムノグロブリ
ンプロモーターを、胸腺で産生させるにはＴ細胞レセプ
タープロモーターを、またニワトリ卵に産生させるにオ
ボアルブミンプロモーターを、それぞれ使用できる。

なお本発明では種々の細胞由来の蛋白で外来遺伝子の
発現が調節されるものだけでなく、外部刺激により調節
されるプロモーターを用いてもよい。例えば、メタロチ
オネインプロモーターを用いて、体外から投与された重
金属が集る肝臓や腎臓などで発現するようにしてもよ
い。またウイルスプロモーターを用いて、ウイルス感染
により発現するようにしてもよい。

これらのプロモーターはその由来とは別の多種の動物
にも使用してもよいのは勿論である。

以上のプラスミド・ベクターを構築するための遺伝子
操作は慣用技術により行なえる（例えば文献29参照）こうして作られた産生用のベクターを宿主動物の胚細
胞に移入する方法には、マイクロインジェクション法
（文献30）などがあり、何れの公知方法に従ってもよ
い。例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水
等に溶かしたベクターをマイクロピペットで受精卵に注
入し、この卵をホルモン処理（PGF₂α、hCG,エストラジ
オール、LH等）または小動物では物理的刺激により擬妊
娠状態にした宿主動物の子宮内に移植する。この宿主動
物を飼育して分娩させることによって遺伝子導入非ヒト
動物が得られる（文献31を参照）。

このような方法により胚細胞に導入された外来遺伝子
は、成長した動物の全細胞に分布する。外来遺伝子はさ
らに生殖細胞にも取り込まれ、その動物の子孫の全ての
体細胞にも分布することになる。なお外来遺伝子を導入
される宿主動物は、ARS（自己複製配列）の由来した細
胞の種と同じである必要はなく、原理的には、哺乳類、
爬虫類、鳥類、昆虫等全ての動物種との間で形質転換が
可能である。哺乳動物としては、例えばマウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマなどがあり、特
にマウス、ヤギ、ウシが好ましい。

このように形質転換された遺伝子導入動物は、成長に
伴ない内因性または外因性の刺激により、目的ペプチド
を産生する。これによってペプチドの大量生産が可能と
なる。

目的ペプチドを大量生産するための好ましい態様とし
ては、前記WAPプロモーター等を利用して遺伝子導入動
物を作成し、成熟後妊娠・分娩させて、乳汁中に目的蛋
白を分泌させ、これを単離する方法が挙げられる。乳汁
からの分離精製法は一般的なものでよいが、例えば、乳
汁を酸沈降法（塩酸などの酸を加えてpH4.2〜4.6とす
る）またはカルシウム・レンニン沈降法（カルシウムイ
オン存在下でレンニンを作用させる）で処理するとカゼ
インを沈降・除去させることができる。上清のホエイ
（whey）から、通常の蛋白分離方法、例えば、ゲル濾
過、カラムクロマトグラフィ、電気泳動、高速液体クロ
マトグラフィなどにより、目的蛋白を単離、精製するこ
とができる。目的蛋白がカゼインと共に沈降するもので
あるときは、乳汁に尿素及び２−メルカプトエタノール
を加えてクロマトグラフィ等上記の一般的分離方法によ
り、目的物を単離精製できる（文献32,33,34を参照）。

またガン遺伝子を導入する場合すなわち目的ペプチド
をガン蛋白とした場合には、特開昭61-81743号公報（対
応米国特許4,736,866号）に記載された方法に従って、
発ガン試験や抗ガン剤のスクリーニングにこの遺伝子導
入動物を用いることもできる。さらに同様な方法によっ
てガン以外の病気の原因遺伝子を導入することにより、
遺伝子病の病態モデル動物を作成し薬物のスクリーニン
グ等に用いることもできる。本発明はこのような実験動
物及びその製造方法も包含する。

（実施例１）遺伝子導入動物の作製ヒトc-myc遺伝子（文献35）とプラスミドpUC19（ファ
ルマシア社製）とを用いてヒトARS含有プラスミドpmyc
（H-P）を構築した。ヒトc-myc遺伝子は細胞性癌遺伝子
であり、正常細胞でも発現されるが多くのガン細胞発現
のレベルが非常に高く、c-mycの異常発現が発ガンの一
因と考えられている。第１図はこのヒトc-myc遺伝子上
流域の制限酵素開裂地図であり、この領域のHindIII-Ps
tI領域にARSが存在することが発明者によって明らかに
されている（文献15）。

ヒトc-myc遺伝子を含むプラスミド（文献35）から切
りだしたHindIII-PstI領域をプラスミドpUC19（ファル
マシア社製）のHindIII-PstI領域に挿入して、ヒトARS
含有プラスミドpmyc（H-P）を作製しdam⁺ E.coli内で増
殖させた。このE.coli MV1184は微生物工業技術研究所
に既に寄託されており、その受託番号は微工研条寄第19
32号（FERM BP-1932）である。

このプラスミドpmyc（H-P）を、マウス（B6C3F1,C57/
BL6×C3H/HenのF₁）の受精卵の雄性前核にマイクロガラ
スピペットを用いて注入し、この卵を偽妊娠雌マウスの
子宮に移植した。

（実施例２）導入DNAの解析３週令の出産児（F₀）雄・雌各１匹の尾の全DNAをSDS
−プロテナーゼＫ法（文献29）により抽出した。抽出DN
Aをアガロース電気泳動にかけ、³²P-pmyc（H-P）をプロ
ーブにしてサザーンブロッティング（文献42）した。そ
の結果導入したpmyc（H-P）はすべて染色体DNAとしてプ
ラスミドのまま存在していた。

動物胚に導入したpmyc（H-P）はdam⁺ E.coli内で増殖
されたものであり、この大腸菌内ではGATCサイト内のア
デニン残基がメチル化される。しかし動物細胞内にはda
mメチラーゼは存在しないから、動物細胞内で新たに複
製されるとすれば複製pmyc（H-P）はメチル化されてい
ないはずである。そこでアデニン残基がメチル化された
GATCサイトを切断部位とするとDpnIと、非メチル化アデ
ニン残基を含むGATCサイトを切断部位とするMboIとで、
それぞれFOマウスの尾のDNAを処理したところ、このDNA
はDpnI抵抗性、MboI感受性を示し、pmyc（H-P）はマウ
ス尾の中で複製されていたことを示していた。すなわち
FOマウスの尾の中でpmyc（H-P）は宿主染色体内に取り
込まれることなくエピゾーム状態で複製されていること
が示された。

同様にF₀の雌雄を交配して得た子孫F₁（雄２匹、雌６
匹）の尾のDNAについて調べたところ、pmyc（H-P）がエ
ピゾーム状態で存在していた。このことはF₀マウスのpm
yc（H-P）が生殖細胞を通して子マウスに伝幡し安定な
形で増殖したことを意味する。さらにF₁同士、F₂同士、
F₀×F₁を交配して全部で120匹の子孫マウスを調べたと
ころ、その全てのマウス中にpmyc（H-P）が染色体外に
存在していた。従ってpmyc（H-P）はマウス個体中にい
ったんプラスミドとして導入されると極めて安定に子孫
に伝幡されることが示された。

第２図はF₂マウス（雄15匹、雌13）の尾のDNAのサザ
ーンブロットパターンであり、矢印部分の低分子量分画
にpmyc（H-P）が存在し、染色体DNAに相当する大分子量
分画（各レーン上端）にはpmyc（H-P）が存在していな
い、すなわちpmyc（H-P）が染色体外DNAとして存在して
いることを示している。

また第３図はF₀（雄）×F₁（雌）のバッククロスして
得たマウス（雄雌各８匹）の尾DNAのサザーンブロット
パターン図であり、代を重ねてもpmyc（H-P）が安定し
て子孫に伝幡されることを示している。

（実施例３） pmyc（H-P）の体内分布 F₂マウスの各臓器のDNAを抽出してサザーンブロッテ
ィングによりpmyc（H-P）の体内分布を調べた。第４図
に示すように調べた全ての臓器にpmyc（H-P）が安定に
存在していた。pmyc（H-P）の複製数は細胞あたり20〜5
0であった。このことは遺伝子導入動物のどの体細胞内
でもヒトARSが機能していることを示している。

なお第４図は雌のF₂マウスについて調べたものである
が、雄のF₂マウスについても同様な結果が得られ、精巣
にもpmyc（H-P）が安定に存在していた。

以上の結果より、ヒトARS含有プラスミドpmyc（H-P）
は動物生殖細胞および全ての体細胞内に３代以上の子孫
にわたり染色体外DNAとして安定に維持され、動物個体
内でもARS活性を有して自己複製することが示された。
これにより任意の目的ペプチドをコードする遺伝子、プ
ロモーターを選択してARS含有プラスミド・ベクターを
構築すれば、目的ペプチドを効率よく大量生産可能な遺
伝子導入動物を作製することが可能になる。

（実施例４） ARSの同定フットプリント法により、pmyc（H-P）のHindIII-Pst
I領域内のARSを同定した。

フットプリント法とは、蛋白質が結合したDNAはDNase
Iに対する反応がブロックされることを利用したもの
で、結合蛋白質存在下でDNaseI処理したDNAと結合蛋白
質非存在下でDNaseI処理したDNAの両方を塩基配列決定
用の高分解能ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、DNas
eIの攻撃から保護された部分（蛋白結合部位）に対応す
るDNAバンドをバンド強度の減少として観測するもので
ある。同時に同じDNAをマクサム−ギルバートの化学反
応処理したものを並べて電気泳動することにより、DNas
eI消化から保護された場所を正確に決定できる（文献3
6）。

ヒトc-myc遺伝子を含むプラスミド（文献35）からHin
dIII-PstI領域を切り出し、これにc-myc蛋白（文献37）
を結合させ、フットプリント法により、c-myc蛋白と結
合したDNA領域を決定した。このDNA領域はで表わされる21塩基であった。このDNA配列は、ヒトc-m
yc遺伝子上流域のHindIII-PstI領域（210bp）の塩基135
-155に対応していた（第７図参照）。

常法に従いこの21基塩のDNAを合成し、この合成ARSを
以下の実施例に供した。

（実施例５） 21bpのARS活性合成した21塩基のDNAにBamHIサイトを付加して（第10
図上段のDNA配列参照）プラスミドpSVPCATのCAT遺伝子
のSV40プロモーター領域の上流BamHIサイトに挿入して
合成ARS含有プラスミドpmyc-o-PCATを作製した。なおプ
ラスミドpSVPCATはプラスミドpUC18（ファルマシア社
製）にCAT遺伝子（文献38）とその上流に隣接してSV40
プロモーターを挿入したもので、エンハンサー領域を有
さないものである。

この合成ARS含有プラスミドpmyc-o-PCATをヒトHeLa細
胞にトランスフェクトし、40時間培養後プラスミドに対
応する低分子量DNAをハート（Hirt）法（文献39）によ
り抽出した。

抽出DNAをEcoRI処理（環状プラスミドを直線状DNAに
する）した後、DpnIまたはMboI処理し、アガロース電気
泳動にかけ、³²ＰでラベルしたpUC18をプローブにして
サザーンブロッティングした。

第９図に示すように、pmyc-o-PCATのDNAはDpnI処理し
ても泳動度に影響がなく（DpnI抵抗性）、MboI処理によ
り切断されていた（MboI感受性）を示し、pmyc-o-PCAT
はHeLa細胞内で複製されていた。すなわち真核細胞であ
るHeLa細胞内でpmyc-o-PCATは宿主染色体内に取り込ま
れることなくエピゾーム状態で複製されていることが示
され、合成21bpDNAはARS活性を有することが確認でき
た。

なお第９図において、p-myc（H-P）PCATはc-myc遺伝
子上流域のHindIII-PstI領域（210bp）の両端をBanHIに
修飾して、p-myc-o-PCATの構築と同様に、プラスミドpS
VPCATのBamHIサイトに挿入したものであり、同様にDpnI
抵抗性、MboI感受性を示し、HeLa細胞内で複製してい
る。この点ARS配列を有さないpSVPCATはDpnI感受性、Mb
oI抵抗性を示しARS活性は認められない（第９図、pSVPC
ATのレーン参照）。

同様なARSアッセイをヒトRaji細胞、マウスＬ細胞等
についても行なったが同様な結果が得られ、合成ARSの
複製能には種特異性がないことが示された。

（実施例６）合成ARSとc-myc蛋白との結合合成21bpARS-DNAを³²Ｐでラベルし、ヒトRaji細胞の
核抽出液（c-myc蛋白を大量に生産している）と混合
し、ポリアクリルアミド電気泳動にかけてゲルシフトア
ッセイを行った。

第10図に示すように、核抽出液（c-myc蛋白）との混
合によりDNA−蛋白複合体に対応する低泳動度のバンド
A,B,C,Dのバンドが認められた。このバンドはホモオリ
ゴ（³²Ｐでラベルしていない合成ARS）で希釈した場
合、また抗c-myc抗体で核抽出液を処理した場合にも消
失していた。またプラスミドpBR322をHaeIII消化して20
〜数100bpのDNA断片としたものを同時添加した場合には
低泳動度のバンドは消失しなかった。この結果より合成
ARS-DNAとc-myc蛋白とは互いに特異的に結合することが
示された。

（実施例７）合成ARSの転写調節活性合成21bpのARS-DNAに転写調節領域が存在するかどう
かをCATアッセイ（文献40）により調べた（第11図）。

CATとはクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼの略で、クロラムフェニコールの１位か３位又は
その両方の水酸基をアセチル化する酵素である。このCA
T遺伝子と検定するDNA配列とを持つベクターを細胞内に
トランスフェクトし、翻訳されてくる酵素の活性を細胞
抽出液のアセチル化能を評価することにより被検DNA配
列の転写調節機能を調べる。

HeLa細胞を細胞10⁶個当り１又は５μｇのp-myc-o-PCA
Tでカルシム燐酸法（文献41）によりトランスフェクト
し、２日間培養後に集めた細胞を200μｌの0.25MのTris
-HClに懸濁し、細胞を３回凍結破壊した後、ソニケーシ
ョンして細胞抽出液を得た。この細胞抽出液に¹⁴Ｃ−ク
ロラムフェニコールを添加して反応させた後、薄層クロ
マトグラフィーにかけオートラジオグラムを行った。

第11図に示すように、５μｇのp-myc-o-PCATを用いた
CATアッセイでアセチル化クロラムフェニコールのバン
ドが検出できた（同図矢印）。同様にpmyc（H-P）PCAT
でトランスフェクトした細胞の抽出液でもアセチル化ク
ロラムフェニコールが検出された。

一方、pUCCAT（プラスミドpUC19のHindIIIサイトにCA
T遺伝子を挿入しただけでSV40プロモーター領域がない
もの）や、pPSVPCAT（pUCCATにSV40プロモーターを挿入
したもの）でトランスフェクトした細胞の抽出液ではア
セチル化能は認められなかった。また合成ARSを挿入し
た元のプラスミドであるpSV2CAT（pSVCATのプロモータ
ー領域上流にSV40エンハンサーを導入したもの）でも顕
著なアセチル化能は認められなかった。

この結果、合成ARSにはHindIII-PstI領域と同様な強
いエンハンサー活性が存在することを示している。

なお同様なCATアッセイはヒトRaji細胞や、マウスＬ
細胞についても行なったが、これらの細胞内でも、合成
21bpARSはエンハンサー活性があることが示された。

以上の結果から、合成21bpARSは、単なる複製開始点
であるだけでなくエンハンサーと同一または非常に近接
した機能を有するものであることが分かった。このこと
はc-myc蛋白などのDNA結合性蛋白はDNA複製開始蛋白質
であると同時にエンハンサー結合蛋白質であることを示
唆する。

次にこの21bpARSのDNA配列を他のARSと比較すると
（第８図）、pmyc（H-P）の塩基135-155に対応するの
は、pARS65で、 PHLmycで、またはである。この領域は高い相同性を有することからこれら
相同領域のDNA配列についてもARS活性が推定でき、今回
合成した21bpDNAと同様に自己複製配列ARSとして本発明
の遺伝子導入非ヒト動物に使用できる。

（発明の効果）以上のように本発明は哺乳動物細胞の自己複製配列
（ARS）を含むプラスミド・ベクターにより動物を形質
転換するようにしたので、種特異性がなく宿主の限定が
ない遺伝子導入非ヒト動物を得ることができる。また導
入されたプラスミド・ベクターはエピゾーム状態で安定
に維持され、染色体外で複製される。従って導入した外
来遺伝子の大量発現が可能となり、目的ペプチドを効率
よく大量に生産することができる。さらに導入プラスミ
ド・ベクターは宿主の染色体内に組込まれないので、従
来の遺伝子導入動物のように、宿主動物に遺伝子異常を
もたらすことがない。さらに本発明により一度目的ペプ
チド生産動物を得れば、その子孫も生産動物として使用
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトc-myc遺伝子上流域の制限酵素開裂地図で
ある。図中、□は非コード・エクソン、■はコード・エ
クソン、P₁,P₂はプロ第２図は遺伝子導入マウスF₂（雄15匹、雌13匹）の尾の
DNAのサザーンブロットパターン図、第３図はF₀（雄）
×F₁（雌）のバッククロスして得たマウスの尾DNAのサ
ザーンブロットパターン図である。各図中、上方が泳動
開始端である。矢印はpmyc（H-P）の位置を示し、矢印
位置より上方に見られるバンドはpmyc（H-P）の２量
体、３量体に対応する。第４図はF₂マウスのpmyc（H-P）体内分布を示すサザー
ンブロットパターン図である。第5,6図はそれぞれpHLmycのARSの推定２次構造図，第７
図はpmyc（H-P）のARSの推定２次構造図、第８図はpmyc
（H-P）のARSとマウスARS（pARS65）及びヒトARS（pHLm
yc）との比較図である。第９図は合成21bpDNAのARSアッセイの結果を示すサザー
ンブロットパターン図である。図中右端が泳動開始端で
ある。第10図は合成21bpDNAのゲルシフトアッセイの結果を示
すブロットパターン図である。図中上方が泳動開始端で
ある。なお図上部のDNA配列は合成21bpARS（下線部）の
両端にそれぞれBamHIサイトを付加してpSVPCATに組込ん
だDNAである。ゲルシフトアッセイにはこのDNAを使用し
た。第11図は合成21bpDNAのCATアッセイの結果を示す薄層ク
ロマトグラム図である。図中矢印はアセチル化クロラム
フェニコールの移動位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−88879（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−291（ＪＰ，Ａ) ＭｉｎｏｏＲａｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，46, ｐ．513−519（1986) Ｃ．Ｄｕｃａｎｅｔａｌ．78ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡ，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．46 （６）ｐ．2207（1987) ＬｏｒｉＦｒａｐｐｉｅｒｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，84，ｐ．6068−6672 （1987）Ａｒｉｇａｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，ｐ．１− ６（1987)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生殖細胞及び体細胞内に、ヒトc-myc遺伝
子上流領域の210塩基対からなるHindIII-PstI領域であ
る自己複製配列DNAと、プロモーター配列と、ペプチド
遺伝子とを含むプラスミドが、染色体外DNAとして自律
複製可能に導入されていることを特徴とする遺伝子導入
非ヒト動物。
【請求項２】生殖細胞及び体細胞内に、以下のDNA配列と、プロモーター配列と、ペプチド遺伝子とを含むプラ
スミドが、染色体外DNAとして自律複製可能に導入され
ていることを特徴とする遺伝子導入非ヒト動物。
【請求項３】ヒトc-myc遺伝子上流領域の210塩基対から
なるHindIII-PstI領域である自己複製配列DNAと、プロ
モーター−配列と、ペプチド遺伝子とを含有するプラス
ミドを胚細胞に導入することにより、請求項１記載の遺
伝子導入非ヒト動物を製造することを特徴とする遺伝子
導入非ヒト動物の製造方法。
【請求項４】以下のDNA配列と、プロモーター配列と、ペプチド遺伝子とを含有する
プラスミドを胚細胞に導入することにより、請求項２記
載の遺伝子導入非ヒト動物を製造することを特徴とする
遺伝子導入非ヒト動物の製造方法。
【請求項５】請求項１記載の遺伝子導入非ヒト動物の体
細胞内で、前記ペプチド遺伝子を発現させることを特徴
とするペプチド製造方法。
【請求項６】請求項２記載の遺伝子導入非ヒト動物の体
細胞内で、前記ペプチド遺伝子を発現させることを特徴
とするペプチド製造方法。