JP2002017357A - アンカーペプチド、融合蛋白質、及び蛋白質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ラクトバチルス属等の乳酸菌等の菌体の表層
に、蛋白質を付着させることができるアンカー、及び分
泌させることができるシグナル、ラクトバチルス属等の
乳酸菌等の菌体の表層に、付着、分泌させることができ
る蛋白質及びその製造方法並びに当該蛋白質を分泌・付
着させる方法。 【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカスFERM BP-
6060株の菌体外プロティナーゼ由来であるか又は特定の
配列と相同若しくは類似した配列であるアンカーペプチ
ド，シグナルペプチド；アンカーペプチド及び／又はシ
グナルペプチドとそれに連結された有用蛋白質とを含む
融合蛋白質；それをコードする遺伝子を発現させる融合
蛋白質の製造方法、有用蛋白質の菌体表層への固定化方
法及び有用蛋白質を菌体表層へ分泌させる方法；融合蛋
白質をコードする遺伝子を有し、融合蛋白質を発現しう
る微生物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質を微生物菌
体表層に固定化するアンカー、蛋白質を微生物菌体表層
へ分泌させるシグナル、これらと有用蛋白質とを含む融
合蛋白質、これらの製造方法、有用蛋白質を微生物菌体
表層に固定化する方法、及び有用蛋白質を微生物菌体表
層へ分泌させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グラム陽性菌の菌体表層蛋白質は、菌体
に結合するための構成部分、即ちアンカーを有し、それ
を介して菌体に結合していると考えられている。このよ
うなアンカーは、一般に、菌体表層蛋白質のC末端側に
存在する。また、菌体の内部で生合成された蛋白質等
は、その一部に、シグナルと呼ばれる特定の構成部分を
有する場合、その蛋白質が、菌体表層蛋白質として菌体
表層に分泌されるようになる。このようなシグナルは、
一般に菌体表層蛋白質のN末端側に存在する。アンカー
及びシグナルには、表層蛋白質の種類、及びその効果を
発現する菌種によって様々な配列のものがある。このよ
うなアンカー及びシグナルを、有用な他の蛋白質と連結
することにより、当該他の蛋白質を菌体表層に分泌させ
たり付着させることができるようになることが期待でき
る。

【０００３】ところで、ラクトバチルス・ヘルベチカス
等のラクトバチルス属等の乳酸菌は、ヒト等の動物の腸
内に分布し、当該動物の健康を維持する上で好ましい種
々の効果を発現するものがあることが知られている。こ
れらの菌体表層に、特定の機能を付与することにより、
さらに好ましい効果を発現することができることが期待
できる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ラク
トバチルス属等の乳酸菌等の菌体の表層に、蛋白質を付
着させることができるアンカー、及び分泌させることが
できるシグナルを提供することにある。

【０００５】本発明のさらなる目的は、ラクトバチルス
属等の乳酸菌等の菌体の表層に、付着、分泌させること
ができる蛋白質及びその製造方法並びに当該蛋白質を分
泌・付着させる方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ラクト
バチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticu
s）FERM BP-6060株の菌体外プロティナーゼ由来である
ことを特徴とするアンカーペプチドが提供される。

【０００７】また、本発明によれば、下記配列表の配列
番号１で示されるアミノ酸配列又は該配列と相同若しく
は類似した配列であることを特徴とするアンカーペプチ
ドが提供される。

【０００８】さらに、本発明によれば、ラクトバチルス
・ヘルベティカスFERM BP-6060株の菌体外プロティナー
ゼ由来であることを特徴とするシグナルペプチドが提供
される。

【０００９】さらに、本発明によれば、下記配列表の配
列番号２で示されるアミノ酸配列又は該配列と相同若し
くは類似した配列であることを特徴とするシグナルペプ
チドが提供される。

【００１０】さらに、本発明によれば、前記アンカーペ
プチド、及び／又は前記シグナルペプチドと、それに連
結された有用蛋白質とを含むことを特徴とする融合蛋白
質が提供される。

【００１１】さらに、本発明によれば、前記融合蛋白質
をコードする遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴
とする、前記融合蛋白質の製造方法が提供される。

【００１２】さらに、本発明によれば、有用蛋白質を、
前記アンカーペプチド及び／又は前記シグナルペプチド
と連結させた状態で発現させる工程を含むことを特徴と
する、有用蛋白質の菌体表層への固定化方法及び有用蛋
白質を菌体表層へ分泌させる方法が提供される。

【００１３】さらに、本発明によれば、前記融合蛋白質
をコードする遺伝子を有し、前記融合蛋白質を発現しう
る微生物が提供される。

【００１４】

【発明の実施の形態】本明細書において、アンカーペプ
チドとは、当該アンカーペプチドが連結しているペプチ
ド又は蛋白質を、菌体表面に固定化されるようにしうる
ペプチドをいう。

【００１５】本発明のアンカーペプチドは、（１）ラク
トバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helvetic
us）FERM BP-6060株の菌体外プロティナーゼ由来のアン
カーペプチドであるか、又は（２）配列表の配列番号１
で示されるアミノ酸配列又は該配列と相同若しくは類似
した配列を有するアンカーペプチドである。

【００１６】ラクトバチルス・ヘルベチカスFERM BP-60
60株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に、平成９年８月１５日にて、受託番号FERM BP-6060と
して寄託されている。前記ラクトバチルス・ヘルベチカ
スFERM BP-6060株の菌体外プロティナーゼとしては、当
該株の菌体内において、分子量約４８ｋDaの蛋白質とし
て生合成されるものを挙げることができる。前記（１）
のアンカーペプチドとしては、具体的には例えば、配列
表の配列番号１で示されるアミノ酸配列又は該配列と相
同若しくは類似した配列を有するもの等を挙げることが
できる。

【００１７】前記（２）のアンカーペプチドにおいて、
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列と相同若し
くは類似した配列を有するアンカーペプチドとは、アン
カー配列としての機能を損なわない程度の若干の欠損・
挿入・変異などを含むものをいい、具体的には例えば、
80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以
上、さらに好ましくは98％以上、さらにより好ましくは
99％以上の相同性を有するものを挙げることができる。

【００１８】本発明のアンカーペプチドを製造する方法
は、特に限定されないが、具体的には例えば、ラクトバ
チルス・ヘルベチカスFERM BP-6060株等の乳酸菌株中
の、前記配列番号１で示されるアミノ酸をコードするDN
A若しくはそれと相同若しくは類似した配列を有するDNA
を発現させる方法等により製造することができる。

【００１９】本明細書において、シグナルペプチドと
は、菌体内に存在する、当該シグナルペプチドが連結し
ているペプチド又は蛋白質を、菌体表面へ分泌されるよ
うにしうるペプチドをいう。

【００２０】本発明のシグナルペプチドは、（３）ラク
トバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helvetic
us）FERM BP-6060株の菌体外プロティナーゼ由来のシグ
ナルペプチドであるか、又は（４）配列番号２で示され
るアミノ酸配列又は該配列と相同若しくは類似した配列
を有するシグナルペプチドである。前記（３）のシグナ
ルペプチドとしては、具体的には例えば、配列表の配列
番号２で示されるアミノ酸配列又は該配列と相同若しく
は類似した配列を有するもの等を挙げることができる。

【００２１】前記（３）のシグナルペプチドにおいて、
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と相同若し
くは類似した配列を有するシグナルペプチドとは、シグ
ナル配列としての機能を損なわない程度の若干の欠損・
挿入・変異などを含むものをいい、具体的には例えば、
90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以
上、さらに好ましくは98％以上、さらにより好ましくは
99％以上の相同性を有するものを挙げることができる。

【００２２】本発明のシグナルペプチドを製造する方法
は、特に限定されないが、具体的には例えば、ラクトバ
チルス・ヘルベチカスFERM BP-6060株等の乳酸菌株中
の、前記配列番号２で示されるアミノ酸をコードするDN
A若しくはそれと相同若しくは類似した配列を有するDNA
を発現させる方法等により製造することができる。

【００２３】本発明の融合蛋白質は、前記（１）又は
（２）のアンカーペプチド及び／又は前記（３）又は
（４）のシグナルペプチドと、それに連結された有用蛋
白質とを含む。

【００２４】前記有用蛋白質としては、治療的、保健
的、工業的、試験的、又は実験的な目的等のあらゆる目
的において、乳酸菌等のグラム陽性菌等の菌体の表層に
固定化されること、及び／又は菌体内において生合成さ
れ表層に分泌されることが有用である蛋白質を挙げるこ
とができる。

【００２５】前記有用蛋白質としては、具体的には例え
ば、表層に当該蛋白質が付着した状態の微生物がヒト等
の体内において保健効果を発現することが期待できる蛋
白質等を挙げることができる。このような保健効果を発
現することが期待できる蛋白質としては、具体的には例
えば、有用な酵素や、腸管定着のための蛋白質を挙げる
ことができる。前記腸管定着のための蛋白質としては、
ヒト等にとり有害なある種の大腸菌がヒト等の腸管に付
着するために有する物質を挙げることができる。このよ
うな物質を産生し表層に有する乳酸菌等がヒト等の腸管
内に存在することにより、当該大腸菌のヒト等腸管への
付着を競合的に阻害することができる。

【００２６】前記有用蛋白質の他の例としては、病原性
細菌又は病原性ウィルス等の抗原蛋白質又はその一部が
挙げられる。このような蛋白質を含む融合蛋白質又はそ
れを表層に分泌するか若しくは表層に固定化する微生物
は、ワクチンとして利用することが期待される。

【００２７】本発明の融合蛋白質としては、前記有用蛋
白質のN末端に前記シグナルペプチドが連結されたも
の、及び／又は前記有用蛋白質のC末端に前記アンカー
ペプチドが連結されたものを、好ましく挙げることがで
きる。

【００２８】本発明の融合蛋白質の製造方法は、前記融
合蛋白質をコードする遺伝子を発現させる工程を含む。

【００２９】前記融合蛋白質をコードする遺伝子を発現
させる方法としては、各種の知られた方法を用いること
ができる。具体的には例えば、前記融合蛋白質をコード
する遺伝子を、適当なベクターに組み込み、適当な宿主
に導入し、培養することにより行うことができる。

【００３０】前記ベクターとしては、具体的には例え
ば、pHY300PLK（宝酒造株式会社製）等の、商業的に入
手可能なもの等の各種のベクターを用いることができ
る。また、前記宿主としては、すべてのグラム陽性菌が
利用可能であるが特に乳酸菌などが一般に使用される。
前記宿主としての乳酸菌としては、ラクトバチルス・ア
シドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクト
バチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラク
トバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクト
バチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosu
s）、ラクトバチルス・ファメンタム（Lactobacillus f
ermentum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillu
s reuteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lacto
bacillus helveticus）、ラクトバチルス・ブルガリカ
ス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・ラ
クティス （Lactococcus lactis）、エンテロコッカス
・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ストレプト
コッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophil
us）など形質転換できる乳酸菌は全て利用する事ができ
る。

【００３１】本発明の、有用蛋白質の菌体表層への固定
化方法は、前記有用蛋白質を、前記アンカーペプチドと
連結させた状態で発現させる工程を含む。

【００３２】前記有用蛋白質を、前記アンカーペプチド
と連結させた状態で発現させる方法としては、これらを
コードする遺伝子を、前記融合蛋白質の製造方法と同様
の方法により発現させる方法が挙げられる。

【００３３】本発明の固定化方法により有用蛋白質を固
定化する菌体としては、前記融合蛋白質の製造方法にお
いて宿主として用いることができるもの等の各種の菌を
挙げることができる。ここで、有用蛋白質を固定化する
菌体は、前記有用蛋白質を前記アンカーペプチドと連結
させた状態で発現させるための宿主とは、同一であって
もよいが異なっていてもよい。また、本発明の有用蛋白
質を菌体表層へ分泌させる方法は、前記有用蛋白質を、
前記シグナルペプチドと連結させた状態で発現させる工
程を含む。

【００３４】前記有用蛋白質を、前記シグナルペプチド
と連結させた状態で発現させる方法としては、これらを
コードする遺伝子を、前記融合蛋白質の製造方法と同様
の方法により発現させる方法が挙げられる。

【００３５】本発明の分泌させる方法により有用蛋白質
を分泌させる菌体としては、前記融合蛋白質の製造方法
において宿主として用いることができるもの等の各種の
菌を挙げることができる。

【００３６】本発明の微生物は、前記融合蛋白質をコー
ドする遺伝子を有し、前記融合蛋白質を発現しうるもの
である。

【００３７】前記微生物の菌種は特に限定されないが、
前記融合蛋白質の製造方法に用いることができるものと
して挙げた各種のグラム陽性菌等を用いることができ
る。

【００３８】本発明の微生物において、前記融合蛋白質
をコードする遺伝子は、前記融合蛋白質の製造方法にお
いて述べた態様で、微生物内に導入することにより、前
記融合蛋白質を発現しうるものとすることができる。

【００３９】本発明の融合蛋白質及び本発明の微生物
は、連結された有用蛋白質の種類に応じて様々な用途に
用いることができ、その製品としての形態も特に限定さ
れないが、具体的には例えば、融合蛋白質及び／又は微
生物をそのまま製品として提供することもでき、融合蛋
白質及び／又は微生物を含むヨーグルト等の発酵乳製
品、乳酸菌飲料、あるいはチーズのような固形製品とす
ることもできる。また、これらを乾燥させたもの、タブ
レットのような形態にしたもの等とすることもできる。

【００４０】

【発明の効果】本発明のアンカーペプチド又はシグナル
ペプチドは、ラクトバチルス属等の乳酸菌等の菌体の表
層に、蛋白質を付着又は分泌させることができる。した
がって、有用な蛋白質と組み合わせて本発明の融合蛋白
質の製造方法により融合蛋白質とすることにより、ヒト
等の生体内等において、菌体に付着させるか菌体より分
泌させることにより得られる有利な効果を発現すること
ができる。

【００４１】

【実施例】以下に、実施例を参照して本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【００４２】なお、以下の実施例において、DNAの操作
はすべてManiatisらの方法（Molecular cloning, a lab
oratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Col
d Spring Harbor (1982))に基いて行った。

【００４３】

【実施例１】大腸菌の繊毛性接着性因子として知られる
FimH蛋白質（Thankavel et al. J.Clin. Invest., 199
7, 100:1123-1136）の一部配列をラクトバチルス・ヘル
ベティカス（Lactobacillus helveticus）FERM BP-6060
株由来の菌体外プロティナーゼ由来のシグナル配列とア
ンカー配列の中央部に配置した融合蛋白質を構築し、シ
グナル配列による分泌性と表層へのアンカリング機能を
検討した。 （１．プロテイナーゼの遺伝子prtYのクローニング）ま
ず、ラクトバチルス・ヘルベティカスFERM BP-6060株の
染色体DNAをLeenhoutsらの方法（Leenhouts,K.J. et a
l., Appl. Emviron. Microbiol., 56, 2726-2735 (199
0)）に従い単離し、、HaeIIIで部分的に切断し、得られ
たフラグメントを、ｐKK223-3発現ベクター（ファルマ
シア・バイオテック社）のSmaIサイトにライゲーション
した。ライゲーションしたベクターを、大腸菌HB101株
に形質転換した。なお、これらの操作のための酵素は、
宝酒造株式会社より購入したものを用いた。

【００４４】形質転換されたクローンを選別したのち、
これらのクローンのうちラクトバチルス・ヘルベチカス
FERM BP-6060株の菌体内において分子量約４８ｋDaの蛋
白質として生合成されるプロテイナーゼを発現する株
を、当該プロテイナーゼに特異的なマウスモノクローナ
ル抗体を用いて検出することにより選択し、さらにその
株内のプラスミドｐKK223-3の配列を分析したところ、
2.6kbのフラグメントが挿入されていることが分かっ
た。このフラグメントが挿入されたプラスミドをさらに
BamHIで切断し、M13mp18ベクターのBamHIサイトに組み
込み、大腸菌JM105株に形質転換し、プロテイナーゼを
発現する株を選択した後、この株中のプラスミドの配列
を分析したところ、前記プロテイナーゼをコードする読
み取り枠を有する1.6kbの配列を有する遺伝子が挿入さ
れていることが分かった。この遺伝子を、prtYと命名し
た。 （２．融合蛋白質をコードする遺伝子の構築）得られた
prtY遺伝子を、その上流、下流域に対応するプライマー
２種（それぞれ、配列表の配列番号３及び４で示される
配列を有するプライマーprtL及びprtR、化学的に合成し
たもの）を用いてPCR増幅し、シャトルベクターpHY300P
LK（宝酒造株式会社製）のHindIIIサイトにブラントエ
ンド化して組み込んだ。連結したプラスミドは大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地にて選択した。得られたプロティナーゼ
の遺伝子を含むプラスミドはpPRT-PHYと命名した。な
お、PCR増幅はTakara Z-Taq（宝酒造株式会社製）を用
いて、98℃、5秒、68℃、20秒の繰り返しで30サイクル
反応させた。

【００４５】プラスミドpPRT-PHY内のprtY遺伝子を制限
酵素SpeIとBpu1102Iで切断した。一方、FimH蛋白質を発
現するfimH遺伝子を含むpSH2プラスミド(Thankavel et
al.J. Clin. Invest., 1997, 100: 1123-1136）をテン
プレートとしてfimH遺伝子の上流、下流に対するプライ
マー2種（それぞれ、配列表の配列番号５及び６で示さ
れる配列を有するプライマーfimL及びfimR、化学的に合
成したもの）を用いてPCR増幅し、制限酵素SpeIとBpu11
02Iで切断した。ここで得られたfimH遺伝子の約680bpの
断片をpPRT-PHY内のSpeI-Bpu1102I切断物に組み込み、
配列表の配列番号７で示される配列（prtY-fimH-prtY遺
伝子）を構築した（図１参照）。なお、配列番号７にお
いて、SpeI切断により組換えた部分は２０６番目のCと
２０７番目のTとの間であり、Bpu1102I切断により組換
えた部分は８８５番目のCと８８６番目のTとの間であ
る。このプラスミドを上記方法にて大腸菌JM105株に形
質転換し、得られたプラスミドをpFIM-PRT-PHYと命名し
た。ここで得られたpFIM-PRT-PHYを含む形質転換体はFI
M-PRT-PHYと命名し、受託番号FERM P-17914号として、
工業技術院生命工学工業技術研究所に、2000年6月21日
付けにて寄託している。 （３．大腸菌形質転換での融合蛋白質発現の確認） （３．１．菌体抽出液の分離）上記形質転換株と宿主株
である大腸菌JM105株とをそれぞれLB培地にて培養し
た。それぞれの培養菌体を150mM NaCl,50mMリン酸バッ
ファー（PBS）で洗浄後、超音波破砕し、15,000rpmで１
０分間の遠心分離後、上清を菌体抽出液として以下の実
験に用いた。 （３．２．SDS-PAGE及びウエスタンブロッティング）上
記の菌体抽出液を常法に従いSDS-PAGEにより電気泳動
し、ニトロセルロース膜に蛋白質を転写し、0.5%カゼイ
ン-PBSでブロッキング後、抗fim抗体あるいは抗プロテ
ィナーゼ抗体を一次抗体として反応させた。次にビオチ
ン化標識抗マウス抗体を反応後、ストレプトアビジン-
ペルオキシダーゼを反応させ、発色させた。結果を図２
に示す。図２に示す通り、宿主株であるJM105株にはい
ずれの抗体も強い反応性は示さなかったのに対し、形質
転換体では両抗体酵素はいずれも約４０ｋDaバンドへの
反応性がみられた。こららの結果から、fimH蛋白質は正
規のフレームで融合蛋白質内で発現していること、さら
にそれに連結されたプロティナーゼ遺伝子も正しいフレ
ームで発現されていることが示唆された。また、分子量
が推定される分子量と同じことからも、本来の融合蛋白
質が正しく発現したものと考えられた。 （３．３．融合蛋白質のCaco-2接着性評価）ヒト腸管上
皮由来Caco-2細胞を仔牛血清を5%添加したMEM培地(Gibc
o)で、5% CO₂インキュベーターで37℃で培養した。1×1
0⁵/mlの培養液1mlを24ウェルプレートに移し、単層とな
るまで培養した。

【００４６】プラスミドｐSH２を含みfimHを発現する大
腸菌pSH2-ORN103(fim+)株とプラスミドフリーでfimHを
発現しないORN103株（Thankavel et al. J. Clin. Inve
st.,1997, 100: 1123-1136；著者により公衆に分譲され
る。また、本願出願人も当該菌株を保有し、公衆に分譲
する。）をアイソトープでメタボリックラベルした。ア
イソトープ標識は、これらの菌を、 [methyl ³H]-thymi
dine (40Ci/mmol;室町化学) を1μl/ml添加したLB培地
10mlで培養後、3000×gで10分間の遠心により菌体を回
収し、PBSで2回洗浄した後、総菌数が2×10⁹cells/mlと
なるようPBSに懸濁することにより行った。ラベルした
菌体の放射活性を測定し、総菌数を顕微鏡下で測定し
て、総菌数当たりのカウントを測定した。

【００４７】一方、上記の24ウェルプレート中に培養し
たCaco-2の培養液に20%グルタルアルデヒド(和光純薬)
を0.1ml添加し、プレートを室温に30分間、静置した
後、PBSで2回洗浄し、上記のアイソトープラベルした菌
液0.5ml(1×10⁹cells)を添加した。37℃で1時間培養し
て菌体をCaco-2細胞へ結合させ、3回洗浄により遊離の
菌体を除去した。

【００４８】続いて、菌液としてpSH2-ORN103(fim+)株
を添加したウェルの一部に、表１に示す各種大腸菌の菌
体抽出液（10⁸個／mlとなるようにPBSに懸濁後、超音波
破砕し、20,000rpmで10分間遠心分離した上清）のいず
れかをウェル当たり500μｌ加えて、37℃で30分間イン
キュベートし、洗浄した。１％SDS-1N NaOHを200μl添
加して30分間置いた後、ウェルよりCaco-2細胞と菌体の
混合物を回収し、シンチレーション液(和光純薬)に懸濁
して、液体シンチレーションカウンターLSC-900(Aloka
社製)により放射活性を測定した。

【００４９】その結果、fim(-)株の接着性はfim(+)株に
比べて極めて低かった。また、fim(+)株の接着性をfim
(-)株の菌体抽出液はあまり阻害しなかった(表１)。一
方、fim(+)株の菌体抽出液はその接着性を大きく阻害し
た。また、幾分阻害程度は下がるものの融合蛋白質を発
現するFIM-PRT-PHY株の菌体抽出液ものはその接着を阻
害した。以上のことから、本融合蛋白質が本来のfimH蛋
白質の機能を発現していることが確認された。

【００５０】

【表１】

【００５１】（３．４．乳酸菌への形質転換）さらに上
記プラスミドpFIM-PRT-PHYを乳酸菌ラクトバチルス・カ
ゼイ（Lactobacillus casei）IAM1198株にエレクトロポ
レーションし、テトラサイクリンを4μg/mlの濃度で含
むMRS培地で生育する株を選択することにより、形質転
換体を得た。形質転換体をMRS培地中で培養し、集菌
後、PBSで洗浄し、0.1%SDSを含む10mM Tris-HClバッフ
ァーで菌体を懸濁し、超音波破砕した。15,000rpmで１
０分間の遠心分離後、上清を表層蛋白質菌体抽出液とし
て以下の実験に用いた。また、対照の菌体抽出液とし
て、プラスミドpFIM-PRT-PHYをを導入しないラクトバチ
ルス・カゼイ（Lactobacillus casei）IAM1198株を同様
に操作した菌体抽出液を調製し、同様に以下の実験に用
いた。

【００５２】表層蛋白質菌体抽出液について、上記
（３．２．）と同様にSDS電気泳動及びウエスタンブロ
ッテングを行い、抗fimH抗体を用いて反応するバンドを
検出した。結果を図３に示す。図３に示した通り、その
結果、上記（３．２）において大腸菌で確認されたバン
ドと同じ位置である約４０ｋDa付近に特異的に反応する
バンドを検出した。これらのことから乳酸菌においても
菌体表層に本発明の融合蛋白質が効率的に発現固定化さ
れていることが示された。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ラクトバチルス・ヘルベチカスFERM B
P-6060株より切り出したプロテイナーゼの遺伝子prtY
（図１A）、大腸菌のFimH蛋白質の遺伝子（図１B）及び
本願実施例において構築されたprtY-fimH-prtY遺伝子
（図１C）の関係を示す概略図である。

【図２】図２は、prtY-fimH-prtY遺伝子で形質転換した
大腸菌JM105株（形質転換体FIM-PRT-PHY）及び形質転換
を行わなかったJM105株の菌体抽出物を、SDS-PAGE及び
ウエスタンブロッティングにて分析した泳動図である。
数字１〜４はレーン番号を示し、レーン１及び３では形
質転換を行わなかったJM105株の菌体抽出物を試料と
し、レーン２及び４では形質転換体FIM-PRT-PHYの菌体
抽出物を試料とした。また、レーン１及び２では抗fimH
抗体を一次抗体として反応させ、レーン３及び４では抗
プロテイナーゼ抗体を一次抗体として反応させた。

【図３】図３は、prtY-fimH-prtY遺伝子で形質転換した
ラクトバチルス・カゼイIAM1198株及び形質転換を行わ
なかったIAM1198株の菌体抽出物を、SDS-PAGE及びウエ
スタンブロッティングにて分析した泳動図である。数字
１〜４はレーン番号を示し、レーン１及び３では形質転
換を行わなかったIAM1198株の菌体抽出物を試料とし、
レーン２及び４では形質転換体の菌体抽出物を試料とし
た。また、レーン１及び２では抗fimH抗体を一次抗体と
して反応させ、レーン３及び４では抗プロテイナーゼ抗
体を一次抗体として反応させた。

【配列表】 <110> Calpis Co.,Ltd. <120> Anchor Peptide, Fused Protein and Method for Anchoring Protein <130> 00-398 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 1 Ala Lys Arg Val Gly Thr Asp Lys Val Thr Arg Tyr Asn Ala Val Thr 1 5 10 15 Val Ala Met Asn Thr Thr Lys Leu Ala Asn Gly Ile Ser Tyr Tyr Ser 20 25 30 Ile Glu Asn Gly Lys Ala Thr Gly Lys Tyr Ile Asn Ala Asp Asn Ile 35 40 45 Asp Gly Thr Lys Arg Thr Leu Lys His Asn Ala Tyr Val Tyr Glu Ser 50 55 60 Ser Lys Lys Arg Ala Asn Lys Val Val Leu Lys Lys Gly Thr Glu Val 65 70 75 80 Thr Thr Tyr Gly Asn Pro Tyr Thr Phe Lys Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr 85 90 95 Lys Ile Gly Ala Asp Thr Lys Lys Thr Tyr Val Arg Val Glu Asn Phe 100 105 110 Asp <210> 2 <211> 70 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 2 Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Pro Val Ala Ala Thr Ala Met Pro Val Asn Ala Ala Thr 20 25 30 Thr Val Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn Lys Pro Thr Val Asp Leu Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Val Ser Glu Ser Lys Asp Thr Val Asn Val Thr Pro 50 55 60 Ser Phe Thr Leu Thr Ser 65 70 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 ttttagcaaa tcgcctaaac aagttaaaat 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 cgcactactt taacgtttag aaaagagtag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 tgcctggtca ttcactagta aaaccgccaa 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 tcgctggaat aagcttagcg ttgcgcgtca 30 <210> 7 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:prtY-fimH-prtY gene <220> <221> CDS <222> (1)..(1227) <400> 7 atg aag aaa aat tta aga att gtt agc gct gct gct gct gct tta tta 48 Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 gct gtt gct cct gtt gct gca act gct atg cca gtt aac gct gct act 96 Ala Val Ala Pro Val Ala Ala Thr Ala Met Pro Val Asn Ala Ala Thr 20 25 30 act gtt act act tca act act act aac aag cca act gtt gac tta agt 144 Thr Val Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn Lys Pro Thr Val Asp Leu Ser 35 40 45 ggt gca ggt tct gtt agt gaa tct aaa gat act gtt aat gta act cca 192 Gly Ala Gly Ser Val Ser Glu Ser Lys Asp Thr Val Asn Val Thr Pro 50 55 60 tca ttt act ttg act agt aaa acc gcc aat ggt acc gca atc cct att 240 Ser Phe Thr Leu Thr Ser Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile 65 70 75 80 ggc ggt ggc agc gcc aat gtt tat gta aac ctt gcg cct gcc gtg aat 288 Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn 85 90 95 gtg ggg caa aag ctg gtc gta gat ctt tcg acg caa atc ttt tgc cat 336 Val Gly Gln Lys Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His 100 105 110 aac gat tac cca gaa acc att aca gac tat gtc aca ctg caa cga ggt 384 Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly 115 120 125 tcg gct tat ggc ggc gtg tta tct agt ttt tcc ggg acc gta aaa tat 432 Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr 130 135 140 aat ggc agt agc tat cct ttc cct act acc agc gaa acg ccg cgg gtt 480 Asn Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val 145 150 155 160 gtt tat aat tcg aga acg gat aag ccg tgg ccg gtg gcg ctt tat ttg 528 Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu 165 170 175 acg ccg gtg agc agt gcg ggg gga gtg gcg att aaa gct ggc tca tta 576 Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu 180 185 190 att gcc gtg ctt att ttg cga cag acc aac aac tat aac agc gat gat 624 Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp 195 200 205 ttc cag ttt gtg tgg aat att tac gcc aat aat gat gtg gtg gtg ccc 672 Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro 210 215 220 act ggc ggc tgc gat gtt tct gct cgt gat gtc acc gtt act ctg ccg 720 Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro 225 230 235 240 gac tac cct ggt tca gtg ccg att cct ctt acc gtt tat tgt gcg aaa 768 Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys 245 250 255 agc caa aac ctg ggg tat tac ctc tcc ggc aca acc gca gat gcg ggc 816 Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly 260 265 270 aac tcg att ttc acc aat acc gcg tcg ttt tca ccc gcg cag ggc gtc 864 Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val 275 280 285 ggc gta cag ttg acg cgc aac gct aag cgt gtt ggt act gac aag gta 912 Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Ala Lys Arg Val Gly Thr Asp Lys Val 290 295 300 act cgt tac aac gct gta act gtt gct atg aac act act aag ctt gct 960 Thr Arg Tyr Asn Ala Val Thr Val Ala Met Asn Thr Thr Lys Leu Ala 305 310 315 320 aac ggt att tca tac tac agc atc gaa aac ggc aag gca act ggc aag 1008 Asn Gly Ile Ser Tyr Tyr Ser Ile Glu Asn Gly Lys Ala Thr Gly Lys 325 330 335 tac atc aac gct gac aac atc gat ggt act aag cgt act ttg aag cac 1056 Tyr Ile Asn Ala Asp Asn Ile Asp Gly Thr Lys Arg Thr Leu Lys His 340 345 350 aac gca tac gtt tac gag tca tca aag aag cgt gct aac aag gtt gtt 1104 Asn Ala Tyr Val Tyr Glu Ser Ser Lys Lys Arg Ala Asn Lys Val Val 355 360 365 ctt aag aag ggt act gaa gta act act tac ggt aat cca tac acc ttc 1152 Leu Lys Lys Gly Thr Glu Val Thr Thr Tyr Gly Asn Pro Tyr Thr Phe 370 375 380 aag aac ggc aag aag tac tac aag atc ggt gct gac acc aag aag act 1200 Lys Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Lys Ile Gly Ala Asp Thr Lys Lys Thr 385 390 395 400 tac gtt aga gtt gaa aac ttt gac taa 1227 Tyr Val Arg Val Glu Asn Phe Asp 405 <210> 8 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:prtY-fimH-prtY gene <400> 8 Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Pro Val Ala Ala Thr Ala Met Pro Val Asn Ala Ala Thr 20 25 30 Thr Val Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn Lys Pro Thr Val Asp Leu Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ser Val Ser Glu Ser Lys Asp Thr Val Asn Val Thr Pro 50 55 60 Ser Phe Thr Leu Thr Ser Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn 85 90 95 Val Gly Gln Lys Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His 100 105 110 Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly 115 120 125 Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Ser Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr 130 135 140 Asn Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val 145 150 155 160 Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu 165 170 175 Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu 180 185 190 Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp 195 200 205 Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro 210 215 220 Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro 225 230 235 240 Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys 245 250 255 Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly 260 265 270 Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val 275 280 285 Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Ala Lys Arg Val Gly Thr Asp Lys Val 290 295 300 Thr Arg Tyr Asn Ala Val Thr Val Ala Met Asn Thr Thr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Asn Gly Ile Ser Tyr Tyr Ser Ile Glu Asn Gly Lys Ala Thr Gly Lys 325 330 335 Tyr Ile Asn Ala Asp Asn Ile Asp Gly Thr Lys Arg Thr Leu Lys His 340 345 350 Asn Ala Tyr Val Tyr Glu Ser Ser Lys Lys Arg Ala Asn Lys Val Val 355 360 365 Leu Lys Lys Gly Thr Glu Val Thr Thr Tyr Gly Asn Pro Tyr Thr Phe 370 375 380 Lys Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Lys Ile Gly Ala Asp Thr Lys Lys Thr 385 390 395 400 Tyr Val Arg Val Glu Asn Phe Asp 405

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (72)発明者 有馬 三樹子 神奈川県大和市中央７−９−12 (72)発明者 池田 輝雄 神奈川県愛甲郡愛川町中津1791−14 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA04 DA05 DA06 EA04 FA10 FA18 FA20 GA12 HA01 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA30Y AB01 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 BA10 BA41 CA11 EA20 EA50 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lact
   obacillus helveticus）FERM BP-6060株の菌体外プロテ
   ィナーゼ由来であることを特徴とするアンカーペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 下記のアミノ酸配列又は該配列と相同若
   しくは類似した配列であることを特徴とするアンカーペ
   プチド： Ala Lys Arg Val Gly Thr Asp Lys Val Thr Arg Tyr As
   n Ala Val Thr Val AlaMet Asn Thr Thr Lys Leu Ala A
   sn Gly Ile Ser Tyr Tyr Ser Ile Glu Asn GlyLys Ala
   Thr Gly Lys Tyr Ile Asn Ala Asp Asn Ile Asp Gly Th
   r Lys Arg ThrLeu Lys His Asn Ala Tyr Val Tyr Glu S
   er Ser Lys Lys Arg Ala Asn Lys ValVal Leu Lys Lys
   Gly Thr Glu Val Thr Thr Tyr Gly Asn Pro Tyr Thr Ph
   e LysAsn Gly Lys Lys Tyr Tyr Lys Ile Gly Ala Asp T
   hr Lys Lys Thr Tyr Val ArgVal Glu Asn Phe Asp。
3. 【請求項３】 ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lact
   obacillus helveticus）FERM BP-6060株の菌体外プロテ
   ィナーゼ由来であることを特徴とするシグナルペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 下記のアミノ酸配列又は該配列と相同若
   しくは類似した配列であることを特徴とするシグナルペ
   プチド： Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Al
   a Ala Leu Leu Ala ValAla Pro Val Ala Ala Thr Ala M
   et Pro Val Asn Ala Ala Thr Thr Val Thr ThrSer Thr
   Thr Thr Asn Lys Pro Thr Val Asp Leu Ser Gly Ala Gl
   y Ser Val SerGlu Ser Lys Asp Thr Val Asn Val Thr P
   ro Ser Phe Thr Leu Thr Ser 。
5. 【請求項５】 請求項１又は２記載のアンカーペプチ
   ド、及び／又は請求項３又は４記載のシグナルペプチド
   と、それに連結された有用蛋白質とを含むことを特徴と
   する融合蛋白質。
6. 【請求項６】 請求項５記載の融合蛋白質をコードする
   遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする、請求
   項５記載の融合蛋白質の製造方法。
7. 【請求項７】 有用蛋白質を、請求項１又は２記載のア
   ンカーペプチドと連結させた状態で発現させる工程を含
   むことを特徴とする、有用蛋白質の菌体表層への固定化
   方法。
8. 【請求項８】 有用蛋白質を、請求項３又は４記載のシ
   グナルペプチドと連結させた状態で発現させる工程を含
   むことを特徴とする、有用蛋白質を菌体表層へ分泌させ
   る方法。
9. 【請求項９】 請求項５記載の融合蛋白質をコードする
   遺伝子を有し、請求項５記載の融合蛋白質を発現しうる
   微生物。