JPH11501808A - 圧力サイクリング反応器 - Google Patents

圧力サイクリング反応器

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Abstract

(57)【要約】 圧力がタイミングを正確に調節しつつ圧力を加えることにより化学反応、特に酵素反応を好適に同期させる方法および装置。

Description

【発明の詳細な説明】 圧力サイクリング反応器 発明の分野 本発明は、一般に、化学反応を行うための装置に関する。本発明は、この装置 を用いて、一つ以上の化学反応を連続してコントロールするための方法も提供す る。 本発明の背景 化学反応は、例えば、共有結合やイオン結合の形成および開裂;2個以上の化 学化合物の会合または解離;ならびに一次、二次、三次または四次構造の変化の ような分子相互作用をもたらす。化学反応は、非酵素反応および酵素反応を含む 。酵素の存在に関わらず、化学反応は、通常、配座の変化、遷移状態形成、電子 または陽子供与/受容、および電子転位を含む幾つかの機械論的工程または分子 相互作用から成る。一般に、一連の化学反応は、有用な化学生成物を供給する。 例えば、分子生物学において、構造および調節遺伝子配列におけるDNAセグ メントの機能を探るために、部位突然変異導入により生成される一連の欠失体の セットが使用される。遺伝子内に一連の欠失体を生成することにより、エンハン サー、プロモータ、および調節機能に必要な終端部位のような領域、ならびに、 タンパク質の特殊性を定めるドメインのように、構造上の機能を有する領域を細 かくマッピングすることが可能となる。例えば、10ないし20塩基対程度の互 いに僅かに離れた位置に欠失を生成するのが望ましい。一連の欠失体組を生成す る既存の方法は、エンドヌクレアーゼ、Bal31,パンクレアチンDNase I(DNaseI)およびエキソヌクレアーゼIII(ExoIII)を含む種 々の核酸分解酵素で二重鎖DNAを消化する。 エンドヌクレアーゼを用いて、所与のエンドヌクレアーゼのための多重部位を 含有する鋳型DNAを部分的に消化する。この方法は、鋳型DNAの範囲内での 制限部位に関する事前の知識を必要とする。鋳型DNA上の制限部位は、ランダ ムに分散していないため、多くの鋳型DNAは、1組の有用な欠失変異体を生成 するのに十分な、または適当に間隔を置いた制限酵素部位を含有しない。これは 、変異体により調節ドメインの境界を解放するような場合、特に問題となる。 他のエンドヌクレアーゼによれば、Bal31が、5’および3’の終端から 二重鎖直鎖状DNAを消化する。一連の一方向変異体を作るために、二重鎖鋳型 DNA(プラスミド、ファージまたはM13のレプリカ形態)は、ターゲットシ −ケンスの一端部で開裂する制限酵素により線状にされる。線状になったDNA は、Bal31とともに所定の温度下で保温される。反応時間および酵素の量は 、それぞれ、消化の程度および消化速度をコントロールする。最もよく市販され ているBal31の製品は、2つの異なる酵素形態、速い形態と遅い形態であり 、後者は、前者のタンパク質分解フラグメントである。消化の程度は、2つの形 態の比に依存する。従って、Bal31の各バッチを分析して、好適な消化条件 を決定する。 Bal31は、ターゲットDNAとフランキングベクターDNAの両方を同時 に消化する進行的(プロセッシブ)加工酵素である。Bal31の活性は、鋳型 DNAの一次構造に従って変化する。A−Tリッチ領域は、G−Cリッチ領域よ りも速く消化する。切断されたターゲットフラグメントの回収および適当なベク ターへのサブクローニングを行う必要がある。進行特性により、種々異なる欠失 体を生成することになる。Bal31は、RNAの存在によって抑制されるので 消化前に鋳型を精製する必要がある。 第3の酵素、例えばパンクレアチックDNaseIが、Mn2+またはCo2+の ような遷移金属イオンが存在した状態で、両方の鎖のほぼ同じ位置で二重鎖鋳型 DNAを切断する。DNaseIで凝縮環状(クロズドサークル)DNAと反応 することにより1組の直線分子が生成し、これらは、ターゲットDNAをランダ ムに分散した場所で切断する。出発材料の一部分は、線状にされることはない。 制限酵素がターゲットシーケンスの一端部で開裂すると、DNAポリメラーゼを 用いてシーケンスが修復され、再度環状になる。この技術を用いて回復したクロ ーンの画分をかなり小さくすることができる。DNaseIは、例えば、プラス ミド、ファージまたはM13ベクターのレプリカ形態に含まれるターゲットDN Aに欠失を生成することが可能である「ジー・エフ・ホング(G.F.Hong )、J.Mol.Biol.158:539(1982)およびメソッズ・エン ザイモル(Methods Enzymol.)155:93(1987);エ ス・ラバイト(S.Labeit)他、メソッズ・エンザイモル(Method s Enzymol.)155:166(1987)」。 一連の欠失体の組を生成する方法の一つとして、ExoIII「エル・エイチ ・グオ(L.−H.Guo)およびアール・ウー(R.Wu)、メソッズ・エン ザイモル(Methods Enzymol).100:60(1983);エ ス・ヘニコフ(S.Henikoff)、ジーン(Gene)23:351(1 984)およびメソッズ・エンザイモル(Methods Enzymol). 155:156(1987)」。ExoIIIは、5’突出末端または平滑末端 から3’ないし5’方向に二重鎖DNA分子を消化する。ターゲットの一端部と ベクター上のユニバーサルシーケンスプライマのための結合部位との間に開裂部 位が存在する2種の制限酵素で二重鎖DNAを消化することにより、一連の欠失 体を生成する。ターゲットDNAの最も近くで切断する制限酵素は、平滑末端ま たは5’突出末端のいずれかを生成しなければならない。他の酵素は、3’突出 末端を生成しなければならない。ExoIIIは、3’突出末端を有するDNA を消化できないので、二重に制限した分子の消化が一方向に進む。時間の変化に 伴うExoIII消化に続いて、例えばマング・ビーン(Mung Bean) ヌクレアーゼ等の一本鎖ヌクレアーゼを用いて一本鎖領域を除去する。DNAは 、その後、修復されて、再度環状になる。ExoIII消化の程度は、反応時間 の長さを変化することによってコントロールされる。さらに、温度を下げて、消 化速度を遅めてもよい。「ジー・マーフィー(G.Murphy)DNAシーケ ンスプロトコルにおいて(in DNA sequencing Protoc ols、エイチ・ジー・グリフィン(H.G.Griffin)およびエー・エ ム・グリフィン(A.M.Griffin)、編集、フマナ・プレス(Huma na Press)(1993)p.58」。この方法は、上記条件を満たし、 且つターゲットDNAの範囲内で切断しない2個の制限酵素を必要とする。ター ゲ ットDNAが長い場合にこの必要条件を満たすのが困難である。 発明の要約 本発明は、タイミングを正確に調節して圧力を加えることにより、化学反応、 特に酵素反応を好適に同期する方法および装置を特徴とする。開示した装置は、 自動化して、一般に迅速に圧力を変化させることが可能である。同様に、これら の圧力変化は、化学反応を調節し、単一の感圧化学事象、例えば、単一アミノ酸 またはヌクレオチドの開裂または添加を調節可能である。化学事象の調節および 検出は、特に、核酸やポリペプチドのようなヘテロポリマの合成及び特徴づけに 特に有用である。 本発明は、反応容器圧力のプログラマブル変動を生じる圧力サイクリング反応 器を特徴とする。圧力サイクリング反応器は、数百ミリ秒以下で達成できるおよ そ10,000psiから30,000psi以上の容器圧力の最終的変化等の 迅速なプログラマブル変動が可能であることが好ましい。1つの圧力と別の圧力 との間の遷移時間は250ミリ秒、150ミリ秒、100ミリ秒、50ミリ秒、 または30ミリ秒以下であってもよい。 連続して変化する間、圧力を調節する。例えば、第1の圧力P1は、反応阻害 圧力であり、これは、第2の圧力P2、すなわち反応許容または可能圧力に変化 可能である。許容圧力は、調節した期間に、維持される。その後、圧力は、反応 阻害圧力である第3の圧力P3に変化する。いくつかの実施形態では、反応混合 物圧力をP1、P2またはP3のいずれかに維持しながら、反応混合物成分を添加 し、除去する。 圧力パルスまたは圧力サイクルは、(i)第1の圧力から第2の圧力への変化 、(ii)期間中における第2の圧力の維持、(iii)第2の圧力から第3の圧力 への変化を含む事象である。第1の圧力および第3の圧力は、実質的に異なって もよく、また実質的に同一であってもよい。第2の圧力は、反応容器の内容物に 望ましい態様で影響を及ぼすのに充分な圧力であり、これによって、通常、反応 または反応工程が生じる。 本発明によれば、圧力サイクリング反応器は、試料を入れるための反応容器と 、 反応容器に連結した容器加圧器と、加圧器へのシグナルにより反応容器内を反応 不活性化圧力に維持し、加圧器へのシグナルにより所定の短くパルシングした期 間に反応容器の圧力を反応活性化圧力に変化させた後、反応容器の反応不活性化 圧力にリサイクルするためのコントローラとを備える。 本発明の特定の実施形態においては、加圧器が、およそ250ミリ秒未満で、 20,000psiよりも高く圧力を変化させる。容器加圧器は、コントローラ に応答して反応容器と連通するように反応容器に連結した圧力室、例えば空気ポ ンプシリンダと、圧力源に連結した圧力伝送器、例えば空気シリンダとを備える 。圧力室は、可変容積を有し、圧力室の位置は、圧力伝送器によって調節され、 圧力室の容積を調節する。 リリーフバルブを用いて、圧力伝送器の圧力を急速に調整し、それによって反 応容器内で圧力パルスを発生する。圧力室アウトレットバルブが、圧力室と反応 容器との間に位置決めされる。反応容器と連通する流体源と、圧力室との間に、 圧力室インレットバルブが位置決めされる。流体源は、貯蔵室圧力源に連結する ための流体貯蔵室と、貯蔵室調節バルブとを備え、圧力室を介して、流体貯蔵室 から反応容器に流体を移動し、その間、反応容器の圧力を調節する。貯蔵室の流 体の温度は、流体貯蔵室に連結した温度センサと、貯蔵容器加熱および/または 冷却源によって調節される。反応容器の温度は、反応容器に連結した温度センサ と、反応容器加熱および/または冷却源によって調節される。コントローラは、 圧力センサが反応容器に連結した状態で、反応容器の圧力をモニタする。圧力レ ギュレータは、圧力室の圧力を調整し、コントローラは、圧力センサからのフィ ードバックを利用して、圧力レギュレータを調節する。 第2の容器加圧器を反応容器に連結し、それによって、反応容器の圧力が調節 される間、反応容器から流体を除去する。反応容器と第2の容器加圧器との間に は、インレットバルブが配置されている。第2の容器加圧器と第2の流体貯蔵室 との間には、アウトレットバルブが配置されている。第2の貯蔵室コントロール バルブは、第2の流体貯蔵室に連結されている。コントローラは、所定組の格納 信号により、複数個のバルブを調節する。その信号はバルブを調節して、少なく とも1つの加圧した試薬流体を反応容器に添加し、また少なくとも1つの加圧し た反応流体を反応容器から除去し、その間、反応容器には圧力をかけたままであ る。検出器、例えば、放射性同位元素検出器、赤外分光計、質量分析計、ガスク ロマトグラフィー質量分析計、分光光度計、分光蛍光計、電気化学検出器、表面 プラズモン共振検出器または光度計は、反応容器内の流体中に存在するか、また は反応容器から除去した成分の特性を検出する。 反応容器は、抑制部、例えば、反応容器を2つの部分に分割する半透性バリア を備え、容器から流体を除去しながら、反応容器内で固定化試薬、例えば、非液 体支持部に装着した有機化合物を保持する。 本発明は、さらに、試料の温度および圧力状態を調節することにより、試料の 活性を断続的に阻害するための反応器を提供し、この反応器は、試料室と連通し 、試料の活性を阻害するために選択した資料室に第1の所定圧力を加えるための 第1の位置と、試料の活性を与えるために選択した第2の所定圧力に室圧力を変 化させるための第2の位置との間で移動するために取り付けられた加圧器と、第 1の状態と第2の状態とを有し、第1の位置と第2の位置との間で加圧器を移動 させるためのスイッチと、第1および第2の状態間でスイッチを変化させるため のコントローラと、室内の温度を調整するための手段と、室と連通し、室から試 料を除去するためのポートとを備える。 本発明は、さらに試料に加えた圧力を調節することにより、試料の活性を断続 的に阻害するための反応器を提供し、この反応器は、室が加圧されている間、試 験試薬のフローを流体貯蔵室から試料室内に供給するためのシステムを備える。 このシステムは、流体貯蔵室と連通して、第1のコンジット内に配置した第1の バルブと、試料室と連通して、第2のコンジット内に配置した第2のバルブと、 流体貯蔵室と室との間に置かれ、第1のコンジットおよび第2のコンジットと連 通する第1の加圧器と、第1の加圧器に関連して、第1の加圧器にベントをつけ るための第3のバルブとを備える。 第1のバルブが開位置にあり、第2のバルブが閉位置にある状態で、貯蔵室が 第1の加圧器と連通して、第1の加圧器に流体フローを与える。第1のバルブが 閉位置、第2のバルブが開位置、及び第3のバルブが閉位置にある状態で、加圧 器が室と連通して、室を加圧し、第1のバルブが閉位置、第2のバルブが開位置 、 第3のバルブが開位置と閉位置との間でサイクリングされている状態で、室の圧 力がパルシングされる。 本発明の特定の実施形態では、室から試験物質のフローを供給するために、シ ステムが、室と連通して、第3のコンジット内に配置した第4のバルブと、第3 のコンジットの下流で、第4のコンジット内に配置した第5のバルブと、室の下 流に置かれ、第3のコンジットおよび第4のコンジットと連通する第2の加圧器 と、第2の加圧器に関連して、第2の加圧器にベントをつけるための第6のバル ブとを備える。 第1のバルブが閉位置、第2のバルブが開位置、第3のバルブが閉位置、及び 第4のバルブが閉位置にある状態で、加圧器が室と連通して、室を加圧する。第 1のバルブが閉位置、第2のバルブが開位置、第3のバルブが開位置と閉位置と の間でサイクリングし、さらに第4のバルブが閉位置にある状態で、室の圧力が パルシングされる。第1のバルブが閉位置、第2のバルブが開位置、第3のバル ブが閉位置、第4のバルブが開位置、第5のバルブが閉位置、及び第6のバルブ が開位置にある状態で、第1の加圧器が第2の加圧器と連通して、第1の加圧器 から、室を介して、第2の加圧器に至るフロースルーを可能にする。 本発明は、さらに、迅速な圧力サイクルまたは圧力パルスを有する酵素反応工 程を調節する方法を特徴とする。この方法は、酵素反応工程が可逆的に阻害され る圧力Pi,xで試料容器内に試料混合物を供給する工程を備える(xは0以上の 整数である)。試料混合物は、酵素を含む。この方法はまた、期間δta,yにお ける試料混合物の圧力を、酵素反応工程が実施可能である圧力Pa,yに変化させ る工程を備える(yは1以上の整数である)。この方法はまた、期間δti,zに おける試料混合物の圧力を、追加酵素反応工程が可逆的に阻害される圧力Pi,z に変化させる工程を備え、zは1以上の整数であり、それによって酵素反応工程 を調節する。 酵素に加えて、試料混合物は、以下の各々を1つ以上、様々に組み合わせて含 むことも可能である:溶媒、酵素共同因子、酵素の基質、酵素阻害剤、擬態基質 、および無機または有機イオン。大部分の実施形態においては、試料混合物が基 質を含む。試料混合物は、試料混合物の成分は酵素反応後の第5工程の回復のた め に固定化する物質を含めることができる。それによって、試料混合物の成分が試 料容器の空間内で保持されるか、または酵素反応の生成物または副生物が、除去 され、吸着され、会合され、または共有もしくは非共有相互作用により結合され る。 従って、一実施形態は、消化程度を微細に調節して、欠失体を生成することが 可能である。酵素の変化量、反応の長さ、および外界圧力での温度は、圧力に加 えて、圧力がおよそ外界圧力である方法よりも、消化の程度をより微細に調節で きる。この実施形態は、広く、または接近したクラスター化した長さを有する欠 失体を提供する。 本発明は、酵素反応を調節する方法を特徴とする。これらの方法は、可逆的不 活性化圧力で試料容器内で試料混合物を供給する工程を備え、試料混合物は酵素 を含有しており、さらに試料混合物を活性化圧力に晒す工程と、(iii)試料混 合物を不活性化圧力に晒し、それによって酵素反応を調節する工程とを備える。 試料混合物の成分(例えば、1つ以上の酵素基質、共同因子、遷移金属イオン、 溶媒、塩および緩衝液)を、調節するべき特定の酵素反応または反応工程に適す る順序で供給できる。酵素は、分布または進行的特性を有することが可能である 。 不活性化圧力が工程(i)においてPi,xであり、その圧力では、酵素反応工 程が可逆的に阻害され、活性化圧力が工程(ii)においてPa,yであり、その圧 力では、酵素反応工程を実施可能であり、露呈上程(ii)は、期間δta,yで、 圧力をPa,yまで変化させる工程を備え、不活性化圧力が工程(iii)においてPi,z であり、その圧力では、追加酵素反応工程が可逆的に阻害され、露呈工程(i ii)は、期間δti,zで、圧力をPi,zまで変化させる工程を備え、xはゼロ以上 の整数であり、yは1以上の整数であり、zは1以上の整数であり、それによっ て、酵素反応を調節する。 この方法は、以下の工程をさらに備えることが可能である。すなわち、工程( ii)と工程(iii)との間で、活性化圧力Pa,yが、単一酵素事象の平均的長さに 対応する期間ta,yだけ維持されるか、または基質が、試料容器内で固定化され 、工程(iii)の後に、試料容器圧力を維持しながら、試料容器から試料混合物 の成分を除去する工程か、または試料容器圧力を維持しながら、試料混合物に 液体を添加する工程をさらに備えることが可能である。 除去成分が、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ開裂生成物、 エキソヌクレアーゼ、ヌクレオチドまたはその組み合わせを含む。除去成分を、 試料容器から除去する時、半透性物質を通過させることが可能である。 この方法は、工程(iii)の後に試料混合物の成分の特性を検出する工程をさ らに備えることが可能である。成分特性は、放射能、蛍光、化学発光、分子イオ ンチャージ/質量比、電気化学電位、発光、表面プラスモン共振、および赤外吸 収を含む。 基質は、核酸であってもよい(例えば、二重鎖DNA、一本鎖DNA、二重鎖 および一本鎖領域の両方を含むDNA、ならびにRNA、これらはいずれも試料 容器内で固定化されるか、または固定化されない、ならびにその組み合わせ)。 酵素は、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはターミナルトラ ンスフェラーゼであってもよい。 従って、この方法は、核酸基質から開裂される少なくとも1つの開裂フラグメ ント(例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、またはオリゴマ)を生成可能である。 1つの方法では、第1の基質と第2の基質とが存在し、酵素が第1の基質を第 2の基質に装着する。一実施形態では、第1の基質はヌクレオチドであり、第2 の基質はRANオリゴヌクレオチドまたはDNAヌクレオチドを含み、酵素は、 第2の基質がRNAオリゴヌクレオチドであるポリリボヌクレオチドフォスフォ リラーゼであり、且つ第2の基質がDNAヌクレオチドであるターミナルトラン スフェラーゼである。 他の実施形態では、第1の基質はヌクレオチドであり、第2の基質はRNAま たはDNAオリゴヌクレオチドを含み、酵素は、酵素クラス2.7.7から選択 したトランスフェラーゼである。 一実施形態では、基質は、キラルまたはプロキラル官能基を有する化合物であ り、酵素は、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラ ーゼ、リパーゼ、または基質に鏡像体特異的に作用するエステラーゼである。 さらに、工程(i)ないし(iii)における酵素が第1の酵素であり、工程( i)ないし(iii)における試料混合物が第1の試料混合物である。この方法 は、工程(iii)の後に、以下の工程(iv)ないし(vi)、すなわち、(iv)試 料容器内で第2の試料混合物を供給する工程をさらに備え、試料混合物が、可逆 的不活性化圧力Pi,jで第2の酵素を備え、第2の酵素は、工程(i)ないし(i ii)における第1の酵素と同一かまたは異なり、試料容器は、工程(i)ないし (iii)における試料容器を同一であるか、またはバルブによって第1の試料容 器に連結した第2の試料容器であり、さらに(v)第2の試料混合物を可逆的不 活性化圧力に晒す工程と、(vi)第2の試料混合物を可逆的活性化圧力に晒し、 それによって、第1および第2の酵素の酵素反応工程を調節する工程をさらに備 える。 圧力Pa,kまでの遷移時間は、第2の酵素の酵素反応工程が実施され得る圧力 Pa,kまでの期間δta,kに生じる。第1および第2の酵素は、同一の酵素であっ てもよく、また異なる酵素であってもよい。期間δti,lの間、第2の試料混合 物の圧力を、第2の酵素の追加酵素反応工程が可逆的に阻害される圧力Pi,lに 変化させる。幾つかの実施形態では、工程(vi)における反応不活性化圧力Pi, z がPi,lに実質的に等しい。 一実施形態によれば、圧力Pi,xでの試料混合物が温度Ti,x下にある場合、酵 素が阻害される。また、圧力Pa,yでの試料混合物が温度Ta,y下にある場合、酵 素が活性状態にある。さらに、圧力Pi,zでの試料混合物が温度Ti,z下にある場 合、酵素が阻害される。Ti,zおよびTa,yの各々は、Ti,xの値と同じか、また は異なる。j、kおよび1の値は、x、yおよびzとそれぞれ等しい。これらの 下付文字は、上記工程間で(例えば、工程(i)と(ii)間で)圧力の追加工程 を備えてもよく、必ずしも中間ではない異なる圧力を変化してもよいことを強調 することを意図している。この方法における各工程は、望ましい特定の生成物に より、反復サイクルとして、または圧力および時間の非反復変化として組み合わ せることが可能である。さらに、遷移期間δ tsは短い、例えば1秒未満であ るのが好ましく、500、250、200、100または50ミリ秒未満である のが好ましく、δta,yおよびδti,zの各々は、10ミリ秒から250ミリ秒ま での間、または10ミリ秒から50ミリ秒までの間が好ましい。測定可能プラト ーのないスパイク様の遷移変化から数百ミリ秒ないし数百秒までの範囲にわたる 期間、例えばta,yまたはti,zにおいて圧力を維持することが可能である(図1 1参照)。例えば、合計(δta,y+ta,y+δti,z)は、300、700また は1000ミリ秒以下である。 実施の形態は、以下の方法も備えており、この方法においては、基質が試料容 器内で固定化され、第2の酵素が第1の酵素とは異なり、工程(iii)と(iv) との間に、溶出液で溶出させることによって試料混合物圧力を維持しながら、試 料容器から第1の酵素を除去する工程をさらに備えている。また基質は、二重鎖 核酸であり、第1の酵素が5’−3’エキソヌクレアーゼであり、第2の酵素が 3’−5’エキソヌクレアーゼである。それによって、第1の酵素で配列決定を 行って1つ以上のヌクレオチドを同定し、また第2の酵素で配列決定を行って1 つ以上のヌクレオチドを確認することができる。 工程(i)ないし(iii)が1サイクルである場合、方法が、工程(i)ない し(iii)のサイクルを少なくとも49回繰り返す工程をさらに備えることが可 能であり、サイクルにおける各々の値Pi,x、Pi,z、δta,y、Pa,yおよびδti,z が、他のどのサイクルのそれぞれの値からも独立している。 工程(iv)ないし(vi)が1サイクルである場合、方法が、工程(iv)ないし (vi)のサイクルを少なくとも49回繰り返す工程をさらに備えることが可能で ある。試料混合物の圧力を維持しながら、試料混合物(またはそれから除去した 成分)に流体を添加することができる。 さらに、反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす方法は、(i)試料容器内で試料 混合物を供給する工程を備え、試料混合物は、圧力P0、温度T0であり、さらに (ii)試料混合物の温度をT1に変化させる工程と、(iii)反応混合物の圧力を 、期間δt1の間、P1まで上昇させる工程とを備え、P1は、P0よりも少なくと も10,000psiだけ大きく、さらに、(iv)反応混合物の圧力をP2まで 低下させ、それによって、高圧で反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす工程を備え る。 この実施形態では、圧力上昇工程(iii)の後に、試料混合物を反応させる工 程をさらに備えるか、または試料混合物中に触媒を含め、圧力上昇工程(iii) の後に、生成物を触媒から解離させる工程をさらに備え、工程(iii)の後に、 試料容器から試料混合物の成分を除去する工程をさらに備える。 本発明は、さらに、核酸を処理する方法を提供し、この方法は、a)i)試料 容器と、ii)核酸基質と、iii)核酸基質に作用可能な酵素と、iv)容器の圧力 を調節する加圧器とを、いずれかの順で設ける工程と、b)酵素および核酸を試 料容器に溶液で供給し、酵素を不活性化圧力状態で維持する工程と、c)調節し た期間に試料容器の圧力を酵素活性化圧力に変化させ、その結果、この期間中に 酵素が活性状態になり、核酸基質に作用する工程とを備える。 酵素は、エキソヌクレアーゼ(例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ)、DNA ポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ、進行的酵素、分布酵素であってもよい 。酵素は、核酸基質を改変可能であり、その後、開裂したヌクレオチド、アミノ 酸または改変した基質等の反応生成物を検出する。 この方法は、反応容器温度を調節する工程をさらに備えることができる。この 場合、不活性化圧力状態には、反応容器圧力を酵素活性化圧力まで低下させると 、高レベルの酵素活性を許容する温度が含まれる。この方法は、反応容器を低い 酵素不活性化温度(例えば、およそ5℃未満)および酵素活性圧力(例えば、平 方インチあたりおよそ5,000ポントから15,000ポンド)に維持する工 程と、圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、温度を酵素活性化温度( 例えば、15℃から20℃までのインテグラル温度)まで下げる工程と、その後 、圧力を酵素活性化圧力まで低下させる工程とをさらに備える。 例えば、この方法は、a)酵素をおよそ5℃未満の不活性化温度に維持し、そ れによって、酵素を実質的に不活性状態にする工程と、b)核酸基質を不活性酵 素に添加して、反応混合物を生成する工程と、c)試料容器の圧力を、平方イン チあたりおよそ30,000ポンドよりも高い酵素不活性化圧力まで上昇させる 工程と、d)試料容器の反応混合物の温度を、およそ10℃よりも高く上げる工 程と、e)調節した期間に、試料容器の圧力を、平方インチあたりおよそ20, 000ポンド未満の酵素活性化圧力まで下げ、それによって、酵素が核酸基質に 作用するように、酵素を活性状態にする工程とを備える。この方法は、f)試料 容器の圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程を備えることも可能である。 この方法はまた、試料容器の圧力を、酵素不活性化圧力に変化させる工程と、 工程c)およびd)のサイクルを少なくとも1回および5回繰り返す工程とをさ らに備えることが可能である。酵素不活性化圧力は、一般に酵素活性化圧力より も高い。 本発明の他の特徴および利点は、以下の図面の説明、詳細な説明、実施例、お よび請求の範囲から明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図1は、本発明の反応器の概略図である。 図1Aは、図1の反応器のスプリングシールおよびグランドワッシャを示す図 である。 図2は、図1の反応器のハイドロリックシステムの概略図である。 図3は、図1の反応器のコントロールを示すブロック図である。 図4は、反応器の他の実施例を示す図である。 図5は、図4の反応器の構成部分の概略図である。 図5Aは、図4の反応器のハイドロリックシステムの概略図である。 図6は、図4の反応器の機械的概略図である。 図6Aは、ポンプ/バルブモジュールの詳細図である。 図6Bおよび図6Cは、反応容器の構造を示す図である。 図7は、ポンプ/バルブモジュール間の反応容器をシールするためのクランプ を示す図である。 図8は、流体コントロールアルゴリズムのブロック図である。 図9は、流体コントロールアルゴリズムのステップの際のバルブ位置のリスト である。 図10は、図4の反応器のコントロールを示すブロック図である。 図11は、圧力パルスの圧力ー時間プロファイルを示すグラフである。 図12は、静水圧を加える手段によって核酸基体における酵素の作用をコント ロールするための装置の概略図である。 図13は、ラムダエキソヌクレアーゼによるDNAの消化に加えられる静水圧 の効果を示すグラフである。 図14は、ラムダエキソヌクレアーゼによるDNAの消化に加えられる種々の 静水圧および温度の効果を示すグラフである。 定義 本発明を容易に理解するために、多くの用語が以下で、また開示の他の部分で 定義されている。 試料混合物は流体である。流体は、液体または気体でもよい。液体は、水溶液 および有機溶液を含む。応用次第で、試料混合物は、所与の工程で酵素を含んで もよいし、含まなくてもよい。 水性試料混合物は、(a)水(例えば、タップ、蒸留、濾過、脱イオン、脱気 または重水素化)と、ならびに(b)(i)無機カチオンおよびアニオン、(i i)有機化合物および(iii)溶媒和ガスのうちの少なくとも一つとを成分と して含む。試料混合物は、溶解または懸濁した(溶解していない)溶質の流体( 溶媒)に関連して、一般に溶液である。試料混合物は、ポリマー、セラミックま たは複合ビーズもしくは表面上で固定化した酵素または酵素基体も含む。これら の固定化試料混合物成分は、試料混合物内で必ずしも溶解または懸濁していない が、試料混合物成分に晒し、流体の乱れによって混合することが可能である。 無機カチオンは、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウ ム、クロム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、銅およびアルミニウムを含む。無 機アニオンは、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、リン酸塩、リン 酸水素塩、炭酸塩および炭酸水素塩を含む。 有機成分は、天然および合成核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、αー アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチドミメチック、デプシペプチド、ペプチド、 糖類、リポ糖類、およびこれらの混合物を含む。ヌクレオチドは、dATP、d CTP、dGTP、dTTPおよびdUTP等のデオキシヌクレオシド5’トリ リン酸塩;ジデオキシヌクレオチド;c7dGTP、dITP、c7dATP等 のあいまいな配列(ambiguities)を決定するためのヌクレオチド; dATPaSのような2’−デオキシヌクレオシド−5’−O−(1−チオトリ リン酸塩);5−メチルデオキシシチジン5’−トリリン酸塩;リボヌクレオシ ド5’−トリリン酸塩;2’3’−ddNTP;7−デアザ2’−dNTPを含 む。 アミノ酸の例として、20個の共通αーアミノ酸(Gly、Ala、Val、 Leu、Ile、Ser、Thr、Asp、Asn、Lys、Glu、Gln、 Arg、His、Phe、Cys、Trp、Tyr、MetおよびPro)や他 の天然または合成アミノ酸(例えば、ノルロイシン、エチルグリシン、オルニチ ン、メチルブテニルメチルートレオニン、フェニルグリシン、γ−カルボキシグ ルタル酸、β−ヒドロキシプロリン、γ−ヒドロキシプロリン、δ−ヒドロキシ リジン、メチラートアミノ酸、ε−ヨード、ε1−ε2−ジヨード、ε−ニトロ ー、ε−アミノ− およびO−アセチル−チロシン)が挙げられる。 糖類として、ゲルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、スクロ ースおよび他の自然発生置換糖類が挙げられる。有機化合物もまた、放射性同位 元素化合物、および検出可能タグまたは信号を有する他の化合物を含む。 有機試料混合物は、化合物、例えば(a)有機溶媒またはその混合物(例とし てメチレン塩化物、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド、エーテル、 ベンゼン、トルエン、ヘキサンおよび酢酸エチル)、ならびに(b)有機試薬を 含む。 他の型式の流体では、気体は、希ガス(例えば、He、NeおよびAr);H Cl、HF、二原子水素および二原子ハロゲンのような有機合成で試薬として使 用されるガス;ならびに二酸化炭素、一酸化炭素および酸素のような生体システ ムにおいて試薬として使用される大気を含む。反応室を加圧ガス流体に晒すこと により、(a)反応容器の圧力を増加または減少させる、(b)pHを変化させ る、(c)化学または酵素反応のための試薬を提供する、ガス流体試薬が部分的 に液体に溶解してもしなくても、もしあるならば、反応室もしくは気相、または 反応容器に存在する、(d)化学または酵素反応工程を抑制する、さらに(e) 反応容器内に、または反応容器から流体内容物を移動させることが可能となる。 ベクター(または媒介物)は、1個のセルから他のセルまで1個以上のDNA セグメントを移動させる核酸分子である。発現ベクターは、望ましいコーディン グシーケンスおよび特定のホスト生物体における動作可能に結合されたコーディ ングシーケンスの発現に必要な核酸シーケンスを含む組換えDNA分子である。 原核生物における発現に必要な核酸シーケンスは、通常、プロモータ、任意にオ ペレータおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、エンハン サーならびに終結シグナルおよびポリアデニル化信号を利用することが知られて いる。 相補性は、幾つかの塩基のみが塩基対合規則に従って適合しているような部分 的なものであってもよく、また完全であってもよい。核酸のストランド間の相補 性の程度は、核酸のストランド間のハイブリダイゼーションの効率および強度に かなり影響を与える。従って、相補性は、核酸間の結合に依存する検出方法と同 様に増幅反応の精度に影響を与える。 混成は、相補性核酸の対合である。混成および対合の強度(すなわち、核酸間 の会合の強度)は、核酸間の相補性の程度、必要条件の厳重性(ストリンジェン シー)、形成された混成のTmおよび核酸内のG:C比のような要因に影響され る。Tmは、融解温度または、二重鎖核酸分子の占有数が一本鎖に半解離する温 度である。核酸のTmを計算する式は、従来技術においてよく知られている。標 準引例で示すように、Tmの単一推定値は、以下の式で求めることができる:Tm =81.5+0.41(% G+C)。この場合、核酸は、1M NaClの水 溶液に存在する(例えば、アンダーソン(Anderson)およびヤング(Y oung)、核酸混成(Nucleic Acid Hybridizatio n)(1985)における定量フィルタ混成(QuantitativeFil ter Hybridization参照)。他の引例は、構造上の特性および シーケンス特性をTmの計算に対して考慮する、より複雑な計算を含む。 ストリンジェンシーは、核酸混成が行われる温度条件、イオン強度、有機溶媒 のような他の化合物の存在に関連する。ストリンジェンシーが高い場合、相補性 塩基シーケンスの高周波数を有する核酸フラグメント間のみで核酸塩基対合が生 じる。ストリンジェンシーが弱いか、または低い場合、遺伝学上多様である生物 体から得られる核酸は、たとえ相補性シーケンスの周波数が通常、よりいっそう 低くても生じる。 ”核酸”および”核酸基質”は、DNA、RNAおよびPNA(ペプチド核酸 ) を含み、一本鎖、二重鎖、もしくは断続する相補的セグメントを有する一本鎖ま たはその組み合わせのいずれかである。RNAおよびDNA残基の領域を有する キメラオリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴズ・イーティーシー、インク(O ligos Etc.,Inc(ウィルソンビル、オレゴン(Wilsonvi lle、OR))から商業上入手可能である。本発明は、原則として、核酸の長 さを制限せず、核酸は、ゲノムであるか、もしくは定められた長さ(例えば、短 いオリゴヌクレオチド)またはそのフラグメント(単一塩基を含む)であっても よい。核酸は、いかなる由来からも得られ、それ故に、自然発生する;自然発生 して精製される;または合成して、組み換えて、もしくは増幅して生成される。 核酸は、核酸基体からヌクレオチドを除去するか、または末端メチル基もしくは 核酸を他の分子に結合する結合基のような化学成分を添加する酵素によって形成 される改変された核酸を含む。他で説明したように、核酸は、ポリマーもしくは 複合ビーズ、マトリックス、または他の支持面に固定可能である。 核酸は、いずれかの増幅方法によって増幅可能である。増幅可能な核酸は、通 常、試料テンプレート、すなわち、試料から生じる核酸を含む。対照的には、バ ックグラウンドテンプレートは、試料に存在してもしなくてもよく、一般に、キ ャリオーバーの不本意な結果、または試料から精製除去すべき核酸汚染物の存在 である。例えば、検出したもの以外の生物体からの核酸は、テスト試料における バックグラウンドとして存在してもよい。増幅方法の例は、ケー・ビー・ムリス (K.B.Mullis)による米国特許第4,683,195号および4,6 83,202号の方法のようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、これら はここで引用しており、クローニングまたは精製を行うことなく、ゲノムDNA の混合物におけるターゲットシーケンスのセグメントの濃度を増すための方法に ついて述べている。 ”試料”は、最も広い意味で使用する。試料は、人間や動物の試料からの標本 、培養、生物学的試料、環境試料等や、自然発生する合成物質を含む。”試料容 器”という用語は、試料を包囲するか(例えば、バッチフォーマットで)、また は包囲装置に入れた試料を用いるか(例えば、室、チャネルまたは流れにおける 、またその間のチャネリング)のいずれかにより、試料を含有するための手段を 示 すために使用される。同様に、”反応容器”は、いかなるデザインであってもよ く、一般に、反応が起きる試料容器である。 反応または試料混合物は、2個以上の成分の組み合わせに関連する。最適酵素 温度は、所与の圧力および溶媒システム(溶媒および塩)で、酵素が最も活性状 態にある時の温度である。最適条件は各酵素と共に変化するが、一般に、10な いし80℃、特に25ないし37℃の範囲である。最適温度は、例えば、ニュー ・イングランド・バイオラブズ(New England BioLabs(N EB))によって提供されている生成物の文献において見い出せる。 実質上不活性の酵素は、最適酵素温度(**および気圧?)(100%活性) における活性の20%未満であり、一般には、その10%未満である。理想的に は、抑制された、または実質上不活性の酵素は、完全に不活性の状態にあるが( 0%活動度)、この決定は所与の活動度検定の感度および不確実さによって制限 される。可逆的に抑制された酵素は、制限または抑制条件では活動度を示さない が、許容条件に晒した場合、活動度を回復する。許容条件に晒した後、また酵素 活動度が回復する前に、休止または遷移状態にすることは、可能である。許容条 件は、最適酵素活動度が生じる条件と、より遅いが、ある程度有用な活動度が生 じる条件とを含む。 プライマはオリゴヌクレオチドであり、精製した制限消化物のように自然に発 生するか、または合成的に生成されており、核酸線維に相補的なプライマ伸張生 成物の合成が誘発される条件に置かれた場合(すなわち、ヌクレオチドおよびD NAポリメラーゼのような誘発剤が存在する状態で、また好適な温度およびpH で)、合成の開始点として作用することが可能である。プライマは、最大増幅効 率のために一本鎖であるのが好ましいが、代わりに二重鎖であってもよい。二重 鎖の場合、プライマを、伸張生成物を作るために使用する前に、まずその線維を 分離処理する。プライマは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであるのが好まし い。プライマは、誘発剤の存在する状態で、伸張生成物の合成を行うのに十分に 長くなくてはならない。プライマの正確な長さは、温度、プライマの起源、およ び方法の利用を含む多くの要因に依存する。 プローブは、精製した制限消化物のように自然発生するか、または合成的に生 成したオリゴヌクレオチドであり、これは、他のオリゴヌクレオチドとハイブリ ッド形成することが可能である。プローブは、特定の遺伝子シーケンスの検出、 識別および単離に有用である。プローブ、特定の遺伝子シーケンス、またはその 両方は、”レポータ分子”で分類することができるので、プローブ、特定の遺伝 子シーケンスまたはその両方は、酵素(例えば、ELISAおよび酵素ベースの 組織化学分析)、蛍光放射性発光検出システムにおいて検出可能である。 ターゲットシーケンスは、検出および/または増幅に使用されるプライマによ り(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により)結合した核酸領域である。このよう に、他のシーケンス間でターゲットを識別するのが望ましい。セグメントは、タ ーゲットシーケンス内の核酸領域である。 PCR生成物または増幅生成物は、変性、アニーリングおよび伸張の各工程の 2回以上のサイクルの後に結果的に生じる化合物の混合物である。これらの用語 は、1つ以上のターゲットシーケンスの1つ以上のセグメントを増幅した場合を 含む。 増幅試薬は、プライマ、核酸型および増幅酵素を除いた増幅に必要な試薬であ る。増幅試薬は、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸および緩衝液を含む。一 般に、増幅試薬および他の反応成分を、反応(例えば試料)容器(試験管、マイ クロウェル、任意のアウトレットを有する圧力変形可能ケーシング等)に入れる 。 エンドヌクレアーゼおよび制限酵素は、酵素(例えば細菌性酵素)に関連し、 その各々は、特定のヌクレオチドシーケンスにおいて、またはその近くで二重鎖 DNAを切断する。 DNA分子は、”5’端部”および”3’端部”を有すると言われる。その理 由は、1個のモノヌクレオチドペントース環の5’リン酸塩を、フォスフォジエ ステル結合を介して一方向にその近隣の3’酸素に付与するように、モノヌクレ オチドが反応してオリゴヌクレオチドを作るからである。従って、5’リン酸塩 がモノヌクレオチドペントース環の3’酸素に結合されない場合、オリゴヌクレ オチドの端部は”5’端部”と呼ばれ、その3’酸素が、後のモノヌクレオチド ペントース環の5’リン酸塩に結合されない場合は ”3’端部”と呼ばれる。 ここで使用するように、核酸配列は、たとえより大きいオリゴヌクレオチドの内 部配列であっても、5’および3’端部を有するといえる。線状または環状DN A分子のいずれかにおいて、別個の元素を、”下流”または3’元素の”上流” または5’として表現できる。この用語は、DNAストランドに沿って5’から 3’方向に転写が進むという事実を反映する。結合遺伝子の転写を指示するプロ モータおよびエンハンサーエレメントは、一般にコーディング領域の5’または 上流に置かれる。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモータエレメントお よびコーディング領域の3’に置かれた場合でさえ、その効果を発揮することが 可能である。転写終了およびポリアデニル化信号は、コーディング領域の3’ま たは下流に置かれる。 ここで使用するように、用語”遺伝子をコードするヌクレオチドシーケンスを 有するオリゴヌクレオチド”は、遺伝子のコーディング領域を備えるDNAシー ケンス、または換言すれば、遺伝子産物をコードするDNAシーケンスを意味す る。コーディング領域は、cDNAまたはゲノムDNA形態のいずれかで存在可 能である。エンハンサー/プロモータ、スプライス連結、ポリアデニル化信号等 のような好適な調節因子は、転写の適当な開始および/または一次RNA転写の 正確な処理を可能にする必要がある場合、遺伝子のコーディング領域に最も近接 して置くことができる。代わりに、本発明の発現ベクターで利用されるコーディ ング領域は、内因性エンハンサー/プロモータ、スプライス結合、介入シーケン ス、ポリアデニル化信号等、または内在性および外来性調節因子の組み合わせを 含んでもよい。 ポリマ基質を合成または消化する酵素は、各触媒事象の後、基質から解離させ てもよい、すなわちそれらは非進行的(共核酸および分布)であってもよい。一 方、それらは、多くの反応サイクルが完了するまで、ポリマーに結合したまま、 すなわち”進行的(プロセッシブ)”であってもよい。酵素に関して、進行的、 非進行的および分布という用語は、従来技術で用いられている(例として、エー ・コーンバーグ(A.Kornberg)およびティー・エー・ベーカー(T. A.Baker)DNA複製(DNA Replication)、2nd e d.(Freeman and Co.1992)参照)。 発明の詳細な説明 A.序論 本発明は、反応容器の圧力の迅速なプログラマブル変動を生じる圧力サイクリ ング反応器を特徴とする。圧力変動は、多くのプロファイルを用いてプログラミ ング可能である。2つの圧力PおよびP’間の変動が生じる場合、例えば、種々 のプロファイルは以下の通りである。a)PおよびP’の各々における時間の長 さがほぼ同じである、b)Pにおける時間がP’における時間よりも長い、c) PからP’までの遷移時間は、P’からPまでの遷移時間とほぼ同じである、d )PからP’までの遷移時間がP’からPまでの遷移時間よりも長い、e)Pか らP’までの遷移における中間圧力での休止が幾つかあるが、P’からPまでの ジャンプは非常に迅速である。さらに、圧力変動プロファイルは、ほとんど反復 しない異なる圧力間の小さなステップまたは大きなジャンプの変動のような3つ 以上の圧力PおよびP’を含んでもよい。 本発明はまた、反応容器の圧力を維持または増大しながら、反応容器内の成分 を添加したり除去することが可能な圧力サイクリング反応器を提供する。成分は 、圧力変動プロファイルを用いて多くの順列で添加または除去できる。各圧力パ ルスサイクルは同一である必要はない。 従って、圧力サイクリング反応器は、反応の少なくとも1つの工程が感圧的で ある応用において有用となる。これらの反応は、酵素、非酵素、化学的、物理的 、動力学的、熱力学的相互作用を含む。換言すれば、感圧相互作用は、共有(結 合破壊および結合形成)、疎水、イオン(溶媒和)、およびファンデルワールス 力;疎水または親水相互作用;ならびに構造上の配座(二次、三次および四次、 すなわちフォールディング、ならびにヘリックスおよびシートの形成)を含む。 可逆感圧反応工程の速度は、低下、停止、増大または開始することができ、後 者は、可逆阻害圧力が許容圧力に迅速に変化する時に達成される。一般に、多数 の酵素(同一か、または異なる酵素)の速度は、阻害圧力(例えば、高い圧力) でそれらを可逆的に阻害し、その後、圧力を許容圧力に迅速に変化させることに より、同期できる。 圧力反応器は、組み合わせまたは連続動作をそれぞれ行うために、多数の試料 容器を並列または直列に含むことが可能であり、少なくとも1つの反応工程は感 圧的である。多数の試料容器は(より大きい反応容器でさえ)、相互連結可能で あるので、反応した試料混合物の部分を1個の試料容器から他の試料容器まで転 送して、次の処理を受けることが可能である。オリゴヌクレオチド(構造物の製 品を含む)、ペプチドおよび他の有機化合物の組み合わせ合成を、このように行 うことができる。 B. 圧力サイクリング反応器 図1を参照すると、反応器10は反応モジュール12を備えており、反応モジ ュール12は、例えばポリエチレンから作られた試料カプセル17を入れるため の室(チャンバ)15を定める壁面13を有する。反応モジュール12における ポート12aは、カプセル17を室15に配置できるようにする。ショートスト ローク圧力伝送空気シリンダ14と、室15に圧力を加えるための圧力伝送水圧 シリンダ16は、ベースプレート18に実装されている。反応モジュール12は 、可変体積圧力室23を定める、例えばステンレス鋼で形成したトラス20によ って支持される。例えば、青銅合金から形成されたベアリング24によって支持 され且つ案内され、室壁面27を定める、例えば直径3/16”のピストン22 は、反応室12のボア25とシリンダ14および16との間で連通する。ピスト ン22は、シリンダ14および16と共に、室15の圧力を調節する容器加圧器 21を形成する。反応モジュール12は、例えばステンレス鋼から形成され、ボ ア25は、直径がおよそ0.188”であり、長さがおよそ1”である。 図1Aも参照すると、シール36,例えばグランドワッシャ38によって支持 されたBal Seal Engineering Co.Inc.,(San ta Ana、CA)から入手可能であるばね36aならびにバックアップワッ シャ37、37aおよび37bを含むばね付勢シールは、反応室12内でピスト ン22をシーリングする。グランドワッシャ38は、バックアップワッシャ37 bの傾斜面39aと一致する傾斜面39を含む。ばね36aは、低圧で確実にシ ーリングを行い、より高圧でシーリングを援助する。バックアップワッシャおよ びグランドワッシャは、圧力をかけてシール36の押し出しを防止する働きをす る。グランドワッシャ38は、トラス20の棚40によって支持される。 空気シリンダ14は、例えば直径が2.5”のピストン14aを備えており、 延長ロッド26はスルーボア28を有する。Oリング14bは、ピストン14a と、空気シリンダ14の内壁面15との間にシールを形成する。空気シリンダを 14を付勢すると、ピストン22の上向きの力を生じるロッド26により、ピス トン14aにかかる圧力をガイドベアリング24に伝送する。この力は、インレ ット30に装着したソース(図示せず)から空気シリンダまで圧力を変化させる ことにより、調整可能である。空気シリンダ14によりピストン22に加えられ る力は、圧力パルシングの間、反応室12内の低圧力レベルを決定する。空気シ リンダ圧力は、およそ100psi(反応室12内でおよそ17,000psi の圧力を生じる)まで調整可能である。 水圧シリンダ16は、例えば直径が1”のピストン16aを備え、延長ロッド 32は、空気シリンダロッド26のスルーボア28を突き上げる。水圧ロッド3 2の端部34は、ガイドベアリング24に支えられている。延長すると、水圧ロ ッド32は、ピストン22を上向きに駆動する。空気シリンダ14によって発生 する圧力に加えて、空気シリンダ16によって発生する圧力は、反応室における 高圧レベルを決定する。水圧シリンダ圧力は、上限をおよそ1,500psiに 設定した状態で調整可能である。ピストン22の断面積に対する水圧ピストン1 6aの断面積の比は、28.4:1である。 反応モジュール12は、熱硬化性ジャケット42によって包囲され、反応室の の温度を調節する。ジャケット42は、インレットおよびアウトレット取り付け 部44、46をそれぞれ有し、それによって、流体が、温度調節加熱/冷凍浴( 図示せず)から、壁面13を包囲する室48に循環する。反応室12の上部およ び底部の周りには、熱硬化性ジャケット42に対して流体シールを提供するOリ ング52、54が設けられている。反応室12には、その温度をモニタするため にサーモカップル(図示せず)が取り付けられている。反応室12の温度は、お よそ+/−1℃の精度で、およそ−15℃から+40℃までの範囲内で調節され る。試料室15に加える圧力に抵抗するのに十分な厚さでありながら、熱硬化室 48から試料室15まで熱を伝達できるほど薄くなるように、壁面13の厚さ、 例えば、3/16”の厚さを選択する。壁面13の厚さおよびシール36の性能 により決定する反応モジュール12の最大許容圧力は、およそ40,000ps iである。 アセンブリの上部には、圧力トランスジューサ56、例えば、Sensote c,Inc.、Columbus、OHの部品番号HP5651−02−02で 入手可能な75,000psi、+/−0.5%精度ストレーンゲージ型トラン スジューサが取り付けられている。圧力トランスジューサ56は、反応モジュー ル12から取り外してポート12aに接近する。 図2を参照すると、水圧は、水圧ポンプ62により、水圧シリンダ16に送ら れる。水圧システム60は、モータ64によって駆動される水圧ポンプ62と、 流体貯蔵器63と、リリーフバルブ67と、チェックバルブ65と、圧力調整バ ルブ66と、圧力ゲージ68と、アキュムレータ70と、マニュアルバルブ71 と、4方向コントロールバルブ72と、水圧シリンダ16とを備える。 モータ64は、例えば、最大3,000psiで0.8GPMの出力の2HP 電気モータである。実際のシステム圧力は、圧力調整バルブ66でコントロール され、およそ1,500psiの設定上限まで変化可能である。 方向コントロールバルブ72は、例えば、PearseーPearson,I nc.(Milford、MA)のBosch部品#9810231072で入 手可能なデュアル電気ソレノイドによって起動する3位置ばねセンタリングスプ ールバルブである。両方のソレノイドを減勢した状態で、水圧シリンダポート1 9,19aは両方ともドレインライン74に連結され、またシンリンダピストン 16aは、移動自在である。使用する際、一方のソレノイドを付勢してポート1 9を加圧し、他方のソレノイドを減勢してドレインライン74に対してそれを開 き、ピストン16aを強制的に延ばし、それによって試料室15を加圧する。現 在、試料室の圧力をパルスするために、両方のソレノイドが減勢されるので、ピ ストン16aは移動自在であり、試料室15の圧力は、ピストン22を強制的に 下げて(空気シリンダ14によって加える圧力のレベルまで)室内の圧力を低下 させる。代わりに、他方のソレノイドを付勢してポート19aを加圧し、他方の ソレノイドを減勢してドレインパイプ74に対してそれを開き、ピストン16a を強制的に引っ込める。試料室15からの圧力の受動低下が好ましい。その理由 は、水圧応答時間がより速くなり、またピストン22とロッド32との継続的接 触により、ピストン、ロッド間に衝撃荷重が生じるのを回避するからである。方 向コントロールバルブ72は、時々、20msから25msまで迅速にスイッチ ングして、水圧シリンダ16に圧力を加えて、試料室15の圧力を低下させる。 方向コントロールバルブ72の近くには、水圧アキュムレータ70が取り付け られており、応答性を向上させ、圧力変動を抑える。アキュムレータ70は、例 えば、1クォート容量を有し、ポンプ62により、水圧システムライン圧力まで チャージされる。チェックバルブ65の存在により、ポンプ62をオフにした後 、アキュムレータ70はチャージしたままとなる。マニュアルバルブ71を用い て、アキュムレータをディスチャージし、水圧システムを減圧する。リリーブバ ルブ67は、ポンプ62から送られる最大圧力を制限する。 図3を参照すると、反応器10は、調整可能パルス幅およびデューティサイク ルを有するタイミングリレー80によって調節される。タイミングリレー80か らの出力は、方向コントロールバルブ72を調節する。圧力センサデータは、コ ンピュータまたはオシロスコープでモニタ可能である。空気シリンダ14および 水圧シリンダ16によって加えられる反応室圧力は、およそ+/−200psi の精度で調整可能である。圧力を高圧からパルシングした後、高圧にパルシング して戻す前に、低圧でのドエルが、およそ30msecから数分まで調整可能で ある・タイミング精度は、およそ+/−10msecである。 使用する際、例えば酵素を用いて、およそ50μlの試料を入れたカプセル1 7を、例えば、そのカプセル内の試料を凍結させて阻害温度に維持した状態で、 試料室15に配置する。その後、試料室15には、例えばシリコン油が充填され 、加えた圧力をカプセルに伝達可能とする。代わりに、酵素反応の開始を調節す るために、反応カプセルは、圧力を加えるまでDNAおよび酵素を偏析するバリ アを備えることができる。その時、圧力トランスジューサ56は反応モジュール 12に装着される。圧力を反応室15に最初に加えると、カプセルバリアが破裂 し、それによってDNAと酵素が化合することになる。 空気シリンダ14は、水圧シリンダ16が室12を加圧していない時、すなわ ち酵素が阻害されない時、室の圧力を調節する。酵素処理が、10,000ps iから20,000psiまでの圧力で減速し始めるので、DNA配列決定の間 、単一ベースステッピングを最適化するために反応を減速するのが望ましい場合 があり、空気シリンダ14は、パルシングの間、圧力降下の大きさを制限する働 きをする。このように、(空気シリンダ14および水圧シリンダ16によって加 えられる)阻害圧力のレベルと、(空気シリンダ14によって加えられる)活性 化圧力との両方を個別に調節可能である。 図4を参照すると、好ましい別の実施例では、コンピュータコントロールフロ ースルー圧力サイクリング反応器100は、圧力変調フロー環境における選択し た物質の試料を反応することが可能な電空動作の流体処理装置である。流体ポン プおよびバルブの配置を利用して、試料を、静止した、または迅速に変化する圧 力環境に維持すると同時に、様々な試薬に晒すことも可能である。流体圧力は、 およそ40,000psiのレベルまで調整可能であり、流体圧力は、かなり低 いレベルまで迅速に低下し、その後、およそミリ秒で、より高いレベルに戻るこ とが可能である。空気システムについて述べているが、他のシステム、例えば水 圧システムも採用可能であることが理解される。 圧力サイクリング反応器100は、キャビネット101を備えており、このキ ャビネット101には、反応容器102と、第1の容器加圧器インジェクション ポンプ/バルブモジュール104と、第2の容器加圧器ドレインポンプ/バルブ モジュール106とが取り付けられている。モジュール104および106の役 割は逆転できることが理解される。空気バルブモジュール108における一連の 空気バルブ107は、さらに以下で述べるモジュール104、106において流 体ポンプおよびバルブを調節する、キャビネット101に取り付けた圧力伝達空 気シリンダ126、128、130、156、158および160に加圧ガスを 向けてそれと切り換える。キャビネット101に取り付けた流体貯蔵室114、 116は、ポンプ/バルブモジュール104、106にそれぞれ試薬を供給する 。 圧力源118、例えばエアコンプレッサまたは圧縮ガスボトルは、流体貯蔵室 114、116を加圧し、また空気バルブ107に圧力を供給する。流体貯蔵室 は、例えば、ほぼ10psiまで加圧して、フローを助長して、フロー経路が真 空状態にならないようにする。バルブモジュール、空気バルブおよび流体貯蔵室 は、以下で述べるように、クランプ260に取り付ける。 コンピュータ110は、圧力パルシングおよび流体フローのタイミングを計っ てコントロールし、システムの状態をモニタする。2個の信号条件付け装置11 2、113は、入力および出力信号の増幅およびスケーリングを提供する。 ディスプレイパネル300は、圧力ゲージ302、304、306を備えてお り、これらは、流体貯蔵室114、116および空気バルブ107に加えた圧力 をモニタする。ノブ308、310、312は連続する圧力レギュレータ180 、182、184を調整し(図5A参照)、この圧力レギュレータ180、18 2、184は、流体貯蔵室114、116および空気バルブ107に加える圧力 を調節する。ノブ314は、バルブ118cの閉塞を調整する(図5A参照)。 ディジタルディスプレイ316は、圧力トランスジューサ188に示すように反 応容器102内の圧力を表示する(図5参照)。パワースイッチ318、例えば 照明ロッカースイッチは、マスターパワースイッチ、データ獲得パワースイッチ および空気バルブパワースイッチである。インジケータライト320は、空気バ ルブの状態を示し、マニュアルオーバライドプッシュボタンスイッチとしても作 用する。 図5を参照すると、インジェクションポンプ/バルブモジュール104(図4 参照)は、水圧を発生して流体経路190に沿って流体を移動させるためのピス トン型インジェクションポンプ120と、それぞれ流体の移動をコントロールし て流体経路190内の圧力をシーリングするための高圧オンーオフインジェクシ ョンポンプインレットおよびアウトレットバルブ122、124とを備えている 。インレットバルブ122は、バルブ174(以下で述べる)からインジェクシ ョンポンプ120まで延びるコンジット121内に配置され、アウトレットバル ブ124は、インジェクションポンプ120から反応容器102まで延びるコン ジット123内に配置される。ポンプ120は、コンジット121および123 と連通する。空気シリンダ126は、機械的力を与えてポンプ120を駆動し、 空気シリンダ128はポンプインレットバルブ122を作動し、空気シリンダ1 30はポンプアウトレットバルブ124を作動する。位置センサ131は、イン ジ ェクションポンプ120が底の手前にある時、すなわちポンプ120のピストン 120bがほぼ最大限まで延びている時、信号を送る。 空気バルブモジュール108内に配置した4方向空気バルブ132、136お よび138は、圧力源118からシリンダ126、128および130まで、さ らにシリンダ126、128および130からのガスのフローをそれぞれコント ロールして、シリンダロッド126c、128cおよび130cの運動をそれぞ れコントロールする。例えば、バルブ136に関して、第1のフロー経路(矢印 136a)が、シリンダ128の第1の室128aを加圧してバルブ122を開 じ、第2のフロー経路(矢印136b)が、シリンダ128の第2の室128b を加圧してバルブ122を開き、排出ポート136cが大気にベントを開く。 キャビネット101に配置した3方向空気リリーフバルブ134は、正または 負の圧力パルスを発生するために、圧力を迅速に低下させ、シリンダ126の第 1の室126aをリチャージすることができる。キャビネット101に配置した 3方向空気バルブ140により、室126aの圧力をゆっくりと低下させる。バ ルブ132を貫通する第1のフロー経路132aは、バルブ134および140 を矢印134aに沿ったガスフローを与えるように位置決めした状態で、シリン ダ126の第1の室126aを加圧してポンプ120のピストン120bを延ば し、第2のフロー経路132bは、シリンダ126の第2の室126bを加圧し てピストン120bを引っ込める。ピストン120bは、圧力室シリンダ120 aの体積をコントロールする圧力室壁面120cを定める。 同様に、ドレインポンプ/バルブモジュール106は、ピストン型ドレインポ ンプ150と、高圧オン・オフドレインポンプインレットおよびアウトレットバ ルブ152、154とを備える。インレットバルブ152は、反応容器102か らドレインポンプ150まで延びるコンジット151内に配置され、アウトレッ トバルブ154は、ドレインポンプ150からバルブ178(以下で述べる)ま で延びるコンジット153内に配置される。ポンプ150は、コンジット151 および153と連通する。空気シリンダ156は、機械的力を与えてポンプ15 0を駆動し、空気シリンダ158はポンプインレットバルブ152を作動し、空 気シリンダ160はポンプアウトレットバルブ154を作動する。位置センサ1 61は、ドレインポンプ150が底の手前にある時、すなわちほぼ最小の容積で ある時、信号を送る。流量およびフロー速度は、ポンプ120および150によ りコントロールされる。ポンプ150のピストン150bは圧力室壁面150c を定め、これによって、可変容積圧力室ポンプシリンダ150aの容積をコント ロールする。シリンダ150aの最大容積は、反応容器102における流体の容 積よりも実質的に大きい。 空気バルブモジュール108に配置した4方向空気バルブ162、166およ び168は、圧力源118から、シリンダ156、158および160までの、 さらにシリンダ156、158および160からのガスのフローをそれぞれコン トロールして、シリンダロッド156c、158cおよび160cの運動をそれ ぞれコントロールする。3方向空気バルブ170により、シリンダ156の第1 の室156aから圧力をゆっくりと低下させる。 流体貯蔵室114は、多数のタンク172を備える。貯蔵室114に取り付け たマルチポジションバルブ174を用いて、望ましいタンク172を選択する。 流体貯蔵室116は、多数のタンク176を備える。貯蔵室116に取り付けた マルチポジションバルブ178を用いて、望ましいタンク176を選択する。マ ルチポジションバルブ174および178、例えば8個のポジションフェースバ ルブまたはテーパードプラグバルブも、フロー経路190が大気に通じるように 位置決め可能である。 圧力レギュレータ180、182および184は、さらに以下で述べるように 、空気シリンダ126、128、130、156、158および160ならびに 流体貯蔵室114および116への圧力を調整する。調整可能リリーフバルブ、 例えばマニュアルスプリング負荷プランジャバルブ186または電子コンピュー タコントロールバルブは、負の流体システム圧力パルスの下限を決定するシリン ダ126からの排気圧力を調整する。 圧力トランスジューサ188は、例えば、反応容器102に連結した上記のス トレインゲージ型トランスジューサ56のような高速応答圧力トランスジューサ は、試料圧力をモニタする。 図5Aは、空気プランビングを示す。供給源118からのガスは、圧力をおよ そ200psiまで低下させる圧力レギュレータ118aと、ガスをフィルタリ ングしてガスから水分を除去するドレイン119を有するガスフィルタ/水分分 離器118bと、マスターバルブ118cとを介してレギュレータ180、18 2および184に送られる。レギュレータ180を流れるガスはシリンダ126 および156を加圧し、レギュレータ182を流れるガスはシリンダ128、1 30、158および160を加圧し、レギュレータ184を流れるガスは流体貯 蔵室114および116を加圧する。バルブ132および162は、シリンダ1 26および156のどの室をそれぞれ加圧するかをコントロールする。バルブ1 36、138、166および168は、シリンダ128、130、158および 160のうちのどの室をそれぞれ加圧するかをコントロールする。 ポンプ空気シリンダ126および156への圧力は、およそ50psiから1 50psiまでの範囲で設定可能であり、それによって、反応室の阻害圧力をお よそ20,000psiから60,000psiまでの範囲に設定可能となる。 圧力レギュレータ182は、およそ150psiをバルブシリンダ128、13 0、158および160に送るように設定する。上記のように、貯蔵室圧力をお よそ10psiに設定する。圧力レギュレータは、手動調整可能であるか、また はコンピュータ制御も可能である。 図6を参照すると、ポンプ/バルブモジュール104および106ならびにシ リンダ126、128、130、156、158および160の機械的構造を示 している。反応容器102の一方側の構造は、反応容器の他方側の構造の鏡像で あり、ポンプ/バルブモジュール104およびシリンダ126、128および1 30のみについて述べる。シリンダ126によって駆動されるポンプ120と、 シリンダ128によって駆動されるバルブ122と、シリンダ130によって駆 動されるバルブ124とが、ポンプ/バルブモジュール104のハウジング25 0内に取り付けられる。 図6Aを参照すると、ハウジング250は、コンジット121および123( 図5)によって定められた流体経路252と、コンジット121のアーム252 aにおける流体インレット254とを備える。バルブ122は、バルブプランジ ャ256を備え、このバルブプランジャ256は、流体インレット254をブ ロッキングする延長位置と、流体がインレット254を通過するのを可能にする 引っ込み位置との間で移動する。バルブ124はプランジャ258を備え、この プランジャ258は、反応容器102に至るコンジット123におけるフローを ブロッキングする延長位置と、反応室にフローを与える引っ込み位置との間で移 動する。ポンプ120のピストン120bを用いて、流体経路252を加圧する 。コンジット123の流体アウトレット251は、ハウジング250によって定 められた反応室シート253に至る。 ハウジング250は、例えばステンレス鋼から形成されている。バルブ122 および124のプランジャ256および258は、例えば熱処理したステンレス 鋼から形成されている。バルブ122および124は、例えばステンレス鋼で形 成したパッキング圧縮ナット270と、例えば青銅合金で形成したパッキングス ペーサ272と、例えばテフロンで形成したバルブプランジャパッキングディス ク274とを備える。ポンプ120のピストン120bは、例えば熱処理したス テンレス鋼から形成されている。ポンプ120は、例えばステンレス鋼で形成し た保持ナット276と、例えば青銅合金で形成したシールスペーサ278と、ピ ストンシール36とを備える(図1A参照)。ポンプシリンダ120は、ハウジ ング250内のボアによって定められている。 図6B及び図6Cを参照すると、試料の性質や反応に依り、様々な大きさや型 式の反応室を利用できる。図6Bに示すように、反応容器102は、試料室33 0を定める第1の部分102aと、第2の部分102bとを備える。試料室22 0は、数百マイクロリットルまでの試料容積を収容できる。2つの部分は、ねじ 切りして係合され、Oリングシール332でシーリングされる。この2つの部分 は、流路334を定める。図6Cは、通過するためではなく圧力パルシングのた めに設計した反応容器102の構造を示す。第1の部分402は試料室430を 定め、第2の部分404は、試料室430と連通して流路434を定める。2つ の部分は、ねじ切りして係合され、Oリング432でシーリングされる。 図6Bを再度参照すると、反応容器102は、周囲の流体ジャケット336に よって温度調節される。代わりに、熱電加熱および冷却を採用することが可能で あり、または温度を調節するために空気浴を利用することが可能である。外界温 度で、またはそれより高いか、もしくは低い温度で、反応を行ってもよい。温度 センサ338、例えば、熱電対、サーミスタまたはRTDは、反応容器102の 温度をモニタする。ポンプ/バルブモジュール104および106、ならびに貯 蔵室114および116もまた、上記方法のうちの1つによる温度調節のための 温度コントローラ402および温度センサ404を備えるのが好ましい(図6参 照)。 図7を参照すると、クランプ260は、ポンプ/バルブモジュール104、シ リンダ126、128および130、ならびに流体貯蔵室114を取り付けた固 定端部262と、ポンプ/バルブモジュール106、シリンダ156、158お よび160ならびに流体貯蔵室116を取り付けた可動端部264とを備える。 反応室シートにおけるポンプ/バルブモジュール間に反応容器102を配置し、 クランプを締め付けて、モジュール間の反応室を保持し、シーリングする。クラ ンプ260は、エアクランプマシンバイスであり、マシンスクリュ(ヘックスシ ャフト266)で手動で大きく調整し、マルチステージタンデムエアシリンダ2 68で最終クランピングを行う。レギュレータ182からの空気は、クランピン グシリンダに圧力を加えるマニュアルバルブである空気オン・オフバルブ261 を通過することにより、クランプエアシリンダをコントロールする。最大クラン ピング力は、およそ5,000ポンドである。このクランピング機構は、反応容 器102を迅速に交換し、様々な大きさの反応室を考慮することも可能である。 使用する際に、反応を行う試料を反応容器102を入れ、反応室を流路に取り 付けた状態で、一般に流体が流体貯蔵室114から高圧バルブ122および12 4と、反応容器102と、高圧バルブ152および154とを介して流れ、バル ブ178を介して排出される。しかし、システムシンメトリは、反対方向での同 じフローにも備える。図8を参照すると、流路190(図5)を通過する流体の フローは、まず200で流路に流体を充填し、202で流路を加圧し、反応容器 102における204での圧力パルスの生成と206での反応室を通過する流体 の移動とを交互に繰り返す。 図9を参照すると、流路190に流体を充填するために、貯蔵室114からの 流体のアリコートを、バルブ124、152および154を閉じ、バルブ122 を開き、シリンダ126を用いてポンプ120のピストン120bを引っ込めて ポンプ120の可変容積圧力室ポンプシリンダ120aに引き入れる(工程1) 。このアリコートが反応室を通過して流れるためには、バルブ122を閉じ、バ ルブ124、152、154を開き、バルブ178をそのドレーン位置に配置す る。ポンプ120のピストン120bは、その時、延在し、ポンプシリンダ12 0aの内容物を反応室から排出する(工程2)。この動作により、バルブ174 、178間の流路190を充填する。これは、反応容器102が加圧可能となる 前に、必要である。 反応室の加圧は、以下のようにして行われる。バルブ124、152および1 54を閉じて、バルブ122を開く。その後、ポンプ120のピストン120b を引っ込めて、ポンプシリンダ120aに貯蔵室114からの流体を充填する( 工程3)。バルブ122を閉じ、シリンダ126を加圧してポンプ120のピス トン120bを延ばし、バルブ124を開く(工程4)。ポンプ120のピスト ン120bは、流路190における流体の非圧縮性により、ほんの僅か内側に移 動する。反応容器102を加圧する。圧力レベルは、レギュレータ180のガス 圧設定の関数である。 ポンプ120を用いてブリーフ減圧パルスを生成することにより、反応室10 2内にブリーフ圧力パルスを生成することもできる。圧力パルシングのために、 バルブ122および152を閉じ、バルブ124を開き、ピストン120bを延 ばした状態で、バルブ134を瞬間的に駆動して(工程5)、流路134bを開 いて、シリンダ126の加圧側(室126a)をリリーフバルブ186を介して 空中に晒し、その後、そのフロー位置に戻って、経路134aに沿ったフローを 与えて、室126aを再加圧する(工程6)。排出間隔において、ピストン12 0bの流体圧によって、ピストンが十分な量だけ引っ込み、反応容器102の流 体圧を緩和する。しかし、リリーブバルブ186は、シリンダ126のガス圧の 低下を順に制限し、反応容器102の流体圧の低下を順に制限する。このように 、リリーフバルブ186の設定により、負に向かう圧力パルスのためのベースレ ベルを確立する。ガス圧がシリンダ126に再度加えられると、反応室はその前 の圧力レベルに戻される。 圧力をかけて反応容器102を保持しながら、ポンプシリンダ120aから反 応容器102に、またそれを通過して流体を移動させるために、シリンダ156 を加圧して、ポンプ150のピストン150bを内側に駆動する(工程7)。そ の後、バルブ152を開く(工程8)。シンメトリのため、ピストン120bに かかる力はピストン150bにかかる力によって相殺され、流体フローが生じな い。バルブ170をそのベント位置に切り換えることにより、シリンダ156の 加圧した端部156aは、オリフィスを介して大気へとゆっくりベントを開くこ とになる。ガスを放出すると、ピストン120bは遅い速度で延び、ピストン1 50bは引っ込む。ポンプシリンダ120a内の流体は、反応室120を通過し てポンプ150のポンプシリンダ150aに送られる。ピストン120bが底に 到達する直前に、位置センサ131が駆動され、電気信号を送る。この電気信号 は、バルブ152を閉じ、バルブ170を切り換えてベントポートを閉じ、ポン プ150に圧力を再度加える(工程9)。反応室の圧力は、ポンプ120によっ て維持され続けることに注目されたい。 ポンプシリンダ150a内の流体は、バルブ154を開いて、バルブ178を 介して流体を排出させることにより放出する(工程10)。ピストン150bが 底に到達する直前に、センサ161が信号を送って、バルブ154を閉じる。ピ ストン150aが延び続けて、ポンプ154および152間でコンジット153 および151において流体を加圧する。その後、バルブ152を開き、バルブ1 24を閉じて、次の流体伝送サイクルを開始する(工程11)。反応室圧力をポ ンプ150によって維持する。ポンプ120は、今まさに、流体貯蔵室114か らの試薬を再度充填されようとしている。別の圧力パルスを生じるために、バル ブ122が開いて、ピストン120bが引っ込み、その後、バルブ122が閉じ 、バルブ124が開き、バルブ152が閉じて、工程4から処理を繰り返すこと が可能となる。 一定の反応に対しては、システムから過度に放出する前に、反応室を介して流 体のアリコートを前後に数回移動させることが望ましい場合がある。これは、試 料、試薬間の混合を改良することが望ましい場合に当てはまる。これを達成する ために、ポンプ120から反応容器102を通過して試薬を搬送すると、ポンプ 150には超過分が含まれた状態で、バルブ124および152を開き、バルブ 122および154を閉じ、シリンダ156を加圧してピストン150bを延ば し、バルブ140を切り換えてシリンダ126からオリフィスを介してガスを流 すことによって試薬を逆流させる。 一定の反応に対して、ある型式の試薬を一方向に流し、異なる試薬を反対方向 に流すのが望ましい場合には、流体貯蔵室116を設けて、装置の通常の下流端 部に流体源を備える。 図10を参照すると、コンピュータ110をコントロールして流体システムの 機能的構成部分を作動する。圧力と、温度と、位置センサ131および161で 示すピストン120bおよび150bの位置とをコンピュータ110に入力する 。空気バルブ132、134、136、138、140、162、166、16 8および170をコントロールするための電気信号をコンピュータ110によっ て出力する。流体の配列決定および時間圧力プロファイルは、オペレータプログ ラマブルである。レギュレータ180を自動的にコントロールして、圧力センサ からのフィードバックを用いて反応室の望ましい圧力レベルを設定する。 C.使用 開示した反応器を用いて、核酸配列決定、核酸合成、タンパク質配列決定、酵 素キラル合成およびラセミ混合物の鏡像異性体精製を含む化学反応を調節する。 非酵素反応も、調節可能である。 反応容器の内容物に圧力を加えた場合の望ましい効果として、タンパク質アン フォールディング、タンパク質フォールディング、酵素の可逆阻害、酵素の活性 化、反応速度の変動および非酵素反応の熱力学平衡が挙げられる。圧力誘導阻害 とは、一つの酵素反応工程か、いくつかの配列決定酵素反応工程か、または完全 酵素事象を阻害することである。さらに、阻害圧力は、個々の反応分子(例えば 、酵素、共同因子、または第1もしくは第2の基質)の活性を同期することがで きる。圧力が許容圧力に変化すると、多数の酵素分子がほぼ同時に作用し始め、 その結果、酵素の活性をより均一に、正確に、しかも再現可能に調節する。基質 に対して酵素がモル過剰であるならば、通常、同期作用を増進する。酵素反応工 程は、生成物(P)を形成するために酵素(E)と基質(S)との反応に必要な 機 械論的工程を含む。これらの工程は、完全酵素事象に依り、E、S、Pの配座変 化およびその組み合わせ;E−SおよびE−Pの会合または解離;共同因子とS またはEの相互作用;S、E、共同因子間の相互作用;E、Sまたは共同因子と の溶媒相互作用;Eと、S、溶媒または共同因子等の試料混合物の成分とのプロ トン交換;EとSとの触媒相互作用を含む。酵素事象に依り、2つ以上の基質( S、S’、S”等)、2つ以上の生成物(P、P’、P”等)および2つ以上の 共同因子が存在可能である。さらに、いくつかの実施形態では、2つ以上の溶媒 または溶質(例えば、塩または金属イオン)および圧力と関連する温度を用いて 、酵素反応工程を調節する阻害または許容状態を提供する。 同様に、試料混合物の圧力を、酵素反応工程を行うことが可能な圧力に変化さ せることで、次の酵素反応工程、一連の酵素反応工程、または1つ以上の完全酵 素事象を行うことが可能となる。一般的な方法を用いて、望ましい一連の単一酵 素事象をプログラミングすることにより、酵素の活性を調節することができる。 高圧処理によって、多くの生体高分子、例えばタンパク質、酵素、抗体およびポ リヌクレオチドが生じ、これらは1気圧で自然に作用してアンフォールドまたは 変性する。このようなアンフォールディングによって、例えば酵素の活性を阻害 する。逆に、いくつかの酵素またはタンパク質、特に高圧で自然に作用するもの (例えば、深海ベント生物体において)を、低圧で阻害することが可能である。 一般に、濃度、緩衝液、溶媒、酵素、基質および他の添加剤または促進分子が 、従来技術において良く知られている。しかし、通常の酵素濃度よりも高くなる と、より均一で再現可能な結果が得られることになる。従来技術においては、核 酸、マーカー、リンカー、プライマ、緩衝液、アミノ酸、保護基、溶媒、酵素お よび関連の他の試薬に対する商業上の供給源に精通している(例えば、Aldr ich、Milwaukee、WI;Pharmacia Biotech、P iscataway、NJ;Promega Corp.,Madison、W I;Sigma、St.Louis、MO;およびStratagene、La Jolla、CA)。 1.検出 反応の過程および反応の生成物をモニタしたい場合、圧力サイクリング反応器 は、流体に存在するか、または反応容器から除去される成分の特性を検出するた めに連結した検出器400(図10参照)を備える。検出器は、コンピュータ制 御され、分析した成分に関する情報をコンピュータにリレーすることができる。 このように、反応容器内での圧力パルスの前に、その間に、またはその後に、成 分を分析することが可能である。成分はまた、反応容器から除去した後に分析す ることも可能である。検出器の例として、放射性同位体検出器、赤外分光計、質 量分析計、ガスクロマトグラフィー質量分析計、分光光度計、分光蛍光計、電気 化学検出器、表面プラスモン共振検出器および光度計が挙げられる。 2.試薬提示および生成物分離 圧力サイクリング反応器が、再使用可能または未使用の反応物を反応生成物か ら分離するための手段を備えている場合、反応物を効率的に使用することができ る。圧力サイクリング反応器は、容器から流体を除去しながら反応容器内で試薬 を保持するために抑制剤331(図6B参照)を有する反応容器を備えることも 可能である。抑制剤の例として、大きさ、電荷、極性、キラリティーまたはその 組み合わせによって試料混合物成分を分離する膜またはマトリックス等の半透性 (すなわち分離)物質が挙げられる。 半透性物質は、フィルタまたはネット状に試料容器または反応容器の全断面積 を占有することも可能である。抑制剤331、例えば半透性バリアは、反応容器 を2つの部分に分割することができる。2つ以上の半透性バリアは、反応容器を 3つ以上の部分に分割する。 例えば、反応容器または室は、少なくとも2つの異なる膜の間で、反応容器内 に保持した固定化基質を入れることが可能である。1つの膜は、酵素および生成 物または小さい分子が通過できる細孔を有する。他の膜は、生成物または小さい 分子のみが通過する細孔を有する。 さらに、半透性物質は、反応容器または試料容器の壁面に装着したポーチまた はバッグ(固定しているか、可撓性であるかのいずれかである)であってもよい 。例えば、反応容器は、固定化反応物もしくは試薬(酵素もしくは基質のいずれ か)を有する多孔プラスチックもしくはガラスプラグ;または固定化反応物を含 有する多孔膜を支持する反応容器の内面上の膜支持物を含むことが可能である。 さら に、他の例として、固定化試薬を含有する堅い中空の多孔フリットが挙げられ、 このフリットは、反応室または容器の内面に装着される。いくつかの実施形態で は、抑制剤を移動して半透性バリアを提供し、その後、一連のプログラミングし たサイクルの間、一時的に除去して、反応容器または試料容器からすべての成分 を自由に流し出すことが可能である。 分離物質は、一般に、試料混合物成分に関して化学的に不活性であり、また特 定の応用において阻害圧力と同じほど高い流体圧力に構造上耐える。サイズ識別 膜またはフィルムは、0.5KDから300KDまでの分子量カットオフで入手 可能なDIAFLO(登録商標) 限外濾過膜(Amicon、Beverly 、MA)を含む。例えば、膜は、遊離ヌクレオチドまたはアミノ酸から酵素を、 また遊離酵素および遊離ヌクレオチドまたは溶液中のアミノ酸から固定化基質を 分離することが可能である。膜またはマトリックス等の分離物質は、試料混合物 の成分と相互作用する物質または共有結合した配位子が含浸もしくはコーティン グされ、またそうでない場合は、その配位子を用いて、より機能的となる。非対 称表面特性または非対称細孔チャネル疎水性、親水性、サイズ等を有する物質を 使用することも可能である。半透性物質は、カラムクロマトグラフィーの類似体 を含むことも可能であり、少なくとも1つの試料混合物成分が溶離される充填物 質を用いてキラル分離を達成する。 調節される反応と、選択した抑制剤の制限特性に依り、除去した流体は、ヌク レオチド、アミノ酸、酵素、非結合酵素基質、共同因子および種々の溶媒または 塩を含むことが可能である。同様に、試料混合物の保持成分は、溶媒、塩、酵素 、遊離基質または固定化試薬を含むことも可能である。固定化試薬は、非液体支 持部に装着した有機化合物を含む。支持物の例として、ポリマー、複合体、プラ スチックもしくはガラスビーズ、マトリックス、ボード、またはシリンダもしく はチューブを含む他の形状が挙げられる。 いくつかの実施の形態では、溶離した成分が、さらなる圧力処理のための次の 試料容器に直接流れ込む。反応容器を通過して高圧で流体を流す能力は、酵素事 象の調節に加えて分離を援助するための高圧液体クロマゴグラフィーに類似した 方法で用いることが可能である。 高圧を含むいかなる圧力でも、また圧力パルスに関していかなる時にも(すな わち、1つ以上の酵素反応工程を行う前、その間、またはその後)、分離は発生 し得る。各圧力パルスの後、または所定数の圧力パルスの後にも、分離は発生し 得る。 3. 実施の形態 これらの反応に対して、第1および第3の圧力のみ、または外界温度以下との 組み合わせでは、酵素の活性を阻害するのに十分であるが、第2の圧力のみ、ま たは第1の温度よりも高い温度との組み合わせでは、阻害しないため、酵素は基 質上で作用することになる。 本発明は、DNA配列を決定するための開示した反応器を用いる方法を特徴と する。Hind IIIのような制限エンドヌクレアーゼは高圧状態によって可 逆的に阻害可能な分布酵素である(実施例7参照)。ポリヌクレオチドの配列決 定のためのエキソヌクレアーゼは、ラムダエキソヌクレアーゼ、E.coliの エキソヌクレアーゼI−III、ヌクレアーゼBal−31、エキソリボヌクレ アーゼ、DNAポリメラーゼのエキソヌタレアーゼの活性を含む。例えば、エキ ソヌクレアーゼIIIは、25℃で30,000psiおよび40,000ps iで阻害される分布酵素である。減圧した後に活性が検出されたことに基づいて 、この圧力誘導阻害は可逆的である。 遺伝子ブラウジングの方法によれば、ある領域に制限エンドヌクレアーゼ処理 を行い、その後、配列を決定する。エンドヌクレアーゼを繰り返し除去し、配列 決定酵素を導入して、ポリヌクレオチド全体の配列決定を行うことなく長い核酸 中の所定位置をスポット分析することができる。この配列マッピングまたは遺伝 子ブラウジングの方法は、固定された大きな核酸基質を含有する試料混合物を与 える工程と、制限酵素で基質を開裂する工程と、試料容器から制限酵素と開裂生 成物とを除去する工程とを含む。この方法は、ラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧 力下でラムダエキソヌクレアーゼを添加する工程と、圧力をラムダエキソヌクレ アーゼ作用圧力に変化させ、それによって固定化核酸から所定平均数のヌクレオ チド(好ましくは1つのヌクレオチド)を脱離させる工程と、圧力をラムダエキ ソヌクレアーゼ阻害圧力に変化させる工程と、脱離したヌクレオチドを除去し分 析する工程とをさらに含む。 配列決定の他の方法は、確証的配列決定である。この方法によれば、5’−3 ’活性の進行的ラムダエキソヌクレアーゼは、二重鎖DNAに優先的に作用して 、単一ヌクレオチドを除去する。その後、3’−5’活性の進行的エキソヌクレ アーゼI(マグネシウム依存)は、現在露出している一本鎖DNAに作用して、 単一ヌクレオチドを除去する。Exo Iは、ラムダエキソヌクレアーゼが終結 した場所、またはその近くの二重鎖領域で停止する。このように、一本鎖が配列 決定され、相補的鎖もまた配列決定されて、第1の配列を確認する。 この方法は、固定化核酸基質を含有する試料混合物およびラムダエキソヌクレ アーゼ阻害圧力でラムダエキソヌクレアーゼを供給する工程と、圧力をラムダエ キソヌクレアーゼ作用圧力に変化させる工程と、圧力をラムダエキソヌクレアー ゼ阻害圧力に変化させる工程と、脱離した1つ以上のヌクレオチドを除去して分 析する工程とを備える。ヌクレオチド除去および分析が後に続く1つ以上の反復 圧力パルスまたは圧力サイクルの後、0.2M−0.5M NaCl溶液等の溶 離液、その後67mM グリシンKOH、pH9.5、10mM 2−メルカプ トエタノールおよび6.7mM MgCl2等のExo I緩衝液を用いて、試 料混合物からラムダエキソヌクレアーゼを除去する。試料容器には、エキソヌク レアーゼI−阻害圧力での3’−5’活性のエキソヌクレアーゼが含まれ、圧力 がエキソヌクレアーゼ許容圧力に変化し、圧力がエキソヌクレアーゼ阻害圧力に 変化し、放出したヌクレオチドが除去され、分析される。 さらに別の配列決定方法は、プローブ配列決定と、プライマ伸張プローブの配 列決定との両方を含む。プローブ配列決定は、既知の突然変異部位(例えばシス チックフィブロシス)に対応するプライマの組として、一本鎖オリゴヌクレオチ ドを採用する。この方法によれば、患者のDNAの1つ以上の一本鎖転写をPC R生成物から単離して固定化する。患者次第で、既知のDNA一本鎖プローブ基 を用いた反応が一本鎖プローブのハイブリダイゼーションを全く生じないか、ま たは1つ以上の一本鎖プローブのハブリダイゼーションを生じ、二重鎖領域を有 する核酸生成物が生じる。二重鎖部分は、例えば3’−5’鎖上の5’−3’酵 素を用いて選択的に配列決定される。 従って、この方法は、領域を表す固定化一本鎖PCRアンプリコンを含有する 試料混合物を供給する工程と、既知の突然変異および野生型を含む1組のオリゴ ヌクレオチドプローブを試料混合物に添加する工程と、ハイブリッド形成してい ないオリゴヌクレオチドを除去する工程と、3’−5’エキソヌクレアーゼを任 意に添加する工程と、ラムダエキソヌクレアーゼ阻害圧力で、ラムダエキソヌク レアーゼ(5’−3’)を含有する試料混合物を供給する工程と、圧力をラムダ エキソヌクレアーゼ許容圧力に変化させる工程と、圧力をラムダエキソヌクレア ーゼ阻害圧力に変化させる工程と、放出または脱離した1つ以上のヌクレオチド を除去し分析する工程とを備える。第1のプローブ配列が完了するまで、配列決 定工程を繰り返す。次の組のプローブは、ハイブリッド形成され、洗浄される。 一本鎖は、次の二重鎖領域に到達するまで、3’−5’エキソヌクレアーゼで消 化される。その後、ラムダエキソヌクレアーゼ5’−3’を上記のように用いて 、二重鎖領域を分析する。この方法は、オペレータ工程が少ないため、PCRお よび他の増幅技術よりも速い。 可変領域において既知の突然変異に対応する種々の一本鎖オリゴヌクレオチド に配列5’を用いて、プライマ伸張プローブを配列決定する方法に、圧力サイク リング反応器を使用することが可能である。通有プライマプローブは、PCR生 成物からの患者の一本鎖DNAと反応し、患者のDNAは単離され、固定化され る。低ストリンジェンシー状態で反応を行って、通有プローブの非適合を調節す る。プローブは、その領域を介して伸張し、伸張したプライマは、エキソヌクレ アーゼIIIと3’−5’方向に配列決定される。この配列分析は、その領域に おける、既知および未知の突然変異を検出する。 上記実施例に基づいて、圧力サイクリングまたは圧力パルシングの基本原理は 上で詳細に述べているので、この方法の他の実施の形態を以下のように要約する ことができる。上記各工程は、組み合わせてもよいし、さらに別の工程に分割し てもよい。領域のPCRアンプリコンを単離して固定化する。オリゴヌクレオチ ドプライマを固定化アンプリコンと反応させる。ハイブリッド形成されていない プローブを洗浄または溶離によって除去する。ヌクレオチドおよびDNAポリメ ラーゼ(例えば、VentR、New England BioLabs)を、 阻害圧力をかけて試料混合物に供給する。圧力パルスを採用して所定数のヌクレ オチドをプライマに添加する。遊離ポリメラーゼおよびヌクレオチドを洗浄によ って除去する。阻害圧力をかけて、エキソヌクレアーゼIIIを試料混合物に供 給する。圧力パルスを採用して、伸張したプライマから単一ヌクレオチドを脱離 する。放出したヌクレオチドを除去し、分析する。 部分的消化を行う方法を、以下で述べる。定型的な方法では、重要な試料の調 製(一般に500塩基対の読みとり長さ(read−lengths)に対する 切断、単離、精製およびマッピング)、配列決定、ならびにデータ分析(ギャッ プの解読、曖味な配列の解読)を必要とする。本発明は、これら3つの工程の各 々に、例えば長い読みとり長さのテンプレート(例えば、2,000、10,0 00、25,000、50,000またはそれ以上の塩基)を与え、配列決定の 際、酵素反応を調節し、単一のヌクレオチドを一度に放出し、検出して分析を簡 素化することにより影響を与える。ゲル電気泳動は必要ない。5000個の塩基 を数時間以内で(例えば2時間未満または1時間未満)配列決定することが可能 である。上記改良の結果、配列決定した1つ塩基についてのコストも削減される 。 開示した反応器の他の実施の形態は、DNAの合成に用いる。Eco III およびDNAジデオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ(ターミナル トランスフェラーゼ、例えばEC2.7.7.3)等の分布酵素は、高圧で可逆 的に阻害され、後者の酵素は、DNA合成のための鋳型を必要とはしない。DN Aを合成する方法は、(a)支持部(例えば、ビーズ、マトリックスまたは表面 )上で固定化された開始因子(例えばプライマ)を含有する試料容器と、(b) 固定化開始因子の下流で、酵素を遊離ヌクレオチド(例えば、5、10、15、 20または25KD)を分離するのに十分な分子量カットオフを有する半透性物 質と供給する工程を備える。試料容器はまた、ターミナルトランスフェラーゼの 超過量(例えば、開始因子の3’端部1モルあたり少なくとも2モル当量)も含 有する。ヌクレオチドを含有する溶液を、ターミナルトランスフェラーゼ阻害圧 力をかけて試料混合物に添加する。圧力をターミナルトランスフェラーゼ許容圧 力に変化させ、この圧力は、1つのプライマにつき所定平均数のヌクレオチド( 例えば、1つのプライマにつき1つのヌクレオチドまたは単一の完全酵素事象) を 取り込むのに十分な時間だけ、保持される。試料容器圧力をターミナルトランス フェラーゼ阻害圧力に変化させた後、取り込まれていない、または遊離したヌク レオチドを(阻害圧力を保持した状態で)試料容器から洗浄、除去し、一方、酵 素は半透性物質によって試料容器内に保持する。次に望ましいヌクレオチドを試 料混合物に添加して、望ましいオリゴヌクレオチドを形成するまでサイクルを繰 り返す。 いくつかの組み合わせた実施の形態では、試料容器は異なる複数の固定化開始 因子を含めることができる。各開始因子に同時に一つのヌクレオチドが付加され 、その結果これら開始因子には共通のオリゴヌクレオチド配列セグメントが形成 される。半透性物質は、下流バリアとして表すことも可能であり、また試料容器 は半透性物質から形成した複数の分子量カットオフポーチを含むことも可能であ り、このポーチは、一定量のターミナルトランスフェラーゼおよび1つ以上のプ ライマを含む。ポリヌクレオチドを合成するのに有用なポリメラーゼは、SP6 RNA ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、T4 DNA ポリメ ラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ(U.S.Bioc hemical Corp、city/stateから入手可能なシーケナーゼ バージョン2.0)、熱安定性DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラー ゼ、Taqポリメラーゼ、Thermococcus sp.(株90 Nm) DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis DNA ポリメラーゼ、およびPyrococcus sp.GBーD DNAポリメラ ーゼを含む。 クラスE.C.2.7.7の酵素は、ニコチンアミド−ヌクレオチドアデニリ ルトランスフェラーゼ、FMNアデニリルトランスフェラーゼ、パンテテイン− フォスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、サルフェートアデニリルトラン スフェラーゼ、サルフェートアデニリルトランスフェラーゼ(ADP)、DNA 依存性RNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼ、UTP−グルコ ース−1−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−ヘキソース −1−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−キシロース−1 −フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、UTP−グルコース−ヘキソ ース−1−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、マンノース−1−フ ォスフェートグアニリル−トランスフェラーゼ、エタノールアミン−フォスフェ ートシチジリルトランスフェラーゼ、コリンフォスフェートシチジリルトランス フェラーゼ、ニコチネート−ヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、ポリ ヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、tRNAシチジリルトランスフェラ ーゼ、マンノース−1−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ(GDP )、UDP−N−アセチルグルコサミンピロフォスフォリラーゼ、グルコース− 1−フォスフェートチミジリルトランスフェラーゼ、tRNAアデニリル−トラ ンスフェラーゼ、グルコース−1−フォスフェートアデニリルトランスフェラー ゼ、ヌクレオシド−トリフォスフェートヘキソース−1−フォスフェートヌクレ オチジルトランスフェラーゼ、ヘキソース−1−フォスフェートグアニリルトラ ンスフェラーゼ、フコース−1−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ 、ガラクトース−1−フォスフェートチミジリルトランスフェラーゼ、グルコー ス−1−フォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、グルコース−1−フォ スフェートグアニリルトランスフェラーゼ、リボース−5−フォスフェートアデ ニリルトランスフェラーゼ、アルドース−1−フォスフェートアデニリル−トラ ンスフェラーゼ、アルドース−1−フォスフェートヌクレオチジルトランスフェ ラーゼ、3−デオキシマンノオクツロソネートシチジリルトランスフェラーゼ、 グリセロール−3−フォスフェートシチジリル−トランスフェラーゼ、D−リビ トール−5−フォスフェートシチジリルトランスフェラーゼ、フォスファチデー トシチジリルトランスフェラーゼ、グルタメート−アンモニア−リガーゼアデニ リルトランスフェラーゼ、アシルノイラミネートシチジリルトランスフェラーゼ 、グルクロネート−1−フォスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、グアノ シン−トリフォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ、ゲナタミシン2”− ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシン3”−アデニリルトラ ンスフェラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメ ラーゼ、mRNAグアニリルトランスフェラーゼ、アデニリルサルフェート−ア ンモニアアデニリルトランスフェラーゼ、RNAウリジリルトランスフェラーゼ 、ATPアデニリルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアデニルトランスフ ェラ ーゼ、アントラニレートアデニリルトランスフェラーゼ、tRNAヌクレオチジ ルトランスフェラーゼ、N−メチルフォスフォ−エタノールアミンシチジリルト ランスフェラーゼ、(2,3−ジヒドロキシベンゾイル)−アデニレートシンタ ーゼ、および[タンパク質PII]ウリジリルトランスフェラーゼを含む。 本発明は、RNAの合成と同様の方法を特徴とし、ここでは、例えば、酵素ポ リリボヌクレオチドフォスフォリラーゼの分布特性をDNAジヌクレオチジルエ キソトランスフェラーゼまたは上記の他のターミナルトランスフェラーゼの代わ りに用いる。ポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼは鋳型も必要としない。 多数の他のトランスフェラーゼおよびフォスフォリラーゼを上記方法で代用する ことができる。酵素が鋳型を必要とする場合、開始因子には鋳型が含まれる。 類似の方法で、、ポリペプチドを合成し、配列決定することが可能である。タ ンパク分解酵素は、トリプシン(黄色ブドウ球菌(S.aureus)細胞外プ ロテアーゼ)、キモトリプシン、ペプシン、アミノピプチダーゼM(EC3.4 .11.2)およびカルボキシペプチダーゼA、BおよびC(それぞれEC3. 4.17.1;EC3.4.17.2;およびEC3.4.16.1.)を含む 。ポリペプチドは、サブチリシンおよびサーモリジンのような酵素を用いて合成 できる。 4.合成化学 有機合成は、微生物と酵素の両方を採用してキラル化合物を合成する。このよ うな酵素の例としては、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼおよび トランスフェラーゼが挙げられる。ラセミ混合物から鏡像異性体を分離するのに 有用な酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オ キシダーゼおよびトランスフェラーゼを含む。 原則として、感圧遷移状態を有するいかなる化学反応の反応速度も、開示した 反応器によって供給される単なる圧力パルスで調節(増加、減少、または停止) 可能である。化学反応の例としては、ポリペプチドの非酵素合成、グリコプロテ イン、リポポリ糖類、および小さいキラル分子の酵素または非酵素合成が挙げら れる。非酵素反応は、感圧熱力学平衡を受け、一定の圧力をかけて特定の立体異 性体を生成する。平衡は、反応体のモル体積、遷移状態錯体、生成物、またはそ の組み合わせを基準にすることが可能である。触媒を採用する場合、圧力パルス を(温度と組み合わせて)用いて触媒からの生成物の解離を阻害または助長し、 それによって未反応試薬を触媒生成錯体から分離し、生成物を単離し、精製を助 長することが可能である。いくつかの実施形態では、聴音波が圧力パルスを発生 することが可能である。 本発明は、反応平衡に影響を及ぼす方法を提供し、この方法は、圧力をかけて 試料容器内に固定化試薬を供給し、望ましい温度および圧力状態(例えば、高圧 )で1つ以上の反応物を取り込む工程とを備える。反応は、平衡選択状態で進行 し、それによって特定の立体異性体を合成する。反応生成物は、高圧で、または 試料容器を減圧した後に、除去される。 開示した反応器はまた、その二次、三次または四次構造配座をまず変えること により化合物を改変する際に有用となる。例えば、高圧での処理は、タンパク質 フォールディングの結果、通常埋め込まれる(タンパク質表面には露出していな い)1つ以上のアミノ酸残留物を露出させる。露出したアミノ酸を改変した後、 タンパク質を再フォールディングする。 5.阻害 酵素反応工程の阻害は、完全酵素事象を達成するために、酵素反応経路に影響 を及ぼすか、またはそれに関連する機械論的工程、例えばここで述べるような工 程を行わないことである。酵素反応工程の可逆阻害は、後の好都合な条件の下で 、酵素反応工程を行うこと、すなわち酵素が回復不可能な変性、不可逆的な結合 、改変または非活性化が行われていないことを意味する。可逆的阻害状態は、工 程における酵素反応機構経路を一時的に阻止するか、または一時停止する。その 阻害状態は、酵素事象に依り、機械的経路に沿って、2つ以上の酵素反応工程を 効果的に阻止することが可能である。圧力、温度または溶媒内容物等の条件を変 えると、さらなる酵素反応工程を阻害することが可能となる。試料混合物や、温 度等の試料混合物条件に依り、圧力変化から起きるさらなる酵素工程の阻害とし て、後の単一酵素反応工程の阻害、幾つかの酵素工程の阻害、または完全な酵素 事象(例えば、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の開裂もしくは添加、または官能 基の合成有機変換)の阻害が可能である。阻害圧力が許容圧力に一旦変化すると 、酵 素反応経路に沿った進行が、試料混合物成分、時間、温度または溶媒条件によっ て制限される。 必要な試料混合物成分(例えば、基質、共同因子および金属イオン)がすべて 存在し、且つ温度等の他の条件が好ましい場合、阻害圧力が完全酵素事象を阻害 することが可能である。この場合、後に阻害圧力を許容圧力に変化させ、許容圧 力を充分な時間だけ維持することにより、酵素事象が完了する。時間と試料混合 物成分の量が充分存在すれば、複数回の酵素事象が生じる。 必要な試料混合物成分および条件の全てではなく、そのうちの幾つかが存在す る場合、阻害圧力が、1つ以上の酵素反応工程を阻害できる。この第2の場合、 阻害圧力を許容圧力に後に変化させて、許容圧力を充分な時間だけ維持すること により、必要な試料混合物成分および条件が利用可能である同数の酵素反応工程 を生じることになる。必要な試料混合物成分のうちの幾つかが存在しない場合、 または温度等の条件が好ましくない場合、完全酵素事象は起こり得ない。しかし 、試料混合物成分および条件によって、1つまたはそれ以上の後の酵素反応工程 が生じることになる。 一実施形態においては、本発明は、酵素を核酸合成酵素または分解酵素を同期 的に作用させ、同一DNAフラグメントの複数のコピーを改変することを企図し ている。酵素が許容圧力にある期間を調節して、核酸に作用してそれを改変する 酵素事象の数を決定する。 一実施形態は、核酸を処理する方法であって、この方法は、a)i)核酸基質 (例えば、二重鎖デオキシリボ核酸基質)と、ii)前記核酸基質に進行的に作 用することができる酵素(例えば、エキソヌクレアーゼ)と、iii)圧力を加 える手段とを供給する工程と、b)前記核酸基質と前記酵素を混合して、(例え ば温度を下げて)反応混合物を生成する工程と、c)前記酵素の前記核酸基質に 対する作用を調節する(例えば、可逆的に阻害する)ような条件で圧力(例えば 、高圧)を加えるための前記手段を用いて、前記反応混合物を処理する工程とを 備える。 他の実施形態では、d)前記酵素が前記核酸基質に作用するような低圧条件で 圧力を加えるための前記手段を用いて、前記反応混合物を処理する工程をさらに 備え、e)工程cおよびdを少なくとも1回繰り返して、さらに改変された基質 を生成する工程を任意に備える。この方法は、前記改変された基質(すなわち、 酵素が作用できる各工程で発生した基質)を検出するか、または反応の他の生成 物(基質から発生した1つ以上のフラグメント)を検出する工程を備えることも 可能である。 D.圧力および温度を変化させる実施形態 温度を調節することによって、工程全体をさらに調節することができる。一実 施形態では、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており、この方法は、a) i)試料容器と、ii)核酸基質と、iii)前記核酸基質に作用可能な酵素と 、iv)圧力を調節する手段と、v)温度を調節する手段とをいずれかの順に供 給する工程と、b)水溶液内の前記酵素を前記試料容器に添加する工程と、c) 前記酵素が実質的に不活性となるように、前記温度調節素手段を用いて、前記試 料容器内の前記水溶液の温度を下げる工程と、d)前記核酸基質を前記不活性酵 素に添加して、反応混合物を生成する工程と、e)前記圧力調節手段を用いて、 前記試料容器の圧力を高める工程と、f)前記温度調節手段を用いて、前記試料 容器の前記反応混合物の温度を上昇させる工程と、g)前記酵素が活性状態であ り、前記核酸基質に作用するように、前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器 の圧力を降下させる工程とを備える。工程(e)の圧力増大は、最適酵素温度で 前記核酸基質に対する前記酵素の作用を実質的に抑制できる圧力を達成すること が企図されている。また、工程(g)における酵素の前記作用により、前記核酸 基質が改変されることも企図されている。この方法は、工程(g)の後に、前記 改変された核酸基質を検出する工程をさらに備えてもよい。また、工程(f)に おける前記温度上昇は、前記酵素が活性状態である温度を達成することも意図さ れている。 他の実施形態では、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており、この方法 は、a)i)試料容器と、ii)核酸基質と、iii)前記核酸基質に作用可能 な酵素と、iv)圧力を調節する手段と、v)温度を調節する手段とをいずれか の順に供給する工程と、b)水溶液内の前記酵素を前記試料容器に添加する工程 と、c)前記温度調節手段を用いて、前記試料容器内の前記水溶液の温度をおよ そ5℃未満まで下げ、それによって、前記酵素を実質的に不活性にする工程と、 d)前記核酸基質を前記不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と、 e)前記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を、平方インチあたりおよ そ30,000ポンドよりも高くする工程と、f)前記温度調節手段を用いて、 前記試料容器の前記反応混合物の温度を、平方インチあたりおよそ30,000 ポンドよりも高く上昇させる工程と、f)前記温度調節手段を用いて、前記試料 容器内の前記反応混合物の温度を、およそ10℃よりも高くする工程と、g)前 記圧力調節手段を用いて、前記試料容器の圧力を平方インチあたりおよそ20, 000ポンド未満まで下げ、それによって前記酵素が前記核酸基質に作用するよ うに、前記酵素を活性状態にする工程とを備える。一実施形態においては、工程 (g)における前記圧力低下により、平方インチあたりおよそ5,000から1 5,000ポンドの圧力を達成し、工程(f)の前記温度上昇により、およそ1 5℃から20℃までの温度を達成する。 さらに他の実施形態において、本発明は、核酸を処理する方法を企図しており 、この方法は、a)溶液中の酵素を第1の試料容器に、溶液中の核酸基質を第2 の試料容器に、いずれかの順で添加する工程と、b)前記第1および第2の試料 容器の温度をおよそ0℃からおよそ5℃までに下げる工程と、c)前記核酸基質 を反応容器中の前記酵素と化合して、0℃からおよそ5℃までの温度の反応混合 物を生成する工程と、d)圧力調節手段を用いて、前記反応容器の圧力を増大す る工程と、e)前記反応容器中の前記反応混合物の温度を、およそ10℃からお よそ80℃までに上昇させる工程と、f)前記酵素が前記核酸基質に作用して、 前記核酸基質が改変されるように、前記圧力調節手段を用いて、前記反応容器の 圧力を低下させる工程とを備える。本発明は、工程d)およびf)を少なくとも 1回繰り返して、さらに改変された基質を生成する工程をさらに企図している。 核酸の改変は、処理の後、改変された核酸基質を検出することにより、測定で きる。代わりに、核酸の改変の性質または程度を、酵素が添加または除去された 塩基の検出および同定により決定することも可能である。 一実施形態においては、欠失体を生成するために、同期させた酵素作用を採用 することが企図されている。圧力を使用することにより、消化速度を細かく調節 し、一定の長さを有する欠失体の群の生成を定型化することが可能である。 本発明をうまく使用して、核酸配列決定を行うことも企図されている。さらに 、本発明の他の実施形態は、タンパク質配列決定、多糖配列決定およびタンパク 質合成にも有効に利用できる。一実施形態では、核酸配列決定方法を自動化する 。一実施形態では、本発明は、二重鎖または一本鎖ポリヌクレオチドを配列決定 するための方法を企図しており、この方法は、a)第1の端部を有するポリヌク レオチドを固定化する工程と、b)前記第1の端部に結合可能な進行的酵素を添 加し、この結合を生じさせる工程と、c)前記酵素を阻害可能な静水圧を加える 工程と、d)前記酵素が前記ポリヌクレオチドに作用して生成物を産生させる時 間間隔で、前記静水圧を非阻害レベルまで下げる工程と、e)高圧フローストリ ームを与えて、前記生成物を検出器に輸送する工程と、f)前記検出器を用いて 前記生成物を検出する工程と、g)工程(c)から(f)までを繰り返し、その 結果、前記酵素が前記ポリヌクレオチドの全長を転位させる工程とを備える。一 実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは一本鎖であり、工程(d)から( g)までは、複数の前記一本鎖ポリヌクレオチドに対して同期して行われること が企図されている。 この方法を実施する場合、固定化を反応室内で行うことも可能である。一実施 形態では、上記固定化は、前記ポリヌクレオチドを前記反応室に共有結合された 相補的フラグメントにハイブリッド形成させることを含む。酵素は、DNAポリ メラーゼであってもよく、前記反応室内への(第1のデオキシヌクレオチドトリ フォスフェートと共に)ポンピングにより供給してもよい。 本発明は、検出方法に限定されるものではない。例えば、検出器は、質量分析 計または蛍光計であってもよい。 本発明は、酵素の活性を調節することに関し、特に、同期した酵素活性を用い て、核酸のような基質を処理することに関する。この新規なアプローチは、低圧 のパルスによって阻害された反応システムに高い静水圧を加えることにより、D NAの合成または分解に必要な酵素の活性を正確に調節する能力に基づく。各々 がDNA(例えば、固定化DNA)の鎖に結合された、酵素の多数の転写体の活 性を正確に調節する能力により、酵素触媒化反応の同期循環を生じる。各循環の 際、生成物を緩衝液の流れで検出器に輸送する時に検出するのに充分な可溶性生 成物を形成する。例えば、エキソヌクレアーゼが同期され、その結果、DNAの 多数の転写体に作用する多数の酵素がすべて前方に移動し、同じ塩基を同時に放 出する。逆に、DNAポリメラーゼはすべて前方に移動し、同じ塩基を添加する 。電気化学的検出のような利用可能な技術、質量分析計および蛍光計を用いて、 反応産物が容易に検出される。 E.酵素 本発明は、進行的特性を有する酵素と、非進行的(分布)特性を有する酵素と を使用することを企図している。塩またはイオン状態を変化させることにより、 幾つかの酵素は、進行的または分布的特性を備えることが可能である(例えば、 ある一定のフォスフォリラーゼ)。進行的酵素は、化学反応を繰り返し触媒化す るものであり、一方で、特定の基質に結合されたままで、且つそれに沿って移動 する。一実施形態では、本発明は、単一塩基を増加して、DNAテンプレートに 沿った進行的酵素の移動を調節することを企図している。これは、反応システム に高い静水圧を加えて、酵素活性を阻止するか、または阻害することにより達成 される。その後、静水圧を短期間だけ変化(例えば、低下)させて、酵素をDN Aテンプレートに沿って隣の塩基まで移動させる。この移動は、酵素に沿ったD NAの転位としてここで定義されている。 一実施形態においては、本発明の方法に採用される酵素が、優れた進行性を示 す。モノマー酵素が好ましいが、本発明の反応条件で解離しないオリゴマー酵素 もまた適当である。温度、pH、塩の濃度および緩衝液成分等の二次反応パラメ ータの改変により、圧力によって誘導されるサブユニット解離を逆転させること が可能となる。 DNA配列決定に有用な酵素は、DNAポリメラーゼおよびエキソヌクレアー ゼを含む。本発明に有用であるエキソヌクレアーゼの例は、ラムダエキソヌクレ アーゼである。この酵素は、5’末端のモノヌクレオチドに対する進行的かつ階 段的な加水分解および解離を触媒化して、二重鎖DNAの5’−リン酸末端を形 成する。J.W.Little et al.,J.Biol.Chem.24 2:672(1967)参照。酵素は商業上入手可能である(例えば、Nova gen,Inc.,Madison、WI)。 適当な酵素を選択する際、一般的ではない物理化学的特性を示す酵素が有用と なる。例示したものは、(1)2,010メーターのサブマリンサーマルベント から単離されたPyrococcus species GB−D等の“ベント ”生物体の酵素(Deep Vent(登録商標),New England BioLabs)および広い範囲の反応条件を許容する能力と配列決定生成物の 産生量の向上との両方を備えた遺伝子学的に処理した酵素を含む。しかしこれら に限定されない。後者の例はシーケナーザであり、これは、2つのサブユニット を有し、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有さないバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼの遺伝子学的に処理した(商業上入手可能な)バージョン である。他の例は、Thermus thermophilus由来のDNAポ リメラーゼを含み、これは、検出可能3’−5’または5’−3’エキソヌクレ アーゼ活性を持たないが、広い温度範囲を有する単量体酵素である。バクテリオ ファージT4のDNAポリメラーゼは、5’−3’および3’−5’エキソヌク レアーゼ活性を有する単一ポリペプチドチェーンである。 本発明の方法により、使用可能なエキソリボヌクレアーゼがいくつかある。こ れらの酵素は、基質としてRNAを利用する。N.G.Nossal and M.F.Singer,J.Biol.Chem.343:913(1968) ;C.B.Klee and M.F.Singer,J.Biol.Chem .243:923(1968)参照。 適当な進行的酵素を選択するために、特定の条件の下での酵素の作用を調査す ることにより以下の疑問点を解決する必要がある:(1)DNA基質が存在する 状態で、また存在しない状態で酵素が安定したままである圧力範囲は? (2) 酵素が可逆的に阻害される圧力は? またこの阻害は、酵素のDNA基質からの 解離によるものか? (3)加圧の際、反応パラメータの調整により、酵素の安 定性および性能が改良されるか? (4)同期性は、圧力パルス動作速度の関数 としてどの程度維持されるか? また許容圧力でのDNA基質に沿った酵素の椎 定移動速度は? ここで実証されるように、テストした酵素のうちの幾つかは、同期DNA配列 決定に充分な安定性プロファイルを示す。ここで示す条件は、特定の酵素に適す る圧力パルスの好適な作働圧力範囲および作働時間を提供する。 F.高圧の適用 本発明は、圧力装置の性質によって限定されることはない。411MPaの圧 力を発生可能な“手動”器具システムは、商業上入手可能であり、このシステム は加圧媒体としてシリコン油を使用し、2mL反応容器を有する(High P ressure Equipment Company, Erie、PA)。 このシステムは、図1に概略的に示す。 幾つかの実験を行う際(以下参照)、以下の成分を有する装置として、高圧装 置を用いた:圧力発生器1つ(最大圧力60,000psi)cat#37−5 .75−60;圧力ゲージ1つ cat#6PG75;バルブ2つ cat#6 0−11HF4;ティー2つ cat#60−23HF4;1/4”x6”ニッ プル4つ cat#60−8M4−2;1/4”x2 3/4”ニップル2つ cat#60−8M4−1および2ml反応室1つ。5MPa増量圧力ゲージも 、このシステムに連結される。 加圧する溶液を、端部がクリンプシーリングされた小型の変形可能ポリエチレ ネカプセルに入れる。酵素/基質溶液を10μlから50μl含有するカプセル を反応容器に配置して、その後、それをシステムに連結して加圧する。 本発明の圧力特性は、温度と組み合わせで利用可能であることが、意図されて いる。これは、特に、非反応時間(例えば、圧力処理の前に試料を混合してロー ドするための時間、および分析のために試料をアンロードして除去するための時 間)の間、酵素を調節するために有用である。幾つかの実験では(以下参照)、 別々の酵素および基質溶液を氷上で保持する。反応室は、冷蔵庫に保持した(お よそ5℃)。ピペットの先端、カプセル、ピンセット、かみそりの刃、および作 業面(共にテーピングしたガラスプレート3枚)をすべて、−20℃に保持した 。冷却前に、カプセルの一端部をクリンプシーリングした。すべての作業は、− 20℃のガラスプレード上で行った。DNA基質および酵素溶液を、先端の冷た いカプセルに流し入れた。その後、カプセルの端部をクリンピングして、シーリ ングした。(これはおよそ5分かかる。)その後、反応室を圧力装置に連結し て、酵素が活性状態にない圧力を加えた(例えば、50,000psi)。反応 室を、望ましい温度に設定した。その後、望ましい時間、望ましい圧力まで上げ (例えば、酵素を活性化するための15,000psi)、酵素を停止する圧力 (例えば、30,000psi)まで戻した。反応室を(圧力をかけて)取り外 し、−70℃の冷凍庫に配置した(45分間)。カプセルの端部を切り離して、 凍結した試料を回復し、その後、さらなる酵素反応を阻害する停止緩衝液を含む マイクロヒュージチューブ内でカプセルを遠心分離した。非反応時間調節は、許 容圧力での反応と同期間、50,000psiから30,000psiまで圧力 を高めて、実験試料と同じ処理を行った。 上記のように、圧力に関連して温度を使用し、酵素活性を調節することも可能 である。例えば、実施例4は、酵素消化速度を調節するためにいかにして温度を 変化させることができるかについて例示している。この実施例で述べた条件では 、消化(すなわち、1秒あたりDNA配列から除去される塩基数として表す)は 、温度が20℃の時には、温度が15℃の時の10倍速く進み、その場合、その 両温度での圧力は10,000psiに設定される。温度降下が比較的小さいた め(例えば、5℃)、消化速度をかなり落とすことができるという事実により、 酵素活性の調節をさらに向上させて調査を行える。これは、非反応時間において 特に重要となる可能性があり、その場合には、圧力をかけていない時に(酵素を 害することなく可能な程度まで)消化が起きないようにすることが都合よい。 G. 自動化配列決定装置 本発明は、配列決定するための自動装置を企図しており、この装置は、静水圧 での正確で迅速な自動変化を利用して、多数の酵素−基質錯体を同期する。この 装置は、高圧反応室を高速ポンプおよび高速検出器に連結する。この装置は、1 秒あたり数個の塩基を配列決定することができ、5,000から10,000個 の塩基の読みとり長さを有しており、同一の固定化された基質を再初期化して、 配列決定を継続できる可能性がある。 この技術の基づく自動装置は、以下の工程を実施する:(1)フロー室内で配 列決定するDNAの一端部を固定化する;(2)触媒作用がわずか1つの塩基に 限定される条件で、DNA“端部”に酵素を結合させる;(3)高圧で、酵素活 性を可逆的に阻害する;(4)酵素が1つの塩基だけ前方に同期的にステッピン グするように、ある時間間隔で圧力のみを低下させることにより、酵素を活性化 する;(5)阻害圧力で、高圧、高フローストリームで、検出器まで生成物を高 速移動させる;(6)工程(3)、(4)および(5)を繰り返し循環させる。 3つの異なる組の工程は、自動装置に用いることが可能である。配列決定に用 いられる酵素の特性により、いずれの組の工程を使用するかが決定される。酵素 の特性は、以下のグループのうちの一つである。 A.触媒活性を阻害するのに用いる圧力は、基質への酵素の結合を妨げない。 B.触媒活性を阻害する圧力はまた、基質への初期結合を阻害するが、基質結 合酵素を解離しない。他の条件を変えて、触媒活性を調節する。これらの条件は 、温度、pH、イオン強度、マグネシウムイオンの濃度および他の共同因子の濃 度を含む。 C.触媒活性を阻害する圧力はまた、結合を抑制し、触媒活性を他の条件によ って効果的に変えることができない。 グループAの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う: (1)フロー室内で配列決定するDNAの一端部を固定化する;(2)高圧で 、酵素溶液の活性を可逆的に阻害し、この溶液をフロー室に注入する;(3)酵 素をDNAに結合させ、その後、結合していない酵素を洗い出す;(4)酵素が 1つの触媒作用により同期的に進むように、ある時間間隔で圧力のみを低下させ て、酵素を活性化する;(5)、高圧、高フローストリームで検出器まで生成物 を高速移動させる;(6)工程(4)および(5)を繰り返し循環させる。 グループBの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う: (1)フロー室内で配列決定するDNAの一端部を固定化する;(2)その活 性が圧力以外の条件、例えば遊離マグネシムイオンが存在しない状態で阻害され る酵素溶液をフロー室に流し入れる;(3)酵素をDNAに結合させ、その後、 圧力を阻害レベルまで上げる;(4)阻害剤の条件を、圧力を低下させることに より酵素作用を許容するという条件に変える、例えば遊離マグネシウムイオンを 添加する;(5)酵素が1つの触媒作用により同期的に進むように、ある時間間 隔で圧力のみを低下させることにより、酵素を活性化する;(6)活性状態を維 持する高圧、高フローストリームで、検出器まで生成物を高速移動させる;(7 )工程(5)および(6)を繰り返し循環させる。 グループCの酵素に基づく自動装置は、以下の工程を行う: (1)フロー室内で配列決定するDNAの一端部を固定化する;(2)高圧で 、酵素溶液の活性を可逆的に阻害し、この溶液をフロー室内に注入する;(3) 酵素が1つの触媒事象を通過して同期的に結合して進むように、ある時間間隔で 圧力を単に低下させることにより、酵素を活性化する;(4)高圧、高フロース トリームで、検出器まで生成物を高速移動させる;(5)工程(3)および(4 )を繰り返し循環させる。フローストリームは、生成物とともに、洗い出された 酵素と置換するための酵素を含有させるか、または半透性物質のようなフローセ ルに酵素を保持する手段を使用する。 本発明で企図している装置は、ポンプおよび検出器に連結した反応室を備える 。反応室は、固定化DNAを含み、試薬およびDNA結合酵素を取り入れるため のバルブが備わっている。ポンプは、システム内の緩衝液の流れを供給する。圧 力パルスは、圧力パルスを発生する手段によって調節され、反応室における酵素 触媒反応を同期化するためのものである。検出器は、反応室からの緩衝液により 輸送される生成物を同定する。 本発明で企図するように、圧力瞬時昇降(ジャンプ)実験で使用されるパルシ ングシステムを適当に改変するべきである。このようなパルシングシステムは、 6ミリ秒で圧力を変えることができる液圧駆動装置である。(Brower,K .R.,(1968)”A method for measuring th e activation volumes of fast reversi ble reactions,”J.Am.Chem Soc.,90:540 1−5403)。圧電トランスジューサを使用して100ミクロン秒で圧力を変 えることができるパルシングシステムも、好適である(Clegg,R.M., Elson,E.L.and B.W.Maxfield,(1975)”A new technique for optical observatio n of kinetics of chemical reactions perturbed by small pressure changes, ” Biopolymers,14:883−887)。 水の断熱圧縮に関連する温度急騰は、1x10-3deg/atmである(Br ower、K.R.,(1968)“A Method For Measur ing The Activation Volumes Of Fast R eversible Reactions,”J.Am.Chem.Soc., 90:5401−5403)。 DNAの固定化のための幾つかの化学的方法が、述べられている(Goodc hild,J.,(1990) “Conjugates of Oligon ucleotides And Modified Ologonucleot ides:A Review Of Their Synthesis And Properties,” Bioconjugates Chem 1:1 65−187)。一本鎖DNAは、反応室に共有結合した相補的フラグメントに 対するハイブリダイゼーションによって固定化できる。 種々の検出器を、このシステムと共に使用するのが好適である。配列決定のた めに使用する酵素の型式は、検出器の選択に影響を与える。 A.DNAポリメラーゼをこの装置に用いる場合、蛍光計の質量分析計を、以 下のフォーマットで検出器として使用可能である: 1. ベータまたはガンマリン酸塩位置での改変を有するヌクレオシドトリリ ン酸塩の使用。各ヌクレオシドトリリン酸塩は、テンプレートに沿ったポリメラ ーゼ工程として生成される種々のピロリン酸生成物間を質量分析計により区別す ることを可能にする独特の改変を有する。例えば、ピロリン酸塩は、0、1また は2チオ置換体を含有することが可能である。これにより、3つのヌクレオシド トリリン酸塩が独自に標識化される。第4のものは、18Oまたは34S等の安定同 位体で標識付け可能である。フライト質量分析計の時間は、迅速に配列決定する のに必要な速度および感度を有する。 2. 質量分析計検出器を使用することにより、同時に反応室に存在する4つ のdNTPのうちの2つのみを有することも可能となる。再度、チオ基をdNT Pのうちの1つに取り込むことにより、ピロリン酸塩生成物の起源を同定するこ とができる。このフォーマットは、2つの異なるdNTP溶液を反応室内で洗浄 するか、または反応室から洗い出す必要があるため、より時間を要する。このフ ォーマットを選択するには2つの理由がある;a)ポリメラーゼ活性をさらに調 節する;およびb)各塩基が付加された生成物の生成量を向上させる方法を提供 する(すなわち、工程効率を改善する)。以下の方策により、工程効率を上げる ことができる。現在のdNTP溶液から塩基を添加した回数に等しい回数だけ、 反応室をパルシングすることが可能である。これにより、ポリメラーゼが塩基添 加の2つのチャンスが与えられるため、各付加体の生成量が改善されることにな る。この効率改善により、10,000以上の塩基対を含有する核酸の配列決定 が可能になる。 3. さらに別のフォーマットは、検出器として蛍光計を使用する。4つの蛍 光的に標識付けされたdNTPすべての溶液を、反応室内にポンピングする。こ の溶液内のdNTPの濃度は、ポリメラーゼのKm未満である。これにより、1 つの塩基を添加した後、dNTPの濃度をさらに相対的に変化させ、どの塩基を 添加したかを決定することがより容易になる。検出器は、発光スピクトルまたは 蛍光寿命により、異なる標識を区別することができる。検出器が添加した塩基を 同定すると、適当に標識付けされていないdNTPの高濃度溶液を反応室内にポ ンピングしてパルシングする。これは、その工程で付加される塩基数を高めるこ とを保証するのに必要である。次に、標識付けされたdNTP溶液を再度、反応 室内にポンピングし、次の塩基を決定する。 B. 配列決定にエキソヌクレアーゼを使用する場合、基質は固定化DNAで あり、生成物は、酵素によって放出したヌクレオシドモノリン酸塩である。反応 室をパルシングする度に、次のヌクレオシドモノリン酸塩を放出する。その結果 得られる生成物は、その後、検出器にポンピングされる。 例えば: 1. 再度、検出器として、どの塩基が放出したかを同定する質量分析計を使 用することができる。このフォーマットは、鋳型作成を簡素化する標識付けされ たDNAを用いることを必要としない。 2. 他のアプローチとして、温度を下げて、HCl等のエンハンサを添加す ることにより、dNMPの固有蛍光性を向上する(Ishikawa,M., (1993)”Superfast Determination of Nu cleotides in DNA, ”Japanese Patent J P05,126,739[93,126,739]May 21)。この方法は 、蛍光シグナルを発生させるために蛍光標識された基質を使用する必要はない。 3. さらに他のアプローチとして、電気化学的検出を採用し、それによって 、4つの異なるdNMPを区別できる。 配列決定装置の一実施形態として、以下のような操作を行う。反応室内に添加 した既知の第1のdNTPと同時に酵素をポンピングすることにより、ポリメラ ーゼを固定化DNAに結合させる。添加する第1の塩基は、以下の理由から既知 のものである。すなわちプライマ配列のいずれも既知であり、またはベクターを 線状にする際に用いられる制限エンドヌクレアーゼの配列が知られているためで ある。圧力を抑止レベルまで上げ、結合していない酵素やdNTPを除去する。 酵素のポリメラーゼ活性を用いる場合、dNTPを含有する試験溶液を反応室内 にポンピングし、圧力パルスを減少させる。代わりに、酵素の3’−5’エキソ ヌクレアーゼ活性を用いる場合、dNTPを洗い出した後、圧力パルシングを開 始する。一本鎖DNAに対するエキソヌクレアーゼの結合が、選択した配列決定 方法である場合、高い圧力をかけて、酵素を反応室内にポンピングして、パルシ ングを行い、酵素のうちの幾つかを結合させる。再度、結合していない酵素を配 列決定開始前にポンピングする。本発明の一実施形態では、低温および非最適p Hを使用することを企図しており、それによって、結合パルス間で、2つ以上の 塩基によって酵素がステッピングしないことが保証される。 配列決定装置の他の実施形態が、企図されている。一実施形態では、反応室お よび検出器に至る流路の体積を減少させることにより、パルス間の時間間隔をか なり短縮することになる。他の実施形態では、単一分子配列決定のために提案さ れた技術を用いて、フローストリーム内で固定化DNAを懸濁する(Jett, J.H.Keller,R.A.,Martin,J.C.,Marrone, B.L.,Moyzis,R.K.Ratliff,R.L.Seitzing er,N.R.,Shera,E.B.and Stewart,C.C.,( 1989)“High−Speed DNA Sequencing;An Approach Based Upon Fluorescence Det ection Of Single Molecules,”J.Biomol .Struct.Dyn,7:301−309)。さらに他の実施形態では、多 数の検出器を使用し、反応室からのフローストリームを1つの検出器から次の検 出器に迅速に移動させて、検出速度を増す。これらの改良を組み合わせる場合、 単一圧力パルスを用いてまず基質上にエキソヌクレアーゼを結合させることが企 図される。結合していない酵素を洗い出す。その後、圧力を降下することによっ て、酵素が通常の速度でDNAを加水分解する。酵素がすべて同時点で始動し、 すべて同一の基質を利用しているので、比較的長い時間、同期したままとなる。 E.coliのエキソヌクレアーゼIによる加水分解の速度は、275塩基/秒 であると報告されている(Brody,R.S.,Doherty,K.G.a nd Zimmerman,P.D.,(1986)“Processivit y and kinetics of the reaction of ex onuclease I from E.coli with polydeo xyribonucleotides,”J.Biol.Chem.,261: 7136−7143)。200塩基/秒の速度で、DNAの10,000塩基長 を1分以内で配列決定できる。 H. 酵素の評価 一般に、特定の基質に結合したままで、それに沿って移動しながら化学反応を 繰り返し触媒化する進行的酵素が、好ましい。酵素活性を調節する方法において 用いるポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼの候補は、スクリーニングにより決 定する。スクリーニングの手順は、以下で述べており、表1に要約している。 スクリーニング工程に必要な一時的工程は、以下の通りである: I. 基質溶液に酵素を添加し、酵素が不活性状態になるまで圧力を加え( すなわち、阻害剤圧力)、その後減圧して、酵素が活性(すなわち、許容圧力) が維持されているかどうかを決定する。 II. 活性が維持された酵素に対しては、酵素が可逆的に阻害可能であり、 かつ許容できる活性を示す圧力範囲を(工程Iの手順を繰り返すことにより)決 定する。 III.酵素が可逆的に活性を保持し得る温度範囲を決定する。 IV. 酵素によって基質の同期処理を維持するための温度および圧力の最適 条件を決定する。 以下で例示するように、上記手順の思慮深い考察により、いかなる酵素(“X” )も本発明への適用のために評価することが可能である。 酵素(“X”)は、企図された圧力調節方法(すなわち、同期化させた酵素活 性を用いて、核酸等の基質を処理する)において使用するために評価可能である 。酵素Xは、最初に、適当な条件(例えば、低温)で、基質溶液にXを添加する ことにより、工程Iに従って評価する。その後、Xが不活性状態になるまで圧力 を加え、さらに減圧してXが通常活性状態である圧力に復帰させる。これによっ て、Xが活性を維持できたかどうかを決定する。幾つかの酵素は、高圧処理の後 、活性を回復するまでに、低圧での回復期間を必要とする可能性がある。Xが活 性を回復しない場合は、Xはその二次および三次構造で不可逆変化により既に変 性している。しかし、可逆阻害が可能な酵素に過剰な高さの圧力を与えた場合、 不可逆阻害を生じる可能性があることを認識しておくことが重要である。従って 、酵素が活性を回復しない時、より低い圧力では、酵素がうまく可逆阻害しない ことを確信するべきである。 酵素Xの可逆阻害を実証できた場合には、次に、Xが可逆阻害可能であり且つ 許容可能な活性レベルを示す圧力範囲を評価する(工程II)。工程IIは、望 ましい範囲が確認されるまで、工程Iを進行的に繰り返すことにより、容易に実 施できる。すなわち、不可逆阻害が達成されるまで工程Iの不活性圧力を進行的 に高めることにより(幾つかの酵素は同一装置の圧力限界で安定する可能性があ る)、またXがこれ以上阻害されないようになるまで工程Iの不活性圧力を進行 的に低下させることにより、不活性圧力範囲(例えば、20,000psiから 50,000psi)を容易に決定できる。Xが受容可能な活性レベルを示す圧 力範囲は、一連の同じ工程を行って確認できる。不活性圧力範囲は、各圧力パル ス間で、酵素を可逆的に阻害することができる圧力を示す。一方活性圧力範囲は 、酵素により基質を調節的に処理することができる圧力を示す。 次に、工程IIIでは、工程IIで予め決定された圧力下において、酵素Xが 可逆的に活性状態を維持できる温度範囲を決定する。工程IIIは、工程IIで 述べたものと類似の態様で行うことが可能である。すなわち、温度範囲(例えば 、5℃から60℃)は、Xが不可逆的に不活性化されるまで徐々に温度を上げ、 その後、同様に温度を下げることにより、決定する。 最終工程、工程IVでは、Xにより基質の同期的処理を維持するための温度お よび圧力の最適条件を決定する。工程IVでは、幾つかの異なる温度を決定する ことに注目すべきである。例えば、低温(例えば、5℃から10℃)では、圧力 の結合パルス間で、2つ以上のヌクレオチド塩基だけXがステッピングしないこ とが確実となる。同様に、種々の温度対圧力比が、Xの活性速度の細かい調節を 援助することができる。 以下の実施例は、本発明の、ある実施の形態および局面を例示しており、その 範囲を限定するものではないと解釈するべきである。 実施例 下記の実験開示では、以下の省略形を適用する:℃(摂氏);MPa(メガパ スカル);psi(平方インチあたりのポンド);μg(マイクログラム);μ l(マイクロリットル);ml(ミリリットル);およびmM(ミリモル)。圧 力の単位は、以下のように変換できる:1気圧=101.3kPa=14.5p si。 実施例1 ラムダエキソヌクレアーゼ この実施例では、静水圧を用いたラムダエキソヌクレアーゼの活性調節を示す 。これらの実験では、以下の検定緩衝液を用いた:67mM グリシン−KOH (pH9.4)、2.5mM MgCl2および50μg/ml アセチル化B SA。これらの実験に用いる基質は、ラムダDNAのHind III消化物で あった。Hind IIIによるラムダDNAの消化により、大きさが125か ら23,130までの塩基対の範囲である8個のフラグメントが生成される。検 定成分は、以下の割合で混合した:1.0μlの10x検定緩衝液 + 2.0 μlのHind III消化ラムダDNA(0.24μg/μl)+ 0.5μ lのアセチル化BSA(1.0μg/μl)+1.0μlのエキソヌクレアーゼ (望ましい濃度)+5.5μlのH2O。ラムダエキソヌクレアーゼの保存液( 2.0単位/μl、Life Technologies)を、望ましい濃度ま で検定緩衝液内で希釈した。一般的な高圧実験では、上記成分を、特定の割合で 混合して、最終体積40μlを得た。冷却した試薬(0℃から5℃)を外界圧力 下で混合し、最後に酵素を添加して、反応を開始した。次に、この溶液から10 μlを、1.5mlマイクロヒュージチューブに分注した。これを、非反応時間 参照サンプルとして用いた。混合液の残りのものを、使い捨て全量ピペットの端 部から引き出して作成した小型のポリエチレンカプセルに注入した。カプセルは 、縮小端部を折り曲げてシーリングし、その折り曲げた縮小端部は、その上に小 さなアルミニウムバンドをクリンピングして所定位置に保持される。その後、手 動圧力装置の反応室に、カプセルを置く。この手動圧力装置は、圧力が望ましい レベルまで急速に上昇させることができる。カプセルに混合液を注入して圧力を かけるのに要する時間と、圧力を解除してカプセルから試料を回復するのに要す る時間との合計を、非反応時間と呼ぶ。非反応時間は、8分から10分であった 。非反応時間調節用試料を用いて、圧力をかけない時に起きる反応の程度を決定 する。ゲルローディング緩衝液4μl(250mM EDTA、0.25%キシ レンシアノール、0.25%ブロモフェノルブルーおよび30%グリセリン)を 添加することにより、すべての反応を停止させる。望ましい時間だけ選択した圧 力で、試料を反応させる。その後、圧力を解除し、回復した混合物のアリコート 10μlにゲルローディング緩衝液4μlに添加して反応を停止させる。回復 後の試料の残りは、15分間、外界圧力で反応させて、加圧後の酵素活性の回復 の程度を決定することが可能である。 酵素反応後、DNAフラグメントをTBE緩衝液を用いて0.5%アガロース ゲル上で分画した。DNAバンドは、エチジウムブロマイドで染色し、トランス イルミネータで撮影した。酵素活性により基質が、ほとんど染色されない極小さ い一本鎖生成物に分解されると、基質バンド自身の強度減少することになる。 結果(図13)は、ラムダエキソヌクレアーゼ活性が20℃から21℃の温度 で、10,000psiの圧力の下ではほとんど影響されないことを実証した。 酵素活性の阻害は、15,000psiで明白である。酵素活性の阻害は、17 ,500psiおよび20,000psiでさらに増大し、30,000psi で完全に阻害されることが示唆された。反応混合物を1時間、阻害圧力で保持し た後、15分間、外界圧力に急速に戻すと、酵素活性は、完全に回復することが 示された。この酵素は、高圧に対して非常に安定している。しかし、60,00 0psiで基質存在下で15分間の反応を行った結果は、回復活性を示さなかっ た。これらの結果は、ラムダエキソヌクレアーゼが、高い静水圧で可逆的に反応 可能であること実証している。1つのサイクリング実験を行った。この実験では 、17.7秒30,000psi未満の、平均時間43サイクルで250psi 、30,000psi間で圧力を循環させた。その結果生じた基質バンディング パターンは、アガロースゲル電気泳動の後、進行的酵素のパターンになった。従 って、酵素は、30,000psiの圧力では基質から解離しなかった。 実施例2 T4 DNAポリメラーゼ この実施例では、DNAサイズマーカを基質として使用し、サイズマーカをア ガロースゲル電気泳動によって分離し、マーカをエチジウムブロマイド検出で視 覚化することにより、T4 DNAポリメラーゼの二重鎖3’−5’エキソヌク レアーゼ活性を測定した(Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and T.Maniatis,(1989)Molecular Cloni ng:A Laboratory Manual,2nd ed.,p.6.3 −6.19)。エキソヌクレアーゼ活性により、バンドが、ゲル上のより小さい サイズに変わる。 製造業者によって供給される酵素緩衝液内で、室温で圧力をかけ、さらに本質 的には実施例1の述べたように、T4 DNAポリメラーゼ(United S tates Biochemical)の3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を 測定した。0.5%アガロースゲル上のバンド変化によって明らかであるように 、あよそ100個の塩基対を20分間、大気圧で消化した。基質が存在しない場 合、30,000psi以上の圧力での1時間の反応により、酵素が完全に、し かも不可逆的に不活性化された。基質が存在する場合、1時間の反応の間、酵素 を完全に、しかも不可逆的に不活性化するために、40,000psiの圧力を 必要とした。0.5%アガロースゲル上のバンド変化によって示すように、基質 が存在する場合の30,000psiでの1時間の反応によりラムダDNAから のおよそ100個の塩基対の欠失体を生じる。これらのデータは、カプセルに適 当な圧力を加えることにより、酵素の活性を不可逆的に終結することができ、そ れによって、DNAの消化の程度を正確に調節する手段を提供することになる。 実施例3 ラムダエキソヌクレアーゼによる調節された消化 この実施例では、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化の程度を調節するため に、静水圧を用いる。これらの実験のためのDAN基質は、プラスミドpBR3 22であり、この基質を線形にするためにEco RVで消化した。これらの実 験では、10μlの検定容積を用いた。これらの実験では、5μlの基質混合物 と5μlの酵素混合物を生成して、氷上で冷却した。基質混合物は、4μlの1 .33x検定緩衝液+1μlの線状pBR322DNA(およそ0.25μg) を含有した。酵素混合物は、4μlの1.33x検定緩衝液+1μlのラムダエ キソヌクレアーゼ(3.3単位)を含有した。1.33x検定緩衝液は、10μ lの10xラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液+4μlのアセチル化BSA(1. 0μg/μl)+61μlの蒸留水を含有した[10xラムダエキソヌクレアー ゼ緩衝液は670mM グリシン−KOH(pH9.4)および25mM Mg C l2を含有した]。実験を開始するために、酵素混合物を氷上の基質混合物に添 加した。その後、この溶液を、上記のようにカプセルにローディングした(p1 8参照)。その後、カプセルを5℃の反応室に置き、圧力を50,000psi まで急上昇させた。反応室に至るバルブを閉じ、さらに圧力をかけて、バルブと 共に反応室を装置から取り外し、30分間、20℃の水浴に入れた。その後、バ ルブおよび反応室を装置に再連結して、圧力を10,000psiまで急降下さ せ、望ましい期間だけ、そこで保持した。その後、圧力を30,000psiま で上昇させた。それから、バルブおよび反応室を装置から取り外し、−70℃の 冷凍庫に入れた。その後、凍結した試料を上記のように回復させた(p18参照 )。 上記のように、基質DNAをアガロースゲル電気泳動により分析した。これら の実験において用いられる酵素の濃度が高くなると、酵素消化が進むにつれて、 基質バンドがより小さいサイズに変化する。 結果として、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化の程度を、許容圧力で浪費 する時間を制限することにより調節できることが実証された。非反応時間対照サ ンプルレーンと実験レーンとの比較により、10,000psiで浪費する時間 が長くなると、消化の程度も増大することが実証された。 実施例4 ラムダエキソヌクレアーゼにより消化速度における圧力の効果 この実施例では、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化速度(すなわち、1秒 あたりに除去される塩基の数)が、種々の圧力および2つの温度で決定された。 この実施例では、基質は、ラムダDNAのHind III消化物を用いた。こ れらの実験では、最初の加圧の際、反応室の圧力を設定し、実験の間中、一定で あり、反応室は、実験の期間中、水浴に入れたままであった。上記の例外として は、実施例3で述べたように実験を行った。 ヌクレオチドモノリン酸塩が基質バンドの端部から取り外される速度は、アガ ロースゲル電気泳動の後に見られる変化したバンドの塩基対のサイズを評価して 決定された。酵素で処理されていないHind IIIフラグメントのログ[塩 基対]対移動距離を描くことにより、標準曲線を形成した。 20℃の温度で、10,000psi以下の圧力は、ラムダエキソヌクレアー ゼの速度にほとんど影響を与えない。20,000psi以上の圧力は、反応速 度をかなり減速させる。15℃の温度では、10,000psi以上の圧力によ り、反応速度がかなり減少する。データ(図14)は、初期の実験から現れるが 、30,000psiで酵素が完全に阻害されたことを示しているが、事実は異 なる。ここで示された阻害は、採用した検定法があまり感応的でないためであっ た。 実施例5 許容圧力での同等時間の1回の圧力サイクルと5分割の圧力サイクルとの比較 この実施例では、圧力を2分サイクルにより5回与えた場合に生じるバンド変 化を10分サイクルを1回で与えた場合と比較する。両方の場合、50,000 psiを阻害圧力として用い、5,000psiを許容(作用)圧力として用い た。実施例3で述べたように実験を行った。但し、以下の点で実施例と異なる。 基質混合物として0.34μgのHind III消化DNAを含有させた。酵 素化合物として0.8単位のラムダエキソヌクレアーゼを含有させた。圧力サイ クルは上記の通りであり、50,000psiで凍結停止を行った。 図6に示す結果は、両方のサイクリングプロトコルが同一パターンのバンドを 生成することを実証しており、それによって、5分割サイクル実験におけるさら に4回の開始および停止によって、消化の程度に検出可能な効果が得られなかっ たことを示している。この結果はまた、元の長さの基質バンドもゲル上に見られ るという事実に基づいて、酵素が50,000psiで解離していないことも示 唆している。 上記から、本発明が基質上の酵素活性を調節する改良した方法を提供すること が明らかとなるはずである。核酸の場合、本発明は、核酸の処理や一連の欠失体 の生成の実施を考慮し、消化の程度を調節することが可能である。消化の程度を 調節する能力は、欠失変異体を最終的に使用するかどうかに依存して、広くまた は接近してクラスター化された長さを有する欠失群の生成を定型化することがで きる。 実施例6 シーケナーゼ2.0 進行的酵素T7 DNAポリメラーゼ(E.C.2.7.7.7)(U.S. Biochemical Corp.,Cleveland、Ohio)の合成 形態であるシーケナーゼ2.0の活性を、基質としてラムダHind IIIを 用いて検定した。 ラムダフラグメントは、T4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Beverly、MA)の3’−5’エキソヌクレアーゼ活 性により、3’−5’方向で部分的に消化した。以下のものは、0.65mlの 微小遠心チューブ中で混合した:5X(5倍濃度)シーケナーゼ緩衝液(12μ l)、ラムダHind III(0.34μg/μl)および36μlの水。5 X シーケナーゼ緩衝液は、200mM Tris−HCl、pH7.5、10 0mM MgCl2および250mM NaClを含有する。チューブを、3分 間65℃の水浴に入れ、その後、氷浴に入れた。6μlのT4 DNAポリメラ ーゼ(3単位/μl)をチューブに加えた後、チューブを1時間、37℃の水浴 で反応させた。氷上で2分間から5分間、チューブを冷却させた後、チューブの 内容物をカプセルに移し、カプセルをバージョン1の冷却反応室にローディング した。カプセルは特注のものであり、ポリエチレン分注ピペットの一端部を熱シ ーリングし、短く切断したものである。反応室の圧力を50,000psiまで 上昇させ、1時間維持してT4 DNAポリメラーゼの活性を阻害した。反応室 の圧力を2分間から4分間、大気圧に戻した後、カプセルから基質混合物を除去 した。 32μlの溶液あたり2μlの100mM DTTを添加することにより、上 記基質溶液をDTT 5.9mMにした。この希釈液を8.5マイクロリットル だけ、カプセルに入れて、1μlの希釈したシーケナーゼ(3単位/μl)を添 加した。その後、カプセルをバージョン2の開放した冷却(−5℃)反応室に置 き、2分間反応させて、カプセルを冷却した。開放した反応室内で、1μlの冷 却(およそ0℃)dNTP溶液をカプセルにピペットで移した後、カプセル内の 溶液を、およそ20μlの冷却シリコン油(melting point ba th oil、Sigma Chemical Co.,St.Louis、M O)で覆った。dNTP溶液は、4mM dATP、4mM dCTP、4mM dGTP、4mM dTTP、40mM Tris−HCl、pH7.5、2 0mM MgCl2および50mM NaClを含有した。その後、反応室をシ ーリングして、望ましい圧力まで加圧した。 20±1℃にサーモスタットで調温した溶液を反応室の周りで循環させ、反応 室およびカプセルの温度を酵素作用温度まで上げた。選択した試験圧力での標準 10分反応を行い、カプセル温度を作用温度に到達させた。続いて、3つの異な る圧力プロファイル(1)から(3)までを行い、圧力に対する酵素活性の応答 を決定した。これらの実験では、温度を用いたため、遷移時間が必要以上に長く なった。 (1) あらゆる圧力で(20,000、30,000および40,000p si)、非反応時間実験を行った。この実験は、試料のローディングおよび回復 の際、酵素活性が存在するかどうかを決定した。プロファイル:40,000p si、サーモスタットで調温した溶液20℃、10分間(上記参照);40,0 00psi、サーモスタットで調温した溶液−12±2℃、12分間;圧力を大 気圧まで降下させ、凍結試料を回復させる。 (2) 圧力で酵素活性を決定するために、以下のプロファイルを使用した: 40,000psi、サーモスタットで調温した溶液20℃、10分間(大気か ら40,000psiまでの遷移時間は5秒から15秒までである);40,0 00psi、サーモスタットで調温した溶液20℃、さらに20分間、40,0 00psi、サーモスタットで調温された溶液−12±2℃、12分間;圧力を 大気圧まで降下させ(遷移時間は5秒から15秒までであった)、凍結試料を回 復させる。 (3) 圧力処理の後、酵素活性を決定するために、以下のプロファイルを使 用した:40,000psi、サーモスタットで調温した溶液20℃、10分間 ;40,000psi、サーモスタットで調温した溶液20℃、さらに20分間 ;25msecの遷移時間で圧力を300±150psiまで降下、サーモスタ ットで調温した溶液20℃、10分間;圧力を大気圧まで降下する。サーモスタ ットで調温した溶液20℃、試料を回復する。 カプセルのシーリング端部を切断して、4μlの50mM EDTA pH8 .0、0.35%硫酸ドデシルナトリウム、17.5%グリセリンでカプセルの 内容物を遠心分離して、各試料をカプセルから回復した。0.5%アガロースゲ ル上の電気泳動により、試料内のDNAフラグメントのサイズを決定した。以下 の実施例8のように、この検定では、シーケナーゼ活性により、拡散小型基質バ ンドが一定のサイズのより大きいサイズのバンドに変化した。電気泳動の後、エ チジウムブロマイドで染色して、ゲルを撮影した。写真を目視検査して、シーケ ナーゼ活性を評価した(表2参照、結果は±10%)。所定の圧力を加え酵素反 応を行い得られたバンドパターンが非反応時間実験によるバンドパターンと同一 である場合には、その圧力では検出可能な酵素活性を示さないものと判定された 。後圧力試料(3)における一定サイズのバンドの存在は、圧力処理後の酵素活 性の回復を示すものと解釈された。 実施例7 制限エンドヌクレアーゼHind III 2つのHind III開裂部位を有するビオチニル化PCR生成物を基質と して用いて、分布酵素である制限エンドヌクレーゼHind III(E.C. 3.1.21.4)を37℃で検定した。 PCR生成物は、ビオチニル化Lac ZフォワードプライマおよびLac Zリバースプライマ(Genosys Biotechnologies In c.,Woodlands、TX)を用いて生成した。dCTPは、Prome ga、Madison、WIのものを使用した。対照テンプレートおよびPCR 反応のための他のすべての成分は、Life Technologies、Ga ithersburg、MDのPCR非放射性標識付けシステムからのものであ った。このシステムのPCR生成物は、Hind III開裂部位に対して含有 する898塩基対フラグメントである。一つは、ビオチニル化端部からのおよそ 126個の塩基対であり、もう一つは、ビオチニル化端部からのおよそ348個 の塩基対である。DNA混合物は、0.5μlのPCR生成物(およそ25ng )、0.5μlの10X緩衝液および4μlの水を含有した。酵素混合物は、1 μlのHind III(100単位/μl、New England Bio labs、Beverly、MA)、0.5μlの10X緩衝液、および3.5 μlの水を含有した。10X緩衝液は、100mM Tris−HCl、pH7 .9、100mM MgCl2、500mM NaClおよび10mM DTT を含有した。 上記DNAおよび酵素混合物は、別々のチューブで氷上で冷却される。5マイ クロリットルの酵素を5μlのDNA溶液に添加し、氷上で混合し、冷却したカ プセルに迅速に移し、冷却(およそ−15℃)シリコン油で覆った。冷却した( −5℃)反応室(バージョン2)にカプセルをローディングした後、反応室を3 0,000psiまで加圧した。サーモスタットで調温した37℃の溶液が10 分間、反応室を循環する状態で、圧力を30,000psiに維持した。4秒間 の単一圧力パルスを加えた。パルスは、圧力を300psi±200psiに変 化させ、反応室をサーモスタットで37℃に調温した。遷移時間は、およそ25 ミリ秒であった。圧力を30,000psiに維持しながら、サーモスタットで −12℃に調温した溶液を12分間、反応室を循環させて、次の工程で酵素阻害 を確実にした。次の工程では、圧力を大気圧まで下げ、冷却カプセルを取り外し た。 単一サイクル時間が8秒、12秒、16秒および20秒であることを除いて、 上記のように、さらに他の試料を検定した。負の圧力をかけない非反応時間も、 検定した。実施例6のように、試料を回復した。2%アガロースゲル上の電気泳 動により試料を分析し、エチジウムブロマイドで染色した。非反応時間試料は、 生成物由来のバンドは現れなかった、すなわち、30,000psiでは検出可 能活性が存在しなかった。4秒パルス試料が、わずかな生成物バンドを有してお り、パルス時間が4秒から20秒まで長くなると、生成物バンドの強度が増大し た。20秒パルス試料は、わずかな基質バンドを有し、これによって、20秒の 酵素活性の後、消化が完全でないこと示した。 酵素活性は、30,000psi(±6%)で阻害された。300psi±2 00psiの外界圧力まで減圧することで、酵素活性を回復した。 実施例8 多数の短い圧力パルスを有するラムダエキソヌクレアーゼ この実験では、ラムダHind IIIフラグメントのラムダエキソヌクレア ーゼ消化を、多数の短い圧力パルスを用いて研究した。1回の検定につきDNA 混合物は、2μlのラムダHind IIIフラグメント(0.34μg/μl 、IBI、New Haven、CT)および8μlの1.33X検定緩衝液を 含有させた。酵素混合物は、1回の検定につき、1μlのラムダエキソヌクレア ーゼ(5単位/μl、Life Technologies Inc.,Gai thersburg、MD)、1μlの水、および8μlの1.33X検定緩衝 液を含有させた。[1.33X検定緩衝液は、89mMグリシン−KOH、pH 9.4、3.3mM MgCl2、BSA 34μg/mlを含む]上記DNA および酵素混合物は、別々のチューブで氷上で冷却した。その後、10μlの酵 素を10μlのDNA溶液に添加して、氷上で混合した。その直後に、この混合 物を冷却ブロック(およそ−20℃から−10℃)内の冷却カプセル(およそ− 15℃から−5℃)に移して、冷却した(およそ−20℃から−15℃)のシリ コン油で覆った。その後、カプセルをバージョン2の冷却(−5℃)反応室にロ ーディングし、加圧した。それから、圧力は30,000±2,000psiに 保持され、サーモスタットで20℃に調温した溶液を12分間、反応室を循環さ せた。その後、反応室の圧力を2.02±0.02秒のサイクル時間で、210 ±20m秒間、300±100psiまでパルシングした。パルス時間は、30 ,000psi未満の合計時間のオシロスコープ測定による推定値であり、δta,y +ta,y + ti,z に等しい。オシロスコープは、170±20m秒で ある1 5,000psi未満の合計時間を測定したのみであった。1つのパルスからパ ルス時間を含む次のパルスまでの時間は、2.02秒であった。反応室および試 料は、合計594±2回パルシングが加えられた。30,000psiの圧力で は、サーモスタットで−12℃に調温した溶液を12分間、反応室を循環させて 、カプセル内の試料を凍結させた。その後、およそ30m秒で、圧力を大気圧ま で降下させた。8μlの停止緩衝液を用いたことを除いて、実施例6と同様に試 料を回復させた。また、非反応時間に17分を加えた時間、30,000psi で、パルシングを行わないで試料を検定した。1.3μg/mlのエチジウムブ ロマイドと、0.5X TBE=(45mM Tris−borate、1mM EDTA)とを含有する0.5%アガロースゲル上で、上記試料を検定した。 ゲルは、23ボルトで16時間、検定し、その後、撮影した。非反応時間に17 分を加えた時間による対照試料を用いて、パルシング実験中に30,000ps iで生じた酵素活性を評価した。30,000psiおよび20℃では、酵素は およそ0.1塩基/秒の速度である。パルシングした試料でのバンド変化は、非 反応時間に17分を加えた時間による対照のバンドよりも大きかった。パルシン グした試料において除去した塩基の合計から、非反応時間で17分を加えた時間 による対照実験で除去した塩基の数を引くことにより、パルス間で除去した塩基 の数が得られる。パルシングの際に除去した塩基の平均数は、350±60であ り、これによって、酵素は1パルスにつき、平均0.6個の塩基を加水分解した ことになる。 実施例9 パルス長の異なる多数の短い圧力パルスを有するラムダエキソヌクレアーゼ この実験では、ラムダHind IIIフラグメントに対するラムダエキソヌ クレアーゼの作用を、様々な圧力パルス長で研究した。1回の検定あたりのDN A混合物は、2μlのラムダHind IIIフラグメント(0.34μg/μ l、IBI)と、8μlの1.33X検定緩衝液とを含有する。酵素混合物は、 1回の検定につき、1μlのラムダエキソヌクレアーゼ(5単位/μl,Lif e Technologies Inc.,Gaithersburg、MD) 、 1μlの水、および8μlの1.33X検定緩衝液を含有する。[1.33X検 定緩衝液は、89mMグリシン−KOH、pH9.4、3.3mM MgCl2 およびBSA 34μg/mlを含有した]上記DNAおよび酵素混合物は、別 々のチューブで氷上で冷却した。その後、10μlの酵素を10μlのDNA溶 液に添加して、氷上で混合した。その直後に、この混合物を冷却ブロック(およ そ−20℃から−10℃)内の冷却カプセル(およそ−15℃から−5℃)に移 して、冷却したシリコン油(およそ−20℃から−15℃)で覆った。その後、 カプセルをバージョン2.0の冷却(−5℃)反応室にローディングし、加圧し た。それから、圧力は40,000±2,000psiに保持され、サーモスタ ットで20℃に調温した溶液を8分間、反応室を循環させた。その後、反応室の 圧力を2.02±0.02秒のサイクル時間で、430±20m秒間、300± 100psiまでパルシングした。パルス時間は、40,000psi未満の合 計時間の椎定値であり、δta,y(40,000psiから300psiまでの 遷移時間)+ta,y(300psiでの時間)+δti,z(300psiから40 ,000psiまでの遷移時間)に等しい。サイクル時間は、パルス時間にδti,z 後でδta,y+l前に40,000psiでの時間を加えたものに等しい。オシ ロスコープによれば、20,000psi未満のパルス時間は、370±20m 秒であった。1つのパルスからパルス時間を含む次のパルスまでの時間は、2. 02秒であった。反応室および試料は、合計500±2回パルシングした。40 ,000psiの圧力では、サーモスタットで−12℃に調温した溶液を12分 間、反応室を循環させて、カプセル内の試料を凍結させた。その後、およそ15 m秒で、圧力を大気圧まで降下させた。8μlの停止緩衝液を用いたことを除い ては、実施例6のと同様に試料を回復させた。590±20ミリ秒のパルス時間 を用いて、上記のように、さらに他の試料を検定した。パルシングを行わず、非 反応時間に40,000psiで12分23秒を加えた時間を必要とする調節試 料も検定した。上記試料は、実施例7で述べたように、0.5%アガロースゲル 上で、検定した。非反応時間に12分23秒を加えた時間の試料は、検出可能な 活性を示さなかった。バンドは、酵素調節を行わないバンドと同様であった。パ ルシングした試料に対して、変化したバンドのリーディングエッジを用いて、エ キソヌ クレアーゼによって消化した塩基の数を決定した。430m秒のパルス時間で、 酵素は、1つのパルスにつき平均0.6±0.2個の塩基を加水分解し、590 m秒のパルス時間で、酵素は、1つのパルスにつき平均1.1±0.2個の塩基 を加水分解した。 実施例10 迅速なパルスを用いたバージョン3.0フロースルー 既知の配列のターゲットDNAを用いて、PCR生成物を得る。1つは5’− NH2プライマであり、もう1つは5’−リン酸プライマである。このPCR生 成物は、アミン反応性固体支持部上に固定化される(例えば、EMPHAZE ビーズ、3M、St.Paul、MN)。PCR生成物の固定化は、ラムダエキ ソヌクレアーゼによる消化を遊離の5’−末端部(すなわち、リン酸化端部)の みに限定する。固定化DNAを有する固体支持部を反応室に置き、バージョン3 .0にローディングする。反応室には、ビーズを保持するのに充分な細孔サイズ の2つのフリットが取り付けられており、反応生成物を後に検出するのに充分な ビーズ容積を含む。 反応室を、緩衝液A(67mM グリシン−KOH、pH9.4)を用いて大 気圧で洗浄する。反応室およびそれに流れ込む洗浄液を、20℃の温度に平衡さ せる。その後、50μl/mlのBSAおよび5単位/20μlのラムダエキソ ヌクレアーゼも含有する緩衝液Aを用いて、反応室を洗浄する。Mg++が存在し ない状態で、酵素はDNAに結合するが、触媒として活性状態ではない。反応室 の圧力を40,000psiまで上げ、その後、反応室を2.5mM MgCl2 (緩衝液B)を含有する緩衝液Aを用いて洗浄する。その後、反応室の圧力を 、590m秒間、300±200psiにパルシングする。圧力を、パルスの端 部で40,000psiに戻す。その後、反応室を100μlから300μlま での緩衝液Bを用いて、40,000psiで洗浄して、ラムダエキソヌクレア ーゼの作用で放出した遊離ヌクレオチド5’−モノリン酸塩を除去する。洗浄液 は、後の分析のために集める。後の590m秒パルスおよび洗浄液は、上記のよ うに繰り返し適用される。分析のために洗浄液を集める。 集めた洗浄液を質量分析計によって分析し、各洗浄液に存在するヌクレオチド 5’−モノリン酸塩を同定する。この情報を用いて、ラムダエキソヌクレアーゼ によって消化される鎖のヌクレオチド配列を決定する。 他の実施形態 上記から、当業者は、発明の精神および範囲を逸脱することなく、その本質的 特徴を確認することが可能であり、また、発明の種々の変更および変形を行って 、様々な利用および条件に適合させることが可能である。ここで述べた引例はす べて、参考文献として組み入れている。 例えば、開示した反応器は、殺菌、滅菌、タンパク質毒素の不活性化、食肉軟 化、液体中のガスの可溶化、液体脱気、脱水または抽出、物質交代の変化および 微生物の遺伝子発現、好圧微生物の研究、物質の結晶化および精製、ならびにコ ーティングの含浸等の工業用表面処理のような工程でも使用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD ,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,HU,I S,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LK,LR ,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN, MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,S D,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,TT ,UA,UG,US,UZ,VN (72)発明者 ルド エドウィン エイ アメリカ合衆国 ニューハンプシャー州 サレム ブルック ダール ロード 52 (72)発明者 グリーン デイビット ジェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウ ィンチェスター アンバー ウッド ドラ イブ 51

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 調節した感圧反応を実行するための圧力サイクリング反応器であって、 試料を収容するための反応容器と、 前記反応容器に連結した容器加圧器と、 前記加圧器のシグナルにより、前記反応容器内の反応不活性化圧力を維持し、 前記加圧器へのシグナルにより所定の短くパルシングした期間に前記反応容器の 圧力を反応活性化圧力に変化させ、その後、前記反応容器の反応不活性化圧力に リサイクルさせるためのコントローラと、を備える、圧力サイクリング反応器。 2. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記加圧器が、お よそ250ミリ秒未満で、20,000psi以上圧力を変化させることを特徴 とする圧力サイクリング反応器。 3. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器とを 連通する流体源をさらに備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 4. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記容器加圧器が 圧力室を備え、前記圧力室が、前記コントローラに応答して、前記反応容器と連 通するように前記反応容器に連結されることを特徴とする圧力サイクリング反応 器。 5. 請求項4に記載の圧力サイクリング反応器において、前記圧力室が空気 ポンプシンリンダを備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 6. 請求項4に記載の圧力サイクリング反応器において、 前記圧力室が可変容積を有し、 前記加圧器が、圧力源に連結するための圧力伝送器をさらに備え、 前記圧力伝送器が圧力室壁面に連結されて、前記壁面の位置を調節することに より前記圧力室容積を調節することを特徴とする圧力サイクリング反応器。 7. 請求項6に記載の圧力サイクリング反応器において、前記圧力伝送器が 空気シリンダを備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 8. 請求項6に記載の圧力サイクリング反応器において、前記圧力伝送器の 圧力を急速に調節して、前記反応容器内で圧力パルスを発生するためのリリーフ バルブをさらに備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 9. 請求項4に記載の圧力サイクリング反応器において、前記圧力室と前記 反応容器との間に位置決めした圧力室アウトレットバルブをさらに備えることを 特徴とする圧力サイクリング反応器。 10. 請求項4に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器と 連通する流体源と、前記流体源と前記圧力室との間に位置決めした圧力室インレ ットバルブとをさらに備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 11. 請求項10に記載の圧力サイクリング反応器において、前記流体源が 貯蔵室圧力源に連結するための流体貯蔵室と、貯蔵室調節バルブとを備え、前記 圧力室を介して、前記流体貯蔵室から前記反応容器に流体を移動し、その間、前 記反応容器の圧力が調節されることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 12. 請求項11に記載の圧力サイクリング反応器において、前記流体貯蔵 室に連結した温度センサと、貯蔵容器加熱および/または冷却源とをさらに備え 、前記貯蔵室内の前記流体の温度が調節されることを特徴とする圧力サイクリン グ反応器。 13. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器お よび前記コントローラに連結した圧力センサをさらに備え、前記コントローラが 前記圧力容器の圧力をモニタすることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 14. 請求項13に記載の圧力サイクリング反応器において、前記圧力室の 圧力を調整するための圧力レギュレータをさらに備え、前記コントローラが、前 記圧力センサからのフィードバックを用いて前記圧力レギュレータを調節するこ とを特徴とする圧力サイクリング反応器。 15. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記容器加圧器 が第1の容器加圧器であり、 前記反応器が、前記反応容器に連結した第2の容器加圧器をさらに備え、それ によって、前記反応室の圧力を調節する間、流体を前記反応室から除去すること を特徴とする圧力サイクリング反応器。 16. 請求項15に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器 と前記第2の容器加圧器との間に配置した第2の容器加圧器インレットバルブを さらに備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 17. 請求項15に記載の圧力サイクリング反応器において、第2の流体貯 蔵室と、前記第2の流体貯蔵室と前記第2の容器加圧器との間に配置した第2の 容器加圧器アウトレットバルブとをさらに備えることを特徴とする圧力サイクリ ング反応器。 18. 請求項17に記載の圧力サイクリング反応器において、前記第2の流 体貯蔵室に連結した第2の貯蔵室コントロールバルブをさらに備えることを特徴 とする圧力サイクリング反応器。 19. 請求項15に記載の圧力サイクリング反応器において、前記コントロ ーラが、所定の組の格納信号により複数個のバルブを調節し、前記信号は、少な くとも1つの加圧した試薬流体を前記反応容器に添加し、少なくとも1つの加圧 した反応流体を前記反応容器から除去し、その間、前記反応容器に圧力をかけた ままであることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 20. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器に 連結した温度センサと、反応容器加熱および/または冷却源とをさらに備え、前 記反応容器の温度が調節されることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 21. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器内 の流体内に存在するか、または前記反応容器から除去された成分の特性を検出す るために連結した検出器をさらに備えることを特徴とする圧力サイクリング反応 器。 22. 請求項21に記載の圧力サイクリング反応器において、前記検出器が 、放射性同位元素検出器、赤外分光計、質量分析計、ガスクロマトグラフィー質 量分析計、分光光度計、分光蛍光計、電気化学検出器、表面プラスモン共振検出 器および光度計から成る群から選択されることを特徴とする圧力サイクリング反 応器。 23. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記反応容器が 、前記反応容器から流体を除去しながら、前記容器内に固定化試薬を保持するた めの抑制部を備えることを特徴とする圧力サイクリング反応器。 24. 請求項23に記載の圧力サイクリング反応器において、前記固定化試 薬が、非液体支持部に装着した有機成分を備えることを特徴とする圧力サイクリ ング反応器。 25. 請求項1に記載の圧力サイクリング反応器において、前記抑制部が、 前記反応容器を2つの部分に分割する半透性バリアを備えることを特徴とする圧 力サイクリング反応器。 26. 試料の温度および圧力状態を調節することにより、前記試料の活性を 断続的に阻害するための反応器は、 前記試料を受入れるための室を定める反応器本体と、 前記試料の活性を阻害するために選択された第1の所定圧力を前記室に加える ための第1の位置と、前記試料の活性を与えるために選択した第2の所定圧力に 前記室圧力を変化させるための第2の位置との間で移動するために取り付けられ た、前記室と連通する加圧器と、 第1の状態と第2の状態とを有し、前記第1の位置と前記第2の位置との間で 前記加圧器を移動させるためのスイッチと、 前記第1および第2の状態間で前記スイッチを変化させるためのコントローラ と、 前記室内の温度を調整するための手段と、 前記室と連通し、前記室から前記試料を除去するためのポートとを備える、反 応器。 27. 試料に加えた圧力を調節することにより、前記試料の活性を断続的に 阻害するための反応器は、 試験試薬を収容するための流体貯蔵室と、 試料を受けるための室を定める反応器本体と、 前記室が加圧されている間、前記試験試薬のフローを前記室内に供給するため のシステムとを備え、 前記システムは、前記流体貯蔵室と連通して、第1のコンジット内に配置した 第1のバルブと、 前記室と連通して、第2のコンジット内に配置した第2のバルブと、 前記流体貯蔵室と前記室との間に置かれ、前記第1のコンジットおよび前記第 2のコンジットと連通する第1の加圧器と、 前記第1の加圧器に関連して、前記第1の加圧器にベントをつけるための第3 のバルブとを備え、 前記第1のバルブが開位置、前記第2のバルブが閉位置にある状態で、前記貯 蔵室が前記第1の加圧器と連通して、前記第1の加圧器に流体フローを与え、前 記第1のバルブが閉位置、前記第2のバルブが開位置及び前記第3のバルブが閉 位置にある状態で、前記加圧器が前記室と連通して、前記室を加圧し、前記第1 のバルブが閉位置、及び前記第2のバルブが開位置及び前記第3のバルブが開位 置と閉位置との間でサイクリングしている状態で、前記室の前記圧力がパルシン グされることを特徴とする反応器。 28. 請求項27に記載の反応器において、前記室から試験物質のフローを さらに供給し、前記システムは、 前記室と連通して、第3のコンジット内に配置した第4のバルブと、 前記第3のコンジットの下流で、第4のコンジット内に配置した第5のバルブ と、 前記室の下流に置かれ、前記第3のコンジットおよび前記第4のコンジットと 連通する第2の加圧器と、 前記第2の加圧器に関連して、前記第2の加圧器にベントをつけるための第6 のバルブとを備え、 前記第1のバルブが閉位置、前記第2のバルブが開位置、前記第3のバルブが 閉位置及び前記第4のバルブが閉位置にある状態で、前記加圧器が前記室と連通 して、前記室を加圧し、前記第1のバルブが閉位置、前記第2のバルブが開位置 、前記第3のバルブが開位置と閉位置との間でサイクリングし、及び前記第4の バルブが閉位置にある状態で、前記室の前記圧力がパルシングされ、 前記第1のバルブが閉位置、前記第2のバルブが開位置、前記第3のバルブが 閉位置、前記第4のバルブが開位置、前記第5のバルブが閉位置及び前記第6の バルブが開位置にある状態で、前記第1の加圧器が前記第2の加圧器と連通して 、前記第1の加圧器から、前記室を介して、前記第2の加圧器に至るフロースル ーを可能にすることを特徴とする反応器。 29. (i)可逆的不活性化圧力で試料容器内で試料混合物を供給する工程 を備え、前記試料混合物は酵素を含有しており、さらに (ii)前記試料混合物を活性化圧力に晒す工程と、 (iii)前記試料混合物を不活性化圧力に晒し、それによって酵素反応を調節 する工程とを備えることを特徴とする酵素反応調節方法。 30. 請求項29に記載の方法において、前記不活性化圧力が工程(i)に おいてPi,xであり、その圧力では、酵素反応工程が可逆的に阻害され、前記活 性化圧力が工程(ii)においてPa,yであり、その圧力では、前記酵素反応工程 を実施可能であり、前記露呈工程(ii)は、期間δta,yで、圧力をPa,yまで変 化させる工程を備え、前記不活性化圧力が工程(iii)においてPi,zであり、そ の圧力では、追加酵素反応工程が可逆的に阻害され、前記露呈工程(ii)は、期 間δti,zで、圧力をPi,zまで変化させる工程を備え、Xはゼロ以上の整数であ り、yは1以上の整数であり、zは1以上の整数であり、それによって、前記酵 素反応を調節することを特徴とする方法。 31. 請求項29に記載の方法において、工程(i)の前記試料混合物が、 前記酵素の基質をさらに備えることを特徴とする方法。 32. 請求項30に記載の方法において、工程(ii)と工程(iii)との間 で、前記活性化圧力Pa,yが、単一酵素事象の平均的長さに対応する期間ta,yだ け維持されることを特徴とする方法。 33. 請求項29に記載の方法において、前記酵素が分布特性を有すること を特徴とする方法。 34. 請求項29に記載の方法において、前記酵素が進行的特性を有するこ とを特徴とする方法。 35. 請求項29に記載の方法において、前記基質が、前記試料容器内で固 定化され、工程(iii)の後に、前記試料容器圧力を維持しながら、前記試料容 器から前記試料混合物の成分を除去する工程か、または前記試料容器圧力を維持 しながら前記試料混合物に液体を添加する工程をさらに備えることを特徴とする 方法。 36. 請求項35に記載の方法において、前記除去成分が、制限エンドヌク レアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ開裂生成物、エキソヌクレアーゼ、ヌクレオ チドまたはその組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする方法。 37. 請求項35に記載の方法において、前記除去成分が前記試料容器から 除去される時、半透性物質を通過させることを特徴とする方法。 38. 請求項29に記載の方法において、工程(iii)の後、前記試料混合 物の成分の特性を検出する工程をさらに備えることを特徴とする方法。 39. 請求項38に記載の方法において、前記特性が、放射能、蛍光、化学 発光、分子イオンチャージ/質量比、電気化学電位、発光、表面プラスモン共振 、および赤外吸収から選択されることを特徴とする方法。 40. 請求項32に記載の方法において、前記基質が核酸であり、前記酵素 が制限エンドヌクレアーゼであり、少なくとも1つの開裂フラグメントが前記核 酸基質から開裂されることを特徴とする方法。 41. 請求項32に記載の方法において、前記基質が、前記試料容器内で固 定化された核酸であり、前記酵素がエキソヌクレアーゼであり、少なくとも1つ のヌクレオチドが前記核酸基質から開裂されることを特徴とする方法。 42. 請求項41に記載の方法において、前記核酸が、二本鎖DNA、一本 鎖DNA、二本鎖および一本鎖領域の両方を含むDNA、およびRNAから選択 されることを特徴とする方法。 43. 請求項32に記載の方法において、前記基質が第1の基質であり、第 2の基質をさらに備え、前記酵素が前記第1の基質を前記第2の基質に装着する ことを特徴とする方法。 44. 請求項43に記載の方法において、前記第1の基質がヌクレオチドで あり、前記第2の基質がRNAオリゴヌクレオチドまたはDNAヌクレオチドを 含み、前記酵素は、前記第2の基質がRNAオリゴヌクレオチドであるポリリボ ヌクレオチドフォスフォリラーゼであり、前記第2の基質がDNAヌクレオチド であるターミナルトランスフェラーゼであることを特徴とする方法。 45. 請求項43に記載の方法において、前記第1の基質がヌクレオチドで あり、前記第2の基質がRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを備え、前記酵 素が酵素クラス2.7.7から選択されるトランスフェラーゼであることを特徴 とする方法。 46. 請求項32に記載の方法において、前記基質がキラルまたはプロキラ ル官能基を有する化合物であり、前記酵素が鏡像体特異的に前記基質上で作用す ることを特徴とする方法。 47. 請求項46に記載の方法において、前記酵素がプロテアーゼ、デヒド ロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、リパーゼまたはエステラーゼ であることを特徴とする方法。 48. 請求項29に記載の方法において、工程(i)ないし(iii)におけ る前記酵素が第1の酵素であり、工程(i)ないし(iii)における前記試料混 合物が第1の試料混合物であり、工程(iii)の後に以下の工程(iv)ないし(v i)を含み、すなわち、 (iv)試料容器内で第2の試料混合物を供給する工程をさらに備え、前記試料 混合物が、可逆的不活性化圧力Pi,jで第2の酵素を備え、前記第2の酵素は、 工程(i)ないし(iii)における前記第1の酵素と同一かまたは異なり、前記 試料容器は、工程(i)ないし(iii)における前記試料容器を同一であるか、 またはバルブによって前記第1の試料容器に連結した第2の試料容器であり、さ らに (v)前記第2の試料混合物を可逆的不活性化圧力に晒す工程と、 (vi)前記第2の試料混合物を可逆的活性化圧力に晒し、それによって、前記 第1および第2の酵素の酵素反応工程を調節し、期間δta,kの間、前記第2の 酵素の前記酵素反応工程が実施され得る圧力Pa,kに変化させる工程と、 (vi)期間δti,lの間、前記試料混合物の圧力を、前記第2の酵素の追加酵 素反応工程が可逆的に阻害される圧力Pi,lに変化させる工程とを備え、Pi,zが Pi,lに実質的に等しいことを特徴とする方法。 49. 請求項48に記載の方法において、前記第1および第2の酵素が同一 酵素であることを特徴とする方法。 50. 請求項49に記載の方法において、前記基質が前記試料容器内で固定 化され、前記第2の酵素が前記第1の酵素とは異なり、工程(iii)と(iv)と の間に、溶離液で溶離することによって前記試料混合物圧力を維持しながら、前 記試料容器から前記第1の酵素を除去する工程をさらに備えることを特徴とする 方法。 51. 請求項50に記載の方法において、前記基質が二本鎖核酸であり、前 記第1の酵素が5’−3’エキソヌクレアーゼであり、前記第2の酵素が3’− 5’エキソヌクレアーゼであり、それによって、前記第1の酵素で配列決定を行 って1つ以上のヌクレオチドを同定し、また前記第2の酵素で配列決定を行って 1つ以上のヌクレオチドを確認することを特徴とする方法。 52. 請求項29に記載の方法において、圧力Pi,xでの前記試料混合物が 温度Ti,xであり、それによって前記酵素が阻害され、圧力Pa,yでの前記試料混 合物が温度Ta,yであり、それによって前記酵素が活性であり、圧力Pi,zでの前 記試料混合物が温度Ti,zであり、それによって前記酵素が阻害され、Ti,zおよ びTa,yの各々がTi,xと独立して同じか、または異なることを特徴とする方法。 53. 請求項29に記載の方法において、δta,yおよびδti,zの各々が1 0ミリ秒から250ミリ秒までの範囲であることを特徴とする方法。 54. 請求項32に記載の方法において、合計(δta,y+ta,y+δti,z )が1000ミリ秒以下であることを特徴とする方法。 55. 請求項29に記載の方法において、工程(i)ないし(iii)が1サ イクルであり、工程(i)ないし(iii)のサイクルを少なくとも49回繰り返 す工程をさらに備え、サイクルにおける各々の値Pi,x、Pi,z、δta,y、Pa,y およびδti,zが、他のどのサイクルのそれぞれの値からも独立していることを 特徴とする方法。 56. 請求項48に記載の方法において、工程(iv)ないし(vi)が1サイ クルであり、工程(iv)ないし(vi)のサイクルを少なくとも49回繰り返す工 程をさらに備えることを特徴とする方法。 57. 請求項29に記載の方法において、前記試料混合物の圧力を維持しな がら、前記試料混合物に流体を添加する工程をさらに備えることを特徴とする方 法。 58. 請求項29に記載の方法において、前記試料混合物の圧力を維持しな がら、前記試料容器から、前記試料混合物の成分を除去する工程をさらに備える ことを特徴とする方法。 59. 反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす方法は、 (i)試料容器に試料混合物を供給する工程を備え、前記試料混合物は、圧力 P0、温度T0であり、さらに、 (ii)前記試料混合物の温度をT1に変化させる工程と、 (iii)前記反応混合物の圧力を、期間δt1の間、P1まで上昇させる工程と を備え、P1は、P0よりも少なくとも10,000psiだけ大きく、さらに、 (iv)前記反応混合物の前記圧力をP2まで低下させ、それによって、高圧で 前記反応の熱力学的平衡に影響を及ぼす工程を備えることを特徴とする方法。 60. 請求項59に記載の方法において、前記圧力上昇工程(iii)の後に 、前記試料混合物を反応させる工程をさらに備えることを特徴とする方法。 61. 請求項59に記載の方法において、前記試料混合物が触媒を含み、前 記圧力上昇工程(iii)の後に、生成物を前記触媒から解離させる工程をさらに 備えることを特徴とする方法。 62. 請求項59に記載の方法において、工程(iii)の後に、前記試料容 器から、前記試料混合物の成分を除去する工程をさらに備えることを特徴とする 方法。 63. 核酸を処理する方法は、 a)i)試料容器と、ii)核酸基質と、iii)前記核酸基質に作用可能な酵素 と、iv)前記容器の圧力を調節する加圧器とを、いずれかの順で調整する工程と 、 b)前記酵素および前記核酸を含む溶液を前記試料容器に供給し、前記酵素を 不活性化圧力状態で維持する工程と、 c)調節した期間に前記試料容器の圧力を酵素活性化圧力に変化させ、その結 果、前記期間中に、前記酵素が活性状態になり、前記核酸基質に作用する工程と を備えることを特徴とする方法。 64. 請求項63に記載の方法において、前記核酸が二本鎖DNAであるこ とを特徴とする方法。 65. 請求項63に記載の方法において、前記酵素がエキソヌクレアーゼで あることを特徴とする方法。 66. 請求項65に記載の方法において、前記エキソヌクレアーゼがラムダ エキソヌクレアーゼであることを特徴とする方法。 67. 請求項63に記載の方法において、前記酵素がDNAポリメラーゼま たはRNAポリメラーゼであることを特徴とする方法。 68. 請求項63に記載の方法において、前記酵素が進行的特性を有するこ とを特徴とする方法。 69. 請求項63に記載の方法において、前記酵素が前記核酸基質を改変す ることを特徴とする方法。 70. 請求項69に記載の方法において、反応生成物を検出する工程をさら に備えることを特徴とする方法。 71. 請求項63に記載の方法において、反応容器温度を調節する工程をさ らに備え、前記不活性化圧力状態には、反応容器圧力を前記酵素活性化圧力まで 低下させた場合に高レベルの酵素活性を許容する温度が含まれることを特徴とす る方法。 72. 請求項71に記載の方法において、前記反応容器を低い酵素不活性化 温度および酵素活性化圧力に維持する工程と、前記圧力を酵素不活性化圧力まで 上昇させる工程と、前記温度を酵素活性化温度まで下げる工程と、その後、前記 圧力を酵素活性化圧力まで低下させる工程とをさらに備えることを特徴とする方 法。 73. 請求項72に記載の方法において、 a)前記酵素をおよそ5℃未満の不活性化温度に維持し、それによって、前記 酵素を実質的に不活性状態にする工程と、 b)前記核酸基質を前記不活性酵素に添加して、反応混合物を生成する工程と 、 c)前記試料容器の圧力を、平方インチあたりおよそ30,000ポンドより も高い酵素不活性化圧力まで上昇させる工程と、 d)前記試料容器の前記反応混合物の温度を、およそ10℃よりも高く上げる 工程と、 e)調節した期間に、前記試料容器の前記圧力を平方インチあたりおよそ20 ,000ポンド未満の酵素活性化圧力まで下げることによって、前記酵素が前記 核酸基質に作用するように前記酵素を活性状態にする工程と、 f)前記試料容器の前記圧力を酵素不活性化圧力まで上昇させる工程とを備え ることを特徴とする方法。 74. 請求項73に記載の方法において、前記酵素活性化圧力が、平方イン チあたりおよそ5,000ポンドから15,000ポンドまでの圧力であること を特徴とする方法。 75. 請求項73に記載の方法において、前記酵素活性化温度が、およそ1 5℃から20℃であることを特徴とする方法。 76. 請求項73に記載の方法において、 d)前記試料容器の前記圧力を、酵素不活性化圧力に変化させる工程と、 e)工程c)およびd)のサイクルを少なくとも1回繰り返す工程とを備える ことを特徴とする方法。 77. 請求項76に記載の方法において、工程c)およびd)の前記サイク ルを少なくとも5回繰り返すことを特徴とする方法。 78. 請求項63に記載の方法において、前記酵素不活性化圧力が前記酵素 活性化圧力よりも高いことを特徴とする方法。 79. 請求項63に記載の方法において、前記酵素が分布特性を有すること を特徴とする方法。
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