JP2002176989A - 磁気微粒子膜特異的タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の課題は、磁性細菌（Magnetospirill
um sp.）ＡＭＢ−１由来の磁気微粒子膜特異的タンパク
質Ｍｍｓ１６、それをコードするＤＮＡ、及びそれらを
利用したサンドイッチイムノアッセイ法や医薬組成物等
を提供すること。 【解決手段】 磁性細菌の細胞破砕液を細胞膜、磁気微
粒子膜、細胞質の三画分に分画し、それぞれのタンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを比較し、磁性細菌
粒子膜特異的な新規タンパク質Ｍｍｓ１６を同定した。
また、かかるタンパク質のアミノ酸配列やこのタンパク
質をコードする遺伝子の塩基配列を決定し、かかるタン
パク質がＧＴＰａｓｅ活性を示すことを確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、磁気微粒子膜特異
的なタンパク質Ｍｍｓ１６、それをコードするＤＮＡ、
及びそれらの利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】磁性細菌が生成する磁性細菌粒子は、菌
体内ではマグネトソーム（magnetosome）と呼ばれる粒
径５０〜１００ｎｍの磁気微粒子が１０〜２０個チェー
ン状に連なった構造をしており、厚さ約２〜４ｎｍの有
機膜で覆われている。また、磁性細菌によって合成され
る磁性細菌粒子の形態は、八面体形、六角柱、弾丸状な
どの形状があり、これらの形態は種特異的であることが
観察されている（Appl.Microbiol. Biotechnol. 52, 46
4-73, 1999）。この事実は、磁性細菌において種特異的
な結晶の形態制御機構の存在を強く示唆しており、その
制御機構は磁性細菌粒子膜上の膜タンパク質が関与して
いると考えられている（Adv. Microbiol. Biotechnol.
31, 125-181, 1990）。また、小胞内でマグネタイトを
形成するためには、マグネトソーム特異的なタンパク質
が鉄イオンの蓄積や結晶核形成、鉱物の還元、ｐＨのコ
ントロールなどの特異的な機能を担っていることが期待
されている（Adv. Microbiol. Biotechnol. 31, 125-18
1, 1990、J. Bacteriol. 170, 834-841, 1988）。

【０００３】磁気微粒子膜上のタンパク質について、こ
れまでに、Gorby et al.（J. Bacteriol. 170, 834-84
1, 1988）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる細胞膜と磁気微
粒子膜、細胞質のタンパク質プロフィールの比較から、
１５，３３ｋＤａの磁気微粒子膜特異的なタンパク質を
ＭＳ−１株において観察した。Okuda et al.（Gene 17
1, 99-102, 1996）は、ＭＳ−１株において同じ手法で
低分子量のタンパク質を分画するためにTricine／ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行った。その結果、１２，２２，２８ｋ
Ｄａのタンパク質が磁気微粒子膜特異的であることを示
した。本発明者らもＡＭＢ−１株において、２４．８，
３５．６，６６．０ｋＤａの特異的なタンパク質を同定
した（Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 932-937,
2000）。これらの磁性細菌粒子膜特異的なタンパク質
のうち、２２ｋＤａタンパク質の遺伝子ｍａｍ２２（Ge
ne 171, 99-102, 1996）および３５．６ｋＤａタンパク
質の遺伝子ｍｐｓＡ（Biochem. Biophys. Res. Commun.
268, 932-937, 2000）はクローニングされ、モチーフ
解析から機能は推定されているが、機能解析は行われて
おらず、他のタンパク質についてもその後の報告はな
い。また本発明者らにより分離された磁性細菌生成関連
遺伝子ｍａｇＡが、鉄輸送タンパク質をコードしてお
り、細胞膜および磁性細菌粒子膜上に局在することが報
告（J. Biol. Chem. 270, 28392-28396, 1995、J. Bioc
hem. 118, 23-27, 1995）されている。このＭａｇＡタ
ンパク質が、現在までに機能解析されている唯一の磁性
細菌粒子膜上のタンパク質である。

【０００４】いくつかの細菌は、光合成や硝化作用、メ
タンの酸化、窒素固定のような特化した代謝のための細
胞内膜構造を保持しているが、物質を内包するような膜
構造系を細胞内に保持する細菌が観察された報告はな
い。前述の代謝に関連した膜構造は細胞膜に由来するこ
とが観察されているが、その形成メカニズムについては
報告がなく、磁性細菌粒子膜がどこから由来したものか
は不明である。最近、本発明者は、磁性細菌（Magnetos
pirillum sp.）ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ７００２６４）の
磁性細菌粒子膜において特異的に発現する５つのタンパ
ク質、１２．０、１６．０、２４．８、３５．６（Ｍｐ
ｓＡ）及び６６．２ｋＤａのタンパク質を報告し（App
l. Biochem. Biotech. 84-86, 441-446, 2000）、また
磁性細菌粒子膜において最も多く発現している１６．０
ｋＤａのタンパク質が２次元電気泳動によって２つのス
ポットに分離することを報告しているが、その詳細につ
いてはわかっていなかった。

【０００５】他方、特開平５−２０９８８４号公報に
は、磁性細菌から抽出した磁性細菌粒子に、ピリジルジ
チオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを用
い、蛍光標識を行った抗体または抗原を固定化し、それ
らに対する抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行
い、凝集を生じさせたのち、これを磁気的に分離濃縮
し、蛍光濃度を測定することにより極めて微量の抗原、
抗体を精度よく検出できる方法が開示されている。ま
た、特開平６−２６１７４５号公報には、活性汚泥を用
いる汚水、下水等の処理に有用で、しかも均一な形状、
大きさのマグネタイト超微粒子の合成に有用な硫酸還元
能を有する磁気細菌が、特開平７−２４１１９２号公報
には、磁性細菌のマグネトソーム及び遺伝子を含有する
リポソームや、かかるリポソームに磁場を印加すること
により、該リポソームを細胞へ誘導し、該細胞と接触さ
せる工程を有する細胞への遺伝子の導入方法が開示され
ている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、磁性
細菌（Magnetospirillum sp.）ＡＭＢ−１由来の磁気微
粒子膜特異的タンパク質Ｍｍｓ１６（１６ｋＤａタンパ
ク質）、それをコードするＤＮＡ、及びそれらを利用し
たサンドイッチイムノアッセイ法や医薬組成物等を提供
することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、磁性細菌の細胞破砕液を
細胞膜、磁気微粒子膜、細胞質の三画分に分画し、それ
ぞれのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを比
較し、磁性細菌粒子膜特異的な新規のタンパク質Ｍｍｓ
１６を同定し、また、このタンパク質のアミノ酸配列や
かかるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を決定
し、このタンパク質のＮ末端部分配列がＧＴＰ結合タン
パク質と相同性を有し、ＧＴＰ結合能を有するＧＴＰａ
ｓｅであることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】すなわち本発明は、以下の(ａ)又は(ｂ)の
タンパク質をコードするＤＮＡ(ａ)配列番号２に示され
るアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番号２に示
されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつＧＴＰａｓｅ活性を有するタンパク質（請求項
１）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的
配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ
（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＴＰａｓｅ活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）
や、請求項２又は３記載のＤＮＡの一部からなることを
特徴とする高転写活性を有するプロモーター（請求項
４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質（請求項５）や、配列番号２に示されるアミノ
酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＴ
Ｐａｓｅ活性を有するタンパク質（請求項６）や、請求
項５又は６記載のタンパク質の一部からなり、かつＧＴ
Ｐａｓｅ活性を有するペプチド（請求項７）に関する。

【０００９】また本発明は、請求項５若しくは６記載の
タンパク質又は請求項７記載のペプチドと、機能性タン
パク質又は機能性ペプチドとを結合させた融合タンパク
質又は融合ペプチド（請求項８）や、機能性ペプチド
が、機能性タンパク質の一部又はペプチドタグであるこ
とを特徴とする請求項８記載の融合タンパク質又は融合
ペプチド（請求項９）や、機能性タンパク質が、抗原、
抗体、受容体、レクチン、ホルモン、結合性タンパク
質、酵素、及びマーカータンパク質から選ばれる１又は
２以上のタンパク質であることを特徴とする請求項８又
は９記載の融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項１
０）や、請求項５若しくは６記載のタンパク質又は請求
項７記載のペプチドに特異的に結合する抗体（請求項１
１）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と
する請求項１１記載の抗体（請求項１２）や、請求項１
１又は１２記載の抗体に特異的に結合し、かつＧＴＰａ
ｓｅ活性を有することを特徴とする組換えタンパク質又
はペプチド（請求項１３）に関する。

【００１０】また本発明は、請求項５若しくは６記載の
タンパク質、請求項７記載のペプチド、又は請求項８〜
１０のいずれか記載の融合タンパク質若しくは融合ペプ
チドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細
胞（請求項１４）や、宿主細胞が、宿主磁性細菌（Magn
etospirillum sp.）であることを特徴とする請求項１４
記載の宿主細胞（請求項１５）や、宿主磁性細菌（Magn
etospirillum sp.）が、ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４５８，ＡＴＣＣ７００２６４）、ＭＳ−１（ＩＦＯ
１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、
ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、Ｒ
Ｓ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２８３）、又はＭＧＴ−
１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６１７）であることを特徴とす
る請求項１５記載の宿主細胞（請求項１６）や、請求項
１５又は１６記載の宿主磁性細胞から得られる磁気微粒
子（請求項１７）に関する。

【００１１】また本発明は、請求項１７記載の磁気微粒
子上に発現している抗体と、標識抗体とを用いることを
特徴とするサンドイッチイムノアッセイ法（請求項１
８）や、請求項１７記載の磁気微粒子を含有するマグネ
ットリポソーム（請求項１９）や、請求項１９記載のマ
グネットリポソームを有効成分として含有する医薬組成
物（請求項２０）に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の対象となるタンパク質と
しては、図１や配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列からなる磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ１
６や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつＧＴＰａｓｅ活性を有す
るタンパク質等を挙げることができる。なお、図１中、
イタリックはＮ末端アミノ酸シークエンスで得られた部
分配列を示し、下線部はＡＴＰ／ＧＴＰ-binding motif
(P-loop)を保存する配列を示している。また、本発明の
ペプチドとしては、本発明のタンパク質の一部からな
り、かつＧＴＰａｓｅ活性を有するペプチドを挙げるこ
とができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペ
プチドの他、これらタンパク質及びペプチドに特異的に
結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及び
ペプチドをも含めた本発明のタンパク質及びペプチドを
総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」というこ
とがある。なお、本件タンパク質・ペプチドは、例えば
磁性細菌（Magnetospirillum sp.）ＡＭＢ−１の細胞破
砕液を三画分（細胞膜、磁気微粒子膜及び細胞膜）に分
画し、各タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを
比較する方法や、本件タンパク質・ペプチドのＤＮＡ配
列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、そ
の由来は特に制限されるものではない。なお、上記磁性
細菌（Magnetospirillum sp.）ＡＭＢ−１は、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
に基づいて、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市）に、１９９２年１１月１２日受託番号「Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５４５８」として寄託されている。

【００１３】本発明の対象となるＤＮＡとして、具体的
には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる磁気
微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ１６をコードするＤ
ＮＡや、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつＧＴＰａｓｅ活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示
される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列
の一部または全部を含むＤＮＡを挙げることができる。
参考までに、本発明のｍｍｓ１６及びその周辺領域の塩
基配列を図２に示す。図２に示されているように、配列
番号１に示される塩基配列の一部には、高転写活性を有
するプロモーターや磁気微粒子非生成条件調節因子様と
結合しうるパリンドロームも有している。これらはその
ＤＮＡ配列情報等に基づき、公知の方法により調製する
ことができる。

【００１４】また、配列番号１に示される塩基配列又は
その相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプ
ローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行な
い、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離する
ことにより、磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ１
６のＤＮＡと同効な目的とするＧＴＰａｓｅ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。
かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーション
の条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼー
ション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝
液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５
℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，
０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処
理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要
素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当
業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例
示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと
同等のストリンジェンシーを実現することが可能であ
る。

【００１５】本発明の融合タンパク質や融合ペプチドと
しては、本件タンパク質・ペプチドと、機能性タンパク
質又はペプチドとが結合しているものであればどのよう
なものでもよく、機能性タンパク質としては、例えば、
抗原、抗体、プロテインＡ等の免疫関連タンパク質や、
レクチン、アビジン、ビオチン等の結合能を有する結合
性タンパク質や、補酵素、加水分解酵素、酸化還元酵
素、異性化酵素、転移酵素、脱離酵素、制限酵素等の酵
素や、各種受容体や、ＧＦＰ等のマーカタンパク質など
が挙げられ、機能性ペプチドとしては、上記機能性タン
パク質の一部からなるペプチドや、ＨＡ（ヘマグルチニ
ン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳ
Ｔ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、
オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを例示することが
できるがこれらに限定されるものではなく、１又は２以
上の機能性タンパク質や機能性ペプチドが融合した融合
機能性タンパク質であってもよい。かかる融合タンパク
質や融合ペプチドは、常法により作製することができ、
Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件タン
パク質・ペプチドの精製や、本件タンパク質・ペプチド
の検出や、その他当該分野の研究用試薬としても有用で
ある。

【００１６】本発明の前記タンパク質やペプチドに特異
的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体
等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、こ
れらは上記磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ１６
の全部又はその一部を抗原として用いて常法により作製
することができるが、その中でもモノクローナル抗体が
その特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル
抗体等の磁気微粒子膜特異的なタンパク質Ｍｍｓ１６に
特異的に結合する抗体は、例えば、磁気微粒子膜特異的
なタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用であ
る。

【００１７】上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコー
ルを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパ
ク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又
は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与すること
により産生され、例えばモノクローナル抗体の調製に
は、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたら
す、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 197
5）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Imm
unology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリド
ーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,
pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法
を用いることができる。

【００１８】本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに
対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法
（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。
また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニ
ックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体
を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクロー
ンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフ
ィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件
タンパク質・ペプチドに対する抗体は、様々な診断薬や
医薬、その他磁気微粒子膜形成のメカニズムを解明する
上で有用である。そして、これら抗体が特異的に結合す
る組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発
明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。

【００１９】また前記モノクローナル抗体等の抗体に、
例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又
はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質
や、 ¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソ
トープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵
素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タン
パク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチ
ドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体
を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩ
ＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝
集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができ
る。

【００２０】本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプ
チドや、融合タンパク質又は融合ペプチドを発現するこ
とができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かか
る本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主
細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULA
R BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONIN
G: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 198
9）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
る方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、トランスベクション(transvection)、マイクロイン
ジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープロ
ーディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic in
troduction)、感染等により行うことができる。そし
て、宿主細胞としては、磁性細菌、大腸菌、ストレプト
ミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッ
カス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真
菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の
昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬ
ａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒ
ドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損し
た変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細
胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細
胞等を挙げることができるが、磁気を利用して容易に収
集できることから磁性細菌を用いることが好ましい。な
お、磁性細菌（Magnetospirillum sp.）としては、ＡＭ
Ｂ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８）、ＭＳ−１（ＩＦ
Ｏ１５２７２，ＡＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５
６）、ＭＳＲ−１（ＩＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６
１）、ＲＳ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３２８３）、ＭＧ
Ｔ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６１７）等の磁性細菌を具
体的に例示することができるがこれらに限定されるもの
ではない。

【００２１】また、発現系としては、上記本件タンパク
質・ペプチドや、融合タンパク質又は融合ペプチドを宿
主細胞内で発現させることができる発現系であればどの
ようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルス
に由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母
プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワ
クシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮
性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バ
クテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれら
の組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファ
ージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺
伝的要素に由来するものを挙げることができるが、本発
明の高転写活性を有する前記プロモーター、ＨＴ３プロ
モーター（特開平１１−２４３９６３号公報）、ｍａｇ
プロモーター（特開平８−２２８７８２号公報）、ｍｐ
ｓプロモーター（ＷＯ９７／３５９６４号公報）等の磁
性細菌由来のプロモーターを有する組換えプラスミドベ
クターが好ましい。また、これら発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいても
よい。

【００２２】上記発現系を含んでなる宿主磁性細菌等の
宿主細胞や、かかる細胞を培養して得られる上記本件タ
ンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドや、
上記宿主磁性細菌から得られる本件タンパク質・ペプチ
ド又は融合タンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発
現している磁気微粒子は、後述するように本発明のサン
ドイッチイムノアッセイ法や、マグネットリポソームな
どに用いることができる。本件タンパク質・ペプチドを
細胞培養物から回収し精製するには、電気泳動法、硫酸
アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン
またはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、電気
泳動法が用いられる。また、アフィニティークロマトグ
ラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパ
ク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上
記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付
加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を
結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・
ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペ
プチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用するこ
とができる。

【００２３】上記本件タンパク質・ペプチド又は融合タ
ンパク質・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁
気微粒子（マグネトソーム）は、宿主磁性細菌内で、主
としてタンパク質からなる被覆膜で覆われた状態で存在
し、生理活性物質のキャリアとして用いることができ、
かかる磁気微粒子は上記宿主磁性細菌を用いて製造する
ことができる。かかる製造方法としては、例えば、本来
的に有機膜に結合して生成する膜タンパク質Ｍｍｓ１６
の全部又は一部（少なくとも膜結合部分）をコードする
ＤＮＡ、又はそのＤＮＡに機能性タンパク質・ペプチド
をコードするＤＮＡとを融合させたＤＮＡ配列と、前記
高転写活性を有するプロモーター配列とを含む組換えプ
ラスミドにより形質転換された磁性細菌を培養すること
により、本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質
・ペプチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子
を細菌内で生成させる方法を挙げることができる。本件
タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペプチドが
磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子は、培養によ
り増殖させた上記磁性細菌を公知の方法により破砕又は
溶解し、磁石を利用して容易に収集することができる。

【００２４】また本発明のサンドイッチイムノアッセイ
法としては、機能性タンパク質としての抗体と本件タン
パク質・ペプチドとが結合した融合タンパク質を膜上に
発現している磁気微粒子と、標識した抗体とを用いる方
法を具体的に例示することができ、かかる標識物質とし
ては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネー
ト）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍
光物質や、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオ
アイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等
の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを具体的に挙げるこ
とができる。これらの測定方法としては、ＲＩＡ法、Ｅ
ＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血
球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることが
できる。また、機能性タンパク質としての抗体と本件タ
ンパク質・ペプチドとが結合した融合タンパク質を膜上
に発現している磁気微粒子と、標識した抗体とを含有す
るサンドイッチイムノアッセイキットも本発明に含まれ
る。

【００２５】本発明のマグネットリポソームとしては、
前記本件タンパク質・ペプチド又は融合タンパク質・ペ
プチドが磁気微粒子膜上に発現している磁気微粒子（マ
グネトソーム）を含有したものであればどのようなもの
でもよく、かかるマグネットリポソームをドラックキャ
リアーとして医薬に用いることができる。例えば、癌や
免疫疾患などの疾患に対する治療剤、抑制剤等の薬剤と
しての遺伝子と、上記磁気微粒子を封入したマグネット
リポソームを癌や免疫疾患等の患者に注入し、これを外
部磁場によって患部に誘導・固定・放出制御すること
で、癌や免疫疾患などの疾患を治療できる。また、分散
性に優れた磁気微粒子を用いることにより、上記薬剤の
封入率が高くなることから、本発明のマグネットリポソ
ームの作製にかかる分散性に優れた磁気微粒子を用いる
ことが好ましい。

【００２６】

【実施例】以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 実施例１（菌株と培養方法） ｍｍｓ１６遺伝子のクローニング及びＭｍｓ１６タンパ
ク質の発現には大腸菌ＤＨ５αを使用した。この大腸菌
ＤＨ５αはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した
Ｌｕｒｉａ培地を用いて、３７℃で培養した。磁性細菌
Magnetospirillum sp.ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ７００２６
４）はＭＳＧＭ培地（ｐＨ６．７５）（J.Bacteriol. 1
40, 720-729, 1979）を用いて、２６℃、嫌気条件で培
養した（Appl.Microbiol. Biotechnol. 35, 651-655, 1
991）。

【００２７】実施例２（本発明のＭｍｓ１６タンパク質
をコードする遺伝子のクローニング及びシークエンス解
析） 文献（Appl. Biochem. Biotech. 84-86, 441-446, 200
0）記載の方法で、磁性細菌細胞破砕液を細胞膜、磁気
微粒子膜、及び細胞質の三画分に分画し、それらの画分
をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、それぞれの
タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを比較する
ことによって磁性細菌粒子膜特異的な新規タンパク質Ｍ
ｍｓ１６（分子量１６ｋＤａ）を同定し、かかるタンパ
ク質をＴＥＰ−２ｕｎｉｔ（Shimadzu, Kyoto, Japan）
を用いた二次元電気泳動により分離した。分離後、電気
泳動ゲルをクーマシーブリリアントブルー（Coomassie
brilliant blue）Ｒ−２５０で染色した。その結果、Ｍ
ｍｓ１６は２つのスポットに分離していた。そこで２つ
に分離されたタンパク質のＮ末端のアミノ酸シークエン
スをそれぞれ決定するために、かかる２つのスポットの
タンパク質をそれぞれゲルから切り取り、ＰＶＤＦ（po
lyvinylidene difluoride）メンブランにブロットし
た。メンブランにブロットした２つのタンパク質に対し
て、gas-phase sequencer（ＰＰＳＱ−１０、Shimadzu,
Kyoto, Japan）を用いてエドマン分解法により解析
し、Ｎ末端のアミノ酸シークエンス（５８残基）を決定
した結果、完全に一致することがわかった。

【００２８】上記アミノ酸シークエンス、ＭａｇＡのコ
ドン頻度（J. Biol. Chem. 270, 28392-28396, 1995）
に基づき、Ｍｍｓ１６のＮ末端側から４４残基までのペ
プチドをコードする塩基配列を増幅するために、オリゴ
ヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー１：
５′−ＣＡＴＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＴ
ＴＣＧＡ−３′；配列番号３、及びリバースプライマー
１：５′−ＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＴＣ
ＧＡＴＧＴＴ−３′；配列番号４）を設計した。ＰＣＲ
には１〜１０ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートに用い
た。サーマルサイクルのプログラムは、最初のみ９４℃
で３分間変性させ、その後９４℃で６０秒間熱変性さ
せ、６５℃で６０秒間アニーリングさせ、７２℃で２分
間伸張させるというサイクルを３０回繰り返し、最後に
７２℃で１５分間伸張させた。Ｎ末端ペプチドをコード
する塩基配列を増幅したＰＣＲ断片（１３２ｂｐ）は、
ｐＧＥＭ（pGEM-T-easy Vector System; PROMEGA, WI,
USA）にクローニングし、自動ＤＮＡシークエンサーＤ
ＳＱ−２０００Ｌ（Shimadzu, Kyoto, Japan）またはＡ
ＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（Perkin-Elmer Co., Norfor
k）を用いて塩基配列を決定した。

【００２９】ｍｍｓ１６遺伝子のゲノム上の部分塩基配
列を決定後、１３２ｂｐ中の両端領域のプライマー配列
の内側の配列からジーンウォーキング用のプライマー
（５′側のプライマー：５′−ＣＧＣＴＧＧＴＴＧＧＣ
ＧＡＣＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＣＡＴＣＣ−３′；配列
番号５、３′側のプライマー：５′−ＡＡＧＴＡＴＣＴ
ＧＧＧＣＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＣ−３′；配列番
号６）を設計し、既知領域の上流及び下流領域につい
て、ＬＡ ＰＣＲ in vitro Cloning Kit（TaKaRa,Shig
a, Japan）を用いたジーンウォーキングを行った。その
結果、タンパク質Ｍｍｓ１６をコードする４３８ｂｐの
ＯＲＦを含む、１，２３５ｂｐのシークエンス（GenBan
k accession # AB051013）が決定された。また、開始コ
ドンより上流の領域には３つのプロモータ様配列と、１
４のパリンドロームが存在していることがわかった。こ
のＭｍｓ１６タンパク質は、磁性細菌粒子膜上で最も発
現量が多いことから、高発現プロモーターによる制御が
考えられる。また、好気培養下（磁気微粒子非生成条件
下）では発現しないことから、磁気微粒子非生成条件調
節因子様の存在と、その因子による調節が推測される。
調節因子はおそらくプロモーター上流のパリンドローム
群のいずれかに結合すると考えられる。

【００３０】実施例３（塩基配列、アミノ酸配列の解
析） 上記実施例により決定されたＭｍｓ１６タンパク質のＤ
ＮＡやアミノ酸配列の解析をＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（DNAS
TAR INC. Madison, USA）を用いて行った。さらに、Gen
Bank、EMBL DNA databases.を用いてホモロジー解析も
行った。これらのことから、本発明のＭｍｓ１６タンパ
ク質のＮ末端部分配列は、ＧＴＰ結合タンパク質と相同
性があることが、データベース解析によって示された。
また、かかるＮ末端部分配列には細胞がネイティブに保
持する細胞分裂、転写調節、アミノ酸伸長因子、シグナ
ル認識粒子、シグナル伝達などのＧＴＰ結合タンパク質
と相同配列を多く含んでおり、実施例２記載のＰＣＲ増
幅により上記ＧＴＰ結合タンパク質をコードする遺伝子
が非特異に見られた。

【００３１】実施例４（Ｍｍｓ１６タンパク質の発現お
よび単離） Ｍｍｓ１６−ヘマグルチニンタグ（ＨＡ）融合タンパク
質を大腸菌内で高発現させるために、目的遺伝子のＯＲ
Ｆを増幅するＰＣＲプライマーをデザインした。なお、
リバースプライマー２は、ヘマグルチニンエピトープタ
グ（９残基：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）の配列をＣ末端に融
合するようにデザインした。ＥｃｏＲＩサイトをデザイ
ンしたフォワードプライマー２（５′−ＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＴＧＡＧ−３′；配
列番号７）と、ＨｉｎｄIIサイトをデザインしたリバー
スプライマー２（５′−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＴ
ＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴ
ＣＴＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡ−３′；配列番
号８）とを用いてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイク
ルのプログラムは、最初のみ９４℃で３分間変性させ、
その後９４℃で６０秒間熱変性させ、６５℃で６０秒間
アニーリングさせ、７２℃で２分間伸張させるというサ
イクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１５分間伸張
させた。その後、増幅された融合タンパク質をコードす
るＰＣＲ断片をプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Amasham Ph
armacia Biotech, Sweden）のＴｒｃプロモータ下流に
導入し、ｐＴｒｃ１６ＨＡを得た。

【００３２】上記プラスミドｐＴｒｃ１６ＨＡを用いて
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、大腸菌内でＭｍｓ１６−
ＨＡ融合タンパク質を１ｍＭのＩＰＴＧを添加した培地
で発現させた。培養後大腸菌を遠心回収し、破砕用緩衝
液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０、５ｍＭ
のＭｇＣｌ₂、２００μｇ／ｍｌのphenylmethylsulphon
yl fluoride）に再懸濁して超音波により破砕した。ま
た、上記破砕液の水溶性画分に融合タンパク質が局在す
ることを、抗ＨＡ抗体によるウェスタンブロッティング
で確認し、かかる水溶性画分は可溶化条件を検討するこ
となく容易に精製過程に用いることができることがわか
った。抗ＨＡ抗体をプロテインＧセファロースビーズ
（Amasham Pharmacia Biotech, Sweden）に結合させた
後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング
でプロテインＧセファロースに抗ＨＡ抗体が固定化され
ていることを確認し、細胞破砕液を５０％（ｖ／ｖ）抗
体−セファロースに添加した。１時間以上４℃で振とう
した後、遠心分離（５００×ｇ）して上清を除去し、セ
ファロースを破砕用緩衝液で５回洗浄した。沈殿物を破
砕用緩衝液に５０％（ｖ／ｖ）となるように懸濁し、こ
れを免疫沈降物として以下の実施例に用いた。

【００３３】実施例５（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン
ブロッティング） 野生株と組み換え体の各細胞破砕液及び各免疫沈降物
を、それぞれ１／２量の３×サンプルバッファー（０．
１８７５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ６．８、１５％の
2-Mercaptoethanol、６％のＳＤＳ、１５％のSucrose、
０．００６％のBromophenol blue）に懸濁し、変性さ
せ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の４種類のサンプルを調製し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Sodium dodecyl sulfare-polya
crylamide gelelectrophoresis）は１５％（ｗ／ｖ）ア
クリルアミドゲルを用い（Nature 227,680-685, 197
0）、上記４種類の細胞抽出液を各レーン７μｇローデ
ィングし、タンパク質はクーマシーブリリアントブルー
Ｒ−２５０もしくは銀で染色した。分子量はlow-molecu
lar-weight calibration kit（Amasham Pharmacia Biot
ech,Sweden）を用い、標準回帰直線から算出した。ウェ
スタンブロッティングは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを
エレクトロブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写し行
った。免疫染色にはマウス由来抗ＨＡモノクローナル抗
体（１：５，０００希釈）を、二次抗体にはヤギ由来の
アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用
いて行った。

【００３４】上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロ
ットの結果を、それぞれ図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３
Ａの１レーンはＭｍｓ１６−ＨＡ融合遺伝子による組み
換え体の細胞抽出液を、２レーンは野生株の細胞抽出液
を、３レーンは野生株の細胞抽出液と抗ＨＡ抗体固定化
ビーズをインキュベートし、洗浄したビーズから回収し
たタンパク質を、４レーンはＭｍｓ１６−ＨＡ融合遺伝
子による組み換え体の細胞抽出液と抗ＨＡ抗体固定化ビ
ーズをインキュベートし、洗浄したビーズから回収した
タンパク質をローディングしたものである。これらＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの結果か
ら、Ｍｍｓ１６−ＨＡ融合タンパク質が大腸菌内で発現
し、抗ＨＡ抗体固定化ビーズを用いることにより精製で
きることがわかった。

【００３５】実施例６（ＧＴＰ結合能） 本発明のＭｍｓ１６がＧＴＰ結合タンパク質と相同配列
を多く含んでいたことから、Ｍｍｓ１６のＧＴＰ結合能
を以下のように調べてみた。１μｌの[γ−³⁵Ｓ]ＧＴＰ
（１μＭ；１，２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と細胞破砕液と
を、２０μｌのバインディングバッファー（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ ₂、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、０．３％のＴｗｅｅｎ２０）中で混合し、１時間
３０℃で静置した。その後、得られた反応混合物を氷上
で２０分間静置し、紫外線ランプを用いてＧＴＰとタン
パク質の紫外線架橋を行った。次に、１／２量の３×サ
ンプルバッファーを反応溶液に添加し、タンパク質を変
性させ、遠心によりセファロースビーズを沈降させ、上
清を１５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルにローディン
グした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを乾燥させ、サラン
ラップで包み、オートラジオグラフィーで検出した。

【００３６】上記の結果、細胞破砕液中において、野生
株（大腸菌ＤＨ５α）でも観察される [γ−³⁵Ｓ]ＧＴ
Ｐと結合するタンパク質以外に形質転換体のみにみられ
るバンドが観察され、Ｍｍｓ１６精製品は [γ−³⁵Ｓ]
ＧＴＰとは明らかに結合することがわかった。 [α−³²
Ｐ]ＧＴＰを用いた場合では、ＧＴＰ結合型ＧＴＰａｓ
ｅは加水分解活性によってγ位のリン酸が遊離すると、
ＧＴＰａｓｅからＧＤＰも解離することから、ＧＴＰａ
ｓｅの [α−³²Ｐ]ＧＴＰ結合型が観察できない。しか
し、[γ−³⁵Ｓ]ＧＴＰを用いる場合では、γ位のリン酸
の５′にＳが結合しているため、ＧＴＰａｓｅによる加
水分解が行われないことから、ＧＴＰａｓｅの存在を示
すことができる。以上の結果をまとめると、Ｍｍｓ１６
はＧＴＰ結合能を有するＧＴＰａｓｅであることが示唆
された。

【００３７】実施例７（ＧＴＰａｓｅ活性） 実施例６の結果から、ＧＴＰ結合結果の考察をふまえ、
ＧＴＰａｓｅ活性について検討してみた。ＧＴＰａｓｅ
活性測定は以下のように行った。免疫沈降物と、[α−
³²Ｐ]ＧＴＰまたは[γ−³²Ｐ]ＧＴＰとを共に３０μｌ
のバインディングバッファー中で混合し、１時間３０℃
で静置した。反応混合物中のヌクレオチドはPEI cellul
ose TLC plastic sheetを用いて、０．７５ＭのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄（ｐＨ３．４）で展開した。得られた薄層クロマト
グラフィーをサランラップで包み、Fuji imaging plate
（type BAS-IIIs; Fuji Photo Film, Kanagawa, Japa
n）に接触させ、放射能で露光されたスポットをバイオ
イメージングアナライザー（BAS-1500, FUJIFILM）によ
り解析した。その結果を図５に示す。なお、図中の左レ
ーンはバインディングバッファーのみを、中レーンは野
生株の細胞抽出液に対して融合タンパク質精製手順で回
収されたタンパク質を、右レーンは抗ＨＡ抗体固定化ビ
ーズによって精製されたＭｍｓ１６−ヘマグルチニン融
合タンパク質を用いた結果である。これらのことから、
抗ＨＡ抗体固定化セファロース複合体に結合したＭｍｓ
１６−ＨＡ融合タンパク質により、［α−³²Ｐ］ＧＴＰ
が加水分解されて［α−³²Ｐ］ＧＤＰが生じ、［γ−³²
Ｐ］ＧＴＰから［³²Ｐ］Ｐｉが生じることが示されたこ
とから、ＧＴＰａｓｅ活性を有することが示された。

【００３８】

【発明の効果】本発明の磁気微粒子膜特異的タンパク質
Ｍｍｓ１６あるいはその遺伝子に外来遺伝子を結合さ
せ、細胞内で外来遺伝子を発現させることができる。ま
た、本発明の磁気微粒子膜特異的タンパク質Ｍｍｓ１６
にレセプターや抗体等を結合させ、医薬、診断薬として
利用することができる。

【００３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Protein Specific to the Bacterial Magnetic Particle Membrane <130> 12-273 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1235 <212> DNA <213> Magnetospirillum sp. <220> <221> CDS <222> (605)..(1042) <400> 1 aaggsggtca tcgtgcgggc catgccmaat accccggcgg cggtgcggcg cggcatcacc 60 gtctgtgcgc cggggaggcc ktgcccgtgt cgcccgtgag ctttgccagt cgctgctgga 120 agcggtgggc rgtgggctgg gtcgatgacg agggcctgat ggacgtggtc acscgtctcc 180 ggctccgscc ccgcctacat cttcctcctg gccgaggcca tggaggccgc cggtctggcc 240 caggggctgc ccccgccctg gccgagcgtc tggcccgtgc caccgtggsc ggggccggcg 300 aattgctgsg ctgtccgccg aacccgccga gcaactgcgc aagaacgtca cctcgccggg 360 cggcaccaca gcggcggccc tgtcggtgct gatgctgaaa gccacggcat tcccagcctg 420 atgaccgaag cggtggctgc tgccactcgc cgaggacggg aacttgcggg ctaggcgctt 480 cgtcagaggc ggtacctatt tcgatattag atattgagtt gcgtatgact ccgtttgact 540 cgaagccgcc cccgcgtcta tcttgctgca ccgcaacata agacccccgg gttggaggaa 600 taac atg gcc gcc aag cag act gag cag ttc ttt gat ttc gac gtc gcc 649 Met Ala Ala Lys Gln Thr Glu Gln Phe Phe Asp Phe Asp Val Ala 1 5 10 15 aag tat ctg ggc gat ttc aag gtt ccc ggc gtg gat gtc gag acc atc 697 Lys Tyr Leu Gly Asp Phe Lys Val Pro Gly Val Asp Val Glu Thr Ile 20 25 30 gtc gcc aac cag cgc aag aac atc gaa gcg ctg acc cag gcg aac aag 745 Val Ala Asn Gln Arg Lys Asn Ile Glu Ala Leu Thr Gln Ala Asn Lys 35 40 45 ctg gct ttc gag ggc ctg cag aac gtg gtc aag cgt cag gtc gag atc 793 Leu Ala Phe Glu Gly Leu Gln Asn Val Val Lys Arg Gln Val Glu Ile 50 55 60 ctg cgc cag acc atg gac gag gtt gcc cag gtc tcc aag gat ttc gcc 841 Leu Arg Gln Thr Met Asp Glu Val Ala Gln Val Ser Lys Asp Phe Ala 65 70 75 gag ccc ggc tcg ccc cag ggc aag gcc gcc aag cag gcc gag ttc gcc 889 Glu Pro Gly Ser Pro Gln Gly Lys Ala Ala Lys Gln Ala Glu Phe Ala 80 85 90 95 aag gat gcc ttc gag cgc gcc ctg rcc aac gcc cgt gag ctg gcc gag 937 Lys Asp Ala Phe Glu Arg Ala Leu Xaa Asn Ala Arg Glu Leu Ala Glu 100 105 110 atg atc gcc aag gcc aat tcc gag gct ttc gac ctg ctg aac aag cgy 985 Met Ile Ala Lys Ala Asn Ser Glu Ala Phe Asp Leu Leu Asn Lys Xaa 115 120 125 ttc acc cag agc ctg gac gag gcc cgc gag gtc ttc acc aag gcc ggc 1033 Phe Thr Gln Ser Leu Asp Glu Ala Arg Glu Val Phe Thr Lys Ala Gly 130 135 140 aag aag taa gccttccgtt cattcggaac gctgtcggcg gccgctcctg 1082 Lys Lys 145 aaaaggggcg gctntttgat tccggcctga attgggcgct ctaccgtccc tcgatcaggg 1142 ccagaagcgg cgcccattcg gcggcgtagg acttggaacg gcggtcattg gcctcgatca 1202 ccgtcgagcc ggcggcggcc accgcggtat aga 1235 <210> 2 <211> 145 <212> PRT <213> Magnetospirillum sp. <400> 2 Met Ala Ala Lys Gln Thr Glu Gln Phe Phe Asp Phe Asp Val Ala Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Gly Asp Phe Lys Val Pro Gly Val Asp Val Glu Thr Ile Val 20 25 30 Ala Asn Gln Arg Lys Asn Ile Glu Ala Leu Thr Gln Ala Asn Lys Leu 35 40 45 Ala Phe Glu Gly Leu Gln Asn Val Val Lys Arg Gln Val Glu Ile Leu 50 55 60 Arg Gln Thr Met Asp Glu Val Ala Gln Val Ser Lys Asp Phe Ala Glu 65 70 75 80 Pro Gly Ser Pro Gln Gly Lys Ala Ala Lys Gln Ala Glu Phe Ala Lys 85 90 95 Asp Ala Phe Glu Arg Ala Leu Xaa Asn Ala Arg Glu Leu Ala Glu Met 100 105 110 Ile Ala Lys Ala Asn Ser Glu Ala Phe Asp Leu Leu Asn Lys Xaa Phe 115 120 125 Thr Gln Ser Leu Asp Glu Ala Arg Glu Val Phe Thr Lys Ala Gly Lys 130 135 140 Lys 145 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Forward Primer 1 <400> 3 cataagcaga ccgagcagtt cttcga 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reverse Primer 1 <400> 4 ttggcctggg tcagggcctc gatgtt 26 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5'-primer <400> 5 cgctggttgg cgacgatggt ctcgacatcc 30 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3'-primer <400> 6 aagtatctgg gcgatttcaa ggttcc 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Forward Primer 2 <400> 7 gaattcatgg ccgccaagca gactgag 27 <210> 8 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Reverse Primer 2 <400> 8 gggaagcttg gcatagtcgg gcacgtcata gggatacttc ttgccggcct tggtgaa 57

【図面の簡単な説明】

【図１】ゲノムシークエンスから得られた本発明の磁気
微粒子膜特異的タンパク質Ｍｍｓ１６をコードするＯＲ
Ｆのアミノ酸配列を示す図である。

【図２】本発明のｍｍｓ１６遺伝子及び周辺領域の塩基
配列を示す図である。

【図３】大腸菌内で発現した本発明のＭｍｓ１６−ヘマ
グルチニンエピトープタグ融合タンパク質のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ(Ａ)及びウエスタンブロット(Ｂ)の結果を示す図
である。

【図４】大腸菌内で発現した本発明のＭｍｓ１６−ヘマ
グルチニンエピトープタグ融合タンパク質のＧＴＰ結合
能を調べた結果を示す図である。

【図５】大腸菌内で発現した本発明のＭｍｓ１６−ヘマ
グルチニンエピトープタグ融合タンパク質のＧＴＰａｓ
ｅ活性を調べた結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ ４Ｈ０４５ 9/16 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/543 ５４１Ａ 33/543 ５４１ 33/573 Ａ 33/573 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:01） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ０７Ｋ 16/12 (Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ０７Ｋ 19/00 (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA11 BA41 CA01 CA07 DA05 FA02 HA11 4B050 CC03 DD02 FF13E LL03 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC14 AC20 BA01 CA24 CA27 CA46 4C076 AA19 CC07 CC27 CC41 EE41 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA11 DA76 DA89 EA50 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコー
   ドするＤＮＡ。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつＧＴＰａｓｅ活性を有する
   タンパク質
2. 【請求項２】 配列番号１に示される塩基配列又はその
   相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
   ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２記載のＤＮＡとストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズし、かつＧＴＰａｓｅ活性
   を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のＤＮＡの一部から
   なることを特徴とする高転写活性を有するプロモータ
   ー。
5. 【請求項５】 配列番号２に示されるアミノ酸配列から
   なるタンパク質。
6. 【請求項６】 配列番号２に示されるアミノ酸配列にお
   いて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＴＰａｓｅ活
   性を有するタンパク質。
7. 【請求項７】 請求項５又は６記載のタンパク質の一部
   からなり、かつＧＴＰａｓｅ活性を有するペプチド。
8. 【請求項８】 請求項５若しくは６記載のタンパク質又
   は請求項７記載のペプチドと、機能性タンパク質又は機
   能性ペプチドとを結合させた融合タンパク質又は融合ペ
   プチド。
9. 【請求項９】 機能性ペプチドが、機能性タンパク質の
   一部又はペプチドタグであることを特徴とする請求項８
   記載の融合タンパク質又は融合ペプチド。
10. 【請求項１０】 機能性タンパク質が、抗原、抗体、受
    容体、レクチン、ホルモン、結合性タンパク質、酵素、
    及びマーカータンパク質から選ばれる１又は２以上のタ
    ンパク質であることを特徴とする請求項８又は９記載の
    融合タンパク質又は融合ペプチド。
11. 【請求項１１】 請求項５若しくは６記載のタンパク質
    又は請求項７記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
12. 【請求項１２】 抗体がモノクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項１１記載の抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１１又は１２記載の抗体に特異
    的に結合し、かつＧＴＰａｓｅ活性を有することを特徴
    とする組換えタンパク質又はペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項５若しくは６記載のタンパク
    質、請求項７記載のペプチド、又は請求項８〜１０のい
    ずれか記載の融合タンパク質若しくは融合ペプチドを発
    現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
15. 【請求項１５】 宿主細胞が、宿主磁性細菌（Magnetos
    pirillum sp.）であることを特徴とする請求項１４記載
    の宿主細胞。
16. 【請求項１６】 宿主磁性細菌（Magnetospirillum s
    p.）が、ＡＭＢ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５８，ＡＴ
    ＣＣ７００２６４）、ＭＳ−１（ＩＦＯ１５２７２，Ａ
    ＴＣＣ３１６３２，ＤＳＭ３８５６）、ＭＳＲ−１（Ｉ
    ＦＯ１５２７２，ＤＳＭ６３６１）、ＲＳ−１（ＦＥＲ
    Ｍ ＢＰ−１３２８３）、又はＭＧＴ−１（ＦＥＲＭ
    Ｐ−１６６１７）であることを特徴とする請求項１５記
    載の宿主細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１５又は１６記載の宿主磁性細
    胞から得られる磁気微粒子。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載の磁気微粒子上に発現
    している抗体と、標識抗体とを用いることを特徴とする
    サンドイッチイムノアッセイ法。
19. 【請求項１９】 請求項１７記載の磁気微粒子を含有す
    るマグネットリポソーム。
20. 【請求項２０】 請求項１９記載のマグネットリポソー
    ムを有効成分として含有する医薬組成物。