JP4249279B2 - クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 - Google Patents
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・トラコマティス感染症の診断やワクチンなどに使用されるクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア・トラコマティス(Chlamydia Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生きた宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感染粒子である小型の基本小体（Elementary Body:ＥＢと略；直経0.3 μm ）が貧食によって細胞内へ取り込まれ感染し、食空胞（Phagosome)内で網様体（Reticulate body:ＲＢと略；直径0.5 〜2.0 μm)に変換して２分裂で増殖後、ＥＢに再び成熟変換して細胞外に放出され、次に感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言われている。
【０００３】
クラミジア・トラコマティスは主に目と泌尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感染症（Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎）などを起こす。近年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染が広がっていることで注目されている。
【０００４】
クラミジア・トラコマティスには１５種類の血清型（A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2, L3)が存在する。これらは血清学的に３つのグループ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C, J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。［佐藤他、感染症学雑誌、64, 12, 1475-1481,(1990)] 。
【０００５】
クラミジア・トラコマティス感染症の測定法には擦過により採取した患者材料中のクラミジア菌体を対象とする抗原測定法と血清を検体とする抗体測定法がある。以前から抗原測定法が採用されてきたが、患者に苦痛を与えたり、抗原測定材料の採取が容易でないなどの問題があった。最近では検体採取の容易な抗体測定法が広く行われている。また感染リスクの高い人のスクリーニング或いは疫学的調査にも抗体測定が繁用されている。
【０００６】
最も高感度な抗体測定法としては１５種類のクラミジア・トラコマティス血清型を分類するWangのマイクロ−ＩＦ（Immunofluorescence）法が抗体陽性検体を漏れなく検出できる方法として知られている［Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents (ed. Nicols, R. L.) p273, Excerpta Medica, Amsterdam, (1971)]。
【０００７】
しかし、マイクロ−ＩＦ法はその操作が煩雑であり、判定に技量、経験を要し、大量の検体の処理が不可能であるため、一般に臨床検査の検査方法としては採用されていない。また最近では抗原をＬ２株のみに簡略化したＦＡ法（Fluorescence antibody technique)が臨床的に繁用されている。しかしＦＡ法に関してもマイクロ−ＩＦ法と同様の問題をかかえている。
【０００８】
一方、近年、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による抗体測定方法が開発されている。ＥＩＡは多検体を簡便且つ迅速に測定できる利点を有している。ＥＩＡによる抗体測定に使用する抗原としては、クラミジア・トラコマティスに特異的な抗原（種特異的抗原）であるＬ２株由来の主要外膜蛋白質（Major Outer Membrane Prorein、以下「ＭＯＭＰ」という、ＭＯＭＰは外膜蛋白質の約６０％を占めている）の部分精製品（外膜蛋白質画分）が用いられているが、精製純度が低いためにクラミジア・トラコマティスと同属のクラミジア・ニューモニエやクラミジア・シタシの抗体による交差反応が起こることが知られている。これはＭＯＭＰの部分精製品に含まれるクラミジア属共通抗原（属特異的抗原）の存在に起因する。
【０００９】
ＭＯＭＰ以外の外膜蛋白質には、例えば分子量約７５，０００や約６０，０００の蛋白質が知られている。分子量約７５，０００の蛋白質には属特異的抗原［Infect. Immun. 58,(1), 189-196, (1990)］、分子量約６０，０００の蛋白質には属特異的抗原及び種特異的抗原の存在が報告されている［Microbiol. 140, 2003-2011, (1994) & J. Bacteriol. 173,(12), 3821-3830, (1991)]。
【００１０】
以上のように精製純度の低いＭＯＭＰ部分精製品を抗体測定に使用する抗原として用いた場合、クラミジア・ニューモニエ抗体やクラミジア・シタシ抗体による交差反応が起こる。従って属特異的抗原を除去するためにＭＯＭＰを高純度に精製する必要があった。
【００１１】
ＭＯＭＰの高純度精製法としては特開昭57-158725 号に記載されているが、クラミジア・トラコマティスＥＢから精製するため、大量に取得することが困難であった。
大量に取得が可能で、かつ属特異的抗原を含まないＭＯＭＰを製造する方法として、大腸菌による遺伝子組換え法が考えられる。遺伝子組換え法によるＬ２株ＭＯＭＰの製造は以前から試みられていたが、ＭＯＭＰの部分発現であったり、たとえ完全長のＭＯＭＰを発現させたとしても、宿主大腸菌に対する毒性のため、発現量が少なく、大量製造することができなかった。
【００１２】
遺伝子組換え法で発現させた蛋白質を効率良く精製するには、アミノ末端あるいはカルボキシ末端に６個のヒスチジン残基を結合した状態で目的蛋白質を発現させ、菌体を破砕後、Ｎｉキレートカラムを用いた精製法が使われている［Genetic Engineering, Plenum Press, New York, 12, 87-98, (1990)］。６個のヒスチジン残基を付加は精製効率を向上させる目的であり、付加することにより目的蛋白質の発現量が増加するという報告はない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、クラミジア・トラコマティスの抗体測定の抗原として、完全長のクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰの大腸菌による大量製造を可能にする手段を提供する。
【００１４】
本発明者らは、クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰをコードする遺伝子のクローニングを行い、そのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基（アミノ酸タグと呼称）をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、大腸菌で発現させた結果、従来より発現量を大幅に向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、（１）アミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（２）アミノ末端にペプチド結合されたアミノ酸残基が配列表の配列番号１〜５のいずれかに表されることを特徴とする請求項１記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（３）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質が発現する条件で培養し、該形質転換体から発現産物を採取することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の製造方法、（４）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法、（５）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定試薬である。
【００１６】
以下、本発明をより具体的に詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰ遺伝子を取得するには、ＥＢを適当な細胞、例えばＨｅＬａやＬ９２９細胞に感染させ、クラミジア・トラコマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ糖密度勾配遠心によって、大量のＥＢを取得、常法によって染色体ＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。クローニング方法としてλgt10、λgt11或いはＰＣＲ法などがあるが、最近ＰＣＲ法［Nature 324, 163, (1986) ］が多く用いられている。ＰＣＲ法とは目的遺伝子の部分配列から成るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から成るＤＮＡプライマーをアニールさせ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを用いて増幅反応を行うものである。ＰＣＲ法によるクローニングでは、用いるＤＮＡプライマーの配列が重要になる。実施例１にその一例を示したが、これに限定されるものではない。
【００１８】
次いで得られたＭＯＭＰ遺伝子を含む増幅断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベクターに組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的のＤＮＡを有するクローンを選択すれば、本発明に用いるＭＯＭＰ遺伝子ＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡはジデオキシ法等により配列を決定することが可能である。
【００１９】
免疫学的活性を有するＭＯＭＰを大量製造するためには、使用する宿主−ベクター系に合わせてＭＯＭＰ自身の改良が必要となる。この目的のためにＭＯＭＰのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に例えば配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、発現させることができる。本発明では６アミノ酸残基からなるペプチドに限定したが、同様の効果を得るためにアミノ酸残基数、種類及びその配列の変更は当業者にとって容易に推定される。
【００２０】
使用する宿主−ベクター系は大腸菌系を使用することができる。大腸菌を宿主とした発現ベクターは次のように構築できる。プロモーターとしては、Ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター等が使用できる。プロモーターの下流に上記遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向にしたがって挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法は、以下に示す文献［Molecular Cloning, Cold Spring Harbar Laboratory Press, (1989)］に記載されている。
【００２１】
形質転換された大腸菌は、常法により培養し、適当な誘導処理をし、目的のＭＯＭＰを発現させることができる。ＭＯＭＰの発現の有無は抗クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, (3), 116-3120 (1979)]で確認できる。
【００２２】
発現させたＭＯＭＰは次のような方法で精製することができる。
細胞を酵素と非イオン性界面活性剤を用いて破砕する。発現したＭＯＭＰは不溶性を示すので、遠心分離により沈澱画分（ＭＯＭＰが豊富）に集まる。
さらに精製するためには、沈澱（ＭＯＭＰ）画分を可溶化する必要がある。この目的のために強力なアニオン系界面活性剤（望ましくは０．１〜２％ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）を用いて可溶化する。可溶化したＭＯＭＰは調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィー法で高純度に精製することができる。
【００２３】
上述したような方法で得られたＭＯＭＰをポリスチレン平型マイクロプレートに０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で、望ましくは０．５〜２μｇ／ｍｌの濃度で固相すると固相プレート（測定キット）ができる。
【００２４】
上述の固相プレートに、適当に希釈したクラミジア・トラコマティス感染の疑いのある患者血清を加えて、一定温度、一定時間反応させ、その後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。この操作でプレートに固相化したＭＯＭＰに抗クラミジア・トラコマティス抗体のみが結合する。
【００２５】
次に標識抗体、望ましくは酵素標識した抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ或いはＩｇＭ抗体と反応させ、その後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。ここで標識に使う酵素は一般にアルカリフォスファターゼや西洋ワサビパーオキシダーゼ等がよく用いられる。最後に酵素の基質を添加し、発色度を吸光度計で測定し、抗体の有無、つまり感染の有無を測定する。
【００２６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
実施例１．Ｌ２株クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰ遺伝子のクローニング１．ゲノムＤＮＡの調製
(1) 培養とＥＢの精製
クラミジア・トラコマティスＬ２株 ( L2/434/Bubo )を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭ培地で増殖させたＬ９２９細胞に接種した。３７℃で２〜３日培養した。
尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍光抗体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、培養液を捨てて、ハンクスＢＳＳを加え、ラバーポリスメンで細胞をかき取った。
次に感染細胞浮遊液を超音波処理（20KHz 、30秒）後、遠心分離（500 ×g 、４℃、１５分間）して上清を回収した。上清を３５％Renogranfin 液(10mM HEPES, 0.15M NaCl)に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。
得られた沈澱にＳＰＧ（0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin 液の不連続密度勾配（40% / 44% / 52%)に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。４４％と５２％の界面のバンドを回収し、ＳＰＧで希釈した後、３０，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心分離し、精製ＥＢを得た。
【００２８】
(2) ゲノムＤＮＡの調製
上記で得た精製ＥＢに１０倍量のLysis Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA,0.5% SDS, 100 μg/ml Proteinase K)を加え、５５℃、９０分間反応させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させた。得られたゲノムＤＮＡをTE Buffer(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにRNaseAを加え、６０℃、３０分間反応させた。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させた。ゲノムＤＮＡを適当量のTE Buffer に溶解させた。
【００２９】
２．ＭＯＭＰのクローニング
実施例１−１で得たクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノムＤＮＡ溶液１μl を用いて、Saiki らの方法［Nature, 324, 163, (1986)］に従い、Gene Amp PCR Reagent Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法で、主要外膜蛋白質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, ０．１％ゼラチンを含む反応液中にクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノムＤＮＡ溶液１μl と配列番号６及び配列番号７の２種類のプライマーそれぞれ２０pmoles及びTaq polymerase 5units を加え、最終量５０μl とした。
【００３０】
この反応液を９４℃, ３min.→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)×30サイクル〕→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10min.）×5 サイクル〕反応させた。反応終了液を１％アガロースゲル電気泳動で分画した結果、約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物を確認した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物をGeneclean II（BIO101社製）でＤＮＡを回収した後、さらにDNA Blunting Kit（宝酒造製）を用いて平滑化した。
次にpUC19 ２μg を制限酵素ＳmaＩ４units で３０℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ（BRL 社製）で５’末端を脱リン酸化した。
上記ＰＣＲ増幅断片とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結合させ、CaCl2 法〔Molecular Cloning,p250 Cold Spring Harbar Laboratory〕によって大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、Birnboimらのアルカリ−ＳＤＳ法〔Nuc.Acids Res.,7, 1513 (1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マッピングによりＰＣＲ増幅断片を有するクローン（pMOMP-L2と命名）を得た（図１参照）。
【００３１】
得られたクローンからプラスミドＤＮＡを精製し、パーキンエルマージャパン社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａで塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２株公知の塩基配列[J. Bacteriol. 168,(3), 1277-1287 (1986)〕と完全一致した。
【００３２】
実施例２．大腸菌によるＭＯＭＰの発現
１．ノンタグＭＯＭＰ発現ベクターの作製
実施例１で得られたプラスミドpMOMP-L2 ２０μg を制限酵素BstYI ２０units で６０℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタノール沈澱を行なった。
ＤＮＡを溶解後、制限酵素ＫpnＩ２０unitで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、０．８ｋｂ断片をGeneclean IIで回収した。
【００３３】
次に特開平7-147986号に記載のＰＬプロモーター発現ベクター pPLN-MCS ５μg を制限酵素ＫpnＩ5unitsで３７℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素ＮdeＩ 5unitで３７℃、２時間消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、３．２ｋｂの断片をGeneclean IIで回収した。
さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番号８及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
【００３４】
オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。
０．８ｋｂの断片、３．２ｋｂの断片及びアニールしたオリゴヌクレオチドを結合させ、大腸菌N99cI + 導入した。得られた形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素ＮdeＩとＫpnＩによるマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によりプラスミドpCT33(アミノ酸タグを付加していないＭＯＭＰ、ノンタグＭＯＭＰと呼称）を取得した（図２参照）。
【００３５】
２．アミノ酸タグの導入
実施例２−１で得られたプラスミドpCT33 ５μg を制限酵素AflII とEco065I をそれぞれ5unitsで37℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、４．８ｋｂの断片をGeneclean IIで回収した。
次にＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番号１０〜１９に示す１０本のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７及び配列番号１８と１９を各々アニールした。
４．８ｋｂの断片と上記の組合せでアニールした各オリゴヌクレオチドをそれぞれ結合させ、大腸菌N99cI + に導入した。
得られた各形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素AflII とEcoO65I によるマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によりアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys(配列番号１０と１１のアニール、アミノ末端に配列番号１のアミノ酸残基が付加）、pCT33HisTyr(配列番号１２と１３のアニール、アミノ末端に配列番号２のアミノ酸残基が付加）、pCT33Thr（配列番号１４と１５のアニール、アミノ末端に配列番号３のアミノ酸残基が付加）、pCT33Tyr（配列番号１６と１７のアニール、アミノ末端に配列番号４のアミノ酸残基が付加）及びpCT33His（配列番号１８と１９のアニール、アミノ末端に配列番号５のアミノ酸残基が付加）を取得した（図３参照）。
【００３６】
３．ＭＯＭＰの発現
プラスミドpPLN-MCS、ノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT33 及び各アミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Thr及びpCT33Hisをそれぞれ蛋白質発現用大腸菌Ｎ４８３０−１に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌ Ampicillin を含むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、１６時間培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３０℃、約２時間培養後(O.D. 600= 0.4 - 0.5) 、培養温度を42℃にシフトし、さらに３時間培養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。
【００３７】
一定量の菌体をPhosphate Buffered-Saline(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemmli の方法［Nature, 227, 680 (1970)]に従ってＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］を行い、コマシュー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色をした。また泳動後、種特異性の抗クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰモノクローン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果、ＣＢＢ染色では５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisのみ分子量約４０，０００の位置にコントロールのpPLN-MCSには見られない大きなバンドが確認された（図４参照）。このバンドをファルマシア製イメージマスターで定量した結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１よりpCT33 に対し、いずれも１０倍前後の発現量が認められた。
さらに分子量約４０，０００の位置の大きなバンドはウエスタンブロッティングで発色が認められた。またノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT33 も分子量約４０，０００の位置に発色が認められた（図５参照）。
以上のことからＭＯＭＰのアミノ末端に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基を導入すると、ＭＯＭＰの発現量が増加することが確認された。
【００４０】
また超音波破砕処理した菌体を５，５００×ｇで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調べた結果、全てのＭＯＭＰは沈澱画分に見られ、不溶体を形成していることがわかった。
【００４１】
４．ＭＯＭＰの精製
前述の培養法でノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰ発現大腸菌をそれぞれ１リットル培養した。遠心分離して菌体を回収後、８ｍｌのLysis buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V) Sucrose, 1mM EDTA, 4mg/ml Lysozyme) に懸濁後、氷上で３０分間放置した。次に最終濃度が１０ｍＭ MgCl2,10mM MnCl2,１０μｇ／ｍｌ DNaseI,１０μｇ／ｍｌ RNaseA になるようにそれぞれ加え、４℃で３０分間放置した。さらに２０ｍｌのDetergent buffer I(20mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2M NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deoxycholate, 1.6% NP-40) を加え、さらに３０分間放置した。
【００４２】
５，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈澱を回収した。この沈澱に対して１０倍量のDetergent buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Triton X-100) で十分に懸濁し、４℃で１時間放置後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈澱を回収した。Detergent buffer II による沈澱の洗浄を３回繰り返した。
【００４３】
沈殿を２％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解した後、不溶物を遠心分離により除去した。可溶性画分を調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、主要外膜蛋白質を含むゲルを切り出し、エレクトロエリューター（アミコン社製）で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳに対して透析した。
蛋白質純度を検定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ファルマシア社製イメージマスターで分析した結果、ノンタグ及びアミノ酸タグの付加された５種類のＭＯＭＰの純度はほぼ１００％であることがわかった。
【００４４】
実施例３．大腸菌発現クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰを用いた抗クラミジア・トラコマティス抗体の検出
１．ＭＯＭＰ固相プレート（測定キット）の作製
実施例２に記載したノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰを５０ｍＭ炭酸buffer(pH9.5) で各々1 μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アルブミン(BSA) と０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌ加えて４℃一晩静置し、ＭＯＭＰ固相マイクロプレートを作製した。
【００４５】
２．抗クラミジア・トラコマティス抗体の検出
前記述のＭＯＭＰ固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除いた後、ＦＡ法で判定したクラミジア・トラコマティス感染患者血清５０検体及び正常血清５０検体を０．０５％ＢＳＡと０．０５％Tween20 を含むＰＢＳで２００倍に希釈し、その１００μl を固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。ついで、０．０５％Tween20 含むＰＢＳで約４０，０００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジアミン含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、０．０２％過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した。結果を表２に示す。尚、カットオフ値は正常ヒト血清の吸光度の平均に標準偏差を３倍したものを加えた値とした。
【００４６】
【表２】
【００４７】
以上の結果から、アミノ酸タグは陽性一致率及び陰性一致率に影響を及ぼさず、ノンタグと同等の反応性を示すことがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
アミノ末端に配列表１〜５のいずれかのアミノ酸残基を結合させたクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰをコードする遺伝子で大腸菌を形質転換し、発現させ、精製することにより、クラミジア属細菌と交差反応性を示すと考えられる他の外膜蛋白質を実質的に含まない、クラミジア・トラコマティス抗体測定に使用する抗原を大量に提供することが可能となった。
【００４９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００５０】
配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００５１】
配列番号：３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００５２】
配列番号：４
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００５３】
配列番号：５
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
【００５４】
配列番号：６
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TAGCAATTCA GATCTCGATC CC
【００５５】
配列番号：７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTCACACCAA GTGGCGCAAG GA
【００５６】
配列番号：８
配列の長さ：７３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TATGCTGCCT GTGGGTAACC CTGCTGAACC AAGCCTTATG ATCGACGGGA TCCTATGGGA
AGGTTTCGGC GGA
【００５７】
配列番号：９
配列の長さ：７５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GATCTCCGCC GAAACCTTCC CATAGGATCC CGTCGATCAT AAGGCTTGGT TCAGCAGGGT
TACCCACAGG CAGCA
【００５８】
配列番号：１０
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA CAAACACAAA CACAAACTGC CTGTGG
【００５９】
配列番号：１１
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGTTTGT GTTTGTGTTT GTGCATATGT TACCTCC
【００６０】
配列番号：１２
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA CTACCACTAC CACTACCTGC CTGTGG
【００６１】
配列番号：１３
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGTAGT GGTAGTGGTA GTGCATATGT TACCTCC
【００６２】
配列番号：１４
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGAC TACCACTACC ACTACCCTGC CTGTGG
【００６３】
配列番号：１５
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGGTAG TGGTAGTGGT AGTCATATGT TACCTCC
【００６４】
配列番号：１６
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGTA CTATTACTAT TACTATCTGC CTGTGG
【００６５】
配列番号：１７
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGATAGT AATAGTAATA GTACATATGT TACCTCC
【００６６】
配列番号：１８
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA TCACCATCAC CATCACCTGC CTGTGG
【００６７】
配列番号：１９
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGTGAT GGTGATGGTG ATGCATATGT TACCTCC
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ２株主要外膜蛋白質遺伝子を含むベクターの構築を示す図である。
【図２】発現ベクターpCT33 の構築を示す図である。
【図３】発現ベクターpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisの構築を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各種発現ベクター含有大腸菌の菌体全蛋白質を示すパターン図である。
【図５】ウエスタンブロッティングによる各種発現ベクター含有大腸菌の菌体全蛋白質中に含まれるＭＯＭＰを示すパターン図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・トラコマティス感染症の診断やワクチンなどに使用されるクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア・トラコマティス(Chlamydia Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生きた宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感染粒子である小型の基本小体（Elementary Body:ＥＢと略；直経0.3 μm ）が貧食によって細胞内へ取り込まれ感染し、食空胞（Phagosome)内で網様体（Reticulate body:ＲＢと略；直径0.5 〜2.0 μm)に変換して２分裂で増殖後、ＥＢに再び成熟変換して細胞外に放出され、次に感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言われている。
【０００３】
クラミジア・トラコマティスは主に目と泌尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感染症（Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎）などを起こす。近年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染が広がっていることで注目されている。
【０００４】
クラミジア・トラコマティスには１５種類の血清型（A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2, L3)が存在する。これらは血清学的に３つのグループ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C, J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。［佐藤他、感染症学雑誌、64, 12, 1475-1481,(1990)] 。
【０００５】
クラミジア・トラコマティス感染症の測定法には擦過により採取した患者材料中のクラミジア菌体を対象とする抗原測定法と血清を検体とする抗体測定法がある。以前から抗原測定法が採用されてきたが、患者に苦痛を与えたり、抗原測定材料の採取が容易でないなどの問題があった。最近では検体採取の容易な抗体測定法が広く行われている。また感染リスクの高い人のスクリーニング或いは疫学的調査にも抗体測定が繁用されている。
【０００６】
最も高感度な抗体測定法としては１５種類のクラミジア・トラコマティス血清型を分類するWangのマイクロ−ＩＦ（Immunofluorescence）法が抗体陽性検体を漏れなく検出できる方法として知られている［Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents (ed. Nicols, R. L.) p273, Excerpta Medica, Amsterdam, (1971)]。
【０００７】
しかし、マイクロ−ＩＦ法はその操作が煩雑であり、判定に技量、経験を要し、大量の検体の処理が不可能であるため、一般に臨床検査の検査方法としては採用されていない。また最近では抗原をＬ２株のみに簡略化したＦＡ法（Fluorescence antibody technique)が臨床的に繁用されている。しかしＦＡ法に関してもマイクロ−ＩＦ法と同様の問題をかかえている。
【０００８】
一方、近年、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による抗体測定方法が開発されている。ＥＩＡは多検体を簡便且つ迅速に測定できる利点を有している。ＥＩＡによる抗体測定に使用する抗原としては、クラミジア・トラコマティスに特異的な抗原（種特異的抗原）であるＬ２株由来の主要外膜蛋白質（Major Outer Membrane Prorein、以下「ＭＯＭＰ」という、ＭＯＭＰは外膜蛋白質の約６０％を占めている）の部分精製品（外膜蛋白質画分）が用いられているが、精製純度が低いためにクラミジア・トラコマティスと同属のクラミジア・ニューモニエやクラミジア・シタシの抗体による交差反応が起こることが知られている。これはＭＯＭＰの部分精製品に含まれるクラミジア属共通抗原（属特異的抗原）の存在に起因する。
【０００９】
ＭＯＭＰ以外の外膜蛋白質には、例えば分子量約７５，０００や約６０，０００の蛋白質が知られている。分子量約７５，０００の蛋白質には属特異的抗原［Infect. Immun. 58,(1), 189-196, (1990)］、分子量約６０，０００の蛋白質には属特異的抗原及び種特異的抗原の存在が報告されている［Microbiol. 140, 2003-2011, (1994) & J. Bacteriol. 173,(12), 3821-3830, (1991)]。
【００１０】
以上のように精製純度の低いＭＯＭＰ部分精製品を抗体測定に使用する抗原として用いた場合、クラミジア・ニューモニエ抗体やクラミジア・シタシ抗体による交差反応が起こる。従って属特異的抗原を除去するためにＭＯＭＰを高純度に精製する必要があった。
【００１１】
ＭＯＭＰの高純度精製法としては特開昭57-158725 号に記載されているが、クラミジア・トラコマティスＥＢから精製するため、大量に取得することが困難であった。
大量に取得が可能で、かつ属特異的抗原を含まないＭＯＭＰを製造する方法として、大腸菌による遺伝子組換え法が考えられる。遺伝子組換え法によるＬ２株ＭＯＭＰの製造は以前から試みられていたが、ＭＯＭＰの部分発現であったり、たとえ完全長のＭＯＭＰを発現させたとしても、宿主大腸菌に対する毒性のため、発現量が少なく、大量製造することができなかった。
【００１２】
遺伝子組換え法で発現させた蛋白質を効率良く精製するには、アミノ末端あるいはカルボキシ末端に６個のヒスチジン残基を結合した状態で目的蛋白質を発現させ、菌体を破砕後、Ｎｉキレートカラムを用いた精製法が使われている［Genetic Engineering, Plenum Press, New York, 12, 87-98, (1990)］。６個のヒスチジン残基を付加は精製効率を向上させる目的であり、付加することにより目的蛋白質の発現量が増加するという報告はない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、クラミジア・トラコマティスの抗体測定の抗原として、完全長のクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰの大腸菌による大量製造を可能にする手段を提供する。
【００１４】
本発明者らは、クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰをコードする遺伝子のクローニングを行い、そのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基（アミノ酸タグと呼称）をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、大腸菌で発現させた結果、従来より発現量を大幅に向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、（１）アミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（２）アミノ末端にペプチド結合されたアミノ酸残基が配列表の配列番号１〜５のいずれかに表されることを特徴とする請求項１記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（３）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質が発現する条件で培養し、該形質転換体から発現産物を採取することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の製造方法、（４）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法、（５）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定試薬である。
【００１６】
以下、本発明をより具体的に詳細に説明する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰ遺伝子を取得するには、ＥＢを適当な細胞、例えばＨｅＬａやＬ９２９細胞に感染させ、クラミジア・トラコマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ糖密度勾配遠心によって、大量のＥＢを取得、常法によって染色体ＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。クローニング方法としてλgt10、λgt11或いはＰＣＲ法などがあるが、最近ＰＣＲ法［Nature 324, 163, (1986) ］が多く用いられている。ＰＣＲ法とは目的遺伝子の部分配列から成るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から成るＤＮＡプライマーをアニールさせ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを用いて増幅反応を行うものである。ＰＣＲ法によるクローニングでは、用いるＤＮＡプライマーの配列が重要になる。実施例１にその一例を示したが、これに限定されるものではない。
【００１８】
次いで得られたＭＯＭＰ遺伝子を含む増幅断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベクターに組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的のＤＮＡを有するクローンを選択すれば、本発明に用いるＭＯＭＰ遺伝子ＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡはジデオキシ法等により配列を決定することが可能である。
【００１９】
免疫学的活性を有するＭＯＭＰを大量製造するためには、使用する宿主−ベクター系に合わせてＭＯＭＰ自身の改良が必要となる。この目的のためにＭＯＭＰのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に例えば配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、発現させることができる。本発明では６アミノ酸残基からなるペプチドに限定したが、同様の効果を得るためにアミノ酸残基数、種類及びその配列の変更は当業者にとって容易に推定される。
【００２０】
使用する宿主−ベクター系は大腸菌系を使用することができる。大腸菌を宿主とした発現ベクターは次のように構築できる。プロモーターとしては、Ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター等が使用できる。プロモーターの下流に上記遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向にしたがって挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法は、以下に示す文献［Molecular Cloning, Cold Spring Harbar Laboratory Press, (1989)］に記載されている。
【００２１】
形質転換された大腸菌は、常法により培養し、適当な誘導処理をし、目的のＭＯＭＰを発現させることができる。ＭＯＭＰの発現の有無は抗クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, (3), 116-3120 (1979)]で確認できる。
【００２２】
発現させたＭＯＭＰは次のような方法で精製することができる。
細胞を酵素と非イオン性界面活性剤を用いて破砕する。発現したＭＯＭＰは不溶性を示すので、遠心分離により沈澱画分（ＭＯＭＰが豊富）に集まる。
さらに精製するためには、沈澱（ＭＯＭＰ）画分を可溶化する必要がある。この目的のために強力なアニオン系界面活性剤（望ましくは０．１〜２％ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）を用いて可溶化する。可溶化したＭＯＭＰは調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィー法で高純度に精製することができる。
【００２３】
上述したような方法で得られたＭＯＭＰをポリスチレン平型マイクロプレートに０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で、望ましくは０．５〜２μｇ／ｍｌの濃度で固相すると固相プレート（測定キット）ができる。
【００２４】
上述の固相プレートに、適当に希釈したクラミジア・トラコマティス感染の疑いのある患者血清を加えて、一定温度、一定時間反応させ、その後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。この操作でプレートに固相化したＭＯＭＰに抗クラミジア・トラコマティス抗体のみが結合する。
【００２５】
次に標識抗体、望ましくは酵素標識した抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ或いはＩｇＭ抗体と反応させ、その後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。ここで標識に使う酵素は一般にアルカリフォスファターゼや西洋ワサビパーオキシダーゼ等がよく用いられる。最後に酵素の基質を添加し、発色度を吸光度計で測定し、抗体の有無、つまり感染の有無を測定する。
【００２６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
実施例１．Ｌ２株クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰ遺伝子のクローニング１．ゲノムＤＮＡの調製
(1) 培養とＥＢの精製
クラミジア・トラコマティスＬ２株 ( L2/434/Bubo )を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭ培地で増殖させたＬ９２９細胞に接種した。３７℃で２〜３日培養した。
尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍光抗体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、培養液を捨てて、ハンクスＢＳＳを加え、ラバーポリスメンで細胞をかき取った。
次に感染細胞浮遊液を超音波処理（20KHz 、30秒）後、遠心分離（500 ×g 、４℃、１５分間）して上清を回収した。上清を３５％Renogranfin 液(10mM HEPES, 0.15M NaCl)に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。
得られた沈澱にＳＰＧ（0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin 液の不連続密度勾配（40% / 44% / 52%)に重層し、４３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。４４％と５２％の界面のバンドを回収し、ＳＰＧで希釈した後、３０，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心分離し、精製ＥＢを得た。
【００２８】
(2) ゲノムＤＮＡの調製
上記で得た精製ＥＢに１０倍量のLysis Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA,0.5% SDS, 100 μg/ml Proteinase K)を加え、５５℃、９０分間反応させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させた。得られたゲノムＤＮＡをTE Buffer(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃度５０μｇ／ｍｌになるようにRNaseAを加え、６０℃、３０分間反応させた。反応終了後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させた。ゲノムＤＮＡを適当量のTE Buffer に溶解させた。
【００２９】
２．ＭＯＭＰのクローニング
実施例１−１で得たクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノムＤＮＡ溶液１μl を用いて、Saiki らの方法［Nature, 324, 163, (1986)］に従い、Gene Amp PCR Reagent Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法で、主要外膜蛋白質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, ０．１％ゼラチンを含む反応液中にクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノムＤＮＡ溶液１μl と配列番号６及び配列番号７の２種類のプライマーそれぞれ２０pmoles及びTaq polymerase 5units を加え、最終量５０μl とした。
【００３０】
この反応液を９４℃, ３min.→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)×30サイクル〕→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10min.）×5 サイクル〕反応させた。反応終了液を１％アガロースゲル電気泳動で分画した結果、約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物を確認した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物をGeneclean II（BIO101社製）でＤＮＡを回収した後、さらにDNA Blunting Kit（宝酒造製）を用いて平滑化した。
次にpUC19 ２μg を制限酵素ＳmaＩ４units で３０℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ（BRL 社製）で５’末端を脱リン酸化した。
上記ＰＣＲ増幅断片とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結合させ、CaCl2 法〔Molecular Cloning,p250 Cold Spring Harbar Laboratory〕によって大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、Birnboimらのアルカリ−ＳＤＳ法〔Nuc.Acids Res.,7, 1513 (1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マッピングによりＰＣＲ増幅断片を有するクローン（pMOMP-L2と命名）を得た（図１参照）。
【００３１】
得られたクローンからプラスミドＤＮＡを精製し、パーキンエルマージャパン社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ａで塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２株公知の塩基配列[J. Bacteriol. 168,(3), 1277-1287 (1986)〕と完全一致した。
【００３２】
実施例２．大腸菌によるＭＯＭＰの発現
１．ノンタグＭＯＭＰ発現ベクターの作製
実施例１で得られたプラスミドpMOMP-L2 ２０μg を制限酵素BstYI ２０units で６０℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタノール沈澱を行なった。
ＤＮＡを溶解後、制限酵素ＫpnＩ２０unitで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、０．８ｋｂ断片をGeneclean IIで回収した。
【００３３】
次に特開平7-147986号に記載のＰＬプロモーター発現ベクター pPLN-MCS ５μg を制限酵素ＫpnＩ5unitsで３７℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素ＮdeＩ 5unitで３７℃、２時間消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、３．２ｋｂの断片をGeneclean IIで回収した。
さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番号８及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
【００３４】
オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。
０．８ｋｂの断片、３．２ｋｂの断片及びアニールしたオリゴヌクレオチドを結合させ、大腸菌N99cI + 導入した。得られた形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素ＮdeＩとＫpnＩによるマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によりプラスミドpCT33(アミノ酸タグを付加していないＭＯＭＰ、ノンタグＭＯＭＰと呼称）を取得した（図２参照）。
【００３５】
２．アミノ酸タグの導入
実施例２−１で得られたプラスミドpCT33 ５μg を制限酵素AflII とEco065I をそれぞれ5unitsで37℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、４．８ｋｂの断片をGeneclean IIで回収した。
次にＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番号１０〜１９に示す１０本のオリゴヌクレオチドを合成した。
オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７及び配列番号１８と１９を各々アニールした。
４．８ｋｂの断片と上記の組合せでアニールした各オリゴヌクレオチドをそれぞれ結合させ、大腸菌N99cI + に導入した。
得られた各形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法でＤＮＡを精製し、制限酵素AflII とEcoO65I によるマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によりアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys(配列番号１０と１１のアニール、アミノ末端に配列番号１のアミノ酸残基が付加）、pCT33HisTyr(配列番号１２と１３のアニール、アミノ末端に配列番号２のアミノ酸残基が付加）、pCT33Thr（配列番号１４と１５のアニール、アミノ末端に配列番号３のアミノ酸残基が付加）、pCT33Tyr（配列番号１６と１７のアニール、アミノ末端に配列番号４のアミノ酸残基が付加）及びpCT33His（配列番号１８と１９のアニール、アミノ末端に配列番号５のアミノ酸残基が付加）を取得した（図３参照）。
【００３６】
３．ＭＯＭＰの発現
プラスミドpPLN-MCS、ノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT33 及び各アミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Thr及びpCT33Hisをそれぞれ蛋白質発現用大腸菌Ｎ４８３０−１に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌ Ampicillin を含むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、１６時間培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３０℃、約２時間培養後(O.D. 600= 0.4 - 0.5) 、培養温度を42℃にシフトし、さらに３時間培養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。
【００３７】
一定量の菌体をPhosphate Buffered-Saline(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemmli の方法［Nature, 227, 680 (1970)]に従ってＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］を行い、コマシュー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色をした。また泳動後、種特異性の抗クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰモノクローン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。その結果、ＣＢＢ染色では５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisのみ分子量約４０，０００の位置にコントロールのpPLN-MCSには見られない大きなバンドが確認された（図４参照）。このバンドをファルマシア製イメージマスターで定量した結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
表１よりpCT33 に対し、いずれも１０倍前後の発現量が認められた。
さらに分子量約４０，０００の位置の大きなバンドはウエスタンブロッティングで発色が認められた。またノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT33 も分子量約４０，０００の位置に発色が認められた（図５参照）。
以上のことからＭＯＭＰのアミノ末端に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基を導入すると、ＭＯＭＰの発現量が増加することが確認された。
【００４０】
また超音波破砕処理した菌体を５，５００×ｇで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調べた結果、全てのＭＯＭＰは沈澱画分に見られ、不溶体を形成していることがわかった。
【００４１】
４．ＭＯＭＰの精製
前述の培養法でノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰ発現大腸菌をそれぞれ１リットル培養した。遠心分離して菌体を回収後、８ｍｌのLysis buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V) Sucrose, 1mM EDTA, 4mg/ml Lysozyme) に懸濁後、氷上で３０分間放置した。次に最終濃度が１０ｍＭ MgCl2,10mM MnCl2,１０μｇ／ｍｌ DNaseI,１０μｇ／ｍｌ RNaseA になるようにそれぞれ加え、４℃で３０分間放置した。さらに２０ｍｌのDetergent buffer I(20mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2M NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deoxycholate, 1.6% NP-40) を加え、さらに３０分間放置した。
【００４２】
５，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈澱を回収した。この沈澱に対して１０倍量のDetergent buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Triton X-100) で十分に懸濁し、４℃で１時間放置後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈澱を回収した。Detergent buffer II による沈澱の洗浄を３回繰り返した。
【００４３】
沈殿を２％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解した後、不溶物を遠心分離により除去した。可溶性画分を調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、主要外膜蛋白質を含むゲルを切り出し、エレクトロエリューター（アミコン社製）で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳに対して透析した。
蛋白質純度を検定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ファルマシア社製イメージマスターで分析した結果、ノンタグ及びアミノ酸タグの付加された５種類のＭＯＭＰの純度はほぼ１００％であることがわかった。
【００４４】
実施例３．大腸菌発現クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰを用いた抗クラミジア・トラコマティス抗体の検出
１．ＭＯＭＰ固相プレート（測定キット）の作製
実施例２に記載したノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰを５０ｍＭ炭酸buffer(pH9.5) で各々1 μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で静置した。１８時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アルブミン(BSA) と０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌ加えて４℃一晩静置し、ＭＯＭＰ固相マイクロプレートを作製した。
【００４５】
２．抗クラミジア・トラコマティス抗体の検出
前記述のＭＯＭＰ固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除いた後、ＦＡ法で判定したクラミジア・トラコマティス感染患者血清５０検体及び正常血清５０検体を０．０５％ＢＳＡと０．０５％Tween20 を含むＰＢＳで２００倍に希釈し、その１００μl を固相マイクロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。ついで、０．０５％Tween20 含むＰＢＳで約４０，０００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧパーオキシダーゼ標識抗体（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジアミン含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、０．０２％過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６３０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した。結果を表２に示す。尚、カットオフ値は正常ヒト血清の吸光度の平均に標準偏差を３倍したものを加えた値とした。
【００４６】
【表２】
以上の結果から、アミノ酸タグは陽性一致率及び陰性一致率に影響を及ぼさず、ノンタグと同等の反応性を示すことがわかった。
【００４８】
【発明の効果】
アミノ末端に配列表１〜５のいずれかのアミノ酸残基を結合させたクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰをコードする遺伝子で大腸菌を形質転換し、発現させ、精製することにより、クラミジア属細菌と交差反応性を示すと考えられる他の外膜蛋白質を実質的に含まない、クラミジア・トラコマティス抗体測定に使用する抗原を大量に提供することが可能となった。
【００４９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：４
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：５
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：６
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TAGCAATTCA GATCTCGATC CC
【００５５】
配列番号：７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTCACACCAA GTGGCGCAAG GA
【００５６】
配列番号：８
配列の長さ：７３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TATGCTGCCT GTGGGTAACC CTGCTGAACC AAGCCTTATG ATCGACGGGA TCCTATGGGA
AGGTTTCGGC GGA
【００５７】
配列番号：９
配列の長さ：７５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GATCTCCGCC GAAACCTTCC CATAGGATCC CGTCGATCAT AAGGCTTGGT TCAGCAGGGT
TACCCACAGG CAGCA
【００５８】
配列番号：１０
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA CAAACACAAA CACAAACTGC CTGTGG
【００５９】
配列番号：１１
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGTTTGT GTTTGTGTTT GTGCATATGT TACCTCC
【００６０】
配列番号：１２
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA CTACCACTAC CACTACCTGC CTGTGG
【００６１】
配列番号：１３
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGTAGT GGTAGTGGTA GTGCATATGT TACCTCC
【００６２】
配列番号：１４
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGAC TACCACTACC ACTACCCTGC CTGTGG
【００６３】
配列番号：１５
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGGTAG TGGTAGTGGT AGTCATATGT TACCTCC
【００６４】
配列番号：１６
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGTA CTATTACTAT TACTATCTGC CTGTGG
【００６５】
配列番号：１７
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGATAGT AATAGTAATA GTACATATGT TACCTCC
【００６６】
配列番号：１８
配列の長さ：４６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
TTAAGGAGGT AACATATGCA TCACCATCAC CATCACCTGC CTGTGG
【００６７】
配列番号：１９
配列の長さ：４７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
GTTACCCACA GGCAGGTGAT GGTGATGGTG ATGCATATGT TACCTCC
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ２株主要外膜蛋白質遺伝子を含むベクターの構築を示す図である。
【図２】発現ベクターpCT33 の構築を示す図である。
【図３】発現ベクターpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisの構築を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各種発現ベクター含有大腸菌の菌体全蛋白質を示すパターン図である。
【図５】ウエスタンブロッティングによる各種発現ベクター含有大腸菌の菌体全蛋白質中に含まれるＭＯＭＰを示すパターン図である。
Claims (4)
- アミノ末端に配列番号１〜４のいずれかに表される６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質。
- アミノ末端に配列番号１〜５のいずれかに表される６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質が発現する条件で培養し、該形質転換体から発現産物を採取することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の製造方法（ただし、形質転換体から発現産物を採取する工程において、アミノ酸末端にペプチド結合したヒスチジンとキレートするニッケルイオンが固定された金属イオンアフニティークロマトグラフィーによる精製を用いる工程を含む製造方法を除く）。
- 請求項１に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法。
- 請求項１に記載のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定試薬。
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| JP28993897A JP4249279B2 (ja) | 1997-10-22 | 1997-10-22 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 |
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1997
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