JPH10215877A - クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質
をコードする遺伝子をクローニングし、クラミジア・ト
ラコマティス感染症診断に使用される抗原を提供する。 【解決手段】 （１）配列表の配列番号１記載の塩基配
列を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質遺伝子、（２）配列表の配列番号２記
載のアミノ酸配列を有することを特徴とするクラミジア
・トラコマティス主要外膜蛋白質を構成とする。 【効果】 クラミジア・トラコマティス抗体検査やワク
チン製造が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はクラミジア・トラコ
マティス感染症の診断などに使用されるクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝
子に関する。

【０００２】

【従来の技術】クラミジア・トラコマティス(Chlamydia
Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生き
た宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感
染粒子である小型の基本小体（Elementary Body:ＥＢと
略；直経0.3 μm)が貧食によって細胞内へ取り込まれ感
染し、食空胞（Phagosome)内で網様体（Reticulate bod
y:ＲＢと略；直径0.5 〜2.0 μm)に変換して２分裂で増
殖後、ＥＢに再び成熟変換して細胞外に放出され、次に
感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言われ
ている。

【０００３】クラミジア・トラコマティスは主に目と泌
尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感
染症（Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌
性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎）などを起こす。近
年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染
が広がっていることで注目されている。

【０００４】クラミジア・トラコマティスには１５種類
の血清型（A, B, Ba, C, D, E, F,G, H, I, J, K, L1,
L2, L3)が存在する。これらは血清学的に３つのグルー
プ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C,
J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。

【０００５】クラミジア・トラコマティス感染症の検査
法として、近年、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による抗体
検査方法が開発されている。ＥＩＡは多検体を簡便且つ
迅速に測定できる利点を有している。ＥＩＡによる抗体
検査に使用する抗原としては、特開平4-297871号に記載
されているような細胞表面に露出している主要外膜蛋白
質（Major Outer Membrane Prorein:MOMP)の部分精製品
が用いられている。

【０００６】主要外膜蛋白質（Major Outer Membrane P
rotein:MOMP)はクラミジア・トラコマティス外膜蛋白質
の約６０％を占め、その一部が細胞表面に露出してい
る。この蛋白質は抗原性の強い蛋白質として知られてお
り、上述のように抗体検査における抗原に使用された
り、またワクチンとして期待されている。

【０００７】１５種類の血清型のうち、１０株（A, B,
C, D, E, F, H, L1, L2, L3)の主要外膜蛋白質につい
て、その全塩基配列及びアミノ酸配列の情報がGenbank
に登録されている（Accession No.A株:J03813, B株:M19
127, C株:M19128, D株:X62918,X62919,X62920,X62921,E
株:X52557, F株:M30501, H株:X16007,L1株:M36533,L2
株:M19126,L3株:X55700) 一方、Ba, G, I, J 及びK 株はCaldwellらの文献［J. B
acteriol. 168, 1277-1287 (1986) ］に部分配列のみ報
告されている。

【０００８】主要外膜蛋白質の製造法は、特開昭57-158
725 号に記載されているように感染細胞からＥＢを回収
後、破砕して精製する方法が用いられている。この特許
ではＬ２、Ｅ及びＣ株ＥＢが用いられているが、血清型
によってＥＢの増殖度に差があることが知られている。
特にＧ株の増殖が悪く、天然抽出法では主要外膜蛋白質
を大量に取得することは困難であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｇ株
の主要外膜蛋白質遺伝子の全塩基配列及びアミノ酸配列
を明らかにし、遺伝子組換え法による主要外膜蛋白質の
製造を可能にする手段を提供する。本発明者らは、Ｇ株
のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子
のクローニングを行い、全塩基配列を決定し、大腸菌で
発現させ、精製した後、この組換え主要外膜蛋白質を抗
原として用いてＥＩＡを行った結果、ＥＢから精製した
主要外膜蛋白質精製品と同等の性能を得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。

【００１０】

【課題を解決するための手段】即ち本発明は、（１）配
列表の配列番号１記載の塩基配列を有することを特徴と
するクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質遺伝
子、（２）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有
することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要
外膜蛋白質である。詳しくは、新規のクラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質遺伝子を提供するものであ
り、また本遺伝子を発現ベクターに組み込み、このベク
ターにより形質転換された形質転換体及びそれによって
生産されたクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質
を提供するものである。

【００１１】以下、本発明をより具体的に詳細に説明す
る。

【発明の実施の形態】クラミジア・トラコマティス主要
外膜蛋白質遺伝子を取得するには、ＥＢを適当な細胞、
例えばＨｅＬａやＬ９２９細胞に感染させ、クラミジア
・トラコマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ
糖密度勾配遠心によって、大量のＥＢを取得、常法によ
って染色体ＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。
クローニング方法としてλgt10、λgt11或いはＰＣＲ法
などがあるが、最近ＰＣＲ法［Nature 324, 163, (198
6) ］が多く用いられている。

【００１２】ＰＣＲ法とは目的遺伝子の部分配列から成
るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から
成るＤＮＡプライマーをアニールさせ、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを用いて増幅反応
を行うものである。ＰＣＲ法によるクローニングでは、
用いるＤＮＡプライマーの配列が重要になる。実施例１
にその一例を示す。

【００１３】次いで得られた主要外膜蛋白質遺伝子を含
む増幅断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベ
クターに組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的
のＤＮＡを有するクローンを選択すれば、本発明に用い
る主要外膜蛋白質遺伝子ＤＮＡが得られる。得られたＤ
ＮＡはジデオキシ法等により配列を決定することが可能
である。

【００１４】主要外膜蛋白質の生産のためには、その蛋
白質を安定に発現する宿主−ベクター系を選択するこ
と、さらに発現した主要外膜蛋白質が天然物と同様の種
特異的抗原性を有していることが必要である。この目的
のために宿主としては、大腸菌、酵母または昆虫細胞等
を使用することができる。

【００１５】大腸菌を宿主とした発現ベクターは次のよ
うに構築できる。プロモーターとしては、Ｔａｃプロモ
ーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＬ
プロモーター等が使用できる。プロモーターの下流に上
記主要外膜蛋白質遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向にした
がって挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法
は、以下に示す文献［Molecular Cloning, Cold Spring
Harbar Laboratory Press, (1989)］に記載されてい
る。

【００１６】形質転換された大腸菌は、常法により培養
し、適当な誘導処理をし、目的の主要外膜蛋白質を発現
させることができる。主要外膜蛋白質の発現の有無は抗
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質モノクロー
ン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング［Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA., 76, 116-120, (1979)］で確認で
きる。

【００１７】発現させた主要外膜蛋白質は次のような方
法で精製することができる。細胞を酵素と非イオン性界
面活性剤を用いて破砕する。クラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質は不溶性を示すので、遠心分離により
沈澱画分（主要外膜蛋白質が豊富）に集まる。さらに精
製するためには、沈澱（主要外膜蛋白質）画分を可溶化
する必要がある。この目的のために強力なアニオン系界
面活性剤（望ましくは0.1 〜2%ドデシル硫酸ナトリウ
ム；ＳＤＳ）を用いて可溶化する。可溶化した主要外膜
蛋白質は調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィー法
で高純度に精製することができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００１９】実施例１．Ｇ株クラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質遺伝子のクローニング １．クラミジア・トラコマティスゲノムＤＮＡの調製 (1) クラミジア・トラコマティスの培養とＥＢの精製 クラミジア・トラコマティスＧ株 (G/UW-57/CX) を１０
％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含 むイーグルＭＥＭ培地で
増殖させたＬ９２９細胞に接種した。次いで３７℃で２
〜３日培養した。尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍
光抗体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、
培養液を捨てて、ハンクスＢＳＳを加え、ラバーポリス
メンで細胞をかき取った。次に感染細胞浮遊液を超音波
処理（20KHz,30秒）後、遠心分離（500g, 4 ℃,15分
間）して上清を回収した。上清を３５％Renogranfin 液
(10mM HEPES, 0.15MNaCl)に重層し、４３，０００×
ｇ、４℃、1 時間遠心分離した。得られた沈澱にＳＰＧ
（0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸
buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin
液の不連続密度勾配（40% / 44% / 52%)に重層し、４
３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。４４％と
５２％の界面のバンドを回収し、ＳＰＧで希釈した後、
３０，０００Ｇ、４℃、３０分間遠心分離し、精製ＥＢ
を得た。

【００２０】(2) クラミジア・トラコマティスゲノムＤ
ＮＡの調製 上記で得た精製ＥＢに１０倍量のLysis Buffer(10mM Tr
is-HCl(pH8.0), 5mM EDTA, 0.5% SDS, 100μg/ml Prote
inase K)を加え、５５℃、９０分間反応させた後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタ
ノール沈澱させた。得られたゲノムＤＮＡをTE Buffer
(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるようにRNaseAを加え、６０℃、
３０分間反応させた。反応終了後、フェノール／クロロ
ホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させ
た。ゲノムＤＮＡを適当量のTE Buffer に溶解させた。

【００２１】２．クラミジア・トラコマティス主要外膜
蛋白質のクローニング 実施例１−１で得たクラミジア・トラコマティスＧ株ゲ
ノムＤＮＡ溶液１μlを用いて、Saiki らの方法［Natur
e, 324, 163, (1986)］に従い、Gene Amp PCRReagent K
it（宝酒 造社製）を用いたＰＣＲ法で、主要外膜蛋白
質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、１０ｍＭ Tris-
HCl(pH 8.3),５０ｍＭ KCl,５ｍＭ MgCl₂, ０．１％ゼ
ラチンを含む反応液中にクラミジア・トラコマティスＧ
株ゲノムＤＮＡ溶液１μl と配列番号３及び配列番号４
の２種類のプライマーそれぞれ２０pmoles及びTaq poly
merase５units を加え、最終量５０μl とした。

【００２２】この反応液を９４℃, ３min.→〔（94℃,
45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)× 30 サイク
ル〕→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10mi
n.）×５サイクル〕反応させた。反応終了液を１％アガ
ロースゲル電気泳動で分画した結果、約１．３ｋｂのＰ
ＣＲ増幅産物を確認した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ増
幅産物をGeneclean II（BIO101社製）でＤＮＡを回収し
た後、さらにDNA BluntingKit（宝酒造製）を用いて平
滑化した。次にpUC19 ２μg を制限酵素ＳmaＩ４units
で３０℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ
（BRL 社製）で５’末端を脱リン酸化した。上記ＰＣＲ
増幅断片とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を
用いて結合させ、CaCl₂ 法〔Molecular Cloning,p250 C
old Spring Harbar Laboratory〕によって大腸菌ＪＭ１
０９に導入した。得られた形質転換体を適当に１０個選
択、Birnboimらのアルカリ―ＳＤＳ法〔Nuc.Acids Re
s., 7, 1513, (1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マ
ッピングによりＰＣＲ増幅断片を有するクローン（pMOM
P-G2と命名）を得た（図１参照）。

【００２３】得られたクローンからプラスミドＤＮＡを
精製し、パーキンエルマージャパン社製ＤＮＡシーケン
サー３７３Ａを用いて配列番号１に記載の塩基配列を決
定した。オープンリーディングフレームを検索した結
果、配列番号５に記載の領域が判明した。Ｇ株ＭＯＭＰ
の全アミノ酸配列は、配列番号２に記載した。また配列
番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列はＧ株
公知の部分塩基配列及びアミノ酸配列[J. Bacteriol.
1, 68, 1277-1287, (1986) 〕を含むことが確認され
た。

【００２４】実施例２．大腸菌によるクラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質の発現 １．Ｇ株主要外膜蛋白質用発現ベクターの作製 実施例１で得られたプラスミドpMOMP-G2２０μg を制限
酵素BstYI ２０unitsで６０℃、２時間消化後、フェノ
ール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解
後、制限酵素ＫpnＩ２０unitで３７℃、２時間消化後、
１％アガロースゲル電気泳動を行い、０．８ｋｂ断片を
Geneclean IIで回収した。

【００２５】次に特開平7-147986号に記載のＰＬプロモ
ーター発現ベクター pPLN-MCS ５μｇを制限酵素ＫpnＩ
５units で３７℃、２時間消化後、フェノール抽出―エ
タノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素Ｎ
deＩ５unitで３７℃、２時間消化し、１％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、３．２ｋｂの断片をGeneclean IIで
回収した。さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列
番号６及び配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを合成
した。

【００２６】オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL
（宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。０．８ｋｂ
の断片、３．２ｋｂの断片及びアニールしたオリゴヌク
レオチドを結合させ、大腸菌N99cI+に導入した。得られ
た形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法
でＤＮＡを精製し、制限酵素ＮdeＩとＫpnＩによるマッ
ピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によ
りプラスミドｐＣＴ３３−Ｇを取得した（図２参照）。

【００２７】２．主要外膜蛋白質の発現 プラスミドｐＣＴ３３−Ｇを蛋白質発現用大腸菌Ｎ４８
３０−１に形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌ
Ampicillin を含むＬＢ培地１ｍｌで３０℃、１６時間
培養した。前培養液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌ
に接種した。３０℃、約２時間培養後(O.D.₆₀₀ = 0.4 -
0.5) 、培養温度を４２℃にシフトし、さらに３時間培
養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。

【００２８】菌体の一部をPhosphate Buffered-Saline
(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemm
li の方法［Nature, 227, 680 (1970) ］に従ってＳＤ
Ｓ―ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ］を行った。泳動後、種特異性の抗クラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用いてウ
エスタンブロッティングを行った。その結果、分子量約
４０，０００の位置に発色がみられた。従って主要外膜
蛋白質の発現が確認された。

【００２９】また超音波破砕処理した菌体を５，５００
×ｇで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離
した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調
べた結果、主要外膜蛋白質は沈澱画分に見られ、不溶体
を形成していることがわかった。

【００３０】３．主要外膜蛋白質の精製 前述の培養法でＧ株主要外膜蛋白質発現大腸菌を１リッ
トル培養した。遠心分離して菌体を回収後、８ｍｌのLy
sis buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V)Sucrose,1
mM EDTA, 4mg/ml Lysozyme)に懸濁後、氷上で３０分間
放置した。次に最終濃度が１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂,１０ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ₂,１０μｇ／ｍｌＤＮaseI, １０μｇ／ｍ
ｌＲＮaseAになるようにそれぞれ加え、４℃で３０分間
放置した。さらに２０ｍｌのDetergent buffer I(20mM
Tris-HCl (pH7.5), 0.2M NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deox
ycholate, 1.6% NP-40) を加え、さらに３０分間放置し
た。

【００３１】５，５００×ｇで１５分間遠心分離して沈
澱を回収した。この沈澱に対して１０倍量のDetergent
buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM E
DTA,0.5 % Triton X-100) で十分に懸濁し、４℃で５
分間放置後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈
澱を回収した。Detergnt buffer IIによる沈澱の洗浄を
３回繰り返した。

【００３２】沈殿を２％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解した
後、不溶画分を遠心分離により除去した。可溶性画分を
調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、主要外膜蛋白質を含
むゲルを切り出し、エレクトロエリューター（アミコン
社製）で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を０．１％
ＳＤＳを含むＰＢＳに対して透析した。蛋白質純度を検
定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、純度
はほぼ１００％であることがわかった。

【００３３】また免疫学的純度を測定するために、Ｇ株
ＥＢを免疫して得られたウサギ抗血清を用いてウエスタ
ン・ブロッティング行った結果、分子量約４０，０００
の位置のみ反応した。従って，得られた主要外膜蛋白質
精製品は主要外膜蛋白質以外の蛋白質を含んでないこと
がわかった。

【００３４】

【発明の効果】本発明のＧ株クラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質遺伝子を用いることで、遺伝子組換え
法で主要外膜蛋白質を大量に製造することが可能とな
り、クラミジア・トラコマティス抗体検査やワクチン製
造が可能となった。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２９５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源： ・生物名：クラミジア・トラコマティス 直接の起源： ・ライブラリー名：ゲノムＤＮＡ ・クローン名：ＪＭ１０９（ｐＭＯＭＰ−Ｇ２） 配列の特徴： ・特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAGAGAGCTA ATTATACAAT TTAGAGGTAA GAATGAAAAA ACTCTTGAAA TCGGTATTAG TATTTGCCGC TTTGAGTTCT GCTTCCTCCT TGCAAGCTCT GCCTGTGGGG AATCCTGCTG AACCAAGCCT TATGATCGAC GGAATTCTGT GGGAAGGTTT CGGCGGAGAT CCTTGCGATC CTTGCACCAC TTGGTGTGAC GCTATCAGCA TGCGTATGGG TTACTACGGA GACTTTGTTT TCGACCGTGT TTTGAAAACT GATGTGAATA AAGAGTTTGA AATGGGCGAG GCTTTAGCCG GAGCTTCTGG GAATACGACC TCTACTCTCT CAAAATTGGT AGAACGAACG AACCCTGCAT ATGGCAAGCA TATGCAAGAC GCAGAGATGT TTACCAATGC CGCTTGCATG GCATTGAATA TTTGGGATCG TTTTGATGTA TTCTGTACAT TAGGAGCCAC CAGTGGATAT CTTAGAGGAA ATTCAGCATC TTTCAACTTA GTTGGGTTAT TCGGCGATGG TGAAAACGCC ACGCAGCCTG CTGCAACAAG TATTCCTAAC GTGCAGTTAA ATCAGTCTGT GGTGGAACTG TATACAGATA CTGCTTTTGC TTGGAGTGTT GGAGCTCGTG CAGCTTTGTG GGAATGTGGA TGCGCGACTT TAGGCGCTTC TTTCCAATAC GCTCAATCTA AACCTAAAGT CGAAGAATTA AACGTTCTCT GTAACGCAGC TGAGTTTACT ATCAATAAGC CTAAAGGATA TGTAGGGCAA GAATTCCCTC TTGCACTCAC AGCAGGAACT GATGCAGCGA CGGGCACTAA AGATGCCTCT ATTGATTACC ATGAGTGGCA AGCGAGTTTA TCTCTTTCTT ACAGACTCAA TATGTTCACT CCCTACATTG GAGTTAAATG GTCTCGTGCA AGCTTTGATT CTAATACAAT TCGTATAGCC CAGCCGAAGT TGGCAAAACC TGTTGTAGAT ATTACAACCC TTAACCCAAC TATTGCAGGA TGCGGCAGTG TAGTCGCAGC TAACTCGGAA GGACAGATAT CTGATACAAT GCAAATCGTT TCCTTGCAAT TAAACAAGAT GAAATCTAGA AAATCTTGCG GTATTGCAGT AGGAACAACT ATTGTGGATG CAGACAAATA CGCAGTTACA GTTGAGACTC GCTTGATCGA TGAGAGAGCT GCTCACGTAA ATGCACAATT CCGCTTCTAA TTAATTGTAT AATTTTGTTA AACTTTAGCA AGTTTATCTT TGTTAATAAC ACTATCCGTG TTTCTGGGGC TCGAT

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：３９５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源： ・生物名：クラミジア・トラコマティス 直接の起源： ・ライブラリー名：ゲノムＤＮＡ ・クローン名：ＪＭ１０９（ｐＭＯＭＰ−Ｇ２） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：sig peptide ・存在位置：-22..-1 ・特徴を決定した方法：Ｅ Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ser -22 -20 -15 - 10 Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu Pro Ser -5 -1 1 5 10 Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly Asp Pro Cys 15 20 25 Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met Arg Met Gly Tyr 30 35 40 Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Lys Thr Asp Val Asn Lys 45 50 55 Glu Phe Glu Met Gly Glu Ala Leu Ala Gly Ala Ser Gly Asn Thr Thr 60 65 70 Ser Thr Leu Ser Lys Leu Val Glu Arg Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Lys 75 80 85 90 His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu 95 100 105 Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser 110 115 120 Gly Tyr Leu Arg Gly Asn Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe 125 130 135 Gly Asp Gly Glu Asn Ala Thr Gln Pro Ala Ala Thr Ser Ile Pro Asn 140 145 150 Val Gln Leu Asn Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Ala Phe 155 160 165 170 Ala Trp Ser Val Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala 175 180 185 Thr Leu Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu 190 195 200 Glu Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro 205 210 215 Lys Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Ala Leu Thr Ala Gly Thr 220 225 230 Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp 235 240 245 250 Gln Ala Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr 255 260 265 Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ser Asn Thr Ile Arg 270 275 280 Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Lys Pro Val Val Asp Ile Thr Thr Leu 285 290 295 Asn Pro Thr Ile Ala Gly Cys Gly Ser Val Val Ala Ala Asn Ser Glu 300 305 310 Gly Gln Ile Ser Asp Thr Met Gln Ile Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys 315 320 325 330 Met Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val 335 340 345 Asp Ala Asp Lys Tyr Ala Val Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu 350 355 360 Arg Ala Ala His Val Asn Ala Gln Phe Arg Phe 365 370 373

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCAGAAAAAG ATAGCGAGCA CA

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAAAACTG GACCCGACCG AA

【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：１２９５ 配列の型：核酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： ・生物名：クラミジア・トラコマティス 直接の起源： ・ライブラリー名：ゲノムＤＮＡ ・クローン名：ＪＭ１０９（ｐＭＯＭＰ−Ｇ２） 配列の特徴： ・特徴を表す記号：mat peptide ・存在位置：99..1217 ・特徴を決定した方法：Ｅ AAGAGAGCTAATTATACAATTTAGAGGTAAGA 32 ATG AAA AAA CTC TTG AAA TCG GTA TTA GTA TTT GCC GCT TTG AGT 77 Met Lys Lys Leu Leu Lys Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser -22 -20 -15 - 10 TCT GCT TCC TCC TTG CAA GCT CTG CCT GTG GGG AAT CCT GCT GAA 122 Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Pro Ala Glu -5 -1 1 5 CCA AGC CTT ATG ATC GAC GGA ATT CTG TGG GAA GGT TTC GGC GGA 167 Pro Ser Leu Met Ile Asp Gly Ile Leu Trp Glu Gly Phe Gly Gly 10 15 20 GAT CCT TGC GAT CCT TGC ACC ACT TGG TGT GAC GCT ATC AGC ATG 212 Asp Pro Cys Asp Pro Cys Thr Thr Trp Cys Asp Ala Ile Ser Met 25 30 35 CGT ATG GGT TAC TAC GGA GAC TTT GTT TTC GAC CGT GTT TTG AAA 257 Arg Met Gly Tyr Tyr Gly Asp Phe Val Phe Asp Arg Val Leu Lys 40 45 50 ACT GAT GTG AAT AAA GAG TTT GAA ATG GGC GAG GCT TTA GCC GGA 302 Thr Asp Val Asn Lys Glu Phe Glu Met Gly Glu Ala Leu Ala Gly 55 60 65 GCT TCT GGG AAT ACG ACC TCT ACT CTC TCA AAA TTG GTA GAA CGA 347 Ala Ser Gly Asn Thr Thr Ser Thr Leu Ser Lys Leu Val Glu Arg 70 75 80 ACG AAC CCT GCA TAT GGC AAG CAT ATG CAA GAC GCA GAG ATG TTT 392 Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Lys His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe 85 90 95 ACC AAT GCC GCT TGC ATG GCA TTG AAT ATT TGG GAT CGT TTT GAT 437 Thr Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp 100 105 110 GTA TTC TGT ACA TTA GGA GCC ACC AGT GGA TAT CTT AGA GGA AAT 482 Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Arg Gly Asn 115 120 125 TCA GCA TCT TTC AAC TTA GTT GGG TTA TTC GGC GAT GGT GAA AAC 527 Ser Ala Ser Phe Asn Leu Val Gly Leu Phe Gly Asp Gly Glu Asn 130 135 140 GCC ACG CAG CCT GCT GCA ACA AGT ATT CCT AAC GTG CAG TTA AAT 572 Ala Thr Gln Pro Ala Ala Thr Ser Ile Pro Asn Val Gln Leu Asn 145 150 155 CAG TCT GTG GTG GAA CTG TAT ACA GAT ACT GCT TTT GCT TGG AGT 617 Gln Ser Val Val Glu Leu Tyr Thr Asp Thr Ala Phe Ala Trp Ser 160 165 170 GTT GGA GCT CGT GCA GCT TTG TGG GAA TGT GGA TGC GCG ACT TTA 662 Val Gly Ala Arg Ala Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr Leu 175 180 185 GGC GCT TCT TTC CAA TAC GCT CAA TCT AAA CCT AAA GTC GAA GAA 707 Gly Ala Ser Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Lys Pro Lys Val Glu Glu 190 195 200 TTA AAC GTT CTC TGT AAC GCA GCT GAG TTT ACT ATC AAT AAG CCT 752 Leu Asn Val Leu Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro 205 210 215 AAA GGA TAT GTA GGG CAA GAA TTC CCT CTT GCA CTC ACA GCA GGA 797 Lys Gly Tyr Val Gly Gln Glu Phe Pro Leu Ala Leu Thr Ala Gly 220 225 230 ACT GAT GCA GCG ACG GGC ACT AAA GAT GCC TCT ATT GAT TAC CAT 842 Thr Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp Tyr His 235 240 245 GAG TGG CAA GCG AGT TTA TCT CTT TCT TAC AGA CTC AAT ATG TTC 887 Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe 250 255 260 ACT CCC TAC ATT GGA GTT AAA TGG TCT CGT GCA AGC TTT GAT TCT 932 Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser Phe Asp Ser 265 270 275 AAT ACA ATT CGT ATA GCC CAG CCG AAG TTG GCA AAA CCT GTT GTA 977 Asn Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Lys Pro Val Val 280 285 290 GAT ATT ACA ACC CTT AAC CCA ACT ATT GCA GGA TGC GGC AGT GTA 1022 Asp Ile Thr Thr Leu Asn Pro Thr Ile Ala Gly Cys Gly Ser Val 295 300 305 GTC GCA GCT AAC TCG GAA GGA CAG ATA TCT GAT ACA ATG CAA ATC 1067 Val Ala Ala Asn Ser Glu Gly Gln Ile Ser Asp Thr Met Gln Ile 310 315 320 GTT TCC TTG CAA TTA AAC AAG ATG AAA TCT AGA AAA TCT TGC GGT 1112 Val Ser Leu Gln Leu Asn Lys Met Lys Ser Arg Lys Ser Cys Gly 325 330 335 ATT GCA GTA GGA ACA ACT ATT GTG GAT GCA GAC AAA TAC GCA GTT 1157 Ile Ala Val Gly Thr Thr Ile Val Asp Ala Asp Lys Tyr Ala Val 340 345 350 ACA GTT GAG ACT CGC TTG ATC GAT GAG AGA GCT GCT CAC GTA AAT 1202 Thr Val Glu Thr Arg Leu Ile Asp Glu Arg Ala Ala His Val Asn 355 360 365 GCA CAA TTC CGC TTC TAATTAATTGTATAATTTTGTTAAACTTTAGCAAGTTTA 1247 Ala Gln Phe Arg Phe 1260 1270 1280 1290 TCTTTGTTAATAACACTATCCGTGTTTCTGGGGCTCGAT 1295

【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TATGCTGCCT GTGGGTAACC CTGCTGAACC AAGCCTTATG ATCGACGGGA TCCTATGGGA AGGTTTCGGC GGA

【００４１】配列番号：７ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCTCCGCC GAAACCTTCC CATAGGATCC CGTCGATCAT AAGGCTTGGT TCAGCAGGGT TACCCACAGG CAGCA

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｇ株主要外膜蛋白質遺伝子を含むベクターの構
築を示す図である。

【図２】発現ベクターｐＣＴ３３−Ｇの構築を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載の塩基配列を有
   することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要
   外膜蛋白質遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列
   を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス
   主要外膜蛋白質。