JPH10215877A - クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子Info
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- JPH10215877A JPH10215877A JP9025123A JP2512397A JPH10215877A JP H10215877 A JPH10215877 A JP H10215877A JP 9025123 A JP9025123 A JP 9025123A JP 2512397 A JP2512397 A JP 2512397A JP H10215877 A JPH10215877 A JP H10215877A
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Abstract
をコードする遺伝子をクローニングし、クラミジア・ト
ラコマティス感染症診断に使用される抗原を提供する。 【解決手段】 (1)配列表の配列番号1記載の塩基配
列を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質遺伝子、(2)配列表の配列番号2記
載のアミノ酸配列を有することを特徴とするクラミジア
・トラコマティス主要外膜蛋白質を構成とする。 【効果】 クラミジア・トラコマティス抗体検査やワク
チン製造が可能となった。
Description
マティス感染症の診断などに使用されるクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝
子に関する。
Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生き
た宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感
染粒子である小型の基本小体(Elementary Body:EBと
略;直経0.3 μm)が貧食によって細胞内へ取り込まれ感
染し、食空胞(Phagosome)内で網様体(Reticulate bod
y:RBと略;直径0.5 〜2.0 μm)に変換して2分裂で増
殖後、EBに再び成熟変換して細胞外に放出され、次に
感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言われ
ている。
尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感
染症(Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌
性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎)などを起こす。近
年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染
が広がっていることで注目されている。
の血清型(A, B, Ba, C, D, E, F,G, H, I, J, K, L1,
L2, L3)が存在する。これらは血清学的に3つのグルー
プ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C,
J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。
法として、近年、酵素免疫測定法(EIA)による抗体
検査方法が開発されている。EIAは多検体を簡便且つ
迅速に測定できる利点を有している。EIAによる抗体
検査に使用する抗原としては、特開平4-297871号に記載
されているような細胞表面に露出している主要外膜蛋白
質(Major Outer Membrane Prorein:MOMP)の部分精製品
が用いられている。
rotein:MOMP)はクラミジア・トラコマティス外膜蛋白質
の約60%を占め、その一部が細胞表面に露出してい
る。この蛋白質は抗原性の強い蛋白質として知られてお
り、上述のように抗体検査における抗原に使用された
り、またワクチンとして期待されている。
C, D, E, F, H, L1, L2, L3)の主要外膜蛋白質につい
て、その全塩基配列及びアミノ酸配列の情報がGenbank
に登録されている(Accession No.A株:J03813, B株:M19
127, C株:M19128, D株:X62918,X62919,X62920,X62921,E
株:X52557, F株:M30501, H株:X16007,L1株:M36533,L2
株:M19126,L3株:X55700) 一方、Ba, G, I, J 及びK 株はCaldwellらの文献[J. B
acteriol. 168, 1277-1287 (1986) ]に部分配列のみ報
告されている。
725 号に記載されているように感染細胞からEBを回収
後、破砕して精製する方法が用いられている。この特許
ではL2、E及びC株EBが用いられているが、血清型
によってEBの増殖度に差があることが知られている。
特にG株の増殖が悪く、天然抽出法では主要外膜蛋白質
を大量に取得することは困難であった。
の主要外膜蛋白質遺伝子の全塩基配列及びアミノ酸配列
を明らかにし、遺伝子組換え法による主要外膜蛋白質の
製造を可能にする手段を提供する。本発明者らは、G株
のクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子
のクローニングを行い、全塩基配列を決定し、大腸菌で
発現させ、精製した後、この組換え主要外膜蛋白質を抗
原として用いてEIAを行った結果、EBから精製した
主要外膜蛋白質精製品と同等の性能を得ることに成功
し、本発明を完成するに至った。
列表の配列番号1記載の塩基配列を有することを特徴と
するクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質遺伝
子、(2)配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列を有
することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要
外膜蛋白質である。詳しくは、新規のクラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質遺伝子を提供するものであ
り、また本遺伝子を発現ベクターに組み込み、このベク
ターにより形質転換された形質転換体及びそれによって
生産されたクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質
を提供するものである。
る。
外膜蛋白質遺伝子を取得するには、EBを適当な細胞、
例えばHeLaやL929細胞に感染させ、クラミジア
・トラコマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ
糖密度勾配遠心によって、大量のEBを取得、常法によ
って染色体DNAを抽出精製してクローニングを行う。
クローニング方法としてλgt10、λgt11或いはPCR法
などがあるが、最近PCR法[Nature 324, 163, (198
6) ]が多く用いられている。
るDNAプライマーと該遺伝子に相補的な部分配列から
成るDNAプライマーをアニールさせ、耐熱性DNAポ
リメラーゼであるTaqポリメラーゼを用いて増幅反応
を行うものである。PCR法によるクローニングでは、
用いるDNAプライマーの配列が重要になる。実施例1
にその一例を示す。
む増幅断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベ
クターに組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的
のDNAを有するクローンを選択すれば、本発明に用い
る主要外膜蛋白質遺伝子DNAが得られる。得られたD
NAはジデオキシ法等により配列を決定することが可能
である。
白質を安定に発現する宿主−ベクター系を選択するこ
と、さらに発現した主要外膜蛋白質が天然物と同様の種
特異的抗原性を有していることが必要である。この目的
のために宿主としては、大腸菌、酵母または昆虫細胞等
を使用することができる。
うに構築できる。プロモーターとしては、Tacプロモ
ーター、Trpプロモーター、T7プロモーター、PL
プロモーター等が使用できる。プロモーターの下流に上
記主要外膜蛋白質遺伝子のDNA断片を転写方向にした
がって挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法
は、以下に示す文献[Molecular Cloning, Cold Spring
Harbar Laboratory Press, (1989)]に記載されてい
る。
し、適当な誘導処理をし、目的の主要外膜蛋白質を発現
させることができる。主要外膜蛋白質の発現の有無は抗
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質モノクロー
ン抗体を用いたウエスタン・ブロッティング[Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA., 76, 116-120, (1979)]で確認で
きる。
法で精製することができる。細胞を酵素と非イオン性界
面活性剤を用いて破砕する。クラミジア・トラコマティ
ス主要外膜蛋白質は不溶性を示すので、遠心分離により
沈澱画分(主要外膜蛋白質が豊富)に集まる。さらに精
製するためには、沈澱(主要外膜蛋白質)画分を可溶化
する必要がある。この目的のために強力なアニオン系界
面活性剤(望ましくは0.1 〜2%ドデシル硫酸ナトリウ
ム;SDS)を用いて可溶化する。可溶化した主要外膜
蛋白質は調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィー法
で高純度に精製することができる。
く説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
ス主要外膜蛋白質遺伝子のクローニング 1.クラミジア・トラコマティスゲノムDNAの調製 (1) クラミジア・トラコマティスの培養とEBの精製 クラミジア・トラコマティスG株 (G/UW-57/CX) を10
%牛胎児血清(FCS)を含 むイーグルMEM培地で
増殖させたL929細胞に接種した。次いで37℃で2
〜3日培養した。尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍
光抗体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、
培養液を捨てて、ハンクスBSSを加え、ラバーポリス
メンで細胞をかき取った。次に感染細胞浮遊液を超音波
処理(20KHz,30秒)後、遠心分離(500g, 4 ℃,15分
間)して上清を回収した。上清を35%Renogranfin 液
(10mM HEPES, 0.15MNaCl)に重層し、43,000×
g、4℃、1 時間遠心分離した。得られた沈澱にSPG
(0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸
buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin
液の不連続密度勾配(40% / 44% / 52%)に重層し、4
3,000×g、4℃、1時間遠心分離した。44%と
52%の界面のバンドを回収し、SPGで希釈した後、
30,000G、4℃、30分間遠心分離し、精製EB
を得た。
NAの調製 上記で得た精製EBに10倍量のLysis Buffer(10mM Tr
is-HCl(pH8.0), 5mM EDTA, 0.5% SDS, 100μg/ml Prote
inase K)を加え、55℃、90分間反応させた後、フェ
ノール/クロロホルム抽出を行い、ゲノムDNAをエタ
ノール沈澱させた。得られたゲノムDNAをTE Buffer
(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃
度50μg/mlになるようにRNaseAを加え、60℃、
30分間反応させた。反応終了後、フェノール/クロロ
ホルム抽出を行い、ゲノムDNAをエタノール沈澱させ
た。ゲノムDNAを適当量のTE Buffer に溶解させた。
蛋白質のクローニング 実施例1−1で得たクラミジア・トラコマティスG株ゲ
ノムDNA溶液1μlを用いて、Saiki らの方法[Natur
e, 324, 163, (1986)]に従い、Gene Amp PCRReagent K
it(宝酒 造社製)を用いたPCR法で、主要外膜蛋白
質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、10mM Tris-
HCl(pH 8.3),50mM KCl,5mM MgCl2, 0.1%ゼ
ラチンを含む反応液中にクラミジア・トラコマティスG
株ゲノムDNA溶液1μl と配列番号3及び配列番号4
の2種類のプライマーそれぞれ20pmoles及びTaq poly
merase5units を加え、最終量50μl とした。
45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)× 30 サイク
ル〕→〔(94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10mi
n.)×5サイクル〕反応させた。反応終了液を1%アガ
ロースゲル電気泳動で分画した結果、約1.3kbのP
CR増幅産物を確認した。この約1.3kbのPCR増
幅産物をGeneclean II(BIO101社製)でDNAを回収し
た後、さらにDNA BluntingKit(宝酒造製)を用いて平
滑化した。次にpUC19 2μg を制限酵素SmaI4units
で30℃、2時間消化後、アルカリフォスファターゼ
(BRL 社製)で5’末端を脱リン酸化した。上記PCR
増幅断片とpUC19 断片をLigation Kit(宝酒造社製)を
用いて結合させ、CaCl2 法〔Molecular Cloning,p250 C
old Spring Harbar Laboratory〕によって大腸菌JM1
09に導入した。得られた形質転換体を適当に10個選
択、Birnboimらのアルカリ―SDS法〔Nuc.Acids Re
s., 7, 1513, (1979) 〕でDNAを精製し、制限酵素マ
ッピングによりPCR増幅断片を有するクローン(pMOM
P-G2と命名)を得た(図1参照)。
精製し、パーキンエルマージャパン社製DNAシーケン
サー373Aを用いて配列番号1に記載の塩基配列を決
定した。オープンリーディングフレームを検索した結
果、配列番号5に記載の領域が判明した。G株MOMP
の全アミノ酸配列は、配列番号2に記載した。また配列
番号1の塩基配列及び配列番号2のアミノ酸配列はG株
公知の部分塩基配列及びアミノ酸配列[J. Bacteriol.
1, 68, 1277-1287, (1986) 〕を含むことが確認され
た。
コマティス主要外膜蛋白質の発現 1.G株主要外膜蛋白質用発現ベクターの作製 実施例1で得られたプラスミドpMOMP-G220μg を制限
酵素BstYI 20unitsで60℃、2時間消化後、フェノ
ール抽出―エタノール沈澱を行なった。DNAを溶解
後、制限酵素KpnI20unitで37℃、2時間消化後、
1%アガロースゲル電気泳動を行い、0.8kb断片を
Geneclean IIで回収した。
ーター発現ベクター pPLN-MCS 5μgを制限酵素KpnI
5units で37℃、2時間消化後、フェノール抽出―エ
タノール沈澱を行なった。DNAを溶解後、制限酵素N
deI5unitで37℃、2時間消化し、1%アガロースゲ
ル電気泳動を行い、3.2kbの断片をGeneclean IIで
回収した。さらにDNAシンセサイザーを用いて、配列
番号6及び配列番号7に示すオリゴヌクレオチドを合成
した。
(宝酒造社製)を用いて5’末端をリン酸化した後、リ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。0.8kb
の断片、3.2kbの断片及びアニールしたオリゴヌク
レオチドを結合させ、大腸菌N99cI+に導入した。得られ
た形質転換体を適当に24個選択、アルカリ―SDS法
でDNAを精製し、制限酵素NdeIとKpnIによるマッ
ピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によ
りプラスミドpCT33−Gを取得した(図2参照)。
30−1に形質転換した。形質転換体を50μg/ml
Ampicillin を含むLB培地1mlで30℃、16時間
培養した。前培養液1mlを新しいLB培地100ml
に接種した。30℃、約2時間培養後(O.D.600 = 0.4 -
0.5) 、培養温度を42℃にシフトし、さらに3時間培
養した。培養後、遠心分離し菌体を回収した。
(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laemm
li の方法[Nature, 227, 680 (1970) ]に従ってSD
S―ポリアクリルアミドゲル電気泳動[SDS−PAG
E]を行った。泳動後、種特異性の抗クラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用いてウ
エスタンブロッティングを行った。その結果、分子量約
40,000の位置に発色がみられた。従って主要外膜
蛋白質の発現が確認された。
×gで10分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離
した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調
べた結果、主要外膜蛋白質は沈澱画分に見られ、不溶体
を形成していることがわかった。
トル培養した。遠心分離して菌体を回収後、8mlのLy
sis buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V)Sucrose,1
mM EDTA, 4mg/ml Lysozyme)に懸濁後、氷上で30分間
放置した。次に最終濃度が10mM MgCl2,10m
M MnCl2,10μg/mlDNaseI, 10μg/m
lRNaseAになるようにそれぞれ加え、4℃で30分間
放置した。さらに20mlのDetergent buffer I(20mM
Tris-HCl (pH7.5), 0.2M NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deox
ycholate, 1.6% NP-40) を加え、さらに30分間放置し
た。
澱を回収した。この沈澱に対して10倍量のDetergent
buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM E
DTA,0.5 % Triton X-100) で十分に懸濁し、4℃で5
分間放置後、5,000×gで10分間遠心分離して沈
澱を回収した。Detergnt buffer IIによる沈澱の洗浄を
3回繰り返した。
後、不溶画分を遠心分離により除去した。可溶性画分を
調製用SDS−PAGEで分離し、主要外膜蛋白質を含
むゲルを切り出し、エレクトロエリューター(アミコン
社製)で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を0.1%
SDSを含むPBSに対して透析した。蛋白質純度を検
定するためにSDS−PAGEで分析したところ、純度
はほぼ100%であることがわかった。
EBを免疫して得られたウサギ抗血清を用いてウエスタ
ン・ブロッティング行った結果、分子量約40,000
の位置のみ反応した。従って,得られた主要外膜蛋白質
精製品は主要外膜蛋白質以外の蛋白質を含んでないこと
がわかった。
ス主要外膜蛋白質遺伝子を用いることで、遺伝子組換え
法で主要外膜蛋白質を大量に製造することが可能とな
り、クラミジア・トラコマティス抗体検査やワクチン製
造が可能となった。
築を示す図である。
ある。
Claims (2)
- 【請求項1】 配列表の配列番号1記載の塩基配列を有
することを特徴とするクラミジア・トラコマティス主要
外膜蛋白質遺伝子。 - 【請求項2】 配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列
を有することを特徴とするクラミジア・トラコマティス
主要外膜蛋白質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9025123A JPH10215877A (ja) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9025123A JPH10215877A (ja) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10215877A true JPH10215877A (ja) | 1998-08-18 |
Family
ID=12157174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9025123A Pending JPH10215877A (ja) | 1997-02-07 | 1997-02-07 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びそれをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10215877A (ja) |
-
1997
- 1997-02-07 JP JP9025123A patent/JPH10215877A/ja active Pending
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