JPH11123078A - クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 - Google Patents
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬Info
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- JPH11123078A JPH11123078A JP9289938A JP28993897A JPH11123078A JP H11123078 A JPH11123078 A JP H11123078A JP 9289938 A JP9289938 A JP 9289938A JP 28993897 A JP28993897 A JP 28993897A JP H11123078 A JPH11123078 A JP H11123078A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来大量に取得が困難であったクラミジア・
トラコマティス感染症の診断やワクチン等に使用される
抗原の製造法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗
体測定方法及び抗体測定試薬を提供する。 【解決手段】 アミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプ
チド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とす
るクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を構成と
する。
トラコマティス感染症の診断やワクチン等に使用される
抗原の製造法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗
体測定方法及び抗体測定試薬を提供する。 【解決手段】 アミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプ
チド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とす
るクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質を構成と
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、クラミジア・トラ
コマティス感染症の診断やワクチンなどに使用されるク
ラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造
方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方
法及び抗体測定試薬に関する。
コマティス感染症の診断やワクチンなどに使用されるク
ラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造
方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方
法及び抗体測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア・トラコマティス(Chlamydia
Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生き
た宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感
染粒子である小型の基本小体（Elementary Body:ＥＢと
略；直経0.3 μm ）が貧食によって細胞内へ取り込まれ
感染し、食空胞（Phagosome)内で網様体（Reticulate b
ody:ＲＢと略；直径0.5 〜2.0 μm)に変換して２分裂で
増殖後、ＥＢに再び成熟変換して細胞外に放出され、次
に感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言わ
れている。
Trachomatis) は一般細菌と異なり、増殖のために生き
た宿主細胞が必要な偏性細胞内寄生性病原体である。感
染粒子である小型の基本小体（Elementary Body:ＥＢと
略；直経0.3 μm ）が貧食によって細胞内へ取り込まれ
感染し、食空胞（Phagosome)内で網様体（Reticulate b
ody:ＲＢと略；直径0.5 〜2.0 μm)に変換して２分裂で
増殖後、ＥＢに再び成熟変換して細胞外に放出され、次
に感染を起こすという独特の増殖環を持っていると言わ
れている。
【０００３】クラミジア・トラコマティスは主に目と泌
尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感
染症（Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌
性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎）などを起こす。近
年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染
が広がっていることで注目されている。
尿生殖器に感染し、トラコーマ及び封入体結膜炎、性感
染症（Sexually Transmitted Disease:STDと略、非淋菌
性尿道炎、子宮頸管炎、新生児肺炎）などを起こす。近
年、特に日本を含めた先進国でSTD の起炎菌として感染
が広がっていることで注目されている。
【０００４】クラミジア・トラコマティスには１５種類
の血清型（A, B, Ba, C, D, E, F,G, H, I, J, K, L1,
L2, L3)が存在する。これらは血清学的に３つのグルー
プ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C,
J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。
［佐藤他、感染症学雑誌、64, 12, 1475-1481,(1990)]
。
の血清型（A, B, Ba, C, D, E, F,G, H, I, J, K, L1,
L2, L3)が存在する。これらは血清学的に３つのグルー
プ、B-complex(B, Ba, E, D, L1, L2)、C-complex(C,
J, H, I, A)、中間型(G, F, K, L3) に分類される。
［佐藤他、感染症学雑誌、64, 12, 1475-1481,(1990)]
。
【０００５】クラミジア・トラコマティス感染症の測定
法には擦過により採取した患者材料中のクラミジア菌体
を対象とする抗原測定法と血清を検体とする抗体測定法
がある。以前から抗原測定法が採用されてきたが、患者
に苦痛を与えたり、抗原測定材料の採取が容易でないな
どの問題があった。最近では検体採取の容易な抗体測定
法が広く行われている。また感染リスクの高い人のスク
リーニング或いは疫学的調査にも抗体測定が繁用されて
いる。
法には擦過により採取した患者材料中のクラミジア菌体
を対象とする抗原測定法と血清を検体とする抗体測定法
がある。以前から抗原測定法が採用されてきたが、患者
に苦痛を与えたり、抗原測定材料の採取が容易でないな
どの問題があった。最近では検体採取の容易な抗体測定
法が広く行われている。また感染リスクの高い人のスク
リーニング或いは疫学的調査にも抗体測定が繁用されて
いる。
【０００６】最も高感度な抗体測定法としては１５種類
のクラミジア・トラコマティス血清型を分類するWangの
マイクロ−ＩＦ（Immunofluorescence）法が抗体陽性検
体を漏れなく検出できる方法として知られている［Trac
homa and related disorderscaused by chlamydial age
nts (ed. Nicols, R. L.) p273, Excerpta Medica,Amst
erdam, (1971)]。
のクラミジア・トラコマティス血清型を分類するWangの
マイクロ−ＩＦ（Immunofluorescence）法が抗体陽性検
体を漏れなく検出できる方法として知られている［Trac
homa and related disorderscaused by chlamydial age
nts (ed. Nicols, R. L.) p273, Excerpta Medica,Amst
erdam, (1971)]。
【０００７】しかし、マイクロ−ＩＦ法はその操作が煩
雑であり、判定に技量、経験を要し、大量の検体の処理
が不可能であるため、一般に臨床検査の検査方法として
は採用されていない。また最近では抗原をＬ２株のみに
簡略化したＦＡ法（Fluorescence antibody technique)
が臨床的に繁用されている。しかしＦＡ法に関してもマ
イクロ−ＩＦ法と同様の問題をかかえている。
雑であり、判定に技量、経験を要し、大量の検体の処理
が不可能であるため、一般に臨床検査の検査方法として
は採用されていない。また最近では抗原をＬ２株のみに
簡略化したＦＡ法（Fluorescence antibody technique)
が臨床的に繁用されている。しかしＦＡ法に関してもマ
イクロ−ＩＦ法と同様の問題をかかえている。
【０００８】一方、近年、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に
よる抗体測定方法が開発されている。ＥＩＡは多検体を
簡便且つ迅速に測定できる利点を有している。ＥＩＡに
よる抗体測定に使用する抗原としては、クラミジア・ト
ラコマティスに特異的な抗原（種特異的抗原）であるＬ
２株由来の主要外膜蛋白質（Major Outer Membrane Pro
rein、以下「ＭＯＭＰ」という、ＭＯＭＰは外膜蛋白質
の約６０％を占めている）の部分精製品（外膜蛋白質画
分）が用いられているが、精製純度が低いためにクラミ
ジア・トラコマティスと同属のクラミジア・ニューモニ
エやクラミジア・シタシの抗体による交差反応が起こる
ことが知られている。これはＭＯＭＰの部分精製品に含
まれるクラミジア属共通抗原（属特異的抗原）の存在に
起因する。
よる抗体測定方法が開発されている。ＥＩＡは多検体を
簡便且つ迅速に測定できる利点を有している。ＥＩＡに
よる抗体測定に使用する抗原としては、クラミジア・ト
ラコマティスに特異的な抗原（種特異的抗原）であるＬ
２株由来の主要外膜蛋白質（Major Outer Membrane Pro
rein、以下「ＭＯＭＰ」という、ＭＯＭＰは外膜蛋白質
の約６０％を占めている）の部分精製品（外膜蛋白質画
分）が用いられているが、精製純度が低いためにクラミ
ジア・トラコマティスと同属のクラミジア・ニューモニ
エやクラミジア・シタシの抗体による交差反応が起こる
ことが知られている。これはＭＯＭＰの部分精製品に含
まれるクラミジア属共通抗原（属特異的抗原）の存在に
起因する。
【０００９】ＭＯＭＰ以外の外膜蛋白質には、例えば分
子量約７５，０００や約６０，０００の蛋白質が知られ
ている。分子量約７５，０００の蛋白質には属特異的抗
原［Infect. Immun. 58,(1), 189-196, (1990)］、分子
量約６０，０００の蛋白質には属特異的抗原及び種特異
的抗原の存在が報告されている［Microbiol. 140, 2003
-2011, (1994) & J. Bacteriol. 173,(12), 3821-3830,
(1991)]。
子量約７５，０００や約６０，０００の蛋白質が知られ
ている。分子量約７５，０００の蛋白質には属特異的抗
原［Infect. Immun. 58,(1), 189-196, (1990)］、分子
量約６０，０００の蛋白質には属特異的抗原及び種特異
的抗原の存在が報告されている［Microbiol. 140, 2003
-2011, (1994) & J. Bacteriol. 173,(12), 3821-3830,
(1991)]。
【００１０】以上のように精製純度の低いＭＯＭＰ部分
精製品を抗体測定に使用する抗原として用いた場合、ク
ラミジア・ニューモニエ抗体やクラミジア・シタシ抗体
による交差反応が起こる。従って属特異的抗原を除去す
るためにＭＯＭＰを高純度に精製する必要があった。
精製品を抗体測定に使用する抗原として用いた場合、ク
ラミジア・ニューモニエ抗体やクラミジア・シタシ抗体
による交差反応が起こる。従って属特異的抗原を除去す
るためにＭＯＭＰを高純度に精製する必要があった。
【００１１】ＭＯＭＰの高純度精製法としては特開昭57
-158725 号に記載されているが、クラミジア・トラコマ
ティスＥＢから精製するため、大量に取得することが困
難であった。大量に取得が可能で、かつ属特異的抗原を
含まないＭＯＭＰを製造する方法として、大腸菌による
遺伝子組換え法が考えられる。遺伝子組換え法によるＬ
２株ＭＯＭＰの製造は以前から試みられていたが、ＭＯ
ＭＰの部分発現であったり、たとえ完全長のＭＯＭＰを
発現させたとしても、宿主大腸菌に対する毒性のため、
発現量が少なく、大量製造することができなかった。
-158725 号に記載されているが、クラミジア・トラコマ
ティスＥＢから精製するため、大量に取得することが困
難であった。大量に取得が可能で、かつ属特異的抗原を
含まないＭＯＭＰを製造する方法として、大腸菌による
遺伝子組換え法が考えられる。遺伝子組換え法によるＬ
２株ＭＯＭＰの製造は以前から試みられていたが、ＭＯ
ＭＰの部分発現であったり、たとえ完全長のＭＯＭＰを
発現させたとしても、宿主大腸菌に対する毒性のため、
発現量が少なく、大量製造することができなかった。
【００１２】遺伝子組換え法で発現させた蛋白質を効率
良く精製するには、アミノ末端あるいはカルボキシ末端
に６個のヒスチジン残基を結合した状態で目的蛋白質を
発現させ、菌体を破砕後、Ｎｉキレートカラムを用いた
精製法が使われている［Genetic Engineering, Plenum
Press, New York, 12, 87-98, (1990)］。６個のヒスチ
ジン残基を付加は精製効率を向上させる目的であり、付
加することにより目的蛋白質の発現量が増加するという
報告はない。
良く精製するには、アミノ末端あるいはカルボキシ末端
に６個のヒスチジン残基を結合した状態で目的蛋白質を
発現させ、菌体を破砕後、Ｎｉキレートカラムを用いた
精製法が使われている［Genetic Engineering, Plenum
Press, New York, 12, 87-98, (1990)］。６個のヒスチ
ジン残基を付加は精製効率を向上させる目的であり、付
加することにより目的蛋白質の発現量が増加するという
報告はない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、クラ
ミジア・トラコマティスの抗体測定の抗原として、完全
長のクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰの大腸菌によ
る大量製造を可能にする手段を提供する。
ミジア・トラコマティスの抗体測定の抗原として、完全
長のクラミジア・トラコマティスＭＯＭＰの大腸菌によ
る大量製造を可能にする手段を提供する。
【００１４】本発明者らは、クラミジア・トラコマティ
スＭＯＭＰをコードする遺伝子のクローニングを行い、
そのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に配列番号１
〜５のいずれかのアミノ酸残基（アミノ酸タグと呼称）
をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作
製し、大腸菌で発現させた結果、従来より発現量を大幅
に向上させることに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
スＭＯＭＰをコードする遺伝子のクローニングを行い、
そのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に配列番号１
〜５のいずれかのアミノ酸残基（アミノ酸タグと呼称）
をコードする合成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作
製し、大腸菌で発現させた結果、従来より発現量を大幅
に向上させることに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
【００１５】
【課題を解決するための手段】即ち本発明は、（１）ア
ミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免
疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質、（２）アミノ末端にペプ
チド結合されたアミノ酸残基が配列表の配列番号１〜５
のいずれかに表されることを特徴とする請求項１記載の
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（３）
（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス
主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に
大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質が発現する条件で培養し、該
形質転換体から発現産物を採取することを特徴とするク
ラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の製造方法、
（４）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマ
ティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴と
するクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法、
（５）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマ
ティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴と
するクラミジア・トラコマティスの抗体測定試薬であ
る。
ミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプチド結合された免
疫学的な活性を有することを特徴とするクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質、（２）アミノ末端にペプ
チド結合されたアミノ酸残基が配列表の配列番号１〜５
のいずれかに表されることを特徴とする請求項１記載の
クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質、（３）
（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマティス
主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、次に
大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラミジア・トラ
コマティス主要外膜蛋白質が発現する条件で培養し、該
形質転換体から発現産物を採取することを特徴とするク
ラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質の製造方法、
（４）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマ
ティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴と
するクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法、
（５）（１）又は（２）に記載のクラミジア・トラコマ
ティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを特徴と
するクラミジア・トラコマティスの抗体測定試薬であ
る。
【００１６】以下、本発明をより具体的に詳細に説明す
る。
る。
【００１７】
【発明の実施の形態】クラミジア・トラコマティスＭＯ
ＭＰ遺伝子を取得するには、ＥＢを適当な細胞、例えば
ＨｅＬａやＬ９２９細胞に感染させ、クラミジア・トラ
コマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ糖密度
勾配遠心によって、大量のＥＢを取得、常法によって染
色体ＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。クロー
ニング方法としてλgt10、λgt11或いはＰＣＲ法などが
あるが、最近ＰＣＲ法［Nature324, 163, (1986) ］が
多く用いられている。ＰＣＲ法とは目的遺伝子の部分配
列から成るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分
配列から成るＤＮＡプライマーをアニールさせ、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを用いて
増幅反応を行うものである。ＰＣＲ法によるクローニン
グでは、用いるＤＮＡプライマーの配列が重要になる。
実施例１にその一例を示したが、これに限定されるもの
ではない。
ＭＰ遺伝子を取得するには、ＥＢを適当な細胞、例えば
ＨｅＬａやＬ９２９細胞に感染させ、クラミジア・トラ
コマティスを増殖させた後、細胞を破砕し、ショ糖密度
勾配遠心によって、大量のＥＢを取得、常法によって染
色体ＤＮＡを抽出精製してクローニングを行う。クロー
ニング方法としてλgt10、λgt11或いはＰＣＲ法などが
あるが、最近ＰＣＲ法［Nature324, 163, (1986) ］が
多く用いられている。ＰＣＲ法とは目的遺伝子の部分配
列から成るＤＮＡプライマーと該遺伝子に相補的な部分
配列から成るＤＮＡプライマーをアニールさせ、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼを用いて
増幅反応を行うものである。ＰＣＲ法によるクローニン
グでは、用いるＤＮＡプライマーの配列が重要になる。
実施例１にその一例を示したが、これに限定されるもの
ではない。
【００１８】次いで得られたＭＯＭＰ遺伝子を含む増幅
断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベクター
に組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的のＤＮ
Ａを有するクローンを選択すれば、本発明に用いるＭＯ
ＭＰ遺伝子ＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡはジデオ
キシ法等により配列を決定することが可能である。
断片を例えばpUC19 やpBR322等のクローニングベクター
に組み込み、大腸菌等の宿主を形質転換し、目的のＤＮ
Ａを有するクローンを選択すれば、本発明に用いるＭＯ
ＭＰ遺伝子ＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡはジデオ
キシ法等により配列を決定することが可能である。
【００１９】免疫学的活性を有するＭＯＭＰを大量製造
するためには、使用する宿主−ベクター系に合わせてＭ
ＯＭＰ自身の改良が必要となる。この目的のためにＭＯ
ＭＰのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に例えば配
列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基をコードする合
成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、発現させ
ることができる。本発明では６アミノ酸残基からなるペ
プチドに限定したが、同様の効果を得るためにアミノ酸
残基数、種類及びその配列の変更は当業者にとって容易
に推定される。
するためには、使用する宿主−ベクター系に合わせてＭ
ＯＭＰ自身の改良が必要となる。この目的のためにＭＯ
ＭＰのアミノ末端をコードするＤＮＡの上流に例えば配
列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基をコードする合
成ＤＮＡを結合したＭＯＭＰ遺伝子を作製し、発現させ
ることができる。本発明では６アミノ酸残基からなるペ
プチドに限定したが、同様の効果を得るためにアミノ酸
残基数、種類及びその配列の変更は当業者にとって容易
に推定される。
【００２０】使用する宿主−ベクター系は大腸菌系を使
用することができる。大腸菌を宿主とした発現ベクター
は次のように構築できる。プロモーターとしては、Ｔａ
ｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモータ
ー、ＰＬプロモーター等が使用できる。プロモーターの
下流に上記遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向にしたがって
挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法は、以下
に示す文献［Molecular Cloning, Cold Spring Harbar
Laboratory Press, (1989)］に記載されている。
用することができる。大腸菌を宿主とした発現ベクター
は次のように構築できる。プロモーターとしては、Ｔａ
ｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモータ
ー、ＰＬプロモーター等が使用できる。プロモーターの
下流に上記遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向にしたがって
挿入する。発現ベクターの大腸菌への導入方法は、以下
に示す文献［Molecular Cloning, Cold Spring Harbar
Laboratory Press, (1989)］に記載されている。
【００２１】形質転換された大腸菌は、常法により培養
し、適当な誘導処理をし、目的のＭＯＭＰを発現させる
ことができる。ＭＯＭＰの発現の有無は抗クラミジア・
トラコマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用い
たウエスタン・ブロッティング［Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA., 76, (3), 116-3120 (1979)]で確認できる。
し、適当な誘導処理をし、目的のＭＯＭＰを発現させる
ことができる。ＭＯＭＰの発現の有無は抗クラミジア・
トラコマティス主要外膜蛋白質モノクローン抗体を用い
たウエスタン・ブロッティング［Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA., 76, (3), 116-3120 (1979)]で確認できる。
【００２２】発現させたＭＯＭＰは次のような方法で精
製することができる。細胞を酵素と非イオン性界面活性
剤を用いて破砕する。発現したＭＯＭＰは不溶性を示す
ので、遠心分離により沈澱画分（ＭＯＭＰが豊富）に集
まる。さらに精製するためには、沈澱（ＭＯＭＰ）画分
を可溶化する必要がある。この目的のために強力なアニ
オン系界面活性剤（望ましくは０．１〜２％ドデシル硫
酸ナトリウム；ＳＤＳ）を用いて可溶化する。可溶化し
たＭＯＭＰは調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィ
ー法で高純度に精製することができる。
製することができる。細胞を酵素と非イオン性界面活性
剤を用いて破砕する。発現したＭＯＭＰは不溶性を示す
ので、遠心分離により沈澱画分（ＭＯＭＰが豊富）に集
まる。さらに精製するためには、沈澱（ＭＯＭＰ）画分
を可溶化する必要がある。この目的のために強力なアニ
オン系界面活性剤（望ましくは０．１〜２％ドデシル硫
酸ナトリウム；ＳＤＳ）を用いて可溶化する。可溶化し
たＭＯＭＰは調製用電気泳動やカラムクロマトグラフィ
ー法で高純度に精製することができる。
【００２３】上述したような方法で得られたＭＯＭＰを
ポリスチレン平型マイクロプレートに０．１〜１０μｇ
／ｍｌの濃度で、望ましくは０．５〜２μｇ／ｍｌの濃
度で固相すると固相プレート（測定キット）ができる。
ポリスチレン平型マイクロプレートに０．１〜１０μｇ
／ｍｌの濃度で、望ましくは０．５〜２μｇ／ｍｌの濃
度で固相すると固相プレート（測定キット）ができる。
【００２４】上述の固相プレートに、適当に希釈したク
ラミジア・トラコマティス感染の疑いのある患者血清を
加えて、一定温度、一定時間反応させ、その後、未反応
物質を除去するためにプレートを洗浄する。この操作で
プレートに固相化したＭＯＭＰに抗クラミジア・トラコ
マティス抗体のみが結合する。
ラミジア・トラコマティス感染の疑いのある患者血清を
加えて、一定温度、一定時間反応させ、その後、未反応
物質を除去するためにプレートを洗浄する。この操作で
プレートに固相化したＭＯＭＰに抗クラミジア・トラコ
マティス抗体のみが結合する。
【００２５】次に標識抗体、望ましくは酵素標識した抗
ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ或いはＩｇＭ抗体と反応させ、その
後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。
ここで標識に使う酵素は一般にアルカリフォスファター
ゼや西洋ワサビパーオキシダーゼ等がよく用いられる。
最後に酵素の基質を添加し、発色度を吸光度計で測定
し、抗体の有無、つまり感染の有無を測定する。
ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ或いはＩｇＭ抗体と反応させ、その
後、未反応物質を除去するためにプレートを洗浄する。
ここで標識に使う酵素は一般にアルカリフォスファター
ゼや西洋ワサビパーオキシダーゼ等がよく用いられる。
最後に酵素の基質を添加し、発色度を吸光度計で測定
し、抗体の有無、つまり感染の有無を測定する。
【００２６】以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００２７】
実施例１．Ｌ２株クラミジア・トラコマティスＭＯＭＰ
遺伝子のクローニング １．ゲノムＤＮＡの調製 (1) 培養とＥＢの精製 クラミジア・トラコマティスＬ２株 ( L2/434/Bubo )を
１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭ培地
で増殖させたＬ９２９細胞に接種した。３７℃で２〜３
日培養した。尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍光抗
体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、培養
液を捨てて、ハンクスＢＳＳを加え、ラバーポリスメン
で細胞をかき取った。次に感染細胞浮遊液を超音波処理
（20KHz 、30秒）後、遠心分離（500 ×g 、４℃、１５
分間）して上清を回収した。上清を３５％Renogranfin
液(10mM HEPES, 0.15M NaCl)に重層し、４３，０００×
ｇ、４℃、１時間遠心分離した。得られた沈澱にＳＰＧ
（0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸
buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin
液の不連続密度勾配（40% / 44% / 52%)に重層し、４
３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。４４％と
５２％の界面のバンドを回収し、ＳＰＧで希釈した後、
３０，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心分離し、精製Ｅ
Ｂを得た。
遺伝子のクローニング １．ゲノムＤＮＡの調製 (1) 培養とＥＢの精製 クラミジア・トラコマティスＬ２株 ( L2/434/Bubo )を
１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭ培地
で増殖させたＬ９２９細胞に接種した。３７℃で２〜３
日培養した。尚、一部の感染細胞を採取し、直接蛍光抗
体法でクラミジアの増殖を確認した。培養終了後、培養
液を捨てて、ハンクスＢＳＳを加え、ラバーポリスメン
で細胞をかき取った。次に感染細胞浮遊液を超音波処理
（20KHz 、30秒）後、遠心分離（500 ×g 、４℃、１５
分間）して上清を回収した。上清を３５％Renogranfin
液(10mM HEPES, 0.15M NaCl)に重層し、４３，０００×
ｇ、４℃、１時間遠心分離した。得られた沈澱にＳＰＧ
（0.25M ショ糖及び5mM グルタミン酸を含む10mMリン酸
buffer(pH7.2))を加え、懸濁した。これをRenogranfin
液の不連続密度勾配（40% / 44% / 52%)に重層し、４
３，０００×ｇ、４℃、１時間遠心分離した。４４％と
５２％の界面のバンドを回収し、ＳＰＧで希釈した後、
３０，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心分離し、精製Ｅ
Ｂを得た。
【００２８】(2) ゲノムＤＮＡの調製 上記で得た精製ＥＢに１０倍量のLysis Buffer(10mM Tr
is-HCl(pH8.0), 5mMEDTA,0.5% SDS, 100 μg/ml Protei
nase K)を加え、５５℃、９０分間反応させた後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタ
ノール沈澱させた。得られたゲノムＤＮＡをTE Buffer
(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるようにRNaseAを加え、６０℃、
３０分間反応させた。反応終了後、フェノール／クロロ
ホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させ
た。ゲノムＤＮＡを適当量のTE Buffer に溶解させた。
is-HCl(pH8.0), 5mMEDTA,0.5% SDS, 100 μg/ml Protei
nase K)を加え、５５℃、９０分間反応させた後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタ
ノール沈澱させた。得られたゲノムＤＮＡをTE Buffer
(10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA) に溶解後、最終濃
度５０μｇ／ｍｌになるようにRNaseAを加え、６０℃、
３０分間反応させた。反応終了後、フェノール／クロロ
ホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡをエタノール沈澱させ
た。ゲノムＤＮＡを適当量のTE Buffer に溶解させた。
【００２９】２．ＭＯＭＰのクローニング 実施例１−１で得たクラミジア・トラコマティスＬ２株
ゲノムＤＮＡ溶液１μl を用いて、Saiki らの方法［Na
ture, 324, 163, (1986)］に従い、Gene AmpPCR Reagen
t Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法で、主要外膜蛋
白質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、10mM Tris-HC
l(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, ０．１％ゼラチンを
含む反応液中にクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノ
ムＤＮＡ溶液１μl と配列番号６及び配列番号７の２種
類のプライマーそれぞれ２０pmoles及びTaq polymerase
5units を加え、最終量５０μl とした。
ゲノムＤＮＡ溶液１μl を用いて、Saiki らの方法［Na
ture, 324, 163, (1986)］に従い、Gene AmpPCR Reagen
t Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法で、主要外膜蛋
白質を含む遺伝子領域を増幅した。即ち、10mM Tris-HC
l(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl2, ０．１％ゼラチンを
含む反応液中にクラミジア・トラコマティスＬ２株ゲノ
ムＤＮＡ溶液１μl と配列番号６及び配列番号７の２種
類のプライマーそれぞれ２０pmoles及びTaq polymerase
5units を加え、最終量５０μl とした。
【００３０】この反応液を９４℃, ３min.→〔（94℃,
45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)×30サイクル〕
→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10min.）×
5 サイクル〕反応させた。反応終了液を１％アガロース
ゲル電気泳動で分画した結果、約１．３ｋｂのＰＣＲ増
幅産物を確認した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物
をGeneclean II（BIO101社製）でＤＮＡを回収した後、
さらにDNA Blunting Kit（宝酒造製）を用いて平滑化し
た。次にpUC19 ２μg を制限酵素ＳmaＩ４units で３０
℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ（BRL 社
製）で５’末端を脱リン酸化した。上記ＰＣＲ増幅断片
とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結
合させ、CaCl2 法〔Molecular Cloning,p250 Cold Spri
ng Harbar Laboratory〕によって大腸菌ＪＭ１０９に導
入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、Birn
boimらのアルカリ−ＳＤＳ法〔Nuc.Acids Res.,7, 1513
(1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マッピングによ
りＰＣＲ増幅断片を有するクローン（pMOMP-L2と命名）
を得た（図１参照）。
45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 2.5min.)×30サイクル〕
→〔（94℃, 45sec.→55℃, 45sec.→72℃, 10min.）×
5 サイクル〕反応させた。反応終了液を１％アガロース
ゲル電気泳動で分画した結果、約１．３ｋｂのＰＣＲ増
幅産物を確認した。この約１．３ｋｂのＰＣＲ増幅産物
をGeneclean II（BIO101社製）でＤＮＡを回収した後、
さらにDNA Blunting Kit（宝酒造製）を用いて平滑化し
た。次にpUC19 ２μg を制限酵素ＳmaＩ４units で３０
℃、２時間消化後、アルカリフォスファターゼ（BRL 社
製）で５’末端を脱リン酸化した。上記ＰＣＲ増幅断片
とpUC19 断片をLigation Kit（宝酒造社製）を用いて結
合させ、CaCl2 法〔Molecular Cloning,p250 Cold Spri
ng Harbar Laboratory〕によって大腸菌ＪＭ１０９に導
入した。得られた形質転換体を適当に１０個選択、Birn
boimらのアルカリ−ＳＤＳ法〔Nuc.Acids Res.,7, 1513
(1979) 〕でＤＮＡを精製し、制限酵素マッピングによ
りＰＣＲ増幅断片を有するクローン（pMOMP-L2と命名）
を得た（図１参照）。
【００３１】得られたクローンからプラスミドＤＮＡを
精製し、パーキンエルマージャパン社製ＤＮＡシーケン
サー３７３Ａで塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２株
公知の塩基配列[J. Bacteriol. 168,(3), 1277-1287 (1
986)〕と完全一致した。
精製し、パーキンエルマージャパン社製ＤＮＡシーケン
サー３７３Ａで塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２株
公知の塩基配列[J. Bacteriol. 168,(3), 1277-1287 (1
986)〕と完全一致した。
【００３２】実施例２．大腸菌によるＭＯＭＰの発現 １．ノンタグＭＯＭＰ発現ベクターの作製 実施例１で得られたプラスミドpMOMP-L2 ２０μg を制
限酵素BstYI ２０units で６０℃、２時間消化後、フェ
ノール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解
後、制限酵素ＫpnＩ２０unitで３７℃、２時間消化後、
１％アガロースゲル電気泳動を行い、０．８ｋｂ断片を
Geneclean IIで回収した。
限酵素BstYI ２０units で６０℃、２時間消化後、フェ
ノール抽出―エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解
後、制限酵素ＫpnＩ２０unitで３７℃、２時間消化後、
１％アガロースゲル電気泳動を行い、０．８ｋｂ断片を
Geneclean IIで回収した。
【００３３】次に特開平7-147986号に記載のＰＬプロモ
ーター発現ベクター pPLN-MCS ５μg を制限酵素ＫpnＩ
5unitsで３７℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタ
ノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素Ｎde
Ｉ 5unitで３７℃、２時間消化し、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、３．２ｋｂの断片をGeneclean IIで回
収した。さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番
号８及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを合成し
た。
ーター発現ベクター pPLN-MCS ５μg を制限酵素ＫpnＩ
5unitsで３７℃、２時間消化後、フェノール抽出―エタ
ノール沈澱を行なった。ＤＮＡを溶解後、制限酵素Ｎde
Ｉ 5unitで３７℃、２時間消化し、１％アガロースゲル
電気泳動を行い、３．２ｋｂの断片をGeneclean IIで回
収した。さらにＤＮＡシンセサイザーを用いて、配列番
号８及び配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを合成し
た。
【００３４】オリゴヌクレオチドをそれぞれMEGALABEL
（宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。０．８ｋｂ
の断片、３．２ｋｂの断片及びアニールしたオリゴヌク
レオチドを結合させ、大腸菌N99cI + 導入した。得られ
た形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法
でＤＮＡを精製し、制限酵素ＮdeＩとＫpnＩによるマッ
ピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によ
りプラスミドpCT33(アミノ酸タグを付加していないＭＯ
ＭＰ、ノンタグＭＯＭＰと呼称）を取得した（図２参
照）。
（宝酒造社製）を用いて５’末端をリン酸化した後、リ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。０．８ｋｂ
の断片、３．２ｋｂの断片及びアニールしたオリゴヌク
レオチドを結合させ、大腸菌N99cI + 導入した。得られ
た形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤＳ法
でＤＮＡを精製し、制限酵素ＮdeＩとＫpnＩによるマッ
ピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決定によ
りプラスミドpCT33(アミノ酸タグを付加していないＭＯ
ＭＰ、ノンタグＭＯＭＰと呼称）を取得した（図２参
照）。
【００３５】２．アミノ酸タグの導入 実施例２−１で得られたプラスミドpCT33 ５μg を制限
酵素AflII とEco065I をそれぞれ5unitsで37℃、２時間
消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、４．８ｋ
ｂの断片をGeneclean IIで回収した。次にＤＮＡシンセ
サイザーを用いて、配列番号１０〜１９に示す１０本の
オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドを
それぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端を
リン酸化した後、配列番号１０と１１、配列番号１２と
１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７及び配
列番号１８と１９を各々アニールした。４．８ｋｂの断
片と上記の組合せでアニールした各オリゴヌクレオチド
をそれぞれ結合させ、大腸菌N99cI + に導入した。得ら
れた各形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤ
Ｓ法でＤＮＡを精製し、制限酵素AflII とEcoO65I によ
るマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決
定によりアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33His
Lys(配列番号１０と１１のアニール、アミノ末端に配列
番号１のアミノ酸残基が付加）、pCT33HisTyr(配列番号
１２と１３のアニール、アミノ末端に配列番号２のアミ
ノ酸残基が付加）、pCT33Thr（配列番号１４と１５のア
ニール、アミノ末端に配列番号３のアミノ酸残基が付
加）、pCT33Tyr（配列番号１６と１７のアニール、アミ
ノ末端に配列番号４のアミノ酸残基が付加）及びpCT33H
is（配列番号１８と１９のアニール、アミノ末端に配列
番号５のアミノ酸残基が付加）を取得した（図３参
照）。
酵素AflII とEco065I をそれぞれ5unitsで37℃、２時間
消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、４．８ｋ
ｂの断片をGeneclean IIで回収した。次にＤＮＡシンセ
サイザーを用いて、配列番号１０〜１９に示す１０本の
オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドを
それぞれMEGALABEL （宝酒造社製）を用いて５’末端を
リン酸化した後、配列番号１０と１１、配列番号１２と
１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７及び配
列番号１８と１９を各々アニールした。４．８ｋｂの断
片と上記の組合せでアニールした各オリゴヌクレオチド
をそれぞれ結合させ、大腸菌N99cI + に導入した。得ら
れた各形質転換体を適当に２４個選択、アルカリ―ＳＤ
Ｓ法でＤＮＡを精製し、制限酵素AflII とEcoO65I によ
るマッピング及びオリゴヌクレオチド近辺の塩基配列決
定によりアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33His
Lys(配列番号１０と１１のアニール、アミノ末端に配列
番号１のアミノ酸残基が付加）、pCT33HisTyr(配列番号
１２と１３のアニール、アミノ末端に配列番号２のアミ
ノ酸残基が付加）、pCT33Thr（配列番号１４と１５のア
ニール、アミノ末端に配列番号３のアミノ酸残基が付
加）、pCT33Tyr（配列番号１６と１７のアニール、アミ
ノ末端に配列番号４のアミノ酸残基が付加）及びpCT33H
is（配列番号１８と１９のアニール、アミノ末端に配列
番号５のアミノ酸残基が付加）を取得した（図３参
照）。
【００３６】３．ＭＯＭＰの発現 プラスミドpPLN-MCS、ノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT3
3 及び各アミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33His
Lys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Thr及びpCT33His
をそれぞれ蛋白質発現用大腸菌Ｎ４８３０−１に形質転
換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌ Ampicillin を含
むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、１６時間培養した。前培養
液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３０
℃、約２時間培養後(O.D. 600= 0.4 - 0.5) 、培養温度
を42℃にシフトし、さらに３時間培養した。培養後、遠
心分離し菌体を回収した。
3 及び各アミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT33His
Lys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Thr及びpCT33His
をそれぞれ蛋白質発現用大腸菌Ｎ４８３０−１に形質転
換した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌ Ampicillin を含
むＬＢ培地２ｍｌで３０℃、１６時間培養した。前培養
液１ｍｌを新しいＬＢ培地１００ｍｌに接種した。３０
℃、約２時間培養後(O.D. 600= 0.4 - 0.5) 、培養温度
を42℃にシフトし、さらに３時間培養した。培養後、遠
心分離し菌体を回収した。
【００３７】一定量の菌体をPhosphate Buffered-Salin
e(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laem
mli の方法［Nature, 227, 680 (1970)]に従ってＳＤＳ
―ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ］を行い、コマシュー・ブリリアント・ブルー（ＣＢ
Ｂ）染色をした。また泳動後、種特異性の抗クラミジア
・トラコマティスＭＯＭＰモノクローン抗体を用いてウ
エスタンブロッティングを行った。その結果、ＣＢＢ染
色では５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT3
3HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT3
3Hisのみ分子量約４０，０００の位置にコントロールの
pPLN-MCSには見られない大きなバンドが確認された（図
４参照）。このバンドをファルマシア製イメージマスタ
ーで定量した結果を表１に示す。
e(PBS)に懸濁し超音波破砕機で菌体を破砕した後、Laem
mli の方法［Nature, 227, 680 (1970)]に従ってＳＤＳ
―ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ］を行い、コマシュー・ブリリアント・ブルー（ＣＢ
Ｂ）染色をした。また泳動後、種特異性の抗クラミジア
・トラコマティスＭＯＭＰモノクローン抗体を用いてウ
エスタンブロッティングを行った。その結果、ＣＢＢ染
色では５種のアミノ酸タグ導入ＭＯＭＰプラスミドpCT3
3HisLys 、pCT33HisTyr 、pCT33Thr、pCT33Tyr及びpCT3
3Hisのみ分子量約４０，０００の位置にコントロールの
pPLN-MCSには見られない大きなバンドが確認された（図
４参照）。このバンドをファルマシア製イメージマスタ
ーで定量した結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】表１よりpCT33 に対し、いずれも１０倍前
後の発現量が認められた。さらに分子量約４０，０００
の位置の大きなバンドはウエスタンブロッティングで発
色が認められた。またノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT3
3 も分子量約４０，０００の位置に発色が認められた
（図５参照）。以上のことからＭＯＭＰのアミノ末端に
配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基を導入する
と、ＭＯＭＰの発現量が増加することが確認された。
後の発現量が認められた。さらに分子量約４０，０００
の位置の大きなバンドはウエスタンブロッティングで発
色が認められた。またノンタグＭＯＭＰプラスミドpCT3
3 も分子量約４０，０００の位置に発色が認められた
（図５参照）。以上のことからＭＯＭＰのアミノ末端に
配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸残基を導入する
と、ＭＯＭＰの発現量が増加することが確認された。
【００４０】また超音波破砕処理した菌体を５，５００
×ｇで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離
した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調
べた結果、全てのＭＯＭＰは沈澱画分に見られ、不溶体
を形成していることがわかった。
×ｇで１０分間遠心分離し、上清画分と沈澱画分に分離
した。それぞれの画分をウエスタンブロッティングで調
べた結果、全てのＭＯＭＰは沈澱画分に見られ、不溶体
を形成していることがわかった。
【００４１】４．ＭＯＭＰの精製 前述の培養法でノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ酸タ
グ導入ＭＯＭＰ発現大腸菌をそれぞれ１リットル培養し
た。遠心分離して菌体を回収後、８ｍｌのLysis buffer
(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V) Sucrose, 1mM EDTA,
4mg/ml Lysozyme) に懸濁後、氷上で３０分間放置し
た。次に最終濃度が１０ｍＭ MgCl2,10mMMnCl2,１０μ
ｇ／ｍｌ DNaseI,１０μｇ／ｍｌ RNaseA になるように
それぞれ加え、４℃で３０分間放置した。さらに２０ｍ
ｌのDetergent buffer I(20mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2M
NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deoxycholate, 1.6% NP-40) を
加え、さらに３０分間放置した。
グ導入ＭＯＭＰ発現大腸菌をそれぞれ１リットル培養し
た。遠心分離して菌体を回収後、８ｍｌのLysis buffer
(50mM Tris-HCl(pH8.0), 25%(W/V) Sucrose, 1mM EDTA,
4mg/ml Lysozyme) に懸濁後、氷上で３０分間放置し
た。次に最終濃度が１０ｍＭ MgCl2,10mMMnCl2,１０μ
ｇ／ｍｌ DNaseI,１０μｇ／ｍｌ RNaseA になるように
それぞれ加え、４℃で３０分間放置した。さらに２０ｍ
ｌのDetergent buffer I(20mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2M
NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deoxycholate, 1.6% NP-40) を
加え、さらに３０分間放置した。
【００４２】５，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈
澱を回収した。この沈澱に対して１０倍量のDetergent
buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM E
DTA,0.5% Triton X-100) で十分に懸濁し、４℃で１時
間放置後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈澱
を回収した。Detergent buffer II による沈澱の洗浄を
３回繰り返した。
澱を回収した。この沈澱に対して１０倍量のDetergent
buffer II(50mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 10mM E
DTA,0.5% Triton X-100) で十分に懸濁し、４℃で１時
間放置後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈澱
を回収した。Detergent buffer II による沈澱の洗浄を
３回繰り返した。
【００４３】沈殿を２％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解した
後、不溶物を遠心分離により除去した。可溶性画分を調
製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、主要外膜蛋白質を含む
ゲルを切り出し、エレクトロエリューター（アミコン社
製）で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を０．１％Ｓ
ＤＳを含むＰＢＳに対して透析した。蛋白質純度を検定
するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ファルマシア社製
イメージマスターで分析した結果、ノンタグ及びアミノ
酸タグの付加された５種類のＭＯＭＰの純度はほぼ１０
０％であることがわかった。
後、不溶物を遠心分離により除去した。可溶性画分を調
製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、主要外膜蛋白質を含む
ゲルを切り出し、エレクトロエリューター（アミコン社
製）で主要外膜蛋白質を回収した。溶出液を０．１％Ｓ
ＤＳを含むＰＢＳに対して透析した。蛋白質純度を検定
するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ファルマシア社製
イメージマスターで分析した結果、ノンタグ及びアミノ
酸タグの付加された５種類のＭＯＭＰの純度はほぼ１０
０％であることがわかった。
【００４４】実施例３．大腸菌発現クラミジア・トラコ
マティスＭＯＭＰを用いた抗クラミジア・トラコマティ
ス抗体の検出 １．ＭＯＭＰ固相プレート（測定キット）の作製 実施例２に記載したノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ
酸タグ導入ＭＯＭＰを５０ｍＭ炭酸buffer(pH9.5) で各
々1 μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイク
ロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌで分
注し、４℃で静置した。１８時間以上静置したマイクロ
プレートを最終濃度０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２
００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０
５％牛血清アルブミン(BSA) と０．０５％Tween20 を含
むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌ加えて４℃一晩静置し、
ＭＯＭＰ固相マイクロプレートを作製した。
マティスＭＯＭＰを用いた抗クラミジア・トラコマティ
ス抗体の検出 １．ＭＯＭＰ固相プレート（測定キット）の作製 実施例２に記載したノンタグＭＯＭＰ及び５種のアミノ
酸タグ導入ＭＯＭＰを５０ｍＭ炭酸buffer(pH9.5) で各
々1 μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイク
ロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌで分
注し、４℃で静置した。１８時間以上静置したマイクロ
プレートを最終濃度０．０５％Tween20 を含むＰＢＳ２
００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０
５％牛血清アルブミン(BSA) と０．０５％Tween20 を含
むＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌ加えて４℃一晩静置し、
ＭＯＭＰ固相マイクロプレートを作製した。
【００４５】２．抗クラミジア・トラコマティス抗体の
検出 前記述のＭＯＭＰ固相マイクロプレートウエル中のプレ
ート保存液を除いた後、ＦＡ法で判定したクラミジア・
トラコマティス感染患者血清５０検体及び正常血清５０
検体を０．０５％ＢＳＡと０．０５％Tween20 を含むＰ
ＢＳで２００倍に希釈し、その１００μl を固相マイク
ロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で
約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含む
ＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。つい
で、０．０５％Tween20 含むＰＢＳで約４０，０００倍
に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧパーオキシダーゼ標識抗体
（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で約１
時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢ
Ｓ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。洗浄後、
３．３ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、０．０２％過酸化
水素水を加えた基質液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて室
温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１
００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、マイクロプ
レート用比色計を用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６３
０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した。結果を表２
に示す。尚、カットオフ値は正常ヒト血清の吸光度の平
均に標準偏差を３倍したものを加えた値とした。
検出 前記述のＭＯＭＰ固相マイクロプレートウエル中のプレ
ート保存液を除いた後、ＦＡ法で判定したクラミジア・
トラコマティス感染患者血清５０検体及び正常血清５０
検体を０．０５％ＢＳＡと０．０５％Tween20 を含むＰ
ＢＳで２００倍に希釈し、その１００μl を固相マイク
ロプレートのウエルに加え、室温（１５℃〜２５℃）で
約１時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含む
ＰＢＳ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。つい
で、０．０５％Tween20 含むＰＢＳで約４０，０００倍
に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧパーオキシダーゼ標識抗体
（ＭＢＬ社）を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で約１
時間反応させた。反応後、０．０５％Tween20 含むＰＢ
Ｓ２００μｌ／ｗｅｌｌで３〜４回洗浄した。洗浄後、
３．３ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジアミン含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液(pH5.0) に、０．０２％過酸化
水素水を加えた基質液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えて室
温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１
００μｌ／ｗｅｌｌ加えて反応を停止させ、マイクロプ
レート用比色計を用いて主波長４９２ｎｍ、副波長６３
０ｎｍで各ウエルのＯ. Ｄ. 値を測定した。結果を表２
に示す。尚、カットオフ値は正常ヒト血清の吸光度の平
均に標準偏差を３倍したものを加えた値とした。
【００４６】
【表２】
【００４７】以上の結果から、アミノ酸タグは陽性一致
率及び陰性一致率に影響を及ぼさず、ノンタグと同等の
反応性を示すことがわかった。
率及び陰性一致率に影響を及ぼさず、ノンタグと同等の
反応性を示すことがわかった。
【００４８】
【発明の効果】アミノ末端に配列表１〜５のいずれかの
アミノ酸残基を結合させたクラミジア・トラコマティス
ＭＯＭＰをコードする遺伝子で大腸菌を形質転換し、発
現させ、精製することにより、クラミジア属細菌と交差
反応性を示すと考えられる他の外膜蛋白質を実質的に含
まない、クラミジア・トラコマティス抗体測定に使用す
る抗原を大量に提供することが可能となった。
アミノ酸残基を結合させたクラミジア・トラコマティス
ＭＯＭＰをコードする遺伝子で大腸菌を形質転換し、発
現させ、精製することにより、クラミジア属細菌と交差
反応性を示すと考えられる他の外膜蛋白質を実質的に含
まない、クラミジア・トラコマティス抗体測定に使用す
る抗原を大量に提供することが可能となった。
【００４９】
配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５２】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５３】配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５４】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAGCAATTCA GATCTCGATC CC
【００５５】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTCACACCAA GTGGCGCAAG GA
【００５６】配列番号：８ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TATGCTGCCT GTGGGTAACC CTGCTGAACC AAGCCTTATG ATCGACGGGA TCCTATGGGA AGGTTTCGGC GGA
【００５７】配列番号：９ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATCTCCGCC GAAACCTTCC CATAGGATCC CGTCGATCAT AAGGCTTGGT TCAGCAGGGT TACCCACAGG CAGCA
【００５８】配列番号：１０ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAAGGAGGT AACATATGCA CAAACACAAA CACAAACTGC CTGTGG
【００５９】配列番号：１１ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTACCCACA GGCAGTTTGT GTTTGTGTTT GTGCATATGT TACCTC
C
C
【００６０】配列番号：１２ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAAGGAGGT AACATATGCA CTACCACTAC CACTACCTGC CTGTGG
【００６１】配列番号：１３ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTACCCACA GGCAGGTAGT GGTAGTGGTA GTGCATATGT TACCTC
C
C
【００６２】配列番号：１４ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAAGGAGGT AACATATGAC TACCACTACC ACTACCCTGC CTGTGG
【００６３】配列番号：１５ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTACCCACA GGCAGGGTAG TGGTAGTGGT AGTCATATGT TACCTC
C
C
【００６４】配列番号：１６ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAAGGAGGT AACATATGTA CTATTACTAT TACTATCTGC CTGTGG
【００６５】配列番号：１７ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTACCCACA GGCAGATAGT AATAGTAATA GTACATATGT TACCTC
C
C
【００６６】配列番号：１８ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAAGGAGGT AACATATGCA TCACCATCAC CATCACCTGC CTGTGG
【００６７】配列番号：１９ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTACCCACA GGCAGGTGAT GGTGATGGTG ATGCATATGT TACCTC
C
C
【図１】Ｌ２株主要外膜蛋白質遺伝子を含むベクターの
構築を示す図である。
構築を示す図である。
【図２】発現ベクターpCT33 の構築を示す図である。
【図３】発現ベクターpCT33HisLys 、pCT33HisTyr 、pC
T33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisの構築を示す図である。
T33Thr、pCT33Tyr及びpCT33Hisの構築を示す図である。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各種発現ベクター含有
大腸菌の菌体全蛋白質を示すパターン図である。
大腸菌の菌体全蛋白質を示すパターン図である。
【図５】ウエスタンブロッティングによる各種発現ベク
ター含有大腸菌の菌体全蛋白質中に含まれるＭＯＭＰを
示すパターン図である。
ター含有大腸菌の菌体全蛋白質中に含まれるＭＯＭＰを
示すパターン図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 アミノ末端に６個のアミノ酸残基がペプ
チド結合された免疫学的な活性を有することを特徴とす
るクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質。 - 【請求項２】 アミノ末端にペプチド結合されたアミノ
酸残基が配列表の配列番号１〜５のいずれかに表される
ことを特徴とする請求項１記載のクラミジア・トラコマ
ティス主要外膜蛋白質。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質の遺伝子を発現ベクターに
挿入し、次に大腸菌を形質転換し、該形質転換体をクラ
ミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質が発現する条件
で培養し、該形質転換体から発現産物を採取することを
特徴とするクラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質
の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１又は２に記載のクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを
特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定方
法。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載のクラミジア・ト
ラコマティス主要外膜蛋白質を抗原として用いることを
特徴とするクラミジア・トラコマティスの抗体測定試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28993897A JP4249279B2 (ja) | 1997-10-22 | 1997-10-22 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28993897A JP4249279B2 (ja) | 1997-10-22 | 1997-10-22 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11123078A true JPH11123078A (ja) | 1999-05-11 |
| JP4249279B2 JP4249279B2 (ja) | 2009-04-02 |
Family
ID=17749694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28993897A Expired - Lifetime JP4249279B2 (ja) | 1997-10-22 | 1997-10-22 | クラミジア・トラコマティス主要外膜蛋白質及びその製造方法、並びにクラミジア・トラコマティスの抗体測定方法及び抗体測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4249279B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8052975B2 (en) | 1998-12-08 | 2011-11-08 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103068837B (zh) | 2010-05-28 | 2015-06-24 | 斯匹遐生物技术公司 | 嵌合momp抗原、方法和使用 |
-
1997
- 1997-10-22 JP JP28993897A patent/JP4249279B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8052975B2 (en) | 1998-12-08 | 2011-11-08 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| US8263089B2 (en) | 1998-12-08 | 2012-09-11 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4249279B2 (ja) | 2009-04-02 |
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