KR20120068113A

KR20120068113A - 브루셀라 아보투스의 ２６ｋＤａ 재조합 항원 단백질 및 ＬＰＳ를 이용한 진단 키트

Info

Publication number: KR20120068113A
Application number: KR1020100129555A
Authority: KR
Inventors: 박미연; 황규잠; 최영실; 박상희; 주혁; 임명운
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-06-27
Also published as: KR101270662B1

Abstract

본 발명은 브루셀라 아보투스의 26kDa 재조합 항원 단백질 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 특이 표면항원인 26kDa 단백질의 유전자 단편, 이를 포함하는 재조합발현벡터, 및 그로부터 발현된 26kDa 재조합 항원 단백질 및 Lipopolysaccaride(LPS)를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 26kDa 항원 단백질은 브루셀라증의 감염에 대한 진단시약 또는 진단키트 제조에 유용성분으로 이용가능하다. 또한, 본 발명에 따르면, ELISA 키트에 적절한 26 kDa 및 LPS 항원의 조성 및 농도를 적용함으로써 브루셀라증 진단의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있다.

Description

브루셀라 아보투스의 ２６ｋＤａ 재조합 항원 단백질 및 ＬＰＳ를 이용한 진단 키트 {Diagnostic kits of Brucella abortus using 26kDa recombinant antigenic protein and Lipopolysaccaride}

본 발명은 브루셀라 아보투스의 26kDa 재조합 항원 단백질 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 특이 표면항원인 26kDa 단백질의 유전자 단편, 이를 포함하는 재조합발현벡터, 및 그로부터 발현된 26kDa 재조합 항원 단백질 및 Lipopolysaccaride(LPS)를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.

브루셀라병은 소나 돼지에게 흔히 볼 수 있는 2종 법정 가축전염병으로 사람에게도 전파되는 인수 공통 전염병이다. 사람에게 브루셀라균이 감염되면 3주 정도의 잠복기를 거쳐 부정형의 발열?피로?권태감?두통 등의 전신 증세가 나타나는데, 이 때의 발열을 일명 말타열(malta fever) 또는 지중해열(mediterranean fever)이라고 한다. 인축공통전염병으로서의 중요성을 고려하여 세계보건기구(WHO)가 이 병을 예방하기 위하여 적극적인 노력을 기울이고 있으며, 진단법도 국제표준화의 연구가 진전되고 있다.

브루셀라 아보투스의 단백질 26 kDa을 단백 발현하여 브루셀라증의 진단물질로써 이용가능하다는 내용은 몇 몇 논문들에서 발표되어 있다 (J. Clin. Microbiol. 34, 165-169, 1996; Clinic. Diag. Lab Immunol, 8, 772-775, 2001; Clinic. Diag. Lab Immunol, 10, 647-651, 2003; Biothecnol. Appl. Biochem 49, 213-218, 2008). 그러나 이러한 선행 기술들에서 제시한 단백 발현 방식은 발현량 및 발현 효율이 매우 낮다는 문제점을 가지고 있다. 본 발명자들은 단백발현 효율을 극대화하기 위해 발현부위를 선별하여 조절함으로써 이러한 점을 해결하였다.

LPS를 이용하여 진단 키트로 이용하는 내용은 종래의 문헌(Brucellosis in human and animals, WHO, 2006)에 발표되어 있다. 그러나 이러한 선행 기술은 민감도가 낮다는 문제점을 가지고 있다. 본 발명자들은 재조합 26 kDa 단백질과 순수 정제된 LPS를 적정 용량으로 혼합하여 조정하여 ELSA에 적용함으로써 이러한 점을 해결하였다.

본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 발현되는 재조합 단백질이 브루셀라 진단에 유용하도록 항원성 및 발현량이 극대화되게 제작하는 방법 및 진단키트로서 민감도와 특이도 향상을 위한 제작 방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 브루셀라증의 정확한 진단을 위하여 강한 병원성을 보이는 국내 환자 분리 브루셀라 아보투스균의 26kDa 단백질 유전자 단편의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산의 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제조된 26kDa DNA 서열을 포함하는 발현벡터 및 그로 형질 전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 형질전환 된 미생물의 재조합 26kDa 단백질 유전자에서 발현되는 재조합 단백질을 제조하는 방법 및 재조합 단백질과 순수 정제된 LPS를 적절하게 농도 조정하여 브루셀라 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 27번~199번째 아미노산 서열 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 분리주 LSH(Brucella abortus isolates LSH)의 26kDa 항원 단백질을 제공한다.

본원발명의 26kDa 항원 단백질은 국내 환자에게서 분리된 브루셀라 아보투스 분리주 LSH (Brucella abortus isolates LSH)의 다양한 항원 결정기 중 특이 표면항원을 코딩하는 26kDa 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)중에서 앞뒤의 일정부분을 제거하여 특이 표면항원의 민감도 및 특이도를 높힌 27번~199번째 아미노산 서열을 가지고 있다. 또한, 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열이란 아미노산의 치환, 결손 또는 삽입과 같은 변형에도 불구하고 동일한 항원성을 나타낼 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 의미한다.

또한, 본원발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 27번~199번째 를 코딩하는 염기서열 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 분리주 LSH(Brucella abortus isolates LSH)의 26kDa 단백질 유전자 단편을 제공한다.

본원발명의 26kDa 단백질 유전자 단편은, 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 염기서열 중 76 번~ 595 번째 염기서열 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 서열번호 1의 76 번~ 595 번째 염기서열은 상기 서열번호 2의 27번~199번째 아미노산 서열을 코딩하는 재조합 DNA의 염기서열이다. 또한, 이와 기능적으로 동등한 염기서열이란 염기의 치환, 결손 또는 삽입과 같은 변형에도 불구하고 동일한 항원성을 가지는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 단편을 포함하며, 브루셀라 아보투스의 26kDa 항원 단백질을 발현할 수 있는 재조합 단백질 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 단백질 발현벡터에는 브루셀라 아보투스의 26kDa 항원 단백질을 발현시킬 수 있도록 통상의 프로모터 서열, 번역개시 서열 및 터미네이터 서열이 포함될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 단백질 발현벡터는 발현되는 재조합 단백질이 브루셀라증 진단에 유용하도록 항원성이 극대화되게 제작되었을 뿐만 아니라 재조합 단백질의 정제가 용이하도록 단백질의 N-말단부위에 히스티딘이 발현되도록 제작되어 있는 벡터를 사용하여 설계될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 단백질 발현벡터는 도3에 기재된 바와 같이 26kDa 단백질 유전자를 pET-28a(Novagen, USA)에 삽입하여 제조된 p26kDa인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 단백질 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 숙주 세포로는 박테리아와 같은 원핵세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 다세포 유기체 세포와 같은 포유동물세포가 사용될 수 있으나, 발현을 통한 대량생산을 위해서는 대장균이 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 대장균 NIH/BL/26kDa-ET15B (Escherichia coli NIH/BL/26kDa-ET15B)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고, 브루셀라 아보투스의 재조합 26kDa 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 26kDa 항원 단백질의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 제조방법은 His-결합 레진을 이용한 크로마토그라피에 의한 정제공정을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 재조합 26kDa 항원 단백질을 포함하는, 사람을 포함하는 포유동물에서 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 실시예 8에서는 본 발명에 따라 제조된 r26kDa 재조합 항원 단백질 이용한 ELISA의 민감도는 IgM 80.0%, IgG 86.7%를 보였고, 특이도는 IgM 80.0%, IgG 95.0%를 나타났다.

바람직하게는, 본 발명의 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트는 LPS를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 LPS는 브루셀라균에서 추출한 리포다당류(lipopolysaccharide)를 의미한다 (실시예 9 참조). 본 발명의 실시예 13에서는 본 발명의 r26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS을 이용한 ELISA의 민감도는 IgM 95.0%, IgG 91.8%를 보였고, 특이도는 IgM 89.2%, IgG 100%를 나타나, r26kDa 재조합 항원 단백질 단독으로 이용한 ELISA보다 민감도 및 특이도가 높아지는 효과를 었얻다.

바람직하게는, 본 발명의 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트는 26kDa 항원 단백질는 3~8㎍/ml 농도이고, LPS는 1㎍/ml ~ 8㎍/ml 농도인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예 12에서는 IgM에서 r26kDa 단백질 항원과 혼합된 LPS 농도가 4㎍/ml 이상일때 양성과 음성 검체가 구분이 LPS 단독으로 진단하는 경우보다 음성 검체 2건을 제외하고 전반적으로 높아진 것을 보여주었다.

본 발명에 따른 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트는 브루셀라 IgG 뿐 만 아니라 IgM도 효과적으로 검출할 수 있다. 상기 IgG 또는 IgM는 브루셀라에 감염되어 면역반응을 통해 생성된 항체 IgG 또는 IgM를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명의 진단 키트에 사용되는 검출방법은 ELISA법 또는 Disp-stick assay법인 것을 특징으로 한다. ELISA 키트의 경우 본 발명의 재조합 항원이 코팅된 플레이트에 1차 항체인 검체를 반응시킨 후 퍼옥시다제로 라벨된 2차 항체를 결합시킨 다음 OPD(주황색), ABTS(초록색) 또는 TMB(분홍색)의 기질과 반응시키도록 구성된다. Disp-stick assay 키트의 경우 본 발명의 항원을 골드에 흡착 고정시킨 후 글래스 패드위의 맴브레인에 점적하고 그 위에 호스라디시 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제가 결합된 2차 항체를 점적한 다음 검체인 혈청을 글래스 패드위에 떨어뜨려 반응시키도록 구성된다.

바람직하게는, 본 발명의 진단 키트는 브루셀라 이외의 다른 병원균을 함께 진단하기 위하여 1종 이상의 재조합 항원을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

재조합 26kDa 항원 단백질(recombinant 26kDa protein)을 제조하는 방법은 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 특이 표면항원인 26kDa 단백질의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 배양하여 생산되며, 본 발명의 재조합 발현벡터는 발현되는 재조합 단백질이 브루셀라 진단에 유용하도록 발현량이 극대화되게 설계하였다. 따라서 이와 같은 재조합 발현벡터에서 발현된 재조합 26kDa 항원 단백질은 브루셀라증의 감염에 대한 진단시약 또는 진단키트 제조에 유용성분으로 이용가능하다. 또한, 본 발명에서는 브루셀라증 진단의 민감도와 특이도 향상을 위해 ELISA 키트 적용에 적절한 26 kDa 및 LPS 항원의 조성 및 농도에 대한 내용으로 이루어져 있다.

본 발명자들은 브루셀라 아보투스가 감염된 사람으로부터 감염여부를 확인하고 환자의 정확한 진단을 위하여 항원성을 갖는 국내 분리 브루셀라 아보투스(Brucella abortus isolates LSH) 균주의 26kDa 외막 단백질 유전자를 조작하여 항원성이 높은 재조합 단백질을 제조하고자 하였다. 즉, 브루셀라 아보투스 26kDa 단백질 유전자를 먼저 1차와 2차 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction;PCR)을 실시하여 제조하였다. 이렇게 제조된 유전자를 제한효소 EcoR I(NEB, USA)과 Sal I(NEB, USA)으로 절단하고 단백질을 발현케 하는 프로모터와 정제를 용이하게 하기 위하여 히스티딘 6개를 갖는 발현벡터에 T4 DNA 연결효소(NEB, USA)로 연결하여 재조합 발현벡터(pCR-26kDa)를 제조하였고, 상기의 재조합된 26kDa 유전자를 증폭 후 pET-28a(Novagen, USA)에 삽입하여 발현벡터 p26kDa를 제조하였다. 이 발현벡터를 대장균에 삽입하여 형질전환시키고 형질전환된 대장균을 대량 배양한 다음, 브루셀라 아보투스의 26kDa 유전자 조각에서 생산되는 재조합 단백질을 수득하였다.

상기에서 제조된 재조합 26kDa 단백질은 브루셀라증에 대한 진단시약 또는 진단키트에 이용될 수 있고, 브루셀라 아보투스에 대한 항체 생산에도 이용될 수 있다.

도 1는 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 26kDa 단백질 유전자의 총 염기서열을 나타낸다.
도 2는 도 1에 기재된 유전자의 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3는 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 26kDa 단백질을 발현벡터 pET-28a에 구축하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 4는 발현벡터 pET-28a로 형질전환된 대장균의 세포파쇄액을 10% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 재조합에 의해 형질전환된 대장균으로부터 r26kDa 항원의 발현 및 정제과정중의 단백질의 변화를 SDS-PAGE로 나타내는 사진이다.
도 6은 정제된 r26kDa 단백질 항원의 농도별 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다.
도 7은 정제된 LPS 항원의 농도별 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다.
도 8은 정제된 r26kDa 단백질 항원과 LPS 항원의 농도별 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다.
도 9는 미세응집법(MAT)에 의한 역가와 r26kDa 단백질 및 LPS를 항원으로 하는 ELISA IgG 와 IgM 반응성 간의 분포를 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지는 않는다.

[실시예 1] 브루셀라 아보투스의 순수 분리 및 염색체 DNA 분리

브루셀라 아보투스 국내분리주 LSH를 1.5% Sheep Blood 첨가 TSA 배지에 37℃의 CO₂ 배양기(5%)에서 3일간 배양하여 DNA 정제에 필요한 콜로니를 확보한 후 Scraper로 수집하여 PBS에 현탁하고 genomic DNA isolation kits(Qiagene, USA) 을 이용하여 DNA를 분리한다

[실시예 2] 올리고 뉴클레오타이드 합성, 정제 및 분석

브루셀라 아보투스 26kDa 단백질 유전자 증폭 (하기 실시예 3)을 위하여 문헌 (Biothecnol. Appl. Biochem 49, 213-218, 2008)을 참고하여 하기와 같은 각각 22mer 와 21mer 2개의 프라이머 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다.

>BP26-F

5'-GCACAGGAGAATCAGATGACGA-3'

>BP26-R

5'-CGTCATACCCCGGCTATTTAC-3'

아울러 상기의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머로 증폭된 DNA 조각으로부터 재조합 26kDa 단백질을 발현하고자 유전자 증폭에 사용되는 하기와 같은 각각 29mer의 2개 올리고 뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다.

>BP26-EcoR-F

5'-GGGAATTCGCTTTCGCACAGGAGAATCAG-3'

>BP26-Sal-R

5'-CCGTCGACTTACTTGATTTCAAAAACGAC-3'

상기에서, 올리고 뉴클레오타이드는 자동화된 뉴클레오타이드 합성기(ABI-Pharmacia, USA)를 이용하여 합성하였다. 이렇게 합성된 각 올리고 뉴클레오타이드는 15% 폴리아크릴아마이드젤(TE-붕산, pH8.3)에서 전기영동하여 합성 올리고 뉴클레오타이드를 분리시켰다. 전기영동 후 260nm와 280nm 파장을 갖는 자외선으로 올리고 뉴클레오타이드의 순도와 농도를 확인하였으며 이렇게 분리된 올리고 뉴클레오타이드 용액은 영하 70℃에서 감압하여 동결 건조하였다.

[실시예 3] 중합효소연쇄반응(PCR)

주형 DNA(50ng), 10㎕의 10×LA Taq 중합효소완충액(500mM KCl, 15mM MgCl₂ 및 10mM Tris-HCl, pH8.3), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 1.25mM씩 함유), 프라이머(실시예 2에서 합성한 올리고 뉴클레오타이드) 1㎕씩, 0.5㎕의 LA Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)를 혼합한 용액에 증류수를 가하여 총 부피가 100㎕가 되게 하였다. 이때 주형 DNA는 실시예 1에서 분리한 브루셀라 아보투스의 염색체 DNA이고, 프라이머는 실시예 2에서 합성한 각각 29mer의 2개의 올리고 뉴클레오타이드이다.

PCR 반응을 위하여 온도순환기(Thermal cycler, Perkin-Elmer, USA)를 사용하였으며 변성 (denaturation) (94℃, 30초), 결합(annealing), (50℃, 30초), 연장 (extension) (72℃, 1분)을 30회 진행시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 추가반응 시켰다. 그런 다음, 중합효소를 제거하기 위하여 PCR 정제 키트(Promega, USA)를 사용하였으며 정제된 PCR 산물은 추후의 실험에 사용하였다. 도 1은 브루셀라 아보투스 분리주 LSH의 26kDa 단백질 유전자의 총 염기서열을 나타낸다. 상기 PCR에 의해 증폭되는 유전자 단편의 서열을 볼드체로 표시하였다. 도 2는 도 1에 기재된 유전자의 염기서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 아미노산 서열 중에서 상기 PCR 증폭되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 단편을 볼드체로 표시하였다.

[실시예 4] 발현벡터의 제조

실시예 3의 PCR에서 제조된 DNA 조각을 바로 Topo isomerase가 포함된 pCR 2.1 벡터(Invitrogene, USA)에 삽입하였다. 도 3은 26kDa 단백질 유전자를 발현하기 위한 구축과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 이 창출된 플라스미드로부터 제조된 DNA 조각의 염기서열을 결정하였다(참조: 도 1).

유전자의 발현을 위하여 실시예 3에서 2차로 증폭한 재조합 26kDa 단백질 유전자와 발현벡터인 pET-28a(Novagen, USA)를 EcoR I(NEB, USA)과 Sal I(NEB, USA)으로 각각 절단하였다. 절단한 다음, 발현벡터 0.1㎍과 재조합 26kDa 단백질 유전자 30ng을 혼합하고 10배 농도의 접합 농축액(10mM DTT 및 100mM MgCl2, 10mM ATP를 함유한 600mM Tris-HCl, pH7.5) 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(ligase, NEB, USA) 10 단위(Unit)를 가하여 전제부피를 10㎕로 조정하고 16℃에서 18시간 반응시켜 발현벡터 pET-28a에 재조합 26kDa 단백질 유전자가 삽입된 환상의 플라스미드를 제조하였으며 이를 p26kDa라 명명하였다. (참조: 도 3).

[실시예 5] 형질전환체의 제조

제조합된 26kDa 단백질 유전자를 함유하고 있는 발현벡터 p26kDa 10ng을 이미 형질전환에 적합하도록 제조된 대장균(E. coli) NovaBlue(Novagen, USA) 20㎕에 첨가하여 얼음 속에서 약 30분간 반응시키고 42℃에서 40초간 열충격을 주어 재조합 벡터가 형질전환체인 대장균 속으로 들어가도록 하였다. 다시 얼음 속에서 2분간 정치시키고 80㎕의 SOC 액체배지를 넣고 37℃에서 1시간 진탕배양하여 엠피실린(Sigma, USA)이 100㎍/㎖ 함유된 고체 LB 배지에 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 이때 26kDa 단백질 유전자를 포함하고 있는 p26kDa 벡터를 함유하고 있는 형질전환체를 대장균 BL21(Novagen, USA)에 형질전환 시킨 후 대장균 NIH/BL/26kDa-ET15B(Escherichia coli)로 명명하였다.

[실시예 6] r26kDa 단백질의 발현

형질전환체 대장균 NIH/BL/26kDa-ET15B을 100㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 LB 고체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하고 배양된 균체를 LB 액체배지 5㎖에 현탁하여 균탁도가 600nm에서 0.6이 되도록 조절한 다음, 이 배양액 5㎖을 엠피실린이 100㎍/㎖ 함유된 LB 액체배지 500㎖에 접종하여 600nm의 흡광도에서 0.7-1.0이 되도록 37℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopylanoside, Bioneer, KOREA)를 최종 농도가 1mM이 되도록 넣고, 37℃에서 200rpm으로 37℃에서 4?5시간 진탕배양 (200 rpm)하여 발현을 유도시켰다. 배양 후 원심분리하여 균을 모으고 1/15M phosphate buffered saline(pH7.4)에 현탁시키고 균을 파쇄하여 파쇄액을 10% SDS-PAGE하였다(참조: 도 4). 도 4는 발현벡터 pET-28a로 형질전환된 대장균의 세포파쇄액을 10% SDS-PAGE한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 제 M 레인은 분자량 크기 마커이고, 제 1레인은 IPTG 이전의 세포 파쇄액을 전기영동한 결과이며 제 2레인은 IPTG 유도후 4시간 배양한 균의 파쇄액을 전기영동한 결과이며 화살표는 발현된 r26kDa 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 형질전환체 대장균 NIH/BL/26kDa-ET15B에서 r26kDa 단백질이 발현됨을 알 수 있었다.

[실시예 7] r26kDa 단백질의 정제

r26kDa 항원 단백질의 정제는 재조합 단백질 항원이 NIH/BL/26kDa-ET15B(E. coli BL21 )에서 발현될 때 단백질 C-말단에 6 개의 histidine (His-tag) 잔기를 갖게 되는 특징을 이용하여 정제되었다. 단백질 발현유무와 항원성이 확인된 균액을 4℃에서 5000 rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고 PBS로 2회 세척했다. 준비된 균체를 10 ㎖의 PBS로 현탁시킨 후 균주를 마쇄하였다. 마쇄 후 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리 후 불용성의 침전체는 PBS 10ml로 2회 세척 한 다음 용해액(lysis buffer)(20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH7.8)) 7-8ml에 현탁한 후 4℃에서 24시간 용해시키고 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 취했다. 상등액은 재조합 단백질 정제에 이용하였다. 즉 50% Ni-NTA 충진제(slurry) (Qiagen, USA) 4㎖를 용해액으로 2-3회 세척한 후 상등액과 섞어 상온에서 2-3시간 동안 진탕배양하면서 결합시켰다. 컬럼에 상등액-충진제 혼합물을 잘 거품이 발생되지 않도록 조심스럽게 충진하고 혼합액을 용출시킨 후 세척액(washing buffer)(10mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH6.0) 10㎖으로 컬럼을 4회 세척했다. 세척된 컬럼에 정제용출액(elute buffer)(10~200mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH6.0)) 3ml를 통과시켜 r26kDa을 회수했다. 정제 과정 중의 적정한 정제용 출액의 조성을 확인하기 위하여 imidazole의 농도를 달리하여 단백질변화 추이를 10% SDS-PAGE로 전기영동을 실시하여 정제과정이 정상적으로 진행되었는지 확인하여 최종은 200mM imidazole에서 회수하였다.(참조: 도 5) 도 5는 재조합에 의해 형질전환된 대장균으로부터 r26kDa 항원의 발현 및 정제과정중의 단백질의 변화를 SDS-PAGE로 나타내는 사진이다. 도 5에서 제 M 레인은 분자량 크기 마커이고, 제 1레인은 IPTG 유도 이전의 세포 파쇄액을 전기영동한 결과이며 제 2레인은 IPTG 유도후 4시간 배양한 균의 파쇄액을 전기영동한 결과이며, 제 3레인은 용해전 파쇄액이고, 제4레인은 용해후 파쇄액이다. 제5레인은 용해액 원심분리 후의 상등액으로, 제6 레인부터 12레인까지 10mM, 20mM, 50mM, 75 mM, 100mM, 150mM, 200mM의 imidazole 농도변화를 주어 회수에 적정 농도가 200mM임을 확인하고 제 12레인부터 20레인(200mM)로 용출하였다.

[실시예 8] 정제된 r26kDa 단백질 항원을 이용한 진단 실험

ELISA는 코팅용액 (Na₂CO₃ 0.159 g, NaHCO₃ 0.293 g per 100 ㎖)에 정제된 r26kDa을 5㎍/ml 농도가 되게 각 96-웰 플레이트에 100㎕씩 접종하고 37℃에서 1시간 정치하였다. r26kDa 용액을 완전히 제거하고 0.01% Tween-20을 포함한 완충액(PBS-T; NaCl 8 g, KH₂PO₄ 0.2 g, Na₂HPO₄?7H₂O 2.17 g, KCl 0.2 g/ℓ)을 200㎕씩 분주하고 5분간 정치 후 PBS-T를 완전히 털어낸 후 37℃에서 완전히 건조시켰다. 물기가 제거된 96-웰 플레이트에 5% skim milk을 포함한 완충액을 200㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 정치하였다. 완충액을 완전히 제거하고 0.01% Tween-20을 포함한 완충액 (PBS-T)을 200㎕씩 분주하고 5분간 정치 후 PBS-T를 완전히 털어낸 후 1차 항체로 사용할 환자혈청을 완충액으로 1:100으로 희석하여 각 웰 당 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 200 ㎕의 PBS-T로 96-웰 플레이트를 3회 세척하여 건조 시킨 후 IgG를 검출하기 위한 2차 항체로 Horse radish peroxidase-conj㎍ated goat anti-mouse IgG (Sigma Chemical Co., USA)를 PBS에 1:2,000으로 희석해서 각 well에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. IgM을 검출하기 위한 2차 항체도 HRP-conj㎍ated goat anti-human IgM (Sigma Chemical Co.)을 1:2,000으로 희석해서 사용하였다. 반응이 끝난 후 PBS-T로 플레이트를 3회 세척하였다. 세척된 96-웰 플레이트의 물기를 완전히 제거한 후 TMB(Moss, Inc)용액 100㎕씩을 각 웰에 첨가했다. 발색이 시작된 후 5분이 지나면 각 웰에 0.5M HCl 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료는 본 실험실에서 보관하고 항체가 20미만의 혈청 30건 과 160이상인 양성혈청 20건을 가지고 IgG 및 IgM ELISA를 수행한 후 음성검체의 평균값인 0.5를 Cut off value로 정하여 양성과 음성을 구분 하였다. 항체가 20미만인 음성혈청 50건에서 r26kDa 재조합 항원 단백질 이용한 IgM ELISA에서는 cut-off value 이상이 6건, 이하가 24건이었으며, IgG에서는 cut-off value 이상이 4건, 이하가 26건이었다. 항체가 160이상인 양성 혈청에서 IgM의 ELISA결과는 cut-off value 이상이 16건, 이하가 4건이었으며, IgG에서는 cut-off value 이상이 19건, 이하가 1건이었다. 이러한 결과로 r26kDa 재조합 항원 단백질 이용한 ELISA의 민감도는 IgM 80.0%, IgG 86.7%를 보였고, 특이도는 IgM 80.0%, IgG 95.0%를 나타났다. 도 6은 정제된 r26kDa 단백질 항원의 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다. 상기 민감도 와 특이도는 아래와 같은 방법으로 산출하였다.

민감도 (%) = (양성 검체수 / 전체 양성 검체수+ 위음성수) x 100

특이도 (%) = (음성 검체수 / 전체 음성 검체수 + 위양성수) x 100

[실시예 9] LPS의 정제 및 LPS를 항원으로 이용한 진단 실험(LPS-ELISA)

정제된 r26kDa의 ELISA의 항원성을 높이기 위하여 LPS를 추가하는 실험을 진행하였다. LPS의 정제는 브루셀라 아보투스 국내분리주 LSH를 1.5% Sheep Blood 첨가 TSA 배지에 37℃의 CO₂ 배양기(5%)에서 3일간 배양하여 LPS 정제에 필요한 콜로니를 확보한 후 Scraper로 수집하여 PBS에 현탁하고 LPS Extraction kit(Intron, KOREA) 을 이용하여 LPS를 정제한다. ELISA는 코팅용액 (Na₂CO₃ 0.159 g, NaHCO₃ 0.293 g per 100 ㎖)에 정제된 LPS을 농도별로 단계 희석하여 각 well에 100㎕씩 접종하고 37℃에서 1시간 정치한 후 실시예 6에 기재된 동일한 방법으로 진단을 수행하였다.

항체가 20미만 음성 혈청 9건과 160이상 양성혈청 9건을 이용하여 IgG 및 IgM ELISA를 수행한 결과 IgM 과 IgG 모두 LPS 농도를 높임에 따라 흡광도가 증가함을 보였다(참조: 도 7). 도 7은 정제된 LPS 항원의 농도별 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다. IgG에서는 LPS 단독으로 양성 검체와 음성검체간의 구분이 가능하였으며, LPS 농도 1㎍/ml에서 양성과 음성 검체간의 흡광도 차이가 가장 높아 이 농도가 브루셀라 IgG 진단에 적정한 농도임을 확인하였다.

[실시예 10] 정제된 r26kDa 단백질 항원과 LPS 혼합액을 항원으로 한 진단 실험

ELISA는 코팅용액 (Na₂CO₃ 0.159 g, NaHCO₃ 0.293 g per 100 ㎖)에 IgM과 IgG에서 정제된 r26kDa을 5㎍/ml 농도 하에 LPS을 농도별로 단계 희석하여 각 well에 100㎕씩 접종하고 37℃에서 1시간 정치한 후 실시예 6에 기재된 동일한 방법으로 진단을 수행하였다. IgG에서는 r26kDa 단백질 항원과 LPS를 혼합하여 진단을 수행하였을 때 LPS 단독으로 진단하는 것과 큰 차이를 보이지 않았으며, 오히려 양성 검체 1건이 음성으로 판정되는 것을 알 수 있었다. IgM에서는 r26kDa 단백질 항원과 혼합된 LPS 농도 4㎍/ml 이상에서 양성과 음성 검체가 구분이 LPS 단독으로 진단하는 경우보다 음성 검체 2건을 제외하고 전반적으로 높아진 것을 보여 이 농도가 브루셀라 IgM 진단에 적정한 농도임을 확인하였다. 도 8은 정제된 r26kDa 단백질 항원과 LPS 항원의 농도별 IgM 및 IgG ELISA 결과를 나타낸다.

[실시예 13] 정제된 r26kDa 단백질 항원 및 LPS을 이용한 유효성 실험

정제된 r26kDa 단백질 항원과 LPS을 이용한 진단 실험은 이 들 항원을 사용하여 IgG-ELISA와 IgM-ELISA로 실시하고 측정한 항체가와 민감도, 특이도를 계산하였다. 시료는 본 실험실에서 보관하고 있는 혈청을 대상으로 미세응집법 (MAT)으로 측정한 항체가에 따라 선정한 혈청을 사용하였다. 즉 정상인 혈청 30건, MAT 20미만 혈청 30건, MAT 160이상 혈청 45건의 혈청에 대하여 IgG 및 IgM ELISA를 실시하였다. 또한 시판되는 ELISA 키트와의 비교를 위하여 동일한 혈청을 사용설명서에 따라 검사하여 민감도 및 특이도를 계산하였다.

ELISA IgM는 코팅용액 (Na₂CO₃ 0.159 g, NaHCO₃ 0.293 g per 100 ㎖)에 정제된 r26kDa을 5㎍/ml 농도가 되게, LPS는 4㎍/ml 농도로 희석하여 각 well당 100㎍씩 넣고, IgG는 LPS 1㎍/ml 농도가 되도록 희석하여 각 96 플레이트 well당 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 정치한 후 실시예 8에 기재된 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.

r26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS을 이용한 IgM ELISA에서 cut-off value 이상이 2건, 이하가 58건을 확인하였으며, IgG에서는 cut-off value 이상이 4건, 이하가 56건을 확인하였다. 항체가 160이상인 혈청에 LPS를 이용한 IgG의 ELISA결과는 cut-off value 이상이 38건, 이하가 7건을 확인하였으며, IgG에서는 cut-off value 이상이 45건 모두임을 확인하였다. 이러한 결과로 r26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS을 이용한 ELISA 결과는 미세응집법에 대하여 민감도는 IgM 95.0%, IgG 91.8%를 보였고, 특이도는 IgM 89.2%, IgG 100%를 나타나, r26kDa 재조합 항원 단백질 단독으로 이용한 ELISA보다 민감도 및 특이도가 높아지는 효과를 었얻다. 또한 시판되는 Panbio사의 결과는 미세응집법에 대한 민감도는 IgM 97.8%, IgG 95.6%을 보였고, 특이도는 IgM 100%, IgG 96.7%를 나타나, r26kDa 재조합 항원 단백질 및 LPS을 이용한 ELISA 시험 결과 미세응집법 결과와 유의함을 확인할 수 있었고, 시판되는 ELISA 키트 결과와도 준하는 민감도와 특이도 결과를 얻을 수 있었다. 도 9는 미세응집법(MAT)에 의한 역가와 r26kDa 단백질 및 LPS를 항원으로 하는 ELISA IgG 와 IgM 반응성 간의 분포를 나타낸다. (a) 정제된 r26kDa 단백질 항원과 LPS를 이용한 IgM 및 IgG ELISA 결과 (IgM 민감도: 95.0%, 특이도: 89.2%, IgG 민감도: 91.8%, 특이도: 100%) (b) 시판되는 Panbio사의 IgG 및 IgM ELISA 결과 (IgM 민감도: 97.8%, 특이도: 100%, IgG 민감도: 95.6%, 특이도: 96.7%)

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 브루셀라 아보투스의 26kDa 단백질 유전자의 재조합 DNA는 그 발현과 유전자 조작이 용이하도록 인위적으로 설계되었고, 아울러 브루셀라 감염자 또는 환자의 혈청 내의 항체에 대하여 반응성을 나타내며, 배양이 어려우며 시간이 오래 걸리는 브루셀라균의 배양에 비하여 대장균 형질전환체에 삽입되어 발현됨으로써 배양이 간단하여 산업적 유용성을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 이와 같은 재조합 DNA로부터 발현된 26kDa 단백질은 브루셀라증의 진단 시약 또는 진단 키트로 이용 가능 하다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> Diagnostic kits of Brucella abortus using 26kDa recombinant antigenic protein and Lipopolysaccaride <130> PN100019 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 780 <212> DNA <213> Brucella abortus isolates LSH <400> 1 atgaacactc gtgctagcaa ttttctcgca gcctcatttt ccacaatcat gctcgtcggc 60 gctttcagcc tgcccgcttt cgcacaggag aatcagatga cgacgcagcc cgcgcgcatc 120 gccgtcaccg gggaaggcat gatgaccccc tcgcccgata tggccattct caatctctcg 180 gtgctacgcc aggcaaagac cgcgcgcgaa gccatgaccg cgaataataa tgaagccatg 240 accgcgaata atgaagccat gagaaaagtg ctcgatgcca tgaagaaggc cggcatcgaa 300 gatcgcgatc tccagacagg cggcatcgat atccagccga tttatgtcta tcctgacgac 360 aagaacaacc tgaaagagcc taccatcacc ggctattctg tatccaccag tctcacggtt 420 cgcgtgcgcg aactggccaa tgttggaaaa attttgcatg aatccgtcac gctcggtgtt 480 aatcagggcg gtgatttcaa cctggtcaat gataatccct ccgccgtgat cacgaggggc 540 aagcgcgcag tggccaatgc cattgccaag ccgaagacgc ttgccgacgc tgcaggcgtg 600 gggcttggcc gtgtggtgga aatcagtgaa ctgagccgcc cgcccatgcc gatgccgatg 660 ccaattgcgc gcggacagtt cagaaccatg ctagcagccg caccggacaa ttccgtgccg 720 attgccgcag gcgaaaacag ctataacgta tcggtcaatg tcgtttttga aatcaagtaa 780 780 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Brucella abortus isolates LSH <400> 2 Met Asn Thr Arg Ala Ser Asn Phe Leu Ala Ala Ser Phe Ser Thr Ile 1 5 10 15 Met Leu Val Gly Ala Phe Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gln Glu Asn Gln 20 25 30 Met Thr Thr Gln Pro Ala Arg Ile Ala Val Thr Gly Glu Gly Met Met 35 40 45 Thr Pro Ser Pro Asp Met Ala Ile Leu Asn Leu Ser Val Leu Arg Gln 50 55 60 Ala Lys Thr Ala Arg Glu Ala Met Thr Ala Asn Asn Asn Glu Ala Met 65 70 75 80 Thr Ala Asn Asn Glu Ala Met Arg Lys Val Leu Asp Ala Met Lys Lys 85 90 95 Ala Gly Ile Glu Asp Arg Asp Leu Gln Thr Gly Gly Ile Asp Ile Gln 100 105 110 Pro Ile Tyr Val Tyr Pro Asp Asp Lys Asn Asn Leu Lys Glu Pro Thr 115 120 125 Ile Thr Gly Tyr Ser Val Ser Thr Ser Leu Thr Val Arg Val Arg Glu 130 135 140 Leu Ala Asn Val Gly Lys Ile Leu His Glu Ser Val Thr Leu Gly Val 145 150 155 160 Asn Gln Gly Gly Asp Phe Asn Leu Val Asn Asp Asn Pro Ser Ala Val 165 170 175 Ile Thr Arg Gly Lys Arg Ala Val Ala Asn Ala Ile Ala Lys Pro Lys 180 185 190 Thr Leu Ala Asp Ala Ala Gly Val Gly Leu Gly Arg Val Val Glu Ile 195 200 205 Ser Glu Leu Ser Arg Pro Pro Met Pro Met Pro Met Pro Ile Ala Arg 210 215 220 Gly Gln Phe Arg Thr Met Leu Ala Ala Ala Pro Asp Asn Ser Val Pro 225 230 235 240 Ile Ala Ala Gly Glu Asn Ser Tyr Asn Val Ser Val Asn Val Val Phe 245 250 255 Glu Ile Lys

Claims

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 27번~199번째 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 분리주 LSH(Brucella abortus isolates LSH)의 26kDa 항원 단백질.
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중 27번~199번째 를 코딩하는 염기서열 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 분리주 LSH(Brucella abortus isolates LSH)의 26kDa 단백질 유전자 단편
제2항에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 1에 기재된 염기서열 중 76 번~ 595 번째 염기서열 또는 이와 기능적으로 동등한 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 아보투스 분리주 LSH(Brucella abortus isolates LSH)의 26kDa 단백질 유전자 단편.
제2항의 유전자 단편을 포함하며, 브루셀라 아보투스의 26kDa 항원 단백질을 발현할 수 있는 재조합 발현벡터.
제4항에 있어서, 도 3에 기재된 유전자 지도를 갖는 p26kDa인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제4항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제6항에 있어서, 대장균 NIH/BL/26kDa-ET15B(E. coli NIH/BL/26kDa-ET15B)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제6항 또는 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 브루셀라 아보투스의 26kDa 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 26kDa 항원 단백질의 제조방법.
제1항에 따른 26kDa 항원 단백질을 포함하는, 사람을 포함하는 포유동물에서 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
제9항에 있어서, LPS를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
제10항에 있어서, 상기 LPS는 1㎍/ml ~ 8㎍/ml 농도인 것을 특징으로 하는 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
제9항에 있어서, 브루셀라 IgG 와 IgM를 검출하는 것을 특징으로 하는 브루셀라균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
제9항에 있어서, 검출방법은 ELISA법 또는 Dip-stick assay법인 것을 특징으로 하는 진단 키트.