CN111491657A - 用于异源蛋白质生产的人工分泌肽 - Google Patents
用于异源蛋白质生产的人工分泌肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111491657A CN111491657A CN201880081319.8A CN201880081319A CN111491657A CN 111491657 A CN111491657 A CN 111491657A CN 201880081319 A CN201880081319 A CN 201880081319A CN 111491657 A CN111491657 A CN 111491657A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- protein
- lactobacillus
- amino acid
- signal peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 41
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 26
- 230000014616 translation Effects 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 201
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 200
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 157
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 92
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 91
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 138
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 claims description 89
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 88
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 80
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 62
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 claims description 53
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 claims description 44
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 26
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 15
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 4
- 101000952040 Homo sapiens Beta-defensin 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 3
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 claims description 3
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 3
- 102000046975 human DEFB1 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 98
- 241000894007 species Species 0.000 description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 32
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 32
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 15
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 11
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 11
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 10
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 10
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 4
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 4
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 4
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 3
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 3
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 3
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 3
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 3
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 3
- OLTSGVZGKOFTHZ-UHFFFAOYSA-N P.P.P.P.P.P.P.P.P Chemical compound P.P.P.P.P.P.P.P.P OLTSGVZGKOFTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018673 SEC Translocation Channels Human genes 0.000 description 3
- 108010091732 SEC Translocation Channels Proteins 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 3
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 3
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- WLVLIYYBPPONRJ-GCJQMDKQSA-N Asn-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WLVLIYYBPPONRJ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 2
- 201000009182 Chikungunya Diseases 0.000 description 2
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 2
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- -1 I L) Proteins 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 2
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 2
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 2
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 2
- 241001561398 Lactobacillus jensenii Species 0.000 description 2
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 description 2
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000027625 autoimmune inner ear disease Diseases 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O QUIGLPSHIFPEOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ADPACBMPYWJJCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010064539 Autoimmune myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 206010069002 Autoimmune pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000009299 Benign Mucous Membrane Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 102100037437 Beta-defensin 1 Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- LWTTURISBKEVAC-CIUDSAMLSA-N Cys-Cys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N LWTTURISBKEVAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JXVFJOMFOLFPMP-KKUMJFAQSA-N Cys-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JXVFJOMFOLFPMP-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710178510 Defensin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000186811 Erysipelothrix Species 0.000 description 1
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YJIUYQKQBBQYHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N Gln-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- JVACNFOPSUPDTK-QWRGUYRKSA-N Gly-Asn-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVACNFOPSUPDTK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- AFPFGFUGETYOSY-HGNGGELXSA-N His-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AFPFGFUGETYOSY-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N His-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SWBUZLFWGJETAO-KKUMJFAQSA-N His-Tyr-Asn Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O SWBUZLFWGJETAO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108091016366 Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N Ile-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 WZPIKDWQVRTATP-SYWGBEHUSA-N 0.000 description 1
- PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241001662087 Lactobacillus gasseri ATCC 33323 = JCM 1131 Species 0.000 description 1
- 101001076687 Lactobacillus gasseri Inulosucrase Proteins 0.000 description 1
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N VBZOAGIPCULURB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OJDFAABAHBPVTH-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O OJDFAABAHBPVTH-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010071579 Neuronal neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- MLRCILDHWOUQCI-UHFFFAOYSA-N P.P.P.P.P Chemical compound P.P.P.P.P MLRCILDHWOUQCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N Phe-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HOYQLNNGMHXZDW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- BCNRNJWSRFDPTQ-HJWJTTGWSA-N Pro-Ile-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BCNRNJWSRFDPTQ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100094098 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RSC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BKOKTRCZXRIQPX-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N BKOKTRCZXRIQPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O YRNBANYVJJBGDI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N Tyr-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 108010068991 arginyl-threonyl-prolyl-prolyl-prolyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 206010071578 autoimmune retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000029407 autoimmune urticaria Diseases 0.000 description 1
- 210000000467 autonomic pathway Anatomy 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 208000000594 bullous pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000024376 chronic urticaria Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000010205 computational analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- YKBZOVFACRVRJN-UHFFFAOYSA-N dinotefuran Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C(/NC)NCC1CCOC1 YKBZOVFACRVRJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000003305 oral gavage Methods 0.000 description 1
- 229950004327 ozoralizumab Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 1
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
- A61K2035/115—Probiotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
在一些实施方案中，本文提供了能够指导从乳杆菌属分泌的人工分泌肽，用于例如生产异源蛋白质，包括治疗性蛋白质。
Description
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(E)要求下列美国临时申请的权益：2017年10月20日提交的美国临时申请号62/575,350、2017年11月10日提交的美国临时申请号62/584,367、2018年5月24日提交的美国临时申请号62/676,203和2018年6月28日提交的美国临时申请号62/691,553，所述美国临时申请中的每一个通过引用整体并入本文。
联邦资助的研究
本发明是在由能源部颁发的第DE-FG02-02ER63445号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景
大多数分泌蛋白具有在分泌途径中引导跨膜转运的N末端信号肽。这些肽的长度通常15-60个氨基酸，并且特征可能在于通常包含带正电荷的氨基酸的N-末端区域、中心疏水区域和短的C-末端区域。在原核生物(包括细菌)中，分泌信号肽通常通过Sec转位酶引导细胞输出。在自然界中，通过Sec途径输出的每一种蛋白质都与其独特的分泌信号结合在一起。
发明内容
本文提供了通用的人工分泌信号肽，其使得能够高效且稳健地生产多种不同的治疗性蛋白质。现有的治疗性蛋白质生产技术严重依赖于一小组天然存在的分泌信号肽的使用。然而，这些天然存在的肽的性能通常是不可预测的，导致低效/无效的输出和/或未折叠/错误折叠的蛋白质。另外，此类分泌信号肽的性能不一定能在不同蛋白质之间转移。例如，指导一种蛋白质分泌的信号肽通常不能促进另一种蛋白质的分泌。此外，先前表征的在一种细菌菌株中功能性分泌蛋白质的天然信号肽通常不能促进同一蛋白质在其他密切相关的细菌菌株中的分泌。本公开的人工分泌信号肽可靠地促进多种异源蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的分泌。
本公开至少部分基于一些意外数据，这些意外数据显示包含由SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7中的任一个标识的氨基酸序列的人工分泌信号肽能够指导功能性异源蛋白质从乳杆菌属(Lactobacilli)分泌。
因此，在一些方面，本文提供了人工分泌信号肽，其包含与选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
本文还提供了与人工分泌信号肽融合的蛋白质(例如，治疗性蛋白质)。
本文还提供了编码人工分泌信号肽或与人工分泌信号肽融合的蛋白质的核酸。
另外，本公开提供了包含本文所述核酸的载体和细胞(例如，乳杆菌属细胞)。
本公开还提供了生产蛋白质的方法、包含所述蛋白质的组合物以及使用所述组合物和蛋白质的方法。
本公开还提供了如下方法，所述方法包括(a)对细菌菌株特异性序列库中的信号序列群体计算氨基酸残基位置权重矩阵(position weight matrix，PWM)，以及(b)对信号序列群体基于PWM生成共有信号肽序列。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)在细菌菌株的细胞中表达与包含共有信号肽序列的信号肽连接的目标异源蛋白质。所述菌株可以是例如耶尔森氏菌属的某些种(Yersinia spp.)、埃希氏菌属的某些种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属的某些种(Klebsiella spp.)、不动杆菌属的某些种(Acinetobacter spp.)、博德特氏菌属的某些种(Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌属的某些种(Neisseria spp.)、气单胞菌属的某些种(Aeromonas spp.)、弗朗西斯氏菌属的某些种(Franciesella spp.)、棒状杆菌属的某些种(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌属的某些种(Citrobacterspp.)、衣原体属的某些种(Chlamydia spp.)、嗜血杆菌属的某些种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属的某些种(Brucella spp.)、分枝杆菌属的某些种(Mycobacterium spp.)、军团菌属的某些种(Legionella spp.)、红球菌属的某些种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属的某些种(Pseudomonas spp.)、螺杆菌属的某些种(Helicobacter spp.)、沙门菌属的某些种(Salmonella spp.)、弧菌属的某些种(Vibrio spp.)、芽孢杆菌属的某些种(Bacillusspp.)、丹毒丝菌属的某些种(Erysipelothrix spp.)、沙门菌属的某些种(Salmonellaspp.)、链霉菌属的某些种(Streptomyces spp.)、类杆菌属的某些种(Bacteroides spp.)、普雷沃菌属的某些种(Prevotellaspp.)、梭菌属的某些种(Clostridium spp.)、双歧杆菌属的某些种(Bifidobacterium spp.)或乳杆菌属的某些种(Lactobacillus spp.)。在一些实施方案中，所述细菌细胞是益生菌细胞。
在一些实施方案中，目标异源蛋白质是治疗性蛋白质，诸如抗体。例如，抗体可以针对(特异性针对)宿主组织抗原(例如，TNFα或上皮或粘膜表面蛋白)或外来抗原(例如，致病菌、病毒和毒素蛋白)。
在一些实施方案中，编码与共有信号肽序列连接的目标异源蛋白质的核酸与诱导型启动子可操作地连接。
本公开的其他方面提供了如下方法，所述方法包括向患有炎性肠病的受试者施用工程化鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)细胞，该细胞包含编码与源自鼠李糖乳杆菌的人工分泌信号肽融合的抗炎细胞因子的核酸。在一些实施方案中，人工分泌信号肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，人工分泌信号肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗炎细胞因子是IL10。
在一些实施方案中，任选地在单剂量的工程化鼠李糖乳杆菌细胞后，由工程化鼠李糖乳杆菌细胞在受试者中产生的抗炎细胞因子的量为在对照条件下产生的抗炎细胞因子的量的至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一些实施方案中，对照条件包括经工程化以分泌抗炎细胞因子的乳杆菌属细胞。在一些实施方案中，任选地在单剂量的工程化鼠李糖乳杆菌细胞后，受试者中存在的结肠IL10的水平相对于基线(在施用工程化鼠李糖乳杆菌细胞之前三个月内的平均IL10水平)增加至少25％、至少35％或至少45％。
附图简述
图1包括指示乳杆菌属的分泌信号肽的每个位置上的每个氨基酸的概率的序列标志(sequence logos)。通过计算氨基酸残基位置权重矩阵生成序列标志。图A：显示了鼠李糖乳杆菌的分泌信号肽(鼠李糖乳杆菌SP1)的序列标志。图B：显示了加氏乳杆菌(L.Gasseri)的分泌信号肽序列(加氏乳杆菌SP1)的序列标志。图C：显示了鼠李糖乳杆菌的分泌信号肽序列(鼠李糖乳杆菌SP2)的序列标志。
图2显示了表明人工分泌信号肽能够促进抗-HIV抗体片段(J3VHH)从乳杆菌属分泌的数据。分析纯化的培养物上清液。J3VHH的预期大小为14.3KDa。His-纯化的培养物上清液的考马斯染色(SimplyBlue by Invitrogen)用于产生这些图像。图A：显示了表明来自用编码与J3VHH融合的序列如SEQ ID NO:1所示的分泌信号肽的载体转化的鼠李糖乳杆菌的纯化培养物上清液中存在J3VHH的数据。在最后一个泳道中显示了分子量蛋白质标记物。图B：显示了表明来自用编码与J3VHH融合的SEQ ID NO:3的载体转化的加氏乳杆菌的纯化培养物上清液中存在J3VHH的数据。在第一泳道中显示了分子量标记物。
图3显示了数据，所述数据表明具有于SEQ ID NO:3中提供的序列的分泌信号能够促进JM4VHH(抗-HIV抗体片段)、奥左拉珠单抗(Ozoralizumab)(抗-TNFα抗体片段)和VRC01scFV(源自广泛中和的IgG抗体VRC01的抗-HIV抗体片段)从乳杆菌属分泌。来自用编码以与指示的抗体片段融合的SEQ ID NO:3提供的分泌信号的载体转化的鼠李糖乳杆菌的纯化培养物上清液。在第一个泳道中显示了分子量标记物。每个抗体片段的预期大小如下:JM4VHH：15kDa，奥左拉珠单抗：13.3kDa和VRC01scFV：28.8kDa。His-纯化的培养物上清液的考马斯染色(SimplyBlue by Invitrogen)用于产生这些图像。
图4显示了表明具有于SEQ ID No:3中提供的序列的分泌信号能够分泌来自加氏乳杆菌的功能性抗体片段的数据。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)产生数据，以测量指示分泌的抗体对gp120(菌株YU2)的结合亲和力。
图5显示了表明鼠李糖乳杆菌GG(LGG)SP1(SEQ ID NO:1)和鼠李糖乳杆菌GG SP2(SEQ ID NO:5)能够分泌J3VHH的数据。J3VHH的预计大小为14.3kDa。His-纯化的培养物上清液的考马斯染色(SimplyBlue by Invitrogen)用于产生这些图像。
图6显示了表明鼠李糖乳杆菌GG SP2(SEQ ID NO:5)分泌来自鼠李糖乳杆菌的能够结合gp120的功能性J3VHH的数据。显示了检测与gp120的结合的ELISA测定的结果。
图7显示了表明鼠李糖乳杆菌GG SP1(SEQ ID NO:1)分泌来自鼠李糖乳杆菌的能够结合gp120的功能性J3VHH的数据。显示了检测与gp120的结合的ELISA测定的结果。
图8显示了与所指示的天然存在的分泌信号肽的预测的分泌效率对比测量的分泌效率的数据。每种分泌信号都被融合至mCherry的N末端，并在加氏乳杆菌中进行测试。将上清液中的mCherry荧光测量为相对荧光单位(RFU)的倍数变化。灰色条表示预测的分泌效率，黑色条表示加氏乳杆菌中RFU的实验测量的相对倍数变化。白色条表示鼠李糖乳杆菌GG中在RFU的实验测量的相对倍数变化。
图9显示了表明具有于SEQ ID NO:3(加氏乳杆菌SP1)中提供的氨基酸序列的分泌信号肽能够比测试的最高性能的天然存在的信号肽(Lp3189)引导更多的分泌。已将每种分泌信号在N末端与mCherry融合，并在加氏乳杆菌中对其进行测试。显示了以任意单位(AU)测量的上清液中的mCherry荧光。还显示了阴性对照的荧光。
图10包括表明由加氏乳杆菌SP1分泌的J3VHH(SEQ ID NO:3)表现出与文献中报道的常规生产的J3VHH相当的HIV中和活性。图A在左轴上显示了测量由加氏乳杆菌SP1分泌的J3VHH的浓度的ELISA试验的结果。图B显示了“TZM-bl数据”，该数据评估了HIV中和活性。简言之，这种方法测量通过抗体治疗保护的人HIV易感细胞的分数。由加氏乳杆菌SP1分泌的J3VHH的IC50表示为测量的IC50。将文献中报道的常规生产的J3VHH的IC50指示为公布的IC50。
图11包括通过生物层干涉测量法分析抗TNFα抗体片段(由Ablynx销售的)、奥左拉珠单抗(由鼠李糖乳杆菌GG SP1(SEQ ID NO:1)分泌的)的功能的数据。显示了两个重复的KD。
图12A-12B显示了对比数据，所述数据证明工程化乳杆菌属(图12A)可以比大肠杆菌(E.Coli)(图12B)更大量地分泌产物。图12A包括数据，所述数据表明加氏乳杆菌SP1(SEQID NO:3)能够在加氏乳杆菌中分泌具有一个、两个和三个抗原结合位点的抗志贺毒素(Stx2)抗体片段。使用指示的细菌，将蛋白质印迹用于显现3个重复中每种分泌的抗体片段的相对量。抗志贺毒素单体是常规的单一单体(17kDa)，二聚体(33.5kDa)和三聚体(48kDa)分别是两个和三个融合的单体。将每种分泌的抗体片段暴露于抗纯化染色标签20分钟。显示了使用抗eTag检测抗体的蛋白质印迹结果，所述抗体具有使用包含加氏乳杆菌SP1的工程化加氏乳杆菌的针对分泌的志贺毒素(Stx2)的化学发光暴露。
图13包括与通过机器学习对SP功能进行预测性评分相关的数据。图A显示了说明某些氨基酸亚组如何由于它们的物理化学性质相似而耐受肽序列中的彼此取代的维恩图。图B显示了与通过奇异值分解(SVD-LDA)的多维功能属性数据的线性判别分析相关的数据。
图14包括与纯化的IL-10的标准曲线相比的利用无细胞鼠李糖乳杆菌GG(LGG)上清液进行的IL-10捕获ELISA的数据。稀释系列报告为原始培养物CFU/mL密度的分数；纯化的IL-10重悬于无细胞阴性对照培养基中。
图15包括数据，所述数据表明具有于SEQ ID NO:5中提供的氨基酸序列的分泌信号肽(鼠李糖乳杆菌GG SP2)能够比Apf分泌肽和Usp分泌肽引导更多的分泌。将每种分泌信号与mCherry融合，并在鼠李糖乳杆菌GG中进行测试。显示了以任意单位(AU)测量的上清液中的mCherry荧光。还显示了阴性对照的荧光。
图16是描绘长度为33个氨基酸的加氏乳杆菌(加氏乳杆菌SP2)的另一个分泌信号肽序列的序列标志。
图17是凝胶图像，其显示具有以SEQ ID NO:7(加氏乳杆菌SP2)提供的序列的分泌信号肽，与SEQ ID NO:3(加氏乳杆菌SP1)类似，能够分泌来自加氏乳杆菌的J3-VHH。泳道1显示了关于非结合对照的结果，泳道2显示了关于加氏乳杆菌SP1-J3-VHH的结果，泳道3显示了关于加氏乳杆菌SP2-J3-VHH的结果。
图18是表明加氏乳杆菌SP2(SEQ ID No:7)分泌来自加氏乳杆菌的功能性J3-VHH的图。该图显示了使用未纯化上清液中的抗gp120抗体检测与gp120结合的ELISA测定的结果。
图19A-19B是显示鼠李糖乳杆菌GG SP1(SEQ ID NO:1)(图19A)和鼠李糖乳杆菌GGSP2(SEQ ID NO:5)(图19B)中存在的基序的两种物理化学氨基酸性质(疏水性和螺旋度)的图。
图20A-20B是显示加氏乳杆菌SP1(SEQ ID NO:3)(图20A)和加氏乳杆菌SP2(SEQID NO:7)中或加氏乳杆菌SP3(图20B)中存在的基序的两种物理化学氨基酸性质(疏水性和螺旋度)的图。
图21是显示重组鼠李糖乳杆菌GG体内递送IL10的图。
图22是显示供应商纯化的GLP2标准捕获ELISA浓度曲线拟合的图。
图23是显示重组鼠李糖乳杆菌GG体外分泌GLP1的图。
图24是显示由加氏乳杆菌分泌的hBD1抑制大肠杆菌ATCC 25922生长的图。
具体实施方式
在一些方面，本公开提供了用于例如乳杆菌属细胞生产治疗性蛋白质的人工分泌信号肽。
人工分泌信号肽
本发明提供了促进多种蛋白质分泌的人工分泌信号肽。人工分泌信号肽是自然界中不存在的分泌信号肽。例如，人工序列可以通过重组或合成产生。分泌信号肽通常是短肽(例如，15-60个氨基酸)，存在于进入分泌途径的新合成蛋白质的N末端。在一些实施方案中，本公开的人工分泌信号肽包括与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:11和SEQ ID No:7的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID No:3标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3标识的氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:7标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:7标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:7标识的氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:11标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。
本文还提供了编码所述人工分泌信号肽的核酸。核酸是至少两个共价连接在一起的核苷酸，并且在一些情况下，可包含磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“骨架”)。本文描述的核酸可以使用重组或合成技术来产生。在一些实施方案中，编码人工信号肽的核酸与由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID No:6中任一项标识的核酸序列具有至少90％同一性。
在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:2的核酸序列相同。
在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:4的核酸序列相同。
在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:6的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:6的核酸序列相同。
在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:8的核酸序列具有至少98％同一性。在一些实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO:8的核酸序列相同。
在一些实施方案中，所述核酸是密码子优化的。在一些实施方案中，所述核酸未经密码子优化。
应当理解，本公开涵盖本文所述的人工分泌信号肽的任一种或多种以及与参考人工信号肽(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7)共有一定程度序列同一性的人工分泌信号肽的用途。同一性百分比是指如通过比较两种或更多种多肽(例如，蛋白质和肽)或多核苷酸(核酸)的序列确定的所述序列之间的关系。同一性测量通过特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)解决的带有缺口比对(如果有的话)的两个或更多个序列中较小的序列之间相同匹配的百分比。通过已知的方法可以很容易地计算出相关分子的同一性。当其应用于氨基酸或核酸序列时，“同一性百分比(％)”被定义为在对齐序列和引入缺口(如果需要的话)以获得最大同一性百分比后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的缺口和罚分，其值可能会不同。特定序列的变体可以与特定参考序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如由本文所述的以及本领域技术人员已知的序列比对程序和参数测定的。
序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。将用于确定同一性的技术编码入公开可用的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1):387,1984)、BLAST套件(Altschul,S.F.等人，Nucleic Acids Res.25:3389，1997)和FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.215:403,1990)。其他技术包括：Smith-Waterman算法(Smith,T.F.等人，J.Mol.Biol.147:195,1981；Needleman–Wunsch算法(Needleman,S.B.等人，J.Mol.Biol.48:443,1970；和快速最佳全局序列比对算法(FastOptimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)(Chakraborty,A.等人SciRep.3:1746,2013)。
在一些实施方案中，本文描述的人工分泌信号肽可包含相对于本文公开的参考序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7)的保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是不改变其中进行氨基酸取代的蛋白质或肽的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。氨基酸的保守取代包括以下组中的氨基酸之间产生的取代:(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。在一些实施方案中，人工分泌信号肽包含相对于本文公开的参考序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:7)的保守氨基酸取代，使得基序(例如，亲水性头部基序、疏水性核心基序或I型信号肽酶切割位点)的疏水性和/或螺旋度模式相对于参考序列得以保留。例如，参见下面的实施例7。在一些实施例中，疏水性通过计算ΔtR(Gly)来测量。参见例如Kovacs等人，Biopolymers，2006；84(3):283-97。在一些实施例中，螺旋度通过计算Pα来测量。参见例如Deber等人，Protein Sci.2001Jan；10(1):212-9。
可根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法，例如在汇编此类方法的参考文献中发现的那些方法制备变体(参见，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人，New York:John Wiley&Sons,2006；Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Green,M.R.和Sambrook J.,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012；Gibson,D.G.,et al.,Nature Methods6(5):343-345(2009)，其关于多肽制备和修饰的教导通过引用并入本文)。
异源蛋白质
本公开的人工分泌信号肽促进异源蛋白质从乳杆菌属细胞分泌。因此，本文提供了编码与人工分泌信号肽融合的异源蛋白质的核酸。本文还提供了由核酸编码的全长功能性蛋白质。就特定细胞而言的异源蛋白质是该细胞天然不产生的任何蛋白质。如本文所提供的，异源蛋白质可以是乳杆菌细胞天然并不产生的任何蛋白质。在自然界中，独特的分泌信号肽与通过Sec途径输出的每种蛋白质结合在一起。因此，在天然存在的乳杆菌属细胞中可能有许多不同的分泌信号肽，并且所述分泌信号肽通常是不可互换的(例如，不能驱动不同蛋白质的分泌)。令人惊讶的是，本文公开的人工分泌序列是通用的，可用于分泌多种异源蛋白质(包括异源肽)。
作为非限制性实例，本公开的异源蛋白质长度可以是1至10,000个氨基酸。在一些实施方案中，异源蛋白质的长度为1-100个氨基酸，长度为1-25个氨基酸，长度为1-50个氨基酸，长度为10-50个氨基酸，长度为50-100个氨基酸，长度为100-200个氨基酸，长度为200-300个氨基酸，长度为300-400个氨基酸，长度为400-500个氨基酸，长度为500-1,000个氨基酸，或长度为1,000-5,000个氨基酸或长度为5,000-10,000个氨基酸。在一些实施方案中，异源蛋白质为1kDa至10kDa、1kDa至100kDa、1kDa至1,000kDa或1kDa至5,000kDa。在一些实施方案中，异源蛋白质的大小为2kDa至5kDa。
异源蛋白质可以是治疗性蛋白质(包括预防性蛋白质和/或诊断性蛋白质)。治疗性蛋白质的非限制性实例包括抗体、酶、激素(例如胰高血糖素样肽1(GLP1))、生长因子(例如TGFβ)、细胞因子(例如，IL10)、血浆蛋白、融合蛋白、膜溶解蛋白、凝血因子和抗微生物肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是炎症剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是抗炎剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是免疫调节剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是抗癌剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是代谢剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是抗病毒/杀病毒剂。在一些实施方案中，治疗性蛋白质是抗菌/杀菌剂(例如，抗菌肽，诸如防御素(例如，人β防御素1(hBD1)或β防御素2(hBD2))、LL-37、皮抑菌肽、HCV C5α肽、爪蟾抗菌肽或任何细菌来源的抗菌肽)。
可以通过本领域已知的任何方法来测量由本文所述的任何工程化乳杆菌属细胞产生的异源蛋白质或工程化乳杆菌属细胞培养物的上清液的抗微生物/杀菌活性。作为非限制性实例，可以如实施例10中所述测试异源蛋白质或包含异源蛋白质的上清液抑制微生物生长的能力。由本文所述的任何工程化乳杆菌细胞产生的异源蛋白质或来自工程化乳杆菌细胞培养物的上清液可抑制微生物(例如，致病菌)生长至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在一些实施方案中，治疗性蛋白是抗体。术语“抗体”涵盖完整抗体(具有两条重链和两条轻链的免疫球蛋白)和抗体片段。抗体片段包括但不限于骆驼科抗体、重链片段(VHH)、Fab片段、F(ab′)2片段、纳米抗体(单结构域抗体)和双抗体(diabodies)(双特异性/二价二聚体抗体片段)。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是由单个B细胞谱系分泌的抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。多克隆抗体是由不同的B细胞谱系分泌的抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是通过将一个物种(例如，小鼠)的抗原结合区(重链和轻链的可变结构域，VH和VL)与另一个物种(例如，人)的恒定结构域融合而制成的抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰，以增加其与人中天然产生的抗体变体的相似性。在一些实施方案中，抗体是融合抗体(例如，VHH或其他抗体片段与其他蛋白质类型的融合)。在一些实施方案中，抗体是可以在其上进行CDR移植的人源化
通过本文提供的方法产生的单克隆抗体的非限制性实例包括阿昔单抗
阿达木单抗
阿来西普
阿仑珠单抗
巴利昔单抗
贝利木单抗
贝佐洛单抗
卡那单抗
培舍珠单抗(certolizumab pegol)
西妥昔单抗
达克珠单抗(ZENAPAX、
)、地诺单抗(PROLIA、
)、依法珠单抗
戈利木单抗
英夫利昔单抗
伊匹木单抗
依克珠单抗
那他珠单抗
纳武单抗
奥拉珠单抗
奥马佐单抗
奥扎珠单抗(ozoralizumab)、帕利珠单抗
帕尼单抗
潘利珠单抗
利妥昔单抗
托珠单抗
曲妥珠单抗
苏金单抗
和乌司奴单抗
在一些实施方案中，通过本文提供的方法产生的抗体结合外源抗原(例如，致病菌、病毒和毒素蛋白)或结合存在于宿主组织上的抗原(例如，存在于上皮细胞或粘膜组织上的表面蛋白或TNFα)。
在一些实施方案中，通过本文提供的方法产生的抗体与病毒抗原特异性结合。病毒抗原的非限制性实例包括疏螺旋体属、恰加斯、基孔肯雅病、衣原体属、巨细胞病毒、登革热、埃博拉病毒、EBV、脑炎、猫白血病病毒、汉坦病毒、HBsAg、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、疱疹、HIV、HTLV、流感、拉沙病毒、疟疾、麻疹、腮腺炎、支原体属、诺如病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、风疹、SARS、志贺样毒素、弓形虫属、密螺旋体属、伤寒沙门菌(S.Typhi,)、水痘、西尼罗河病毒和寨卡病毒。在一些实施方案中，抗体是选自JM4VHH和VRC01scFV的抗HIV抗体。
在一些实施方案中，产生的抗体与微生物抗原特异性结合。微生物抗原的非限制性例子包括耶尔森氏菌属的某些种(Yersinia spp.)、埃希氏菌属的某些种(Escherichiaspp.)、克雷伯氏菌属的某些种(Klebsiella spp.)、不动杆菌属的某些种(Acinetobacterspp.)、博德特氏菌属的某些种(Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌属的某些种(Neisseriaspp.)、气单胞菌属的某些种(Aeromonas spp.)、弗朗西斯氏菌属的某些种(Franciesellaspp.)、棒状杆菌属的某些种(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌属的某些种(Citrobacter spp.)、衣原体属的某些种(Chlamydia spp.)、嗜血杆菌属的某些种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属的某些种(Brucella spp.)、分枝杆菌属的某些种(Mycobacterium spp.)、军团菌属的某些种(Legionella spp.)、红球菌属的某些种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属的某些种(Pseudomonas spp.)、螺杆菌属的某些种(Helicobacter spp.)、沙门菌属的某些种(Salmonella spp.)、弧菌属的某些种(Vibriospp.)、芽孢杆菌属的某些种(Bacillus spp.)、丹毒丝菌属的某些种(Erysipelothrixspp.)、沙门菌属的某些种(Salmonellaspp.)、链霉菌属的某些种(Streptomyces spp.)、类杆菌属的某些种(Bacteroides spp.)、普雷沃菌属的某些种(Prevotellaspp.)、梭菌属的某些种(Clostridium spp.)、双歧杆菌属的某些种(Bifidobacterium spp.)或乳杆菌属的某些种(Lactobacillus spp.)。在一些实施方案中，抗体与细菌毒素诸如志贺毒素、α毒素、炭疽毒素、蓝藻毒素、白喉毒素、外毒素、百日咳毒素、破伤风毒素或肉毒杆菌神经毒素特异性结合。
在一些实施方案中，抗体与炎性分子诸如细胞因子特异性结合。细胞因子的非限制性例子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、TGF-β超家族。在特定的实施方案中，抗体与TNF-α结合。
在一些实施方案中，治疗性蛋白是细胞因子。在一些实施方案中，治疗性蛋白是抗炎细胞因子。抗炎细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11和IL-13。在一些实施方案中，治疗性蛋白是IL-10。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质是免疫治疗性、肿瘤抑制性细胞因子。免疫治疗性细胞因子的非限制性实例包括IL-2、IL-7、IL-12、TGFβ、IFNγ、IFNα和G-CSF。
在一些实施方案中，人工分泌肽与不止一种异源蛋白质(例如，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少50种或至少100种异源蛋白质)或片段(例如，抗体片段，诸如Fab、(Fab)2或Fc片段)融合。例如，人工分泌肽可以与不止一种治疗性蛋白质融合(例如，所述治疗性蛋白质可以相同或不同)。在一些实施方案中，人工分泌肽与两种或更多种通过接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)相互连接的异源蛋白质融合。在一些实施方案中，人工分泌肽与细胞因子融合，所述细胞因子与抗体(或其他抗体缀合物)连接。在一些实施方案中，人工分泌肽与IL10-IgFc融合。在一些实施方案中，人工分泌肽与两种细胞因子(例如，由接头诸如丝氨酸-甘氨酸接头分隔的两个IL-10细胞因子)融合。
有利地，本发明的人工分泌信号肽使得能够产生具有不同分子量的抗体，并且还使得能够产生多价抗体。本文所述的乳杆菌属系统不受抗体大小的限制。例如，本发明的人工分泌信号肽可以指导包含一个抗体结构域(例如轻链可变结构域和重链可变结构域)的抗体的分泌。在一些实例中，抗体包含两个抗体结构域(例如，两个重链可变结构域、两个轻链可变结构域以及一个轻链可变结构域和一个重链可变结构域)。在一些实例中，抗体包含三个抗体结构域。在一些实施方案中，本公开的抗体具有一个抗原结合位点。在一些实施方案中，本公开的抗体包括例如通过接头(诸如甘氨酸-丝氨酸接头(包含甘氨酸和丝氨酸的接头))连接的两个抗原结合位点。在一些实施方案中，本公开的抗体是包含三个、四个、五个、六个、七个或八个抗原结合位点的多价抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包括例如通过两个接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)连接的三个抗原结合位点。
当在乳杆菌属细胞中表达时，本文产生的异源蛋白质最初与人工分泌信号肽融合(通常在蛋白质的N末端)。然而，应该理解的是，信号肽在成熟蛋白从细胞中分泌出来之前被切割。因此，通过本文提供的方法产生和分泌的功能性蛋白质不应包括所述人工分泌信号肽。
如实施例中所示，本文提供的所产生的异源蛋白质是功能性的。通过Sec转位酶途径输出的蛋白质在合成和分泌过程中保持未折叠状态，只有在蛋白质释放到细胞壁中扩散到细胞外环境中时才开始折叠。因此，即使一种蛋白质被证明是分泌的，也没有迹象表明其是正确折叠和有功能的。本公开的异源蛋白质被适当折叠并发挥功能。评估蛋白质(诸如抗体)功能的方法是已知的，其中任何一种都可以如本文所提供的那样使用。例如，抗体功能可以通过测量抗体与适当抗原的结合亲和力来评估，如实施例1所示。在一些实施方案中，通过本文提供的方法(例如，在乳杆菌属中使用人工分泌信号肽)产生的抗体的结合亲和力与使用天然存在的分泌信号肽产生的相同类型抗体的结合亲和力相当或比其更大。
结合亲和力是表观结合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。通过本文所述方法产生的抗体可对靶抗原或抗原表位具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低值的结合亲和力(KD)。结合亲和力的增加对应于KD的降低。与结合第二抗原的KA(或数值KD)相比，结合第一抗原的KA值更高(或KD值更小)，表明抗体对第一抗原的结合亲和力相对于对第二抗原的结合亲和力更高。在这种情况下，抗体对第一抗原(例如，呈第一构象的第一蛋白质或其模拟物)相对于第二抗原(例如，呈第二构象的相同第一蛋白质或其模拟物；或者第二蛋白质)具有特异性。在一些实施方案中，与使用天然存在的分泌信号肽产生的相同类型的抗体的结合亲和力相比，本文所述的抗体对合适的抗原具有更高的结合亲和力(更高的KA或更小的KD)。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105倍。在一些实施方案中，如本文所提供的任何产生的抗体可以被进一步亲和力成熟，以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可以通过多种方法来测定，包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子体共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件是在HBS-P缓冲液中(10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,0.005％(v/v)表面活性剂P20)。这些技术可用于作为靶蛋白浓度的函数测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合的])通常与游离靶蛋白的浓度([游离的])有以下相关性：
[结合的]＝[游离的]/(Kd+[游离的])
并不总是需要对KA进行精确测定，尽管有时获得亲和力的定量测量(例如使用诸如ELISA之类的方法测定的)就足够了，因为FACS分析或磁性免疫沉淀亲和力与KA成正比例，因此可以用于比较，诸如确定较高的亲和力(例如高2倍)将获得亲和力的定性测量，或获得亲和力的推断，例如通过功能性测定(例如体外或体内测定)中的活性。
核酸
在一些实施方案中，本文提供了编码与人工分泌信号肽融合的异源蛋白质的核酸。如本文别处所述，在一些实施方案中，编码人工分泌信号肽的核酸与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的任一个标识的核酸序列至少90％相同。
在一些实施方案中，所述核酸包含与编码所述蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的启动子。启动子是核酸序列的控制区域，在该区域控制核酸序列的剩余部分的起始和转录速率。启动子还可包含调控蛋白和分子诸如RNA聚合酶和其他转录因子可以结合的亚区域。启动子驱动其所调控的核酸序列的表达或转录。当启动子相对于核苷酸序列处于正确的功能位置和方向以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，启动子被认为是与该核苷酸序列“可操作地连接的”。启动子可以是组成型的或诱导型的。诱导型启动子是通过特定因子的存在或不存在来调节(例如，激活或灭活)的启动子。
根据本公开使用的诱导型启动子包括在乳杆菌属中具有功能的启动子。本文中使用的示例性诱导型启动子是四环素诱导型启动子。
在一些实施方案中，本文提供了用于在乳杆菌属中表达异源蛋白质的表达载体。本文所述的表达载体可包含本公开的任何核酸。表达载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)。本公开的表达载体可使用标准的分子克隆方法产生(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等，New York:John Wiley&Sons,2006；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Green,M.R.和Sambrook J.,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012；Gibson,D.G.等，Nature Methods 6(5):343-345(2009)，其关于分子克隆的教导通过引用并入本文)。
在工程化乳杆菌属细胞中生产异源蛋白质的方法
本公开的一些方面提供了生产蛋白质(例如，异源蛋白质，例如治疗性蛋白质)的方法，其包括在细胞培养基中培养本文所述的工程化乳杆菌属细胞以生产所述蛋白质。在一些实施方案中，所述方法还包括从细胞培养基中回收(例如，分离和/或纯化)所述蛋白质。
对本文提供的乳杆菌属细胞进行工程改造以包含编码与人工分泌信号肽融合的异源蛋白的核酸。因此，本公开提供了包含编码与人工分泌信号肽融合的异源蛋白的核酸的乳杆菌属细胞，并且还提供了包含所述异源蛋白质的乳杆菌属细胞。工程化细胞包含至少一种工程化核酸，或者以其他方式在结构或功能上不同于野生型对应体。因此，包含人工分泌信号肽的乳杆菌属细胞被认为是工程化细胞。在一些实施方案中，工程化乳杆菌属细胞包含本公开的表达载体。可使用重组技术，包括但不限于细菌转化，将本公开的任何核酸引入到乳杆菌属细胞中。
可在本领域公知的条件(例如温度、培养基和孵育时间)下繁殖本公开的乳杆菌属细胞。在一些实施方案中，其中乳杆菌属细胞包含与诱导型启动子可操作地连接的核酸，在有效量的诱导剂存在的情况下培养乳杆菌属细胞以诱导从诱导型启动子的表达。在一些实施方案中，驱动编码异源蛋白质的核酸表达的诱导型启动子是四环素诱导型启动子，因此，在有效量的四环素中培养所述乳杆菌属细胞以诱导从该四环素诱导型启动子的表达。
抗体纯化方法包括但不限于大小排阻色谱法、硫酸铵沉淀法、离子交换色谱法、固定化金属螯合色谱法、亲硫吸附法、甜瓜凝胶色谱法(melon gel chromatography)和抗体配体色谱法，其中任一种都可以如本文所提供的用于在从乳杆菌属细胞分泌后回收蛋白质。
令人惊讶的是，使用本公开的人工分泌信号肽导致异源蛋白质的产生(例如，抗体的产生)，其产率比使用天然存在的分泌信号肽产生的异源蛋白质高至少两个数量级。在一些实施方案中，如本文所提供的产生的异源蛋白的产率比使用天然存在的分泌信号肽产生的异源蛋白质的产率高至少2-10个数量级。例如，如本文所述产生的异源蛋白质的产率可以比使用天然存在的分泌信号肽产生的异源蛋白高2、3、4、5、6、7、8、9或10个数量级。
在一些实施方案中，如本文所述产生的异源蛋白的产率为至少1ng/mL细胞培养基(或其它培养基或缓冲液)。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为至少1ng/mL、至少5ng/mL、至少10ng/mL、至少20ng/mL、至少30ng/mL、至少40ng/mL、至少50ng/mL、至少60ng/mL、至少70ng/mL、至少80ng/mL、至少90ng/mL、至少100ng/mL、至少200ng/mL、至少300ng/mL、至少400ng/mL、至少500ng/mL、至少600ng/mL、至少700ng/mL、至少800ng/mL、至少900ng/mL或至少1μg/mL。
在一些实施方案中，如本文所述产生的异源蛋白质的产率为至少10μg/mL细胞培养基(或其它培养基或缓冲液)。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为至少20μg/ml细胞培养基。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为至少30μg/ml细胞培养基。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为至少40μg/m细胞培养基。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为至少50μg/ml细胞培养基。在一些实施方案中，产生的异源蛋白质的产率为10μg/mL至20μg/mL、10μg/mL至30μg/mL、10μg/mL至40μg/mL或10μg/mL至50μg/mL。
同样令人惊讶的是，本文提供的数据显示，本文提供的乳杆菌属系统的细胞比埃希氏菌属细胞分泌更大量的异源蛋白(见实施例3)。因此，在一些实施方案中，本文提供的使用乳杆菌属细胞的方法导致产生异源蛋白质的产率为使用埃希氏菌属细胞时获得的产率的至少2-10倍。例如，本文提供的使用乳杆菌属细胞的方法可导致产生异源蛋白质的产率为使用埃希氏菌属细胞时获得的产率的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方案中，本公开的乳杆菌属细胞是益生菌细胞。益生菌细胞当以足够的量施用时，可为被施用所述益生菌细胞的宿主赋予健康益处。例如，益生菌细胞可以在宿主的粘膜(例如肠道和阴道粘膜)中赋予健康益处。乳杆菌属的示例性益生菌种类包括但不限于，加氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌(L.casei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)和瑞士乳杆菌(L.helveticus)。本文提供的示例性乳酸杆菌属菌株包括鼠李糖乳杆菌GG、加氏乳杆菌ATCC 33323和加氏乳杆菌OLL2716。
在一些情况下，分泌蛋白(例如抗体)的相对量可以使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白质印迹法(参见例如下面的实施例1和2)来测定。分泌蛋白的功能可以用本领域已知的方法进行测试。例如，可测试抗HIV抗体与gp120结合的能力(参见例如下面的实施例1)。还可用TZM-bl测定(参见例如下面的实施例2)来测试抗HIV抗体中和HIV的能力。
治疗/预防应用以及药物组合物
如下所论述，本公开的分泌抗体的乳杆菌属细胞可在多种治疗和预防应用中用作益生菌药物递送载体。工程化细胞通常存在被受试者视为外来物的风险，并可能引发不良免疫反应。例如，某些类型的细菌是致病性的(例如，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的某些菌株)。因此，尽管大肠杆菌易于遗传操作，但它们在受试者(例如人)中不是有利的药物递送载体。有利的是，乳杆菌属的各种菌株已被联邦药物管理局(FDA)归类为一般认为安全(GRAS)，因此可以是用于药物输送的有利试剂。此外，基因组编辑技术诸如CRISPR可能具有永久引入非预期突变的脱靶效应，而本公开的乳杆菌属系统使得能够将药物局部递送到粘膜器官，通过定殖微生物的连续生产延长半衰期，并且降低生产成本。
在一些方面，本公开还提供了包括向受试者施用本公开的工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质(例如，炎症剂、抗炎剂、免疫调节剂、抗癌剂、代谢剂、抗病毒/杀病毒剂或抗菌/杀细菌剂)的方法。
施用本公开的任何工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质可将受试者中特定蛋白质的量相较于受试者中该蛋白质的基线水平增加至少5％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1,000％)。在一些实施方案中，施用本公开的任何工程化乳杆菌细胞(例如，益生菌细胞)导致受试者中异源蛋白质的产量比对照条件下产生的蛋白的量大至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
可使用任何合适的方法(例如，利用识别目标蛋白质的抗体的蛋白质印迹、免疫荧光或ELISA)在任何组织或器官(例如，血液、结肠、肺、心脏、粘液、汗液、精液、唾液等)中测量受试者中蛋白质(例如，异源蛋白质，包括治疗性蛋白质)的量。蛋白质的量可以在至少一剂(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100剂)本公开的任何工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质之后进行测量，并将其与所述蛋白质的基线或对照水平进行比较。
蛋白质的基线水平或对照水平可以指在施用本公开的任何工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质之前所述内源性蛋白质的量。作为非限制性实例，可在施用本公开的任何工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质之前的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、10个月或12个月内测定蛋白质的对照或基线水平。
通常，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫疾病的非限制性实例包括艾迪森氏病、丙种球蛋白缺乏血症、斑秃、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫血管性水肿、自身免疫性家族性自主神经异常、自身免疫脑脊髓炎、自身免疫肝炎、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫视网膜病、自身免疫荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、巴洛氏病、贝切特氏病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、巨淋巴结增生症(CD)、乳糜泻(Celiac disease)、查加斯疾病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss)、疤痕性类天疱疮(cicatricialpemphigoid)、耳蜗前庭综合征、冷凝集素病(Cold agglutinin disease)、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜伊红细胞性筋膜炎、结节性红斑、基本混合性冷球蛋白血症、伊万斯综合征、纤维肌痛、纤维化性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯综合征、肉芽肿病伴多血管炎(Granulomatosis with Polyangiitis)、格雷夫斯氏病、Guillain-Barre综合征、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(HSP)、妊娠疱疹或天疱疮妊娠(PG)、低丙球蛋白血症(Hypogammalglobulinemia)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病、Lambert-Eaton综合征、白细胞碎裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木质结膜炎、线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病、美尼尔氏病、显微镜下型多血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、穆伦溃疡、Mucha-Habermann病、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼表瘢痕化天疱疮、视神经炎、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、平坦部炎(周围葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎(Progesterone dermatitis)、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞发育不全(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、Schmidt综合征、巩膜炎、硬皮病、Sjogren综合征、精子及睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎(SO)、Takayasu动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(THS)、横断性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病(或肉芽肿病伴多血管炎(GPA))。
在一些实施方案中，本公开提供了向患有肠道炎症的受试者施用所述工程化乳杆菌属细胞或分泌的治疗性蛋白的方法。肠道炎症的实例包括但不限于克罗恩病、肠易激病(IBD)、肠易激综合征(IBS)和溃疡性结肠炎。例如，溃疡性结肠炎会导致大肠(结肠)和直肠最内层的长期炎症和溃疡。作为另一个实例，克罗恩病的特征在于消化道衬里的炎症，所述炎症通常会深入到受累组织中。
在一些实施方案中，向患有肠道炎症的受试者施用本公开的分泌抗炎细胞因子(例如抗TNFα)的工程化乳杆菌属细胞。在一些实施方案中，肠道炎症是克罗恩病。在一些实施方案中，肠道炎症是肠易激病。在一些实施方案中，肠道炎症是肠易激综合征。在一些实施方案中，肠道炎症是溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，施用工程化乳杆菌属可减少受试者的炎症至少10％(例如15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、70％、80％或90％)。可使用本领域公知的方法来监测炎症。例如，可使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测炎性细胞因子的水平。
在一些实施方案中，受试者患有病毒感染或微生物感染。病毒感染或微生物感染可影响任何组织或器官，包括肠道、皮肤、肺、鼻咽或女性生殖道。病毒感染的实例包括但不限于疏螺旋体属、恰加斯、基孔肯雅病、衣原体属、巨细胞病毒、登革热、埃博拉病毒、EBV、脑炎、猫白血病病毒、汉坦病毒、HBsAg、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、疱疹、HIV、HTLV、流感、拉沙病毒、疟疾、麻疹、腮腺炎、支原体属、诺如病毒、轮状病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、风疹、SARS、志贺样毒素、弓形虫属、密螺旋体属、伤寒沙门菌(S.Typhi,)、水痘、西尼罗河病毒和寨卡病毒。微生物感染的实例包括但不限于耶尔森氏菌属的某些种(Yersinia spp.)、埃希氏菌属的某些种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属的某些种(Klebsiella spp.)、不动杆菌属的某些种(Acinetobacter spp.)、博德特氏菌属的某些种(Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌属的某些种(Neisseria spp.)、气单胞菌属的某些种(Aeromonas spp.)、弗朗西斯氏菌属的某些种(Franciesella spp.)、棒状杆菌属的某些种(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌属的某些种(Citrobacter spp.)、衣原体属的某些种(Chlamydia spp.)、嗜血杆菌属的某些种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属的某些种(Brucella spp.)、分枝杆菌属的某些种(Mycobacterium spp.)、军团菌属的某些种(Legionella spp.)、红球菌属的某些种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属的某些种(Pseudomonas spp.)、螺杆菌属的某些种(Helicobacter spp.)、沙门菌属的某些种(Salmonella spp.)、弧菌属的某些种(Vibrio spp.)、芽孢杆菌属的某些种(Bacillusspp.)、丹毒丝菌属的某些种(Erysipelothrix spp.)、沙门菌属的某些种(Salmonellaspp.)、链霉菌属的某些种(Streptomyces spp.)、类杆菌属的某些种(Bacteroides spp.)、普雷沃菌属的某些种(Prevotellaspp.)、梭菌属的某些种(Clostridium spp.)、双歧杆菌属的某些种(Bifidobacterium spp)或乳杆菌属的某些种(Lactobacillus spp.)。
在一些实施方案中，向受试者施用乳杆菌属细胞组合物作为预防措施，以便例如微生物感染或病毒感染，诸如HIV感染。因此，在一些实施方案中，对乳杆菌属细胞进行工程改造以编码核酸，所述核酸编码抗微生物抗体或抗病毒抗体，诸如抗HIV病毒抗体。
在一些实施方案中，向患有疾病(例如，影响胃肠道、呼吸道、女性生殖道或其任意组合的疾病)的受试者施用本发明公开的产生一种或多种异源蛋白质的任何工程化乳杆菌属细胞，例如加氏乳杆菌(L.gasseri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌(L.casei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbreuckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、短乳杆菌(L.brevis)和瑞士乳杆菌)(L.helveticus)。工程化乳杆菌属细胞可调节宿主组织(例如，通过IL10的免疫调节作用或通过GLP1的激素作用)或中和病原体或毒素(例如，病毒或细菌)。作为非限制性实例，可向有此需要的受试者施用经工程改造以分泌hBD1、J3、抗志贺毒素纳米体或其组合的乳杆菌属细胞，以中和病原体、毒素或其任何组合。
在一些实施方案中，将乳杆菌属细胞和/或分泌蛋白质配制在药物组合物中。药物组合物可包含药物载体(例如脂质体或纳米载体)。药物组合物还可包含或可替代地包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性例子包括水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其组合。药学上可接受的赋形剂可包括磷酸盐缓冲盐水、碳酸氢盐溶液、防腐剂、稳定剂、乳化剂(例如磷脂乳化剂)、增溶剂(例如表面活性剂)或粘合剂。赋形剂可根据施用方式和途径以及标准制药实践来选择。
在本公开的药物组合物的配制和/或制备中的一般考虑可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用整体并入本文)中。
有效量或治疗有效量是单独地或与至少一种其它活性剂组合地赋予受试者以治疗效果所需的活性剂的量。如本领域技术人员所知，有效量根据施用途径、赋形剂使用以及与其他活性剂的共同使用而变化。施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体免疫系统的强度或遗传倾向。合适的剂量范围可由本领域技术人员容易地确定，并且可为微克级的本公开的多肽。本文公开的组合物的剂量可取决于施用途径，并根据受试者的体格而变化。
在一些情况下，向受试者施用至少一剂(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100剂)任何工程化乳杆菌属细胞(例如，益生菌细胞)或治疗性蛋白质。例如，一剂工程化乳杆菌属细胞可包含110^3至10^50(例如，10^6至10^20)个菌落形成单位(CFU)。
如本领域普通技术人员所理解的，给药方案可以根据多种因素(例如，要施用的组合物的类型，包括要施用的细菌的类型或菌株，要施用的蛋白质的类型等)而变化。给药方案的非限制性实例包括每天至少一剂、每隔一天至少一剂、每天至少两剂、每天至少三剂、每两天至少一剂、每三天至少一剂、每四天至少一剂、每五天至少一剂、每六天至少一剂、每周至少一剂或每月至少一剂。在一些实施方案中，每天一次、每隔一天一次或每周一次向受试者施用至少一剂(例如，一剂或三剂)任何工程化乳杆菌属细胞。本文所述的任何工程化乳杆菌属细胞或蛋白质的剂量可以随餐施用或不随餐施用。
合适的施用途径包括胃肠外、通过皮下注射或植入、静脉内、肌内、鞘内、腹膜内、皮内、胸骨内、关节内、颅内、病灶内、直肠内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内或肺内。或者，其他施用方式，包括栓剂、口服制剂、肠内、经鼻、局部或经粘膜施用可能是理想的。对于栓剂，粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯。口服制剂可包括通常使用的起始剂(incipients)，例如药物级的糖精、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式。作为非限制性实例，可将乳杆菌属细胞配制在肠溶胶囊、片剂、浆液或乳基食品中。
本领域普通技术人员将理解，合适的施用途径可取决于待施用的组合物的类型。例如，某些施用途径(例如肠胃外、静脉内或皮下施用)可能不适合向受试者施用细菌细胞，因为将细菌直接施用至血流中可能会导致败血症(不受特定理论的约束)。相反，肠胃外、静脉内或皮下施用可以适合于通过本文所述的任何方法产生的重组肽的施用。
如上所述，所需剂量取决于施用途径的选择；制剂的性质；受试者疾病的性质；受试者的物种、体格、体重、表面积、年龄和性别；正在服用的其他药物；以及医生的判断。合适的剂量范围为0.01-100.0mg/kg。鉴于可用组合物的多样性和各种施用途径的不同效率，预期所需剂量会有很大差异。例如，预期口服施用比通过静脉内注射施用需要更高的剂量。如本领域所熟知的，这些剂量水平的变化可使用标准的经验程序进行优化调整。将组合物包封在合适的递送媒介物(例如，聚合物微粒或可植入装置)中可提高递送效率，特别是对于口服递送。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使用氨基酸残基位置权重矩阵计算乳杆菌属菌株特异性信号肽序列(参见例如下面的实施例1)。可用于计算位置权重矩阵的一个示例性计算机程序是GLAM。在一些实施方案中，所述方法包括计算位置权重矩阵，并且进一步使用使得能够对SP函数进行预测性评分的算法，以在计算机中过滤潜在的非功能性变量(参见，例如，下面的实施例4)。
附加实施方案
本公开还提供了由编号段落包含的以下附加实施方案。
1.一种人工分泌信号肽，其包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11和SEQ ID No:7的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
2.段落1的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。
3.段落2的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。
4.段落3的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1标识的氨基酸序列相同。
5.段落1的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。
6.段落5的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。
7.段落6的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:3标识的氨基酸序列相同。
8.段落1的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。
9.段落8的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。
10.段落9的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:5标识的氨基酸序列相同。
11.段落1的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:7标识的氨基酸序列具有至少95％同一性。
12.段落11的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:7标识的氨基酸序列具有至少98％同一性。
13.段落12的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:11或SEQ IDNo:7标识的氨基酸序列7标识的氨基酸序列相同。
14.与段落1-13中任一项的人工分泌信号肽融合的蛋白质。
15.段落14的蛋白质，其中所述人工分泌信号肽与所述蛋白质的N末端融合。
16.段落14或15的蛋白质，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
17.段落16的蛋白质，其中所述蛋白质是抗体。
18.段落17的蛋白质，其中所述抗体与病毒抗原或微生物抗原特异性结合。
19.段落17或18的蛋白质，其中所述抗体是单结构域抗体
20.段落16的蛋白质，其中所述治疗性蛋白质是细胞因子。
21.段落20的蛋白质，其中所述细胞因子是IL-10。
22.一种核酸，其编码段落1-15中任一项的人工分泌信号肽或段落14-21中任一项的蛋白质。
23.段落22的核酸，其中所述核酸包含与编码所述蛋白质的核苷酸序列可操作连接的启动子。
24.段落23的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。
25.段落22-24中任一项的核酸，其中所述核酸已进行了密码子优化。
26.一种载体，其包含段落22-25中任一项的核酸。
27.段落26的载体，其中所述载体是表达载体。
28.一种工程化乳杆菌属细胞，其包含段落22-25中任一项的核酸或者段落26或27的载体。
29.段落28的工程化乳杆菌属细胞，其中所述工程化乳杆菌属细胞选自加氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌细胞。
30.一种生产蛋白质的方法，其包括在细胞培养基中培养段落28或29的工程化乳杆菌属细胞，以生产由所述核酸编码的蛋白质。
31.段落30的方法，其中所述工程化乳杆菌属细胞是鼠李糖乳杆菌GG(LGG)细胞。
32.段落30或31的方法，其中所述乳杆菌细胞每mL细胞培养基产生至少10μg所述蛋白质。
33.段落32的方法，其中所述乳杆菌属细胞每mL细胞培养基产生至少30μg所述蛋白质。
34.段落33的方法，其中还包括从细胞培养基中回收所述蛋白质。
35.通过段落33或34的方法产生的蛋白质。
36.一种方法，其包括向受试者施用段落28或29的工程化乳杆菌属细胞或者段落35的蛋白质。
37.段落36的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾患。
38.段落37的方法，其中所述自身免疫疾病是炎性肠病或克罗恩病。
39.段落36的方法，其中所述受试者患有病毒感染或微生物感染。
40.一种方法，其包括:
(a)为细菌菌株特异性序列库中的信号序列群计算氨基酸残基位置权重矩阵(PWM)；以及
(b)基于信号序列群的PWM产生共有信号肽序列。
41.段落40的方法，其中还包括(c)在所述细菌菌株的细胞中表达与包含该共有信号肽序列的信号肽连接的目标异源蛋白。
42.段落40或41的方法，其中所述细菌菌株选自耶尔森氏菌属的某些种、埃希氏菌属的某些种、克雷伯氏菌属的某些种、不动杆菌属的某些种、博德特氏菌属的某些种、奈瑟氏球菌属的某些种、气单胞菌属的某些种、弗朗西斯氏菌属的某些种、棒状杆菌属的某些种、柠檬酸杆菌属的某些种、衣原体属的某些种、嗜血杆菌属的某些种、布鲁氏菌属的某些种、分枝杆菌属的某些种、军团菌属的某些种、红球菌属的某些种、假单胞菌属的某些种、螺杆菌属的某些种、沙门菌属的某些种、弧菌属的某些种、芽孢杆菌属的某些种、丹毒丝菌属的某些种、沙门菌属的某些种、链霉菌属的某些种、类杆菌属的某些种、普雷沃菌属的某些种、梭菌属的某些种、双歧杆菌属的某些种或乳杆菌属的某些种。
43.段落42的方法，其中所述细菌细胞是益生菌细胞。
44.段落40-43中任一项的方法，其中所述目标异源蛋白质是治疗性蛋白质。
45.段落44的方法，其中所述治疗性蛋白质是抗体。
46.段落41-45中任一项的方法，其中编码与共有信号肽序列连接的目标异源蛋白质的核酸与诱导型启动子可操作地连接。
实施例
实施例1:能够从乳杆菌属分泌抗体片段的人工分泌信号的鉴定。
为了鉴定能够可靠地和可重现地分泌各种抗体片段的信号肽序列，进行了分泌信号的全基因组文库的高通量筛选，该文库是通过对具有已测序的基因组的所有乳杆菌属进行计算分析组装而来的。这构成了迄今为止最大的候选分泌信号肽库，扩大了基因转盘(genetic dial)可用于改善分泌的范围，也为平行方法提供了基础：所述文库可被压缩成模板序列，用于设计可潜在地在逐株基础上推广的人工信号，而不是依赖预先存在的分泌信号(其可能与其天然蛋白质伴侣共同进化)。将公开可用的基序发现算法用于分析文库的菌株特异性亚部分，以计算氨基酸残基位置权重矩阵(PWM)并产生最大概率肽。
由于鼠李糖乳杆菌GG和加氏乳杆菌是人微生物组(microbiome)(例如，在肠道和阴道粘膜中)中值得注意的益生菌，并且可用于人微生物组中的终点应用，所以对鼠李糖乳杆菌GG(图图1，图A)和加氏乳杆菌(图1，图B)进行了肽序列分析。首先选择每个菌株的PWM产生的最高概率序列(对于鼠李糖乳杆菌GG为SEQ ID NO:1，对于加氏乳杆菌为SEQ ID NO:3)，并使用由物种基因组制成的密码子使用表生成相应菌株特异性的和经密码子优化的核苷酸序列(对于鼠李糖乳杆菌GG为SEQ ID NO:2，对于加氏乳杆菌为SEQ ID NO:4)。然后，测试每个分泌信号肽在N末端融合至抗-HIV抗体片段1(J3VHH)时指导分泌的能力。值得注意的是，两种人工信号肽都指导J3VHH的分泌(图2，图A和B)。
迄今为止，还没有发现能够在加氏乳杆菌中分泌纳米体的天然存在的分泌信号。对于鼠李糖乳杆菌来说，公开的分泌信号肽优于最高产率的天然存在的序列两个数量级。通过质谱进一步证实了分泌，其中鼠李糖乳杆菌和加氏乳杆菌的蛋白质覆盖度分别为22.05％和59.84％(覆盖度的差异与相对分泌产率相关，如图2中所见)。此外，当分泌信号肽与针对其计算序列的菌株不匹配时，未观察到分泌，表明该策略的菌株特异性。同样值得注意的是，当这些序列由组成型启动子表达时，信号肽以破坏其功能的方式快速突变。然而，当被四环素诱导系统控制时，它们在遗传上保持稳定。
所公开的分泌信号肽也与其他抗体片段一起发挥作用，所述其他抗体片段包括已公开的第二抗-HIV
(JM4VHH)、由Ablynx(奥左拉珠单抗)销售的抗-TNFα
和已公开的抗-HIV单链片段3(其衍生自广泛中和IgG抗体VRC01(VRC01scFv))。在JM4VHH和奥左拉珠单抗的情况下，当融合到SEQ ID NO:3提供的分泌信号肽时，检测到由加氏乳杆菌分泌到上清液中的水平与J3VHH相同，而在VRC01scFv的情况下，该水平为J3VHH的一半(图3)。后一种蛋白质的产率降低可能是由于其大小为其它测试抗体片段的两倍的事实。
测试使用公开的分泌信号肽从乳杆菌属分泌的抗体片段，以确定抗体片段是否具有功能。通过Sec转位酶途径输出的蛋白质在合成和分泌过程中保持未折叠状态，只有在蛋白质释放到细胞壁中扩散到细胞外环境中时才开始折叠。因此，即使一种蛋白质被证明是分泌的，也没有迹象表明其是正确折叠和有功能的。因此，将测量与适当抗原的结合亲和力的测定用于确定分泌的抗体片段是否具有功能。
因此，通过使用测量与适当抗原的结合亲和力的测定直接测试功能来证实抗体片段被正确折叠。所有测试的抗HIV抗体都被证明能结合gp120-一种能协调与T细胞CD4受体的结合的病毒外壳蛋白。因此，在加氏乳杆菌中进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量对gp120的抗体结合亲和力(图4)，所述加氏乳杆菌包含在N末端与具有SEQ ID NO:3中提供的氨基酸序列的分泌信号融合的抗体片段。针对所有抗HIV抗体变体测量的结合曲线与之前公布的每个变体1-3的结果相当。使用Octet仪器实时测量结合动力学，通过生物层干涉测量法对功能进行二次验证。这些实验确证了测试的抗-HIV抗体的ELISA数据，报告的VRC01scFV、J3VHH和JM4VHH对于HIV-RSC3的KD值分别为10.22nM、75.55nM和110.9nM。值得注意的是，J3VHH和JM4VHH被证明与其它抗体变体(诸如VRC01)相比，与RSC3抗原的结合相对较弱。平行地，加氏乳杆菌分泌的奥左拉珠单抗对TNFα的结合经测量具有0.69nM±.26nM的KD(n＝3)。在这两种情况下，不具有预期结合活性的抗体被用作阴性对照(即，对于TNFα实验使用J3VHH，对于HIV实验使用奥左拉珠单抗)。阴性对照在所有验证实验中都没有可测量的结合活性。类似地，包含人工分泌信号的鼠李糖乳杆菌GG SP1(SEQ ID NO:1)分泌功能性J3VHH，如通过上述gp120 ELISA测定所确定的(图7)。通过生物层干涉法测量由Ablynx销售的抗TNFα抗体片段、由鼠李糖乳杆菌GG SP1分泌的奥左拉珠单抗的功能。该方法显示分泌的抗体片段以纳摩尔浓度亲和力(KD＝6.2nM，2个重复)与其靶蛋白结合，与Ablynx报道的奥左拉珠单抗活性相当(图11)。
在鼠李糖乳杆菌GG中具有可重现的功能性的另一种分泌信号肽是基于长度不同的另一种序列(对于鼠李糖乳杆菌GG SP2为30个氨基酸对比对于鼠李糖乳杆菌GG SP1为25个氨基酸)用SEQ ID NO:5(鼠李糖乳杆菌GG SP2)中提供的氨基酸序列鉴定的。将编码SEQID NO:5的核酸以SEQ ID NO:6提供。鼠李糖乳杆菌GG SP1和鼠李糖乳杆菌GG SP2均从鼠李糖乳杆菌分泌J3VHH(图5)。进行ELISA以测量鼠李糖乳杆菌GG SP2分泌的J3VHH是否具有功能。分析来自包含与J3VHH融合的鼠李糖乳杆菌GG SP2的工程化鼠李糖乳杆菌GG的上清液和纯化上清液，以测定分泌的J3VHH与gp120的结合亲和力。与阴性对照相比，来自包含与J3VHH融合的鼠李糖乳杆菌GG SP2的工程化鼠李糖乳杆菌GG的上清液和纯化的上清液中与gp120的结合显著更高，表明分泌的J3VHH具有功能(图6)。
生成了文献中报道的八种经典信号肽序列的预测的分泌对比测量的分泌的曲线(图8)。每一个天然存在的信号肽在N末端与荧光蛋白mCherry融合。在加氏乳杆菌中测试这些构建体，以确定每种天然存在的信号肽指导分泌的能力。分泌水平用纯化上清液中mCherry荧光的量来测量。图8展现出在鼠李糖乳杆菌GG中通过现有技术预期的分泌效率与实际测量的分泌之间缺乏相关性。对加氏乳杆菌观察到类似的结果，除了一种天然存在的分泌信号肽外，所有其它肽均未表现出可测量的分泌(图8)。仅检测到Lp3189的分泌信号肽的分泌。值得注意的是，包含SEQ ID NO:3(加氏乳杆菌SP1)中提供的氨基酸序列的人工分泌信号优于Lp3189的分泌信号肽(图9)。如图8中所示，图9中各分泌信号肽在N-末端与mCherry融合，用纯化上清液中mCherry荧光的量来测量分泌水平。加氏乳杆菌SP1(SEQ IDNO:3)与Lp3189的分泌信号肽相比，分泌超过3倍的mCherry水平。因此，SEQ ID NO:3能够比在加氏乳杆菌中测试的最高性能的天然存在的信号肽引导更多的分泌。
类似地，包含SEQ ID NO:5(鼠李糖乳杆菌GG SP2或LGG SP2)中提供的氨基酸序列的人工分泌信号优于图8中所示的LGG中的两个表现最好的分泌信号肽(Apf，Usp)。当与mCherry融合时，LGG SP2表现出在纯化上清液中的分泌水平为Usp和Apf的信号肽的1.5至2.75倍(图15)。值得注意的是，产生图9数据的实验是通过纯化50mL细菌培养物进行的，而图15中的数据是用5mL细菌培养物产生的。因此，图9和图15中使用的肽之间的绝对产率不能进行比较，但基于所使用的培养物的体积，可以预期10倍的差异。
实施例2:加氏乳杆菌SP1(SEQ ID NO:3)的的治疗适用性
TZM-bl测定用于确定由加氏乳杆菌SP1(SEQ ID NO:3)分泌的抗HIV抗体片段(J3VHH)是否能够保护HIV易感细胞免受HIV感染。测量J3VHH的结合(图10，图A)。将TZM-bl测定用于测量被抗体治疗保护的人HIV易感细胞的分数(图10，图B)。值得注意的是，乳杆菌SP1分泌的J3VHH表现出与文献1报道的常规生产的J3VHH相当的活性(IC50，加框的)。这表明可以基本相等的功能性生产已被证实的治疗性蛋白质。
实施例3:人工信号肽对抗志贺毒素抗体片段分泌的影响。
为了确定人工信号肽对抗志贺毒素(Stx2)抗体片段分泌的影响，将加氏乳杆菌SP1(SEQ ID NO:3)在N末端与三种不同的抗志贺毒素抗体片段中的每一种融合，并在加氏乳杆菌中进行测试。收集未纯化的上清液，通过蛋白质印迹三次重复检测未纯化上清液中每种抗体片段的分泌。抗志贺毒素(Stx2)单体是常规的单结构域抗体片段(17kDa)，二聚体(33.5kDa)和三聚体(48kDa)分别是两个和三个融合的单体。单体通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头融合产生二聚体和三聚体。将每种分泌的抗体片段暴露于抗纯化染色标签20分钟。如图12所示，加氏乳杆菌SP1分泌Stx2单体、Stx2二聚体和Stx2三聚体(图12)。
实施例4:通过机器学习进行的SP功能预测评分
下面提供了数据分析方法，该方法基于来自植物乳杆菌的异源(NucA)分泌文库的公开数据4进行训练，用于通过分析其组成氨基酸来预测信号肽功能。由于某些亚组的氨基酸的物理化学性质相似，它们可耐受肽序列中的相互替代(图13，图A)。功能特性包括与计算的分泌信号的C末端切割基序序列相似性、N末端序列基序长度、N末端序列基序亲水性、核心序列长度、核心序列疏水性、核心序列跨膜螺旋长度、核心序列跨膜螺旋度以及以下比率：核心序列跨膜螺旋长度/疏水序列长度。通过将这与由针对分泌信号肽产生的位置权重矩阵给出的序列概率配对，可以通过在计算机上鉴定表现不佳者来减少筛选中的变体数量。此外，作为机器学习技术，由其预测为强的序列的分泌筛选产生的任何测量数据可以被反馈到模型中，从而提高其对后续筛选的预测的准确性。通过奇异值分解的多维函数性质数据的线性判别分析的实例提供于图13(图B)中。通过机器学习对SP功能进行预测性评分的管线包括以下步骤:
1.使用SignalP生成给定菌株的天然分泌肽(SP)文库
2.使用GLAM为给定的天然SP文库生成共有序列；
3.给定共有位置宽度矩阵，生成人工SP文库；
4.用SVD-LDA预测人工SP文库成员功能；
5.过滤掉具有功能差可能性的SP；
6.执行功能筛选；以及
7.如果没有命中，则将测量数据反馈到步骤4并重新训练算法，重复预测。
实施例5:LGG的IL-10分泌
对鼠李糖乳杆菌GG(LGG)进行工程改造以分泌IL-10，部分是为了证明本公开的合成分泌信号与除
外的治疗有效载荷一起发挥作用。将先前与奥左拉珠单抗、伏巴鲁单抗(Vobari luzumab)、抗-
和荧光报告蛋白一起成功地使用的相同信号肽(SEQ ID NO:1)与IL-10融合。LGG可强劲地分泌具有相同信号肽的IL-10，每毫升培养上清液产生至少30μg细胞因子(图14)。本文报道的分泌水平至少是先前报道的3μg/mL分泌水平的10倍(Steidler,L等w2000.Science 289(5483):1352–55)。与乳酸乳杆菌不同，LGG不会被胆盐杀死，这使得其成为治疗性蛋白质(例如全长蛋白质、融合蛋白、肽等)的理想口服递送媒介物。
实施例6:加氏乳杆菌的第二功能性SP序列(加氏乳杆菌SP2，SEQ ID NO:7)
基于加氏乳杆菌的第二共有序列(SP2)测试另一种合成SP，其中将GLAM2预设为所有天然加氏乳杆菌信号肽的平均长度：33aa(图16)。
通过对来自表达与加氏乳杆菌SP2融合的J3-VHH的重组加氏乳杆菌的纯化上清液的蛋白质凝胶分析验证了加氏乳杆菌SP2，并将其与加氏乳杆菌SP1(SEQ ID No:3，长度＝30aa)进行比较。与加氏乳杆菌SP1(预期大小为14.3kD)相比，加氏乳杆菌SP2分泌相当(尽管略少)量的蛋白质(图17)。凝胶结果还表明没有可检测量的未切割的蛋白质，表明两种合成的SP都被信号肽酶I高效地加工。
分泌的产物被证实是有功能的，如通过利用未纯化上清液进行的抗gp120 ELISA所示(图18)。通过该测定指示的每CFU的结合强度也与通过凝胶针对加氏乳杆菌SP1相比于加氏乳杆菌SP2观察到的较低量的蛋白质相一致-表明较短的合成SP长度通常是所需的。
实施例7:给定的共有序列中允许的氨基酸取代的相关物理化学特征进行分析
本文显示至少两个合成信号肽序列在鼠李糖乳杆菌GG和加氏乳杆菌中功能性分泌异源蛋白质。在每个实例中，基于不同的共有序列生成完全不同的信号肽-一种基于给定物种的平均信号肽长度(SP2)，而另一种则设置了GLAM2共有软件来随机采样不同的长度并预测其本身的最佳长度(SP1)。为了比较这两个序列，将两个物理化学氨基酸特性(疏水性和螺旋度)相对于每个SP的基序(N末端亲水性头部序列、疏水性核心序列和C末端I型信号肽酶切割位点)绘图。图19A显示鼠李糖乳杆菌GG SP1(SEQ ID NO:1)的疏水性和螺旋度曲线，图19B显示鼠李糖乳杆菌GG SP2(SEQ ID NO:5)的疏水性和螺旋度曲线。图20A显示了加氏乳杆菌SP1(SEQ ID NO:3)的疏水性和螺旋度曲线，图20B显示了加氏乳杆菌SP2(SEQ IDNO:7)的疏水性和螺旋度曲线。
除了以下两个例外，对于每种菌株在SP1与SP2之间，亲水性N末端头部序列和I型信号肽酶切割位点的共有序列基本相同:(1)对于鼠李糖乳杆菌GG，与SP2相比，SP1的N-末端序列短1个K，这可能是与总长度成比例的差异；(2)对于加氏乳杆菌来说，切割位点的最后一个氨基酸在SP1中为S，在SP2中为T，然而这些氨基酸是相近的同源物(对应于上述保守氨基酸取代组e)，并且最终位置在该基序(即AXA-AX)中被认为是更可变的。
它们的疏水性核的含量不同，但仅在I、L和V(对应于上述保守氨基酸取代组a)以及A和G(对应于上述保守氨基酸取代组d)内具有关系相近的氨基酸取代(near-relativeamino acid substitution)-尽管长度减小，但仍产生相似的疏水性和螺旋度模式-有趣的是，尽管总长度减小，但保留了先前表征的在切割基序之前5-6个氨基酸开始的序列疏水性和螺旋度下降。这表明了信号肽加工对这一特征的假定重要性，这一点迄今尚未在已发表的文献中讨论过。因此，保留这些疏水性和螺旋度模式的氨基酸取代更有可能产生功能性SP变体。
实施例8:通过鼠李糖乳杆菌体内分泌IL10
进行概念验证实验以证明用合成信号肽工程改造的乳杆菌在体内表现出与体外相当的功能。在这种情况下，通过口服管饲，每天一次，连续5天用10^10CFU的重组鼠李糖乳杆菌GG接种健康小鼠(balb/c品系)，所述重组鼠李糖乳杆菌GG经工程改造以分泌IL10(使用LGG SP2，SEQ ID NO:5)。在此期间，给一组小鼠喂食含有0.1mg/mL脱水四环素的饮用水，所述脱水四环素诱导由对脱水四环素敏感的可开关启动子控制的SP2-IL10表达。另一组未提供任何诱导剂，用作阴性对照。第5天，处死小鼠，收获整个结肠组织，匀浆，并测量IL10分泌产率，与之前用培养上清液所进行的完全一样-利用纯化的IL10的标准曲线的IL10捕获ELISA。由于IL10在健康的结肠组织中天然表达，因此在其中未提供诱导剂的阴性对照中存在背景信号。然而，诱导使结肠IL10的水平升高了45％，并导致诱导的重组体将3.9ng IL10递送至整个结肠(图21)。
先前的工作表明，在DSS-结肠炎模型[5]中，通过每天17次向小鼠提供的分泌重组IL10的乳酸乳杆菌向整个结肠递送0.28ng IL10可使结肠炎症状减轻30％。令人惊讶的是，本文所用的重组鼠李糖乳杆菌GG，每天仅向小鼠提供一次，递送3.9ng IL10-因此，与以前的方法相比，在很短的时间内，IL10的递送量增加了约14倍，并且所需的细菌剂量要低得多。
实施例9:鼠李糖乳杆菌GG体外分泌GLP1
胰高血糖素样肽1(GLP1)是一种由结肠L细胞天然产生的内分泌激素，其可刺激胰岛素的产生，从而改善葡萄糖耐受性。其还有助于进食时的饱腹感，并已被观察到影响脂质代谢、逆转内皮功能障碍和降低心房血压。因此，已被提议作为糖尿病、肥胖症和心血管疾病的治疗候选物[6]。然而，GLP1在血流中迅速降解为无活性形式，并在口服施用时被消化。因此，工程化微生物以类似于在结肠中发生的天然GLP1表达的方式为GLP1递送提供了独特的机会。如此处所证明的，本公开的合成信号肽促进了GLP1的分泌，因此表明由小肽(2-5kDa)组成的激素是可通过本文提供的方法分泌的额外有效载荷类别。使用SP2对肠道共生体鼠李糖乳杆菌(SEQ ID NO:5)进行工程改造以在诱导下分泌GLP1。在体外通过脱水四环素诱导4小时后，在无细胞上清液中使用GLP1捕获ELISA测定，利用纯化的GLP1标准测量分泌的GLP1。令人惊讶的是，这种重组菌株可以分泌和递送高达5.3mg/ml GLP1(见图22和23)。
实施例10:加氏乳杆菌分泌hBD1
合成信号肽分泌的另一类蛋白质有效载荷是长度为10-50个氨基酸的小肽效应物-包括抗微生物肽和防御素。这类肽的一个示例性实例是人β防御素1(hBD1)。该肽是用于该应用的理想有效载荷，因为其对乳杆菌属无毒[7]，同时具有通过直接杀微生物活性和趋化驱动的效应免疫细胞募集的抗菌活性[8]。由人微生物群分泌的hBD1的应用可用于治疗这种细菌可被递送到的任何粘膜部位中的任何革兰阳性感染。本实验测试了来自利用SP1技术工程改造以分泌hBD1的诱导的重组加氏乳杆菌的上清液是否能够抑制致病菌株大肠杆菌ATCC 25922的生长。已知hBD1对该菌株的最小抑制浓度在5–10μg/mL之间[8]。以50∶50的比率将诱导6小时的来自加氏乳杆菌培养物的无细胞上清液与预生长至早期指数期(OD值为0.25至0.35)的大肠杆菌培养物混合。在37℃下进行20小时后，对未经修饰的加氏乳杆菌、分泌hBD1的加氏乳杆菌和乳杆菌属生长培养基(MRS)允许的大肠杆菌生长进行一式三份测量，并与背景光密度信号(在无大肠杆菌的MRS中)进行比较。令人惊讶的是，尽管WT加氏乳杆菌可能通过天然分泌的细菌素抑制细菌生长约32％，但分泌hBD1的加氏乳杆菌抑制大肠杆菌生长98％(图24)。
材料和方法
生长条件
当生长转化的培养物时，将乳杆菌属在红霉素选择下在37摄氏度或室温下用MRS培养基进行培养。当培养细胞用于生产蛋白质时，以任何浓度(可高达500ng/mL)加入无水四环素。通常，常规地生长细胞直至对数生长期中期(光密度＝0.4-0.6)，然后加入无水四环素直至达到稳定期(OD＝1-1.2)。生长的第二阶段可以在37摄氏度下数小时内发生，或者在室温下过夜。在摇动的充气培养箱中生长加氏乳杆菌。在厌氧条件下生长鼠李糖乳杆菌GG。
试剂
1.MRS培养基：将下面的55g混合物与1L蒸馏水混合，高压灭菌15分钟，
DifcoTM lactobacilli MRS琼脂
每升近似配方*
蛋白胨3号----------------------------10.0g
牛提取物-------------------------------10.0g
酵母提取物----------------------------5.0g
葡萄糖----------------------------------20.0g
聚山梨酯80---------------------------1.0g
柠檬酸铵-------------------------------2.0g
醋酸钠----------------------------------5.0g
硫酸镁----------------------------------0.1g
硫酸锰----------------------------------0.05g
磷酸氢二钾----------------------------2.0g
通过检查瓶底的棕色糖浆来确保培养基未焦糖化
2.MRS琼脂：MRS培养基配方+1.5％w/v的BactoAgar，高压灭菌15分钟
3.甘氨酸原液：将20g甘氨酸与100mL蒸馏水混合，用0.22μM滤膜过滤灭菌。
4.电穿孔调节剂1：0.5M蔗糖，7M磷酸钾，1mM氯化镁蒸馏水溶液；用0.22μm滤膜过滤灭菌。
5.电穿孔调节剂2：925mM蔗糖，3.5mM氯化镁蒸馏水溶液；用0.22μm滤膜过滤灭菌。
6.恢复培养基1：用20mM氯化镁、2mM氯化钙补充MRS培养基的等分试样；用0.22μm滤膜过滤灭菌。
7.恢复培养基2：用0.5M蔗糖、0.1M氯化镁补充MRS培养基的等分试样；用0.22μm滤膜过滤灭菌。
8.STE培养基：6.7％蔗糖，50mM Tris-Cl pH 8,1mM EDTA；用0.22μm滤膜过滤灭菌。
将构建体引入乳杆菌属的方法
1.在MRS培养基中接种乳杆菌属的预培养物，每次转化需要1mL
2.根据菌株的要求，培养过夜或培养至一定密度(光密度为1.0或更高)，例如：
a.鼠李糖乳杆菌GG：37℃，在装有2.5g钯催化剂的厌氧罐中，并补充了适用于厌氧培养的BD GASPAKTM(Ref#260683)
b.加氏乳杆菌：37℃，好氧条件
3.在补充有甘氨酸原液至0.25-2.5％的终浓度的MRS培养基中以1/10稀释度存在的继代培养预培养物(在逐株基础上优化的)
a.鼠李糖乳杆菌GG：2％甘氨酸
b.加氏乳杆菌：0.5％甘氨酸
4.孵育至0.25的光密度
5.暂停孵育，用0-20μg氨苄青霉素补充培养基
a.鼠李糖乳杆菌GG：10μg
b.加氏乳杆菌：0μg
6.孵育至0.5的光密度
7.在4-21℃的环境温度下，通过以2000-6000G离心15分钟来沉淀细胞
a.鼠李糖乳杆菌GG：5000G,21℃
b.加氏乳杆菌：3500G,4℃
8.用0.5倍体积的电穿孔调节剂机械重悬细胞，并简单混合(调节剂的选择应根据菌株进行优化)
a.鼠李糖乳杆菌GG：电穿孔调节剂1
b.加氏乳杆菌：电穿孔调节剂2
9.按照步骤7沉淀细胞
10.按照步骤8重复洗涤
11.按照步骤7沉淀细胞
12.每10mL原始MRS+甘氨酸培养体积用100uL电穿孔调节剂机械重悬细胞
13.将100uL重悬细胞等分至在冰上预冷却的0.2cm电穿孔杯中
14.将1-5uL质粒DNA与50-500ng溶解在TE缓冲液中的DNA(根据菌株优化的输入DNA量)混合
a.鼠李糖乳杆菌GG：100-200ng DNA
b.加氏乳杆菌：400ng DNA
15.根据使用的电穿孔调节剂，在以下条件下进行电穿孔
a.电穿孔调节剂1–峰值电压：1.7kV,电容：25uF，并联电阻：200ohm
b.电穿孔调节剂2–峰值电压：1.5kV,电容：25uF，并联电阻：800ohm
16.根据使用的电穿孔调节剂，在以下条件下重悬电穿孔的细胞
a.电穿孔调节剂1–3mL回收培养基1
b.电穿孔调节剂2–1mL回收培养基2
17.根据细胞生长条件通过孵育回收细胞，持续2-4小时
a.鼠李糖乳杆菌GG：3小时
b.加氏乳杆菌：2小时
18.将100uL回收的细胞(或其浓缩物/稀释液)涂铺在补充有针对质粒的选择标记的适当抗生素浓度的MRS琼脂上，例如：
a.鼠李糖乳杆菌GG：10μg/mL红霉素
b.加氏乳杆菌：4μg/mL红霉素
19.在与用于所选菌株的液体培养相同的生长条件下孵育48-72小时
a.鼠李糖乳杆菌GG：37℃，在装有2.5g钯催化剂并补充了适用于厌氧培养的BDGASPAKTM(Ref#260683)的厌氧罐中进行48小时
b.加氏乳杆菌：37℃，好氧条件，进行72小时
20.对于转化后的DNA诊断
a.鼠李糖乳杆菌GG：挑选1uL菌落生物量，并重悬于16uL STE缓冲液(pH 8)+1.6uL溶菌酶+2uL蛋白酶K+0.4uL变溶菌素中以进行裂解。在37℃孵育30分钟。在PCR反应中使用0.5-1uL裂解材料作为模板，或根据需要使用整个体积进行基于RCA的Sanger测序。
b.加氏乳杆菌：挑选整个菌落生物量，重悬于补充有选择性抗生素的3mL MRS培养基中，生长24-48小时，直至光密度为1.0。在PCR反应中直接使用0.5-1uL培养物作为模板，或者按照标准技术(例如
Miniprep)从液体中提取完整的质粒DNA
c.
计算人工分泌序列的方法
1)将SignalP用于从我们希望对其分泌进行工程改造的给定菌株的蛋白质组(来源于NCBI蛋白质组数据库)(即对于鼠李糖乳杆菌SP 1和鼠李糖乳杆菌SP 2为鼠李糖乳杆菌蛋白质组，对于加氏乳杆菌SP为加氏乳杆菌蛋白质组)中计算挖掘所有可能的、天然的SP序列。
2)生成天然SP序列的氨基酸fasta文件，并将其以所需的共有序列长度(鼠李糖乳杆菌SP 1使用25的长度，鼠李糖乳杆菌SP2使用30的长度，加氏乳杆菌SP 1使用30的长度)放入GLAM中。通常，使用步骤1中生成的天然SP库的平均长度。
3)在给定FASTA文件和期望长度(最可能的共有序列)的情况下，GLAM为可能的共有序列生成位置权重矩阵。取每个给定序列位置的最大概率氨基酸并将其用作人工SP序列-如图1中序列标志图像中最上面的字母所示。
序列
鼠李糖乳杆菌GG SP1
MKKKLLALALLALLLAGCGQVSAAT(SEQ ID NO:1)
鼠李糖乳杆菌GG SP1核酸
ATGAAGAAGAAATTGTTGGCATTGGCATTGTTGGCATTGTTGTTGGCAGGCTGCGGCCAAGTTTCAGCAGCAACC(SEQ ID NO:2)
加氏乳杆菌SP1
MKKKLLSLGAALALLGLSLTACSNTAKAAS(SEQ ID NO:3)
加氏乳杆菌SP1核酸
ATGAAAAAAAAATTATTATCATTAGGTGCTGCTTTAGCTTTATTAGGTTTATCATTAACTGCTTGTTCAAATACTGCTAAAGCTGCTTCA(SEQ ID NO:4)
鼠李糖乳杆菌GG SP2
MKKLLLLLVVLLGLAALLLSGCGTSVSAAT(SEQ ID NO:5)
鼠李糖乳杆菌GG SP2核酸
ATGAAAAAATTGTTGTTGTTGTTGGTTGTTTTGTTGGGCTTGGCAGCATTGTTGTTGTCAGGCTGCGGCACCTCAGTTTCAGCAGCAACC(SEQ ID NO:6)
加氏乳杆菌SP2
MKKKLIVLLAALALLFGLGLALTCSSNTAKAAS(SEQ ID NO:7)
加氏乳杆菌SP2核酸
ATGAAAAAAAAATTGATTGTTTTGTTGGCAGCATTGGCATTGTTGTTTGGCTTGGGCTTGGCATTGACCTGCTCATCAAATACCGCAAAAGCAGCAACC(SEQ ID NO:8)
GLP1：
HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:9)
HBD1:
GNFLTGLGHRSDHYNCISSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(SEQ ID NO:10)
加氏乳杆功SP3
MKKKLIVLLAALALLFGLGLALTCSSNTAKAAT(SEQ ID NO:11)
参考文献
1.McCoy,L.E.et al.J.Exp.Med.209,1091–1103(2012).
2.Matz,J.et al.J.Virol.87,1137–1149(2013).
3.Mata-Fink,J.et al.J.Mol.Biol.425,444–456(2013).
4.Mathiesen,G.et al.BMC Genomics 10,425(2009).
5.Steidler et al.Science 2000
6.Ryan et al.Nature Scientific Reports 2017
7.Lebeer,S.et al.Microbiology Biotechnology 4(3)(2010)
8.Wu Z.et al.PNAS 100(15),8880-8885(2003)
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请针对其各自被引用的主题通过引用并入本文，在某些情况下，所述参考文献、专利和专利申请可涵盖整个文档。
除非明确相反地指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/种(a)”和“该/所述”应理解为表示“至少一个/种”。
还应当理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括一个以上的步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡短语，例如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......组成”等，都应理解为开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语。
数值前的术语“约”和“基本上”是指所述数值的±10％。
在提供数值范围的情况下，在该范围的上端和下端之间的每个值在本文中被具体地涵盖和描述。
序列表
<110> President and Fellows of Harvard College
<120> 用于异源蛋白质生产的人工分泌肽
<130> H0498.70651WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/691,553
<151> 2018-06-28
<150> US 62/676,203
<151> 2018-05-24
<150> US 62/584,367
<151> 2017-11-10
<150> US 62/575,350
<151> 2017-10-20
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Met Lys Lys Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Cys Gly Gln Val Ser Ala Ala Thr
20 25
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
atgaagaaga aattgttggc attggcattg ttggcattgt tgttggcagg ctgcggccaa 60
gtttcagcag caacc 75
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Met Lys Lys Lys Leu Leu Ser Leu Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Ala Cys Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
atgaaaaaaa aattattatc attaggtgct gctttagctt tattaggttt atcattaact 60
gcttgttcaa atactgctaa agctgcttca 90
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Leu Gly Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ser Gly Cys Gly Thr Ser Val Ser Ala Ala Thr
20 25 30
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
atgaaaaaat tgttgttgtt gttggttgtt ttgttgggct tggcagcatt gttgttgtca 60
ggctgcggca cctcagtttc agcagcaacc 90
<210> 7
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Met Lys Lys Lys Leu Ile Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Gly Leu Gly Leu Ala Leu Thr Cys Ser Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala
20 25 30
Ser
<210> 8
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
atgaaaaaaa aattgattgt tttgttggca gcattggcat tgttgtttgg cttgggcttg 60
gcattgacct gctcatcaaa taccgcaaaa gcagcaacc 99
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
20 25 30
Val Lys Gly Arg Gly
35
<210> 10
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Gly Asn Phe Leu Thr Gly Leu Gly His Arg Ser Asp His Tyr Asn Cys
1 5 10 15
Ile Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr
20 25 30
Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys
35 40 45
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met Lys Lys Lys Leu Ile Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Gly Leu Gly Leu Ala Leu Thr Cys Ser Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala
20 25 30
Thr
Claims (32)
1.一种人工分泌信号肽，其包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:7中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:7中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性。
3.根据权利要求2的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:7中任一个的氨基酸序列具有至少98％同一性。
4.根据权利要求3的人工分泌信号肽，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11和SEQ ID No:7中的任一个的氨基酸序列。
5.一种与权利要求1-4中任一项的人工分泌信号肽融合的蛋白质。
6.根据权利要求5的蛋白质，其中所述人工分泌信号肽与所述蛋白质的N末端融合。
7.根据权利要求5或6所述的蛋白质，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
8.根据权利要求7的蛋白质，其中所述蛋白质是抗体，任选地，其中所述抗体与病毒抗原或微生物抗原特异性结合。
9.根据权利要求7的蛋白质，其中所述治疗性蛋白质是细胞因子，任选地，其中所述细胞因子是IL-10。
10.根据权利要求7的蛋白质，其中所述治疗性蛋白质是内分泌激素，任选地，其中所述内分泌激素是胰高血糖素样肽1(GLP1)。
11.根据权利要求7的蛋白质，其中所述治疗性蛋白质是抗微生物肽，任选地其中所述抗微生物肽是人β防御素1(hBD1)。
12.一种核酸，其编码权利要求1-4中任一项的人工分泌信号肽或权利要求5-11中任一项的蛋白质。
13.根据权利要求22的核酸，其中所述核酸包含与编码所述蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子。
14.一种工程化乳杆菌属细胞，其包含权利要求12或13的核酸。
15.根据权利要求14的工程化乳杆菌属细胞，其中所述工程化乳杆菌属细胞选自加氏乳杆菌(L.gasseri)细胞和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)细胞。
16.一种生产蛋白质的方法，其包括在细胞培养基中培养权利要求14或15的工程化乳杆菌属细胞，以生产由所述核酸编码的蛋白质。
17.根据权利要求16的方法，其中所述工程化乳杆菌属细胞是鼠李糖乳杆菌GG(LGG)细胞。
18.根据权利要求16或17的方法，其中所述乳杆菌属细胞每mL细胞培养基产生至少10μg所述蛋白质。
19.根据权利要求16-18中任一项的方法，其还包括从所述细胞培养基中回收所述蛋白质。
20.一种方法，其包括向受试者施用权利要求14或15的工程化乳杆菌属细胞。
21.根据权利要求20的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾患。
22.根据权利要求21的方法，其中所述自身免疫性疾患是炎性肠病，任选地，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。
23.根据权利要求20的方法，其中所述受试者患有微生物感染。
24.一种方法，其包括:
(a)为细菌菌株特异性序列库中的信号序列群计算氨基酸残基位置权重矩阵；以及
(b)基于信号序列群体的PWM产生共有信号肽序列。
25.根据权利要求24的方法，其还包括(c)在所述细菌菌株的细胞中表达与包含所述共有信号肽序列的信号肽连接的目标异源蛋白质，任选地其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质。
26.一种方法，其包括向患有炎症性肠病的受试者施用工程化鼠李糖乳杆菌属细胞，所述细胞包含编码与源自鼠李糖乳杆菌的人工分泌信号肽融合的抗炎细胞因子的核酸。
27.根据权利要求26的方法，其中所述人工分泌信号肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求26的方法，其中所述人工分泌信号肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
29.根据权利要求26-28中任一项的方法，其中所述抗炎细胞因子是IL10。
30.根据权利要求26-29中任一项的方法，其中所述核酸包含与编码与人工分泌信号肽融合的抗炎细胞因子的核苷酸序列可操作地连接的诱导型启动子。
31.根据权利要求26-29中任一项的方法，其中由所述工程化鼠李糖乳杆菌细胞在受试者中产生的抗炎细胞因子的量，任选地在单剂量的所述工程化鼠李糖乳杆菌细胞后，是在对照条件下产生的抗炎细胞因子的量的至少2倍、至少5倍或至少10倍，任选地其中所述对照条件包括经工程改造而分泌所述抗炎细胞因子的乳杆菌属细胞。
32.根据权利要求26-31中任一项的方法，其中所述受试者中存在的结肠IL10的水平，任选地在单剂量的所述工程化鼠李糖乳杆菌细胞之后相对于基线升高了至少25％、至少35％或至少45％。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762575350P | 2017-10-20 | 2017-10-20 | |
| US62/575,350 | 2017-10-20 | ||
| US201762584367P | 2017-11-10 | 2017-11-10 | |
| US62/584,367 | 2017-11-10 | ||
| US201862676203P | 2018-05-24 | 2018-05-24 | |
| US62/676,203 | 2018-05-24 | ||
| US201862691553P | 2018-06-28 | 2018-06-28 | |
| US62/691,553 | 2018-06-28 | ||
| PCT/US2018/056610 WO2019079663A1 (en) | 2017-10-20 | 2018-10-19 | ARTIFICIAL SECRETING PEPTIDES FOR THE PRODUCTION OF HETEROLOGOUS PROTEINS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111491657A true CN111491657A (zh) | 2020-08-04 |
Family
ID=66173492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880081319.8A Pending CN111491657A (zh) | 2017-10-20 | 2018-10-19 | 用于异源蛋白质生产的人工分泌肽 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11530433B2 (zh) |
| EP (1) | EP3697428A4 (zh) |
| JP (1) | JP7330517B2 (zh) |
| KR (1) | KR20200077534A (zh) |
| CN (1) | CN111491657A (zh) |
| WO (1) | WO2019079663A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022198019A1 (en) * | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Tenza, Inc. | Synthetic pre-protein signal peptides for directing secretion of heterologous proteins in bacillus bacteria |
| WO2023220708A2 (en) * | 2022-05-12 | 2023-11-16 | Tenza, Inc. | Synthetic pre-protein signal peptides for directing secretion of heterologous proteins in escherichia bacteria |
| DE102022119024A1 (de) * | 2022-07-28 | 2024-02-08 | INM - Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Neuartige genetische Werkzeuge |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002017357A (ja) * | 2000-07-04 | 2002-01-22 | Calpis Co Ltd | アンカーペプチド、融合蛋白質、及び蛋白質の固定化方法 |
| WO2011160062A2 (en) * | 2010-06-17 | 2011-12-22 | The Usa As Represented By The Secretary, National Institutes Of Health | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5733540A (en) | 1995-03-08 | 1998-03-31 | Lee; Peter Poon-Hang | Protection from viral infection via colonization of mucosal membranes with genetically modified bacteria |
| US6093394A (en) | 1997-04-11 | 2000-07-25 | Gynelogix, Inc. | Vaginal lactobacillus medicant |
| AU2003276822A1 (en) | 2002-03-08 | 2004-02-02 | Osel, Inc. | Lactobacilli expressing biologically active polypeptides and uses thereof |
| WO2007019901A1 (en) | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Unilever N.V. | Food products comprising probiotic micro-organisms and antibodies |
| US20080051317A1 (en) | 2005-12-15 | 2008-02-28 | George Church | Polypeptides comprising unnatural amino acids, methods for their production and uses therefor |
| WO2009143309A2 (en) | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Trustees Of Dartmouth College | Female reproductive tract and anal prophylaxes |
| WO2010077682A2 (en) | 2008-12-08 | 2010-07-08 | James Allen Lemke | Treatment of hiv and aids using probiotic lactobacillus reuteri |
| US9073990B2 (en) * | 2010-04-05 | 2015-07-07 | Bar-Llan University | Protease-activatable pore-forming polypeptides |
| GB2482536B (en) | 2010-08-05 | 2013-07-24 | Hera Pharmaceuticals Inc | Expression of antibody or a fragment thereof in lactobacillus |
| US10533231B2 (en) * | 2012-10-26 | 2020-01-14 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Artificial bioluminescent enzyme |
| WO2015116933A2 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof |
| CN117535350A (zh) | 2016-05-20 | 2024-02-09 | 哈佛学院董事及会员团体 | 年龄相关疾病和病症的基因治疗方法 |
| RU2021135949A (ru) | 2016-09-13 | 2022-04-14 | Интрексон Актобиотикс Н.В. | Мукоадгезивный микроорганизм |
-
2018
- 2018-10-19 CN CN201880081319.8A patent/CN111491657A/zh active Pending
- 2018-10-19 JP JP2020522356A patent/JP7330517B2/ja active Active
- 2018-10-19 KR KR1020207014298A patent/KR20200077534A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-10-19 EP EP18869030.9A patent/EP3697428A4/en active Pending
- 2018-10-19 US US16/757,687 patent/US11530433B2/en active Active
- 2018-10-19 WO PCT/US2018/056610 patent/WO2019079663A1/en unknown
-
2022
- 2022-11-14 US US18/055,044 patent/US20230257794A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002017357A (ja) * | 2000-07-04 | 2002-01-22 | Calpis Co Ltd | アンカーペプチド、融合蛋白質、及び蛋白質の固定化方法 |
| WO2011160062A2 (en) * | 2010-06-17 | 2011-12-22 | The Usa As Represented By The Secretary, National Institutes Of Health | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200077534A (ko) | 2020-06-30 |
| EP3697428A4 (en) | 2021-11-24 |
| EP3697428A1 (en) | 2020-08-26 |
| US11530433B2 (en) | 2022-12-20 |
| US20230257794A1 (en) | 2023-08-17 |
| JP7330517B2 (ja) | 2023-08-22 |
| WO2019079663A1 (en) | 2019-04-25 |
| WO2019079663A8 (en) | 2019-06-13 |
| US20200270666A1 (en) | 2020-08-27 |
| JP2021500035A (ja) | 2021-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230257794A1 (en) | Artificial secretion peptides for heterologous protein production | |
| US9732143B2 (en) | Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria | |
| US7833791B2 (en) | Lactobacilli expressing biologically active polypeptides and uses thereof | |
| JP5787298B2 (ja) | 膜に提示したタンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 | |
| AU2020218748B2 (en) | A genetically modified lactobacillus and uses thereof | |
| CN113490686A (zh) | 病原体结合蛋白 | |
| CN113330120A (zh) | 利用源自干酪乳杆菌的两种启动子共表达两种靶蛋白的表面表达载体以及使用其在微生物表面上表达蛋白质的方法 | |
| JP2021137021A (ja) | 遺伝子発現カセット及びそれを含む発現ベクター | |
| WO2015078840A1 (en) | Full and partial protein secretion and cell surface display using type iii secretion system | |
| US20160000901A1 (en) | Compositions and Methods for the Production of Virus-Like Particles | |
| Pourhassan et al. | Biotechnological applications of type 1 secretion systems | |
| Jester et al. | Expression and manufacturing of protein therapeutics in spirulina | |
| US8754198B2 (en) | Modified food grade microorganism for treatment of inflammatory bowel disease | |
| JP2021527047A (ja) | 消化管系へのペイロード送達のための、ｂｔｎｌ３／８を標的とする構築物 | |
| US20210309984A1 (en) | ChiA Enzyme | |
| CN113330119A (zh) | 使用源自干酪乳杆菌的半乳糖变旋酶基因启动子用于组成型高表达的表面表达载体及其用途 | |
| CN106928364B (zh) | 一种FAP纳米抗体Nb26 | |
| WO2022071581A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合ペプチド | |
| US20230210964A1 (en) | Compositions and methods for detoxifying bacterial endotoxins and hydrogen sulfide by recombinant fusion enzymes | |
| US20240150440A1 (en) | Constructs comprising single domain vhh antibodies against sars cov-2 | |
| WO2021221136A1 (ja) | 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体 | |
| WO2021221137A1 (ja) | 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を用いた医薬品及び検査キット | |
| JP2007236237A (ja) | ベクターライブラリーの製造方法、人工ポリクローナル抗体の製造方法、及び医薬組成物の製造方法 | |
| CN117088972A (zh) | 一种靶向SARS-CoV-2RBD蛋白的鲨源纳米抗体和应用 | |
| CN116120443A (zh) | 靶向SARS-CoV-2 RBD与其受体ACE2共享表位的驼源纳米抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200804 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |