KR20200077534A - 이종 단백질 생성을 위한 인공 분비 펩티드 - Google Patents

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KR20200077534A
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아니크 뎁나스
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본원에는, 일부 실시양태에서, 예컨대 치료 단백질을 포함하는 이종 단백질을 생성하는데 사용하기 위해 락토바실루스로부터 분비를 지시할 수 있는 인공 분비 펩티드가 제공된다.

Description

이종 단백질 생성을 위한 인공 분비 펩티드
관련 출원
본 출원은 2017년 10월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/575,350, 2017년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/584,367, 2018년 5월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 62/676,203 및 2018년 6월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/691,553에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 후원 연구
본 발명은 에너지부에 의해 수여된 승인 번호 DE-FG02-02ER63445 하에서 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
배경
대부분의 분비 단백질은 분비 경로에서 막을 가로지르는 전위를 지시하는 N-말단 신호 펩티드를 갖는다. 이들 펩티드는 일반적으로 15 내지 60개의 아미노산 길이이며, 전형적으로 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 N-말단 영역, 중심 소수성 영역 및 짧은 C-말단 영역을 특징으로 할 수 있다. 박테리아를 포함하는 원핵생물에서, 분비 신호 펩티드는 종종 Sec 트랜스로카제를 통해 세포 외수송을 지시한다. 사실상, Sec 경로를 통해 외수송되는 모든 단백질은 그의 고유의 분비 신호에 결합된다.
본원에는, 다양한 상이한 치료 단백질의 효율적이고 강력한 생성을 가능하게 하는 다목적 인공 분비 신호 펩티드가 제공된다. 기존의 치료 단백질 생성 기술은 주로 작은 세트의 자연-발생 분비 신호 펩티드의 사용에 의존한다. 그러나, 이들 자연-발생 펩티드의 성능은 종종 예측할 수 없어서 비효율적인/비효과적인 외수송 및/또는 접히지 않은/잘못 접힌 단백질을 초래한다. 또한, 이러한 분비 신호 펩티드의 성능이 상이한 단백질들 사이에서 반드시 전달될 수 있는 것이 아니다. 예컨대 하나의 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드는 종종 또 다른 것의 분비를 촉진할 수 없다. 또한, 하나의 박테리아 균주에서 기능적으로 단백질을 분비하는 이전에 특징규명된 천연 신호 펩티드는 종종 다른 밀접하게 관련된 박테리아 균주에서 동일한 단백질의 분비를 촉진하지 못한다. 본 개시내용의 인공 분비 신호 펩티드는 다양한 이종 단백질 (예컨대, 치료 단백질)의 분비를 확실하게 촉진한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 7 중 어느 하나에 의해 확인되는 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호 펩티드가 락토바실루스로부터 기능적 이종 단백질의 분비를 지시할 수 있다는 것을 보여주는 예상치 못한 데이터에 기초한다.
따라서, 본원에는, 일부 측면에서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호 펩티드가 제공된다.
또한, 본원에는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 단백질 (예컨대, 치료 단백질)이 제공된다.
또한, 본원에는 인공 분비 신호 펩티드 또는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다.
또한, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터 및 세포 (예컨대, 락토바실루스 세포)를 제공한다.
본 개시내용은 또한 단백질을 생성하는 방법, 단백질을 포함하는 조성물, 및 조성물 및 단백질을 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 (a) 박테리아 균주-특이적 서열의 라이브러리 내의 신호 서열의 집단에 대한 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스 (position weight matrix: PWM)를 계산하는 단계, 및 (b) 신호 서열의 집단에 대한 PWM에 기초하여 컨센서스 신호 펩티드 서열을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (c) 박테리아 균주의 세포에서 컨센서스 신호 펩티드 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된 관심의 이종 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 박테리아 균주는, 예컨대 예르시니아 종 (Yersinia spp.), 에쉐리키아 종 (Escherichia spp.), 크렙시엘라 종 (Klebsiella spp.), 아시네토박테르 종 (Acinetobacter spp.), 보르데텔라 종 (Bordetella spp.), 네이세리아 종 (Neisseria spp.), 아에로모나스 종 (Aeromonas spp.), 프란시에셀라 종 (Franciesella spp.), 코리네박테리움 종 (Corynebacterium spp.), 시트로박테르 종 (Citrobacter spp.), 클라미디아 종 (Chlamydia spp.), 헤모필루스 종 (Hemophilus spp.), 브루셀라 종 (Brucella spp.), 미코박테리움 종 (Mycobacterium spp.), 레기오넬라 종 (Legionella spp.), 로도코쿠스 종 (Rhodococcus spp.), 슈도모나스 종 (Pseudomonas spp.), 헬리코박테르 종 (Helicobacter spp.), 살모넬라 종 (Salmonella spp.), 비브리오 종 (Vibrio spp.), 바실루스 종 (Bacillus spp.), 에리시펠로트릭스 종 (Erysipelothrix spp.), 살모넬라 종, 스트렙토미세스 종 (Streptomyces spp.), 박테로이데스 종 (Bacteroides spp.), 프레보텔라 종 (Prevotella spp.), 클로스트리디움 종 (Clostridium spp.), 비피도박테리움 종 (Bifidobacterium spp.), 또는 락토바실루스 종 (Lactobacillus spp.)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 프로바이오틱 세포이다.
일부 실시양태에서, 관심의 이종 단백질은 치료 단백질, 예컨대 항체이다. 예컨대, 항체는 숙주 조직 항원 (예컨대, TNFα, 또는 상피 또는 점막 표면 단백질) 또는 외래 항원 (예컨대, 병원성 박테리아, 바이러스, 및 독소 단백질)에 지시될 수 (특이적일 수) 있다.
일부 실시양태에서, 컨센서스 신호 펩티드 서열에 작동적으로 연결된 관심의 이종 단백질을 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 개시내용의 다른 측면은 염증성 장 질환을 갖는 대상체에게 락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)로부터 유래되는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 항-염증성 시토카인을 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 락토바실루스 람노수스를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인공 분비 신호 펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인공 분비 신호 펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-염증성 시토카인은 IL10이다.
일부 실시양태에서, 조작된 락토바실루스 람노수스 세포에 의해 대상체에서 생성되는 항-염증성 시토카인의 양은, 임의적으로 조작된 락토바실루스 람노수스 세포의 단일 용량 후, 대조 조건 하에서 생성되는 항-염증성 시토카인의 양보다 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 크다. 일부 실시양태에서, 대조 조건은 항-염증성 시토카인을 분비하도록 조작된 락토바실루스 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 존재하는 결장 IL10의 수준은, 임의적으로 조작된 락토바실루스 람노수스 세포의 단일 용량 후, 기준선 (조작된 엘. 람노수스 (L. rhamnosus) 세포 투여 전 3개월 이내의 평균 IL10 수준)과 비교하여 적어도 25%, 적어도 35%, 또는 적어도 45% 증가된다.
도 1은 락토바실루스에 대한 분비 신호 펩티드의 각각 위치에서 각각의 아미노산의 확률을 나타내는 서열 로고를 포함한다. 서열 로고는 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스 (PWM)를 계산함으로써 생성되었다. 패널 a: 엘. 람노수스에 대한 분비 신호 펩티드 (엘. 람노수스 SP1)에 대한 서열 로고를 도시한다. 패널 b: 엘. 가세리에 대한 분비 신호 펩티드 서열 (엘. 가세리 SP1)에 대한 서열 로고를 도시한다. 패널 c: 엘. 람노수스에 대한 분비 신호 펩티드 서열 (엘. 람노수스 SP2)에 대한 서열 로고를 도시한다.
도 2는 인공 분비 신호 펩티드가 락토바실루스로부터 항-HIV 항체 단편 (J3VHH)의 분비를 촉진할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. 정제된 배양 상청액을 분석하였다. J3VHH의 예상된 크기는 14.3 KDa이다. his-정제된 배양 상청액의 쿠마시 염색 (인비트로겐 (Invitrogen)에 의한 심플리블루(SimplyBlue))을 이용하여 이들 이미지를 생성하였다. 패널 a: J3VHH에 융합된 서열식별번호: 1로 제공되는 분비 신호 펩티드를 코딩하는 벡터로 형질전환된 엘. 람노수스로부터의 정제된 배양 상청액에서 J3VHH의 존재를 나타내는 데이터를 도시한다. 분자량 단백질 마커는 마지막 레인에 표시된다. 패널 b: J3VHH에 융합된 서열식별번호: 3을 코딩하는 벡터로 형질전환된 엘. 가세리로부터의 정제된 배양 상청액에서 J3VHH의 존재를 나타내는 데이터를 도시한다. 분자량 마커는 제1 레인에 표시된다.
도 3은 서열식별번호: 3에 제공된 서열을 갖는 분비 신호가 락토바실루스로부터 JM4VHH (항-HIV 항체 단편), 오조랄리주맙 (항-TNFα 항체 단편) 및 VRC01scFV (광범위하게 중화하는 IgG 항체 VRC01로부터 유래되는 항-HIV 항체 단편)의 분비를 촉진할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. 지시된 항체 단편에 융합된 서열식별번호: 3에 제공된 분비 신호를 코딩하는 벡터로 형질전환된 엘. 가세리로부터의 정제된 배양 상청액. 분자량 마커는 제1 레인에 표시된다. 각각의 항체 단편의 예상 크기는 하기와 같다: JM4VHH: 15 kDa, 오조랄리주맙: 13.3 kDa 및 VRC01scFV: 28.8 kDa. his-정제된 배양 상청액의 쿠마시 염색 (인비트로겐에 의한 심플리블루)을 이용하여 이들 이미지를 생성하였다.
도 4는 서열식별번호: 3에 제공된 서열을 갖는 분비 신호가 엘. 가세리로부터 기능적 항체 단편을 분비할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. gp120 (스트레인 YU2)에 대한 지시된 분비된 항체의 결합 친화도를 측정하기 위해 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 데이터를 생성하였다.
도 5는 엘. 람노수스 GG (LGG) SP1 (서열식별번호: 1) 및 엘. 람노수스 GG SP2 (서열식별번호: 5)가 J3VHH를 분비할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. J3VHH의 예상 크기는 14.3 kDa이다. his-정제된 배양 상청액 (인비트로겐에 의한 심플리블루)의 쿠마시 염색을 이용하여 이들 이미지를 생성하였다.
도 6은 엘. 람노수스 GG SP2 (서열식별번호: 5)가 엘. 람노수스로부터 gp120에 결합할 수 있는 기능적 J3VHH를 분비한다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. gp120에 대한 결합을 검출하는 ELISA 검정의 결과가 도시된다.
도 7은 엘. 람노수스 GG SP1 (서열식별번호: 1)이 엘. 람노수스로부터 gp120에 결합할 수 있는 기능적 J3VHH를 분비한다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. gp120에 대한 결합을 검출하는 ELISA 검정의 결과가 도시된다.
도 8은 지시된 자연-발생 분비 신호 펩티드의 측정된 분비 효율에 대비하여 예측된 분비 효율과 관련된 데이터를 도시한다. 각각의 분비 신호를 엠체리 (mCherry)에 N-말단에서 융합시키고 엘. 가세리에서 시험하였다. 상청액에서의 엠체리 형광은 상대적 형광 단위 (RFU)의 배수 변화로서 측정되었다. 회색 막대는 예측된 분비 효율을 나타내고, 검은 막대는 엘. 가세리에서의 RFU의 상대적인 실험적으로 측정된 배수 변화를 나타낸다. 흰색 막대는 엘. 람노수스 GG에서의 RFU의 상대적인 실험적으로 측정된 배수 변화를 나타낸다.
도 9는 서열식별번호: 3에 제공된 아미노산 서열을 갖는 분비 신호 펩티드 (엘. 가세리 SP1)가 시험된 최고 성능의 자연-발생 신호 펩티드 (Lp3189)보다 더 많은 분비를 지시할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 도시한다. 각각의 분비 신호를 엠체리에 N-말단에서 융합시키고 엘. 가세리에서 시험하였다. 임의의 단위 (AU)로 측정된 상청액에서의 엠체리 형광이 표시된다. 음성 대조군에 대한 형광도 도시된다.
도 10은 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)에 의해 분비되는 J3VHH가 문헌에보고된 바와 같이 통상적으로 생성되는 J3VHH에 필적하는 HIV 중화 활성을 나타낸다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다. 패널 a는 왼쪽 축에 엘. 가세리 SP1에 의해 분비되는 J3VHH의 농도를 측정하는 ELISA 실험 결과를 도시한다. 패널 b는 HIV 중화 활성을 평가하는 'TZM-bl 데이터를 도시한다. 간략하게, 이것은 항체로의 처리에 의해 보호되는 인간 HIV-감수성 세포의 분율을 측정한다. 엘. 가세리 SP1에 의해 분비되는 J3VHH의 IC50은 측정된 IC50으로 표시된다. 문헌에 보고된 바와 같이 통상적으로 생성되는 J3VHH의 IC50은 공개된 IC50으로 표시된다.
도 11은 생물층 간섭계법을 통해 엘. 람노수스 GG SP1 (서열식별번호: 1)에 의해 분비되는, 아블린크스 (Ablynx)에 의해 시판되는 항-TNFα 항체 단편인 오조랄리주맙의 기능을 분석하는 데이터를 포함한다. 2개의 레플리케이트에 대한 KD 가 표시된다.
도 12a-12b는 조작된 락토바실루스 (도 12a)가 생성물을 이. 콜리 (E. coli) (도 12b)보다 많은 양으로 분비할 수 있다는 것을 입증하는 비교 데이터를 도시한다. 도 12a는 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)이 엘. 가세리에서 1, 2 및 3개의 항원 결합 부위를 갖는 항-시가 독소 (Stx2) 항체 단편을 분비할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다. 웨스턴 블롯을 이용하여 지시된 박테리아를 사용하여 3개의 레플리케이트에 대한 각각의 분비된 항체 단편의 상대적인 양을 시각화하였다. 항-시가 독소 단량체는 통상적인 단일 단량체 (17 kDa)이고, 이량체 (33.5 kDa) 및 삼량체 (48 kDa)는 각각 2개 및 3개의 융합된 단량체이다. 각각을 항-정제 염색 태그에 20분 동안 노출시켰다. 엘. 가세리 SP1을 포함하는 조작된 엘. 가세리를 사용하여 분비된 시가 독소 (Stx2)에 대한 화학발광 노출과 함께 항-eTag 검출 항체를 사용한 웨스턴 블롯 결과가 도시된다.
도 13은 머신 러닝에 의한 SP 기능의 예측 점수화에 관한 데이터를 포함한다. 패널 a는 아미노산의 특정 서브세트가 그들의 물리화학적 특성의 유사성으로 인해 펩티드 서열에서 서로의 치환을 허용할 수 있는 방법에 대한 벤 (Venn) 다이어그램을 도시한다. 패널 b는 특이값 분해 (SVD-LDA)를 통한 다차원 기능적 특성 데이터의 선형 판별 분석과 관련된 데이터를 도시한다.
도 14는 정제된 IL-10의 표준 곡선과 비교하여 무세포 엘. 람노수스 GG (LGG) 상청액을 사용하는 IL-10 포획 ELISA로부터의 데이터를 포함한다. 희석 시리즈는 최초 배양물 CFU/mL 밀도의 분율로 보고되고; 정제된 IL-10은 무세포 음성 대조군 배양 배지에 재현탁시켰다.
도 15은 서열식별번호: 5에 제공된 아미노산 서열을 갖는 분비 신호 펩티드 (엘. 람노수스 GG SP2)가 Apf 분비 펩티드 및 Usp 분비 펩티드보다 더 많은 분비를 지시할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다. 각각의 분비 신호를 엠체리에 융합시키고 엘. 람노수스 GG에서 시험하였다. 임의의 단위 (AU)로 측정된 상청액 중의 엠체리 형광이 표시된다. 음성 대조군에 대한 형광도 도시된다.
도 16은 33개 아미노산 길이인 엘. 가세리에 대한 또 다른 분비 신호 펩티드 서열 (엘. 가세리 SP2)을 나타내는 서열 로고이다.
도 17은 서열식별번호: 7 (엘. 가세리 SP2)로 제공되는 서열을 갖는 분비 신호 펩티드가 서열식별번호: 3 (엘. 가세리 SP1)과 유사하게 엘. 가세리로부터 J3-VHH를 분비할 수 있다는 것을 나타내는 겔 이미지이다. 레인 1은 비-결합 대조군의 결과를 도시하고, 레인 2는 엘. 가세리 SP1-J3-VHH의 결과를 도시하고, 레인 3은 엘. 가세리 SP2-J3-VHH의 결과를 도시한다.
도 18은 엘. 가세리 SP2 (서열식별번호: 7)가 엘. 가세리로부터 기능적 J3-VHH를 분비한다는 것을 나타내는 그래프이다. 그래프는 정제되지 않은 상청액 중의 항-gp120 항체를 사용하여 gp120에 대한 결합을 검출하는 ELISA 검정 결과를 도시한다.
도 19a-19b는 엘. 람노수스 GG SP1 (서열식별번호: 1) (도 19a) 및 엘. 람노수스 GG SP2 (서열식별번호: 5) (도 19b)에 존재하는 모티프의 2가지 물리화학적 아미노산 특성 (소수성 및 나선성)을 나타내는 그래프이다.
도 20a-20b는 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3) (도 20a) 및 엘. 가세리 SP2 (서열식별번호: 7) 또는 엘. 가세리 SP3 (도 20b)에 존재하는 모티프의 2가지 물리화학적 아미노산 특성 (소수성 및 나선성)을 나타내는 그래프이다.
도 21은 재조합 엘. 람노수스 GG에 의한 IL10의 생체내 전달을 나타내는 그래프이다.
도 22는 벤더 정제된 GLP2 표준 캡처 ELISA 농도 곡선 피팅을 나타내는 그래프이다.
도 23은 재조합 엘. 람노수스 GG에 의한 GLP1의 시험관내 분비를 나타내는 그래프이다.
도 24는 엘. 가세리에 의해 분비되는 hBD1에 의한 이. 콜리 ATCC 25922 성장 억제를 나타내는 그래프이다.
본 개시내용은, 일부 측면에서, 예컨대 락토바실루스 세포에 의한 치료 단백질 생성에 사용하기 위한 인공 분비 신호 펩티드를 제공한다.
인공 분비 신호 펩티드
본 개시내용은 다양한 단백질의 분비를 촉진하는 인공 분비 신호 펩티드를 제공한다. 인공 분비 신호 펩티드는 자연에서는 발생하지 않는 분비 신호 펩티드이다. 인공 서열은, 예컨대 재조합적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. 분비 신호 펩티드는 일반적으로 분비 경로에 들어가는 새로운 합성 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드 (예컨대, 15-60개 아미노산)이다. 본 개시내용의 인공 분비 신호 펩티드는, 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열식별번호: 11에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하다.
또한, 본원에는 인공 분비 신호 펩티드를 코딩하는 핵산이 제공된다. 핵산은 서로 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드이고, 일부의 경우, 포스포디에스테르 결합 (예컨대, 포스포디에스테르 "골격")을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 핵산은 재조합 또는 합성 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인공 신호 펩티드를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 또는 서열식별번호: 6 중 어느 하나에 의해 확인되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 2의 핵산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 2의 핵산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 4의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 4의 핵산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 4의 핵산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 6의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 6의 핵산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 6의 핵산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 8의 핵산 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 8의 핵산 서열과 적어도 98% 동일하다. 일부 실시양태에서, 핵산은 서열식별번호: 8의 핵산 서열과 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 코돈-최적화되지 않는다.
본 개시내용은 본원에 기재된 인공 분비 신호 펩티드 중 어느 하나 이상 뿐만 아니라 참조 인공 신호 펩티드 (예컨대, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 7)와 특정 정도의 서열 동일성을 공유하는 인공 분비 신호 펩티드의 사용을 포괄한다는 것을 이해해야 한다. 동일성 퍼센트는 서열을 비교함으로써 측정된 2개 이상의 폴리펩티드 (예컨대, 단백질 및 펩티드) 또는 폴리뉴클레오티드 (핵산)의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 동일성은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (예컨대, "알고리즘")에 의해 다뤄지는 갭 정렬과 함께 (존재하는 경우) 2개 이상의 서열의 더 작은 서열 사이의 동일한 일치 퍼센트를 측정한다. 관련된 분자의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 아미노산 또는 핵산 서열에 적용하는 "동일성 퍼센트 (%)"는 서열들을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입한 후 제2 서열의 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 잔기 (아미노산 잔기 또는 핵산 잔기)와 동일한 후보 아미노산 또는 핵산 서열의 잔기의 퍼센트로 정의된다. 동일성은 동일성 퍼센트의 계산에 의존하지만 계산에 도입된 갭 및 패널티로 인해 값이 다를 수 있다. 특정 서열의 변이체는, 본원에 기재된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 측정되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 그 특정 참조 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 그러나 100% 미만의 서열 동일성을 가질 수 있다.
2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 동일성을 결정하는 기술은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 2개의 서열 사이의 상동성을 결정하기 위한 예시적인 컴퓨터 소프트웨어는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984), 블라스트 스위트 (BLAST suite) (Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997), 및 파스타 (FASTA) (Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 기술은 스미쓰-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘 (Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981); 니들만-윈쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970); 및 FOGSAA (Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm) (Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3: 1746, 2013)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인공 분비 신호 펩티드는 본원에 개시된 참조 서열 (예컨대, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 7)에 관하여 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질 또는 펩티드의 상대적인 하전 또는 크기 특징이 변경되지 않는 아미노산 치환이다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 중에서 이루어지는 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 일부 실시양태에서, 인공 분비 신호 펩티드는 본원에 개시된 참조 서열 (예컨대, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 7)에 관하여 보존적 아미노산 치환을 포함하여, 모티프 (예컨대, 친수성 헤드 모티프, 소수성 코어 모티프, 또는 유형 I 신호 펩티다제 절단 부위)의 소수성 및/또는 나선성 프로파일이 참조 서열에 관하여 보존된다. 예컨대, 하기 실시예 7을 참조한다. 일부 실시양태에서, 소수성은 △tR(Gly)를 계산함으로써 측정된다. 예컨대, 문헌 (Kovacs et al., Biopolymers. 2006;84(3):283-97)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 나선성은 Pα를 계산함으로써 측정된다. 예컨대, 문헌 (Deber et al., Protein Sci. 2001 Jan;10(1):212-9)을 참조한다.
변이체는 이러한 방법을 컴파일하는 참조문헌에서 발견되는 것과 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경하는 방법에 따라 제조될 수 있다 (예컨대, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., New York: John Wiley & Sons, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Green, M.R. and Sambrook J., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012; Gibson, D.G., et al., Nature Methods 6(5):343-345 (2009))을 참조하며, 폴리펩티드 제조 및 변형과 관련된 교시가 참조로 본원에 포함됨).
이종 단백질
본 개시내용의 인공 분비 신호 펩티드는 락토바실루스 세포로부터 이종 단백질의 분비를 촉진한다. 따라서, 본원에는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 이종 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다. 또한, 본원에는 핵산에 의해 코딩되는 전장의 기능적 단백질이 제공된다. 특정 세포와 관련하여 이종 단백질은 그 세포에 의해 자연적으로 (정상적으로) 생성되지 않는 단백질이다. 본원에서 제공되는 이종 단백질은 락토바실루스 세포에 의해 자연적으로 생성되지 않는 임의의 단백질일 수 있다. 사실상, 독특한 분비 신호 펩티드가 Sec 경로를 통해 외수송되는 각각의 단백질에 결합된다. 따라서, 자연 발생 락토바실루스 세포 내에 다수의 상이한 분비 신호 펩티드가 존재할 수 있고, 분비 신호 펩티드는 종종 상호교환이 가능하지 않다 (예컨대, 상이한 단백질의 분비를 유도할 수 없다). 놀랍게도, 본원에 개시된 인공 분비 서열은 다목적이며 다양한 이종 단백질 (이종 펩티드 포함)을 분비하는데 사용될 수 있다.
비제한적 예로서, 본 개시내용의 이종 단백질은 1 내지 10,000개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 1-100개 아미노산 길이, 1-25개 아미노산 길이, 1-50개 아미노산 길이, 10-50개 아미노산 길이, 50-100개 아미노산 길이, 100-200개 아미노산 길이, 200-300개 아미노산 길이, 300-400개 아미노산 길이, 400-500개 아미노산 길이, 500-1,000개 아미노산 길이, 1,000-5,000개 아미노산 길이, 또는 5,000-10,000개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 1 kDa 내지 10 kDa, 1 kDa 내지 100 kDa, 1 kDa 내지 1,000 kDa 또는 1 kDa 내지 5,000 kDa이다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질은 2 kDa 내지 5 kDa 크기이다.
이종 단백질은 치료 단백질 (예방 단백질 및/또는 진단 단백질 포함)일 수 있다. 치료 단백질의 비제한적 예는 항체, 효소, 호르몬 (예컨대, 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP1)), 성장 인자 (예컨대, TGFβ), 시토카인 (예컨대, IL10), 혈장 단백질, 융합 단백질, 막-용해 단백질, 응고 인자, 및 항미생물성 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 염증제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항-염증제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 면역조정제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항암제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 대사제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항바이러스제/살바이러스제이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항박테리아제/살박테리아제 (예컨대, 항박테리아성 펩티드, 예컨대 데펜신 (예컨대, 인간 베타 데펜신 1 (hBD1) 또는 베타 데펜신 2 (hBD2)), LL-37, 데르마셉틴, HCV C5알파 펩티드, 마가이닌, 또는 박테리아 기원의 임의의 항미생물성 펩티드)이다.
본원에 기재된 임의의 조작된 락토바실루스 세포에 의해 생성되는 이종 단백질 또는 조작된 락토바실루스 세포 배양물로부터의 상청액의 항미생물성/살박테리아성 활성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 이종 단백질 또는 이종 단백질을 포함하는 상청액의 미생물의 성장을 억제하는 능력은 실시예 10에서 기재되는 바와 같이 시험될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 조작된 락토바실루스 세포에 의해 생성되는 이종 단백질 또는 조작된 락토바실루스 세포 배양물로부터의 상청액은 미생물 (예컨대, 병원성 박테리아)의 성장을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항체이다. 용어 "항체"는 전체 항체 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 면역글로불린) 및 항체 단편을 포괄한다. 항체 단편은 카멜리드 항체, 중쇄 단편 (VHH), Fab 단편, F(ab')2 단편, 나노바디 (단일-도메인 항체) 및 디아바디 (이중특이적/이가 이량체 항체 단편)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 단일 B 세포 계통에 의해 분비되는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 상이한 B 세포 계통에 의해 분비되는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 하나의 종 (예컨대, 마우스)으로부터의 항원 결합 영역 (중쇄 및 경쇄의 가변 도메인, VH 및 VL)을 또 다른 종 (예컨대, 인간)으로부터의 불변 도메인과 융합시킴으로써 제조되는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 단백질 서열이 인간에서 자연적으로 생성되는 항체 변이체와의 유사성을 증가시키기 위해 변형된 비-인간 종으로부터의 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 융합 항체 (예컨대, VHH 또는 다른 항체 단편의 다른 단백질 유형에 대한 융합물)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 CDR 그래프팅이 수행될 수 있는 인간화된 나노바디(NANOBODY)®이다.
본원에서 제공되는 방법에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 아브식시맙 (레오프로(REOPRO)®), 아달리무맙 (후미라(HUMIRA)®), 알레파셉트 (아메비베(AMEVIVE)®), 알렘투주맙 (캄파쓰(CAMPATH)®), 바실릭시맙 (시물렉트(SIMULECT)®), 벨리무맙 (벤리스타(BENLYSTA)®), 베즐로툭수맙 (진플라바(ZINPLAVA)®), 카나키누맙 (이라리스(ILARIS)®) 세르톨리주맙 페골 (심지아(CIMZIA)®), 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®), 다클리주맙 (제나팍스, 진브리타(ZENAPAX, ZINBRYTA)®), 데노수맙 (프롤리아, 엑스게바(PROLIA, XGEVA)®), 에필리주맙 (랍티바(RAPTIVA)®), 골리무맙 (심포니(SIMPONI)®), 인플렉트라 (레미카데(REMICADE)®), 이팔리무맙 (예르보이(YERVOY)®), 익세키주맙 (탈츠(TALTZ)®), 나탈리주맙 (티사브리(TYSABRI)®), 니볼루맙 (오프디보(OPDIVO)®), 올라라투맙 (라르트루보(LARTRUVO)®), 오말리주맙 (졸레어(XOLAIR)®), 오조랄리주맙, 팔리비주맙 (시나기스(SYNAGIS)®), 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)®), 펨브롤리주맙 (케이트루다(KEYTRUDA)®), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®), 토실리주맙 (악템라(ACTEMRA)®), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)®), 세쿠키누맙 (코센틱스(COSENTYX)®) 및 우스테키누맙 (스텔라라(STELARA)®)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 의해 생성되는 항체는 외래 항원 (예컨대, 병원성 박테리아, 바이러스, 및 독소 단백질)에 결합하거나, 숙주 조직에 존재하는 항원 (예컨대, 상피 또는 점막 조직에 존재하는 표면 단백질 또는 TNFα)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 의해 생성되는 항체는 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 바이러스 항원의 비제한적인 예는 보렐리아, 차가스, 치쿤구니아, 클라미디아, 시토메갈로, 뎅기, 에볼라, EBV, 뇌염, 고양이 백혈병 바이러스, 한타바이러스, HBsAg, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 헤르페스, HIV, HTLV, 인플루엔자, 라사, 말라리아, 홍역, 볼거리, 미코플라스마, 노로바이러스, 파필로마바이러스, 파르보바이러스, 풍진, SARS, 시가 유사 독소, 톡소플라스마, 트레포네마, 에스. 티피 (S. Typhi), 바리셀라, 웨스트 나일 및 지카 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 JM4VHH 및 VRC01scFV로부터 선택되는 항-HIV 항체이다.
일부 실시양태에서, 생성되는 항체는 미생물 항원에 특이적으로 결합한다. 미생물 항원의 비제한적인 예는 예르시니아 종, 에쉐리키아 종, 크렙시엘라 종, 아시네토박테르 종, 보르데텔라 종, 네이세리아 종, 아에로모나스 종, 프란시에셀라 종, 코리네박테리움 종, 시트로박테르 종, 클라미디아 종, 헤모필루스 종, 브루셀라 종, 미코박테리움 종, 레기오넬라 종, 로도코쿠스 종, 슈도모나스 종, 헬리코박테르 종, 살모넬라 종, 비브리오 종, 바실루스 종, 에리시펠로트릭스 종, 살모넬라 종, 스트렙토미세스 종, 박테로이데스 종, 프레보텔라 종, 클로스트리디움 종, 비피도박테리움 종, 및 락토바실루스 종 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 박테리아 독소, 예컨대 시가 독소, 알파 독소, 탄저균 독소, 시아노톡신, 디프테리아 독소, 외독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 또는 보툴리늄 신경독소에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 염증 분자, 예컨대 시토카인에 특이적으로 결합한다. 시토카인의 비제한적인 예는 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 종양 괴사 인자, 콜로니 자극 인자, TGF-베타 슈퍼패밀리를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 TNF-알파에 결합한다.
일부 실시양태에서, 치료 단백질은 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 항-염증성 시토카인이다. 항-염증성 시토카인의 비제한적인 예는 인터류킨 (IL)-1 수용체 길항제, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, 및 IL-13을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질은 IL-10이다.
일부 실시양태에서, 치료 단백질은 면역치료의 종양-억제성 시토카인이다. 면역치료 시토카인의 비제한적인 예는 IL-2, IL-7, IL-12, TGFβ, IFNγ, IFNα, 및 G-CSF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인공 분비 펩티드는 하나 초과의 이종 단백질 (예컨대, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 또는 적어도 100개 이종 단백질), 또는 단편 (예컨대, Fab, (Fab)2, 또는 Fc 단편과 같은 항체 단편)에 융합된다. 예컨대, 인공 분비 펩티드는 하나 초과의 치료 단백질에 융합될 수 있다 (예컨대, 치료 단백질은 동일하거나 상이할 수 있다). 일부 실시양태에서, 인공 분비 펩티드는 링커 (예컨대, 글리신-세린 링커)를 통해 서로 연결된 2개 이상의 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 인공 분비 펩티드는 항체 (또는 다른 항체 접합체)에 연결된 시토카인에 융합된다. 일부 실시양태에서, 인공 분비 펩티드는 IL10-IgFc 융합물에 융합된다. 일부 실시양태에서, 인공 분비 펩티드는 2개의 시토카인 (예컨대, 세린-글리신 링커와 같은 링커에 의해 분리된 2개의 IL-10 시토카인)에 융합된다.
유리하게는, 본 발명의 인공 분비 신호 펩티드는 상이한 분자량의 항체의 생성을 가능하게 하고 또한 다가 항체의 생성을 가능하게 한다. 본원에 기재된 락토바실루스 시스템은 항체의 크기에 의해 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 인공 분비 신호 펩티드는 하나의 항체 도메인 (예컨대, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인)을 포함하는 항체의 분비를 지시할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 2개의 항체 도메인 (예컨대, 2개의 중쇄 가변 도메인, 2개의 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인)을 포함한다. 일부 예에서, 항체는 3개의 항체 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 하나의 항원 결합 부위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예컨대 글리신-세린 링커 (글리신 및 세린을 포함하는 링커)와 같은 링커에 의해 연결된 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 항원 결합 부위를 포함하는 다가 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예컨대 2개의 링커 (예컨대, 글리신-세린 링커)에 의해 연결된 3개의 항원-결합 부위를 포함한다.
본원에서 생성되는 이종 단백질은 락토바실루스 세포 내에서 발현되는 경우 전형적으로 단백질의 N-말단에서 인공 분비 신호 펩티드에 융합된다. 그러나, 성숙한 단백질이 세포로부터 분비되기 전에 신호 펩티드가 절단된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법에 의해 생성되고 분비되는 기능적 단백질은 인공 분비 신호 펩티드를 포함하지 않아야 한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본원에서 제공되는 바와 같이 생성되는 이종 단백질은 기능적이다. Sec 트랜스로카제 경로를 통해 외수송되는 단백질은 합성 및 분비 동안 접히지 않은 상태로 유지되며, 세포외 환경으로의 확산을 위해 단백질이 세포벽으로 방출될 때만 접히기 시작한다. 따라서, 단백질이 분비되는 것으로 보여지더라도, 단백질이 정확하게 접히고 기능적이라는 표시는 없다. 본 개시내용의 이종 단백질은 적절히 접히고 기능적이었다. 항체와 같은 단백질의 기능을 평가하는 방법은 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본원에서 제공되는 바와 같이 이용될 수 있다. 예컨대, 실시예 1에 나타난 바와 같이 항체의 적절한 항원에 대한 결합 친화도를 측정함으로써 항체 기능이 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 의해 (예컨대, 락토바실루스에서 인공 분비 신호 펩티드를 사용하여) 생성되는 항체의 결합 친화도는 자연-발생 분비 신호 펩티드를 사용하여 생성되는 동일한 유형의 항체의 결합 친화도에 필적하거나 그 이상이다.
결합 친화도는 겉보기 연합 상수 또는 KA이다. KA는 해리 상수 (KD)의 역수이다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 항체는 표적 항원 또는 항원성 에피토프에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M 또는 그 이하의 결합 친화도 (KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 상응한다. 제2 항원과 비교하여 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화성 결합은 제2 항원에 결합하기 위한 KA (또는 수치 KD)보다 제1 항원에 결합하기 위한 더 높은 KA (또는 더 작은 수치 KD)로 표시될 수 있다. 이러한 경우에, 항체는 제2 항원 (예컨대, 제2 입체형태의 동일한 제1 단백질 또는 그의 모방체; 또는 제2 단백질)과 비교하여 제1 항원 (예컨대, 제1 입체형태의 제1 단백질 또는 그의 모방체)에 대해 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 자연-발생 분비 신호 펩티드를 사용하여 생성되는 동일한 유형의 항체의 결합 친화도와 비교하여 적절한 항원에 대해 더 높은 결합 친화도 (더 높은 KA 또는 더 작은 KD)를 갖는다. (예컨대, 특이성 또는 다른 비교에 대한) 결합 친화도의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 생성되는 임의의 항체는 표적 항원 또는 그의 항원성 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시키기 위해 더욱 친화도 성숙될 수 있다.
결합 친화도 (또는 결합 특이성)는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광법 (예컨대, 형광 검정을 이용)을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충액 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% (v/v) 계면 활성제 P20)에 있다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는데 이용될 수 있다. 결합된 결합 단백질의 농도 ([결합])는 일반적으로 하기의 수학식으로 자유 표적 단백질의 농도 ([자유])와 관련된다:
[결합] = [자유] / (Kd + [자유])
그러나 때로는 친화도의 정량적 측정을 얻는 것으로 충분할 수 있으므로, 예컨대 ELISA, FACS 분석 또는 자기 면역침전과 같은 방법을 이용하여 결정하면 KA에 비례하므로, 예컨대 친화도의 질적 측정을 얻거나, 예컨대 시험관내 또는 생체내 검정과 같은 기능적 검정으로 활성에 의해 친화도의 추론을 얻기 위해 더 높은 친화도가, 예컨대 2배 더 높은지를 결정하는 것과 같은 비교를 위해 사용될 수 있기 때문에, KA를 항상 정확하게 결정할 필요는 없다.
핵산
본원에는, 일부 실시양태에서, 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 이종 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다. 본원의 다른 곳에서 기재되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 인공 분비 신호 펩티드를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 6 중 어느 하나에 의해 확인되는 핵산 서열과 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, 핵산은 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자가 결합할 수 있는 서브-영역을 함유할 수 있다. 프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현 또는 전사를 추진한다. 프로모터는 뉴클레오티드 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어 ("추진")하기 위해 뉴클레오티드 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및 배향에 있는 경우 뉴클레오티드 서열에 "작동적으로 연결된" 것으로 간주된다. 프로모터는 구성적이거나 유도적일 수 있다. 유도성 프로모터는 특정 인자의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 (예컨대, 활성화 또는 불활성화되는) 프로모터이다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 락토바실루스에서 기능하는 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터는 테트라사이클린-유도성 프로모터이다.
본원에는, 일부 실시양태에서, 락토바실루스에서 이종 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 발현 벡터는 본 개시내용의 임의의 핵산을 포함할 수 있다. 발현 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드 및 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 발현 벡터는 표준 분자 클로닝 방법을 이용하여 생성될 수 있다 (예컨대, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al., New York: John Wiley & Sons, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Green, M.R. and Sambrook J., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012; Gibson, D.G., et al., Nature Methods 6(5):343-345 (2009)을 참조하며, 분자 클로닝에 관한 교시가 참조로 본원에 포함됨).
조작된 락토바실루스 세포에서 이종 단백질 생성 방법
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 조작된 락토바실루스 세포를 세포 배양 배지에서 배양하여 단백질 (예컨대, 치료 단백질과 같은 이종 단백질)을 생성하는 단계를 포함하는 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포 배양 배지로부터 단백질을 회수 (예컨대, 단리 및/또는 정제)하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 제공되는 락토바실루스 세포는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하도록 조작된다. 따라서, 본 개시내용은 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 락토바실루스 세포를 제공하고, 또한 이종 단백질을 포함하는 락토바실루스 세포를 제공한다. 조작된 세포는 적어도 하나의 조작된 핵산을 포함하거나 달리 야생형 대응물과 구조적으로 또는 기능적으로 구별된다. 따라서, 인공 분비 신호 펩티드를 포함하는 락토바실루스 세포는 조작된 세포로 간주된다. 일부 실시양태에서, 조작된 락토바실루스 세포는 본 개시내용의 발현 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 임의의 핵산은 박테리아 형질전환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 재조합 기술을 이용하여 락토바실루스 세포로 도입될 수 있다.
본 개시내용의 락토바실루스 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 조건 (예컨대, 온도, 배양 배지 및 인큐베이션 시간) 하에서 증식될 수 있다. 락토바실루스 세포가 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산을 포함하는 일부 실시양태에서, 락토바실루스 세포는 유도성 프로모터로부터의 발현을 유도하기 위해 유효량의 유도제의 존재 하에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 이종 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 추진하는 유도성 프로모터는 테트라사이클린-유도성 프로모터이므로, 락토바실루스 세포는 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터의 발현을 유도하도록 유효량의 테트라사이클린에서 배양된다.
항체 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피, 티오필릭 흡착, 멜론 겔 크로마토그래피 및 항체 리간드 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 락토바실루스 세포로부터의 분비 후 단백질을 회수하기 위해 이들 중 임의의 것이 본원에서 제공되는 바와 같이 이용될 수 있다.
놀랍게도, 본 개시내용의 인공 분비 신호 펩티드의 사용은 자연-발생 분비 신호 펩티드를 사용하여 생성되는 이종 단백질보다 적어도 두 자릿수 더 큰 수율로 이종 단백질의 생성 (예컨대, 항체의 생성)을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 생성되는 이종 단백질의 수율은 자연-발생 분비 신호 펩티드를 사용하여 생성되는 이종 단백질보다 적어도 2-10 자릿수 더 크다. 예컨대, 제공되는 바와 같이 생성되는 이종 단백질의 수율은 자연-발생 분비 신호 펩티드를 사용하여 생성되는 이종 단백질보다 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 자릿수 더 클 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 1 ng/mL의 세포 배양 배지 (또는 다른 배지 또는 완충액)이다. 일부 실시양태에서, 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 1 ng/mL, 적어도 5 ng/mL, 적어도 10 ng/mL, 적어도 20 ng/mL, 적어도 30 ng/mL, 적어도 40 ng/mL, 적어도 50 ng/mL, 적어도 60 ng/mL, 적어도 70 ng/mL, 적어도 80 ng/mL, 적어도 90 ng/mL, 적어도 100 ng/mL, 적어도 200 ng/mL, 적어도 300 ng/mL, 적어도 400 ng/mL, 적어도 500 ng/mL, 적어도 600 ng/mL, 적어도 700 ng/mL, 적어도 800 ng/mL, 적어도 900 ng/mL, 또는 적어도 1 μg/mL이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 바와 같이 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 10 μg/mL의 세포 배양 배지 (또는 다른 배지 또는 완충액)이다. 일부 실시양태에서, 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 20 μg/mL의 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 30 μg/mL의 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 40 μg/mL의 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 생성되는 이종 단백질의 수율은 적어도 50 μg/mL의 세포 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 생성된 이종 단백질의 수율은 10 μg/mL 내지 20 μg/mL, 10 μg/mL 내지 30 μg/mL, 10 μg/mL 내지 40 μg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 50 μg/mL이다.
또한, 본원에서 제공되는 락토바실루스 시스템의 세포가 이종 단백질을 에쉐리키아 세포보다 많은 양으로 분비한다는 것을 보여주는 본원에서 제공되는 데이터는 놀라운 것이다 (실시예 3 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 락토바실루스 세포를 사용하는 본원에서 제공되는 방법은 에쉐리키아 세포를 사용하는 경우 달성되는 수율보다 2 내지 10배 큰 수율로 이종 단백질 생성을 발생시킨다. 예컨대, 락토바실루스 세포를 사용하는 본원에서 제공되는 방법은 에쉐리키아 세포를 사용하는 경우 달성되는 수율보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 큰 수율로 이종 단백질 생성을 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 락토바실루스 세포는 프로바이오틱 세포이다. 프로바이오틱 세포는, 적절한 양으로 투여되는 경우, 이들이 투여되는 숙주에 건강상의 이익을 제공한다. 예컨대, 프로바이오틱 세포는 숙주의 점막 (예컨대, 소화관 및 질 점막)에서 건강상의 이익을 제공할 수 있다. 락토바실루스의 예시적인 프로바이오틱 종은 엘. 가세리, 엘. 람노수스, 엘. 플란타룸 (L. plantarum), 엘. 카세이 (L. casei), 엘. 살리바리우스 (L. salivarius) 및 엘. 헬베티쿠스 (L. helveticus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 제공되는 바와 같은 사용을 위한 예시적인 락토바실루스 균주는 엘. 람노수스 GG, 엘. 가세리 ATCC 33323 및 엘. 가세리 OLL2716을 포함한다.
일부 경우에, 분비된 단백질 (예컨대, 항체)의 상대적인 양은 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 웨스턴 블롯을 이용하여 결정될 수 있다 (예컨대, 하기 실시예 1 및 2 참조). 분비된 단백질의 기능은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 예컨대, 항-HIV 항체는 gp120에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다 (예컨대, 하기 실시예 1 참조). 항-HIV 항체는 또한 TZM-bl 검정으로 HIV를 중화시키는 능력에 대해 시험될 수 있다 (예컨대, 하기 실시예 2 참조).
치료/예방 적용 및 제약 조성물
하기에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용의 항체-분비 락토바실루스 세포는 다양한 치료 및 예방 적용에서 프로바이오틱 약물-전달 벡터로서 사용될 수 있다. 조작된 세포는 종종 대상체에서 외래 물질로 인식될 위험이 있으며 잠재적으로 불리한 면역 반응을 유발할 수 있다. 예컨대, 특정 유형의 박테리아는 병원성이다 (예컨대, 이. 콜리 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 특정 균주). 따라서, 이. 콜리가 유전자 조작이 가능하지만, 대상체 (예컨대, 인간)에서 유리한 약물-전달 벡터가 아니다. 유리하게는, 락토바실루스의 다양한 균주는 연방 의약국 (Federal Drug Administration: FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 인정되는 물질 (Generally Recognized as Safe: GRAS)로 분류되었으므로, 약물 전달을 위한 유리한 제제일 수 있다. 또한, CRISPR과 같은 게놈 편집 기술은 의도되지 않은 돌연변이를 영구적으로 도입하는 벗어난 표적 효과를 가질 수 있지만, 본 개시내용의 락토바실루스 시스템은 점막 기관으로의 국소 약물 전달을 가능하게 하고, 미생물을 군집화함으로써 연속 생산을 통해 반감기를 연장시키고 생산비를 낮출 수 있다.
본 개시내용은 또한, 일부 측면에서, 대상체에게 본 개시내용의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질 (예컨대, 염증제, 항-염증제, 면역조정제, 항암제, 대사제, 항바이러스제/살바이러스제, 또는 항박테리아제/살박테리아제)을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질의 투여는 대상체에서 특정 단백질의 양을, 대상체에서 단백질의 기준선 수준과 비교하여, 적어도 5% (예컨대, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포)의 투여는 대상체에서 대조 조건 하에서 생성되는 단백질의 양보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 큰 이종 단백질의 생성을 발생시킨다.
대상체에서 단백질 (예컨대, 치료 단백질을 포함하는 이종 단백질)의 양은 임의의 적합한 방법 (예컨대, 웨스턴 블롯, 관심 단백질을 인식하는 항체를 사용하는 면역형광, 또는 ELISA)을 이용하여 임의의 조직 또는 기관 (예컨대, 혈액, 결장, 폐, 심장, 점액, 땀, 정액, 타액 등)에서 측정될 수 있다. 단백질의 양은 본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질의 적어도 1회 용량 (예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 100회 용량) 후에 측정되고 단백질의 기준선 또는 대조군 수준과 비교될 수 있다.
단백질의 기준선 수준 또는 대조군 수준은 본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질의 투여 전 내인성 단백질의 양을 지칭할 수 있다. 비제한적인 예로서, 단백질의 대조군 또는 기준선 수준은 본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질의 투여 전에 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 10개월 또는 12개월 이내에 결정될 수 있다.
전형적으로, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 자가면역 병태를 갖는다. 자가면역 병태의 비제한적인 예는 애디슨 질환, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군, 자가면역 혈관부종, 자가면역 자율신경기능이상, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 두드러기, 축삭 & 뉴런 신경병증 (AMAN), 발로 (Balo) 질환, 베체트 (Behcet) 질환, 양성 점막 유사천포창, 물집 유사천포창, 캐슬만 (Castleman) 질환 (CD), 셀리악 (Celiac) 질환, 샤가스 (Chagas) 질환, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 (CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염 (CRMO), 처크-스트라우스 (Churg-Strauss), 흉터 유사천포창, 코간 (Cogan) 증후군, 한랭 응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론 질환, 포진성 피부염, 피부근육염, 데빅 (Devic) 질환 (시신경 척수염), 원반모양 루푸스, 드레슬러 (Dressler) 증후군, 자궁내막증, 호산성 식도염 (EoE), 호산성 근막염, 결절 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 (Evans) 증후군, 섬유근육통, 섬유화 폐포염, 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 다발혈관염을 갖는 육아종증, 그라베스 (Graves) 질환, 길랭-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 (Henoch-Schonlein) 자반 (HSP), 임신성 포진 또는 임신성 유사천포창 (PG), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병증, IgG4-관련된 경화 질환, 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP), 봉입체 근육염 (IBM), 간질성 방광염 (IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병 (유형 1 당뇨병), 소아 근육염 (JM), 가와사키 (Kawasaki) 질환, 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평 태선, 경화 태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환 (LAD), 루푸스, 만성 라임 질환, 메니에르 (Meniere) 질환, 현미경적 다발혈관염 (MPA), 혼합 결합 조직 질환 (MCTD), 무렌 (Mooren) 궤양, 무차-하베르만 (Mucha-Habermann) 질환, 다발성 경화증, 중증 근육무력증, 근육염, 기면증, 시각 신경척수염, 중성구감소증, 안구 흉터 유사천포창, 시각 신경염, 재발 류머티즘 (PR), PANDAS, 신생물 소뇌 변성 (PCD), 발작성 야간 혈색뇨 (PNH), 패리 롬베르그 (Parry Romberg) 증후군, 주변 포도막염 (말초 포도막염), 파르소나게-터너 (Parsonnage-Turner) 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위성 뇌척수막염, 악성 빈혈 (PA), POEMS 증후군, 결절 다발동맥염, 다분비선 증후군 유형 I, II, III, 류마티스성 다발근육통, 다발근육염, 심근경색후 증후군, 심낭막절개술후 증후군, 원발성 담관 간경화증, 원발성 경화 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선 관절염, 진성 적혈구계 무형성증 (PRCA), 괴저화농피부증, 레이노 (Raynaud) 현상, 반응성 관절염, 반사 교감신경 이상증, 재발 다발연골염, 하지 불편 증후군 (RLS), 복막뒤 섬유증, 류마티스 열, 류마타스성 관절염, 사코이드증, 쉬미트 (Schmidt) 증후군, 공막염, 공피증, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 정자 & 고환 자가면역, 근육강직 (Stiff person) 증후군 (SPS), 아급성 박테리아 심내막염 (SBE), 수삭 (Susac) 증후군, 교감 눈염증 (SO), 타카야스 (Takayasu) 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성 자반증 (TTP), 톨로사-헌트 (Tolosa-Hunt) 증후군 (THS), 횡단 척수염, 유형 1 당뇨병, 궤양성 결장염 (UC), 미분류된 결합 조직 질환 (UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증, 및 베게너 (Wegener) 육아종증 (또는 다발혈관염을 갖는 육아종증 (GPA))을 포함한다.
본 개시내용은, 일부 실시양태에서, 소화관 염증을 갖는 대상체에게 조작된 락토바실루스 세포 또는 분비된 치료 단백질을 투여하는 방법을 제공한다. 소화관 염증의 예는 크론 질환, 과민성 장 질환 (IBD), 과민성 장 증후군 (IBS) 및 궤양성 결장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 궤양성 결장염은 대장 (결장)과 직장의 최내측 내막에서 장기간-지속되는 염증 및 상처 (궤양)을 유발한다. 다른 예로서, 크론 질환은 소화관의 내막의 염증을 특징으로 하며, 종종 병든 조직으로 깊숙이 퍼진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-염증성 시토카인 (예컨대, 항-TNFα)을 분비하는 조작된 락토바실루스 세포는 소화관 염증을 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 소화관 염증은 크론 질환이다. 일부 실시양태에서, 소화관 염증은 과민성 장 질환이다. 일부 실시양태에서, 소화관 염증은 과민성 장 증후군이다. 일부 실시양태에서, 소화관 염증은 궤양성 결장염이다. 일부 실시양태에서, 조작된 락토바실루스의 투여는 대상체의 염증을 적어도 10% (예컨대, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 55%, 60%, 70%, 80% 또는 90%) 감소시킬 수 있다. 염증은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예컨대, 염증성 시토카인의 수준은 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 바이러스 감염 또는 미생물 감염을 갖는다. 바이러스 감염 또는 미생물 감염은 소화관, 피부, 폐, 코인두, 또는 여성 생식관을 포함하는 임의의 조직 또는 기관에 영향을 끼칠 수 있다. 바이러스 감염의 예는 보렐리아, 차가스, 치쿤구니아, 클라미디아, 시토메갈로, 뎅기, 에볼라, EBV, 뇌염, 고양이 백혈병 바이러스, 한타바이러스, HBsAg, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 헤르페스, HIV, HTLV, 인플루엔자, 라사, 말라리아, 홍역, 볼거리, 미코플라스마, 노로바이러스, 파필로마바이러스, 파르보바이러스, 풍진, SARS, 시가 유사 독소, 톡소플라마, 트레포네마, 에스. 티피, 바리셀라, 웨스트 나일 및 지카를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 미생물 감염의 예는 예르시니아 종, 에쉐리키아 종, 크렙시엘라 종, 아시네토박테르 종, 보르데텔라 종, 네이세리아 종, 아에로모나스 종, 프란시에셀라 종, 코리네박테리움 종, 시트로박테르 종, 클라미디아 종, 헤모필루스 종, 브루셀라 종, 미코박테리움 종, 레기오넬라 종, 로도코쿠스 종, 슈도모나스 종, 헬리코박테르 종, 살모넬라 종, 비브리오 종, 바실루스 종, 에리시펠로트릭스 종, 살모넬라 종, 스트렙토미세스 종, 박테로이데스 종, 프레보텔라 종, 클로스트리디움 종, 비피도박테리움 종, 및 락토바실루스 종 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 락토바실루스 세포 조성물은, 예컨대 미생물 감염 또는 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염을 예방하기 위해 예방 수단으로서 대상체에게 투여된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 락토바실루스 세포는 항-미생물 항체 또는 항-바이러스 항체, 예컨대 항-HIV 항체를 코딩하는 핵산을 코딩하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 이종 단백질을 생성하는 본 개시내용의 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 엘. 가세리, 엘. 람노수스, 엘. 플란타룸, 엘. 카세이, 엘. 살리바리우스, 엘. 아시도필루스 (L. acidophilus), 엘. 델브레우키이 (L. delbreuckii), 엘 불가리쿠스 (L. bulgaricus), 엘. 젠세니이 (L. jensenii), 엘. 크리스파투스 (L. crispatus), 엘. 파라카세이 (L. paracasei), 엘. 존소니이 (L. johnsonii), 엘. 레우테리 (L. reuteri), 엘. 페르멘툼 (L. fermentum), 엘. 브레비스 (L. brevis), 및 엘. 헬베티쿠스)는 질환 (예컨대, 위장관, 기도, 여성 생식관, 또는 그의 조합에 영향을 끼치는 질한)을 갖는 대상체에게 투여된다. 조작된 락토바실루스 세포는 숙주 조직 (예컨대, IL10을 통한 면역조정 효과 또는 GLP1을 통한 호르몬 효과)을 조정하거나 병원체 또는 독소 (예컨대, 바이러스 또는 박테리아)를 중화시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, hBD1, J3, 항-시가 독소 나노바디 또는 그의 조합을 분비하도록 조작된 락토바실루스 세포는 병원체, 독소 또는 그의 임의의 조합을 중화시키기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 락토바실루스 세포 및/또는 분비된 단백질은 제약 조성물로 제형화된다. 제약 조성물은 제약 담체 (예컨대, 리포좀 또는 나노캐리어)를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 제약상-허용되는 부형제를 또한 포함하거나 대안적으로 포함할 수 있다. 제약상-허용되는 부형제의 비제한적 예는 물, 식염수, 덱 스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 조합을 포함한다. 제약상-허용되는 부형제는 포스페이트 완충 식염수, 비카보네이트 용액, 보존제, 안정화제, 유화제 (예컨대, 인지질 유화제), 가용화제 (예컨대, 계면활성제) 또는 결합제를 포함할 수 있다. 부형제는 투여 방식 및 경로, 및 표준 제약 실무에 기초하여 선택될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려 사항은, 예컨대 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (그의 전문이 참조로 본원에 포함됨))에서 찾을 수 있다.
유효량 또는 치료 유효량은 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 활성제와 조합하여 대상체에게 치료 효과를 부여하는데 필요한 활성제의 양이다. 유효량은 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 활성제와의 공동 사용에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인식되는 바와 같이 다양하다. 투여되는 양은, 예컨대 개체의 면역계 또는 유전적 소인의 강도를 포함하여 치료될 대상체에 의존적이다. 적합한 용량 범위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 약 마이크로그램의 본 개시내용의 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 개시된 조성물의 용량은 투여 경로에 의존적일 수 있고, 대상체의 크기에 따라 다양하다.
일부 경우에, 임의의 조작된 락토바실루스 세포 (예컨대, 프로바이오틱 세포) 또는 치료 단백질의 적어도 1회 용량 (예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 100회 용량)이 대상체에게 투여된다. 예로서, 조작된 락토바실루스 세포의 용량은 10^3 내지 10^50 (예컨대, 10^6 내지 10^20) 콜로니-형성 단위 (CFU)를 포함할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 알 수 있는 바와 같이, 투여 스케줄은 다양한 인자 (예컨대, 투여될 박테리아의 유형 또는 균주, 투여될 단백질의 유형 등을 포함하여 투여될 조성물의 유형)에 따라 달라질 수 있다. 투여 스케줄의 비제한적 예는 1일에 적어도 1회 용량, 격일에 적어도 1회 용량, 1일에 적어도 2회 용량, 1일에 적어도 3회 용량, 2일에 적어도 1회 용량, 3일에 적어도 1회 용량, 4일에 적어도 1회 용량, 5일에 적어도 1회 용량, 6일에 적어도 1회 용량, 1주에 적어도 1회 용량, 또는 1개월에 적어도 1회 용량의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 조작된 락토바실루스 세포의 적어도 1회 용량 (예컨대, 1회 용량 또는 3회 용량)은 1일 1회, 격일에 1회 또는 1주일에 1회 대상체에게 투여된다. 본원에 기재된 임의의 조작된 락토바실루스 세포 또는 단백질의 용량은 식사와 함께 투여되거나 식사 없이 투여될 수 있다.
적합한 투여 경로는 비경구, 주사 또는 이식으로, 피하, 정맥내, 근육내, 척수강내, 복강내, 피내, 흉골내, 관절내, 두개내, 병변내, 직장내 (intrarectually), 직장내 (intrarectally), 질내, 비내, 위내, 기관내 또는 폐내 투여를 포함한다. 대안적으로, 좌약, 경구 제형, 장, 코, 국소 또는 경점막 투여를 포함하는 다른 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌약의 경우, 결합제 및 담체는, 예컨대 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제형은, 예컨대 제약 등급의 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 초기제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제형 또는 분말의 형태를 취할 수 있다. 비제한적인 예로서, 락토바실루스 세포는 장용 캡슐, 정제, 슬러리 또는 유제품 기반 식품으로 제형화될 수 있다.
적합한 투여 경로는 투여될 조성물의 유형에 의존할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 예컨대, 특정 투여 경로 (예컨대, 비경구, 정맥내, 또는 피하 투여)는, 특정 이론에 구애됨이 없이, 박테리아의 혈류로의 직접적인 투여는 패혈증을 유발할 수 있기 때문에, 대상체에 박테리아 세포의 투여에 적합하지 않을 수 있다. 대조적으로, 비경구, 정맥내 또는 피하 투여는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성되는 재조합 펩티드의 투여에 적합할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 필요한 용량은 투여 경로; 제형의 특성; 대상자의 질병의 특성; 대상자의 종, 크기, 체중, 표면적, 연령 및 성별; 투여되는 다른 약물; 진료의의 판단의 선택에 의존한다. 적합한 용량은 0.01-100.0 mg/kg의 범위이다. 이용가능한 다양한 조성물 및 다양한 투여 경로의 상이한 효율을 고려하여 필요한 용량의 광범위한 변형이 예상된다. 예컨대, 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 더 많은 용량을 요구할 것으로 예상된다. 이들 용량 수준의 변화는 관련 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이 최적화를 위한 표준 실험 작업을 이용하여 조정될 수 있다. 적합한 전달 비히클 (예컨대, 중합체성 미세입자 또는 이식가능한 장치)에 조성물의 캡슐화는, 특히 경구 전달을 위한 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스를 사용하여 락토바실루스 균주-특이적 신호 펩티드 서열을 계산하는 단계를 포함한다 (예컨대, 하기 실시예 1 참조). 위치 가중치 매트릭스를 계산하는데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 프로그램은 GLAM이다. 일부 실시양태에서, 방법은 위치 가중치 매트릭스를 계산하는 단계 및 잠재적으로 비기능적인 변이체를 인실리코 (in silico) 필터링하기 위해 SP 기능의 예측 점수화를 가능하게 하는 알고리즘을 사용하는 단계를 추가로 포함한다 (예컨대, 하기 실시예 4 참조).
추가의 실시양태
본 개시내용은 또한 번호가 매겨진 단락에 의해 포함되는 하기의 추가적인 실시양태를 제공한다.
1. 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호 펩티드.
2. 단락 1에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
3. 단락 2에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
4. 단락 3에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
5. 단락 1에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
6. 단락 5에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
7. 단락 6에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 3에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
8. 단락 1에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
9. 단락 8에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
10. 단락 9에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 5에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
11. 단락 1에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
12. 단락 11에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
13. 단락 12에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 7에 의해 확인되는 아미노산 서열과 동일한 것인 인공 분비 신호 펩티드.
14. 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락의 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 단백질.
15. 단락 14에 있어서, 인공 분비 신호 펩티드가 단백질의 N-말단에 융합되는 것인 단백질.
16. 단락 14 또는 단락 15에 있어서, 단백질이 치료 단백질인 단백질.
17. 단락 16에 있어서, 단백질이 항체인 단백질.
18. 단락 17에 있어서, 항체가 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단백질.
19. 단락 17 또는 단락 18에 있어서, 항체가 단일-도메인 항체 (나노바디®)인 단백질.
20. 단락 16에 있어서, 치료 단백질이 시토카인인 단백질.
21. 단락 20에 있어서, 시토카인이 IL-10인 단백질.
22. 단락 1 내지 단락 15 중 어느 한 단락의 인공 분비 신호 펩티드 또는 단락 14 내지 단락 21 중 어느 한 단락의 단백질을 코딩하는 핵산.
23. 단락 22에 있어서, 핵산이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 것인 핵산.
24. 단락 23에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인 핵산.
25. 단락 22 내지 단락 24 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산이 코돈-최적화된 것인 핵산.
26. 단락 22 내지 단락 25 중 어느 한 단락의 핵산을 포함하는 벡터.
27. 단락 26에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 벡터.
28. 단락 22 내지 단락 25 중 어느 한 단락의 핵산 또는 단락 26 또는 단락 27의 벡터를 포함하는 조작된 락토바실루스 세포.
29. 단락 28에 있어서, 조작된 락토바실루스 세포가 엘. 가세리 및 엘. 람노수스 세포로부터 선택되는 것인 조작된 락토바실루스 세포.
30. 세포 배양 배지에서 단락 28 또는 단락 29의 조작된 락토바실루스 세포를 배양하여 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 생성하는 단계를 포함하는 단백질을 생성하는 방법.
31. 단락 30에 있어서, 조작된 락토바실루스 세포가 락토바실루스 람노수스 GG (LGG) 세포인 방법.
32. 단락 30 또는 단락 31에 있어서, 락토바실루스 세포가 세포 배양 배지 mL당 적어도 10 μg의 단백질을 생성하는 것인 방법.
33. 단락 32에 있어서, 락토바실루스 세포가 세포 배양 배지 mL당 적어도 30 μg의 단백질을 생성하는 것인 방법.
34. 단락 33에 있어서, 세포 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
35. 단락 33 또는 단락 34의 방법에 의해 생성된 단백질.
36. 대상체에게 단락 28 또는 단락 29의 조작된 락토바실루스 세포 또는 단락 35의 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
37. 단락 36에 있어서, 대상체가 자가면역 병태를 갖는 것인 방법.
38. 단락 37에 있어서, 자가면역 병태가 염증성 장 질환 또는 크론 질환인 방법.
39. 단락 36에 있어서, 대상체가 바이러스 감염 또는 미생물 감염을 갖는 것인 방법.
40. (a) 박테리아 균주-특이적 서열의 라이브러리 내의 신호 서열의 집단에 대한 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스 (PWM)를 계산하는 단계; 및
(b) 신호 서열의 집단에 대한 PWM에 기초하여 컨센서스 신호 펩티드 서열을 생성하는 단계
를 포함하는 방법.
41. 단락 40에 있어서, (c) 박테리아 균주의 세포에서 컨센서스 신호 펩티드 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된 관심의 이종 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
42. 단락 40 또는 단락 41에 있어서, 박테리아 균주가 예르시니아 종, 에쉐리키아 종, 크렙시엘라 종, 아시네토박테르 종, 보르데텔라 종, 네이세리아 종, 아에로모나스 종, 프란시에셀라 종, 코리네박테리움 종, 시트로박테르 종, 클라미디아 종, 헤모필루스 종, 브루셀라 종, 미코박테리움 종, 레기오넬라 종, 로도코쿠스 종, 슈도모나스 종, 헬리코박테르 종, 살모넬라 종, 비브리오 종, 바실루스 종, 에리시펠로트릭스 종, 살모넬라 종, 스트렙토미세스 종, 박테로이데스 종, 프레보텔라 종, 클로스트리디움 종, 비피도박테리움 종, 또는 락토바실루스 종의 균주로부터 선택되는 것인 방법.
43. 단락 42에 있어서, 박테리아 세포가 프로바이오틱 세포인 방법.
44. 단락 40 내지 단락 43 중 어느 한 단락에 있어서, 관심의 이종 단백질이 치료 단백질인 방법.
45. 단락 44에 있어서, 치료 단백질이 항체인 방법.
46. 단락 41 내지 단락 45 중 어느 한 단락에 있어서, 컨센서스 신호 펩티드 서열에 연결된 관심의 이종 단백질을 코딩하는 핵산이 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
실시예
실시예 1: 락토바실루스로부터 항체 단편을 분비할 수 있는 인공 분비 신호의 확인
다양한 항체 단편을 확실하고 재현성 있게 분비할 수 있는 신호 펩티드 서열을 확인하기 위해, 서열화된 게놈을 갖는 모든 락토바실루스의 컴퓨터 분석으로부터 조립된 분비 신호의 범-게놈 라이브러리의 대량신속처리 스크린을 수행하였다. 이는 분비를 개선하기 위해 유전자 다이얼이 회전될 수 있는 범위를 확장하는 현재까지 가장 큰 후보 분비 신호 펩티드 풀을 구성하고, 또한 병렬 접근에 대한 기초를 제공하였다: 라이브러리는 아마도 그들의 천연 단백질 파트너와 공동-진화하는 기존의 분비 신호에 의존하기보다는 잠재적으로 균주별로 일반화할 수 있는 인공 신호의 설계를 위한 템플릿 서열로 압축될 수 있다. 공개적으로 이용가능한 모티프 발견 알고리즘을 이용하여 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스 (PWM)를 계산하고 최대 확률 펩티드를 생성하기 위해 라이브러리의 균주-특이적 서브섹션을 분석하였다.
엘. 람노수스 GG 및 엘. 가세리는 (예컨대, 소화관 및 질 점막의) 인간 마이크로바이옴에서 주목할만한 프로바이오틱스이고, 인간 마이크로바이옴의 종점 적용에 사용될 수 있기 때문에, 펩티드 서열의 분석은 엘. 람노수스 GG (도 1, 패널 a) 및 엘. 가세리 (도 1, 패널 b)에서 수행되었다. 각각의 균주의 PWM에 의해 수득된 최고 확률 서열이 먼저 선택되었고 (엘. 람노수스 GG의 경우 서열식별번호: 1 및 엘. 가세리의 경우 서열식별번호: 3), 상응하는 균주-특이적이고 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 종 게놈으로부터 제조된 코돈-사용 표를 사용하여 생성되었다 (람노수스 GG의 경우 서열식별번호: 2 및 엘. 가세리의 경우 서열식별번호: 4). 이어서, 각각의 분비 신호 펩티드가 항-HIV 항체 단편1 (J3VHH)에 N-말단에서 융합 시 분비를 유도하는 능력을 시험하였다. 놀랍게도, 인공 신호 펩티드 둘 다는 J3VHH의 분비를 지시하였다 (도 2, 패널 a 및 b).
현재까지, 엘. 가세리에서 나노바디를 분비할 수 있는 자연 발생 분비 신호는 발견되지 않았다. 엘. 람노수스의 경우, 개시된 분비 신호 펩티드는 최고 수율의 자연-발생 서열을 두자릿수로 능가한다. 분비는 질량 분광측정에 의해 엘. 람노수스 및 엘. 가세리에 대해 각각 22.05% 및 59.84% 단백질 범위를 갖는 것으로 추가로 확인되었다 (범위의 차이는 도 2에 도시되는 상대적 분비 수율과 상관관계가 있다). 또한, 분비 신호 펩티드는 서열이 계산된 균주와 일치하지 않는 경우, 분비가 관찰되지 않았으며, 이는 이 전략의 균주-특이성을 나타낸다. 이들 서열이 구성적 프로모터에 의해 발현되는 경우, 신호 펩티드는 그들의 기능을 파괴하는 방식으로 신속히 돌연변이된다는 점이 주목할만하다. 그러나, 테트라사이클린-유도성 시스템에 의해 제어되는 경우, 그들은 유전적으로 안정하게 유지된다.
개시된 분비 신호 펩티드는 또한 제2의 공개된 항-HIV 나노바디®2 (JM4VHH), 아블린크스에 의해 시판되는 항-TNFα 나노바디® (오조랄리주맙), 및 광범위하게 중화하는 IgG 항체 VRC01로부터 유래되는 항-HIV 단일쇄 단편3 (VRC01scFv)을 포함하는 다른 항체 단편과 함께 기능하였다. 서열식별번호: 3으로 제공되는 분비 신호 펩티드에 융합 시, 엘. 가세리에 의한 상청액으로의 분비는 JM4VHH 및 오졸라리주맙의 경우 J3VHH와 동일한 수준으로 검출되고, VRC01scFv의 경우 그 수준의 절반으로 검출되었다 (도 3). 후자의 단백질에 대한 감소된 수율은 그것이 시험된 다른 항체 단편의 크기의 2배라는 사실에 기인할 수 있다.
개시된 분비 신호 펩티드를 사용하여 락토바실루스로부터 분비된 항체 단편을 시험하여 항체 단편이 기능적인지의 여부를 결정하였다. Sec 트랜스로카제 경로를 통해 외수송되는 단백질은 합성 및 분비 동안 접혀지지 않은 상태로 유지되며, 세포외 환경으로의 확산을 위해 단백질이 세포벽으로 방출될 때만 접히기 시작한다. 따라서, 단백질이 분비되는 것으로 나타나더라도, 단백질이 정확하게 접히고 기능적이라는 표시는 없다. 이에, 적절한 항원에 대한 결합 친화도를 측정하는 검정을 이용하여 분비된 항체 단편이 기능적인지의 여부를 결정하였다.
그 결과, 항체 단편은 적절한 항원에 대한 결합 친화도를 측정하는 검정을 이용하여 기능에 대해 직접적으로 시험함으로써 적절하게 접힌 것으로 확인되었다. 시험된 모든 항-HIV 항체는 gp120 - T-세포 CD4 수용체에 대한 결합을 조정하는 바이러스 코트 단백질 - 에 결합하는 것으로 기록되었다. 따라서, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)을 수행하여 서열식별번호: 3에 제공된 아미노산 서열을 갖는 분비 신호에 N-말단에서 융합된 항체 단편을 포함하는 엘. 가세리에서의 gp120에 대한 항체 결합 친화도를 측정하였다 (도 4). 모든 항-HIV 항체 변이체에 대해 측정된 결합 곡선은 각각1-3에 대해 이전에 공개된 결과와 필적한다. 결합 동역학을 실시간으로 측정하기 위해 옥테트 (Octet) 기기를 사용하여 생물층 간섭계법에 의해 기능을 2차적으로 검증하였다. 이들 실험은 시험된 항-HIV 항체에 대한 ELISA 데이터를 확증하였으며, 각각 VRC01scFV, J3VHH 및 JM4VHH에 대해 10.22 nM, 75.55 nM 및 110.9 nM의 HIV-RSC3에 대한 KD 값을 보고하였다. J3VHH 및 JM4VHH는 다른 항체 변이체, 예컨대 VRC01과 비교하여 RSC3 항원에 상대적으로 약한 결합을 갖는 것으로 기록되어 있음에 주목할 필요가 있다. 동시에, TNFα에 대한 엘. 가세리에서 분비된 오조랄리주맙 결합은 0.69 nM ± .26 nM의 KD를 갖는 것으로 측정되었다 (n = 3). 두 경우 모두에서, 예상되는 결합 활성이 없는 항체를 음성 대조군 (즉, TNFα 실험의 경우 J3VHH, HIV 실험의 경우 오조랄리주맙)으로 사용하였다. 음성 대조군은 모든 검증 실험에서 측정가능한 결합 활성을 등록하지 않았다. 유사하게, 상기 기재된 gp120 ELISA 검정에 의해 결정 시, 엘. 람노수스 GG SP1 (서열식별번호: 1)을 포함하는 인공 분비 신호는 기능적 J3VHH를 분비하였다 (도 7). 엘. 람노수스 GG SP1에 의해 분비되는, 아블린크스에 의해 시판되는 항-TNFα 항체 단편인 오조랄리주맙의 기능을 생물층 간섭계법에 의해 측정하였다. 이 방법은 분비된 항체 단편이 아블린크스에 의해 보고된 오조랄리주맙 활성과 동등하게 나노몰 친화도 (KD = 6.2 nM, 2개의 레플리케이트)로 표적 단백질에 결합한다는 것을 입증하였다 (도 11).
엘. 람노수스 GG에서 재현가능한 기능성을 갖는 또 다른 분비 신호 펩티드는 상이한 길이의 또 다른 서열 (엘. 람노수스 GG SP1의 경우 25개 아미노산에 대비하여 엘. 람노수스 GG SP2의 경우 30개 아미노산)에 기초하여 서열식별번호: 5 (엘. 람노수스 GG SP2)에서 제공되는 아미노산 서열로 확인되었다. 서열식별번호: 5를 코딩하는 핵산이 서열식별번호: 6으로 제공된다. 엘. 람노수스 GG SP1 및 엘. 람노수스 GG SP2는 모두 엘. 람노수스로부터 J3VHH를 분비하였다 (도 5). 엘. 람노수스 GG SP2에 의해 분비되는 J3VHH가 기능적인지의 여부를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. J3VHH에 융합된 엘. 람노수스 GG SP2를 포함하는 조작된 엘. 람노수스 GG로부터의 상청액 및 정제된 상청액을 분석하여 분비된 J3VHH의 gp120에 대한 결합 친화도를 결정하였다. gp120에 대한 결합은 음성 대조군과 비교하여 J3VHH에 융합된 엘. 람노수스 GG SP2를 포함하는 조작된 엘. 람노수스 GG로부터의 상청액 및 정제된 상청액에서 상당히 더 높았으며, 이는 분비된 J3VHH가 기능적임을 시사한다 (도 6).
문헌에 보고된 8개의 표준 신호 펩티드 서열의 예측된 분비 대 측정된 분비의 플롯이 생성되었다 (도 8). 각각의 자연 발생 신호 펩티드를 형광 단백질인 엠체리에 N-말단에서 융합시켰다. 이들 구축물을 엘. 가세리에서 시험하여 분비를 지시하는 각각의 자연 발생 신호 펩티드의 능력을 결정하였다. 분비 수준을 정제된 상청액에서 엠체리 형광의 양으로 측정하였다. 도 8은 엘. 람노수스 GG에서 기존 기술에 의한 예상 분비 효율과 실제 측정된 분비 사이에 상관성이 없음을 나타내었다. 엘. 가세리에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었으며, 하나의 자연 발생 분비 신호 펩티드를 제외하고는 모두에서 측정가능한 분비가 나타나지 않았다 (도 8). 분비는 Lp3189에 대한 분비 신호 펩티드에 대해서만 검출되었다. 특히, 서열식별번호: 3 (엘. 가세리 SP1)에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호는 Lp3189에 대한 분비 신호 펩티드를 능가하였다 (도 9). 도 8에서 도시되는 바와 같이, 도 9의 각각의 분비 신호 펩티드는 엠체리에 N-말단에서 융합되었으며, 정제된 상청액에서 엠체리 형광의 양으로 분비 수준을 측정하였다. 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)은 Lp3189에 대한 분비 신호 펩티드와 비교하여 3배 초과 수준의 엠체리를 분비하였다. 따라서, 서열식별번호: 3은 엘. 가세리에서 시험된 최고 성능의 자연 발생 신호 펩티드보다 더 많은 분비를 지시할 수 있다.
유사하게, 서열식별번호: 5에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호 (엘. 람노수스 GG SP2 또는 LGG SP2)는 도 8에 도시된 LGG에서 상위 2개의 수행 분비 신호 펩티드 (Apf, Usp)를 능가하였다. LGG SP2는 엠체리에 융합 시 Usp 및 Apf에 대한 신호 펩티드보다 정제된 상청액에서 1.5 내지 2.75배 더 높은 분비 수준을 나타내었다 (도 15). 특히, 도 9에 대한 데이터를 제공하는 실험은 50 mL의 박테리아 배양물의 정제를 통해 수행되었고, 도 15의 데이터는 5 mL의 박테리아 배양물로 생성되었다. 따라서, 도 9 및 도 15에 사용된 펩티드 사이의 절대 수율은 비교될 수 없으나, 사용된 배양물의 부피에 기초하여 10배 차이가 예상된다.
실시예 2: 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)의 치료 적용성
TZM-bl 검정을 이용하여 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)에 의해 분비되는 항-HIV 항체 단편 (J3VHH)이 HIV 감염으로부터 HIV-감수성 세포를 보호할 수 있는지의 여부를 결정하였다. J3VHH의 결합을 측정하였다 (도 10, 패널 a). TZM-bl 검정을 이용하여 항체로 처리함으로써 보호되는 인간 HIV-감수성 세포의 분율을 측정하였다 (도 10, 패널 b). 특히, 엘. 가세리 SP1에 의해 분비되는 J3VHH는 문헌1에 보고된 통상적으로 생성되는 J3VHH에 필적하는 활성 (IC50, 박스에 나타냄)을 나타낸다. 이것은 입증된 치료 단백질이 본질적으로 동등한 기능성을 가지고 생성될 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 항-시가 독소 항체 단편의 분비에 대한 인공 신호 펩티드의 영향
항-시가 독소 (Stx2) 항체 단편의 분비에 대한 인공 신호 펩티드의 영향을 결정하기 위해, 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)을 3개의 상이한 항-시가 독소 항체 단편 각각에 N-말단에서 융합시키고, 엘. 가세리에서 시험하였다. 정제되지 않은 상청액을 수집하고, 정제되지 않은 상청액 중의 각각의 항체 단편의 분비를 3개의 레플리케이트로 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 항-시가 독소 (Stx2) 단량체는 통상적인 단일 도메인 항체 단편 (17 kDa)이고, 이량체 (33.5 kDa) 및 삼량체 (48 kDa)는 각각 2개 및 3개의 융합된 단량체이다. 단량체를 가요성 글리신-세린 링커에 의해 융합시켜 이량체 및 삼량체를 생성하였다. 각각을 항-정제 염색 태그에 20분 동안 노출시켰다. 도 12에서 도시되는 바와 같이, 엘. 가세리 SP1은 Stx2 단량체, Stx2 이량체 및 Stx2 삼량체를 분비하였다 (도 12).
실시예 4: 머신 러닝에 의한 SP 기능의 예측 점수화
하기에는 신호 펩티드의 구성 아미노산 분석을 통해 그의 기능을 예측하기 위해, 엘. 플란타룸4에서의 이종 (NucA) 분비 라이브러리로부터 공개된 데이터에 대해 훈련된 데이터 분석 방법이 제공된다. 특정 서브세트의 아미노산은 그들의 물리화학적 특성의 유사성으로 인해 펩티드 서열에서 서로의 치환을 허용할 수 있다 (도 13, 패널 a). 기능적 특성은 계산된 분비 신호에 대한 C-말단 절단 모티프 서열 유사성, N-말단 서열 모티프 길이, N-말단 서열 모티프 친수성, 코어 서열 길이, 코어 서열 소수성, 코어 서열 막횡단 나선 길이, 코어 서열 막횡단 나선성 및 하기 비율을 포함한다: 코어 서열 막횡단 나선 길이/소수성 서열 길이. 이것을 분비 신호 펩티드에 대해 생성된 위치 가중치 매트릭스에 의해 주어진 서열 확률과 쌍을 이루어, 약한 수행자를 인실리코 확인함으로써 스크린에서 변이체의 수를 감소시킬 수 있다. 또한, 머신 러닝 기술로서, 강하다고 예측되는 서열의 분비 스크린에 의해 산출되는 임의의 측정된 데이터는 모델로 다시 공급될 수 있으므로, 후속 스크린에 대한 예측의 정확성을 향상시킨다. 특이값 분해를 통한 다차원 기능적 특성 데이터의 선형 판별 분석의 예가 도 13, 패널 b에 제공된다. 머신 러닝에 의한 SP 기능의 예측 점수화를 위한 파이프라인은 하기 단계를 포함한다:
1. 주어진 균주의 천연 분비 펩티드 (SP) 라이브러리를 생성하기 위해 시그널피 (SignalP)를 사용;
2. GLAM을 이용하여 주어진 천연 SP 라이브러리에 대한 컨센서스 서열을 생성;
3. 컨센서스된 위치 폭 매트릭스를 감안하여 인공 SP 라이브러리를 생성;
4. SVD-LDA로 인공 SP 라이브러리 멤버 기능을 예측;
5. 기능적 가능성이 낮은 SP를 필터링.
6. 기능적 스크린을 수행; 및
7. 적중이 없는 경우, 측정된 데이터를 단계 4로 피드백하고, 알고리즘을 재훈련하고, 예측을 반복.
실시예 5: LGG에 의한 IL-10 분비
엘. 람노수스 GG (LGG)는 부분적으로 IL-10을 분비하도록 조작되어 본 개시내용의 합성 분비 신호가 나노바디® 이외의 다른 치료 페이로드와 기능한다는 것을 입증하였다. 이전에 오조랄리주맙, 보바릴루주맙, 항-HIV 나노바디® 및 형광 리포터 단백질과 성공적으로 사용된 동일한 신호 펩티드 (서열식별번호: 1)를 IL-10에 융합시켰다. LGG는 동일한 신호 펩티드로 IL-10을 강력하게 분비하여, 배양 상청액 mL당 적어도 30 μg의 시토카인을 생성할 수 있었다 (도 14). 본원에 보고된 분비 수준은 이전에 보고된 3 μg/mL 분비 수준의 적어도 10배이다 (Steidler, L., et al. 2000. Science 289 (5483): 1352-55). 엘. 락티스 (L. lactis)와 달리 LGG는 담즙산염에 의해 죽지 않으므로 치료 단백질 (예: 전장 단백질, 융합 단백질, 펩티드 등)에 이상적인 경구 전달 비히클이 된다.
실시예 6: 엘. 가세리에 대한 제2의 기능적 SP 서열 (엘. 가세리 SP2, 서열식별번호: 7)
엘. 가세리에 대한 제2의 컨센서스 서열을 기초로 하여 또 다른 합성 SP (SP2)를 시험하였으며, 여기서 GLAM2는 모든 천연 엘. 가세리 신호 펩티드의 평균 길이: 33aa로 미리 설정되었다 (도 16).
엘. 가세리 SP2는 엘. 가세리 SP2에 융합된 J3-VHH를 발현하는 재조합 엘. 가세리로부터의 정제된 상청액의 단백질 겔 분석을 통해 검증되었으며, 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3, 길이 = 30 aa)과 비교되었다. 엘. 가세리 SP2는 엘. 가세리 SP1 (예상 크기 14.3 kD)과 비교하여 (비록 약간 적지만) 필적할만한 양의 단백질을 분비하였다 (도 17). 겔 결과는 또한 검출가능한 양의 비-절단된 단백질이 없음을 나타내며, 이는 두 합성 SP가 신호 펩티다제 I에 의해 효율적으로 프로세싱된다는 것을 나타낸다.
분비된 생성물은 정제되지 않은 상청액으로 항-gp120 ELISA에 의해 나타난 바와 같이 기능적인 것으로 검증되었다 (도 18). 이 검정에 의해 나타난 CFU당 결합 강도는 또한 엘. 가세리 SP2와 비교하여 엘. 가세리 SP1에 대한 겔에 의해 시각적으로 보여진 더 적은 양의 단백질과 일치하며 - 이는 더 짧은 합성 SP 길이가 일반적으로 바람직할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 주어진 컨센서스에 대한 허용된 아미노산 치환의 적절한 물리화학적 특성 분석
적어도 2개의 합성 신호 펩티드 서열은 본원에서 엘. 람노수스 GG 및 엘. 가세리에서 이종 단백질을 기능적으로 분비하는 것으로 입증되었다. 각각의 예에서, 완전히 상이한 신호 펩티드가 별개의 컨센서스 서열에 기초하여 생성되었다 - 주어진 종에 대한 평균 신호 펩티드 길이에 기초한 하나의 신호 펩티드 (SP2) 및 GLAM2 컨센서스 소프트웨어가 상이한 길이를 무작위로 샘플링하고 스스로 최적의 길이를 예측하도록 설정된 경우의 하나의 신호 펩티드 (SP1). 이들 두 서열을 비교하기 위해, 각각의 SP의 모티프 (N-말단 친수성 헤드 서열, 소수성 코어 서열, 및 C-말단 유형 I 신호 펩티다제 절단 부위)에 대해 2가지의 물리화학적 아미노산 특성 (소수성 및 나선성)를 플롯팅하였다. 도 19a는 엘. 람노수스 GG SP1 (서열식별번호: 1)에 대한 소수성 및 나선성 곡선을 도시하고, 도 19b는 엘. 람노수스 GG SP2 (서열식별번호: 5)에 대한 소수성 및 나선성 곡선을 도시한다. 도 20a는 엘. 가세리 SP1 (서열식별번호: 3)에 대한 소수성 및 나선성 곡선을 도시하고, 도 20b는 엘. 가세리 SP2 (서열식별번호: 7)에 대한 소수성 및 나선성을 도시한다.
친수성 N-말단 헤드 서열 및 유형 I 신호 펩티다제 절단 부위에 대한 컨센서스는 각각의 균주에 대해 SP1과 SP2 사이에서 본질적으로 동일하였으며, 하기의 2가지를 예외로 하였다: 1) 엘. 람노수스 GG의 경우, N-말단 서열은 SP2에 대비하여 SP1에서 하나의 K가 더 짧았으며, 이는 전체 길이와 비례하는 차이일 수 있으며; (2) 엘. 가세리의 경우, 절단 부위의 마지막 아미노산은 SP1에서 S이고 SP2에서 T였지만, 이들 아미노산은 가까운 코그네이트 (cognate)이며 (상기 기재된 보존적 아미노산 치환기 e에 해당), 최종 위치는 이 모티프 (즉, AXA-AX)에서 더 가변적인 것으로 이해된다.
그들은 소수성 코어의 함량이 상이하였지만, I, L 및 V (상기 기재된 보존적 아미노산 치환기 a에 해당) 및 A 및 G (상기 기재된 보존적 아미노산 치환기 d에 해당) 내에서 가까운 상대적 아미노산 치환에 의해서만 상이하였으며 - 길이의 감소에도 불구하고 유사한 소수성 및 나선성 프로파일 곡선을 발생시켰으며 - 흥미롭게도, 전체 길이의 감소에도 불구하고, 절단 모티프 이전에 5-6개 아미노산을 시작하는 이전에 특징지어졌던 서열 소수성 및 나선성의 감소는 보존된다. 이는 현재까지 공개된 문헌에서 논의되지 않았던, 신호 펩티드 프로세싱을 위한 이러한 특색에 대한 추정적 중요성을 나타낸다. 따라서, 이들 소수성 및 나선성 곡선을 보존하는 아미노산 치환은 기능적 SP 변이체를 더 잘 산출할 것으로 예상된다.
실시예 8: 생체내에서 엘. 람노수스 GG에 의한 IL10의 분비
합성 신호 펩티드로 조작된 락토바실루스가 시험관내에서와 같이 생체내에서 유사한 기능을 나타낸다는 것을 입증하기 위한 개념 증명 실험을 수행하였다. 이 경우, 건강한 마우스 (스트레인 balb/c)에 10^10 CFU의 IL10을 분비하도록 조작된 재조합 엘. 람노수스 GG (LGG SP2, 서열식별번호: 5를 사용)를 경구 위관 영양으로 연속 5일 동안 1일 1회 접종하였다. 이 기간 동안, 한 그룹의 마우스에는 0.1 mg/mL의 안히드로테트라사이클린이 포함된 식수를 공급하였으며, 이는 안히드로테트라사이클린에 민감한 전환가능한 프로모터에 의해 제어되는 SP2-IL10의 발현을 유도한다. 다른 그룹에는 어떠한 유도제도 제공되지 않았으며, 음성 대조군으로 사용되었다. 5일째에, 마우스를 희생시키고, 전체 결장 조직을 수거하고, 균질화하고, 정확히 배양 상청액으로 이전에 수행한 바 같이 IL10 분비 수율을 측정하였다 - 정제된 IL10의 표준 곡선과 함께 IL10 캡처 ELISA. IL10은 건강한 결장 조직에서 자연적으로 발현되기 때문에, 유도제가 제공되지 않은 음성 대조군에 배경 신호가 존재한다. 그러나, 유도는 결장 IL10의 수준을 45% 증가시키며, 유도된 재조합체에 의해 전체 결장에 3.9 ng IL10을 전달한다 (도 21).
이전 연구는 마우스에게 1일 17회 제공된 재조합 IL10 분비 엘. 락티스에 의해 전체 결장에 전달된 0.28 ng의 IL10이 DSS-결장염 모델에서 결장염 증상의 30% 감소를 부여하였다는 것을 입증하였다 [5]. 놀랍게도, 본원에 사용된 재조합 엘. 람노수스 GG는 마우스에게 1일 1회 제공되는 경우 3.9 ng의 IL10을 전달한다 - 따라서, ~14배 이상의 IL10이 순식간에 전달되었으며, 이전 방법과 비교하여 훨씬 적은 용량의 박테리아가 필요하였다.
실시예 9: 시험관내에서 엘. 람노수스 GG에 의한 GLP1의 분비
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP1)은 결장 L-세포에 의해 자연적으로 생성되는 내분비 호르몬이며, 인슐린 생성을 자극하여 글루코스 내성을 향상시킨다. 또한 식사 시 만족감을 느끼는데 기여하며, 지질 대사에 영향을 끼치고 내피 기능장애를 역전시키고 심방 혈압을 낮추는 것으로 관찰되었다. 따라서, 당뇨병, 비만 및 심혈관 질환에 대한 치료 후보로 제안되었다 [6]. 그러나, GLP1은 혈류에서 불활성 형태로 빠르게 분해되고, 경구 투여시 소화된다. 따라서, 조작된 미생물은 결장에서 발생하는 고유 GLP1 발현과 유사한 방식으로 GLP1 전달을 위한 독특한 기회를 제공한다. 본원에 입증되는 바와 같이, 본 개시내용의 합성 신호 펩티드는 GLP1의 분비를 촉진하므로, 작은 펩티드 (2-5 kDa)로 구성된 호르몬이 본원에서 제공되는 방법에 의한 분비에 접근가능한 추가의 페이로드 부류임을 나타낸다. 소화관 공생체 엘. 람노수스 GG (서열식별번호: 5)는 SP2를 사용하는 유도 하에 GLP1을 분비하도록 조작되었다. 분비된 GLP1은 정제된 GLP1 표준과 함께 GLP1 캡처 ELISA 검정을 이용하여 시험관내에서 안히드로테트라사이클린에 의해 4시간 유도 후 무세포 상청액에서 측정되었다. 놀랍게도, 이 재조합 균주는 최대 5.3 ng/mL의 GLP1을 분비하고 전달할 수 있다 (도 22 및 23 참조).
실시예 10: 엘. 가세리에 의한 hBD1의 분비
합성 신호 펩티드에 의한 분비에 대한 또 다른 단백질 페이로드 부류는 항미생물성 펩티드 및 데펜신을 포함하여 10-50개 아미노산 길이의 작은 펩티드 이펙터이다. 이 부류의 펩티드의 하나의 예시적인 경우는 인간 베타 데펜신 1 (hBD1)이다. 이 펩티드는 락토바실루스에 대해 무독성이고 [7] 직접적인 살미생물 활성 및 화학주성에 의해 주도되는 이펙터 면역 세포 동원을 통한 항-박테리아 활성을 가지므로 [8] 이 적용에 이상적인 페이로드이다. 인간 미생물총에 의해 분비되는 hBD1에 대한 적용은 이러한 박테리아가 전달될 수 있는 임의의 점막 부위에서 임의의 그람-양성 감염의 치료에 적용될 수 있다. 이 실험은 SP1을 사용하여 hBD1을 분비하도록 조작된 유도된 재조합 엘. 가세리로부터의 상청액이 병원성 균주 이. 콜리 ATCC 25922의 성장을 억제할 수 있는지의 여부를 시험하였다. hBD1은 이 균주에 대해 5 - 10 μg/mL의 최소 억제 농도를 나타내는 것으로 공지되어 있다 [8]. 6시간 동안 유도된 엘. 가세리 배양물로부터의 무세포 상청액을 50:50 비율로 초기 지수기 (OD 값 0.25 내지 0.35 범위)로 미리-성장된 이. 콜리 배양물과 혼합하였다. 비변형된 엘. 가세리, hBD1-분비 엘. 가세리 및 락토바실루스 성장 배지 (MRS)에 의해 허용되는 이. 콜리의 성장을 3회 측정하고 37℃에서 20시간 후 (이. 콜리가 없는 MRS에서의) 배경 광학 밀도 신호와 비교하였다. 놀랍게도, WT 엘. 가세리는 아마도 자연적으로 분비된 박테리오신을 통해 대략 32%까지 정균적으로 성장을 억제하는 반면, hBD1을 분비하는 엘. 가세리는 98%까지 이. 콜리 성장을 방지하였다 (도 24).
재료 및 방법
성장 조건
락토바실루스는 형질전환된 배양물을 성장시키는 경우 에리스로마이신 선별 하에 37℃ 또는 실온에서 MRS 배지로 배양되었다. 무수 테트라사이클린은 단백질 생성을 목적으로 세포를 성장시키는 경우 최대 500 ng/mL의 농도로 첨가되었다. 전형적으로, 세포는 중간-로그 성장기 (광학 밀도 = 0.4-0.6)가 될 때까지 통상적으로 성장시킨 다음, 정체기에 도달할 때까지 (OD = 1-1.2) 무수 테트라사이클린을 첨가하였다. 제2 성장기는 37℃에서 몇 시간 또는 실온에서 밤새 일어날 수 있다. 엘. 가세리는 진탕되고 통기되는 인큐베이터에서 성장시켰다. 엘. 람노수스 GG는 혐기성 조건에서 성장시켰다.
시약
1. MRS 배지: 55 g의 하기의 칵테일을 1 L 증류수와 혼합, 15분 오토클레이브:
디프코(Difco)TM 락토바실루스 MRS 한천
리터 당 적합한 포뮬러*
프로테오즈 펩톤 번호 3 10.0 g
소고기 추출물 10.0 g
효모 추출물 5.0 g
덱스트로스 20.0 g
폴리소르베이트 80 1.0 g
암모늄 시트레이트 2.0 g
소듐 아세테이트 5.0 g
황산마그네슘 0.1 g
황산망간 0.05 g
인산이칼륨 2.0 g
병 바닥에서 갈색 시럽을 점검함으로써 배지가 캐러멜화되지 않았는지를 확인한다.
2. MRS 한천: MRS 배지 제형 + 1.5% w/v의 박토한천 (BactoAgar), 15분 오토클레이브한다.
3. 글리신 스톡 용액: 20 g의 글리신을 100 mL 증류수와 혼합하고, 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
4. 전기천공 컨디셔너 1: 증류수 중의 0.5 M 수크로스, 7 mM 인산칼륨, 1 mM 염화마그네슘 용액; 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
5. 전기천공 컨디셔너 2: 증류수 중의 925 mM 수크로스, 3.5 mM 염화마그네슘 용액; 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
6. 회수 배지 1: 20 mM 염화마그네슘, 2 mM 염화칼슘으로 MRS 배지의 분취물을 보충하고; 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
7. 회수 배지 2: 0.5 M 수크로스, 0.1 M 염화마그네슘으로 MRS 배지의 분취물을 보충하고; 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
8. STE 배지: 6.7% 사카로스, 50 mM 트리스-Cl pH 8, 1 mM EDTA; 0.22 μM 막으로 필터 멸균한다.
락토바실루스로 구축물을 도입하는 방법
1. MRS 배지에 락토바실루스의 예비-배양물을 접종, 형질전환당 1 mL 필요
2. 예컨대 하기의 균주의 요구에 따라 밤새 또는 밀도 (1.0 이상의 광학 밀도)로 성장시킴:
a. 엘. 람노수스 GG: 혐기성 배양을 위해 평가된 BD 가스팍(BD GASPAK)™으로 보충된 2.5 g의 팔라듐 촉매를 갖는 혐기성 용기에서 37도 (Ref # 260683)
b. 엘. 가세리: 37도, 호기성 조건
3. 예비-배양물을 0.25-2.5%의 최종 농도로 (균주별로 최적화됨) 글리신 스톡 용액이 보충된 MRS 배지에서 1/10 희석으로 계대배양함
a. 엘. 람노수스 GG: 2% 글리신
b. 엘. 가세리: 0.5% 글리신
4. 0.25의 광학 밀도로 인큐베이션함
5. 인큐베이션을 멈추고 0-20 μg의 암피실린으로 배지를 보충함
a. 엘. 람노수스 GG: 10 μg
b. 엘. 가세리: 0 μg
6. 0.5의 광학 밀도로 인큐베이션함
7. 4-21도의 주위 온도에서 2000-6000 G에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화시킴
a. 엘. 람노수스 GG: 5000G, 21도
b. 엘. 가세리: 3500G, 4도
8. 0.5 부피의 전기천공 컨디셔너로 세포를 기계적으로 재현탁시키고 간단히 혼합함 (컨디셔너의 선택은 균주별로 최적화됨)
a. 엘. 람노수스 GG: 전기천공 컨디셔너 1
b. 엘. 가세리: 전기천공 컨디셔너 2
9. 단계 7에 따라 세포를 펠렛화시킴
10. 단계 8에 따라 세척을 반복함
11. 단계 7에 따라 세포를 펠렛화시킴
12. 10 mL의 원래의 MRS + 글리신 배양 부피당 100 uL의 전기천공 컨디셔너로 세포를 기계적으로 재현탁시킴
13. 100 μL의 재현탁된 세포를 얼음에서 미리-냉각시킨 0.2 cm 전기천공 큐벳에 분주함
14. 1-5 uL의 플라스미드 DNA를 TE 버퍼에 용해된 50-500 ng의 DNA와 혼합함 (균주별로 최적화된 DNA 양을 투입)
a. 엘. 람노수스 GG: 100-200 ng DNA
b. 엘. 가세리: 400 ng DNA
15. 사용되는 전기천공 컨디셔너에 따라 하기의 조건으로 전기천공함
a. 전기천공 컨디셔너 1 - 피크 전압: 1.7 kV, 커패시턴스: 25 uF, 병렬 저항: 200 ohm
b. 전기천공 컨디셔너 2 - 피크 전압: 1.5 kV, 커패시턴스: 25 uF, 병렬 저항: 800 ohm
16. 사용되는 전기천공 컨디셔너에 따라 하기의 조건에서 전기천공된 세포를 재현탁시킴
a. 전기천공 컨디셔너 1 - 3 mL 회수 배지 1
b. 전기천공 컨디셔너 2 - 1 mL 회수 배지 2
17. 2-4시간 동안 세포 성장 조건에 따라 인큐베이션을 통해 세포를 회수함
a. 엘. 람노수스 GG: 3시간
b. 엘. 가세리: 2시간
18. 예컨대 하기의 플라스미드 선별 마커에 대한 적절한 항생제 농도로 보충된 MRS 한천에서 100 uL의 회수된 세포 (또는 그의 농축물/희석물)를 확산시킴:
a. 엘. 람노수스 GG: 10 μg/mL 에리트로마이신
b. 엘. 가세리: 4 μg/mL 에리트로마이신
19. 선별된 균주에 대해 액체 배양에서 사용된 것과 동일한 성장 조건에서 48-72시간 인큐베이션함
a. 엘. 람노수스 GG: 혐기성 배양을 위해 평가된 BD 가스팍™으로 보충된 2.5 g의 팔라듐 촉매를 갖는 혐기성 용기에서 37도 (Ref # 260683), 48시간 동안
b. 엘. 가세리: 37도, 호기성 조건, 72시간 동안
20. 형질전환 후 DNA 진단을 위해
a. 엘. 람노수스 GG: 1 uL의 콜로니 바이오매스를 선택하고, 용해를 위해 16 uL STE 완충액 (pH 8) + 1.6 uL 리소자임 + 2 uL 프로테이나제 K + 0.4 uL 무타노리신에서 재현탁시킴. 37도에서 30분 인큐베이션함. PCR 반응에서 템플릿으로 0.5-1 uL의 용해된 물질을 사용하거나, 필요에 따라 RCA 기반 생어 (Sanger) 서열분석을 위해 전체 부피를 사용함
b. 엘. 가세리: 전체 콜로니 바이오매스를 선택하고, 선별 항생제가 보충된 3 mL MRS 배지에 재현탁시키고, 광학 밀도가 1.0이 될 때까지 24-48시간 동안 성장시킴. PCR 반응에서 템플릿으로 직접적으로 0.5-1 uL의 배양액을 사용하거나, 표준 기술에 따라 액체로부터 전체 플라스미드 DNA를 추출함 (예: 퀴아젠(Qiagen)® 미니프렙).
c.
인공 분비 서열을 계산하는 방법
1) 시그널피는 분비를 조작하고자 하는 주어진 균주의 프로테옴 (NCBI 프로테옴 데이터베이스에서 공급됨) (즉, 엘. 람노수스 SP 1 및 엘. 람노수스 SP 2의 경우 엘. 람노수스 프로테옴, 엘. 가세리 SP의 경우 엘. 가세리 프로테옴)으로부터 가능한 모든 천연 SP 서열을 컴퓨터로 조사하는데 사용되었다.
2) 천연 SP 서열의 아미노산 파스타 파일이 생성되었으며, 컨센서스 서열의 원하는 길이 (길이 25는 엘. 람노수스 SP 1에 대해 사용되고, 길이 30은 엘. 람노수스 SP2에 대해 사용되고, 길이 30은 엘. 가세리 SP1에 대해 사용됨)로 GLAM에 투입되었다. 일반적으로, 단계 1에서 생성되는 천연 SP 풀의 평균 길이가 사용되었다.
3) GLAM은 파스타 파일 및 원하는 길이 - 가장 가능성이 높은 컨센서스 서열 - 를 고려하여 가능한 컨센서스 서열에 대한 위치 가중치 매트릭스를 생성한다. 각각의 주어진 서열 위치에 대해 가장 높은 가능성의 아미노산을 인공 SP 서열로 취하여 사용하였다 - 도 1의 서열 로고 이미지에서 최상위 문자로 표시됨.
서열
엘. 람노수스 GG SP1
Figure pct00001
엘. 람노수스 GG SP1 핵산
Figure pct00002
엘. 가세리 SP1
Figure pct00003
엘. 가세리 SP1 핵산
Figure pct00004
엘. 람노수스 GG SP2
Figure pct00005
엘. 람노수스 GG SP2 핵산
Figure pct00006
엘. 가세리 SP2
Figure pct00007
엘. 가세리 SP2 핵산
Figure pct00008
GLP1:
Figure pct00009
HBD1:
Figure pct00010
엘. 가세리 SP3
Figure pct00011
참조문헌
Figure pct00012
본원에 개시된 모든 참조문헌, 특허 및 특허원은 각각이 인용되는 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수 형태는, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
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상기 명세서 뿐만 아니라 청구범위에서, "포함하는", "가지고 있는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "구성되는" 등과 같은 모든 과도적 문구는 개방형, 즉 포함하지만 제한되지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"의 과도적 문구만이 미국 특허청의 특허심사절차 매뉴얼 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이 각각 폐쇄된 또는 반-폐쇄된 과도적 문구이다.
수치에 선행하는 용어 "약" 및 "실질적으로"는 인용된 수치의 ± 10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상단과 하단 사이의 각각의 값이 본원에서 구체적으로 고려되고 설명된다.
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College <120> ARTIFICIAL SECRETION PEPTIDES FOR HETEROLOGOUS PROTEIN PRODUCTION <130> H0498.70651WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/691,553 <151> 2018-06-28 <150> US 62/676,203 <151> 2018-05-24 <150> US 62/584,367 <151> 2017-11-10 <150> US 62/575,350 <151> 2017-10-20 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Lys Lys Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Cys Gly Gln Val Ser Ala Ala Thr 20 25 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 atgaagaaga aattgttggc attggcattg ttggcattgt tgttggcagg ctgcggccaa 60 gtttcagcag caacc 75 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Met Lys Lys Lys Leu Leu Ser Leu Gly Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Ala Cys Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala Ser 20 25 30 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 atgaaaaaaa aattattatc attaggtgct gctttagctt tattaggttt atcattaact 60 gcttgttcaa atactgctaa agctgcttca 90 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Met Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Leu Gly Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Gly Cys Gly Thr Ser Val Ser Ala Ala Thr 20 25 30 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 atgaaaaaat tgttgttgtt gttggttgtt ttgttgggct tggcagcatt gttgttgtca 60 ggctgcggca cctcagtttc agcagcaacc 90 <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Met Lys Lys Lys Leu Ile Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Phe 1 5 10 15 Gly Leu Gly Leu Ala Leu Thr Cys Ser Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala 20 25 30 Ser <210> 8 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 atgaaaaaaa aattgattgt tttgttggca gcattggcat tgttgtttgg cttgggcttg 60 gcattgacct gctcatcaaa taccgcaaaa gcagcaacc 99 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 9 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 20 25 30 Val Lys Gly Arg Gly 35 <210> 10 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 10 Gly Asn Phe Leu Thr Gly Leu Gly His Arg Ser Asp His Tyr Asn Cys 1 5 10 15 Ile Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala Cys Pro Ile Phe Thr 20 25 30 Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala Lys Cys Cys Lys 35 40 45 <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Met Lys Lys Lys Leu Ile Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu Phe 1 5 10 15 Gly Leu Gly Leu Ala Leu Thr Cys Ser Ser Asn Thr Ala Lys Ala Ala 20 25 30 Thr

Claims (32)

  1. 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인공 분비 신호 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 것인 인공 분비 신호 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 98% 동일성을 갖는 것인 인공 분비 신호 펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 아미노산 서열이 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 11, 및 서열식별번호: 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인 인공 분비 신호 펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 인공 분비 신호 펩티드가 단백질의 N-말단에 융합되는 것인 단백질.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 단백질이 치료 단백질인 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 단백질이 항체이고, 임의적으로 항체가 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 치료 단백질이 시토카인이고, 임의적으로 시토카인이 IL-10인 단백질.
  10. 제7항에 있어서, 치료 단백질이 내분비 호르몬이고, 임의적으로 내분비 호르몬이 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP1)인 단백질.
  11. 제7항에 있어서, 치료 단백질이 항미생물성 펩티드이고, 임의적으로 항미생물성 펩티드가 인간 베타 데펜신 1 (hBD1)인 단백질.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 인공 분비 신호 펩티드 또는 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 핵산.
  13. 제22항에 있어서, 핵산이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 것인 핵산.
  14. 제12항 또는 제13항의 핵산을 포함하는 조작된 락토바실루스 (Lactobacillus) 세포.
  15. 제14항에 있어서, 조작된 락토바실루스 세포가 엘. 가세리 (L. gasseri) 세포 및 엘. 람노수스 (L. rhamnosus) 세포로부터 선택되는 것인 조작된 락토바실루스 세포.
  16. 세포 배양 배지에서 제14항 또는 제15항의 조작된 락토바실루스 세포를 배양하여 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 생성하는 단계를 포함하는, 단백질을 생성하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 조작된 락토바실루스 세포가 락토바실루스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG) 세포인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 락토바실루스 세포가 세포 배양 배지 mL당 적어도 10 μg의 단백질을 생성하는 것인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지로부터 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 대상체에게 제14항 또는 제15항의 조작된 락토바실루스 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 대상체가 자가면역 병태를 갖는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 자가면역 병태가 염증성 장 질환이고, 임의적으로 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론 질환인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 대상체가 미생물 감염을 갖는 것인 방법.
  24. (a) 박테리아 균주-특이적 서열의 라이브러리 내의 신호 서열의 집단에 대한 아미노산 잔기 위치 가중치 매트릭스 (PWM)를 계산하는 단계; 및
    (b) 신호 서열의 집단에 대한 PWM에 기초하여 컨센서스 신호 펩티드 서열을 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, (c) 박테리아 균주의 세포에서 컨센서스 신호 펩티드 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된 관심의 이종 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하고, 임의적으로 이종 단백질이 치료 단백질인 방법.
  26. 염증성 장 질환을 갖는 대상체에게 락토바실루스 람노수스로부터 유래되는 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 항-염증성 시토카인을 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 락토바실루스 람노수스 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 인공 분비 신호 펩티드가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 인공 분비 신호 펩티드가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항-염증성 시토카인이 IL10인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 인공 분비 신호 펩티드에 융합된 항-염증성 시토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  31. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 락토바실루스 람노수스 세포에 의해 대상체에서 생성되는 항-염증성 시토카인의 양이, 임의적으로 조작된 락토바실루스 람노수스 세포의 단일 용량 후, 대조 조건 하에서 생성되는 항-염증성 시토카인의 양보다 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 크고, 임의적으로 대조 조건이 항-염증성 시토카인을 분비하도록 조작된 락토바실루스 세포를 포함하는 것인 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 존재하는 결장 IL10의 수준이, 임의적으로 조작된 락토바실루스 람노수스 세포의 단일 용량 후, 기준선과 비교하여 적어도 25%, 적어도 35%, 또는 적어도 45% 증가되는 것인 방법.
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