CN110913875A - 程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节子和抗癌治疗剂的微生物 - Google Patents

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S·萨哈
A·费舍尔
Y·米利特
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Abstract

公开了基因程序化微生物，例如细菌或病毒，其药物组合物，和调控和治疗癌症的方法。

Description

程序化以在肿瘤细胞中产生免疫调节子和抗癌治疗剂的微 生物
相关申请
本申请要求2017年1月6日提交的美国临时申请号62/443,634；2017年1月6日提交的美国临时申请号62/443,639；2017年1月11日提交的PCT申请号PCT/US2017/013072；2017年7月12日提交的美国临时申请号62/531,784；2017年8月9日提交的美国临时申请号62/543,322；2017年8月30日提交的美国临时申请号62/552,319；2017年11月29日提交的美国临时申请号62/592,317；和2017年12月18日提交的美国临时申请号62/607,210的优先权；其全部内容各自通过引用明确并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2018年1月4日，名称为126046_21320_SL.txt，大小为1,278,036个字节。
背景技术
目前的癌症疗法通常采用使用免疫疗法、外科手术、化疗、放射治疗、或其某种组合(美国癌症协会)。虽然这些药物对癌症患者显示出巨大的益处，但许多癌症仍然难以使用常规疗法治疗。目前，许多常规癌症疗法全身施用并对健康组织产生不利影响，导致显著的副作用。例如，许多癌症疗法专注于激活免疫系统以增强患者的抗肿瘤反应(Kong等，2014)。然而，尽管有这样的疗法，肿瘤周围的微环境仍然具有高度免疫抑制作用。此外，全身改变的免疫调节引发免疫功能失调，包括机会性自身免疫疾病和免疫相关的不良事件的发作。
在过去几十年中已经做出了重大努力来开发特异性靶向癌细胞的细胞毒性药物。近年来，肿瘤学已经发生了范式转变，其中癌症的临床问题不仅被认为是癌细胞中基因异常的积累，而且还被认为是免疫系统对这些异常细胞的耐受性。因此，最近的抗癌疗法专门被设计为靶向免疫系统而非癌细胞。这样的疗法旨在逆转癌症免疫耐受性并刺激有效的抗肿瘤免疫应答。例如，目前的免疫疗法包括免疫刺激分子，其是靶向渗入肿瘤微环境的各种免疫细胞群的模式识别受体(PRR)激动剂或免疫刺激性单克隆抗体。然而，尽管它们具有免疫靶向设计，但这些疗法已经在临床上开发为犹如它们是依赖于免疫治疗剂的全身施用(例如，每2-3周静脉内输注)的常规抗癌药物。结果是许多目前的免疫疗法由于高剂量需求而遭受毒性，并且还经常导致不期望的自身免疫应答或其他免疫相关的不良事件。
最近的研究表明，某些类型的肠道微生物在小鼠中的存在可以增强癌症免疫治疗的抗肿瘤作用，而不增加毒副作用(M.Vétizou等等,“Anticancer immunotherapy byCTLA-4 blockade relies on the gut microbiota,”Science,doi:10.1126/aad1329,2015；A.Sivan等,“Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity andfacilitates anti–PD-L1 efficacy,”Science,doi:0.1126/science.aac4255,2015)。在这些小鼠研究中鉴定的肠道微生物物种是否在人类中具有相同的效果尚不清楚。
因此，对于能够靶向血管化不良的缺氧肿瘤区域、特异性靶向癌细胞，同时最小程度地影响正常组织并增强免疫系统以对抗肿瘤，包括避免或逆转肿瘤免疫耐受的有效癌症治疗存在未满足的需求。
发明内容
本公开提供了微生物的组合物、方法和用途，所述微生物选择性地靶向肿瘤和肿瘤细胞，并且能够产生在肿瘤位点处局部产生的一种或多种抗癌分子，例如免疫调节剂。在某些方面，本公开提供了被工程化以产生一种或多种抗癌分子例如免疫调节剂的微生物。这样的工程化微生物可被体内靶向至癌细胞和/或肿瘤位点用于选择性递送包含一种或多种抗癌分子的基因回路或盒至患病组织微环境。在某些方面，工程化微生物是细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌Nissle，Clostridium novyi NT和Clostridium butyricummiyairi，以及本文提供的能够选择性地归巢于肿瘤微环境的其他示例性细菌菌株。因此，在某些实施方式中，全身施用工程化微生物，例如，通过口服施用、静脉内注射、皮下注射或其他手段，并且能够选择性地定植肿瘤位点。例如，大肠杆菌Nissle 1917在口服递送后已经显示出选择性地归巢到肝转移的啮齿动物模型中的肿瘤组织，但不定植健康器官或纤维化肝脏组织。(Danino等，2015；Stritzker等，Int J Med Micro，297：151-162(2007))。在其他实施方式中，将工程化微生物(例如细菌或病毒)局部(直接)递送至肿瘤位点或微环境，例如通过肿瘤内施用，例如肿瘤内注射。
本公开提供了选择性地归巢至肿瘤微环境或局部施用到肿瘤位点，以递送一种或多种抗癌分子的工程化微生物。将抗癌分子(例如免疫调节剂)局部递送至肿瘤微环境是有利的，因为与经常导致自身免疫毒性的全身递送相比，其允许递送高得多的浓度的治疗剂(抗癌分子)。此外，最近的证据支持了免疫调节剂，例如受体激动剂和免疫刺激性抗体，直接递送至肿瘤，甚至是在单个位点，可通过靶向肿瘤微环境中存在的免疫细胞而产生全身或适应性抗肿瘤免疫应答。这样的免疫细胞包括渗入和/或包围肿瘤部位的例如成熟抗原呈递细胞、辅助和效应细胞毒性T细胞、致耐受性树突细胞、肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞，以及其他细胞类型。因此，在一些方面，本公开提供了选择性靶向肿瘤细胞并且能够产生局部递送至肿瘤部位以产生局部瘤内免疫应答的一种或多种抗癌分子的微生物。这导致优于其他方法的肿瘤选择性适应性免疫应答的诱导，因为它避免产生对自身抗原(ato-antigen)的免疫应答。
在某些方面，工程化微生物产生靶向肿瘤内免疫细胞(例如，渗透到肿瘤微环境中)的一种或多种抗癌分子。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生固有抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生局部抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生全身或适应性抗肿瘤免疫应答。本文描述了合适的抗癌分子的实例。
除了产生触发免疫应答的抗癌分子，工程化微生物本身是有利的，因为它们可以产生发展成全身性或适应性免疫应答的抗肿瘤免疫应答，例如，局部或固有免疫应答。例如，工程化微生物可以刺激渗入肿瘤微环境的免疫细胞的抗原呈递能力(例如，B细胞、浆细胞样和髓样树突状细胞(DC)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg、自然杀伤细胞(NK细胞)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM))。在肿瘤微环境中发现的许多免疫细胞表达模式识别受体(PRR)，这些受体通过激活促炎信号传导通路、刺激吞噬反应(巨噬细胞，中性粒细胞和树突细胞)或作为分泌蛋白质结合微生物而在固有免疫应答中发挥关键作用。PRR识别两类分子：与微生物病原体相关的病原体相关分子模式(PAMP)，和与在细胞损伤、死亡应激或组织损伤过程中释放的细胞组分相关的损伤相关分子模式(DAMP)。PAMP对于每种病原体是独特的，并且是病原体存活所需的必需分子结构，例如细菌细胞壁分子(例如脂蛋白)、病毒衣壳蛋白以及病毒和细菌DNA。PRR可以识别各种微生物病原体，包括细菌、病毒、寄生虫、真菌和原生动物。PRR主要由固有免疫系统的细胞表达，例如，抗原呈递巨噬细胞和树突细胞，但也可以由其他细胞(免疫细胞和非免疫细胞两者)表达，并且定位于细胞表面以检测细胞外病原体或定位于内体和细胞基质内，在那里它们检测细胞内入侵病毒。
PRR的实例包括Toll样受体(TLR)，其是具有检测感染病原体的细胞外结构域的1型跨膜受体。TLR1、2、4和6识别细菌脂质，TLR3、7和8识别病毒RNA，TLR9识别细菌DNA，TLR5和10识别细菌或寄生虫蛋白。(参见下表1，表示TLR的肿瘤微环境中的细胞的实例)。PRR的其他实例包括C型凝集素受体(CLR)，例如I组甘露糖受体和II组脱唾液酸糖蛋白受体，细胞质(细胞内)PRR，核苷酸寡聚化(NOD)样受体(NLR)，例如NOD1和NOD2，视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)，例如RIG-I、MDA5和DDX3，以及分泌的PRR，例如集合素、五聚蛋白、纤维凝胶、脂质转移酶、肽聚糖识别蛋白(PGR)和富含亮氨酸的重复受体(LRR)。
在检测到病原体(例如，通过PAMP或DAMP刺激)后，PRR启动信号通路的激活，例如刺激共刺激分子和促炎细胞因子的产生的NF-κB通路，例如I型IFN、IL-6、TNF和IL-12，其机制在激活针对感染性病原体的炎症和免疫应答中起作用。这样的应答引发参与适应性免疫应答的肿瘤微环境中存在的免疫细胞的激活(例如，抗原呈递细胞(APC)，例如B细胞、DC、TAM和其他骨髓衍生的抑制细胞)。最近的证据表明，由PAMP和DAMP激活的免疫机制也在激活针对肿瘤细胞的免疫应答中起作用。例如，研究表明，小鼠和人类肿瘤微环境中APC的TLR激活将其表型从耐受性转变为免疫原性，同时II类MHC、CD80和CD86上调，其需要激活以维持有效的适应性抗肿瘤免疫应答的发展。(LeMercier等，CancRes，73：4629-40(2013)；Kim等，Blood，119：355-63(2012))。
此外，TLR也可以由肿瘤细胞表达。癌细胞上TLR的直接激活可导致靶向肿瘤细胞的死亡和/或上调抗原呈递分子，例如，在B细胞淋巴瘤的情况下。因此，在化学疗法、肿瘤靶向疗法或导致肿瘤细胞死亡的其他疗法中，肿瘤细胞可以释放内源性DAMP，其被TLR或其他PRR识别为肿瘤浸润性免疫细胞和肿瘤细胞周围的细胞，并激活免疫应答。这样的激动剂(例如，DAMP)通过激活浸润肿瘤的APC来刺激抗肿瘤应答，有效地增强针对肿瘤相关抗原的适应性抗肿瘤应答。
另一种PRR亚科是被认为是在病毒感染时的双链病毒RNA的传感器和可以被靶向用于肿瘤内免疫刺激的RIG-I样受体(RLR)。在刺激时，例如，在肿瘤内递送溶瘤病毒时，RLR触发宿主细胞释放I型IFN并导致其通过细胞凋亡而死亡。这样的细胞因子和肿瘤相关抗原(TAA)释放也导致抗肿瘤免疫应答的激活。鉴于RLR在所有肿瘤类型中内源表达，它们是通用的免疫原性治疗靶标，并且特别与通过局部递送溶瘤病毒产生的免疫应答相关。
长期以来在肿瘤内递送病原体(例如本公开的微生物)时观察到肿瘤应答，并且已经显示肿瘤应答在多种类型的癌症中提供治疗益处，包括实体瘤、黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌，这些作用部分地是由于激活PRR的微生物的核酸部分、衣壳蛋白和/或细胞壁部分的促炎性质。例如，肿瘤内注射细菌、肺炎链球菌和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的提取物已显示出对实体瘤的治疗效果。卡介苗(BCG)的肿瘤内注射已经显示出对多种不同类型癌症的治疗益处，包括黑色素瘤和鳞状细胞癌，这部分地是由于BCG DNA和细胞壁骨架激活PRR的能力(Morton等,Ann Surg,1974,180:635-43；Melvin等,JAMA,1974,229:688；Krown等m Cancer,1978,42:2648-60；Bier等,Cancer Immunol,1981,12:71-79；Hortobagyi等,Cancer,1978,42:2293-2303；Bast等,N Engl J Med,1974,290:1458-69；Shimada等,J Natl Cancer Inst,1985,74:681-8；Tokunaga等,Jpn J InfectDis,1999,52:1-11；Krieg等,Nature,1995,374:546-9；Neville等,Nat Clin PractOncol,2007,4:462-9；Ryan等,Bioessays.2006Jan；28(1):84-94；Baban等,BioengineeredBugs 1:6,385-394；2010年11月/12月)。
使用溶瘤病毒治疗也观察到了全身免疫效应，这部分地是由于它们的病毒DNA和/或其衣壳蛋白作为PRR激动剂的能力。已经显示肿瘤内病毒的肿瘤内递送产生全身性抗肿瘤免疫应答，例如，在肝癌和肝细胞癌中。Bowie等，NatrevImmunol，2008,8：911-22；Park等，LancetOncol，2008,9：533-542；Heo等，NatMed，2013,19：329-36)。
这些方法具有已经阻碍它们治疗癌症的广泛适用性的若干限制(Ryan等,BioEssays 28:84–94,(2005).Use of bacteria in anti-cancer therapies；Nallar等,Cytokine.2016,Bacteria and genetically modified bacteria as cancertherapeutics:Current advances and challenges；Krzykawski C combined bacterialand viral treatment:a novel anticancer strategy,Cent Eur J Immunol.2015；40(3):366-72；Li等,Live-Attenuated Bacterial Vectors:Tools for Vaccine andTherapeutic Agent Delivery.Vaccines(Basel).2015Nov10；3(4):940-72)。包括细菌或病毒的大多数免疫疗法也已失败(Krzykawski,Centr Eur J Immunol 2015；40(3):366-372)。例如，致病细菌可局部和全身引起大量炎症响应，这可导致显著的不良事件，例如败血症。还据报道，生长中的肿瘤不能发展健康的脉管系统，并且缺少这个，就会出现缺氧区域。由于缺氧和有缺陷的血管化，许多细胞死亡，在肿瘤中留下所有碎片引起不良事件(Krzykawski,Centr Eur J Immunol 2015；40(3):366-372)。因此，细菌的选择被建议是将限制细菌主要扩散到肿瘤组织的任选的或必需的厌氧菌(Dang等2001:Proc Natl AcadSci U S A 98:15155-15160)。另外，必须提供将治疗性细菌精确递送至血液供应有限的肿瘤的方法。
本发明的微生物，如工程化的非致病性的细菌，可以通过选择性地和局部地在肿瘤部位处产生一种或多种抗癌分子来克服早期方法的一些局限性，并且具有增加的能够激活肿瘤内免疫应答的优势。在一些方面，微生物能够激活固有或局部免疫应答。在一些方面，微生物能够激活APC。在一些方面，微生物能够激活针对远端癌细胞的全身性抗肿瘤免疫。在一些方面，微生物能够激活适应性抗肿瘤免疫。
在某些实施方式中，工程化微生物产生靶向肿瘤内免疫细胞(例如，渗透到肿瘤微环境的免疫细胞)的一种或多种抗癌分子。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生局部抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生全身或适应性抗肿瘤免疫应答。在某些实施方式中，由工程化微生物产生的抗癌分子产生针对远离局部肿瘤部位(肿瘤内递送或注射部位)的癌细胞的全身性或适应性抗肿瘤免疫应答。在某些方面，工程化微生物产生靶向肿瘤细胞并激活局部和/或全身免疫应答的一种或多种抗癌分子。
全身施用的工程化微生物的特异性肿瘤靶向能力和/或工程化微生物的局部(例如，瘤内)递送不仅在肿瘤部位提供局部细胞毒性作用，而且还提供具有最小的自身免疫功能障碍或其他不良免疫事件的治疗性全身性抗肿瘤免疫应答(对抗远端癌细胞和/或未注射的肿瘤部位)。微生物的局部递送或选择性肿瘤靶向阻止了血液中高浓度免疫调节剂(例如免疫刺激剂)的循环。此外，微生物的局部或选择性肿瘤递送允许触发适应性免疫应答所需的肿瘤部位中的高得多的浓度的免疫刺激剂。
除了与其选择性靶向肿瘤细胞(作为局部递送或归巢到肿瘤部位的能力的结果)，导致产生局部和适应性免疫应答两者的能力相关的优势，工程化微生物具有它们可以被工程化以产生抗癌分子(例如免疫调节剂)的组合的优势。工程化微生物具有它们可以被工程化以选择性地向肿瘤部位递送一种以上的抗癌分子的进一步优势。例如，工程化微生物可以被工程化以产生组合逆转癌症诱导的免疫耐受并且还触发有效抗肿瘤免疫应答的抗癌分子。例如，工程化微生物可以被工程化以产生一种或多种可以用于逆转免疫耐受(或免疫抑制)和一种或多种可以用于激活抗原呈递和/或刺激或激活免疫应答的抗癌分子的组合。此外，这些抗癌分子可以通过响应于在肿瘤微环境中发现的环境条件而被诱导的诱导型启动子来调节，例如，在缺氧或低氧条件下。这种类型的调节进一步用于确保抗癌分子在肿瘤部位表达而不在正常或非癌组织中表达。
因此，在某些方面中，本公开的工程化微生物被工程化以产生在肿瘤微环境中抑制或抑制肿瘤免疫耐受的一种或多种抗癌分子。在某些方面，本公开的工程化微生物被工程化以产生在肿瘤微环境中激活或刺激抗肿瘤免疫应答的一种或多种抗癌分子。在某些方面，本公开的工程化微生物被工程化以产生在肿瘤微环境中抑制或抑制肿瘤免疫耐受并激活或刺激抗肿瘤免疫应答的一种或多种抗癌分子。在一些实施方式中，肿瘤免疫耐受的局部抑制和免疫刺激导致全身适应性免疫应答。
因此，在某些方面中，本公开的工程化微生物被工程化以产生可以(1)在局部肿瘤微环境中抑制或抑制或逆转肿瘤免疫耐受、(2)在局部肿瘤微环境中激活或刺激抗肿瘤免疫应答、(3)两者兼而有之的一种或多种抗癌分子。在某些方面，本公开的工程化微生物被工程化以产生可抑制或抑制肿瘤免疫耐受的一种或多种抗癌分子。在局部肿瘤微环境中抑制或抑制或逆转肿瘤免疫耐受的抗癌分子的实例包括，例如：(1)抑制免疫检查点的抗癌分子；(2)抑制抑制性细胞因子和/或趋化因子的抗癌分子；(3)抑制吞噬作用逃逸的抗癌分子；(4)减少或耗尽有助于免疫抑制的代谢物的抗癌分子；(5)抑制血管生成的抗癌分子。因此，本公开的基因工程化微生物被工程化以产生一种或多种抗癌分子，其选自免疫检查点抑制剂、抑制性细胞因子和/或趋化因子的抑制剂、帮助吞噬作用逃逸的分子的抑制剂、减少或耗尽有助于免疫抑制的代谢物的分子、促进血管生成的分子的抑制剂，及其组合。这些分子的非限制性实例在下文中描述。
在某些方面，本公开的工程化微生物被工程化以产生可以激活或刺激抗肿瘤免疫应答的一种或多种抗癌分子。在局部肿瘤微环境中激活或刺激抗肿瘤免疫应答的抗癌分子的实例包括，例如：(1)免疫刺激细胞因子；(2)与其他免疫分子(例如免疫刺激细胞因子)共同作用以刺激免疫应答的共刺激分子；(3)促进免疫接合的抗体；(4)参与过继效应细胞治疗的免疫分子；(5)用作疫苗的肿瘤抗原，和(6)细胞毒素或裂解肽。因此，本公开的基因工程化微生物被工程化以产生一种或多种抗癌分子，其选自免疫刺激细胞因子、与其他免疫分子共同作用以刺激免疫应答的共刺激分子、促进免疫接合的抗体、参与过继效应细胞疗法的免疫分子、用作疫苗的肿瘤抗原、细胞毒素或裂解肽，及其组合。这些分子的非限制性实例在下文中描述。
在任何这些实施方式中，工程化微生物是工程化细菌。在任何这些实施方式中，工程化微生物是肿瘤靶向工程化细菌。在一些实施方式中，肿瘤靶向工程化细菌天然地归巢于癌细胞和/或肿瘤部位。在一些实施方式中，肿瘤靶向工程化细菌被工程化，使得其靶向癌细胞和/或靶向肿瘤部位，例如，包含提供肿瘤靶向能力的非天然基因序列。在任何这些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生抑制或抑制肿瘤免疫耐受的一种或多种抗癌分子，并且还产生激活或刺激抗肿瘤免疫应答的一种或多种抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以在由低氧条件激活的启动子的控制下产生一种或多种抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达一种或多种抗癌分子。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子(例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子)的控制下表达一种或多种抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子、组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述的启动子)的控制下表达一种或多种抗癌分子。
在任何这些实施方式中，工程化细菌的组合可与常规的癌症疗法联合使用，例如手术、化疗、靶向疗法、放射疗法、螺旋断层治疗(tomotherapy)、免疫疗法、癌症疫苗、激素疗法、热疗，干细胞移植(外周血、骨髓和脐带血移植)、光动力疗法、疗法、血液制品捐赠和输血、以及溶瘤病毒。在任何这些实施方式中，工程化细菌可以产生一种或多种细胞毒素或裂解肽。在任何这些实施方式中，工程化细菌可以与癌症或肿瘤疫苗联合使用。
附图说明
图1描绘了示意性的腺苷降解途径和相应的细菌途径酶。
图2描绘了显示腺苷降解回路的两个示例性基因组织的示意图。通过表达大肠杆菌核苷通透酶nupC转运子将腺苷导入细胞。或者，可以使用NupG。腺苷通过腺嘌呤脱氨酶add的表达转化成肌苷。肌苷通过肌苷磷酸化酶xapA和deoD的表达转化为次黄嘌呤。通过表达次黄嘌呤羟化酶xdhA、xdhB、xdhC将次黄嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸盐。这样的回路可以位于微生物中的一个或多个质粒中，或者可以整合到染色体中。在某些实施方式中，一个或多个回路处于本领域已知的或本文描述的诱导型启动子的控制下。例如，可以在低氧条件下诱导这样的诱导型启动子，例如FNR启动子(所描绘的)。在其他实施方式中，启动子在某些分子或代谢物的存在下诱导，例如，在与肿瘤微环境相关和/或与免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下。在一些实施方式中，在某些组织类型中诱导启动子。在一些实施方式中，在某些肠特异性分子或代谢物的存在下诱导启动子。在一些实施方式中，在在肠或肿瘤中可以存在或可以不存在的一些其他代谢物存在的情况下诱导启动子，例如阿拉伯糖或本领域已知或本文描述的另外的化学或营养诱导剂。在某些实施方式中，一个或多个盒处于本文所述或本领域已知的组成型启动子的控制下，例如，其表达可使用不同强度的核糖体结合位点进行微调。这样的微生物任选还包含营养缺陷型，例如deltaThyA或deltaDapA。
图3描绘了显示菌株SYN1565(包括PfnrS-nupC)、SYN1584(包括PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC)、SYN1655(包括PfnrS-nupC；PfnrS-add-xapA-deoD)和SYN1656(包括PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC；PfnrS-add-xapA-deoD)可以体外降解腺苷，即使在葡萄糖存在时的柱状图。
图4描绘了显示在底物限制条件下在1um腺苷的存在下(其对应于体内肿瘤环境中预期的腺苷水平)的腺苷降解的柱状图。结果显示低浓度的激活的SYN1656(1×106个细胞)(以及所描绘的其他菌株)能够将腺苷降解至低于定量限。
图5描绘了通过工程化大肠杆菌Nissle(SYN1656)进行的腺苷消耗单独或与抗PD-1组合对肿瘤体积的效果的体内分析的线图。数据表明消耗腺苷的菌株作为单一药剂和与aPD-1组合的抗肿瘤活性。
图6A、图6B、图6C和图6D描绘了显示由各种工程化细菌菌株进行的色氨酸生产的柱状图。图6A描绘了显示各种产生色氨酸的菌株进行的色氨酸生产的柱状图。数据显示表达反馈抗性形式的AroG(AroGfbr)是获得色氨酸生产所必需的。另外，使用反馈抗性trpE(trpEfbr)对色氨酸生产具有积极作用。图6B显示来自包含tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr构建体的菌株的色氨酸生产，比较葡萄糖和葡萄糖醛酸酯作为在存在和不存在氧的情况下的碳源。大肠杆菌需要两个分子的磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)来产生一个分子的色氨酸。当使用葡萄糖作为碳源时，50％的所有可用PEP用于通过PTS系统(磷酸转移酶系统)将葡萄糖输入细胞。通过有氧使用非PTS糖(葡萄糖醛酸酯)改善了色氨酸生产。数据还显示了使tnaA缺失的积极效果(仅在有氧早期时间点)。图6C描绘了显示通过添加丝氨酸，改善的由包含ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr的工程化菌株进行的色氨酸生产的柱状图。图6D描绘了显示菌株SYN2126、SYN2323、SYN2339、SYN2473、和SYN2476中的色氨酸生产的比较的柱状图。SYN2126ΔtrpRΔtnaA。ΔtrpRΔtnaA，tet-aroGfbr。SYN2339包含ΔtrpRΔtnaA、tet-aroGfbr、tet-trpEfbrDCBA。SYN2473包含ΔtrpRΔtnaA、tet-aroGfbr-serA、tet-trpEfbrDCBA。SYN2476包含ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA。结果表明，表达aroG不是在这些条件下获得Trp生产所充分的或必要的，并且表达serA有益于色氨酸生产。
图7描绘了本公开的示范性实施方式的示意图，其中基因工程化细菌包含用于生产色氨酸和降解犬尿氨酸的回路。
图8描绘了本公开的一个实施方式的示意图。在该实施方式中，色氨酸是从犬尿氨酸合成。通过这种转换，免疫抑制代谢物(犬尿氨酸)可以从外部环境例如肿瘤环境除去，并且促炎症代谢物(色氨酸)产生。来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶将KYN转化为AA(邻氨基苯甲酸)，其然后可以通过大肠杆菌trp操纵子的酶转化为色氨酸。任选地，可以使trpE基因缺失，因为从犬尿氨酸生成色氨酸不需要它。在替代的实施方式中，trpE基因不被缺失，以通过使用犬尿氨酸和分支酸盐两者作为底物来最大化色氨酸生产。在本发明的一个实施方式中，包含该回路的基因工程化细菌可用于减少癌症中的免疫逃逸。
图9描绘了显示在补充有75uM犬尿氨酸的M9培养基中原始和ALE进化犬尿氨酸酶表达菌株的犬尿氨酸消耗速率的柱状图。菌株标记如下：SYN1404：包含Trp:E中的缺失和在四环素诱导型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle(Nissle delta TrpE::CmR+Ptet-Pseudomonas KYNU p15aKanR)；SYN2027：包含Trp:E中的缺失和在在HA3/4位点处整合到基因组中的组成型启动子(内源性lpp启动子)的控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的大肠杆菌Nissle(HA3/4::Plpp-pKYNaseKanR TrpE::CmR)；SYN2028：包含Trp:E中的缺失和在在HA3/4位点处整合到基因组中的组成型启动子(合成J23119启动子)的控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的大肠杆菌Nissle(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR)；SYN2027-R1：源自ALE的第一进化菌株，衍生自母体SYN2027菌株(Plpp-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。SYN2027-R2：源自ALE的第二进化菌株，衍生自母体SYN2027菌株(Plpp-pKYNase KanRTrpE::CmR进化菌株复制2)。SYN2028-R1：源自ALE的第一进化菌株，衍生自母体SYN2028菌株(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。SYN2028-R2：源自ALE的第二进化菌株，衍生自母体SYN2028菌株(HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR进化菌株复制1)。
图10A和图10B描绘了显示通过产生来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的菌株进行的肿瘤内犬尿氨酸耗尽的点图。图10A描绘了显示对在中等拷贝质粒上携带组成型表达的荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的犬尿氨酸消耗菌株SYN1704观察到的肿瘤内浓度的点图。图10B描绘了显示对携带组成型表达的荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的染色体整合拷贝的犬尿氨酸消耗菌株SYN2028观察到的肿瘤内浓度的点图。IDO抑制剂INCB024360用作阳性对照。
图11描绘了缺失argR基因和表达反馈抗性argAfbr基因的工程化细菌菌株的示例性实施方式。该菌株还在染色体上包含一个或多个营养缺陷型修饰。该菌株可用于生产精氨酸。
图12描绘了在氧气存在(+O2)或不存在(-O2)的情况下，在诱导(+ATC)和非诱导(-ATC)条件下，由链霉素抗性Nissle(SYN-UCD103)、SYN-UCD205和SYN-UCD204产生的体外精氨酸水平的柱状图。SYN-UCD103是对照Nissle构建体。SYN-UCD205包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr。SYN204包含在低拷贝质粒上在四环素诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr。
图13A和图13B描绘了在厌氧诱导后的各个时间点的培养基中的氨水平的柱状图。图13A描绘了在0、30、60和120分钟测量的SYN-UCD205、SYN-UCD206和SYN-UCD301的精氨酸生产的水平的柱状图。图13B描绘了SYN-UCD204(包含低拷贝质粒上的ΔArgR、PfnrS-argAfbr和野生型ThyA)、SYN-UCD301、SYN-UCD302和SYN-UCD303(其全部三个均包含整合的FNR-argAfbr构建体；SYN UCD301包含ΔArgR，和wtThyA；SYN303包含ΔArgR，和ΔThyA)的精氨酸生产的水平的柱状图。结果表明，FNR argAfbr的染色体整合导致相似水平的精氨酸生产，如用表达相同构建体的低拷贝质粒菌株所见。
图14描绘了显示对具有由malEK基因座处的fnr诱导型启动子驱动的ArgAfbr的染色体插入，以及ΔArgR和ΔThyA及无抗生素抗性的工程化细菌菌株中的体外功效(从氨产生精氨酸)进行评估(SYN-UCD303)的线图。链霉素抗性大肠杆菌Nissle(Nissle)用作参比。
图15A和图15B描绘了本公开用于表达通过可扩散外膜(DOM)系统分泌的治疗性多肽，例如，本文中所描述的抗癌/免疫调节效应子，例如，hIL-12、mIL-12、hIL-15、GMCSF、TNF-α、IFN-γ、CXCL10、CXCL9和/或透明质酸酶的示例性回路的基因组织的示意图。感兴趣的治疗性多肽与在分泌到周质空间中后被切割的原型N-末端Sec依赖性分泌信号或Tat依赖性分泌信号融合。示例性分泌标签包括sec依赖性PhoA、OmpF、OmpA、cvaC和Tat依赖性标签(TorA、FdnG、DmsA)。在某些实施方式中，基因工程化细菌包含lpp、pal、tolA和/或nlpI中的一种或多种中的缺失。任选地，还使周质蛋白酶缺失，包括但不限于degP和ompT，例如，以增加多肽在外周胞质中的稳定性。FRT-KanR-FRT盒用于下游整合。表达是由tet启动子(图15A)或诱导型启动子，例如氧水平依赖性启动子(例如，FNR诱导型启动子，图15B)，以及可以是或可以不是天然存在(例如，可以外源添加)于肠中的代谢物例如阿拉伯糖诱导的启动子驱动。在某些实施方式中，一个或多个盒是在组成型启动子的控制下。
图16描绘了在细菌的表面上展示的感兴趣的多肽的示意图。这样的治疗性蛋白质的非限制性实例是scFv。多肽表达为融合蛋白，其包含来自另外的蛋白质的外膜锚，其发展为展示系统的一部分。本文描述了这样的锚的非限制性实例，包括LppOmpA、NGIgAsig-NGIgAP、InaQ、Intimin、Invasin、pelB-PAL和blcA/BAN。在非限制性实例中，细菌菌株具有一种或多种可扩散的外膜表型(“渗漏膜”)突变，例如，如本文所述。
图17描绘了野生型大肠杆菌(泳道1)和表达抗PD-1scFv的菌株(泳道2)的总细胞溶质提取物的蛋白印迹分析。
图18描绘了与来自表达tet诱导型抗PD-1-scFv的菌株的提取物一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示大肠杆菌中表达的抗PD-1-scFv结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图19描绘了分泌抗PD-1scFv的各种菌株的总细胞溶质提取物的蛋白印迹分析。在泳道1-6中检测到约34kDa的单一条带，分别对应于来自SYN2767、SYN2769、SYN2771、SYN2773、SYN2775和SYN2777的提取物。
图20描绘了与来自分泌tet诱导型抗PD-1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的提取物一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD-1-scFv结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图21描绘了与来自分泌tet诱导型抗PD1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的不同量的提取物(0、2、5、和15ul)一起孵育的表达PD1的EL4细胞的流式细胞术分析的示意图，显示从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD1-scFv以剂量依赖性方式结合小鼠EL4细胞上的PD1。
图22A和22B描绘了EL4细胞的流式细胞术分析的示意图。图22B描绘了竞争测定，其中将来自分泌tet诱导型抗PD1-scFv的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与不同量的可溶性PDL1(0、5、10和30ug)一起孵育，显示PDL1可以剂量依赖性地和从大肠杆菌Nissle分泌的抗PD1-scFv与小鼠EL4细胞上的PD1竞争结合。图22B显示IgG对照。
图23A-图23D，描绘了显示在施用盐水或SYN1704的小鼠中测量的肿瘤内犬尿氨酸(图23A)和血浆犬尿氨酸(图23C)的浓度的点图。与盐水对照相比，对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704，观察到犬尿氨酸的肿瘤内(P<0.001)和血浆(P<0.005)浓度的显著降低。色氨酸水平保持恒定(数据未示出)。
图24A、24B和24C描绘了曲线图，显示在CT26肿瘤中单次施用KYN消耗菌株对肿瘤(图24A)和血浆(图24B)中的肿瘤KYN水平，和肿瘤重量(图24C)的影响。通过肿瘤内给药以1e8 CFU/mL向小鼠给药SYN94或SYN1704。处死动物并在指定时间收集血液和组织。
图25描绘了细菌上清液的蛋白印迹分析，显示由大肠杆菌菌株SYN3366和SYN3367分泌的鼠CD40L1(47-260)和CD40L2(112-260)被mCD40抗体检测到。
图26描绘了来自SYN2996(泳道1)、SYN3159(泳道2)、SYN3160(泳道3)、SYN3021(泳道4)、SYN3020(泳道5)和SYN3161(泳道6)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示WT mSIRPα、mCV1SIRPα、mFD6x2SIRPα、mCV1SIRPα-IgG4、mFD6SIRPα-IgG4和抗mCD47 scFv分别从这些菌株分泌。
图27描绘了与来自SYN1557(1；delta PAL母体菌株)、SYN2996(2；表达tet诱导型mSIRPα)、SYN3021(3；表达tet诱导型抗mCD47scFv)、SYN3161(4；表达tet诱导型mCV1SIRPα-hIgG融合)的上清液一起孵育的表达CD47的CT26细胞的流式细胞术分析的示意图，显示在大肠杆菌中表达的分泌产物可与小鼠CT26细胞上的CD47结合。
图28描绘了与来自SYN1557(1；delta PAL母体菌株)、SYN3020(2；表达tet诱导型mFD6SIRPα-hIgG融合)、SYN3160(3；表达tet诱导型FD1x2SIRPα)、SYN3159(4；表达tet诱导型mCV1SIRPα)、SYN3021(5；表达tet诱导型mCV1SIRPα-hIgG融合)的上清液一起孵育的表达CD47的CT26细胞的流式细胞术分析的示意图，显示在大肠杆菌中表达的分泌产物可与小鼠CT26细胞上的CD47结合。
图29描绘了CT26细胞的流式细胞术分析的示意图。进行竞争测定，其中来自分泌tet诱导型鼠SIRPalpha的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与重组SIRPalpha一起孵育，表明重组SIRPalpha可以和大肠杆菌Nissle分泌的SIRPalpha与CT26细胞上的CD47竞争结合。
图30描绘了CT26细胞的流式细胞术分析的示意图。进行竞争测定，其中来自分泌tet诱导型鼠SIRPalpha的大肠杆菌Nissle菌株的提取物与抗CD47抗体一起孵育，显示该抗体可以和大肠杆菌Nissle分泌的SIRPalpha与CT26细胞上的CD47竞争结合。
图31A描绘了用于在SYN2997和SYN2998中表达的小鼠和人透明质酸酶的分泌的回路。图31B描绘了来自SYN2997(泳道1)和SYN2998(泳道2)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示小鼠和人透明质酸酶分别从这些菌株分泌。
图32描绘了显示在ELISA测定中作为透明质酸(hyaluronan)降解的量度的SYN1557(母体菌株delta PAL)、SYN2997和SYN2998的透明质酸酶活性的柱状图。
图33A描绘了来自表达四环素诱导型水蛭透明质酸酶的SYN3369(泳道1)和SYN1557(母体菌株delta PAL)(泳道2)的细菌上清液的蛋白印迹分析，显示水蛭透明质酸酶从SYN3369分泌。M＝标志物。图33B和图33C描绘了显示透明质酸酶活性作为ELISA测定中透明质酸降解的量度的柱状图。图33B显示了具有重组透明质酸酶的阳性对照。图33C显示SYN1557(母体菌株delta PAL)和表达四环素诱导型水蛭透明质酸酶的SYN3369的透明质酸酶活性。
图34描绘了大肠杆菌1917Nissle染色体内的示例性整合位点的图。这些位点表示可以将回路组分插入到染色体内而不干扰必需基因表达的区域。反斜杠(/)用于显示插入将发生在发散或会聚表达的基因之间。生物合成基因(例如thyA)内的插入可用于产生营养缺陷型。在一些实施方式中，将个体回路组分插入到一个以上的指示位点中。在一些实施方式中，将多个不同的回路插入到一个以上指示位点中。因此，通过将回路插入到大肠杆菌1917Nissle染色体的多个位点中，基因工程化细菌可以包含允许多种作用机制(MoAs)的回路。
图35描绘了显示本公开的基因工程化细菌如何可以通过在免疫缺陷中补充基质以实现宽抗肿瘤活性来转化肿瘤微环境的示意图。
图36描绘了显示用于改善的抗肿瘤活性的机制组合的示意图。
图37描绘了与单独的载剂或抗CTLA-4抗体相比，携带荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的组成型表达的染色体整合拷贝的犬尿氨酸消耗菌株SYN2028进行的犬尿氨酸消耗单独或与抗CTLA4抗体组合对肿瘤体积的影响的体内分析的线图。数据表明作为单个药剂和与抗CTLA4抗体组合的犬尿氨酸消耗菌株的抗肿瘤活性，并且SYN2028改善了CT26中αCTL-4介导的抗肿瘤活性。在该研究中，BALB/c小鼠被植入CT26肿瘤；以100μg/小鼠IP施用抗CTLA4抗体；细菌以1×10e7进行肿瘤内施用；细菌和抗体全部每两周施用一次。
图38A、38B、38C和38D描绘了显示在图37中显示的研究中各个个体小鼠的线图。图38E描绘了相应的Kaplan-Meier图。
图39A、图39B、图39C、图39D、图39E描绘了显示示出了Kyn消耗者SYN2028与αυτιCTL-4和抗PD-1抗体组合在MC38肿瘤中具有改善的抗肿瘤活性的线图。图39B，39C，39D和39E描绘了显示图39A中所示研究的各个个体小鼠的线图。Kyn消耗者SYN2028与抗CTL-4和抗PD-1抗体组合相对于单独的载剂(图39B)、抗CTLA4和抗PD-1抗体(图39C)，或者SYN94(链霉素抗性大肠杆菌Nissle)加上抗CTLA4和抗PD-1抗体(图39D)，在MC38肿瘤中具有改善的抗肿瘤活性(图39E)；即，犬尿氨酸消耗者具有改善抗CTLA-4/抗PD1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。图39F描绘了相应的Kaplan-Meier图。
图40A描绘了在40B、40C、40D、40E和40F中显示的研究的施用方案的图。图40B、40C、40D、40E和40F描绘了各个个体小鼠中化学治疗剂环磷酰胺(非清髓化疗，预调理)和产生精氨酸的菌株(SYN825，图40E)或犬尿氨酸消耗菌株(SYN2028，图40F)的组合治疗对肿瘤体积的影响的体内分析的线图。将组合治疗的效果与单独的载剂(图40B)、单独的环磷酰胺(图40C)，或SYN94(链霉素抗性野生型Nissle，图40D)的处理进行比较。数据表明产生精氨酸和消耗犬尿氨酸的菌株与环磷酰胺组合的抗肿瘤活性。在该研究中，BALB/c小鼠被植入CT26肿瘤；环磷酰胺(CP)以100mg/kg IP施用；细菌以1×10e7(在100ul体积中)肿瘤内施用。施用方案如图40A所示。
图41描绘了显示在抗原呈递细胞中的STING途径的示意图。
图42A描绘了显示用于STING激动剂的表达的示例性构建体的示意图，例如，如见于SYN3527中的。该构建体使用dacA，其是来自单核细胞增多性李斯特氏菌的二腺苷酸环化酶基因。在一些实施方式中，将构建体引入大肠杆菌Nissle中。在一些实施方式中，构建体位于质粒上。在一些实施方式中，构建体整合到细菌染色体中。在一些实施方式中，dacA基因经密码子优化以在大肠杆菌Nissle中表达。如所示，dacA的表达可以由四环素诱导型启动子驱动。或者，可以使用本领域已知的或本文描述的不同的诱导型启动子来驱动dacA的表达。在又一些替代实施方式中，本领域已知或本文描述的组成型启动子可用于驱动dacA的表达。
图42B描绘了显示通过LC/MS测量的体外细胞外和细胞内的环二-AMP累积的柱状图。在不含有dacA表达构建体的对照菌株中没有测量到环-二-AMP累积。
图43描绘了用活细菌和热杀灭细菌处理的RAW 267.4细胞中的相对IFNb1 mRNA表达。
图44A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图44B和图44C。图44B描绘了显示植入B16-F10肿瘤并用盐水、SYN94(链霉素抗性野生型Nissle)或SYN3527(包含四环素诱导型dacA构建体)处理的小鼠的平均肿瘤体积的线图。图44C描绘了显示研究中的个体小鼠的肿瘤体积的线图。图44D描绘了显示在第9天的肿瘤重量的图。图44E描绘了显示通过流式细胞术测量的在第9天在肿瘤引流淋巴结中的总T细胞数。图44F描绘了显示CD4(常规)和CD8T细胞亚组中的激活的(CD44高)T细胞的百分比的图，图44G描绘了显示通过流式细胞术测量的在第9天在肿瘤引流淋巴结中STING注射后Treg的激活的缺乏的图。
图45A和图45B描绘了显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天(图45A)或第9天(图45B)通过Luminex Bead Assay测量的B16肿瘤中的IFN-b1的浓度的柱状图。
图46A描绘了显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex Bead Assay测量的B16肿瘤中的IL-6(左图)、IL-1β(中图)和MCP-1(右图)的浓度的柱状图。图46B描绘了显示与用盐水或链霉素抗性Nissle处理的小鼠相比，在tet诱导型STING激动剂产生菌株SYN3527的施用和诱导后，在第2天和第9天通过Luminex Bead Assay测量的B16肿瘤中的颗粒酶B(左图)、IL-2(中图)和IL-15(右图)的浓度的柱状图。在图46A和图46B两者中，每个小图中的柱以与图45A和图45B中相同的顺序排列，即盐水(左)、链霉素抗性野生型Nissle(中)和SYN3527(SYN-STING，右)。
图47A和图47B描绘了大肠杆菌Nissle菌株SYN3529(Nissle p15A Ptet-CodA)和SYN3620(Nissle p15A Ptet-CodA::Upp融合)将5-FC转化为5-FU的能力的柱状图。该图显示在2小时的测定时间后的5-FC水平(图47A)和5-FU水平(图47B)。
图48A和图48B描绘了显示在用SYN3527(包含来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型DacA)刺激后4小时(图48A)或刺激后2小时和4小时(图48B)的小鼠骨髓来源树突细胞中的INF-b1产生(图48A)或IFN-b1 mRNA表达(图48B)的图。在实验之前，SYN3527未被诱导(“STINGun”)或用四环素诱导“STINGin”。
图49A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图49B、图49C、图49D和图49E中。图49B描绘了显示植入B16-F10肿瘤并用PBS、SYN3620(包含pUC-Kan-tet-CodA::Upp融合)或SYN3529(包含pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶))处理的小鼠的平均肿瘤体积的线图。图49C描绘了显示研究中的个体小鼠的肿瘤体积的线图。图49D描绘了显示第6天的肿瘤重量的图。图49E描绘了显示通过质谱法测量的第6天的5-FC的肿瘤内浓度的图。
图50A和图50B描绘了显示STING激动剂生产者SN3527、犬尿氨酸消耗者SYN2028和组合菌株(STING激动剂生产者加上犬尿氨酸消耗者)SYN3831的环-二-AMP的生产(图50A)和犬尿氨酸的消耗(图50B)。
图51A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图51B和51C中。图51B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图51C描绘了显示通过流式细胞术测量的在第8天通过从CT26肿瘤分离的肿瘤内淋巴细胞的指示免疫细胞群的中值平均荧光强度(MFI)测量的CCR7(左)或CD40(右)的相对表达的图。
图52A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图52B-52D中。图52B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图52C描绘了显示通过ELISA测量的CT26肿瘤中TNFα的相对浓度的图。图52D描绘了显示植入CT26肿瘤并用SYN(DOM突变体)或SYN-TNFα(包含PAL::CM p15a TetR Ptet-PhoA-TNFalpha)处理的小鼠的平均肿瘤体积的线图。
图53A描绘了显示体内小鼠研究的概况的示意图，其结果示于图53B和53C中。图53B描绘了显示通过菌落形成单位(CFU)测量的肿瘤的细菌定植的图。图53C描绘了显示通过ELISA测量的CT26肿瘤中IFNγ的相对浓度的图。
图54A和图54B描绘了人T细胞Transwell测定的结果，其中在SYN细菌上清液中添加以各种浓度稀释的SYN-CXCL10上清液后，通过流式细胞术测量迁移细胞的数量。将抗CXCR3加入到含有100％SYN-CXCL10上清液的对照孔中，以验证迁移对CXCL10-CXCR3途径的特异性。图54A描绘了迁移细胞的总数。图54B描绘了相对于无细胞因子对照的迁移。
图55描绘了显示基于细胞的测定的结果的线图，其显示在用IL-15分泌者SYN3525(PAL::Cm p15a Ptet-PpiA(ECOLIN_18620)-IL-15-Sushi)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后CD3+IL15RAalpha+T细胞中的STAT5磷酸化。
图56描绘了显示基于细胞的测定的结果的图，其显示在用TNFα分泌者SYN2304(PAL::Cm p15a TetR Ptet-phoA TNFα)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后HeLa细胞中的IkappaBalpha降解。
图57A和图57B描绘了显示基于细胞的测定的结果的图，其显示在用IFNgamma分泌者SYN3543(PAL::Cm p15a Ptet-87K PhoA-mIFNg)、母体对照SYN1557和重组IL-15对照的上清液处理后小鼠RAW264.7细胞中的STAT1磷酸化。
具体实施方式
实施方式的描述
使用常规疗法特别难以控制某些肿瘤。缺氧是实体瘤的特征性特征，其中癌细胞在非常低的氧浓度下存在。缺氧区域通常围绕坏死组织并且作为实体形式的癌症发展过大而不适于其脉管系统。当血管供应不能满足肿瘤的代谢需求时，肿瘤的微环境变得缺氧。肿瘤内的多个区域含有<1％的氧气，而正常组织中的氧气含量为3-15％(Vaupel和Hockel，1995)，无血管区域可构成肿瘤质量的25-75％(Dang等，2001)。大约95％的肿瘤在某种程度上是缺氧的(Huang等，2004)。全身递送的抗癌剂依赖于肿瘤脉管系统来递送，然而，不良的血管形成阻碍了向快速分裂的细胞供氧，使得它们对在血管化不良的低氧性肿瘤区域中靶向细胞增殖的治疗剂不太敏感。放射疗法不能杀死缺氧细胞，因为氧气是辐射诱导的细胞死亡所需的效应物。与具有正常氧水平的细胞相比，缺氧细胞对放射治疗的抗性高达三倍(Bettegowda等，2003；Tiecher，1995；Wachsberger等，2003)。由于所有这些原因，使用常规疗法特别难以管理不可切除的局部晚期肿瘤。
除了与靶向缺氧环境相关的挑战之外，特异性靶向和摧毁癌症的疗法必须识别正常组织和恶性组织之间的差异，包括导致具有缺氧和坏死区域的异质肿块的遗传改变和病理生理学变化。
本发明包括基因工程微生物，例如基因工程化细菌，其药物组合物，以及调节或治疗癌症的方法。在某些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞。在某些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞，特别是在低氧条件下，例如在缺氧肿瘤环境中。在某些实施方式中，基因工程化细菌局部递送至肿瘤细胞。在某些方面，本文公开的组合物和方法可用于将一种或多种抗癌分子递送至癌细胞或在癌细胞中产生一种或多种抗癌分子。
本公开涉及局部和肿瘤特异性递送抗癌分子以治疗癌症的组合物和治疗方法。在某些方面，本公开涉及基因工程微生物，其能够靶向癌细胞并产生一种或多种抗癌分子，例如本文提供的任何抗癌分子。在某些方面，本公开涉及基因工程化细菌，其能够靶向癌细胞并产生一种或多种抗癌分子。在某些方面，本公开涉及基因工程化细菌，其能够靶向癌细胞，特别是在肿瘤的缺氧区域中，并且在氧水平诱导型启动子的控制下产生一种或多种抗癌分子。与现有的常规疗法相反，肿瘤的缺氧区域为厌氧细菌的生长提供了完美的生态位，厌氧细菌的使用提供了以精确方式根除晚期局部肿瘤的机会，从而不伤害周围良好血管化的含氧量正常的组织。
在一些方面，本公开提供了基因工程微生物，其能够将一种或多种抗癌分子递送至肿瘤细胞或肿瘤微环境。在一些方面，本公开涉及基因工程微生物，其例如通过本公开中描述的任何递送方式全身递送，并且能够产生一种或多种抗癌分子，例如本公开中描述的任何抗癌分子。在一些方面，本公开涉及基因工程微生物，其例如通过局部肿瘤内施用局部递送，并且能够产生一种或多种抗癌分子，例如本公开中描述的任何抗癌分子。在一些方面，本文公开的组合物和方法可用于将一种或多种抗癌分子选择性地递送至肿瘤细胞，从而减少全身细胞毒性或系统性免疫功能障碍，例如自身免疫事件或其他免疫相关不良事件的发作。
为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。应根据本公开的其余部分并且如本领域普通技术人员所理解的那样阅读这些定义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
“瘤内施用”意在包括将微生物递送至肿瘤内部位的任何和所有手段，并且不限于瘤内注射方式。本文详细讨论了用于工程微生物的递送方式的实例。
“癌症”或“癌的(cancerous)”用于指以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。在一些实施方式中，癌症是指肿瘤。“肿瘤”用于指任何肿瘤细胞生长或增殖或任何癌前或癌细胞或组织。肿瘤可以是恶性的或良性的。癌症的类型包括但不限于肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如，尤文肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如，星形细胞瘤，脑干胶质瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠道癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病)，肝癌，肺癌，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(如基底细胞癌，黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。癌症治疗的副作用可能包括但不限于机会性自身免疫性疾病，全身毒性，贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病变，蛀牙，尿路感染，和/或记忆和注意力问题(NationalCancer Institute)。
如本文所用，“远位”和“远位效应”是指其中肿瘤的局部治疗不仅缩小或以其他方式影响所治疗的肿瘤，而且还缩小或以其他方式影响局部治疗范围之外的其他肿瘤的效应。在一些实施方式中，基因工程化细菌可引起远位效应。在一些实施方式中，在施用基因工程化细菌时未观察到远位效应。
“缺氧”用于指相比生理水平降低的组织氧供应，从而产生缺氧环境。“常氧”指的是组织氧供应的生理水平。缺氧是实体瘤的标志，其特征在于由于灌注不足而导致的低氧和坏死区域(Groot等，2007)。
如本文所用，“有效负载”是指由基因工程微生物(例如细菌或病毒)产生的一种或多种感兴趣的分子。在一些实施方式中，有效负载是治疗性有效负载，例如抗癌分子。在一些实施方式中，有效负载是调节性分子，例如转录调节因子，例如FNR。在一些实施方式中，有效负载包含调节元件，例如启动子或阻遏物。在一些实施方式中，有效负载包含诱导型启动子，例如来自FNRS。在一些实施例中，有效载荷包括阻遏元件，例如终止开关。在一些实施方式中，有效负载由基因或多个基因或操纵子编码。在替代性实施方式中，有效负载通过生物合成或生物化学途径产生，其中生物合成或生物化学途径可任选地对微生物是内源的。在一些实施方式中，基因工程微生物包含两种或更多种有效负载。
如本文所用，术语“低氧(low oxygen)”是指氧气(O2)的水平、量或浓度低于大气中存在的氧气的水平、量或浓度(例如，<21％O2；<160托O2))。因此，术语“低氧条件或条件”或“低氧环境”是指含有比大气中存在的氧气的水平低的氧气的条件或环境。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在哺乳动物肠道中发现的氧气(O2)的水平、量或浓度，例如，腔，胃，小肠，十二指肠，空肠，回肠，大肠，盲肠，结肠，远端乙状结肠，直肠和肛管。在一些实施方式中，术语“低氧”是指O2的水平、量或浓度为0-60mmHg O2(0-60托O2)(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，和60mmHg O2)，包括任何和所有其增量部分(例如，0.2mmHg，0.5mmHg O2，0.75mmHg O2，1.25mmHg O2，2.175mmHg O2，3.45mmHg O2，3.75mmHg O2，4.5mmHgO2，6.8mmHg O2，11.35mmHg O2，46.3mmHg O2，58.75mmHg，等等，这些示例性的部分在此列出用于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制)。在一些实施方式中，“低氧”是指约60mmHg O2或更低(例如，0至约60mmHg O2)。术语“低氧”也可以指的是0-60mmHg O2(含端点)之间范围O2水平、量或浓度，例如，0-5mmHg O2，<1.5mmHg O2，6-10mmHg，<8mmHg，47-60mmHg，等等，这些示例性的范围在此列出用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。参见，例如，Albenberg等，Gastroenterology，147(5)：1055-1063(2014)；Bergofsky等，JClin.Invest.，41(11)：1971-1980(1962)；Crompton等，J Exp.Biol.，43：473-478(1965)；He等，PNAS(USA)，96：4586-4591(1999)；McKeown，Br.J.Radiol.，87：20130676(2014)(doi：10.1259/brj.20130676)，其各自讨论了在各种物种的哺乳动物肠中发现的氧水平，并且其各自全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指在除肠以外的哺乳动物器官或组织中发现的氧(O2)的水平、量或浓度，例如泌尿生殖道，肿瘤组织等，其中氧以降低的水平存在，例如，在低氧(hypoxic)或缺氧(anoxic)水平。在一些实施方式中，“低氧”是指存在于部分需氧，半需氧，微需氧，无氧，微氧，低氧，缺氧和/或厌氧条件下的氧气(O2)的水平、量或浓度。例如，表1总结了各种器官和组织中存在的氧气量。在一些实施方式中，氧气(O2)的水平、量或浓度表示为溶解氧的量(“DO”)，其是指液体中存在的游离的非化合物氧(O2)的水平和通常以毫克/升(mg/L)，百万分率(ppm；1mg/L＝1ppm)或微摩尔(μmole)(1μmol O2＝0.022391mg/L O2)报告。Fondriest Environmental,Inc.,“Dissolved Oxygen”,Fundamentals of Environmental Measurements,19Nov 2013,www.fondriest.com/ environmental-measurements/parameters/water-quality/dissolved-oxygen/>。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指氧(O2)的水平、量或浓度为约6.0mg/L DO或更低，例如6.0mg/L，5.0mg/L，4.0mg/L，3.0mg/L，2.0mg/L，1.0mg/L或0mg/L，及其中任何部分，如3.25mg/L，2.5mg/L，1.75mg/L，1.5mg/L，1.25mg/L，0.9mg/L，0.8mg/L，0.7mg/L，0.6mg/L，0.5mg/L，0.4mg/L，0.3mg/L，0.2mg/L和0.1mg/L DO，这里列出的示例性部分用于说明目的，并不意味着以任何方式进行限制。氧的液体或溶液水平也可以被报告为空气饱和度的百分比或氧饱和度的百分比(在稳定平衡下在某个温度、压力和盐度下溶液中的溶解氧(O2)的浓度与将溶解于溶液中的氧的最大量的比率)。没有氧气生产者或消费者的充分通气的溶液(例如，经受混合和/或搅拌的溶液)是100％空气饱和的。
在一些实施方式中，术语“低氧”是指40％或更低的空气饱和度，例如40％，39％，38％，37％，36％，35％，34％，33％，32％，31％，30％，29％，28％，27％，26％，25％，24％，23％，22％，21％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％和0％空气饱和度，包括其中任何和所有增量部分(例如，30.25％，22.70％，15.5％，7.7％，5.0％，2.8％，2.0％，1.65％，1.0％，0.9％，0.8％，0.75％，0.68％，0.5％。0.44％，0.3％，0.25％，0.2％，0.1％，0.08％，0.075％，0.058％，0.04％。0.032％，0.025％，0.01％等)和在0-40％之间含端点(例如，0-5％，0.05-0.1％，0.1-0.2％，0.1-0.5％，0.5-2.0％，0-10％，5-10％，10-15％，15-20％，20-25％，25-30％等)的任何范围的空气饱和度水平。
这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。在一些实施方式中，术语“低氧”意指9％O2饱和度或更低，例如9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0％O2饱和度，包括其任何和所有增量分数(例如，6.5％，5.0％，2.2％，1.7％，1.4％，0.9％，0.8％，0.75％，0.68％，0.5％。0.44％，0.3％，0.25％，0.2％，0.1％，0.08％，0.075％，0.058％，0.04％。0.032％，0.025％，0.01％等)和在0-9％之间含端点(例如0-5％，0.05-0.1％，0.1-0.2％，0.1-0.5％，0.5-2.0％，0-8％，5-7％，0.3-4.2％O2等)的任何范围的O2饱和度水平。这里列出的示例性部分和范围是出于说明性目的，并不意味着以任何方式进行限制。
表1.
Figure BDA0002194618080000281
Figure BDA0002194618080000291
如本文所用，术语“基因”或“基因序列”是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列和密码子优化的序列。术语“基因”或“基因序列”尤其包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
如本文所用，术语“基因盒”和“回路”“基因盒”和“回路”尤其是指表达多肽或蛋白质的任何序列，包括基因组序列，cDNA序列，天然存在的序列，人工序列，和密码子优化的序列，包括内源基因的修饰，例如在自然界中通常不与之相关的启动子的控制下的天然和非天然基因的缺失，突变和表达。
“抗癌分子”是指通过基因工程微生物(例如工程化细菌)产生的一种或多种感兴趣的治疗物质或药物，其能够减少和/或抑制细胞生长或复制。在一些实施方式中，抗癌分子是可用于调节或治疗癌症的治疗分子。在一些实施方式中，抗癌分子是由基因编码的治疗分子。在替代性实施方式中，抗癌分子是通过生物化学或生物合成途径产生的治疗分子，其中生物合成或生物化学途径可任选地对微生物是内源的。在一些实施方式中，基因工程微生物能够产生两种或更多种抗癌分子。抗癌分子的非限制性实例包括免疫检查点抑制剂(例如，CTLA-4抗体，PD-1抗体，PDL-1抗体)，细胞毒性剂(例如，ClyA，FASL，TRAIL，TNF-α)，免疫刺激细胞因子和共刺激分子(例如，OX40，CD28，ICOS，CCL21，IL-2，IL-18，IL-15，IL-12，IFN-γ，IL-21，TNF，GM-CSF)，抗原和抗体(如肿瘤抗原，新抗原，CtxB-PSA融合蛋白，CPV-OmpA融合蛋白，NY-ESO-1肿瘤抗原，RAF1，抗免疫抑制分子抗体，抗VEGF，抗CXR4/CXCL12，抗GLP1，抗GLP2，抗半乳糖凝集素1，抗半乳糖凝集素3，抗Tie2，抗CD47，抗免疫检查点的抗体，抗免疫抑制细胞因子和趋化因子的抗体)，DNA转移载体(如内皮抑素，血小板反应蛋白-1，TRAIL，SMAC，Stat3，Bcl2，FLT3L，GM-CSF，IL-12，AFP，VEGFR2)和酶(例如，大肠杆菌CD，HSV-TK)。在一些实施方式中，抗癌分子包括介导RNA干扰，微RNA应答或抑制，TLR应答，反义基因调节，靶蛋白结合(适体或诱饵寡核苷酸)，基因编辑(例如CRISPR干扰)的核酸分子。在一些实施方式中，细菌或病毒可用作载体以将DNA转移到哺乳动物细胞中，例如通过细菌转染(Bernardes等，2013)。本文描述并列出了其他抗癌分子。
抗体通常是指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，其能够非共价地、可逆地和以特异性方式结合相应的抗原。示例性抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)，通过二硫键连接。公认的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ，μ，α，δ或ε，其又分别定义免疫球蛋白类别IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。每条链的N-末端限定了约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的这些区域。
如本文所用，术语“抗体”或“抗体”意在包括具有一种或多种特定结合特异性的抗体及其片段的所有变体。因此，术语“抗体”或“抗体”意指包括全长抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体(ScFv，骆驼科)，Fab，Fab'，这些片段的多聚体形式(例如，F(ab')2)，单域抗体(sdAB，VHH片段)，重链抗体(HCAb)，纳米抗体，双抗体和微抗体。抗体可具有一种以上的结合特异性，例如是双特异性的。术语“抗体”还意味着包括所谓的抗体模拟物。抗体模拟物是指小分子，例如3-30kDa，其可以是单氨基酸链分子，其可以特异性结合抗原但不具有抗体相关结构。抗体模拟物包括但不限于Affibody分子(蛋白A的Z结构域)，Affilins(Gamma-B结晶)，遍在蛋白，Affimers(胱抑素)，Affitins(Sac7d(来自Sulfolobusacidocaldarius))，Alpha体(三螺旋)卷曲螺旋)，Anticalins(Lipocalins)，Avimers(各种膜受体的结构域)，DARPins(锚蛋白重复基序)，Fynomers(Fyn的SH3结构域)，Kunitz结构域肽(各种蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域)，Ecallantide(Kalbitor)，和单抗体。在某些方面，术语“抗体”或“抗体”意指单链抗体，单域抗体和骆驼抗体。用于治疗癌症和其他抗癌抗体的抗体的效用可以例如在Scott等，CancerTherapyforCancer，NatureReviewsCancer2012年第12卷中找到，其通过引用整体并入。
“单链抗体”或“单链抗体”通常是指包含免疫球蛋白的重链，免疫球蛋白的轻链和任选的接头或键(例如二硫键)的肽。单链抗体缺乏传统抗体中发现的恒定Fc区。在一些实施方式中，单链抗体是天然存在的单链抗体，例如骆驼科抗体。在一些实施方式中，单链抗体是合成的，工程化的或修饰的单链抗体。在一些实施方式中，尽管添加了接头并去除了恒定区，但与原始免疫球蛋白相比，单链抗体能够保留基本上相同的抗原特异性。在一些方面，单链抗体可以是“scFv抗体”，其是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白(没有任何恒定区)，任选地连接有10至约25个氨基酸的短接头肽，例如美国专利No.4,946,778中描述的，其内容通过引用整体并入本文。Fv片段是保持抗体的结合位点的最小片段，该结合位点可以在一些方面维持原始抗体的特异性。用于产生单链抗体的技术描述于美国专利号4,946,778中。scFv的VH和VL序列可以通过连接VL的C末端与VH的N末端或通过连接VL的N末端与VH的C末端来连接。ScFv片段是独立的折叠实体，其可以在任一端与其他表位标签或蛋白质结构域无特色地融合。不同长度的接头可用于连接VH和VL序列，其中接头可以是富含甘氨酸(提供柔韧性)和富含丝氨酸或苏氨酸(增加溶解度)。短接头可以阻止两个结构域的结合，并且可以产生多聚体(双抗体，三体等)。长接头可以导致蛋白水解或弱域结合(在Voelkel等，2011中描述)。最常使用长度为15至20个氨基酸或18至20个氨基酸的接头。包括其他柔性接头的接头的其他非限制性实例描述于Chen等，2013(Adv DrugDeliv Rev.2013年10月15日；65(10)：1357-1369，Fusion Protein Linkers:Property,Design and Functionality)，其内容通过引用整体并入本文。柔性接头还富含小氨基酸或极性氨基酸，如甘氨酸和丝氨酸，但可以含有其他氨基酸，如苏氨酸和丙氨酸，以保持柔性，以及极性氨基酸，如赖氨酸和谷氨酸，以提高溶解度。示例性接头包括但不限于“KESGSVSSEQLAQFRSLD和EGKSSGSGSESKST，(Gly)8，以及富含Gly和Ser的柔性接头GSAGSAAGSGEF。如本文所用的“单链抗体”还包括单域抗体，其包括骆驼科抗体和其他重链抗体，轻链抗体，包括衍生自人，小鼠或其他物种的纳米抗体和单域VH或VL结构域。单域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠，人，骆驼，美洲驼，鱼，鲨鱼，山羊，兔和牛。单域抗体包括具有骆驼支架的结构域抗原结合单元，其来自骆驼，美洲驼或羊驼。骆驼科动物产生缺乏轻链的功能性抗体。重链可变(VH)结构域自主折叠并独立地作为抗原结合单元起作用。与经典抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比，其结合表面仅涉及三个CDR。骆驼科抗体能够获得与常规抗体相当的结合亲和力。基于骆驼科支架的抗体可以使用本领域熟知的方法生产。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR，'免疫球蛋白新抗原受体')，从中可以获得称为VNAR片段的单域抗体。或者，来自人或小鼠的IgG的二聚体可变结构域可以分成单体。纳米抗体是衍生自轻链的单链抗体。术语“单链抗体”也指抗体模拟物。
在一些实施方式中，由工程微生物表达的抗体是生物特异性的。在某些实施方式中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(双抗体)，双特异性scFv抗体，其中抗体分子识别两种不同的表位，单结合结构域(dAb)和微抗体。单体单链双抗体(scDb)易于在细菌和哺乳动物细胞中组装，并且在生理条件下显示出改善的稳定性(Voelkel等，2001及其中的参考文献；Protein Eng.(2001)14(10)：815-823(描述用于表达单体和二聚体双特异性单链双抗体的优化的接头序列)。
如本文所用，术语“多肽”包括“多肽”以及“多肽”，并且是指由通过酰胺键(即肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指特定长度的产物。因此，“肽”，“二肽”，“三肽”，“寡肽”，“蛋白质”，“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可用于代替这些术语中的任何术语，或与这些术语中的任何术语互换。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，衍生化，蛋白水解切割或非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生。在其他实施方式中，多肽由本发明的基因工程化细菌产生。本发明的多肽可具有约3或更多，5或更多，10或更多，20或更多，25或更多，50或更多，75或更多，100或更多，200或更多，500或更多，1,000或更多，或2,000或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，虽然它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为是折叠的，并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同的构象的多肽被称为是未折叠的。
“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。特定水平的纯化是不需要的。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质，包括但不限于细菌或哺乳动物细胞，被认为出于本发明的目的是分离的，如是已被通过任何合适的技术分离，分级，或部分或基本上纯化的天然或重组多肽。重组肽，多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽，多肽或蛋白质，即由通过编码多肽的外源重组DNA表达构建体转化的微生物或哺乳动物细胞产生的。在大多数细菌培养物中表达的蛋白质或肽通常不含聚糖。还包括前述多肽的片段，衍生物，类似物或变体，及其任何组合作为多肽。术语“片段”，“变体”，“衍生物”和“类似物”包括具有与原始肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的多肽，并且包括保留相应的原始多肽的至少一种或多种性质的任何多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。片段还包括衍生自本文所述任何多肽的特异性抗体或生物活性片段或免疫活性片段。变体可以天然存在或非天然存在。可以使用本领域已知的诱变方法产生非天然存在的变体。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代，缺失或添加。
多肽还包括融合蛋白。如本文所用，术语“变体”包括融合蛋白，其包含原始肽的序列或与原始肽足够相似。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含两种或更多种不同蛋白质的氨基酸序列的嵌合蛋白质。通常，融合蛋白由众所周知的体外重组技术产生。融合蛋白可具有与作为融合蛋白的组分的个体原始蛋白质相似的结构功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的调节功能(但不一定到了相同的程度)，和/或类似的生化功能(但不一定到了相同的程度)和/或免疫活性(但不一定到了相同的程度)。“衍生物”包括但不限于肽，其含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。通过比较一个肽的氨基酸序列与第二个肽的序列来确定两种肽之间的“相似性”。如果一个肽的氨基酸是相同的或保守的氨基酸取代，则其与第二个肽的相应氨基酸相似。保守取代包括在Dayhoff，MO，ed.，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，National Biomedical ResearchFoundation，Washington，DC(1978)和Argos，EMBO J.8(1989)，779-785中描述的那些。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守的变化或取代：-Ala，Pro，Gly，Gln，Asn，Ser，Thr；-Cys，Ser，Tyr，Thr；-Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；-Lys，Arg，His；-Phe，Tyr，Trp，His；和-Asp，Glu。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码一种或多种融合蛋白的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与稳定化多肽融合的效应子或抗癌分子的基因序列。此类稳定化多肽是本领域已知的并且包括Fc蛋白。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的融合蛋白是Fc融合蛋白，例如IgG Fc融合蛋白或IgA Fc融合蛋白。
在一些实施方式中，抗癌分子通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子的C末端通过肽接头或肽键与稳定化多肽的N末端共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子的N末端通过肽接头或肽键与稳定化多肽的C末端共价融合。在一些实施方式中，稳定化多肽包含免疫球蛋白Fc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH2恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH1恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区，免疫球蛋白重链CH2恒定区和免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。权利要求2-64和权利要求112-122中任一项的基因工程化细菌，其中免疫球蛋白Fc多肽是人IgG Fc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽是人IgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽包含序列[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1，2，3，4，5或6。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgG FC融合多肽。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgG4 Fc多肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS。在一些实施方式中，SIRPα的N末端通过包含SGGGGSGGGGSGGGGS的肽接头与IgG4 Fc的C末端共价融合。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多聚体多肽组分的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，多肽是二聚体。二聚体蛋白质的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-15(异二聚体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的一种或多种基因，其中所述一种或多种多肽包含第一单体和第二单体。在一些实施方式中，第一单体多肽通过肽接头或肽键与第二单体多肽共价连接。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，第一和第二单体具有相同的多肽序列。在一些实施方式中，第一和第二单体各自具有不同的多肽序列。在一些实施方式中，第一单体是IL-12p35多肽，第二单体是IL-12p40多肽。在一些实施方式中，接头包含GGGGSGGGS。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码hIGg4融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:1117中的一个或多个具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的hIgG4部分。在另一个实施方式中，hIgG4部分包含SEQ ID NO:1117。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽的hIgG4部分由SEQ ID NO:1117组成。
在一些实施方式中，编码融合蛋白(例如hIGg4融合蛋白)的核酸包含与SEQ IDNO:1103具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源性的序列。在一些实施方式中，编码融合蛋白的核酸包含SEQ ID NO:1103。在一些实施方式中，编码hIgG4的核酸部分由SEQ ID NO:1103组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:1121中的一个或多个具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的接头部分。在另一个实施方式中，接头部分包含SEQ ID NO:1121。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽的接头部分由SEQ ID NO:1121组成。
在一些实施方式中，可以通过与促进效应子功能的另一多肽融合来改善抗癌分子的效应子功能。这种融合的非限制性实例是IL-15与IL-15Rα的Sushi结构域的融合，如本文所述。因此，在一些实施方式中，第一单体多肽是IL-15单体，第二单体是IL-15Rαsushi结构域多肽。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码本文所述的一种或多种分泌标签的一个或多个基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌包含内源膜相关蛋白中的一个或多个突变，从而允许可扩散的外膜表型。本文描述了合适的外膜突变。
如本文所用，术语“足够相似”是指第一氨基酸序列，其相对于第二氨基酸序列含有足够或最少数量的相同或等同的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或至少约100％同一性的共同结构域的氨基酸序列在本文中定义为足够相似。优选地，变体与本发明的肽的氨基酸序列足够相似。这些变体通常保留了本发明的肽的功能活性。变体包括氨基酸序列分别与天然肽和野生型肽相差一个或多个氨基酸缺失，添加和/或取代的肽。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
如本文所用，术语“接头”，“接头肽”或“肽接头”或“接头”是指连接或连接两个多肽序列，例如，连接两个多肽域的合成的或非天然或非天然存在的氨基酸序列。如本文所用，术语“合成的”是指非天然存在的氨基酸序列。本文描述了示例性接头。另外的示例性接头在US20140079701中提供，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，接头是富含甘氨酸的接头。在一些实施方式中，接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。在一些实施方式中，接头包含SEQ ID NO:979。
如本文所用，术语“密码子优化的序列”是指序列，其是从现有编码序列修饰，或设计例如用于改善在从编码序列转录的转录物RNA分子的表达宿主细胞或生物体中的翻译，或改善编码序列的转录。密码子优化包括但不限于包括选择用于编码序列的密码子以适合表达宿主生物的密码子偏好的过程。
许多生物显示出对使用特定密码子编码在生长的多肽链中插入特定氨基酸的偏倚或偏好。遗传密码的简并性允许密码子偏好或密码子偏倚，生物体之间的密码子使用的差异，并且在许多生物体中有很好的记录。密码子偏倚通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而后者又被认为依赖于，尤其是被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择的tRNA在细胞中的优势通常是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化来定制基因以用于给定生物中的最佳基因表达。
如本文所用，术语“分泌系统”或“分泌蛋白”是指能够从微生物(例如细菌细胞质)分泌或输出抗癌分子的天然或非天然分泌机制。分泌系统可包含单一蛋白质或可包含组装在复合物中的两种或更多种蛋白质，例如HlyBD。革兰氏阴性细菌分泌系统的非限制性实例包括修饰的III型鞭毛，I型(例如，溶血素分泌系统)，II型，IV型，V型，VI型和VII型分泌系统，抗性-结瘤-分裂(RND)多药外排泵，各种单膜分泌系统。革兰氏阳性细菌分泌系统的非限制性实例包括Sec和TAT分泌系统。在一些实施方式中，抗癌分子包括RNA或肽来源的“分泌标签”，以将抗癌分子引导至特定的分泌系统。在一些实施方式中，分泌系统能够在从工程化细菌分泌抗癌分子之前去除该标签。例如，在V型自身分泌介导的分泌中，通过天然Sec系统将“载客”肽从细胞质转移到周质区室中时除去N-末端肽分泌标签。此外，一旦自分泌物跨外膜移位，可通过自催化或蛋白酶催化的例如OmpT切割除去C-末端分泌标签，从而将抗癌分子释放到细胞外环境中。
如本文所用，术语“转运蛋白”意指用于将分子从细胞外环境导入微生物的机制，例如一种或多种蛋白质。
免疫系统通常分为两类，先天免疫和适应性免疫，尽管与这些免疫相关的免疫反应并不相互排斥。“先天免疫”是指在外来因子或抗原在体内出现时立即或在数小时内激活的非特异性防御机制。这些机制包括物理屏障，如皮肤，血液中的化学物质，以及免疫系统细胞，如树突状细胞(DC)，白细胞，吞噬细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和自然杀伤细胞(NK)，它们攻击身体中的外来物质或细胞。此外，在先天免疫应答期间，产生细胞因子，其激活适应性免疫应答。“适应性免疫”或“获得性免疫”是指抗原特异性免疫应答，并且比先天免疫应答更复杂。必须首先通过抗原呈递细胞(APC)处理或“呈递”抗原。抗原呈递细胞或辅助细胞是在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。专业的抗原呈递细胞，包括巨噬细胞，B细胞，和树突细胞，专门用于将外来抗原呈递给T辅助细胞，而其他细胞类型可以将来自细胞内的抗原呈递给细胞毒性T细胞。一旦抗原被呈递并被识别，适应性免疫系统就会激活一群专门设计用于攻击该抗原的免疫细胞。与先天系统一样，适应性系统包括体液免疫组分(B淋巴细胞)和细胞介导的免疫(T淋巴细胞)组分。B细胞被激活以分泌抗体，其通过血流并与外来抗原结合。辅助T细胞(调节性T细胞，CD4+细胞)和细胞毒性T细胞(CTL，CD8+细胞)在其T细胞受体与抗原结合的MHC I类分子相互作用时被激活。细胞因子帮助T细胞成熟，成熟细胞反过来产生细胞因子，从而产生额外的T细胞。一旦被激活，辅助T细胞释放细胞因子，其调节和指导不同免疫细胞类型(包括APC，巨噬细胞，中性粒细胞和其他淋巴细胞)的活性，以杀死和去除靶细胞。T辅助细胞本身没有细胞毒性或吞噬活性，而是充当免疫应答介质，其指导其他细胞执行这些任务。辅助T细胞还分泌额外的信号，有助于细胞毒性T细胞的活化。激活后，CTL经历克隆选择，其中它获得功能并快速分裂以产生激活的效应细胞团。然后，活化的CTL遍布全身，寻找具有独特MHC I类和抗原的细胞。效应器CTL释放细胞毒素，在靶细胞的质膜中形成孔，引起细胞凋亡。适应性免疫还包括“记忆”，使得针对特定抗原的未来反应更有效。在感染消退后，T辅助细胞和细胞毒性T细胞死亡并被吞噬细胞清除，然而，这些细胞中的一些仍然作为记忆细胞。如果稍后遇到相同的抗原，则这些记忆细胞迅速分化成效应细胞，缩短了产生有效反应所需的时间。
“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点”是指完全或部分减少，抑制，干扰或调节一种或多种免疫检查点蛋白质的分子。免疫检查点蛋白调节T细胞活化或功能，并且是本领域已知的。非限制性实例包括CTLA-4及其配体CD80和CD86，以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。免疫检查点蛋白负责T细胞反应的共刺激或抑制相互作用，并调节和维持自身耐受性和生理免疫反应。全身免疫疗法，例如，使用CTLA-4抑制剂，可以改变免疫调节，引起免疫功能障碍，并导致机会性自身免疫疾病(参见，例如，Kong等，2014)。
“共刺激”分子是免疫调节剂，其增加或激活刺激免疫应答或炎症反应的信号。共刺激分子可以被认为是免疫检查点(免疫检查点是免疫系统中调高信号(共刺激分子)或调低信号的分子)，但是如本文所用，共刺激分子不被称为免疫检查点，而是被称为共刺激物。因此，如本文所用，“免疫检查点”意指抑制性免疫检查点而非共刺激分子。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“抑制”癌细胞的抗癌分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够减少细胞增殖，减少肿瘤生长和/或减少肿瘤体积的细菌或病毒或分子，减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“抑制”生物分子的抗癌分子，例如免疫调节剂，例如细胞因子，趋化因子，免疫调节代谢物或任何其他免疫调节剂，因子或分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够减少，降低或消除该生物分子(例如免疫调节剂)的生物活性，生物学功能和/或数量的细菌或病毒或抗癌分子。
如本文所用，基因工程微生物，例如工程化细菌，或“激活”或“刺激”生物分子的抗癌分子，例如免疫调节剂，例如细胞因子，趋化因子，免疫调节代谢物或任何其他免疫调节剂，因子或分子，是指与对照相比，例如，在相同条件下的未处理的对照或相同亚型的未修饰的微生物，能够激活，增加，增强或促进该生物分子，例如，免疫调节剂的生物活性，生物学功能和/或数量的细菌或病毒或抗癌分子。
“肿瘤靶向细菌”是指能够将其自身引导至癌细胞的细菌。肿瘤靶向细菌可以天然地能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。在一些实施方式中，不是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌经基因工程改造以将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。可以进一步改造肿瘤靶向细菌以增强或改善所需的生物学特性，减轻全身毒性和/或确保临床安全性。这些物种，菌株和/或亚型可以减毒，例如，缺失毒素基因。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌具有低感染能力。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌是运动的。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌能够深入渗透到肿瘤中，在那里标准治疗无法到达。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌能够定植至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％的恶性肿瘤。肿瘤靶向细菌的实例包括但不限于Bifidobacterium,Caulobacter,Clostridium,Escherichiacoli,Listeria,Mycobacterium,Salmonella,Streptococcus,and Vibrio,e.g.,Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium breveUCC2003,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium longum,Clostridiumacetobutylicum,Clostridium butyricum,Clostridium butyricum M-55,Clostridiumbutyricum miyairi,Clostridium cochlearum,Clostridium felsineum,Clostridiumhistolyticum,Clostridium multifermentans,Clostridium novyi-NT,Clostridiumparaputrificum,Clostridium pasteureanum,Clostridium pectinovorum,Clostridiumperfringens,Clostridium roseum,Clostridium sporogenes,Clostridium tertium,Clostridium tetani,Clostridium tyrobutyricum,Corynebacterium parvum,Escherichia coli MG1655,Escherichia coli Nissle 1917,Listeria monocytogenes,Mycobacterium bovis,Salmonella choleraesuis,Salmonella typhimurium和Vibriocholera(Cronin等，2012；Forbes，2006年；Jain和Forbes，2001年；Liu等，2014；Morrissey等，2010；Nuno等，2013；Patyar等，2010；Cronin等，Mol Ther 2010；18：1397-407)。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌是非致病细菌。
“肿瘤靶向溶瘤病毒”是指能够将其自身引导至癌细胞的病毒。肿瘤靶向病毒可天然地能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。不是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的溶瘤病毒可以进行基因工程改造以将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织。此外，它们可以进一步设计以针对特定的癌症或细胞类型。还可以改造靶向肿瘤的溶瘤病毒以增强或改善所需的生物学特性(例如，裂解特性)，减轻全身毒性和/或确保临床安全性。这些物种，菌株和/或亚型可以减毒，例如，缺失毒素基因。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌具有低感染能力。肿瘤靶向溶瘤病毒的实例在Chlocca等，Cancer Immunol research，2014，2：295-300和Kaufman等，Nature，2016，14：642-662中综述。
“微生物”是指微观，亚显微或超微尺寸的生物或微生物，其通常由单个细胞组成。微生物的实例包括细菌，病毒，寄生虫，真菌，某些藻类，原生动物和酵母。在一些方面，将微生物工程化(“工程微生物”)以产生一种或多种抗癌分子。在某些实施方式中，工程微生物是工程化细菌。在某些实施方式中，工程微生物是工程化酵母。
如本文所用，术语“重组微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰。因此，“重组细菌细胞”或“重组细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰的细菌细胞或细菌。例如，重组细菌细胞可以具有引入其DNA的核苷酸插入，核苷酸缺失，核苷酸重排和核苷酸修饰。这些遗传修饰可以存在于细菌或细菌细胞的染色体中，或存在于细菌或细菌细胞中的质粒上。本文公开的重组细菌细胞可包含质粒上的外源核苷酸序列。或者，重组细菌细胞可包含稳定引入其染色体中的外源核苷酸序列。
“编程或工程微生物”是指微生物，例如细菌，酵母或病毒细胞，或细菌，酵母或病毒，其已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能。因此，“编程或工程化细菌细胞”或“编程或工程化细菌”是指已经从其天然状态进行遗传修饰以执行特定功能的细菌细胞或细菌。在某些实施方式中，编程或工程化细菌细胞已被修饰以表达一种或多种蛋白质，例如，一种或多种具有治疗活性或用于治疗目的的蛋白质。编程或工程化细菌细胞可另外具有一旦表达感兴趣的一种或多种蛋白质就停止生长或自我破坏的能力。
“非致病性细菌”是指不能在宿主中引起疾病或有害反应的细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌是革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，非致病细菌不含有脂多糖(LPS)。在一些实施方式中，非致病细菌是共生细菌。非致病性细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：Bacillus,Bacteroides,Bifidobacterium,Brevibacteria,Clostridium,Enterococcus,Escherichia coli,Lactobacillus,Lactococcus,Saccharomyces,and Staphylococcus,e.g.,Bacillus coagulans,Bacillus subtilis,Bacteroides fragilis,Bacteroidessubtilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacterium lactis,Bifidobacterium longum,Clostridium butyricum,Enterococcus faecium,Escherichia coli Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus casei,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus rhamnosus,Lactococcus lactis和Saccharomyces boulardii(Sonnenborn等，2009；Dinleyici等，2014；美国专利号6835376；美国专利号6203797；美国专利号5589168；美国专利号7731976)。天然致病细菌可以通过基因工程改造以减少或消除致病性。
“益生菌”用于指活的非致病微生物，例如细菌，其可赋予含有适量微生物的宿主生物以健康益处。在一些实施方式中，宿主生物是哺乳动物。在一些实施方式中，宿主生物是人。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，益生菌是革兰氏阳性细菌。目前，一些非致病细菌的物种，菌株和/或亚型被认为是益生菌。益生菌细菌的实例包括，但不限于属于以下属的某些菌株：Bifidobacteria,Escherichia coli,Lactobacillus,and Saccharomyces,e.g.,Bifidobacterium bifidum,Enterococcusfaecium,Escherichia coli strain Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum和Saccharomyces boulardii(Dinleyici等，2014；美国专利号5589168；美国专利号6203797；美国专利号6835376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等，2012；Cuevas-Ramos等，2010；Olier等，2012；Nougayrede等，2006)。可以对非致病细菌进行基因工程改造以增强或改善所需的生物学特性，例如生存能力。可以对非致病细菌进行基因工程以提供益生菌特性。益生菌可以通过基因工程改造或编程以增强或改善益生菌特性。
如本文所用，“溶瘤病毒”(OV)是具有特异性感染和裂解癌细胞的能力，同时使正常细胞不受伤害的病毒。感兴趣的溶瘤病毒包括但不限于腺病毒，柯萨奇病毒，呼肠孤病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，牛痘，禽痘，水疱性口炎病毒(VSV)，麻疹和细小病毒，还包括狂犬病，西尼罗河病毒，新城疫及其基因改造版本。OV的非限制性实例是TalimogeneLaherparepvec(T-VEC)，其是由FDA作为癌症治疗剂许可的第一种溶瘤病毒。
“可操作地连接”是指核酸序列，例如编码CTLA-4抑制剂的基因，其以允许核酸序列表达的方式与调节区序列连接，例如以顺式作用。调节区是核酸，其可以引导感兴趣的基因的转录，并且可以包括启动子序列，增强子序列，应答元件，蛋白质识别位点，可诱导元件，启动子控制元件，蛋白质结合序列，5'和3'非翻译区，转录起始位点，终止序列，多腺苷酸化序列和内含子。
“诱导型启动子”是指与一个或多个基因可操作地连接的调节区，其中基因的表达在所述调节区的诱导物的存在下增加。
“外源环境条件”是指诱导本文所述启动子的环境或环境。在一些实施方式中，外源环境条件对含有癌细胞(例如肿瘤)的恶性生长是特异性的。短语“外源环境条件”意指完整(未溶解的)工程微生物外部的环境条件，但是对于肿瘤环境或宿主受试者环境是内源的或天然的。因此，“外源的”和“内源的”可互换使用，指其中环境条件对哺乳动物体为内源，但对完整微生物细胞是外部或外源的环境条件。在一些实施方式中，外源环境条件是低氧，微需氧或厌氧条件，例如低氧和/或坏死组织。一些实体瘤与低细胞内和/或细胞外pH相关；在一些实施方式中，外源环境条件是低pH环境。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含pH依赖性启动子。在一些实施方式中，本公开的基因工程微生物包含氧水平依赖性启动子。在一些方面，细菌已经进化出能够感测氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区”是指一种或多种氧水平感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或活化激活下游基因表达。
氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR(富马酸盐和硝酸盐还原酶)，ANR和DNR。相应的FNR响应性启动子，ANR(厌氧硝酸盐呼吸)-响应性启动子和DNR(异化硝酸盐呼吸调节剂)-响应性启动子是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Eiglmeier等，1989；Galimand等，1991；Hasegawa等，1998；Hoeren等，1993；Salmon等，2003)，非限制性实例示于表2中。
在一个非限制性实例中，启动子(PfnrS)衍生自大肠杆菌Nissle富马酸和硝酸盐还原酶基因S(fnrS)，已知其在低环境氧或无环境氧条件下高度表达(Durand和Storz，2010；Boysen等，2010)。PfnrS启动子在厌氧条件下被天然存在于Nissle中的全局转录调节因子FNR激活。在厌氧条件下，FNR形成二聚体并与其控制下的特定基因的启动子中的特定序列结合，从而激活它们的表达。然而，在有氧条件下，氧与FNR二聚体中的铁-硫簇反应并将它们转化为无活性形式。以这种方式，采用PfnrS诱导型启动子来调节蛋白质或RNA的表达。PfnrS在本申请中与FNRS，fnrs，FNR，P-FNRS启动子和其他此类相关名称可互换使用以指示启动子PfnrS。
表2.转录因子和响应基因和调节区的实例
Figure BDA0002194618080000451
Figure BDA0002194618080000461
如本文所用，“非天然”核酸序列是指通常不存在于微生物中的核酸序列，例如内源序列的额外拷贝，或异源序列，例如来自不同物种，菌株，或细菌或病毒的亚株的序列，或与来自相同亚型的细菌或病毒的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列。在一些实施方式中，非天然核酸序列是合成的非天然存在的序列(参见，例如，Purcell等，2013)。非天然核酸序列可以是调节区，启动子，基因和/或基因盒中的一个或多个基因。在一些实施方式中，“非天然的”是指两种或更多种核酸序列，其在自然界中彼此不存在相同的关系。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含可操作地连接至直接或间接诱导型启动子的基因，所述启动子与所述基因天然无关，例如，可操作地与编码抗癌分子的基因连锁的FNR反应性启动子(或本文所述的其他启动子)。
“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作连接的编码序列或基因连续转录的启动子。组成型启动子和变体在本领域是熟知的，包括，但不限于，BBa_J23100，组成型大肠杆菌σS启动(例如，osmY启动子(国际基因工程机(iGEM大赛)登记处标准生物部件名称BBa_J45992；BBa_J45993))，组成型大肠杆菌σ32启动子(例如，htpG热休克启动子(BBa_J45504))，组成型大肠杆菌σ70启动子(例如，拉克启动子(BBa_J54200；BBa_J56015)，大肠杆菌CreABCD磷酸盐传感操纵子启动子(BBa_J64951)，GlnRS启动子(BBa_K088007)，lacZ启动子(BBa_K119000；BBa_K119001)；M13K07基因I启动子(BBa_M13101)；M13K07基因II启动子(BBa_M13102)，M13K07基因III启动子(BBa_M13103)，M13K07基因IV启动子(BBa_M13104)，M13K07基因V启动子(BBa_M13105)，M13K07基因VI启动子(BBa_M13106)，M13K07基因VIII启动子(BBa_M13108)，M13110(BBa_M13110))，组成型枯草芽孢杆菌σA启动子(例如，启动子veg(BBa_K143013)，启动子43(BBa_K143013)，PliaG(BBa_K823000)，PlepA(BBa_K823002)，Pveg(BBa_K823003))，组成型枯草芽孢杆菌σB启动子(例如，启动子CTC(BBa_K143010)，启动子gsiB(BBa_K143011))，沙门氏菌启动子(例如，来自沙门氏菌的Pspv2(BBa_K112706)，来自沙门氏菌的Pspv(BBa_K112707))，噬菌体T7启动子(例如，T7启动子(BBa_I712074；BBa_I719005；BBa_J34814；BBa_J64997；BBa_K113010；BBa_K113011；BBa_K113012；BBa_R0085；BBa_R0180；BBa_R0181；BBa_R0182；BBa_R0183；BBa_Z0251；BBa_Z0252；BBa_Z0253))和噬菌体SP6启动子(例如，SP6启动子(BBa_J64998))。在一些实施方式中，此类启动子在体外具有活性，例如在培养，扩增和/或制造条件下。在一些实施方式中，此类启动子在体内具有活性，例如在体内环境中发现的条件下，例如肠和/或肿瘤微环境。
如本文所用，“稳定维持的”或“稳定的”细菌或病毒用于指携带非天然遗传物质的细菌或病毒宿主细胞，例如抗癌分子，使得非天然遗传物质是保留，表达和传播。稳定的细菌或病毒能够在体外存活和/或生长，例如在培养基中和/或体内，例如在缺氧和/或坏死组织中。例如，稳定细菌或病毒可以是基因工程化细菌或基因工程化病毒，其包含编码抗癌分子的非天然遗传物质，其中携带非天然遗传物质的质粒或染色体稳定地保持在细菌或病毒中，使得抗癌分子可以在细菌或病毒中表达，并且细菌或病毒能够在体外和/或体内存活和/或生长。
如本文所用，术语“调节”和“治疗”及其同源物是指癌症或其至少一种可辨别的症状的改善。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指至少一种可测量的物理参数的改善，不一定是患者可辨别的。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指在物理上(例如，可辨别的症状的稳定)，生理学上(例如，物理参数的稳定化)或两者来抑制癌症的进展。在另一个实施方式中，“调节”和“治疗”是指减缓癌症的进展或逆转癌症的进展。如本文所用，“预防”及其同源性是指延迟发作或降低获得给定癌症的风险。
需要治疗的那些可以包括已经患有特定癌症的个体，以及处于患有所述癌症的风险的那些，或可以最终患有所述癌症的那些。例如，通过与癌症的发生相关的一种或多种风险因素的存在(例如，酒精使用，烟草使用，肥胖，过度暴露于紫外线，高水平的雌激素，家族史，遗传易感性)，癌症的存在或进展，或患有癌症的受试者对治疗的可能接受，来评估治疗需求。癌症是由受影响细胞内的基因组不稳定性和高突变率引起的。治疗癌症可以包括消除与癌症相关的症状和/或调节受试者肿瘤的生长和/或体积，并且不一定包括消除癌症的潜在原因，例如潜在的遗传易感性。
如本文所用，术语“常规癌症治疗”或“常规癌症疗法”是指被大多数医疗保健专业人员广泛接受和使用的治疗或疗法。它与替代或补充疗法不同，后者没有广泛使用。常规癌症治疗的实例包括手术，化学疗法，靶向疗法，放射疗法，Tomotherapy，免疫疗法，癌症疫苗，激素疗法，体温过高，干细胞移植(外周血，骨髓和脐带血移植)，光动力疗法，疗法，和血液制品捐赠和输血。
如本文所用，“药物组合物”是指本公开的基因工程微生物与其他组分(例如生理学上合适的载体和/或赋形剂)的制剂。
可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用的细菌或病毒化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂。
术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。实例包括但不限于碳酸氢钙，磷酸钙，各种糖和淀粉类型，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致预防，延迟症状发作或改善病症(例如癌症)症状的化合物的量。治疗有效量可以例如足以治疗，预防，降低严重性，延迟发作，和/或降低与癌细胞相关的病症的一种或多种症状发生的风险。治疗有效量以及治疗有效的给药频率可以通过本领域已知的方法确定并在下面讨论。
除非另有明确说明，否则本文所用的冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。
当在列表中的要素之间使用时，短语“和/或”旨在表示(1)仅存在单个列出的要素，或(2)存在列表的多于一个要素。例如，“A，B和/或C”表示选择可以仅A；仅B；仅C；A和B；A和C；B和C；或A，B和C。短语“和/或”可以与列表中的要素中的“至少一个”或“一个或多个”互换使用。
细菌
基因工程化微生物或程序化微生物，例如本公开的基因工程化细菌，能够局部和肿瘤特异性递送抗癌分子，从而减少与全身施用所述分子相关的全身细胞毒性和/或免疫功能障碍。工程化细菌可以全身，口服，局部和/或肿瘤内给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够靶向癌细胞，特别是在肿瘤的缺氧区域，并产生抗癌分子，例如本文提供的免疫检查点抑制剂或其他抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在启动子的控制下表达抗癌分子，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的低氧环境)激活。
在一些实施方式中，肿瘤靶向微生物是天然能够将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌。例如，可以在细菌或宿主中没有任何特异性遗传修饰的情况下实现肿瘤的细菌定植(Yu等，2008)。在一些实施方式中，肿瘤靶向细菌是天然不能将其自身引导至癌细胞，坏死组织和/或缺氧组织的细菌，但是经基因工程改造以这样做。在一些实施方式中，基因工程化细菌血行传播以到达靶向肿瘤。细菌感染与肿瘤消退有关(Hall，1998；Nauts和McLaren，1990)，并且已经显示某些细菌物种定位并裂解坏死的哺乳动物肿瘤(Jain和Forbes，2001)。肿瘤靶向细菌的非限制性实例显示在表3中。
表3.具有肿瘤靶向能力的细菌
Figure BDA0002194618080000501
某些细菌的肿瘤靶向能力似乎取决于肿瘤发展阶段，但与肿瘤类型无关(Yu等，2008)。已经显示静脉注射的细菌靶向肿瘤的中央部分并且与那些肿瘤的坏死区域一致(Yu等，2008)。单独的炎症已被证明不足以维持细菌定植(Yu等，2008)。在一些实施方式中，在细菌递送之前，例如通过溶瘤痘苗病毒使肿瘤致敏以增强定植。在一些实施方式中，血源性细菌进入肿瘤并且能够在中央坏死区域中扩增，因为细菌的清除受到抑制(Yu等，2008)。
在一些实施方式中，感兴趣的基因在细菌中表达，其增强免疫疗法的功效。Vetizou等(2015)描述了特异性针对Bacteroides thetaiotaomicron或脆弱拟杆菌的T细胞应答，其与小鼠和患者中CTLA-4阻断的功效相关。Sivan等(2015)说明了双歧杆菌对黑素瘤小鼠模型中抗肿瘤免疫和抗PD-L1抗体(PD-1配体)功效的重要性。在一些实施方式中，表达一种或多种抗癌分子的细菌是拟杆菌。在一些实施方式中，表达一种或多种抗癌分子的细菌是双歧杆菌。在一些实施方式中，表达一种或多种抗癌分子的细菌是大肠杆菌Nissle。在一些实施方式中，表达一种或多种抗癌分子的细菌是Clostridium novyi-NT。在一些实施方式中，表达一种或多种抗癌分子的细菌是Clostridium butyricum miyairi。
在某些实施方式中，基因工程化细菌是专性厌氧细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌是兼性厌氧细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌是需氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性细菌并且缺乏LPS。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性和专性厌氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阳性和兼性厌氧细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是非致病细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是共生细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是益生菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是天然致病细菌，其被修饰或突变以减少或消除致病性。示例性细菌包括但不限于Bacillus,Bacteroides,Bifidobacterium,Brevibacteria,Caulobacter,Clostridium,Enterococcus,Escherichia coli,Lactobacillus,Lactococcus,Listeria,Mycobacterium,Saccharomyces,Salmonella,Staphylococcus,Streptococcus,Vibrio,Bacilluscoagulans,Bacillus subtilis,Bacteroides fragilis,Bacteroides subtilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacteriumbifidum,Bifidobacterium breve UCC2003,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium lactis,Bifidobacterium longum,Clostridium acetobutylicum,Clostridium butyricum,Clostridium butyricum M-55,Clostridium butyricummiyairi,Clostridium cochlearum,Clostridium felsineum,Clostridiumhistolyticum,Clostridium multifermentans,Clostridium novyi-NT,Clostridiumparaputrificum,Clostridium pasteureanum,Clostridium pectinovorum,Clostridiumperfringens,Clostridium roseum,Clostridium sporogenes,Clostridium tertium,Clostridium tetani,Clostridium tyrobutyricum,Corynebacterium parvum,Escherichia coli MG1655,Escherichia coli Nissle 1917,Listeria monocytogenes,Mycobacterium bovis,Salmonella choleraesuis,Salmonella typhimurium,Vibriocholera和表3所示细菌。在某些实施方式中，基因工程化细菌选自Enterococcus faecium,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus casei,Lactobacillus johnsonii,Lactobacillus paracasei,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus reuteri,Lactobacillus rhamnosus,Lactococcus lactis,和Saccharomyces boulardii。在某些实施方式中，基因工程化细菌选自Bacteroidesfragilis,Bacteroides thetaiotaomicron,Bacteroides subtilis,Bifidobacteriumbifidum,Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium lactis,Clostridiumbutyricum,Escherichia coli Nissle,Lactobacillus acidophilus,Lactobacillusplantarum,Lactobacillus reuteri,和Lactococcus lactis。在一些实施方式中，乳杆菌用于一种或多种抗癌分子的肿瘤特异性递送。已经发现静脉内注射干酪乳杆菌在肿瘤中积聚，其通过硝酸甘油(NG)(一种常用的NO供体)增强，可能是由于NO在增加血管流向血管内肿瘤中的作用(Methods Mol Biol.2016；1409:9-23.Enhancement of Tumor-TargetedDelivery of Bacteria with Nitroglycerin Involving Augmentation of the EPREffect)。
在一些实施方式中，遗传改造的细菌是专性厌氧菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是梭菌并且能够肿瘤特异性递送抗癌分子。梭菌属于专性厌氧细菌，其产生孢子并且天然能够定植并且在一些情况下溶解缺氧肿瘤(Groot等，2007)。在实验模型中，梭菌已用于递送前药转化酶并增强放射治疗(Groot等，2007)。在一些实施方式中，基因工程化细菌选自Clostridium novyi-NT,Clostridium histolyticium,Clostridium tetani,Clostridium oncolyticum,Clostridium sporogenes,和Clostridium beijerinckii(Liu等，2014)。在一些实施方式中，梭菌属天然是非致病性的。例如，溶瘤梭菌(Clostridiumoncolyticum)是致病性的并且能够裂解肿瘤细胞。在替代性实施方式中，梭菌属天然致病性但经过修饰以降低或消除致病性。例如，Clostridium novyi是天然致病性的，并且Clostridium novyi-NT被修饰以去除致死毒素。Clostridium novyi-NT和Clostridiumsporogenes已用于递送单链HIF-1α抗体以治疗癌症，并且是“优良的肿瘤定植梭菌属菌株”(Groot等，2007)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌兼性厌氧菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是沙门氏菌，例如鼠伤寒沙门氏菌，并且能够肿瘤特异性递送抗癌分子。沙门氏菌是非孢子形成的革兰氏阴性细菌，是兼性厌氧菌。在一些实施方式中，沙门氏菌是天然致病性的，但经过修饰以减少或消除致病性。例如，对鼠伤寒沙门氏菌进行修饰以去除致病位点(减毒)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是双歧杆菌并且能够肿瘤特异性递送抗癌分子。双歧杆菌是革兰氏阳性，分支的厌氧细菌。在一些实施方式中，双歧杆菌天然是非致病性的。在替代性实施方式中，双歧杆菌是天然致病性的，但经过修饰以降低或消除致病性。已显示双歧杆菌和沙门氏菌优先靶向并在肿瘤的缺氧和坏死区域中复制(Yu等，2014)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是大肠杆菌。例如，已显示大肠杆菌Nissle在口服或静脉内给药后优先在体内定植肿瘤组织(Zhang等，2012和Danino等，2015)。大肠杆菌也显示出强大的肿瘤特异性复制(Yu等，2008)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(大肠杆菌Nissle)，肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，“已经进化为最佳表征的益生菌之一”(Ukena等，2007)。该菌株的特征在于其完全无害(舒尔茨，2008)，并且具有GRAS(通常识别为安全)状态(Reister等，2014，强调)。
本发明的基因工程化细菌可以被破坏，例如通过组织或血清中的防御因子(Sonnenborn等，2009)。在一些实施方式中，重复施用基因工程化细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌施用一次。
在某些实施方式中，本文所述的抗癌分子在基因工程化细菌的一个物种、菌株或亚型中表达。在替代性实施方式中，抗癌分子在基因工程化细菌的两个或更多个物种、菌株和/或亚型中表达。本领域普通技术人员将理解，本文公开的遗传修饰可以被修饰并适用于其他物种、菌株和细菌亚型。
适合的细菌的其他实例描述于国际专利公开WO/2014/043593中，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，突变此类细菌以减弱一种或多种毒力因子。
在一些方面，工程化细菌可以与其他癌症疗法组合，例如常规抗癌疗法，其他免疫疗法和/或工程化或未工程化的溶瘤病毒。
抗癌分子
消除(逆转)局部免疫抑制
肿瘤细胞通常通过产生干扰树突细胞的抗原呈递或成熟的信号来逃避破坏，从而导致它们的前体成熟为免疫抑制细胞类型。因此，一种或多种抗癌分子的局部递送，其预防或抑制免疫调节分子的活性，所述免疫调节分子参与在肿瘤部位引发、促进和/或维持免疫抑制，单独或与一种或多种其他抗癌分子组合，提供治疗益处。
免疫检查点抑制剂
在一些实施方式中，抗癌分子是免疫抑制分子的抑制剂，例如免疫检查点分子的抑制剂。待抑制的免疫检查点分子可以是任何已知的或后来发现的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子。在一些实施方式中，待抑制的免疫检查点分子或其他免疫抑制分子选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，PD-L2，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1。，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R，CD39，CD73，B7-H3，B7-H4，IDO，TDO，KIR和A2aR。在某些方面，本公开提供了工程化微生物，例如工程化细菌，其被工程化以产生一种或多种抑制免疫检查点或其他免疫抑制分子的抗癌分子。在一些实施方式中，遗传改造的微生物能够减少癌细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其已经被工程化以靶向癌症或肿瘤细胞。在一些实施方式中，基因工程化微生物是表达免疫检查点抑制剂或另一种免疫抑制剂分子的抑制剂的细菌，其在由低氧条件(例如，肿瘤的低氧环境)激活的启动子的控制下。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下表达一种或多种免疫检查点抑制剂，例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是基因工程化细菌，其包含编码CTLA-4抑制剂的基因，例如针对CTLA-4的抗体。在任何这些实施方式中，抗-CTLA-4抗体可以是单链抗-CTLA-4抗体。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是基因工程化细菌，其包含编码PD-1抑制剂的基因，例如针对PD-1的抗体。在任何这些实施方式中，抗PD-1抗体可以是单链抗PD-1抗体。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是包含编码选自PD-L1，PD-L2，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R，CD39，CD73，B7-H3，B7-H4，IDO，TDO，KIR和A2aR抑制剂的抑制剂的基因的工程化细菌，例如针对任何列出的免疫检查点或其他抑制分子的抗体。在任何这些实施方式中，抗体可以是单链抗体。在一些实施方式中，表达检查点抑制剂或另一种免疫抑制剂分子的抑制剂的工程化细菌局部施用，例如通过肿瘤内注射。在一些实施方式中，表达检查点抑制剂或另一种免疫抑制剂分子的抑制剂的工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物是肿瘤靶向细菌，其包含编码CTLA-4抑制剂的基因，例如抗CTLA-4抗体，并且能够特异性地和局部地递送抗癌分子至癌细胞。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其包含编码PD-1抑制剂的基因，例如抗PD-1抗体，并且能够特异性地和局部地递送抗癌分子至癌细胞。在其他实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其包含编码检查点的抑制剂，或选自PD-L1，PD-L2，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R，CD39，CD73，B7-H3，B7-H4，IDO，TDO，KIR和A2aR的另一种免疫抑制分子的抑制剂的基因，例如针对任何此类分子的抗体并且能够将抗癌分子特异性地和局部地递送至癌细胞。
在其他实施方式中，本公开的基因工程化细菌包含编码免疫检查点或其他免疫抑制分子的一种或多种抑制剂的一种或多种基因，选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，PD-L2，TIGIT。，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R，CD39，CD73，B7-H3，B7-H4，IDO，TDO，KIR和A2aR。基因工程化细菌可以局部递送，例如通过肿瘤内注射，或者可以是肿瘤靶向细菌，其全身递送并且归巢于靶向肿瘤。
在一些实施方式中，本公开提供了表达CTLA-4抑制剂的基因工程化微生物，例如工程化细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达CTLA-4抑制剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)活化。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗-CTLA-4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗-CTLA-4抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗-CTLA-4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗-CTLA-4抗体，例如单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达CD-80抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗CD80抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗CD80抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗CD80抗体，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CD80抗体，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达CD-86抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗CD86抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗CD86抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗CD86抗体，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CD86抗体，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。
在任何这些实施方式中，抗免疫检查点抗体可以是单链抗体。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件，缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在此描述的启动子的控制下，表达针对一个或多个免疫检查点的一种或多种单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达针对一个或多个免疫检查点的一种或多种单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化微生物是表达PD-1抑制剂的肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在启动子的控制下表达PD-1抑制剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)活化。在一些实施方式中，基因工程化微生物是肿瘤靶向细菌，其在启动子的控制下表达PD-1抑制剂，所述启动子由低氧条件(例如肿瘤的缺氧环境)活化。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗PD-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-1抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗PD-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗PD-1抗体，例如单链抗体。
在一些实施方式中，编码scFv构建体(例如PD1-scFv)的核酸包含序列，所述序列与选自SEQ ID NO:975，SEQ ID NO:976，SEQ ID NO:977，SEQ ID NO:978，SEQ ID NO:979和/或SEQ ID NO:980的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约90％，或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，编码scFv构建体(例如PD1-scFv)的核酸包含选自SEQ ID NO:975，SEQ ID NO:976，SEQ ID NO:977，SEQ ID NO:978，SEQ ID NO:979，和/或SEQ ID NO:980的序列。在一些实施方式中，编码scFv构建体的核酸，例如PD1-scFv，由选自SEQ ID NO:975，SEQ ID NO:976，SEQ ID NO:977，SEQ ID NO:978，SEQ ID NO：979，和/或SEQ ID NO:980的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达PD-L1抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达抗PD-L1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L1抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗PD-L1抗体，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达PD-L2抑制剂的肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗PD-L2抗体的肿瘤靶向细菌，例如在由低氧条件活化的启动子控制下的单链抗体。
在任何这些实施方式中，抗免疫检查点抗体可以是单链抗体。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件，缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文中描述的启动子的控制下，表达针对一个或多个免疫检查点的一种或多种单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达针对一个或多个免疫检查点的一种或多种单链抗体。
因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制LAG3的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对LAG-3的抗体，例如针对LAG-3的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗LAG-3抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗LAG-3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件，或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和在本文描述的任何启动子的控制下，表达抗LAG-3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗LAG-3抗体，例如单链抗体。
TIGIT由调节和记忆CD4+T细胞，CD8+T细胞和自然杀伤细胞的子集表达。TIGIT调节自然杀伤细胞杀伤和CD4+T细胞活化，并通过增加白细胞介素10(IL-10)同时抑制树突细胞产生IL-12来促进耐受。因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制TIGIT的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对TIGIT的抗体，例如针对TIGIT的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗TIGIT抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗TIGIT抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗TIGIT抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活和在本文描述的启动子的控制下，表达抗TIGIT抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗TIGIT抗体，例如单链抗体。
含有V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化抑制因子(VISTA)是一种免疫检查点，它是T细胞功能的有效负调节因子，主要在造血细胞上表达。在多种鼠癌模型中渗透肿瘤的骨髓细胞上发现VISTA的水平很高。VISTA抑制T细胞活化，诱导Foxp3表达，并在肿瘤微环境中高度表达。它的阻断可以通过改善T细胞反应增强小鼠的抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤生长减慢。因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制VISTA的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对VISTA的抗体，例如针对VISTA的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗VISTA抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗VISTA抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗VISTA抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗VISTA抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗VISTA抗体，例如单链抗体。
B7-H3或CD276是属于B7/CD28超家族的免疫检查点分子。B7-H3下调人T细胞应答，例如，降低初始以及预活化T细胞中的T细胞增殖和细胞因子产生。已经在几种人类癌症中报道了B7-H3表达，表明B7-H3作为抗肿瘤免疫调节剂的作用。例如，另外，肿瘤B7-H3表达与许多不同肿瘤类型的患者存活率相关，包括透明细胞肾细胞癌，尿路上皮细胞癌，卵巢癌，胶质母细胞瘤，骨肉瘤，胰腺癌和神经母细胞瘤，以及其他实体瘤。B7-H3在肿瘤血管系统上的发现进一步扩展了其作为癌症免疫治疗靶标的效用。因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制B7-H3的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对B7-H3的抗体，例如针对B7-H3的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗B7-H3抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗B7-H3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗B7-H3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗B7-H3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗B7-H3抗体，例如单链抗体。
甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，又称含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM-3)是一种Th1特异性细胞表面蛋白，可介导T细胞衰竭与其他抑制性受体包括程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG-3)。TIM3，其是一种免疫检查点，调节巨噬细胞激活，并可能在癌症中在CD8+T细胞和调节性T细胞的功能障碍方面与PD-1通路相互作用。因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制TIM-3的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对Tim-3的抗体，例如针对Tim-3的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗TIM-3抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗TIM-3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗TIM-3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗TIM-3抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗TIM-3抗体，例如单链抗体。
癌胚抗原相关细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)(CEACAM1)也称为CD66a(群集区别66a)是免疫检查点，它是属于免疫球蛋白超家族的人糖蛋白。它起到在白细胞，上皮细胞和内皮细胞上检测到的细胞-细胞粘附分子的作用。CEACAM1在血管生成，细胞凋亡，肿瘤抑制，转移以及先天性和适应性免疫应答的调节中起作用。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CEACAM1的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CEACAM1的抗体，例如针对CEACAM1的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗CEACAM1抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗CEACAM1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CEACAM1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗CEACAM1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗CEACAM1抗体，例如单链抗体。
白细胞相关免疫球蛋白样受体1(也称为CD305(分化群305))是在外周单核细胞(包括NK细胞，T细胞和B细胞)上发现的抑制性受体，其调节免疫应答以防止被识别为自身的细胞裂解。其中，LAIR-1可以抑制效应T细胞对CD3结合或抗原刺激的细胞毒活性，下调Ig和细胞因子的产生，并抑制细胞因子介导的信号。LAIR-1还抑制外周血前体在体外向树突细胞的分化和GM-CSF依赖性增殖。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制LAIR-1的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对LAIR-1的抗体，例如针对LAIR-1的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗LAIR-1抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗LAIR-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗LAIR-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗LAIR-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子的控制下，例如本文所述的任何启动子，表达抗LAIR-1抗体，例如单链抗体。
B-和T-淋巴细胞衰减剂BTLA(也称为CD272)在激活期间诱导T细胞。BTLA通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)的相互作用显示T细胞抑制。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族的配体，成员14(TNFRSF14)，也称为疱疹病毒进入介质(HVEM)。CD160也是HVEM的配体，其结合提供了一种共抑制信号。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抗癌分子，其抑制BTLA或CD160与HVEM的结合。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制BLTA的抗癌分子和/或抑制CD160的抗癌分子和/或抑制HVEM的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对BTLA的抗体和/或针对CD160的抗体，和/或HVEM拮抗剂(拮抗剂配体或抗体)，例如针对BTLA的单链抗体和/或针对CD160的单链抗体和/或单个抗体针对HVEM的链拮抗抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗BTLA抗体和/或抗CD160抗体和/或HVEM拮抗剂，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗BTLA抗体和/或抗CD160抗体和/或HVEM拮抗剂，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在启动子的控制下表达抗BTLA抗体，和/或抗CD160抗体，和/或HVEM拮抗剂，例如单链抗体。这是由低氧条件激活的。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗BTLA抗体和/或抗CD160抗体和/或HVEM拮抗剂，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子，或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下，表达抗BTLA抗体和/或抗CD160抗体和/或HVEM拮抗剂，例如单链抗体。
OX-2膜糖蛋白，也称为CD200(分化群)200)是1型膜糖蛋白，其在与CD200R1结合后调节骨髓细胞活性并在不同组织中递送巨噬细胞谱系的抑制信号。CD200受体结合诱导脾DCs(pDC)的浆细胞样子集以表达IDO，其启动能够抑制抗原特异性应答的色氨酸分解代谢的致耐受途径。体内。在腹膜巨噬细胞中，IFNγCD200R1参与抑制IL-17刺激的细胞因子分泌。CD200R1与单核细胞的结合也抑制了人PBMC中IL-5和IL-13的分泌。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CD200与CD200R1结合的抗癌分子。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CD200的抗癌分子和/或抑制CD200R1的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CD200的抗体和/或针对CD200R1的抗体，例如针对CD200的单链抗体和/或针对CD200R1的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CD200抗体和/或抗CD200R1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗CD200抗体和/或抗CD200R1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CD200和/或抗CD200R1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗CD200抗体和/或抗CD200R1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗CD200抗体和/或抗CD200R1抗体，例如单链抗体。
KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)是在自然杀伤(NK)细胞上发现的受体，其作为免疫检查点起作用。KIR与肿瘤配体(例如，HLAC)的相互作用下调NK细胞毒活性，并且还介导同种异体干细胞移植中的耐受性并降低移植物抗宿主病。已发现KIR在肺癌细胞中具有免疫抑制作用。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制KIR的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对KIR的抗体，例如针对KIR的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗KIR抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗KIR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗KIR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗KIR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗KIR抗体，例如单链抗体。
腺苷，通过A2A腺苷受体(A2aR)起作用，正在成为免疫功能的重要抑制剂。研究证明了A2a受体阻断增强肿瘤疫苗，检查点阻断和过继性T细胞治疗的能力。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制A2aR的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对A2aR的抗体，例如针对A2aR的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗A2aR抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗A2aR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗A2aR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗A2aR抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗A2aR抗体，例如单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:755，SEQ ID NO:756，SEQID NO:757，SEQ ID NO:758，SEQ ID NO:759和/或SEQ ID NO:760的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。
本文描述了用于构建单链抗-CTLA-4抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:761，SEQ ID NO:762，SEQ ID NO:763，SEQ ID NO:764)。
用于构建单链抗PD-1抗体的示例性重链和轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:1，SEQID NO:2，SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
在一些实施方式中，所述序列与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。用于构建单链抗体的其他示例性重链和轻链氨基酸序列包括SEQ ID NO:5-46。
在一些实施方式中，单链抗体与SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ IDNO:13NO：14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ IDNO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQ IDNO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:NO：39，SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQID NO:43，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，或SEQ ID NO:46的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，其与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。
免疫代谢和代谢转化
色氨酸和犬尿氨酸
T调节细胞或Treg是T细胞的亚群，其通过防止过度免疫反应，维持对自身抗原的耐受性和消除自身免疫来调节免疫系统。Tregs抑制其他细胞的免疫反应，例如，在成功消除入侵生物后关闭免疫反应。这些细胞通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。
存在不同的调节性T细胞亚群，包括表达CD4，CD25和Foxp3的那些亚群(CD4+CD25+调节性T细胞)。
虽然调节性T细胞在介导免疫稳态和促进外周耐受的建立和维持中是至关重要的，但它们被认为有助于许多肿瘤的进展。Tregs是抑制效应T细胞反应的关键，因此代表了有效抗肿瘤反应的主要障碍之一，以及依赖于抗肿瘤反应的诱导或增强的现有疗法的失败。
因此，在某些实施方式中，本公开的基因工程化细菌产生一种或多种消除Tregs和/或抑制或阻断Tregs活化的抗癌分子。
色氨酸(TRP)与犬尿氨酸(KYN)代谢途径被确立为先天性和适应性免疫的关键调节因子。一些临床前模型表明，这种免疫耐受途径在癌症免疫，自身免疫，感染，移植排斥和过敏方面具有活性。靶向该途径的药物，例如吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)，正在进行临床试验，目的是逆转癌症诱导的免疫抑制。
必需氨基酸色氨酸的分解代谢是维持许多类型癌症中免疫抑制微环境的中心途径。肿瘤微环境中的肿瘤细胞或骨髓细胞表达高水平的吲哚胺-2，3-双加氧酶1(IDO1)，这是色氨酸降解中的第一种和限速酶。该酶活性导致局部微环境中色氨酸的消耗和随后的T细胞应答的抑制，这导致免疫抑制(因为T细胞对低色氨酸水平特别敏感)。最近的临床前研究表明，通过酶TRP-2，3-双加氧酶2(TDO)在肿瘤中的色氨酸降解的替代途径。因此，肿瘤细胞可以代替IDO1或除了IDO1之外还通过TDO表达和分解代谢色氨酸。
此外，一些研究已经提出通过色氨酸降解的免疫抑制不仅仅是降低局部色氨酸水平的结果，而且还是积累高水平的色氨酸代谢物的结果。人体肿瘤组织的临床前研究和分析已经证明T细胞反应被色氨酸代谢物抑制，主要是通过与细胞质转录因子芳烃受体(AHR)结合。这些研究表明，色氨酸代谢产物犬尿氨酸与芳香烃受体的结合导致重新编程幼稚CD4+T辅助细胞(Th)的分化，有利于调节性T细胞表型(Treg)，同时抑制白细胞介素-17的分化(IL-17)-产生Th(Th17)细胞。芳基氢受体的活化还导致促进树突细胞上的致耐受性表型。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物，例如基因工程化细菌，能够通过产生色氨酸来消耗Treg或抑制或阻断Treg的活化。在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物能够通过产生色氨酸来增加CD8+:Treg比(例如，有利于产生CD8+而非Tregs)。
增加色氨酸
在一些实施方式中，本公开的基因工程化微生物能够产生色氨酸。用于生产色氨酸的示例性回路示于图6A-6D，图7，和图8。
在一些实施方式中，产生色氨酸的基因工程化细菌和/或其他微生物包含编码色氨酸生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含色氨酸操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含大肠杆菌的色氨酸操纵子。(Yanofsky，RNA(2007)，13：1141-1154)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含枯草芽孢杆菌的色氨酸操纵子。(Yanofsky，RNA(2007)，13：1141-1154)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自枯草芽孢杆菌的trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物任选地包含基因序列以产生色氨酸前体：分支酸。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种色氨酸生物合成途径的酶的一种或多种基因序列和编码分支酸生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列和编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC基因的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自枯草芽孢杆菌的trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列和编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC基因的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码野生型或反馈抗性SerA基因的序列。大肠杆菌serA编码的3-磷酸甘油酸(3PG)脱氢酶催化L-丝氨酸(Ser)生物合成的主要磷酸化途径的第一步。该步骤是将3PG氧化成3-磷酸羟基丙酮酸(3PHP)，同时将NAD+还原为NADH。作为色氨酸生物合成的一部分，大肠杆菌对每种产生的色氨酸使用一个丝氨酸。不希望受到理论的约束，通过表达serA，色氨酸产生得到改善(参见，例如，图6A-图6D)
在任何这些实施方式中，AroG和TrpE任选地被反馈抗性版本替代以改善色氨酸的产生。
在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。
在任何这些实施方式中，tnaA基因(编码将Trp转化为吲哚的色氨酸酶)任选地可以缺失以防止沿该途径的色氨酸分解代谢并进一步增加产生的色氨酸水平。
在任何这些实施方式中，pheA基因可任选地缺失。
大肠杆菌的内膜蛋白YddG，由yddG基因编码，是已知的氨基酸输出体RhtA和YdeD的同源物。研究表明YddG能够输出芳族氨基酸，包括色氨酸。因此，YddG可以起到色氨酸输出体或色氨酸分泌系统(或色氨酸分泌蛋白)的作用。Doroshenko等描述了其他芳族氨基酸输出体，FEMS Microbial Lett.，275：312-318(2007)。因此，在一些实施方式中，工程化细菌任选地还包含编码YddG的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌可过表达YddG。在一些实施方式中，工程化细菌任选地包含一个或多个yddG基因拷贝。
在一个具体实施方式中，通过表达trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因从分支酸前体产生色氨酸。AroG和TrpE被反馈抗性版本取代，以改善色氨酸的产生。菌株任选地还包含野生型或反馈抗性SerA基因。在一个实施方式中，菌株包含反馈抗性SerA基因。在该具体实施方式中，删除trpR和TnaA。
由本发明的基因工程化细菌和/或其他微生物编码的示例性色氨酸合成盒包括SEQ ID NO:47-54。
示例性的色氨酸生物合成酶序列包括SEQ ID NO:55-59
在一些实施方式中，色氨酸生物合成酶或盒与SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，SEQID NO:49，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:52，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:54，SEQID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58和/或SEQ ID NO:59的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:59中的一个或多个具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽包含SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:59中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽由SEQ ID NO:47至SEQID NO:59中的一个或多个的序列组成。
示例性多肽序列反馈抗性AroG和TrpE分别示于SEQ ID NO:60和61。表15。野生型和反馈抗性AroG和TrpE，SerA和色氨酸酶序列包括SEQ ID NO:60-64。
在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽与SEQ IDNO:60至SEQ ID NO:63中的一种或多种具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:63中的一种或多种具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:63中的一种或多种具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQID NO:60至SEQ ID NO:63中的一种或多种具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:60至SEQ IDNO:63中的一种或多种具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多肽与SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:63中的一个或多个具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽包含SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:63中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽由SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:63中的一个或多个的序列组成。
在一些实施方式中，包含SEQ ID NO:64的内源性TnaA多肽被突变或缺失。
在一些实施方式中，修饰和/或突变用于产生色氨酸的一种或多种基因，例如，以增强稳定性，增加色氨酸产生。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的并且在本文中提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的任何分泌回路，以及本领域，(6)一个或多个表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解本文所述的一种或多种代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)一种或多种这些另外的回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗体，抗-PD1和/或抗-PDL1抗体。
减少犬尿氨酸
如上所述，研究表明犬尿氨酸与芳烃受体的结合导致调节性T细胞(Tregs)的产生。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物包含用于代谢或降解犬尿氨酸并降低细胞外环境中的犬尿氨酸水平的机制。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物包含编码犬尿氨酸酶的基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化微生物编码用于表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因序列，其将犬尿氨酸转化为AA(蒽环酸)，然后其可通过大肠杆菌trp操纵子的酶转化为色氨酸。任选地，可以缺失trpE基因，因为从犬尿氨酸生成色氨酸不需要它。因此，在一个实施方式中，基因工程化细菌可包含编码trpD，trpC，trpA和trpD和犬尿氨酸酶的一种或多种基因或基因盒。该缺失可以阻止通过内源性分支酸途径产生色氨酸，并且可以通过犬尿氨酸酶增加从犬尿氨酸产生色氨酸。
在替代性实施方式中，trpE基因不被缺失，以通过使用犬尿氨酸和分支酸作为底物来最大化色氨酸的产生。在本发明的一个实施方式中，包含该回路的基因工程化细菌和/或其他微生物可用于减少癌症中的免疫逃逸。
在一些实施方式中，微生物编码用于从细胞外环境(例如肿瘤环境)摄取犬尿氨酸的转运蛋白。位于鼠伤寒沙门氏菌chr和trp操纵子之间的AroT，以及大肠杆菌trp基因座附近的类似基因aroR和aroS被发现参与芳香族氨基酸的转运。AroP是一种通透酶，参与跨越芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸)的细胞质膜的转运。这些转运蛋白/通透酶的表达可用于基因工程化微生物中的犬尿氨酸输入。
本公开的基因工程化细菌编码的编码犬尿氨酸酶的示例性基因在某些实施方式中包括SEQ ID NO:65-67
在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一种或多种具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多肽和/或多核苷酸与SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一个或多个具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽包含SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸和/或多肽由SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中的一个或多个的序列组成。
示例性密码子优化的犬尿氨酸酶盒序列包括SEQ ID NO:68，865，69，866，70，867。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ IDNO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一种或多种具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:865至SEQ IDNO:868中的一个或多个具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸包含SEQ ID NO:68至SEQ IDNO:70和SEQ ID NO:865至SEQ ID NO:868中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌编码和表达的一种或多种多核苷酸由SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70和SEQID NO:865至SEQ ID NO:868中的一个或多个的序列组成。
在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体与选自SEQ IDNO:116，SEQ ID NO:888，SEQ ID NO:889，SEQ ID NO:890，SEQ ID NO:891，SEQ ID NO:892和/或SEQ ID NO:893的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体包含选自SEQID NO:116，SEQ ID NO:888，SEQ ID NO:889，SEQ ID NO:890，SEQ ID NO:891，SEQ ID NO:892，和/或SEQ ID NO:893的序列。在一些实施方式中，用于表达荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的构建体由选自SEQ ID NO:116，SEQ ID NO:888，SEQ ID NO:889，SEQ ID NO:890，SEQ IDNO:891，SEQ ID NO:892，和/或SEQ ID NO:893的序列组成。其他合适的犬尿氨酸酶描述于美国专利公布20170056449中，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，使用本文所述的分泌系统将犬尿氨酸酶分泌到细胞外环境，例如肿瘤微环境中。
基因工程化细菌和/或其他微生物可包含用于产生犬尿氨酸酶的任何合适的基因。在一些实施方式中，用于产生犬尿氨酸酶的基因被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，增加犬尿氨酸酶产生。在一些实施方式中，工程化细菌和/或其他微生物也具有增强的犬尿氨酸摄取或输入，例如，包含转运蛋白或其他机制，用于增加犬尿氨酸对细菌和/或其他微生物细胞的摄取。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生犬尿氨酸酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症，或某些组织，免疫抑制，或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在肠道或肿瘤中可能存在或不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的存在下，产生犬尿氨酸酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠道或肿瘤中可以存在的代谢物的存在家，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物的存在下，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造期间表达，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌和/或其他微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的并且在本文中提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述或本领域已知的任何分泌回路，(6)一个或多个表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解本文所述的一种或多种代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)一种或多种这些额外回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与一个或多个免疫检查点组合施用。本文所述的抑制剂，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
增加色氨酸和减少犬尿氨酸
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物包含用于代谢或降解犬尿氨酸的机制，在一些实施方式中，其还导致色氨酸的产生增加。在一些实施方式中，基因工程化细菌调节细胞外环境中的TRP:KYN比率或KYN:TRP比率。在一些实施方式中，基因工程化细菌增加TRP:KYN比率或KYN:TRP比率。在一些实施方式中，基因工程化细菌降低TRP:KYN比率或KYN:TRP比率。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码酶犬尿氨酸酶的序列。产生犬尿氨酸酶以在细胞中将犬尿氨酸代谢为邻氨基苯甲酸。Schwarcz等。，NatureReviews Neuroscience，13，465-477；2012；Chen&Guillemin，2009；2；1-19；Intl.J.Tryptophan Res。在一些实施方式中，工程化微生物具有将犬尿氨酸从局部环境输入(运输)到细胞中的机制。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含aroP，tnaB或mtr基因的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶分泌物的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码色氨酸生物合成途径的酶的基因序列和编码犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含色氨酸操纵子，例如大肠杆菌的色氨酸操纵子。或枯草芽孢杆菌，以及编码犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列，例如，来自大肠杆菌和编码犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列，例如来自枯草芽孢杆菌和编码犬尿氨酸酶的序列。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。此外，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含基因序列以产生色氨酸前体，分离酸，例如，编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列，编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC基因的序列，以及编码犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自枯草芽孢杆菌的trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列，编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC基因的序列，以及编码犬尿氨酸酶的序列。
任选地，可以缺失trpE基因，因为从犬尿氨酸生成色氨酸不需要它。因此，在一个实施方式中，基因工程化细菌可包含编码trpD，trpC，trpA和trpD和犬尿氨酸酶的一种或多种基因或基因盒(参见例如图8。该缺失可以阻止通过内源性分支酸途径产生色氨酸，并且可以通过犬尿氨酸酶增加从犬尿氨酸产生色氨酸。
在替代性实施方式中，trpE基因不被缺失，以通过使用犬尿氨酸和分支酸作为底物来最大化色氨酸的产生。在本发明的一个实施方式中，包含该回路的基因工程化细菌可用于减少癌症中的免疫逃逸。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码野生型或反馈抗性SerA基因的序列。在任何这些实施方式中，AroG和TrpE任选地被反馈抗性版本替代以改善色氨酸的产生。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。在任何这些实施方式中，tnaA基因(编码将Trp转化为吲哚的色氨酸酶)任选地可以缺失以防止沿该途径的色氨酸分解代谢并进一步增加产生的色氨酸水平。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以进一步包含用于从细胞输出或分泌色氨酸的基因序列。因此，在一些实施方式中，工程化细菌还包含编码YddG的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌可过表达YddG，其是一种芳族氨基酸输出体。在一些实施方式中，工程化细菌任选地包含一个或多个yddG基因拷贝。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以进一步包含用于将犬尿氨酸输入或运输到细胞中的基因序列。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶分泌物的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含aroP，tnaB或mtr基因的一个或多个拷贝。
在一些实施方式中，使用本文所述的分泌系统将犬尿氨酸酶分泌到细胞外环境(例如肿瘤微环境)中，例如，并且可用于在细胞外降解犬尿氨酸。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗犬尿氨酸并任选地产生色氨酸的细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比，消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗犬尿氨酸和任选产生色氨酸的细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗率在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率在相同条件下与相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌增加约80％至100％。在一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，使用本文所述的分泌系统将一种或多种色氨酸产生酶分泌到细胞外环境，例如肿瘤微环境中。
基因工程化细菌可包含用于产生犬尿氨酸酶和色氨酸生产的任何合适的基因。在一些实施方式中，用于产生犬尿氨酸酶和/或色氨酸产生酶的基因被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，增加犬尿氨酸消耗和/或色氨酸产生。在一些实施方式中，工程化细菌还具有增强的色氨酸或犬尿氨酸的摄取或输入，例如，包含转运蛋白或用于增加色氨酸或犬尿氨酸摄入细菌细胞的其他机制，如上文详细讨论的。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制或癌组织相关的病症下产生犬尿氨酸酶和色氨酸产生酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在低氧条件下产生犬尿氨酸酶和色氨酸生产酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够在某些分子或代谢物的存在下，在与癌症，某些组织，免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，或在肠道中可能存在或不存在的其他一些代谢物，例如阿拉伯糖的存在下，产生犬尿氨酸酶和色氨酸产生酶。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述的代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)这些另外的回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
ALE
在肿瘤微环境中，氨基酸色氨酸(TRP)及其降解产物犬尿氨酸(KYN)作为免疫调节信号发挥关键作用。肿瘤经常将TRP(其具有促炎性质)降解为具有抗炎特征的KYN，从而促进免疫监视的逃避。
可以设计大肠杆菌Nissle以有效地导入KYN并将其转化为TRP。虽然Nissle的通常不利用KYN，但通过在在四环素启动子(Ptet)控制下的中拷贝质粒上引入来自荧光假单胞菌(kynU)的犬尿氨酸酶(KYNase)，具有该质粒(Ptet-KYNase)的新菌株能够将L-犬尿氨酸转化为邻氨基苯甲酸。
大肠杆菌在其TRP生物合成途径中天然使用邻氨基苯甲酸。简而言之，TrpE(与TrpD复合)酶将分支酸转化为邻氨基苯甲酸。然后TrpD，TrpC，TrpA和TrpB催化五步反应，以吲哚与丝氨酸缩合形成色氨酸而结束。通过λ-RED重组工程取代TrpE酶，随后的Nissle菌株(ΔtrpE::Cm)是一种营养缺陷型，不能在不添加TRP或邻氨基苯甲酸盐的情况下在基本培养基中生长。通过在ΔtrpE::Cm(KYNase-trpE)中表达犬尿氨酸酶，可以通过提供KYN来替代地拯救这种营养缺陷型。
利用KYNase-trpE中KYN的生长限制性质，采用适应性实验室进化来进化能够越来越有效利用KYN的菌株。首先建立KYN浓度的下限，并通过降低KYN浓度的传代进化突变体。虽然这可以选择能够增加KYN输入的突变体，但细菌细胞仍然倾向于利用游离的外源性TRP。在肿瘤环境中，可以通过耗尽KYN和增加局部TRP浓度来提供双重治疗功能。因此，为了进化出相对于TRP优选KYN的菌株，可以将TRP-5-氟-L-色氨酸(ToxTRP)的毒性类似物纳入ALE实验中。然后对得到的最佳表现菌株进行全基因组测序，以便对贡献的突变进行去卷积。可以进行Lambda-RED以重新引入TrpE，以使Trp调节失活(trpR，tyrR，转录衰减子)以上调TrpABCDE表达并增加分支酸产生。由此产生的菌株现在对外部TRP不敏感，有效地将KYN转化为TRP，并且现在也过量产生TRP。
嘌呤能系统-ATP/腺苷代谢
成功的癌症免疫疗法的一个重要障碍是肿瘤采用许多机制来促进免疫逃逸，包括产生抗炎细胞因子，调节免疫亚群的募集和免疫抑制代谢物的产生。一种这样的免疫抑制途径是通过CD73产生细胞外腺苷，一种有效的免疫抑制分子。嘌呤能系统调节和细化免疫细胞功能，例如细胞间相互作用，细胞因子和趋化因子分泌，表面抗原脱落，细胞内病原体去除和产生活性氧物质。由受损或垂死的细胞和细菌释放的细胞外ATP促进免疫吞噬细胞的募集并激活P2X7R，这是NLRP3炎性体的共激活因子，然后引发促炎性细胞因子如IL-1β和IL-18的产生。细胞外ATP分解为ADP，AMP和腺苷的分解代谢受糖基磷脂酰肌醇(GPI-)锚定的外核苷酸酶和膜结合激酶的控制。CD39(外核苷三磷酸二磷酸水解酶1，E-NTPDase1)将ATP水解成AMP，然后通过CD73(ecto-5'-核苷酸酶，Ecto5'NTase)将其去磷酸化为腺苷。因此，CD39和CD73协同作用以将促炎性ATP转化为免疫抑制性腺苷。值得注意的是，CD39的活性可被NDP激酶和腺苷酸激酶的作用逆转，而CD73的活性实际上是不可逆的。因此，CD73代表了ATP驱动的促炎环境转化为腺苷诱导的抗炎环境的关键检查点。换句话说，CD73负调节细胞外三磷酸腺苷(ATP)的促炎作用。
在肿瘤环境中，CD39和CD73产生增加的肿瘤微环境特征的腺苷水平。已经在几种血液或实体瘤中观察到CD39和CD73的高表达和活性。此外，表达CD39和CD73的癌症外泌体还可以提高肿瘤微环境中的腺苷水平。CD39/CD73复合物参与肿瘤免疫反应过程，通过抑制肿瘤特异性T细胞(特别是T辅助细胞和细胞毒性T细胞)的激活，克隆扩增和归巢，破坏细胞溶解效应T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤，和诱导Treg和Th17细胞的抑制能力，并增强1型巨噬细胞向促进肿瘤的2型巨噬细胞的转化(Antonioli等，TrendsMolMed。2013年6月；19(6)：355-367综述。CD39和CD73在免疫和炎症方面)。髓样抑制细胞(MDSCs)似乎也通过CD39介导的机制促进肿瘤生长。
除其免疫调节作用外，外核苷酸酶途径直接有助于调节癌细胞生长，分化，侵袭，迁移，转移和肿瘤血管生成。靶向这些酶的试剂在几种恶性肿瘤鼠模型中显示出抗肿瘤功效和有利的耐受性特征(Anonioli等，2013)。在一些实施方式中，本公开的工程化微生物，例如工程化细菌，产生一种或多种抑制CD39活性和/或抑制CD73活性的抗癌分子。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CD39的抗癌分子和/或抑制CD73的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CD39的抗体和/或针对CD73的抗体，例如针对CD39的单链抗体和/或针对CD73的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CD39抗体和/或抗CD73抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗CD39抗体和/或抗CD73抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CD39和/或抗CD73抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如任何由所述条件激活和本文描述的启动子的控制下，表达抗CD39抗体和/或抗CD73抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗CD39抗体和/或抗CD73抗体，例如单链抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于从肿瘤微环境中除去过量腺苷的手段。许多细菌从环境中清除低浓度的核苷，以通过补救的合成途径合成核苷酸和脱氧核苷酸。另外，在大肠杆菌中，核苷可以用作用于生长的氮和碳的唯一来源(Neuhard J,NygaardP.Biosynthesis and conversion of nucleotides,purines and pyrimidines.In:Neidhardt FC,Ingraham JL,Low KB,Magasanik B,Schaechter M,Umbarger HE,editors.Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and molecularbiology.Washington DC:ASM Press；1987.pp.445–473)。两个进化上不相关的阳离子连接转运蛋白家族，浓缩核苷转运蛋白(CNT)家族和核苷:H+转运蛋白(NHS)家族，负责核苷摄取(参见例如Cabrita et al.,Biochem.Cell Biol.Vol.80,2002.Molecular biology andregulation of nucleoside and nucleobase transporter proteins in eukaryotesand prokaryotes，其内容通过引用整体并入本文)。NupC和NupG是大肠杆菌中的转运蛋白家族成员。nupC和nupG基因缺陷的突变体不能以核苷作为单一碳源生长。这两种转运蛋白都是质子连接的，但它们的选择性不同。NupC是H+/核苷酸同向转运蛋白家族的核苷酸转运蛋白。NupC嘧啶核苷-H+转运蛋白介导核苷，特别是嘧啶的同向(即H+-偶联底物摄取)。在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中发现了该家族的两个已知成员。NupG能够运输多种核苷和脱氧核苷；相反，NupC不运输鸟苷或脱氧鸟苷。来自大肠杆菌的NupG的同系物存在于广泛的真细菌中，包括人肠道病原体如鼠伤寒沙门氏菌，与牙周病相关的生物如牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌，以及欧文氏菌属中的植物病原体(如Vaziri et al.,Mol MembrBiol.2013Mar；30(1-2):114–128所述)。
使用分子建模来探测核苷转运蛋白NupG的机制，其内容通过引用整体并入本文。来自CNT超家族的推定细菌转运蛋白和来自NupG/XapB家族的转运蛋白包括下表4和表5中列出的那些。另外，基于与称为尿嘧啶/尿囊素转运蛋白家族的酵母转运蛋白家族(Cabrita等，同上)的同源性鉴定codB(GenBankP25525，大肠杆菌)。
表4。推定的CNT家族转运蛋白
Figure BDA0002194618080000871
表5。来自NupG/XapB家族的细菌转运蛋白
蛋白质(基因名称) GenBank登记号 生物
1.yegT P76417 大肠杆菌
2.NupG P09452 大肠杆菌
3.XapB P45562 大肠杆菌
4.(CC1628) AAK23606 Caulobacter crescentus
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于将腺苷从肿瘤微环境导入工程化细菌或工程化病毒的工具。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码核苷转运蛋白的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷转运蛋白的序列。在某些实施方式中，基因工程化细菌包含编码大肠杆菌核苷酸渗透酶nupG或nupC的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于在低氧条件激活的启动子控制下编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白(例如nupG或nupC转运蛋白序列)的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白的序列，例如nupG或nupC转运蛋白序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，如本文描述的任何启动子的控制下编码核苷转运蛋白或腺苷转运蛋白的序列，例如nupG或nupC转运蛋白序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于代谢或降解腺苷的手段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种能够将腺苷转化为尿酸的酶的基因序列(参见图1，图2和图3)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC基因的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC基因的序列，并且包含编码核苷或腺苷转运蛋白的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码来自大肠杆菌的add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC基因的序列，并且包含编码nupG或nupC的序列。示例性工程化细菌显示在图2中。
可用于腺苷降解回路的示例性序列包括SEQ ID NO:71-77。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列具有至少约80％的同一性，或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列具有至少约90％的同一性，或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列具有至少约95％的同一性，或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％同源。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其包含选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQID NO:77的一个或多个多核苷酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，其由选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的一个或多个多核苷酸序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸序列，但是为了遗传密码的冗余，编码与选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列相同的蛋白质。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约80％同源的多肽，或其功能片段。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约90％同源的多肽，或其功能片段。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约95％同源的多肽，或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶或腺苷转运蛋白的核酸，但为了遗传密码的冗余，其编码与由选自SEQ ID NO:71，SEQ IDNO:72，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77的序列编码的多肽至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。
在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含整合到HA1/2(agaI/rsmI)区域的染色体中的PfnrS-nupC，整合到HA9/10(exo/cea)区域的染色体中的PfnrS-xdhABC，和整合到malE/K区域的染色体中的PfnrS-add-xapA-deoD。
在一些实施方式中，构建体包含PfnrS(SEQ ID NO:856)，PfnrS-nupC(SEQ ID NO:857)，PfnrS-xdhABC(SEQ ID NO:858)，xdhABC(SEQ ID NO:859)，PfnrS-add-xapA-deoD(SEQ ID NO:860)和add-xapA-deoD(SEQ ID NO:861)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码消耗腺苷的构建体的核酸序列，其与选自SEQ ID NO:856，SEQ ID NO:857，SEQ ID NO:858，SEQ ID NO:859，SEQ ID NO:860和/或SEQ ID NO:861的多核苷酸序列或其变体或功能片段至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％同源。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码消耗腺苷的构建体的核酸序列，所述构建体包含选自SEQ ID NO:856，SEQ ID NO:857，SEQ IDNO:858，SEQ ID NO:859，SEQ ID NO:860，和/或SEQ ID NO:861的一个或多个多核苷酸序列。在一些实施方式中，基因工程化的细菌包含编码腺苷消耗构建体由选自SEQ ID NO:856，SEQ ID NO:857，SEQ ID NO:858，SEQ ID NO:859，SEQ ID NO:860，和/或SEQ ID NO:861的一个或多个多核苷酸序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码NupC的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其包含编码SEQ ID NO:78的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码NupC多肽，其由SEQ ID NO:78组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhA的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其包含编码SEQ ID NO:79的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhA多肽，其由编码SEQ ID NO:79的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhB的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其包含编码SEQ ID NO:80的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhB多肽，其由编码SEQ ID NO:80的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XdhC的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其包含编码SEQ ID NO:81的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码XdhC多肽，其由编码SEQ ID NO:81的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码Add的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其包含编码SEQ ID NO:82的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码Add多肽，其由编码SEQ ID NO:82的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码XapA的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其包含编码SEQ ID NO:83的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码XapA多肽，其由编码SEQ ID NO:83的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DeoD的核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其包含编码SEQ ID NO:84的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码DeoD多肽，其由编码SEQ ID NO:84的序列组成。
本文描述的数据表明本文所述的腺苷消耗菌株单独或与抗PD1和/或PD-L1抗体组合的抗肿瘤活性。
在任何这些实施方式中，经基因工程化以消耗腺苷的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的腺苷。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的尿酸盐。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的尿酸盐。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的尿酸盐。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌使腺苷降解速率与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使腺苷降解速率与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌将降解速率与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，当在低氧条件下诱导时，基因工程化细菌具有约1.8-10μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌具有约5-9μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌具有约6-8μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约50％至70％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约55％至65％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约55％至60％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导1小时后使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导1小时后使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约97％至99％。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导2小时后使腺苷降解增加约40-50倍。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导2小时后使腺苷降解增加约44-48倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，基因工程化细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够使细胞增殖与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤大小与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，降解腺苷。在一些实施方式中，编码用于腺苷降解的回路的基因序列由可由这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述腺苷降解回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于增加肿瘤微环境中ATP水平的手段，例如通过增加来自微生物的ATP的产生和分泌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于降低肿瘤微环境中腺苷水平的手段(例如，通过增加腺苷的摄取，通过代谢和/或降解腺苷)，增加肿瘤中ATP的水平。微环境，和/或阻止或阻止肿瘤微环境中ATP向腺苷的转化。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于代谢腺苷的基因，其在由低氧条件，缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活和本文所述的启动子的控制下。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达一种或多种基因，用于在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下代谢腺苷。
精氨酸/精氨酸酶I代谢
L-精氨酸(L-Arg)是一种非必需氨基酸，在包括免疫反应在内的几种生物系统中起着重要作用。L-Arg对免疫应答的重要性最初通过受损的T细胞功能和肝移植或创伤后患者和啮齿动物中发现的血清L-Arg水平减少之间的关联提示，该过程通过补充L-Arg而迅速逆转。在不存在L-Arg的情况下培养的T细胞失去CD3ζ表达并且不能增殖。值得注意的是，已经观察到渗入肿瘤的T细胞具有降低的信号转导蛋白表达，增殖能力降低和细胞因子产生减少。
L-精氨酸被精氨酸酶I，精氨酸酶II和诱导型一氧化氮合酶代谢。精氨酸酶1水解L-精氨酸转化为尿素和L-鸟氨酸，后者是细胞周期进程所需的多胺(腐胺，亚精胺和精胺)生产的主要底物。已经在患有各种恶性肿瘤(包括胃癌，结肠癌，乳腺癌和肺癌)的患者中观察到高精氨酸酶活性，并且还需要恶性细胞产生多胺以维持其快速增殖。
最近的研究揭示了肿瘤浸润性骨髓细胞的独特亚群，而不是肿瘤细胞，其产生高水平的精氨酸酶I和阳离子氨基酸转运蛋白2B，这使得它们能够迅速掺入L-精氨酸(L-Arg)并耗尽细胞外L-抗肿瘤微环境。这些细胞是T细胞受体表达和抗原特异性T细胞应答的有效抑制剂。这些细胞也被证明是调节性T细胞的有效诱导剂。肿瘤微环境中的其他细胞包括恶性细胞，T淋巴细胞，甚至其他骨髓亚群，不产生精氨酸酶I并且不损害T细胞功能。因此，认为这些肿瘤浸润性骨髓细胞代表了一种独特的亚群，具有通过各种机制抑制保护性免疫应答的能力。此外，精氨酸酶抑制剂几乎完全抑制这些肿瘤相关骨髓细胞的抑制功能，这表明精氨酸酶I可能是这些细胞损害T细胞功能的主要机制之一。因此，精氨酸酶I表达的增加不仅可以促进肿瘤生长，还可以作为次要效应，局部减少L-Arg水平允许肿瘤逃脱免疫反应。
此外，MDSC主要通过活性氧中间体的产生和精氨酸代谢酶一氧化氮合酶和精氨酸酶的表达抑制有效的抗肿瘤适应性免疫应答。存在两种哺乳动物精氨酸酶同种型，其均将精氨酸水解成鸟氨酸和尿素。MDSC可通过连续L-精氨酸耗竭的精氨酸酶的组成型表达来抑制T细胞免疫功能。精氨酸酶I介导的肿瘤微环境中的精氨酸消耗导致T淋巴细胞增殖，细胞因子合成和抗肿瘤免疫应答的抑制。在人T淋巴细胞中，精氨酸的缺乏诱导信号转导T细胞受体相关的ζ链的下调，损害肌动蛋白结合蛋白cofilin的去磷酸化，并通过诱导G0-G1停滞抑制细胞周期的进展。此外，MDSC衍生的iNOS将L-精氨酸转化为瓜氨酸和NO，其通过抑制Jak/STAT信号传导抑制T细胞功能，降低MHCII类表达并诱导T细胞凋亡(Munder,Br JPharmacol.2009 Oct；158(3):638–651.Arginase:an emerging key player in themammalian immune system)。因此，鉴于精氨酸酶在肿瘤相关MDSC中的作用以及其在炎症诱导的免疫抑制中的致病作用的所有累积数据，用于临床使用的精氨酸酶抑制剂的开发是最重要的。
因此，在某些实施方式中，本公开的工程化微生物，例如工程化细菌能够消耗或降低在肿瘤微环境中发现的精氨酸酶I的水平。如所讨论的，L-精氨酸被精氨酸酶I代谢，精氨酸酶I水解L-精氨酸转化为尿素和L-鸟氨酸。因此，通过向肿瘤微环境中添加L-精氨酸可以耗尽精氨酸酶I的水平。此外，数项研究已经表明，L-精氨酸作为精氨酸酶I.的有效抑制剂(Rodriguez et al.,Arginase I Production in the Tumor Microenvironment byMature Myeloid Cells Inhibits T-Cell Receptor Expression and Antigen-SpecificT-Cell Responses,2004,Can Res,64:5839)。因此，在某些实施方式中，本公开的工程化微生物能够产生L-精氨酸。USSN14/960，333和PCT/US2015/064140中提供了微生物，用于工程的遗传回路和用于工程化微生物以产生精氨酸的方法，其内容通过引用整体并入本文，包括附图。
在一些实施方式中，产生L-精氨酸的基因工程化细菌包含编码L-精氨酸生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种能够将谷氨酸转化为精氨酸的酶的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含大肠杆菌的精氨酸操纵子，如下文详细描述的。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含另一种细菌的精氨酸操纵子，如下文详述。在任何这些实施方式中，精氨酸阻遏物(ArgR)任选地可以被缺失，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。
在诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌中，精氨酸生物合成途径能够在八步酶促过程中将谷氨酸转化为精氨酸，其涉及酶N-乙酰谷氨酸合成酶，N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酸磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸。氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，氨基甲酰磷酸合酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨酸琥珀酸合成酶和精氨基琥珀酸裂解酶(Cunin等，1986)。前五个步骤涉及N-乙酰化以产生鸟氨酸前体。在第六步中，鸟氨酸转氨甲酰酶(也称为鸟氨酸氨基甲酰转移酶)催化瓜氨酸的形成。最后两个步骤涉及氨基甲酰磷酸利用以从瓜氨酸产生精氨酸。
argA编码N-乙酰谷氨酸合成酶，argB编码N-乙酰谷氨酸激酶，argC编码N-乙酰谷氨酰基磷酸还原酶，argD编码乙酰转移酶，argE编码N-乙酰鸟氨酸酶，argF编码鸟氨酸氨甲酰转移酶，argI还编码鸟氨酸氨甲酰转移酶，argG编码精氨琥珀酸合酶，argH编码精氨琥珀酸裂解酶和argJ编码鸟氨酸乙酰转移酶。carA编码具有谷氨酰胺酶活性的氨基甲酰磷酸合酶的小A亚基，carB编码氨基甲酰磷酸合成酶的大B亚基，其催化氨合成氨基甲酰磷酸。这些精氨酸生物合成基因中的一种或多种的不同组合(即argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB)可以自然地或合成地组织成一个或多个操纵子，并且这种组织可以在细菌种类，菌株和亚型之间变化。每个操纵子的调节区域包含至少一个ARG盒，并且每个调节区域的ARG盒的数量可以在操纵子和细菌之间变化。
编码这些酶的所有基因通过其与ArgR的相互作用受到精氨酸的抑制，以形成结合每个基因的调节区并抑制转录的复合物。N-乙酰谷氨酸合成酶也通过单独的精氨酸在蛋白质水平上进行变构反馈抑制(Tuchman等，1997；Caldara等，2006；Caldara等，2008；Caldovic等，2010)。
调节细菌中精氨酸生物合成的基因分散在整个染色体上并组织成多个操纵子，这些操纵子由一个阻遏物控制，Maas和Clark(1964)将其称为“调节子”。每个操纵子由一个调节区调节，该调节区包含至少一个18个核苷酸的不完全回文序列，称为ARG盒，与启动子重叠并与阻遏蛋白结合(Tian等，1992；Tian等，1994))。所述argR基因编码阻遏蛋白，其结合一种或多种ARG盒(Lim等，1987)。精氨酸作为共催化剂起作用，激活精氨酸阻遏物。调节每个操纵子的ARG盒可能不相同，并且共有ARG盒序列是A/T nTGAAT A/T A/T T/A T/AATTCAn T/A(Maas，1994)。此外，argR的调控区包含两个启动子，其中一个与两个ARG盒重叠并且是自动调节的。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含突变体精氨酸调节子并且在相同条件下产生比相同亚型的未修饰细菌或病毒更多的精氨酸。突变体精氨酸调节子包含一个或多个核酸突变，其减少或阻止一个或多个编码负责在精氨酸生物合成途径中将谷氨酸转化为精氨酸的酶的操纵子的精氨酸介导的抑制，通过ArgR与ARG盒结合和/或精氨酸与N-乙酰谷氨酸合成酶结合，从而增强精氨酸和/或中间副产物的生物合成。
在一些工程化细菌或工程化病毒中，精氨酸调节子包括但不限于编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA；argB，编码N-乙酰谷氨酸激酶；argC，编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶；argD，编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶；argE，编码N-乙酰鸟氨酸酶；argG，编码精氨琥珀酸合成酶；argH，编码精氨琥珀酸裂解酶；argF和argI中的一种或两种，每种都独立地编码鸟氨酸转氨甲酰酶；carA，编码氨基甲酰磷酸合成酶的小亚基；carB，编码氨基甲酰磷酸合成酶的大亚基；其操纵子；运营商；促进者；ARG盒子；和/或其调节区域。在一些实施方式中，精氨酸调节子包含argJ，编码鸟氨酸乙酰转移酶(除N-乙酰谷氨酸合成酶和/或N-乙酰基鸟氨酸酶之外或代替N-乙酰谷氨酸合成酶和/或N-乙酰基鸟氨酸酶)，其操纵子，其操纵子，其启动子，其ARG盒，和/或其监管区域。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸生物合成途径并且能够产生精氨酸。在更具体的方面，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸调节子，其中一种或多种编码精氨酸生物合成酶的操纵子被解除抑制，以在相同条件下产生比相同亚型的未修饰细菌更多的精氨酸。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒过量产生精氨酸。
本领域的技术人员将理解的是，精氨酸生物合成基因的操纵子内的组织跨物种，菌株，和细菌亚型而变化，例如，在大肠杆菌K12中的双极argECBH，在枯草芽孢杆菌中的argCAEBD-carAB-ARGF，和植物乳杆菌中的双极carAB-argCJBDF。来自不同细菌的操纵子组织的非限制性实例显示在下表6中(在一些情况下，基因通过与大肠杆菌中已知序列的序列同源性推定和/或鉴定；在一些情况下，不是所有基因中的基因。精氨酸调节子是已知的和/或如下所示。在某些情况下，精氨酸生物合成酶在细菌的物种，菌株和亚型之间变化。
表6。Arg操纵子组织的例子
Figure BDA0002194618080001021
Figure BDA0002194618080001031
每个操纵子受调节区调节，所述调节区包含至少一个启动子和至少一个ARG盒，其控制所述操纵子中精氨酸生物合成基因的抑制和表达。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸调节子，其包含一种或多种核酸突变，其减少或消除精氨酸介导的一种或多种操纵子的抑制，所述操纵子编码负责精氨酸生物合成途径中将谷氨酸转化为精氨酸的酶。通过减少或消除ArgR阻遏物结合(例如，通过突变或缺失精氨酸阻遏物或通过对编码精氨酸生物合成酶的每个操纵子突变至少一个ARG盒)和/或精氨酸与N-乙酰谷氨酸合成酶的结合(例如，通过突变N-乙酰谷氨酸合成酶以产生精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr)可以实现减少或消除精氨酸介导的抑制。
ARG盒
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸调节子，其在至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，用于编码精氨酸生物合成酶N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶和氨基甲酰磷酸合酶的一个或多个操纵子，从而去阻遏调节子并增强精氨酸和/或中间副产物的生物合成。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含突变体精氨酸阻遏物，其包含一个或多个核酸突变，使得精氨酸阻遏物功能降低或失活，或基因工程化细菌不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，导致调节子的去阻遏和精氨酸和/或中间副产物生物合成的增强。在这些实施方式的任一个中，基因工程化细菌或基因工程化病毒可进一步包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸调节子，其在至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，用于编码精氨酸生物合成酶和精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体例如argAfbr的一个或多个操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变或缺失的精氨酸阻遏物和精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr，突变精氨酸调节子，其在编码精氨酸生物合成酶，和/或突变或缺失的精氨酸阻遏物的每个操纵子的至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒编码精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶，并且还包含突变体精氨酸调节子，其在编码N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，氨基甲酰磷酸合成酶和野生型N-乙酰谷氨酸合成酶的一个或多个操纵子的每个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，使ArgR结合减少或消除，从而去抑制调节子和增强精氨酸和/或中间副产物生物合成。例如，编码精氨琥珀酸合酶(argG)的操纵子的调节区可以是组成型的，从而驱动精氨酸生物合成。
在一些实施方式中，突变包含精氨酸生物合成基因的一个或多个操纵子中的所有ARG盒以减少或消除ArgR结合。在一些实施方式中，突变编码精氨酸生物合成酶的一个或多个操纵子中的所有ARG盒以减少或消除ArgR结合。在一些实施方式中，突变包含精氨酸生物合成基因的每个操纵子中的所有ARG盒以减少或消除ArgR结合。在一些实施方式中，突变编码精氨酸生物合成酶的每个操纵子中的所有ARG盒以减少或消除ArgR结合。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒编码由组成型启动子驱动的精氨酸反馈抗性N-乙酰基谷氨酸合酶，精氨基琥珀酸合酶，并且还包含突变体精氨酸调节子，其在每个ARG盒中包含一个或多个核酸突变。编码N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸裂解酶，氨基甲酰磷酸合成酶和任选的野生型N-乙酰谷氨酸合成酶的操纵子，以减少或消除ArgR结合从而使调节子去抑制并增强精氨酸的生物合成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸调节子和反馈抗性ArgA，并且当表达精氨酸反馈抗性ArgA时，能够在相同条件下产生比相同亚型的未修饰细菌更多的精氨酸。
在一些实施方式中，ARG盒与SEQ ID NO:87，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO:89，SEQ IDNO:90，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95，SEQ IDNO:96，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:98，和/或SEQ ID NO:99的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。
在一些实施方式中，单个操纵子中可存在多于一个ARG盒。在这些实施方式的一个方面，操纵子中的至少一个ARG盒突变以产生与操纵子的调节区域结合的必需的降低的ArgR。在这些实施方式的另一个方面，操纵子中的每个ARG盒被突变以产生与操纵子的调节区域结合的必需的减少的ArgR。例如，大肠杆菌Nissle中的carAB操纵子包含两个ARG盒，并且一个或两个ARG盒序列可以是突变的。大肠杆菌Nissle中的argG操纵子包含三个ARG盒，并且可以突变，破坏或缺失一个，两个或三个ARG盒序列。在一些实施方式中，所有三个ARG盒序列被突变，破坏或缺失，并且组成型启动子(例如BBa_J23100)插入argG操纵子的调节区中。本领域技术人员将理解，每个调节区域的ARG盒的数量可以在细菌之间变化，并且ARG盒的核苷酸序列可以针对每个操纵子而变化。
“精氨酸操纵子”，“精氨酸生物合成操纵子”和“arg操纵子”可互换使用，指在包含至少一个启动子盒至少一个ARG盒子的共有调节区的控制下编码精氨酸生物合成酶的一个或多个基因的簇。在一些实施方式中，一种或多种基因共转录和/或共翻译。编码负责精氨酸生物合成的酶的基因的任何组合可以自然地或合成地组织成操纵子。例如，在枯草芽孢杆菌中，编码N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰鸟氨酸酶，N-乙酰谷氨酸激酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，氨基甲酰磷酸合酶和鸟氨酸转氨甲酰酶的基因组织在单个操纵子中，argCAEBD-carAB-argF，在包含启动子和ARG盒的共享监管区域的控制下。在大肠杆菌K12和Nissle中，编码N-乙酰基鸟氨酸酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，N-乙酰谷氨酸激酶和精氨基琥珀酸裂解酶的基因组织在两个双极操纵子argECBH中。编码负责精氨酸生物合成的酶的操纵子可以分布在整个染色体的不同位点。在未修饰的细菌中，每个操纵子可以通过ArgR被精氨酸抑制。在一些实施方式中，通过修饰由本文提供的精氨酸生物合成操纵子编码的酶的表达，可以在基因工程化细菌或基因工程化病毒中改变精氨酸和/或中间副产物的产生。每个精氨酸操纵子可以存在于质粒或细菌染色体上。此外，任何精氨酸操纵子或精氨酸操纵子内的基因或调节区的多个拷贝可存在于细菌或病毒中，其中操纵子或基因或调节区的一个或多个拷贝可以突变或以其他方式改变为本文描述的。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒经工程改造以包含相同产物的多个拷贝(例如，操纵子或基因或调节区)以增强拷贝数或包含执行多种不同功能的操纵子的多个不同组分。
“ARG盒共有序列”是指ARG盒核酸序列，已知其核酸在argR，argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和/或carB的一个或多个调节区中以高频率发生。如上所述，每个arg操纵子包含调节区，其包含至少一个18-核苷酸不完全的回文序列，称为ARG盒，其与启动子重叠并且阻遏蛋白结合于其上(Tian等，1992)。ARG盒的核苷酸序列可能因每个操纵子而异，共有ARG盒序列为A/T nTGAAT A/T A/T T/A T/A ATTCAn T/A(Maas，1994)。精氨酸阻遏物与一个或多个ARG盒结合以主动抑制与该一个或多个ARG盒可操作连接的精氨酸生物合成酶的转录。
“突变体精氨酸调节子”或“突变的精氨酸调节子”用于指精氨酸调节子，其包含一个或多个核酸突变，其减少或消除精子因子介导的每个操纵子的抑制，所述操纵子编码负责将谷氨酸转化为精氨酸的酶。精氨酸生物合成途径，使得突变体精氨酸调节子在相同条件下产生比来自相同细菌亚型的未修饰调节子更多的精氨酸和/或中间副产物。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr，和突变体精氨酸调节子，其包含至少一个ARG盒中的一个或多个核酸突变，用于编码精氨酸生物合成酶N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨基琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶和氨基甲酰磷酸合酶的一个或多个操纵子，从而去抑制调节子并增强精氨酸和/或中间副产物的生物合成。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸阻遏物，其包含一个或多个核酸突变，使得精氨酸阻遏物功能降低或失活，或基因工程化细菌或基因工程化病毒不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏基因已被缺失)，导致调节子的去阻遏和精氨酸和/或中间副产物生物合成的增强。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr，突变精氨酸调节子，其在每个操纵子的至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变。编码精氨酸生物合成酶，和/或突变或缺失的精氨酸阻遏物。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。和突变体精氨酸调节子，其在编码精氨酸生物合成酶的每个操纵子的至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr，和突变或缺失的精氨酸阻遏物。在一些实施方式中，突变体精氨酸调节子包含编码野生型N-乙酰基谷氨酸合成酶的操纵子和在所述操纵子的至少一个ARG盒中的一个或多个核酸突变。在一些实施方式中，突变体精氨酸调节子包含编码野生型N-乙酰基谷氨酸合成酶和突变或缺失的精氨酸阻遏物的操纵子。在一些实施方式中，突变体精氨酸调节子包含编码鸟氨酸乙酰转移酶的操纵子(除了N-乙酰谷氨酸合成酶和/或N-乙酰基鸟氨酸酶之外或代替N-乙酰谷氨酸合成酶和/或N-乙酰基鸟氨酸酶)和在所述操纵子的至少一个ARG盒中的一个或多个核酸突变。
ARG盒与每个精氨酸生物合成操纵子的调节区中的启动子重叠。在突变体精氨酸调节子中，一个或多个精氨酸生物合成操纵子的调节区域被充分突变以破坏回文ARG盒序列并降低ArgR结合，但仍然包含与待识别的非突变调节区的启动子足够高的同源性。作为天然操纵子特异性启动子。操纵子在至少一个ARG盒中包含至少一个核酸突变，从而减少或消除ArgR与ARG盒和操纵子调节区的结合。在一些实施方式中，保护免受DNA甲基化的碱基和在ArgR结合期间保护免受羟基自由基攻击的碱基是破坏ArgR结合的突变的主要靶标。突变调节区的启动子与非突变调节区的启动子保持足够高的同源性，使得RNA聚合酶以足够的亲和力与其结合，以促进可操作连接的精氨酸生物合成酶的转录。在一些实施方式中，突变体启动子的G/C：A/T比与野生型启动子的G/C：A/T比相差不超过10％。
在一些实施方式中，单个操纵子中可存在多于一个ARG盒。在这些实施方式的一个方面，改变操纵子中的至少一个ARG盒以产生与操纵子的调节区域结合的必需的降低的ArgR。在这些实施方式的另一个方面，操纵子中的每个ARG盒被改变以产生与操纵子的调节区域结合的必需的减少的ArgR。
“减少的”ArgR结合用于指与抑制剂结合在相同条件下相同亚型的细菌中的未修饰的ARG盒和调节区相比，抑制剂与操纵子中ARG盒结合的减少或与所述操纵子的调节区结合的总阻遏物的减少。
“ArgR”或“精氨酸阻遏物”用于指通过调节精氨酸调节子中精氨酸生物合成基因的转录能够抑制精氨酸生物合成的蛋白质。当在野生型细菌中增加编码精氨酸阻遏蛋白(“argR”)的基因的表达时，精氨酸生物合成减少。当argR的表达在野生型细菌或病毒中降低时，或者如果argR缺失或突变以使精氨酸阻遏物功能失活，则精氨酸生物合成增加。
“缺乏任何功能性ArgR”和“ArgR缺失细菌”的细菌用于指其中每种精氨酸阻遏物在相同条件下与来自相同亚型的细菌的未修饰的精氨酸阻遏物相比显著降低或消除活性的细菌。精氨酸阻遏物活性的降低或消除可导致例如精氨酸生物合成基因的转录增加和/或精氨酸浓度增加。细菌，其中精氨酸阻抑物活性被降低或消除，可通过修改细菌argR基因或通过修饰argR基因的转录而产生。例如，染色体argR基因可以缺失，可以突变，或argR基因可以用不具有野生型阻遏物活性的argR基因替换。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒在至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，用于编码精氨酸生物合成酶N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合酶，精氨琥珀酸裂解酶和氨基甲酰磷酸合酶的一个或多个操纵子，另外包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含反馈抗性形式的ArgA，以及编码精氨酸生物合成酶N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，鸟氨酸乙酰转移酶和氨基甲酰磷酸合成酶的一个或多个操纵子的每个ARG盒中的一个或多个核酸突变。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含反式抗性形式的ArgA，由组成型启动子表达的精氨基琥珀酸合酶，以及编码精氨酸生物合成酶，N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰胺还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，鸟氨酸乙酰转移酶和氨基甲酰磷酸合成酶的每个操纵子的每个ARG盒中的一个或多个核酸突变。在这些实施方式中，细菌能够产生精氨酸。
下表图1显示了突变构建体的实例，其中一个或多个核酸突变减少或消除了每个精氨酸操纵子的精氨酸介导的抑制。突变构建体包含由氧水平依赖性启动子驱动的反馈抗性形式的ArgA，例如FNR启动子。每个突变体精氨酸调节子在至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，用于编码N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨基琥珀酸合酶，精氨基琥珀酸裂解酶，氨基甲酰磷酸合酶和野生型N-乙酰谷氨酸合成酶的一个或多个操纵子，使ArgR结合减少或消除，从而增强精氨酸和/或中间副产物的生物合成。突变体精氨酸调节子构建体的非限制性实例例如描述于2016年5月25日提交的PCT/US2016/034200和2016年5月25日提交的15/164828，公布为US20160333326，和2015年4月12日提交的PCT/US2015/064140，2015年4月12日提交的美国专利No.9487764，其全部内容通过引用并入本文。
突变可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方式中，精氨酸调节子受单一阻遏蛋白调节。在细菌的特定物种，菌株和/或亚型中，已经提出精氨酸调节子可以由两个推定的阻遏物调节(Nicoloff等，2004)。因此，在某些实施方式中，本发明的精氨酸调节子受一种以上的阻遏蛋白调节。
在某些实施方式中，突变体精氨酸调节子在基因工程化细菌的一种，菌株或亚型中表达。在替代性实施方式中，突变体精氨酸调节子在基因工程化细菌的两种或更多种，菌株和/或亚型中表达。
精氨酸阻遏蛋白结合位点(ARG盒)
在一些实施方式中，基因工程化细菌另外包含突变体精氨酸调节子，其在至少一个ARG盒中包含一个或多个核酸突变，用于编码精氨酸生物合成酶N-乙酰谷氨酸激酶，N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶，乙酰基鸟氨酸氨基转移酶，N-乙酰基鸟氨酸酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨基琥珀酸合酶，精氨琥珀酸裂解酶和氨基甲酰磷酸合酶的一个或多个操纵子，使得精氨酸调节子被去阻遏并且精氨酸和/或中间副产物(例如瓜氨酸)的生物合成得到增强。这种基因工程化细菌描述于2016年1月11日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072，公开号为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文。
精氨酸阻遏物(ArgR)
基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸调节子，其包含一个或多个核酸突变，其减少或消除精氨酸介导的一个或多个操纵子的抑制，所述操纵子编码在精氨酸生物合成途径中负责将谷氨酸转化为精氨酸的酶和/或中间副产物。在一些实施方式中，可以通过减少或消除ArgR阻遏物结合来实现精氨酸介导的抑制的减少或消除，例如通过突变编码精氨酸生物合成酶的一个或多个操纵子的至少一个ARG盒(如上所述))或通过突变或缺失精氨酸阻遏物(在此讨论)和/或通过减少或消除精氨酸与N-乙酰谷氨酸合成酶的结合(例如，通过突变N-乙酰谷氨酸合成酶以产生精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如，argAfbr)。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌1或基因工程化病毒具有功能性ArgR阻遏物，因此减少或消除了每个精氨酸生物合成操纵子的ArgR阻遏物介导的转录抑制。在一些实施方式中，工程化细菌包含突变体精氨酸阻遏物，其包含一个或多个核酸突变，使得精氨酸阻遏物功能降低或失活。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒不具有精氨酸阻遏物(例如，精氨酸阻遏物基因已被缺失)，导致调节子的去阻遏和精氨酸和/或中间副产物生物合成的增强。在一些实施方式中，通常存在于相应的野生型细菌中的功能性argR基因的每个拷贝独立地缺失或通过一个或多个核苷酸缺失，插入或取代而失活。在一些实施方式中，缺失通常存在于相应的野生型细菌中的功能性argR基因的每个拷贝。
在一些实施方式中，精氨酸调节子受单一阻遏蛋白调节。在细菌的特定物种，菌株和/或亚型中，已经提出精氨酸调节子可以由两种不同的推定抑制子调节(Nicoloff等，2004)。因此，在某些实施方式中，在基因工程化细菌或基因工程化病毒中突变或缺失各自包含不同氨基酸序列的两种不同的ArgR蛋白。
在一些实施方式中，包含突变或缺失的精氨酸阻遏物的基因工程化细菌或基因工程化病毒另外包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含反馈抗性形式的ArgA，缺乏任何功能性精氨酸阻遏物，并且能够产生精氨酸。在一些实施方式中，argR基因在基因工程化细菌或基因工程化病毒中缺失。在一些实施方式中，突变argR基因以使ArgR功能失活。在一些实施方式中，argG基因在基因工程化细菌或基因工程化病毒中缺失。在一些实施方式中，突变argG基因以使ArgR功能失活。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含argAfbr和缺失的ArgR。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含argAfbr，缺失的ArgR和缺失的argG。在一些实施方式中，从细菌基因组中缺失缺失的ArgR和/或缺失的argG，并且argAfbr存在于质粒中。在一些实施方式中，从细菌基因组中缺失缺失的ArgR和/或缺失的argG，并且argAfbr是染色体整合的。在一个具体实施方式中，遗传修饰的细菌或基因工程化病毒包含染色体整合的argAfbr，缺失的基因组ArgR和缺失的基因组argG。在另一个具体的实施方式中，遗传修饰的细菌包含存在于质粒上的argAfbr，缺失的基因组ArgR和缺失的基因组argG。
反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶突变体，例如argAfbr。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含突变体精氨酸调节子，其包含精氨酸反馈抗性ArgA，并且当表达精氨酸反馈抗性ArgA时，能够产生比相同条件下相同亚型的未修饰的细菌更多的精氨酸和/或中间副产物。精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶蛋白(argAfbr)是比来自反馈敏感母体菌株的酶显著更低敏感于L-精氨酸(参见，例如，Eckhardt et al.,1975；Rajagopal et al.,1998)。反馈抗性argA基因可以存在于质粒或染色体上。在一些实施方式中，来自质粒的表达可用于增加argAfbr表达。在一些实施方式中，来自染色体的表达可用于增加argAfbr表达的稳定性。
在一些实施方式中，本公开的任何基因工程化细菌或基因工程化病毒在一个或多个整合位点整合到细菌染色体中。例如，编码精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶的序列的一个或多个拷贝可以整合到细菌染色体中。具有整合到染色体中的精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶的多个拷贝允许更大量地产生N-乙酰谷氨酸合酶并且还允许微调表达水平。或者，除了精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合酶之外，本文所述的不同回路，例如任何杀灭开关回路，可以在一个或多个不同的整合位点整合到细菌染色体中以执行多种不同的功能。
多种不同的反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶蛋白质是本领域已知的，并且可以在基因工程化细菌或基因工程化病毒中组合。在一些实施方式中，argAfbr基因在组成型启动子的控制下表达。在一些实施方式中，argAfbr基因在由肿瘤微环境诱导的启动子的控制下表达。
在一些实施方式中，质粒或染色体还包含野生型ArgR结合位点，例如ARG盒。在一些情况下，功能性ArgR的存在和/或积累可导致除ARG盒之外的位点处的脱靶结合，这可导致基因表达的脱靶变化。进一步包含功能性ARG盒的质粒或染色体可用于减少或消除脱靶ArgR结合，即通过充当ArgR宿。在一些实施方式中，质粒或染色体不包含功能性ArgR结合位点，例如，质粒或染色体包含修饰的ARG盒或不包含ARG盒。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含在氧水平依赖性启动子(例如FNR启动子)的控制下表达的argAfbr，以及在包含如上所述的一个或多个ARG盒突变的突变体调节区域的控制下表达的野生型argA。在某些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含在氧水平依赖性启动子控制下表达的argAfbr，例如FNR启动子，并且不包含野生型argA。在其他实施方式中，突变体精氨酸调节子包含在氧水平依赖性启动子(例如FNR启动子)的控制下表达的argAfbr，并且还包含没有任何ARG盒突变的野生型argA。
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒从质粒和/或染色体表达ArgAfbr。在一些实施方式中，argAfbr基因在组成型启动子的控制下表达。在一些实施方式中，argAfbr基因在诱导型启动子的控制下表达。在一个实施方式中，argAfbr在氧水平依赖性启动子的控制下表达，所述启动子在低氧或厌氧环境下活化，例如FNR启动子。
示例性argAfbr序列的核酸序列显示在SEQ ID NO:102中。示例性argAfbr序列的多肽序列显示在SEQ ID NO:103中。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:102的核酸序列或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，但是为了遗传密码的冗余，其编码与SEQ ID NO:102相同的多肽或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:102的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列，或其功能片段，或者为了遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:102相同的多肽或其功能片段的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码SEQ ID NO:103的多肽序列或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码编码多肽的多肽序列，其含有相对于SEQ IDNO:103的一个或多个保守氨基酸取代或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与SEQ ID NO:103的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽序列，或其功能片段。
在一些实施方式中，当精氨酸反馈抗性N-乙酰谷氨酸合成酶有活性时，与相同条件下来自相同亚型的细菌的野生型N-乙酰谷氨酸合成酶相比，N-乙酰谷氨酸合成酶的精氨酸反馈抑制在基因工程化细菌中降低至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或至少约95％。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生精氨酸的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生精氨酸的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够使细胞增殖与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤大小与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
产生精氨酸的菌株还描述于2016年5月25日提交的PCT/US2016/034200和2016年5月25日提交的15/164，828(公布为US20160333326)和PCT/US2015/064140(2015年4月12日提交)和2015年4月12日提交的美国专利No.9487764，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，用于产生精氨酸的基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，用于产生精氨酸的基因序列由可由这些条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，用于产生精氨酸的任何一种或多种所述回路存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在一个非限制性实例中，精氨酸产生回路可以与anit-CD47分泌回路组合。
抑制或耗竭PGE2
前列腺素E2(PGE2)在许多肿瘤中过量产生，其有助于癌症进展。PGE2是一种多效分子，参与许多生物过程，包括血管生成，细胞凋亡，炎症和免疫抑制。PGE2由花生四烯酸通过环加氧酶2(COX-2)合成。COX-2将花生四烯酸(AA)转化为前列腺素内过氧化物H2(PGH2)。然后通过前列腺素E合酶(PGES)将PHG2转化为PHE2，其中有三种形式。PGE2可被15-PGDH和羰基还原酶分解代为生物学无活性的15-酮-PG，或由分泌型MRP4分泌。
MDSCs被认为在肿瘤环境中的PGE2产生中起关键作用。肿瘤衍生因子诱导COX2，PGES1和MRP4并下调MDSC中15-PGDH的表达，并且与MDSC抑制活性相关。通过COX-2抑制剂抑制PGE2显示出作为癌症治疗的希望，但是全身给药与严重的副作用相关，并且在COX-2抑制剂塞来昔布的情况下，已观察到对肿瘤预防的抗性。
除抑制PGE产生外，15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)对PGE2的降解是另一种降低肿瘤中PGE2水平的方法。缺乏前列腺素脱氢酶可防止前列腺素E2的分解代谢，前列腺素E2有助于癌细胞逃避免疫系统并规避药物治疗。最近的研究表明，局部递送至肿瘤微环境的15-PGDH可以产生抗肿瘤免疫应答。例如，将编码15-PGDH的腺病毒注射到包含表达CD11b的非淋巴细胞白细胞的小鼠肿瘤中(其具有增加的PGE2水平，更高的COX-2表达并且与来自外部的细胞相比显著降低15-PGDH的表达。肿瘤)导致肿瘤生长明显减慢。这些研究进一步表明，15-PGDH表达在肿瘤细胞中最高，但在肿瘤相关CD11b细胞中也是显著的，其中它产生PGE2分泌减少四倍。这与CD11b细胞分泌的免疫抑制细胞因子减少有关，导致其命运转变，促进其分化为树突细胞。这些研究表明，肿瘤中PGE2的过量产生通过阻止抗原呈递细胞的成熟而促进免疫逃避，并且可以通过强制表达15-PGDH来克服这种逃避。(Eruslanov etal.,Volume 88,November 2010 Journal of Leukocyte Biology；Tumor-mediatedinduction of myeloid-derived suppressor cells and M2-polarized macrophages byaltering intracellular PGE2 catabolism in myeloid cells)。
其他研究证实了局部PGE2分解代谢在癌症治疗中的益处。Celecoxib是一种非甾体抗炎COX-2抑制剂，用于治疗疼痛和炎症，可减少结肠腺瘤的复发，但对一些15-PGDH水平低的患者无效。这些结果与研究结果一致，该研究表明，在小鼠中，15-PGDH的基因敲除赋予塞来昔布预防结肠肿瘤的能力接近完全的抗性。这些和其他研究强调了通过抑制合成或促进催化或两者来降低癌症中PGE2水平的潜在重要性。
在一些实施方式中，基因工程化微生物，例如基因工程化细菌产生一种或多种能够降低或消耗肿瘤微环境中PGE2水平的抗癌分子。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抗癌分子，其能够抑制或降低PGE2产生，例如在花生四烯酸合成途径中产生COX-2抑制剂或酶抑制剂。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抗癌分子，其促进从肿瘤微环境摄取PGE2，例如表达PGE2转运蛋白。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种促进，增强或刺激PGE2降解的抗癌分子。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种降解PGE2的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌产生15-羟基前列腺素脱氢酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抗癌分子，其能够抑制或降低PGE2产生，和/或促进从肿瘤微环境摄取PGE2，例如，表达PGE2转运蛋白和/或促进PGE2降解，例如，产生15-羟基前列腺素脱氢酶。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在低氧条件激活的启动子控制下，编码PGE2转运蛋白的序列和/或编码15-羟基前列腺素脱氢酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，编码PGE2转运蛋白的序列和/或编码15-羟基前列腺素脱氢酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文描述的启动子)的控制下，编码PGE2转运蛋白的序列和/或编码15-羟基前列腺素脱氢酶的序列。
免疫抑制细胞因子
某些细胞因子，称为免疫抑制细胞因子，是从肿瘤细胞中分泌出来的，其作用是抑制先天和/或适应性免疫反应，在某些情况下通过Tregs，TAM和DCregs。因此，在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制一种或多种免疫抑制细胞因子的抗癌分子。白细胞介素10(IL-10)，也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，是由单核细胞和淋巴细胞产生的抗炎细胞因子(例如，2型T辅助细胞，肥大细胞，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tregs))。IL-10可由单核细胞产生PD-1在这些细胞中触发。Il-10已被证明可以下调巨噬细胞上表达Th1细胞因子，MHCII类抗原和共刺激分子。还报道了抑制细胞因子分泌，抗原呈递和CD4+T细胞活化。进一步研究表明，IL-10抑制脂多糖(LPS)和细菌产物介导的促炎细胞因子TNFα，IL-1β，IL-12的诱导，和IFNγ来自Toll样受体(TLR)的分泌物触发了髓系细胞。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生间接或直接抑制IL-10的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对IL-10的抗体，例如针对IL-10的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗IL-10抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗IL-10抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在由低氧条件活化的启动子控制下表达抗IL-10抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗IL-10抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文描述的启动子)的控制下表达抗IL-10抗体，例如单链抗体。
CCR4在正常和肿瘤免疫中也具有重要作用。C趋化因子受体4(CCR4)对于调节免疫平衡是重要的，并且已知在癌组织和外周血中的Th2细胞和效应Treg细胞上选择性表达。在患有CCR4+T细胞白血病/淋巴瘤的一部分患者中，肿瘤细胞本身作为调节性T(Treg)细胞起作用，在面对宿主抗肿瘤免疫应答时促进肿瘤存活。在其他类型的癌症中，趋化因子TARC/CCL17和MDC/CCL22，由肿瘤细胞和肿瘤微环境产生的CCR4的特异性配体，将CCR4+Treg细胞吸引到肿瘤，在那里它们为肿瘤逃离宿主免疫应答创造了有利的环境。研究表明，肿瘤浸润性巨噬细胞和肿瘤细胞产生趋化因子(CC基序)配体22(CCL22)，其对Treg细胞以及表达CC趋化因子受体4型(CCR4)的效应T细胞进行化学吸附。因此，抑制CCR4信号传导有可能通过选择性地消耗Treg并防止它们迁移到肿瘤微环境中来促进抗肿瘤免疫应答。事实上，体内和体外抗CCR4mAb治疗已被证明可选择性消耗效应Treg细胞并有效诱导肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+T细胞。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CCR4和/或抑制CCL17和/或抑制CCL22的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CCR4的拮抗抗体，和/或针对CCR4的拮抗抗体和/或针对CCL17的抗体和/或针对CCL22的抗体，例如针对CCR4的单链抗体和/或针对CCL17的单链抗体和/或针对CCL22的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达拮抗性CCR4配体和/或抗CCR4抗体和/或抗CCL17抗体和/或抗CCL22抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达CCR4和/或抗CCR4抗体和/或抗CCL17抗体和/或抗CCL22抗体的拮抗配体例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达CCR4和/或抗CCR4抗体和/或抗CCL17抗体和/或抗CCL22抗体的拮抗配体，例如，单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达CCR4和/或抗CCR4抗体和/或抗CCL17抗体和/或抗CCL22抗体的拮抗配体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达CCR4和/或抗CCR4抗体和/或抗CCL17抗体和/或抗CCL22抗体的拮抗配体，例如单链抗体。
白细胞介素-27(IL-27)是异二聚体细胞因子IL-12家族的成员，其通过在T细胞和/或天然杀伤细胞上高度表达的受体发出信号。已显示IL-27抑制Th17细胞在炎症中的发展和分化，并在Th1和Th2效应细胞中诱导Treg样活性。还显示IL-27在这些Th1和Th2细胞中诱导IL-10的产生和分泌。这些结果通过另外的研究得到证实，这些研究表明IL-27可诱导IL-10和IFN-γ的产生，并抑制抗CD3，抗CD28激活的人CD4+T细胞的IL-17分泌。此外，IL-27处理的T细胞抑制CD4+的增殖T细胞以IL-10依赖性方式。总之，这些研究表明IL-27在产生抗炎性IL-10的T细胞群中起作用。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生间接或直接抑制IL-27的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对IL-27的抗体，例如针对IL-27的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗IL-27抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗IL-27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件活化的启动子控制下表达抗IL-27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗IL-27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文描述的任何启动子)的控制下表达抗IL-27抗体，例如单链抗体。
白细胞介素35(IL-35)是一个IL-12家庭细胞因子产生调节性T细胞(Tregs)，但不是效应T细胞并在免疫抑制中发挥作用。它是由二聚体组成的蛋白质IL-12α和IL-27β链，由两个独立的编码基因。IL-35是一种免疫抑制细胞因子，主要由Tregs表达，通过调节效应T细胞以及骨髓细胞参与抑制抗肿瘤免疫。在被Tregs分泌后，IL-35抑制炎症反应免疫细胞IL-35已显示出对不同T细胞亚群的选择性活性，诱导增殖Treg细胞群但降低Th17细胞群的活性，导致抑制效果。阻断IL-35的活性有可能逆转肿瘤微环境中的免疫抑制并导致强大且有效的抗肿瘤免疫应答。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生间接或直接抑制IL-35的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对IL-35的抗体，例如针对IL-35的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗IL-35抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗IL-35抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗IL-35抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗IL-35抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗IL-35抗体，例如单链抗体。
集落刺激因子1受体(CSF1R，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体，M-CSFR，分化簇115，CD115)是单次通过I型膜蛋白，并作为集落刺激因子1(CSF1)的受体，其试一种在调节巨噬细胞和单核细胞的存活，增殖，分化和功能中起重要作用的细胞因子。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，单核细胞源性抑制细胞(MMDSC)和粒细胞MDSC(G-MDSC)被认为是免疫抑制性肿瘤微环境的驱动因子。这些白细胞还可以促进肿瘤细胞增殖，赋予对细胞毒性应激的抗性，并促进转移性传播。阻断CSF1/CSF1R减少TAM的数量并重新编程剩余的TAM以支持抗原呈递并支持肿瘤微环境中的T细胞活化。这反过来导致免疫抑制减少和干扰素反应升高，这抑制肿瘤进展(Yu Zhu等，Cancer Res，2014年9月15日，74)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CSF1和/或抑制CSF1R的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CSF1的抗体和/或针对CSF1R的抗体，例如针对CSF1的单链抗体和/或针对CSF1R的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CSF1抗体和/或抗CSF1R抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CSF1抗体和/或抗CSF1R抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CSF1抗体和/或抗CSF1R抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗CSF1抗体和/或抗CSF1R抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗CSF1抗体和/或抗CSF1R抗体，例如单链抗体。
单核细胞趋化蛋白1(MCP-1，CCL2)是细胞因子/趋化因子超家族的成员。CCL2首先被表征为诱导单核细胞迁移的趋化因子(Loberg等，CCL2 is an important mediator ofprostate cancer growth in vivo via regulation of macrophageinfiltration.Neoplasia.2007；9:556–62).et al.,2010)。通过CCL2-CCR2轴募集到肿瘤的单核细胞被极化为TAM，有助于肿瘤细胞存活(McClellan等，2012)。此外，已发现CCL2发挥许多其他趋化性质，包括将淋巴细胞亚群(包括T-regs)和内皮细胞吸引到炎症部位。CCL2还通过抑制CD8+T细胞效应子功能直接影响T细胞功能(HuK.等，Recombined CCchemokine ligand 2 into B16 cells induces production of Th2-dominantedcytokines and inhibits melanoma metastasis.Immunology Letters.2007；113:19–28)。最近，在结肠直肠癌中已经描述了CCL2作为MDSC积累和MDSC介导的CD4+和CD8+T细胞抑制的调节剂的另外作用。本研究的结果提示CCL2-MDSC免疫检查点在肿瘤发展的最早阶段，易受CCL2指导的阻断和潜在的CCL-2定向治疗(Chun等，CCL2Promotes ColorectalCarcinogenesis by Enhancing Polymorphonuclear Myeloid-Derived Suppressor CellPopulation and Function
Figure BDA0002194618080001241
Cell Reports 12,244-257)。在患者中，已发现CCL2在多种肿瘤类型中处于高水平，这与不良临床结果相关。诸如Loberg等的研究表明，全身施用抗CCL2中和抗体显著延缓了肿瘤生长。最近已显示使用针对两种小鼠CCL2小鼠蛋白的两种抗体的组合来减少前列腺癌异种移植模型中的肿瘤发生和转移。特别地，已提出抗CCL2疗法可与免疫刺激疗法如疫苗疗法组合使用(Fridlender等，Cancer Res.2010Jan 1；70(1):109.CCL2 Blockade AugmentsCancer Immunotherapy)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CCL2的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CCL2的抗体，例如针对CCL2的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗CCL2抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗CCL2抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在由低氧条件活化的启动子控制下表达抗CCL2抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗CCL2抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗CCL2抗体，例如单链抗体。
CD70是一种细胞因子，是一种类型的II跨膜糖蛋白，属于分子的肿瘤坏死因子(TNF)超家族。在其配体CD27结合后，它促进细胞的增殖，存活和分化。CD70的表达通常限于活化的T细胞和B细胞，但在某些肿瘤细胞中表达，并且通过与CD27的相互作用涉及肿瘤细胞和Treg细胞存活。肿瘤细胞对CD70的组成型表达被认为允许通过增加抑制性Treg的量，通过诱导T细胞凋亡和通过使T细胞向T细胞衰竭倾斜来逃避免疫系统。已经表明，CD70的抑制可以消除其在肿瘤微环境中的免疫抑制作用。(CD70:An emerging target in cancerimmunotherapy,Jacobs et al.,Pharmacology&Therapeutics,Volume 155,November2015,Pages 1–10)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制CD70和/或CD27的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对CD70和/或CD27的抗体，例如针对CD70的单链抗体和/或针对CD27的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗CD70和/或抗CD27抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下活化的启动子的控制下表达抗CD70抗体和/或抗CD27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件活化的启动子控制下表达抗CD70抗体和/或抗CD27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗CD70抗体和/或抗CD27抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗CD70抗体和/或抗CD27抗体，例如单链抗体。
哺乳动物中存在三种功能相似的TGF-β亚型(TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3)；TGF-β1是主要在免疫系统中表达的同种型。除了其对肿瘤细胞增殖和血管生成的直接影响之外，TGF-β还使肿瘤能够逃避免疫监视(参见，例如，Wrzesinski等，Clin Cancer ResSeptember 15,2007 13；5262Transforming Growth Factor-βand the Immune Response:Implications for Anticancer Therapy)。作为多效细胞因子，TGF-β对多种免疫细胞类型发挥作用。例如，TGF-β可以阻断IL-2的产生，从而阻断T细胞和NK细胞的增殖。此外，TGF-β还通过抑制CD8+效应分子(例如IFN-γ和穿孔素)的表达来控制T细胞效应子功能，并且还促进Treg的产生。最后，认为TGF-β负调节调节分化的树突细胞的抗原呈递功能。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生的抑制TGF-β抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对TGF-β的中和抗体，例如抗TGF-β单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗TGF-β抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在低氧条件下活化的启动子的控制下表达抗TGF-β抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在由低氧条件活化的启动子控制下表达抗TGF-β抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗TGF-β抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗TGF-β抗体，例如单链抗体。
Th1/CD8-趋化因子
趋化因子对于吸引和募集免疫细胞至关重要，例如那些激活免疫应答的免疫细胞和诱导癌细胞凋亡的免疫细胞。趋化因子的靶细胞表达趋化因子结合并介导功能的相应受体。因此，CC和CXC趋化因子的受体分别称为CCR和CXCR。CC趋化因子与CC趋化因子受体结合，CXC趋化因子与CXC趋化因子受体结合。大多数受体通常与多于一种趋化因子结合，并且大多数趋化因子通常与多于一种受体结合。
趋化因子干扰素-γ诱导蛋白10kDa(CXCL10)是CXC趋化因子家族的成员，其与CXCR3受体结合以发挥其生物学作用。CXCL10参与趋化性，诱导细胞凋亡，调节细胞生长和抑制血管生成抑制作用。CXCL10与多种人类疾病有关，包括传染病，慢性炎症，免疫功能障碍，肿瘤发展，转移和传播。更重要的是，CXCL10已被确定为介导疾病严重程度的主要生物学标记，可用作各种疾病的预后指标。在这篇综述中，我们关注当前的研究，阐明CXCL10在癌症发病机制中的新兴作用。了解CXCL10在疾病发生和发展中的作用可能为开发CXCL10作为相关人类恶性肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点奠定基础。
CXCL10和CXCL9各自特异性激活一种受体CXCR3，这是一种七跨膜跨膜G蛋白偶联受体，主要在活化的T淋巴细胞(Th1)，自然杀伤细胞(NK)，炎症树突细胞，巨噬细胞和B细胞上表达。干扰素诱导的血管生成抑制CXC趋化因子和干扰素诱导的T细胞化学引诱物(I-TAC/CXCL11)也激活CXCR3。这些CXC趋化因子优先在Th1淋巴细胞上表达。
免疫介导的组织特异性破坏与Th1极化，相关趋化因子(CXCR3和CCR5配体，例如CXCL10和CXCL9)以及与细胞毒性机制的激活相关的基因相关。其他研究表明，早期乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肝细胞癌，卵巢癌和黑色素瘤等癌症的长期无病生存率和总生存率始终与T辅助细胞1型(Th1)细胞相关因子的激活有关，如IFN-γ，信号转导和转录激活因子1(STA1)，IL-12，IFN-调节因子1，转录因子T-bet，免疫效应因子或细胞毒性因子(颗粒酶)，穿孔素和颗粒溶素，CXCR3和CCR6配体趋化因子(CXCL9，CXCL10和CCL5)，其他趋化因子(CXCL1和CCL2)和粘附分子(MADCAM1，ICAM1，VCAM1)。已显示化学吸引和粘附在确定肿瘤内免疫细胞的密度中起关键作用。其他研究表明，CXCL9，CXCL10和CXCL11的上调可预测治疗反应性(特别对过继转移疗法有反应)。还有其他研究表明，驱动淋巴细胞浸润的趋化因子预示着肝细胞癌患者的存活。
现在认识到癌症进展受癌细胞内在和微环境因素的调节。已经证实T辅助细胞1(Th1)和/或细胞毒性T细胞的存在与几种癌症中复发的风险降低相关，并且促炎性肿瘤微环境与肝细胞癌患者群体中延长的存活相关。已显示CXCL10，CCL5和CCL2表达与Th1，CD8+T细胞和天然杀伤细胞的肿瘤浸润相关。数据显示CXCL10，CCL5和CCL2是吸引Th1，CD8+T细胞和NK细胞进入肿瘤微环境的主要趋化因子。此外，CXCL10和TLR3(诱导CXCL10，CCL5和CCL2)表达与癌细胞凋亡相关。
CXC基序趋化因子10(CXCL10)，也称为干扰素γ诱导的蛋白质10(IP-10)或小诱导型细胞因子B10，是人类中由CXCL10基因编码的8.7kDa蛋白质。CXCL10是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，其由几种细胞类型响应IFN-γ分泌，包括单核细胞，内皮细胞和成纤维细胞。CXCL10具有多种作用，包括单核细胞/巨噬细胞，T细胞，NK细胞和树突细胞的化学吸引，促进T细胞与内皮细胞的粘附，抗肿瘤活性以及抑制骨髓集落形成和血管生成。该趋化因子通过与细胞表面趋化因子受体CXCR3结合而引发其作用。
在促炎条件下，CXCL10由多种细胞分泌，例如白细胞，活化的嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞，上皮细胞，内皮细胞，基质细胞(成纤维细胞)和角质形成细胞，以响应IFN-γ。这种干扰素反应的关键调节剂，优先吸引活化的Th1淋巴细胞进入炎症区域，其表达与Th1免疫应答有关。CXCL10也是单核细胞，T细胞和NK细胞的化学引诱物。(Chew等，Gut，2012，61：427-438)。还有其他研究表明，免疫保护特征基因，如Th1型趋化因子CXCL10和CXCL9，可能在癌症中表观遗传沉默。(Peng等，Nature，2015，doi：10.1038/nature15520)。
趋化因子(CXC基序)配体9(CXCL9)是属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，也称为由γ干扰素(MIG)诱导的单核因子。CXCL9是由IFN-γ诱导的T细胞化学引诱物(Th1/CD8吸引趋化因子)。它与另外两种CXC趋化因子CXCL10和CXCL11密切相关。CXCL9，CXCL10和CXCL11都通过与趋化因子受体CXCR3相互作用引发其趋化功能。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是获得Th1/CD8的趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是CXCR3配体趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种趋化因子的基因序列，所述趋化因子是CCR5配体趋化因子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码CXCL10的一个或多个拷贝的基因序列。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL10。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL10。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CXCL10。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌分泌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL10。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL10。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CXCL10。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL10的细菌能够将细胞增殖与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL10的细菌能够使肿瘤生长与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL10的细菌能够将肿瘤尺寸与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够将肿瘤体积与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够将肿瘤重量与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够将响应率与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更大程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞的趋化性至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞的趋化性至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更大的程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞的趋化性约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更大程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更大的程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更大的程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL10的细菌能够与CXCR3结合与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与CXCR3结合与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞趋化至至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更高的程度。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，或其片段或功能变体。在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO:1207或SEQID NO:1208的序列具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，基因序列CXCL10多肽与选自SEQID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列与选自SEQ IDNO:1207或SEQ ID NO:1208的序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列包含选自SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列。在另一个实施方式中，编码CXCL10多肽的基因序列由选自SEQ ID NO:1207或SEQ ID NO:1208的序列组成。在其中基因工程化细菌编码CXCL10的任何这些实施方式中，可以除去编码分泌标签的一个或多个序列并用不同的标签替换。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，所述CXCL10多肽与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CXCL10多肽的基因序列，其具有与选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，或具有功能性其片段。在另一个实施方式中，CXCL10多肽包含选自SEQ IDNO:1205或SEQ ID NO:1206的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的CXCL10多肽由选自SEQ ID NO:1205或SEQ ID NO:1206的序列组成。在其中基因工程化细菌编码CXCL10多肽的任何这些实施方式中，可以除去分泌标签并用不同的分泌标签代替。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述CXCL10回路。在一些实施方式中，编码CXCL10的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码CXCL10的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码CXCL10的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到微生物染色体中的一个或多个位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在一些实施方式中，CXCL10是分泌的。在一些实施方式中，包含编码CXCL10的基因序列的基因工程化细菌包含选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。在一些实施方式中，包含用于产生CXCL10的基因序列的基因工程化细菌还包含编码IL-15的基因序列。在一些实施方式中，IL-15是分泌的。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列包含选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一些实施方式中，细菌还包含trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含用于产生色氨酸的基因序列。在一些实施方式中，用于产生色氨酸的基因序列选自trpE，trpD，trpC，trpB，trpA，aroG和SerA。在一些实施方式中，aroG是aroG(aroGfbr)的反馈抗性形式。在一些实施方式中，trpE是trpE的反馈抗性形式(trpEfbr)。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含trpR中的突变或缺失。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含tnaA中的突变或缺失。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码CXCL9的一个或多个拷贝的基因序列。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL9。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL9。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的CXCL9。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的CXCL9。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CXCL9。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将活化的Th1淋巴细胞吸引至至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，15倍，20倍，30倍，40倍，50倍，100倍，500倍或1千倍更高程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞的趋化性至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞的趋化性至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进T细胞趋化至至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更高程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的趋化性至三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更高。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CXCL9的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与CXCR3结合至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与CXCR3结合至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与CXCR3结合至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更高。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述CXCL9回路。在一些实施方式中，编码CXCL9的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码CXCL9的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码CXCL9的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
抑制Th2型细胞因子
细胞因子是负责免疫系统中大多数生物效应的激素信使，并且可以在功能上分为两组：促炎性的和基本上抗炎但促进过敏反应的那些。T淋巴细胞是细胞因子的主要来源。存在两种主要的T淋巴细胞亚群，其特征在于存在称为CD4和CD8的细胞表面分子。表达CD4的T淋巴细胞也称为辅助性T细胞，并且这些被认为是最多产的细胞因子产生者。该亚组可以进一步细分为Th1和Th2，它们产生的细胞因子称为Th1型细胞因子和Th2型细胞因子。
Th2细胞介导针对细胞外寄生虫，细菌，过敏原和毒素的体液或抗体介导的免疫应答的激活和维持。Th2细胞通过产生各种细胞因子介导这些功能，例如IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-13和IL-17E(IL-25)，它们负责强抗体产生，嗜酸性粒细胞活化和抑制几种巨噬细胞功能，从而提供不依赖吞噬细胞的保护性反应。还已知Th2型细胞因子将巨噬细胞极化为M2型(免疫抑制型巨噬细胞)。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种抑制肿瘤中Th2型细胞因子产生的分子的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述Th2型细胞因子抑制环路。在一些实施方式中，编码Th2型细胞因子抑制环的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码Th2型细胞因子抑制环的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码Th2型细胞因子抑制环的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
髓源性抑制细胞功能
越来越多的证据表明，骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)通过抑制T细胞抗肿瘤功能和调节先天免疫反应而促成癌症免疫逃避。在许多癌症中，血液中MDSC数量的增加与晚期和转移性负荷相关。MDSC包含异质的未成熟骨髓细胞群，其特征在于CD11b和Gr-1的共表达，并且在携带肿瘤的小鼠中缺乏成熟巨噬细胞和树突细胞的特征。MDSCs可分为两个不同的亚群，其基因表达谱和免疫抑制活性不同：单核细胞MDSCs(Mo-MDSCs)和多形核(PMN)-MDSC，也称为粒细胞(G)-MDSC(如例如，Chun等，CCL2 Promotes ColorectalCarcinogenesis by Enhancing Polymorphonuclear Myeloid-Derived Suppressor CellPopulation and Function Cell Reports 12,244-257)。这两种类型的MDSC通过不同方式实现免疫抑制：虽然两者都使用精氨酸酶-1作为其抑制活性，但是(PMN)-MDSC产生高水平的ROS并且几乎没有NO(如果有的话)；而Mo-MDSC产生高水平的NO，但很少(如果有的话)ROS。MDSC在癌症中的扩展主要由可溶性癌细胞因子和生长因子驱动，包括但不限于前列腺素，GM-CSF，M-CSF，IL-1β，IL-6，VEGF，TGFβ，IL-10，IL-12，IL-13，IL-17，PGE2和TNF。在大多数情况下，JAK/Stat信号被启动，如Condamine等，2015Annu Rev Med.2015Jan 14；66:97–110.Regulation of Tumor Metastasis by Myeloid-derived Suppressor Cells所述，其内容通过引用整体并入本文。
MDSC抑制的机制包括产生活性氧(ROS)，Arg-1和一氧化氮(NO)。此外，最近的研究表明，由超氧化物与NO反应产生的过氧亚硝酸盐(PNT)可引起T细胞受体-CD8复合物的硝化。这降低了TCR与肽结合的I类MHC结合并阻止CD8+T细胞识别癌细胞的能力。此外，已显示肿瘤微环境中L-精氨酸和半胱氨酸的加速消耗减少CD3ζ链表达，减少IL-2和IFN-γ的产生，并抑制T细胞增殖，Condamine等，2015及其中的参考文献)。一些研究显示了M-MDSC使用各种机制诱导Tregs分化和/或增殖的能力(Condamine等2015及其中的参考文献)。值得注意的是，PMN-MDSC不能促进Treg分化，能够抑制TGF-β诱导的Treg产生或增殖。MDSC还具有将Treg募集到肿瘤部位的能力，并且该能力依赖于CCR5(Condamine等2015及其中的参考文献)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抗癌分子，其抑制肿瘤微环境中MDSC的活化，产生，发展，分化，活性和/或迁移。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抗癌分子，其启动，促进或刺激肿瘤微环境中MDSC的破坏。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制选自M-CSF，IL-1β，IL-6，VEGF，TGFβ，IL-10，IL-13，IL-17，PGE2及其组合的一种或多种细胞因子的抗癌分子。例如，基因工程化微生物可以编码针对选自M-CSF，IL-1β，IL-6，VEGF，TGFβ，IL-10，IL-13，IL-17，PGE2及其组合的细胞因子的抗体，例如，针对一种或多种这些细胞因子的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活，由缺氧条件激活，或由炎性条件激活的启动子，例如由所述条件激活并在此描述的任何启动子的控制下表达一种或多种上述抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达一种或多种上述抗体，例如单链抗体。
吞噬作用逃逸的抑制
CD47-SIRPα途径
癌症具有上调“不要吃我”信号的能力，以允许逃避内源性“吃我”信号，这些信号是作为程序性细胞死亡和程序性细胞去除的一部分诱导的，以促进肿瘤进展。
CD47是涉及细胞迁移和T细胞和树突细胞活化的细胞表面分子。此外，CD47通过结合在吞噬细胞上表达的信号调节蛋白α(SIRPα)起到吞噬作用的抑制剂的作用，导致酪氨酸磷酸酶活化和抑制吞噬细胞突触的亚膜组装位点处的肌球蛋白积累。结果，CD47传达了“不要吃我的信号”。CD47的缺失导致老化或受损细胞的稳态吞噬作用。
在多种人肿瘤类型中观察到升高的CD47表达水平，允许肿瘤通过吞噬吞噬作用逃离先天免疫系统。该过程通过肿瘤细胞上的CD47与吞噬细胞上的SIRPα结合而发生，从而促进吞噬作用和肿瘤存活的抑制。
抗CD47抗体已经在体外和小鼠异种移植模型中证实了针对许多不同人类癌症的临床前活性(Chao等，CurrOpinImmunol。2012年4月；24(2)：225-232。The CD47-SIRPαPathway in Cancer Immune Evasion and Potential Therapeutic Implications，以及其中的参考文献)。除CD47外，SIRPα也可作为治疗策略的靶点；例如，体外施用的抗SIRPα抗体引起巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用(Chao等，2012)。
在第三种方法中，使用人SIRPα的单个14kDaCD47结合结构域(不含跨膜部分的可溶形式)作为人CD47的竞争性拮抗剂开发了CD47靶向疗法(如Weiskopf等，EngineeredSIRPαvariants as immunotherapeutic adjuvants to anti-cancer antibodies；Science.2013Jul 5；341(6141):10.1126/science.1238856，其内容通过引用整体并入本文。因为野生型SIRPα对CD47显示出相对低的亲和力，所以通过酵母表面展示的体外进化产生突变的SIRPα，其显示作为CD47的强结合物和拮抗剂。这些变体包括CV1(共有变体1)和高亲和力变体FD6，以及这些变体的Fc融合蛋白。导致亲和力增加的氨基酸变化位于人SIRPα的d1结构域中。SIRPα变体的非限制性实例也描述于WO/2013/109752中，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生抑制表达于巨噬细胞的CD47和/或抑制SIRPα和/或抑制或防止CD47和SIRPα之间的相互作用的一种或多种抗癌分子。例如，基因工程化微生物可以编码针对CD47的抗体和/或针对SIRPα的抗体，例如针对CD47的单链抗体和/或针对SIRPα的单链抗体。在另一个非限制性实例中，基因工程化微生物可编码包含SIRPαCD47结合结构域的竞争性拮抗剂多肽。这样的竞争性拮抗剂多肽可以通过CD47的竞争性结合的作用，防止CD47与SIRP的相互作用α对巨噬细胞表达。在一些实施方式中，竞争性拮抗剂多肽是可溶的，例如，从微生物分泌。在一些实施方式中，竞争性拮抗剂多肽展示在微生物的表面上。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域的野生型形式。在一些实施方式中，编码竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，所述变体形式是CV1SIRPα变体。在一些实施方式中，变体形式是FD6变体。在一些实施方式中，αSIRP变体是Weiskopf等，和/或国际专利公开WO/2013/109752描述的变体。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码SIRPαCD47结合结构域或其变体融合到稳定多肽。在一些实施方式中，编码所述竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码的野生型形式SIRPαCD47结合结构域融合到稳定多肽。在一个非限制性示例中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是IgG的Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合于野生型αSIRPCD47结合结构域多肽是IgG4的Fc部分。在一些实施方式中，编码竞争性拮抗剂多肽的基因工程化微生物编码与稳定化多肽融合的SIRPαCD47结合结构域的突变或变体形式。在一些实施方式中，融合到稳定多肽变体形式是CV1SIRPα变体。在一些实施方式中，与稳定化多肽融合的变体形式是F6变体。在一些实施方式中，融合到稳定多肽的SIRPα变体是Weiskopf等，和/或国际专利公开WO/2013/109752描述的变体。在一个非限制性示例中，稳定多肽融合到所述变体SIRPαCD47结合结构域多肽是Fc部分。在一些实施方式中，稳定多肽融合到所述变体SIRPαCD47结合结构域多肽是IgG的Fc部分。在一些实施方式中，与变体SIRPαCD47结合域多肽融合的稳定化多肽是IgG4Fc部分。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或突变以改善CD47亲和力)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗-CD47抗体和/或抗-SIRPα，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文描述的任何启动子的控制下表达抗CD47抗体和/或抗SIRPα抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码竞争性拮抗剂SIRPαCD47结合结构域(WT或具有改善的CD47亲和力的突变变体)的一种或多种基因，其在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下。在任何这些实施方式中，基因工程化微生物还可以产生一种或多种能够刺激Fc介导的功能的抗癌分子，例如ADCC，和/或M-CSF和/或GM-CSF，导致阻断吞噬作用抑制。
基因工程化细菌和/或其他微生物可包含编码任何合适的抗CD47抗体，抗SIRPα抗体或竞争性SIRPαCD47结合域多肽(具有改善的CD47结合亲和力的野生型或突变变体)的一种或多种基因用于抑制或预防CD47-SIRPα相互作用。在一些实施方式中，修饰和/或突变抗体(或)或竞争性多肽，例如，以增强稳定性，增加CD47拮抗作用。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生抗体或竞争性多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的情况下，产生抗体或竞争性多肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码B6H12-抗CD47-scFv的抗CD47基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与SEQ ID NO:994至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含SEQ ID NO:994的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码由SEQ ID NO:994组成的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码5F9-抗-CD47-scFv的抗-CD47基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码与选自SEQ ID NO:996的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含SEQ ID NO:996的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码由SEQ ID NO:996组成的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码5F9antihCD47scFv-V5-HIS的抗CD47基因序列。在一些实施方式中，抗CD47scFv序列与选自SEQ ID NO：993和SEQ ID NO:995的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源，不包括非编码区和编码标签的序列。在一些实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:993和SEQ ID NO:995的序列，不包括非编码区和编码标签的序列。在一些实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:993和SEQ ID NO:995的序列组成，不包括非编码区和编码标签的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，所述SIRPα多肽与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119，SEQ ID NO:1120的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SIRPα多肽的基因序列，其具有与选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQID NO：1119，SEQ ID NO:1120的序列约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性，或其功能片段。在另一个实施方式中，SIRPα多肽包含选自SEQ ID NO:1118，SEQ ID NO:1231，SEQ ID NO:1119和SEQ ID NO:1120的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由选自SEQ ID NO:1118，SEQID NO:1231，SEQ ID NO:1119和SEQ ID NO:1120的序列组成。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)，或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的SIRPalpha，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPalpha-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPα变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生分泌的SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα-融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌SIRPα，SIRPalpha变体(例如，CV1或FD6变体)或SIRPα融合蛋白(例如，SIRPalphaIgGFc融合蛋白)的细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比将肿瘤细胞的吞噬作用增加至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的抗CD47scFv。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的抗-CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的抗CD47scFv。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的抗CD47scFv。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌抗CD47scFv的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤细胞的吞噬作用增加至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使肿瘤细胞的吞噬作用增加至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加肿瘤细胞的吞噬作用三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造期间表达，如所述于此。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌和/或其他微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如任何营养缺陷型本领域已知的并且在本文中提供，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌物回路，例如本文所述的任何分泌回路，以及本领域，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述的任何表面展示回路，以及本领域中已知的(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种代谢物的回路(例如，本文所述的犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)一种或多种这些附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
磷脂酰丝氨酸外化
磷脂酰丝氨酸(PS)向质膜外表面的重新分布标志着细胞识别，吞噬作用和吞噬细胞的最终降解(细胞增多症)。此外，表达PS的细胞和免疫细胞之间的相互作用引发免疫抑制途径，其阻止局部和全身免疫激活。尽管这些途径被凋亡细胞用于平息潜在的免疫后遗症以抵抗“自身”，但这些相同的途径被肿瘤劫持以逃避免疫反应。
PS在癌症中失调，并且随着PS受体的上调，在肿瘤微环境中提供有效的免疫抑制。在肿瘤微环境中，促炎和适应性免疫应答被几种表达未成熟肿瘤血管的PS抑制，肿瘤来源的外泌体和肿瘤细胞。此外，结合和摄取PS表达细胞的肿瘤内DC维持不成熟的表型，从而阻止最佳功能性抗原呈递和T细胞应答活化所需的共刺激分子的表达。PS受体，包括受体的TAM和TIM家族，在浸润的骨髓衍生细胞上表达，其中它们在炎症信号传导后起促进组织稳态的作用。在肿瘤微环境中，这些受体与PS或PS桥接分子结合，导致免疫抑制细胞因子的表达和预防有效的抗肿瘤免疫应答。
全身施用膜联蛋白A5(AnxA5)或其他PS配体，PS靶向抗体和靶向PS受体的药物已显示可减缓肿瘤进展(综述于Birge等，Cell Death and Differentiation advanceonline publication 26 February 2016；doi:10.1038/cdd.2016.11Phosphatidylserineis a global immunosuppressive signal in efferocytosis,infectious disease,andcancer)
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制PS和/或抑制PS受体的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码针对PS的抗体和/或针对PS的抗体。受体，例如针对PS的单链抗体和/或针对PS受体的单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗PS抗体和/或抗PS受体抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗PS抗体和/或抗PS受体抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是在由低氧条件激活的启动子控制下表达抗PS抗体和/或抗PS受体抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制通过PS受体的PS信号传导的抗癌分子，例如，基因工程化微生物可编码PS受体拮抗剂，例如拮抗性P5配体。在某些实施方式中，P5受体拮抗剂是膜联蛋白A5。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达拮抗性P5配体的肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达拮抗性P5配体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达拮抗性P5配体。
在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达P5受体和/或抗PS抗体和/或抗PS受体抗体(例如单链抗体)的拮抗配体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子，或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达P5受体和/或抗PS抗体和/或抗PS受体抗体(例如单链抗体)的拮抗配体。
免疫抑制和血管生成和缺氧/HIF调节
新生血管形成对于肿瘤发展至关重要，因为肿瘤必须建立血液供应才能进展。血管生成是肿瘤新血管形成中最突出的步骤。血管生成过程受许多因素调节，这些因子促进或抑制内皮细胞活化。促血管生成因子包括VEGF，成纤维细胞生长因子(FGF)和ANG家族成员。血管抑制分子包括血小板反应蛋白-1，内皮抑素和tumstatin，以及某些CXCL趋化因子。在肿瘤血管生成期间，失调导致促血管生成因子过多，导致不受抑制的发芽和内皮扩张。当这些芽相遇并吻合时出现新的血管，随后血管通过形成基底膜和壁细胞的募集而稳定。
已经清楚的是，免疫细胞起着关键的促血管生成作用，并且至少部分地导致临床上对血管生成抑制剂的短暂反应(Rivera和Bergers，TrendsImmunol。2015年4月；36(4)：240-9。Intertwined regulation of angiogenesis and immunity by myeloid cells)。缺氧肿瘤通过分泌许多细胞因子和生长因子驱动几种先天免疫细胞群的募集和浸润。例如，肿瘤来源的VEGF，CSF-1，MCP-1和SDF1α募集巨噬细胞，G-MDSC和Mo-MDSC；CXCL2募集血管生成中性粒细胞和单核细胞；ANG2募集表达血管生成TIE2的单核细胞/巨噬细胞(TEM)。
在某些实施方式中，本公开提供了工程化微生物，其产生一种或多种抑制以下一种或多种活性的抗癌分子：VEGF，CXCR4/CXCL12，HIF-1α，半乳糖凝集素，Neutropilin和Tie2。
肿瘤细胞分泌的其他细胞因子包括IL-4和IL-6，其诱导浸润性单核细胞分化为血管生成和免疫抑制性巨噬细胞。一旦募集到肿瘤微环境中，MDSCs，TAM，TEM和嗜中性粒细胞分泌或释放螯合的血管生成因子，其中最普遍的是VEGF。VEGF的促血管生成活性主要通过其与内皮细胞上的VEGFR2的相互作用引起。此外，还已知VEGF通过多种机制抑制许多不同类型的免疫细胞。例如，VEGF与CD34+造血祖细胞上的VEGFR1结合，并通过抑制NF-κB信号传导抑制向成熟树突细胞的分化，导致抗原呈递缺陷(Oyama等，J.Immunol。，160(1998)，第1224-1232页；Vascular endothelial growth factor affects dendritic cellmaturation through the inhibition of nuclear factor-kappa)。此外，VEGF还诱导程序性死亡配体1(PDL1)在树突细胞上的表达，抑制T细胞活化和促进自身耐受。此外，VEGF通过限制T细胞与血管腔表面的粘附，抑制T细胞外渗，抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖和细胞毒性，并刺激T调节(Treg)细胞的增殖(例如，Motz,et al.,Nat.Rev.Immunol.,11(2011),pp.702–711；The parallel lives of angiogenesis and immunosuppression:cancer and other tales)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制VEGF的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗VEGF抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗VEGF抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗VEGF抗体，例如单链抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗VEGF抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗VEGF抗体。示例性抗VEGF：重链和轻链包括SEQ ID NO:124和125。
缺氧诱导因子1-α，也称为HIF-1-α是异二聚体的亚基转录因子由缺氧诱导因子1(HIF-1)编码的缺氧诱导因子1(HIF-1)HIF1A基因。已知HIF-1诱导超过60种基因的转录，包括VEGF和促红细胞生成素参与血管生成和红细胞生成，有助于促进和增加氧气输送到缺氧区域。HIF-1还诱导参与的基因转录细胞增殖和生存，以及葡萄糖和铁新陈代谢。HIF-1通过经历构象变化来响应全身氧水平，并且与缺氧响应基因的启动子的HRE区域相关联以诱导转录。
肿瘤微环境中的缺氧是血管生成的关键调节剂。该调节由转录因子的缺氧诱导因子(HIF)家族介导。HIF尤其协调代谢和血管适应低氧。HIF稳定化导致各种促血管生成生长因子和趋化因子(包括VEGF，PIGF和ANG2)的上调，直接导致血管生长以及骨髓衍生的骨髓细胞的募集(C.Murdoch,et al.Blood,104(2004),pp.2224–2234；Mechanisms regulatingthe recruitment of macrophages into hypoxic areas of tumors and otherischemic tissues)。由HIF诱导的VEGF激活内皮细胞并吸引骨髓细胞，促进这些细胞的血管生成特性(Avraham-Davidi，等；J.Exp。Med。，210(2013)，pp.2611-2625)。HIF-1α还诱导FoxP3，即Treg转录主调节因子。FOXP3(叉头盒P3)在其启动子中含有推定的缺氧反应元件，使其表达对HIF-1α活化敏感(Clambey，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,109(2012),pp.E2784–E2793；Hypoxia-inducible factor-1 alpha-dependent induction of FoxP3drives regulatory T-cell abundance and function during inflammatory hypoxiaof the mucosa)。
HIF-1在许多人类癌症中过表达。HIF-1过表达通过其在启动血管生成和调节细胞代谢以克服缺氧中的作用而与促进肿瘤生长和转移密切相关。在研究的大多数实体肿瘤中已经注意到显著的HIF-1表达，包括结肠，乳腺，胰腺，肾，前列腺，卵巢，脑和膀胱癌。临床上，许多癌症中HIF-1a水平升高，包括宫颈癌，非小细胞肺癌，乳腺癌(LV阳性和阴性)，少突神经胶质瘤，口咽癌，卵巢癌，子宫内膜癌，食道癌，头颈癌和胃癌，与侵袭性肿瘤进展有关。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制HIF的抗癌分子，例如HIF-1。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗HIF-1抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗HIF抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗HIF抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗HIF抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达抗HIF抗体，例如单链抗体。在任何这些实施方式中，抗HIF抗体是抗HIF-1抗体。在任何这些实施方式中，抗HIF抗体是抗HIF1-α(抗HIF-1α抗体)。
Semaphorin3A(SEMA3A)是肿瘤中的另一种缺氧诱导因子，其涉及巨噬细胞募集和随后的血管生成。SEMA3A与TAM上的跨膜指导蛋白神经毡蛋白1(NRP1)相互作用，导致VEGFR1活化并迁移到缺氧肿瘤微环境中(Rivera和Bergers，2015)。到达后，NRP1不再表达，导致其迁移表型丧失。然后将TAM重编程为血管生成和免疫抑制表型，并产生免疫抑制和促血管生成因子，包括ARG1，CCL22，IL-10，VEGF，SEMA3A和MMP-9(A.Casazza，等，CancerCell,24(2013),pp.695–709 Impeding macrophage entry into hypoxic tumor areasby Sema3A/Nrp1 signaling blockade inhibits angiogenesis and restoresantitumor immunity)。Neuropilin-1(NRP1)和Neuropilin-2(NRP2)受体是跨膜糖蛋白，主要是用于信号素的共受体，它还可作为某些形式的血管内皮生长因子(VEGF)的受体。例如，VEGF165与NRP1和NRP2结合。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制NRP1，NRP2和/或semaphorin3A的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗NRP1抗体和/或抗NRP2抗体，和/或抗semaphorin3A抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子控制下表达抗NRP1抗体和/或抗NRP2抗体，和/或抗semaphorin3A抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在低氧条件激活的启动子的控制下表达抗-抗NRP1抗体和/或抗NRP2抗体，和/或抗-semaphorin3A抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗NRP1抗体和/或抗NRP2抗体，和/或抗semaphorin3A抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子，或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗NRP1抗体和/或抗NRP2抗体，和/或抗semaphorin3A抗体，例如单链抗体。在任何这些实施方式中，抗体是抗NRP1抗体。
另外，HIF-1α诱导CXCL12(SDF1α)及其受体CXCR4，这两者都与髓样细胞的保留有关。最近的研究为趋化因子受体CXCR4在癌症起始细胞(或癌症干细胞)的维持，传播和随后的转移性定植中的作用提供了强有力的证据(Gil等，J Immunol。2014；193(10)：5327-37；CXCL12/CXCR4 blockade by oncolytic virotherapy inhibits ovarian cancer growthby decreasing immunosuppression and targeting cancer-initiating cells，并参考其中的参考文献)。在卵巢癌中，CXCL12/CXCR4轴介导的信号集中参与进展，因为CXCL12可通过细胞外基质刺激卵巢癌细胞迁移和侵袭。由肿瘤组织和周围基质产生的CXCL12刺激VEGF介导的血管生成和骨髓内皮祖细胞的募集(Gil等，及其中的参考文献)。还显示CXCL12在肿瘤部位募集抑制性骨髓细胞和树突细胞并诱导肿瘤内Treg定位(Gil等，及其中的参考文献)。在Gil等描述的研究中，与卵巢癌模型中单独的溶瘤相比，表达CXCR4拮抗剂的肿瘤转移性扩散的溶瘤痘苗病毒(OVV)和改善的总体存活率(Gil等，JImmunol。201415；193(10)：5327-37；CXCL12/CXCR4 blockade by oncolytic virotherapy inhibits ovariancancer growth by decreasing immunosuppression and targeting cancer-initiatingcells)。该受体在癌细胞中的表达与转移至含有高浓度CXCL12的组织(例如肺，肝和骨髓)有关。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制CXCR4/CXCL12受体/配体结合的抗癌分子。因此，基因工程化细菌产生一种或多种抑制CXCR4和/或CXCL12的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗CXCR4抗体(拮抗性)和/或抗CXCL12抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗CXCR4抗体(拮抗性)和/或抗CXCL12抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达抗CXCR4抗体(拮抗性)和/或抗CXCL12抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗CXCR4抗体(拮抗性)和/或抗CXCL12抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗CXCR4抗体(拮抗性)和/或抗CXCL12抗体，例如单链抗体。在任何这些实施方式中，抗体是抗NRP1抗体。
半乳糖凝集素是至少15种β-半乳糖苷结合蛋白的家族，参与生长发育以及癌症进展和转移。半乳糖凝集素分为三种类型：原型，嵌合体和串联重复。P轮型半乳糖凝集素(半乳糖凝集素-1，-2，-5，-7，-10，-11，-13，-14和-15)每个亚基含有一个碳水化合物识别结构域(CRD)。串联重复型半乳糖凝集素(例如，半乳糖凝集素-4，6，-8，-9和-12)含有通过接头肽连接的两个CRD。Galectin-3是该家族中研究最多的成员，是嵌合型半乳糖凝集素的唯一代表，其在C末端具有一个CRD。半乳糖凝集素-3在许多肿瘤中表达，并且可能在肿瘤进展中起重要作用。最近的研究表明，半乳糖凝集素-3尤其可能具有免疫抑制特性并且可以诱导活化的T细胞的凋亡或者导致缺乏T细胞功能(参见，例如，Ahmed et al.,Clin.Med.Insights Oncol.2015；9:113–121；Galectin-3 as a Potential Target toPrevent Cancer Metastasis)。已显示细胞表面糖蛋白，例如CD29，CD7，CD95，CD98和T细胞受体与半乳糖凝集素-3结合，半乳糖凝集素-3可介导细胞外半乳糖凝集素-3诱导细胞凋亡。例如，细胞外半乳糖凝集素-3与CD29/CD7复合物结合，其触发细胞内凋亡信号级联的激活，随后是线粒体细胞色素c释放和胱天蛋白酶-3的活化(参见Ahmed等，及其中的参考文献)。此外，一些研究表明，galectin-3可促进许多癌症中的肿瘤血管生成和转移。通过减少TGFβ1诱导的TAM的VEGF分泌，破坏半乳糖凝集素-3表达可损害肿瘤血管生成(Machado等，CancerMed。2014年4月；3(2)：201-14。Galectin-3disruption impaired tumoralangiogenesis by reducing VEGF secretion from TGFβ1-induced macrophages)。半乳糖凝集素-1延长VEGF受体2(VEGFR2)的细胞表面保留并刺激VEGF非依赖性肿瘤血管生成。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制半乳糖凝集素-3和/或半乳糖凝集素-1的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗半乳糖凝集素-3抗体和/或抗半乳糖凝集素-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗半乳糖凝集素-3抗体和/或抗半乳糖凝集素-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在低氧条件激活的启动子的控制下表达抗半乳糖凝集素-3抗体和/或抗半乳糖凝集素-1抗体，例如单链抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗半乳糖凝集素-3抗体和/或抗半乳糖凝集素-1抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子，或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗半乳糖凝集素-3抗体和/或抗半乳糖凝集素-1抗体，例如单链抗体。
TIE-1和TIE-2包含结合并被其激活的细胞表面受体血管生成素，Ang1，Ang2，Ang3和Ang4。血管生成素是血管形成所需的蛋白质生长因子(血管生成)。Ang1和Ang4作为Tie2的激动或活化配体起作用，而Ang2和Ang3起竞争性拮抗剂的作用。表达TIE2的单核细胞/巨噬细胞(TEM)是一种高血管生成和免疫抑制性肿瘤浸润巨噬细胞亚群，其表达血管生成素受体TIE2，并且通常通过TIE2配体ANG2的内皮细胞表达与血管并置(TIE2可以结合ANG1导致血管稳定，或TIE2，反对稳定)。TEM的免疫抑制作用是由于它们分泌IL-10的能力，IL-10抑制T细胞活化并刺激Tregs的扩增。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制Tie-2的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗Tie-2抗体和/或抗Ang1抗体和/或抗Ang4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低活化的启动子控制下表达抗Tie-2抗体和/或抗Ang1抗体和/或抗Ang4抗体，例如单链抗体。-氧气条件。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达抗Tie-2抗体，和/或抗Ang1抗体和/或抗Ang4抗体，例如单链抗体，控制由低氧条件激活的启动子。在某些实施方式中，基因工程化细菌在在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗Tie-2抗体和/或抗Ang1抗体和/或抗Ang4抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子，或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达抗Tie-2抗体和/或抗Ang1抗体和/或抗Ang4抗体，例如单链抗体。
VEGFR-2似乎是VEGF诱导的诱变和通透性中最重要的受体。血管生成过程中的受体激活诱导内皮细胞产生血小板活化因子(PAF)，刺激其有丝分裂和迁移，并增加血管通透性。PAF促进有效的血管生成因子和趋化因子的表达，包括酸性成纤维细胞因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和巨噬细胞炎性蛋白2(Hoeben等，Pharmacological Reviewsvol.56no.4 549-580；Vascular Endothelial Growth Factor and Angioge)。
在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种抑制VEGFR-2的抗癌分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是表达抗VEGFR-2抗体的肿瘤靶向细菌，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗VEGFR-2抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件活化的启动子的控制下表达抗VEGFR-2抗体，例如单链抗体。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达抗VEGFR-2抗体，例如单链抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达抗VEGFR-2抗体，例如单链抗体。
基质调制
在许多情况下，肿瘤微环境或基质占据肿瘤块的大部分。肿瘤微环境或基质由动态分类的细胞外基质组分和非肿瘤细胞组成，包括成纤维细胞，血管细胞和免疫细胞，其组成通常在疾病发展的各个阶段发生变化。例如，一些基质可以是非常不均匀的并且包含细胞和无细胞组分，包括例如成纤维细胞，肌成纤维细胞，星状细胞，免疫细胞，血管，细胞外基质(例如，胶原蛋白，纤连蛋白，蛋白多糖和透明质酸，催化活性酶)。，蛋白酶)和可溶性蛋白质，如细胞因子和生长因子。基质对癌细胞产生的各种影响，以及基质中细胞之间复杂的“串扰”(细胞：细胞和细胞：基质相互作用)，对治疗的成功或失败具有显著影响。在许多情况下，基质支持局部侵袭，肿瘤生长，促进远端转移，导致更高的肿瘤等级，并且同时作为药物递送的物理屏障，因此导致较差的总体存活。因此，改变基质组成或功能的分子和方法(例如，肿瘤基质的酶促重塑)可在治疗策略中起重要作用。例如，胰腺导管腺癌(PDA)是最富含基质的癌症之一，并且基质成分常常超过癌细胞。
细胞外基质(ECM)成分的积累可以扭曲肿瘤和基质组织的正常结构，导致血液和淋巴管的异常构型。可能有助于肿瘤治疗抗性的一个因素是ECM的刚性，其显著压缩血管，导致灌注减少(由于扩散和对流的限制)，最终阻碍治疗剂向肿瘤细胞的递送。减少基质中的血管压缩和辅助药物递送的一种策略是酶促分解ECM支架，其在一些基质肿瘤环境中由成纤维细胞，免疫细胞和嵌入密集且复杂的ECM中的内皮细胞组成，具有丰富的透明质酸或透明质酸(HA)。HA是一种大的线性糖胺聚糖(GAG)，由重复的N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸单元组成，由于其高胶体渗透压而保留水。HA在维持组织的结构，完整性和可塑性方面起着重要作用，特别是在胚胎发生和肿瘤发生等动态过程中。据信HA在肿瘤基质形成中起作用。HA中水的保留为健康器官中的结缔组织提供弹性，但当其积聚过量时会增加间质液压并压缩血管，就像许多实体肿瘤一样，例如PDA，前列腺肿瘤，结肠，乳房，胃，卵巢和胰腺。例如，与正常小动脉和毛细血管压力分别为40-80mmHg和15-40mmHg相比，观察到PDA中的组织间液压为75-130mmHg。认为HA通过促进胶原纤维在张力下的束缚而保持刚性。
透明质酸酶(PEGPH20；rHuPH20)的酶促HA降解已被证明可降低小鼠胰腺导管腺癌(PDA)肿瘤中的间质液压，同时观察血管通畅，给药和存活(Provenzano等。Cancer Cell，2012，21：418-429；Thompson等，Mol Cancer Ther，2010，9：3052-64)。据信PEGPH20通过将延伸的聚合物裂解成取代基单元而释放与HA结合的水。被困水的释放将组织间液压降低至20-30mmHg的范围，使得小动脉和毛细血管塌陷(Provenzano等)。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码一种或多种调节基质的分子的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码降解透明质酸或透明质酸(HA)的酶的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码透明质酸酶的一个或多个拷贝的基因序列。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的透明质酸酶。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的透明质酸酶。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的透明质酸没。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比降解0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的透明质酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比降解1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的透明质酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比降解三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的透明质酸。在一个实施方式中，包含一种或多种编码用于分泌的透明质酸酶的基因的基因工程化细菌能够在相同条件下将透明质酸降解至与相同浓度的重组透明质酸酶大约相同的程度。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生透明质酸酶的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种选自SEQ ID NO:1127，SEQ ID NO:1128，SEQ ID NO:1129，SEQ ID NO:1130，SEQ ID NO:1131的多肽的透明质酸酶基因序列或其功能片段。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有与选自SEQ IDNO:1127，SEQ ID NO:1128，SEQ ID NO:1129，SEQ ID NO:1130，SEQ ID NO:1131的多肽或其功能片段至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同一性的一个或多个多肽的基因序列或更多。在一些具体实施方式中，所述多肽包含选自SEQ ID NO:1127，SEQ ID NO:1128，SEQ ID NO:1129，SEQ ID NO:1130，SEQ ID NO:1131的一种或多种多肽。在其他具体实施方式中，多肽由一种或多种选自SEQ ID NO:1127，SEQ ID NO:1128，SEQ IDNO:1129，SEQ ID NO:1130，SEQ ID NO:1131的多肽组成。在某些实施方式中，透明质酸酶序列具有与选自SEQ ID NO:1122，SEQ ID NO:1123，SEQ ID NO:1224，SEQ ID NO:1225，SEQID NO:1226或其功能片段的一种或多种多核苷酸至少约80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一些具体实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:11127，SEQ ID NO:1128，SEQ ID NO:1129，SEQ IDNO:1130，SEQ ID NO:1131的一个或多个序列。在其他具体实施方式中，基因序列由选自SEQID NO:1127，SEQ ID NO:1128，SEQ ID NO:1129，SEQ ID NO:1130，SEQ ID NO:1131的一种或多种多核苷酸组成。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码人透明质酸酶的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，透明质酸酶是水蛭透明质酸酶。在任何这些实施方式中，包含透明质酸酶的基因序列进一步编码选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签位于透明质酸酶多肽序列的N末端和透明质酸酶编码序列的5'末端。在一些实施方式中，分泌标签位于透明质酸酶多肽序列的C末端和透明质酸酶编码序列的3'末端。在一个实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码透明质酸酶用于分泌。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码透明质酸酶以在细菌细胞表面上展示。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述基质调节回路或基因序列，例如透明质酸酶回路。在一些实施方式中，编码基质调节回路的基因序列，例如透明质酸酶回路，由在体内和/或体外由这些条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，任何一种或多种所述基质调节基因序列，例如透明质酸酶基因序列，存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的基质调节，例如透明质酸酶回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于输入生物分子或基质的一种或多种转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的任何分泌回路，否则本领域已知的，(6)一个或多个表面展示回路，例如本文所述和本领域中已知的任何表面展示回路，以及(7)用于产生或降解一个的一个或多个回路。本文所述的更多代谢物(例如犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)(8)一种或多种此类附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还包含用于消耗腺苷的基因序列。在一些实施方式中，用于消耗腺苷的基因序列包含选自add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC的一种或多种基因。在一些实施方式中，用于消耗腺苷的基因序列编码用于输入腺苷的转运蛋白。在一些实施方式中，编码转运蛋白的基因序列包含nupC。在一些实施方式中，编码转运蛋白的基因序列包含nupG。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含编码抗-CD40抗体的基因序列。在一些实施方式中，抗CD40抗体是scFv。在一些实施方式中，分泌抗CD40抗体。在一些实施方式中，抗CD40抗体展示在细胞表面上。
先天免疫应答的激活
裂解肽
由于存在PAMP和DAMP，本发明的细菌本身将导致肿瘤部位的细胞裂解，这将引发先天免疫应答。此外，一些细菌具有裂解微生物的附加特征，具有裂解肿瘤细胞的能力。因此，在一些实施方式中，工程化微生物产生天然或天然裂解肽。在一些实施方式中，可以进一步改造细菌以产生一种或多种细胞毒性分子，例如裂解肽，其具有在递送至肿瘤部位时在肿瘤微环境中局部裂解癌症或肿瘤细胞的能力。在细胞裂解后，肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原，其用于促进适应性免疫应答。PAMP和DAMP的存在促进抗原呈递细胞的成熟，例如树突细胞，其激活抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答。因此，不仅向肿瘤位点递送裂解肽用于局部杀死肿瘤细胞，它还将肿瘤相关抗原和新抗原暴露于抗原呈递细胞，导致免疫介导的抗肿瘤反应。这些新抗原可以在促炎环境中被局部APC摄取，其可以引发针对新抗原的免疫应答，杀死表达抗原的癌细胞，包括未暴露于细菌的远端癌细胞。或病毒。示例性裂解肽描述于国际专利申请PCT/US2017/013072中，其内容通过引用整体并入本文。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒能够产生一种或多种细胞毒素。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒能够产生一种或多种裂解肽分子，例如本文提供的任何细胞毒素和裂解肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种细胞毒素和/或裂解肽，例如本文提供的一种或多种肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达一种或多种细胞毒素和/或裂解肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件活化的启动子的控制下表达一种或多种细胞毒素和/或一种或多种裂解肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达一种或多种细胞毒素和/或一种或多种裂解肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达一种或多种细胞毒素和/或一种或多种裂解肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达一种或多种细胞毒素和/或一种或多种裂解肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码裂解或毒性肽。在一些实施方式中，所述多肽与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，裂解或毒性肽与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ IDNO:126-151中的一个或多个的序列具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，裂解或毒性肽与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，裂解或毒性肽与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ IDNO:126-151中的一个或多个的序列具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，裂解或毒性肽与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，裂解或毒性肽具有与选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，裂解或毒性肽包含选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列。在另一个实施方式中，裂解或毒性肽基因由选自SEQ ID NO:104-107和SEQ ID NO:126-151中的一个或多个的序列组成。
STING激动剂
干扰素基因刺激物(STING)，也称为跨膜蛋白173(TMEM173)，干扰素调节因子3激活介质(MITA)，MPYS或内质网干扰素刺激因子(ERIS)，是一种二聚体蛋白，主要在巨噬细胞，T细胞，树突细胞，内皮细胞和某些成纤维细胞和上皮细胞中表达。STING在先天性免疫反应中起着重要作用-缺乏STING的小鼠虽然在接触各种微生物后容易发生致命性感染但仍然存活。STING以细胞溶质环状二核苷酸(CDN)的形式作为第二信使的细胞溶质受体起作用。在CDN刺激后，STING激活TBK1/IRF3(干扰素调节因子3)，NF-κB和STAT6信号转导途径，从而促进I型干扰素和促炎细胞因子应答。CDNs包括经典的环状二-GMP(c[G(30-50)pG(30-50)p]或环状二-AMP或环状GAMP(cGMP-AMP)(Barber，STING-dependent cytosolic DNAsensing pathways；Trends Immunol.2014 Feb；35(2):88-93)。
CDN可以是外源(即，细菌)和/或内源产生的(即，在暴露于dsDNA时通过宿主酶在宿主内)。STING能够识别各种细菌产生的CDN，这会触发先天免疫信号反应(Ma等，ThecGAS-STING Defense Pathway and Its Counteraction by Viruses；Cell Host&Microbe19,February 10,2016)。此外，STING与cGAS产生的CDN结合，cGAS是一种干扰素诱导蛋白，可产生环GMP-AMP或cGAMP(Cai等，The cGAS-cGAMP-STING Pathway of Cytosolic DNASensing and Signaling；Molecular Cell 54,April 24,2014)。cGAS与dsDNA相互作用并利用GTP和ATP产生能够STING活化的cGAMP。与具有两个经典30-50磷酸二酯键的原核CDN相比，人cGAS产物含有独特的20-50键，产生混合连接环GMP-AMP分子，表示为2'，3'cGAMP(如(Kranzusch等，Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2’,3’cGAMP Signaling；Molecular Cell 59,891–903，2015年9月17日及其中的参考文献)。细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)编码一种名为DncV的酶，它是cGAS的结构同源物，并通过规范的3'-5'键(3'，3'cGAMP)合成相关的第二信使。
干扰素基因(STING)途径的刺激物成分在免疫系统检测肿瘤细胞中起重要作用。在临床前研究中，环状二核苷酸(CDN)，天然存在的或合理设计的合成衍生物，能够促进侵袭性抗肿瘤反应。例如，当与STINGVAX形式的经辐射的GM-CSF分泌的全细胞疫苗共同配制时，合成的CDNs增加了抗肿瘤效力，并且STINGVAX结合PD-1阻断诱导已建立肿瘤的消退(Fu等，STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumorsresistant to PD-1blockade；Sci Transl Med.2015Apr 15；7(283):283ra52)。在另一个例子中，Smith等。进行了一项研究，显示STING激动剂可通过刺激免疫反应来增强CART治疗，从而消除过继转移的淋巴细胞无法识别的肿瘤细胞，从而提高CART细胞治疗的有效性(Smith等，Biopolymers co-delivering engineered T cells and STING agonists caneliminate heterogeneous tumors；J Clin Invest.2017Jun 1；127(6):2176-2191)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其能够产生一种或多种STING激动剂。可以通过本公开的基因工程化细菌产生的STING激动剂的非限制性实例包括2’2’-cGAMP,2’2’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(2’,5’)pA(2’,5’)p]),2’3’-cGAMP,2’3’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(2’,5’)pA(3’,5’)p]),2’3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp),3'3'-cGAMP,3’3’-cGAMP VacciGradeTM(Cyclic[G(3’,5’)pA(3’,5’)p]),c-di-AMP,c-di-AMPVacciGradeTM(Th1/Th2应答的环二腺苷酸单磷酸盐),2'3'-c-di-AMP,2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)(c-di-AMP的双硫代磷酸酯类似物,Rp异构体),2’3’-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)VacciGradeTM,c-di-GMP,c-di-GMP VacciGradeTM,2’3’-c-di-GMP,和c-di-IM。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其包含编码一种或多种酶的基因，用于产生一种或多种STING激动剂。
Cyclic-di-GAMP合酶(cdi-GAMP合酶或cGAS)从一个ATP和一个GTP产生环二-GAMP。在一些实施方式中，酶是c-di-GAMP合酶(cGAS)。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于在EC2.7.7.86中表达酶的基因序列。在一些实施方式中，此类酶是细菌酶。在一些实施方式中，酶是细菌c-di-GMP合酶。在一个实施方式中，细菌c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一些实施方式中，酶是哺乳动物酶。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码人多肽cGAS的基因。
二腺苷酸环化酶从两个ATP分子产生一个分子环二磷酸。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达二乙二醇化环化酶的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于在EC2.7.7.85类中表达酶的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶是细菌二乙酸酯化环化酶。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶是DacA。在一个实施方式中，DacA来自单核细胞增生李斯特氏菌。
其他合适的二腺苷酸环化酶是本领域已知的，包括EggNog数据库(http://eggnogdb.embl.de)中包括的那些。可以由细菌表达的二乙酸酯酶环化酶的非限制性实例包括Megasphaera sp.UPII 135-E(HMPREF1040_0026),Streptococcus anginosus SK52＝DSM 20563(HMPREF9966_0555),Streptococcus mitis bv.2str.SK95(HMPREF9965_1675),Streptococcus infantis SK1076(HMPREF9967_1568),Acetonema longum DSM 6540(ALO_03356),Sporosarcina newyorkensis 2681(HMPREF9372_2277),Listeria monocytogenesstr.Scott A(BN418_2551),Candidatus Arthromitus sp.SFB-mouse-Japan(SFBM_1354),Haloplasma contractile SSD-17B 2seqs HLPCO_01750,HLPCO_08849),Lactobacilluskefiranofaciens ZW3(WANG_0941),Mycoplasma anatis1340(GIG_03148),Streptococcusconstellatus subsp.pharyngis SK1060＝CCUG 46377(HMPREF1042_1168),Streptococcus infantis SK970(HMPREF9954_1628),Paenibacillus mucilaginosusKNP414(YBBP),Nostoc sp.PCC 7120(ALL2996),Mycoplasma columbinum SF7(MCSF7_01321),Lactobacillus ruminis SPM0211(LRU_01199),Candidatus Arthromitussp.SFB-rat-Yit(RATSFB_1182),Clostridium sp.SY8519(CXIVA_02190),Brevibacilluslaterosporus LMG 15441(BRLA_C02240),Weissella koreensis KACC 15510(WKK_01955),Brachyspira intermedia PWS/A(BINT_2204),Bizionia argentinensis JUB59(BZARG_2617),Streptococcus salivarius 57.I(SSAL_01348),Alicyclobacillusacidocaldarius subsp.acidocaldarius Tc-4-1(TC41_3001),Sulfobacillusacidophilus TPY(TPY_0875),Streptococcus pseudopneumoniae IS7493(SPPN_07660),Megasphaera elsdenii DSM 20460(MELS_0883),Streptococcus infantariussubsp.infantarius CJ18(SINF_1263),Blattabacterium sp.(Mastotermesdarwiniensis)str.MADAR(MADAR_511),Blattabacterium sp.(Cryptocercuspunctulatus)str.Cpu(BLBCPU_093),Synechococcus sp.CC9605(SYNCC9605_1630),Thermus sp.CCB_US3_UF1(AEV17224.1),Mycoplasma haemocanis str.Illinois(MHC_04355),Streptococcus macedonicus ACA-DC 198(YBBP),Mycoplasma hyorhinis GDL-1(MYM_0457),Synechococcus elongatus PCC 7942(SYNPCC7942_0263),Synechocystissp.PCC 6803(SLL0505),Chlamydophila pneumoniae CWL029(YBBP),Microcoleuschthonoplastes PCC 7420(MC7420_6818),Persephonella marina EX-H1(PERMA_1676),Desulfitobacterium hafniense Y51(DSY4489),Prochlorococcus marinus str.AS9601(A9601_11971),Flavobacteria bacterium BBFL7(BBFL7_02553),Sphaerochaeta globusstr.Buddy(SPIBUDDY_2293),Sphaerochaeta pleomorpha str.Grapes(SPIGRAPES_2501),Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu50(SAV2163),Streptococcus pyogenes M1GAS(SPY_1036),Synechococcus sp.WH 8109(SH8109_2193),Prochlorococcus marinussubsp.marinus str.CCMP1375(PRO_1104),Prochlorococcus marinus str.MIT 9515(P9515_11821),Prochlorococcus marinus str.MIT 9301(P9301_11981),Prochlorococcus marinus str.NATL1A(NATL1_14891),Listeria monocytogenes EGD-e(LMO2120),Streptococcus pneumoniae TIGR4 2 seqs SPNET_02000368,SP_1561),Streptococcus pneumoniae R6 (SPR1419),Staphylococcus epidermidis RP62A(SERP1764),Staphylococcus epidermidis ATCC 12228(SE_1754),Desulfobacteriumautotrophicum HRM2(HRM2_32880),Desulfotalea psychrophila LSv54(DP1639),Cyanobium sp.PCC 7001(CPCC7001_1029),Chlamydophila pneumoniae TW-183(YBBP),Leptospira interrogans serovar Lai str.56601(LA_3304),Clostridium perfringensATCC 13124(CPF_2660),Thermosynechococcus elongatus BP-1(TLR1762),Bacillusanthracis str.Ames(BA_0155),Clostridium thermocellum ATCC 27405(CTHE_1166),Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC 8293(LEUM_1568),Oenococcusoeni PSU-1(OEOE_1656),Trichodesmium erythraeum IMS101(TERY_2433),Tannerellaforsythia ATCC 43037(BFO_1347),Sulfurihydrogenibium azorense Az-Fu1(SULAZ_1626),Candidatus Koribacter versatilis Ellin345(ACID345_0278),Desulfovibrioalaskensis G20(DDE_1515),Carnobacterium sp.17-4(YBBP),Streptococcus mutansUA159(SMU_1428C),Mycoplasma agalactiae(MAG3060),Streptococcus agalactiaeNEM316(GBS0902),Clostridium tetani E88(CTC_02549),Ruminococcuschampanellensis 18P13(RUM_14470),Croceibacter atlanticus HTCC2559(CA2559_13513),Streptococcus uberis 0140J(SUB1092),Chlamydophila abortus S26/3(CAB642),Lactobacillus plantarum WCFS1(LP_0818),Oceanobacillus iheyensisHTE831(OB0230),Synechococcus sp.RS9916(RS9916_31367),Synechococcus sp.RS9917(RS9917_00967),Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168(YBBP),Aquifexaeolicus VF5(AQ_1467),Borrelia burgdorferi B31(BB_0008),Enterococcus faecalisV583(EF_2157),Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482(BT_3647),Bacillus cereusATCC 14579(BC_0186),Chlamydophila caviae GPIC(CCA_00671),Synechococcussp.CB0101(SCB01_010100000902),Synechococcus sp.CB0205(SCB02_010100012692),Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076(ACID_1909),Geobacillus kaustophilusHTA426(GK0152),Verrucomicrobium spinosum DSM 4136(VSPID_010100022530),Anabaena variabilis ATCC 29413(AVA_0913),Porphyromonas gingivalis W83(PG_1588),Chlamydia muridarum Nigg(TC_0280),Deinococcus radiodurans R1(DR_0007),Geobacter sulfurreducens PCA 2 seqs GSU1807,GSU0868),Mycoplasma arthritidis158L3-1(MARTH_ORF527),Mycoplasma genitalium G37(MG105),Treponema denticolaATCC 35405(TDE_1909),Treponema pallidum subsp.pallidum str.Nichols(TP_0826),butyrate-producing bacterium SS3/4(CK3_23050),Carboxydothermushydrogenoformans Z-2901(CHY_2015),Ruminococcus albus 8(CUS_5386),Streptococcus mitis NCTC 12261(SM12261_1151),Gloeobacter violaceus PCC 7421(GLL0109),Lactobacillus johnsonii NCC 533(LJ_0892),Exiguobacterium sibiricum255-15(EXIG_0138),Mycoplasma hyopneumoniae J(MHJ_0485),Mycoplasma synoviae 53(MS53_0498),Thermus thermophilus HB27(TT_C1660),Onion yellows phytoplasmaOY-M(PAM_584),Streptococcus thermophilus LMG 18311(OSSG),CandidatusProtochlamydia amoebophila UWE25(PC1633),Chlamydophila felis Fe/C-56(CF0340),Bdellovibrio bacteriovorus HD100(BD1929),Prevotella ruminicola 23(PRU_2261),Moorella thermoacetica ATCC 39073(MOTH_2248),Leptospira interrogans serovarCopenhageni str.Fiocruz L1-130(LIC_10844),Mycoplasma mobile 163K(MMOB4550),Synechococcus elongatus PCC 6301(SYC1250_C),Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406(CHU_3222),Geobacter metallireducens GS-15 2 seqs GMET_1888,GMET_1168),Bacillus halodurans C-125(BH0265),Bacteroides fragilis NCTC 9343(BF0397),Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX(YBBP),Clostridium acetobutylicum ATCC 824(CA_C3079),Clostridium difficile 630(CD0110),Lactobacillus acidophilus NCFM(LBA0714),Lactococcus lactis subsp.lactis Il1403(YEDA),Listeria innocuaClip11262(LIN2225),Mycoplasma penetrans HF-2(MYPE2120),Mycoplasma pulmonisUAB CTIP(MYPU_4070),Thermoanaerobacter tengcongensis MB4(TTE2209),Pediococcuspentosaceus ATCC 25745(PEPE_0475),Bacillus licheniformis DSM 13＝ATCC 14580 2seqs YBBP,BL02701),Staphylococcus haemolyticus JCSC1435(SH0877),Desulfuromonas acetoxidans DSM 684(DACE_0543),Thermodesulfovibrioyellowstonii DSM 11347(THEYE_A0044),Mycoplasma bovis PG45(MBOVPG45_0394),Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C(ADEH_1497),Clostridium beijerinckii NCIMB8052(CBEI_0200),Borrelia garinii PBi(BG0008),Symbiobacterium thermophilum IAM14863(STH192),Alkaliphilus metalliredigens QYMF(AMET_4313),Thermusthermophilus HB8(TTHA0323),Coprothermobacter proteolyticus DSM 5265(COPRO5265_1086),Thermomicrobium roseum DSM 5159(TRD_0688),Salinibacter ruberDSM 13855(SRU_1946),Dokdonia donghaensis MED134(MED134_03354),Polaribacterirgensii 23-P(PI23P_01632),Psychroflexus torquis ATCC 700755(P700755_02202),Robiginitalea biformata HTCC2501(RB2501_10597),Polaribacter sp.MED152(MED152_11519),Maribacter sp.HTCC2170(FB2170_01652),Microscilla marina ATCC 23134(M23134_07024),Lyngbya sp.PCC 8106(L8106_18951),Nodularia spumigena CCY9414(N9414_23393),Synechococcus sp.BL107(BL107_11781),Bacillus sp.NRRL B-14911(B14911_19485),Lentisphaera araneosa HTCC2155(LNTAR_18800),Lactobacillussakei subsp.sakei 23K(LCA_1359),Mariprofundus ferrooxydans PV-1(SPV1_13417),Borrelia hermsii DAH(BH0008),Borrelia turicatae 91E135(BT0008),Bacillusweihenstephanensis KBAB4(BCERKBAB4_0149),Bacillus cytotoxicus NVH 391-98(BCER98_0148),Bacillus pumilus SAFR-032(YBBP),Geobacter sp.FRC-32 2 seqsGEOB_2309,GEOB_3421),Herpetosiphon aurantiacus DSM 785(HAUR_3416),Synechococcus sp.RCC307(SYNRCC307_0791),Synechococcus sp.CC9902(SYNCC9902_1392),Deinococcus geothermalis DSM 11300(DGEO_0135),Synechococcus sp.PCC 7002(SYNPCC7002_A0098),Synechococcus sp.WH 7803(SYNWH7803_1532),Pedosphaeraparvula Ellin514(CFLAV_PD5552),Synechococcus sp.JA-3-3Ab(CYA_2894),Synechococcus sp.JA-2-3Ba(2-13)(CYB_1645),Aster yellows witches-broomphytoplasma AYWB(AYWB_243),Paenibacillus sp.JDR-2(PJDR2_5631),Chloroflexusaurantiacus J-10-fl(CAUR_1577),Lactobacillus gasseri ATCC 33323(LGAS_1288),Bacillus amyloliquefaciens FZB42(YBBP),Chloroflexus aggregans DSM 9485(CAGG_2337),Acaryochloris marina MBIC11017(AM1_0413),Blattabacterium sp.(Blattellagermanica)str.Bge(BLBBGE_101),Simkania negevensis Z(YBBP),Chlamydophilapecorum E58(G5S_1046),Chlamydophila psittaci 6BC 2 seqs CPSIT_0714,G5O_0707),Carnobacterium sp.AT7(CAT7_06573),Finegoldia magna ATCC 29328(FMG_1225),Syntrophomonas wolfei subsp.wolfei str.Goettingen(SWOL_2103),Syntrophobacterfumaroxidans MPOB(SFUM_3455),Pelobacter carbinolicus DSM 2380(PCAR_0999),Pelobacter propionicus DSM 2379 2 seqs PPRO_2640,PPRO_2254),Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223(TETH39_0457),Victivallisvadensis ATCC BAA-548(VVAD_PD2437),Staphylococcus saprophyticussubsp.saprophyticus ATCC 15305(SSP0722),Bacillus coagulans 36D1(BCOA_1105),Mycoplasma hominis ATCC 23114(MHO_0510),Lactobacillus reuteri 100-23(LREU23DRAFT_3463),Desulfotomaculum reducens MI-1(DRED_0292),Leuconostoccitreum KM20(LCK_01297),Paenibacillus polymyxa E681(PPE_04217),Akkermansiamuciniphila ATCC BAA-835(AMUC_0400),Alkaliphilus oremlandii OhILAs(CLOS_2417),Geobacter uraniireducens Rf4 2 seqs GURA_1367,GURA_2732),Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903(CSAC_1183),Pyramidobacterpiscolens W5455(HMPREF7215_0074),Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis L550(LBL_0913),Roseiflexus sp.RS-1(ROSERS_1145),Clostridiumphytofermentans ISDg(CPHY_3551),Brevibacillus brevis NBRC 100599(BBR47_02670),Exiguobacterium sp.AT1b(EAT1B_1593),Lactobacillus salivarius UCC118(LSL_1146),Lawsonia intracellularis PHE/MN1-00(LI0190),Streptococcus mitis B6(SMI_1552),Pelotomaculum thermopropionicum SI(PTH_0536),Streptococcuspneumoniae D39(SPD_1392),Candidatus Phytoplasma mali(ATP_00312),Gemmatimonasaurantiaca T-27(GAU_1394),Hydrogenobaculum sp.Y04AAS1(HY04AAS1_0006),Roseiflexus castenholzii DSM 13941(RCAS_3986),Listeria welshimeri serovar 6bstr.SLCC5334(LWE2139),Clostridium novyi NT(NT01CX_1162),Lactobacillus brevisATCC 367(LVIS_0684),Bacillus sp.B14905(BB14905_08668),Algoriphagus sp.PR1(ALPR1_16059),Streptococcus sanguinis SK36(SSA_0802),Borrelia afzelii PKo 2seqs BAPKO_0007,AEL69242.1),Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC11842(LDB0651),Streptococcus suis 05ZYH33(SSU05_1470),Kordia algicida OT-1(KAOT1_10521),Pedobacter sp.BAL39(PBAL39_03944),Flavobacteriales bacteriumALC-1(FBALC1_04077),Cyanothece sp.CCY0110(CY0110_30633),Plesiocystis pacificaSIR-1(PPSIR1_10140),Clostridium cellulolyticum H10(CCEL_1201),Cyanothecesp.PCC 7425(CYAN7425_4701),Staphylococcus carnosus subsp.carnosus TM300(SCA_1665),Bacillus pseudofirmus OF4(YBBP),Leeuwenhoekiella blandensis MED217(MED217_04352),Geobacter lovleyi SZ 2 seqs GLOV_3055,GLOV_2524),Streptococcusequi subsp.zooepidemicus(SEZ_1213),Thermosinus carboxydivorans Nor1(TCARDRAFT_1045),Geobacter bemidjiensis Bem(GBEM_0895),Anaeromyxobactersp.Fw109-5(ANAE109_2336),Lactobacillus helveticus DPC 4571(LHV_0757),Bacillussp.m3-13(BM3-1_010100010851),Gramella forsetii KT0803(GFO_0428),Ruminococcusobeum ATCC 29174(RUMOBE_03597),Ruminococcus torques ATCC 27756(RUMTOR_00870),Dorea formicigenerans ATCC 27755(DORFOR_00204),Dorea longicatena DSM 13814(DORLON_01744),Eubacterium ventriosum ATCC 27560(EUBVEN_01080),Desulfovibriopiger ATCC 29098(DESPIG_01592),Parvimonas micra ATCC 33270(PEPMIC_01312),Pseudoflavonifractor capillosus ATCC 29799(BACCAP_01950),Clostridium scindensATCC 35704(CLOSCI_02389),Eubacterium hallii DSM 3353(EUBHAL_01228),Ruminococcus gnavus ATCC 29149(RUMGNA_03537),Subdoligranulum variabile DSM15176(SUBVAR_05177),Coprococcus eutactus ATCC 27759(COPEUT_01499),Bacteroidesovatus ATCC 8483(BACOVA_03480),Parabacteroides merdae ATCC 43184(PARMER_03434),Faecalibacterium prausnitzii A2-165(FAEPRAA2165_01954),Clostridiumsp.L2-50(CLOL250_00341),Anaerostipes caccae DSM 14662(ANACAC_00219),Bacteroides caccae ATCC 43185(BACCAC_03225),Clostridium bolteae ATCC BAA-613(CLOBOL_04759),Borrelia duttonii Ly(BDU_14),Cyanothece sp.PCC 8801(PCC8801_0127),Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363(LLMG_0448),Geobacillusthermodenitrificans NG80-2(GTNG_0149),Epulopiscium sp.N.t.morphotype B(EPULO_010100003839),Lactococcus garvieae Lg2(LCGL_0304),Clostridium leptum DSM 753(CLOLEP_03097),Clostridium spiroforme DSM 1552(CLOSPI_01608),Eubacteriumdolichum DSM 3991(EUBDOL_00188),Clostridium kluyveri DSM 555(CKL_0313),Porphyromonas gingivalis ATCC 33277(PGN_0523),Bacteroides vulgatus ATCC 8482(BVU_0518),Parabacteroides distasonis ATCC 8503(BDI_3368),Staphylococcushominis subsp.hominis C80(HMPREF0798_01968),Staphylococcus caprae C87(HMPREF0786_02373),Streptococcus sp.C150(HMPREF0848_00423),Sulfurihydrogenibium sp.YO3AOP1(SYO3AOP1_0110),Desulfatibacillum alkenivoransAK-01(DALK_0397),Bacillus selenitireducens MLS10(BSEL_0372),Cyanothecesp.ATCC 51142(CCE_1350),Lactobacillus jensenii 1153(LBJG_01645),Acholeplasmalaidlawii PG-8A(ACL_1368),Bacillus coahuilensis m4-4(BCOAM_010100001120),Geobacter sp.M18 2 seqs GM18_0792,GM18_2516),Lysinibacillus sphaericus C3-41(BSPH_4568),Clostridium botulinum NCTC 2916(CBN_3506),Clostridium botulinum Cstr.Eklund(CBC_A1575),Alistipes putredinis DSM 17216(ALIPUT_00190),Anaerofustis stercorihominis DSM 17244(ANASTE_01539),Anaerotruncuscolihominis DSM 17241(ANACOL_02706),Clostridium bartlettii DSM 16795(CLOBAR_00759),Clostridium ramosum DSM 1402(CLORAM_01482),Borrelia valaisiana VS116(BVAVS116_0007),Sorangium cellulosum So ce 56(SCE7623),Microcystis aeruginosaNIES-843(MAE_25390),Bacteroides stercoris ATCC 43183(BACSTE_02634),CandidatusAmoebophilus asiaticus 5a2(AASI_0652),Leptospira biflexa serovar Patoc strainPatoc 1(Paris)(LEPBI_I0735),Clostridium sp.7_2_43FAA(CSBG_00101),Desulfovibrio sp.3_1_syn3(HMPREF0326_02254),Ruminococcus sp.5_1_39BFAA(RSAG_02135),Clostridiales bacterium 1_7_47FAA(CBFG_00347),Bacteroides fragilis 3_1_12(BFAG_02578),Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF(NTHER_0240),Macrococcus caseolyticus JCSC5402(MCCL_0321),Streptococcus gordoniistr.Challis substr.CH1(SGO_0887),Dethiosulfovibrio peptidovorans DSM 11002(DPEP_2062),Coprobacillus sp.29_1(HMPREF9488_03448),Bacteroides coprocola DSM17136(BACCOP_03665),Coprococcus comes ATCC 27758(COPCOM_02178),Geobacillussp.WCH70(GWCH70_0156),uncultured Termite group 1 bacterium phylotype Rs-D17(TGRD_209),Dyadobacter fermentans DSM 18053(DFER_0224),Bacteroidesintestinalis DSM 17393(BACINT_00700),Ruminococcus lactaris ATCC 29176(RUMLAC_01257),Blautia hydrogenotrophica DSM 10507(RUMHYD_01218),CandidatusDesulforudis audaxviator MP104C(DAUD_1932),Marvinbryantia formatexigens DSM14469(BRYFOR_07410),Sphaerobacter thermophilus DSM 20745(STHE_1601),Veillonella parvula DSM 2008(VPAR_0292),Methylacidiphilum infernorum V4(MINF_1897),Paenibacillus sp.Y412MC10(GYMC10_5701),Bacteroides finegoldii DSM 17565(BACFIN_07732),Bacteroides eggerthii DSM 20697(BACEGG_03561),Bacteroidespectinophilus ATCC 43243(BACPEC_02936),Bacteroides plebeius DSM 17135(BACPLE_00693),Desulfohalobium retbaense DSM 5692(DRET_1725),Desulfotomaculumacetoxidans DSM 771(DTOX_0604),Pedobacter heparinus DSM 2366(PHEP_3664),Chitinophaga pinensis DSM 2588(CPIN_5466),Flavobacteria bacterium MS024-2A(FLAV2ADRAFT_0090),Flavobacteria bacterium MS024-3C(FLAV3CDRAFT_0851),Mooreaproducta 3L(LYNGBM3L_14400),Anoxybacillus flavithermus WK1 (AFLV_0149),Mycoplasma fermentans PG18(MBIO_0474),Chthoniobacter flavus Ellin428(CFE428DRAFT_3031),Cyanothece sp.PCC 7822(CYAN7822_1152),Borrelia spielmaniiA14S(BSPA14S_0009),Heliobacterium modesticaldum Ice1(HM1_1522),Thermusaquaticus Y51MC23(TAQDRAFT_3938),Clostridium sticklandii DSM 519(CLOST_0484),Tepidanaerobacter sp.Re1(TEPRE1_0323),Clostridium hiranonis DSM 13275(CLOHIR_00003),Mitsuokella multacida DSM 20544(MITSMUL_03479),Haliangium ochraceumDSM 14365(HOCH_3550),Spirosoma linguale DSM 74(SLIN_2673),unidentifiedeubacterium SCB49(SCB49_03679),Acetivibrio cellulolyticus CD2(ACELC_020100013845),Lactobacillus buchneri NRRL B-30929(LBUC_1299),Butyrivibriocrossotus DSM 2876(BUTYVIB_02056),Candidatus Azobacteroidespseudotrichonymphae genomovar.CFP2(CFPG_066),Mycoplasma crocodyli MP145(MCRO_0385),Arthrospira maxima CS-328(AMAXDRAFT_4184),Eubacterium eligens ATCC27750(EUBELI_01626),Butyrivibrio proteoclasticus B316(BPR_I2587),Chloroherpeton thalassium ATCC 35110(CTHA_1340),Eubacterium biforme DSM 3989(EUBIFOR_01794),Rhodothermus marinus DSM 4252(RMAR_0146),Borrelia bissettiiDN127(BBIDN127_0008),Capnocytophaga ochracea DSM 7271(COCH_2107),Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.acidocaldarius DSM 446(AACI_2672),Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725(ATHE_0361),Denitrovibrio acetiphilus DSM12809(DACET_1298),Desulfovibrio desulfuricans subsp.desulfuricans str.ATCC27774(DDES_1715),Anaerococcus lactolyticus ATCC 51172(HMPREF0072_1645),Anaerococcus tetradius ATCC 35098(HMPREF0077_0902),Finegoldia magna ATCC53516(HMPREF0391_10377),Lactobacillus antri DSM 16041(YBBP),Lactobacillusbuchneri ATCC 11577(HMPREF0497_2752),Lactobacillus ultunensis DSM 16047(HMPREF0548_0745),Lactobacillus vaginalis ATCC 49540(HMPREF0549_0766),Listeria grayi DSM 20601(HMPREF0556_11652),Sphingobacterium spiritivorum ATCC33861(HMPREF0766_11787),Staphylococcus epidermidis M23864:W1(HMPREF0793_0092),Streptococcus equinus ATCC 9812(HMPREF0819_0812),Desulfomicrobiumbaculatum DSM 4028(DBAC_0255),Thermanaerovibrio acidaminovorans DSM 6589(TACI_0837),Thermobaculum terrenum ATCC BAA-798(TTER_1817),Anaerococcusprevotii DSM 20548(APRE_0370),Desulfovibrio salexigens DSM 2638(DESAL_1795),Brachyspira murdochii DSM 12563(BMUR_2186),Meiothermus silvanus DSM 9946(MESIL_0161),Bacillus cereus Rock4-18(BCERE0024_1410),Cylindrospermopsisraciborskii CS-505(CRC_01921),Raphidiopsis brookii D9(CRD_01188),Clostridiumcarboxidivorans P7 2 seqs CLCAR_0016,CCARBDRAFT_4266),Clostridium botulinumE1 str.BoNT E Beluga(CLO_3490),Blautia hansenii DSM 20583(BLAHAN_07155),Prevotella copri DSM 18205(PREVCOP_04867),Clostridium methylpentosum DSM 5476(CLOSTMETH_00084),Lactobacillus casei BL23(LCABL_11800),Bacillus megateriumQM B1551(BMQ_0195),Treponema primitia ZAS-2(TREPR_1936),Treponemaazotonutricium ZAS-9(TREAZ_0147),Holdemania filiformis DSM 12042(HOLDEFILI_03810),Filifactor alocis ATCC 35896(HMPREF0389_00366),Gemella haemolysansATCC 10379(GEMHA0001_0912),Selenomonas sputigena ATCC 35185(SELSP_1610),Veillonella dispar ATCC 17748(VEIDISOL_01845),Deinococcus deserti VCD115(DEIDE_19700),Bacteroides coprophilus DSM 18228(BACCOPRO_00159),Nostocazollae 0708(AAZO_4735),Erysipelotrichaceae bacterium 5_2_54FAA(HMPREF0863_02273),Ruminococcaceae bacterium D16(HMPREF0866_01061),Prevotella biviaJCVIHMP010(HMPREF0648_0338),Prevotella melaninogenica ATCC 25845(HMPREF0659_A6212),Porphyromonas endodontalis ATCC 35406(POREN0001_0251),Capnocytophagasputigena ATCC 33612(CAPSP0001_0727),Capnocytophaga gingivalisATCC 33624(CAPGI0001_1936),Clostridium hylemonae DSM 15053(CLOHYLEM_04631),Thermosediminibacter oceani DSM 16646(TOCE_1970),Dethiobacter alkaliphilusAHT 1(DEALDRAFT_0231),Desulfonatronospira thiodismutans ASO3-1(DTHIO_PD2806),Clostridium sp.D5(HMPREF0240_03780),Anaerococcus hydrogenalis DSM 7454(ANHYDRO_01144),Kyrpidia tusciae DSM 2912(BTUS_0196),Gemella haemolysans M341(HMPREF0428_01429),Gemella morbillorum M424(HMPREF0432_01346),Gemellasanguinis M325(HMPREF0433_01225),Prevotella oris C735(HMPREF0665_01741),Streptococcus sp.M143(HMPREF0850_00109),Streptococcus sp.M334(HMPREF0851_01652),Bilophila wadsworthia 3_1_6(HMPREF0179_00899),Brachyspirahyodysenteriae WA1(BHWA1_01167),Enterococcus gallinarum EG2(EGBG_00820),Enterococcus casseliflavus EC20(ECBG_00827),Enterococcus faecium C68(EFXG_01665),Syntrophus aciditrophicus SB(SYN_02762),Lactobacillus rhamnosus GG 2seqs OSSG,LRHM_0937),Acidaminococcus intestini RyC-MR95(ACIN_2069),Mycoplasmaconjunctivae HRC/581(MCJ_002940),Halanaerobium praevalens DSM 2228(HPRAE_1647),Aminobacterium colombiense DSM 12261(AMICO_0737),Clostridiumcellulovorans 743B(CLOCEL_3678),Desulfovibrio magneticus RS-1(DMR_25720),Spirochaeta smaragdinae DSM 11293(SPIRS_1647),Bacteroidetes oral taxon 274str.F0058(HMPREF0156_01826),Lachnospiraceae oraltaxon 107 str.F0167(HMPREF0491_01238),Lactobacillus coleohominis 101-4-CHN(HMPREF0501_01094),Lactobacillus jensenii 27-2-CHN(HMPREF0525_00616),Prevotella buccae D17(HMPREF0649_02043),Prevotella sp.oral taxon 299 str.F0039(HMPREF0669_01041),Prevotella sp.oral taxon 317 str.F0108(HMPREF0670_02550),Desulfobulbuspropionicus DSM 2032 2 seqs DESPR_2503,DESPR_1053),Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum DSM 571(TTHE_0484),Thermoanaerobacter italicus Ab9(THIT_1921),Thermovirga lienii DSM 17291(TLIE_0759),Aminomonas paucivoransDSM 12260(APAU_1274),Streptococcus mitis SK321(SMSK321_0127),Streptococcusmitis SK597(SMSK597_0417),Roseburia hominis A2-183(RHOM_12405),Oribacteriumsinus F0268(HMPREF6123_0887),Prevotella bergensis DSM 17361(HMPREF0645_2701),Selenomonas noxia ATCC 43541(YBBP),Weissella paramesenteroides ATCC 33313(HMPREF0877_0011),Lactobacillus amylolyticus DSM 11664(HMPREF0493_1017),Bacteroides sp.D20(HMPREF0969_02087),Clostridium papyrosolvens DSM 2782(CPAP_3968),Desulfurivibrio alkaliphilus AHT2(DAAHT2_0445),Acidaminococcusfermentans DSM 20731(ACFER_0601),Abiotrophia defectiva ATCC 49176(GCWU000182_00063),Anaerobaculum hydrogeniformans ATCC BAA-1850(HMPREF1705_01115),Catonella morbi ATCC 51271(GCWU000282_00629),Clostridium botulinum D str.1873(CLG_B1859),Dialister invisus DSM 15470(GCWU000321_01906),Fibrobactersuccinogenes subsp.succinogenes S85 2 seqs FSU_0028,FISUC_2776),Desulfovibriofructosovorans JJ(DESFRDRAFT_2879),Peptostreptococcus stomatis DSM 17678(HMPREF0634_0727),Staphylococcus warneri L37603(STAWA0001_0094),Treponemavincentii ATCC 35580(TREVI0001_1289),Porphyromonas uenonis 60-3(PORUE0001_0199),Peptostreptococcus anaerobius 653-L(HMPREF0631_1228),Peptoniphiluslacrimalis 315-B(HMPREF0628_0762),Candidatus Phytoplasma australiense(PA0090),Prochlorococcus marinus subsp.pastoris str.CCMP1986(PMM1091),Synechococcus sp.WH 7805(WH7805_04441),Blattabacterium sp.(Periplanetaamericana)str.BPLAN(BPLAN_534),Caldicellulosiruptor obsidiansis OB47(COB47_0325),Oribacterium sp.oral taxon 078 str.F0262(GCWU000341_01365),Hydrogenobacter thermophilus TK-6 2 seqs ADO46034.1,HTH_1665),Clostridiumsaccharolyticum WM1(CLOSA_1248),Prevotella sp.oral taxon 472 str.F0295(HMPREF6745_1617),Paenibacillus sp.oral taxon 786 str.D14(POTG_03822),Roseburia inulinivorans DSM 16841 2 seqs ROSEINA2194_02614,ROSEINA2194_02613),Granulicatella elegans ATCC 700633(HMPREF0446_01381),Prevotellatannerae ATCC 51259(GCWU000325_02844),Shuttleworthia satelles DSM 14600(GCWU000342_01722),Phascolarctobacterium succinatutens YIT 12067(HMPREF9443_01522),Clostridium butyricum E4 str.BoNT E BL5262(CLP_3980),Caldicellulosiruptor hydrothermalis 108(CALHY_2287),Caldicellulosiruptorkristjanssonii 177R1B(CALKR_0314),Caldicellulosiruptor owensensis OL(CALOW_0228),Eubacterium cellulosolvens 6(EUBCEDRAFT_1150),Geobacillusthermoglucosidasius C56-YS93(GEOTH_0175),Thermincola potens JR(THERJR_0376),Nostoc punctiforme PCC 73102(NPUN_F5990),Granulicatella adiacens ATCC 49175(YBBP),Selenomonas flueggei ATCC 43531(HMPREF0908_1366),Thermocrinis albusDSM 14484(THAL_0234),Deferribacter desulfuricans SSM1(DEFDS_1031),Ruminococcus flavefaciens FD-1(RFLAF_010100012444),Desulfovibriodesulfuricans ND132(DND132_0877),Clostridium lentocellum DSM 5427(CLOLE_3370),Desulfovibrio aespoeensis Aspo-2(DAES_1257),Syntrophothermuslipocalidus DSM 12680(SLIP_2139),Marivirga tractuosa DSM 4126(FTRAC_3720),Desulfarculus baarsii DSM 2075(DEBA_0764),Synechococcus sp.CC9311(SYNC_1030),Thermaerobacter marianensis DSM 12885(TMAR_0236),Desulfovibrio sp.FW1012B(DFW101_0480),Jonquetella anthropi E3_33 E1(GCWU000246_01523),Syntrophobotulus glycolicus DSM 8271(SGLY_0483),Thermovibrio ammonificans HB-1(THEAM_0892),Truepera radiovictrix DSM 17093(TRAD_1704),Bacilluscellulosilyticus DSM 2522(BCELL_0170),Prevotella veroralis F0319(HMPREF0973_02947),Erysipelothrix rhusiopathiae str.Fujisawa(ERH_0115),Desulfurispirillumindicum S5(SELIN_2326),Cyanothece sp.PCC 7424(PCC7424_0843),Anaerococcusvaginalis ATCC 51170(YBBP),Aerococcus viridans ATCC 11563(YBBP),Streptococcusoralis ATCC 35037 2 seqs HMPREF8579_1682,SMSK23_1115),Zunongwangia profundaSM-A87(ZPR_0978),Halanaerobium hydrogeniformans(HALSA_1882),Bacteroidesxylanisolvens XB1A(BXY_29650),Ruminococcus torques L2-14(RTO_16490),Ruminococcus obeum A2-162(CK5_33600),Eubacterium rectale DSM 17629(EUR_24910),Faecalibacterium prausnitzii SL3/3(FPR_27630),Ruminococcus sp.SR1/5(CK1_39330),Lachnospiraceae bacterium 3_1_57FAA_CT1(HMPREF0994_01490),Lachnospiraceae bacterium 9_1_43BFAA(HMPREF0987_01591),Lachnospiraceaebacterium 1_4_56FAA(HMPREF0988_01806),Erysipelotrichaceae bacterium 3_1_53(HMPREF0983_01328),Ethanoligenens harbinense YUAN-3(ETHHA_1605),Streptococcusdysgalactiae subsp.dysgalactiae ATCC 27957(SDD27957_06215),Spirochaetathermophila DSM 6192(STHERM_C18370),Bacillus sp.2_A_57_CT2(HMPREF1013_05449),Bacillus clausii KSM-K16(ABC0241),Thermodesulfatator indicus DSM 15286(THEIN_0076),Bacteroides salanitronis DSM 18170(BACSA_1486),Oceanithermus profundusDSM 14977(OCEPR_2178),Prevotella timonensis CRIS 5C-B1(HMPREF9019_2028),Prevotella buccalis ATCC 35310(HMPREF0650_0675),Prevotella amnii CRIS 21A-A(HMPREF9018_0365),Bulleidia extructa W1219(HMPREF9013_0078),Bacteroidescoprosuis DSM 18011(BCOP_0558),Prevotella multisaccharivorax DSM 17128(PREMU_0839),Cellulophaga algicola DSM 14237(CELAL_0483),Synechococcus sp.WH 5701(WH5701_10360),Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay(DESAF_3283),Oscillibacter valericigenes Sjm18-20(OBV_23340),Deinococcus proteolyticus MRP(DEIPR_0134),Bacteroides helcogenes P 36-108(BACHE_0366),Paludibacterpropionicigenes WB4(PALPR_1923),Desulfotomaculum nigrificans DSM 574(DESNIDRAFT_2093),Arthrospira platensis NIES-39(BAI89442.1),Mahellaaustraliensis 50-1 BON(MAHAU_1846),Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1(THEWI_2191),Ruminococcus albus 7(RUMAL_2345),Staphylococcus lugdunensis HKU09-01(SLGD_00862),Megasphaera genomosp.type_1 str.28L(HMPREF0889_1099),Clostridiales genomosp.BVAB3 str.UPII9-5(HMPREF0868_1453),Pediococcusclaussenii ATCC BAA-344(PECL_571),Prevotellaoulorum F0390(HMPREF9431_01673),Turicibacter sanguinis PC909(CUW_0305),Listeria seeligeri FSL N1-067(NT03LS_2473),Solobacterium moorei F0204(HMPREF9430_01245),Megasphaeramicronuciformis F0359(HMPREF9429_00929),Capnocytophaga sp.oral taxon 329str.F0087 2 seqs HMPREF9074_00867,HMPREF9074_01078),Streptococcus anginosusF0211(HMPREF0813_00157),Mycoplasma suis KI3806(MSUI04040),Mycoplasmagallisepticum str.F(MGF_2771),Deinococcus maricopensis DSM 21211(DEIMA_0651),Odoribacter splanchnicus DSM 20712(ODOSP_0239),Lactobacillus fermentum CECT5716(LC40_0265),Lactobacillus iners AB-1(LINEA_010100006089),cyanobacteriumUCYN-A(UCYN_03150),Lactobacillus sanfranciscensis TMW 1.1304(YBBP),Mucilaginibacter paludis DSM 18603(MUCPA_1296),Lysinibacillus fusiformis ZC1(BFZC1_03142),Paenibacillus vortex V453(PVOR_30878),Waddlia chondrophila WSU86-1044(YBBP),Flexistipes sinusarabici DSM 4947(FLEXSI_0971),Paenibacilluscurdlanolyticus YK9(PAECUDRAFT_1888),Clostridium cf.saccharolyticum K10(CLS_03290),Alistipes shahii WAL 8301(AL1_02190),Eubacterium cylindroides T2-87(EC1_00230),Coprococcus catus GD/7(CC1_32460),Faecalibacterium prausnitziiL2-6(FP2_09960),Clostridium clariflavum DSM 19732(CLOCL_2983),Bacillusatrophaeus 1942(BATR1942_19530),Mycoplasma pneumoniae FH(MPNE_0277),Lachnospiraceae bacterium 2_1_46FAA(HMPREF9477_00058),Clostridium symbiosumWAL-14163(HMPREF9474_01267),Dysgonomonas gadei ATCC BAA-286(HMPREF9455_02764),Dysgonomonas mossii DSM 22836(HMPREF9456_00401),Thermus scotoductusSA-01(TSC_C24350),Sphingobacterium sp.21(SPH21_1233),Spirochaeta caldaria DSM7334(SPICA_1201),Prochlorococcus marinus str.MIT 9312(PMT9312_1102),Prochlorococcus marinus str.MIT 9313(PMT_1058),Faecalibacteriumcf.prausnitzii KLE1255(HMPREF9436_00949),Lactobacillus crispatus ST1(LCRIS_00721),Clostridium ljungdahlii DSM 13528(CLJU_C40470),Prevotella bryantii B14(PBR_2345),Treponema phagedenis F0421(HMPREF9554_02012),Clostridiumsp.BNL1100(CLO1100_2851),Microcoleus vaginatus FGP-2(MICVADRAFT_1377),Brachyspira pilosicoli 95/1000(BP951000_0671),Spirochaeta coccoides DSM 17374(SPICO_1456),Haliscomenobacter hydrossis DSM 1100(HALHY_5703),Desulfotomaculum kuznetsovii DSM 6115(DESKU_2883),Runella slithyformis DSM19594(RUNSL_2859),Leuconostoc kimchii IMSNU 11154(LKI_08080),Leuconostocgasicomitatum LMG 18811(OSSG),Pedobacter saltans DSM 12145(PEDSA_3681),Paraprevotella xylaniphila YIT 11841(HMPREF9442_00863),Bacteroides clarus YIT12056(HMPREF9445_01691),Bacteroides fluxus YIT 12057(HMPREF9446_03303),Streptococcus urinalis 2285-97(STRUR_1376),Streptococcus macacae NCTC 11558(STRMA_0866),Streptococcus ictaluri 707-05(STRIC_0998),OscillochloristrichoidesDG-6(OSCT_2821),Parachlamydia acanthamoebae UV-7(YBBP),Prevotelladenticola F0289(HMPREF9137_0316),Parvimonas sp.oral taxon 110 str.F0139(HMPREF9126_0534),Calditerrivibrio nitroreducens DSM 19672(CALNI_1443),Desulfosporosinus orientis DSM 765(DESOR_0366),Streptococcus mitis bv.2str.F0392(HMPREF9178_0602),Thermodesulfobacterium sp.OPB45(TOPB45_1366),Synechococcus sp.WH 8102(SYNW0935),Thermoanaerobacterium xylanolyticum LX-11(THEXY_0384),Mycoplasma haemofelis Ohio2(MHF_1192),Capnocytophaga canimorsusCc5(CCAN_16670),Pediococcus acidilactici DSM 20284(HMPREF0623_1647),Prevotella marshii DSM 16973(HMPREF0658_1600),Peptoniphilus duerdenii ATCCBAA-1640(HMPREF9225_1495),Bacteriovorax marinus SJ(BMS_2126),Selenomonassp.oral taxon 149 str.67H29BP(HMPREF9166_2117),Eubacterium yuriisubsp.margaretiae ATCC 43715(HMPREF0379_1170),Streptococcus mitis ATCC 6249(HMPREF8571_1414),Streptococcus sp.oral taxon 071 str.73H25AP(HMPREF9189_0416),Prevotella disiens FB035-09AN(HMPREF9296_1148),Aerococcus urinae ACS-120-V-Col10a(HMPREF9243_0061),Veillonella atypica ACS-049-V-Sch6(HMPREF9321_0282),Cellulophaga lytica DSM 7489(CELLY_2319),Thermaerobacter subterraneusDSM 13965(THESUDRAFT_0411),Desulfurobacterium thermolithotrophum DSM 11699(DESTER_0391),Treponema succinifaciens DSM 2489(TRESU_1152),Marinithermushydrothermalis DSM 14884(MARKY_1861),Streptococcus infantis SK1302(SIN_0824),Streptococcus parauberis NCFD 2020(SPB_0808),Streptococcus porcinusstr.Jelinkova 176(STRPO_0164),Streptococcus criceti HS-6(STRCR_1133),Capnocytophaga ochracea F0287(HMPREF1977_0786),Prevotella oralis ATCC 33269(HMPREF0663_10671),Porphyromonas asaccharolytica DSM 20707(PORAS_0634),Anaerococcus prevotii ACS-065-V-Col13(HMPREF9290_0962),Peptoniphilus sp.oraltaxon 375 str.F0436(HMPREF9130_1619),Veillonella sp.oral taxon 158 str.F0412(HMPREF9199_0189),Selenomonas sp.oral taxon 137 str.F0430(HMPREF9162_2458),Cyclobacterium marinum DSM 745(CYCMA_2525),Desulfobacca acetoxidans DSM 11109(DESAC_1475),Listeria ivanovii subsp.ivanovii PAM 55(LIV_2111),Desulfovibriovulgaris str.Hildenborough(DVU_1280),Desulfovibrio vulgaris str.'Miyazaki F'(DVMF_0057),Muricauda ruestringensis DSM 13258(MURRU_0474),Leuconostocargentinum KCTC 3773(LARGK3_010100008306),Paenibacillus polymyxa SC2(PPSC2_C4728),Eubacterium saburreum DSM 3986(HMPREF0381_2518),Pseudoramibacteralactolyticus ATCC 23263(HMP0721_0313),Streptococcus parasanguinis ATCC 903(HMPREF8577_0233),Streptococcus sanguinis ATCC 49296(HMPREF8578_1820),Capnocytophaga sp.oral taxon 338 str.F0234(HMPREF9071_1325),Centipedaperiodontii DSM 2778(HMPREF9081_2332),Prevotella multiformis DSM 16608(HMPREF9141_0346),Streptococcus peroris ATCC 700780(HMPREF9180_0434),Prevotella salivae DSM 15606(HMPREF9420_1402),Streptococcus australis ATCC700641 2 seqs HMPREF9961_0906,HMPREF9421_1720),Streptococcus cristatus ATCC51100 2 seqs HMPREF9422_0776,HMPREF9960_0531),Lactobacillus acidophilus 30SC(LAC30SC_03585),Eubacterium limosum KIST612(ELI_0726),StreptococcusdowneiF0415(HMPREF9176_1204),Streptococcus sp.oral taxon 056 str.F0418(HMPREF9182_0330),Oribacterium sp.oral taxon 108 str.F0425(HMPREF9124_1289),Streptococcus vestibularis F0396(HMPREF9192_1521),Treponema brennaborense DSM12168(TREBR_1165),Leuconostoc fallax KCTC 3537(LFALK3_010100008689),Eremococcus coleocola ACS-139-V-Col8(HMPREF9257_0233),Peptoniphilus hareiACS-146-V-Sch2b(HMPREF9286_0042),Clostridium sp.HGF2(HMPREF9406_3692),Alistipes sp.HGB5(HMPREF9720_2785),Prevotella dentalis DSM 3688(PREDE_0132),Streptococcus pseudoporcinus SPIN 20026(HMPREF9320_0643),Dialistermicroaerophilus UPII 345-E(HMPREF9220_0018),Weissella cibaria KACC 11862(WCIBK1_010100001174),Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis KCTC 3167(LCORCK3_010100001982),Synechococcus sp.PCC 7335(S7335_3864),Owenweeksiahongkongensis DSM 17368(OWEHO_3344),Anaerolinea thermophila UNI-1(ANT_09470),Streptococcus oralis Uo5(SOR_0619),Leuconostoc gelidum KCTC 3527(LGELK3_010100006746),Clostridium botulinum BKT015925(CBC4_0275),Prochlorococcusmarinus str.MIT 9211(P9211_10951),Prochlorococcus marinus str.MIT 9215(P9215_12271),Staphylococcus aureus subsp.aureus NCTC 8325(SAOUHSC_02407),Staphylococcus aureus subsp.aureus COL(SACOL2153),Lactobacillus animalis KCTC3501(LANIK3_010100000290),Fructobacillus fructosus KCTC 3544(FFRUK3_010100006750),Acetobacterium woodii DSM 1030(AWO_C28200),Planococcusdonghaensis MPA1U2(GPDM_12177),Lactobacillus farciminis KCTC 3681(LFARK3_010100009915),Melissococcus plutonius ATCC 35311(MPTP_0835),Lactobacillusfructivorans KCTC 3543(LFRUK3_010100002657),Paenibacillus sp.HGF7(HMPREF9413_5563),Lactobacillus oris F0423(HMPREF9102_1081),Veillonella sp.oral taxon 780str.F0422(HMPREF9200_1112),Parvimonas sp.oral taxon 393 str.F0440(HMPREF9127_1171),Tetragenococcus halophilus NBRC 12172(TEH_13100),CandidatusChloracidobacterium thermophilum B(CABTHER_A1277),Ornithinibacillusscapharcae TW25(OTW25_010100020393),Lacinutrix sp.5H-3-7-4(LACAL_0337),Krokinobacter sp.4H-3-7-5(KRODI_0177),Staphylococcus pseudintermedius ED99(SPSE_0659),Staphylococcus aureus subsp.aureus MSHR1132(CCE59824.1),Paenibacillus terrae HPL-003(HPL003_03660),Caldalkalibacillus thermarumTA2.A1(CATHTA2_0882),Desmospora sp.8437(HMPREF9374_2897),Prevotellanigrescens ATCC 33563(HMPREF9419_1415),Prevotella pallens ATCC 700821(HMPREF9144_0175),Streptococcus infantis X(HMPREF1124。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环状二-AMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的环二AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的环二AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的环状二AMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环状二-AMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的AMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环二-GAMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％。至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的环二GAMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的环二GAMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的环状二-GAMP。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生环二-GAMP的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的ATP和/或GTP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的ATP和/或GTP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的ATP和/或GTP。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使STING激动剂的产生率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约80％至100％。在一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产生增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，4小时后，基因工程化细菌使STING激动剂产生增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使STING激动剂产量增加约99％至100％。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约10-50倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约50-100倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约100-500倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约10000-1000倍。
在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些激动剂STING生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够增加巨噬细胞和/或树突细胞中的IFN-β1mRNA水平，例如，在细胞培养物中。在一些实施方式中，IFN-β1mRNA的增加取决于施用的细菌剂量。在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够增加巨噬细胞和/或树突细胞(例如肿瘤)中的IFN-β1mRNA水平。在一些实施方式中，IFN-β1的增加取决于施用的细菌的剂量。
在一个实施方式中，与在相同条件下施用相同亚型的未修饰细菌时观察到的IFN-β1产生水平相比，肿瘤中IFN-β1产生约为2倍，约3倍，约4倍，例如，在第一次注射细菌后第2天。在一些实施方式中，基因工程化细菌在骨髓来源的树突细胞中诱导产生约6000至25000，15000至25000，6000至8000，20000至25000pg/ml的IFNb1mRNA，例如在刺激后4小时。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌可以剂量依赖性地增加骨髓来源的树突细胞中的IFN-b1产生，例如，在2或4小时后刺激。
在一些实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的另一种酶)的基因序列的基因工程化细菌能够减少肿瘤体积，例如，在3种细菌治疗方案后4或9天。在一个非限制性实例中，9天后肿瘤体积为约0至30mm3。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生STING激动剂的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更多。在一些实施方式中，包含编码dacA的基因序列的基因工程化细菌实现100％的响应率。
在一些实施方式中，响应速率是比未修饰的细菌的观察到的约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在又一个实施方式中，响应率在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的相比为约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，包含编码c-di-GAMP合酶，二腺苷酸环化酶或其他产生STING激动剂的多肽的基因序列的基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比实现至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更多。在一些实施方式中，肿瘤消退与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的相比约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，肿瘤消退与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的相比为约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌增加肿瘤引流淋巴结中的总T细胞数。在一些实施方式中，肿瘤引流淋巴结中总T细胞数量与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比的增加为至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更多。在一些实施方式中，总T细胞数量的增加是与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，总T细胞数量的增加为与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的相比约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌增加肿瘤引流淋巴结中活化的效应CD4和CD8T细胞的百分比。
在一些实施方式中，肿瘤引流淋巴结中活化的效应物CD4和CD8T细胞的百分比与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比为至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更多。在一些实施方式中，活化的效应物CD4和CD8T细胞的百分比与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比为约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，活化效应物CD4和CD8T细胞的百分比为与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且活化效应物CD4和CD8T细胞的百分比是在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的2至4倍更多。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌实现肿瘤内先天细胞因子的早期上升和效应子-T细胞应答的后期升高。
在一些实施方式中，包含编码肿瘤微环境中的dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌能够克服免疫抑制并产生强大的先天性和适应性抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，包含编码dacA的基因序列的基因工程化细菌抑制调节性T细胞的增殖或积累。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌实现肿瘤内先天细胞因子的早期升高，包括但不限于IL-6，IL-1β和MCP-1。
在一些实施方式中，IL-6为与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更多诱导。在一些实施方式中，IL-6与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多诱导。在另一个实施方式中，IL-6与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比为约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多诱导。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是dacA，并且诱导的IL-6的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2-3倍。
在一些实施方式中，肿瘤中IL-1β的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高。在一些实施方式中，IL-1β的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在另一个实施方式中，IL-1β的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且IL-1β的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2倍，3倍或4倍。
在一些实施方式中，肿瘤中MCP1的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高。在一些实施方式中，MCP1的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多。在另一个实施方式中，MCP1的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且MCP1的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2倍，3倍或4倍。
在一些实施方式中，包含编码dacA(或用于产生STING激动剂的其他酶)的基因序列的基因工程化细菌实现与效应子-T细胞应答相关的分子的活化，包括但不限于粒酶B，IL-2，和IL-15。
在一些实施方式中，肿瘤中颗粒酶B的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高。在一些实施方式中，颗粒酶B的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍。在另一个实施方式中，颗粒酶B的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且颗粒酶B的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约2倍，3倍或4倍。
在一些实施方式中，肿瘤中IL-2的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高。在一些实施方式中，IL-2的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在另一个实施方式中，IL-2的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且IL-2的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约3倍，4倍或5倍。
在一些实施方式中，肿瘤中IL-15的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高。在一些实施方式中，IL-15的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高。在另一个实施方式中，IL-15的水平与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比升高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，由细菌编码的基因是DacA，并且IL-15的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约23倍，4倍或5倍。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DacA的基因序列。在一个实施方式中，dacA基因与SEQ ID NO:1210具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，dacA基因与SEQ ID NO:1210具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，dacA基因与SEQ ID NO:1210具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，dacA基因与SEQ ID NO:1210具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，dacA基因与SEQ ID NO:1210具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，dacA基因具有与SEQ ID NO:1210至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，dacA基因包含SEQ IDNO:1210的序列。在另一个实施方式中，dacA基因由SEQ ID NO:1210的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与SEQ ID NO:1209具有至少约80％同一性的DacA多肽的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DacA多肽的基因序列，其与SEQ ID NO:1209具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DacA多肽的基因序列，其与SEQ ID NO:1209具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码DacA多肽的基因序列，其具有与SEQ ID NO:1209或其功能片段约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:1209的DacA多肽的基因序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1209组成。
在一些实施方式中，修饰和/或突变c-di-GAMP合酶，二腺苷酸环化酶或产生其他STING激动剂的多肽，例如以增强稳定性或增加STING激动作用。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生c-di-GAMP合酶或其他产生STING激动剂的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的情况下，产生c-di-GAMP合酶或其他产生STING激动剂的多肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码来自霍乱弧菌的c-di-GAMP合酶。在一些实施方式中，来自霍乱弧菌的c-di-GAMP合酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加STING激动作用。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码来自单核细胞增生李斯特氏菌的环状二-AMP合酶。在一些实施方式中，来自单核细胞增生李斯特氏菌的二腺苷酸环化酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加STING激动作用。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生用于产生STING激动剂的酶，例如环状二-AMP合酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的情况下，产生产生STING激动剂的酶，例如环二-AMP合酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，包括但不限于用于表达产生STING激动剂的酶的回路，例如环状二AMP合酶，例如，来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个，包括但不限于用于表达产生STING激动剂的酶的回路，例如，来自单核细胞增生李斯特菌的环状二-AMP合酶，存在于一个或多个质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到细菌和/或其他微生物染色体中的一个或多个位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如任何营养缺陷型本领域已知的并且在本文中提供，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌物回路，例如本文所述的任何分泌回路，以及本领域，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述的任何表面展示回路，以及本领域中已知的(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种代谢物的回路(例如，本文所述的犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)一种或多种这些附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗体或抗-PD1或抗-PDL1抗体。
在一个实施方式中，施用产生STING激动剂的染色引起远位效应。在一个实施方式中，施用包含一种或多种编码去腺苷酸环化酶的基因的基因工程化细菌引起远位效应。在一个实施方式中，在第2天和第3天之间观察到远位效应。
激活效应免疫细胞(免疫刺激剂)
T细胞激活剂
细胞因子和细胞因子受体
CD4(分化簇4)是在免疫细胞如细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突细胞表面上发现的糖蛋白。CD4+T辅助细胞是白细胞，其功能是向其他类型的免疫细胞发送信号，从而在免疫过程中协助其他免疫细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。当T细胞辅助细胞通过MHCII类分子呈递肽抗原时，它们被激活，所述MHCII类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦被激活，T辅助细胞分裂并分泌调节或辅助主动免疫应答的细胞因子。T辅助细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，TH9或TFH细胞，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。细胞毒性T细胞通过结合与MHCI类分子相关的抗原识别它们的靶标，所述MHCI类分子存在于所有有核细胞的表面上。
在一些实施方式中，基因工程化微生物，例如基因工程化细菌，能够产生一种或多种调节一种或多种T效应细胞的抗癌分子，例如CD4+细胞和/或CD8+细胞。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种抗癌分子，其激活，刺激和/或诱导一种或多种T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)的分化。在一些实施方式中，免疫调节剂是激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)分化的细胞因子。在一些实施方式中，基因工程化细菌产生一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，IL-18，TNF和干扰素γ(IFN-γ)的细胞因子。如本文所用，一种或多种细胞因子的产生包括融合蛋白，其包含一种或多种细胞因子，其通过与另一种细胞因子或其他免疫调节分子连接的肽融合。实例包括但不限于IL-12和IL-15融合蛋白。通常，本文所述的所有激动剂和拮抗剂可通过肽接头与另一种目的多肽融合，以改善或改变其功能。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种细胞因子的序列，所述细胞因子选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，IL-18，TNF和IFN-γ。在一些实施方式中，基因工程化微生物编码一种或多种细胞因子融合蛋白。此类融合蛋白的非限制性实例包括可操作地连接抗体多肽的一种或多种细胞因子多肽，其中抗体识别肿瘤特异性抗原，从而使细胞因子接近肿瘤。
白细胞介素12(IL-12)是一种细胞因子，其作用在先天性和适应性免疫之间产生相互作用。IL-12由许多免疫细胞分泌，包括活化的树突细胞，单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞，以及其他细胞类型。IL-12是由p35和p40亚基组成的异二聚体蛋白(IL-12-p70；IL-12-p35/p40)，并与由两个亚基IL-12R-β1和IL-12R-β2组成的受体结合。IL-12受体在许多免疫细胞上组成型或诱导型表达，包括NK细胞，T细胞和B淋巴细胞。在IL-12结合后，受体被激活并且通过JAK/STAT途径启动下游信号传导，导致对IL-12的细胞应答。IL-12通过增加来自NK和T细胞的IFN-γ的产生而起作用，IFN-γ是IL-12作用的最有效的介质。此外，IL-12促进活化的NK细胞，CD8+和CD4+T细胞的生长和细胞毒性，并将CD4+Th0细胞的分化转向Th1表型。此外，IL-12增强针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和IgG的诱导以及B细胞产生IgE的抑制。此外，IL-12还在骨髓衍生的抑制细胞的重编程中起作用，指导Th1型免疫应答并有助于增加MHCI类分子的表达(例如，在Waldmann等，Cancer ImmunolResMarch2015.3；219中综述)。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-12。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-12的序列(即p35和p40亚基)。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-12，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-12基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-12拷贝的序列，例如，IL-12基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激IL-12产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-12的序列和编码用于分泌IL-12的分泌肽的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-12和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-12和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达L-12和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-12和/或表达分泌肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其中两个白细胞介素-12单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40))通过接头共价连接。在一些实施方式中，接头是富含丝氨酸甘氨酸的接头。在一个实施方式中，基因序列编码构建体，其中'GGGGSGGGGSGGGGS'的15个氨基酸接头插入两个单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40)之间以产生强制二聚体人IL-12(diIL-12)融合蛋白。在一些实施方式中，基因序列经密码子优化用于表达，例如用于在大肠杆菌中表达。在任何实施方式中，其中基因工程化细菌包含用于表达IL-12的基因序列，其中两个亚基连接，基因序列可以进一步包含分泌标签。分泌标签包括本文所述或本领域已知的任何分泌标签。非限制性实例包括OmpF，cvaC，TorA，fdnG，dmsA，PelB，HlyA，Adhesin(ECOLIN_19880)，DsbA(ECOLIN_21525)，GltI(ECOLIN_03430)，GspD(ECOLIN_16495)，HdeB(ECOLIN_19410)，MalE(ECOLIN_22540)，OppA。(ECOLIN_07295)，PelB，PhoA(ECOLIN_02255)，PpiA(ECOLIN_18620)，TolB，侵权，OmpA，PelB，mglB和lamB分泌标签。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO：1170，SEQ ID NO:1171，SEQID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ IDNO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ IDNO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ IDNO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ IDNO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ IDNO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ IDNO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ IDNO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ IDNO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的基因序列，其具有与选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:11NO：1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列，或其功能片段约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基包含选自SEQ ID NO:1169，SEQ IDNO:1170，SEQ ID NO:1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ IDNO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ IDNO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列。在另一个实施方式中，与基因工程化细菌表达的IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基由选自SEQ ID NO:1169，SEQ ID NO:1170，SEQIDNO：1171，SEQ ID NO:1172，SEQ ID NO:1173，SEQ ID NO:1174，SEQ ID NO:1175，SEQ ID NO:1176，SEQ ID NO:1177，SEQ ID NO:1178，SEQ ID NO:1179，SEQ ID NO:1191，SEQ ID NO:1192，SEQ ID NO:1193和SEQ ID NO:1194的序列组成。在其中基因工程化细菌编码与IL-12(p40)亚基连接的IL-12(p35)亚基的任何这些实施方式中，去除编码标签的一种或多种序列，例如V5，FLAG或His标签。在其他实施方式中，除去分泌标签并用不同的分泌标签代替。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-12。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，80-90，90-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-350，350-400pg/ml培养基，例如诱导4小时后。在一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480，490或500，pg/ml培养基，例如诱导4小时后。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌分泌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-12。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-12。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，基因工程化以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-12的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-15和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-15，和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-15和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-15和/或表达分泌肽。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述IL-15回路。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码IL-12的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
IL-15在先天性和适应性免疫系统的体内平衡中显示多效功能，并与IL-15受体结合，IL-15受体是由三个亚基组成的异源三聚体受体。α亚基特异于IL-15，而β(CD122)和γ(CD132)亚基与IL-2受体共享，并允许通过JAJ/STAT途径共享信号传导。
IL-15由几种细胞类型产生，包括树突细胞，单核细胞和巨噬细胞。在同一细胞中产生的IL-15Rα和IL-15的共表达允许IL-15与IL-15Rα的细胞内结合，然后IL-15Rα作为复合物穿梭至细胞表面。一旦进入细胞表面，那么这些细胞的IL-15Rα能够将IL-15转运至不表达IL-的CD8T细胞，NK细胞和NK-T细胞的IL-15Rβ-γc。15，诱导形成所谓的免疫突触。鼠和人IL-15Rα以膜结合和可溶形式存在。可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)通过蛋白水解切割从跨膜受体组成型产生。
IL-15对于淋巴样发育和先天免疫细胞的外周维持和T细胞的免疫记忆至关重要，特别是天然杀伤(NK)和CD8+T细胞群。与IL-2相反，IL-15不促进Tregs的维持，此外，已显示IL-15保护效应T细胞免受IL-2介导的活化诱导的细胞死亡。
因此，IL-15的递送被认为是长期抗肿瘤免疫的有希望的策略。在重组人IL-15的第一次人体临床试验中，在处理时观察到NK细胞的10倍扩增并显著增加γδT细胞和CD8+T细胞的增殖。此外，已开发出含有细胞因子-受体融合复合物的IL-15超级激动剂，并进行评估以增加反应的长度。这些包括L-15N72D超级激动剂/IL-15RαSushi-Fc融合复合物(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)(Kim等，2016 IL-15 superagonist/IL-15RαSushi-Fcfusion complex(IL-15SA/IL-15RαSu-Fc；ALT-803)显著增强NK和记忆CD8+T细胞的特异性亚群，并介导针对鼠乳腺癌和结肠癌的有效抗肿瘤活性。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-15。
通过将IL-15与融合蛋白IL-15Rα-Fc预先结合或通过与IL-15Rα的寿司结构域(hyper-IL-15)直接融合以模拟反式呈递，IL-15的生物活性得到极大改善。细胞相关的IL-15Rα对IL-15的影响IL-15单独施用或作为与IL-15Rα的复合物施用，在动物模型中显示出有效的抗肿瘤活性(Cheng等，Immunotherapy of metastatic and autochthonous livercancer with IL-15/IL-15Rαfusion protein；Oncoimmunology.2014；3(11):e963409，以及其中的参考文献)。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-15，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-15基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-15基因拷贝的序列，例如，IL-15基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激IL-15产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15Ra的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的序列和编码IL-15Ra的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码包含IL-15和IL-15Ra的融合多肽的序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-15的序列和编码用于分泌IL-15的分泌肽的序列。示例性分泌标签包括但不限于OmpF，cvaC，TorA，fdnG，dmsA，PelB，HlyA，Adhesin(ECOLIN_19880)，DsbA(ECOLIN_21525)，GltI(ECOLIN_03430)，GspD(ECOLIN_16495)，HdeB(ECOLIN_19410)，MalE(ECOLIN_22540)，OppA(ECOLIN_07295)，PelB，PhoA(ECOLIN_02255)，PpiA(ECOLIN_18620)，TolB，侵权，OmpA，PelB，mglB和lamB分泌标签。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％IL-15的45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够促进NK细胞扩增至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞的扩增至至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比促进NK细胞扩增至至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，15倍，20倍，30倍，40倍，50倍，100倍，500倍或1000倍更逗。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖增加至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更大程度。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比使γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖增加至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8倍-2倍或2倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比增加γδT细胞和/或CD8+T细胞的增殖至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高的亲和力。在另一个实施方式中，基因工程化细菌能够与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比与IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白受体结合至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍。八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍，或一千倍或更高的亲和力。
在一些实施方式中，包含一种或多种编码IL-15用于分泌的基因的基因工程化细菌能够诱导STAT5磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够诱导STAT5磷酸化至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT5磷酸化至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT5磷酸化至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高。在一个实施方式中，IL-15分泌菌株在相同条件下以相同的量诱导与rhIL15相当的STAT5磷酸化。
在一些实施方式中，包含编码IL-15用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够诱导STAT3磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，包含编码IL-15用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够诱导STAT3磷酸化，例如在CD3+IL15RAα+T细胞中。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IL-15或IL-15/IL-15Rα融合蛋白的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够诱导STAT3磷酸化至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT3磷酸化至少1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT3磷酸化至少三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高。在一个实施方式中，IL-15分泌菌株在相同条件下以相同的量诱导与rhIL15相当的STAT3磷酸化。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，连接子和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ IDNO:1135，SEQ ID NO:1136的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，连接子和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种IL-15，IL-Rα，连接子和IL-15-IL15Rα融合多肽的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136序列具有至少约90％的同一性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与选自SEQ ID NO:1133，SEQ IDNO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136的一个或多肽的基因序列或其功能片段的一个或多个多肽具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同一性。在其他具体实施方式中，多肽由选自SEQ ID NO:1133，SEQ ID NO:1134，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1136的一种或多种多肽组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15，IL-Rα，连接子和IL-15-IL15Rα融合蛋白的基因序列，或其片段或功能变体。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ IDNO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ IDNO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的序列具有至少约95％的同一性。在某些实施方式中，IL-15，IL-Rα，连接子和IL-15-IL15Rα融合蛋白序列具有与选自SEQ ID NO:1338SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQID NO:1343，SEQ ID NO:1344或其功能片段的一个或多个多核苷酸至少约80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在一些具体实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQ ID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的一种或多种多核苷酸。在其他具体实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:1338，SEQ ID NO:1339，SEQID NO:1340，SEQ ID NO:1341，SEQ ID NO:1342，SEQ ID NO:1343，SEQ ID NO:1344的一种或多种多核苷酸组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，或其片段或功能变体。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQIDNO：1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，基因序列IL-15或IL-15融合蛋白与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列与选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％具有89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列包含选自SEQ ID NO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQ ID NO:1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列。在另一个实施方式中，编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列由选自SEQ IDNO:1345，SEQ ID NO:1200，SEQ ID NO:1201，SEQ ID NO:1202，SEQIDNO：1203，SEQ ID NO:1204和SEQ ID NO:1199的序列组成。在其中基因工程化细菌编码IL-15或IL-15融合蛋白的任何这些实施方式中，除去编码标签的一种或多种序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码本文所述的IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQIDNO：1197，和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约80％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其与选自SEQ ID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15或IL-15融合蛋白的基因序列，其具有与选自SEQ IDNO:1195，SEQIDNO：1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198，或其功能片段的序列约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，IL-15或IL-15融合蛋白包含选自SEQID NO:1195，SEQ ID NO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的IL-15或IL-15融合蛋白由选自SEQ ID NO:1195，SEQ IDNO:1196，SEQ ID NO:1197和SEQ ID NO:1198的序列组成。在其中基因工程化细菌编码IL-15或IL-15融合蛋白的任何这些实施方式中，可以除去分泌标签并用不同的分泌标签代替。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-15和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-15，和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-15和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-15和/或表达分泌肽。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述IL-15回路。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码IL-15的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码IL-15的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在一些实施方式中，IL-15是分泌的。在一些实施方式中，包含编码IL-15的基因序列的基因工程化细菌包含选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。在一些实施方式中，包含用于产生IL-15的基因序列的基因工程化细菌还包含编码CXCL10的基因序列。在一些实施方式中，CXCL10是分泌的。在一些实施方式中，编码CXCL10的基因序列包含选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在细菌编码IL-15和/或CXCL10的任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一些实施方式中，细菌还包含trpE中的突变或缺失。在任何这些实施方式中，细菌可以进一步包含用于产生色氨酸的基因序列。在一些实施方式中，用于产生色氨酸的基因序列选自trpE，trpD，trpC，trpB，trpA，aroG和SerA。在一些实施方式中，aroG是aroG(aroGfbr)的反馈抗性形式。在一些实施方式中，trpE是trpE的反馈抗性形式(trpEfbr)。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含trpR中的突变或缺失。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含tnaA中的突变或缺失。
干扰素γ(IFNγ或II型干扰素)是一种对先天性和适应性免疫至关重要的细胞因子对抗病毒，一些细菌和原生动物感染。IFNγ激活巨噬细胞并诱导II类主要组织相容性复合物(MHC)分子表达。IFNγ可以抑制病毒复制，并在免疫系统中具有免疫刺激和免疫调节作用。IFNγ主要由天然杀伤(NK)和天然杀伤T(NKT)细胞产生，作为先天免疫应答的一部分，并由CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞产生。一旦抗原特异性免疫发展IFNγ由T辅助细胞(特别是Th1细胞)，细胞毒性T细胞(TC细胞)和NK细胞分泌。只要。它具有多种免疫刺激作用，在免疫系统中起着不同的作用，包括促进NK细胞活性，增加巨噬细胞的抗原呈递和溶酶体活性，诱导一氧化氮合酶iNOS的活化，从活化的血浆B细胞产生某些IgG，促进导致细胞免疫的Th1分化。它还可以使正常细胞增加表达I类MHC分子以及抗原呈递细胞上的II类MHC促进与白细胞迁移相关的粘附和结合，并且通过激活巨噬细胞参与肉芽肿形成，使得它们在杀死细胞内生物方面变得更强大。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生IFN-γ。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IFN-γ的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IFN-γ，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上的IFN-γ基因序列拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两种或更多种IFN-γ基因拷贝的序列，例如，两种，三种，四种，五种，六种或更多种IFN-γ基因拷贝。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IFN-γ和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IFN-γ和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件激活的启动子控制下表达IFN-γ和/或分泌肽，或通过炎性条件表达，例如由所述条件激活的任何启动子和这里描述的。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何所述启动子)的控制下表达IFN-γ和/或表达分泌肽。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％IFN-γ的比例为45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IFN-γ。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的IFN-γ。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的IFN-γ。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，包含编码IFN-γ的一种或多种基因的基因工程化细菌在巨噬细胞系中诱导STAT1磷酸化。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％。，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％或更高。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更高的水平。在另一个实施方式中，基因工程化细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比诱导STAT1磷酸化三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更高的水平。
在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，细菌能够使肿瘤中IFNγ产生增加0.1，0.2，0.3ng/克肿瘤。在一个具体实施方式中，与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比，细菌能够在相同条件下将IFNγ产生增加约5倍，10倍或15倍。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生IFN-γ的细菌与相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌相比能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述IFN-γ回路。在一些实施方式中，编码IFN-γ的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，编码IFN-γ的基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，编码IFN-γ的任何一种或多种所述基因序列存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到微生物染色体中的一个或多个位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
白细胞介素-18(IL18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种促炎细胞因子，属于IL-1超家族，由巨噬细胞产生。和其他细胞。IL-18与...结合白细胞介素-18受体，与IL-12一起，在脂多糖等微生物产物感染后诱导细胞免疫(LPS)。用IL-18刺激后，自然杀伤(NK)细胞和某些T辅助细胞1型细胞释放干扰素-γ(IFN-γ)或II型干扰素，其在激活巨噬细胞和其他免疫细胞中起作用。IL-18也能诱导严重炎症反应。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-18。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-18的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-18，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-18基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-18基因拷贝的序列，例如，IL-18基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-18和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-18和/或表达分泌肽。
白细胞介素-2(IL-2)是细胞因子调节的活动的白血细胞(白细胞，经常淋巴细胞)。IL-2是人体对微生物的自然反应的一部分感染，区分外国(“非自我”)和“自我”。IL-2通过与淋巴细胞表达的IL-2受体结合来介导其作用。IL-2是细胞因子家族的成员，其还包括IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21。IL-2通过IL-2受体发出信号，IL-2受体是由α，β和γ亚单位组成的复合物。γ亚基由该细胞因子受体家族的所有成员共享。当初始T细胞被抗原刺激时，IL-2促进T细胞分化为效应T细胞并进入记忆T细胞。通过其在T细胞免疫记忆发展中的作用，其取决于抗原选择的T细胞克隆的数量和功能的扩展，它还在细胞介导的免疫中起关键作用。IL-2已经被美国食品药品管理局(FDA)和几个欧洲国家批准用于治疗癌症(恶性黑素瘤，肾细胞癌)。IL-2也用于治疗黑素瘤转移，并具有高完全反应率。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-2。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-2的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-2，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-2基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-2基因拷贝的序列，例如，IL-2基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件活化的启动子的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-2和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-2和/或表达分泌肽。
白细胞介素-21是一种细胞因子，对免疫系统的某些细胞具有强大的调节作用，包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。IL-21诱导细胞分裂/增殖在这些细胞中。IL-21在活化的人中表达CD4+T细胞，但在大多数其他组织中没有。此外，IL-21表达在T辅助细胞的Th2和Th17亚群中上调。IL-21也表达于NKT细胞调节这些细胞的功能。当与IL-21结合时，IL-21受体通过Jak/STAT途径起作用，利用Jak1和Jak3以及STAT3同型二聚体激活其靶基因。已经显示IL-21通过富集具有IL-2产生能力的独特CD28+CD127hiCD45RO+表型的记忆型CTL群来调节人T细胞的分化程序。IL-21还通过持续和增加的CD8+细胞应答具有抗肿瘤作用，以实现持久的肿瘤免疫。IL-21已被批准用于转移性的1期临床试验黑素瘤(MM)和肾细胞癌(RCC)患者。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生IL-21。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-21的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达IL-21，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上IL-21基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个IL-21拷贝的序列，例如，IL-21基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激IL-21产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码IL-21的序列和编码用于分泌IL-21的分泌肽的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达IL-21和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达II-21，和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达IL-21和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何本文所述启动子)的控制下表达IL-21和/或表达分泌肽。
肿瘤坏死因子(TNF)(也称为cachectin或TNFα)是一种可引起细胞溶解的细胞因子在某些条件下，某些肿瘤细胞系可刺激细胞增殖并诱导细胞分化。TNF参与系统性疾病炎症是构成急性期反应的细胞因子之一。它主要是通过激活产生的巨噬细胞虽然可以由许多其他细胞类型产生，例如CD4+淋巴细胞，NK细胞，中性粒细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞和神经元。TNF的主要作用是调节免疫细胞。
TNF可以结合两种受体，TNFR1(TNF受体1型；CD120a；p55/60)和TNFR2(TNF受体2型；CD120b；p75/80)。TNFR1在大多数组织中表达，并且可以被膜结合的和可溶的三聚体形式的TNF完全激活，而TNFR2仅在免疫系统的细胞中发现，并且对TNF同源三聚体的膜结合形式起反应。在与其受体结合后，TNF可以激活NF-κB和MAPK途径，其介导许多蛋白质的转录并介导参与细胞分化和增殖的几种途径，包括涉及炎症反应的那些途径。TNF还调节诱导细胞凋亡的途径。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节树突细胞活化的免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是TNF。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生TNF。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码TNF的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达TNF，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上的TNF基因序列拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两种或更多种TNF拷贝的序列，例如，两种，三种，四种，五种，六种或更多种TNF基因拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激TNF产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码TNF的序列和编码用于分泌TNF的分泌肽的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达TNF和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其在由低氧条件激活的启动子的控制下表达TNF，和/或表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达TNF和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达TNF和/或表达分泌肽。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％的TNF。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生的TNF比TNF产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，TNF的三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％TNF的45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌TNF至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，TNF的三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌TNF的细菌能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一个实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少约40-60％，例如，在两剂量治疗方案的第7天减少约45-55％。在一个实施方式中，在施用表达TNF的细菌时肿瘤体积为约300mm3，相对于在相同条件下施用相同亚型的未修饰细菌约600mm3。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生TNF的细菌能够增加树突细胞和/或巨噬细胞上的CCR7表达。
在一些实施方式中，包含编码TNFα用于分泌的一种或多种基因的基因工程化细菌能够激活NFkappaB途径，例如在具有TNF受体的细胞中。在一些实施方式中，包含一种或多种编码TNFα的基因的基因工程化细菌能够诱导IkappaBalpha降解。在一些实施方式中，从工程化细菌分泌的分泌的TNFα水平导致IkappaBalpha降解至与相同浓度下相同浓度的重组TNFα相同的程度。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
CD40是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，并且是其活化所必需的。由该基因编码的蛋白质受体是TNF受体超家族的成员。
在巨噬细胞中，激活的主要信号是来自Th1型CD4T细胞的IFN-γ。次级信号是T细胞上的CD40L(CD154)，其结合巨噬细胞表面上的CD40。结果，巨噬细胞在其表面上表达更多的CD40和TNF受体，这有助于提高激活水平。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节巨噬细胞和/或树突细胞活化的免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是CD40配体。因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生CD40配体。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码CD40配体的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达CD40配体，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含一个以上CD40配体基因序列的拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个CD40配体拷贝的序列，例如，CD40配体基因的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激CD40配体产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码CD40配体的序列和编码用于分泌CD40配体的分泌肽的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达CD40配体和/或在由低氧条件激活的启动子的控制下表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达CD40配体，和/或在由低氧条件激活的启动子控制下表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达CD40配体和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如本文所述的任何启动子)的控制下表达CD40配体和/或表达分泌肽。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％比未修饰的CD40配体多45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％的CD40配体。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的CD40配体。两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CD40配体。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌分泌至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％的细菌。，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多CD40配体比相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的CD40配体。两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌分泌三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的CD40配体。
在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CD40配体的细菌能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CD40配体的细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以分泌CD40配体的细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌能够将响应率提高至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌能够增加树突细胞和/或巨噬细胞上的CCR7表达。
在一些实施方式中，CCR7为至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比诱导更多或更多。在一些实施方式中，CCR7诱导的诱导比未修饰的细菌的约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，CCR7为约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，巨噬细胞中诱导的CCR7的水平为25％-55％，比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约30-45％。
在一个实施方式中，树突细胞中诱导的CCR7水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约两倍。
在一些实施方式中，经基因工程改造以产生CD40配体的细菌能够增加树突细胞和/或巨噬细胞上的CCR7表达。
在一些实施方式中，CD40为至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比诱导更多或更多。在一些实施方式中，CD40比未修饰的细菌所观察到的诱导约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，CD40为约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。在一个实施方式中，巨噬细胞中诱导的CD40的水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高30-50％。
在一个实施方式中，树突细胞中诱导的CD40水平比在相同条件下用相同细菌亚型的未修饰细菌观察到的水平高约10％。
因此，在一个实施方式中，基因工程化细菌编码与SEQ ID NO:1093中的一个或多个具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的CD40配体多肽。在另一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:1093。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ IDNO:1093组成。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF2)，是一种单体由巨噬细胞，T细胞，肥大细胞，NK细胞，内皮细胞和成纤维细胞分泌的糖蛋白。GM-CSF是一个白细胞生长因子，作为细胞因子，促进免疫系统的发展和促进对感染的防御。例如，GM-CSF刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞，单核细胞离开循环并迁移到组织中，于是它们成熟为巨噬细胞和树突细胞。GM-CSF是其中的一部分免疫/炎症级联，通过这种方法，少量巨噬细胞的激活迅速导致其数量增加，这一过程对于抵抗感染至关重要。GM-CSF通过信号转导和转录激活因子发出信号，STAT5或通过STAT3(激活巨噬细胞)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节树突细胞活化的免疫调节剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是GM-CSF。因此，在一些实施方式中，工程化细菌被工程化以产生GM-CSF。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码GM-CSF的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达GM-CSF，例如，可操作地连接至强启动子和/或包含一个以上拷贝的GM-CSF基因序列。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个GM-CSF拷贝的序列，例如，两个，三个，四个，五个，六个或更多个GM-CSF基因拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌产生一种或多种刺激GM-CSF产生的抗癌分子。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码GM-CSF的序列和编码用于分泌GM-CSF的分泌肽的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌在由低氧条件激活的启动子的控制下表达GM-CSF和/或表达分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达GM-CSF，和/或在由低氧条件激活的启动子控制下表达分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达GM-CSF和/或分泌肽，所述炎性条件例如由所述条件激活的任何启动子和这里描述的。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子(例如任何所述启动子)的控制下表达GM-CSF和/或表达分泌肽。在表7中。
表7。
Figure BDA0002194618080002351
Figure BDA0002194618080002361
在一些实施方式中，启动子序列与SEQ ID NO:152，SEQ IDNO：153，SEQ ID NO:154，SEQ ID NO:155，SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:157，SEQ ID NO:158和/或SEQ ID NO:159的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
在一些实施方式中，某些前体序列被一种或多种细菌序列取代，包括但不限于细菌分泌信号序列。在一些实施方式中，编码细胞因子的多核苷酸序列经密码子优化用于细菌表达。
在一些实施方式中，某些前体序列被一种或多种哺乳动物序列取代，包括但不限于哺乳动物分泌信号序列。在一些实施方式中，编码细胞因子的多核苷酸序列经密码子优化用于哺乳动物表达。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码免疫调节细胞因子的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达hIL-12的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1053的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1054的多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达hIL-15的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1057的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达GMCSF的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1058的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达TNF-α的基因序列，例如细胞外部分。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1059的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达IFN-γ的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1060的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达CXCL10的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1061的多肽的一种或多种基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于表达CXCL9的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码SEQ ID NO:1062的多肽的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与SEQ ID NO:1053，SEQ ID NO:1054，SEQID NO:1055，SEQ ID NO:1056，SEQ ID NO:1057，SEQ ID NO:1058，SEQ ID NO:1059，SEQ IDNO:1060，SEQ ID NO:NO：1061SEQ，和SEQ IDNO：1062所述多肽至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含选自SEQ ID NO:1053，SEQ ID NO:1054，SEQ ID NO:1055，SEQ ID NO:1056，SEQ ID NO:1057，SEQ ID NO:1058，SEQ ID NO:1059，SEQ ID NO:1060，SEQ ID NO:1061SEQ和IDNO：1062的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码多肽的核酸序列，所述多肽由选自SEQ ID NO:1053，SEQ ID NO:1054，SEQ IDNO:1055，SEQ ID NO:1056，SEQIDNO：1057，SEQ ID NO:1058，SEQ ID NO:1059，SEQ ID NO:1060，SEQ ID NO:1061SEQ和IDNO：1062的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是为了遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1063相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1063。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是为了遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1064相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列SEQ IDNO:1064。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是对于遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1067相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1067。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是对于遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1068相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1068。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是对于遗传密码的冗余，编码与SEQID NO:1069相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1069。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是对于遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1070相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1070。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，但是对于遗传密码的冗余，编码与SEQ ID NO:1071相同的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含SEQ ID NO:1071。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:1063，SEQ ID NO:1064，SEQ ID NO:1067，SEQ ID NO:1068，SEQ ID NO:1069，SEQ ID NO:1070和/或SEQ ID NO:1071的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:1063，SEQ ID NO:1064，SEQ ID NO:1067，SEQ ID NO:1068，SEQID NO:1069，SEQIDNO：1070，和/或SEQ ID NO:1071的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含由选自SEQ ID NO:1063，SEQ ID NO:1064，SEQ ID NO:1067，SEQ ID NO:1068，SEQID NO:1069，SEQIDNO：1070，和/或SEQ ID NO:1071的序列组成的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:894，SEQ ID NO:895，SEQID NO:896，SEQ ID NO:897，SEQ ID NO:898，SEQ ID NO:899，SEQ ID NO:900，SEQ ID NO:901，SEQ ID NO:NO：902，SEQ ID NO:903，SEQ ID NO:904，SEQ ID NO:905，SEQ ID NO:906，SEQ ID NO:907，SEQ ID NO:908，SEQ ID NO:909，SEQ ID NO:910，SEQ ID NO:911，SEQ IDNO:912和/或SEQ ID NO:913DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:894，SEQ ID NO:895，SEQ ID NO:896，SEQ ID NO:897，SEQ IDNO:898，SEQIDNO：899，SEQ ID NO:900，SEQ ID NO:901，SEQ ID NO:902，SEQ ID NO:903，SEQ ID NO:904，SEQ ID NO:905，SEQ ID NO:906，SEQ ID NO:907，SEQ ID NO:908，SEQ IDNO:909，SEQ ID NO:910，SEQ ID NO:911，SEQ ID NO:912和/或SEQ ID NO:913的DNA序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含由选自SEQ ID NO:894，SEQ ID NO:895，SEQ IDNO:896，SEQ ID NO:897，SEQ ID NO:898，SEQ ID NO:899，SEQ ID NO:900，SEQ ID NO:901，SEQ ID NO:902，SEQ ID NO:903，SEQ ID NO:904，SEQ ID NO:905，SEQ ID NO:906，SEQ IDNO:907，SEQ ID NO:908，SEQ ID NO:909，SEQ ID NO:910，SEQ ID NO:911，SEQ ID NO:912和/或SEQ ID NO:913的DNA序列组成的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与SEQ ID NO:914，SEQ ID NO:915，SEQID NO:916，SEQ ID NO:917，SEQ ID NO:918和SEQ ID NO:919DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列包含选自SEQ ID NO:914，SEQ ID NO:915，SEQ IDNO:916，SEQ ID NO:917，SEQ ID NO:918和SEQ ID NO：919的DNA序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含由选自SEQ ID NO:914，SEQ ID NO:915，SEQ ID NO:916，SEQ ID NO:917，SEQ ID NO:918，和SEQ ID NO:919的DNA序列组成的核酸序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:920。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:921。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-12a构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:922。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-12b构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:923。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-12b构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:924。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-12构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:925。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:932。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列，例如SEQ IDNO:933。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人GMCSF构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:934。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IL-15构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:935。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IL-15构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:936。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IL-15构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:937。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人TNFα构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:938。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人TNFα构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:939。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人TNFα构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:940。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌标签的人IFNg构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:941。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人IFNg构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:942。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人IFNγ构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:943。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端OmpF分泌的人CXCL9构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:1075。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端PhoA分泌标签的人CXCL9构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:1076。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有N末端TorA分泌标签的人CXCL9构建体的基因序列，例如SEQ ID NO:1077。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其编码与选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的多肽序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽，或其功能片段或变体。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其编码与选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的多肽序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其编码包含选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的序列的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其编码由选自SEQ ID NO:920-943或1072-1078的序列组成的多肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种选自SEQ ID NO:953-960和SEQ ID NO:1081-1084的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与一种或多种DNA至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。选自SEQ ID NO:953-960和SEQ ID NO:1081-1084的序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有人IL-12a和人IL-12b的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，其包含SEQID NO:965的phoA-hIL12b-phoA-hIL12a部分或SEQ ID NO:966的phoA-mIL12b-phoA-mIL12a部分。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-IL15的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:967的phoA-IL15部分的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-GMCSF的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:968的phoA-GMCSF部分的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-TNFα的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ IDNO:969的phoA-TNFα部分的基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-IFNgγ的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:970的phoA-IFNgamma部分的基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-hCXCL10的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1085的phoA-hCXCL10部分的基因序列。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含含有phoA-hCXCL9的构建体。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:1087的hCXCL9部分的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。SEQ ID NO:1085和SEQ ID NO:1087。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与选自SEQ ID NO:965，SEQ ID NO:966，SEQ ID NO:967，SEQ ID NO:968，SEQ ID NO:969，SEQ ID NO:970的DNA序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列，不包括非编码区。
共刺激分子
CD40是在抗原呈递细胞上发现的共刺激蛋白，并且是其活化所必需的。CD154(CD40L)在T辅助细胞上与CD40的结合激活抗原呈递细胞并诱导多种下游免疫刺激作用。在一些实施方式中，抗癌分子(例如，免疫调节剂)是CD40的激动剂，例如，选自激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽的激动剂，和CD40L多肽片段。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-CD40抗体，激动性抗-CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段的序列。
因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-CD40抗体，激动性抗-CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段，例如，与强力有效连接。启动子和/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段的两个或更多个拷贝的序列，例如，两个任何这些序列的三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段的序列和编码分泌肽的序列(s)用于分泌所述抗体和多肽。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段和/或在表达的控制下表达分泌肽。由低氧条件激活的启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段和/或表达分泌肽。在由低氧条件激活的启动子的控制下。在某些实施方式中，基因工程化细菌在受控制下表达激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段和/或分泌肽。由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌在对照下表达激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段和/或表达分泌肽。癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子。
在一些实施方式中，工程化细菌包含编码针对CD40的抗体的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，CD40是人CD40。在一些实施方式中，抗CD40抗体是scFv。在一些实施方式中，分泌抗CD40抗体。在一些实施方式中，抗CD40抗体展示在细胞表面上。在任何这些实施方式中，包含透明质酸酶的基因序列进一步编码选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，FdnG，DmsA和PelB的分泌标签。在一些实施方式中，分泌标签位于抗CD40多肽序列的N末端和抗CD40编码序列的5'末端。在一些实施方式中，分泌标签位于抗CD40多肽序列的C末端和抗CD40编码序列的3'末端。在一个实施方式中，分泌标签是PhoA。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含选自lpp，nlP，tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。在一些实施方式中，缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
在一些实施方式中，基因工程化微生物能够在在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述基质调节回路或基因序列，例如透明质酸酶回路。在一些实施方式中，编码基质调节回路的基因序列，例如透明质酸酶回路，由在体内和/或体外由这些条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，任何一种或多种所述基质调节基因序列，例如透明质酸酶基因序列，存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述的基质调节，例如透明质酸酶回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)用于输入生物分子或基质的一种或多种转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的任何分泌回路，否则本领域已知的，(6)一个或多个表面展示回路，例如本文所述和本领域中已知的任何表面展示回路，以及(7)用于产生或降解一个的一个或多个回路。本文所述的更多代谢物(例如犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)(8)一种或多种此类附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌进一步编码透明质酸酶用于分泌或在细胞表面上展示。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌还包含用于消耗腺苷的基因序列。在一些实施方式中，用于消耗腺苷的基因序列包含选自add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC的一种或多种基因。在一些实施方式中，用于消耗腺苷的基因序列编码用于输入腺苷的转运蛋白。在一些实施方式中，编码转运蛋白的基因序列包含nupC。在一些实施方式中，编码转运蛋白的基因序列包含nupG。
CD28是在T细胞上表达的蛋白质之一，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。在一些实施方式中，抗癌分子(例如，免疫调节剂)是CD28的激动剂，例如，选自激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80(B7.1)多肽或多肽的激动剂。其片段和CD86(B7.2)多肽或其多肽片段。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段，例如，可操作地与强启动子连接和/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD40抗体，激动性抗CD40抗体片段，CD40配体(CD40L)多肽或CD40L多肽片段的两个或更多个拷贝的序列，例如，两个任何这些序列的三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段和编码序列的序列。用于分泌所述抗体和多肽的分泌肽。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段和/或表达分泌肽。在由低氧条件激活的启动子的控制下。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段和/或或表达在低氧条件下活化的启动子控制下的分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段和/或分泌肽，在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子的控制下，例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD28抗体，激动性抗CD28抗体片段，CD80多肽，CD80多肽片段，CD86多肽或CD86多肽片段和/或表达分泌肽。在癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子的控制下，例如本文所述的任何启动子。
ICOS是一种在结构上和功能上与CD28相关的诱导型T细胞共刺激因子。在一些实施方式中，抗癌分子，例如免疫调节剂，是ICOS的激动剂，例如，选自激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOS配体(ICOSL)多肽和ICOSL的激动剂。多肽片段。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段的序列。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段，例如，与强启动子可操作地连接和/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两种或更多种激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段(例如，2，3，4)的序列。任何这些序列的五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段的序列和编码用于编码分泌肽的序列的序列。所述抗体和多肽的分泌。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段和/或在启动子控制下表达分泌肽。由低氧条件激活。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段和/或表达分泌肽。控制由低氧条件激活的启动子。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达激动性抗-ICOS抗体，激动性抗-ICOS抗体片段，ICOSL多肽或ICOSL多肽片段和/或表达分泌肽。
CD226是在天然杀伤细胞，血小板，单核细胞和T细胞亚群(例如，CD8+和CD4+细胞)的表面上表达的糖蛋白，其介导细胞与携带其配体CD112和CD155的其他细胞的粘附。除其他外，它参与免疫突触形成并触发自然杀伤(NK)细胞活化。在一些实施方式中，抗癌分子，例如免疫调节剂是CD226的激动剂，例如，选自激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽的激动剂，和CD155多肽片段。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗CD226抗体，激动性抗CD226抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽或CD155多肽片段的序列。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段，例如，可操作地连接至强启动子和/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段的两个或更多个拷贝的序列，例如，两个任何这些序列的三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段和编码分泌肽的序列的序列(s)用于分泌所述抗体和多肽。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段和/或在表达的控制下表达分泌肽。由低氧条件激活的启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段和/或表达分泌肽。(s)在由低氧条件激活的启动子的控制下。在某些实施方式中，基因工程化细菌在受控制下表达激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段和/或分泌肽。由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如由所述条件激活并在本文中描述的任何启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌在对照下表达激动性抗CD226抗体，激动性抗CD266抗体片段，CD112多肽，CD112多肽片段，CD155多肽和CD155多肽片段和/或表达分泌性肽。癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子。
CD137或4-1BB是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白，其表达并对活化的T淋巴细胞(例如，CD8+和CD4+细胞)具有共刺激活性。已显示它增强T细胞增殖，IL-2分泌存活和细胞溶解活性。在一些实施方式中，抗癌分子，例如免疫调节剂，是CD137(4-1BB)的激动剂，例如，选自激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽的激动剂(CD137L)和CD137L多肽片段。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段的序列。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段，例如，与强启动子可操作地连接并且/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个拷贝的激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段的序列，例如，两个，三个任何这些序列的四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段的序列，以及编码分泌肽的序列(s))用于分泌所述抗体和多肽。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段，和/或在a的控制下表达分泌肽。由低氧条件激活的启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段，和/或表达分泌肽)在低氧条件下活化的启动子的控制下。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子，例如本文所述的任何启动子的控制下表达激动性抗CD137抗体，激动性抗CD137抗体片段，CD137配体多肽或CD137配体多肽片段，和/或表达分泌性肽。
OX40或CD134是T细胞受体，参与保持T细胞的存活并随后增加细胞因子的产生。OX40由于其提高存活率的能力，在维持免疫反应和记忆反应方面发挥着关键作用。它还在Th1和Th2介导的反应中起重要作用。在一些实施方式中，抗癌分子，例如免疫调节剂，是OX40的激动剂，例如选自激动性抗OX40抗体，激动性抗OX40抗体片段，OX40配体(OX40L)和OX40L片段的激动剂。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段的序列。因此，在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以产生激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段的序列。在一些实施方式中，工程化细菌经工程改造以过表达激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段，例如，可操作地连接优选的启动子和/或包含任何这些基因序列的一个以上拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码两个或更多个拷贝的激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段的序列。例如，任何这些序列的两个，三个，四个，五个，六个或更多个拷贝。在一些实施方式中，工程化细菌包含编码激动性抗OX40或抗CD134抗体的序列，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段和编码序列。用于分泌所述抗体和多肽的分泌肽。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段和/或表达分泌肽。在由低氧条件激活的启动子的控制下。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其表达激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段和/或表达在低氧条件下活化的启动子控制下的分泌肽。在某些实施方式中，基因工程化细菌在由缺氧条件或炎性条件激活的启动子，例如任何由所述条件激活并在本文描述的启动子的控制下，表达激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段和/或分泌肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌在癌症特异性启动子，组织特异性启动子或组成型启动子的控制下，例如本文所述的任何启动子，表达激动性抗OX40或抗CD134抗体，激动性抗OX40或抗CD134抗体片段，OX40L多肽或OX40L多肽片段和/或表达分泌肽。
在任何这些实施方式中，抗体可以是人抗体或人源化抗体，并且可以包含不同的同种型，例如人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。此外，抗体可以包含恒定区，其被修饰以增加或降低效应子功能，例如FcR结合，FcRn结合，补体功能，糖基化，C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)。在任何这些实施方式中，抗体可以是单链抗体或单链抗体片段。
抗原/疫苗
通过将肿瘤抗原(例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原(TAA(s))和/或新抗原引入局部肿瘤环境，可以产生针对特定癌症或肿瘤细胞的免疫应答。已知与新抗原相关的兴趣。如本文所用，术语“肿瘤抗原”意指肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原(TAA)和新抗原。如本文所用，肿瘤抗原还包括“致癌病毒抗原”，癌胚抗原，组织分化抗原和癌-睾丸抗原。
可以改造工程化微生物，使得肽(例如肿瘤抗原)可以锚定在微生物细胞壁中(例如，在微生物细胞表面)。这些被称为壁锚定抗原因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌被工程化以产生一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方式中，基因工程化细菌经工程改造以产生一种或多种肿瘤特异性抗原。在一些实施方式中，基因工程化细菌经工程改造以产生一种或多种肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，基因工程化细菌经工程改造以产生一种或多种新抗原。在一些实施方式中，基因工程化细菌被工程化以产生选自致癌病毒抗原，癌胚抗原，改变的细胞表面糖脂和糖蛋白，组织分化抗原，癌症-睾丸抗原和独特型的一种或多种抗原。抗原。本文提供了示例性肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原和/或新抗原，并且是本领域已知的。
在一些实施方式中，抗原分泌到肿瘤微环境中，其中它们被免疫细胞吸收用于抗原呈递。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种肿瘤抗原的序列，例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原和/或新抗原，以及允许分泌的序列。抗原，例如本文所述的任何分泌系统，方法和序列。在一些实施方式中，抗原锚定于工程化微生物细胞壁，膜或衣壳。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌被工程化以产生一种或多种肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原和/或新抗原，其是壁锚定抗原。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码一种或多种肿瘤抗原的序列，例如肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原和/或新抗原，以及将抗原靶向细胞的序列。壁，膜或衣壳，例如本文所述的任何细胞壁靶向方法和序列
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种选自SEQ ID NO:160-561的基因序列。在一些实施方式中，所述序列与SEQ ID NO:160-561中的任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
其他免疫调节剂
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节M2巨噬细胞诱导细胞因子和/或生长因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生抑制M2巨噬细胞诱导细胞因子和/或生长因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节M1巨噬细胞的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生诱导M1巨噬细胞的免疫调节剂。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节髓源性抑制细胞(MDSC)的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生抑制MDSC功能的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节抗原呈递细胞和T细胞相互作用的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节CTL/CD8+T细胞诱导细胞因子和/或生长因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生刺激CTL/CD8+T细胞诱导细胞因子和/或生长因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生调节攻击免疫抑制细胞的趋化因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生刺激攻击免疫抑制细胞的趋化因子的免疫调节剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生免疫调节剂，例如下表8中发现的任何免疫调节剂。
表8。示例性免疫调节剂
Figure BDA0002194618080002551
Figure BDA0002194618080002561
其他抗癌分子
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生细胞毒性的抗肿瘤分子。例如，基因工程化细菌能够产生天青蛋白，例如铜绿假单胞菌天青蛋白，一种能够进入人类癌细胞并诱导细胞凋亡的细菌氧化还原蛋白(Bernardes等，2013；Zang等，2012)。在一些实施方式中，基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其能够在由低氧条件激活的启动子的控制下表达天青蛋白。
在替代性实施方式中，抗癌分子选自细胞毒性剂，ClyA，FASL，TRAIL，TNF-α，细胞因子，CCL21，IL-2，IL-18，LIGHT，抗原，抗体，单个-chain抗体，CtxB-PSA融合蛋白，CPV-OmpA融合蛋白，NY-ESO-1肿瘤抗原，RAF1，单链HIF1-α抗体，单链CTLA-4抗体，单个链PD-1抗体，内皮抑素，血小板反应蛋白-1，TRAIL，SMAC，Stat3，Bcl2，FLT3L，GM-CSF，IL-12，AFP，VEGFR2，酶，大肠杆菌CD和HSV-TK。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌是肿瘤靶向细菌，其包含编码单链HIF1-α抗体的基因，并且能够将抗癌分子特异性地和局部地递送至癌细胞。
CD166是免疫球蛋白超家族的成员和淋巴细胞抗原CD6的配体，介导嗜同性和嗜异性粘附。它在活化的白细胞T细胞，B细胞，单核细胞，造血干细胞(HSC)，转移性黑素瘤，神经细胞，内皮细胞，支持造血细胞的成骨细胞系和MDSC上表达。在一个实施方式中，基因工程化细菌含有一种或多种编码针对CD166的单链抗体的基因。在另一个实施方式中，基因工程化的OV编码针对CD70的单链抗体。抗免疫CD166的单链抗体的非限制性实例描述于Immunotherapy November 2010，Volume59，Issue11，pp1665-1674中。
其他抗癌分子包括治疗性核酸(RNA和DNA)，例如，国际专利申请PCT中描述的RNAi分子(例如siRNA，miRNA，dsRNA)，mRNA，反义分子，适体和CRISPER/Cas9分子。在2017年11月1日提交的/US2017/013072，公布为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生RNA或DNA抗癌分子的一种或多种抗癌分子的序列，例如包括选自RNAi分子(siRNA，miRNA，dsRNA)的核酸分子。，mRNA，反义分子，适体和CRISPR/Cas9分子。这些分子在下文提供的参考文献中举例说明和讨论。
在一些实施方式中，基因工程化细菌可以与治疗性过继细胞疗法组合施用，例如在2017年11月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中描述的任何过继性细胞疗法，公布为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文，或者在本领域中已知。
在其他实施方式中，在2017年11月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中描述的一种或多种TCR疗法，公开为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文，或者以其他方式在本领域可以与本发明的基因工程化细菌组合施用。
BiTE抗体是由两种不同抗体的scFv组成的重组融合蛋白，其通过柔性接头连接，因此具有两个不同的结合位点。在一些实施方式中，基因工程化细菌可以编码一种或多种BiTE抗体，例如，针对一种或多种本文所述的免疫调节剂。例如，在一些实施方式中，BiTE抗体针对免疫检查点，例如针对CTLA-4，PD-1或PD-L1。在一些实施方式中，BiTE抗体针对CD47或SIRPα。在其他实施方式中，一种或多种BiTE抗体可以与本发明的基因工程化细菌组合施用。在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌产生SEQ ID NO:562的抗体或其片段或变体。
在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％的抗癌分子。
在另一种抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的抗癌分子。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的抗癌分子。
在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至底物多100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌基质约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌能够使细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在本文所述的任何抗癌分子生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
前药
前药治疗提供较少反应性和细胞毒性的抗癌药物。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够将前药转化为其活性形式。合适的前药系统的一个例子是5-FC/5-FU系统。
细胞毒性和放射增敏剂5-氟尿嘧啶(5-FU)用于治疗许多癌症，包括胃肠道，乳腺癌，头颈癌和结肠直肠癌(Duivenvorrden等，2006，Sensitivityof5-氟尿嘧啶抗性癌细胞至腺病毒自杀基因治疗；癌症基因治疗(2006)14，57-65)。然而，毒性限制了其在较高浓度下的给药。为了在肿瘤中获得更高浓度且毒性更小，开发了前药系统。胞嘧啶脱氨酶使前药5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨基成5-FU。可以以相对高的浓度引入5-FC，允许在肿瘤部位产生的5-FU达到高于可以全身安全施用的浓度。在肿瘤部位，然后通过细胞酶将5-FU转化为有效的嘧啶抗代谢物，5-FdUMP，5-FdUTP和5-FUTP。这些代谢物作为代谢阻滞剂起作用，抑制胸苷酸合成酶，将核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸，从而抑制DNA合成(Horani等2015年。抗癌前药-三十年的设计；wjpps；第4卷，第07期，1751-1779，以及其中的参考文献)。
该系统通过包含将5-FU转化为5-氟尿苷一磷酸的UPRT进一步改进，这是其激活途径的第一步，类似于哺乳动物乳清酸磷酸核糖转移酶的作用(Tiraby等，1998；伴随)大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶的表达改善了5-氟胞嘧啶的细胞毒性。FEMSMicrobiolLett1998；176：41-49)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列(EC3.5.4.1)
在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶是codA。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达来自酵母的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌表达codA-upp融合蛋白。
适用于基因工程化细菌中异源表达的胞嘧啶脱氨酶的非限制性实例包括发光杆菌(Larbognteriumleiognathi)亚种。mandapamensissvers.1.1。(PMSV_1378)，PseudomonasmendocinaNK-01(MDS_1548)，StreptomycescoelicolorA3(2)(SCO4634)，AchromobacterxylosoxidansAXX-A(AXXA_10715，AXXA_16292)，Gluconacetobactersp。SXCC-1(CODA)，GallibacteriumanatisUMN179(UMN179_00049)，KlebsiellaoxytocaKCTC1686(KOX_14050，KOX_04555)，TaylorellaasinigenitalisMCE3(TASI_1310)，RhodococcusjostiiRHA1(RHA1_RO00599，RHA1_RO00597)，产气肠杆菌KCTC2190(EAE_13265，EAE_05115)，CandidatusArthromitussp。SFB-小鼠-日本(SFBM_1249)，青枯雷尔氏菌Po82(CODA)，SalinisphaerashabanensisE1L3A(SSPSH_07086)，粘多糖芽孢杆菌KNP414(KNP414_03230，KNP414_03233)，BradyrhizobiumjaponicumUSDA6(BJ6T_60100，BJ6T_60090)，CandidatusArthromitussp。SFB-rat-Yit(RATSFB_1079)，恶臭假单胞菌S16(PPS_2740)，WeissellakoreensisKACC15510(WKK_05060)，阴沟肠杆菌EcWSU1(YAHJ，CODA)，BizioniaargentinensisJUB59(BZARG_2213)，根癌农杆菌F2(AGAU_L101956)，副球菌(Paracoccusdenitrificans)SD1(PDI_1216)，嗜酸性硫杆菌TPY(CODA)，VibriotubiashiiATCC19109(VITU9109_13741)，NitrosococcuswatsoniiC-113(NWAT_2475)，Blattabacteriumsp。(Mastotermesdarwiniensis)str。MADAR(CODA)，Blattabacteriumsp。(Cryptocercuspunctulatus)str。Cpu(CODA)，PelagibacteriumhalotoleransB2(KKY_852，KKY_850)，Burkholderiasp。YI23(BYI23_A018410，BYI23_A008960)，Synechococcussp。CC9605(SYNCC9605_0854)，荧光假单胞菌F113(AEV61892.1)，弧菌属。EJY3(VEJY3_16491)，SynechococcuselongatusPCC7942(SYNPCC7942_0568)，Bradyrhizobiumsp。ORS278(BRADO1789，BRADO0862)，Synechocystissp。PCC6803(CODA)，MicrocoleuschthonoplastesPCC7420(MC7420_274)，Prochlorococcusmarinusstr。AS9601(CODA)，大肠杆菌O157：H7str。EDL933(YAHJ，CODA)，恶臭假单胞菌KT2440(CODA)，Synechococcussp。WH8109(SH8109_1371)，Prochlorococcusmarinussubsp。马林努斯大街CCMP1375(SSNA)，Prochlorococcusmarinusstr。麻省理工学院9515(CODA)，Prochlorococcusmarinusstr。麻省理工学院9301(CODA)，Prochlorococcusmarinusstr。NATL1A(CODA)，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciensstr。)C58(ATU4698)，自体脱硫杆菌HRM2(CODA)，Cyanobiumsp。PCC7001(CPCC7001_2605)，鼠疫耶尔森氏菌KIM10(CODA)，产气荚膜梭菌ATCC13124(CODA)，Nocardioidessp。JS614(NOCA_1495)，棒状杆菌有效菌YS-314(CODA)，谷氨酸棒杆菌ATCC13032(CGL0076，CODA)，炭疽杆菌str。Ames(BAS4389)，Dickeyadadantii3937(CODA)，大肠杆菌CFT073(CODA，YAHJ)，红色TrichodesmiumerythraeumIMS101(TERY_4570)，荧光假单胞菌Pf0-1(CODA，PFL01_3146)，长双歧杆菌NCC2705(CODA)，Carnobacteriumsp。17-4(CAR_C04640，ATZC)，铜绿假单胞菌PAO1(CODA)，破伤风梭菌E88(CTC_01883)，鼠疫耶尔森氏菌CO92(CODA)，伯克霍尔德氏菌J2315(BCAM2780，CODA)，荧光假单胞菌SBW25(CODA)，创伤弧菌CMCP6(VV2_0789)，沙门氏菌NCTC12419(CODA)，肠沙门氏菌亚种。entericaserovarTyphistr。CT18(CODA)，荧光假单胞菌Pf-5(CODA)，海洋芽孢杆菌HTE831(OB1267)，Synechococcussp。RS9916(RS9916_32902)，Synechococcussp。RS9917(RS9917_02061)，MannheimiasucciniciproducensMBEL55E(SSNA)，副溶血性弧菌RIMD2210633(VPA1243)，BradyrhizobiumjaponicumUSDA110(BLL3846，BLL7276)，MarinobacteradhaerensHP15(HP15_2772)，粪肠球菌V5833seqsEF_1061，EF_1062，EF_0390)，芽孢杆菌蜡烛ATCC14579(BC_4503)，Synechococcussp。Synechococcussp。CB0101(SCB01_010100001875)CB0205(SCB02_010100013621)，BurkholderiamalleiATCC23344(CODA)，LabrenziaalexandriiDFL-11(SADFL11_5050)，MyxococcusxanthusDK1622(MXAN_5420)，RuegeriapomeroyiDSS-3(SPO2806)，GloeobacterviolaceusPCC7421(GLL2528)，Streptomycessp。C(SSNG_03287，SSNG_04186)，RalstoniaeutrophaJMP134(REUT_B3993)，MoorellathermoaceticaATCC39073(MOTH_0460)，RubrobacterxylanophilusDSM9941(RXYL_0224)，BurkholderiaxenovoransLB400(BXE_A2120，BXE_A1533)，Sinorhizobiummeliloti1021(R02596)，MesorhizobiumlotiMAFF303099(MLR5363，MLL2061)，青枯雷尔氏菌GMI1000(CODA)，细长聚球蓝细菌PCC6301(CODA)，BurkholderiavietnamiensisG4(BCEP1808_4874)，红螺菌(Rhodospirillumrubrum)ATCC11170(RRU_A2788)，Marinobactersp。ELB17(MELB17_06099)，GluconacetobacterdiazotrophicusPA15(GDIA_2518，GDI3632)，肺炎克雷伯菌亚种。肺炎支原体MGH78578(KPN_00632，CODA)，多杀巴斯德氏菌亚种。multocidastr。Pm70(PM0565)，球形红细菌2.4.1(RSP_0341)，戊糖片球菌ATCC25745(PEPE_0241)，Pseudogulbenkianiaferrooxidans2002(FURADRAFT_0739)，DesulfuromonasacetoxidansDSM684(DACE_0684)，AurantimonasmanganoxydansSI85-9A1(SI859A1_01947)，Bradyrhizobiumsp。BTAi1(BBTA_2105，BBTA_7204)，阪崎肠杆菌ATCCBAA-894(ESA_03405)，ArthrobacteraurescensTC1(AAUR_3889，AAUR_0925)，Arthrobactersp。FB24(ARTH_3600)，Jannaschiasp。CCS1(JANN_1306)，Polaromonassp。JS666(BPRO_1960)，深紫红色细菌SS9(Y3946)，Frankiasp。EuI1c(FRAEUI1C_4724，FRAEUI1C_4625)，ThermomicrobiumroseumDSM5159(TRD_1845)，土壤杆菌S4(AVI_2101，AVI_2102)，土壤杆菌放射菌K845seqsARAD_9085，ARAD_9086，ARAD_8033，ARAD_3518，ARAD_9893)，费氏弧菌ES114(CODA)，Lyngbyasp。聚合酶链球菌8106(L8106_10086)，Synechococcussp。BL107(BL107_11056)，芽孢杆菌属。NRRLB-14911(B14911_04044)，Roseobactersp。MED193(MED193_17224)，Roseovariussp。217(ROS217_10957)，PelagibacabermudensisHTCC2601(R2601_16485，R2601_00530)，Marinomonassp。MED121(MED121_23629)，Lactobacillussakeisubsp。清酒23K(LCA_1212)，BacillusweihenstephanensisKBAB4(BCERKBAB4_4331)，RhodopseudomonaspalustrisHaA2(RPB_2084)，AliivibriosalmonicidaLFI1238(CODA)，Synechococcussp。CC9902(SYNCC9902_1538)，大肠杆菌str。K-12substr。W3110(CODA，YAHJ)，ParacoccusdenitrificansPD1222(PDEN_1057)，Synechococcussp。WH7803(CODA)，Synechococcussp。SyAchococcussp。JA-3-3Ab(CYA_1567，CODA)。JA-2-3Ba(2-13)(CYB_1063，CODA)，短杆菌亚种BL2(BLINB_010200009485)，AzotobactervinelandiiDJ(CODA)，Paenibacillussp。JDR-26seqsPJDR2_6131，PJDR2_6134，PJDR2_3617，PJDR2_3622，PJDR2_3255，PJDR2_3254)，FrankiaalniACN14a(FRAAL4250)，短双歧杆菌UCC2003(CODA)，Blattabacteriumsp。(Blattellagermanica)str。Bge(BLBBGE_353)，αproteobacteriumBAL199(BAL199_01644，BAL199_09865)，Carnobacteriumsp。AT7(CAT7_10495，CAT7_05806)，NitrosomonaseutrophaC91(NEUT_1722)，哈维氏弧菌ATCCBAA-1116(VIBHAR_05319)，BurkholderiaambifariaAMMD(BAMB_3745，BAMB_4900)，Actinobacillussuccinogenes130Z(ASUC_1190)，RhodobactersphaeroidesATCC17025(RSPH17025_0955)，Lactobacillusreuteri100-23(LR0661)，AcidiphiliumcryptumJF-5(ACRY_0828)，HahellachejuensisKCTC2396(HCH_05147)，AlkaliphilusoremlandiiOhILAs(CLOS_1212，CLOS_2457)，BurkholderiadolosaAUO158(BDAG_04094，BDAG_03273)，Roseobactersp。AzwK-3b(RAZWK3B_08901)，恶臭假单胞菌F1(PPUT_2527)，ClostridiumphytofermentansISDg(CPHY_3622)，BrevibacillusbrevisNBRC1005994seqsBBR47_15870，BBR47_15630，BBR47_15620，BBR47_15610)，Bordetellaavium197N(CODA)，大肠杆菌536(CODA，YAHJ))，PolaromonasnaphthalenivoransCJ2(PNAP_4007)，RamlibactertataouinensisTTB310(CODA)，Janthinobacteriumsp。马赛(CODA)，施氏假单胞菌A1501(CODA)，嗜水气单胞菌亚种。嗜水气单胞菌ATCC7966(CODA)，真养雷氏菌H16(CODA，SSNA)，昆虫假单胞菌L48(PSEEN3598)，LabrenziaaggregataIAM12614(SIAM614_16372，SIAM614_21000)，短乳杆菌ATCC367(LVIS_1932)，SagittulastellataE-37(SSE37_18952)，芽孢杆菌B149053seqsBB14905_20948，BB14905_12010，BB14905_12015)，PseudomonasputidaW6193seqsPPUTW619_3228，PPUTW619_2210，PPUTW619_2162)，StenotrophomonasmaltophiliaR551-3(SMAL_2348)，BurkholderiaphymatumSTM815(BPHY_1477)，Vibrionales细菌SWAT-3(VSWAT3_26556)，Roseobactersp。GAI101(RGAI101_2568)，VibrioshiloniiAK1(VSAK1_17107)，Pedobactersp。BAL39(PBAL39_00410)，Roseovariussp。TM1035(RTM1035_18230，RTM1035_17900)，Octarcabacterantarcticus238(OA238_4970)，PhaeobactergallaeciensisDSM17395(CODA)，OceanibulbusindolifexHEL-45(OIHEL45_14065，OIHEL45_01925)，Octarcabacterantarcticus307(OA307_78)，VerminephrobactereiseniaeEF01-2(VEIS_0416，VEIS_4430)，ShewanellawoodyiATCC51908(SWOO_1853)，Yersiniaenterocoliticasubsp。enterocolitica8081(CODA)，ClostridiumcellulolyticumH10(CCEL_0909)，BurkholderiamultivoransATCC17616(CODA，BMUL_4281)，LeptothrixcholodniiSP-6(LCHO_0318)，AcidovoraxcitrulliAAC00-1(AAVE_3221)，BurkholderiaphytofirmansPsJN(BPHYT_2598，BPHYT_2388)，DelftiaacidovoransSPH-1(DACI_4995)，ShewanellapealeanaATCC700345(SPEA_2187)，DinoroseobactershibaeDFL12(CODA)，Pseudomonasmendocinaymp(PMEN_3834)，Serratiaproteamaculans568(SPRO_0096，SPRO_4594)，Enterobactersp。638(ENT638_3792，ENT638_3140)，Marinomonassp。MWYL1(MMWYL1_1583)，SaccharopolysporaerythraeaNRRL2338(SERYN2_010100001217)，XenorhabdusnematophilaATCC19061(XNC1_2097)，Nocardioidaceae细菌Broad-1(NBCG_02556)，HoefleaphototrophicaDFL-43(HPDFL43_16047)，Paracoccussp。TRP(PATRP_010100008956)，Cyanothecesp。PCC8801(PCC8801_1952)，ShewanellasediminisHAW-EB3(SSED_2803)，Methylobacteriumsp。4-46(M446_3603，M446_0933)，MethylobacteriumradiotoleransJCM2831(MRAD2831_4824)，AzorhizobiumcaulinodansORS571(AZC_1945)，OchrobactrumanthropiATCC49188(OANT_3311)，Ruegeriasp。R11(RR11_1621)，Cyanothecesp。ATCC51142(CODA)，StreptomycesclavuligerusATCC27064(SCLAA2_010100026671，SCLAV_5539)，LysinibacillussphaericusC3-41(BSPH_4231)，ClostridiumbotulinumNCTC2916(CODA)，AnaerotruncuscolihominisDSM172413seqsANACOL_03998，ANACOL_02279，ANACOL_01309)，ActinosynnemamirumDSM43827(AMIR_0538)，SanguibacterkeddieiiDSM10542(SKED_28020，SKED_17260)，StackebrandtianassauensisDSM44728(SNAS_1703)，MicrocystisaeruginosaNIES-843(MAE_05360)，ClostridiumperfringensNCTC8239(CODA)，KitasatosporasetaeKM-6054(KSE_36300，KSE_36320)，ArthrobacterchlorophenolicusA6(ACHL_1061)，Streptomycesgriseussubsp。griseusNBRC13350(SGR_6458)，Clostridiumsp。7_2_43FAA(CSBG_02087)，梭菌属细菌1_7_47FAA(CBFG_00901)，白色链霉菌J1074(SSHG_05633)，ShewanellahalifaxensisHAW-EB4(SHAL_2160)，甲基芽孢杆菌ORS2060(MNOD_3349)，链霉菌属物种。Mg1(SSAG_05271)，欧文氏菌(Erwiniatasmaniensis)Et1/99(CODA)，大肠杆菌BL21(DE3)4seqsYAHJ，CODA，B21_00295，B21_00283)，ConexibacterwoeseiDSM146843seqsCWOE_5700，CWOE_5704，CWOE_0344)，柠檬酸杆菌属(Citrobactersp。)。30_2(CSAG_03013，CSAG_02691)，伯克霍尔德氏菌细菌1_1_47(HMPREF0189_01313)，肠杆菌科细菌9_2_54FAA(HMPREF0864_03568)，溃疡杆菌ATCC49185(FUAG_02220)，FusobacteriumvariumATCC27725(FVAG_00901)，BeutenbergiacavernaeDSM12333(BCAV_1683，BCAV_1451)，ProvidenciastuartiiATCC25827(PROSTU_04183)，ProteuspenneriATCC35198(PROPEN_03672)，StreptosporangiumroseumDSM43021(SROS_3184，SROS_4847)，Paenibacillussp。Y412MC103seqsGYMC10_2692，GYMC10_4727，GYMC10_3398)，大肠杆菌ATCC8739(YAHJ，CODA)，KtedonobacterracemiferDSM44963(KRAC_3038)，MarinomonasposidonicaIVIA-Po-181(MAR181_2188)，Cyanothecesp。PCC7822(CYAN7822_1898)，EdwardsiellatardaEIB202(CODA)，ProvidenciarustigianiiDSM4541(PROVRUST_05865)，EnterobactercancerogenusATCC35316(ENTCAN_08376，ENTCAN_08631)，CitrobacteryoungaeATCC29220(CIT292_10672，CIT292_09697)，Citreicellasp。SE45(CSE45_2970)，EscherichiaalbertiiTW07627(ESCAB7627_0317)，OligotrophacarboxidovoransOM5(OCAR_4627，CODA)，Escherichiacolistr。K-12substr。MG1655(YAHJ，CODA)，布氏乳杆菌NRRLB-30929(LBUC_2038)，ArthrospiramaximaCS-328(AMAXDRAFT_2897)，Pantoeasp。AB(PANABDRAFT_0565，PANABDRAFT_2938)，真杆菌biformeDSM3989(EUBIFOR_01772)，普罗维登斯alcalifaciensDSM30120(PROVALCAL_01131，PROVALCAL_02804)，雷氏普罗威登斯菌DSM1131(PROVRETT_08714，PROVRETT_08169)，嗜麦芽窄食K279a(ATZC2)，AnaerococcuslactolyticusATCC51172(CODA)，AnaerococcustetradiusATCC35098(HMPREF0077_0097)，ChryseobacteriumgleumATCC35910(DAN2)，LactobacillusbuchneriATCC11577(CODA)，LactobacillusvaginalisATCC49540(CODA)，ListeriagrayiDSM20601(HMPREF0556_10753，HMPREF0556_10751，ATZC)，DesulfomicrobiumbaculatumDSM4028(DBAC_2936))，AnaerococcusprevotiiDSM20548(APRE_1112)，SebaldellatermitidisATCC33386(STERM_0789)，MeiothermussilvanusDSM9946(MESIL_2103)，ProteusmirabilisHI4320(CODA)，MesorhizobiumopportunistumWSM2075(MESOP_0162)，VariovoraxparadoxusS110(VAPAR_2654)，巨大芽孢杆菌QMB1551(BMQ_0980)，假双歧杆菌DSM20438＝JCM1200(BIFPSEUDO_04382)，FerrimonasbalearicaDSM9799(FBAL_2173)，Ruminococcaceae细菌D16(HMPREF0866_00501)，Photorhabdusasymbioticasubsp。asymbioticaATCC43949(PAU_00294)，Halothiobacillusneapolitanusc2(HNEAP_0844)，副猪嗜血杆菌SH0165(CODA)，DickeyazeaeEch1591(DD1591_0763)，Bilophilawadsworthia3_1_6(HMPREF0179_03393)，EnterococcusgallinarumEG2(EGBG_00349)，EnterococcuscasseliflavusEC20(ECBG_00307)，SpirochaetasmaragdinaeDSM11293(SPIRS_1052，SPIRS_0110)，不动杆菌juniiSH205(HMPREF0026_02783)，VibriosplendidusLGP32(VS_II0327)，DickeyadadantiiEch703(DD703_0777)，Moritellasp。PE36(PE36_15643)，HirschiabalticaATCC49814(HBAL_0036)，AminomonaspaucivoransDSM12260(APAU_2064)，WeissellaparamesenteroidesATCC33313(CODA)，DickeyadadantiiEch586(DD586_3388)，Streptomycessp。SPB78(SSLG_06016)，Streptomycessp。AA4(SSMG_05855，SSMG_03227)，绿色链霉菌DSM40736(SSQG_04727)，黄色链霉菌ATCC33331(SFLA_1190)，厌氧菌厌氧菌ATCCBAA-1850(HMPREF1705_02256)，Pantoeasp。At-9b(PAT9B_3678，PAT9B_1029，PAT9B_0855)，VariovoraxparadoxusEPS(VARPA_3257，VARPA_0920)，Prochlorococcusmarinussubsp。帕斯托里斯大街CCMP1986(CODA)，Synechococcussp。WH7805(WH7805_05676)，Blattabacteriumsp。(美洲大蠊)str。BPLAN(CODA)，BurkholderiaglumaeBGR1(BGLU_1G17900)，Azoarcussp。BH72(CODA)，ClostridiumbutyricumE4str。BoNTEBL5262(CODA)，ErwiniapyrifoliaeEp1/96(CODA)，ErwiniabillingiaeEb661(EBC_35430，CODA，EBC_32850，EBC_32780)，Edwardsiellaictaluri93-146(NT01EI_3615)，CitrobacterrodentiumICC168(CODA)，StarkeyanovellaDSM506(SNOV_3614，SNOV_2304)，Burkholderiasp。CCGE1001(BC1001_2311)，Burkholderiasp。CCGE1002(BC1002_1908，BC1002_1610)，Burkholderiasp。CCGE1003(BC1003_1147)，EnterobacterasburiaeLF7a(ENTAS_4074，ENTAS_3370)，OchrobactrumintermediumLMG3301(OINT_2000395，OINT_2001541)，ClostridiumlentocellumDSM5427(CLOLE_1291)，DesulfovibrioaespoeensisAspo-2(DAES_2101)，GordonianeofelifaecisNRRLB-59395(SCNU_19677)，Synechococcussp。CC9311(SYNC_0740)，ThermaerobactermarianensisDSM12885(TMAR_1477)，RhodomicrobiumvannieliiATCC17100(RVAN_3395)，BacilluscellulosilyticusDSM2522(BCELL_1091，BCELL_1234)，Cyanothecesp。PCC7424(PCC7424_0235)，Lachnospiraceae细菌3_1_57FAA_CT1(HMPREF0994_04419)，芽孢杆菌属物种。2_A_57_CT2(HMPREF1013_04901，HMPREF1013_04902，HMPREF1013_01532，HMPREF1013_04888)，Afipiasp。1NLS2(AFIDRAFT_3092)，BacillusclausiiKSM-K16(ABC4032)，SerratiaodoriferaDSM4582(YAHJ，CODA)，溶藻弧菌40B(VMC_19080)，PseudonocardiadioxanivoransCB1190(PSED_5383)，VibriocoralliilyticusATCCBAA-450(VIC_002709)，VibrioorientalisCIP102891＝ATCC33934(VIA_000851)，Photobacteriumdamselaesubsp。damselaeCIP102761(VDA_000799)，PrevotellabuccalisATCC35310(HMPREF0650_2329)，Serratiaodorifera4Rx13(SOD_G01050，SOD_H00810)，Synechococcussp。WH5701(WH5701_16173，WH5701_07386)，ArthrospiraplatensisNIES-39(BAI89358.1)，Vibriosp。N418(VIBRN418_08807)，阴沟肠杆菌SCF1(ENTCL_0362)，ClaiococcusclausseniiATCCBAA-344(CODA)，PantoeaananatisLMG20103(CODA，YAHJ)，Bradyrhizobiaceae细菌SG-6C(CSIRO_2009)，PantoeavagansC9-1(CODA，YAHJ))，发酵乳杆菌CECT5716(LC40_0597)，LactobacillusinersAB-1(LINEA_010100006044)，梭状芽孢杆菌ZC1(BFZC1_05123，BFZC1_05118)，类芽孢杆菌V453(PVOR_16204，PVOR_25863)，阴沟肠杆菌亚种。cloacaeATCC13047(ECL_04741，ECL_03997)，MarinomonasmediterraneaMMB-1(MARME_0493)，阴沟肠杆菌亚种。cloacaeNCTC9394(ENC_29090，ENC_34640)，Rahnellasp。Y9602(RAHAQ_4063，RAHAQ_0278)，AchromobacterpiechaudiiATCC43553(HMPREF0004_2397，ATZC，CODA)，Sutterellawadsworthensis3_1_45B(HMPREF9464_00595)，Pseudomonasfulva12-X(PSEFU_1564)，RahnellaaquatilisCIP78.65＝ATCC33071(AEX50243.1，AEX53933.1))，Prochlorococcusmarinusstr。麻省理工学院9312(PMT9312_1400)，Prochlorococcusmarinusstr。MIT9313(CODA)，荧光假单胞菌WH6(YAHJ)，ClostridiumljungdahliiDSM13528(CLJU_C19230)，StreptomyceslingchenggensisBCW-1(SBI_06150)，AmycolatopsismediterraneiU32(AMED_1997)，MicrocoleusvaginatusFGP-2(MICVADRAFT_2986，MICVADRAFT_1253)，KetogulonigeniumvulgarumWSH-001(CODAB，KVU_1143)，AchromobacterxylosoxidansA84seqsAXYL_01223，AXYL_05738，AXYL_01981，CODA)，PedobactersaltansDSM12145(PEDSA_0106)，MesorhizobiumciceribiovarbiserrulaeWSM1271(MESCI_0163)，PseudomonasputidaGB-1(PPUTGB1_2651，PPUTGB1_3590)，XanthobacterautotrophicusPy2(XAUT_4058)，Synechococcussp。WH8102(CODA)，CorynebacteriumvariabileDSM44702(CODA)，Agrobacteriumsp。H13-3(AGROH133_09551)，PediococcusacidilacticiDSM20284(CODA)，副流感嗜血杆菌T3T1(PARA_18250)，WeeksellavirosaDSM16922(WEEVI_1993)，AerococcusurinaeACS-120-V-Col10a(CODA)，ThermaerobactersubterraneusDSM13965(THESUDRAFT_1163)，AeromonascaviaeAe398(ACAVA_010100000636)，BurkholderiarhizoxinicaHKI454(RBRH_03808)，肠沙门氏菌亚种。arizonaeserovarstr。RSK2980(SARI_04290)，HylemonellagracilisATCC19624(HGR_11321)，AggregatibactersegnisATCC33393(CODA)，RoseovariusnubinhibensISM(ISM_11230)，Plautiastalisymbiont(PSTAS_010100016161，PSTAS_010100013574)，PeptoniphilushareiACS-146-V-Sch2b(CODA)，假性弧菌FO-BEG1(PSE_0768)，WeissellacibariaKACC11862(WCIBK1_010100001529)，Synechococcussp。PCC7335(S7335_2052，S7335_109，S7335_1731)，AnaerolineathermophilaUNI-1(ANT_02950)，Prochlorococcusmarinusstr。麻省理工学院9211(CODA)，Prochlorococcusmarinusstr。MIT9215(CODA)，FructobacillusfructosusKCTC3544(FFRUK3_010100004834)，乳杆菌属farciminisKCTC3681(LFARK3_010100001847)，食果糖乳杆菌KCTC3543(LFRUK3_010100002075)，嗜盐四联球菌NBRC121723个seqsTEH_05430，TEH_14850，TEH_02220)，弧菌属巴西LMG20546(VIBR0546_14545)，CupriavidustaiwanensisLMG19424(CODA)，MicrobacteriumtestaceumStLB037(MTES_1247，MTES_3600)，PaenibacillusterraeHPL-003(HPL003_22070)，RubrivivaxbenzoatilyticusJA2(RBXJA2T_04743)，PolymorphumgilvumSL003B-26A1(SL003B_2461)，肠沙门氏菌亚种。entericaserovarTyphimuriumstr。LT2(STM3334)，StreptomycesgriseoaurantiacusM045(SGM_3210)，AeromonasveroniiB565(B565_3987)，Halomonassp。TD01(GME_08209)，BurkholderiagladioliBSR3(BGLA_2G13660)。
在一些实施方式中，肿瘤内施用基因工程化细菌并全身施用5-FC。在一些实施方式中，基因工程化细菌和5-FC都是全身施用的。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌从5-FC0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％产生5-FU。％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％在相同条件下，例如在体外或体内条件下，比相同细菌亚型的未修饰细菌更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多，例如体外培养或体内条件。
在任何这些实施方式中，经基因工程改造以产生5-FU的细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％或更多或更多量为5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多。
在这些5-FC至5-FU转化实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA的基因序列。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约80％的同一性。在另一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约85％的同一性。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约95％的同一性。在另一个实施方式中，CodA基因与SEQ ID NO:1213具有至少约96％，97％，98％或99％的同一性。因此，在一个实施方式中，CodA基因具有至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％。与SEQ ID NO:1213的％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，CodA基因包含SEQID NO:1213的序列。在另一个实施方式中，CodA基因由SEQ ID NO:1213的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约80％同一性的CodA多肽的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，其与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约90％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，其与SEQ IDNO:1216或SEQ ID NO:1217具有至少约95％的同一性。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码CodA多肽的基因序列，其具有与SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217或其功能片段具有约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217的CodA多肽的基因序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:1216或SEQ ID NO:1217组成。
在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加5-FU产生。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的情况下，产生胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，来自大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶被修饰和/或突变，例如，以增强稳定性，或增加5-FU产生。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在诱导条件下，例如在与免疫抑制和/或肿瘤微环境相关的条件下产生胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件或缺氧条件下，在存在某些分子或代谢物的情况下，在存在与癌症或某些组织，免疫抑制或炎症相关的分子或代谢物的情况下，或在存在肠道，循环或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物，例如阿拉伯糖的情况下，产生胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，包括但不限于用于从大肠杆菌表达胞嘧啶脱氨酶的回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在细菌和/或其他微生物扩增，生产和/或制造过程中表达，如所述于此。
在任何这些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个，包括但不限于用于表达胞嘧啶脱氨酶的回路，例如来自单核细胞增生李斯特菌，存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到细菌和/或其他微生物染色体中的一个或多个位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化细菌和/或其他微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如任何营养缺陷型本领域已知的并且在本文中提供，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌物回路，例如本文所述的任何分泌回路，以及其他已知的分泌回路。本领域，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述的任何表面展示回路，以及本领域中已知的(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种代谢物的回路(e)本文所述的g，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)和(8)一种或多种这些附加回路的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4抗体或抗-PD1或抗-PDL1抗体。
组合回路-抗癌分子的组合
在一些实施方式中，一种或多种微生物是经基因工程改造以表达编码一种或多种免疫调节效应子的基因序列或两种或多种这些效应子的组合。此类基因序列包括但不限于用于在肿瘤微环境中产生或分解代谢物的基因序列，和/或用于在微生物细胞表面分泌或展示的多肽，包括但不限于细胞因子，抗体，例如免疫检查点抑制剂和本文所述的其他抗癌分子。这些基因序列可以位于微生物中的质粒上，或者可以整合到染色体中或两者中。在某些实施方式中，一种或多种基因序列处于本领域已知或本文描述的诱导型启动子的控制之下。例如，可以在低氧条件下诱导这种诱导型启动子，例如FNR启动子。在其他实施方式中，启动子在某些分子或代谢物存在下诱导，例如，在与肿瘤微环境相关的分子或代谢物存在下和/或与免疫抑制相关。在一些实施方式中，在某些组织类型中诱导启动子。在一些实施方式中，在某些肠特异性或肿瘤特异性分子或代谢物的存在下诱导启动子。在一些实施方式中，在存在于肠或肿瘤中可能存在或可能不存在的一些其他代谢物的情况下诱导启动子，例如阿拉伯糖或本领域已知或本文描述的另一种化学或营养诱导剂。在某些实施方式中，所述一个或多个盒处于本文所述或本领域已知的组成型启动子的控制下，例如，其表达可使用不同强度的核糖体结合位点进行微调。此类微生物任选还包含营养缺陷型，例如氨基酸营养缺陷型或核苷酸营养缺陷型，例如deltaDapA或deltaThyA。
在实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种调节T效应细胞的免疫调节剂，例如CD4+和CD8+细胞。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种免疫调节剂，其激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化。在一些实施方式中，免疫调节剂是激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)分化的细胞因子。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的两种或更多种细胞因子。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或更多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2和IL-15的核酸序列。在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。例如，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码IL-2的核酸序列和包含编码IL-15的核酸序列的基因工程化细菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或更多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40，激动剂(例如任何CD40，CD28)的激动剂的核酸序列。本文公开的ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18和核酸序列的细胞因子的核酸序列。(s)编码选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40的一种或多种激动剂，激动剂，例如任何CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)，本文公开的OX40和OX40激动剂。在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码GM-CSF的核酸序列和编码促进树突细胞活化的另一种免疫调节剂的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种促进树突细胞活化的免疫调节剂的核酸序列，例如GM-CSF和选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137的一种或多种激动剂(4-1BB)和OX40，激动剂，例如本文公开的任何CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种促进树突细胞活化的免疫调节剂的核酸序列，例如GM-CSF和编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种促进树突细胞活化的免疫调节剂的核酸序列，例如GM-CSF，编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列，以及编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40的激动剂的核酸序列，例如本文公开的任何CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40的激动剂的核酸序列，激动剂和基因工程化细菌，其包含编码一种或多种核酸序列的核酸序列。更多促进树突细胞活化的免疫调节剂，例如GM-CSF。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。基因工程化细菌，其包含编码一种或多种促进树突细胞活化的免疫调节剂的核酸序列，例如GM-CSF。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40的激动剂的核酸序列，包含核酸的激动剂和基因工程化细菌。编码一种或多种促进树突细胞活化的免疫调节剂的酸序列，例如GM-CSF。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种抑制免疫抑制分子的免疫调节剂，例如免疫检查点分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂，例如本文公开的任何免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码两种或更多种针对选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子的任何检查点分子的单链抗体的核酸序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码针对CTLA-4和PD-1的单链抗体的核酸序列。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫检查点抑制剂，选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂。在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列，并且基因工程化细菌能够产生选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR的一种或多种免疫检查点抑制剂检查点抑制剂。在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列和基因。工程化细菌包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列和能够产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂的基因工程化细菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种抑制免疫抑制分子的免疫调节剂，例如T调节细胞或Treg。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生色氨酸并且还能够代谢或降解犬尿氨酸。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含色氨酸操纵子，例如大肠杆菌的色氨酸操纵子或枯草芽孢杆菌的色氨酸操纵子和编码犬尿嘧啶酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列和编码酶犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列和编码酶犬尿氨酸酶的序列。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述细菌包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。能够产生色氨酸和/或代谢或降解犬尿氨酸的基因工程化细菌。在一些实施方式中，组合物包含能够产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂的基因工程化细菌，和能够产生色氨酸和/或代谢或降解犬尿氨酸的基因工程化细菌。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列和能够产生色氨酸的基因工程化细菌。和/或代谢或降解犬尿氨酸。在一些实施方式中，组合物包含能够产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂的基因工程化细菌，包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，和IL-18的一种或多种细胞因子的核酸序列的基因工程化细菌和能够产生色氨酸和/或代谢或降解犬尿氨酸的基因工程化细菌。在一些实施方式中，组合物包含能够产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂的基因工程化细菌，包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21，和IL-18的一种或多种细胞因子的核酸序列的基因工程化细菌和能够产生色氨酸和/或代谢或降解犬尿氨酸和基因工程化细菌的基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生两种或更多种抑制免疫抑制分子的免疫调节剂，例如免疫检查点和Tregs。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生色氨酸并且还产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂，例如本文公开的任何免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpCtrpC-F，trpB和trpA基因的序列或编码trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因和核酸的序列。编码一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子的检查点分子的一种或多种单链抗体的酸序列。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，组合物包含能够产生色氨酸的基因工程化细菌和能够产生选自PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的一种或多种免疫检查点抑制剂的基因工程化细菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够代谢犬尿氨酸并且还产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂，例如本文公开的任何免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的核酸序列和编码针对选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子的任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列。在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一些实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码犬尿嘧啶酶的核酸序列和基因工程化细菌，所述细菌包含编码针对选自CTLA-4，PD-1，PD的任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列。-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生色氨酸，代谢犬尿氨酸，并且还产生一种或多种选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR检查点抑制剂的免疫检查点抑制剂，例如本文公开的任何免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列或编码trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列，核酸编码犬尿氨酸酶的酸序列，和编码一种或多种针对任何检查点分子的单链抗体的核酸序列，所述检查点分子选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。
在任何上述组合实施方式中，细菌还包含用于编码分泌系统以从细菌分泌一种或多种抗癌分子的基因序列。在任何上述组合实施方式中，分泌系统选自改良的III型鞭毛，I型(例如，溶血素分泌系统)，II型，IV型，V型，VI型和VII型分泌系统，抗性-结瘤分裂(RND)多药物外排泵，单膜分泌系统，Sec和TAT分泌系统。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌还包含编码用于从细菌输出色氨酸的分泌系统的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含一种或多种编码YddG的基因序列。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌还包含编码用于将犬尿氨酸导入细菌的转运蛋白的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含选自aroP，tnaB和基因序列的一个或多个拷贝。mtr基因。
在任何上述组合实施方式中，工程化微生物也能够从肿瘤部位消耗腺苷。在任何上述组合实施方式中，细菌包含一种或多种基因或基因盒，其包含一种或多种用于从肿瘤内部位消耗腺苷的基因。在任何上述组合实施方式中，细菌包含基因盒，所述基因盒包含一个或多个用于将腺苷转化为尿酸盐的基因。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC基因的一个或多个拷贝的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷导入细菌的转运蛋白的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含用于编码核苷转运蛋白的基因序列，例如腺苷转运蛋白。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码来自大肠杆菌的nupG或nupC的一个或多个拷贝的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含一种或多种基因或包含一种或多种生物合成基因的基因盒，用于合成精氨酸。在任何上述组合实施方式中，细菌包含编码一种或多种选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB的精氨酸生物合成基因的基因序列。在用于产生精氨酸的任何上述组合实施方式中，精氨酸阻遏物(argR)被缺失，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。在用于产生精氨酸的任何上述组合实施方式中，细菌包含编码反馈抗性argA的基因。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌产生细胞毒素或裂解肽。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种抗癌分子和可操作地连接的启动子的基因序列存在于细菌的染色体上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种抗癌分子和可操作地连接的启动子的基因序列存在于细菌中的质粒上。在任何上述组合实施方式中，细菌是营养缺陷型，其包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变，例如，其中所述基因选自thyA，dapD和dapA。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含杀灭开关。在一些实施方式中，本公开提供了包含工程化细菌的组合物，所述工程化细菌包含基因或基因盒，所述基因盒包含一种或多种用于消除腺苷的基因和能够产生色氨酸和/或代谢或降解犬尿氨酸的基因工程化细菌，例如包含核酸的细菌编码犬尿氨酸酶的酸序列。在一些实施方式中，组合物还包含工程化细菌，其包含编码一种或多种针对选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR分子的任何检查点分子的单链抗体的核酸序列。在一些实施方式中，组合物还包含基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40激动剂的激动剂的核酸序列。在一些实施方式中，组合物还包含基因工程化细菌，其包含编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的核酸序列。在一些实施方式中，组合物还包含能够产生精氨酸的基因工程化细菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫调节剂，其激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化，并且还产生一种或多种抑制免疫的免疫调节剂。抑制分子，例如免疫检查点和Tregs。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞的分化，例如CD4+和CD8+细胞和编码一种或多种的核酸序列。针对任何检查点分子的更多单链抗体，例如选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR的检查点分子。在任何这些实施方式中，编码一种或多种激活，刺激和/或诱导T效应细胞分化的免疫调节剂的核酸序列可以是编码一种或多种选自IL-2，IL-的细胞因子的序列。15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18，编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40，激动剂和/或激动剂的激动剂的序列编码促进树突细胞活化的免疫调节剂的序列，例如GM-CSF。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2和/或IL-15的核酸序列和编码针对CTLA-4和/或PD-1的单链抗体的核酸序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化，并且还能够产生色氨酸。例如，包含色氨酸操纵子，例如大肠杆菌的色氨酸操纵子或枯草芽孢杆菌的色氨酸操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)和编码trpE的核酸序列的分化，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)和编码trpE的核酸序列的分化，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。在任何这些实施方式中，编码一种或多种激活，刺激和/或诱导T效应细胞分化的免疫调节剂的核酸序列可以是编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的序列，编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40，激动剂和/或激动剂的激动剂的序列编码促进树突细胞活化的免疫调节剂的序列，例如GM-CSF。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2和/或IL-15的核酸序列和编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因或trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的核酸序列并且任选地可以包含缺失或突变的色氨酸阻遏物(trpR)和/或任选地包含基因序列以产生色氨酸前体，Chorismate，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以进一步包含编码针对任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列，例如选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR的检查点分子。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码细胞因子的核酸序列，例如IL-2和/或IL-15，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因或trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的核酸序列，以及编码针对任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列，例如CTLA-4和/或PD-1。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化，并且还能够代谢或降解犬尿氨酸，例如，包含编码酶犬尿氨酸酶的序列。在任何这些实施方式中，编码一种或多种激活，刺激和/或诱导T效应细胞分化的免疫调节剂的核酸序列可以是编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的序列，编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40，激动剂和/或激动剂的激动剂的序列编码促进树突细胞活化的免疫调节剂的序列，例如GM-CSF。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2和/或IL-15的核酸序列和编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以进一步包含编码针对任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列，例如选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT的检查点分子，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码细胞因子的核酸序列，例如IL-2和/或IL-15，编码犬尿氨酸酶的核酸序列，和编码针对任何一种或多种单链抗体的核酸序列。检查点分子，例如CTLA-4和/或PD-1。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种免疫调节剂的核酸序列，所述免疫调节剂激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化，也能够产生色氨酸。，可以代谢或降解犬尿氨酸。在这些实施方式的一些中，基因工程化细菌包含色氨酸操纵子，例如大肠杆菌的色氨酸操纵子或枯草芽孢杆菌的色氨酸操纵子和编码酶犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的序列和编码酶犬尿氨酸酶的序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因的序列和编码酶犬尿氨酸酶的序列。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。在任何这些实施方式中，编码一种或多种激活，刺激和/或诱导T效应细胞分化的免疫调节剂的核酸序列可以是编码一种或多种选自IL-2，IL-15，IL-12，IL-7，IL-21和IL-18的细胞因子的序列，编码一种或多种选自CD40，CD28，ICOS，CD226，CD137(4-1BB)和OX40，激动剂和/或激动剂的激动剂的序列编码促进树突细胞活化的免疫调节剂的序列，例如GM-CSF。例如，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2和/或IL-15的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因或trpE，trpD的核酸序列，trpC，trpF，trpB和trpA基因，编码犬尿氨酸酶的核酸序列，并且任选地可以包含缺失或突变的色氨酸阻遏物(trpR)和/或任选地包含基因序列以产生色氨酸前体，Chorismate，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和aroC的序列。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，以及编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，编码犬尿氨酸酶的核酸序列，编码aroG的核酸序列，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC基因，以及任选缺失或突变的色氨酸阻遏物(trpR)。在另一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，和编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在另一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-12的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，和编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在另一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码CD40激动剂的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，和编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在另一具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2的核酸序列，CD40激动剂，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，以及编码犬尿氨酸酶的核酸序列。在任何这些实施方式中，任选地可以缺失，突变或修饰色氨酸阻遏物(trpR)，以减少或消除其阻遏物功能。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌任选地包含产生色氨酸前体的基因序列，分支酸酯，例如编码aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和AroC的序列。而且，在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以进一步包含编码针对任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列，例如选自CTLA-4，PD-1，PD-L1，TIGIT，VISTA，LAG-3，TIM1，TIM3，CEACAM1，LAIR-1，HVEM，BTLA，CD160，CD200，CD200R和A2aR的检查点分子。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码细胞因子的核酸序列，例如IL-2和/或IL-15，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列或trpE，trpD，trpC，trpF，trpB和trpA基因，编码犬尿氨酸酶的核酸，和编码针对任何检查点分子的一种或多种单链抗体的核酸序列，例如CTLA-4和/或PD-1。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-2的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，编码犬尿氨酸酶的核酸和编码PD-1或CTLA-4的核酸序列。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含编码IL-15的核酸序列，编码trpE，trpG-D，trpC-F，trpB和trpA基因的核酸序列，编码犬尿氨酸酶的核酸和编码PD-1或CTLA-4的核酸序列。
在任何上述组合实施方式中，工程化微生物也能够从肿瘤部位消耗腺苷。在任何上述组合实施方式中，细菌包含一种或多种基因或基因盒，其包含一种或多种用于从肿瘤内部位消耗腺苷的基因。在任何上述组合实施方式中，细菌包含基因盒，所述基因盒包含一个或多个用于将腺苷转化为尿酸盐的基因。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC基因的一个或多个拷贝的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷导入细菌的转运蛋白的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含用于编码核苷转运蛋白的基因序列，例如腺苷转运蛋白。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含用于编码来自大肠杆菌的nupG或nupC的一个或多个拷贝的基因序列。在任何上述组合实施方式中，细菌包含一种或多种基因或包含一种或多种生物合成基因的基因盒，用于合成精氨酸。在任何上述组合实施方式中，细菌包含编码一种或多种选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB的精氨酸生物合成基因的基因序列。在用于产生精氨酸的任何上述组合实施方式中，精氨酸阻遏物(argR)被缺失，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。在用于产生精氨酸的任何上述组合实施方式中，细菌包含编码反馈抗性argA的基因。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌产生细胞毒素或裂解肽。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)和编码用于将腺苷转化为尿酸盐的酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)，并且还包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB，xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)，并且还包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB，xdhC和nupG的一个或多个拷贝的基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可包含色氨酸生产回路。在一些实施方式中，任选的色氨酸回路包括TrpE的缺失。在一些实施方式中，色氨酸产生回路包含trpE，trpD，trpC，trpB，trpA，aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和aroC中的一种或多种或其组合。在一些实施方式中，此类色氨酸生产回路包含aroG(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA及其组合中的一种或多种。在一些实施方式中，色氨酸产生回路包含aroG(fbr)，serA(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA或其组合中的一种或多种。在一些实施方式中，此类色氨酸产生回路包含aroG(fbr)，serA(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA，YddG或其组合。在一些实施方式中，色氨酸产生回路包含trpE，trpD，trpC，trpB，trpA及其组合。
在一些实施方式中，选择由基因工程化细菌表达的回路以组合多种机制。例如，通过激活肿瘤微环境中的多个正交免疫调节途径，将免疫学上的冷肿瘤转化为免疫热的肿瘤。可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可以由基因工程化细菌表达的效应子靶向的不同免疫应答组分包括免疫激活和引发(“免疫引发剂”)，以及免疫增强和T细胞扩增(“免疫维持者”)(参见图36)。在一些组合实施方式中，“免疫引发剂”与“免疫维持剂”组合。在一些实施方式中，免疫引发剂和/或免疫维持者可进一步与基质调节剂例如透明质酸酶组合。在一些实施方式中，可以组合并同时或依次施用包含编码免疫起始基因和免疫维持者的基因的两种或更多种不同细菌，以及任选的基质调节剂。本文所述的靶向免疫激活和引发(免疫引发剂)的效应物的非限制性实例包括可溶性SIRPα，抗CD47抗体和抗CD40抗体，CD40-配体，TNF-α，IFN-γ，5-FC至5。-FU转换和STING激动剂。免疫维持者包括促进免疫增强的药剂和促进T细胞扩增的药剂或两者。本文所述的用于靶向免疫增强的效应物的非限制性实例包括犬尿氨酸降解，腺苷降解，精氨酸产生，CXCL10，IL-15，IL-12分泌和检查点阻断，例如通过抗PD-1分泌或展示。本文所述的靶向T细胞扩增的效应物的非限制性实例包括抗PD-1和抗PD-L1抗体，抗-CTLA-4抗体和IL-15。用于靶向基质调节的效应物的一个实例是透明质酸酶。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发和T细胞扩增。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫增强和T细胞扩增。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫增强和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向T细胞扩增和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发，免疫增强和T细胞扩增。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发，免疫增强和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发，T细胞扩增和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫增强，T细胞扩增和基质调节。在一些实施方式中，所选效应子靶向免疫激活和引发，免疫增强，T细胞扩增和基质调节。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)和一种或多种编码IL-15用于分泌的基因序列。在一些实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)和一种或多种编码CXCL10用于分泌的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码CXCL10的基因序列和一种或多种编码IL-15的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)，一种或多种编码IL-15的基因序列，和编码CXCL10的一种或多种基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可进一步包含一种或多种抗PD-1或抗PD-L1抗体，例如scFv。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码犬尿氨酸酶的基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)，一种或多种编码IL-15的基因序列，一种或多种编码CXCL10的基因序列。和编码抗PD-1抗体的一种或多种基因序列。
在一个具体实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码犬尿氨酸酶的基因序列(和任选地用于产生本文所述的色氨酸的回路)，一种或多种编码IL-15的基因序列，一种或多种编码CXCL10的基因序列。和编码抗PD-L1抗体的一种或多种基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可用于治疗，管理和预防结肠直肠癌。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可用于治疗，管理和预防肝细胞癌。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可用于治疗，管理和预防晚期黑素瘤。在任何这些实施方式中，口服给予基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，通过肿瘤内注射在肿瘤内施用基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，全身施用基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，任选的色氨酸回路可包括TrpE的缺失。在一些实施方式中，色氨酸产生回路可包含trpE，trpD，trpC，trpB，trpA，aroG，aroF，aroH，aroB，aroD，aroE，aroK和aroC中的一种或多种或其组合。在一些实施方式中，此类色氨酸生产回路包含aroG(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA及其组合中的一种或多种。在一些实施方式中，色氨酸产生回路包含aroG(fbr)，serA(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA或其组合中的一种或多种。在一些实施方式中，此类色氨酸产生回路包含aroG(fbr)，serA(fbr)，trpE(fbr)，trpD，trpC，trpB，trpA，YddG或其组合。在一些实施方式中，色氨酸产生回路包含trpE，trpD，trpC，trpB，trpA及其组合。
在一些实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷转化为尿酸的酶的一种或多种基因，并且还包含编码用于分泌的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如，scFv抗体)。本文描述了可以衍生scFv的示例性抗CD40抗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码用于分泌的抗CD40抗体的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码用于分泌的抗CD40抗体的基因序列。本文描述了合适的分泌标签和用于分泌此类抗体的其他序列。
在一些实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷转化为尿酸的酶的一种或多种基因，并且还包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如，scFv抗体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG基因的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的基因序列。本文描述了合适的膜展示锚和用于此类抗体的表面展示的其他序列。
在一些实施方式中，细菌包含编码用于分泌的透明质酸酶的一种或多种基因，并且还包含编码用于分泌的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如，scFv抗体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码透明质酸酶的基因序列，并且还包含编码用于分泌的抗CD40抗体的基因序列。
在一些实施方式中，细菌包含编码透明质酸酶的一种或多种基因，并且还包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如，scFv抗体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码透明质酸酶的基因序列，并且还包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的基因序列。
在一些实施方式中，细菌包含一种或多种编码用于将腺苷转化为尿酸的酶的基因，并且还包含一种或多种编码用于分泌的透明质酸酶的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码用于分泌的透明质酸酶的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG基因的一个或多个拷贝的基因序列，并且还包含编码透明质酸酶的基因序列。
在一些实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷转化为尿酸的酶的一种或多种基因，编码用于分泌的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如scFv抗体)，和编码透明质酸酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列，编码用于分泌的抗CD40抗体的一个或多个基因序列，和或更多编码透明质酸酶的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG基因的一个或多个拷贝的基因序列，编码用于分泌的抗CD40抗体的一个或多个基因序列，和一种或多种编码透明质酸酶的基因序列。
在一些实施方式中，细菌包含编码用于将腺苷转化为尿酸的酶的一种或多种基因，编码用于表面展示的抗CD40抗体的一种或多种基因序列(例如scFv抗体)，和编码透明质酸酶的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC的一个或多个拷贝的基因序列，编码用于表面展示的抗CD40抗体的一个或多个基因序列，和一种或多种编码透明质酸酶的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG基因的一个或多个拷贝的基因序列，编码用于表面展示的抗CD40抗体的一个或多个基因序列，和一种或多种编码透明质酸酶的基因序列。在任何这些实施方式中，细菌可用于治疗，管理和预防胰腺导管腺癌。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌通过口服，肿瘤内或全身给药。
在一些实施方式中，细菌包含编码回路的基因序列，所述回路用于增加精氨酸的产生和编码一种或多种抗CD47抗体的基因序列。在一些实施方式中，包含编码增加精氨酸产生的回路的基因序列的基因工程化细菌还包含用于分泌一种或多种抗CD47抗体的基因序列。在一些实施方式中，包含编码用于增加精氨酸产生的回路的基因序列的基因工程化细菌还包含用于一种或多种抗CD47抗体的表面展示的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于分泌和/或表面展示的基因序列或一种或多种抗CD47抗体，并且还包含选自argA，argB，argC，argD，argE的一种或多种精氨酸生物合成基因。，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB。在用于产生精氨酸和抗CD47的一些实施方式中，精氨酸阻遏物(argR)被缺失，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。在用于抗CD47和精氨酸生物合成的生产的一些实施方式中，细菌还包含编码反馈抗性argA的基因。
在一些实施方式中，细菌包含编码回路的基因序列，所述回路用于增加精氨酸的产生和编码一种或多种可溶形式的SIRPα的基因序列，例如缺少跨膜和细胞质部分。在一些实施方式中，包含编码增加精氨酸产生的回路的基因序列的基因工程化细菌还包含用于分泌一种或多种可溶形式的SIRPα的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种可溶形式的SIRPα的一种或多种基因序列，并且还包含选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB的一种或多种精氨酸生物合成基因。在一些实施方式中，包含用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌和用于分泌一种或多种可溶形式的SIRPα，精氨酸阻遏物(argR)的一种或多种基因序列被缺失，突变或修饰以减少或消除。它的阻遏功能。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种用于分泌一种或多种可溶形式的SIRPα的基因，并且还包含用于产生精氨酸的途径，包括编码反馈抗性argA的基因。
在一些实施方式中，用于产生抗癌分子组合的两种或更多种基因序列与一种或多种直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道中发现的条件，肿瘤微环境或其他组织特异性条件。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)可操作地连接，如本文所述。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖，或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与两个或更多个不同的启动子序列可操作地连接，所述启动子序列可以全部是组成型的(相同或不同的组成型启动子)，所有可诱导的(通过相同或不同的诱导物)，或组成型的混合物。和诱导型启动子。
在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种抗癌分子和可操作地连接的启动子的基因序列存在于细菌的染色体上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种抗癌分子和可操作地连接的启动子的基因序列存在于细菌中的质粒上。在任何上述组合实施方式中，细菌是营养缺陷型，其包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变，例如，其中所述基因选自thyA，dapD和dapA。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌包含杀灭开关。
在本节所述的任何实施方式中，其中基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫调节剂，其激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化和/或是能够产生抑制免疫抑制分子的一种或多种免疫调节剂，例如免疫检查点和Treg，基因工程化细菌可以进一步能够产生裂解肽分子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种裂解肽分子的序列，选自D-肽A，D-肽B，D-肽C，D-肽D，DK6L9，NRC-03，NRC-07，Gomesin，HepcidinTH2-3，DermaseptinB2，PTP7，MGA2，HNP-1，Tachyplesin，Temporin-1CEa，NK-2，牛乳铁蛋白B6，CecropinCB1，Polybia-MPI，SVS-1，Epinecidin-1，
D-K6L9，MPI-1，A9K，Hectate，Phor14，Phor21，BEPTII，BEPTII-I，TfR-裂解肽，BPC96，RGD-Tachyplesin，A9K，ERα17p，CR1166，肽适体，Pentastatin-1，趋化抑制素-1，适当的抑制素，肉豆蔻酰-Cys-Ala-Val-Ala-Tyr-(1，3二甲基)His-OMe，9种生长抑素肽类似物和LTX-401。
在一些实施方式中，基因工程化微生物编码一个或多个盒，其产生GM_CSF，富含CpG的寡核苷酸，和由其衍生的肿瘤细胞裂解物或抗原，如Ali等所述。
Figure BDA0002194618080002971
SciTranslMed1，8ra19(2009)DC亚群和T细胞的原位调节介导小鼠中的肿瘤消退，其内容通过引用整体并入本文。
在本节所述的任何实施方式中，其中基因工程化细菌能够产生一种或多种免疫调节剂，其激活，刺激和/或诱导T效应细胞(例如CD4+和CD8+细胞)的分化和/或是能够产生抑制免疫抑制分子的一种或多种免疫调节剂，例如免疫检查点和Treg，基因工程化细菌可以进一步能够产生一种或多种肿瘤抗原，例如本文所述的任何肿瘤抗原或其他已知的肿瘤抗原。艺术。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在低氧条件下产生抗癌分子并且能够将细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达用于在质粒和/或染色体上产生抗癌分子的基因。用于产生抗癌分子的基因或基因盒可以在一个或多个整合位点整合到细菌染色体中。例如，编码抗癌分子的序列的一个或多个拷贝可以整合到细菌染色体中。具有整合到染色体中的编码抗癌分子的基因的多个拷贝允许更大的分子产生并且还允许微调表达水平。或者，除了编码抗癌分子的基因之外，本文所述的不同回路，例如任何杀灭开关回路，可以在一个或多个不同的整合位点整合到细菌染色体中以执行多种不同的功能。基因工程化细菌可以产生多种不同的抗癌分子。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，工程化细菌可以与常规癌症疗法结合使用，例如手术，化学疗法，靶向疗法，放射疗法，Tomotherapy，免疫疗法，癌症疫苗，激素疗法，体温过高，干细胞移植。(外周血，骨髓和脐带血移植)，光动力疗法，溶瘤病毒疗法，血液制品捐赠和输血。在用于产生抗癌分子的任何这些实施方式中，例如免疫抑制剂(抗体)，激动剂抗体，激动剂抗体和/或免疫刺激细胞因子，工程化细菌的组合可以与用于其他的常规免疫疗法联合使用。治疗癌症，例如检查点抑制剂，Fc介导的ADCC，BiTE，TCR，过继细胞疗法(TIL，CAR，NK/NKT等)，以及本文所述和本领域已知的任何其他免疫疗法。在任何这些实施方式中，工程化细菌可以产生一种或多种细胞毒素或裂解肽。在任何这些实施方式中，工程化细菌可以与癌症或肿瘤疫苗联合使用。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码一种或多种融合蛋白的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与稳定化多肽融合的效应子或抗癌分子的基因序列。此类稳定化多肽是本领域已知的并且包括Fc蛋白。在一些实施方式中，由基因工程化细菌编码的融合蛋白是Fc融合蛋白，例如IgGFc融合蛋白或IgAFc融合蛋白。
在任何这些组合的实施方式中，抗癌分子可以通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子通过肽接头或肽键与稳定化多肽共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子的C末端通过肽接头或肽键与稳定化多肽的N末端共价融合。在一些实施方式中，抗癌分子的N末端通过肽接头或肽键与稳定化多肽的C末端共价融合。在一些实施方式中，稳定化多肽包含免疫球蛋白Fc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH2恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH3恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含至少一部分免疫球蛋白重链CH1恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区，免疫球蛋白重链CH2恒定区和免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽是人IgGFc多肽。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc多肽是人IgG4Fc多肽。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽包含序列[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n为1，2，3，4，5或6。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgGFF融合多肽。在一些实施方式中，融合蛋白包含SIRPαIgG4Fc多肽。在一些实施方式中，富含甘氨酸的肽接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS。在一些实施方式中，SIRPα的N末端通过包含SGGGGSGGGGSGGGGS的肽接头与IgG4Fc的C末端共价融合。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码多聚体多肽组分的一种或多种基因序列。在一些实施方式中，多肽是二聚体。二聚体蛋白质的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-15(异二聚体)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种多肽的一种或多种基因，其中所述一种或多种多肽包含第一单体和第二单体。在一些实施方式中，第一单体多肽通过肽接头或肽键与第二单体多肽共价连接。在一些实施方式中，接头包含富含甘氨酸的肽。在一些实施方式中，第一和第二单体具有相同的多肽序列。在一些实施方式中，第一和第二单体各自具有不同的多肽序列。在一些实施方式中，第一单体是IL-12p35多肽，第二单体是IL-12p40多肽。在一些实施方式中，接头包含GGGGSGGGS。
在任何这些组合实施方式中，抗癌分子的效应子功能可以通过与促进效应子功能的另一种多肽融合来改善。这种融合的非限制性实例是IL-15与IL-15Rα的Sushi结构域的融合，如本文所述。因此，在一些实施方式中，第一单体多肽是IL-15单体，第二单体是IL-15Rαsushi结构域多肽。
在任何这些实施方式和所有组合实施方式中，基因工程化细菌包含编码本文所述的一种或多种分泌标签的基因序列。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌在内源膜相关蛋白中包含一个或多个突变，从而允许可扩散的外膜表型。本文描述了合适的外膜突变。
免疫激活剂和免疫稳定剂的组合
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含可靶向免疫激活和引发(引发剂)和免疫维持者(例如，免疫增强或T细胞扩增)的回路。或者，本公开提供了包含组合(例如，两种或更多种)不同基因工程化细菌的组合物，每种细菌编码一种或多种免疫激活剂/引物(引发剂)和/或一种或多种免疫支持物。这些不同或不同的细菌菌株可以同时或依次施用。表A和表B中描述了免疫引发剂和维持剂的非限制性实例。
表A.免疫引发剂
效果 类型 效应
免疫激活/启动 细胞因子/趋化因子 TNF-α
免疫激活/启动 细胞因子/趋化因子 IFN-γ
免疫激活/启动 细胞因子/趋化因子 IFN-β
免疫激活/启动 单链抗体/配体 SIRPalpha
免疫激活/启动 单链抗体/配体 CD40L
免疫激活/启动 代谢转化 STING激动剂
溶瘤/底漆 工程化疗 5FC->5FU
表B.免疫持续者
效果 类型 效应
免疫增强/逆转疲劳 单链抗体/配体 抗PD-1
免疫增强/T细胞扩增 单链抗体/配体 抗CTLA-4
免疫增强/T细胞扩增 细胞因子/趋化因子 IL-15
免疫增强/T细胞扩增 细胞因子/趋化因子 CXCL10
免疫增强/T细胞扩增 代谢转化 精氨酸生产者
免疫增强/T细胞扩增 代谢转化 腺苷消费者
免疫增强/T细胞扩增 代谢转化 犬尿氨酸消费者
在一些组合实施方式中，表A的一种或多种效应子可与表B的一种或多种效应子组合。
可以选择多种效应物，其对免疫应答的不同组分具有影响。可由一种或多种基因工程化细菌表达的效应物靶向的不同免疫应答组分包括免疫激活和引发(“免疫引发剂”)，免疫增强，T细胞扩增(“免疫维持者”)(参见图36)。在一些组合实施方式中，“免疫引发剂”与“免疫维持剂”组合。在一些实施方式中，免疫引发剂和/或免疫维持者可进一步与基质调节剂例如透明质酸酶组合。在一些实施方式中，可以组合并同时或依次施用包含编码免疫起始基因和免疫维持者的基因的两种或更多种不同细菌，以及任选的基质调节剂。本文所述的靶向免疫激活和引发的效应物的非限制性实例包括可溶性SIRPα，抗CD47抗体和抗CD40抗体，CD40-配体，TNF-α，IFN-γ，5-FC至5-FU转化，和STING激动剂。本文所述的用于靶向免疫增强的效应物的非限制性实例包括犬尿氨酸降解，腺苷降解，精氨酸产生，CXCL10，IL-15，IL-12分泌和检查点阻断，例如通过抗PD-1分泌或展示。本文所述的靶向T细胞扩增的效应物的非限制性实例包括抗PD-1和抗PD-L1抗体，抗-CTLA-4抗体和IL-15。
在一个组合的实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生一种或多种免疫引发剂的基因序列，其与一种或多种基因序列组合以产生一种或多种免疫维持者。在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物。在一个这样的组合物实施方式中，包含用于产生一种或多种免疫引发剂的基因序列的一种或多种基因工程化细菌可以与一种或多种基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生一种或多种免疫维持者的基因序列。或者，组合物中的每种细菌可以同时具有免疫维持剂和免疫引发剂。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是趋化因子或细胞因子。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是趋化因子或细胞因子，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，趋化因子或细胞因子引发剂选自TNF-α，IFN-γ和IFN-β1。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是单链抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是单链抗体，一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是受体配体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是受体配体，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，其中一种免疫引发剂是受体配体，免疫引发剂是CD40L。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，受体配体是SIRPα，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是代谢转化。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是代谢转化，并且一种免疫维持者是代谢转化，例如选自犬尿氨酸消费者，色氨酸生产者，精氨酸生产者和腺苷消费者。在一些实施方式中，引发剂代谢转化是STING激动剂生产者，例如去腺苷酸环化酶，例如DacA。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂可以是工程化免疫疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，一种免疫维持者是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，并且一种免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，一种免疫引发剂是工程化学疗法，并且一种免疫维持者是代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。在一些实施方式中，启动子工程化学疗法是5FC至5FU转化，例如通过codA，或其变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫维持者或增强剂可选自抗PD-1单链抗体，抗-CTLA4单链抗体，IL-15，CXCL10或代谢转化。代谢转化可以是精氨酸产生，腺苷消耗和/或犬尿氨酸消耗。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是单链抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是单链抗体，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是抗PD-1抗体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是抗CTLA4抗体。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是受体配体。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是受体配体，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是PD1或PDL1或CTLA4，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是细胞因子或趋化因子。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，并且免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是细胞因子或趋化因子，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是IL-15，或其片段，变体或融合蛋白。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是CXCL10，或其片段，变体或融合蛋白。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者可以是代谢转化。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是代谢转化。在一些实施方式中，一种免疫维持者是代谢转化，免疫引发剂是工程化学疗法。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是犬尿氨酸消耗。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是精氨酸产生。在一些免疫维持者和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，免疫维持者是腺苷消耗。在任何这些实施方式中，免疫引发剂可选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码用于消耗犬尿氨酸(和任选地产生色氨酸)的酶的基因序列和用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是代谢转化，例如STING激动剂生产者，例如去腺苷酸环化酶，例如dacA。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是工程化学疗法，例如，用于将5FC转化为5FU的codA。在一些实施方式中，免疫引发剂选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码TNF-α的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿嘧啶酶的基因序列和编码IFN-γ的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码IFN-β1的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和编码本文所述的SIRPα或其变体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码CD40L的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码用于产生STING激动剂(例如dacA)的酶的基因序列，用于产生环二-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列和编码用于将5FC转化为5FU的酶的基因序列，例如codA或其变体或融合蛋白。在任何这些犬尿氨酸消耗和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，可以缺失trpE。
在任何这些组合实施方式中，基因工程化细菌可包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列和用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码例如去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA，和用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，免疫维持剂与脱腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是受体配体。在一些实施方式中，与去腺苷酸环化酶(例如dacA)组合的免疫维持者是代谢转化，例如精氨酸生产者，犬尿氨酸消费者和/或腺苷消费者。在一些实施方式中，免疫维持者选自抗PD-1抗体，抗-CTLA4抗体，IL-15，CXCL10，精氨酸生产者，腺苷消费者和犬尿氨酸消费者。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码dacA的基因序列和编码抗PD-1抗体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码抗-CTLA4抗体的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码dacA的基因序列和编码IL-15的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码CXCL10的基因序列。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于产生精氨酸的回路的基因序列，例如，如本文所述。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因序列，例如犬尿激酶，例如来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列，例如dacA和编码用于消耗腺苷的酶的基因序列，如本文所述。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，dacA来自单核细胞增生李斯特氏菌。
在任何这些组合物实施方式中，包含编码用于食用犬尿氨酸(和任选地产生色氨酸)的酶的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌可以与包含基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌组合以产生免疫引发剂。在一些实施方式中，包含编码犬尿喹啉酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫引发剂的基因序列。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是单链抗体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是受体配体。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是代谢转化，例如STING激动剂生产者，例如去腺苷酸环化酶，例如dacA。在一些实施方式中，与犬尿氨酸酶结合的免疫引发剂是工程化学疗法，例如，用于将5FC转化为5FU的codA。在一些实施方式中，免疫引发剂选自TNF-α，IFN-γ，IFN-β1，SIRPα，CD40L，STING激动剂和5FC->5FU。在一个实施方式中，一种或多种不同的基因工程化细菌包含编码犬尿喹啉酶的基因序列和编码TNF-α的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码IFN-γ的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码IFN-β1的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码本文所述的SIRPα或其变体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种包含编码CD40L的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码犬尿喹啉酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列，例如用于生产的dacA。环二正电子。在一个实施方式中，包含编码犬尿喹啉酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于将5FC转化为5FU的酶的基因序列，例如codA或变体。或其融合蛋白。在任何这些犬尿氨酸消耗和免疫引发剂组合和/或组合物实施方式中，可以缺失trpE。
在任何这些组合物实施方式中，可以包含编码用于产生STING激动剂的酶的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌可以与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，将包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌(例如dacA)与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含用于产生免疫维持者的基因序列。在一些实施方式中，免疫维持剂与去腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是趋化因子或细胞因子。在一些实施方式中，与dacA组合的免疫维持者是单链抗体。在一些实施方式中，免疫维持剂与脱腺苷酸环化酶(例如dacA)组合是受体配体。在一些实施方式中，与去腺苷酸环化酶(例如dacA)组合的免疫维持者是代谢转化，例如精氨酸生产者，犬尿氨酸消费者和/或腺苷消费者。在一些实施方式中，免疫维持者选自抗PD-1抗体，抗-CTLA4抗体，IL-15，CXCL10，精氨酸生产者，腺苷消费者和犬尿氨酸消费者。在一个实施方式中，将包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌例如dacA与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码抗PD-1抗体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌例如dacA与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码抗-CTLA4抗体的基因序列。在一个实施方式中，将包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌(例如dacA)与一种或多种包含编码IL-15的基因序列的不同基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与包含编码CXCL10的基因序列的一种或多种不同的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于产生精氨酸的回路的基因序列，例如，这里描述的。在一个实施方式中，包含编码去腺苷酸环化酶的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌，例如dacA，与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于犬尿氨酸的酶的基因序列，例如犬尿氨酸酶。例如，来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，将包含编码dacA的基因序列的组合物的一种或多种不同的基因工程化细菌与一种或多种不同的基因工程化细菌组合，所述细菌包含编码用于消耗腺苷的酶的基因序列，如本文所述。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，dacA来自单核细胞增生李斯特氏菌。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列与编码犬尿氨酸酶的基因序列的组合。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列以及编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌，而犬尿喹啉酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因和包含一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因的基因工程化细菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列和包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列和包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌，而犬尿喹啉酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多STING激动剂(例如环状二-AMP)多％。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％犬尿氨酸45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多的犬尿氨酸两倍更多。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的STING激动剂。例如，环状二-AMP，比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或90％至100％更多ATP两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％色氨酸含量高％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比色氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至40％相对于未经修改的45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个实施方式中，在4小时后，相对于相同条件下的相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些实施方式中，基因工程化细菌使STING激动剂的产生率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至40％相对于未经修改的45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使STING激动剂的产生率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使STING激动剂的产生速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个实施方式中，4小时后，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约80％至100％。在一个实施方式中，相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌在4小时后在相同条件下使STING激动剂产生增加约90％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使STING激动剂产生增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，4小时后，相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，基因工程化细菌使STING激动剂产量增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使STING激动剂产量增加约10000-1000倍。
在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列以及编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列以及编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个具体实施方式中，编码腺苷降解途径的基因是染色体整合的并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因，所述基因包括基因工程化细菌，所述细菌包含编码用于消耗腺苷的酶的一种或多种基因。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在一个实施方式中，产生的STING激动剂是环二-GAMP。在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码c-di-GAMP合酶的基因序列与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码腺苷降解途径的基因序列。在一个实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，c-di-GAMP合酶来自霍乱弧菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个具体实施方式中，编码腺苷降解途径的基因是染色体整合的并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的STING激动剂。例如，环状二-AMP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多腺苷。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多ATP。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多ATP。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％尿酸盐含量高出100％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生比尿酸盐至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的尿酸盐。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的尿酸盐。
在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生STING激动剂的酶的基因，其与一种或多种编码用于产生精氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码二乙酸酯化环化酶的基因序列以及编码精氨酸产生途径的基因序列。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于产生STING激动剂的酶的一种或多种基因，所述基因与包含一种或多种编码用于产生精氨酸的酶的基因的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，产生的STING激动剂是c-di-AMP。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码二乙二醇化环化酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多STING激动剂(例如环状二-AMP)。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多精氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的STING激动剂。例如，环状二-AMP，比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍比相同细菌亚型的未修饰细菌多30倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的STING激动剂，例如环二磷酸腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比精氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％在相同条件下，ATP比相同细菌亚型的未修饰细菌多％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％谷氨酸含量多％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤大小减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码酶的基因，所述酶用于将5-FC转化为5-FU与一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码用于将5-FC转化为5-FU的酶的一种或多种基因，所述基因与包含一种或多种编码用于消耗犬尿氨酸的酶的基因的基因工程化细菌组合。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％的STING激动剂，例如环二磷酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％犬尿氨酸。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌将5-FC的1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的犬尿氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FC。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比色氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和犬尿氨酸消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码酶的基因，所述酶用于将5-FC转化为5-FU与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列与编码腺苷降解途径的基因序列的组合。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含一种或多种编码酶的基因，所述酶用于将5-FC转化为5-FU与一种或多种编码用于消耗腺苷的酶的基因组合。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌，编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％的STING激动剂，例如环状二-AMP。
在任何这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗的实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，90％至100％腺苷。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍腺苷，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一个中，基因工程化细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％多100％的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FC。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任一个中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％的尿酸盐。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生比尿酸盐至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的尿酸盐。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的尿酸盐。
在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些STING激动剂生产和腺苷消耗实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和腺苷消耗实施方式中的任何一种中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码用于产生5-FU的酶的基因，其与一种或多种编码用于产生精氨酸的酶的基因组合。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列与编码精氨酸产生途径的基因序列的组合。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一个实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含编码用于产生5-FU的酶的一种或多种基因与基因工程化细菌的组合，所述基因工程化细菌包含编码用于产生精氨酸的酶的一种或多种基因。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码胞嘧啶脱氨酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自大肠杆菌。在一个实施方式中，胞嘧啶脱氨酶来自酵母。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌多90％至100％的5-FU。
在任何5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至80％在相同条件下，与相同细菌亚型的未修饰细菌相比，精氨酸高90％或90％至100％。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多5-FU。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的5-FU。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生的精氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者90％至100％的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的5-FC。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中的任一个中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些5-FC至5-FU转化和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在任何将免疫激活和引发与免疫增强相结合的实施方式中，编码用于靶向免疫激活和引发的效应子的基因序列和编码用于免疫增强的效应子的基因序列可以与一个或多个直接可操作地连接或者间接诱导型启动子。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道中发现的条件，肿瘤微环境或其他组织特异性条件。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)可操作地连接，如本文所述。在一些实施方式中，两种或更多种基因序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖，或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。本文描述了合适的组成型启动子。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与两个或更多个不同的启动子序列可操作地连接，所述启动子序列可以全部是组成型的(相同或不同的组成型启动子)，所有可诱导的(通过相同或不同的诱导物)，或组成型的混合物。和诱导型启动子。
在任何上述免疫激活和免疫增强组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应子的基因序列可以存在于细菌的染色体上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应子的基因序列可以存在于细菌中的质粒上。在任何上述组合实施方式中，用于产生一种或多种免疫激活和免疫增强效应子的基因序列可以存在于质粒和细菌中的染色体上。在任何上述组合实施方式中，细菌可以是营养缺陷型，其包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变，例如，其中所述基因选自thyA，dapD和dapA。在任何上述组合实施方式中，基因工程化细菌可包含杀灭开关。
在一些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述免疫引发剂回路和免疫维持器回路，用于在低氧条件下和/或在癌症存在下和/或肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢物，和/或存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物，和/或存在于肠道中可能存在的代谢物，和/或在体内可能存在或不存在的代谢物存在下，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质。在一些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，编码免疫引发剂和免疫维持者的回路的基因序列由可被这样的条件和/或诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些免疫引发剂和维持者组合和/或组合物中，任何一种或多种免疫引发剂回路和免疫维持者回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一种或多种质粒中。微生物染色体中的位点。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1。抗体。
代谢回路的组合
腺苷和犬尿氨酸消耗量
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含产生和/或消耗一种或多种代谢物的回路。或者，本公开提供了包含组合(例如，两种或更多种)不同基因工程化细菌的组合物，每种细菌编码一种或多种酶，用于产生和/或消耗一种或多种代谢底物。此类底物的非限制性实例包括犬尿氨酸，色氨酸，腺苷和精氨酸。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于腺苷降解和犬尿氨酸消耗的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列以及腺苷降解途径。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于降解腺苷和基因工程化细菌的回路，以消耗犬尿氨酸。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码犬尿嘧啶酶的基因序列以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，犬尿嘧啶酶来自荧光假单胞菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％在相同条件下，腺苷比同一细菌亚型的未修饰细菌多％。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。腺苷比相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍。二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的腺苷。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％尿酸盐含量高出100％至100％。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的细菌。-更多尿酸盐。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍的细菌。比相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌折叠，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍的尿酸盐。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌使腺苷降解率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，相对于相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌，或90％至100％。在另一个实施方式中，经基因工程以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌使腺苷降解速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍，或两倍更多。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌将降解速率提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍。相对于相同细菌亚型的未修饰细菌，折叠，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍条件。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，当在低氧条件下诱导时，经基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可具有约1.8-10μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌具有约5-9μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌具有约6-8μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌，即在诱导下，可使腺苷降解增加约50％至70％。低氧条件，1小时后。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在1小时后在低氧条件下诱导时，使腺苷降解增加约55％至65％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导时，在1之后，使腺苷降解增加约55％至60％。小时。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在1小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个具体实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在1小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在2小时后在低氧条件下诱导时，使腺苷降解增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导时，在2之后，使腺苷降解增加约97％至99％。小时。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可在2小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约40-50倍。在一个具体实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在2小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约44-48倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导时，使腺苷降解增加约95％至100％，3个小时后。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导3小时后，使腺苷降解增加约98％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下(即，在低氧条件下诱导3小时后)后，使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4个小时后，使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4小时后，使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，基因工程化以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在相同条件下，即在低氧条件下诱导4小时后，使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％。％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％45犬尿氨酸的％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％比未修饰的细菌更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍。犬尿嘧啶的倍数，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，经基因工程改造以消耗犬尿氨酸和任选产生色氨酸的细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％的细菌。％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或者多90％至100％的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比色氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌的％。在另一种腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍，或在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌的数量增加两倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍。相对于相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌，折叠，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一个腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，在4小时后，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一个腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后在相同条件下使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一个特定的腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下和/或在癌症和/或肿瘤存在下降解腺苷和犬尿氨酸。在一些实施方式中，编码用于降解腺苷和/或犬尿氨酸的回路的基因序列由可由这些条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些腺苷和犬尿氨酸消耗实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和犬尿氨酸消耗回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一个或多个质粒中。微生物染色体。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1。抗体。
腺苷消耗和精氨酸产生
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于降解腺苷和精氨酸产生的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码精氨酸产生回路的基因序列以及腺苷降解途径。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。
在一个实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于降解腺苷和基因工程化细菌的回路，其包含用于产生精氨酸的序列。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码反馈抗性ArgA(ArgAfbr)的基因序列和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失，以及包含编码腺苷降解途径的基因序列的基因工程化细菌。
在一个组合物实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在一个组合物实施方式中，编码腺苷降解途径酶的基因序列包含选自xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC的一种或多种基因。在一个实施方式中，编码腺苷降解途径的基因序列包含xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在一个实施方式中，腺苷途径酶来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，所述二乙酸酯化环化酶来自单核细胞增生李斯特氏菌，并且编码腺苷降解途径的基因序列包含例如来自大肠杆菌的xdhA，xdhB，xdhC，add，xapA，deoD和nupC。在具体的实施方式中，腺苷途径酶整合到染色体中并且在低氧启动子(例如FNR)的控制下。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％腺苷的45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％比未修饰的细菌多。在另一个实施方式中，细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的腺苷。在相同条件下的细菌亚型。在另一个实施方式中，细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍。两倍更多折叠，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的腺苷。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％15％45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多尿酸盐两倍更多。在另一个实施方式中，细菌比未修饰的细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的尿酸盐。在另一个实施方式中，细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍。折叠率，四倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌使腺苷降解率增加0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％。％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％相对于相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌。在另一个实施方式中，细菌相对于细菌将腺苷降解速率提高1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。在另一个实施方式中，细菌将降解速率提高约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍。相对于相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌，折叠，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，当在低氧条件下诱导时，细菌可具有约1.8-10μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，细菌具有约5-9μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。在一个具体实施方式中，细菌具有约6-8μmol/hr/109细胞的腺苷降解速率。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，即在低氧条件下诱导，1后，细菌可使腺苷降解增加约50％至70％。小时。在一个实施方式中，即在1小时后在低氧条件下诱导时，细菌使腺苷降解增加约55％至65％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导1小时后，细菌使腺苷降解增加约55％至60％。在另一个实施方式中，1小时后，当在低氧条件下诱导时，细菌使腺苷降解增加约1.5-3倍。在一个具体实施方式中，细菌在1小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约2-2.5倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌使腺苷降解增加约85％至100％。在一个实施方式中，即在2小时后在低氧条件下诱导时，细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导2小时后，细菌使腺苷降解增加约97％至99％。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，在低氧条件下诱导2小时后，细菌可使腺苷降解增加约40-50倍。在一个具体实施方式中，细菌在2小时后在低氧条件下诱导时使腺苷降解增加约44-48倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个具体实施方式中，即在低氧条件下诱导3小时后，细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导3小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在一种腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌使腺苷降解增加约95％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌使腺苷降解增加约98％至100％。在一个实施方式中，即在低氧条件下诱导4小时后，细菌使腺苷降解增加约99％至99％。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约100-1000倍。在另一个实施方式中，细菌在低氧条件下诱导4小时后使腺苷降解增加约1000-10000倍。
在任何腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％精氨酸含量高于％。
在另一种腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。-精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％。％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些腺苷消耗和精氨酸生产消耗实施方式中，基因工程化微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下和/或在存在癌症的情况下降解腺苷和产生精氨酸。在一些实施方式中，编码腺苷降解和精氨酸产生的回路的基因序列由这些条件和/或诱导物可诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些腺苷消耗和精氨酸产生实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和精氨酸产生回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一个或多个位点中。微生物染色体。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1。抗体。
犬尿氨酸消耗和精氨酸产量
在一些实施方式中，基因工程化细菌包括用于消耗犬尿氨酸和精氨酸产生的回路。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码精氨酸产生回路的基因序列以及犬尿氨酸消耗(和任选的色氨酸产生)途径。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列与精氨酸产生途径的组合。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在替代性实施方式中，本公开提供了包含不同基因工程化细菌的组合(例如，两种或更多种)的组合物，每种细菌编码不同的免疫调节剂。因此，在一些实施方式中，组合物包含基因工程化细菌，其包含用于消耗犬尿氨酸和基因工程化细菌的回路，其包含用于产生精氨酸的回路。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码精氨酸产生回路的基因序列，所述基因序列与基因工程化细菌组合，所述基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸消耗(和任选的色氨酸产生)途径的基因序列。在一个实施方式中，所述组合物包含基因工程化细菌，所述基因工程化细菌包含编码犬尿氨酸酶的基因序列以及包含编码精氨酸产生途径的基因序列的基因工程化细菌。在一个实施方式中，犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。在一个具体实施方式中，来自荧光假单胞菌的犬尿嘧啶酶是染色体整合的并且在组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，编码精氨酸产生回路的基因序列包含反馈抗性ArgA(ArgAfbr)和内源精氨酸操纵子阻遏物ArgR中的缺失。在一个实施方式中，ArgAfbr来自大肠杆菌。在一个具体实施方式中，ArgAfbr整合到染色体中并且处于低氧启动子的控制下，例如FNR。在任何这些实施方式中，可以缺失TrpE。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌消耗0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％犬尿氨酸的45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％比未修饰的细菌多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的犬尿氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍。犬尿嘧啶的倍数，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，经基因工程以消耗犬尿氨酸和任选地产生色氨酸的细菌产生至少约0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％，或相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌的色氨酸多90％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比色氨酸产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍的色氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的色氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌将犬尿氨酸消耗率提高0％至2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至在相同条件下相对于相同细菌亚型的未修饰细菌100％。在另一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗率增加1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍，或两倍更多。在另一个实施方式中，基因工程化细菌使犬尿氨酸消耗速率增加约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍。相对于相同条件下相同细菌亚型的未修饰细菌，折叠，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多。
在一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约80％至100％。在一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后在相同条件下使犬尿氨酸消耗增加约90％至100％。在一种特定的犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约95％至100％。在一个具体实施方式中，基因工程化细菌在4小时后相对于相同细菌亚型的未修饰细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约99％至100％。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10-50倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约50-100倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约100-500倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约500-1000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约1000-5000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约5000-10000倍。在另一个实施方式中，基因工程化细菌在4小时后使犬尿氨酸消耗增加约10000-1000倍。
在任何犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至10％至10％。12％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％精氨酸含量高于％。
在另一种犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。-精氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌产生约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的精氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化细菌消耗0％至2％，2％至4％，4％至6％，6％至8％，8％至10％，10％至12％。％，12％至14％，14％至16％，16％至18％，18％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至35％，35％至40％，40％至45％，45％至50％，50％至55％，55％至60％，60％至65％，65％至70％至80％，80％至90％或90％至100％更多谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌比未修饰的细菌消耗1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍多的谷氨酸。在另一个实施方式中，基因工程化细菌消耗约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍更多的谷氨酸。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，细菌能够将细胞增殖减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够使肿瘤生长减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤尺寸减小至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在任何这些实施方式中，细菌能够将肿瘤重量减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多。
在一些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，基因工程化微生物能够表达任何一种或多种所述回路，用于在低氧条件下和/或在癌症和/或存在下的犬尿氨酸消耗和精氨酸产生。肿瘤微环境，或组织特异性分子或代谢物，和/或存在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物，和/或存在于肠道中的代谢物，和/或存在下代谢物可以存在或不存在于体内，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质。在一些实施方式中，编码用于犬尿氨酸消耗和精氨酸产生的回路的基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在任何这些犬尿氨酸消耗和精氨酸生产实施方式中，任何一种或多种所述腺苷降解回路和犬尿氨酸消耗回路存在于一种或多种质粒上(例如，高拷贝或低拷贝)或整合到一个或多个位点中。微生物染色体。此外，在一些实施方式中，基因工程化微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一种或多种杀灭开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何杀灭开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌回路，例如本文所述的和本领域已知的任何分泌回路，(6)一种或多种表面展示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面展示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种本文所述代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，色氨酸，腺苷，精氨酸)，和(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，经基因工程改造以消耗腺苷和犬尿氨酸的细菌可单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1。抗体。
调节抗癌分子的表达
在一些实施方式中，细菌细胞包含携带编码有效负载的基因的稳定维持的质粒或染色体，使得有效负载可在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够存活并且/或体外生长，例如在培养基中和/或体内，例如在肠道中或在肿瘤微环境中。在一些实施方式中，细菌细胞包含两种或更多种不同的有效载荷或操纵子，例如，两种或更多种有效载荷基因。在一些实施方式中，细菌细胞包含三种或更多种不同的转运蛋白或操纵子，例如三种或更多种有效负载基因。在一些实施方式中，细菌细胞包含4，5，6，7，8，9，10或更多个不同的有效载荷或操纵子，例如4，5，6，7，8，9，10或更多个有效载荷基因。
本文中术语“有效负载”“目的多肽”或“目的多肽”，“目的蛋白质”，“目的蛋白质”，“有效负载”，“效应分子”，“效应子”是指本文所述的一种或多种效应分子。和/或一种或多种酶或多肽起到产生这种效应分子所需的酶的作用。有效载荷的非限制性实例包括IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM。-CSF，CXCL10，CXCL9，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4，抗LAG3，抗TIM3和本文所述的其他)，犬尿氨酸酶，色氨酸和/或精氨酸产生酶，腺苷降解酶。
如本文所用，术语“目的多肽”或“目的多肽”，“目的蛋白质”，“目的蛋白质”，“有效负载”，“有效负载”还包括任何或多种任何色氨酸合成酶。，犬尿氨酸降解酶，腺苷降解酶，产生精氨酸的酶和本文所述的其他代谢途径酶。如本文所用，术语“感兴趣的基因”或“感兴趣的基因序列”包括编码一种或多种基因的一种或多种基因和/或基因序列和/或基因盒。本文描述的抗癌分子。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含相同有效负载基因的多个拷贝。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至在低氧或厌氧条件下诱导的启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并且可操作地连接于通过暴露于四环素或阿拉伯糖或本文所述的另一种化学或营养诱导物而诱导的启动子。
在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且可操作地连接至直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体中并且与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与通过暴露于四环素或阿拉伯糖或本文所述的另一种化学或营养诱导物诱导的启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效载荷，所有有效载荷都存在于染色体上。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效载荷，所有有效载荷都存在于一种或多种相同或不同的质粒上。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种有效负载，其中一些存在于染色体上，并且其中一些存在于一种或多种相同或不同的质粒上。
在上述任何实施方式中，用于产生抗癌分子组合的一种或多种有效负载与一种或多种直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道，肿瘤微环境或其他组织特异性条件中发现的条件。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，一种或多种有效负载可操作地连接至在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子。在一些实施方式中，一种或多种有效负载可操作地连接至在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)，如本文所述。在一些实施方式中，一种或多种有效负载与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖，或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。
在一些实施方式中，如本文所述，在体内条件下诱导启动子，例如肠。在一些实施方式中，如本文所述，在体外条件下诱导启动子，例如各种细胞培养和/或细胞制造条件。在一些实施方式中，如本文所述，在体内条件下诱导启动子，例如肠，并且在体外条件下，例如各种细胞培养和/或细胞产生和/或制造条件，如本文所述。
在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的启动子直接由外源环境条件(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)诱导。在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的启动子由外源环境条件(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)间接诱导。
在一些实施方式中，启动子直接或间接地由哺乳动物肠道特异性的外源环境条件诱导。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由对哺乳动物的肿瘤和/或小肠的缺氧环境特异的外源环境条件诱导。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由低氧或厌氧条件诱导，例如肿瘤的低氧环境和/或哺乳动物肠的环境。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由对肿瘤，特定组织或哺乳动物的肠特异的分子或代谢物诱导。在一些实施方式中，启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。
FNR依赖性调控
本发明的基因工程化细菌包含用于产生抗癌分子的基因或基因盒，其中所述基因或基因盒与由外源环境条件控制的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，诱导型启动子是氧水平依赖性启动子，并且抗癌分子在低氧，微需氧或厌氧条件下表达。例如，在低氧条件下，氧水平依赖性启动子被相应的氧水平感应转录因子激活，从而驱动抗癌分子的产生。
细菌已经进化出能够感知氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。氧水平依赖性启动子是一种或多种氧水平感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或活化激活下游基因表达。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含用于在氧水平依赖性启动子控制下产生有效负载的基因或基因盒。在更具体的方面，基因工程化细菌包括基因或基因盒，用于在氧水平依赖性启动子的控制下产生有效载荷，所述启动子在低氧或厌氧环境下活化，例如肿瘤的低氧环境和/或哺乳动物肠道的环境。
在某些实施方式中，细菌细胞包含编码在富马酸盐和硝酸盐还原酶调节剂(FNR)响应性启动子控制下表达的有效负载的基因。在大肠杆菌中，FNR是控制从需氧代谢到无氧代谢转换的主要转录激活因子(Unden等，1997)。在厌氧状态下，FNR二聚化成活性DNA结合蛋白，激活数百个负责适应厌氧生长的基因。在好氧状态下，FNR被氧气防止二聚化并且是无活性的。FNR应答启动子包括但不限于SEQ ID NO:563-579的FNR应答启动子。下划线序列是预测的核糖体结合位点，粗体序列是用于克隆的限制性位点。
FNR启动子序列是本领域已知的，并且任何合适的FNR启动子序列可用于本发明的基因工程化细菌中。任何合适的FNR启动子可以与任何合适的有效载荷组合。
如本文所用，术语“有效负载”是指一种或多种例如抗癌分子，包括但不限于IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，透明质酸酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4，抗LAG3，抗TIM3和本文所述的其他物质)，犬尿氨酸酶，色氨酸和/或精氨酸产生酶，腺苷降解酶。
非限制性FNR启动子序列提供在SEQ ID NO:563-579中。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含以下中的一种或多种：SEQ IDNO:563，SEQ ID NO:564，SEQ ID NO:565，SEQ ID NO:566，SEQ ID NO:567，SEQ ID NO:568，SEQ ID NO:569，nirB1启动子(SEQ ID NO:570)，nirB2启动子(SEQ ID NO:571)，nirB3启动子(SEQ ID NO:572)，ydfZ启动子(SEQ ID NO:573)，nirB与强核糖体结合位点(SEQ ID NO:574)融合的启动子，与强核糖体结合位点(SEQ ID NO:575)融合的ydfZ启动子，fnrS，厌氧诱导的小RNA基因(fnrS1启动子SEQ ID NO:576或fnrS2启动子SEQ ID NO:577)，与crp结合位点融合的nirB启动子(SEQ ID NO:578)，和与crp结合位点融合的fnrS(SEQ ID NO:579)。在一些实施方式中，FNR应答启动子与选自SEQIDNOs的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源：563-579。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列包含FNR响应性启动子，所述启动子包含选自SEQ ID NO:563-579的序列。在另一个实施方式中，FNR应答启动子由选自SEQIDNOs：563-579的序列组成。
在一些实施方式中，将多种不同的FNR核酸序列插入基因工程化细菌中。在替代性实施方式中，基因工程化细菌包含编码在交替氧水平依赖性启动子控制下表达的有效负载的基因，例如DNR(Trunk等，2010)或ANR(Ray等，1997)。在这些实施方式中，有效负载基因的表达在低氧或厌氧环境中特别是在肠道中被激活。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法进一步优化基因表达，例如通过优化核糖体结合位点和/或增加mRNA稳定性。在一个实施方式中，哺乳动物肠是人哺乳动物肠。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生在精氨酸脱亚胺酶和硝酸盐还原转录调节剂(ANR)的厌氧调节的控制下表达的抗癌分子的基因或基因盒。在铜绿假单胞菌中，ANR“是表达在限氧或厌氧条件下可诱导的生理功能所必需的”(Winteler等，1996；Sawers，1991)。铜绿假单胞菌ANR与大肠杆菌FNR同源，并且“共有FNR位点(TTGAT----ATCAA)被ANR和FNR有效识别”(Winteler等，1996)。与FNR一样，在厌氧状态下，ANR激活许多负责适应厌氧生长的基因。在有氧状态下，ANR无效。荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌，丁香假单胞菌和门多萨假单胞菌都具有ANR的功能类似物(Zimmermann等，1991)。由ANR调节的启动子是本领域已知的，例如arcDABC操纵子的启动子(参见，例如，Hasegawa等，1998)。
在其他实施方式中，用于产生有效负载的一种或多种基因序列在氧水平依赖性启动子的控制下表达，所述启动子与转录激活因子(例如CRP)的结合位点融合。CRP(环状AMP受体蛋白或分解代谢物激活蛋白或CAP)通过抑制负责摄取，代谢和同化较不利的碳源的基因，在存在快速代谢的碳水化合物(如葡萄糖)时，在细菌中发挥重要的调节作用(Wu)等，2015)。这种对葡萄糖的偏好被称为葡萄糖抑制，以及碳分解代谢物抑制(Deutscher，2008；
Figure BDA0002194618080003581
和Stülke，2008)。在一些实施方式中，用于产生抗癌分子的基因或基因盒由与CRP结合位点融合的氧水平依赖性启动子控制。在一些实施方式中，有效负载的一种或多种基因序列由与CRP结合位点融合的FNR启动子控制。在这些实施方式中，当环境中不存在葡萄糖时，环AMP结合CRP。这种结合导致CRP的构象变化，并允许CRP紧密结合其结合位点。然后CRP结合通过直接蛋白质-蛋白质相互作用将RNA聚合酶募集到FNR启动子来激活基因或基因盒的转录。在葡萄糖存在下，环AMP不与CRP结合，并且抑制用于产生有效负载的基因或基因盒的转录。在一些实施方式中，使用与转录激活因子的结合位点融合的氧水平依赖性启动子(例如，FNR启动子)来确保当足够量的用于产生有效负载的基因或基因盒在厌氧条件下不表达。例如，通过在体外向生长培养基中添加葡萄糖，可以存在葡萄糖。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的氧水平依赖性启动子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的氧水平感应转录因子，例如FNR，ANR或DNR。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含氧水平感应转录因子和来自不同物种，菌株或细菌亚群的相应启动子。异源氧水平依赖性转录调节因子和/或启动子增加与所述启动子可操作连接的基因的转录，例如，用于在低氧或厌氧环境中产生有效负载的一种或多种基因序列，如与相同条件下细菌中的天然基因和启动子相比较。在某些实施方式中，非天然氧水平依赖性转录调节因子是来自淋病奈瑟氏球菌的FNR蛋白(参见，例如，Isabella等，2011)。在一些实施方式中，相应的野生型转录调节因子保持完整并保留野生型活性。在替代性实施方式中，缺失或突变相应的野生型转录调节因子以减少或消除野生型活性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型氧水平依赖性转录调节因子，例如FNR，ANR或DNR，以及相对于来自相同亚型细菌的野生型启动子突变的相应启动子。与野生型启动子相比，突变启动子增强与野生型转录调节因子的结合并增加与所述启动子可操作地连接的基因的转录，例如，在低氧或厌氧环境中编码有效负载的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型氧水平依赖性启动子，例如FNR，ANR或DNR启动子，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录调节子突变的相应转录调节子。与野生型转录调节因子相比，突变的转录调节因子增强与野生型启动子的结合并增加与所述启动子可操作地连接的基因的转录，例如编码有效负载的基因，在低氧或厌氧环境中。在相同的条件下。在某些实施方式中，突变氧水平依赖性转录调节因子是包含增强二聚化和FNR活性的氨基酸取代的FNR蛋白(参见，例如，Moore等，(2006)。在一些实施方式中，相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列，氧水平感应转录调节因子和相应的启动子都是突变的，以便在低氧条件下增加有效负载的表达。
在一些实施方式中，细菌细胞包含编码中的氧气水平感测转录调节，例如，FNR基因的内源基因的多个拷贝。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因存在于质粒上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于不同的质粒上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于同一质粒上。
在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因存在于染色体上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于不同的染色体上。在一些实施方式中，编码氧水平感应转录调节因子的基因和编码有效负载的基因存在于同一染色体上。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达氧水平感应转录调节因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方式中，转录调节子的表达由与控制编码有效负载的基因的表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方式中，转录调节因子的表达受控制有效负载表达的相同启动子控制。在一些实施方式中，转录调节子和有效负载从启动子区域发散转录。
RNS依赖性调控
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含编码在诱导型启动子控制下表达的有效负载的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒在受炎性条件激活的启动子控制下表达有效负载。在一个实施方式中，用于产生有效负载的基因在炎性环境中活化的炎性依赖性启动子的控制下表达，例如活性氮物种或RNS启动子。
如本文所用，“活性氮物质”和“RNS”可互换使用，是指高分子氮，离子和/或衍生自分子氮的基团。RNS可引起有害的细胞效应，如亚硝化应激。RNS包括但不限于一氧化氮(NO·)，过氧亚硝酸盐或过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)，二氧化氮(·NO2)，三氧化二氮(N2O3)，过氧亚硝酸(ONOOH)和硝基过氧碳酸盐(ONOOCO2-)(由...表示的不成对电子)。细菌已经进化出能够感知RNS水平的转录因子。不同的RNS信号传导途径由不同的RNS水平触发并且以不同的动力学发生。
如本文所用，“RNS诱导型调节区”是指一种或多种RNS感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或活化激活下游基因表达；在RNS存在下，转录因子结合和/或激活调节区。在一些实施方式中，RNS诱导型调节区包含启动子序列。在一些实施方式中，转录因子感知RNS并随后结合RNS诱导型调节区，从而激活下游基因表达。在替代性实施方式中，转录因子在不存在RNS的情况下与RNS诱导型调节区结合；在RNS存在下，转录因子经历构象变化，从而激活下游基因表达。RNS诱导型调节区可以与一个或多个基因可操作地连接，例如有效载荷基因序列，例如本文所述的任何有效载荷。例如，在RNS存在下，转录因子感知RNS并激活相应的RNS诱导型调节区，从而驱动可操作地连接的基因序列的表达。因此，RNS诱导基因或基因序列的表达。
如本文所用，“RNS-可抑制调节区”是指一种或多种RNS-感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在RNS存在下，转录因子不与调节区结合并且不抑制调节区。在一些实施方式中，RNS-可抑制的调节区包含启动子序列。RNS去抑制性调节区可以与一个或多个基因可操作地连接，例如有效负载基因序列。例如，在RNS存在下，转录因子感知RNS并且不再结合和/或抑制调节区，从而去除可操作地连接的基因序列或基因盒。因此，RNS抑制基因或基因的表达。
如本文所用，“RNS-可抑制调节区”是指一种或多种RNS-感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在RNS存在下，转录因子结合并抑制调节区。在一些实施方式中，RNS-可阻抑调节区包含启动子序列。在一些实施方式中，感测RNS的转录因子能够结合与启动子序列的一部分重叠的调节区。在替代性实施方式中，感测RNS的转录因子能够结合启动子序列上游或下游的调节区。RNS-可阻抑调节区可以与基因序列或基因盒可操作地连接。例如，在RNS存在下，转录因子感知RNS并结合相应的RNS-可阻抑调节区，从而阻断可操作连接的基因序列或基因序列的表达。因此，RNS抑制基因或基因序列的表达。
如本文所用，“RNS-响应调节区”是指RNS诱导型调节区，RNS-可抑制调节区和/或RNS-可抑制调节区。在一些实施方式中，RNS响应调节区包含启动子序列。每个调节区域能够结合至少一个相应的RNS感应转录因子。感测RNS及其相应的RNS响应基因，启动子和/或调节区的转录因子的实例包括但不限于表9中所示的那些。
表9。RNS感应转录因子和RNS响应基因的实例
Figure BDA0002194618080003621
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含可调节调节区，其由能够感测至少一种活性氮物质的转录因子直接或间接控制。可调节调节区与一个或多个能够直接或间接驱动有效负载表达的基因可操作地连接，从而控制有效负载相对于RNS水平的表达。例如，可调调节区域是RNS诱导调节区域，并且有效载荷是有效载荷，例如本文提供的任何有效载荷；当RNS存在时，例如，在发炎的组织中，RNS感应转录因子结合和/或激活调节区并驱动有效负载基因或基因的表达。随后，当炎症得到改善时，RNS水平降低，并且有效负载的产生减少或消除。
在一些实施方式中，可调节调节区是RNS诱导型调节区；在RNS存在下，转录因子感知RNS并激活RNS诱导的调节区，从而驱动可操作地连接的基因或基因的表达。在一些实施方式中，转录因子感知RNS并随后结合RNS诱导型调节区，从而激活下游基因表达。在替代性实施方式中，转录因子在不存在RNS的情况下与RNS诱导型调节区结合；当转录因子感知RNS时，它经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
在一些实施方式中，可调调节区是RNS诱导型调节区，并且感测RNS的转录因子是NorR。NorR“是一种无响应的转录激活因子，可调节编码风味内毒素的norVW基因的表达，以及相关的黄素蛋白，将NO还原成一氧化二氮”(SpirO2006)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被NorR活化的基因的任何合适的RNS响应调节区。能够被NorR激活的基因是本领域已知的(参见，例如，SpirO2006；Vine等，2011；Karlinsey等，2012)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自norVW的RNS诱导型调节区，其可操作地连接至一种或多种基因，例如一种或多种有效负载基因序列。在RNS存在下，NorR转录因子感知RNS并激活至norVW调节区，从而驱动可操作地连接的基因的表达并产生有效负载。
在一些实施方式中，可调调节区是RNS诱导型调节区，并且感测RNS的转录因子是DNR。DNR(异化硝酸盐呼吸调节剂)在一氧化氮存在下“促进nir，nor和nos基因的表达”(Castiglione等，2009)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被DNR活化的基因的任何合适的RNS响应调节区。能够被DNR活化的基因是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Giardina等，2008)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自norCB的RNS诱导型调节区，其可操作地连接至基因或基因盒，例如，丁酸基因盒。在RNS存在下，DNR转录因子感知RNS并激活至norCB调节区，从而驱动可操作地连接的基因或基因的表达并产生一种或多种有效载荷。在一些实施方式中，DNR是铜绿假单胞菌DNR。
在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生在异化硝酸盐呼吸调节剂(DNR)控制下表达的抗癌分子的基因或基因盒。DNR是FNR家族的成员(Arai等，1995)，并且是与ANR一起用于“铜绿假单胞菌的厌氧硝酸盐呼吸”的转录调节因子(Hasegawa等，1998)。对于某些基因，FNR结合基序“可能仅由DNR识别”(Hasegawa等，1998)。可以使用受外源环境条件和相应调节区控制的任何合适的转录调节因子。非限制性实例包括ArcA/B，ResD/E，NreA/B/C和AirSR，并且其他在本领域中是已知的。
在一些实施方式中，可调调节区是RNS去抑制调节区，并且相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在RNS存在下，转录因子不再与调节区结合，从而使可操作连接的基因或基因盒去阻遏。
在一些实施方式中，可调调节区是RNS去抑制调节区，并且感测RNS的转录因子是NsrR。NsrR是“一种Rrf2型转录抑制因子，可以感知NO并控制负责NO代谢的基因的表达”(Isabella等，2009)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被NsrR抑制的基因的任何合适的RNS响应调节区。在一些实施方式中，NsrR是淋病奈瑟氏球菌NsrR。能够被NsrR抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Isabella等，2009；Dunn等，2010)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自norB的RNS-可抑制的调节区，其可操作地连接于一个或多个基因，例如有效负载基因。在存在RNS的情况下，NsrR转录因子感知RNS并且不再与norB调节区结合，从而去除有效载荷基因或基因的有效连接并产生有效载荷的编码。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达RNS感应转录因子是有利的，所述转录因子不调节细菌中大量天然基因的表达。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌表达来自不同物种，菌株或细菌亚群的RNS感应转录因子，其中转录因子不结合本发明的基因工程化细菌中的调节序列。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌是大肠杆菌，并且RNS感应转录因子是NsrR，例如来自淋病奈瑟氏球菌，其中大肠杆菌不包含所述NsrR的结合位点。在一些实施方式中，异源转录因子最小化或消除基因工程化细菌中内源调节区和基因的脱靶效应。
在一些实施方式中，可调节调节区是RNS可阻抑调节区，并且相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在RNS存在下，转录因子检测RNS并与RNS-可阻抑调节区结合，从而抑制可操作连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方式中，RNS感应转录因子能够结合与启动子序列的一部分重叠的调节区。在替代性实施方式中，RNS感应转录因子能够结合启动子序列上游或下游的调节区。
在这些实施方式中，基因工程化细菌可包含两个阻遏物激活调节回路，其用于表达有效负载。两个阻遏物激活调节回路包括第一RNS感应阻遏物和第二阻遏物，其可操作地连接至基因或基因盒，例如编码有效负载。在这些实施方式的一个方面，RNS感应阻遏物抑制第二阻遏物的转录，其抑制基因或基因盒的转录。在这些实施方式中有用的第二阻遏物的实例包括但不限于TetR，C1和LexA。在没有第一阻遏物结合的情况下(其在没有RNS的情况下发生)，第二阻遏物被转录，其抑制一个或多个基因的表达。在存在第一阻遏物(其在RNS存在下发生)的结合的情况下，抑制第二阻遏物的表达，并表达一种或多种基因，例如有效载荷基因。
RNS响应性转录因子可以诱导，去抑制或抑制基因表达，这取决于基因工程化细菌中使用的调节区序列。一种或多种类型的RNS感应转录因子和相应的调节区序列可以存在于基因工程化细菌中。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种类型的RNS感应转录因子，例如NsrR，和一种相应的调节区序列，例如来自norB。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种类型的RNS感应转录因子，例如NsrR，和两种或更多种不同的相应调节区序列，例如来自norB和aniA。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种类型的RNS感应转录因子，例如NsrR和NorR，和两种或更多种相应的调节区序列，例如分别来自norB和norR。一个RNS响应调节区可能能够结合一种以上的转录因子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种类型的RNS感应转录因子和一种相应的调节区序列。几种RNS调节的调节区的核酸序列是本领域已知的(参见，例如，SpirO2006；Isabella等，2009；Dunn等，2010；Vine等，2011；Karlinsey等，2012)。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含编码RNS感应转录因子的基因，例如nsrR基因，其由其天然启动子，诱导型启动子，比天然启动子强的启动子控制，例如，GlnRS启动子或P(Bla)启动子，或组成型启动子。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达RNS感应转录因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方式中，RNS感应转录因子的表达受与控制治疗分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方式中，RNS感应转录因子的表达受控制治疗分子表达的相同启动子控制。在一些实施方式中，RNS感应转录因子和治疗分子从启动子区域发散转录。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的RNS感应转录因子的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的RNS响应调节区。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含RNS感应转录因子和来自不同物种，菌株或细菌亚群的相应RNS响应调节区。与在相同条件下来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区相比，异源RNS感应转录因子和调节区可以在RNS存在下增加与所述调节区可操作地连接的基因的转录。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含RNS感应转录因子NsrR和来自淋病奈瑟氏球菌的相应调节区nsrR。在一些实施方式中，天然RNS感应转录因子，例如NsrR，保持完整并保留野生型活性。在替代性实施方式中，缺失或突变天然RNS感应转录因子，例如NsrR，以减少或消除野生型活性。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含编码RNS感应转录因子的内源基因的多个拷贝，例如nsrR基因。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于同一质粒上。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方式中，编码RNS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于同一染色体上。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码RNS感应转录因子的野生型基因，例如NsrR基因，和相对于野生型突变的相应调节区，例如norB调节区。来自相同亚型的细菌的调节区域。与野生型调节区在相同条件下相比，突变调节区在RNS存在下增加有效负载的表达。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型RNS响应调节区，例如norB调节区，和相应的转录因子，例如NsrR，其相对于来自细菌的野生型转录因子突变。相同的子类型。与野生型转录因子在相同条件下相比，突变转录因子在RNS存在下增加有效负载的表达。在一些实施方式中，相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列，RNS感应转录因子和相应的调节区都发生突变，以便在RNS存在下增加有效负载的表达。
在一些实施方式中，用于产生抗癌分子的基因或基因盒存在于质粒上并且可操作地连接至由RNS诱导的启动子。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如通过优化核糖体结合位点，操纵转录调节子和/或增加mRNA稳定性。
在一些实施方式中，本公开的任何基因可以在一个或多个整合位点整合到细菌染色体中。例如，编码有效负载基因的一个或多个拷贝的一个或多个拷贝可以整合到细菌染色体中。具有整合到染色体中的基因或基因的多个拷贝允许更大量地产生有效负载并且还允许微调表达水平。或者，除了治疗基因或基因盒之外，本文所述的不同回路，例如任何分泌或输出回路，可以在一个或多个不同的整合位点整合到细菌染色体中以执行多种不同的功能。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌在RNS存在下产生至少一种有效负载，以将局部肠道炎症减少至少约1.5倍，至少约2倍，至少约10倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约50倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，至少约600倍，至少约700倍，至少约800倍，至少约900倍，至少约1000倍，或至少1500倍。炎症可通过本领域已知的方法测量，例如，使用内窥镜检查计数疾病损伤；检测外周血中T调节细胞的分化，例如通过荧光激活分选；测量T调节细胞水平；测量细胞因子水平；测量粘膜损伤区域；例如，通过qPCR测定炎性生物标志物；PCR阵列；转录因子磷酸化测定；免疫测定；和/或细胞因子测定试剂盒(Mesoscale，Cayman Chemical，Qiagen)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌产生至少约1.5倍，至少约2倍，至少约10倍，至少约15倍，至少约20倍，至少约30倍。，至少约50倍，至少约100倍，至少约200倍，至少约300倍，至少约400倍，至少约500倍，至少约600倍，至少约700倍，至少约800倍，至少约900倍，至少约1，000倍或至少约1500倍RNS存在下的有效负载量。某些未修饰的细菌将不具有可检测水平的有效载荷。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方式中，有效载荷在RNS存在下是可检测的。
ROS依赖性调节
在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒包含用于产生在诱导型启动子控制下表达的有效负载的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒在启动子控制下表达有效负载，所述启动子由细胞损伤条件激活。在一个实施方式中，用于产生有效负载的基因在细胞受损依赖性启动子的控制下表达，所述启动子在存在细胞或组织损伤的环境中被激活，例如活性氧物质或ROS启动子。
如本文所用，“活性氧物质”和“ROS”可互换使用，是指高分子量，离子和/或衍生自分子氧的基团。ROS可以作为有氧呼吸或金属催化氧化的副产物产生，并且可以引起有害的细胞效应，例如氧化损伤。ROS包括但不限于过氧化氢(H2O2)，有机过氧化物(ROOH)，羟基离子(OH-)，羟基自由基(·OH)，超氧化物或超氧阴离子(·O2-)，单线态氧(1O2)，臭氧(O3)，碳酸根，过氧化物或过氧自由基(·O2-2)，次氯酸(HOCl)，次氯酸根离子(OCl-)，次氯酸钠(NaOCl)，一氧化氮(NO·)，过氧亚硝酸盐或过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)(未配对的电子用·表示)。细菌已经进化出能够感知ROS水平的转录因子。不同的ROS信号通路由不同的ROS水平触发，并以不同的动力学发生(Marinho等，2014)。
如本文所用，“ROS诱导型调节区”是指一种或多种ROS感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合和/或活化激活下游基因表达；在ROS存在下，转录因子结合和/或激活调节区。在一些实施方式中，ROS诱导型调节区包含启动子序列。在一些实施方式中，转录因子感知ROS并随后结合ROS诱导型调节区，从而激活下游基因表达。在替代性实施方式中，转录因子在不存在ROS的情况下与ROS诱导型调节区结合；在ROS存在下，转录因子经历构象变化，从而激活下游基因表达。ROS-诱导型调节区可以与基因序列或基因序列可操作地连接，例如编码一种或多种有效负载的序列。例如，在ROS的存在下，转录因子例如OxyR感知ROS并激活相应的ROS诱导型调节区，从而驱动可操作地连接的基因序列或基因序列的表达。因此，ROS诱导基因或基因的表达。
如本文所用，“ROS-可抑制的调节区”是指一种或多种ROS-感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合抑制下游基因表达；在ROS存在下，转录因子不会结合并且不会抑制调节区。在一些实施方式中，ROS-可抑制的调节区包含启动子序列。ROS-可抑制的调节区可以与一个或多个基因可操作地连接，例如编码一个或多个有效载荷的一个或多个基因。例如，在ROS的存在下，转录因子(例如OhrR)感知ROS并且不再结合和/或抑制调节区，从而去除可操作地连接的基因序列或基因盒。因此，ROS去抑制基因或基因盒的表达。
如本文所用，“ROS-可抑制调节区”是指一种或多种ROS感应转录因子能够结合的核酸序列，其中相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在ROS存在下，转录因子结合并抑制调节区。在一些实施方式中，ROS-可阻抑调节区包含启动子序列。在一些实施方式中，感测ROS的转录因子能够结合与启动子序列的一部分重叠的调节区。在替代性实施方式中，感测ROS的转录因子能够结合启动子序列上游或下游的调节区。ROS-可阻抑调节区可以与基因序列或基因序列可操作地连接。例如，在ROS存在下，转录因子(例如PerR)感知ROS并结合相应的ROS-可阻抑调节区，从而阻断可操作地连接的基因序列或基因序列的表达。因此，ROS抑制基因或基因的表达。
如本文所用，“ROS响应性调节区”是指ROS诱导型调节区，ROS-可抑制调节区和/或ROS-可抑制调节区。在一些实施方式中，ROS响应调节区包含启动子序列。每个调节区域能够结合至少一种相应的ROS感应转录因子。感测ROS及其相应的ROS响应基因，启动子和/或调节区的转录因子的实例包括但不限于表10中所示的那些。
表10。ROS感应转录因子和ROS响应基因的实例
Figure BDA0002194618080003701
Figure BDA0002194618080003711
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含可调节调节区，其由能够感测至少一种活性氧物质的转录因子直接或间接控制。可调节调节区可操作地连接到能够直接或间接驱动有效负载表达的基因或基因盒，从而控制有效负载相对于ROS水平的表达。例如，可调调节区是ROS诱导型调节区，分子是有效负载；当ROS存在时，例如在发炎的组织中，ROS感应转录因子结合和/或激活调节区并驱动基因组序列用于有效负载，从而产生有效负载。随后，当炎症得到改善时，ROS水平降低，并且有效负载的产生减少或消除。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS诱导型调节区；在ROS存在下，转录因子检测ROS并激活ROS诱导型调节区，从而驱动可操作连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方式中，转录因子感知ROS并随后结合ROS诱导型调节区，从而激活下游基因表达。在替代性实施方式中，转录因子在不存在ROS的情况下与ROS诱导型调节区结合；当转录因子感知ROS时，它经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS诱导型调节区，并且感测ROS的转录因子是OxyR。OxyR“主要作为过氧化物应激反应的全局调节剂”，并且能够调节许多基因，例如“参与H2O2解毒(katE，ahpCF)，血红素生物合成(hemH)，还原剂供应(grxA，gor，trxC)，硫醇-二硫化物异构化(dsbG)，Fe-S中心修复(sufA-E，sufS)，铁结合(yaaA)，铁进口系统(毛皮)的抑制“和”OxyS，小调节RNA“(Dubbs)等，2012)。基因工程化细菌可包含来自被OxyR激活的基因的任何合适的ROS响应调节区。能够被OxyR激活的基因是本领域已知的(参见，例如，Zheng等，2001；Dubbs等，2012)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自oxyS的ROS诱导型调节区，其可操作地连接至基因，例如有效负载基因。在存在ROS(例如H2O2)的情况下，OxyR转录因子感知ROS并激活至oxyS调节区，从而驱动可操作地连接的有效负载基因的表达并产生有效负载。在一些实施方式中，OxyR由大肠杆菌oxyR基因编码。在一些实施方式中，oxyS调节区是大肠杆菌oxyS调节区。在一些实施方式中，ROS诱导型调节区选自katG，dps和ahpC的调节区。
在替代性实施方式中，可调调节区是ROS诱导型调节区，并且感测ROS的相应转录因子是SoxR。当SoxR“被其[2Fe-2S]簇氧化激活时，它会增加SoxS的合成，从而激活其靶基因表达”(Koo等，2003)。“已知SoxR主要响应超氧化物和一氧化氮”(Koo等，2003)，并且还能够响应H2O2。本发明的基因工程化细菌可包含来自SoxR激活的基因的任何合适的ROS响应调节区。能够被SoxR激活的基因是本领域已知的(参见，例如，Koo等，2003)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自soxS的ROS诱导型调节区，其可操作地连接至基因，例如有效负载。在存在ROS的情况下，SoxR转录因子感知ROS并激活soxS调节区，从而驱动可操作地连接有效负载基因的表达并产生有效负载。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS可去抑制的调节区，并且相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子不再与调节区结合，从而使有效连接的基因或基因盒去阻遏。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS可去抑制的调节区，并且感测ROS的转录因子是OhrR。OhrR“与一对与ohrA启动子位点重叠的反向重复DNA序列结合，从而抑制转录事件”，但氧化的OhrR“不能结合其DNA靶标”(Duarte等，2010)。OhrR是一种“转录抑制因子[...]感知有机过氧化物和NaOCl”(Dubbs等，2012)，并且“被H2O2弱活化，但它对有机氢过氧化物显示出更高的反应性”(Duarte等，2010)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被OhrR抑制的基因的任何合适的ROS响应调节区。能够被OhrR抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自ohrA的ROS-可抑制的调节区，其可操作地连接至基因或基因盒，例如有效负载基因。在存在ROS(例如NaOCl)的情况下，OhrR转录因子感知ROS并且不再结合ohrA调节区，从而去除可操作地连接的有效负载基因并产生有效负载。
OhrR是ROS响应调节剂MarR家族的成员。“MarR家族的大多数成员是转录抑制因子，并且通常与启动子中的-10或-35区域结合，导致RNA聚合酶结合的空间抑制”(Bussmann等，2010)。该家族的其他成员是本领域已知的，包括但不限于OspR，MgrA，RosR和SarZ。在一些实施方式中，感测ROS的转录因子是OspR，MgRA，RosR和/或SarZ，并且本发明的基因工程化细菌包含来自被OspR，MgRA，RosR抑制的基因的一个或多个相应的调节区序列。和/或SarZ。能够被OspR，MgRA，RosR和/或SarZ抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012)。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS可去抑制的调节区，并且感测ROS的相应转录因子是RosR。RosR是“MarR型转录调节因子”，其结合“具有共有序列TTGTTGAYRYRTCAACWA的18-bp反向重复序列”并且“被氧化剂H2O2可逆地抑制”(Bussmann等，2010)。RosR能够抑制许多基因和推定的基因，包括但不限于“假定的聚异戊二烯结合蛋白(cg1322，rosR上游和发散的基因)，感觉组氨酸激酶(cgtS9)，Crp的推定转录调节因子/FNR家族(cg3291)，谷胱甘肽S-转移酶家族的蛋白质(cg1426)，两种推定的FMN还原酶(cg1150和cg1850)，和四种推定的单加氧酶(cg0823，cg1848，cg2329和cg3084)“(Bussmann等。，2010)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被RosR抑制的基因的任何合适的ROS响应调节区。能够被RosR抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Bussmann等，2010)。在某些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自cgtS9的ROS-可抑制的调节区，其可操作地连接至基因或基因盒，例如有效负载。在存在ROS(例如H2O2)的情况下，RosR转录因子感知ROS并且不再与cgtS9调节区结合，从而去除可操作地连接的有效负载基因并产生有效负载。
在一些实施方式中，基因工程化细菌表达ROS感应转录因子是有利的，所述转录因子不调节细菌中大量天然基因的表达。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌表达来自不同物种，菌株或细菌亚群的ROS感应转录因子，其中转录因子不结合本发明的基因工程化细菌中的调节序列。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌是大肠杆菌，并且ROS感应转录因子是RosR，例如来自谷氨酸棒杆菌，其中大肠杆菌不包含所述RosR的结合位点。在一些实施方式中，异源转录因子最小化或消除基因工程化细菌中内源调节区和基因的脱靶效应。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS可抑制调节区，并且相应转录因子的结合抑制下游基因表达；在ROS存在下，转录因子检测ROS并与ROS-可阻抑调节区结合，从而抑制可操作连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方式中，ROS感应转录因子能够结合与启动子序列的一部分重叠的调节区。在替代性实施方式中，ROS感应转录因子能够结合启动子序列上游或下游的调节区。
在一些实施方式中，可调节调节区是ROS可抑制调节区，并且感测ROS的转录因子是PerR。在枯草芽孢杆菌中，PerR“当与DNA结合时，抑制编码参与氧化应激反应的蛋白质(katA，ahpC和mrgA)，金属稳态(hemAXCDBL，fur和zoaA)及其自身合成(perR)的基因”(Marinho等，2014)。PerR是一种“全局调节剂，主要响应H2O2”(Dubbs等，2012)和“与每个盒子的DNA相互作用，一个特定的回文共有序列(TTATAATNATTATAA)(SEQ ID NO:113)，位于其内部和附近。PerR控制基因的启动子序列“(Marinho等，2014)。PerR能够结合“与启动子的一部分重叠或紧邻其下游”的调节区域(Dubbs等，2012)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被PerR抑制的基因的任何合适的ROS响应调节区。能够被PerR抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012)。
在这些实施方式中，基因工程化细菌可包含两个阻遏物激活调节回路，其用于表达有效负载。两个阻遏物激活调节回路包括第一ROS感应阻遏物，例如PerR，和第二阻遏物，例如TetR，其可操作地连接至基因或基因盒，例如有效负载。在这些实施方式的一个方面，ROS感应阻遏物抑制第二阻遏物的转录，其抑制基因或基因盒的转录。在这些实施方式中有用的第二阻遏物的实例包括但不限于TetR，C1和LexA。在一些实施方式中，ROS感应阻遏物是PerR。在一些实施方式中，第二阻遏物是TetR。在该实施方式中，PerR-可阻抑调节区驱动TetR的表达，并且TetR-可阻抑调节区驱动基因或基因盒的表达，例如有效负载。在不存在PerR结合(其在不存在ROS的情况下发生)的情况下，tetR被转录，并且TetR抑制基因或基因盒的表达，例如有效负载。在存在PerR结合(其在ROS存在下发生)的情况下，抑制tetR表达，并表达基因或基因盒，例如有效负载。
ROS响应性转录因子可以诱导，去抑制或抑制基因表达，这取决于基因工程化细菌中使用的调节区序列。例如，虽然“OxyR主要被认为是在氧化条件下的转录激活因子...OxyR在氧化和还原条件下都可以起到抑制剂或活化剂的作用”(Dubbs等，2012)，并且已经证明OxyR“是其自身表达以及fhuF(编码铁离子还原酶)和流感(编码抗原43外膜蛋白)的抑制因子“(Zheng等，2001)。本发明的基因工程化细菌可包含来自被OxyR抑制的基因的任何合适的ROS响应调节区。在一些实施方式中，OxyR用于两个阻遏物激活调节回路，如上所述。能够被OxyR抑制的基因是本领域已知的(参见，例如，Zheng等，2001)。或者，例如，尽管RosR能够抑制许多基因，但它也能够激活某些基因，例如，narKGHJI操纵子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自RosR激活的基因的任何合适的ROS响应调节区。此外，还观察到“PerR介导的阳性调节......并且似乎涉及PerR与远端上游位点的结合”(Dubbs等，2012)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含来自被PerR激活的基因的任何合适的ROS响应调节区。
一种或多种类型的ROS感应转录因子和相应的调节区序列可以存在于基因工程化细菌中。例如，“在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中都发现了OhrR，并且可以与OxyR或PerR或两者结合”(Dubbs等，2012)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种类型的ROS感应转录因子，例如OxyR，和一种相应的调节区序列，例如来自oxyS。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种类型的ROS感应转录因子，例如OxyR，和两种或更多种不同的相应调节区序列，例如来自oxyS和katG。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种类型的ROS感应转录因子，例如OxyR和PerR，以及两种或更多种相应的调节区序列，例如分别来自oxyS和katA。一个ROS响应调节区可能能够结合一种以上的转录因子。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含两种或更多种类型的ROS感应转录因子和一种相应的调节区序列。
几种示例性OxyR调节的调节区的核酸序列示于表10中。OxyR结合位点加下划线和粗体。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含与DNA序列SEQ ID NO:580，SEQ ID NO:581，SEQ ID NO:582或SEQ ID NO:583，或其功能片段至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源的核酸序列。
在一些实施方式中，调节区序列与SEQ ID NO:580，SEQ ID NO:581，SEQ ID NO:582和/或SEQ ID NO:583的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含编码ROS感应转录因子的基因，例如oxyR基因，其由其天然启动子，诱导型启动子，比天然启动子强的启动子控制，例如，GlnRS启动子或P(Bla)启动子，或ac组成型启动子。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达ROS感应转录因子以增强表达稳定性可能是有利的。在一些实施方式中，ROS感应转录因子的表达受与控制治疗分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方式中，ROS感应转录因子的表达受控制治疗分子表达的相同启动子控制。在一些实施方式中，ROS感应转录因子和治疗分子从启动子区域发散转录。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自不同物种，菌株或细菌亚群的ROS感应转录因子的基因。在一些实施方式中，基因工程化细菌包括来自不同物种，应变或细菌的亚株一个ROS响应调节区。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含ROS感应转录因子和来自不同物种，菌株或细菌亚群的相应ROS响应调节区。与在相同条件下来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区相比，异源ROS感应转录因子和调节区可以在ROS存在下增加与所述调节区可操作地连接的基因的转录。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含ROS感应转录因子OxyR和来自大肠杆菌的相应调节区域oxyS。在一些实施方式中，天然ROS感应转录因子(例如OxyR)保持完整并保留野生型活性。在替代性实施方式中，缺失或突变天然ROS感应转录因子，例如OxyR，以减少或消除野生型活性。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含编码ROS感应转录因子的内源基因的多个拷贝，例如oxyR基因。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于其上。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方式中，编码ROS感应转录因子的基因和用于产生治疗分子的基因或基因盒存在于同一染色体上。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码ROS感应转录因子的野生型基因，例如soxR基因，和相对于野生型突变的相应调节区，例如soxS调节区。来自相同亚型的细菌的调节区域。与野生型调节区在相同条件下相比，突变调节区在ROS存在下增加有效负载的表达。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含野生型ROS响应调节区，例如oxyS调节区，和相应的转录因子，例如OxyR，其相对于来自细菌的野生型转录因子突变。相同的子类型。与野生型转录因子在相同条件下相比，突变转录因子在ROS存在下增加有效负载的表达。在一些实施方式中，ROS感应转录因子和相应的调节区都相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列突变，以便在ROS存在下增加有效负载的表达。
在一些实施方式中，用于产生有效负载的基因或基因盒存在于质粒上并可操作地连接至由ROS诱导的启动子。在一些实施方式中，用于产生有效负载的基因或基因盒存在于染色体中并且可操作地连接至由ROS诱导的启动子。在一些实施方式中，用于产生有效负载的基因或基因盒存在于染色体上并且与通过暴露于四环素诱导的启动子可操作地连接。在一些实施方式中，用于产生有效负载的基因或基因盒存在于质粒上并且可操作地连接到通过暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方式中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如通过优化核糖体结合位点，操纵转录调节子和/或增加mRNA稳定性。
在一些实施方式中，基因工程化细菌可包含能够产生有效负载的基因的多个拷贝。在一些实施方式中，能够产生有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至ROS响应调节区。在一些实施方式中，能够产生有效负载的基因存在于染色体中并且可操作地连接至ROS响应调节区。
因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌或基因工程化病毒在氧水平依赖性启动子，活性氧物种(ROS)依赖性启动子或活性氮物种(RNS)的控制下产生一种或多种有效载荷-依赖性启动子和相应的转录因子。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含稳定维持的质粒或染色体，其携带用于产生有效负载的基因，使得有效负载可在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外存活和/或生长，例如，在培养基中和/或体内。在一些实施方式中，细菌可包含编码有效负载的基因的多个拷贝。在一些实施方式中，编码有效负载的基因在低拷贝质粒上表达。在一些实施方式中，低拷贝质粒可用于增加表达的稳定性。在一些实施方式中，低拷贝质粒可用于在非诱导条件下减少渗漏表达。在一些实施方式中，编码有效负载的基因在高拷贝质粒上表达。在一些实施方式中，高拷贝质粒可用于增加有效负载的表达。在一些实施方式中，编码有效负载的基因在染色体上表达。
其他扩增子
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生在诱导型启动子控制下表达的抗癌分子的基因或基因盒，所述诱导型启动子响应于环境中的特定分子或代谢物，例如肿瘤微环境，特定组织，或哺乳动物的肠道。在哺乳动物肠道中，健康和/或疾病状态或肿瘤微环境中发现的任何分子或代谢物可用于诱导有效负载表达。
在替代性实施方式中，用于产生抗癌分子的基因或基因盒可操作地连接到环境中不存在的营养或化学诱导物，例如肿瘤微环境，特定组织或哺乳动物肠。在一些实施方式中，营养或化学诱导剂在基因工程化细菌之前，同时或相继施用。
在一些实施方式中，用于产生抗癌分子的基因或基因盒与在低氧或厌氧条件下诱导的启动子可操作地连接。
其他诱导性启动子
在一些实施方式中，编码抗癌分子的基因存在于质粒上并且可操作地连接至由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导的启动子。在一些实施方式中，编码抗癌分子的基因存在于染色体中并且可操作地连接于由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导的启动子。
在一些实施方式中，细菌细胞包含携带一种或多种基因序列的稳定维持的质粒或染色体，其可被一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导，编码抗体。癌分子，使得抗癌分子可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外存活和/或生长，例如在培养基中和/或体内，例如在肿瘤中。或在肠道。在一些实施方式中，细菌细胞包含编码抗癌分子的一种或多种基因序列的两个或更多个不同拷贝，其由启动子可诱导的一种或多种营养和/或化学诱导物控制和/或或代谢物。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码抗癌分子的相同一种或多种基因序列的多个拷贝，其由启动子可诱导的一种或多种营养和/或化学诱导剂控制和/或或代谢物。在一些实施方式中，编码抗癌分子的一种或多种基因序列存在于质粒上并且可操作地连接至可被一种或多种营养和/或化学诱导剂诱导的直接或间接诱导型启动子和/或代谢物。在一些实施方式中，编码抗癌分子的一种或多种基因序列存在于染色体上并且可操作地连接至由一种或多种营养和/或化学诱导剂直接或间接诱导的和/或代谢物。
在一些实施方式中，编码本文所述目的多肽的一种或多种基因序列存在于质粒上并且与启动子可操作地连接，所述启动子可被一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物直接或间接诱导。在一些实施方式中，细菌细胞包含携带编码抗癌分子的基因的稳定维持的质粒或染色体，其由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导，使得抗癌分子可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外存活和/或生长，例如在培养条件下和/或体内，例如在肠和/或肿瘤中。微环境。在一些实施方式中，细菌细胞包含两种或更多种用于产生目标多肽的基因序列，其中一种或多种基因序列由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含相同基因序列的多个拷贝，用于产生由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导的目标多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含用于产生目的多肽的多个不同基因序列的拷贝，其中一个或多个由一种或多种营养和/或化学诱导剂诱导和/或代谢物。
在一些实施方式中，用于产生目标多肽的基因序列存在于质粒上并且可操作地连接至由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导的启动子。在一些实施方式中，用于产生目的多肽的基因序列存在于染色体中并且与由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物诱导的启动子可操作地连接)。
在一些实施方式中，与编码目标多肽的基因可操作地连接的启动子由一种或多种营养和/或化学诱导剂和/或代谢物直接或间接诱导。
在一些实施方式中，一种或多种诱导型启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间使用或诱导。在一些实施方式中，在一种或多种抗癌分子和/或其他目的多肽的体内表达期间诱导启动子。在一些实施方式中，一种或多种抗癌分子和/或其他目的多肽的表达由一种或多种阿拉伯糖诱导型启动子在体内直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由化学和/或营养诱导物和/或代谢物诱导，所述化学和/或营养诱导物和/或代谢物与本发明的基因工程化细菌共同施用。
在一些实施方式中，一种或多种抗癌分子和/或其他目的多肽的表达由一种或多种启动子直接或间接驱动。在体内施用之前，在体外生长，制备或制造菌株期间，由化学和/或营养诱导物和/或代谢物诱导。在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导物和/或代谢物诱导的启动子在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间使用。在一些实施方式中，启动子被分子直接或间接诱导，所述分子被添加到细菌培养物中以诱导表达并预先加载具有抗癌分子和/或其他目的多肽的细菌。管理。在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导物和/或代谢物诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由化学和/或营养诱导剂和/或代谢物诱导的培养物在厌氧条件下生长。
阿拉伯糖代谢的基因组织在一个操纵子AraBAD中，该操纵子由PAraBAD启动子控制。PAraBAD(或Para)启动子适合满足诱导型表达系统的标准。与许多其他系统相比，PAraBAD显示出对有效载荷基因表达的更严格控制，这可能是由于AraC的双重调节作用，AraC既可作为诱导物又可作为抑制因子。另外，可以在宽范围的L-阿拉伯糖浓度上调节基于ParaBAD的表达水平，以微调有效负载的表达水平。然而，暴露于亚饱和L-阿拉伯糖浓度的细胞群被分成诱导和未诱导细胞的两个亚群，这由L-阿拉伯糖转运蛋白的可用性中各个细胞之间的差异决定(Zhang等，Development and Application of an Arabinose-Inducible Expression System by Facilitating Inducer Uptake in Corynebacteriumglutamicum；Appl.Environ.Microbiol.August 2012 vol.78 no.16 5831-5838)。或者，如本文所述，可以通过优化核糖体结合位点(RBS)来控制或微调来自ParaBad的诱导型表达。
在一个实施方式中，一种或多种目标抗癌分子蛋白(例如一种或多种治疗性多肽)的表达由一种或多种阿拉伯糖诱导型启动子直接或间接驱动。
在一些实施方式中，阿拉伯糖诱导型启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间使用或诱导。在一些实施方式中，一种或多种目标抗癌分子蛋白的表达由一种或多种阿拉伯糖诱导型启动子在体内直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由与本发明的基因工程化细菌(例如阿拉伯糖)共同施用的分子诱导。
在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种阿拉伯糖诱导型启动子直接或间接驱动。期间在体内给药之前，在体外生长，制备，或该菌株的制造。在一些实施方式中，在培养物中诱导阿拉伯糖诱导型启动子，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/中使用。或制造。在一些实施方式中，启动子直接或间接由分子诱导，所述分子在细菌培养物中添加以诱导表达并在施用前用有效负载预加载细菌，例如阿拉伯糖。在一些实施方式中，由阿拉伯糖诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由阿拉伯糖诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一个实施方式中，阿拉伯糖诱导型启动子驱动包含一种或多种目的蛋白质的构建体与第二启动子(例如第二组成型或诱导型启动子)共同表达。在一些实施方式中，两个启动子位于构建体的近侧并驱动其表达，其中阿拉伯糖诱导型启动子在第一组外源条件下驱动表达，第二启动子在第二组外源条件下驱动表达。在一个非限制性实例中，第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间，例如阿拉伯糖和IPTG)。在另一个非限制性实例中，第一诱导条件可以是培养条件，例如包括阿拉伯糖存在，第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧，微需氧或厌氧条件，肿瘤微环境条件，肠代谢物的存在，和/或与细菌菌株组合施用的代谢物。在一些实施方式中，一种或多种阿拉伯糖启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达，与驱动相同基因序列表达的FNR启动子组合。
在一些实施方式中，阿拉伯糖诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒。在一些实施方式中，阿拉伯糖诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质从整合到细菌染色体中的构建体中表达。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，将一种或多种目的蛋白质敲入阿拉伯糖操纵子并由天然阿拉伯糖诱导型启动子驱动。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种具有与SEQ ID NO:585至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的基因序列。在一些实施方式中，阿拉伯糖诱导型构建体还包含编码AraC的基因，所述基因与一种或多种一种或多种目的蛋白质相同的启动子发散转录。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:585的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:585组成的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种具有与SEQ ID NO:586具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含含有SEQ ID NO:586的基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含由SEQ ID NO:586组成的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有与SEQ ID NO:587编码的多肽具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的多肽的一种或多种基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:587的多肽的基因序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:587组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其可通过鼠李糖诱导系统诱导。基因rhaBAD组织在一个操纵子中，该操纵子由rhaPBAD启动子控制。rhaPBAD启动子受两种激活剂RhaS和RhaR的调节，相应的基因属于一个转录单位，它在rhaBAD的相反方向上发散转录。在L-鼠李糖存在下，RhaR与rhaPRS启动子结合并激活RhaR和RhaS的产生。然后RhaS与L-鼠李糖结合，与rhaPBAD和rhaPT启动子结合并激活结构基因的转录。与阿拉伯糖系统相反，其中AraC在基因序列中提供并发散转录，因此在鼠李糖表达系统中不必大量表达调节蛋白，因为从染色体表达的量足以甚至在多拷贝质粒上激活转录。因此，只有rhaPBAD启动子被克隆到待表达基因的上游。完全诱导rhaBAD转录还需要结合CRP-cAMP复合物，CRP-cAMP复合物是分解代谢物抑制的关键调节剂。或者，如本文所述，可以通过优化核糖体结合位点(RBS)来控制或微调来自rhaBAD的诱导型表达。
在一个实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种鼠李糖诱导型启动子直接或间接驱动。在一个实施方式中，有效负载的表达由鼠李糖诱导型启动子直接或间接驱动。
在一些实施方式中，鼠李糖诱导型启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间用于或诱导。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种鼠李糖诱导型启动子在体内直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子由与本发明的基因工程化细菌(例如鼠李糖)共同施用的分子直接或间接诱导。
在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种鼠李糖诱导型启动子直接或间接驱动。期间在体内给药之前，在体外生长，制备，或该菌株的制造。在一些实施方式中，鼠李糖诱导型启动子在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/中使用。或制造。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由分子诱导，所述分子在细菌培养物中添加以诱导表达并在施用前用有效负载预加载细菌，例如鼠李糖。在一些实施方式中，由鼠李糖诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由鼠李糖诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一个实施方式中，鼠李糖诱导型启动子驱动包含一种或多种目的蛋白质的构建体与第二启动子(例如第二组成型或诱导型启动子)共同表达。在一些实施方式中，两个启动子位于构建体的近侧并驱动其表达，其中鼠李糖诱导型启动子在第一组外源条件下驱动表达，第二启动子在第二组外源条件下驱动表达。在一个非限制性实例中，第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间，例如鼠李糖和阿拉伯糖)。在另一个非限制性实例中，第一诱导条件可以是培养条件，例如包括鼠李糖存在，第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧，微需氧或厌氧条件，肿瘤微环境条件，肠代谢物的存在，和/或与细菌菌株组合施用的代谢物。在一些实施方式中，一种或多种鼠李糖启动子驱动一种或多种目的蛋白质和/或转录调节因子(例如FNRS24Y)与驱动相同基因序列表达的FNR启动子的组合的表达(S)。
在一些实施方式中，鼠李糖诱导型启动子从低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒驱动一种或多种目的蛋白质的表达。在一些实施方式中，鼠李糖诱导型启动子从整合到细菌染色体中的构建体驱动一种或多种目的蛋白质的表达。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:588的序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，基因序列包含SEQ ID NO:588的序列。在另一个实施方式中，基因序列由SEQ ID NO:588组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其可通过异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导型系统或诱导来自Lac启动子的转录的其他化合物诱导。IPTG是一种分子模拟的异乳糖，一种乳糖代谢物，可激活lac操纵子的转录。与异乳糖相反，IPTG中的硫原子产生不可水解的化学金发，其防止IPTG降解，使浓度保持恒定。IPTG与lac阻遏物结合并以变构方式从lac操纵子释放四聚体阻遏物(lacI)，从而允许lac操纵子中基因的转录。由于IPTG不被大肠杆菌代谢，因此其浓度保持恒定并且Lac启动子控制的表达速率在体内和体外都受到严格控制。IPTG的摄入与乳糖通透酶的作用无关，因为其他运输途径也参与其中。如本文所述，通过优化核糖体结合位点(RBS)，可以控制或微调来自PLac的诱导型表达。可以以类似方式使用其他使LacI失活的化合物代替IPTG。
在一个实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种IPTG诱导型启动子直接或间接驱动。
在一些实施方式中，IPTG诱导型启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间使用或诱导。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种体内IPTG诱导型启动子直接或间接驱动。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由与本发明的基因工程化细菌(例如IPTG)共同施用的分子诱导。
在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白的表达由一种或多种IPTG诱导型启动子直接或间接驱动。期间在体内给药之前，在体外生长，制备，或该菌株的制造。在一些实施方式中，IPTG诱导型启动子在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/中使用。或制造。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由分子诱导，所述分子在细菌培养物中添加以诱导表达并在施用前用有效负载预加载细菌，例如IPTG。在一些实施方式中，由IPTG诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由IPTG诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一个实施方式中，IPTG诱导型启动子驱动包含一种或多种目的蛋白质的构建体与第二启动子(例如第二组成型或诱导型启动子)共同表达。在一些实施方式中，两个启动子位于构建体的近侧并驱动其表达，其中IPTG诱导型启动子在第一组外源条件下驱动表达，第二启动子在第二组外源条件下驱动表达。在一个非限制性实例中，第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间，例如阿拉伯糖和IPTG)。在另一个非限制性实例中，第一诱导条件可以是培养条件，例如包括IPTG存在，第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧，微需氧或厌氧条件，肿瘤微环境条件，肠代谢物的存在，和/或与细菌菌株组合施用的代谢物。在一些实施方式中，一种或多种IPTG诱导型启动子与驱动相同基因序列表达的FNR启动子一起驱动一种或多种目的蛋白质的表达。
在一些实施方式中，IPTG诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒。在一些实施方式中，IPTG诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自整合到细菌染色体中的构建体。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:589的任何序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:589。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:589组成。
在一些实施方式中，IPTG诱导型构建体还包含编码lacI的基因，所述基因与一种或多种一种或多种目的蛋白质相同的启动子发散转录。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:590的任何序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:SEQ IDNO:590。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:590组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与由SEQ ID NO:591的任何序列编码的多肽具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的多肽的一种或多种基因序列。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:591的多肽的基因序列。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由SEQ ID NO:591组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其可通过四环素诱导系统诱导。最初的系统Gossen和Bujard(通过四环素响应启动子严格控制哺乳动物细胞中的基因表达。GossenM&BujardH.PNAS，1992年6月15日；89(12)：5547-51)开发被称为四环素：在四环素存在下，来自tet诱导型启动子的表达减少。通过将tetR与来自单纯疱疹病毒的VP16(病毒粒子蛋白16)的C末端结构域融合，产生四环素控制的反式激活因子(tTA)。在不存在四环素的情况下，tTA的tetR部分将结合tet启动子中的tetO序列，并且激活结构域促进表达。在存在四环素的情况下，四环素与tetR结合，阻止tTA与tetO序列结合。接下来，开发了反向Tet阻遏物(rTetR)，其产生依赖于四环素的存在而不是抑制。新的反式激活因子rtTA(反向四环素控制的反式激活因子)是通过将rTetR与VP16融合而产生的。系统上的四环素也称为rtTA依赖系统。
在一个实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种四环素诱导型启动子直接或间接驱动。
在一些实施方式中，四环素诱导型启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间使用或诱导。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质和/或转录调节物(例如FNRS24Y)的表达由一种或多种四环素诱导型启动子在体内直接或间接驱动。在一些实施方式中，所述启动子由与本发明的基因工程化细菌共同施用的分子直接或间接诱导，例如四环素。
在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白的表达由一种或多种四环素诱导型启动子直接或间接驱动。期间在体内给药之前，在体外生长，制备，或该菌株的制造。在一些实施方式中，四环素诱导型启动子在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/中使用。或制造。在一些实施方式中，启动子直接或间接地由分子诱导，所述分子在细菌培养物中添加以诱导表达并在施用前用有效负载预加载细菌，例如四环素。在一些实施方式中，由四环素诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，由四环素诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一个实施方式中，四环素诱导型启动子驱动包含一种或多种目的蛋白质的构建体与第二启动子(例如第二组成型或诱导型启动子)共同表达。在一些实施方式中，两个启动子位于构建体的近侧并驱动其表达，其中四环素诱导型启动子在第一组外源条件下驱动表达，第二启动子在第二组外源条件下驱动表达。在非限制性实例中，第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间，例如四环素和IPTG)。在另一个非限制性实例中，第一诱导条件可以是培养条件，例如包括四环素存在，第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧，微需氧或厌氧条件，肿瘤微环境条件，肠代谢物的存在，和/或与细菌菌株组合施用的代谢物。在一些实施方式中，一种或多种四环素启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达与驱动相同基因序列表达的FNR启动子的组合。
在一些实施方式中，四环素诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒。在一些实施方式中，四环素诱导型启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自整合到细菌染色体中的构建体。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:596的任何粗体序列(tet启动子以粗体显示)具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的基因序列。在另一个实施方式中，所述一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:596。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:596组成。
在一些实施方式中，四环素诱导构建体还包含编码AraC的基因，其与一种或多种一种或多种目的蛋白质在相同的启动子上发散转录。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因。序列与斜体中的任何SEQ ID NO:596的序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性(Tet阻遏物以斜体显示)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码具有与由SEQ ID NO:596的任何序列编码的多肽具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的多肽的一种或多种基因序列。斜体(Tet阻抑器用斜体字表示)。在一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:596。在一个实施方式中，多肽由SEQ ID NO:596组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其表达受温度敏感机制控制。温度调节剂是有利的，因为在不使用外部化学品或专用培养基的情况下具有强转录控制(参见，例如，Nemani等，磁性纳米粒子高温诱导的胞嘧啶脱氨酶表达在微囊化的大肠杆菌中用于酶-前药治疗；J Biotechnol。2015年6月10日；203：32-40，以及其中的参考文献)。使用突变体cI857阻遏物和pL和/或pR噬菌体λ启动子的温控蛋白表达已被用于改造重组细菌菌株。然后可以通过噬菌体λ的突变体不耐热cI857阻遏物有效地调节克隆在λ启动子下游的感兴趣的基因。在低于37℃的温度下，cI857与pR启动子的oL或oR区结合并通过RNA聚合酶阻断转录。在较高温度下，功能性cI857二聚体不稳定，与oL或oRDNA序列的结合被消除，并且启动mRNA转录。
如本文所述，可通过优化核糖体结合位点(RBS)来控制或进一步微调来自ParaBad的诱导型表达。
在一个实施方式中，一种或多种目的蛋白质的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动。
在一些实施方式中，温控调节的启动子可在一种或多种目的蛋白质的体内表达期间使用或诱导。在一些实施方式中，感兴趣的一种或多种蛋白(S)的表达是通过在体内的一个或多个温控启动子(一个或多个)直接或间接地驱动。在一些实施方式中，启动子由与本发明的基因工程化细菌共同施用的分子(例如温度)直接或间接诱导。
在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动。期间在体内给药之前，在体外生长，制备，或该菌株的制造。在一些实施方式中，改变一种或多种目的蛋白质的产生可能是有利的。这可以在温度调节的系统中通过在较低温度(例如30℃)下生长菌株来完成。然后可以通过将温度升高至37℃和/或42℃来诱导表达。在一些实施方式中，温控的启动子是在培养物中诱导，例如，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中生长，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间使用。在一些实施方式中，在37℃和42℃之间的温度诱导的培养物在需氧条件下生长。在一些实施方式中，通过37℃和42℃之间的温度诱导诱导的培养物在厌氧条件下生长。
在一个实施方式中，温控启动子驱动包含一种或多种目的蛋白质的构建体与第二启动子(例如第二组成型或诱导型启动子)共同表达。在一些实施方式中，两个启动子位于构建体的近侧并驱动其表达，其中温控启动子在第一组外源条件下驱动表达，第二启动子在第二组外源条件下驱动表达。在一个非限制性实例中，第一和第二条件可以是两个连续的培养条件(即，在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中制备培养物期间，例如，体温调节和阿拉伯糖)。在另一个非限制性实例中，第一诱导条件可以是培养条件，例如允许温度，第二诱导条件可以是体内条件。此类体内条件包括低氧，微需氧或厌氧条件，肿瘤微环境条件，肠代谢物的存在，和/或与细菌菌株组合施用的代谢物。在一些实施方式中，一种或多种温控启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达与FNR启动子的组合，所述FNR启动子驱动相同基因序列的表达。
在一些实施方式中，温控调节的启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒。在一些实施方式中，温控调节的启动子驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自整合到细菌染色体中的构建体。本文描述了示例性插入位点。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:592的任何序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:SEQ ID NO:592。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:592组成。
在一些实施方式中，温控调节的构建体还包含编码突变体cI857阻遏物的基因，其与相同的启动子从一种或多种一种或多种目的蛋白质发散转录。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:593的任何序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:SEQID NO:593。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:593组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码与由SEQ ID NO:595的任何序列编码的多肽具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的多肽的一种或多种基因序列。在一个实施方式中，多肽包含SEQ ID NO:595。在一个实施方式中，多肽由SEQ ID NO:595组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其可通过由PssB启动子驱动的系统间接诱导。Pssb启动子在有氧条件下是活跃的，并且在厌氧条件下关闭。
该启动子可用于在有氧条件下表达感兴趣的基因。该启动子也可用于严格控制基因产物的表达，使其仅在厌氧条件下表达。在这种情况下，氧诱导的PssB启动子诱导阻遏物的表达，其抑制感兴趣的基因的表达。结果，感兴趣的基因仅在不存在阻遏物的情况下表达，即在厌氧条件下表达。该策略具有额外的控制水平，可改善微调和更严格的控制。
在一个实施方式中，一种或多种目的蛋白的表达通过在一种或多种PssB启动子控制下表达的阻遏物间接调节。
在一些实施方式中，RssB启动子的诱导间接驱动一种或多种目的蛋白质的体内表达。在一些实施方式中，在体内施用之前，在体外生长，制备或制备菌株期间，RssB启动子的诱导间接驱动一种或多种目的蛋白质的表达。在一些实施方式中，在培养物中，例如在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中提供诱导RssB启动子的条件，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制期间使用，和/或制造。
在一些实施方式中，PssB启动子间接驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自低拷贝质粒或本文所述的高拷贝质粒或生物安全系统质粒。在一些实施方式中，PssB启动子间接驱动一种或多种目的蛋白质的表达来自整合到细菌染色体中的构建体。本文描述了示例性插入位点。
在另一个非限制性实例中，该策略可用于控制thyA和/或dapA的表达，例如，以制备条件性营养缺陷型。敲除了dapA或ThyA的染色体拷贝。在厌氧条件下，dapA或thyA-可能表达，并且菌株可以在没有dap或胸苷的情况下生长。在有氧条件下，关闭dapA或thyA表达，并且在没有dap或胸苷的情况下菌株不能生长。例如，这种策略可以用于允许细菌在厌氧条件下存活，例如肿瘤微环境的肠道或条件，但是防止在有氧条件下存活(生物安全开关)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种与SEQ ID NO:597的任何序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的基因序列。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列包含SEQ ID NO:597。在另一个实施方式中，一种或多种基因序列由SEQ ID NO:597组成。
组成型启动子
在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于质粒上并可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方式中，编码有效负载的基因存在于染色体上并且与组成型启动子可操作地连接。
在一些实施方式中，组成型启动子在体内条件下是有活性的，例如肿瘤微环境的肠和/或条件，如本文所述。在一些实施方式中，启动子在体外条件下是有活性的，例如，如本文所述的各种细胞培养和/或细胞制造条件。在一些实施方式中，组成型启动子在体内条件下是活性的，例如，如本文所述的肿瘤微环境的肠和/或条件，以及在体外条件下，例如各种细胞培养和/或细胞产生和/或制造条件，如本文所述。
在一些实施方式中，与编码有效负载的基因可操作地连接的组成型启动子在各种外源环境条件下(例如，体内和/或体外和/或生产/制造条件)具有活性。
在一些实施方式中，组成型启动子在对哺乳动物肠道特异的外源环境条件和/或肿瘤微环境条件下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子在哺乳动物小肠特异性的外源环境条件下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子在低氧或厌氧条件下有活性，例如哺乳动物肠道的环境和/或肿瘤微环境的条件。在一些实施方式中，组成型启动子在哺乳动物肠道特异性的分子或代谢物和/或肿瘤微环境条件存在下具有活性。在一些实施方式中，组成型启动子由与细菌细胞共同施用的分子直接或间接诱导。在一些实施方式中，组成型启动子在体外培养，细胞生产和/或制造条件期间存在的分子或代谢物或其他条件下是有活性的。
细菌组成型启动子是本领域已知的。在一些实施方式中，启动子是组成型大肠杆菌σ70启动子或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:598-690的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与选自SEQ ID NO:598-690的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在另一个实施方式中，启动子序列包含选自SEQ ID NO:598-690的序列。在另一个实施方式中，启动子序列“序列”由选自SEQ ID NO:598-690的序列组成。
在一些实施方式中，启动子是组成大肠杆菌σS启动或它们的衍生物。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:691和692的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:691和692中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是组成型大肠杆菌σ32启动子或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:693-695的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:693-695中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是组成型枯草芽孢杆菌σA启动子或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:696-701的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:696-701中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是组成枯草芽孢杆菌σB启动子或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQID NO:702-704的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:702-704中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是来自沙门氏菌或其衍生物的组成型启动子。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:705和706的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ IDNO:705和706中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是来自噬菌体T7或其衍生物的组成型启动子。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:707和722的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:707和722中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
在一些实施方式中，启动子是来自噬菌体SP6或其衍生物的组成型启动子。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:723的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:723中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是来自酵母或其衍生物的组成型启动子。在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:724-737的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:724-737中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
在一些实施方式中，启动子是选自CMV和Ubc或其衍生物的组成型启动子。在一些实施方式中，在一些实施方式中，启动子包含选自SEQ ID NO:738和739的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:738和739中任一个的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
表11。启动子
Figure BDA0002194618080003971
在一些实施方式中，启动子是Plpp或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:740的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:740的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PapFAB46或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:741的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:741的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PJ23101+UP元件或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:742的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:742的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PJ23107+UP元件或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:743的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:743的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在一些实施方式中，启动子是PSYN23119或其衍生物。在一些实施方式中，启动子包含SEQ ID NO:744的序列。在一些实施方式中，组成型启动子与SEQ ID NO:744的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。
核糖体结合位点
在一些实施方式中，添加，切换或替换核糖体结合位点。通过测试一些核糖体结合位点，可以将表达水平微调至所需水平。在一些实施方式中，选择适合于原核表达并可用于实现所需表达水平的RBS。RBS的非限制性实例列于标准生物学部分的登记处。在一些实施方式中，RBS选自BBa_J61100(SEQ ID NO:1019)，BBa_J61101(SEQ ID NO:1020)，BBa_J61102(SEQ ID NO:1021)，BBa_J61103(SEQ ID NO:1022)，BBa_J61104(SEQIDNO)。：1023)，BBa_J61105(SEQ ID NO:1024)，BBa_J61106(SEQ ID NO:1025)，BBa_J61107(SEQ ID NO:1026)，BBa_J61108(SEQ ID NO:1027)，BBa_J61109(SEQ ID NO:1028)，BBa_J61110(SEQ IDNO:1029)，BBa_J61111(SEQ ID NO:1030)，BBa_J61112(SEQ ID NO:1031)，BBa_J61113(SEQID NO:1032)，BBa_J61114(SEQ ID NO:1033)，BBa_J61115(SEQ ID NO:1034)，BBa_J61116(SEQ ID NO:1035)，BBa_J61117(SEQ ID NO:1036)，BBa_J61118(SEQ ID NO:1037)，BBa_J61119(SEQ ID NO:1038)，BBa_J61120(SEQ ID NO:1039)，BBa_J61121(SEQ ID NO:1040)，BBa_J61122(SEQ ID NO:1041)，BBa_J61123(SEQ ID NO:1042)，BBa_J61124(SEQ ID NO:1043)，BBa_J61125(SEQ ID NO:1044)，BBa_J61126(SEQ ID NO:1045)。)，BBa_J61127(SEQID NO:1046)，BBa_J61128(SEQ ID NO:1047)，BBa_J61129(SEQ ID NO:1048)，BBa_J61130(SEQ ID NO:1049)，BBa_J61131(SEQ ID NO:1)。050)，BBa_J61132(SEQ ID NO:873)，BBa_J61133(SEQ ID NO:869)，BBa_J61134(SEQ ID NO:870)，BBa_J61135(SEQ ID NO:871)，BBa_J61136(SEQ ID NO:874)，BBa_J61137(SEQ ID NO:875)，BBa_J61138(SEQ ID NO:876)，BBa_J61139(SEQ ID NO:877)，BBa_B0029(SEQ ID NO:880)，BBa_B0030(SEQ ID NO:881)，BBa_B0031(SEQ ID NO:882)。)，BBa_B0032(SEQ ID NO:883)，BBa_B0033(SEQ ID NO:884)，BBa_B0034(SEQ ID NO:885)，BBa_B0035(SEQ ID NO:886)，BBa_B0064(SEQ ID NO:887)或其衍生物。
在一些实施方式中，组成型启动子与选自SEQ ID NO:1018-1050和869-871，873-877，880-887的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在另一个实施方式中，启动子序列“序列”包括选自SEQ ID NO:1018-1050和869-871，873-877，880-887的序列。在另一个实施方式中，启动子序列“序列”由选自SEQ ID NO:1018-1050和869-871,873-877,880-887的序列组成。
应变文化中有效载荷的诱导
在一些实施方式中，期望在施用之前预先诱导目的有效负载或蛋白质表达和/或有效负载活性。这种目的有效负载或蛋白质可以是用于分泌的效应物，或者可以是催化代谢反应以产生效应物的酶。在其他实施方式中，目的蛋白质是使有害代谢物分解代谢的酶。在这种情况下，菌株预装有活性有效负载或目标蛋白质。在这种情况下，本发明的基因工程化细菌在细胞培养期间在细胞培养期间提供的条件下表达一种或多种目的蛋白质，在体内给药之前进行扩增，纯化，发酵和/或制造。此类培养条件可以在烧瓶，发酵罐或其他合适的培养容器中提供，例如，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间使用。如本文所用，术语“细菌培养物”或细菌细胞培养物“或”培养物“是指细菌细胞或微生物，其在几个生产过程中维持或体外生长，包括细胞生长，细胞扩增，回收，纯化，发酵。和/或制造。如本文所用，术语“发酵”是指在限定条件下细菌的生长，扩增和维持。在诱导剂，营养物，限定温度等存在下，发酵可在许多细胞培养条件下发生，包括厌氧或低氧或氧化条件。
选择培养条件以实现细胞的最佳活性和活力，同时保持高细胞密度(高生物量)产量。监测和调整许多细胞培养条件和操作参数以实现最佳活性，高产量和高活力，包括氧水平(例如，低氧，微氧，需氧)，培养基温度和营养素和/或不同生长。培养基中提供的培养基，化学和/或营养诱导剂和其他组分。
在一些实施方式中，直接或间接诱导一种或多种目的蛋白质，同时使菌株生长用于体内施用。不希望受理论束缚，预诱导可以增强体内活性。这在肠道的近端区域尤其重要，其首先由细菌例如小肠到达。如果该隔室中的细菌停留时间相对较短，则细菌可以通过小肠而不会达到完全的体内诱导能力。相反，如果菌株被预先诱导和预加载，菌株已经完全活跃，当细菌到达肠道时允许更快的活动。因此，没有传输时间被“浪费”，其中应变不是最佳活动的。随着细菌继续通过肠道，体内诱导发生在肠道的环境条件下(例如，低氧，或存在肠道代谢物)。
在一个实施方式中，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间诱导一种或多种有效负载的表达。在一个实施方式中，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/或制造过程中诱导几种不同目的蛋白的表达。在一个实施例中，一个或多个有效载荷的表达由与多顺反馈消息相同的启动子驱动。在一个实施例中，一个或多个有效载荷的表达由与两个或更多个单独消息相同的启动子驱动。在一个实施例中，一个或多个有效载荷的表达由一个或多个不同的启动子驱动。
在一些实施方式中，在体内施用之前的菌株生长期间，在没有任何预诱导方案的情况下施用菌株。
厌氧诱导
在一些实施方式中，细胞在培养的厌氧或低氧条件下诱导。在这种情况下，细胞生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。和指数生长，然后切换到厌氧或低氧条件约3至5小时。在一些实施方式中，在厌氧或低氧条件下诱导菌株，例如以诱导FNR启动子活性并在一种或多种FNR启动子的控制下驱动一种或多种有效载荷和/或转运蛋白的表达。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/或制造过程中诱导。厌氧或低氧条件。在一个实施方式中，几种不同目的蛋白质的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或在厌氧或低温下制造期间被诱导。氧气条件。
在一个实施方式中，两种或更多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在厌氧或低氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在厌氧或低氧条件下由与两种或更多种单独消息相同的启动子驱动。在一个实施方式中，表达一种或多种有效负载(在一种或多种FNR启动子的控制下)并且在厌氧或低氧条件下从一种或多种不同的启动子驱动。
不希望受理论的束缚，认为包含FNR启动子的控制下的一个或多个有效载荷(一个或多个)的菌株，可以允许从体外这些启动子有效载荷(一个或多个)的表达，厌氧或低氧培养条件下，和在在体内，在肠道中发现的低氧条件和/或肿瘤微环境的条件下。
在一些实施方式中，可以在化学和/或营养诱导剂的存在下在厌氧或低氧条件下诱导由阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂诱导的启动子。特别地，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受FNR启动子控制，而其他基因序列受化学和/或营养诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，菌株可以包含在一种或多种FNR启动子和一种或多种有效载荷基因序列和/或转运蛋白基因序列和/或一种或多种有效载荷基因序列的控制下的一种或多种有效负载基因序列。在一种或多种启动子控制下的转录调节基因序列，所述启动子由一种或多种化学和/或营养诱导剂诱导，包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，本文所述或本领域已知的四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂。在一些实施方式中，菌株可包含一个或多个有效负载基因序列和/或在一个或多个FNR启动子的控制下，和一个或多个有效负载基因序列在一个或多个的控制下。本文描述的组成型启动子。在一些实施方式中，菌株可包含在FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在本文所述的一种或多种温控启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列。
在一个实施方式中，一种或多种有效负荷的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，制剂和/中诱导。或在厌氧和/或低氧条件下制造。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是阿拉伯糖，并且启动子可被阿拉伯糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是IPTG，并且启动子可通过IPTG诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是鼠李糖，并且启动子可由鼠李糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是四环素，并且启动子可通过四环素诱导。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在厌氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。和/或低氧条件。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在厌氧和厌氧下由两种或更多种单独的信息从相同的启动子驱动。/或低氧条件。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在厌氧和/或低浓度下由一种或多种不同的启动子驱动。氧气条件。
在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受第一诱导型启动子控制，而其他基因序列受第二诱导型启动子控制，均由化学和/或营养诱导剂诱导，厌氧或低氧条件。在一个实施方式中，菌株可包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，均由化学和/或营养诱导剂诱导。在一些实施方式中，菌株包含在第三诱导型启动子控制下的基因序列，例如厌氧/低氧启动子，例如FNR启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子或低氧启动子，以及在第二诱导型启动子控制下的其他启动子。，例如温度敏感的启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如FNR启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一些实施方式中，菌株可包含在FNR启动子和一种或多种有效载荷基因序列控制下的一种或多种有效载荷基因序列和/或转运蛋白基因序列和/或转录调节基因序列(s)和/或转运蛋白基因序列和/或转录调节基因序列在一种或多种启动子的控制下，所述启动子由一种或多种化学和/或营养诱导剂诱导。包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述或本领域已知的其他化学和/或营养诱导剂。另外，菌株可包含处于体温调节控制下的构建体。在一些实施方式中，细菌菌株还包含在一种或多种在低氧条件下有活性的组成型启动子控制下的有效负载和/或转运蛋白序列。
有氧诱导
在一些实施方式中，期望在需氧条件下制备，预加载和预诱导菌株。这允许更有效的生长和活力，并且在一些情况下，减少毒性代谢物的积累。在这种情况下，细胞生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。然后通过添加诱导物或通过其他方式诱导指数生长，例如转移到许可温度，持续约3至5小时。
在一些实施方式中，在本文所述或本领域已知的阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导物可诱导的启动子可在化学和/或营养诱导物存在下在需氧条件下诱导。细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制期间被诱导。和/或在有氧条件下制造。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在有氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。条件。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在有氧条件下由与两种或更多种单独消息相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在有氧条件下从一种或多种不同的启动子驱动。
在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是阿拉伯糖，并且启动子可被阿拉伯糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是IPTG，并且启动子可通过IPTG诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是鼠李糖，并且启动子可由鼠李糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是四环素，并且启动子可通过四环素诱导。
在一些实施方式中，在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间诱导由温度调节的启动子。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造过程中诱导。有氧条件。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动，并在有氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动，并在有氧条件下由与两种或多种单独信息相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达由一种或多种温控启动子直接或间接驱动，并在有氧条件下从一种或多种不同启动子驱动。
在一个实施方式中，菌株可包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，两者均在需氧条件下诱导。在一些实施方式中，菌株包含在有氧培养条件下诱导的三种或更多种不同的启动子。
在一个实施方式中，菌株可包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，均由化学和/或营养诱导剂诱导。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导型启动子，以及在第二诱导型启动子控制下的其他基因序列，例如温度敏感的。有氧培养条件下的启动子。在一些实施方式中，将两种或更多种化学诱导的启动子基因序列与本文所述的温控构建体组合。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是阿拉伯糖，并且启动子可被阿拉伯糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是IPTG，并且启动子可通过IPTG诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是鼠李糖，并且启动子可由鼠李糖诱导。在一个实施方式中，化学和/或营养诱导剂是四环素，并且启动子可通过四环素诱导。
在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如FNR启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一些实施方式中，菌株可以包含在FNR启动子和一种或多种有效载荷基因序列控制下的一种或多种有效载荷基因序列和/或转运蛋白基因序列和/或转录调节基因序列(s)和/或在一种或多种启动子控制下的转运蛋白基因序列和/或转录调节基因序列，所述启动子由一种或多种化学和/或营养诱导剂诱导。包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述或本领域已知的其他化学和/或营养诱导剂。另外，菌株可包含处于体温调节控制下的构建体。在一些实施方式中，细菌菌株还包含在有氧条件下有活性的一种或多种组成型启动子控制下的有效负载和/或转运蛋白序列。
在一些实施方式中，基因工程化菌株包含在需氧培养条件下诱导的基因序列。在一些实施方式中，这些菌株还包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。在一些实施方式中，这些菌株不进一步包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化菌株包含基因序列，其在需氧培养条件下是可诱导的阿拉伯糖。在一些实施方式中，这些菌株不进一步包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化菌株包含基因序列，其在有氧培养条件下是IPTG可诱导的。在一些实施方式中，这些菌株还包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。在一些实施方式中，这些菌株不进一步包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。
在一些实施方式中，包含在有氧培养条件下可诱导阿拉伯糖的基因序列。在一些实施方式中，此类菌株还包含在有氧培养条件下可被IPTG诱导的序列。在一些实施方式中，这些菌株还包含FNR诱导型基因有效负载和/或转运蛋白序列，用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中进行体内活化。在一些实施方式中，这些菌株不进一步包含用于在肿瘤微环境的肠和/或条件中体内活化的FNR诱导型基因序列。
从上述非限制性实施例中显而易见的是，遗传工程菌株包含可诱导的多种组合的诱导型基因序列。例如，除了阿拉伯糖和/或IPTG之外或者用温度调节，鼠李糖或四环素可以用作具有合适启动子的诱导物。另外，这些细菌菌株也可以在厌氧条件下用化学和/或营养诱导剂诱导。
微需氧诱导
在一些实施方式中，通过在微需氧条件下预诱导细菌菌株来优化生存力，生长和活性。在一些实施方式中，微需氧条件最适合于在最佳生长，活性和活力条件与诱导的最佳条件之间“达到平衡”；特别地，如果一种或多种有效载荷和/或转运蛋白的表达由厌氧和/或低氧启动子(例如FNR启动子)驱动。在这种情况下，细胞生长(例如，持续1.5至3小时)直至它们达到一定的OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1×108到1×1011。然后通过添加诱导物或通过其他方式诱导指数生长，例如在允许温度下转移约3至5小时。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间在微需氧条件下被诱导。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在微需氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且在微氧条件下由与两种或更多种单独消息相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并在微需氧条件下由一种或多种不同的启动子驱动。
不希望受理论束缚，在FNR启动子控制下包含一种或多种有效负载的菌株可允许在体外，微氧培养条件下和体内，在体外，从这些启动子表达有效负载。在肠道中发现的低氧条件和/或肿瘤微环境的条件。
在一些实施方式中，可以在化学和/或营养诱导物存在下在微需氧条件下诱导由阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂诱导的启动子。特别地，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受FNR启动子控制，而其他基因序列受化学和/或营养诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，菌株可以包含在一种或多种FNR启动子和一种或多种有效载荷基因序列控制下的一种或多种有效负载基因序列(一种或多种)在一种或多种的控制下。由一种或多种化学和/或营养诱导剂诱导的启动子，包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述的其他化学和/或营养诱导物或本领域已知的。在一些实施方式中，菌株可以包含在一种或多种FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列，和在一种或多种组成型启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列(s)在此描述。在一些实施方式中，菌株可包含在FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在本文所述的一种或多种温控启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制期间被诱导。，和/或在微氧条件下制造。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在微需氧条件下以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动。条件。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且在微氧条件下由与两种或更多种单独消息相同的启动子驱动。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在微需氧条件下从一种或多种不同的启动子驱动。
在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受第一诱导型启动子控制，而另一些基因序列受第二诱导型启动子控制，均由化学和/或营养诱导剂诱导，微氧条件。在一个实施方式中，菌株可包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，均由化学和/或营养诱导剂诱导。在一些实施方式中，菌株包含在第三诱导型启动子控制下的基因序列，例如厌氧/低氧启动子或微氧启动子，例如FNR启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子或低氧或微氧启动子和其他在第二诱导型启动子控制下的启动子。诱导型启动子，例如温度敏感启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如FNR启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一些实施方式中，菌株可以包含在FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在由一种或多种启动子控制的一种或多种有效负载基因序列。一种或多种化学和/或营养诱导剂，包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述或本领域已知的其他化学和/或营养诱导剂。另外，菌株可包含处于体温调节控制下的构建体。在一些实施方式中，细菌菌株还包含在一种或多种在低氧条件下有活性的组成型启动子控制下的有效负载。
使用定相，脉冲和/或循环诱导菌株
在一些实施方式中，在细胞生长，扩增，回收，纯化，发酵和/或制造期间采用循环，定相或脉冲技术以在体内施用之前有效诱导和生长菌株。该方法用于在最佳生长，活动，细胞健康和活力条件与诱导的最佳条件之间“达到平衡”；特别是，如果在诱导条件下生长，细胞健康或生存能力受到负面影响。在这种情况下，细胞在第一阶段或循环中生长(例如，持续1.5至3小时)，直到它们达到某一OD，例如，OD在0.1至10的范围内，表明一定的密度，例如，范围从1X10。^8到1X10^11，然后通过添加诱导剂或通过其他方式诱导，例如转移到允许温度(如果启动子被温度调节)，或改变氧水平(例如，降低氧水平)在诱导FNR启动子驱动的构建体的情况下约3至5小时。在第二阶段或循环中，条件恢复到支持最佳生长，细胞健康和活力的原始条件。或者，如果使用化学和/或营养诱导剂，则可以在第二阶段或循环中向培养物中加入第二剂量的诱导物。
在一些实施方式中，采用两个循环的最佳条件和诱导条件(即，生长，诱导，恢复和生长，诱导)。在一些实施方式中，采用三个循环的最佳条件和诱导条件。在一些实施方式中，采用四个或更多个最佳条件循环和诱导条件。在非限制性实例中，这种循环和/或定相用于在厌氧和/或低氧条件下诱导(例如，诱导FNR启动子)。在一个实施方式中，细胞生长至最佳密度，然后在厌氧和/或低氧条件下诱导。在由于应激诱导条件而对生长和/或生存力产生负面影响之前，细胞返回到氧化条件以恢复，之后它们再次返回以诱导厌氧和/或低氧条件第二次。在一些实施方式中，根据需要重复这些循环。
在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入一次。在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入两次。在一些实施方式中，用化学和/或营养诱导剂将生长的培养物掺入三次或更多次。在一个非限制性实例中，细胞首先在最佳生长条件下生长至一定密度，例如1.5至3小时)，达到0.1至10，直至细胞密度为1×10^8至1X10^11。然后将化学诱导剂，例如阿拉伯糖或IPTG加入培养物中。3至5小时后，加入另外剂量的诱导物以重新开始诱导。可根据需要重复尖峰。
在一些实施方式中，定相或循环培养物中温度的变化。在另一个实施例中，温度的调节可用于改善有效载荷的活动。例如，降低培养期间的温度可以改善有效负载的正确折叠。在这种情况下，细胞首先在最适于生长的温度下生长(例如，37℃)。在一些实施方式中，然后例如通过化学诱导剂诱导细胞以表达有效负载。同时或在设定量的诱导时间之后，将介质中的温度降低，例如在25和35℃之间，以允许改善所表达的有效载荷的折叠。
在一些实施方式中，有效负载受不同诱导型启动子的控制，例如两种不同的化学诱导剂。在其他实施方式中，有效负载在低氧条件或微氧条件下诱导，第二有效负载由化学诱导剂诱导。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受一种或多种FNR启动子的控制，并且在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制和/或制造期间通过使用诱导。定相或循环或脉冲或尖峰技术。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并通过使用定相或循环或脉冲以多顺反馈信息的形式从相同的启动子驱动。或尖峰技术。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并且通过使用定相或循环或脉冲或由两种或更多种单独的消息从相同的启动子驱动。尖峰技术。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达在一种或多种FNR启动子的控制下，并通过使用定相或循环或脉冲或掺加技术从一种或多种不同的启动子驱动。
在一些实施方式中，可以通过在化学品和/或营养物存在下使用定相或循环或脉冲或掺加技术诱导由阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或其他化学和/或营养诱导剂诱导的启动子。诱导剂。特别地，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列受FNR启动子控制，而其他基因序列受化学和/或营养诱导剂诱导的启动子控制。在一些实施方式中，菌株可以包含在一种或多种FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在一种或多种启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列。其由一种或多种化学和/或营养诱导剂诱导，包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述或本领域已知的其他化学和/或营养诱导剂。在一些实施方式中，菌株可包含在一种或多种FNR启动子和一种或多种有效载荷基因序列和/或转运蛋白基因序列的控制下的一种或多种有效负载基因序列和/或本文所述的一种或多种组成型启动子控制下的转录调节基因序列或通过采用定相或循环或脉冲或掺加技术诱导的转录调节基因序列。在一些实施方式中，菌株可包含在FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在本文所述的一种或多种温控启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列，和通过使用定相或循环或脉冲或尖峰技术诱导。
本文描述的任何菌株可以通过使用定相或循环或脉冲或掺加技术来生长。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并在细胞生长，细胞扩增，发酵，回收，纯化，配制期间被诱导。，和/或在厌氧和/或低氧条件下制造。
在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且以多顺反子信息的形式从相同的启动子驱动，并且通过使用定相或循环或脉冲或尖峰技术诱导。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且作为两种或更多种单独的信息从相同的启动子驱动并生长。通过使用定相或循环或脉冲或尖峰技术。在一个实施方式中，一种或多种有效负载的表达受化学和/或营养诱导物调节的一种或多种启动子的控制，并且由一种或多种不同的启动子驱动，所有这些启动子都被诱导。通过使用定相或循环或脉冲或尖峰技术。
在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，均由化学和/或营养诱导剂诱导，通过采用定相或循环或脉冲或尖峰技术。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，而另一些基因序列在第二诱导型启动子的控制下，两者均由化学和/或营养诱导剂通过采用定相或循环或脉冲或尖峰技术。在一些实施方式中，菌株包含在第三诱导型启动子控制下的基因序列，例如厌氧/低氧启动子，例如FNR启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子或低氧启动子，以及在第二诱导型启动子控制下的其他启动子。，例如温度敏感的启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如FNR启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一个实施方式中，菌株可以包含基因序列的组合，其中一些基因序列在第一诱导型启动子的控制下，例如化学诱导的启动子和在第二诱导型启动子控制下的其他启动子，例如温度敏感启动子。在一些实施方式中，菌株可以包含在FNR启动子控制下的一种或多种有效负载基因序列和在由一种或多种启动子控制的一种或多种有效负载基因序列。一种或多种化学和/或营养诱导剂，包括但不限于阿拉伯糖，IPTG，鼠李糖，四环素和/或本文所述或本领域已知的其他化学和/或营养诱导剂。另外，菌株可包含处于体温调节控制下的构建体。在一些实施方式中，细菌菌株还包含在一种或多种在低氧条件下有活性的组成型启动子控制下的有效负载序列。可以通过采用定相或循环或脉冲或尖峰技术来诱导这些实施方式中描述的任何菌株。
产生具有增强的运输生物分子能力的细菌菌株
由于它们易于培养，生成时间短，种群密度非常高且基因组小，因此可以在缩短的时间尺度内将微生物进化为独特的表型。适应性实验室进化(ALE)是在选择压力下传代微生物以进化具有优选表型的菌株的过程。最常见的是，这适用于提高碳/能源的利用率或使应变适应环境压力(例如，温度，pH)，从而更能够在碳基质上或在压力下生长的突变菌株将胜过不太适应的菌株。人口并最终将主导人口。
通过产生营养缺陷型，该相同的过程可以扩展到任何必需的代谢物。营养缺陷型是不能合成必需代谢物的菌株，因此必须使培养基中提供的代谢物生长。在这种情况下，通过制备营养缺陷型并将其传递给减少量的代谢物，所得的显性菌株应该更能够获得并掺入该必需代谢物。
例如，如果破坏用于产生氨基酸的生物合成途径，则可以通过ALE进化能够高亲和力捕获所述氨基酸的菌株。首先，菌株在不同浓度的营养缺陷型氨基酸中生长，直至建立支持生长的最小浓度。然后将菌株以该浓度传代，并以规则的间隔稀释成降低浓度的氨基酸。随着时间的推移，对于氨基酸最具竞争力的细胞-在生长限制浓度-将成为人口的主导。这些菌株可能在其氨基酸转运蛋白中具有突变，导致导入必需和限制性氨基酸的能力增加。
类似地，通过使用不能使用上游代谢物形成氨基酸的营养缺陷型，可以产生菌株，其不仅可以更有效地输入上游代谢物，而且还将代谢物转化为必需的下游代谢物。这些菌株还会进化突变以增加上游代谢物的进口，但也可能含有增加下游酶的表达或反应动力学或降低竞争性底物利用途径的突变。
在前面的实施例中，通过突变营养缺陷使得先天对微生物的代谢物成为必需的，并且选择应用内源代谢物的生长限制性补充。然而，能够消耗非天然化合物的表型可以通过将它们的消耗与必需化合物的生产联系起来来进化。例如，如果分离来自不同生物的基因，其可以产生必需化合物或必需化合物的前体，则该基因可以重组导入并在异源宿主中表达。这种新的宿主菌株现在能够从以前不可代谢的底物合成必需营养素。因此，可以通过产生不能转化直接下游代谢物并选择生长限制量的非天然化合物同时表达重组酶的营养缺陷型来应用类似的ALE过程。这将导致非天然底物的转运，异源酶的表达和活性以及下游天然酶的表达和活性的突变。应该强调的是，该过程的关键要求是能够将非天然代谢物的消耗限制为生长所必需的代谢物的产生。
一旦建立了选择机制的基础并且已经建立了最低水平的补充，就可以进行实际的ALE实验。在整个过程中，必须严格监控几个参数。重要的是培养物保持在指数生长期并且不允许达到饱和/稳定期。这意味着必须在每次传代期间检查生长速率，并相应地调整随后的稀释度。如果生长速率提高到稀释度变大的程度，那么营养缺乏补充剂的浓度应该降低，使得生长速度减慢，选择压力增加，并且稀释不会严重到在传代期间严重偏向亚群。此外，应定期将细胞稀释，在固体培养基上生长，并测试单个克隆以确认在ALE培养物中观察到的生长速率表型。
预测何时停止ALE实验也需要警惕。由于指导进化的成功与整个实验中“筛选”的突变数量直接相关，并且突变通常是DNA复制过程中错误的函数，因此累积细胞分裂(CCD)可作为已筛选的总突变体的代理。以前的研究表明，在不同的碳源上生长的有益表型可以在大约1011.2CCD1中分离出来。通过向培养物中添加化学诱变剂可以加速这一速率-例如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)-这会导致DNA复制错误增加。然而，当持续传代导致生长速率的边际或没有改善时，群体已经收敛到某个适应度最大值，并且可以停止ALE实验。
在ALE实验结束时，应稀释细胞，在固体培养基上分离并测定与培养瓶匹配的生长表型。然后将来自所选择的那些的最佳表现者准备用于基因组DNA并送去进行全基因组测序。在基因组周围发生的揭示突变的测序能够提供改善的表型，但也将包含沉默突变(那些不提供益处但不损害所需表型的突变)。在存在NTG或其他化学诱变剂的培养物中，将会有明显更多的沉默，背景突变。如果对其当前状态下的最佳性能应变感到满意，则用户可以继续应用该应变。否则，通过基因组工程技术将突变重新引入亲本菌株，可以使进化的突变从进化的菌株中解卷积。见Lee，D.-H.，Feist，AM，Barrett，CL&Palsson，B.
Figure BDA0002194618080004151
细胞分裂的累积数量是大肠杆菌适应性实验室进化的有意义的时间尺度。PLoSONE6，e26172(2011)。
如本文其他地方所述，这些方法用于产生消耗犬尿氨酸和过量产生色氨酸的大肠杆菌Nissle突变体。
核酸
在一些实施方式中，本公开提供了用于消耗腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种消耗腺苷的酶的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码Add的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码XapA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码DeoD的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码XdhA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码XdhB的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码XdhC的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码NupC的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码NupG的基因序列。
在一些实施方式中，核酸包含选自xapA，deoD，xdhA，xdhB，xdhC，nupC及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自xapA，deoD，xdhA，xdhB，xdhC，nupG及其任何组合的基因序列。
在一些实施方式中，包含选自xapA，deoD，xdhA，xdhB，xdhC，nupC及其任何组合的基因序列的核酸序列还包含编码抗CD40抗体的核酸序列。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含nupC。因此，在一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列与SEQ ID NO:71具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列与SEQ ID NO:71具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列与SEQ ID NO:71具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列与SEQ ID NO:71具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列包含SEQ ID NO:71。在另一个实施方式中，包含nupC基因的核酸序列由SEQ ID NO:71组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含xdhA。因此，在一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列与SEQ ID NO:72具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列与SEQ ID NO:72具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列与SEQ ID NO:72具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列与SEQ ID NO:72具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列包含SEQ ID NO:72。在另一个实施方式中，包含xdhA基因的核酸序列由SEQ ID NO:72组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含xdhB。因此，在一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列与SEQ ID NO:73具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列与SEQ ID NO:73具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列与SEQ ID NO:73具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列与SEQ ID NO:73具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列包含SEQ ID NO:73。在另一个实施方式中，包含xdhB基因的核酸序列由SEQ ID NO:73组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含xdhC。因此，在一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列与SEQ ID NO:74具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列与SEQ ID NO:74具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列与SEQ ID NO:74具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列与SEQ ID NO:74具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列包含SEQ ID NO:74。在另一个实施方式中，包含xdhC基因的核酸序列由SEQ ID NO:74组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含Add。因此，在一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列与SEQ ID NO:75具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列与SEQ ID NO:75具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列与SEQ ID NO:75具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列与SEQ ID NO:75具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列包含SEQ ID NO:75。在另一个实施方式中，包含Add基因的核酸序列由SEQ ID NO:75组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含xapA。因此，在一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列与SEQ ID NO:76具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列与SEQ ID NO:76具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列与SEQ ID NO:76具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列与SEQ ID NO:76具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列包含SEQ ID NO:76。在另一个实施方式中，包含xapA基因的核酸序列由SEQ ID NO:76组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于从肿瘤微环境中降解或消除腺苷的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶的核酸序列包含deoD。因此，在一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列与SEQ ID NO:77具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列与SEQ ID NO:77具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列与SEQ ID NO:77具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列与SEQ ID NO:77具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列包含SEQ ID NO:77。在另一个实施方式中，包含deoD基因的核酸序列由SEQ ID NO:77组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含NupC。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:78具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:78的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由SEQ ID NO:78组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含XdhA。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:79具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:79的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:79的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含XdhB。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ IDNO:80具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:80具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:80的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:80的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含XdhC。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:81具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:81的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:81的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包括Add。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:82具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:82的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ IDNO:82的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含XapA。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:83具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:83的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:83的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，腺苷分解代谢酶包含DeoD。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:84具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:84的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:84的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于分解代谢腺苷的新核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶盒的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶盒的核酸序列包含含有xdhABC的核酸序列。因此，在一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列与SEQ ID NO:857具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列与SEQ ID NO:857具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列与SEQ ID NO:857具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列与SEQ ID NO:857具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列包含SEQ ID NO:857的序列。在另一个实施方式中，包含xdhABC的核酸序列由SEQ ID NO:857的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于分解代谢腺苷的新核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种腺苷分解代谢酶盒的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码腺苷降解酶盒的核酸序列包含含有add-xapA-deoD的核酸序列。因此，在一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列与SEQ ID NO:861具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列与SEQ ID NO:861具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列与SEQ ID NO:861具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列与SEQ ID NO:861具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列包含SEQ ID NO:861的序列。在另一个实施方式中，包含add-xapA-deoD的核酸序列由SEQ ID NO:861的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生精氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种精氨酸产生回路的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argB的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argC的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argD的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argE的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argF的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argG的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argH的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码arg1的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argJ的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码carA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码carB的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码argA(fbr)的基因序列。
在一些实施方式中，核酸包含编码精氨酸生物合成基因的基因序列，所述基因序列选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB以及反馈抗性argA及其任何组合。在一些实施方式中，核酸序列包含编码精氨酸生物合成基因的基因序列，所述基因序列选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB以及反馈抗性argA及其任何组合。包含编码抗-CD47抗体的核酸序列。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生精氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种精氨酸产生多肽的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码精氨酸产生酶的核酸序列包含argA(fbr)(反馈抗性argA)。因此，在一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:102具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:102具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:102具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:102具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列包含SEQ ID NO:102。在另一个实施方式中，包含argA(fbr)基因的核酸序列由SEQ ID NO:102组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，精氨酸产生酶包含argA(fbr)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:103具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:103具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:103具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:103具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:103的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:103的序列组成。
在一些实施方式中，本公开内容提供了产生色氨酸的新核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码TrpE的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码TrpD的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码TrpC的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码TrpB的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码TrpA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroG的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroF的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroH的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroB的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroD的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroE的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroK的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码AroA的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码aroG(fbr)的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码trpE(fbr)的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码serA(fbr)的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码YddG的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含编码犬尿氨酸酶的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB和TrpA及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA，AroG，AroF，AroH及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA，AroG，AroF，AroH和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA，AroG，AroF，AroH，AroB，AroD，AroE，AroK和aroA及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自TrpE，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA，AroG，AroF，AroH，AroB，AroD，AroE，AroK和aroA和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，SerA(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，SerA(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，SerA(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpA，YddG及其任何组合的基因序列。在一些实施方式中，核酸包含选自AroG(fbr)，SerA(fbr)，TrpE(fbr)，TrpD，TrpC，TrpB，TrpAYddG和犬尿氨酸酶及其任何组合的基因序列。
在一些实施方式中，包含编码犬尿氨酸酶的基因序列的核酸还包含含有编码IL-15的基因序列的核酸序列。
在一些实施方式中，本公开提供了用于分泌IL-15的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码IL-15用于分泌的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码用于分泌的IL-15的核酸序列包含PhoA-11-15。因此，在一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列与SEQ ID NO:957具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列与SEQ ID NO:957具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列与SEQ ID NO:957具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列与SEQ ID NO:957具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列包含SEQ ID NO:957。在另一个实施方式中，包含IL-15基因的核酸序列由SEQ ID NO:957组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，核酸编码IL-15(OmpF分泌标签)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:935具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:935具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:935具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:935具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:935的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:935的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，核酸编码IL-15(PhoA分泌标签)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:936具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:936具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:936具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:936具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:936的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:936的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，核酸编码IL-15(TorA分泌标签)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:937具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:937具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:937具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:937具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:937的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:937的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于耗尽犬尿氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸消耗酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码犬尿氨酸分解代谢酶的核酸序列包含kynU(假单胞菌属)。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:68具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列包含SEQ ID NO:68。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列由SEQ ID NO:68组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于耗尽犬尿氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸消耗酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码犬尿氨酸分解代谢酶的核酸序列包含kynU(人)。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:69具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:69具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:69具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:69具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列包含SEQ ID NO:69。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列由SEQ ID NO:69组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于耗尽犬尿氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种犬尿氨酸消耗酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码犬尿氨酸分解代谢酶的核酸序列包含kynU(Shewanella)。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:70具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:70具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ IDNO:70具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列与SEQ ID NO:70具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列包含SEQ ID NO:70。在另一个实施方式中，包含kynU基因的核酸序列由SEQ ID NO:70组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码犬尿氨酸分解代谢酶的核酸序列包含trpE。因此，在一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列与SEQ ID NO:50具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列与SEQ ID NO:50具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列与SEQ ID NO:50具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列与SEQ ID NO:50具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列包含SEQ ID NO:50。在另一个实施方式中，包含trpE基因的核酸序列由SEQ ID NO:50组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含trpD。因此，在一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列与SEQ ID NO:51具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列与SEQ ID NO:51具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列与SEQ ID NO:51具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列与SEQ ID NO:51具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列包含SEQ ID NO:51。在另一个实施方式中，包含trpD基因的核酸序列由SEQID NO:51组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含trpC。因此，在一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列与SEQ ID NO:52具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列与SEQ ID NO:52具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列与SEQ ID NO:52具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列与SEQ ID NO:52具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列包含SEQ ID NO:52。在另一个实施方式中，包含trpC基因的核酸序列由SEQID NO:52组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含trpB。因此，在一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列与SEQ ID NO:53具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列与SEQ ID NO:53具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列与SEQ ID NO:53具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％与SEQ ID NO:53具有96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列包含SEQ ID NO:53。在另一个实施方式中，包含trpB基因的核酸序列由SEQ ID NO:53组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含trpA。因此，在一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列与SEQ IDNO:54具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列与SEQ ID NO:54具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列与SEQ ID NO:54具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列与SEQ ID NO:54具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列包含SEQ ID NO:54。在另一个实施方式中，包含trpA基因的核酸序列由SEQID NO:54组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含aroG(fbr)。因此，在一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:862具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:862具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:862具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:862具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列包含SEQ ID NO:862。在另一个实施方式中，包含aroG(fbr)基因的核酸序列由SEQ ID NO:862组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含serA。因此，在一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列与SEQ ID NO:864具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列与SEQ ID NO:864具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列与SEQ ID NO:864具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列与SEQID NO:864具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列包含SEQ ID NO:864。在另一个实施方式中，包含serA基因的核酸序列由SEQ ID NO:864组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于产生色氨酸的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸产生酶的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码产生色氨酸的酶的核酸序列包含trpE(fbr)。因此，在一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:879具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:879具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:879具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列与SEQ ID NO:879具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列包含SEQ ID NO:879。在另一个实施方式中，包含trpE(fbr)基因的核酸序列由SEQ ID NO:879组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，犬尿氨酸降解酶包含犬尿氨酸酶(荧光假单胞菌)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:65具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:65的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:65的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，犬尿氨酸降解酶包含犬尿氨酸酶(人)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:66具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:66具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:66具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:66具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:66的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:66的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，犬尿氨酸降解酶包含犬尿氨酸酶(Shewanella)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:67具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:67具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:67具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:67具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:67的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:67的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含TrpE。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:55具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:55具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:55具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:55具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:55的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:55的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含trpD。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:56具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:56具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:56具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:56具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:56的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:56的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含TrpC。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:57具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:57具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:57具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:57具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:57的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:57的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含TrpB。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:58具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:58具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:58具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:58具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:58的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:58的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含TrpA。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:59具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:59具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:59具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:59具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:59的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:59的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含AroG(fbr)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:60具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:60具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:60具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:60具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:60的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:60的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含TrpE(fbr)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:61具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:61具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:61具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:61具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:61的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:61的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含SerA。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:62具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:62具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:62具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:62具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:62的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:62的序列组成。
在本文所述的核酸实施方式之一中，色氨酸生产酶包含SerA(fbr)。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:63具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:63具有至少约90％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:63具有至少约95％的同一性。因此，在一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其与SEQ ID NO:63具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％。％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其包含编码SEQ ID NO:63的序列。在另一个实施方式中，核酸序列编码多肽，其由编码SEQ ID NO:63的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于色氨酸生产的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码一种或多种色氨酸生产酶盒的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码色氨酸生产酶盒的核酸序列包含含有Fbr-aroG-serA的核酸序列。因此，在一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列与SEQ ID NO:863具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列与SEQ ID NO:863具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列与SEQ ID NO:863具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列与SEQ ID NO:863具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列包含SEQ IDNO:863的序列。在另一个实施方式中，包含Fbr-aroG-serA的核酸序列由SEQ ID NO:863的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于色氨酸生产的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码色氨酸生产酶盒的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码色氨酸生产酶盒的核酸序列包含含有TrpEDCBA的核酸序列。因此，在一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列与SEQ ID NO:872具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列与SEQ ID NO:872具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列与SEQ ID NO:872具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列与SEQ ID NO:872具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列包含SEQ ID NO:872的序列。在另一个实施方式中，包含TrpEDCBA的核酸序列由SEQ ID NO:872的序列组成。
在一些实施方式中，本公开提供了用于色氨酸生产的新型核酸。在一些实施方式中，核酸包含编码色氨酸生产酶盒的基因序列。在本文所述的核酸实施方式之一中，编码色氨酸生产酶盒的核酸序列包含含有fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列。因此，在一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列与SEQ ID NO:878具有至少约80％的同一性。在一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列与SEQ ID NO:878具有至少约90％的同一性。在一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列与SEQ ID NO:878具有至少约95％的同一性。在一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列与SEQ ID NO:878具有具有至少约85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在另一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列包含SEQID NO:878的序列。在另一个实施方式中，包含fbrS40FTrpE-DCBA的核酸序列由SEQ ID NO:878的序列组成。
在上述任何核酸实施方式中，用于产生抗癌分子组合的一种或多种核酸序列与一种或多种直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在外源环境条件下诱导，例如在肠道，肿瘤微环境或其他组织特异性条件中发现的条件。在一些实施方式中，所述一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子由在肠道，肿瘤微环境或其他特定条件中发现的代谢物诱导。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与在低氧或厌氧条件下诱导的直接或间接诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与在炎性条件下诱导的直接或间接诱导型启动子(例如，RNS，ROS)可操作地连接，如本文所述。在一些实施方式中，一种或多种核酸序列与直接或间接诱导型启动子可操作地连接，所述启动子在免疫抑制条件下诱导，例如，如在肿瘤中发现的，如本文所述。在一些实施方式中，所述两种或更多种基因序列与通过暴露化学或营养诱导物诱导的直接或间接诱导型启动子连接，所述化学或营养诱导物可以在体内条件下存在或不存在并且可以在体内存在期间存在。体外条件(例如菌株培养，扩增，制造)，例如四环素或阿拉伯糖，或本文所述的其他条件。在一些实施方式中，两种或更多种有效负载都与组成型启动子连接。此类组成型启动子描述于本文的表48-表58中。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与相同的启动子序列可操作地连接。在一些实施方式中，两个或更多个基因序列与两个或更多个不同的启动子序列可操作地连接，所述启动子序列可以全部是组成型的(相同或不同的组成型启动子)，所有可诱导的(通过相同或不同的诱导物)，或组成型的混合物。和诱导型启动子。
在一个实施方式中，编码一种或多种抗癌分子的一种或多种核酸序列位于细菌细胞中的质粒上。在另一个实施方式中，编码一种或多种抗癌分子的一种或多种核酸序列位于细菌细胞的染色体中。在任何这些核酸实施方式中，编码一种或多种抗癌分子的一种或多种核酸序列可以与编码本文所述的其他抗癌分子的任何其他核酸组合。
分泌
在本文所述的任何实施方式中，其中基因工程微生物产生蛋白质，多肽，肽或其他旨在从微生物分泌的抗癌，DNA，RNA，小分子或其他分子，工程微生物可包含分泌机制和编码分泌系统的相应基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含天然分泌机制或非天然分泌机制，其能够在细胞外环境中从细菌细胞质分泌抗癌分子。许多细菌已经进化出复杂的分泌系统以跨越细菌细胞包膜运输底物。诸如小分子，蛋白质和DNA的底物可以释放到细胞外空间或周质(例如肠腔或其他空间)中，注射到靶细胞中或与细菌膜结合。
在革兰氏阴性细菌中，分泌机器可以跨越内膜和外膜中的一个或两个。在一些实施方式中，基因工程化细菌还包含非天然双膜跨膜分泌系统。双膜-分泌系统包括但不限于I型分泌系统(T1SS)，II型分泌系统(T2SS)，III型分泌系统(T3SS)，IV型分泌系统(T4SS)，VI型分泌系统(T6SS)和多药物外排泵的阻力-结瘤-分裂(RND)家族(Pugsley1993；Gerlach等，2007；Collinson等，2015；Costa等，2015)；Reeves等，2015；WO2014138324A1，通过引用并入本文。具有革兰氏阴性样细胞包膜的分枝杆菌也可编码VII型分泌系统(T7SS)(Stanley等，2003)。除T2SS外，双跨膜分泌物通常将底物从细菌细胞质直接转运到细胞外空间或进入靶细胞。相反，仅跨越外膜的T2SS和分泌系统可以使用两步机制，其中底物首先通过内跨膜转运蛋白转移至周质，然后转移至外膜或分泌到细胞外空间。外膜跨膜分泌系统包括但不限于V型分泌物或自转运系统或自动递增系统(T5SS)，卷曲分泌系统和用于菌毛组装的伴侣-引导途径(Saier，2006；Costa等。，2015)。
在其中一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质从微生物分泌或输出的一些实施方式中，工程微生物包含包含分泌标签的基因序列。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质包括RNA或肽来源的“分泌标签”将一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质导向特定的分泌系统。例如，I型溶血素分泌系统的分泌标签编码在α溶血素蛋白(HlyA)的C末端53个氨基酸中。
在一些实施方式中，基于溶血素的分泌系统用于分泌目标分子，例如治疗性肽。I型分泌系统具有将其乘客肽直接从细胞质转移到细胞外空间的优点，从而避免了其他分泌类型的两步过程。该途径使用HlyB，一种ATP结合盒转运蛋白；HlyD，一种膜融合蛋白；和TolC，一种外膜蛋白。这三种蛋白质的组装形成了通过内膜和外膜的通道。HlyB插入内膜形成孔，HlyD将HlyB与TolC(外膜孔)对齐，从而形成穿过内膜和外膜的通道。本发明，该通道用于分泌HlyA，然而，为了分泌本公开的治疗性肽，HlyA的含有分泌信号的C末端部分与治疗性肽(星形)的C末端部分融合以介导。这种肽的分泌。可通过自催化或蛋白酶催化的例如OmpT切割除去C-末端分泌标签，从而将一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质释放到细胞外环境中。在一些实施方式中，一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质含有表达为融合蛋白，其具有大肠杆菌CFT073(C末端分泌标签)的α-溶血素(hlyA)的C末端的53个氨基酸。
在一些实施方式中，V型自转运分泌系统用于分泌目标分子，例如治疗性肽。V型自动分泌系统使用N端Sec依赖性肽标签(内膜)和C端标签(外膜)。该系统使用Sec系统从细胞质到周质。然后将C-末端标签插入外膜中，形成孔，“载客蛋白”穿过该孔。由于机器的简单性和处理相对大的蛋白质通量的能力，V型分泌系统对于重组蛋白的细胞外产生具有吸引力。例如，治疗性肽(星形)可以与N-末端分泌信号，接头和自转运蛋白的β-结构域融合。N-末端，Sec依赖性信号序列将蛋白质导向SecA-YEG机器，该机器将蛋白质穿过内膜移动到周质中，随后切割信号序列。β-结构域被招募到Bam复合体('β-barrel组装机器')，其中β结构域被折叠并作为β-桶结构插入外膜中。治疗肽穿过接头序列之前的β-桶结构的中空孔。一旦穿过外膜，乘客通过自催化，内含肽样机制(Bam复合物的左侧)或通过膜结合蛋白酶(黑色剪刀；Bam右侧)从膜包埋的C-末端标签释放复杂的)(即OmpT)。例如，膜相关肽酶至接头中的互补蛋白酶切割位点。因此，在一些实施方式中，分泌的分子，例如异源蛋白质或肽包含自身转运蛋白的N-末端分泌信号，接头和β-结构域，以允许分子从细菌分泌。
Sec系统删除了N端标签。因此，在一些实施方式中，分泌系统能够在从工程化细菌分泌一种或多种目的蛋白质或治疗性蛋白质之前除去该标签。在V型自身分泌介导的分泌中，通过天然Sec系统将“载客”肽从细胞质转移到周质区室中时除去N-末端肽分泌标签。此外，一旦自分泌物跨外膜移位，可通过自催化或蛋白酶催化的例如OmpT切割除去C-末端分泌标签，从而将抗癌分子释放到细胞外环境中。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌包含来自志贺氏菌，沙门氏菌，大肠杆菌，Bivrio，伯克霍尔德氏菌，耶尔森氏菌，衣原体或假单胞菌的III型或III型分泌系统(T3SS)。传统的T3SS能够通过针复合物将蛋白质从细菌细胞质转运到宿主细胞质中。在III型传统分泌系统中，基体与鞭毛非常相似，然而，传统的T3SS不是“尾巴”/鞭子，而是使用注射器将载客蛋白注入宿主细胞。分泌标签由N-末端肽编码(长度变化，并且存在几种不同的标签，参见PCT/US14/020972)。在该分泌系统中不从多肽中除去N-末端标签。
可以修饰T3SS以从细菌细胞质分泌分子，但不将分子注射到宿主细胞质中。因此，分子分泌到肠腔，肿瘤微环境或其他细胞外空间中。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含所述经修饰的T3SS并且能够从细菌细胞质中分泌目的分子。在一些实施方式中，分泌的分子，例如异源蛋白质或肽包含III型分泌序列，其允许目标分子从细菌分泌。
在一些实施方式中，遗传改造的微生物包含修饰的III型分泌系统。在Flagellar修饰的III型分泌中，标签在mRNA的5'非翻译区编码，因此没有肽标签可以切割/去除。这种改进的系统不包含“注射器”部分，而是使用鞭毛结构的基体作为孔移位穿过两个膜并通过形成鞭毛向外移位。如果fliC/fliD基因(编码鞭毛“尾巴”/鞭子)被破坏，则鞭毛不能完全形成，这促进了总体分泌。在一些实施例中，尾部可以完全移除。
在一些实施方式中，鞭毛III型分泌途径用于分泌目的分子。在一些实施方式中，通过将肽重组融合至天然鞭毛组分的N-末端鞭毛分泌信号，使用不完整的鞭毛来分泌目标治疗性肽。以这种方式，细胞内表达的嵌合肽可以跨内膜和外膜移动到周围的宿主环境中。
例如，改良的鞭毛III型分泌装置，其中基因fliC上游的非翻译DNA片段(编码鞭毛蛋白)，例如173-bp区域，与编码异源蛋白质或肽的基因融合，可用于分泌多肽。感兴趣的(参见，例如，Majander等，使用改良的大肠杆菌鞭毛分泌装置的细胞的细胞外分泌.NatBiotechnol.2005年4月；23(4)：475-81)。在一些情况下，来自fliC基因座的非翻译区可能不足以介导过客肽通过鞭毛的易位。这里可能需要将N末端信号延伸到FliC的氨基酸编码序列中，例如，通过使用173bp的非翻译区以及FliC的前20个氨基酸(参见，例如，Duan等，J.Biol.Chem。，Vol.30，p.1998)，通过共生细菌分泌促胰岛素蛋白：重新接受肠道以治疗糖尿病，Appl。ENVIRON。微生物。2008年12月第一卷74没有。237437-7438)。
在备选实施方式中，基因工程化细菌还包含非天然单跨膜分泌系统。单跨膜转运蛋白可以作为分泌系统的组分，或者可以独立地输出底物。此类转运蛋白包括但不限于ATP结合盒易位酶，鞭毛/毒力相关转位酶，缀合相关转位酶，一般分泌系统(例如大肠杆菌中的SecYEG复合物)，分枝杆菌中的辅助分泌系统。几种革兰氏阳性菌(如炭疽芽孢杆菌，约氏乳杆菌，谷氨酸棒杆菌，戈登链球菌，金黄色葡萄球菌)和双精氨酸易位(TAT)系统(Saier，2006；Rigel和Braunstein，2008；Albiniak等)al。，2013)。已知一般的分泌和TAT系统都可以将具有可切割的N-末端信号肽的底物输出到周质中，并且已经在生物制药生产的背景下进行了探索。然而，TAT系统可以提供特别的优点，因为它能够运输折叠的基板，从而消除了过早或不正确折叠的可能性。在某些实施方式中，基因工程化细菌包含TAT或TAT样系统，并且能够从细菌细胞质中分泌目标抗癌分子。本领域普通技术人员将理解，本文公开的分泌系统可以被修饰以在细菌的不同物种，菌株和亚型中起作用，和/或适于递送不同的有效负载。
为了将蛋白质(例如治疗性多肽)转移至细胞外空间，必须首先将多肽在细胞内翻译，在内膜上移动并最终在外膜上移动。许多效应蛋白(例如，治疗性多肽)-特别是真核来源的蛋白-含有二硫键以稳定三级和四级结构。虽然这些键能够在周质伴侣的帮助下在氧化周质区中正确形成，但为了使多肽易位穿过外膜，必须减少二硫键并再次展开蛋白质。
在革兰氏阴性细菌中分泌正确折叠的蛋白质的一种方法-特别是那些需要二硫键的细菌-是将还原环境周质与不稳定的外膜结合起来。以这种方式，蛋白质被动员到氧化环境中并被允许适当地折叠。与编排的细胞外分泌系统相反，蛋白质然后能够通过膜渗漏以正确折叠的形式逃离周质空间。因此，这些“渗漏的”革兰氏阴性突变体能够分泌生物活性的，适当的二硫键结合的多肽。在一些实施方式中，基因工程化细菌具有“渗漏”或去稳定的外膜。使细菌外膜不稳定以诱导渗漏可以通过删除或诱变负责将外膜束缚至刚性肽聚糖骨架的基因来实现，包括例如lpp，ompC，ompA，ompF，tolA，tolB和pal。Lpp是细菌细胞中最丰富的多肽，以每个细胞约500,000个拷贝存在，并且作为肽聚糖的细菌细胞壁的主要“主要”。1.Silhavy，TJ，Kahne，D和Walker，S.细菌细胞包膜。Cold Spring HarbPerspectBiol2，a000414(2010)。TolA-PAL和OmpA复合物的功能与Lpp相似，是其他缺失靶点，可产生渗漏表型。另外，当周质蛋白酶失活时，已观察到渗漏表型。周质非常密集地填充蛋白质，因此编码几种周质蛋白以促进蛋白质周转。去除周质蛋白酶如degS，degP或nlpI可通过促进周质蛋白的过度积累而诱导渗漏表型。蛋白酶的突变还可以通过防止这些蛋白酶的靶向降解来保留效应子多肽。
此外，这些突变的组合可以协同地增强细胞的渗漏表型，而不会在细胞活力方面造成重大牺牲。因此，在一些实施方式中，工程化细菌具有一个或多个缺失或突变的膜基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有缺失或突变的lpp基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自ompA，ompA和ompF基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自tolA，tolB和pal基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的周质蛋白酶基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种选自degS，degP和nlp1的缺失或突变的周质蛋白酶基因。在一些实施方式中，工程化细菌具有一种或多种缺失或突变的基因，选自lpp，ompA，ompF，tolA，tolB，pal，degS，degP和nlp1基因。
为了最小化对细胞活力的干扰，可以通过放置一个或多个膜或周质蛋白酶基因(例如选自lpp，ompA，ompF，tolA，tolB，pal，degS，degP和nlpl)使得渗漏表型可诱导。控制诱导型启动子。例如，可以在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下抑制lpp或其他细胞壁稳定性蛋白质或周质蛋白酶的表达。例如，在诱导条件下，可以表达转录抑制蛋白或设计的反义RNA，其减少靶膜或周质蛋白酶基因的转录或翻译。相反，某些肽的过表达可导致不稳定的表型，例如大肠杆菌素的过表达或TolA的第三拓扑结构域，其中可在需要递送(分泌)治疗性多肽的条件下诱导肽过表达。这些策略将使脆弱的，渗漏的表型与生物量产生分离。因此，在一些实施方式中，工程化细菌在诱导型启动子的控制下具有一种或多种膜和/或周质蛋白酶基因。
下表12和表13列出了革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的分泌系统。
表12。革兰氏阳性细菌的分泌系统
Figure BDA0002194618080004431
Figure BDA0002194618080004441
表13。革兰氏阴性菌的分泌系统
Figure BDA0002194618080004442
Figure BDA0002194618080004451
Figure BDA0002194618080004461
上面的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表列出了可用于从工程菌中分泌多肽和其他分子的分泌系统，MiltonH.Saier，Jr。Microbe/Volume1，Number9,2006“Protein”革兰氏阴性细菌中的分泌系统革兰氏阴性细菌具有许多蛋白质分泌-膜插入系统，其显然是独立进化的，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含本文所述的天然或非天然分泌系统，用于分泌抗癌分子，例如细胞因子，抗体(例如scFv)，代谢酶，例如犬尿氨酸酶，其他这里描述的。
在一些实施方式中，分泌标签选自PhoA，OmpF，cvaC，TorA，fdnG，dmsA，PelB，HlyA分泌信号和HlyA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签是PhoA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含选自SEQ ID NO:745或SEQ ID NO:746的序列。在一些实施方式中，分泌标签是OmpF分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签是OmpF分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:747。在一些实施方式中，分泌标签是cvaC分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:748。在一些实施方式中，分泌标签是torA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:749。在一些实施方式中，分泌标签是fdnG分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:750。在一些实施方式中，分泌标签是dmsA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:751。在一些实施方式中，分泌标签是PelB分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含SEQ ID NO:752。在一些实施方式中，分泌标签是HlyA分泌信号。在一些实施方式中，分泌标签包含选自SEQ ID NO:753和SEQ ID NO:754的序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码分泌标签的核酸序列。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列与选自以下的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源：SEQ ID NO:745，SEQ ID NO:746，SEQ ID NO:747，SEQID NO:748，SEQ ID NO:749，SEQ ID NO:750，SEQ ID NO:751，SEQ ID NO:752，SEQ ID NO:7NO：753，和/或SEQ ID NO:754。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列包含选自SEQID NO:745，SEQ ID NO:746，SEQ ID NO:747，SEQ ID NO:748，SEQ ID NO:749，SEQIDNO：750，SEQ ID NO:751，SEQ ID NO:752，SEQ ID NO:753和/或SEQ ID NO:754的序列。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列由选自SEQ ID NO:745，SEQ ID NO:746，SEQ ID NO:747，SEQ ID NO:748，SEQ ID NO:749，SEQIDNO：750，SEQ ID NO:751，SEQ ID NO:752，SEQID NO:753和/或SEQ ID NO:754的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含选自Adhesin(ECOLIN_19880)，DsbA(ECOLIN_21525)，GltI(ECOLIN_03430)，GspD(ECOLIN_16495)，HdeB(ECOLIN_19410)，Malde(ECOLIN_22540)，OppA(ECOLIN_07295)的分泌标签的多肽。)，PelB，PhoA(ECOLIN_02255)，PpiA(ECOLIN_18620)，TolB，侵权，OmpA，PelB，DsbAmglB和lamB分泌标签。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码分泌标签的核酸序列。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列与选自以下的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％同源：SEQ ID NO:1222，SEQ ID NO:1223，SEQ ID NO:1224，SEQ ID NO:1225，SEQ ID NO:1226，SEQ ID NO:1227，SEQ ID NO:1228，SEQ ID NO:1229，SEQ ID NO:1222NO：1230，SEQ ID NO:1141，SEQ ID NO:1142，SEQ ID NO:1143，SEQ ID NO:1144，SEQ ID NO:1145，SEQ ID NO:1253，SEQ ID NO:1157，SEQ ID NO:1158，SEQ ID NO:1159，SEQ ID NO:1160，SEQ ID NO:1161，SEQ ID NO:1162，SEQ ID NO:1163，SEQ ID NO:1164，SEQ ID NO:1165，SEQ ID NO:1166，和SEQ ID NO:1167。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列包含选自SEQ ID NO:1222，SEQ ID NO:1223，SEQ ID NO:1224，SEQ ID NO:1225，SEQ ID NO:1226，SEQIDNO：1227，SEQ ID NO:1228，SEQ ID NO:1229，SEQ ID NO:1230，SEQ ID NO:1141，SEQ ID NO:1142，SEQ ID NO:1143，SEQ ID NO:1144，SEQ ID NO:1145，SEQ ID NO:1253，SEQ ID NO:1157，SEQ ID NO:1158，SEQ ID NO:1159，SEQ ID NO:1160，SEQ ID NO:1161，SEQ ID NO:1162，SEQ ID NO:1163，SEQ ID NO:1164，SEQ ID NO:1165，SEQ ID NO:1166和SEQ ID NO:1167的序列。。在一个实施方式中，编码分泌标签的核酸序列由选自SEQ ID NO:1222，SEQ ID NO:1223，SEQ ID NO:1224，SEQ ID NO:1225，SEQID NO:1226，SEQIDNO：1227，SEQ ID NO:1228，SEQ ID NO:1229，SEQ ID NO:1230，SEQ IDNO:1141，SEQ ID NO:1142，SEQ ID NO:1143，SEQ ID NO:1144，SEQ ID NO:1145，SEQ IDNO:1253，SEQ ID NO:1157，SEQ ID NO:1158，SEQ ID NO:1159，SEQ ID NO:1160，SEQ IDNO:1161，SEQ ID NO:1162，SEQ ID NO:1163，SEQ ID NO:1164，SEQ ID NO:1165，SEQ IDNO:1166和SEQ ID NO:1167的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌编码包含分泌标签的多肽，其具有与选自SEQID NO:1218，SEQ ID NO:1219，SEQ ID NO:1181，SEQ ID NO:1220，SEQ ID NO:1221，SEQ IDNO:1180，SEQ ID NO:1184，SEQ ID NO:1186，SEQ ID NO:1190，SEQ ID NO:1182，SEQ IDNO:1135，SEQ ID NO:1183，SEQ ID NO:1188，SEQ ID NO:1187，SEQ ID NO:747，SEQ ID NO:1185和SEQ ID NO:1189至少约80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的分泌标签多肽序列。在另一个实施方式中，分泌标签包含选自SEQ ID NO:1218，SEQ ID NO:1219，SEQ ID NO:1181，SEQ ID NO:1220，SEQ ID NO:1221，SEQ ID NO:1180，SEQIDNO：1184，SEQ ID NO:1186，SEQ ID NO:1190，SEQ ID NO:1182，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1183，SEQ ID NO:1188，SEQ ID NO:1187，SEQ ID NO:747，SEQ ID NO:1185和SEQ ID NO:1189的序列。在另一个实施方式中，分泌标签由选自SEQ ID NO:1218，SEQ ID NO:1219，SEQ ID NO:1181，SEQID NO:1220，SEQ ID NO:1221，SEQ ID NO:1180，SEQ ID NO:1184，SEQ ID NO:1186，SEQ IDNO:1190，SEQ ID NO:1182，SEQ ID NO:1135，SEQ ID NO:1183，SEQ ID NO:1188，SEQ IDNO:1187，SEQ ID NO:1184NO：747，SEQ ID NO:1185和SEQ ID NO:1189的序列组成。
任何分泌标签或分泌系统可以与本文所述的任何细胞因子组合，并且可以用于产生由本文所述的直接或间接诱导或组成型启动子驱动的构建体(基于质粒或整合的)。在一些实施方式中，分泌系统与一种或多种基因组突变组合使用，其导致渗漏或可扩散的外膜表型(DOM)，包括但不限于lpp，nlP，tolA，PAL。
在一些实施方式中，分泌系统选自III型鞭毛，修饰的III型鞭毛，I型(例如，溶血素系统)，II型，IV型，V型，VI型和VII型分泌系统，抗性结瘤。-division(RND)多药物外排泵，单膜分泌系统，Sec和TAT分泌系统。
本文描述的任何分泌系统可以根据本公开内容用于分泌目标多肽。在一些实施方式中，修饰由遗传工程化细菌分泌的治疗性蛋白质以增加对蛋白酶(例如肠蛋白酶)的抗性。
在一些实施方式中，基因工程微生物能够在低氧条件下，和/或在癌症和/或肿瘤微环境和/或肿瘤微环境或组织特异性分子或代谢物的存在下，和/或在与炎症或免疫抑制相关的分子或代谢物的存在下，和/或在肠内可能存在的代谢物的存在下，和/或在可以或可以不体内存在，并且可以在菌株培养，扩增，生产和/或制造过程中体外存在的代谢物，例如阿拉伯糖和本文所述的其他物质的存在下，表达任何一种或多种所述回路。在一些实施方式中，基因序列由可被这样的条件和/或诱导物诱导的启动子控制。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，如本文所述。在一些实施方式中，基因序列由组成型启动子控制，并且在体内条件和/或体外条件下表达，例如在扩增，生产和/或制造期间，如本文所述。
在一些实施方式中，所述回路中的任何一个或多个存在于一种或多种质粒(例如，高拷贝或低拷贝)上或整合到微生物染色体中的一个或多个位点中。此外，在一些实施方式中，遗传改造的微生物还能够表达任何一种或多种所述回路，并且还包含以下中的一种或多种：(1)一种或多种营养缺陷型，例如本领域已知的和本文提供的任何营养缺陷型，例如，thyA营养缺陷型，(2)一个或多个灭活开关回路，例如本文所述的或本领域已知的任何灭活开关，(3)一种或多种抗生素抗性回路，(4)一种或多种用于输入生物分子或底物的转运蛋白，例如本文所述的或本领域已知的任何转运蛋白，(5)一种或多种分泌环，例如本文所述的任何分泌环，以及本领域已知的任何分泌环，(6)一种或多种表面显示回路，例如本文所述和本领域已知的任何表面显示回路，和(7)一种或多种用于产生或降解一种或多种代谢物的回路(例如，犬尿氨酸，tr)本文所述的色氨酸，腺苷，精氨酸(8)这些附加回路中的一种或多种的组合。在任何这些实施方式中，基因工程化细菌可以单独施用或与本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂组合施用，包括但不限于抗-CTLA4，抗-PD1或抗-PD-L1抗体。
感兴趣的蛋白质的非限制性实例包括细胞因子，例如IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS。激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，SIRPα和变体，透明质酸酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4和本文所述的其他物质)和抗-CD47，抗CD40和产生或消耗酶的代谢产物，例如犬尿氨酸酶，色氨酸和/或精氨酸合成酶，以及腺苷降解酶。可以突变这些多肽以增加稳定性，对蛋白酶消化的抗性和/或活性。
表14。从工程菌分泌多肽的分泌系统的比较
Figure BDA0002194618080004511
Figure BDA0002194618080004521
在一些实施方式中，使用鞭毛III型分泌系统的组分分泌目标治疗性多肽。在一个非限制性实例中，这种目的治疗性多肽，例如，IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226。激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，透明质酸酶，色氨酸和/或精氨酸合成酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4)本文所述的犬尿嘧啶酶和腺苷降解酶在fliC-5'UTR(例如，来自fliC基因座的173-bp非翻译区)后组装，并由天然启动子驱动。在其他实施方式中，使用鞭毛III型分泌系统的组分分泌的感兴趣的治疗性肽的表达由tet诱导型启动子驱动。在备选实施方式中，诱导型启动子，例如氧水平依赖性启动子(例如，FNR诱导型启动子)，由IBD特异性分子诱导的启动子或由炎症或炎症反应诱导的启动子(RNS，ROS启动子)，和由a诱导的启动子。在肠道中可以或可以不天然存在(例如，可以外源添加)的代谢物，例如使用阿拉伯糖。在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽由质粒(例如，中等拷贝质粒)表达。在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽从构建体表达，所述构建体整合到fliC基因座中(从而缺失fliC)，其中它由天然FliC启动子驱动。在一些实施方式中，FliC的N末端部分(例如，FliC的前20个氨基酸)包含在构建体中，以进一步提高分泌效率。
在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽，例如，IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，透明质酸酶，色氨酸和/或精氨酸合成酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4和本文所述的其他物质)，犬尿氨酸酶，腺苷降解酶，通过扩散外膜(DOM)系统分泌。在一些实施方式中，目标治疗性多肽与N-末端Sec依赖性分泌信号融合。这种N-末端Sec依赖性分泌信号的非限制性实例包括PhoA，OmpF，OmpA和cvaC。在备选实施方式中，目标治疗性多肽与Tat依赖性分泌信号融合。示例性Tat依赖性标签包括TorA，FdnG和DmsA。
在某些实施方式中，遗传工程化细菌包含一种或多种外膜和/或周质蛋白的缺失或突变。这些蛋白质的一个或多个可以缺失或突变的非限制性实例包括lpp，pal，tolA和/或nlpI。在一些实施方式中，lpp被删除或突变。在一些实施方式中，pal被删除或突变。在一些实施方式中，tolA被删除或突变。在其他实施方式中，nlpI被缺失或突变。在其他实施方式中，某些周质蛋白酶缺失或突变，例如，以增加多肽在周质中的稳定性。此类蛋白酶的非限制性实例包括degP和ompT。在一些实施方式中，degP被删除或突变。在一些实施方式中，ompT被删除或突变。在一些实施方式中，degP和ompT被删除或突变。
在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽，例如IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，透明质酸酶，色氨酸和/或精氨酸合成酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4和本文所述的其他，犬尿嘧啶酶)，腺苷降解酶，通过V型自动分泌物(pic蛋白)分泌物分泌。在一些实施方式中，目标治疗性蛋白质表达为与天然Nissle自分泌物大肠杆菌_01635的融合蛋白(其中原始的乘客蛋白质被感兴趣的治疗性多肽替换。
在一些实施方式中，感兴趣的治疗性多肽，例如IL-12，IL-2，IL-15，IL-18，IL-7，IL-21，CD40激动剂，CD40激动剂，CD226激动剂，CD137激动剂，ICOS激动剂，OXO40激动剂，GM-CSF，CXCL10，CXCL9，色氨酸和/或精氨酸合成酶，抗体，例如scFv，包括但不限于检查点抑制剂(例如，PD1，PDL1，CTLA4，抗LAG3，抗TIM3和本文所述的其他药物，犬尿氨酸酶，腺苷降解酶，通过I型溶血素分泌物分泌。在一个实施方式中，目标治疗性多肽表达为融合蛋白，其具有大肠杆菌CFT073的α-溶血素(hlyA)的C末端的53个氨基酸。
表面显示
在一些实施方式中，遗传工程化细菌和/或微生物编码一种或多种编码抗癌分子的基因和/或基因盒，所述抗癌分子锚定或展示在细菌和/或微生物的表面上。展示或锚定于细菌和/或微生物的抗癌分子的实例是本文所述的任何抗癌分子，并且包括但不限于抗体，例如scFv片段和肿瘤特异性抗原。或新抗原。在非限制性实例中，锚定或展示在细菌细胞表面上的抗体或scFv片段针对本文所述的检查点抑制剂，包括但不限于CLTLA4，PD-1，PD-L1。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码治疗性多肽或效应分子的一种或多种基因序列，例如ScFv，其锚定或展示在细菌表面上，并且在发挥其效应子功能的同时保持锚定。在其他实施方式中，编码表面展示的治疗性多肽的基因工程化细菌，例如抗体或scFv片段，在发挥其效应子功能之前，期间或之后裂解。在一些实施方式中，基因工程化细菌编码治疗性肽，其暂时附着于细胞表面并且在发挥其功能之前，期间或之后与细菌解离。
在一些实施方式中，较短的肽或多肽，例如长度小于60个氨基酸的肽或多肽，显示在遗传工程化细菌的细胞表面上。在一些实施方式中，此类较短的肽或多肽包含免疫调节效应分子。本文描述了此类治疗性多肽的非限制性实例。
用于在革兰氏阴性细菌表面上展示较短肽或多肽的几种策略是本领域已知的，并且例如描述于Georgiou等人，在微生物表面上展示异源蛋白质：来自组合文库的筛选。生活重组疫苗：NatBiotechnol。1997年1月；15(1)：29-34，其内容通过引用整体并入本文。这些系统都具有共同的主题，通过使用来自表面蛋白的膜锚定结构域的序列构建基因融合，将重组蛋白靶向细胞表面。
表15-17中描述了这种策略的非限制性实例。
表15。示例性细胞表面展示策略
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表16。示例性细胞表面展示策略
Figure BDA0002194618080004562
Figure BDA0002194618080004571
表17。示例性细胞表面策略
Figure BDA0002194618080004572
Figure BDA0002194618080004581
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种短治疗肽或多肽的一种或多种基因序列，所述短治疗肽或多肽融合到外膜蛋白(OMP)的表面暴露环中，例如来自肠细菌。在一个非限制性实例中，将由遗传工程化细菌表达的短治疗性肽或多肽插入外膜蛋白LamB中，例如，从大肠杆菌中插入，并展示在细菌细胞表面上。通过将肽插入到LamB的表面暴露环中的肽的细胞外展示例如描述于Hofnung等，外源多肽在大肠杆菌细胞表面的表达；方法细胞生物学。34：77-105，和Charbit，A。等，1987。在活重组细菌上展示乙型肝炎病毒preS2区的两个表位，J.Immunol。139：1658年至1664年。
在另一个非限制性实例中，由基因工程化细菌中包含的一种或多种基因序列编码的短治疗性肽或多肽被插入外膜蛋白PhoE，例如，来自大肠杆菌，并展示在细菌上。细胞表面。PhoE蛋白是大肠杆菌K-12的另一种丰富的外膜蛋白，其具有三聚体结构并且用作小分子的孔。对PhoE的一级结构的分析揭示了穿过膜的16个β折叠，以及暴露在细胞表面的八个高变区。这些细胞表面暴露的PhoE蛋白区域中的一个或多个可用于插入异源肽。例如，病原生物的抗原决定簇已经在PhoE蛋白的一个或多个细胞表面暴露区域中呈现(例如，如Aterberg等，1990；大肠杆菌的外膜PhoE蛋白作为外源抗原决定簇的载体：口蹄疫病毒表位的免疫原性；疫苗。1990年2月；8(1)：85-91)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种编码一种或多种短的治疗性肽或基因序列的基因序列，所述短期治疗性肽或多肽与细胞外附属物的蛋白质组分融合。已经描述了几种系统，其中细胞外附属物如菌毛和鞭毛用于在细菌细胞表面展示目的肽。使用的鞭毛和支柱蛋白的实例包括FliC(大肠杆菌鞭毛的主要结构组分)和PapA(Pap菌毛的主要亚基)。在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码FLITRX系统的一种或多种组分的一种或多种基因序列。FLITRX系统是基于使用FliC和硫氧还蛋白的融合蛋白的大肠杆菌展示系统，硫氧还蛋白是一种小的氧化还原蛋白，代表了一种高度通用的支架，允许肽插入物假定与其他蛋白质结合相容的确认。在FLITRX系统中，硫氧还蛋白融合到FliC的可分配区域中。然后，可以将异源肽插入FliC融合体中的硫氧还蛋白结构域内，并进行表面暴露。其他支架蛋白是本领域已知的，其中一些可在该系统中替代硫氧还蛋白作为支架蛋白。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含FimH融合蛋白，其中目标治疗性肽与FimH融合，FimH是1型菌毛的粘附素，例如来自大肠杆菌。在某些位置含有多达56个外源氨基酸的FimH粘附素嵌合体作为菌毛细胞器的组分被转运到细菌表面(Pallesen等，I型菌毛的ChimericFimH粘附：用于异源序列的细菌表面展示系统)。微生物学141：2839-2848)。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一种或多种基因序列，其中目标治疗性肽与F11菌毛的主要亚基融合，例如，来自大肠杆菌。F11菌毛的主要亚基的高变区可用于插入异源肽，例如抗原表位(VanDie等，在大肠杆菌的P-菌毛中表达外源表位。摩尔。吉恩将军。222：297-303)。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码papA融合蛋白的一种或多种基因序列，其中目标治疗性肽与papA融合。在一些实施方式中，在PapA的成熟部分的编码序列的密码子7或68之后插入感兴趣的肽，因为PapA的氨基酸7和68区域中的肽定位于菌毛的外侧(Steidler)等人，Pappili作为用于表面暴露金黄色葡萄球菌中金黄色葡萄球菌蛋白A的免疫球蛋白G结合结构域的载体系统；JBacteriol。1993年12月；175(23)：7639-43)。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含一种或多种基因序列，其编码大于60个氨基酸的多肽，例如免疫调节效应子，并且展示在细菌细胞表面上。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码融合蛋白的一种或多种基因序列，其中感兴趣的治疗性肽(例如长度大于60个氨基酸的多肽)与来自的脂蛋白融合。革兰氏阴性细菌，或其一种或多种片段。
在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含一种或多种基因序列，其编码融合蛋白，其中目标治疗性蛋白与肽聚糖相关脂蛋白(PAL)或其片段融合。融合蛋白位于周质中并且可以在外膜透化时在外部展示。例如，PAL-scFv融合蛋白显示与其抗原结合并与细胞包膜的胞壁蛋白层紧密结合(Fuchs等，Targeting重组抗体表面大肠杆菌融合至肽聚糖相关脂蛋白)；生物技术(纽约州)。1991年12月；9(12)：1369-72)。PAL-scFv融合体位于周质中并与胞壁质层结合，并且在外膜透化后，scFv变得可被外部添加的抗原接近。在一些实施方式中，包含用于表面展示的融合蛋白的基因工程化细菌还具有可渗透的外膜。导致渗漏外膜的突变和/或缺失在本文其他地方描述。
在一个实施方式中，遗传工程化细菌编码融合蛋白，其中感兴趣的治疗性蛋白质(例如免疫调节效应子)与革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的主要脂蛋白的残基融合。在一个实施方式中，基因工程化细菌编码融合蛋白，其中感兴趣的治疗性蛋白质与信号肽和革兰氏阴性细菌的主要脂蛋白的9个N-末端氨基酸残基融合，例如E.大肠杆菌。大肠杆菌主要脂蛋白的这些残基起疏水性膜锚的作用。例如，这些残基与治疗性多肽(在这种情况下是scFv片段)的融合构建体导致免疫反应性和细胞结合的多肽在大肠杆菌中的特异性积累(Laukkanen等，Lipid-taggedantibodies：bacterialexpression和脂蛋白-单链抗体融合蛋白的表征。摩尔。微生物。4：1259-1268)。
在一个实施方式中，遗传工程化细菌编码融合蛋白，其中将感兴趣的治疗性蛋白质插入革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的TraT蛋白中，例如在180位。TraT蛋白是一种表面暴露的脂蛋白，由IncF组的质粒指定，介导血清抗性和表面排斥。泰勒等人。表明插入脊髓灰质炎病毒的C3表位，例如在180位，允许抗原暴露于细胞表面，同时保持野生型蛋白的寡聚构象(Taylor等，TheTraTlipoproteinasa用于将外来抗原决定簇转运到大肠杆菌K12细胞表面的载体：TraT蛋白中的结构-功能关系。MolMicrobiol。1990年8月；4(8)：1259-68)。
在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码融合蛋白的一个或多个基因和/或基因盒，所述融合蛋白包含Lpp-OmpA展示载体，其包含来自主要脂蛋白(Lpp)的N末端外膜信号，其融合至来自外部的结构域。膜蛋白OmpA，与目标治疗性多肽融合。在该系统中，Lpp信号肽介导定位，并且OmpA提供用于展示目标治疗性蛋白质的框架。已经使用Lpp-OmpA融合体在大肠杆菌表面上展示大小在20和54kDa之间的几种蛋白质(参见，例如，Staphopoulos等，表达大肠杆菌的表征和Lpp-OmpA(46-159)-PhoA融合蛋白定位于外膜中)。例如，Fransco等人将β-内酰胺酶与Lpp的N-末端靶向序列和含有天然蛋白质的8个跨膜环中的5个的OmpA片段融合。将该融合蛋白组装在细胞表面上，并将β-内酰胺酶结构域稳定地锚定在细胞壁中(Fransisco等，将β-内酰胺酶转运和锚定到大肠杆菌的外表面；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448。科学院。科学。USAVol89，pp.2713-2717,1992)。
在一个实施方式中，II型分泌途径或其变体用于在细菌细胞表面上瞬时或更长时间显示目标治疗性蛋白质，例如奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶分泌途径或志贺氏菌的VirG蛋白质途径。在一个实施方式中，IgA蛋白酶分泌途径用于在革兰氏阴性细菌的细胞表面上输出和展示目标治疗性肽。淋病奈瑟氏球菌和流感嗜血杆菌的IgA蛋白酶使用最常见的II型分泌途径的变异，以实现独立于任何其他基因产物的细胞外输出。奈瑟氏球菌属的IgA基因编码切割人IgA1抗体的细胞外蛋白。单独的iga基因足以指导在奈瑟氏球菌，沙门氏菌和大肠杆菌物种中选择的IgA蛋白酶的细胞外分泌(Klauser等，1993，使用奈瑟菌IgA蛋白酶β-结构域的霍乱毒素B亚基的细胞外转运：构象依赖性的外膜易位。EMBOJ9：1991-1999，以及其中的参考文献)。通过信号肽酶和自身蛋白水解切割，从大前体分几步处理成熟的IgA蛋白酶。前体由四个结构域组成：(1)介导内膜转运的氨基末端信号肽；(2)蛋白酶结构域(3)α结构域，用蛋白酶分泌的碱性α螺旋区和(4)自转运蛋白β结构域，其具有外膜转运的基本功能。基本上，IgA蛋白酶的C末端β自转运蛋白结构域在外膜中形成通道，其介导穿过膜的N末端结构域的输出，其进而瞬时显示在细菌的外表面上。然后通过蛋白水解切割释放α结构域和蛋白酶结构域。Klauser等。(1993)，显示用霍乱毒素B替换淋病奈瑟氏球菌IgA蛋白酶的天然N-末端结构域导致在鼠伤寒沙门氏菌中的载客多肽的表面呈递。在另一项研究中，使用淋病奈瑟氏球菌IgA蛋白酶的信号序列和C末端β自转运蛋白结构域转移并展示针对大肠杆菌细菌细胞表面上的猪流行性腹泻病毒表位的scFv(Pyo等)。例如，在细胞表面上表达单链Fv的大肠杆菌作为猪流行性腹泻病毒的潜在预防剂；Vaccine(27)(2009)2030-2036。)。
因此，在一个实施方式中，遗传工程化细菌编码IgA蛋白酶片段，其中α结构域被目标治疗性蛋白质取代，并与功能性IgA蛋白酶β-结构域融合，其介导通过外膜的输出。不希望受理论束缚，在这种融合蛋白中消除了IgA蛋白酶活性，因此不会发生融合蛋白自身蛋白水解释放到培养基中，导致目标治疗性蛋白质在细胞表面上的展示。革兰氏阴性宿主细菌。
来自志贺氏菌的VirG蛋白的分泌类似于奈瑟氏球菌的IgA蛋白酶所使用的输出系统(参见，例如，Suzuki等，1995；VirgellaJBiol的VirG蛋白的细胞外转运。Chem270：30874-30880，以及其中的参考文献)。因此，在一些实施方式中，遗传工程化细菌编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与VirG的跨膜区融合的目标治疗性蛋白，导致目标治疗性蛋白的表面展示。已显示志贺氏菌大质粒上的VirG基因负责丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)的定位沉积，其从入侵的细菌细胞的一个极落后并在细丝中延伸通过宿主上皮细胞质。VirG是一种表面暴露的外膜蛋白，由三个独特的结构域组成，即N-末端信号序列(氨基酸1-52)，idα-结构域(氨基酸53-758)和dC-末端β-核心。(氨基酸759-1102)(参见，例如，Suzuki等，1996；ShigellaVirGDomains的功能分析对于与Vinculin和基于肌动蛋白的运动的相互作用必需；J.Biol.Chem。Chem。，271,21878-21885，以及其中的参考文献)。铃木等人。(1995)；表明外源蛋白如MalE或PhoA蛋白与N末端37-kDaVirG部分的融合导致载客多肽从周质转运到外膜的外侧，表明C-末端37嵌入外膜中的-kDaVirG部分以与IgA蛋白酶β-结构域同源的方式参与前一个VirG部分或异源或客体多肽从周质空间到外膜外侧的转运。在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一个或多个基因或基因盒，其中C端37-kDaVirG蛋白片段与目标治疗性蛋白融合。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一种或多种基因或基因盒，其中目标治疗性蛋白质与支链淀粉酶融合用于临时表面展示。普鲁兰酶特异性地由肺炎克雷伯氏菌释放到培养基中，并且在从早期静止生长期开始释放到培养基中之前作为完全暴露的细胞表面结合的中间体存在。细胞表面锚定通过N-末端脂肪酰基修饰实现，其化学组成与其他细菌蛋白质的化学组成相同。
与IgA蛋白酶不同，肺炎克雷伯氏菌的脂蛋白支链淀粉酶(PulA)也通过II型分泌机制输出，需要14个基因才能跨越外膜转运。例如，Pugsley及其同事已经表明，脂蛋白支链淀粉酶(PulA)可以促进周质酶β-内酰胺酶穿过外膜的转运。特别地，在表达所有支链淀粉酶分泌基因的大肠杆菌菌株中，含有N-末端834-氨基酸支链淀粉酶区段的支链淀粉酶-β-内酰胺酶杂合蛋白分子被有效地转运至细胞表面。值得注意的是，支链淀粉酶杂交体仅暂时附着在细菌表面，随后被释放到培养基中(Kornacker和Pugsley：正常的周质酶β-内酰胺酶在与细胞融合时特异而有效地通过大肠杆菌外膜转位。表面酶支链淀粉酶。摩尔。微生物。4：1101-1109，以及其中的参考文献)。因此，在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含一种或多种基因序列，其包含分泌所需的全套支链淀粉酶基因，并且融合蛋白包含与N-末端支链淀粉酶多肽片段融合的目标治疗性蛋白质，例如，正如Kornacker和Pugsley所描述的那样。在一些实施方式中，将包含与目标治疗性蛋白质融合的N-末端支链淀粉酶多肽的融合蛋白瞬时展示在细菌细胞的表面上，随后释放到培养基或细胞外空间中。
在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一种或多种基因或基因盒，其中来自丁香假单胞菌的冰成核蛋白(INP)在细胞壁中锚定目标治疗性蛋白。INP是一种分泌蛋白，催化细胞外冰形成为冰核。在许多革兰氏阴性菌中发现了INP，包括丁香假单胞菌，草生欧文氏菌，野油菜黄单胞菌和荧光假单胞菌。丁香假单胞菌菌株，inaK，inaV和inaZ以及inaQ中的四个基因在序列和初级组织中表现出高度的相似性(Li等，丁香假单胞菌冰核蛋白变体(InaQ)的分子特征及其在大肠杆菌中的跨膜转运活性分析。2012；8(8)：1097-1108)。所有INP(1200aa至1500aa)包含三个不同的结构域：(1)N-末端结构域(约占总序列的15％)，其相对疏水并且可能能够与甘露聚糖偶联。磷脂酰肌醇基在外膜中通过N-聚糖(Asp)或O-聚糖(Ser，Thr)键；(2)C末端结构域(约4％)，它是相对亲水的末端；(3)中心重复结构域(CRD)(约81％)，其构成由16个残基(或48个残基)周期性与共有八肽(Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-)给出的连续重复。LEU-THR)。INP已被用于各种细菌细胞表面展示系统，包括大肠杆菌，运动发酵单胞菌，沙门氏菌，鳗弧菌，恶臭假单胞菌和蓝细菌，所有这些INP能够将异源蛋白质靶向表面。宿主细胞。此外，仅显示N末端区域指导外源蛋白质转运至细胞表面，并且可用作潜在的细胞表面展示基序(Li等人，2004使用N在大肠杆菌表面上的外源蛋白质的功能展示)-冰核蛋白的末端结构域；BiotechnolBioeng。2004年1月20日；85(2)：214-21)。因此，在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含用于表面展示目标治疗性肽的IMP融合物。在一些实施方式中，INP蛋白的N-末端区与目的多肽融合以进行表面展示。
IMP蛋白还具有可修饰的内部重复单元，即CRD长度是可调节的，这允许蛋白质融合长度的灵活性(Jung等人，1998)，并且还可以容纳更大的多肽。例如，基于INP的展示系统用于在大肠杆菌的细胞表面上成功表达90kDA蛋白质(Wu等人，2006；使用冰核蛋白质在大肠杆菌上的Chi92的细胞表面展示用于改善催化和抗真菌活性；FEMS微生物学快报，第256卷，第1期；第119-125页)。
本领域技术人员应理解，本文所述的此类融合蛋白或杂合蛋白的易位需要“易位”能力构象，例如，在周质空间中形成二硫键可能是不合需要的并且抑制易位通过外膜(参见，例如，Klauser等，1990)，或者可能需要，(或至少不阻碍)通过外膜的易位(参见，例如，Puggsley，1992；Translocation of a folde dproteinacross大肠杆菌中的外膜；ProcNatlAcadSciUSA.1992Dec15；89(24)：12058-12062)。在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一种或多种基因序列，其中在易位至细胞表面之前防止形成二硫键。在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码融合蛋白的一个或多个基因或基因盒，其中在易位至细胞表面之前形成二硫键。
还开发了用于在革兰氏阳性细菌中展示蛋白质的表达系统。因此，在一些实施方式中，革兰氏阳性细菌被工程化以在其细胞表面上展示感兴趣的治疗性蛋白质。Uhlen等。使用融合蛋白A的细胞壁结合的X结构域，用于展示长达88个氨基酸的外来肽到葡萄球菌菌株的表面。例如，一项研究描述了一种表达系统，允许将异源蛋白质靶向木葡萄球菌(一种凝固酶阴性革兰氏阳性细菌)的细胞表面(Hansson等，凝固酶阴性细菌表面的重组蛋白表达)Staphylococcusxylosus；JBacteriol。1992年7月；174(13)：4239-45)。
在编码信号肽的基因片段和葡萄球菌蛋白A的细胞表面结合区之间融合的重组基因片段的表达通过膜锚定区和高度电荷的细胞壁将所得的融合蛋白靶向外部细菌细胞表面。因此，在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码在编码信号肽的基因片段和葡萄球菌蛋白A的细胞表面结合区之间融合的治疗性多肽的一种或多种基因序列。
通过利用源自S.hyicus的脂肪酶基因构建体和葡萄球菌蛋白A的细胞表面附着部分的启动子，信号序列和前肽区构建大肠杆菌-葡萄球菌穿梭载体。该系统已被研究用于在S.carnosus上的异源多肽的表面展示(Samuelson等，在Staphylococcuscarnosus上的重组蛋白的细胞表面展示；JBacteriol。1995年3月；177(6)：1470-6)。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码治疗性多肽融合蛋白的一种或多种基因序列，所述治疗性多肽融合蛋白包含来源于S.hyicus的脂肪酶基因构建体和葡萄球菌的细胞表面附着部分的启动子，信号序列和前肽区域。蛋白A.
在其他研究中，使用链球菌热原的纤维状M6蛋白作为链球菌细胞中抗原递送的载体。(Pozzi等，1992；在链球菌表面上传递和表达异源抗原。感染。Immunm。60：1902-1907)。在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含一种或多种基因序列，所述基因序列包含治疗性多肽融合蛋白，所述治疗性多肽融合蛋白包含链球菌热原的纤维状M6蛋白，用于治疗性多肽的细胞表面展示。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码目的多肽的一种或多种基因或基因盒，其通过与intimin或侵袭素的融合展示在细胞表面上。Intimins和侵袭素属于细菌粘附素家族，其特异性地与各种真核细胞表面受体相互作用，从而介导细菌粘附和侵袭。intimins和invasionin都提供了理想地适合细胞表面展示的结构支架。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码目的多肽的一个或多个基因或基因盒，其通过与intimin的融合显示在细胞表面上，例如与肠道血管大肠杆菌Intimin的融合。EaeA蛋白质或其羧基末端截短(例如，如Wentzel等人，在肠出血性大肠杆菌IntiminEaeAJBacteriol的大肠杆菌K-12表面上展示乘客蛋白质中所述。2001年12月；183(24)：
7273-7284)。例如，侵袭素的N-末端489个氨基酸足以促进融合蛋白定位于细胞表面。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码目的多肽的一个或多个基因或基因盒，其通过与侵袭素的融合显示在细胞表面上，例如肠出血性大肠杆菌入侵，或羧基末端截短。例如，intimin的N-末端539个氨基酸足以促进融合蛋白的外膜定位(Liu等，肠出血性大肠杆菌的Tir结合区intimin足以在细菌诱导的宿主细胞后触发肌动蛋白缩合。信号传导；MolMicrobiol。1999年10月；34(1)：67-81)。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码目的多肽的一个或多个基因或基因盒，其通过与炭疽芽孢杆菌外部蛋白(BclA)的融合作为锚定基序展示在细胞表面上。BclA是一种外孢子蛋白，一种围绕炭疽芽孢杆菌孢子的毛发样蛋白。在非限制性实例中，目的多肽与BclA的N-末端结构域(21个氨基酸)的C-末端连接，例如，如Park等人所述。(通过炭疽芽孢杆菌的BclAexosporium在大肠杆菌上表面展示重组蛋白质)。
已经开发了各种其他锚定图案，包括OprF，OmpC和OmpX。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含编码目标多肽的一种或多种基因或基因盒，其通过与OprF，OmpC和OmpX的融合展示在细胞表面上。
在一些实施方式中，目标治疗性多肽永久性地展示在遗传工程化细菌的细胞表面上。在一些实施方式中，目标治疗性多肽瞬时展示在遗传工程化细菌的细胞表面上。
在一些实施方式中，治疗性多肽展示在例如本文所述的菌株中，其显示出渗漏表型。此类菌株在编码将外膜连接至肽聚糖骨架的蛋白质的一种或多种基因中具有失活突变，例如，lpp，ompC，ompA，ompF，tolA，tolB，pal和/或编码周质的一种或多种基因。蛋白酶，例如degS，degP，nlpl。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含侵袭素展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:990的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含LppOmpA展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:991的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含intiminN展示标签的治疗性多肽的基因序列。在一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码包含SEQ ID NO:992的多肽的基因序列。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含显示锚，其与选自SEQ ID NO:990，SEQID NO:991和SEQ ID NO:992的序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同源性。在另一个实施方式中，遗传工程化细菌包含编码展示锚的基因序列，所述展示锚包含选自SEQ ID NO:990，SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:992的序列。在另一个实施方式中，由遗传工程化细菌表达的展示锚由选自SEQ ID NO:990，SEQ ID NO:991和SEQ ID NO:992的序列组成。
在一些实施方式中，一种或多种ScFv显示在细菌细胞表面上，单独或与其他感兴趣的治疗性多肽组合。
在一些实施方式中，细胞表面展示策略或回路与一种细菌中的分泌策略或回路组合。在一些实施方式中，显示和分泌相同的多肽。在一些实施方式中，展示第一多肽并分泌第二多肽。在一些实施方式中，显示策略或回路策略与用于细胞内产生酶并因此其底物的细胞内分解代谢的回路组合。在一些实施方式中，显示策略或显示回路与用于细胞内产生肠屏障增强剂分子和/或抗炎效应分子的回路组合。
在一些实施方式中，表面展示的多肽或融合蛋白的表达由诱导型启动子驱动。在一些实施方式中，诱导型启动子是氧水平依赖性启动子(例如，FNR诱导型启动子)。在一些实施方式中，诱导型启动子由肠道特异性和/或肿瘤特异性或由炎症或炎症反应(RNS，ROS启动子)诱导的启动子诱导，或由可能或可能不是天然存在的代谢物诱导的启动子诱导(例如，可以外源添加)在肠中，例如，阿拉伯糖。在备选实施方式中，表面展示的多肽或多肽融合蛋白的表达由组成型启动子驱动。
在一些实施方式中，表面展示的多肽或融合蛋白的表达是基于质粒的。在一些实施方式中，编码用于表面展示的抗体或scFv片段的基因序列是染色体插入的。
必需基因，营养缺陷型，杀伤开关和宿主质粒依赖性
如本文所用，术语“必需基因”是指细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以通过定向缺失基因和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见，例如，Zhang和Lin，2009，DEG5.0，一个必需的数据库)。原核生物和真核生物中的基因，核酸。AcidsRes。，37：D455-D458和Gerdes等，Essentialgenesonmetabolicmaps，Curr。奥平。Biotechnol。，17(5)：448-456，其中每一个的全部内容通过引用明确地并入本文中)。
在其他实施方式中，营养缺陷型修饰也可用于筛选产生抗癌分子的突变细菌。
“必需基因”可能取决于生物体所处的环境和环境。例如，必需基因的突变，修饰或切除可导致本公开的重组细菌成为营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。
营养缺陷型修饰旨在使细菌在没有外源添加的生存或生长必需营养素的情况下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养素所必需的基因。在一些实施方式中，本文所述的任何基因工程化细菌还包含细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变。在一个实施方式中，必需基因是DNA合成基因，例如thyA。在另一个实施方式中，必需基因是细胞壁合成基因，例如dapA。在另一个实施方式中，必需基因是氨基酸基因，例如serA或MetA。可以靶向细胞存活和/或生长所需的任何基因，包括但不限于cysE，glnA，ilvD，leuB，lysA，serA，metA，glyA，hisB，ilvA，pheA，proA，thrC，trpC，tyrA，只要相应的野生型基因产物不在细菌中产生，thyA，uraA，dapA，dapB，dapD，dapE，dapF，flhD，metB，metC，proAB和thi1。示例性细菌基因可被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株，如在2017年11月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中所述，公开为WO2017/123675，其内容通过引用并入本文。整体。这些包括但不限于寡核苷酸合成，氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因。引入ThyA营养缺陷型的方法的非限制性实例描述于2017年11月1日提交的专利申请PCT/US2017/013072的实施例63，公开号为WO2017/123675，其内容通过引用并入本文。整个。
在一些实施方式中，本公开的基因工程化细菌是合成的配体依赖性必需基因(SLiDE)细菌细胞。SLiDE细菌细胞是合成的营养缺陷型，在一种或多种必需基因中发生突变，只在特定配体存在下生长(参见Lopez和Anderson“用于BL21的配体依赖性必需基因的合成营养生长因子”(DE3生物安全株)，ACS合成Biology(2015)DOI：10.1021/acssynbio.5b00085，其全部内容通过引用明确并入本文)。
在一些实施方式中，SLiDE细菌细胞包含必需基因中的突变。在一些实施方式中，必需基因选自pheS，dnaN，tyrS，metG和adk。在一些实施方式中，必需基因是dnaN，其包含一个或多个以下突变：H191N，R240C，I317S，F319V，L340T，V347I和S345C。在一些实施方式中，必需基因是dnaN之间包含突变H191N，R240C，I317S，F319V，L340T，V347I，和S345C。在一些实施方式中，必需基因是包含下列突变中的一个或多个PHES：F125G，P183T，P184A，R186A，和I188L。在一些实施方式中，必需基因是包含突变F125G，P183T，P184A，R186A，和I188LPHES。在一些实施方式中，必需基因是tyrS，其包含一个或多个以下突变：L36V，C38A和F40G。在一些实施方式中，必需基因是包含突变L36V，C38A，和F40GtyrS。在一些实施方式中，必需基因是metG，其包含一个或多个以下突变：E45Q，N47R，I49G和A51C。在一些实施方式中，必需基因是metG，其包含突变E45Q，N47R，I49G和A51C。在一些实施方式中，必需基因是ADK包含下列突变中的一个或多个：I4L，L5I，和L6G。在一些实施方式中，必需基因ADK包含突变I4L，L5I，和L6G。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌由配体补充。在一些实施方式中，配体选自苯并噻唑，吲哚，2-氨基苯并噻唑，吲哚-3-丁酸，吲哚-3-乙酸和L-组氨酸甲酯。例如，包含metG(E45Q，N47R，I49G和A51C)突变的细菌细胞由苯并噻唑，吲哚，2-氨基苯并噻唑，吲哚-3-丁酸，吲哚-3-乙酸或L-组氨酸甲酯补充。包含dnaN突变的细菌细胞(H191N，R240C，I317S，F319V，L340T，V347I和S345C)由苯并噻唑，吲哚或2-氨基苯并噻唑补充。包含pheS突变的细菌细胞(F125G，P183T，P184A，R186A和I188L)由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。包含tyrS(L36V，C38A和F40G)突变的细菌细胞由苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。包含adk(I4L，L5I和L6G)突变的细菌细胞由苯并噻唑或吲哚补充。
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含一种以上的突变必需基因，其使其对配体营养缺陷。在一些实施方式中，细菌细胞包含两个必需基因的突变。例如，在一些实施方式中，细菌细胞包含tyrS(L36V，C38A和F40G)和metG(E45Q，N47R，I49G和A51C)中的突变。在其他实施方式中，细菌细胞包含三种必需基因中的突变。例如，在一些实施方式中，细菌细胞包含tyrS(L36V，C38A和F40G)，metG(E45Q，N47R，I49G和A51C)和pheS(F125G，P183T，P184A，R186A和I188L)中的突变。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌还包含灭活开关。合适的杀灭开关在2016年6月24日提交的国际专利申请PCT/US2016/39427中描述，公开为WO2016/210373，其内容通过引用整体并入本文。杀伤开关旨在主动杀死工程微生物以响应外部刺激。与细菌死亡的营养缺陷型突变相反，因为它们缺乏生存所必需的营养物质，杀灭开关由环境中的特定因子触发，该因子诱导微生物中产生导致细胞死亡的毒性分子。
在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌还包含经过修饰以产生宿主-质粒相互依赖性的质粒。在某些实施方式中，相互依赖的宿主-质粒平台如Wright等，2015中所述。在一些实施方式中，生物安全系统包含基于质粒和染色体整合的组分。在非限制性实例中，基于质粒的组分可包含一种或多种选自SEQ ID NO:997-1001的基因序列或选自SEQ IDNO:1002-1004的多肽序列，并且染色体整合的组分可包含一种或多种选择的基因序列。来自SEQ ID NO:1005-1010。这些和其他系统和平台在2017年11月1日提交的国际专利申请PCT/US2017/013072中描述，公开为WO2017/123675，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含与一种或多种生物安全质粒组合的整合到细菌染色体中的一种或多种生物安全构建体。在一些实施方式中，质粒包含条件复制起点(COR)，质粒复制起始蛋白以反式提供，即由染色体整合的生物安全构建体编码。在一些实施方式中，将染色体整合的构建体进一步引入宿主中，从而产生营养缺陷型(例如，dapA或thyA营养缺陷型)，其又由生物安全性质粒构建体表达的基因产物补充。在一些实施方式中，生物安全性质粒进一步编码广谱毒素(例如，Kis)，而整合的生物安全性构建体编码抗毒素(例如，抗Kis)，允许质粒在含有两种构建体的细菌细胞中繁殖。
在本文所述的任何实施方式中，遗传改造的微生物包含基因序列或突变，其提供一种或多种调节机制，例如用于抑制，选自营养缺陷型杀伤开关或宿主-质粒依赖性。
遗传调控回路
在一些实施方式中，遗传工程化细菌包含用于表达本文所述构建体的多层遗传调节回路。合适的多层遗传调节回路描述于2016年6月24日提交的国际专利申请PCT/US2016/39434，公布为WO2016/210378。其内容通过引用整体并入本文。遗传调节回路可用于筛选产生抗癌分子或营养营养缺陷型的突变细菌。在某些实施方式中，本发明提供了用于选择产生一种或多种目的基因的基因工程化细菌的方法。
药物组合物和制剂
包含本发明的基因工程微生物的药物组合物可用于治疗，控制，改善和/或预防癌症。本发明的药物组合物包含一种或多种基因工程化细菌，和/或一种或多种基因工程OV，单独或与预防剂，治疗剂和/或药学上可接受的载体组合。
在某些实施方式中，药物组合物包含一种物种，菌株或亚型细菌，其经工程改造以包含本文所述的遗传修饰，例如编码一种或多种抗癌分子的一种或多种基因。在备选实施方式中，药物组合物包含两种或更多种细菌，菌株和/或细菌亚型，其各自经工程改造以包含本文所述的遗传修饰，例如编码一种或多种抗癌分子的一种或多种基因。
在一些实施方式中，基因工程化细菌作为孢子全身或肿瘤内施用。作为非限制性实例，遗传工程化细菌是梭菌，并且施用导致肿瘤内缺氧/坏死区域的选择性定植。在一些实施方式中，孢子仅在存在于实体瘤中的缺氧/坏死区域中萌发，而在体内其他任何地方都不发芽。
本发明的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成药用组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co.，Easton，PA)。在一些实施方式中，将药物组合物进行压片，冷冻干燥，直接压片，常规混合，溶解，制粒，研磨，乳化，包封，包埋或喷雾干燥，以形成片剂，颗粒，纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊，微片，丸剂。或粉末，可以是肠溶包衣或未包衣的。适当的配方取决于给药途径。
基因工程微生物可以以任何合适的剂型配制成药物组合物(例如，用于口服给药的液体，胶囊，小药囊，硬胶囊，软胶囊，片剂，肠溶衣片剂，悬浮粉末，颗粒或基质缓释形式)。并且用于任何合适类型的给药(例如，口服，局部，注射，静脉内，皮下，肿瘤内，肿瘤周围，立即释放，脉冲释放，延迟释放或持续释放)。基因工程化细菌的合适剂量可以为约104至1012个细菌。组合物可以每天，每周或每月施用一次或多次。可以在餐前，餐中或餐后施用组合物。在一个实施方式中，药物组合物在受试者进餐前施用。在一个实施方式中，药物组合物目前与膳食一起施用。在一个实施方式中，药物组合物在受试者吃饭后施用。
基因工程化细菌或基因工程病毒可以配制成药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体，增稠剂，稀释剂，缓冲剂，缓冲剂，表面活性剂，中性或阳离子脂质，脂质复合物，脂质体，渗透促进剂，载体化合物和其他药学上可接受的载体或药剂。例如，药物组合物可包括但不限于添加碳酸氢钙，碳酸氢钠，磷酸钙，各种糖和类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇和表面活性剂，包括，例如，聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，本发明的基因工程化细菌可以配制在碳酸氢钠溶液中，例如1摩尔碳酸氢钠溶液(以缓冲酸性细胞环境，例如胃)。可以施用基因工程化细菌并配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，和那些与阳离子形成的盐，例如衍生自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙胺的阳离子，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等
遗传工程微生物可以静脉内施用，例如通过输注或注射。或者，基因工程微生物可以通过肿瘤内和/或肿瘤周围给药。在其他实施方式中，遗传工程微生物可以动脉内，肌肉内或腹膜内施用。在一些实施方式中，基因工程化细菌定殖肿瘤的约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。在一些实施方式中，遗传工程化细菌与聚乙二醇化形式的rHuPH20(PEGPH20)或其他试剂共同施用，以破坏肿瘤隔膜，以增强肿瘤囊，胶原和/或基质的渗透。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够产生抗癌分子以及一种或多种降解纤维组织的酶。
本公开内容的基因工程微生物可以通过瘤内注射施用，产生直接沉积在靶肿瘤内的细菌或病毒。肿瘤内注射工程化细菌或病毒可引起有效的局部炎症反应以及针对肿瘤细胞的适应性免疫应答。将细菌或病毒悬浮在溶液中，然后将其取出到1ml注射器中。在一些实施方式中，用18号多针针(Quadra-Fuse，RexMedical)注射肿瘤。注射部位是无菌制备的。如果可用，可以使用超声或CT来鉴定注射用肿瘤的坏死区域。如果未识别出坏死区域，则可以将注射引导至肿瘤的中心。将针插入预定区域一次，并均匀分配压力。缓慢取出注射针，并对注射部位进行消毒。
与静脉内施用相比，将本发明的基因工程化细菌或病毒直接瘤内注射到实体瘤中可能是有利的。使用静脉注射方法，只有一小部分细菌可能到达目标肿瘤。例如，在大肠杆菌Nissle注入4T1荷瘤小鼠的尾静脉后，大多数细菌(>99％)迅速从动物身上清除，只有一小部分施用的细菌在肿瘤中定殖(Stritzker等。，2007)。特别地，在与小鼠相比具有相对大的血容量和相对小的肿瘤的大型动物和人类患者中，肿瘤内注射可能是特别有益的。直接注射到肿瘤中允许递送更高浓度的治疗剂并避免可由全身给药引起的毒性。此外，细胞瘤内注射诱导肿瘤内强烈和局部的免疫反应。
取决于位置，肿瘤类型和肿瘤大小，可以使用不同的施用技术，包括但不限于皮肤，皮下和经皮注射，治疗性内窥镜超声波检查或支气管内肿瘤内递送。在肿瘤内给药程序之前，进行镇静与局部麻醉和标准心脏，压力和氧气监测，或患者的全麻醉。
对于一些肿瘤，可以采用经皮注射，这是侵入性最小的给药方法。超声，计算机断层扫描(CT)或荧光检查可用作引导和定位针的引导。例如，在Lencioni等人，2010中描述了经皮肿瘤内注射用于肝细胞癌。肿瘤内，皮下和淋巴结肿瘤的肿瘤内注射例如在WO/2014/036412(Amgen)中描述，用于晚期黑素瘤。
单个插入点或多个插入点可用于经皮注射方案。使用单个插入点，可以沿着多个轨道经皮注射溶液，只要针的径向范围允许。在其他实施例中，如果肿瘤大于针的径向范围，则可以使用多个注射点。针可以在不离开的情况下被拉回，并且根据需要重新定向直到注射和分散全剂量。为了保持无菌状态，每次注射使用单独的针头。针的大小和长度取决于肿瘤类型和大小。
在一些实施方式中，用18号多针针(Quadra-Fuse，RexMedical)经皮注射肿瘤。该装置由一个20厘米长的18号穿刺针组成。针头有三个可伸缩的插脚，每个插头有四个端子侧孔和一个带延长管夹的连接器。尖头从针的侧壁展开。针可以经皮引入肿瘤的中心，并且可以定位在肿瘤的最深边缘。尖头部署在肿瘤的边缘。尖头以最大长度展开，然后以规定的间隔缩回。可选地，可以执行一个或多个旋转-注射-旋转操纵，其中，尖头缩回，针旋转60度，然后重复展开尖头和另外的注射。
治疗性内镜超声检查(EUS)用于克服获得某些其他肿瘤的固有解剖学限制(Shirley等，2013)。EUS引导下的细针注射(EUS-FNI)已成功用于治疗头颈部，食管，胰腺，肝脏和肾上腺肿块的抗肿瘤治疗(Verna等，2008)。EUS-FNI已被广泛用于胰腺癌注射。细针注射需要使用曲线回声镜。小心插管食管，将回声内窥镜送入发生胰腺检查的胃和十二指肠，并确定目标肿瘤。测量最大平面以估计肿瘤体积并计算注射体积。将适当的体积吸入注射器中。将准备好的22号细针抽吸(FNA)针头送入回声镜的工作通道。在超声引导下，针头进入肿瘤。根据肿瘤的大小，可以通过将肿瘤分成切片然后将相应的体积部分注射到每个切片中来进行给药。使用安装有多普勒技术的内窥镜超声处理器确保没有动脉或静脉结构可能干扰针进入肿瘤(Shirley等，2013)。在一些实施方式中，与直型针相比，EUS-FNI的“多次注射针”(MIN)可用于改善肿瘤的注射分布(Ohara等，2013)。
如Celikoglu等人，2008中所述，可以通过支气管内肿瘤内递送方法实现肺癌的瘤内施用，例如非小细胞肺癌。进行支气管镜检查(经鼻或口腔)以观察待治疗的病变。可以通过支气管表面上的可见长度-宽度高度测量来目测估计肿瘤体积。然后通过支气管镜的工作通道引入针装置。由连接到塑料导管的金属针组成的针导管放置在护套内，以防止在推进过程中针对工作通道的损坏。针的大小和长度是变化的，并根据肿瘤的类型和大小确定。由塑料制成的针头比金属针头的刚性小，并且是理想的，因为它们可以在工作通道中绕过更尖锐的弯曲。将针插入病变部位并注射本发明的基因工程化细菌。在几个插入点处重复插入针，直到完全灌注肿瘤块。每次注射后，针头完全从肿瘤中取出，然后嵌入另一个位置。在支气管镜注射期结束时，可以使用机械解剖或伴随灌洗和抽吸的其他消融技术去除由治疗引起的任何坏死碎片的移除。
在一些实施方式中，使用包括但不限于经皮注射，EUS-FNI或支气管内肿瘤内递送方法的方法将能够将免疫调节剂递送至靶肿瘤的基因工程化细菌或病毒直接施用于肿瘤。在某些情况下，其他技术，如腹腔镜或开放手术技术被用于进入目标肿瘤，然而，这些技术更具侵入性，并带来更大的发病率和更长的住院时间。
在一些实施方式中，将细菌(例如大肠杆菌Nissle)或孢子(例如诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)NT)溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用于全身或肿瘤内注射。
要注射的剂量来源于肿瘤的类型和大小。本发明的药物或基因工程化细菌或病毒的剂量通常比全身静脉内给药的剂量低，例如低几个数量级。
注入每个病变的体积基于肿瘤的大小。为了获得肿瘤体积，可以进行最大平面的测量。然后，估计的肿瘤体积可以将注射体积的确定通知为总体积的百分比。例如，可以使用总肿瘤体积的约20-40％的注射体积。
例如，如WO/2014/036412(Amgen)中所述，对于其最大尺寸大于5cm的肿瘤，可注射至多4ml。对于最大尺寸为2.5至5厘米的肿瘤，可注射最多2毫升的肿瘤。对于最大尺寸为2.5至5厘米的肿瘤，可注射最多2毫升的肿瘤。对于最大尺寸在1.5到2.5厘米之间的肿瘤，可以注射高达1毫升的肿瘤。对于最大尺寸在0.5和1.5厘米之间的肿瘤，可以注射高达0.5毫升的肿瘤。对于最大尺寸等于或小于0.5的肿瘤，可注射高达0.1ml的肿瘤。或者，超声扫描可用于确定肿瘤可以吸收的注射体积而不会泄漏到周围组织中。
在一些实施方式中，治疗方案将包括一次或多次瘤内施用。在一些实施方式中，治疗方案将包括初始剂量，其后是至少一个后续剂量。可以在两个或更多个循环中顺序施用一个或多个剂量。
例如，第一剂可以在第1天施用，第二剂可以在1,2,3,4,5,6天，1,2,3或4周后或更长的间隔后施用。另外的剂量可以在1,2,3,4,5,6天后或1,2,3或4周或更长的间隔后施用。在一些实施方式中，第一次和随后的施用具有相同的剂量。在其他实施方式中，施用不同剂量。在一些实施方式中，每天施用超过一个剂量，例如，可以每天施用两次，三次或更多次剂量。
所描述的给药途径和剂量仅用作指导。最佳给药途径和剂量可由熟练的从业者容易地确定。剂量可根据各种参数确定，尤其是根据肿瘤的位置，肿瘤的大小，待治疗患者的年龄，体重和状况以及给药途径和方法。
在一个实施方式中，梭菌孢子全身递送。在另一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送梭菌孢子。在一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送大肠杆菌Nissle。在其他实施方式中，已知通过静脉内注射或口服施用已知可磨损肿瘤的大肠杆菌Nissle，如例如Danino等人的小鼠模型中所述。2015年，或Stritzker等人，2007，其内容通过引用整体并入本文。用于降低毒性的大肠杆菌Nissle突变包括但不限于导致非豆蔻酰化LPS和降低内毒素活性的msbB突变体，如Stritzker等人，2010中所述(Stritzker等，BioengineeredBugs1：2,139-145)。；益生菌大肠杆菌Nissle1917的肉豆蔻酸化阴性msbB-突变体保留肿瘤特异性定植特性，但在免疫活性小鼠中显示较少的副作用。
对于静脉内注射，优选的细菌剂量是在肿瘤中发现最多细菌的剂量和在其他组织中发现的最低量。在小鼠中，Stritzker等(InternationalJournalofMedicalMicrobiology297(2007)151-162；肿瘤特异性定植，组织分布和大肠杆菌Nissle1917在活小鼠中的基因诱导)发现成功肿瘤所需的细菌数量最少定植为2×104CFU，其中一半小鼠显示肿瘤定植。注射2×105和2×106CFU导致所有肿瘤的定植，并且肿瘤中的细菌数量增加。然而，在较高浓度下，细菌计数在肝脏和脾脏中变得可检测到。
在一些实施方式中，本发明的基因工程微生物可以口服给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌可用于预防，治疗或控制肝癌或肝转移。例如，Danino等人表明口服大肠杆菌Nissle能够通过在肝转移的小鼠模型中穿过胃肠道来定植肝转移灶(Danino等，可编程益生菌用于检测尿液中的癌症)。ScienceTranslationalMedicine，7(289)：1-10，其内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，通过肿瘤内注射递送基因工程微生物微生物。在一个实施方式中，遗传工程微生物微生物是胸腔内输送的。在一个实施方式中，遗传工程微生物皮下注射。在一个实施方式中，遗传工程微生物静脉注射。在一个实施方式中，遗传工程改造的微生物在胸膜内递送。
本发明的工程化细菌或病毒在肿瘤内递送的肿瘤类型包括局部晚期和转移性肿瘤，包括但不限于B，T和NK细胞淋巴瘤，结肠和直肠癌，黑素瘤，包括转移性黑素瘤，真菌病。真菌，Merkel癌，肝癌，包括继发于结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，滤泡性淋巴瘤，前列腺癌，难治性肝癌和Merkel细胞癌的肝细胞癌和肝转移。
本文公开的基因工程微生物可以局部给药并以软膏，乳膏，透皮贴剂，洗剂，凝胶，洗发剂，喷雾剂，气溶胶，溶液，乳剂或本领域技术人员熟知的其他形式配制。参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA。在一个实施方式中，对于不可喷雾的局部剂型，使用粘性至半固体或固体形式，其包含载体或一种或多种与局部施用相容并且动态粘度大于水的赋形剂。合适的制剂包括但不限于溶液，悬浮液，乳液，乳膏，软膏，粉末，搽剂，油膏等，其可以用助剂灭菌或混合(例如，防腐剂，稳定剂，润湿剂，缓冲剂，或盐)用于影响各种性质，例如渗透压。其它合适的局部剂型包括可喷雾气溶胶制剂，其中活性成分与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如气态推进剂，如氟利昂)或挤压瓶混合包装。保湿剂或保湿剂也可以加入药物组合物和剂型中。这些另外的成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方式中，可以将包含本发明的重组细菌的药物组合物配制成卫生产品。例如，卫生产品可以是抗菌制剂，或发酵产品，例如发酵液。卫生产品可以是例如洗发剂，护发素，乳膏，糊剂，乳液和润唇膏。
本文公开的基因工程微生物可以口服给药并配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等。口服使用的药物组合物可以使用固体赋形剂制备，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素组合物，例如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。还可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
片剂或胶囊可通过常规方法用药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蔗糖，葡萄糖，山梨糖醇，淀粉，树胶，高岭土和黄蓍胶)制备。填料(例如，lactose，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙，铝，锌，硬脂酸，聚乙二醇，十二烷基硫酸钠，淀粉，苯甲酸钠，L-亮氨酸，硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉，马铃薯淀粉，羟基乙酸淀粉钠，糖，纤维素衍生物，二氧化硅粉末)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法包衣。可以存在涂层壳，并且常见的膜包括但不限于聚丙交酯，聚乙醇酸，聚酐，其他可生物降解的聚合物，藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(APA)，藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(A-PMCG-A)，甲基丙烯酸羟甲酯(HEMA-MMA)，多层HEMA-MMA-MAA，聚丙烯腈(PAN-PVC)，丙烯腈/甲基烯丙基磺酸钠(AN-69)，聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5)/PDMS)，聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)，硅质包封物，硫酸纤维素/海藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(CS/A/PMCG)，醋酸邻苯二甲酸纤维素，海藻酸钙，k-角叉菜胶-刺槐豆胶凝胶珠，结冷胶-黄原胶珠，聚(丙交酯-共-乙交酯)，角叉菜胶，淀粉聚酸酐，淀粉聚甲基丙烯酸酯，聚氨基酸和肠溶衣聚合物。
在一些实施方式中，将基因工程化细菌肠溶包衣以释放到肠道或肠道的特定区域，例如大肠中。从胃到结肠的典型pH曲线是约1-4(胃)，5.5-6(十二指肠)，7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，可以修改pH曲线。在一些实施方式中，涂层在特定pH环境中降解以指定释放位点。在一些实施方式中，使用至少两种涂层。在一些实施方式中，外涂层和内涂层在不同的pH水平下降解。
在一些实施方式中，可以在一个或多个涂层(例如，外层，内层和/或中间涂层)中使用肠溶包衣材料。肠溶包衣的聚合物在低pH下保持非离子化，因此保持不溶。但随着胃肠道中pH的增加，酸性官能团能够电离，并且聚合物溶胀或变得可溶于肠液中。
用于肠溶包衣的材料包括醋酸纤维素邻苯二甲酸酯(CAP)，聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯)，醋酸偏苯三酸纤维素(CAT)，聚邻苯二甲酸乙酸乙烯酯(PVAP)和邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)，脂肪酸，蜡，紫胶(褐藻酸酯)，塑料和植物纤维。另外，还使用玉米醇溶蛋白，Aqua-Zein(不含醇的水性玉米醇溶蛋白制剂)，直链淀粉和淀粉衍生物，以及糊精(例如麦芽糖糊精)。其他已知的肠溶包衣包括乙基纤维素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸邻苯二甲酸直链淀粉酯，乙酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯。
涂料聚合物还可包含一种或多种邻苯二甲酸酯衍生物，CAT，HPMCAS，聚丙烯酸衍生物，包含丙烯酸和至少一种丙烯酸酯的共聚物，EudragitTMS(聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1：2)；EudragitL100TMS(聚(甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯)1：1)；EudragitL30DTM，(聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1：1)；和(EudragitL100-55)(聚(甲基丙烯酸，丙烯酸乙酯)1：1)(EudragitTML是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯合成的阴离子聚合物)，聚甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸和丙烯酸酯共聚物混合，海藻酸，海藻酸铵，海藻酸钠，钾，镁或钙，乙酸乙烯酯共聚物，聚乙酸乙烯酯30D(30％在水中的分散体)，包含聚(二甲基氨基乙基丙烯酸酯)的中性甲基丙烯酸酯(“EudragitETM”)，甲基丙烯酸甲酯的共聚物丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸三甲基铵乙酯，甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸乙酯的共聚物，玉米醇溶蛋白，虫胶，树胶或多糖，或其组合。
涂层还可包括含有羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基乙基纤维素(HPEC)，羟丙基纤维素(HPC)，羟丙基乙基纤维素(HPEC)，羟甲基丙基纤维素(HMPC)，乙基羟乙基纤维素(EHEC)(乙基纤维素)，羟乙基甲基纤维素(HEMC)，羟甲基乙基纤维素(HMEC)的聚合物。，丙基羟乙基纤维素(PHEC)，甲基羟乙基纤维素(MHEC)，疏水改性羟乙基纤维素(NEXTON)，羧甲基羟乙基纤维素(CMHEC)，甲基纤维素，乙基纤维素，水溶性乙酸乙烯酯共聚物，树胶，多糖如海藻酸和藻酸盐如海藻酸铵，钠藻酸盐，海藻酸钾，碳酸酯邻苯二甲酸酯，醋酸直链淀粉邻苯二甲酸酯，醋酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)，邻苯二甲酸纤维素酯，邻苯二甲酸纤维素醚，邻苯二甲酸羟丙基纤维素(HPCP)，邻苯二甲酸羟丙基乙基纤维素(HPECP)，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMC)P)，乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(HPMCAS)。
在一些实施方式中，将基因工程微生物肠溶包衣以释放到肠或肠的特定区域，例如大肠。从胃到结肠的典型pH曲线是约1-4(胃)，5.5-6(十二指肠)，7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，可以修改pH曲线。在一些实施方式中，涂层在特定pH环境中降解以指定释放位点。在一些实施方式中，使用至少两种涂层。在一些实施方式中，外涂层和内涂层在不同的pH水平下降解。
用于口服给药的液体制剂可以采用溶液，糖浆，悬浮液或干燥产品的形式，在使用前用水或其它合适的载体配制。这些液体制剂可以通过常规方法用药学上可接受的试剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)制备；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如杏仁油，油性酯，乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂也可以适当含有缓冲盐，调味剂，着色剂和甜味剂。口服给药的制剂可以适当地配制用于本文所述的基因工程微生物的缓释，控释或持续释放。
在一个实施方式中，本公开内容的基因工程微生物可以配制成适于给予儿科受试者的组合物。如本领域中公知的，儿童与成人在许多方面有所不同，包括胃排空，pH值，胃肠道渗透性等的不同的速率(Ivanovska等，Pediatrics，134(2)：361-372,2014)。此外，儿科制剂的可接受性和偏好，例如给药途径和味道属性，对于实现可接受的儿科依从性是至关重要的。因此，在一个实施方式中，适于给予儿科受试者的组合物可包括易于吞咽或可溶解的剂型，或更可口的组合物，例如具有添加的调味剂，甜味剂或味道阻滞剂的组合物。在一个实施方式中，适合给予儿科受试者的组合物也适合于对成人给药。
在一个实施方式中，适于给予儿科受试者的组合物可包括溶液，糖浆，悬浮液，酏剂，用于重构的悬浮液或溶液的粉末，可分散/泡腾片剂，可咀嚼片剂，粘性的糖果，棒棒糖，冷冻流行，锭剂，口香糖，口服薄条，口腔崩解片，小袋，软明胶胶囊，撒口服粉剂或颗粒剂。在一个实施方式中，该组合物是胶状糖果，其由明胶基质制成，赋予糖果弹性，所需的耐嚼稠度和更长的保质期。在一些实施方式中，胶粘糖果还可包含甜味剂或调味剂。
在一个实施方式中，适合给予儿科受试者的组合物可包括调味剂。如本文所用，“香料”是为制剂提供独特味道和香味的物质(液体或固体)。香料还有助于改善配方的适口性。香料包括但不限于草莓，香草，柠檬，葡萄，泡泡糖和樱桃。
在某些实施方式中，基因工程微生物可以口服给药，例如，用惰性稀释剂或可同化的食用载体。该化合物也可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入受试者的饮食中。对于口服治疗给药，化合物可与赋形剂混合并以可摄入的片剂，口含片，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂等形式使用。为了通过肠胃外给药以外的方式给药化合物，可能需要用化合物包被化合物或与化合物共同给药以防止其失活。
在另一个实施方式中，包含本发明的重组细菌的药物组合物可以是可食用产品，例如食品。在一个实施方式中，食品是牛奶，浓缩牛奶，发酵乳(酸奶，酸奶，冷冻酸奶，乳酸菌发酵饮料)，奶粉，冰淇淋，奶油奶酪，干奶酪，豆浆，发酵豆浆。，蔬菜果汁，果汁，运动饮料，糖果，糖果，婴儿食品(如婴儿蛋糕)，营养食品，动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方式中，食品是发酵食品，例如发酵乳制品。在一个实施方式中，发酵乳制品是酸奶。在另一个实施方式中，发酵乳制品是奶酪，牛奶，奶油，冰淇淋，奶昔或克非尔。在另一个实施方式中，将本发明的重组细菌组合在含有旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方式中，食品是饮料。在一个实施方式中，饮料是基于果汁的饮料或含有植物或草药提取物的饮料。在另一个实施方式中，食品是果冻或布丁。适用于施用本发明重组细菌的其他食品是本领域熟知的。例如，参见US2015/0359894和US2015/0238545，其中每个的全部内容通过引用明确并入本文。在另一个实施方式中，将本发明的药物组合物注射，喷洒或撒在食品上，例如面包，酸奶或奶酪。
在一些实施方式中，通过肠溶包衣或未包衣的纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊或微片剂，将组合物配制用于肠内给药，空肠内给药，十二指肠内给药，内部给药，胃分流给药或宫内给药。药物组合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，使用例如常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。该组合物可以是油性或水性载体中的悬浮液，溶液或乳液，并且可以含有悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
本文所述的基因工程微生物可以鼻内给药，以气溶胶形式，喷雾剂，雾剂或液滴形式配制，并且以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体)。可以通过提供递送计量量的阀来确定加压气溶胶剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶)，其含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
遗传工程微生物可以作为贮库制剂给药和配制。这种长效制剂可以通过植入或注射给药，包括静脉内注射，皮下注射，局部注射，直接注射或输注。例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
在一些实施方式中，本文公开了单一剂型的药学上可接受的组合物。单剂量形式可以是液体或固体形式。单剂量形式可以直接给予患者而无需修改，或者可以在给药前稀释或重构。在某些实施方式中，单一剂型可以以大丸剂形式施用，例如单次注射，单次口服剂量，包括包含多个片剂，胶囊，丸剂等的口服剂量。在备选实施方式中，单一剂型可以在一段时间内施用，例如通过输注。
药物组合物的单剂型可通过将药物组合物分成较小等分试样，单剂量容器，单剂量液体形式或单剂量固体形式制备，例如片剂，颗粒，纳米颗粒，纳米胶囊，微胶囊，微片，小丸，或粉末，可以是肠溶包衣或未包衣的。在给予患者之前，可以通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构固体形式的单剂量。
在其他实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，泵可用于实现控制或持续释放。在另一个实施方式中，聚合物材料可用于实现本公开内容的治疗的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酸酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的，不含可浸出的杂质，储存时稳定，无菌和可生物降解。在一些实施方式中，可以将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要一小部分全身剂量。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可以调整剂量方案以提供治疗反应。给药可取决于若干因素，包括疾病的严重性和反应性，给药途径，治疗的时间过程(数天至数月至数年)和改善疾病的时间。例如，可以一次施用单次推注，可以在预定时间段内施用几次分开的剂量，或者可以如治疗情况所示减少或增加剂量。剂量的规格取决于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果。剂量值可能随待缓解病症的类型和严重程度而变化。对于任何特定受试者，可以根据个体需要和治疗临床医生的专业判断随时间调整特定剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养或动物模型中的标准药学方法确定。例如，可以确定LD50，ED50，EC50和IC50，并且可以计算毒性和治疗效果之间的剂量比(LD50/ED50)作为治疗指数。可以使用表现出毒副作用的组合物，经过仔细修改以最小化潜在的损害以减少副作用。最初可以从细胞培养测定和动物模型估计剂量。从体外和体内测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。
成分单独或以单位剂量形式混合在一起供应，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物，在密封容器如安瓿或小袋中，表明活性剂的量。如果给药方式是注射，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前混合各成分。
药物组合物可以包装在气密密封的容器中，例如安瓿或小药囊，表明药剂的量。在一个实施方式中，一种或多种药物组合物作为干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物在密封容器中提供，并且可以重构(例如，用水或盐水)至适当的浓度以施用于受试者。在一个实施方式中，一种或多种预防或治疗剂或药物组合物作为干燥的无菌冻干粉末在密封的容器中提供，储存在2℃至8℃之间，并在1小时内，3小时内，5小时内给药。小时，6小时内，12小时内，24小时内，48小时内，72小时内，或重建后一周内。可以包括冷冻保护剂用于冻干剂型，主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其它合适的增量剂包括甘氨酸和精氨酸，其中任一种都可以以0-0.05％的浓度包含，和聚山梨醇酯-80(最佳地包括在0.005-0.01％的浓度下)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。药物组合物可以制备成可注射溶液，并且可以进一步包含可用作佐剂的试剂，例如用于增加吸收或分散的试剂，例如透明质酸酶。
在一些实施方式中，将基因工程微生物及其组合物配制用于静脉内施用，肿瘤内施用或肿瘤周围施用。遗传工程微生物可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入或注射给药。例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
在一些实施方式中，考虑到有效递送的需要和克服宿主抗病毒免疫应答，制备遗传工程化的OV用于递送。逃避抗病毒反应的方法包括施用不同的病毒血清型作为治疗方案的一部分(血清型转换)，制剂，例如聚合物包衣以掩盖病毒免于抗体识别和使用细胞作为递送载体。
在另一个实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方式中，泵可用于实现控制或持续释放。在另一个实施方式中，聚合物材料可用于实现本公开内容的治疗的受控或持续释放(参见例如美国专利号5,989,463)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)酸)，聚乙交酯(PLG)，聚酸酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)，和聚原酸酯。用于持续释放制剂的聚合物可以是惰性的，不含可浸出的杂质，储存时稳定，无菌和可生物降解。在一些实施方式中，可以将受控或持续释放系统置于预防或治疗靶标附近，因此仅需要一小部分全身剂量。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
本发明的基因工程化细菌可以以中性或盐形式给药和配制。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些，例如衍生自盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的那些，和那些与阳离子形成的盐，例如衍生自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙胺的阳离子，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等
治疗方法
本发明的另一方面提供了治疗癌症的方法。在一些实施方式中，本发明提供用于减少，改善或消除与癌症相关的一种或多种症状的方法。在一些实施方式中，癌症选自肾上腺癌，肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌(例如，尤文肉瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤)，脑癌(例如，星形细胞瘤)。，脑干胶质瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤)，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，乳腺癌，Castleman病，宫颈癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，胆囊癌，胃肠癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病，心脏癌，卡波西肉瘤，肾癌，喉癌，下咽癌，白血病(如急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病)，肝脏癌症，肺癌，淋巴瘤(如艾滋病相关淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，Hogkin淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤)，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔癌，鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌癌症，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌样瘤，唾液腺癌，肉瘤，皮肤癌(如基底细胞癌，黑色素瘤)，小肠癌，胃癌，畸胎瘤，睾丸癌，咽喉癌癌症，胸腺癌，甲状腺癌，不寻常的儿童癌症，尿道癌，子宫癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。在一些实施方式中，与其相关的症状包括但不限于贫血，食欲不振，膀胱内层刺激，出血和瘀伤(血小板减少症)，味觉或嗅觉改变，便秘，腹泻，口干，吞咽困难，水肿，疲劳，脱发(脱发)，感染，不孕，淋巴水肿，口腔溃疡，恶心，疼痛，周围神经病，蛀牙，尿路感染和/或记忆和注意力问题。
该方法可包括制备具有至少一种本文所述的基因工程物种，菌株或亚型细菌的药物组合物，并以治疗有效量将该药物组合物给予受试者。遗传改造的微生物可以局部施用，例如，肿瘤内或肿瘤周围施用到组织或供应容器中，或全身施用，例如通过输注或注射静脉内施用。在一些实施方式中，遗传工程化细菌通过静脉内，肿瘤内，动脉内，肌肉内，腹膜内，口服或局部给药。在一些实施方式中，遗传工程微生物通过静脉内给药，即全身给药。
在某些实施方式中，向受试者施用药物组合物减少了受试者中的细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积。在一些实施方式中，本公开的方法可以将细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积减少至少约10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％。与未治疗或对照受试者中的水平相比，75％，80％，85％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，通过在施用药物组合物之前和之后比较受试者中的细胞增殖，肿瘤生长和/或肿瘤体积来测量减少。在一些实施方式中，治疗或改善受试者中的癌症的方法允许癌症的一种或多种症状改善至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多。
在施用药物组合物之前，期间和之后，可以在生物样品中测量受试者中的癌细胞和/或生物标记物，例如血液，血清，血浆，尿液，腹膜液和/或来自的活组织检查。组织或器官。在一些实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的肿瘤体积减少至不可检测的大小，或小于约1％，2％，5％，10％，20％，25％，治疗前受试者肿瘤体积的30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％或90％。在其他实施方式中，所述方法可包括施用本发明的组合物以将受试者中的细胞增殖速率或肿瘤生长速率降低至不可检测的速率，或降低至小于约1％，2％，5％，10％，治疗前20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％或90％的比率。
对于表达基于免疫的抗癌分子的基因工程微生物，响应模式可能与传统的细胞毒性疗法不同。例如，用免疫疗法治疗的肿瘤可能在它们消退之前扩大，和/或可能出现新的病变(Agarwala等，2015)。肿瘤大小增加可能是由于肿瘤组织中通常不存在的淋巴细胞和巨噬细胞的严重浸润。另外，响应时间可能比与标准疗法相关的响应时间慢，例如细胞毒性疗法。在一些实施方式中，抗癌分子的递送可以调节受试者肿瘤的生长和/或改善癌症的症状，同时暂时增加肿瘤的体积和/或大小。
基因工程化细菌可以被破坏，例如，通过组织或血清中的防御因子(Sonnenborn等人，2009)，或通过激活杀灭开关，在施用后数小时或数天。因此，包含用于产生抗癌分子的基因或基因盒的药物组合物可以以治疗有效剂量和频率重新施用。在备选实施方式中，遗传工程化细菌在施用后数小时或数天内不被破坏，并且可以在肿瘤中繁殖并定殖肿瘤。
药物组合物可以单独施用或与一种或多种另外的治疗剂组合施用，例如化学治疗药物或检查点抑制剂，例如，如本文所述和本领域已知的。选择一种或多种另外的治疗剂的重要考虑因素是所述药剂应与本发明的基因工程化细菌相容，例如，所述药剂不得杀死细菌。在一些研究中，抗癌免疫疗法(例如CTLA-4或PD-1抑制剂)的功效需要在微生物组中存在特定的细菌菌株(Ilda等人，2013；Vetizou等人，2015；Sivan等人。，2015)。在一些实施方式中，包含细菌的药物组合物增强了检查点抑制剂或化学治疗剂的作用，例如，允许降低全身给药的化学治疗剂或免疫治疗剂的剂量。在一些实施方式中，药物组合物与一种或多种共生或益生菌一起施用，例如双歧杆菌或拟杆菌。
在一些实施方式中，基因工程化细菌依次，同时或随后与一种或多种化学治疗剂一起施用，所述化学治疗剂选自Trabectedin，Belotecan，Cisplatin，Carboplatin，Bevacizumab，Pazopanib，5-氟尿嘧啶，
Figure BDA0002194618080004901
和
Figure BDA0002194618080004902
在一些实施方式中，基因工程化细菌与吉西他滨(Gemzar)一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，基因工程化细菌依次，同时或随后与环磷酰胺给药一起施用。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，包含编码用于产生或消耗代谢物(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者)的酶的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后施用于给药。用一种或多种化学治疗剂。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂和细菌。在一些实施方式中，包含编码代谢转化体(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者)的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药一起施用。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于降解腺苷的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后给予化学治疗剂。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于食用犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与化学治疗剂给药。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消费者，犬尿氨酸消费者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂，例如，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比，％，95％或更多。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消费者，犬尿氨酸消费者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂，例如，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多与在相同条件下单独的化学疗法相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比，或更多。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消费者，犬尿氨酸消费者，精氨酸生产者，能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九与化疗相比，倍数，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独使用。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含用于产生免疫激活和引发效应子的基因序列，与化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。
在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，全身施用化学治疗剂和细菌。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码二乙二醇化环化酶或其他产生STING激动剂的酶的基因序列，与化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺)，例如，比较10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独进行化疗。在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比，更多或更多。在一些实施方式中，表达用于产生STING激动剂的腺苷酸环化酶或其他酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，与a相比，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独化疗。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述胞嘧啶脱氨酶用于将5-FC转化为5-FU的基因工程化细菌依次，同时或随后给予化学治疗剂。在一个实施方式中，化学治疗剂是环磷酰胺。
在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。(例如，环磷酰胺)，例如，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多与在相同条件下单独的化学疗法相比，或与相同亚型的未修饰细菌在相同条件下相比。
在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍更多。与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比更多或更多。在一些实施方式中，表达用于将5-FC转化为5-FU的胞嘧啶脱氨酶的基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍-折叠，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独进行化疗。
在一些实施方式中，包含编码本文所述的一种或多种腺苷降解酶的基因序列的一种或多种基因工程化细菌与本文所述的一种或多种化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌包含编码抗CD40抗体的基因序列，用于产生和分泌抗CD40抗体至细胞外环境中，所述细菌依次，同时或随后与一种或多种给药一起给药。本文所述的更多化学治疗剂。在另一个非限制性实例中，本文所述的一种或多种工程化细菌包含编码用于表面展示的抗CD40抗体的基因序列，与本文所述的一种或多种化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。在另一个非限制性实例中，包含编码透明质酸酶(用于分泌或表面展示)的基因序列的本文所述的一种或多种工程化细菌与本文所述的一种或多种化学治疗剂一起依次，同时或随后给药。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码抗CD40抗体的基因序列以及与编码用于降解腺苷的酶的基因序列组合，所述细菌依次，同时或随后施用。用本文所述的一种或多种化学治疗剂给药。在一些实施方式中，包含编码透明质酸酶的基因序列的一种或多种工程菌与编码用于降解腺苷的酶的基因序列组合，依次，同时或随后与一种或多种给药一起施用。本文所述的化学治疗剂。在一些实施方式中，由遗传工程化细菌编码的腺苷消耗酶包括add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC中的一种或多种。在一些实施方式中，由遗传工程化细菌编码的用于腺苷消耗的酶包含add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG中的一种或多种。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码抗CD40抗体的基因序列，用于表面展示或分泌，与编码用于降解腺苷的酶的基因序列组合，同时顺序施用，或随后用本文所述的一种或多种化学治疗剂给药。在一些实施方式中，依次施用本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列以及与编码透明质酸酶(用于表面展示或分泌)的基因序列的组合，同时或随后给予本文所述的一种或多种化学治疗剂。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码透明质酸酶的基因序列与编码用于降解腺苷的酶的基因序列和编码抗CD40抗体的基因序列的组合。对于表面展示或分泌，用本文所述的一种或多种化学治疗剂依次，同时或随后给药。在一个实施方式中，遗传工程菌包含编码一种或多种腺苷降解酶的基因序列或编码透明质酸酶的基因序列或编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列，单独或与本文所述的一种或多种化学治疗剂组合施用，用于治疗，控制或预防胰腺导管腺癌。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码一种或多种腺苷降解酶的基因序列，编码透明质酸酶的基因序列和编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列，单独或者与本文所述的一种或多种化学治疗剂组合，用于治疗，控制或预防胰腺导管腺癌。在任何这些实施方式中，一种或多种化学治疗剂全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，其中基因工程化细菌与化学治疗剂组合，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺)，例如，比较10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独进行化疗。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与在相同条件下单独化疗相比，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍或者与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十与在相同条件下或与未修饰的细菌相比的单独化疗相比，倍数，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多倍在相同条件下的相同亚型。
在一些实施方式中，包含编码一种或多种本文所述腺苷降解酶的基因序列的一种或多种基因工程化细菌与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，由遗传工程化细菌编码的腺苷消耗酶包括add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupC中的一种或多种。在一些实施方式中，由遗传工程化细菌编码的用于腺苷消耗的酶包含add，xapA，deoD，xdhA，xdhB和xdhC和nupG中的一种或多种。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列，与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码透明质酸酶用于分泌或表面展示的基因序列，与吉西他滨一起依次，同时或随后给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码抗CD40抗体的基因序列，用于表面展示或分泌，与编码用于降解腺苷的酶的基因序列组合，同时顺序施用，或随后用吉西他滨给药。在一个实施方式中，给予基因工程化细菌，其包含编码腺苷降解酶的基因序列和编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列，单独或与吉西他滨组合，用于治疗，管理或预防胰腺导管腺癌。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码抗CD40抗体的基因序列，用于与编码透明质酸酶的基因序列组合进行表面展示或分泌，依次，同时或随后给药。吉西他滨。在一个实施方式中，给予包含编码透明质酸酶的基因序列的基因工程化细菌和编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列，单独或与吉西他滨组合用于治疗，管理或预防胰腺。导管腺癌。在任何这些实施方式中，吉西他滨全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码透明质酸酶的基因序列，用于表面展示或分泌，与编码用于降解腺苷的酶的基因序列组合，依次，同时或随后施用。服用吉西他滨。在一个实施方式中，给予基因工程化细菌，其包含编码腺苷降解酶的基因序列和编码透明质酸酶的基因序列，用于表面展示或分泌，单独或与吉西他滨组合，用于治疗，管理或预防胰腺导管腺癌。在一个实施方式中，给予基因工程化细菌，其包含编码腺苷降解酶的基因序列和编码透明质酸酶的基因序列，用于表面展示或分泌，单独或与吉西他滨组合，用于治疗，管理或预防胰腺导管腺癌。在任何这些实施方式中，吉西他滨全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌包含编码透明质酸酶的基因序列，用于表面展示或分泌，与编码用于降解腺苷和编码抗CD40的基因序列的酶的基因序列组合。用于表面展示或分泌的抗体依次，同时或随后与吉西他滨给药一起施用。在一个实施方式中，基因工程化细菌包含编码腺苷降解酶的基因序列或编码用于表面展示或分泌的透明质酸酶的基因序列或编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列。单独或与吉西他滨组合，用于治疗，管理或预防胰腺导管腺癌。在一个实施方式中，遗传工程菌包含编码腺苷降解酶的基因序列和编码用于表面展示或分泌的透明质酸酶的基因序列和编码用于表面展示或分泌的抗CD40抗体的基因序列。单独或与吉西他滨组合，用于治疗，管理或预防胰腺导管腺癌。在任何这些实施方式中，吉西他滨全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种细菌全身或口服或肿瘤内给药。
在一些实施方式中，其中基因工程化细菌与吉西他滨组合，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)(例如，环磷酰胺)，例如，与10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多相比，在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独化疗。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与在相同条件下单独化疗相比，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍或者与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，基因工程化细菌能够改善共同施用的化学治疗剂(例如，环磷酰胺或本文所述或本领域已知的另一种药剂)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十与在相同条件下或与未修饰的细菌相比的单独化疗相比，倍数，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多倍在相同条件下的相同亚型。
在一些实施方式中，一种或多种基因工程化细菌与一种或多种检查点抑制剂或本领域已知或本文所述的其他抗体一起，同时或随后给药。免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4抗体(包括但不限于Ipilimumab和Tremelimumab(CP675206))，抗-4-1BB(CD137，TNFRSF9)抗体(包括但不限于PF-05082566和Urelumab))，抗CD134(OX40)抗体，包括但不限于Anti-OX40抗体(ProvidenceHealthandServices)，抗PD-1抗体(包括但不限于Nivolumab，Pidilizumab，Pembrolizumab(MK-3475/SCH900475，lambrolizumab)，REGN2810，PD-1(Agenus))，抗PD-L1抗体(包括但不限于durvalumab(MEDI4736)，avelumab(MSB0010718C)和atezolizumab(MPDL3280A，RG7446，RO5541267))和抗KIR抗体(包括但不限于Lirilumab)，LAG3抗体(包括但不限于BMS-986016)，抗CCR4抗体(包括但不限于Mogamulizumab)，抗CD27抗体(包括但不限于Varlilumab)，抗CXCR4抗体(包括但不限于Ulocuplumab)。在一些实施方式中，所述至少一种细菌细胞与抗磷脂酰丝氨酸抗体(包括但不限于Bavituxumab)依次，同时或随后给药。
在一些实施方式中，所述至少一种细菌细胞与选自TLR9抗体的一种或多种抗体(包括但不限于MGN1703PD-1抗体(包括但不限于，MGN1703PD-1抗体)顺序，同时或随后给药；SHR-1210(Incyte/JiangsuHengrui))，抗OX40抗体(包括但不限于OX40(Agenus))，抗Tim3抗体(包括但不限于Anti-Tim3(Agenus/INcyte))，抗Lag3抗体(包括但不限于Anti-Lag3(Agenus/INcyte))，抗B7H3抗体(包括但不限于Enoblituzumab(MGA-271)，抗CT-011(hBAT，hBAT1)如WO2009101611中所述，抗PDL-2抗体(包括但不限于AMP-224(描述于WO2010027827和WO2011066342))，抗CD40抗体(包括但不限于CP-870,893))，抗CD40抗体(包括但不限于CP-870,893)。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于产生或消耗代谢物的酶的基因序列，例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者，依次，同时或随后给药。一种或多种检查点抑制剂。在一些实施方式中，全身施用检查点抑制剂，并且肿瘤内施用细菌。在一些实施方式中，检查点抑制剂和细菌全身施用。在一些实施方式中，包含编码代谢转化物(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者)的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后施用抗PD1抗体给药。在一些实施方式中，包含编码代谢转化物(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者)的基因序列的一种或多种工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA-给药一起施用。4抗体。
在一些实施方式中，包含编码代谢转化物(例如犬尿氨酸或腺苷消耗者或精氨酸生产者)的基因序列的基因工程化细菌依次，同时或随后施用抗CTLA4抗体和抗PD-给药。1抗体。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体给药一起施用。
在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与检查点抑制剂给药，例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不是限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后施用抗PD1抗体给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述腺苷降解途径的基因工程化细菌依次，同时或随后施用抗-CTLA4抗体给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于腺苷降解的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体一起给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与检查点抑制剂给药，例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不是限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于消耗犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗PD1抗体给药一起施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于食用犬尿氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体一起给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与检查点抑制剂给药，例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不是限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体给药。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗PD1抗体给药一起施用。在一些实施方式中，表达任何一种或多种所述用于产生精氨酸的回路的基因工程化细菌依次，同时或随后与抗-CTLA4抗体和抗-PD1抗体一起给药。
在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消耗者和/或犬尿氨酸消费者和/或精氨酸生产者，能够改善共同作用的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)，例如，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85与在相同条件下单独的检查点抑制剂疗法相比，或与相同亚型的未修饰细菌在相同条件下相比，％，90％，95％或更多。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消耗者和/或犬尿氨酸消费者和/或精氨酸生产者，能够改善共同作用的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍与在相同条件下单独的化疗相比或在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比更多或更多。在一些实施方式中，基因工程化细菌，例如腺苷消耗者和/或犬尿氨酸消费者和/或精氨酸生产者，能够改善共同作用的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)，例如，约三倍，四倍，约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍-折叠，九倍，十倍，十五倍，二十倍，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独进行化疗。
在一些实施方式中，经遗传工程改造以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与检查点相比，例如10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独使用抑制剂疗法。在一些实施方式中，经遗传工程改造以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与在相同条件下单独化疗相比，1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍或者与在相同条件下相同亚型的未修饰细菌相比。在一些实施方式中，经遗传工程改造以消耗腺苷的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，二十与在相同条件下或与未修饰的细菌相比的单独化疗相比，倍数，三十倍，四十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多倍在相同条件下的相同亚型。
在一些实施方式中，遗传工程化以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与检查点相比，例如10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌相比，在相同条件下单独使用抑制剂疗法。在一些实施方式中，经基因工程改造以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。与单独的化疗相比，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍条件或与相同亚型的未修饰细菌在相同条件下相比。在一些实施方式中，经遗传工程改造以消耗犬尿氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。)，例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，与单独化疗相比，在相同条件下或与未修饰的相比，更多，二十倍，三十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多倍在相同条件下相同亚型的细菌。
在一些实施方式中，经遗传工程改造以产生精氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。例如，与a相比，例如，10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多在相同条件下或与相同亚型的未修饰细菌在相同条件下相比，单独检查点抑制剂治疗。在一些实施方式中，经遗传工程改造以产生精氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。与单独的化疗相比，例如1.0-1.2倍，1.2-1.4倍，1.4-1.6倍，1.6-1.8倍，1.8-2倍或两倍或更多倍条件或与相同亚型的未修饰细菌在相同条件下相比。在一些实施方式中，经遗传工程改造以产生精氨酸的细菌能够改善共同施用的检查点抑制剂(例如，PD-1和/或CTLA-4)的抗肿瘤活性(例如，肿瘤增殖，大小，体积，重量)。)，例如，大约三倍，四倍，大约三倍，四倍，五倍，六倍，七倍，八倍，九倍，十倍，十五倍，与单独化疗相比，在相同条件下或与未修饰的相比，更多，二十倍，三十倍，五十倍，一百倍，五百倍或一千倍或更多倍在相同条件下相同亚型的细菌。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于表面展示的抗CD47抗体的基因序列，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药，例如，如本文所述和已知的本领域技术人员包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于表面展示的抗CD47抗体的基因序列，与抗PD-1抗体一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含本文所述的用于增加精氨酸产生的基因回路，依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药。在一些实施方式中，抗体是nivolumab。在一些实施方式中，抗体是prembrolizumab。本文描述了此类抗PD-1抗体的其他非限制性实例。
在一些实施方式中，包含编码用于分泌的抗CD47抗体的基因序列的一种或多种本文所述的工程化细菌依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药一起施用。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于表面展示的抗CD47抗体的基因序列，与抗PD-1抗体一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含本文所述的用于增加精氨酸产生的基因回路，依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药。在一些实施方式中，抗体是nivolumab。在一些实施方式中，抗体是prembrolizumab。本文描述了此类抗PD-1抗体的其他非限制性实例。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码用于表面展示或分泌的抗CD47抗体的基因序列，与用于增加本文所述的精氨酸产生的基因回路组合，依次，同时或，或随后用抗PD-1抗体给药。在一个实施方式中，使用这样的方案，其包含一种或多种基因工程化细菌，其包含用于产生精氨酸和用于分泌抗-CD47的回路，单独或与PD-1抗体(例如，nivolumab或prembrolizumab)组合。用于治疗，管理和预防晚期实体瘤。在一些实施方式中，口服施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，全身施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，肿瘤内施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，抗PD-1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种精氨酸生物合成基因可选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB。在一些实施方式中，精氨酸阻遏物(argR)被删除，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。在一些实施方式中，细菌还包含编码反馈抗性argA的基因。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于分泌的可溶形式的SIRPα的基因序列，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药，例如，如本文所述和已知的本领域，包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，包含编码可溶形式的SIRPα用于分泌的基因序列的一种或多种本文所述的工程化细菌依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含本文所述的用于增加精氨酸产生的基因回路，依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药。在一些实施方式中，抗体是nivolumab。在一些实施方式中，抗体是prembrolizumab。本文描述了此类抗PD-1抗体的其他非限制性实例。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码可溶形式的SIRPα的基因序列，用于与本文所述的增加的精氨酸产生的基因回路组合分泌，依次，同时或随后施用。用抗PD-1抗体给药。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其包含用于产生精氨酸和用于分泌可溶形式的SIRPα的回路，单独或与PD-1抗体(例如，nivolumab或prembrolizumab)组合，用于治疗，管理和预防晚期实体瘤。在一些实施方式中，口服施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，全身施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，肿瘤内施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，抗PD-1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在任何这些实施方式中，一种或多种精氨酸生物合成基因可选自argA，argB，argC，argD，argE，argF，argG，argH，argI，argJ，carA和carB。在一些实施方式中，精氨酸阻遏物(argR)被删除，突变或修饰，以减少或消除其阻遏物功能。在一些实施方式中，细菌还包含编码反馈抗性argA的基因。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码一种或多种本文所述细胞因子的基因序列用于分泌到细胞外环境中，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药。例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码本文所述的一种或多种细胞因子以分泌到细胞外环境中的基因序列，依次，同时或随后给予抗-给药。PD-1抗体。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列和任选的用于产生色氨酸的途径，依次，同时或随后给药，抗PD-1抗体。本文描述了此类抗PD-1抗体的非限制性实例。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码一种或多种本文所述细胞因子的基因序列，用于与编码一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列组合分泌。任选地，用于产生色氨酸的回路依次，同时或随后与抗PD-1抗体给药。本文描述了此类抗PD-1抗体的非限制性实例，包括但不限于pembrolizumab和nivolumab。在这些实施方式中，抗PD-1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-1抗体的施用组合用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，所述细菌产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选地包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)并且还产生一种或多种细胞因子。如本文所述，单独或与PD-1抗体组合，例如，nivolumab或pembrolizumab，用于治疗，控制和预防结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗结肠直肠癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-1抗体的施用组合用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)并产生一种或多种细胞因子。本文描述的用于分泌的单独或与PD-1抗体(例如，nivolumab或pembrolizumab)组合用于肝细胞癌的治疗，管理和预防。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-1抗体的施用组合用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)并分泌一种或多种描述的细胞因子。本文中，单独或与PD-1抗体组合，例如，nivolumab或prembrolizumab，用于治疗，控制和预防免疫疗法-难治性晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗晚期黑素瘤。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码IL-15用于分泌到细胞外环境中的基因序列，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药，例如，如本文所述。本领域已知的，包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码IL-15的基因序列以分泌到细胞外环境中，与抗PD-1抗体一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码IL-15的基因序列与编码一种或多种用于降解犬尿氨酸(和任选地用于产生色氨酸)的酶的基因序列的组合。，与抗PD-1抗体一起给药，同时或随后给药。本文描述了此类抗PD-1抗体的非限制性实例，包括pembrolizumab和nivolumab。在这些实施方式中，抗PD-1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或用于分泌的IL-15，或两者。，可以与PD-1抗体的给药一起用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，所述细菌产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选地包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)并且还产生IL-15，单独或在与PD-1抗体(例如，nivolumab或pembrolizumab)的组合用于治疗，管理和预防结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗结肠直肠癌。在一些实施方式中，包含编码用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或IL-15或两者的酶的基因序列的一种或多种基因工程化细菌可以是用于治疗肝细胞癌，同时给予PD-1抗体。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的基因序列，包括产生色氨酸的回路)并产生用于分泌的IL-15，单独或与PD-1抗体组合，例如，nivolumab或pembrolizumab，用于治疗，控制和预防肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或用于分泌的IL-15，或两者。，可以与PD-1抗体的给药一起用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)和分泌IL-15，单独或组合用PD-1抗体，例如nivolumab或prembrolizumab，用于治疗，控制和预防免疫治疗-难治性晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗晚期黑素瘤。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于分泌的抗CD47抗体的基因序列，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药，例如，如本文所述和本领域已知的。包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，包含编码用于分泌的抗CD47抗体的基因序列的一种或多种本文所述的工程化细菌依次，同时或随后与抗PD-L1抗体给药一起施用。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码用于表面展示的抗CD47抗体的基因序列，与抗PD-L1抗体一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含本文所述的用于增加精氨酸产生的基因回路，与抗PD-L1抗体一起依次，同时或随后给药。在一些实施方式中，抗体是durvalumab。在一些实施方式中，抗体是avelumab。在一些实施方式中，抗体是atezolizumab。本文描述了此类抗PD-L1抗体的其他非限制性实例。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码用于表面展示或分泌的抗CD47抗体的基因序列，与用于增加本文所述的精氨酸产生的基因回路组合，依次，同时或，或随后用抗PD-L1抗体给药。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其包含用于产生精氨酸和用于分泌抗-CD47的回路，单独或与PD-L1抗体组合，例如durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，管理和预防晚期实体瘤。在一些实施方式中，口服施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，全身施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在一些实施方式中，肿瘤内施用用于治疗晚期实体瘤的基因工程化细菌。在任何这些实施方式中，抗PD-L1抗体全身或口服或肿瘤内施用。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码一种或多种本文所述细胞因子的基因序列用于分泌到细胞外环境中，与检查点抑制剂一起依次，同时或随后给药。例如，如本文所述和本领域已知的，包括但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA-4。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码本文所述的一种或多种细胞因子以分泌到细胞外环境中的基因序列，依次，同时或随后给予抗-给药。PD-L1抗体。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码一种或多种用于降解犬尿氨酸和任选地产生色氨酸的酶的基因序列，依次，同时或随后施用抗-给药。PD-L1抗体。本文描述了此类抗PD-L1抗体的非限制性实例。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程化细菌，其包含编码一种或多种本文所述细胞因子的基因序列，用于与编码一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列组合分泌。任选地，色氨酸的产生依次，同时或随后与抗PD-L1抗体给药一起给药。本文描述了此类抗PD-L1抗体的非限制性实例，包括但不限于durvalumab，avelumab或atezolizumab。在这些实施方式中，抗PD-L1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-L1抗体的施用组合用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，所述细菌产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选地包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)并且还产生一种或多种细胞因子。本文所述的单独或与PD-L1抗体组合，例如durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，控制和预防结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗结肠直肠癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-L1抗体的施用组合用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)并产生一种或多种细胞因子。本文描述的用于分泌，单独或与PD-L1抗体组合，例如durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，管理和预防肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或一种或多种描述的细胞因子。本文中或两者可以与PD-L1抗体的施用组合用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)并分泌一种或多种描述的细胞因子。本文中，单独或与PD-L1抗体组合，例如，durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，控制和预防免疫疗法-难治性晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗晚期黑素瘤。
在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码IL-15的基因序列以分泌到细胞外环境中，与抗PD-L1抗体一起，同时或随后给药。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种工程菌，其包含编码IL-15的基因序列与编码一种或多种用于降解犬尿氨酸(和任选地用于产生色氨酸)的酶的基因序列的组合。用抗PD-L1抗体依次，同时或随后给药。本文描述了此类抗PD-L1抗体的非限制性实例，包括durvalumab，avelumab和atezolizumab。在这些实施方式中，抗PD-L1抗体全身或口服或肿瘤内给药。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或用于分泌的IL-15，或两者。，可以与PD-L1抗体的给药联合用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，所述细菌产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)并且还产生IL-15，单独或在与PD-L1抗体(例如，durvalumab，avelumab或atezolizumab)的组合用于治疗，管理和预防结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗结肠直肠癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗结肠直肠癌。在一些实施方式中，包含编码用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或IL-15或两者的酶的基因序列的一种或多种基因工程化细菌可以是用于治疗肝细胞癌，同时给予PD-L1抗体。在一个实施方式中，这种方案包含一种或多种基因工程化细菌，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的基因序列，包括产生色氨酸的回路)并产生用于分泌的IL-15，单独或与PD-L1抗体组合，例如durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，控制和预防肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗肝细胞癌。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗肝细胞癌。在一些实施方式中，所述一种或多种基因工程化细菌包含编码用于降解犬尿氨酸的酶的基因序列(和任选的包含用于产生色氨酸的回路的基因序列)或用于分泌的IL-15，或两者。，可以与PD-L1抗体的给药一起用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，包含一种或多种基因工程化细菌的方案，其产生一种或多种用于降解犬尿氨酸的酶(和任选的包含产生色氨酸的回路的基因序列)和分泌IL-15，单独或组合用PD-L1抗体，例如durvalumab，avelumab或atezolizumab，用于治疗，控制和预防免疫疗法-难治性晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是口服的，用于治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是肿瘤内治疗晚期黑素瘤。在一个实施方式中，一种或多种基因工程化细菌的施用是全身性的，用于治疗晚期黑素瘤。
在一些实施方式中，基因工程微生物可以作为方案的一部分施用，其包括其他治疗方式或其他方式的组合。这些方式或药剂的非限制性实例是常规疗法(例如，放射疗法，化学疗法)，其他免疫疗法，干细胞疗法和靶向疗法(例如，BRAF或血管内皮生长因子抑制剂；抗体或化合物)，本文所述的细菌和溶瘤病毒。治疗还包括与抗体-免疫接合相关，包括Fc介导的ADCC治疗，使用将细胞毒性T细胞与肿瘤细胞(例如BiTE)连接的双特异性可溶性scFv的治疗，以及具有效应功能的可溶性TCR。免疫疗法包括疫苗(例如，病毒抗原，肿瘤相关抗原，新抗原或其组合)，检查点抑制剂，细胞因子疗法，过继性细胞疗法(ACT)。ACT包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法，天然或工程化TCR或CAR-T疗法，天然杀伤细胞疗法和树突细胞疫苗或其他抗原呈递细胞的其他疫苗。靶向治疗包括抗体和化学化合物，并且包括例如抗血管生成策略和BRAF抑制。
通过表达未甲基化的CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟细菌DNA的免疫刺激活性。Bode等，ExpertRev疫苗。2011年4月；10(4)：499-511。CpGDNA作为疫苗佐剂。当用作疫苗佐剂时，CpGODN改善专职抗原呈递细胞的功能并促进体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。在一些实施方式中，CpG可以与本发明的基因工程化细菌组合施用。
在一个实施方式中，遗传工程微生物与肿瘤细胞裂解物组合施用。
可以基于症状的严重程度和癌症的进展来选择药物组合物的剂量和给药频率。适当的治疗有效剂量和给药频率可由治疗临床医生选择。
体内治疗
基因工程化细菌可以在体内评估，例如在动物模型中。可以使用与癌症相关的疾病或病症的任何合适的动物模型，例如肿瘤同系或异种移植小鼠模型(参见，例如，Yu等，2015)。基因工程化细菌可以全身或局部施用至动物，例如，通过口服施用(强饲)、静脉内或皮下注射或通过肿瘤内注射，并且例如通过测量肿瘤体积来确定治疗功效。
非限制性的动物模型的实例包括小鼠模型，如在Dang等，2001，Heap等，2014和Danino等，2015)中描述。
临床前小鼠模型确定哪种免疫疗法和组合免疫疗法将在不同的癌症中产生最佳治疗指数(最大抗肿瘤功效和最小免疫相关不良事件(irAE))。
将衍生自各种人癌细胞类型或患者肿瘤块的培养细胞植入小鼠组织部位已被广泛用于产生癌症小鼠模型(异种移植建模)。在异种移植建模中，将人肿瘤或细胞系皮下或原位植入免疫受损的宿主动物(例如裸鼠或SCID小鼠)中以避免移植排斥。因为在这样的模型中没有再现原始人肿瘤微环境，所以在这些模型中可能无法准确测量靶向免疫调节剂的抗癌剂的活性，使得具有完整免疫系统的小鼠模型是更加期望的。
因此，同系免疫活性宿主中的鼠癌细胞(同种异体移植)的植入被用于生成具有衍生自作为给定小鼠品系的相同遗传背景的肿瘤组织的小鼠模型。在同系模型中，宿主免疫系统是正常的，这可以更接近地代表肿瘤微环境的真实情况。将肿瘤细胞或癌细胞系皮下或原位植入同系免疫活性宿主动物(例如小鼠)中。可用于免疫检查点基准设定的同系小鼠模型的代表性鼠肿瘤细胞系包括但不限于表18中列出的细胞系。
表18.用于同系小鼠模型的选定细胞系
Figure BDA0002194618080005131
另外的细胞系包括但不限于表19中的那些，其在Joseph F.Grosso和MariaN.Jure-Kunkel等,2013中关于CTLA-4基准设定描述，其全部内容通过引用并入本文。
表19.用于同系小鼠模型的鼠细胞系和CTLA-4抗体
Figure BDA0002194618080005141
Figure BDA0002194618080005151
对于衍生自某些细胞系的肿瘤，可加入卵清蛋白以进一步刺激免疫应答，从而提高应答基线水平。
取决于细胞系，可在同系小鼠模型中使用的小鼠品系的实例包括C57BL/6、FVB/N、Balb/c、C3H/HeJ、C3H/HeJ、NOD/ShiLT、A/J、129S1/SvlmJ、NOD。此外，多种进一步基因工程化小鼠品系已被报道在分子和组织学水平两者上都模拟人类肿瘤发生。这些基因工程化小鼠模型也为该领域提供了优异的工具，此外，在这些模型中开发的来自侵入性肿瘤的癌细胞系也是用于同系肿瘤模型的细胞系的良好资源。表20中提供了基因工程化品系的实例。
表20.示例性的感兴趣的基因工程化小鼠品系
Figure BDA0002194618080005161
Figure BDA0002194618080005171
Figure BDA0002194618080005181
Figure BDA0002194618080005191
通常针对人类蛋白质的抗体不检测它们的鼠类对应物。在研究抗体，包括针对人免疫检查点分子的抗体时，有必要考虑这一点。例如，伊匹单抗(Ipilimumab)未显示出与大鼠、小鼠或兔子的CTLA-4的交叉反应性或与之结合。
在某些情况下，感兴趣基因的转基因小鼠可用于克服这个问题，如为伊匹单抗所作的。然而，在没有人转基因的同系小鼠模型中，必须使用小鼠蛋白反应性抗体来测试治疗性抗体策略。例如，用于通过感兴趣的基因工程化细菌表达的合适的CTLA-4抗体包括但不限于9H10、UC10-4F10-11、9D9和K4G4(表33)。
最近，已经开发出“人源化”小鼠模型，其中免疫缺陷小鼠用人免疫系统重建，并且帮助克服了与小鼠和人免疫系统之间的差异相关的问题，允许进行体内研究。组合IL2受体无效和严重联合免疫缺陷突变(scid)的严重免疫缺陷小鼠(NOD-scidIL2Rgnμll小鼠)缺乏成熟T细胞、B细胞或功能性NK细胞，并且缺乏细胞因子信号传导。这些小鼠可以被植入人造血干细胞和外周血单核细胞。将CD34+造血干细胞(hu-CD34)注射到免疫缺陷小鼠中，导致包括用于长期研究的非常好的T细胞成熟和功能的人免疫细胞群的多谱系植入。该模型具有12个月的研究期，其具有显示T细胞依赖性炎症应答而对宿主没有供体细胞免疫反应性的功能性人免疫系统。患者来源的异种移植物可以很容易地植入这些模型中，并且免疫调节剂的作用在更能反映人类肿瘤微环境(基于免疫和非免疫细胞两者)的体内环境中进行研究(Baia等，2015)。
在人源化小鼠模型中使用的感兴趣的人细胞系包括但不限于HCT-116和HT-29结肠肿瘤细胞系。
如Roberts等，2014所述，大鼠F98神经胶质瘤模型和自发性犬肿瘤的效用，其全部内容通过引用整体并入本文。通过植入工程化以表达荧光素酶的F98大鼠神经胶质瘤细胞产生的局部侵袭性肿瘤被肿瘤内注射C.novyi-NT孢子，导致萌发和荧光素酶活性的快速下降。C.novyi-NT萌发通过细菌的营养形式的出现来证明。在这些研究中，C.novyi-NT被精确地训练成针对肿瘤，放过附近的细胞。
犬软组织肉瘤例如在许多品种中很常见，并且具有与人类相似的临床、组织病理学和遗传学特征(Roberts等，2014；Staedtke等，2015)，特别是在遗传方面变异和突变谱方面。Roberts等在狗中进行了一项研究，其中将C.novi-NT孢子在1至4个治疗周期中肿瘤内注射(1×108C.novyi-NT孢子)到自发发生的实体瘤中90天。观察到有效的炎症应答，表明肿瘤内注射增加了先天免疫应答。
在一些实施方案中，将本发明的基因工程化微生物全身施用至本文所述的任何模型中，例如口服、皮下、静脉内或肿瘤内施用，以评估抗肿瘤功效和任何治疗相关的不良副作用。
完整的引用
在整个说明书中引用的的完整引用或参考文献包括：
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实施例
下面的实施例提供本公开的说明性实施方式。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开的精神或范围的情况下可以进行的多种修改和变化。这样的修改和变化包含在本公开的范围内。实施方式不以任何方式限制本公开。
本文的公开内容提供了与在下文实施例中描述的任何SEQ ID NO的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源性的序列。
实施例1抗癌分子
在构建单链抗CTLA-4抗体中使用的示例性核酸序列描述于2017年1月11日提交、公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072，其全部内容通过引用并入本文，例如在实施例1中。在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列与DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源或包含所述DNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ ID NO:771、SEQIDNO772、SEQ ID NO:773、SEQ IDNO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的多肽。在另一个实施方式中，基因工程化细菌包含基因序列，所述基因序列编码包含选自SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ ID NO:770、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ IDNO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776的序列的多肽。在另一个实施方式中，由基因工程化细菌表达的多肽由选自SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ IDNO:768、SEQ ID NO:769、SEQ IDNO：770、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ ID NO:774、SEQ ID NO:775和/或SEQ ID NO:776的序列组成。
在一些实施方式中，基因工程化细菌包含核酸序列，所述核酸序列与DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源或包含所述DNA序列，所述DNA序列编码与SEQ ID NO:777、SEQ ID NO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ IDNO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQ ID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源的多肽。在另一个实施方式中，基因序列包含选自SEQ ID NO:777、SEQ IDNO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ ID NO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQ ID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788的序列。在另一个实施方式中，基因序列由选自SEQ ID NO:777、SEQ ID NO:778，SEQ ID NO:779，SEQ ID NO:780，SEQ ID NO:781，SEQ ID NO:782，SEQ ID NO:783，SEQ ID NO:784，SEQID NO:785，SEQ ID NO:786，SEQ ID NO:787和/或SEQ ID NO:788的序列组成。
实施例2.大肠杆菌Nissle的肿瘤药代动力学
如于2017年1月11日提交的公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072所述对肿瘤药代动力学进行测定和确定，其全部内容通过引用并入本文，例如，实施例58-61。使用CT26肿瘤模型在7天内测定Nissle(1e7和1e8细胞/剂量)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在剂量两者下相似。在任何时间点在血液中都未检测到细菌。
在CT26肿瘤模型中比较链霉素抗性Nissle和Nissle DOM突变体(Nissle deltaPAL::CmR)的肿瘤药代动力学。肿瘤组织中的细菌计数在菌株两者中相似。在血液中未检测到细菌。这些结果表明野生型和DOM突变体Nissle两者都可以在肿瘤环境中存活。
使用CT26肿瘤模型于1e6(组1)或1e7细胞/剂量(组2)下评估链霉素抗性Nissle对肿瘤内施用的体内细胞因子响应。在指定剂量下在小鼠CT-24模型中在SYN94肿瘤内施用后的时间过程中测量在血清和肿瘤中的水平。结果表明，在肿瘤中于较高剂量下引发细胞因子应答但不在血清中。较低剂量不引起实质性细胞因子反应。
在IT给药(1e7细胞/剂量)后在48小时评估肿瘤PK、在各种组织中细菌的水平和在这些组织中的细胞因子水平。如在国际专利申请PCT/US2017/013072(通过引用并入本文)中所见，细菌主要存在于肿瘤中而在测试的其他组织中不存在。在所有血清、肿瘤和肝脏中测量的TNFα水平在SYN94、盐水处理和初始组之间类似。当Nissle通过IV以1e8施用时，TNFα水平相对于在1.5小时测量的TNFα水平可忽略不计。然而，即使是IV施用，TNFα水平在4小时时降低至不可检测的水平。在SYN94的1e6 IV剂量下检测到TNFα的类似低水平。
实施例3A.代谢物的LC-MS/MS定量
如2017年1月11日提交的公布为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072所述，通过LC-MS/MS进行细菌上清液和肿瘤组织中的腺苷、犬尿氨酸、色氨酸和精氨酸的定量，其全部内容通过引用并入本文。
实施例3B.使用染色体插入的工程化细菌菌株
用于将构建体整合到大肠杆菌Nissle的基因组中的方法描述在国际专利申请PCT/US2017/013072中，其通过引用并入本文。
实施例4.腺苷降解菌株的产生
腺苷降解途径中的3个操纵子的示意图示于图4A和4B中。为了产生腺苷消耗菌株，将每一个操纵子(或在nupC的情况下，单个基因)克隆到在PfnrS启动子控制下的KIKO载体中。从KIKO载体制备敲入PCR产物，并进行等位基因交换以将这些操纵子整合到大肠杆菌基因组中。通过使用如本文所述的λ红色重组酶系统促进等位基因交换。产生多种菌株组合，表21总结了在腺苷降解测定中产生和比较的菌株。表22总结了用于各个构建体的整合位点。
表21.腺苷消耗菌株
Figure BDA0002194618080005281
表22.整合位点(也可以参见菌株表)
构建体 染色体整合位点
P<sub>fnrS</sub>-nupC 整合到HA1/2(agaI/rsmI)区域
P<sub>fnrS</sub>-xdhABC 整合到HA9/10(exo/cea)区域
P<sub>fnrS</sub>-add-xapA-deoD 整合到malE/K区域
实施例5.体外腺苷降解测量
体外腺苷消耗
葡萄糖是大肠杆菌的优选碳源。然而，在没有葡萄糖的情况下，大肠杆菌也可以使用腺苷作为唯一的碳源。评估新产生的菌株降解腺苷的能力，并且是否即使在存在优选碳源即葡萄糖的情况下也能够这样做。
为了实现这一点，包括野生型对照的各菌株的过夜培养物在LB中于37℃生长，250rpm下振荡。将培养物以1:100稀释(10mL在125mL带挡板的烧瓶中)并生长1.5小时至早期对数期。一旦培养物达到早期对数，将培养物移入供给厌氧气氛(85％N2、10％CO2、5％H2)的Coy厌氧室。将培养物厌氧孵育4小时以允许诱导工程化腺苷降解途径基因。
从厌氧室中取出培养物并测试腺苷降解活性。为实现此目的，将～1e8的激活的细菌细胞在1.5mL微量离心管中旋下并重悬于腺苷测定缓冲液(含有10mM腺苷的1×M9基本培养基，其中不含葡萄糖或含0.5％葡萄糖(参见幻灯片))。将管在37摄氏度下静态孵育5小时，每小时取出上清液样品共5小时。通过LC-MS分析上清液样品以确定腺苷浓度。
结果显示在图3中，表明所有工程化菌株都能够以高于野生型对照菌株的速率降解腺苷(通过其在上清液样品中的不存在来确定)。无论是否存在大肠杆菌的优选碳源即葡萄糖，所有菌株都能够降解腺苷。
在底物限制条件下的体外活性
在先前的研究中，底物是非限制性的，即，菌株能够在Vmax下发挥功能。这样的底物浓度远远超过体内预期的浓度。接下来，在更有限的底物浓度(与体内肿瘤中的腺苷浓度更一致)和更低剂量下(与可在小鼠中IV或IT施用而不引起败血症的剂量更一致)评估工程化细菌的腺苷降解能力。
各菌株的过夜培养物在37℃下在LB中生长，以250rpm振荡。将培养物以1:100稀释(10mL在125mL带挡板的烧瓶中)并生长1.5小时至早期对数期。一旦培养物达到早期对数，将它们移入供给厌氧气氛(85％N2、10％CO2、5％H2)Coy厌氧室。将培养物厌氧孵育4小时以允许诱导工程化腺苷降解途径基因。
激活的细胞在cellometer上定量并在PBS中稀释至5e8 cfu/ml。将10μl该悬浮液(包含5e6细菌)重悬于1mL含有M9基本培养基、0.5％葡萄糖和100μM腺苷的腺苷测定缓冲液中。将细胞在37℃静态孵育。每小时取出上清液样品共5小时以确定腺苷降解速率。通过LC-MS分析上清液样品以确定腺苷浓度。报告的降解速率是0至5小时采样之间的最大线性速率(这可以不包括较晚的时间点，因为速率在极低底物(腺苷)降解下可以不是线性的)。
结果如图5和6所示，表明所有工程化菌株都能够以高于对照菌株SYN01的速率降解腺苷(通过其在上清液样品中的不存在来确定)。SYN1656是含有包含腺苷降解途径的所有三种整合的最高度工程化的菌株，其能够以最高的速率降解腺苷并且在3小时内使腺苷水平达到不可检测的水平。
线性速率在表23中显示。
表23.线性腺苷降解速率
线性速率(umol/hr/10<sup>9</sup>细胞)
SYN001 1.95
SYN1552 5.90
SYN1584 6.39
SYN1655 5.65
SYN1656 6.88
实施例6.腺苷消耗菌株的体内作用
评估腺苷消耗菌株SYN1656(包含PfnrS-nupC；PfnrS-xdhABC；PfnrS-add-xapA-deoD)单独和与抗PD1的组合在体内的作用。
根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1e6个细胞/小鼠皮下植入每只动物(BalbC/J(雌性，8周))的右侧腹侧，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组用于给药。
为了制备细胞，链霉素抗性Nissle(SYN094)在LB培养基中生长，直到在600nm处的吸光度(A600 nm)达到0.4(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并且在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μl可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。为了制备SYN1656，将细胞在LB(2L)中以1:100稀释，在需氧条件下生长1.5小时，然后转移至厌氧室4小时。在施用之前，将细胞浓缩200倍并冷冻(15％甘油、2g/L葡萄糖，在PBS中)。
CT26植入后大约10天，在第1天，将细菌悬浮于0.1ml PBS中，然后对小鼠称重、测量并随机分组至如下治疗组：第1组盐水注射(100μl)(n＝14)；第2组SYN94 IT 10e7(n＝14)；第3组-SYN1656 IT10e7(n＝14)；第4组-SYN1656 IT 10e7加上aPD-1(BioXcell)，10mg/kg，i.p.(n＝14)；第5组-aPD-1(BioXcell)，10mg/kg，i.p.(n＝9)。
在第1天和第4天，按照其分组用盐水或者单独肿瘤内(IT)用菌株或者与抗PD-1(I.P.)组合向动物给药。收集血浆用于进行进一步分析。图5显示了第1、4和7天的小鼠的肿瘤体积。结果显示，在第7天所有三个治疗组(SYN1656、抗PD1、和SYN1656加上抗PD1)与用盐水处理的对照相比肿瘤体积减少。在SYN1656和抗PD1处理组中肿瘤大小最小，然后是单独的SYN1656和单独的抗PD1，表明两种处理之间可以存在协同作用，并且表明腺苷消耗菌株作为单个药剂和与aPD-1组合的抗肿瘤活性。用SYN1656和抗PD1处理的动物中的肿瘤体积显著低于单独盐水处理(p＝0.01)。用SYN1656和抗PD1处理的动物的肿瘤体积也显著低于单独用抗PD1处理的动物的肿瘤体积。
在其他研究中，该研究扩展到包括在第10、15和18天的给药和分析，直到动物达到约2000mm3的肿瘤大小。
实施例7.用于色氨酸生物合成的构建体的合成
各种构建体被合成、并克隆到载体pBR322用于转化大肠杆菌。在一些实施方式中，编码效应分子的构建体被整合到基因组中。色氨酸生产构建体序列的非限制性实例包括fbrAroG(具有RBS和前导区；SEQ ID NO:868)、fbrAroG(SEQ ID NO:862)、fbrAroG-serA(具有RBS；SerA在第二RBS后开始，SEQ ID NO:863)，SerA(具有RBS SEQ ID NO:864)、TrpEDCBA(具有RBS和前导区SEQ ID NO:872)、fbrS40FTrpE-DCBA(具有前导区和RBS SEQ ID NO:878)、fbrTrpE(SEQ ID NO:879)。在一些实施方式中，色氨酸生产构建体与SEQ ID NO:862、SEQ ID NO:863、SEQ ID NO:864、SEQ ID NO:872、SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:868、SEQ IDNO:878、SEQ ID NO:879的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％同源。
实施例8.大肠杆菌Nissle的工程化菌株中的色氨酸生产
宿主来源的(例如色胺或犬尿氨酸)或肠道细菌来源的(如吲哚乙酸或吲哚)许多色氨酸代谢产物都已显示可以通过激活AhR受体在IBD的背景下下调炎症。在结肠炎的实验模型中，已显示其他色氨酸代谢物，例如细菌来源的吲哚丙酸盐，有助于恢复肠屏障完整性。在该实施例中，大肠杆菌菌株Nissle被工程化以产生色氨酸，即所有这些有益代谢物的前体。
首先，为了去除由转录因子TrpR介导的色氨酸生物合成基因的负调节，从大肠杆菌Nissle的基因组中缺失trpR基因。通过PCR从大肠杆菌Nissle基因组DNA扩增色氨酸操纵子trpEDCBA，并克隆到在tetR阻遏物基因下游的tet启动子控制下的低拷贝质粒pSC101中。然后将该tet-trpEDCBA质粒转化到ΔtrpR突变体中以获得ΔtrpR、tet-trpEDCBA菌株。随后，来自大肠杆菌Nissle的aroG基因(aroGfbr)的反馈抗性版本(编码催化第一个朝向芳香族氨基酸生产的关键步骤的酶)被合成并克隆到中等拷贝质粒p15A中，在tetR阻遏物下游的tet启动子的控制下。将该质粒转化到ΔtrpR、tet-trpEDCBA菌株中以获得ΔtrpR、tet-trpEDCBA、tet-aroGfbr菌株。最后，从tet-trpEBCDA产生反馈抗性版本的tet-trpEBCDA构建体(tet-trpEfbrBCDA)。将tet-aroGfbr和tet-trpEfbrBCDA构建体转化到ΔtrpR突变体中以获得ΔtrpR、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr菌株。
所有产生的菌株在含有适当抗生素的LB中生长过夜，并在培养管中在具有抗生素的3ml LB中进行1/100传代培养。在37℃，250rpm下生长2小时后，向培养物中加入100ng/mL无水四环素(ATC)以诱导构建体的表达。诱导2小时后，通过以4,000rpm离心5分钟沉淀细菌细胞，并重悬于3mL M9基本培养基中。将细胞再次以4,000rpm旋下5分钟，重悬于含有0.5％葡萄糖的3mL M9基本培养基中，并在37℃以250rpm放置。在2小时、4小时和16小时收集200μl，并通过LC-MS/MS在细菌上清液中定量色氨酸。图6A显示由ΔtrpR，tet-trpEDCBA，tet-aroGfbr菌株生产和分泌的色氨酸。通过表达反馈抗性版本的trpE，显著增强了色氨酸的生产。
实施例9.通过使用非PTS碳源和通过缺失编码将色氨酸转化为吲哚的色氨酸酶的tnaA基因而改善的色氨酸
大肠杆菌中色氨酸的前体分子之一是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。只有3％的可用PEP通常用于生产芳香酸(包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)。当使用葡萄糖作为唯一碳源生长大肠杆菌时，使用磷酸转移酶系统(PTS)将50％的PEP用于将葡萄糖输入细胞。为了增加色氨酸生产，使用非PTS氧化糖葡萄糖醛酸酯来测试工程化大肠杆菌Nissle菌株ΔtrpR、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr的色氨酸分泌。此外，编码色氨酸酶的tnaA基因在ΔtrpR，tet-trpEfbrDCBA，tet-aroGfbr菌株中缺失以阻断色氨酸转化为吲哚以获得ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr菌株。
将ΔtrpR、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr和ΔtrpRΔtna、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr菌株在含有适当抗生素的LB中生长过夜，并在培养管中在含有抗生素的3mL LB中进行1/100传代培养。在37℃，250rpm下生长2小时后，向培养物中加入100ng/mL无水四环素(ATC)以诱导构建体的表达。诱导2小时后，通过以4,000rpm离心5分钟沉淀细菌细胞，并重悬于3mL M9基本培养基中。将细胞再次以4,000rpm旋下5分钟，重悬于含有1％葡萄糖或1％葡萄糖醛酸酯的3mL M9基本培养基中，并在37℃以250rpm放置在厌氧室中。在3小时和16小时收集200μl，并通过LC-MS/MS在细菌上清液中定量色氨酸。图6B显示当使用非PTS氧化糖葡萄糖醛酸酯时，色氨酸生产在需氧条件下翻倍。此外，tnaA的缺失在需氧和厌氧条件两者下在3小时时间点以及仅在厌氧条件下在16小时时间点对色氨酸生产具有积极影响。
实施例10.通过增加丝氨酸生物合成改善的色氨酸生产
在大肠杆菌的色氨酸生物合成中的最后一步消耗一个分子的丝氨酸。在该实施例中，我们证实丝氨酸可用性是色氨酸生产的限制因素并且描述了生产色氨酸的大肠杆菌Nissle菌株ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbrserA和ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbrserAfbr菌株的构建。
ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr菌株在含有适当抗生素的LB中生长过夜，并在培养管中在含有抗生素的3mL LB中进行1/100传代培养。在37℃，250rpm下生长2小时后，向培养物中加入100ng/mL无水四环素(ATC)以诱导构建体的表达。诱导2小时后，通过以4,000rpm离心5分钟沉淀细菌细胞，并重悬于3mL M9基本培养基中。将细胞再次以4,000rpm旋下5分钟，重悬于含有1％葡萄糖或1％葡萄糖醛酸酯和10mM丝氨酸的3mL M9基本培养基中，并在37℃放置在厌氧室中。在3小时和16小时收集200μl，并通过LC-MS/MS在细菌上清液中定量色氨酸。图6C显示通过丝氨酸添加将色氨酸生产提高三倍。
为了增加在ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr菌株中丝氨酸生物合成的速率，通过PCR扩增来自大肠杆菌Nissle的、编码催化在丝氨酸生物合成途径的第一个步骤的酶的serA基因，并通过Gibson组装克隆到tet-aroGfbr质粒中。然后将新生产的tet-aroGfbr-serA构建体转化到ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA菌株中以生产ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr-serA菌株。tet-aroGfbr-serA构建体进一步修饰以编码反馈抗性版本的serA(serAfbr)。新产生的tet-aroGfbr-serAfbr构建体被用来生产ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA、tet-aroGfbr-serAfbr菌株，被优化以提高丝氨酸生物合成的速率并最大化色氨酸生产。
实施例11.各种色氨酸生产菌株的比较
比较在产生的不同菌株中的色氨酸生产速率，根据本文所述方法和序列产生下列构建体和菌株，并在需氧条件下在存在葡萄糖醛酸酯作为碳源的情况下测定色氨酸生产。SYN2126包含ΔtrpRΔtnaA(ΔtrpRΔtnaA)。SYN2323包含ΔtrpRΔtnaA和质粒上用于表达反馈抗性aroG的四环素诱导型构建体(ΔtrpRΔtnaA，tet-aroGfbr)。SYN2339包含ΔtrpRΔtnaA和第一质粒上用于表达反馈抗性aroG的第一四环素诱导型构建体和第二质粒上含有trp操纵子的基因与反馈抗性形式的trpE的第二四环素诱导型构建体(ΔtrpRΔtnaA、tet-aroGfbr、tet-trpEfbrDCBA)。SYN2473包含ΔtrpRΔtnaA和第一质粒上用于表达反馈抗性aroG和SerA的第一四环素诱导型构建体和第二质粒上含有trp操纵子的基因与反馈抗性形式的trpE的第二四环素诱导型构建体(ΔtrpRΔtnaA、tet-aroGfbr-serA、tet-trpEfbrDCBA)。SYN2476包含ΔtrpRΔtnaA和质粒上含有trp操纵子的基因与反馈抗性形式的trpE的四环素诱导型构建体(ΔtrpRΔtnaA、tet-trpEfbrDCBA)。
将过夜培养物在3mL LB加抗生素中1/100稀释并生长2小时(37℃，250rpm)。接下来，用100ng/mL ATC诱导细胞2小时(37℃，250rpm)，旋下，用cmL M9洗涤，再次旋下，并重悬于3mL M9+1％葡萄糖醛酸酯中。将细胞铺板用于CFU计数。对于该测定，将细胞置于在37℃下以250rpm振荡培养。在1小时、2小时、3小时、4小时、16小时收集上清液用于色氨酸的HPLC分析。如图6D所示，结果表明，表达aroG不是在这些条件下获得Trp生产所充分的或必要的，而表达serA有益于色氨酸生产。
实施例12.ALE
首先，生产菌株，其包含用于表达由组成型启动子驱动的荧光假单胞菌KYNase的trpE敲除和整合构建体(表24)。将KYNase构建体整合到HA3/4位点处，并使用两种不同的启动子；内源性lpp基因的启动子用于母体菌株SYN2027(HA3/4::Plpp-pKYNaseKanRTrpE::CmR)，而合成pSynJ23119用于母体菌株SYN2028(HA3/4::PSynJ23119-pKYNaseKanRTrpE::CMR)。生产这些菌株使得菌株将演化，其将包含荧光假单胞菌KYNase的染色体整合版本。(见表24)。
表24.用于荧光假单胞菌犬尿氨酸酶的组成型表达的构建体
Figure BDA0002194618080005361
这些菌株在棋盘测定中验证(例如，如描述于2017年1月11日提交的公开为WO2017/123675的国际专利申请PCT/US2017/013072，其全部内容通过引用并入本文)以具有与其基于质粒的Ptet对应物相似的ALE参数。使用PCT/US2017/013072中描述的棋盘测定建立用于在ALE实验中使用的犬尿氨酸(KYN)和ToxTrp浓度的下限，并且下限浓度对应于对从中等拷贝质粒表达tet诱导型KYNase的菌株观察到的下限浓度。
从母体菌株SYN2027和SYN2028衍生的突变体如下通过在较低浓度的KYN和三种不同ToxTrp浓度中传代而演化。
用补充有葡萄糖和L-犬尿氨酸(M9+KYN)的M9基本培养基在平板上培养ALE母体菌株。选择来自各母体的单菌落，重悬于20μl无菌磷酸盐缓冲盐水溶液中。然后将该菌落用于接种两种M9+KYN培养物，生长至对数晚期，并在600nm处测定光密度。然后将这些培养物在含有1mL M9+KYNU的96孔深孔板的3列中稀释至103。三行中的每一行具有不同的ToxTrp浓度(增加2倍)，而每列具有降低浓度的KYN(2倍)。每12小时，用来自培养物生长至OD600约为0.1的孔的30μl稀释平板。将该过程重复5天，然后将ToxTrp浓度加倍以维持选择压力。在两周时间后，未检测到生长速率增加，并将培养物接种到M9+KYN上。所有培养于37℃下350RPM振荡进行。选择个体菌落并在M9+KYN+ToxTrp培养基中筛选以确认增加的生长速率的表型。
选择各母体菌株的两个重复(SYN20207-R1、SYN2027-R2、SYN2028-R1、和SYN2028-R2)，并测定犬尿氨酸生产。
简言之，过夜培养物在400ml LB中1:100稀释并让其生长4小时。接下来，将2ml培养物旋下并重悬于2ml M9缓冲液中。测量培养物的OD600(在PBS中1/100稀释)。将用于针对起始细胞计数～OD0.8(～1E8)的3ml测定的必需量的细胞培养物旋下。将细胞沉淀重悬于培养管中的测定体积(3ml)中的M9+0.5％葡萄糖+75uM KYN中。在每个时间点(t＝0、2和3小时)将220μl取出到圆锥形96WP中，重复三次，并且在每个时间点取出4μl用于cfu测量。在各个时间点，将样品在锥形96WP中以3000g旋下5分钟，并将200μl从各个孔转移到透明的平底96WP中。在同一平板中制备犬尿氨酸标准曲线和空白样品。接下来，向各个孔中加入40μl30％三氯酸(v/v)并通过上下吸移混合。用铝箔密封平板并在60℃下孵育15分钟。将平板在11500rpm，4℃下旋下15分钟，将来自各个孔的125μl等分并与另外96WP中的125μl 2％Ehrlich试剂在冰醋酸中混合。将样品上下混合移液，并在OD480下测量吸光度。在图9中显示了母体菌株SYN2027和SYN2028和相应演化菌株的生长速率。
实施例13.犬尿氨酸消耗菌株降低CT26鼠肿瘤模型中的肿瘤犬尿氨酸水平
在肿瘤环境中体内评估包含来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因工程化细菌消耗犬尿氨酸的能力。将包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle菌株SYN1704(Nissle delta TrpE::CmR+Pconstitutive-Pseudomonas KYNU KanR)用于第一项研究(研究1)。
在第二项研究(研究2)中，评估包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的整合构建体的大肠杆菌Nissle菌株SYN2028(Nissle HA3/4::PSynJ23119-pKYNase KanR TrpE::CmR)的活性。
在两项研究中，根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1e6个细胞/小鼠皮下植入每只动物的右侧腹侧(BalbC/J(雌性，8周))，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组以进行给药。
对于瘤内注射，细菌在LB培养基中生长直至在600nm(A600nm)处达到0.4的吸光度(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μL可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。
研究1：CT26植入后大约10天，将细菌悬浮在0.1ml PBS中，对小鼠肿瘤内注射(5E6细胞/小鼠)100μl，如下所示：组1-载剂对照(n＝8)、组2-SYN94(n＝8)和组3-SYN1704(n＝8)。从第2天到研究结束，动物每周两次用100μl载剂对照或细菌以5e6细胞/小鼠给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到～2000mm3时对动物实施安乐死，并且如本文所述通过LC/MS测量犬尿氨酸浓度。结果示于图10A。对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704和对于野生型大肠杆菌Nissle，观察到肿瘤内浓度的显著降低。与野生型Nissle相比，肿瘤内犬尿氨酸水平在SYN1704中降低，尽管由于一个异常值，差异没有达到显著性。
研究2：CT26植入后大约10天，细菌悬浮在0.1ml盐水中，对小鼠肿瘤内注射(1E8细胞/小鼠)如下所示的细菌悬浮液：组1-载剂对照(n＝10)、组2-SYN94(n＝10)、组3-SYN2028(n＝10)。组5(n＝10)每天两次通过口服强饲接受INCB024360(IDO抑制剂)作为对照。从第2天到研究结束，动物每周两次用100μl载剂对照或细菌以1e8细胞/小鼠进行肿瘤内给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。组5每天两次通过口服强饲接受INCB024360作为对照直至研究结束。当肿瘤达到～2000mm3时，对动物实施安乐死。将肿瘤碎片置于预先称重的bead-buster管中并储存在冰上用于分析。如本文所述，通过LC/MS测量犬尿氨酸浓度。结果显示于图10B中。与野生型Nissle或野生型对照相比，观察到犬尿氨酸消耗菌株SYN2028的肿瘤内浓度的显著降低。在SYN2028中观察到的肿瘤内犬尿氨酸水平与对IDO抑制剂INCB024360观察到的那些相似。
实施例14.携带染色体插入和质粒的工程化细菌菌株的体外功效的比较
为了比较具有在malEK基因座处由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr染色体插入的工程化细菌菌株和具有包含由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr的低拷贝质粒的菌株之间的体外功效，在厌氧诱导后的不同时间点测量培养基中的精氨酸水平。另外，为了评估胸苷的营养缺陷是否可能对精氨酸生产效率有影响，比较了具有或不具有ThyA缺失的包含在低拷贝质粒上或整合在染色体上的fnr-argAfbr的工程化细菌菌株的精氨酸生产。
将过夜培养物在LB中以1:100稀释，并在37℃下振荡(250rpm)生长。生长1.5小时后，如下诱导细菌培养物：(1)在厌氧条件下在Coy厌氧室(供应90％N2、5％CO2、5％H2，和20mM硝酸)中在37℃下，在LB中在37℃下诱导包含FNR诱导型argAfbr的细菌4小时；(2)用无水四环素(100ng/mL)诱导包含四环素诱导型argAfbr的细菌。诱导后，从培养箱中取出细菌并以最大速度旋下5分钟。将细胞重悬于1mL M9葡萄糖中，并测量OD600。稀释细胞直至OD600在0.6-0.8之间。在M9葡萄糖培养基中重悬的细胞在37℃振荡下有氧生长。除去100μl细胞重悬液，在时间＝0时测量OD600。100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析(LC-MS/MS)。在每个后续时间点(例如，30、60和120分钟)，移除100μl细胞悬浮液并测量OD600；将100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析。分析样品的精氨酸浓度。在每个时间点，通过质谱法确定的相对于OD600的标准化浓度用于确定每单位时间每个细胞的精氨酸生产速率。以上提供了LC-MS/MS方法的概述。
在诱导后30、60和120分钟时在(1)Syn-UCD301(SYN825；包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、(2)SYN-UCD205(包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、和(3)SYN-UCD206(包含在低拷贝质粒上在FNR诱导型启动子控制下表达的ΔArgR和ΔThyA和argAfbr)之间比较精氨酸生产。使用SYN-UCD103作为对照Nissle构建体，并显示结果。
本文中所显示的是在0、30、60和120分钟时测量的SYN-UCD205、SYN-UCD206、和SYN-UCD301的精氨酸生产的水平。精氨酸生产在所有三种菌株之间类似，在120分钟时观察到SYN-UCD301的最高精氨酸生产，表明FNR argAfbr的染色体整合导致与对表达相同构建体的低拷贝质粒菌株观察到的相似水平的精氨酸生产，并且可以甚至略微增加精氨酸生产速率。SYN-UCD206与SYN-UCD205和SYN-UCD-301(60分钟时较低精氨酸水平)相比表现出减弱的精氨酸生产，但在120分钟达到类似的精氨酸生产水平，表明ΔThyA可以对精氨酸生产有轻微的减弱作用。SYN-UCD103对照没有检测到精氨酸生产。
接下来，如前文所述制备样品，并且在诱导后120分钟在(1)SYN-UCD204(包含在低拷贝质粒上在四环素诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR和argAfbr)、和(2)SYN-UCD301(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、CmR和argAfbr)、(3)SYN-UCD302(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、ΔThyA、CmR(氯霉素抗性)和argAfbr)、和(4)SYN-UCD303(包含在malEK基因座处整合到染色体中在FNR诱导型启动子的控制下表达的ΔArgR、ΔThyA、KanR(卡那霉素抗性)和argAfbr)之间比较精氨酸生产。
使用包含ΔArgR和ΔThyA的SYN-UCD106作为对照Nissle构建体。结果显示于图13B中。如图13B所示，精氨酸生产升高至0.7-0.9μmol/1×109个细胞，表明精氨酸生产在携带质粒上的argAfbr的菌株和具有argAfbr的整合拷贝的菌株中处于相似水平。
实施例15.携带染色体插入和质粒的工程化细菌菌株的体外功效比较
评估具有malEK基因座处由fnr诱导型启动子驱动的argAfbr染色体插入、具有ΔArgR和ThyA缺失且无抗生素抗性的工程化细菌菌株(SYN-UCD303)的体外功效(从氨生成精氨酸)。
将过夜培养物在LB中以1:100稀释，并在37℃下振荡(250rpm)生长。在生长1.5小时，细菌培养物在厌氧条件下在Coy厌氧室(供应90％N2、5％CO2、5％H2，和20mM硝酸)中在37℃下在LB中在37℃下诱导。诱导后，从培养箱中取出细菌并以最大速度旋下5分钟。将细胞重悬于1mL M9葡萄糖中，并测量OD600。稀释细胞直至OD600在0.6-0.8之间。在M9葡萄糖培养基中重悬的细胞在37℃振荡下有氧生长。除去100μl细胞重悬液，在时间＝0时测量OD600。100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析(LC-MS/MS)。在每个后续时间点(例如，20、40、60、80、100和120分钟)，移除100μl细胞悬浮液并测量OD600；将100μl等分试样在-20℃下在圆底96孔板中冷冻用于质谱分析。分析样品的精氨酸浓度。在每个时间点，通过质谱法确定的相对于OD600的标准化浓度用于确定每单位时间每个细胞的精氨酸生产速率。以上提供了LC-MS/MS方法的概述。结果显示于图14。
实施例16.用于细胞因子分泌的构建体和细菌的产生
为了产生能够分泌免疫调节多肽，例如细胞因子，例如hIL-12、mIL-12、hIL-15、GMCSF、TNF-α、IFN-γ、CXCL9和CXCL10的菌株，采用不同分泌策略设计了多种构建体。合成各种细胞因子构建体，并克隆到载体pBR322中以用于转化大肠杆菌。在一些实施方式中，编码效应分子的构建体被整合到基因组中。在一些实施方式中，编码效应分子的构建体位于质粒上，例如中等拷贝质粒。
实施例17.在MC38模型中犬尿氨酸消耗菌株与全身性抗PD-1和抗CTLA-4的组合的活性
在C57BL/6-MC38同源肿瘤模型中评估犬尿氨酸消耗菌株SYN2028增加组合的抗CTLA4和抗PD-1的抗肿瘤应答的能力。
为了制备在研究中使用的细胞，过夜培养物用于接种具有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据表52的研究设计，将肿瘤MC38植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射犬尿氨酸消耗细菌和腹膜内注射抗CTLA-4和抗PD-1抗体。在第9天向每只动物的右侧腹侧SC植入MC38细胞(1×105/小鼠/100μl)。监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到～50-80mm3时，将小鼠随机分入处理组，如表52所示。
在一周内记录肿瘤体积和体重三次，在两次测量之间间隔1-2天。
表52.研究设计
Figure BDA0002194618080005431
Figure BDA0002194618080005441
图39A、39B、39C、39D和39E的结果显示，在MC38模型中犬尿氨酸消耗菌株具有改善抗CTLA-4/抗PD-1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。具体而言，在抗PD-1/抗CTLA-4组中，25％的小鼠对治疗有应答；抗PD-1/抗CTLA-4加SYN94组观察到相同的应答率。在抗PD-1/抗CTLA-4加SYN2028组中，71％的小鼠有应答。
实施例18.精氨酸生产者和犬尿氨酸消耗者与非清髓性化疗联合的活性
在CT26肿瘤模型中评估精氨酸生产者(SYN828)和犬尿氨酸消耗者(SYN2028)与环磷酰胺处理的组合的活性。
为了制备用于研究的细胞，过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据下文所述的时间线和图40A，将CT26肿瘤植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射生产精氨酸的细菌(SYN828)和消耗犬尿氨酸的细菌(SYN2028)和对照与100mg/kg环磷酰胺(CP)的组合。
简言之，在第9天将CT26细胞SC植入(在PBS中1e6细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到约50-80mm3。在第0天，用100mg/kg(100μl/小鼠)环磷酰胺I.P.预处理小鼠并随机分组。在治疗的第1天，小鼠接受100μl的SYN94(WT，1e8CFU/mL)(I.T.)、SYN2028(Kyn，1e8CFU/mL)或SYN825(Arg，1e8CFU/mL)(I.T.)。在第4天、第8天、第11天和第15天，称重动物，测量肿瘤，并向小鼠给药适当的治疗/组。个体小鼠的肿瘤体积显示在图40B、40C、40D、40E和40F中，指示消耗犬尿氨酸和生产精氨酸的菌株与环磷酰胺的组合相比于单独环磷酰胺的抗肿瘤活性。
实施例19.通过LC-MS/MS对细菌细胞沉淀和肿瘤组织匀浆进行环二AMP定量
样品制备
为了生产标准品，在1.5毫升微量离心管中制备10mg/ml环二AMP，并且分别在水中制备250、100、20、4、0.8、0.16、0.032μg/mL的溶液。制备具有200、20和2μg/mL水平的QC溶液。
样品制备：对于体外样品，通过加入100μl 2:1乙腈:水、涡旋并离心抽提细菌沉淀。将20μl上清液转移到新的96孔板中，并通过添加180μl 0.1％甲酸稀释10倍。对于体内样品，通过向10μl肿瘤匀浆中加入90μl的2:1乙腈:水来抽提组织匀浆。将样品涡旋并离心。将20μl上清液转移到新的96孔板中，并通过添加180μl 0.1％甲酸稀释10倍。将板用ClearASeal片热密封并充分混合。
LC-MS/MS方法
通过使用Thermo TSQ Quantum Max三重四极质谱仪(LC-MS/MS)通过耦合到串联质谱的液相色谱测量分析物。表55-表57提供了LC-MS/MS方法的总结。
表55.
Figure BDA0002194618080005451
表56.HPLC方法
Figure BDA0002194618080005461
表57.串联质谱:
Figure BDA0002194618080005462
对于数据分析，整合SRM色谱图，并将标准品的峰面积相对于浓度作图。拟合线性曲线，并使用它们的峰面积和来自标准曲线的斜率截距形式方程计算未知物的浓度。
实施例20.在大肠杆菌Nissle细胞表面上展示抗mPD1-scFv
为了生产能够在细胞的Nissle表面上展示抗MPD1-scFv的基因工程化细菌，根据本文所述的如表31所示的方法生产构建体。序列是SEQ ID NO:987-989。展示锚多肽包括SEQ ID NO:990-992。
表31.用于展示抗mPD1-scFv的菌株
Figure BDA0002194618080005463
Figure BDA0002194618080005471
在一些实施方式中，展示锚与序列SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、和/或SEQ IDNO:992至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源。
包含含有tet诱导型ptet-LppOmpA-抗PD-1-scFv的基于质粒的构建体的大肠杆菌Nissle在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导ptet-LppOmpA-J43-scFv表达18小时。
为了测定单链抗体是否被展示到基因工程化大肠杆菌Nissle的表面上并功能性结合到PD1，进行全细胞ELISA测定。在室温下使用含有2％BSA的PBS封闭109个细胞1小时，并加入生物素化mPD1并在室温下孵育1小时。然后，用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤细胞3次，并与链霉亲和素缀合的HRP在封闭溶液中一起孵育40分钟。孵育后，将孔用PBST洗涤3次并重悬于PBS中，然后按照制造商的说明书(Thermofisher)使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物试剂盒染色。使用生物素化IgG和普通PBS代替mPD1作为阴性对照。离心除去细胞，收集上清液。使用ELISA读数器在450nm下测量上清液的信号强度。结果(数据不可用)表明J43-scFv(抗mPD1)被展示在基因工程化细菌的表面上并且可以结合mPD1(表32)。
表32.Nissle表面展示ELISA测定
Figure BDA0002194618080005472
Figure BDA0002194618080005481
实施例21.在大肠杆菌中的α-PD1-scFv表达
为了确定功能性scFv是否可以在大肠杆菌中表达，基于与小鼠PD1反应的J43单克隆抗体生成抗PD-1-scFv片段。
从专利EP1445264A1获得小鼠单克隆抗体J43序列。接下来，设计单链可变片段(scFv)。通过IDTDNA合成含有tet启动子、核糖体结合位点、设计的J43-scFv、C末端V5标签和C末端六组氨酸标签的片段。将构建体克隆到pCRTM-BluntII-
Figure BDA0002194618080005482
载体(Invitrogen)中，并如本文所述转化到大肠杆菌DH5α中以产生质粒pUC-ptet-J43scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:976-980)。
将包含tet诱导型J43-抗PD1-scFv-V5的大肠杆菌或野生型对照在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:40稀释并振荡(250rpm)至光密度为0.8，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导J43-抗PD1-scFv-V5表达。向野生型对照培养物中加入相同量的四环素。诱导4小时后，沉淀细菌，在PBS中洗涤、收获，重悬于2mL超声缓冲液(PBS)中，并在冰上超声裂解。将不溶性碎片在4℃下以12,000rpm旋下两次，每次15分钟。
蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定法测定，并通过蛋白印迹分析从野生型和包含Ptet-J43-抗PD-1-ScFv-V5的菌株分离的提取物。将蛋白质转移到PVDF膜上，用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测J43-抗PD1-scFv。在泳道2(来自J43-抗PD1-scFv-V5菌株的提取物)中检测到在27kDa处的单一条带。在泳道1(野生型提取物)中没有检测到条带。
为了确定从大肠杆菌DH5α纯化的单链抗体是否功能性结合靶蛋白PD1，进行ELISA测定。将平板在4℃下用每孔100μl 2μg/ml PD1(Rndsystems)吸收过夜。在室温下用2％BSA的PBS/0.1％Tween-20封闭孔2小时。洗涤三次后，将孔与细菌提取物(J43-scFv-V5或野生型-neg-ctrl)在室温下孵育1小时。将孔用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤4次，并与HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)在封闭溶液中一起孵育40分钟。孵育后，用PBST洗涤孔4次，然后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)染色。使用ELISA读数器在450nm下测量信号强度。结果显示于表77，指示由基因工程化细菌表达的抗体可以与PD1特异性结合。
表77.ELISA结合测定
Figure BDA0002194618080005491
接下来，使用收获C末端聚组氨酸标签的pET22b载体表达重组J43-抗-scFv-V5，并使用固定的金属离子亲和层析纯化。通过280nm处的吸收测定蛋白质浓度，并通过考马斯凝胶确认纯度(数据未显示)。
为了确定大肠杆菌中表达的抗PD-1-scFv是否与小鼠EL4细胞上的表面PD1结合，使用EL4细胞进行流式细胞术分析。EL4是在其细胞表面表达PD1的小鼠淋巴瘤细胞系。
EL4细胞在含有10％FBS的Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在含有0.5％BSA的D-PBS中洗涤2-3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的PBS中，向其中加入纯化的scFv-V5和抗V5-FITC抗体，并在室温下孵育1小时。阴性对照不加scFv-V5。将细胞重悬于0.5ml PBS中并在流式细胞仪上分析。结果显示在图18中。相对于仅具有单独EL4和EL4加二抗的样品，仅当纯化的抗PD1-scFv-V5和抗V5-FITC两者都存在时(显示两个不同的批次)观察到群移位(population shift)。
实施例22.抗mPD1-scFv的分泌
根据本文所述的方法产生用于抗mPD1-scFv分泌的菌株显示于表30。
表30.用于分泌抗mPD1-scFv的菌株
Figure BDA0002194618080005501
Figure BDA0002194618080005511
包含含有tet诱导型J43-抗-scFv-V5与PhoA、OmpF或PelB分泌标签(参见SEQ IDNO:981-986)的基于质粒的构建体的大肠杆菌Nissle或野生型对照在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导PhoA-、OmpF-或PelB-J43-抗-scFv-V5表达。野生型Nissle培养物中未添加四环素。在室温下诱导18小时后，沉淀细菌，收集上清液并置于冰上。
通过BCA蛋白质测定确定在培养基和细胞裂解物中的蛋白质浓度，并且通过蛋白印迹分析从野生型和包含Ptet-J43-抗-scFv-V5的菌株分离的提取物和培养基。将蛋白质转移到PVDF膜上，用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测J43-抗scFv。结果显示在图19中。在泳道1-6中检测到在约34kDa处的单一条带，分别对应于来自SYN2767、SYN2769、SYN2771、SYN2773、SYN2775和SYN2777的提取物。
为了确定大肠杆菌Nissle中的分泌J43-抗-scFv是否结合小鼠细胞上的PD1，使用EL4细胞进行流式细胞术分析。EL4是在其细胞表面表达PD1的小鼠淋巴瘤细胞系。
EL4细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在D-PBS中洗涤3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的D-PBS中，向其中加入纯化的scFv-V5和抗V5-FITC抗体，并在室温下孵育1小时。阴性对照不加分泌的J43-scFv-V5。将细胞重悬于0.5ml PBS中并在流式细胞仪上分析。结果显示在图20中。相对于仅具有单独EL4和EL4加二抗的样品，仅当纯化的抗PD1-scFv-V5(1’抗体)和抗V5-FITC(2’抗体)两者都存在时观察到群移位。用不同量的分泌的scFv(0、2、5和15μl)进行类似的研究，观察到EL4细胞的剂量依赖性染色(图21)。
接下来，进行竞争测定以确定PDL1是否可以抑制由基因工程化细菌分泌的抗PD-1-scFv与鼠PD1的结合。使EL4细胞生长并基本上如前文所述进行流式细胞术方案，不同之处在于在分泌的抗PD1-scFv-V5的孵育期间以各种浓度(0、5、10和30μg/mL)加入PDL1。大鼠IgG用作分泌的scFv的阴性对照。结果显示于图22A和图22B中。PDL1以剂量依赖性方式竞争分泌的抗mPD1-scFv与EL4细胞表面上的mPD1的结合。大鼠-IgG蛋白的阴性对照未显示类似的剂量依赖性结合竞争。
实施例23.细胞因子分泌(IL-15)
为了确定工程化细菌表达的hIL-15是否被分泌，测量来自包含hIL-15分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hIL-15浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hIL-15的质粒。
大肠杆菌Nissle菌株在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中1:200稀释并振荡(200rpm)2小时。将培养物稀释至0.5的光密度，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导hIL-1表达。诱导12小时后，将细胞离心，收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。另外，为了检测细胞内重组蛋白质的生产，将沉淀的细菌洗涤并用含有蛋白酶抑制剂和Ready-Lyse Lysozyme Solution(Epicenter)的BugBusterTM(Millipore)重悬浮，导致与原始培养条件相比，裂解物浓缩10倍。在室温下孵育10分钟后，将不溶性碎片在4℃以12,000rcf旋下20分钟，然后置于冰上直至进一步处理。
根据制造商的说明书，通过hIL-15ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hIL-15的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hIL-15的分泌水平。使用重组hIL-15生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表25总结了在各上清液中测量的hIL-15的水平。数据显示hIL-15从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表25.分泌的hIL-15的浓度
Figure BDA0002194618080005531
实施例24.细胞因子分泌(GMCSF)
为了确定由工程化细菌表达的hGMCSF是否被分泌，测量来自包含hGMCSF分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hGMCSF的浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hGMCSF的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hGMCSF ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hGMCSF的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hGMCSF的分泌水平。使用重组hGMCSF生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表26总结了在各上清液中测量的hGMCSF的水平。数据显示hGMCSF从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表26.分泌的GMCSF的浓度
Figure BDA0002194618080005541
实施例25.细胞因子分泌(TNFα)
为了确定工程化细菌表达的hTNFα是否被分泌，测量来自包含hTNFα分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hTNFα浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hTNFα的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hTNFαELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hTNFα的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hTNFα的分泌水平。使用重组hTNFα生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表27总结了在各上清液中测量的hTNFα的水平。数据显示hTNFα从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表27.分泌的TNFa的浓度
Figure BDA0002194618080005551
实施例26.分泌的TNF-α的功能测定
接下来，进行研究以证实从基因工程化细菌分泌的TNF-α是功能性的。基于TNF-α介导的NF-κB激活，采用基于细胞的测定。TNF-α与其受体结合导致IKK对IkBα的磷酸化和降解。TNF-α的生物活性可以通过流式细胞术定量IkB降解来确定。
简单地说，用来自SYN2304(包含PAL::Cm p15A TetR Ptet-phoA TNFα)的TNFα分泌上清液处理HeLa细胞10分钟。然后将细胞固定在基于多聚甲醛的缓冲液中，然后在Triton X-100中通透。通过流式细胞术确定IkBa降解的调节，结果显示在图56中。
如图56所示，SYN2304表现出接近rhTNFa的生物活性，并且SYN1557处理不产生可测量信号，表明没有来自细菌上清液的脱靶组分(即LPS)的混淆。
实施例27.细胞因子分泌(hIFNg)
为了确定由工程化细菌表达的hIFNg是否被分泌，测量来自包含hIFNg分泌构建体的工程化菌株/菌株的细菌上清液的hIFNg的浓度。菌株包含Lpp(lpp::Cm)、nlpI(nlpI::Cm)、tolA(tolA::Cm)或PAL(PAL::Cm)中的缺失。所有菌株还包含表达具有PhoA分泌标签的hIFNg的质粒。
如先前IL-15的实施例所述使大肠杆菌Nissle菌株生长、诱导、处理。
根据制造商的说明书，通过hIFNg ELISA(RnD Systems,Minneapolis,MN)测量在无细胞培养基和细菌细胞提取物中的hIFNg的浓度。所有样品重复三次，并使用标准曲线计算hIFNg的分泌水平。使用重组hIFNg生产标准曲线。野生型Nissle作为阴性对照包含在ELISA中，未观察到信号。表28总结了在各上清液中测量的hIFNg的水平。数据显示hIFNg从不同细菌菌株以不同水平分泌。
表28.分泌的IFNg的浓度
Figure BDA0002194618080005561
表29提供了对各细胞因子获得的分泌水平的总结，并列出可以解释观察到的分泌水平的一些差异的细胞因子的一些结构特征。
表29.分泌结果的总结
Figure BDA0002194618080005571
实施例28.在大肠杆菌中的抗CD47 scFv表达
为了确定功能性抗CD47-scFv是否可以在大肠杆菌中表达，基于与人CD47反应的B6H12和5F9单克隆抗体产生抗CD47-scFv片段。
从公开的专利(US20130142786A1)获得单克隆抗体B6H12和5F9(抗人CD47)序列。接下来，设计了靶向人CD47的单链可变片段(scFv)。通过IDTDNA合成含有tet启动子、核糖体结合位点、设计的抗hCD47-scFv、C末端V5标签和C末端六组氨酸标签的片段。将构建体克隆到pCRTM-BluntII-
Figure BDA0002194618080005572
载体(Invitrogen)中，并如本文所述转化到大肠杆菌DH5α中以产生质粒pUC-ptet-B6H12antihCD47scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:993)和pUC-ptet-5F9antihCD47scFv-V5-HIS(SEQ ID NO:994)。
将包含pUC-ptet-B6H12antihCD47scFv-V5-HIS或pUC-ptet-5F9antihCD47scFv-V5-HIS的大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并以0.8的光密度振荡(200rpm)生长，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导ptet-scFv的表达18小时，然后将细菌沉淀，在PBS中洗涤、收获、重悬于2mLPBS缓冲液中并在冰上超声裂解。将不溶性碎片在4℃下以12,000rpm旋下两次，每次15分钟。
为了确定在大肠杆菌DH5α中表达的抗CD47单链抗体是否功能性结合靶蛋白，进行ELISA测定。将平板在4℃下用每孔100μl 2μg/ml靶蛋白(人CD47、小鼠CD47、IgG和PBS，来自Rndsystems)吸收过夜。在室温下用2％BSA的PBS/0.1％Tween-20封闭孔2小时。洗涤三次后，将孔与细菌提取物在室温下孵育1小时。将孔用PBST(PBS/0.1％Tween-20)洗涤4次，并与HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)在封闭溶液中孵育40分钟。孵育后，用PBST洗涤孔4次，然后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)染色。使用ELISA读数器在450nm下测量信号强度。结果显示于表33，表明由基因工程化细菌表达的抗CD47-scFv可以与人CD47特异性结合。
表33.ELISA结合测定
Figure BDA0002194618080005581
Figure BDA0002194618080005591
实施例29.犬尿氨酸消耗菌株在CT26鼠肿瘤模型中降低肿瘤犬尿氨酸水平
在肿瘤环境中体内评估包含来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的基因工程化细菌消耗犬尿氨酸的能力。使用包含Trp:E缺失和在组成型启动子控制下表达来自荧光假单胞菌的犬尿氨酸酶的中等拷贝质粒的大肠杆菌Nissle菌株SYN1704(Nissle delta TrpE::CmR+Pconstitutive-Pseudomonas KYNU KanR)。
在两项研究中，根据提供的指南培养从ATCC获得的CT26细胞。将PBS中约1×106个细胞/小鼠皮下植入每只动物的右侧腹侧(BalbC/J(雌性，8周))，并监测肿瘤生长约10天。当肿瘤达到约100-150mm3时，将动物随机分组以进行给药。
对于肿瘤内注射，细菌在LB培养基中生长直至在600nm(A600nm)处达到0.4的吸光度(对应于2×108菌落形成单位(CFU)/mL)并在PBS中洗涤两次。将悬浮液在PBS或盐水中稀释，使得100μL可以以适当的剂量经肿瘤内注射到具有肿瘤的小鼠中。
CT26植入后大约10天，将细菌悬浮在0.1ml PBS中，对小鼠肿瘤内注射(1E7细胞/小鼠)100μl，如下所示：组1-生理盐水对照(n＝7)、组2-SYN1704(n＝7)。动物每周两次(BIW)根据它们的分组用生理盐水或菌株肿瘤内(IT)给药。称重动物并每周测量肿瘤体积两次。当肿瘤达到～2000mm3时对动物实施安乐死。收获血浆和肿瘤组织，并如本文所述通过LC/MS测量犬尿氨酸和色氨酸浓度。结果显示于图42A和42C。对于犬尿氨酸消耗菌株SYN1704，观察到犬尿氨酸的肿瘤内(P<0.001)和血浆(P<0.005)浓度的显著降低。色氨酸水平保持恒定(数据未示出)。
实施例30.在CT26肿瘤模型中对SYN94和SYN1704的动力学研究
评估在CT26肿瘤中KYN消耗菌株的单次施用对肿瘤KYN水平和肿瘤重量的影响。允许来自CRL的8周龄的雌性Balb/C小鼠(18-25g)适应设施至少3天。动物被放置在普通食物和水上。
在第8天，将CT26细胞(在PBS中～1e6个细胞/小鼠)SC植入到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长一周直至肿瘤达到～100-150mm3。然后根据表34(第1天)将动物称重、测量并随机分成处理组。通过肿瘤内给药以适当的浓度给动物施用SYN94或SYN1704。对于肿瘤内注射，将SYN94细胞从3.0×10e11 CFU/mL原液稀释至1×10e8CFU/mL的浓度，并将SYN1704细胞从原液稀释至1×10e8 CFU/mL的浓度。
表34.研究设计
Figure BDA0002194618080005601
在给药后每天观察动物与肿瘤生长有关的异常或过度疼痛的迹象。在第1天(T＝0组；组1)、第2天(T＝24h；组2和5)、第4天(T＝72h；组3和6)和第8天(T＝168h；组4和7)处死动物。
通过在适当的端点心脏流血收集各组的全血。将最大可获得的血液收集到LiHep管(BD)中。将样品保持在冰上直至它们在离心机中旋转(2000g，在4℃下10分钟)。然后将血浆转移到1.5mL Eppendorf管中并在-80℃下储存直至后来分析。将肿瘤样品分成两部分，并在重新称重的bead buster管中在适当的端点收集第一部分。将组织在管中称重，然后储存在-80℃下用于进一步分析。将肿瘤的另一部分固定在10％福尔马林中用于切片和分析。通过LCMS分析来自血液收集的血浆样品，并使用基于细胞的测定进行细胞因子分析。通过LCMS分析肿瘤样品的犬尿氨酸水平。结果如图43A-43C所示。
实施例31.小鼠CD40L的分泌
为了产生能够分泌CD40L的基因工程化细菌，根据本文所述的方法生产如表89所示的mCD40L1(47-260)和mCD40L2(122-260)构建体。mCD40L1(47-260)和mCD40L2(122-260)分别对应于全长mCD40L的细胞外部分和mCD4L的可溶形式。
表89.用于分泌鼠CD40L的菌株
Figure BDA0002194618080005611
包含含有ptet-PhoA-CD40L1(47-260)(SYN3366)和tet-PhoA-CD40L2(112-260)(SYN3367)的基于质粒的tet诱导型构建体的大肠杆菌Nissle和母体对照菌株SYN1557分别在LB培养基中生长过夜。将培养物在LB中以1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/ml的浓度添加至培养物中以诱导mCD40L1和mCD40L2表达。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用HRP缀合的抗V5抗体(Biolegend)检测mCD40-L1和mCD40L-2。结果显示在图25中。对于mCD40L1和mCD40L2，分别检测到在约32kDa和24kDa处的单一条带。
为了确定在澄清的上清液中由捕获的由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的mCD40L是否可以与mCD40功能性结合和/或通过抗mCD40L抗体检测到，通过用mCD40或抗mCD40L抗体包被的板进行ELISA测定。结果显示在表35中，表明由基因工程化细菌分泌的mCD40L1(47-260)和mCD40L2(112-260)可以与mCD40结合。
表35.CD40 ELISA结合测定
Figure BDA0002194618080005621
实施例32.SIRPα和变体和抗CD47 scFv的分泌
为了产生能够分泌抗SIRPα的基因工程化细菌，根据本文所述的方法生产在表36中显示的构建体。显示的序列包括SEQ ID NO:1094-1104和SEQ ID NO:1105-1121。
表36.用于分泌SIRPα、SIRPα变体和mCD47 scFv配体的菌株
Figure BDA0002194618080005631
将大肠杆菌Nissle菌株SYN1557、SYN2996、SYN3159、SYN3160、SYN3021、SYN3020和SYN3161在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将浓度为100ng/mL的无水四环素(ATC)加入培养物中以诱导SIRPα或SIRPα变体或CD47scFv表达。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗V5-HRP抗体(Biolegend)检测SIRPα和SIRPα变体和抗CD47 scFv。结果显示在图26中。对于WT mSIRPα、CV1SIRPα、FD6x2SIRPα、FD6SIRPα-IgG4、CV1SIRPα-IgG4和抗CD47 scFv分别检测到在约46kDa、20kDa、33kDa、42kDa、42kDa和30kDa处的单一条带。
为了确定由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的野生型SIRPα、SIRPα变体和抗CD47-scFv是否可以功能性结合CD47和/或通过抗SIRPα抗体检测到，通过用相应的抗体或配体包被平板进行ELISA测定。结果显示在表37中，表明基因工程化细菌分泌的mSIRPα和抗mCD47scFv两者均可与mCD47结合。
表37.SIRPα/CD47 ELISA结合测定
Figure BDA0002194618080005641
Figure BDA0002194618080005642
为了确定大肠杆菌Nissle分泌的SIRPα、SIRPα变体和抗CD47scFv是否与小鼠细胞上的CD47结合，使用CT26细胞进行流式细胞术分析。CT26是在其细胞表面上表达CD47的小鼠结肠癌细胞系。
CT26细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(DMEM)中生长。将细胞旋下，吸出上清液，将沉淀重悬于1ml D-PBS中，转移至冷冻测定管(1×106个细胞)中，并在D-PBS中洗涤3次。将细胞重悬于含有0.5％BSA的D-PBS中，向其中加入10μl上清液(10倍浓缩)并在4℃孵育1小时。使用来自SYN1557的上清液用作基线阴性对照。然后将细胞重悬于0.5ml PBS中，稀释至适当浓度并在流式细胞仪上分析。结果显示在(图27和图28)中。对含有分泌的SIRPα、SIRPα变体和抗CD47 scFv的样品，观察到相对于基线的群移位，对表达CV1SIRPα-IgG4的SYN3021观察到最大移位。
接下来，进行竞争测定以确定基因工程化细菌分泌的鼠SIRP是否可以和重组mSIRPα或抗CD47抗体与CT26细胞上的鼠CD47竞争结合。使CT26细胞生长并基本上如前文所述进行流式细胞术方案，不同之处在于在分泌的FD6x2sirpα或FD6sirpαhIgG4的孵育期间加入重组SIRPα(Rndsystems)或抗CD47抗体(Biolegend)。图29和图30分别显示与重组SIRPα和抗CD47抗体竞争的结果。重组SIRPα和抗CD47抗体两者均能够与分泌的SIRPα竞争结合CT26细胞上的CD47。
实施例33.透明质酸酶的分泌
为了产生能够分泌透明质酸酶的基因工程化细菌，根据本文所述的方法如图31A所示生产构建体(SYN2998：Nissle delta PAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA--FLAG-humanhyaluronidase-V5-His tags；SYN2997：Nissle delta PAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA-FLAG-human hyaluronidase-V5-His；SYN3369:Nissle delta PAL::CmR；p15A-ptet-RBS-PhoA-FLAG-leech hyaluronidase-V5-His)。
将大肠杆菌Nissle菌株SYN1557、SYN2997(分泌小鼠透明质酸酶)、SYN2998(分泌人透明质酸酶)和SYN3369(分泌水蛭透明质酸酶)在LB培养基中培养过夜。将培养物在LB中1:100稀释并振荡(200rpm)至光密度为0.8，此时将培养物冷却至室温，并将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导表达透明质酸酶。
诱导18小时后，将细胞旋下，并收集上清液。为了产生无细胞培养基，将澄清的上清液进一步通过0.22微米过滤器过滤以除去任何残留的细菌并置于冰上。
然后通过蛋白质印迹分析上清液。将来自25μl上清液的蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗V5-HRP抗体(Biolegend)检测透明质酸酶。结果显示在图31B中。对于分泌的小鼠和人透明质酸酶两者，检测到在约50kDa处的单一条带，对于水蛭透明质酸酶，检测到在约57kDa处的单一条带。
为了确定由基因工程化大肠杆菌Nissle分泌的透明质酸酶是否是有活性的，根据制造商的说明书使用生物素化的透明质酸包被的平板进行关于裂解透明质酸能力的透明质酸酶活性测定。简而言之，透明质酸酶将切割聚合物并导致平板上生物素的损失，然后可以通过链霉亲和素-HPR和底物检测。结果显示在图32中，表明由基因工程化细菌分泌的透明质酸酶能够降解透明质酸。母体菌株SYN1557用作阴性对照。对分泌的水蛭透明质酸酶获得的结果显示在图33A、图33B和图33C中。
实施例34.生产IL-15的工程化大肠杆菌Nissle菌株
菌株构建和生化分析：
为了产生能够分泌具有生物活性的白细胞介素15(IL-15)的工程化大肠杆菌Nissle菌株，构建了融合蛋白，其中IL-15融合至形成功能性受体所需的IL-15Rα的最小区域(称为Sushi结构域)。IL-15和IL-15Rα形成功能性复合物，其刺激细胞信号传导，以及在称为反式呈递的过程中刺激表达IL-2Rβ和γc的相邻淋巴细胞的活化和增殖(参见，例如Ochoa等,High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology.2013 Apr 1；2(4):e23410)。IL-15的生物活性通过两个不同的修饰而大大提高：在IL-15的氨基酸72处的天冬酰胺至天冬氨酸的置换(Zhu X,Marcus WD,Xu W,LeeHI,Han K,Egan JO,Yovandich JL,Rhode PR,Wong HC.Novel human interleukin-15agonists.J Immunol.2009；183:3598–3607)，和/或通过细胞相关的IL-15Rα通过模拟IL-15的反式呈递与IL-15Rα的sushi结构域直接融合(Mortier等,Soluble interleukin-15receptor alpha(IL-15R alpha)-sushi as a selective and potent agonist of IL-15action through IL-15R betagamma.Hyperagonist IL-15 x IL-15R alpha fusionproteins.J Biol Chem 2006；281:1612-9)。
为了生产经修饰的重组IL-15-Sushi融合蛋白，将具有N72D突变的IL-15单体融合到由20个氨基酸接头连接的sushi结构域的C末端(78个氨基酸)。向IL-15R sushi结构域的N末端包含FLAG标签和因子Xa切割位点以促进标签的检测、纯化和去除。为了促进向外周胞质的易位，将IL15融合蛋白克隆到10个成员的质粒文库中。分泌的融合蛋白的编码序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并从IDT Technologies订购为双链DNA片段。一旦接收到DNA，就使用标准克隆方法将其消化并连接到10个成员的质粒文库中。质粒文库的各成员含有低拷贝质粒骨架和驱动可变优化核糖体结合位点和分泌标签的表达的Ptet启动子。一旦将IL-15融合物C末端克隆分泌标签，将质粒转化到SYN1557(deltaPAL，可扩散外膜(DOM)表型)中以产生IL-15-Sushi分泌菌株SYN3516-SYN3525。构建体序列的非限制性实例包括SEQID NO:1132-1137和SEQ ID NO:1138-1144。表37提供了IL-15-Sushi菌株的描述。表38提供了使用WT IL-15产生的菌株的列表。
表37.菌株描述
Figure BDA0002194618080005671
Figure BDA0002194618080005681
表38.菌株描述
Figure BDA0002194618080005682
通过SYN3525生产IL-15和体外定量
为了测定IL-15的生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定日期前，阴性对照菌株(SYN1557)和IL-15-sushi结构域生产菌株(SYN3516-SYN3525)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃下生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导IL-15-sushi融合蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
为了通过质粒文库评估IL-15融合物的生产，SYN1557和生产IL-15的文库的培养物被诱导并收获重复两份。将这些上清液连续稀释并使用IL-15ELISA试剂盒(Human IL-15Quantikine ELISA Kit–D1500,R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。显示在表39中的筛选分泌文库的数据显示来自包含来自大肠杆菌的PpiA分泌信号作为前导肽的SYN3525的最大生产。SYN1557上清液在ELISA中未显示交叉反应性(数据未显示)。
表39
Figure BDA0002194618080005691
为了进一步评估来自SYN3525的IL-15生产，在挡板烧瓶中使菌株生长并诱导以产生最大收率。从SYN3525的过滤上清液中，将SYN1557和SYN3525的样品稀释重复三份，并在ELISA试剂盒(Human IL-15Quantikine ELISA Kit-D1500,R&D Systems,Minneapolis,MN)上运行。这些分析的结果如表40所示。结果显示，在最大诱导条件下，SYN3525上清液含有733-795ng/mL的在IL-15ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表40.来自三次不同ELISA运行的SYN3525上清结果
SYN3525 IL-15(ng/ml)
运行1 795.23
运行2 733.75
运行3 792.80
平均 773.93
SEM(n＝3) 20.10
为了比较，来自表达WT IL-15的构建体的分泌显示于表41中。
表41.
Figure BDA0002194618080005701
实施例35.细菌地分泌的IL-15的功能测定
接下来，进行功能测定以证实从SYN3525分泌的IL-15是功能性的。已显示STAT3和STAT5在配体结合后被IL-15Rα磷酸化。
通过Miltenyi untouched pan-T-cell试剂盒从人白细胞纯化T细胞(收率＝～5e7个细胞/制备物)。通过用Phytohaemagglutinin P(PHA)进行48小时的温和刺激来诱导IL15Rα表达。用来自表达IL15的细菌SYN 3525的上清液处理激活的T细胞15分钟。将经处理的细胞在基于多聚甲醛的溶液中固定，然后在90％甲醇中进行苛刻的通透化。在IL15R+CD3+细胞中通过多色流式细胞术定量磷酸-STAT5的调节。结果显示在图55中，显示SYN3525来源的IL15表现出与rhIL15类似的生物活性。在来自两种单独的细菌制备物的上清液之间观察到一致的结果。
实施例36.用于分泌的二聚化IL-12的构建
菌株工程化：
为了产生能够分泌具有生物活性的白细胞介素12(IL-12)异二聚体的工程化大肠杆菌Nissle菌株，产生了构建体，其中两个白细胞介素-12单体亚基(IL-12A(p35)和IL-12B(p40))通过接头共价连接。
为了便于从大肠杆菌Nissle生产重组人IL-12蛋白的二聚化，'GGGGSGGGGSGGGGS'的15个氨基酸的接头(SEQ ID NO:1247)被插入在两个单体亚基(IL-12A(P35)和IL-12B(p40))之间以产生强制二聚体人IL-12(diIL-12)融合蛋白，并对该序列进行密码子优化。
为了促进易位到外周胞质，将分泌标签添加到diIL-12融合蛋白的N末端。含有诱导型Ptet启动子、核糖体结合位点、diIL-12编码序列和其它必需接头的元件的DNA序列由IDT Technologies合成，随后克隆到高拷贝数质粒载体中。将质粒转化到SYN1555、SYN1556、SYN1557或SYN1625(分别包含nlp1、tolA、PAL或lpp缺失以产生可扩散膜表型)以产生二聚化人IL-12(diIL-12)分泌菌株。
表43.非限制性IL-12构建体序列
Figure BDA0002194618080005721
表44.非限制性IL-12构建体多肽序列
Figure BDA0002194618080005722
Figure BDA0002194618080005731
通过SYN3466至SYN3505生产diIL-12用于体外测定：
为了测定IL-12生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量，使用振荡平板如下。阴性对照菌株(SYN1555、SYN1556、SYN1557或SYN1625)和diIL-12生产菌株(SYN3466至SYN3505)两者被划线到LB琼脂平板上并分别在氯霉素，或者氯霉素和羧苄青霉素下在37℃生长。在过夜生长后，挑取个体菌落并用于接种4mL 2YT培养基的起始培养物，用于将来振荡平板生长。用琼脂平板中使用的相同抗生素接种起始培养物。当起始培养物达到饱和时，将培养物以1:25反向稀释到具有适当抗生素的新的2YT振荡平板中。此起始培养物在37℃生长2小时至OD600＝～0.8-1。然后通过添加Tc诱导物(100μg/mL)诱导培养物。这些诱导的培养物在30℃下振荡孵育4小时以促进IL-12的生产。
当生产阶段完成后，从培养箱中取出培养物的振荡平板，并在20000×g离心10分钟以沉淀全部细胞。保留上清液用于ELISA分析。
通过ELISA定量上清液中的diIL-12：
为了评估上清液中diIL-12的量，使用来自R&D systems的人IL-12p70Quantikine ELISA试剂盒测定样品。这些分析的结果如表45所示。结果显示，上清液含有17至309pg/mL的在IL-12ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平。
表45.来自ELISA分析的上清液结果(pg/mL)
Figure BDA0002194618080005741
Figure BDA0002194618080005751
实施例37.生产IL-15的工程化大肠杆菌Nissle菌株
菌株工程化
为了生产能够分泌具有生物活性的白细胞介素15(IL-15)的工程化大肠杆菌Nissle菌株，构建了融合蛋白，其中IL-15融合至形成功能性受体所需的IL-15Rα的最小区域(称为Sushi结构域)。IL-15和IL-15Rα形成功能性复合物，其刺激细胞信号传导，以及在称为反式呈递的过程中刺激表达IL-2Rβ和γc的相邻淋巴细胞的活化和增殖(参见，例如Ochoa等,High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology.2013 Apr 1；2(4):e23410)。IL-15的生物活性是通过经由细胞相关的IL-15Rα通过模拟IL-15的反式呈递与IL-15Rα的sushi结构域直接融合而极大改善(Mortier等,Soluble interleukin-15 receptor alpha(IL-15R alpha)-sushi as a selectiveand potent agonist of IL-15 action through IL-15R betagamma.Hyperagonist IL-15x IL-15R alpha fusion proteins.J Biol Chem 2006；281:1612-9)。
为了生产重组IL-15-Sushi融合蛋白，IL-15单体融合到由20个氨基酸的接头连接的sushi结构域的C末端。为了促进向外周胞质的易位，将19410、tort或pelB分泌标签添加到IL-15-Sushi融合蛋白的N末端。含有Ptet启动子、RBS、IL-15-Sushi编码序列和其它必需接头的DNA序列由IDT Technologies合成，随后克隆到由IDT Technologies提供的在tet诱导型启动子控制下的高拷贝数质粒载体中。将质粒转化到SYN1557(delta PAL，可扩散外膜(DOM)表型)或SYN94(无PAL缺失大肠杆菌Nissle菌株)中以生产IL-15-Sushi分泌菌株SYN3458至SYN3463。表46和表47列出了构建体序列的许多非限制性实例。
表46.非限制性IL-15构建体多肽序列
Figure BDA0002194618080005761
表47.非限制性IL-15构建体多肽序列
Figure BDA0002194618080005762
通过SYN3458至SYN3463生产IL-15用于体外测定：
为了测定IL-15生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定日期前，阴性对照菌株(SYN1557)和IL-15-sushi结构域生产菌株(SYN3458至SYN3463)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导IL-15-sushi融合蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
通过ELISA定量SYN3458至SYN3463上清液中的IL-15：
为了评估在过滤上清液中的IL-15的生产，将SYN1557和SYN3458至SYN3463的样品稀释重复三份，并在人IL-15Quantikine ELISA试剂盒(Ra&D Systems)上运行。这些分析的结果如表48所示。结果显示，SYN3458至SYN3463上清液含有4至275ng/mL在IL-15ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN94和SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表48.来自三次不同ELISA运行的上清液结果
最终菌株 宿主菌株 质粒 ng/mL
SYN3460 SYN1557 ptet-pelBss-hIL15-SUSHI-融合体 275
SYN3461 SYN1557 ptet-19410ss-hIL15-SUSHI-融合体 166
SYN3458 SYN1557 ptet-tortss-hIL15-SUSHI-融合体 59
SYN3459 SYN94 ptet-tortss-hIL15-SUSHI-融合体 78
SYN3462 SYN94 ptet-pelBss-hIL15-SUSHI-融合体 4
SYN3463 SYN94 ptet-19410ss-hIL15-SUSHI-融合体 72
实施例38.CXCL10的分泌
为了生产重组CXCL10趋化因子，设计了合成构建体(未提供数据)。CXCL10蛋白的分泌/可溶形式经密码子优化以在大肠杆菌中表达，并从IDT Technologies订购为双链DNA片段。为了促进向外周胞质的易位，将CXCL10可溶性蛋白克隆到10个成员的质粒文库中。一旦接收到DNA，就使用标准克隆方法将其消化并连接到10个成员的质粒文库中。质粒文库的各成员含有低拷贝质粒骨架和驱动可变优化核糖体结合位点和分泌标签表达的Ptet启动子。一旦将CXCL10 C末端克隆分泌标签，将质粒转化到SYN1557(deltaPAL，可扩散外膜(DOM)表型)中以产生CXCL10分泌菌株SYN3404和SYN3406-SYN3414。构建体序列包括SEQ IDNO:1205、SEQ ID NO:1206、SEQ ID NO:1208和SEQ ID NO:1209。
表49.菌株描述
ID 基因型 构建体
SYN3414 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.PpiA-CXCL10
SYN3413 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.phoA-CXCL10
SYN3412 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.PelB-CXCL10
SYN3411 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.OppA-CXCL10
SYN3410 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.MalE-CXCL10
SYN3409 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.HdeB-CXCL10
SYN3408 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.GspD-CXCL10
SYN3407 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.Gltl-CXCL10
SYN3406 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.DsbA-CXCL10
SYN3404 PAL(PAL::Cm) p15a.Ptet.Adhesin-CXCL10
为了测定CXCL10生产和/或定量生物活性，生长培养物并诱导，然后收集上清液并通过ELISA定量。在测定前日期，阴性对照菌株(SYN1557)和CXCL10生产菌株(SYN3404-SYN3414)两者被划线到LB琼脂平板上并在适宜的抗生素下在37℃生长。对于每50ml待生长的诱导培养物，用单一菌落接种2YT培养液的2ml起始培养物，允许在37℃下生长2小时，在8000×g下旋下10分钟，并且将细胞再悬浮于具有无水四环素(aTc)诱导剂(100ng/mL)的原始体积的2YT培养基。这些培养物放置在30℃振荡4小时以诱导CXCL10蛋白的生产。接下来，从培养箱中取出培养物并以20,000×g离心10分钟以沉淀所有细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以生产无菌的上清液。这些上清液用于基于细胞的测定。
为了通过质粒文库评估CXCL10生产，SYN1557和生产CXCL10的文库的培养物被诱导并收获重复两份。将这些上清液连续稀释并使用CXCL10 ELISA试剂盒(Human CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kit–DIP100,R&D Systems,Minneapolis,MN)定量。显示在表50中的筛选我们的分泌文库的数据显示来自SYN3413的最大生产，其包含来自大肠杆菌的PhoA分泌信号作为前导肽。SYN1557上清液在ELISA中未显示交叉反应性(数据未显示)。
表50.CXCL10分泌
为了进一步评估从SYN3413生产CXCL10，在挡板烧瓶中使菌株生长并诱导产生最大收率。从SYN3413的过滤上清液中，将SYN1557和SYN3413的样品稀释重复三份，并在ELISA试剂盒(Human CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA Kit-DIP100，R&D Systems，Minneapolis，MN)上运行。这些分析的结果如表112所示。结果显示，在最大诱导条件下，SYN3413上清液含有199-232ng/mL在CXCL10 ELISA测定中反应呈阳性的物质。相比之下，SYN1557上清液具有不可检测的水平(未显示)。
表51.来自SYN3414的三个重复的分泌的hCXCL10的浓度
SYN3414 CXCL10(ng/ml)
运行1 199.71
运行2 231.96
运行3 232.16
平均 221.28
SEM(n＝3) 10.78
CXCL10的功能测定
为了确定从如上所述的任何菌株分泌的CXCL10是否是功能性的，进行Chemotaxis测定，基本上如Mikucki等所述(Mikucki等，Non-redundant Requirement for CXCR3Signaling during Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor VascularCheckpoints；Nat Commun.2015；6:7458,其全部内容通过引用并入本文)。
简言之，将细胞痕迹标记的幼稚(或扩增)人CD8+T细胞转移到顶部有T细胞(5×105细胞)、底部有rCXCL10/上清液、存在或不存在PTX或抗CXCL10的24孔transwell平板(5uM孔)中。细胞孵育3小时，并通过流式细胞术计数迁移的细胞。或者，通过流动、western或ELISA测量phosphoAKT。
实施例39.生产STING激动剂的菌株的产生
为了产生STING激动剂菌株，DacA(单核细胞增多性李斯特氏菌环二AMP合酶)克隆到Ptet启动子控制下的p15中，以产生如表53所述的菌株。总结构建体序列。
表53.c-di-AM生产菌株
Figure BDA0002194618080005811
实施例40.体外STING激动剂生产
首先体外评估新产生的菌株生产c-di-AMP的能力。
将大肠杆菌Nissle菌株SYN3527(包含DacA构建体)和对照菌株在LB培养基中培养过夜。将培养物在补充了0.5％(w/v)葡萄糖的M9基本培养基中稀释1:25，并在37℃下振荡(350rpm)生长2小时。将培养物稀释至光密度为0.5，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度添加至培养物中以诱导DacA的表达。诱导4小时后，取出样品用于环二核苷酸生产的LC/MS分析。将样品以5000RPM离心20分钟以分离细胞和细胞外部分。然后使用细胞沉淀物确定细胞内环二-AMP，并使用培养基上清液确定环二AMP的细胞外积累。通过LC/MS确定浓度。
结果示于图42B。表明工程化菌株能够在细胞内生产c-di-AMP，并且在较低程度上细胞外生产c-di-AMP。对于野生型对照，在细胞内或细胞外部分中未发现环二AMP(数据未显示)。
实施例41.细菌地生产的STING激动剂诱导免疫应答
为了确定细菌地生产的STING激动剂或细菌chassi本身是否负责诱导免疫应答，将活的和热杀灭的SYN3527加入到RAW 267.4小鼠巨噬细胞系的上清液中，并且测量IFN-β1mRNA的水平。
如在图43中所看到的，IFNb1 mRNA表达在c-di-AMP分泌菌株下剂量依赖性增加，但当热杀灭时不是。
实施例42.STING激动剂生产菌株的体内活性
为了确定STING激动剂生产菌株SYN3527(包含基于质粒的、来自单核细胞增多性李斯特氏菌的四环素诱导型p15a Ptet-DacA的大肠杆菌Nissle)的耐受性、定植和活性，在B16肿瘤模型中评估肿瘤体积、重量和T细胞应答。
为了生产用于该研究的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株于37℃振荡孵育直到该培养物达到对数期(OD600＝0.8-1.0)结束。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据如下文和图44A所述的时间线，将B16肿瘤植入小鼠，对小鼠瘤内注射STING激动剂生产细菌和对照。处理在不同时间点取得的样品用于CFU计数每克肿瘤、细胞因子分析(IFN-β和T细胞组)和肿瘤引流淋巴结(TDLN)的流式细胞术分析。
简言之，在第9天将B16细胞SC植入(在PBS中2×10e5细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。在第3天，监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到约50-80mm3时，将小鼠随机分组(N＝15/组/5只小鼠/时间点)进行肿瘤内给药，如下：盐水(对照组，组1)、SYN94(链霉素抗性Nissle，组2，1×10e7)和SYN3527(STING激动剂，组3，1×10e7)。基于组将适当的细菌或盐水(用于注射的对照)给药至动物。4小时后，通过腹膜内注射用10μg ATC(无水四环素)处理小鼠。在第2天，在ATC剂量后24小时，将来自各处理组的5只小鼠处死，5只小鼠/组(组1-4)，并处理样品用于分析。在第4天，称重小鼠，测量肿瘤体积，并将适当的处理/组给药至小鼠。4小时后，向小鼠注射10μg ATC。在第5天，在ATC剂量后24小时处死5只小鼠/组。在第8天，称重剩余小鼠的肿瘤，测量并将适当的处理/组给药至小鼠。在第9天，在ATC剂量后24小时将5只小鼠/组处死。
在第1、4和9天的肿瘤体积示于图44B和对于个体小鼠示于图44C，表明在该时间段内SYN3527的施用导致排斥或肿瘤生长的控制(在第9天，对于SYN3527相对于盐水对照，p<0.02)。显示于图44D中的在施用STING激动剂生产细菌后第9天的肿瘤重量显示与盐水对照处理相比显著的肿瘤消退(p<0.02)。通过将细胞置于单细胞悬液中并用以下抗体进行染色来进行来自肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞的流式细胞术分析：抗CD4-APC、TCR-β-PECy7、CD8-α-BV785、CD25-BV650和FoxP3-PE(均来自Biolegend)。肿瘤消退与如通过流式细胞术分析测量的肿瘤引流淋巴结(TDLN)中总T细胞数量的增加相关，(对于SYN3527相对于盐水对照，p<0.03)，其可以指示肿瘤特异性T细胞的活化和扩增(图44E)。
对于细胞因子分析，根据制造商的说明书进行Luminex测定。为了确定细菌地生产的STING激动剂对固有免疫系统的激活，评估了INF-β1、IL-6、IL-1β和MCP-1(Ccl2)的水平，第2天和第9天的结果显示在图45A和图45B以及图46A和图46B中。结果表明，SYN3527生产的STING激动剂能够显著增加肿瘤中第2天的IFN-β生产(相对于对照或SYN94，P<0.008)，以及在第2天但不是第9天诱导相对于单独的盐水和Nissle的一般固有免疫应答，如通过IL-6(相对于对照，p<0.006)、TNF-α(相对于对照，**p<0.002，相对于SYN94，*p<0.01)和MCP-1诱导所示。第2天肿瘤内的固有应答在第9天转换为T细胞相关应答，如T细胞相关细胞因子颗粒酶B(相对于对照，p<0.006；相对于SYN94，<0.03)、IL-2(相对于对照，p<0.03)和IL-15(相对于对照或SYN94，p<0.05)的生产所示(图46B)。
实施例43.在MC38肿瘤模型中腺苷消耗菌株与全身性抗PD-1和抗CTLA-4的组合的活性
在C57BL/6-MC38同系肿瘤模型中评估腺苷消耗菌株SYN1656增强组合的抗CTLA4和抗PD-1的抗肿瘤应答的能力。
为了生产在该研究中使用的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm离心20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据表54的研究设计，将MC38肿瘤植入小鼠，并且对小鼠肿瘤内注射腺苷消耗细菌和腹膜内注射抗CTLA-4和抗PD-1抗体。在第9天，将MC38细胞(1×105/小鼠/100μl)SC植入每只动物的右侧腹侧中。监测肿瘤生长；当肿瘤在第1天达到～50-80mm3时，将小鼠随机分入处理组，如表54所示。
在一周内记录肿瘤体积和体重三次，在两次测量之间间隔1-2天。
表52.研究设计
Figure BDA0002194618080005841
Figure BDA0002194618080005851
结果表明，腺苷消耗菌株具有在MC38模型中改善抗CTLA-4/抗PD-1抗体介导的抗肿瘤活性的能力。具体地，在抗PD-1/抗CTLA-4组中，12只小鼠中的5只对处理有应答，包括12只中的1只具有完全应答。在抗PD-1/抗CTLA-4加SYN1656组中，相同数量(12只中的5只)有应答，但5个应答者中的至少4个是完全应答者。
实施例44.用于将5-FC转化为5-FU的菌株的产生
5-FU是受其全身性毒性限制的常见化学治疗剂。但是，5-FC的耐受性要好得多。使用codA(胞嘧啶脱氨酶)或codA(胞嘧啶脱氨酶)与upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)的融合物，5-FC可在肿瘤中转化为活性药物形式5F-UMP，从而最小化相关副作用。
为了产生5-FU生产菌株，将codA(胞嘧啶脱氨酶)或codA(胞嘧啶脱氨酶)与upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶)的融合物克隆到在Ptet启动子控制下的p15载体中以生产如表58所述的菌株。
表58.
菌株: 基因型
SYN3529 Nissle pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶)
SYN3620 Nissle p15A Ptet-CodA::Upp融合物
实施例45.5-FC至5-FU的体外转化
首先体外评估新产生的菌株将5-FC转化为5-FU的能力。
大肠杆菌Nissle菌株SYN3529、前文所述的SYN3620和SYN94对照(具有链霉素抗性的野生型Nissle)在LB培养基中培养过夜。培养物在补充了0.5％葡萄糖的M9基本培养基(w/v)中稀释1:50，并在37℃下振荡(350rpm)生长2小时，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导CodA或CodA-Upp融合体的表达。诱导2小时后，将培养物旋下，吸出培养基并将细胞沉淀重悬浮于M9+0.5％葡萄糖(w/v)+ATC(100ng/mL)+10mM 5-氟胞嘧啶(Sigma-
Figure BDA0002194618080005861
)中。然后将这些培养物返回到37℃培养箱，并允许振荡孵育另外2个小时，此时取出样品用于5-FU生产的LC/MS分析。将样品以5000RPM离心20分钟以分离细胞和细胞外部分。然后将细胞沉淀用于测定细胞内5-FC和5-FU，并使用培养基上清液确定5-FU的细胞外积累或5-FC的消耗。
结果示于图47A和图47B，表明工程化菌株能够以高于野生型对照菌株的速率降解5-FC(图47A)并生产5-FU(图47B)。由于对于5-FUMP没有可用标准品，我们无法测量来自SYN3620的5-FUMP的累积。
实施例45.在CT26肿瘤模型中5F-C至5-FU转化者的体内活性
为了确定5-FC至5-FU转化菌株SYN3529(包含pUC-Kan-tet-CodA(胞嘧啶脱氨酶))和SYN3620(包含pUC-Kan-tet-CodA::Upp融合体)的体内活性和功效，在CT26肿瘤模型中评估肿瘤体积并与PBS对照进行比较。
为了制备用于研究的细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
根据如下文和图49A所述的时间线，向小鼠植入CT26肿瘤，瘤内注射生产能够将5-FC转化为5-FU的酶的细菌或载剂对照，并用5-FC给药。在不同时间点测量肿瘤体积，同时在实验结束时对肿瘤进行称重和处理，以评估5-FC的相对消耗作为菌株生物活性的量度。
简言之，在第15天将CT26细胞SC植入(在PBS中1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长直至肿瘤达到～150-450mm3。在第0天，将小鼠随机分组(每组N＝5)用于肿瘤内给药如下：PBS(组1，载剂对照)、SYN3529(组2，1×107CFU)、SYN3620(组3，1×107CFU)。测量肿瘤大小，并在第0天、第2天和第5天用细菌或PBS I.T.注射小鼠，然后在4小时后是ATC(1ug I.P.)。从第3天开始，通过IP注射每天施用5-FC(500mg/kg)。在第6天处死小鼠用于最终分析。
在第0、2和5天的平均肿瘤体积示于图49B和对于个体小鼠示于图49C，表明SYN3529或SYN3560与5-FC一起的施用导致与PBS对照相比在该时间段内肿瘤生长的迟钝。显示于图49D中的在施用细菌后第6天、5-FC给药后第3天的肿瘤重量显示与PBS对照处理相比肿瘤质量的减少。肿瘤匀浆的质谱分析证实与PBS对照相比，细菌地定植的肿瘤的5-FC水平的降低，表明5-FC原位转化为其活性形式5-FU(图49E)。
实施例46.组合的犬尿氨酸消耗者和STING激动剂生产者的产生和菌株活性的体外测量
为了产生消耗犬尿氨酸并生产STING激动剂的菌株，用先前在SYN3527(克隆到在Ptet启动子控制下的p15载体中的DacA)中使用的构建体转化SYN2028(包含Nissle HA3/4::PSynJ23119-pKynase TrpE::CmR)，以产生如表57所述的菌株。
表57.
Figure BDA0002194618080005871
Figure BDA0002194618080005881
接下来，体外评估新产生的菌株消耗犬尿氨酸并生产STING激动剂的能力。大肠杆菌Nissle菌株SYN094(野生型对照)、SYN2028(KYN)、SYN3527(STING)和SYN3831(KYN+STING)在含有适当抗生素的LB培养基中生长过夜。培养物在补充了0.5％葡萄糖和适当抗生素或LB和抗生素的M9基本培养基中稀释1:25(w/v),并在37℃下生长振荡(350rpm)2小时。
对于环二AMP生产的测量，在M9培养基中的培养物用相同的M9补充培养基稀释至0.5的光密度(600nm)，此时将无水四环素(ATC)以100ng/mL的浓度加入到培养物中以诱导DacA的表达。将细胞再诱导4小时以允许环二AMP的积累。
取出样品用于环二核苷酸生产的LC/MS分析。将样品以10000×g离心5分钟以分离细胞和细胞外部分。然后将细胞沉淀用于测定细胞内环二AMP。通过LC/MS确定浓度。
为了量化犬尿氨酸消耗，将LB培养物旋下并重悬于含有100μM L-犬尿氨酸(Sigma-
Figure BDA0002194618080005882
)的LB中至光密度(600nm)为1.0。然后将这些培养物置于37℃振荡4小时以允许犬尿氨酸的消耗。对于犬尿氨酸消耗测量，从各培养物中取出样品并以10000×g旋转5分钟以分离细胞和细胞外部分。取出培养基上清液并用于通过LC/MS分析确定犬尿氨酸的消耗。
显示于图50A的结果表明工程化菌株SYN3831能够类似于SYN3527生产环二AMP，其中其犬尿氨酸消耗母体SYN2028不能生产环二AMP。图50B的结果表明，新的组合菌株SYN3831也保留了与其母体SYN2028类似的消耗犬尿氨酸的能力。总的来说，这些结果支持在体外组合菌株SYN3831具有生产STING激动剂环二AMP和消耗AHR激动剂犬尿氨酸的能力两者。
实施例47.对分泌的IFN-γ的功能分析
接下来，进行了研究以证实从基因工程化细菌分泌的IFN-γ是功能性的。基于在IFNγ与其受体结合后STAT1的增加的磷酸化，采用基于细胞的测定。IFN-γ的生物活性可以通过流式细胞术定量STAT1磷酸化来确定。
接下来，进行了研究以证实从基因工程化细菌分泌的IFN-γ是功能性的。基于在IFNγ与其受体结合后STAT1的增加的磷酸化，采用基于细胞的测定。IFN-γ的生物活性可以通过流式细胞术定量STAT1磷酸化来确定。
简而言之，用来自表达鼠IFNg的细菌(包含PAL::Cm P15APtet-87K PhoA-mIFNg的SYN3543)的上清液处理小鼠RAW264.7细胞15分钟。将经处理的细胞在基于多聚甲醛的溶液中固定，然后在90％甲醇中进行苛刻的通透化。通过流式细胞术定量磷酸-STAT1的调节，结果显示在图57A和57B中。
图57A和图57B显示在两个独立的测定中SYN3543的生物活性。
实施例48.CD40L分泌菌株SYN3367在体内的活性
为了确定CD40L分泌菌株SYN3367(包含PAL::Cm pUC-tet-PhoA-mCD40L 112-260；在本实施例中和图51中称为SYN-CD40L)的体内活性，在CT26肿瘤模型中通过流式细胞术评估肿瘤内抗原呈递细胞(APC)的激活，并与SYN1557(DOM突变体；在本实施例中和图51中称为SYN)或重组小鼠CD40L(R&D Systems)的处理进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞SC植入(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；当肿瘤达到～80-100mm3时，将小鼠随机分组(每组N＝6)用于肿瘤内给药，如下：SYN1557(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)、SYN3367(mCD40L分泌者，组2，1×107)，和重组mCD40L(1μg；组3)。在第0天，对小鼠I.T.注射细菌。在第1、4和7天，通过I.P.注射(三次脉冲)向所有组注射1μg ATC。在第1、4和7天，通过I.T.注射用1μg重组CD40L处理组3。在第8天，处死所有小鼠，3只小鼠用于通过流式细胞术分析肿瘤内APC的激活，并且3只小鼠用于通过CFU铺板测量细菌定植。
将三个代表性肿瘤均质化，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图51B所示，SYN-CD40L以与SYN类似的程度定植肿瘤，达到高达1×108CFU/g肿瘤。通过在37℃下在DNA酶和Liberase TL(Sigma)的混合物中消化肿瘤30分钟、将细胞置于单细胞悬浮液中并用以下抗体进行染色，进行来自三个代表性肿瘤的肿瘤内APC的流式细胞术分析：抗MHCII(IA/IE)、CD45.2、CD40、Gr1、CD197(CCR7)、CD11b、CD11c(均来自Biolegend)。用SYN-CD40L处理CT26肿瘤导致肿瘤内树突细胞上更高水平的CCR7表达(SYN-CD40L相对于SYN对照，P<0.04)，以及朝向巨噬细胞上的更高表达的趋势(图51C)。另外，在肿瘤中的树突细胞和巨噬细胞两者上观察到朝向CD40的更高表达的趋势。这些结果表明，SYN-CD40L处理导致肿瘤内关键APC亚群的激活增加。
实施例49.hTNFα在CT26肿瘤中的活性
为了在CT26肿瘤中确定hTNFα表达菌株SYN2304(包含PAL::CMP15A TetR Ptet-PhoA-TNFα；在本实施例和图52中称为SYN-TNFα)的体内活性，评估肿瘤体积，并且与SYN1557(DOM突变体；在本实施例和图52中称为SYN)进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基中。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞SC植入(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；当肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分组(每组N＝5)用于肿瘤内给药，如下：SYN(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)和SYN-TNFα(TNF-α分泌者，组2，1×107)。在第0天和第4天，给小鼠I.T.注射细菌。在第1天和第4天，两组通过IP注射给予1μg ATC(两次脉冲)。肿瘤大小每周测量2次。将肿瘤匀浆，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图52B所示，SYN-TNFα以与SYN类似的程度定植肿瘤，达到至多1×108CFU/g肿瘤。仅在SYN-TNFα处理的CT26肿瘤中检测到hTNFα的肿瘤内表达，如通过hTNFαELISA(R&D Systems)测量的(图52C)。图52D中的结果显示，在第一次细菌剂量之后第7天用SYN-TNFα处理的CT26肿瘤与SYN处理相比，肿瘤生长显著减少(P<0.02)。总的来说，这些结果证实，SYN-TNFα能够在CT26肿瘤中定植和存留，在那里它们表达可检测水平的hTNFα并导致肿瘤生长显著减少。
实施例50.mIFNγ分泌菌株SYN3367在体内的活性
为了确定IFNγ表达菌株SYN3367(包含PAL::Cm p15a Ptet-87K PhoA-mIFNg；在本文中称为SYN-IFNγ)的体内动力学，处理CT26肿瘤并与SYN1557(DOM突变体；本文中称为SYN)处理的肿瘤进行比较。
为了制备用于该研究的细菌细胞，将过夜培养物用于接种含有抗生素的500mL LB培养基。将菌株在37℃振荡孵育直至培养物达到对数期结束(OD600＝0.8-1.0)。为了收获，将细胞以5000rpm旋下20分钟，吸出培养基，用PBS洗涤细胞，重悬于15％甘油和PBS中，等分并在-80℃冷冻。通过连续铺板对细胞进行浓度测试。
简言之，将CT26细胞(在PBS中的1×106个细胞/小鼠)SC植入到每只动物的右侧腹侧。监测肿瘤生长；直到肿瘤达到～50-80mm3时，将小鼠随机分组(n＝每组6只)用于肿瘤内给药如下：SYN(渗漏表型DOM突变体，组1，1×107)和SYN-IFNγ(IFNγ分泌者，组2，1×107)。在第0天和第3天向小鼠给药适当的细菌菌株。在第1、4和7天，所有小鼠I.P.注射1μg ATC(三次脉冲)。在第8天，处死所有小鼠，3只小鼠用于通过CFU铺板测量肿瘤内细菌定植，并且3只小鼠用于通过ELSIA分析肿瘤内IFNγ生产。将肿瘤匀浆，将肿瘤匀浆物连续稀释并铺板在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，以测量菌落形成单位浓度。如图XB所示，SYN-IFNγ以与SYN相似的程度定植肿瘤，达到至多1×108CFU/g肿瘤。仅在SYN-IFNγ处理的CT26肿瘤中检测IFNγ的肿瘤内表达，如通过鼠IFNγELISA(R&D Systems)所测量的(图53C)。总的来说，这些结果证实SYN-IFNγ能够在CT26肿瘤中定植和存留，在那里它们在用ATC诱导后表达可检测水平的IFNγ。
实施例51.对分泌的CXCL10的功能分析
为了确定从任何上述菌株分泌的人CXCL10是否是功能性的，进行趋药性测定，基本上如Mikucki等所述(Mikucki,等,Non-redundant Requirement for CXCR3 Signalingduring Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor Vascular Checkpoints；NatCommun.2015；6:7458,其全部内容通过引用并入本文)。在该测定中，人CD8+T细胞(抗CD3/CD28扩增后8天)被细胞痕迹紫色标记并转移到顶部有T细胞、底部有细菌上清液、存在或不存在抗hCXCR3的24孔transwell板(5uM孔)中。将细胞孵育3小时，并通过流式细胞术计数从孔的底部回收的迁移细胞。
为了制备细菌上清液，解冻菌株(SYN1557对照菌株和SYN2942(包含PAL::CmPtet-87K PhoA(ECOLIN_02255)))并培养过夜，然后通过添加四环素诱导3小时以表达hCXCL10。将上清液无菌过滤，然后如下文所述使用。为了制备T细胞，在用抗CD3/CD28珠子刺激后约8天，对预分离的原代人CD8 T细胞(AllCells)进行计数、收获和重悬在T细胞培养基中。在底部有0.5ml空间和在孔顶部有0.1ml空间和具有5uM孔大小的24孔transwell板用于测定。为了制备用于孔底部的细菌上清液，将来自SYN2942的上清液稀释在取自SYN1557对照细菌的上清液中以产生含有100％、33％、11％、3.7％和0％SYN2942的混合物。为了准备孔的顶部，将100μl的T细胞加入到顶部孔(含有约2.5×10个细胞)。将抗CXCR3(小鼠IgG1；克隆G025H7)以最终浓度为1μg/ml加入到对照孔中。板在分析之前被放置在37℃培养箱中3个小时。为了分析，将每个底部孔的内容物转移到96孔板的两个孔中。将平板旋下，合并两个孔，重悬于PBS中，并在MACSQuant流式细胞仪上分析以定量迁移细胞的数量。原代人T细胞以剂量依赖性方式向SYN2942上清液运输，其通过阻断CXCL10的受体CXCR3而消除。该数据(未显示)表明SYN2942生产的hCXCL10具有生物学活性，并且是以足够浓度丰富以触发体外原代T细胞运输。

Claims (136)

1.一种基因工程化微生物，其包含用于产生一种或多种抗癌分子的一种或多种基因序列，其中所述一种或多种基因序列可操作地连接至在自然界中与所述一种或多种基因序列不相关的启动子，并且其中所述一种或多种抗癌分子促进选自以下的效应功能：
(a)免疫激活和初免；
(b)免疫增强；
(c)T细胞扩增；
(d)基质调节；及
(e)其组合。
2.根据权利要求1所述的基因工程化微生物，其中所述微生物是细菌。
3.根据权利要求2所述的基因工程化微生物，其中所述细菌是肿瘤靶向细菌。
4.根据权利要求2或3所述的基因工程化细菌，其中所述细菌是革兰氏阳性细菌。
5.根据权利要求2或3所述的基因工程化微生物，其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌是专性厌氧细菌。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌是兼性厌氧细菌。
8.根据权利要求4所述的基因工程化细菌，其中所述细菌选自Clostridium novyi NT，和Clostridium butyricum和Bifidobacterium longum。
9.根据权利要求5所述的基因工程化细菌，其中所述细菌选自大肠杆菌Nissle和大肠杆菌K-12。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述启动子是诱导型启动子。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述诱导型启动子由低氧或厌氧条件诱导。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述诱导型启动子由肿瘤的缺氧环境诱导。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述诱导型启动子选自FNR诱导型启动子、ANR诱导型启动子和DNR诱导型启动子。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述启动子是组成型启动子。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的基因工程化微生物，其中所述一种或多种基因序列编码透明质酸酶。
16.根据权利要求15所述的基因工程化微生物，其中所述一种或多种基因序列编码人透明质酸酶。
17.根据权利要求2-16中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码透明质酸酶。
18.根据权利要求17所述的基因工程化细菌，其中所述透明质酸酶是被分泌的。
19.根据权利要求17所述的基因工程化细菌，其中所述透明质酸酶展示在细胞表面上。
20.根据权利要求2-19中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码抗CD40抗体。
21.根据权利要求20所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD40抗体是scFv。
22.根据权利要求20或21所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD40抗体是被分泌的。
23.根据权利要求20或21所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD40抗体展示在细胞表面上。
24.根据权利要求2-23中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码靶向CD47的抗癌分子。
25.根据权利要求24所述的基因工程化细菌，其中所述靶向CD47的抗癌分子是可溶形式的SIRPα。
26.根据权利要求25所述的基因工程化细菌，其中所述可溶形式的SIRPα是被分泌的。
27.根据权利要求25所述的基因工程化细菌，其中所述可溶形式的SIRPα是表面展示的。
28.根据权利要求24所述的基因工程化细菌，其中所述靶向CD47的抗癌分子是抗CD47抗体。
29.根据权利要求28所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD47抗体是scFv。
30.根据权利要求28或29所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD47抗体是被分泌的。
31.根据权利要求28或29所述的基因工程化细菌，其中所述抗CD47抗体是表面展示的。
32.根据权利要求2-31中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码CXCL10。
33.根据权利要求32所述的基因工程化细菌，其中所述CXCL10是被分泌的。
34.根据权利要求32所述的基因工程化细菌，其中所述CXCL10是表面展示的。
35.根据权利要求2-34中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码IL-15。
36.根据权利要求35所述的基因工程化细菌，其中所述IL-15是被分泌的。
37.根据权利要求35所述的基因工程化细菌，其中所述IL-15是表面展示的。
38.根据权利要求2-37中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述基因序列包含选自以下的分泌标签：PhoA、OmpF、ompA、cvaC、TorA、fdnG、dmsA、PelB、tolB、torT、dsbA、GltI、GspD、HdeB、MalE、mglB、OppA、PpiA、lamb、ECOLIN_05715、ECOLIN_16495、ECOLIN_19410和ECOLIN_19880分泌信号。
39.根据权利要求38所述的基因工程化细菌，其中所述分泌标签是PhoA。
40.根据权利要求2-39中任一项所述的基因工程化细菌，其还包含选自lpp、nlP、tolA和PAL的外膜蛋白中的一个或多个缺失。
41.根据权利要求40所述的基因工程化细菌，其中被缺失或突变的外膜蛋白是PAL。
42.根据权利要求2-41中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含用于腺苷的消耗的一种或多种基因序列。
43.根据权利要求42所述的基因工程化细菌，其中所述用于腺苷的消耗的一种或多种基因序列包含选自add、xapA、deoD、xdhA、xdhB和xdhC的一种或多种基因。
44.根据权利要求2-43中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述用于腺苷的消耗的一种或多种基因序列编码用于输入腺苷的转运蛋白。
45.根据权利要求44所述的基因工程化细菌，其中所述编码转运蛋白的一种或多种基因序列包含nupC。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的基因工程化细菌，其中所述编码转运蛋白的一种或多种基因序列包含nupG。
47.根据权利要求44或权利要求45所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列包含add、xapA、deoD、xdhA、xdhB、xdhC和nupC。
48.根据权利要求44或权利要求46所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列包含add、xapA、deoD、xdhA、xdhB、xdhC和nupG。
49.根据权利要求2-48中任一项所述的基因工程化细菌，其包含用于精氨酸的产生的一种或多种基因序列。
50.根据权利要求49所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码选自argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG、argH、argI、argJ、carA和carB的一种或多种精氨酸生物合成基因。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含精氨酸阻遏物基因(argR)中的缺失或突变。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种基因序列编码反馈抗性argA。
53.根据权利要求2-52中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含编码犬尿氨酸酶的一种或多种基因序列。
54.根据权利要求53所述的基因工程化细菌，其中所述犬尿氨酸酶来自荧光假单胞菌。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含trpE中的突变或缺失。
56.根据权利要求2-55中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含用于色氨酸的产生的一种或多种基因序列。
57.根据权利要求56所述的基因工程化细菌，其中所述细菌还包含选自trpE、trpD、trpC、trpB、trpA、aroG和SerA的一种或多种基因序列。
58.根据权利要求56或57所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含反馈抗性形式的aroG(aroGfbr)。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含反馈抗性形式的trpE(trpEfbr)。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含trpR中的突变或缺失。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含tnaA中的突变或缺失。
62.根据权利要求2-61中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述细菌包含抗生素抗性基因序列。
63.根据权利要求2-62中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述基因序列中的一种或多种存在于染色体上。
64.根据权利要求2-63中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述基因序列中的一种或多种存在于质粒上。
65.一种药物组合物，其包含根据权利要求2-64中任一项所述的细菌和药学上可接受的载体。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其还包含一种或多种化学治疗剂。
67.根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自
Figure FDA0002328622840000061
Figure FDA0002328622840000062
5-氟尿嘧啶、
Figure FDA0002328622840000063
Figure FDA0002328622840000064
和吉西他滨。
68.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是吉西他滨。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的药物组合物，其用于治疗胰腺导管癌。
70.一种药物组合物，其包含根据权利要求2-69中任一项所述的细菌和药学上可接受的载体。
71.根据权利要求70所述的药物组合物，其还包含一种或多种免疫检查点抑制剂。
72.根据权利要求71所述的药物组合物，其中所述检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
73.根据权利要求72所述的药物组合物，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
74.根据权利要求73所述的药物组合物，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。
75.根据权利要求73所述的药物组合物，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。
76.根据权利要求73所述的药物组合物，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。
77.根据权利要求65-76中任一项所述的药物组合物，其用于治疗、管理和预防结肠直肠癌。
78.根据权利要求65-76中任一项所述的药物组合物，其用于治疗、管理和预防肝细胞癌。
79.根据权利要求65-76中任一项所述的药物组合物，其用于治疗、管理和预防晚期实体瘤。
80.一种药物试剂盒，其包含根据权利要求65-76中任一项所述的药物组合物和一种或多种化学治疗剂。
81.根据权利要求80所述的药物试剂盒，其中所述化学治疗剂选自
Figure FDA0002328622840000071
Figure FDA0002328622840000072
5-氟尿嘧啶、
Figure FDA0002328622840000073
Figure FDA0002328622840000074
和吉西他滨。
82.根据权利要求81所述的药物试剂盒，其中所述化学治疗剂是吉西他滨。
83.根据权利要求80或81的药物试剂盒，其用于治疗胰腺导管癌。
84.一种药物试剂盒，其包含根据权利要求65-76中任一项所述的药物组合物和一种或多种免疫检查点抑制剂。
85.根据权利要求84所述的药物试剂盒，其中所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
86.根据权利要求84或权利要求85所述的药物试剂盒，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
87.根据权利要求80-86中任一项所述的药物试剂盒，其用于治疗、管理和预防结肠直肠癌。
88.根据权利要求80-86中任一项所述的药物试剂盒，其用于治疗、管理和预防肝细胞癌。
89.根据权利要求80-86中任一项所述的药物试剂盒，其用于治疗、管理和预防晚期实体瘤。
90.一种治疗或调节有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用包含根据权利要求80-86中任一项所述的药物试剂盒的组分的治疗方案的步骤。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述癌症选自肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(例如尤文肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、脑癌(例如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)、支气管肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、Castleman病、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、心脏癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、下咽癌、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞性白血病)、肝癌、肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤)、小肠癌、胃癌、畸胎瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、不寻常的儿童癌症、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
92.一种治疗或调节有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求65-79中任一项所述的药物组合物的步骤。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述癌症选自肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(例如、尤文肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、脑癌(例如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)、支气管肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、Castleman病、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、心脏癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、下咽癌、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞性白血病)、肝癌、肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤)、小肠癌、胃癌、畸胎瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、不寻常的儿童癌症、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述细菌被肿瘤内施用。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述细菌被口服施用。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述细菌被全身施用。
97.一种治疗或调节有需要的受试者的癌症的方法，其包括治疗方案，所述治疗方案包括向所述受试者施用根据权利要求65-79中任一项所述的药物组合物的步骤。
98.根据权利要求97所述的方法，其还包括在所述细菌之前、之后或与所述细菌同时向所述受试者施用一种或多种化学治疗剂的步骤。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述化学治疗剂选自
Figure FDA0002328622840000091
Figure FDA0002328622840000092
5-氟尿嘧啶、
Figure FDA0002328622840000093
和吉西他滨。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述化学治疗剂是吉西他滨。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述细菌被口服施用。
102.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述细菌被肿瘤内施用。
103.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述细菌被全身施用。
104.根据权利要求103的方法，其中所述癌症选自肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(例如、尤文肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、脑癌(例如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤)、支气管肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、Castleman病、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、心脏癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、下咽癌、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞性白血病)、肝癌、肺癌、淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤)、小肠癌、胃癌、畸胎瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、不寻常的儿童癌症、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
105.一种治疗或调节有需要的受试者的癌症的方法，其包括治疗方案，所述治疗方案包括向所述受试者施用根据权利要求65-79中任一项所述的药物组合物的步骤。
106.根据权利要求105所述的方法，其还包括在所述细菌之前或之后或与所述细菌同时施用一种或多种免疫检查点抑制剂的步骤。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述一种或多种免疫检查点抑制剂选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。
109.根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其用于治疗、管理和预防结肠直肠癌。
110.根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其用于治疗、管理和预防肝细胞癌。
111.根据权利要求105-108中任一项所述的方法，其用于治疗、管理和预防晚期实体瘤。
112.根据权利要求2-64中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述基因序列包含编码稳定化多肽的序列。
113.根据权利要求112所述的基因工程化细菌，其中所述基因序列还包含编码肽接头的序列。
114.根据权利要求113所述的基因工程化细菌，其中所编码的抗癌分子通过肽接头或肽键与所述稳定化多肽连接。
115.根据权利要求113或114所述的基因工程化细菌，其中所编码的抗癌分子的C末端通过肽接头或肽键与所述稳定化多肽的N末端连接。
116.根据权利要求113或权利要求114所述的基因工程化细菌，其中所述抗癌分子的N末端通过肽接头或肽键与所述稳定化多肽的C末端连接。
117.根据权利要求112-116中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述稳定化多肽包含免疫球蛋白Fc多肽。
118.根据权利要求117所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH2恒定区的至少一部分。
119.根据权利要求117所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH3恒定区的至少一部分。
120.根据权利要求117所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白重链CH1恒定区的至少一部分。
121.根据权利要求117所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分。
122.根据权利要求117所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽包含免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分、免疫球蛋白重链CH2恒定区、和免疫球蛋白重链CH3恒定区。
123.根据权利要求117-122中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽是人IgG Fc多肽。
124.根据权利要求117-122中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述免疫球蛋白Fc多肽是人IgG4 Fc多肽。
125.根据权利要求113-124中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述接头包含富甘氨酸肽。
126.根据权利要求125所述的基因工程化细菌，其中所述富甘氨酸肽包含序列[GlyGlyGlyGlySer]n，其中n是1、2、3、4、5或6。
127.根据权利要求125或126所述的基因工程化细菌，其中所述富甘氨酸肽包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS。
128.根据权利要求123-127中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述抗癌分子是SIRPα，并且其中SIRPα的N末端通过包含SGGGGSGGGGSGGGGS的肽接头与IgG4 Fc的C末端连接。
129.根据权利要求2-64和112-127中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述一种或多种抗癌分子包含第一单体多肽和第二单体多肽。
130.根据权利要求129所述的基因工程化细菌，其中所述第一单体多肽通过肽接头或肽键与第二单体多肽共价连接。
131.根据权利要求130所述的基因工程化细菌，其中所述接头包含富甘氨酸肽。
132.根据权利要求129-131中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述第一单体和第二单体各自具有不同的多肽序列。
133.根据权利要求129-131中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述第一单体和所述第二单体具有相同的多肽序列。
134.根据权利要求129-132中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述第一单体是IL-12 p35多肽和所述第二单体是IL-12 p40多肽。
135.根据权利要求134所述的基因工程化细菌，其中所述接头包含GGGGSGGGS。
136.根据权利要求129-132中任一项所述的基因工程化细菌，其中所述第一单体是IL-15多肽和所述第二单体是IL-15Rα sushi结构域多肽。
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