JP2020505016A - 腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物 - Google Patents

腫瘍細胞において免疫モジュレーターおよび抗がん治療剤を産生するようにプログラムされた微生物 Download PDF

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Abstract

細菌またはウイルスなどの遺伝的にプログラムされた微生物、その医薬組成物、ならびにがんをモジュレートおよび処置する方法が開示される。本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位で局所的に産生される１つまたは複数の抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる微生物の組成物、方法および使用を提供する。ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数の抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターを産生するように操作されている、微生物を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，６３４号、２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，６３９号、２０１７年１月１１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２号、２０１７年７月１２日に出願された米国仮出願第６２／５３１，７８４号、２０１７年８月９日に出願された米国仮出願第６２／５４３，３２２号、２０１７年８月３０日に出願された米国仮出願第６２／５５２，３１９号、２０１７年１１月２９日に出願された米国仮出願第６２／５９２，３１７号および２０１７年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／６０７，２１０号に対する優先権を主張し、その各々の内容は、その全体が、本明細書に参照により明示的に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１月４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２６０４６＿２１３２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは１，２７８，０３６バイトである。
現行のがん治療は、免疫療法、外科手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの何らかの組合せの使用を用いるのが一般的である（アメリカがん協会（American Cancer Society））。これらの薬物は、がん患者への大きな恩恵を示してきたが、多くのがんは、従来の治療法を使用して処置することが未だに困難である。現在、多くの従来のがん治療は、全身投与されるため健常組織に悪影響を及ぼし、結果として有意な副作用が生じることになる。例えば、多くのがん治療は、患者の抗腫瘍応答を後押しするために免疫系を活性化することに重点を置いている（Kongら、２０１４年）。しかし、そのような治療にもかかわらず、腫瘍の周囲の微小環境は、依然として高免疫抑制性である。加えて、全身的な免疫調節の変更は、日和見自己免疫障害および免疫関連有害事象の発生を含む、免疫不全を誘発する。
がん細胞を特異的に標的とする細胞傷害薬を開発するために、過去数十年にわたって大きな努力が払われてきた。近年、腫瘍学におけるパラダイムがシフトし、がんの臨床的問題は、がん細胞の遺伝的異常の蓄積であるばかりでなく、免疫系によるこれらの異常細胞の寛容でもあると考えられている。その結果、最近の抗がん治療剤は、がん細胞ではなく免疫系を特異的に標的とするように設計されている。そのような治療法は、がん免疫寛容を回復させること、および有効な抗腫瘍免疫応答を刺激することを目標とする。例えば、現行の免疫療法は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニストである免疫刺激性分子、または腫瘍微小環境に浸潤する様々な免疫細胞集団を標的とする免疫刺激性モノクローナル抗体を含む。しかし、それらの免疫標的設計にもかかわらず、これらの治療法は、あたかも免疫療法の全身投与（例えば、２〜３週間ごとの静脈内注入）に頼る従来の抗がん薬であるかのように、臨床開発されてきた。結果として、多くの現行の免疫療法は、高い投薬要求量に起因して毒性に悩まされ、そしてまた、望ましくない自己免疫応答または他の免疫関連有害事象をもたらすことが多い。
最近の研究は、マウスにおいて、ある特定の種類の消化管微小生物の存在が、毒性副作用を増大させることなくがん免疫療法の抗腫瘍効果を増強することができることを示唆している（M.Vetizouら、「Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota」、Science、doi:10.1126/aad1329、２０１５年；A.Sivanら、「Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy」、Science、doi:0.1126/science.aac4255、２０１５年）。これらのマウス研究で同定された消化管微生物種に人間でも同じ効果があるかどうかは、明らかでない。
M.Vetizouら、「Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota」、Science、doi:10.1126/aad1329、２０１５年 A.Sivanら、「Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy」、Science、doi:0.1126/science.aac4255、２０１５年
したがって、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域を標的とすることができる、がん性細胞を特異的に標的とする一方で正常組織にはほとんど影響を及ぼさず、がん免疫寛容を回避することまたは回復させることを含めて免疫系を腫瘍と闘うように後押しする、有効ながん治療に対するまだ対処されていない要求がある。
本開示は、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的とする微生物であって、腫瘍部位で局所的に産生される１つまたは複数の抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターを産生することができる微生物の組成物、方法および使用を提供する。ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数の抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターを産生するように操作されている、微生物を提供する。そのような操作された微生物を、１つまたは複数の抗がん分子を含む遺伝子回路またはカセットのｉｎ ｖｉｖｏでの罹病組織微小環境への選択的送達のために、がん細胞および／または腫瘍部位に標的化することができる。ある特定の態様では、操作された微生物は、細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、ならびに本明細書で提供される他の例示的菌株であり、これらは、腫瘍微小環境に選択的にホーミングすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、操作された微生物は、例えば経口投与、静脈内注射、皮下注射または他の手段により、全身投与され、腫瘍部位に選択的にコロニー形成することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７は、肝臓転移の齧歯動物モデルにおいて経口送達後に腫瘍組織に選択的にホーミングすることが示されているが、健常な臓器または線維症肝組織にはコロニー形成しない。（Daninoら、２０１５年；Stritzkerら、Int J Med Micro、２９７巻：１５１〜１６２頁（２００７年））。他の実施形態では、操作された微生物、例えば、細菌またはウイルスは、腫瘍部位または微小環境に、例えば腫瘍内（intrtumoral）注射などの腫瘍内投与によって、局所的に（直接的に）送達される。
本開示は、１つまたは複数の抗がん分子を送達するための操作された微生物であって、腫瘍微小環境に選択的にホーミングする、または腫瘍部位に局所的に投与される、操作された微生物を提供する。腫瘍微小環境への抗がん分子、例えば、免疫モジュレーション物質の局所送達は、自己免疫毒性をもたらすことが多い全身送達と比較してはるかに高濃度の治療剤（例えば、抗がん分子）の送達を可能にするため、有利である。さらに、最近の証拠は、腫瘍に、単一部位であっても、直接送達された免疫モジュレーション物質、例えば、受容体アゴニストおよび免疫刺激性抗体は、腫瘍微小環境に存在する免疫細胞を標的とすることにより全身または適応抗腫瘍免疫応答を生成することができるという考えを裏付ける。そのような免疫細胞には、例えば、腫瘍部位に浸潤するおよび／または腫瘍部位を包囲する、成熟抗原提示細胞、ヘルパーおよびエフェクター細胞傷害性Ｔ細胞、免疫寛容性（tolergenic）樹状細胞、腫瘍関連マクロファージおよび調節性Ｔ細胞が、数ある細胞型の中でも特に含まれる。したがって、一部の態様では、本開示は、腫瘍細胞を選択的に標的とし、１つまたは複数の抗がん分子を産生することができる微生物であって、腫瘍部位に局所送達されて局所腫瘍内免疫応答を生じさせる、微生物を提供する。この微生物は、腫瘍選択的適応免疫応答の誘導をもたらし、この誘導は、自己抗原（ato-antigens）に対する免疫応答の生成を回避するので、他の方法より有利である。
ある特定の態様では、操作された微生物は、腫瘍内免疫細胞（例えば、腫瘍微小環境に浸潤するもの）を標的とする、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、自然抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、局所抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、全身または適応抗腫瘍免疫応答を生成する。適切な抗がん分子の例は、本明細書に記載されている。
免疫応答を誘発する抗がん分子を産生することに加えて、操作された微生物は、それら自体が、抗腫瘍免疫応答、例えば、全身または適応免疫応答に発展する局所または自然免疫応答を生成することができる点で、有利である。例えば、操作された微生物は、腫瘍微小環境に浸潤する免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、形質細胞様および骨髄性樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ならびに腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））の抗原提示能力を刺激することができる。腫瘍微小環境に見られる多くの免疫細胞は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を発現し、この受容体は、炎症誘発性シグナル伝達経路の活性化、食細胞応答（マクロファージ、好中球および樹状細胞）の刺激、または分泌タンパク質としての微生物との結合により、自然免疫応答において重要な役割を果たす。ＰＲＲは、微生物病原体に関連する、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と、細胞損傷、死滅ストレスまたは組織傷害中に放出される細胞成分に関連する、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）という、２つの分子クラスを認識する。ＰＡＭＰは、各病原体に特有のものであり、病原体生存に必要な不可欠分子構造、例えば、細菌細胞壁分子（例えば、リポタンパク質）、ウイルスカプシドタンパク質、ならびにウイルスおよび細菌ＤＮＡである。ＰＲＲは、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌および原虫を含む、様々な微生物病原体を特定することができる。ＰＲＲは、主として、自然免疫系の細胞、例えば、抗原提示マクロファージおよび樹状細胞によって発現されるが、他の細胞（免疫細胞と非免疫細胞の両方）によって発現されることもあり、細胞表面に局在して細胞外病原体を検出するか、またはエンドソームおよび細胞基質内に局在し、そこで細胞内に侵入するウイルスを検出する。
ＰＲＲの例としては、感染病原体を検出する細胞外ドメインを有する１型膜貫通受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が挙げられる。ＴＬＲ１、２、４および６は、細菌脂質を認識し、ＴＬＲ３、７および８は、ウイルスＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は、細菌ＤＮＡを認識し、ＴＬＲ５および１０は、細菌または寄生虫タンパク質を認識する。（ＴＬＲを発現する腫瘍微小環境内の細胞の例については、下記表１を参照されたい）。ＰＲＲの他の例としては、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、例えば、Ｉ型マンノース受容体およびＩＩ型アシアロ糖タンパク質受容体、細胞質（細胞内）ＰＲＲ、ヌクレオチドオリゴマー化（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、例えば、ＮＯＤ１およびＮＯＤ２、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−１）様受容体（ＲＬＲ）、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＤＤＸ３、ならびに分泌ＰＲＲ、例えば、コレクチン、ペントラキシン、フィコリン、脂質トランスフェラーゼ、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲ）およびロイシンリッチリピート受容体（ＬＲＲ）が挙げられる。
病原体（例えば、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによる刺激）が検出されると、ＰＲＲは、共刺激分子および炎症性サイトカイン、例えば、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＬ−１２の産生を刺激する、ＮＦ−カッパＢ経路などの、シグナル伝達経路の活性化を開始し、この機序は、感染性病原体に対して開始される炎症および免疫応答の活性化の一因となる。そのような応答は、適応免疫応答に関与する腫瘍微小環境に存在する免疫細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、ＤＣ、ＴＡＭ、および他の骨髄系由来サプレッサー細胞）の活性化を誘発する。最近の証拠は、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰにより活性化される免疫機序が、腫瘍細胞に対する免疫応答の活性化の一因にもなることを示す。例えば、マウス体内およびヒト腫瘍微小環境内のＡＰＣのＴＬＲ活性化は、クラスＩＩ ＭＨＣ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を上方調節して、それらの表現型を免疫寛容性から免疫原性に改変し、この活性化は、効率的な適応抗腫瘍免疫応答の発生を維持するために必要とされることが、研究により示された。（LeMercierら、Canc Res、７３巻：４６２９〜４０頁（２０１３年）；Kimら、Blood、１１９巻：３５５〜６３頁（２０１２年））。
さらに、ＴＬＲは、腫瘍細胞によって発現されることもある。がん細胞上のＴＬＲの直接活性化は、例えば、例えばＢ細胞リンパ腫の場合、標的腫瘍細胞の死滅をもたらすこと、および／または抗原提示分子を上方調節することができる。したがって、化学療法、腫瘍標的療法、または腫瘍細胞死を引き起こす他の療法時に、腫瘍浸潤免疫細胞上および腫瘍細胞を包囲している細胞上のＴＬＲまたは他のＰＲＲにより認識され、免疫応答を活性化する、内在性ＤＡＭＰが、腫瘍細胞により放出されうる。そのようなアゴニスト（例えば、ＤＡＭＰ）は、腫瘍に浸潤するＡＰＣの活性化によって抗腫瘍応答を刺激して、腫瘍関連抗原に対する適応抗腫瘍応答を有効に開始させる。
もう１つのＰＲＲサブファミリーは、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）であり、これは、ウイルス感染時の二本鎖ウイルスＲＮＡのセンサーであると考えられており、腫瘍内免疫刺激の標的とされうる。刺激されると、例えば、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内に送達されると、ＲＬＲは、宿主細胞によるＩ型ＩＦＮの放出を誘発し、アポトーシスによるその死滅をもたらす。そのようなサイトカインおよび腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、抗腫瘍免疫応答の活性化ももたらす。ＲＬＲは、すべての腫瘍型において内因性発現されることを考えると、ＲＬＲは、普遍的な免疫原性促進性治療標的であり、腫瘍溶解性ウイルスの局所送達により生成される免疫応答に特に関連性がある。
腫瘍応答は、長年にわたって、本開示の微生物などの病原体の腫瘍内送達時に観察されており、固形腫瘍、黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌をはじめとする、いくつかの種類のがんにおいて治療利益をもたらすことが示されており、その効果は、一部は、ＰＲＲを活性化する微生物の核酸画分、カプシドタンパク質および／または細胞壁画分の炎症誘発特性に起因する。例えば、細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からの抽出物の腫瘍内注射は、固形腫瘍に対する治療効果が示されている。カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）の腫瘍内注射は、ＰＲＲを活性化するＢＣＧ ＤＮＡおよび細胞壁骨格の能力に一部は起因して、黒色腫および扁平上皮癌をはじめとする、いくつかの異なる種類のがんに対する治療利益が示されている（Mortonら、Ann Surg、１９７４年、１８０巻：６３５〜４３頁；Melvinら、JAMA、１９７４年、２２９巻：６８８頁；Krownら、m Cancer、１９７８年、４２巻：２６４８〜６０頁；Bierら、Cancer Immunol、１９８１年、１２巻：７１〜７９頁；Hortobagyiら、Cancer、１９７８年、４２巻：２２９３〜２３０３頁；Bastら、N Engl J Med、１９７４年、２９０巻：１４５８〜６９頁；Shimadaら、J Natl Cancer Inst、１９８５年、７４巻：６８１〜８頁；Tokunagaら、Jpn J Infect Dis、１９９９年、５２巻：１〜１１頁；Kriegら、Nature、１９９５年、３７４巻：５４６〜９頁；Nevilleら、Nat Clin Pract Oncol、２００７年、４巻：４６２〜９頁；Ryanら、Bioessays. ２００６年１月、２８巻（１号）：８４〜９４頁；Babanら、Bioengineered Bugs １巻：６号、３８５〜３９４頁、２０１０年１１月／１２月）。
腫瘍溶解性ウイルス療法を使用して、ＰＲＲアゴニストとして作用するそれらのウイルスＤＮＡおよび／またはカプシドタンパク質の能力に一部は起因する全身免疫効果も、観察されている。腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内送達は、例えば肝がんおよび肝細胞癌において、全身抗腫瘍免疫応答を生成することが示されている。（Bowieら、Nat rev Immunol、２００８年、８巻：９１１〜２２頁；Parkら、Lancet Oncol、２００８年、９巻：５３３〜５４２頁；Heoら、Nat Med、２０１３年、１９巻：３２９〜３６頁）。
これらの手法には、いくつかの制限があり、その制限が、がんの処置へのそれらの広い適用可能性を妨げてきた（Ryanら、BioEssays ２８巻：８４〜９４頁、（２００５年）. Use of bacteria in anti-cancer therapies；Nallarら、Cytokine.２０１６年、Bacteria and genetically modified bacteria as cancer therapeutics: Current advances and challenges；Krzykawski C combined bacterial and viral treatment: a novel anticancer strategy、Cent Eur J Immunol.２０１５年；４０巻（３号）：３６６〜７２頁；Liら、Live-Attenuated Bacterial Vectors: Tools for Vaccine and Therapeutic Agent Delivery. Vaccines (Basel).２０１５年１１月１０日；３巻（４号）：９４０〜７２頁）。細菌またはウイルスを含むほとんどの免疫療法も失敗してきた（Krzykawski、Centr Eur J Immunol ２０１５年；４０巻（３号）：３６６〜３７２頁）。病原性細菌は、例えば、敗血症などの有意な有害事象につながりうる大きな炎症応答を局所的におよび全身的に引き起こしうる。成長する腫瘍は、健常な脈管構造を発生させることができず、それがないので低酸素領域が出現することも、報告されている。ハイポキシア、およびハンディキャップのある脈管形成の結果として、多くの細胞が死滅して、全てが腫瘍内に残屑を残し、これが有害事象の原因となる（Krzykawski、Centr Eur J Immunol ２０１５年；４０巻（３号）：３６６〜３７２頁）。それ故、最適な細菌は、細菌の主として腫瘍組織への拡散を制限することになる任意選択のまたは必須の嫌気性菌であると提案されている（Dangら ２００１年： Proc Natl Acad Sci U S A ９８巻：１５１５５〜１５１６０頁）。さらに、血液供給が制限された腫瘍への治療用細菌の正確な送達方法が、提供されなければならない。
操作された非病原性細菌などの本開示の微生物は、１つまたは複数の抗がん分子を腫瘍部位で選択的かつ局所的に産生することにより、以前の手法の制限の一部を克服することができ、腫瘍内免疫応答を活性化することができる追加の利点を有することができる。一部の態様では、微生物は、自然または局所免疫応答を活性化することができる。一部の態様では、微生物は、ＡＰＣを活性化することができる。一部の態様では、微生物は、遠位がん細胞に対する全身抗腫瘍免疫を活性化することができる。一部の態様では、微生物は、適応抗腫瘍免疫を活性化することができる。
ある特定の実施形態では、操作された微生物は、腫瘍内免疫細胞（例えば、腫瘍微小環境に浸潤する免疫細胞）を標的とする、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、局所抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、全身または適応抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の実施形態では、操作された微生物により産生される抗がん分子は、局所腫瘍部位（腫瘍内送達または注射部位）から遠位のがん細胞に対する全身または適応抗腫瘍免疫応答を生成する。ある特定の態様では、操作された微生物は、腫瘍細胞を標的とし、局所および／または全身免疫応答を活性化する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。
全身投与された、操作された微生物の特異的腫瘍標的化能力、および／または操作された微生物の局所（例えば、腫瘍内）送達は、最小限の自己免疫不全または他の有害免疫事象で、腫瘍部位に対して局所的細胞傷害効果をもたらすばかりでなく、治療全身抗腫瘍応答を（遠位がん細胞および／または未注射腫瘍部位に対して）もたらす。微生物による局所送達または選択的腫瘍標的化は、血液中の高濃度の免疫モジュレーター、例えば免疫刺激剤の循環を防止する。さらに、微生物の局所または選択的腫瘍送達は、適応免疫応答の誘発を必要とする腫瘍部位において、はるかに高い免疫刺激剤濃度を可能にする。
局所免疫応答と適応免疫応答の両方を生じさせる結果となる、腫瘍細胞を（腫瘍部位への局所送達またはホーミング能力の結果として）選択的に標的とするそれらの能力に関連する利点に加えて、操作された微生物には、それらが抗がん分子、例えば免疫モジュレーター、の組合せを産生するように操作されうるという利点がある。操作された微生物には、それらが１つより多くの抗がん分子を腫瘍部位に選択的に送達するように操作されうるという点で、さらなる利点がある。例えば、操作された微生物は、組合せで、がん誘導免疫寛容を回復させる、およびまた有効な抗腫瘍免疫応答を誘発する、抗がん分子を産生するように、操作されうる。例えば、操作された微生物は、免疫寛容（または免疫抑制）を回復させるのに役立ちうる１つまたは複数の抗がん分子と、抗原提示を活性化するのにおよび／または免疫応答を刺激もしくは活性化するのに役立ちうる１つまたは複数の抗がん分子である、抗がん分子の組合せを産生するように操作されうる。さらに、これらの抗がん分子は、腫瘍微小環境に見られる環境条件に応答して、例えば、低酸素または低酸素条件下で誘導される、誘導性プロモーターにより調節されうる。このタイプの調節は、抗がん分子が腫瘍部位で発現され、正常または非がん性組織では発現されないことを確実にするのに、さらに役立つ。
したがって、ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、腫瘍微小環境において腫瘍免疫寛容を阻害または抑制する１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、腫瘍微小環境において腫瘍免疫寛容を阻害または抑制し、抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激する、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。一部の実施形態では、腫瘍免疫寛容および免疫刺激の局所的抑制は、全身性適応免疫応答につながる。
したがって、ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、（１）局所腫瘍微小環境において腫瘍免疫寛容を阻害するまたは抑制するまたは回復させるか、（２）局所腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激するか、または（３）両方を行うことができる、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、腫瘍免疫寛容を阻害することまたは抑制することのどちらかができる、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。局所腫瘍微小環境において腫瘍免疫寛容を阻害するまたは抑制するまたは回復させる抗がん分子の例としては、例えば、（１）免疫チェックポイントを阻害する抗がん分子、（２）抑制性サイトカインおよび／またはケモカインを阻害する抗がん分子、（３）食作用回避を阻害する抗がん分子、（４）免疫抑制の一因となる代謝物を減少または枯渇させる抗がん分子、ならびに（５）血管新生を阻害する抗がん分子が挙げられる。したがって、本開示の遺伝子操作された微生物は、免疫チェックポイントインヒビター、抑制性サイトカインおよび／またはケモカインのインヒビター、食作用回避を支援する分子のインヒビター、免疫抑制の一因となる代謝物を減少または枯渇させる分子、血管新生を促進する分子のインヒビター、ならびにこれらの組合せから選択される、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。これらの分子の非限定的な例は、本明細書の下段に記載される。
ある特定の態様では、本開示の操作された微生物は、抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激することができる１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。局所腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激する抗がん分子の例としては、例えば、（１）免疫刺激性サイトカイン、（２）他の免疫分子、例えば免疫刺激性サイトカインとともに、免疫応答を刺激するように作用する、共刺激分子、（３）免疫関与を促進する抗体、（４）養子エフェクター細胞療法に関与する免疫分子、（５）ワクチンとして役立つ腫瘍抗原、および（６）細胞毒または細胞溶解性ペプチドが挙げられる。したがって、本開示の遺伝子操作された微生物は、免疫刺激性サイトカイン、他の免疫分子とともに免疫応答を刺激するように作用する共刺激分子、免疫関与を促進する抗体、養子エフェクター細胞療法に関与する免疫分子、ワクチンとして役立つ腫瘍抗原、細胞毒または細胞溶解性ペプチド、ならびにこれらの組合せから選択される、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。これらの分子の非限定的な例は、本明細書の下段に記載される。
これらの実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、腫瘍を標的とする操作された細菌である。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする操作された細菌は、がん細胞および／または腫瘍部位に自然にホーミングする。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする操作された細菌は、がん細胞および／または腫瘍部位を標的とするように操作されており、例えば、腫瘍標的化能を提供する非ネイティブ遺伝子配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、腫瘍免疫寛容を阻害または抑制する１つまたは複数の抗がん分子を産生するように、およびまた、抗腫瘍免疫応答を活性化または刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で１つまたは複数の抗がん分子を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の抗がん分子を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の抗がん分子を発現する。
これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌の組合せは、外科手術、化学療法、標的療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注、ならびに腫瘍溶解性ウイルスなどの、従来のがん治療と併用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併用することができる。
図１は、アデノシン分解経路および対応する細菌経路酵素の概略図を表す。
図２は、アデノシン分解回路の２つの例示的な遺伝子構成を示す概略図を表す。アデノシンは、Ｅ．ｃｏｌｉヌクレオシドパーミアーゼｎｕｐＣトランスポーターの発現を通して細胞内に輸送される。あるいは、ＮｕｐＧを使用することができる。アデノシンは、アデノシンデアミナーゼａｄｄの発現を通してイノシンに変換される。イノシンは、イノシンホスホリラーゼｘａｐＡおよびｄｅｏＤの発現を通してヒポキサンチンに変換される。ヒポキサンチンは、ヒポキサンチンヒドロキシラーゼｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣの発現を通してキサンチンおよび尿酸塩に変換される。そのような回路は、微生物の１つもしくは複数のプラスミドに位置することができ、または染色体に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の回路は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される誘導性プロモーターの制御下にある。例えば、そのような誘導性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター（表示）は低酸素条件下で誘導されうる。他の実施形態では、プロモーターは、ある特定の分子または代謝物の存在下、例えば腫瘍微小環境および／または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の組織タイプにおいて誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の腸管特異的分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腸管または腫瘍に存在しても存在しなくてもよい一部の他の代謝物、例えばアラビノースまたは当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の化学的もしくは栄養学的インデューサーの存在下で誘導される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のカセットは、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の構成的プロモーターの制御下にあり、例えばその発現を、異なる強さのリボソーム結合部位を使用して微調整することができる。そのような微生物は場合により、栄養要求性、例えばデルタＴｈｙＡまたはデルタＤａｐＡも含む。
図３は、株ＳＹＮ１５６５（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣを含む）、ＳＹＮ１５８４（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣを含む）、ＳＹＮ１６５５（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）、およびＳＹＮ１６５６（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）が、グルコースが存在する場合であっても、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアデノシンを分解できることを示す棒グラフを表す。
図４は、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境で予想されるアデノシンレベルに対応する１μＭアデノシンの存在下で、基質制限条件でのアデノシン分解を示す棒グラフを表す。結果は、低濃度の活性化ＳＹＮ１６５６（１×１０６個細胞）（および同様に表示の他の株）が、定量限界より下でアデノシンを分解できることを示している。
図５は、操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ１６５６）の単独または抗ＰＤ１との組合せによるアデノシン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、およびＰＤ−１と組み合わせたアデノシン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄは、様々な操作された細菌株によるトリプトファン産生を示す棒グラフを表す。図６Ａは、様々なトリプトファン産生株によるトリプトファン産生を示す棒グラフを表す。データは、ＡｒｏＧのフィードバック抵抗型の（ＡｒｏＧｆｂｒ）の発現がトリプトファン産生を得るために必要であることを示している。さらにフィードバック抵抗性のｔｒｐＥ（ｔｒｐＥｆｂｒ）の使用は、トリプトファン産生に対して正の効果を有する。図６Ｂは、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ構築物を含む株からのトリプトファン産生を示し、酸素の存在下および非存在下での炭素源としてのグルコースとグルクロネートとを比較する。Ｅ．ｃｏｌｉは、トリプトファン１分子を産生するためにホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）２分子を要する。グルコースを炭素源として使用すると、利用可能な全てのＰＥＰの５０％がＰＴＳ系（ホスホトランスフェラーゼ系）を通してグルコースを細胞に輸送するために使用される。トリプトファン産生は、非ＰＴＳ糖（グルクロネート）を好気的に使用することによって改善される。データはまた、ｔｎａＡ（ごく初期の時点で好気的に）欠失の正の効果も示す。図６Ｃは、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒを含む操作された株によるトリプトファン産生が、セリンの添加を通して改善することを示す棒グラフを表す。図６Ｄは、株ＳＹＮ２１２６、ＳＹＮ２３２３、ＳＹＮ２３３９、ＳＹＮ２４７３、およびＳＹＮ２４７６におけるトリプトファン産生の比較を示す棒グラフを表す。ＳＹＮ２１２６は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒを含む。ＳＹＮ２３３９は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡを含む。ＳＹＮ２４７３は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡを含む。ＳＹＮ２４７６は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡを含む。結果は、ａｒｏＧの発現がこれらの条件下でＴｒｐ産生を得るために必要でも十分でもないこと、およびｓｅｒＡの発現がトリプトファン産生にとって有益であることを示している。 同上。
図７は、遺伝子操作された細菌がトリプトファン産生およびキヌレニン分解のための回路を含む、本開示の例示的な実施形態の概略図を表す。
図８は、本開示の一実施形態の概略図を表す。この実施形態では、トリプトファンはキヌレニンから合成される。この変換を通して、免疫抑制性の代謝物（キヌレニン）を、外部環境、例えば腫瘍環境から除去することができ、炎症促進性の代謝物（トリプトファン）が生成される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、ＫＹＮをＡＡ（アントラニル酸）に変換し、次にこれをＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐオペロンの酵素を通してトリプトファンに変換することができる。必要に応じて、キヌレニンからのトリプトファン生成にとって必要でない場合には、ｔｒｐＥ遺伝子を欠失させてもよい。代替の実施形態では、基質としてキヌレニンおよびコリスミ酸塩の両方を使用することによってトリプトファン産生を最大限にするために、ｔｒｐＥ遺伝子を欠失させない。本発明の一実施形態では、この回路を含む遺伝子操作された細菌は、がんにおける免疫回避の低減にとって有用でありうる。
図９は、７５μＭキヌレニンを補充したＭ９培地における、当初の株およびＡＬＥから進化させたキヌレニナーゼ発現株のキヌレニン消費速度を示す棒グラフを表す。株を以下のように標識する：ＳＹＮ１４０４：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する、中コピー数プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＮｉｓｓｌｅデルタＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｔｅｔ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ｐ１５ａ ＫａｎＲ）；ＳＹＮ２０２７：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、ＨＡ３／４部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター（内因性のｌｐｐプロモーター）の制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＨＡ３／４：：Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）；ＳＹＮ２０２８：Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、ＨＡ３／４部位でゲノムに組み込まれた構成的プロモーター（合成Ｊ２３１１９プロモーター）の制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）；ＳＹＮ２０２７−Ｒ１：親ＳＹＮ２０２７株に由来し、ＡＬＥに起因する第１の進化株（Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。ＳＹＮ２０２７−Ｒ２：親ＳＹＮ２０２７株に由来し、ＡＬＥに起因する第２の進化株（Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート２）。ＳＹＮ２０２８−Ｒ１：親ＳＹＮ２０２８株に由来し、ＡＬＥに起因する第１の進化株（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。ＳＹＮ２０２８−Ｒ２：親ＳＹＮ２０２８株に由来し、ＡＬＥに起因する第２の進化株（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ進化株レプリケート１）。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを産生する株による腫瘍内キヌレニン枯渇を示すドットプロットを表す。図１０Ａは、中コピー数プラスミドにおいて構成的に発現されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。図１０Ｂは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体組み込みコピーを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８に関して観察された腫瘍内濃度を示すドットプロットを表す。ＩＤＯインヒビターＩＮＣＢ０２４３６０を陽性対照として使用する。
図１１は、ａｒｇＲ遺伝子が欠失され、フィードバック抵抗性のａｒｇＡｆｂ ｒ遺伝子を発現する、操作された細菌株の例示的な実施形態を表す図である。この株は、染色体上に１つまたは複数の栄養要求性の改変をさらに含む。この株は、アルギニンの産生にとって有用である。
図１２は、誘導（＋ＡＴＣ）条件および非誘導（−ＡＴＣ）条件下、酸素の存在下（＋Ｏ２）または非存在下（−Ｏ２）でのストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３）、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、およびＳＹＮ−ＵＣＤ２０４によって産生されたｉｎ ｖｉｔｒｏアルギニンレベルの棒グラフを表す。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３は、対照のＮｉｓｓｌｅ構築物である。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５は、低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む。ＳＹＮ２０４は、低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されるΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む。
図１３Ａおよび図１３Ｂは、嫌気的誘導後の様々な時点での培地中のアンモニアレベルの棒グラフを表す。図１３Ａは、０、３０、６０、および１２０分で測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６、およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す。図１３Ｂは、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（低コピー数プラスミドにおいてΔＡｒｇＲ、ＰｆｎｒＳ−ＡｒｇＡｆｂｒ、および野生型ＴｈｙＡを含む）、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２、およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（その３つ全てが、組み込まれたＦＮＲ−ＡｒｇＡｆｂｒ構築物を含み、ＳＹＮ ＵＣＤ３０１は、ΔＡｒｇＲ、およびｗｔＴｈｙＡを含み、ＳＹＮ ３０３は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含む）のアルギニン産生レベルの棒グラフを表す図である。結果は、ＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組み込みによって、同じ構築物を発現する低コピー数プラスミド株に関して認められるように類似のレベルのアルギニン産生が得られることを示している。
図１４は、ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを有し、抗生物質抵抗性を有しない、ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有する操作された細菌株（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（アンモニアからのアルギニン産生）の評価を示す折れ線グラフを表す。ストレプトマイシン抵抗性Ｅ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ（Ｎｉｓｓｌｅ）を参照として使用する。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、拡散性外膜（ＤＯＭ）システムを介して分泌される治療ポリペプチド、例えば本明細書に記載される抗がん／免疫調節エフェクター、例えばｈＩＬ−１２、ｍＩＬ−１２、ｈＩＬ−１５、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、および／またはヒアルロニダーゼの発現に関する本開示の例示的な回路の遺伝子組成の概略図を表す。目的の治療ポリペプチドを、プロトタイプのＮ末端Ｓｅｃ依存的分泌シグナルまたはＴａｔ依存的分泌シグナルに融合し、これらは分泌時にペリプラズムへと切断される。例示的な分泌タグには、ｓｅｃ依存的ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡ、ｃｖａＣ、およびＴａｔ依存的タグ（ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡ、および／またはｎｌｐＩのうちの１つまたは複数の欠失を含む。必要に応じて、例えばペリプラズムにおけるポリペプチドの安定性を増加させるために、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴを含むがこれらに限定されないペリプラズムプロテアーゼも同様に欠失させる。ＦＲＴ−ＫａｎＲ−ＦＲＴカセットを下流の組み込みのために使用する。発現はｔｅｔプロモーター（図１５Ａ）または誘導性プロモーター、例えば酸素レベル依存的プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター、図１５Ｂ）、および腸管に本来存在してもしていなくてもよい（例えば、外から添加することができる）代謝物、例えばアラビノースによって誘導されるプロモーターによって駆動される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のカセットは、構成的プロモーターの制御下にある。
図１６は、細菌の表面上に提示される目的のポリペプチドの概略図を表す。そのような治療タンパク質の非制限的な例は、ｓｃＦｖである。ポリペプチドは、提示システムの一部として開発された別のタンパク質からの外膜アンカーを含む融合タンパク質として発現される。そのようなアンカーの非制限的な例を本明細書に記載し、これには、ＬｐｐＯｍｐＡ、ＮＧＩｇＡｓｉｇ−ＮＧＩｇＡＰ、ＩｎａＱ、インチミン、インベイシン、ｐｅｌＢ−ＰＡＬ、およびｂｌｃＡ／ＢＡＮが挙げられる。非制限的な例において、細菌株は、例えば本明細書に記載されるように、１つまたは複数の拡散性外膜表現型（「漏出性の膜」）変異を有する。
図１７は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ（レーン１）および抗ＰＤ１ ｓｃＦｖを発現する株（レーン２）の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。
図１８は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを発現する株からの抽出物と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に結合することを示す。
図１９は、抗ＰＤ１ ｓｃＦｖを分泌する様々な株の総サイトゾル抽出物のウェスタンブロット解析を表す。単一のバンドがレーン１〜６において３４ｋＤａ付近で検出され、それぞれＳＹＮ２７６７、ＳＹＮ２７６９、ＳＹＮ２７７１、ＳＹＮ２７７３、ＳＹＮ２７７５、およびＳＹＮ２７７７からの抽出物に対応した。
図２０は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に結合することを示す。
図２１は、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの様々な量の抽出物（０、２、５、および１５μｌ）と共にインキュベートしたＰＤ１発現ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖがマウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に用量依存的に結合することを示す。
図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＥＬ４細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。図２２Ｂは、ｔｅｔ誘導性抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを分泌するＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を、様々な量の可溶性ＰＤＬ１（０、５、１０、および３０μｇ）と共にインキュベートする競合アッセイを表し、ＰＤＬ１が、マウスＥＬ４細胞上のＰＤ１に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖの結合と用量依存的に競合することができることを示す。図２２Ｂは、ＩｇＧ対照を示す。
図２３Ａ〜図２３Ｄは、食塩水またはＳＹＮ１７０４のいずれかを投与したマウスにおいて測定した腫瘍内キヌレニン（図２３Ａ）および血漿中キヌレニン（図２３Ｃ）の濃度を示すドットブロットを表す。キヌレニンの腫瘍内（Ｐ＜０．００１）および血漿中（Ｐ＜０．００５）濃度の有意な低減が、食塩水対照と比較してキヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４に関して観察された。トリプトファンレベルは一定のままであった（データは示していない）。 同上。
図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、ＣＴ２６腫瘍におけるＫＹＮ消費株の単回投与が、腫瘍（図２４Ａ）および血漿（図２４Ｂ）中の腫瘍ＫＹＮレベル、ならびに腫瘍重量（図２４Ｃ）に及ぼす効果を示すグラフを表す。マウスに、ＳＹＮ９４またはＳＹＮ１７０４を１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬで腫瘍内投与を介して投与した。動物を犠牲にして採血し、表記の時間に組織を収集した。 同上。
図２５は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＹＮ３３６６およびＳＹＮ３３６７によって分泌されたマウスＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）がｍＣＤ４０抗体によって検出されることを示す細菌上清のウェスタンブロット解析を表す。
図２６は、ＳＹＮ２９９６（レーン１）、ＳＹＮ３１５９（レーン２）、ＳＹＮ３１６０（レーン３）、ＳＹＮ３０２１（レーン４）、ＳＹＮ３０２０（レーン５）、およびＳＹＮ３１６１（レーン６）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、ＷＴ ｍＳＩＲＰα、ｍＣＶ１ＳＩＲＰα、ｍＦＤ６ｘ２ＳＩＲＰα、ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４、ｍＦＤ６ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４、および抗ｍＣＤ４７ ｓｃＦｖがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。
図２７は、ＳＹＮ１５５７（１；デルタＰＡＬ親株）、ＳＹＮ２９９６（２；ｔｅｔ誘導性ｍＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３０２１（３；ｔｅｔ誘導性抗ｍＣＤ４７ｓｃＦｖを発現する）、ＳＹＮ３１６１（４；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）からの上清と共にインキュベートしたＣＤ４７発現ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された分泌産物がマウスＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に結合することができることを示す。
図２８は、ＳＹＮ１５５７（１；デルタＰＡＬ親株）、ＳＹＮ３０２０（２；ｔｅｔ誘導性ｍＦＤ６ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）、ＳＹＮ３１６０（３；ｔｅｔ誘導性ＦＤ１ｘ２ＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３１５９（４；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰαを発現する）、ＳＹＮ３０２１（５；ｔｅｔ誘導性ｍＣＶ１ＳＩＲＰα−ｈＩｇＧ融合体を発現する）からの上清と共にインキュベートしたＣＤ４７発現ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された分泌産物がマウスＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に結合することができることを示す。
図２９は、ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。ｔｅｔ誘導性マウスＳＩＲＰアルファを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を組換えＳＩＲＰアルファと共にインキュベートする競合アッセイを実施し、組換えＳＩＲＰアルファがＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰアルファの結合と競合することができることを示す。
図３０は、ＣＴ２６細胞のフローサイトメトリー分析のダイアグラムを表す。ｔｅｔ誘導性マウスＳＩＲＰアルファを分泌するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株からの抽出物を抗ＣＤ４７抗体と共にインキュベートする競合アッセイを実施し、抗体がＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対してＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰアルファの結合と競合することができることを示す。
図３１Ａは、ＳＹＮ２９９７およびＳＹＮ２９９８において発現されたマウスおよびヒトヒアルロニダーゼの分泌のための回路を表す。図３１Ｂは、ＳＹＮ２９９７（レーン１）およびＳＹＮ２９９８（レーン２）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、マウスおよびヒトヒアルロニダーゼがそれぞれ、これらの株から分泌されることを示す。
図３２は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのＳＹＮ１５５７（親株デルタＰＡＬ）、ＳＹＮ２９９７、およびＳＹＮ２９９８のヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。
図３３Ａは、テトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するＳＹＮ３３６９（レーン１）およびＳＹＮ１５５７（親株デルタＰＡＬ）（レーン２）からの細菌上清のウェスタンブロット解析を表し、ヒルヒアルロニダーゼがＳＹＮ３３６９から分泌されることを示す。Ｍ＝マーカー。図３３Ｂおよび図３３Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒアルロナン分解の測定としてのヒアルロニダーゼ活性を示す棒グラフを表す。図３３Ｂは、組換えヒアルロニダーゼによる陽性対照を示す。図３３Ｃは、ＳＹＮ１５５７（親株デルタＰＡＬ）、およびテトラサイクリン誘導性ヒルヒアルロニダーゼを発現するＳＹＮ３３６９のヒアルロニダーゼ活性を示す。 同上。
図３４は、Ｅ．ｃｏｌｉ １９１７ Ｎｉｓｓｌｅ染色体内の例示的な組み込み部位のマップを表す。これらの部位は、回路の構成要素が、本質的な遺伝子発現に干渉することなく、染色体に挿入されうる領域を示している。逆斜線（／）は、挿入が発散性または収束性に発現される遺伝子の間で起こることを示すために使用される。生合成遺伝子、例えばｔｈｙＡ内の挿入は、栄養要求株を作製するために有用でありうる。一部の実施形態では、個々の回路の構成要素を表記の部位の１つより多くに挿入する。一部の実施形態では、複数の異なる回路を表記の部位の１つより多くに挿入する。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ １９１７ Ｎｉｓｓｌｅ染色体の複数の部位に回路を挿入することによって、遺伝子操作された細菌は、複数の作用機序（ＭｏＡ）を可能にする回路を含みうる。
図３５は、広い抗腫瘍活性を達成するために免疫欠損において間質を補完することによって、本開示の遺伝子操作された細菌が腫瘍微小環境をどのように変換することができるかを示す概略図を表す。
図３６は、抗腫瘍活性の改善のための機序の組合せを示す概略図を表す。
図３７は、ビヒクルまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体単独と比較した、単独または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの構成的に発現された染色体に組み込まれたコピーを有するキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８によるキヌレニン消費が腫瘍体積に及ぼす効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の折れ線グラフを表す。データは、単剤としての、および抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせたキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆し、ＳＹＮ２０２８が、ＣＴ２６においてαＣＴＬ−４媒介抗腫瘍活性を改善することを示唆している。本試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍を移植し；抗ＣＴＬＡ４抗体を１００μｇ／マウスでＩＰ投与した；細菌１×１０ｅ７個を腫瘍内に投与した；細菌および抗体を全て隔週で投与した。
図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ、および３８Ｄは、図３７に示す試験に関する各々の個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。図３８Ｅは、対応するカプランマイヤープロットを表す。 同上。 同上。
図３９Ａ、図３９Ｂ、図３９Ｃ、図３９Ｄ、図３９Ｅは、抗ＣＴＬ−４および抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＫｙｎ消費体ＳＹＮ２０２８が、ＭＣ３８腫瘍における抗腫瘍活性を改善することを示す折れ線グラフを表す。図３９Ｂ、３９Ｃ、３９Ｄ、および３９Ｅは、図３９Ａに示す試験の各個々のマウスを示す折れ線グラフを表す。抗ＣＴＬ−４および抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＫｙｎ消費体ＳＹＮ２０２８は、ＭＣ３８腫瘍において、ビヒクル（図３９Ｂ）、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体単独（図３９Ｃ）、またはＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）＋抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体（図３９Ｄ）と比較して改善された抗腫瘍活性を有する（図３９Ｅ）；すなわち、キヌレニン消費体は、抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ１抗体媒介性の抗腫瘍活性の改善能を有する。図３９Ｆは、対応するカプランマイヤープロットを表す。 同上。 同上。
図４０Ａは、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ、および４０Ｆに示す試験の投与スキーマを示すチャートを表す。図４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ、および４０Ｆは、化学療法剤であるシクロホスファミド（骨髄非破壊性化学療法、プレコンディショニング）およびアルギニン産生株（ＳＹＮ８２５、図４０Ｅ）、またはキヌレニン消費株（ＳＹＮ２０２８、図４０Ｆ）による組合せ処置が腫瘍体積に及ぼす効果のｉｎ ｖｉｖｏ分析の各個々のマウスの折れ線グラフを表す。組合せ処置の効果をビヒクル単独（図４０Ｂ）、シクロホスファミド単独（図４０Ｃ）、またはＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ、図４０Ｄ）による処置と比較した。データは、シクロホスファミドと組み合わせたアルギニン産生株およびキヌレニン消費株の抗腫瘍活性を示唆する。本試験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、シクロホスファミド（ＣＰ）を１００ｍｇ／ｋｇでＩＰ投与し、細菌１×１０ｅ７個（１００μｌ体積中）を腫瘍内に投与した。投与スキーマを図４０Ａに示す。 同上。
図４１は抗原提示細胞におけるＳＴＩＮＧ経路を示す概略図を表す。
図４２Ａは、例えばＳＹＮ３５２７において認められるようにＳＴＩＮＧアゴニストの発現のための例示的な構築物を示す概略図を表す。構築物は、ｄａｃＡ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのジアデニレートシクラーゼ遺伝子を用いる。一部の実施形態では、構築物をＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに導入する。一部の実施形態では、構築物はプラスミドに位置する。一部の実施形態では、構築物は細菌染色体に組み込まれる。一部の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅでの発現に関してコドン最適化される。示されるように、ｄａｃＡの発現はテトラサイクリン誘導性プロモーターによって駆動されうる。あるいは、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される異なる誘導性プロモーターを使用して、ｄａｃＡの発現を駆動してもよい。なお他の代替の実施形態では、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される構成的プロモーターを使用して、ｄａｃＡの発現を駆動してもよい。
（図４２Ｂ）図４２Ｂは、ＬＣ／ＭＳによって測定した場合のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞外および細胞内環状ジＡＭＰ蓄積を示す棒グラフを表す。ｄａｃＡ発現構築物を含有しない対照株では環状ジＡＭＰ蓄積は測定されなかった。
図４３は、生きた細菌および熱死滅細菌によって処置したＲＡＷ ２６７．４細胞における相対的ＩＦＮｂ１ ｍＲＮＡ発現を表す。
図４４Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図４４Ｂおよび図４４Ｃに示す。図４４Ｂは、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を移植し、食塩水、ＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ）、またはＳＹＮ３５２７（テトラサイクリン誘導性ｄａｃＡ構築物を含む）によって処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図４４Ｃは、試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図４４Ｄは、９日目での腫瘍重量を示すグラフを表す。図４４Ｅはフローサイトメトリーを介して測定した９日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるＴ細胞総数を示すグラフを表す。図４４Ｆは、ＣＤ４（従来の）およびＣＤ８ Ｔ細胞サブセット中の活性化（ＣＤ４４ ｈｉｇｈ）Ｔ細胞のパーセンテージを示すグラフを表し、図４４Ｇは、フローサイトメトリーを介して測定した９日目での腫瘍流入領域リンパ節におけるＳＴＩＮＧ注射時のＴｒｅｇの活性化の欠如を示すグラフを表す。 同上。 同上。 同上。
図４５Ａおよび図４５Ｂは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合の、ｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日後（図４５Ａ）または９日後（図４５Ｂ）にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＩＦＮ−ｂ１の濃度を示す棒グラフを表す。
図４６Ａは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合の、ｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるＩＬ−６（左のパネル）、ＩＬ−１ベータ（中央のパネル）およびＭＣＰ−１（右のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図４６Ｂは、食塩水またはストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅによって処置したマウスと比較した場合のｔｅｔ誘導性ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７の投与および誘導の２日および９日後にＬｕｍｉｎｅｘ Ｂｅａｄアッセイによって測定したＢ１６腫瘍におけるグランザイムＢ（左のパネル）、ＩＬ−２（中央のパネル）、およびＩＬ−１５（右のパネル）の濃度を示す棒グラフを表す。図４６Ａおよび図４６Ｂの両方において、各パネルにおける棒グラフは図４５Ａおよび図４５Ｂと同じ順序で整列し、すなわち食塩水（左）、ストレプトマイシン抵抗性野生型Ｎｉｓｓｌｅ（中央）、およびＳＹＮ３５２７（ＳＹＮ−ＳＴＩＮＧ、右）である。 同上。
図４７Ａおよび図４７Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２９（Ｎｉｓｓｌｅ ｐ１５Ａ Ｐｔｅｔ−ＣｏｄＡ）およびＳＹＮ３６２０（Ｎｉｓｓｌｅ ｐ１５Ａ Ｐｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体）が５−ＦＣを５−ＦＵに変換する能力の棒グラフを表す。グラフは２時間のアッセイ時間後の５−ＦＣレベル（図４７Ａ）および５−ＦＵレベル（図４７Ｂ）を示す。
図４８Ａおよび図４８Ｂは、ＳＹＮ３５２７（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のテトラサイクリン誘導性ＤａｃＡを含む）による刺激の４時間後（図４８Ａ）または刺激の２および４時間後（図４８Ｂ）のいずれかでのマウス骨髄由来樹状細胞におけるＩＮＦ−ｂ１産生（図４８Ａ）、またはＩＦＮ−ｂ１ ｍＲＮＡ発現（図４８Ｂ）を示すグラフを表す。ＳＹＮ３５２７は誘導されないままであったか（「ＳＴＩＮＧｕｎ」）、または実験前にテトラサイクリンによって誘導された「ＳＴＩＮＧｉｎ」。
図４９Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図４９Ｂ、図４９Ｃ、図４９Ｄ、および図４９Ｅに示す。図４９Ｂは、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を移植し、ＰＢＳ、ＳＹＮ３６２０（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体を含む）、またはＳＹＮ３５２９（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）を含む）によって処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図４９Ｃは、試験における個々のマウスの腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。図４９Ｄは、６日目での腫瘍重量を示すグラフを表す。図４９Ｅは、質量分析を介して測定した６日目での５−ＦＣの腫瘍内濃度を示すグラフを表す。 同上。 同上。
図５０Ａおよび図５０Ｂは、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体ＳＮ３５２７、キヌレニン消費体ＳＹＮ２０２８、および組合せ株（ＳＴＩＮＧアゴニスト産生体＋キヌレニン消費体）ＳＹＮ３８３１の環状ジＡＭＰの産生（図５０Ａ）およびキヌレニンの消費（図５０Ｂ）を示す棒グラフを表す。
図５１Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図５１Ｂおよび５１Ｃに示す。図５１Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した腫瘍の細菌定着を示すグラフを表す。図５１Ｃは、フローサイトメトリーを介して測定した８日目のＣＴ２６腫瘍から単離した腫瘍内リンパ球の表記の免疫細胞集団における平均蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値によって測定したＣＣＲ７（左）またはＣＤ４０（右）の相対的発現を示すグラフを表す。 同上。
図５２Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図５２Ｂ〜５２Ｄに示す。図５２Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した腫瘍の細菌定着を示すグラフを表す。図５２Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定したＣＴ２６腫瘍におけるＴＮＦαの相対的濃度を示すグラフを表す。図５２Ｄは、ＣＴ２６腫瘍を移植し、ＳＹＮ（ＤＯＭ変異体）またはＳＹＮ−ＴＮＦα（ＰＡＬ：：ＣＭ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＴＮＦアルファを含む）によって処置したマウスの平均腫瘍体積を示す折れ線グラフを表す。 同上。
図５３Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の概要を示す概略図を表し、その結果を図５３Ｂおよび５３Ｃに示す。図５３Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）によって測定した腫瘍の細菌定着を示すグラフを表す。図５３Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合のＣＴ２６腫瘍におけるＩＦＮγの相対的濃度を示すグラフを表す。
図５４Ａおよび図５４Ｂは、遊走細胞の数を、ＳＹＮ細菌上清中で様々な濃度で希釈したＳＹＮ−ＣＸＣＬ１０上清の添加後にフローサイトメトリーを介して測定するヒトＴ細胞トランスウェルアッセイの結果を表す。抗ＣＸＣＲ３を、１００％ＳＹＮ−ＣＸＣＬ１０上清を含有する対照ウェルに添加し、ＣＸＣＬ１０−ＣＸＣＲ３経路に関する遊走の特異性を確認した。図５４Ａは、遊走細胞の総数を表す。図５４Ｂは、サイトカインなしの対照と比較した遊走を表す。
図５５は、ＩＬ−１５分泌体ＳＹＮ３５２５（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）−ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合のＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示す折れ線グラフを表す。
図５６は、ＴＮＦアルファ分泌体ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ｐｈｏＡ ＴＮＦａ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合の、ＨｅＬａ細胞におけるＩカッパＢアルファの分解を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。
図５７Ａおよび図５７Ｂは、ＩＦＮガンマ分泌体ＳＹＮ３５４３（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇ）、親対照ＳＹＮ１５５７、および組換えＩＬ−１５対照の上清によって処置した場合の、マウスＲＡＷ２６４．７細胞におけるＳＴＡＴ１リン酸化を示す細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフを表す。
ある特定の腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。ハイポキシアは、がん性細胞が非常に低い酸素濃度で存在する固形腫瘍の特有の特徴である。ハイポキシアの領域は、多くの場合、壊死組織を包囲し、固形のがんがそれらの脈管構造より大きくなると発生する。血管供給が、腫瘍の代謝要求を満たすことができないと、腫瘍の微量環境は酸欠になる。腫瘍内の複数のエリアは、正常組織内の３〜１５％酸素と比較して＜１％酸素を含有し（VaupelおよびHockel、１９９５年）、無血管領域が腫瘍塊の２５〜７５％を占めることもある（Dangら、２００１年）。腫瘍のおおよそ９５％は、ある程度は低酸素である（Huangら、２００４年）。全身送達される抗がん剤は、腫瘍脈管構造に頼って送達されるが、不良な脈管形成が、急速に分裂する細胞への酸素供給を妨げ、その結果、脈管形成不良の低酸素腫瘍領域における細胞増殖を標的とする治療に対するそれらの細胞の感受性が低くなる。放射線療法は、酸素が放射線誘導細胞死の必要エフェクターであるため、低酸素細胞を死滅させることができない。低酸素細胞には、放射線療法に対して、正常な酸素レベルを有する細胞の３倍までの抵抗性がある（Bettegowdaら、２００３年；Tiecher、１９９５年；Wachsbergerら、２００３年）。これらのすべての理由のため、切除不能な局所進行腫瘍は、従来の治療法を使用して管理することが特に困難である。
低酸素環境を標的とすることに関連する課題に加えて、がんを特異的に標的とし、破壊する治療法は、遺伝的変更と、ハイポキシアおよび壊死のエリアを有する不均質な塊をもたらす病態生理学的変化とを含む、正常組織と悪性組織との差を認識しなければならない。
本発明は、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、およびがんをモジュレートまたは処置するための方法を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、特に、低酸素腫瘍環境などの低酸素条件で、がん性細胞を標的とすることができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞に局所送達される。ある特定の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、１つもしくは複数の抗がん分子をがん性細胞に送達すること、またはがん性細胞において１つもしくは複数の抗がん分子を産生することができる。
本開示は、がんを処置するために抗がん分子を局所的かつ腫瘍特異的に送達するための、組成物および治療方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、１つまたは複数の抗がん分子、例えば、本明細書で提供される抗がん分子のいずれかを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞を標的とすることができ、１つまたは複数の抗がん分子を産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。ある特定の態様では、本開示は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域におけるがん性細胞を標的とすることができ、酸素レベル誘導性プロモーターの制御下で１つまたは複数の抗がん分子を産生することができる、遺伝子操作された細菌に関する。既存の従来の治療法とは対照的に、腫瘍の低酸素エリアは、嫌気性細菌の成長のための完璧なニッチを提供し、その使用は、周囲の脈管形成良好な酸素正常状態の組織を温存して、進行した局所腫瘍を正確に根絶する機会をもたらす。
一部の態様では、本開示は、１つまたは複数の抗がん分子を腫瘍細胞または腫瘍微小環境に送達することができる、遺伝子操作された微生物を提供する。一部の態様では、本開示は、全身的に、例えば本開示に記載の送達手段のいずれかによって、送達され、１つまたは複数の抗がん分子、例えば、本開示に記載の抗がん分子のいずれかを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本開示は、局所的に、例えば局所腫瘍内投与によって、送達され、１つまたは複数の抗がん分子、例えば、本開示に記載の抗がん分子のいずれかを産生することができる、遺伝子操作された微生物に関する。一部の態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用して、１つまたは複数の抗がん分子を腫瘍細胞に選択的に送達することによって、全身性細胞傷害性または全身性免疫不全、例えば、自己免疫事象または他の免疫関連有害事象の発生を低減させることができる。
本開示をより容易に理解することができるように、ある特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残部に照らし合わせて、また当業者により理解されるように、読まれたい。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。さらなる定義は、詳細な説明の至る所に示される。
「腫瘍内投与」は、腫瘍内部位への微生物送達についての任意のおよびすべての意味を含むように意図されており、腫瘍内注射手段に限定されない。操作された微生物の送達手段の例は、本明細書中で詳細に論じられている。
「がん」または「がん性」は、非調節細胞成長を特徴とする生理状態を指すために使用される。一部の実施形態では、がんは、腫瘍を指す。「腫瘍」は、任意の新生物細胞成長もしくは増殖または任意の前がん性もしくはがん性細胞もしくは組織を指すために使用される。腫瘍は、悪性であることもあり、または良性であることもある。がんの種類の例としては、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫)、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。がん処置の副作用としては、日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲減退、膀胱内膜の炎症、出血および内出血（血小板減少）、味覚または嗅覚の変化、便秘、下痢、口内乾燥、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染、不妊、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、ならびに／または記憶および集中力に関する問題を挙げることができるが、これらに限定されない（米国国立がん研究所（National Cancer Institute））。
本明細書で使用される場合、「アブスコパル」および「アブスコパル効果」は、腫瘍の局部的処置が、処置される腫瘍を収縮させるかまたはそれらに別様に影響を与えるばかりでなく、局部的処置の範囲外の他の腫瘍も収縮させるかまたはそれらにも別様に影響を与える効果を指す。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アブスコパル効果を惹起することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与時にアブスコパル効果が観察されない。
「ハイポキシア」は、酸欠環境を生じさせる結果となる、生理的レベルと比較して低下した組織への酸素供給量を指すように使用される。「酸素正常状態」は、組織への生理的酸素供給レベルを指す。ハイポキシアは、固形腫瘍の顕著な特徴であり、不十分な灌流に起因する低酸素および壊死領域を特徴とする（Grootら、２００７年）。
本明細書で使用する場合、「ペイロード」は、遺伝子操作された微生物、例えば、細菌またはウイルスにより産生される、目的の１つまたは複数の分子を指す。一部の実施形態では、ペイロードは、治療用ペイロード、例えば、抗がん分子である。一部の実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えば、ＦＮＲなどの転写調節因子である。一部の実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーなどの、調節エレメントを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、ＦＮＲＳからのものなどの誘導性プロモーターを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、キルスイッチなどのリプレッサーエレメントを含む。一部の実施形態では、ペイロードは、遺伝子（１つもしくは複数）またはオペロンによりコードされている。代替実施形態では、ペイロードは、生合成または生化学的経路により産生され、生合成または生化学的経路は、必要に応じて微生物に内在性のものであってもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２またはそれより多いペイロードを含む。
本明細書で使用される場合、用語「低酸素」は、大気中に存在する酸素のレベル、量または濃度より少ない（例えば、＜２１％Ｏ２；＜１６０Ｔｏｒｒ Ｏ２））、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。したがって、用語「１つまたは複数の低酸素条件」または「低酸素環境」は、大気中に存在するより低いレベルの酸素を含有する条件または環境を指す。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、哺乳動物の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位Ｓ状結腸、直腸および肛門管に見られる酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、用語「低酸素」は、０〜６０ｍｍＨｇ Ｏ２（０〜６０Ｔｏｒｒ Ｏ２）（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５，４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０ｍｍＨｇ Ｏ２）であって、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、０．２ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇ Ｏ２、０．７５ｍｍＨｇ Ｏ２、１．２５ｍｍＨｇ Ｏ２、２．１７５ｍｍＨｇ Ｏ２、３．４５ｍｍＨｇ Ｏ２、３．７５ｍｍＨｇ Ｏ２、４．５ｍｍＨｇ Ｏ２、６．８ｍｍＨｇ Ｏ２、１１．３５ｍｍＨｇ Ｏ２、４６．３ｍｍＨｇ Ｏ２、５８．７５ｍｍＨｇなど（これらの例示的分数は、説明を目的としてここに列挙されており、決して制限するようには意図されていない））を含む、Ｏ２のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、「低酸素」は、約６０ｍｍＨｇ Ｏ２またはそれ未満（例えば、０〜約６０ｍｍＨｇ Ｏ２）を指す。用語「低酸素」は、０〜６０ｍｍＨｇ Ｏ２の間（両端の値を含む）、例えば、０〜５ｍｍＨｇ Ｏ２、＜１．５ｍｍＨｇ Ｏ２、６〜１０ｍｍＨｇ、＜８ｍｍＨｇ、４７〜６０ｍｍＨｇなどの、Ｏ２レベル、量または濃度の範囲を指すこともあり、この列挙された例示的範囲は、説明を目的としてここに列挙されおり、決して制限するようには意図されていない。例えば、Albenbergら、Gastroenterology、１４７巻（５号）：１０５５〜１０６３頁（２０１４年）；Bergofskyら、J Clin.Invest.、４１巻（１１号）：１９７１〜１９８０頁（１９６２年）；Cromptonら、J Exp.Biol.、４３巻：４７３〜４７８頁（１９６５年）；Heら、PNAS (USA)、９６巻：４５８６〜４５９１頁（１９９９年）；McKeown, Br. J. Radiol.、８７巻：２０１３０６７６頁（２０１４年）（doi: 10.1259/brj.20130676）を参照されたく、これらの開示の各々は、様々な種の哺乳動物の消化管に見られる酸素レベルを論じており、これらの各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、酸素が低下したレベルで、例えば、低酸素または無酸素レベルで存在する、消化管以外の哺乳動物の臓器または組織、例えば、尿生殖路、腫瘍組織などに見られる酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。一部の実施形態では、「低酸素」は、部分好気、半好気、微好気、非好気、微有酸素、低酸素、無酸素および／または嫌気条件で存在する、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されている。例えば、表１は、様々な臓器および組織に存在する酸素量を要約するものである。一部の実施形態では、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度は、溶存酸素（「ＤＯ」）の量として表され、これは、液体中に存在する遊離、非化合物酸素（Ｏ２）のレベルを指し、通常は、１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）、百万分率（ｐｐｍ；１ｍｇ／Ｌ＝１ｐｐｍ）、またはマイクロモル（μｍｏｌ）（１μｍｏｌ Ｏ２＝０．０２２３９１ｍｇ／Ｌ Ｏ２）で報告される。Fondriest Environmental, Inc.、「Dissolved Oxygen」、Fundamentals of Environmental Measurements、２０１３年１１月１９日、www.fondriest.com/environmental-measurements/parameters/water-quality/dissolved- oxygen/>。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、約６．０ｍｇ／Ｌ ＤＯまたはそれ未満、例えば、６．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、または０ｍｇ／Ｌ、ならびにこれらに関する任意の分数、例えば、３．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌおよび０．１ｍｇ／Ｌ ＤＯである、酸素（Ｏ２）のレベル、量または濃度を指すように意図されており、例示的分数は、説明を目的としてここに列挙され、決して制限するようには意図されていない。液体または溶液中の酸素のレベルはまた、空気飽和度のパーセンテージとして報告されることもあり、または酸素飽和度のパーセンテージ（溶液中の溶存酸素（Ｏ２）の濃度の、ある特定の温度、圧力および塩分で、安定平衡下で、溶液に溶解するであろう酸素の最大量に対する比）として報告されることもある。酸素産生物質も消費物質も含まない、十分に曝気された溶液（例えば、混合および／または撹拌に供された溶液）は、１００％空気飽和されている。
一部の実施形態では、用語「低酸素」は、空気飽和度４０％またはそれ未満、例えば、空気飽和度４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、および０％を、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、３０．２５％、２２．７０％、１５．５％、７．７％、５．０％、２．８％、２．０％、１．６５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、ならびに０〜４０％の間（両端の値を含む）の任意の空気飽和レベル範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜１０％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％など）を含めて、指すように意図されている。
ここに列挙された例示的分数および範囲は、説明を目的としたものであり、決して制限するようには意図されていない。一部の実施形態では、用語「低酸素」は、Ｏ２飽和度９％またはそれ未満、例えば、Ｏ２飽和度９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０％を、これらの任意のおよびすべての増分分数（例えば、６．５％、５．０％、２．２％、１．７％、１．４％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）、および０〜９％の間（両端の値を含む）の任意のＯ２飽和レベルの範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜８％、５〜７％、０．３〜４．２％Ｏ２など）を含めて、指すように意図されている。ここに列挙された例示的分数および範囲は、説明を目的としたものであり、決して制限するようには意図されていない。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を指す。用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびにネイティブおよび非ネイティブ遺伝子の、それらが自然には通常は関連していないプロモーターの制御下での発現を、とりわけ含む。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子カセット」および「回路」「遺伝子カセット」および「回路」は、内在性遺伝子の改変、例えば、欠失、突然変異、ならびにネイティブおよび非ネイティブ遺伝子の、それらが自然には通常は関連していないプロモーターの制御下での発現を含む、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、天然に存在する配列、人工配列、およびコドン最適化配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の配列を、とりわけ指す。
「抗がん分子」は、遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌により産生される、目的の１つまたは複数の治療用物質または薬物であって、細胞成長または複製を低減および／または阻害することができる治療用物質または薬物を指す。一部の実施形態では、抗がん分子は、がんのモジュレーションまたは処置に有用である治療用分子である。一部の実施形態では、抗がん分子は、遺伝子によりコードされている治療用分子である。代替実施形態では、抗がん分子は、生化学的または生合成経路により産生される治療用分子であり、生合成または生化学的経路は、必要に応じて微生物に内在性のものであってもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２つまたはそれより多い抗がん分子を産生することができる。抗がん分子の非限定的な例としては、免疫チェックポイントインヒビター（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１抗体、ＰＤＬ−１抗体）、細胞傷害剤（例えば、Ｃｌｙ Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−アルファ）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激分子（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２１、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、免疫サプレッサー分子に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ＧＬＰ２、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３、抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体）、ＤＮＡ転移ベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン−１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２）、ならびに酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ、ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。一部の実施形態では、抗がん分子は、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答または阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、遺伝子編集、例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉を媒介する、核酸分子を含む。一部の実施形態では、細菌またはウイルスをベクターとして使用して、例えばバクトフェクション（Bernardesら、２０１３年）により、ＤＮＡを哺乳動物細胞に転移させることができる。他の抗がん分子は、本明細書に記載され、列挙されている。
抗体は、対応する抗原に非共有結合で、可逆的に、および特異的様式で結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、または免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを一般的に指す。例示的抗体構造ユニットは、四量体を含む。各四量体は、ジスルフィド結合によって接続された同一の２対のポリペプチド鎖であって、各対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖で構成されている。認知されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのどちらかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、さらにはこれらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担当する、約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸数の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は、１つまたは複数の特定の結合特異性を有する、様々な抗体およびそれらの断片すべてを包含するように意図されている。したがって、用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、ＶＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むように意図されている。抗体は、１つより多くの結合特異性を有することができ、例えば、二特異性でありうる。用語「抗体」はまた、いわゆる抗体模倣物を含むように意図されている。抗体模倣物は、抗原に特異的に結合することができるが抗体関連構造を有さない、単一アミノ酸鎖分子でありうる、小分子、例えば、３〜３０ｋＤａを指す。抗体模倣物は、アフィボディ分子（プロテインＡのＺドメイン）、アフィリン（ガンマ−Ｂクリスタリン（crystalline））、ユビキチン、アフィマー（クリスタチン）、アフィチン（Ｓａｃ７ｄ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓからのもの））、アルファボディ（トリプルヘリックスコイルドコイル）、アンチカリン（リポカリン）、アビマー（様々な膜受容体のドメイン）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートモチーフ）、フィノマー（ＦｙｎのＳＨ３ドメイン）、クニッツドメインペプチド（様々なプロテアーゼインヒビターのクニッツドメイン）、エカランチド（カルビトール）、およびモノボディを含むが、これらに限定されない。ある特定の態様では、用語「抗体」（単数）または「抗体」（複数）は、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、およびラクダ科動物抗体を指すように意図されている。がんの処置における抗体の有用性およびさらなる抗がん抗体は、例えば、その全体が参照により組み込まれるScottら、Antibody Therapy for Cancer、Nature Reviews Cancer ２０１２年４月 １２巻において見つけることができる。
「単鎖抗体」（単数）または「単鎖抗体」（複数）は、免疫グロブリンの重鎖と、免疫グロブリンの軽鎖と、必要に応じて、リンカーまたは結合、例えばジスルフィド結合とを含むペプチドを通常は指す。単鎖抗体は、旧来の抗体に見られる定常Ｆｃ領域を欠いている。一部の実施形態では、単鎖抗体は、天然に存在する単鎖抗体、例えば、ラクダ科動物抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、合成の、操作された、または修飾された単鎖抗体である。一部の実施形態では、単鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。一部の態様では、単鎖抗体は、例えば米国特許４，９４６，７７８号に記載されているような、アミノ酸数１０〜約２５の短いリンカーペプチドで、必要に応じて接続されている、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の（いずれの定常領域も有さない）融合タンパク質を指す、「ｓｃＦｖ抗体」であってもよく、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｖ断片は、抗体の結合部位を保持する最小の断片であって、一部の態様では結合部位が元の抗体の特異性を維持しうる、断片である。単鎖抗体の産生技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ｓｃＦｖのＶｈおよびＶＬ配列を、ＶＬのＣ末端と接続することになるＶＨのＮ末端を介して接続してもよく、またはＶＬのＮ末端と接続することになるＶＨのＣ末端を介して接続してもよい。ｓｃＦｖ断片は、どちらかの末端が他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインと区別不能に融合されうる、独立したフォールディング実体である。様々な長さのリンカーを使用してＶｈおよびＶＬ配列を連結させることができ、リンカーは、グリシンリッチであってもよく（これは可動性をもたらす）、またはセリンもしくはトレオニンリッチであってもよい（これは可溶性を増大させる）。短いリンカーは、２つのドメインの会合を防止するこができ、多量体（ダイアボディ、トリアボディなど）をもたらすことができる。長いリンカーはタンパク質分解または弱いドメイン会合をもたらすことができる（Voelkelら、２０１１年に記載されている）。アミノ酸数１５〜２０の間またはアミノ酸数１８〜２０の間の長さのリンカーが使用されることが、最も多い。他の可動性リンカーを含む、リンカーのさらなる非限定的な例は、Chenら、２０１３年（Adv Drug Deliv Rev. ２０１３年１０月１５日；６５巻（１０号）：１３５７〜１３６９頁. Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality）に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。可動性リンカーはまた、グリシンおよびセリンなどの小さいまたは極性のアミノ酸を多く含むが、可動性を維持するためにトレオニンおよびアラニンなどの追加のアミノ酸を、ならびに可溶性を向上させるためにリシンおよびグルタメートなどの極性アミノ酸を含有することもある。例示的なリンカーとしては、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤおよびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、（Ｇｌｙ）８、ならびにＧｌｙおよびＳｅｒリッチ可動性リンカー、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」は、ヒト、マウスまたは他の種に由来するナノボディおよび単一ドメインＶＨまたはＶＬドメインを含む、ラクダ科動物抗体および他の重鎖抗体、軽鎖抗体を含む、単一ドメイン抗体も含む。単一ドメイン抗体は、これらに限定されないがマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含む、いずれの種に由来してもよい。単一ドメイン抗体は、ラクダ、ラマまたはアルパカに由来するラクダ科動物足場を有するドメイン抗原結合ユニットを含む。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能性抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自律的にフォールディングし、独立して抗原結合ユニットとして機能する。その結合面は、古典的抗原結合分子（Ｆａｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲしか含まない。ラクダ科動物抗体は、従来の抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を達成することができる。ラクダ科動物足場に基づく抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して産生することができる。軟骨魚類は、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）も有し、この抗体から、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。あるいは、ヒトまたはマウスからのＩｇＧからの二量体可変ドメインを単量体に分割することができる。ナノボディは、軽鎖に由来する単鎖抗体である。用語「単鎖抗体」は、抗体模倣物も指す。
一部の実施形態では、操作された微生物により発現される抗体は、二特異性である。ある特定の実施形態では、二特異性抗体分子は、ｓｃＦｖまたはその断片を含み、第１のエピトープおよびｓｃＦｖ、またはその断片に対する結合特異性を有し、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分は、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二特異性ｓｃＦｖ抗体、単一結合ドメイン（ｄＡｂ）、およびミニボディを含む。単量体単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、細菌および哺乳動物細胞において容易に組み立てられ、生理条件下で向上した安定性を示す（Voelkelら、２００１年およびその中の参考文献；Protein Eng.（２００１年）１４巻（１０号）：８１５〜８２３頁には、単量体および二量体二特異性単鎖抗体の発現のための最適化リンカー配列が記載されている）。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」（単数）はもちろん「ポリペプチド」（複数）も含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）により直鎖状に連結されたアミノ酸単量体で構成されている分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２またはそれより多いアミノ酸数の任意の鎖（単数）または鎖（複数）を指し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２もしくはそれより多いアミノ酸数の鎖（単数）もしくは鎖（複数）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはいずれかと同義で使用されうる。用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾産物を指すようにも意図されている。ポリペプチドは、天然生物源に由来することもあり、または組換え技術により産生されることもある。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌により産生される。本発明のポリペプチドは、約３もしくはそれより多い、５もしくはそれより多い、１０もしくはそれより多い、２０もしくはそれより多い、２５もしくはそれより多い、５０もしくはそれより多い、７５もしくはそれより多い、１００もしくはそれより多い、２００もしくはそれより多い、５００もしくはそれより多い、１，０００もしくはそれより多い、または２，０００もしくはそれより多いアミノ酸数のサイズのものであってもよい。ポリペプチドは、被定義三次元構造を有することもあるが、そのような構造を必ずしも有する必要はない。被定義三次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングされていると言われ、被定義三次元構造を有さず、むしろ多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは、フォールディングされていないと言われる。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体は、その天然の環境にないポリペプチドを指す。特定の精製レベルは、要求されない。細菌または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現された、組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的では単離されたと見なされ、任意の適切な技術により分離された、分画された、または部分的にもしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドも、単離されたとみなされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物により形質転換された、微生物または哺乳動物の細胞から産生された、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養において発現されるタンパク質またはペプチドには、通常はグリカンがないであろう。前述のポリペプチドの断片、誘導体、アナログまたはバリアント、およびそれらの組合せも、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「アナログ」は、元のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つまたは複数の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片はもちろん、欠失断片も含む。断片は、本明細書に記載の任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的活性断片も含む。バリアントは、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともある。天然に存在しないバリアントは、当技術分野において公知の突然変異誘発法を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含みうる。
ポリペプチドは、融合タンパク質も含む。本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、元のペプチドの配列を含む、または元のペプチドと十分に類似している配列を含む、融合タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、２つまたはそれより多い異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は、周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術の結果として得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と、類似の構造機能を（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の調節機能を（必ずしも同程度にではないが）、および／または類似の生化学機能を（必ずしも同程度にではないが）および／または免疫学的活性を（必ずしも同程度にではないが）有しうる。「誘導体」は、２０の標準アミノ酸についての１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含むが、これらに限定されない。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列をもう１つのペプチドの配列と比較することにより決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、もう１つのペプチドの対応するアミノ酸と、それが同一のまたは保存的アミノ酸置換である場合、類似している。保存的置換は、Dayhoff, M. O.編、The Atlas of Protein Sequence and Structure 5、National Biomedical Research Foundation、Washington, D.C.（１９７８年）、およびArgos, EMBO J. ８巻（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものを含む。例えば、次の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を示す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、安定化ポリペプチドと融合されているエフェクターまたは抗がん分子をコードする遺伝子配列を含む。そのような安定化ポリペプチドは、当技術分野において公知であり、Ｆｃタンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされている融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質またはＩｇＡ Ｆｃ融合タンパク質である。
一部の実施形態では、抗がん分子は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドと共有結合で融合されている。一部の実施形態では、抗がん分子は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドと共有結合で融合されている。一部の実施形態では、抗がん分子のＣ末端は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドのＮ末端と共有結合で融合されている。一部の実施形態では、抗がん分子のＮ末端は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドのＣ末端と共有結合で融合されている。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域および免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである、請求項２〜６４のいずれか、および請求項１１２〜１２２のいずれかに記載の、遺伝子操作された細菌。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドは、配列［ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ］ｎ（配列中、ｎは、１、２、３、４、５または６である）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰアルファＩｇＧ ＦＣ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰアルファＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファのＮ末端は、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含むペプチドリンカーによってＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端と共有結合で融合されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、多量体ポリペプチドの成分をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、二量体である。二量体タンパク質の非限定的な例としては、ＩＬ−１５（ヘテロ二量体）などの、サイトカインが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、１つまたは複数のポリペプチドは、第１の単量体および第２の単量体を含む。一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって第２の単量体ポリペプチドと共有結合で連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、同じポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、各々が異なるポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ３５ポリペプチドであり、第２の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ４０ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１７の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｈＩｇＧ４部分を含むｈＩＧｇ４融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、ｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドのｈＩｇＧ４部分は、配列番号１１１７からなる。
一部の実施形態では、ｈＩＧｇ４融合タンパク質などの融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号１１０３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、配列番号１１０３を含む。一部の実施形態では、ｈＩｇＧ４をコードする核酸部分は、配列番号１１０３からなる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２１の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するリンカー部分を含む融合タンパク質をコードする。別の実施形態では、リンカー部分は、配列番号１１２１を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドのリンカー部分は、配列番号１１２１からなる。
一部の実施形態では、抗がん分子のエフェクター機能を、エフェクター機能を助長する別のポリペプチドとの融合によって向上させることができる。そのような融合の非限定的な例は、本明細書に記載のＩＬ−１５ＲアルファのＳｕｓｈｉドメインとのＩＬ−１５の融合である。したがって、一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ＩＬ−１５単量体であり、第２の単量体は、ＩＬ−１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインポリペプチドである。
これらの実施形態のいずれか、およびすべての組合せ実施形態において、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の１つまたは複数の分泌タグをコードする遺伝子配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、拡散性外膜表現型を可能にする、内在性膜会合タンパク質の１つまたは複数の突然変異を含む。適切な外膜突然変異は、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「十分に類似している」は、第２のアミノ酸配列と比較して同一または同等のアミノ酸残基を、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するために十分なまたは最小の数、含有する、第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書では定義される。好ましくは、バリアントは、本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているであろう。そのようなバリアントは、本発明のペプチドの機能活性を一般に保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸欠失、付加および／または置換によってそれぞれネイティブおよびｗｔペプチドとはアミノ酸配列が異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在するバリアントはもちろん、人工的に設計されたものでもありうる。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」は、２つのポリペプチド配列を接続するまたは連結させる、例えば、２つのポリペプチドドメインを連結させる、合成のまたは非ネイティブのまたは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「合成（の）」は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的リンカーは、本明細書に記載されている。さらなる例示的リンカーは、米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に提供されており、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎである。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号９７９を含む。
本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化配列」は、例えば、コード配列から転写された転写物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を向上させるように、またはコード配列の転写を向上するように、既存のコード配列から修飾された、または設計された、配列を指す。コドン最適化は、発現宿主生物のコドン選好に適合するようにコード配列のコドンを選択することを含むプロセスを含むが、これらに限定されない。
多くの生物は、成長ポリペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドンの使用にバイアスまたは選好を示す。コドン選好またはコドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、遺伝コードの縮重により可能にされ、多くの生物間で十分に裏付けられている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、さらにはその翻訳効率は、とりわけ、翻訳されることになるコドンの特性、および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成に最も多く使用されるコドンの現れである。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせることができる。
本明細書で使用される場合、用語「分泌系」または「分泌タンパク質」は、微生物の、例えば、細菌の細胞質から、抗がん分子を分泌または排出することができるネイティブまたは非ネイティブ分泌機構を指す。分泌系は、単一のタンパク質を含むこともあり、または複合体に組み立てられた２つまたはそれより多いタンパク質、例えばＨｌｙＢＤを含むこともある。グラム陰性菌の分泌系の非限定的な例としては、修飾ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌系が挙げられる。グラム陽性菌の分泌系の非限定的な例としては、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系が挙げられる。一部の実施形態では、抗がん分子は、抗がん分子を特定の分泌系に方向付けるための、ＲＮＡ由来またはペプチド由来どちらかの「分泌タグ」を含む。一部の実施形態では、分泌系は、操作された細菌から抗がん分子を分泌する前に、このタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌の場合、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、ネイティブＳｅｃ系により細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの転位時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を越えて転位すると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒切断またはプロテアーゼ触媒切断、例えばＯｍｐＴ切断により除去され、それによって、抗がん分子を細胞外環境中に放出することができる。
本明細書で使用される場合、用語「輸送体」は、例えば、細胞外環境から微生物に分子を移入するための機構、例えば、タンパク質（単数）またはタンパク質（複数）を指すように意図されている。
免疫系は、自然免疫と適応免疫という２つのカテゴリーに通常は分けられるが、これらの免疫に関連する免疫応答は、相互排他的ではない。「自然免疫」は、体内での外来作用因子または抗原の出現から直ちにまたは数時間以内に活性化される非特異的防御機構を指す。これらの機構は、物理的バリア、例えば皮膚、血液中の化学物質、ならびに体内の外来作用因子または細胞を攻撃する免疫系細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を含む。また、自然免疫応答中に、サイトカインが産生され、これにより適応免疫応答が活性化される。「適応免疫」または「獲得免疫」は、抗原特異的免疫応答を指し、自然免疫応答より複雑である。抗原は、先ず、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセシングまたは「提示」されなければならない。抗原提示細胞またはアクセサリー細胞は、それらの表面に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成している抗原を提示する、細胞である。マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞をはじめとする、プロフェッショナル抗原提示細胞は、外来抗原のヘルパーＴ細胞への提示を専門に扱い、その一方で、他の細胞型は、細胞内で発生する抗原を細胞傷害性Ｔ細胞に提示することができる。抗原が提示され、認識されると、適応免疫系が、抗原を攻撃するように特異的に設計された免疫細胞の大群を活性化する。自然系同様、適応系は、液性免疫成分（Ｂリンパ球細胞）と細胞性免疫（Ｔリンパ球細胞）成分の両方を含む。Ｂ細胞が活性化されて抗体を分泌し、これらの抗体が、血流を通って移動し、外来抗原と結合する。ヘルパーＴ細胞（調節性Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋細胞）は、それらのＴ細胞受容体が抗原結合ＭＨＣクラスＩ分子と相互作用すると活性化される。サイトカインは、Ｔ細胞成熟を助け、さらにはこれらの成熟細胞がサイトカインを産生し、これにより、さらなるＴ細胞の産生が可能になる。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は、サイトカインを放出し、これらのサイトカインが、ＡＰＣ、マクロファージ、好中球および他のリンパ球を含む異なる免疫細胞型の活性を調節し、標的細胞を死滅させ、除去するように活性を方向付ける。ヘルパーＴ細胞は、それら自体は細胞傷害活性も食作用活性も有さず、その代わり、これらの仕事を遂行するように他の細胞に指示する免疫応答メディエーターとして作用する。ヘルパーＴ細胞はまた、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を支援する追加のシグナルを分泌する。活性化されると、ＣＴＬは、クローン選択され、その際に機能を獲得し、迅速に分裂して活性化されたエフェクター細胞の大群を産生する。次いで、活性化されたＣＴＬは、体中を移動して、特有のＭＨＣクラスＩおよび抗原を有する細胞を探索する。エフェクターＣＴＬは、標的細胞の細胞膜に孔を形成する細胞毒を放出して、アポトーシスを引き起こす。適応免疫は、特定の抗原に対するさらなる応答をより効率的にする「メモリー」も含む。感染が解消されると、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞は死滅し、食細胞により一掃されるが、これらの細胞の少数は、メモリー細胞として残存する。後になって同じ抗原に遭遇した場合、これらのメモリー細胞が迅速にエフェクター細胞に分化して、有効な応答を開始するのに必要な時間を短縮する。
「免疫チェックポイントインヒビター」または「免疫チェックポイント」は、１つもしくは複数の免疫チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、阻害する、そのようなタンパク質に干渉する、またはそのようなタンパク質をモジュレートする分子を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節し、当技術分野において公知である。非限定的な例としては、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ−１およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性または阻害性相互作用に関与し、自己免疫寛容および生理的免疫応答を調節し、維持する。例えばＣＴＬＡ−４インヒビターを使用する、全身免疫療法は、免疫調節を変更し、免疫不全を誘発し、日和見自己免疫障害をもたらす（例えば、Kongら、２０１４年を参照されたい）。
「共刺激」分子は、免疫応答または炎症応答を刺激するシグナルを増大させるまたは活性化する免疫モジュレーターである。共刺激分子は、免疫チェックポイント（免疫チェックポイントは、シグナル（共刺激分子）を強めるかまたはシグナルを弱める免疫系の分子である）と考えることができるであろうが、本明細書で使用される場合、共刺激分子は、免疫チェックポイントとは称されず、その代わりに共刺激因子と称される。したがって、本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、阻害性免疫チェックポイントを指し、共刺激分子を指さないように意図されている。
本明細書で使用される場合、がん性細胞を「阻害する」、遺伝子操作された微生物、例えば操作された細菌、または抗がん分子は、同じ条件下で対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく細胞増殖を低減させること、腫瘍成長を低減させること、および／または腫瘍体積を低減させることができる、細菌またはウイルスまたは分子を指す。
本明細書で使用される場合、免疫モジュレーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫モジュレーション代謝物、または任意の他の免疫モジュレーション物質、因子もしくは分子などの、生体分子を「阻害する」、遺伝子操作された微生物、例えば操作された細菌、または抗がん分子は、その生体分子、例えば免疫モジュレーター、の生物活性、生物学的機能および／または数を、同じ条件下で、対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して低減させること、減少させること、または除去することができる、細菌またはウイルスまたは抗がん分子を指す。
本明細書で使用される場合、免疫モジュレーター、例えば、サイトカイン、ケモカイン、免疫モジュレーション代謝物、または任意の他の免疫モジュレーション物質、因子もしくは分子などの、生体分子を「活性化する」または「刺激する」、遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌、または抗がん分子は、その生体分子、例えば免疫モジュレーター、の生物活性、生物学的機能および／または数を、同じ条件下で、対照、例えば、未処置対照もしくは同じ亜型の未改変微生物と比較して活性化すること、増大させること、増強すること、または促進することができる、細菌またはウイルスまたは抗がん分子を指す。
「腫瘍を標的とする細菌」は、それら自体をがん性細胞に方向付けることができる細菌を指す。腫瘍を標的とする細菌は、天然に、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができる。一部の実施形態では、天然にそれら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができない細菌は、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けるように遺伝子操作される。腫瘍を標的とする細菌を、所望の生物学的特性を増強もしくは向上させるように、全身毒性を弱めるように、および／または臨床的安全性を確実にするように、さらに操作することができる。これらの種、株および／または亜型を弱毒化することができ、例えば、毒性遺伝子について欠失させることができる。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、低い感染能を有する。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、運動性である。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、標準的処置が届かない腫瘍に深く侵入することができる。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、悪性腫瘍の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％にコロニー形成することができる。腫瘍を標的とする細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＶｉｂｒｉｏ、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ−５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない（Croninら、２０１２年；Forbes、２００６年；JainおよびForbes、２００１年；Liuら、２０１４年；Morrisseyら、２０１０年；Nunoら、２０１３年；Patyarら、２０１０年；Croninら、Mol Ther ２０１０年；１８巻：１３９７〜４０７頁）。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、非病原性細菌である。
「腫瘍を標的とする腫瘍溶解性ウイルス」は、それら自体をがん性細胞に方向付けることができるウイルスを指す。腫瘍を標的とするウイルスは、天然に、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができる。天然にそれら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができない腫瘍溶解性ウイルスを、それら自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けるように遺伝子操作することができる。加えて、それらを、特定のがんまたは細胞型を標的とするようにさらに操作することができる。腫瘍を標的とする腫瘍溶解性ウイルスを、所望の生物学的特性（例えば、溶解特性）を増強もしくは向上させるように、全身毒性を弱めるように、および／または臨床的安全性を確実にするように、さらに操作することもできる。これらの種、株および／または亜型を弱毒化することができ、例えば、毒性遺伝子について欠失させることができる。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、低い感染能を有する。腫瘍を標的とする腫瘍溶解性ウイルスの例は、Chloccaら、Cancer Immunol research、２０１４年、２巻：２９５〜３００頁およびKaufmanら、Nature、２０１６年、１４巻：６４２〜６６２頁に概説されている。
「微生物」は、単一細胞から通常はなる顕微鏡的な、顕微鏡でも見えないほど微小なまたは超顕微鏡的なサイズの、生物または微小生物を指す。微生物の例としては、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、ある特定の藻類、原虫、および酵母が挙げられる。一部の態様では、微生物は、１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている（「操作された微生物」）。ある特定の実施形態では、操作された微生物は、操作された細菌である。ある特定の実施形態では、操作された微生物は、操作された酵母である。
本明細書で使用される場合、用語「組換え微生物」は、そのネイティブ状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。したがって、「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」は、そのネイティブ状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を指す。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡに導入された、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成およびヌクレオチド修飾を有しうる。これらの遺伝子改変は、細菌のもしくは細菌細胞の染色体内に存在することもあり、または細菌もしくは細菌細胞におけるプラスミド上に存在することもある。本明細書で開示される組換え細菌細胞は、プラスミド上に外因性ヌクレオチド配列を含むこともある。あるいは、組換え細菌細胞は、それらの染色体に安定に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むこともある。
「プログラムされたまたは操作された微生物」は、特定の機能を遂行するようにそのネイティブ状態から遺伝子改変された微生物、例えば、細菌、酵母もしくはウイルス細胞、または細菌、酵母もしくはウイルスを指す。したがって、「プログラムされたもしくは操作された細菌細胞」または「プログラムされたもしくは操作された細菌」は、特定の機能を遂行するようにそのネイティブ状態から遺伝子改変された、細菌細胞または細菌を指す。ある特定の実施形態では、プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、治療活性を有するまたは治療目的に役立つ１つまたは複数のタンパク質を発現するように改変されたものである。プログラムされたまたは操作された細菌細胞は、目的のタンパク質が発現されると成長を停止させるまたはそれ自体を破壊する能力を、さらに有しうる。
「非病原性細菌」は、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことができない細菌を指す。一部の実施形態では、非病原性細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌は、グラム陽性菌である。一部の実施形態では、非病原性細菌は、リポ多糖（ＬＰＳ）を含有しない。一部の実施形態では、非病原性細菌は、共生細菌である。非病原性細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する、ある特定の株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Sonnenbornら、２００９年；Dinleyiciら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号、米国特許第６，２０３，７９７号、米国特許第５，５８９，１６８号、米国特許第７，７３１，９７６号）。天然に病原性の細菌を遺伝子操作して、病原性の低下または除去をもたらすことができる。
「プロバイオティック」は、適切な量の微生物を含有する宿主生物に健康上の恩恵をもたらすことができる、生存している非病原性微生物、例えば、細菌を指すために使用される。一部の実施形態では、宿主生物は、哺乳動物である。一部の実施形態では、宿主生物は、ヒトである。一部の実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、プロバイオティック細菌は、グラム陽性菌である。非病原性細菌の一部の種、株および／または亜型は、現在プロバイオティック細菌として認知されている。プロバイオティック細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する、ある特定の株、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない（Dinleyiciら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティックは、細菌のバリアントまたは突然変異株でありうる（Arthurら、２０１２年；Cuevas-Ramosら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Nougayredeら、２００６年）。非病原性細菌を、所望の生物学的特性、例えば、生存性を増強または向上させるように、遺伝子操作することができる。非病原性細菌を、プロバイオティック特性をもたらすように、遺伝子操作することができる。プロバイオティック細菌を、プロバイオティック特性を増強または向上させるように、遺伝子操作するか、またはプログラムすることができる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」（ＯＶ）は、正常細胞を無傷のままにしながら、がん細胞を特異的に感染させ、溶解する能力を有する、ウイルスである。目的の腫瘍溶解性ウイルスは、これらに限定されないが、アデノウイルス、コクサッキー、レオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニア、鶏痘、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹、およびパルボウイルスを含み、狂犬病、ウエストナイルウイルス、ニューカッスル病、およびそれらの遺伝子改変バージョンも含む。ＯＶの非限定的な例は、ＦＤＡによりがん治療剤として認可された最初の腫瘍溶解性ウイルスである、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）である。
「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現を可能にする様式で、例えばｃｉｓで作用する様式で、調節領域配列に接合されている、核酸配列、例えば、ＣＴＬＡ−４インヒビターをコードする遺伝子に当てはまる。調節領域は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列ならびにイントロンを含みうる。
「誘導性プロモーター」は、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した調節領域であって、遺伝子の発現が前記調節領域のインデューサーの存在下で増加される、調節領域を指す。
「外因性環境条件」は、本明細書に記載のプロモーターが誘導される設定または状況を指す。一部の実施形態では、外因性環境条件は、がん性細胞を含有する悪性成長、例えば、腫瘍に特異的である。句「外因性環境条件」は、無傷の（溶解されていない）操作された微生物の外部の、しかし腫瘍環境または宿主対象環境に内在性のまたはそれに固有の、環境条件を指すように意図されている。したがって、「外因性」および「内在性」は、哺乳動物体に内在性であるが、無傷の微生物細胞の外部にあるかまたはそのような細胞にとって外因性である、環境条件を指すために同義で使用される。一部の実施形態では、外因性環境条件は、低酸素、微好気または嫌気条件、例えば、低酸素および／または壊死組織である。一部の固形腫瘍は、低い細胞内および／または細胞外ｐＨを伴い、一部の実施形態では、外因性環境条件は、低ｐＨ環境である。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ｐＨ依存性プロモーターを含む。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。一部の態様では、細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるシグナル伝達経路を異なる酸素レベルにより誘発することができ、異なるシグナル伝達経路は、異なる動態で存在しうる。「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が、下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を指す。
酸素レベル依存性転写因子の例としては、ＦＮＲ（フマル酸・硝酸レダクターゼ）、ＡＮＲおよびＤＮＲが挙げられるが、これらに限定されない。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ（嫌気硝酸呼吸）応答性プロモーター、およびＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）応答性プロモーターは、当技術分野において公知であり（例えば、Castiglioneら、２００９年；Eiglmeierら、１９８９年；Galimandら、１９９１年；Hasegawaら、１９９８年；Hoerenら、１９９３年；Salmonら、２００３年を参照されたい）、非限定的な例は、表２に示される。
非限定的な例では、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、低または無環境酸素条件下で高度に発現されることが公知であるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅフマル酸・硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）から得られた（DurandおよびStorz、２０１０年；Boysenら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、天然にＮｉｓｓｌｅに見られる包括的転写調節因子ＦＮＲにより嫌気条件下で活性化される。嫌気条件下で、ＦＮＲは、二量体を形成し、その制御下にある特定の遺伝子のプロモーター中の特定の配列と結合することによって、それらの遺伝子の発現を活性化する。しかし、好気条件下では、酸素がＦＮＲ二量体中の鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性形態に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本願では、ＦＮＲＳ、ｆｎｒｓ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーター、およびプロモーターＰｆｎｒＳを示すための他のそのような関連する呼称と同義で使用される。
本明細書で使用される場合、「非ネイティブ」核酸配列は、微生物に通常は存在しない核酸配列、例えば、内在性配列の余剰コピー、あるいは異種配列、例えば、細菌もしくはウイルスの異なる種、株もしくは亜株からの配列、または同じ亜型の細菌もしくはウイルスからの非修飾配列と比較して修飾および／もしくは突然変異されている配列を指す。一部の実施形態では、非ネイティブ核酸配列は、合成の、天然に存在しない配列である（例えば、Purcellら、２０１３年を参照されたい）。非ネイティブ核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセット内の１つもしくは複数の遺伝子でありうる。一部の実施形態では、「非ネイティブ」は、自然には互いに同じ関係性で見いだされない２つまたはそれより多い核酸配列を指す。非ネイティブ核酸配列は、プラスミドまたは染色体上に存在しうる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ある遺伝子を有し、遺伝子は、前記遺伝子と自然には関連していない誘導性プロモーター、例えば、抗がん分子をコードする遺伝子に作動可能に連結したＦＮＲ応答性プロモーター（または本明細書に記載の他のプロモーター）に直接または間接的に作動可能に連結している。
「構成的プロモーター」は、その制御下にある、および／またはそれが作動可能に連結した、コード配列または遺伝子の連続転写を助長することができる、プロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σＳプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ名ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧ熱ショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ σ７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣｒｅＡＢＣＤリン酸感知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、ＰｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、ＰｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプロモーター（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａからのＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａからのＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、およびバクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））を含む。一部の実施形態では、そのようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、培養、拡大増殖および／または製造条件下で、活性である。一部の実施形態では、そのようなプロモーターは、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境、例えば、消化管および／または腫瘍微小環境に見られる条件で、活性である。
本明細書で使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌またはウイルスは、非ネイティブ遺伝物質、例えば抗がん分子を保有して、非ネイティブ遺伝物質が保持され、発現され、増やされるような、細菌またはウイルス宿主細胞を指すために使用される。安定な細菌またはウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、ならびに／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、低酸素および／もしくは壊死組織において、生存および／または成長することができる。例えば、安定な細菌またはウイルスは、抗がん分子をコードする非ネイティブ遺伝物質を含む、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスであって、非ネイティブ遺伝物質を保有するプラスミドまたは染色体が、細菌またはウイルスにおいて安定に維持されて、抗がん分子を細菌またはウイルスにおいて発現することができ、細菌およびウイルスがｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで生存および／または成長することができるような、細菌およびウイルスでありうる。
本明細書で使用する場合、「モジュレートする」および「処置する」という用語ならびにそれらの同語源語は、がん、またはその少なくとも１つの認識できる症状の改善を指す。他の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、患者によって必ずしも認識されうるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、がんの進行を、身体的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）または両方により、阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」は、がんの進行を緩徐化することまたは進行を好転させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、所与のがんの獲得の開始を遅らせること、またはその獲得リスクを低下させることを指す。
処置を必要とする者は、特定のがんを既に有する個体はもちろん、がんを有するリスクがある、または最終的にがんにかかる可能性がある個体を含みうる。処置の必要性は、例えば、がんの発症に関連する１つもしくは複数のリスク因子（例えば、アルコール使用、タバコ使用、肥満、紫外線への過度の曝露、高いエストロゲンレベル、家族歴、遺伝的感受性）の存在、がんの存在もしくは進行、または可能性としてがんを有する対象の処置に対する受容性によって評定される。がんは、ゲノム不安定性および罹患細胞内の高い突然変異率によって引き起こされる。がんの処置は、がんに関連する症状の除去、ならびに／または対象の腫瘍の成長および／もしくは体積のモジュレーションを包含し得、がんの根本原因、例えば、根底にある遺伝的素因の除去を必ずしも包含しない。
本明細書で使用される場合、用語「従来のがん処置」または「従来のがん治療（法）」は、ほとんどの医療専門家によって広く受入れられ、使用されている、処置または治療（法）を指す。それは、幅広く使用されていない代替または補完療法とは異なる。がんのための従来の処置の例としては、外科手術、化学療法、標的療法、放射線治療、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、治療、ならびに血液製剤輸血および輸注が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および／または賦形剤のような他の成分を伴う本開示の遺伝子操作された微生物の調製物を指す。
同義で使用されうる句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物を有意に刺激しない、かつ投与される細菌性またはウイルス性化合物の生物活性および生物学的特性を消失させない、担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの句のもとに含まれる。
用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに助長するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々な種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「治療有効用量」および「治療有効量」は、状態、例えばがんの予防、症状開始の遅延、または症状の改善をもたらす、化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、がん性細胞に関連する障害の１つもしくは複数の症状の処置、予防、重症度低下、開始遅延、および／または発生リスク低下に十分でありうる。治療有効量、ならびに治療に有効な投与頻度は、当技術分野において公知の方法および下段で論じられる方法により決定することができる。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、相反する明確な指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると解されたい。
リスト内の要素間に使用される場合の句「および／または」は、（１）挙げられている単一の要素のみが存在すること、または（２）リストの１つより多い要素が存在することのいずれかを意味するように意図されている。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、またはＡ、ＢおよびＣでありうることを示す。句「および／または」は、リスト中の要素「の少なくとも１つ」または「の１つもしくは複数」と同義で使用されうる。
細菌
本開示の遺伝子操作された微生物、またはプログラムされた微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、抗がん分子を局所的にかつ腫瘍特異的に送達することができ、それによって、前記分子の全身投与に関連する全身性の細胞傷害性および／または免疫不全を低減させることができる。操作された細菌は、全身、経口、局所および／または腫瘍内投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん性細胞、特に、腫瘍の低酸素領域のがん性細胞を標的とすることができ、抗がん分子、例えば、本明細書で提供される免疫チェックポイントインヒビターまたは他の抗がん分子を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば腫瘍の低酸素環境、により活性化されるプロモーターの制御下で抗がん分子を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、腫瘍を標的とする微生物は、天然にそれ自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができる、細菌である。例えば、腫瘍の細菌コロニー形成を、細菌のまたは宿主のいかなる特異的遺伝子改変もなく、達成することができる（Yuら、２００８年）。一部の実施形態では、腫瘍を標的とする細菌は、天然にそれ自体をがん性細胞、壊死組織および／または低酸素組織に方向付けることができないが、それをするように遺伝子操作されている細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、血行性に拡散して標的腫瘍に達する。細菌感染は、腫瘍退縮と結び付けられており（Hall、１９９８年；NautsおよびMcLaren、１９９０年）、ある特定の細菌種は、壊死性哺乳動物腫瘍に局在し、それらを溶解することが示されている（JainおよびForbes、２００１年）。腫瘍を標的とする細菌の非限定的な例は、表３に示される。
ある特定の細菌の腫瘍標的化能は、腫瘍発達の段階に依存するが、腫瘍型には無関係であるようである（Yuら、２００８年）。静脈内注射された細菌は、腫瘍の中心部分を標的とし、それらの腫瘍の壊死領域と同一空間を占めることが示されている（Yuら、２００８年）。炎症だけでは、細菌コロニー形成を持続するのに不十分であることが示されている（Yuら、２００８年）。一部の実施形態では、腫瘍は、コロニー形成を増進するための細菌送達前に、例えば腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって、感作される。一部の実施形態では、血液感染性細菌は、細菌の排除が阻害されるため、腫瘍に侵入し、中心壊死領域において増幅することができる（Yuら、２００８年）。
一部の実施形態では、目的の遺伝子が細菌内で発現され、これにより、免疫療法の有効性が増強される。Vetizouら（２０１５年）には、マウスにおいておよび患者においてＣＴＬＡ−４遮断の有効性と関連付けられた、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓに特異的なＴ細胞応答が記載されている。Sivanら（２０１５年）は、黒色腫のマウスモデルにおいて、抗腫瘍免疫にとっての、および（ＰＤ−１リガンド）有効性に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体にとっての、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの重要性を説明している。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子を発現する細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子を発現する細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子を発現する細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子を発現する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子を発現する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉである。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、偏性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、通性嫌気性細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、好気性細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性菌であり、ＬＰＳを欠く。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性かつ偏性嫌気性の細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陽性かつ通性嫌気性の細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非病原性細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、共生細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、プロバイオティック細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変または突然変異されている、天然に病原性の細菌である。例示的細菌としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ−５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｍｉｙａｉｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、および表３に示されている細菌が挙げられる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが、１つまたは複数の抗がん分子の腫瘍特異的送達に使用される。静脈内注射されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉは、腫瘍内に蓄積し、これが、一般に使用されるＮＯ供与体であるニトログリセリン（ＮＧ）により、おそらく乏血管性腫瘍への血流を増加させる上でのＮＯの役割に起因して増進されたことが以前に判明している（Fangら、２０１６年（Methods Mol Biol.２０１６年；１４０９巻：９〜２３頁．Enhancement of Tumor-Targeted Delivery of Bacteria with Nitroglycerin Involving Augmentation of the EPR Effect）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、偏性嫌気性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａであり、抗がん分子を腫瘍特異的に送達することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、胞子を産生し、天然にコロニー形成することができ、低酸素腫瘍を溶解することができる場合もある、偏性嫌気性細菌である（Grootら、２００７年）。実験的モデルにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、プロドラッグ変換酵素を送達するために、および放射線療法を増強させるために、使用されている（Grootら、２００７年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからなる群から選択される（Liuら、２０１４年）。一部の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に非病原性である。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｕｍは、病原性であり、腫瘍細胞を溶解することができる。代替実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉは、天然に病原性であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴは、致死性毒素を除去するように改変されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ−ＮＴおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓは、がんを処置するために側鎖ＨＩＦ−１α抗体を送達するために使用されており、「優れた腫瘍コロニー形成性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株」である（Grootら、２００７年）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、通性嫌気性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍであり、抗がん分子を腫瘍特異的に送達することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、通性嫌気性菌である、非胞子形成性グラム陰性菌である。一部の実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、病原性部位を除去するように改変される（弱毒化される）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍであり、抗がん分子を腫瘍特異的に送達することができる。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、グラム陽性、分岐状嫌気性細菌である。一部の実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に非病原性である。代替実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、天然に病原性であるが、病原性を低下させるようにまたは除去するように改変される。ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａは、腫瘍の低酸素で壊死の領域を優先的に標的とし、そこで複製することが示されている（Yuら、２０１４年）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グラム陰性菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、経口投与または静脈内投与のどちらかの後、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍組織に優先的にコロニー形成することが示されている（Zhangら、２０１２年およびDaninoら、２０１５年）。Ｅ．ｃｏｌｉは、確固たる腫瘍特異的複製を示すことも示されている（Yuら、２００８年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、「最もよく特徴付けられているプロバイオティクスの１つに進化した」Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科のグラム陰性細菌である（Ukenaら、２００７年）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）である。この株は、その完全な無害性（Schultz、２００８年）を特徴とし、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）状態（Reisterら、２０１４年、この文献を強調しておく）を有する。
本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば組織または血清中の防御因子により、破壊されうる（Sonnenbornら、２００９年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、反復投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１回投与される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗がん分子は、遺伝子操作された細菌の１つの種、株または亜型において発現される。代替実施形態では、抗がん分子は、遺伝子操作された細菌の２つまたはそれより多い種、株および／または亜型において発現される。当業者には、本明細書で開示される遺伝子改変を、他の細菌の種、株および亜型のために改変し、それらに適応させることができることは理解されるであろう。
適切である細菌の他の例は、国際特許出願公開ＷＯ／２０１４／０４３５９３に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、そのような細菌は、１つまたは複数の病原性因子を弱毒化するように突然変異されている。
一部の態様では、操作された細菌を、他のがん治療、例えば、従来の抗がん治療剤、他の免疫療法、および／または操作されたもしくは操作されていない腫瘍溶解性ウイルスと、組み合わせることができる。
抗がん分子
局所免疫抑制の除去（逆転）
腫瘍細胞は、抗原提示または樹状細胞の成熟（それらの前駆体を代わりに免疫抑制細胞型に成熟させること）に干渉するシグナルを生成することにより、破壊を免れることが多い。したがって、腫瘍部位での免疫抑制の開始、促進および／または維持に関与する免疫モジュレーション分子の活性を防止または阻害する１つまたは複数の抗がん分子の、単独での、または１つもしくは複数の他の抗がん分子との組合せでの、局所送達は、治療利益をもたらす。
免疫チェックポイントインヒビター
一部の実施形態では、抗がん分子は、免疫サプレッサー分子のインヒビター、例えば、免疫チェックポイント分子のインヒビターである。阻害される免疫チェックポイント分子は、いずれの公知のまたは後に発見される免疫チェックポイント分子または他の免疫サプレッサー分子であってもよい。一部の実施形態では、阻害される免疫チェックポイント分子、または他の免疫サプレッサー分子は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲから選択される。ある特定の実施形態では、本開示は、免疫チェックポイントまたは他の免疫サプレッサー分子を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生するように操作されている、操作された微生物、例えば、操作された細菌を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、がん性細胞増殖、腫瘍成長、および／または腫瘍体積を低減させることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がんまたは腫瘍細胞を標的とするように操作された、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で免疫チェックポイントインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビターを発現する細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを発現する。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＣＴＬＡ−４インヒビター、例えば、ＣＴＬＡ−４に対する抗体をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、単鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体であってもよい。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＰＤ−１インヒビター、例えば、ＰＤ−１に対する抗体をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＰＤ−１抗体は、単鎖抗ＰＤ−１抗体であってもよい。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲインヒビターから選択されるインヒビター、例えば、列挙された免疫チェックポイントまたは他のサプレッサー分子のいずれかに対する抗体をコードする遺伝子を含む、操作された細菌である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、単鎖抗体であってもよい。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビターを発現する、操作された細菌は、局所的に、例えば、腫瘍内注射によって、投与される。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビターを発現する、操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＣＴＬＡ−４インヒビター、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体をコードする遺伝子を含む、腫瘍を標的とする細菌であり、抗がん分子をがん性細胞に特異的かつ局所的に送達することができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１インヒビター、例えば抗ＰＤ−１抗体をコードする遺伝子を含む、腫瘍を標的とする細菌であり、抗がん分子をがん性細胞に特異的かつ局所的に送達することができる。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲから選択される、チェックポイントのインヒビターまたは別の免疫サプレッサー分子のインヒビター、例えば、そのような分子のいずれかに対する抗体をコードする遺伝子を含む、腫瘍を標的とする細菌であり、抗がん分子をがん性細胞に特異的かつ局所的に送達することができる。
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＫＩＲ、およびＡ２ａＲから選択される免疫チェックポイントまたは他の免疫サプレッサー分子の１つまたは複数のインヒビターをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。遺伝子操作された細菌は、局所的に、例えば、腫瘍内注射によって、送達することができ、または全身送達され、標的腫瘍にホーミングする、腫瘍を標的とする細菌でありうる。
一部の実施形態では、本開示は、ＣＴＬＡ−４インヒビターを発現する、遺伝子操作された微生物、例えば、操作された細菌を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＴＬＡ−４インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ−８０インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ８０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ８０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ８０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ８０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ−８６インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ８６抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ８６抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ８６抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ８６抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗免疫チェックポイント抗体は、単鎖抗体であってもよい。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により、低酸素条件により、または炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイントに対する１つまたは複数の単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイントに対する１つまたは複数の単鎖抗体を発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、ＰＤ−１インヒビターを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件、例えば、腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＰＤ−１インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件、例えば腫瘍の低酸素環境により活性化されるプロモーターの制御下で、ＰＤ−１インヒビターを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖ、をコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の相同性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖ、をコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ構築物、例えばＰＤ１−ｓｃＦｖ、をコードする核酸は、配列番号９７５、配列番号９７６、配列番号９７７、配列番号９７８、配列番号９７９、および／または配列番号９８０から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１インヒビターを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ２インヒビターを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗免疫チェックポイント抗体は、単鎖抗体でありうる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により、低酸素条件により、または炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイントに対する１つまたは複数の単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つまたは複数の免疫チェックポイントに対する１つまたは複数の単鎖抗体を発現する。
したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＧ３を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＬＡＧ−３に対する抗体、例えば、ＬＡＧ−３に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＴＩＧＩＴは、調節性およびメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞のサブセットにより発現される。ＴＩＧＩＴは、ナチュラルキラー細胞死滅およびＣＤ４＋Ｔ細胞活性化をモジュレートし、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を増加させること、その一方で樹状細胞によるＩＬ−１２産生を抑制することにより、寛容を促進する。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＩＧＩＴを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＴＩＧＩＴに対する抗体、例えば、ＴＩＧＩＴに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＩＧＩＴ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）は、造血細胞上に主として発現されるＴ細胞機能の強力な負の調節因子である、免疫チェックポイントである。ＶＩＳＴＡは、複数のマウスがんモデルにおいて腫瘍に浸潤した骨髄性細胞上に高レベルで見られる。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞活性化を抑制し、Ｆｏｘｐ３発現を誘導し、腫瘍微小環境内で高度に発現される。その遮断は、マウスにおいてＴ細胞応答を向上させることにより抗腫瘍免疫応答を増強し、その結果、腫瘍成長を緩徐化することができる。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＶＩＳＴＡを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＶＩＳＴＡに対する抗体、例えば、ＶＩＳＴＡに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ２７６は、Ｂ７／ＣＤ２８スーパーファミリーに属する免疫チェックポイント分子である。Ｂ７−Ｈ３は、ヒトＴ細胞応答をダウンモジュレートし、例えば、既に活性化されたＴ細胞はもちろん、ナイーブＴ細胞においてもＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を減少させる。Ｂ７−Ｈ３発現は、いくつかのヒトがんにおいて、抗腫瘍免疫の調節因子としてのＢ７−Ｈ３の役割を示す報告がなされている。例えば、さらに、腫瘍Ｂ７−Ｈ３発現は、腎明細胞癌、尿路上皮細胞癌、卵巣がん、膠芽腫、骨肉腫、膵がんおよび神経芽腫、ならびに他の固形腫瘍を含む、多数の異なる腫瘍型において患者生存率不良と相関関係が示されている。腫瘍脈管構造上でのＢ７−Ｈ３の発見は、がん免疫療法標的としてのその有用性をさらに広げた。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ７−Ｈ３を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体、例えば、Ｂ７−Ｈ３に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＴＩＭ−３（Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ−ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ−３）としても公知の、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）およびリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）を含む、他の阻害性受容体とともにＴ細胞疲弊を媒介する、Ｔｈ１特異的細胞表面タンパク質である。免疫チェックポイントであるＴＩＭ３は、マクロファージ活性化を調節し、がんにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇが機能不全の際にＰＤ−１経路と相互作用しうる。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＩＭ−３を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、Ｔｉｍ−３に対する抗体、例えば、Ｔｉｍ−３に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＴＩＭ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＩＭ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＩＭ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＩＭ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＩＭ−３抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＣＤ６６ａ（表面抗原分類６６ａ）としても公知の癌胎児抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）（ＣＥＡＣＡＭ１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒト糖タンパク質である、免疫チェックポイントである。それは、白血球、上皮および内皮上で検出される細胞間接着分子として機能する。ＣＥＡＣＡＭ１は、血管新生、アポトーシス、腫瘍抑制、転移、ならびに自然および適応免疫応答のモジュレーションに関与する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＥＡＣＡＭ１を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体、例えば、ＣＥＡＣＡＭ１に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＣＤ３０５（表面抗原分類３０５）としても公知）は、免疫応答を調節して、自己として認識された細胞の溶解を防止する、末梢単核細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む）上に見られる阻害性受容体である。数ある中でも特に、ＬＡＩＲ−１は、ＣＤ３結合または抗原刺激時のエフェクターＴ細胞の細胞傷害活性を阻害することができ、Ｉｇおよびサイトカイン産生を下方調節することができ、サイトカイン媒介シグナルを阻害することができる。ＬＡＩＲ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹状細胞への末梢血前駆体の分化、およびＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖も阻害する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＩＲ−１を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＬＡＩＲ−１に対する抗体、例えば、ＬＡＩＲ−１に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＬＡＩＲ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＬＡＩＲ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＬＡＩＲ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＬＡＩＲ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＬＡＩＲ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＢおよびＴリンパ球アテニュエーターＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知）は、Ｔ細胞の活性化中に誘導される。ＢＴＬＡは、腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）との相互作用によってＴ細胞阻害を示す。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）としても公知の、腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリー、メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドである。ＣＤ１６０は、結合することにより共阻害シグナルが送達される、ＨＶＥＭのリガンドでもある。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＢＴＬＡまたはＣＤ１６０のＨＶＥＭとの結合を阻害する抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＢＬＴＡを阻害する抗がん分子、および／またはＣＤ１６０を阻害する抗がん分子、および／またはＨＶＥＭを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＢＴＬＡに対する抗体および／またはＣＤ１６０に対する抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト（アンタゴニストリガンドもしくは抗体）、例えば、ＢＴＬＡに対する単鎖抗体および／またはＣＤ１６０に対する単鎖抗体および／またはＨＶＥＭに対する単鎖アンタゴニスト抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＢＴＬＡ抗体および／または抗ＣＤ１６０抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＢＴＬＡ抗体および／または抗ＣＤ１６０抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＢＴＬＡ抗体および／または抗ＣＤ１６０抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＢＴＬＡ抗体および／または抗ＣＤ１６０抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＢＴＬＡ抗体および／または抗ＣＤ１６０抗体および／またはＨＶＥＭアンタゴニスト、例えば単鎖抗体を発現する。
ＯＸ−２膜糖タンパク質、別名ＣＤ２００（表面抗原分類２００）は、ＣＤ２００Ｒ１と結合すると、骨髄性細胞活性を調節し、多様な組織におけるマクロファージ系統に阻害シグナルを送達する、１型膜糖タンパク質である。ＣＤ２００受容体結合は、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的応答を抑制することができるトリプトファン異化の免疫寛容経路を開始させる酵素ＩＤＯを発現するように、脾臓ＤＣ（ｐＤＣ）の形質細胞様サブセットを誘導する。腹膜マクロファージの場合、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７刺激サイトカイン分泌が、ＣＤ２００Ｒ１の関与により阻害される。単球に対するＣＤ２００Ｒ１の関与も、ヒトＰＢＭＣからのＩＬ−５およびＩＬ−１３の分泌を阻害する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ２００のＣＤ２００Ｒ１との結合を阻害する抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ２００を阻害する抗がん分子、および／またはＣＤ２００Ｒ１を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＤ２００に対する抗体および／またはＣＤ２００Ｒ１に対する抗体、例えば、ＣＤ２００に対する単鎖抗体および／またはＣＤ２００Ｒ１に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ２００抗体および／または抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ２００抗体および／または抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ２００および／または抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ２００抗体および／または抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ２００抗体および／または抗ＣＤ２００Ｒ１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）は、免疫チェックポイントとして機能する、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に見られる受容体である。ＫＩＲと腫瘍リガンド（例えば、ＨＬＡＣ）の相互作用は、ＮＫ細胞傷害活性を下方調節し、さらには寛容を媒介し、同種異系幹細胞移植の際の移植片対宿主病を低減させる。ＫＩＲは、肺がん細胞において免疫抑制性であることが判明した。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＫＩＲを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＫＩＲに対する抗体、例えば、ＫＩＲに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＫＩＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＫＩＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＫＩＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＫＩＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＫＩＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
Ａ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ａＲ）を介して作用するアデノシンが、免疫機能の重要なインヒビターとして浮上している。研究によって、Ａ２ａ受容体遮断により腫瘍ワクチン、チェックポイント遮断および養子Ｔ細胞療法を増強させることが可能であることが実証された。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ａ２ａＲを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、Ａ２ａＲに対する抗体、例えば、Ａ２ａＲに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗Ａ２ａＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ａ２ａＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ａ２ａＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ａ２ａＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ａ２ａＲ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７５５、配列番号７５６、配列番号７５７、配列番号７５８、配列番号７５９、および／または配列番号７６０のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、核酸配列を含む。
単鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体の構築における使用のための例示的重鎖および軽鎖アミノ酸配列が示され、本明細書に記載されている（例えば、配列番号７６１、配列番号７６２、配列番号７６３、配列番号７６４）。
単鎖抗ＰＤ−１抗体の構築における使用のための例示的重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４を含む。
一部の実施形態では、配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。単鎖抗体の構築のための他の例示的重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５〜４６を含む。
一部の実施形態では、単鎖抗体は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４ 配列番号４５、または配列番号４６の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
免疫代謝および代謝的変換体
トリプトファンおよびキヌレニン
調節性Ｔ細胞、またはＴｒｅｇは、過剰な免疫反応を防止すること、自己抗原に対する寛容を維持すること、および自己免疫を消失させることによって免疫系をモジュレートする、Ｔ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、他の細胞の免疫応答を抑制し、例えば、侵入してくる生物の排除に成功した後、免疫応答を停止させる。これらの細胞は、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を一般に抑制または下方調節する。
ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞）を発現するものを含む、調節性Ｔ細胞の種々の亜集団がある。
調節性Ｔ細胞は、免疫恒常性の媒介に、ならびに末梢寛容の確立および維持の促進に、極めて重要であるが、多くの腫瘍の進行の一因となると考えられる。Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞応答を減弱させるのに肝要であり、したがって、有効な抗腫瘍応答の主な障害の１つに相当し、抗腫瘍応答の誘導または強化に頼る現行の治療の失敗を意味する。
したがって、ある特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、Ｔｒｅｇを枯渇させる、および／またはＴｒｅｇ活性化を阻害もしくは遮断する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。
トリプトファン（ＴＲＰ）からキヌレニン（ＫＹＮ）への代謝経路は、自然および適応免疫の肝要な調節因子として定着している。いくつかの前臨床モデルは、この免疫寛容経路が、がん免疫、自己免疫、感染症、移植拒絶反応およびアレルギーに有効であることを示唆する。この経路を標的とする薬物、例えば、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）は、がん誘導免疫抑制を逆転させることを目指して臨床試験中である。
必須アミノ酸トリプトファンの異化は、多くの種類のがんにおいて免疫抑制性微小環境を維持する中心経路である。この腫瘍微小環境における腫瘍細胞または骨髄性細胞は、高レベルのインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）を発現し、このＩＤＯ１は、トリプトファンの分解における第１の、律速酵素である。この酵素活性は、局所微小環境におけるトリプトファンの枯渇、およびその後のＴ細胞応答阻害をもたらし、その結果、免疫抑制が生じる（Ｔ細胞は、低トリプトファンレベルに対して特に感受性であるからである）。つい最近の前臨床研究は、腫瘍における酵素ＴＲＰ−２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ）を介する代替トリプトファン分解経路を示唆する。したがって、腫瘍細胞は、ＩＤＯ１の代わりに、またはＩＤＯ１に加えて、ＴＤＯを介してトリプトファンを発現および異化する可能性がある。
加えて、いくつかの研究は、トリプトファン分解による免疫抑制が、局所トリプトファンレベルの低下の結果のみならず、高レベルのトリプトファン代謝物の蓄積の結果でもあることを提案している。ヒト腫瘍組織の前臨床研究および分析によって、Ｔ細胞応答が、トリプトファン代謝物により、主として、細胞質転写因子であるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）と結合することにより、阻害されることが実証されている。これらの研究は、アリール炭化水素受容体とのトリプトファン代謝物キヌレニンの結合が、調節性Ｔ細胞表現型（Ｔｒｅｇ）に有利に働くナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の分化の再プログラミングをもたらし、その一方で、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）産生Ｔｈ（Ｔｈ１７）細胞への分化の抑制をもたらすことを示す。アリール水素受容体の活性化は、樹状細胞に対する免疫寛容性表現型の促進ももたらす。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを産生することにより、Ｔｒｅｇを枯渇させることまたはＴｒｅｇの活性化を阻害もしくは遮断することができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、トリプトファンを産生することにより、ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇ比を増大させることができる（例えば、ＴｒｅｇよりＣＤ８＋の産生に有利に働く）。
トリプトファンを増加させること
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、トリプトファンを産生することができる。例示的なトリプトファン産生回路は、図６Ａ〜６Ｄ、図７および図８に示されている。
一部の実施形態では、トリプトファンを産生する、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、トリプトファン生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ．のトリプトファンオペロンを含む（Yanofsky、RNA（２００７年）、１３巻：１１４１〜１１５４頁）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンを含む。（Yanofsky、ＲＮＡ（２００７年）、１３巻：１１４１〜１１５４頁）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列を必要に応じて含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列を必要に応じて含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、コリスメート生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＳｅｒＡ遺伝子またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子のどちらかをコードする配列を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｒＡにコードされている３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）デヒドロゲナーゼは、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）生合成の主リン酸化経路の第１のステップを触媒する。このステップは、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの同時還元を伴う、３ＰＧの３−ホスホヒドロキシピルベート（３ＰＨＰ）への酸化である。トリプトファン生合成の一部として、Ｅ．ｃｏｌｉは、産生されるトリプトファンごとに１つのセリンを使用する。理論によって拘束されることを望むものではないが、ｓｅｒＡを発現することにより、トリプトファン産生は向上される（例えば、図６Ａ〜図６Ｄを参照されたい）。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、必要に応じて、トリプトファン産生を向上させるためにフィードバック耐性バージョンで置換される。
これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）を、必要に応じて、欠失させて、この経路に沿ってのトリプトファン異化を防止すること、およびさらに、産生されるトリプトファンレベルを増加させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、ｐｈｅＡ遺伝子を、必要に応じて、欠失させることができる。
ｙｄｄＧ遺伝子によりコードされている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの内膜タンパク質ＹｄｄＧは、公知のアミノ酸排出輸送体ＲｈｔＡおよびＹｄｅＤのホモログである。研究より、ＹｄｄＧは、トリプトファンをはじめとする芳香族アミノ酸を排出することができることが示されている。したがって、ＹｄｄＧは、トリプトファン排出輸送体またはトリプトファン分泌系（またはトリプトファン分泌タンパク質）として機能することができる。他の芳香族アミノ酸排出輸送体は、Doroshenkoら、FEMS Microbial Lett.、２７５巻：３１２〜３１８頁（２００７年）に記載されている。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列を必要に応じてさらに含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＹｄｄＧを過剰発現することができる。一部の実施形態では、操作された細菌は、必要に応じて、ｙｄｄＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーを含む。
１つの特定の実施形態では、トリプトファンは、コリスメート前駆体からｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子の発現によって産生される。ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、トリプトファン産生を向上させるためにフィードバック耐性バージョンで置換される。株は、野生型ＳｅｒＡ遺伝子またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子のどちらかを必要に応じてさらに含む。一実施形態では、株は、フィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子を含む。この特定の実施形態では、ｔｒｐＲおよびＴｎａＡは、欠失される。
本開示の遺伝子操作された細菌および／または他の微生物によりコードされている例示的なトリプトファン合成カセットは、配列番号４７〜５４を含む。例示的なトリプトファン生合成酵素配列は、配列番号５５〜５９を含む。
一部の実施形態では、トリプトファン生合成酵素またはカセットは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、および／または配列番号５９の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号４７から配列番号５９までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号４７から配列番号５９までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号４７から配列番号５９までの１つまたは複数の配列からなる。
フィードバック耐性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥの例示的なポリペプチド配列は、配列番号６０および６１で示される。表１５。野生型およびフィードバック耐性ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥ、ＳｅｒＡならびにトリプトファナーゼ配列は、配列番号６０〜６４を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドは、配列番号６０から配列番号６３までの１つまたは複数の配列からなる。
一部の実施形態では、配列番号６４を含む内在性ＴｎａＡポリペプチドは、突然変異または欠失される。
一部の実施形態では、トリプトファンを産生するための１つまたは複数の遺伝子は、例えば、安定性を増強させ、トリプトファン産生を増加させるために、改変および／または突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１および／もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
キヌレニンを減少させること
上で論じたように、研究により、キヌレニンのアリール炭化水素受容体との結合は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生をもたらすことが示されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニンを代謝または分解するための、および細胞外環境におけるキヌレニンレベルを低下させるための機構を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼの発現のための遺伝子配列をコードし、このキヌレニナーゼは、キヌレニンをＡＡ（アントラニル酸（Anthranillic acid））に変換し、その後、このＡＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐオペロンの酵素によってトリプトファンに変換されうる。必要に応じて、ｔｒｐＥ遺伝子を、それがキヌレニンからのトリプトファンの生成に必要とされない場合には、欠失させてもよい。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡ、ならびにｔｒｐＤおよびキヌレニナーゼをコードする、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含むことができる。この欠失は、内在性コリスメート経路によるトリプトファンの産生を妨げることもあり、キヌレニナーゼによるキヌレニンからのトリプトファンの産生を増加させることもある。
代替実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子は、キヌレニンとコリスメートの両方を基質として使用することによりトリプトファン産生を最大にするために、欠失されない。本発明の一実施形態では、この回路を含む遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、がんにおける免疫回避を低減させるのに有用でありうる。
一部の実施形態では、微生物は、細胞外環境、例えば腫瘍環境、からのキヌレニンの取込みのための輸送体をコードする。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおいてｃｈｒとｔｒｐオペロンの間に位置するａｒｏＴ、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのｔｒｐ座位付近の類似の遺伝子、ａｒｏＲおよびａｒｏＳは、芳香族アミノ酸の輸送に関与することが判明した。ａｒｏＰは、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）の細胞質膜を横断する輸送に関与する透過酵素である。そのような輸送体／透過酵素の発現は、遺伝子操作された微生物におけるキヌレニン移入に有用でありうる。
本開示の遺伝子操作された細菌によりコードされるキヌレニナーゼをコードする例示的な遺伝子は、ある特定の実施形態では、配列番号６５〜６７を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、配列番号６５から配列番号６７までの１つまたは複数の配列からなる。
例示的なコドン最適化キヌレニナーゼカセット配列は、配列番号６８、８６５、６９、８６６、７０、８６７を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数の配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされ、発現される１つまたは複数のポリヌクレオチドは、配列番号６８から配列番号７０までおよび配列番号８６５から配列番号８６８までの１つまたは複数の配列からなる。
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓキヌレニナーゼの発現のための構築物は、配列番号１１６、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、および／または配列番号８９３から選択される配列からなる。他の適切なキヌレニナーゼは、米国特許出願公開第２０１７００５６４４９号に記載されており、前記特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、本明細書に記載の分泌系を使用して、細胞外環境、例えば、腫瘍微小環境に分泌される。
遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニナーゼを産生するために任意の適切な遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼを産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強させ、キヌレニナーゼ産生を増加させるように、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、操作された細菌および／または他の微生物はまた、キヌレニンの取込みまたは移入が増強されており、例えば、キヌレニンの細菌および／または他の微生物細胞への取込みを増加させるための輸送体または他の機構を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、キヌレニナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する、分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、キヌレニナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管または腫瘍内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／もしくは他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
トリプトファンを増加させること、およびキヌレニンを減少させること
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、キヌレニンを代謝または分解するための機構であって、一部の実施形態では、トリプトファンの産生増加ももたらす機構を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境におけるＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比をモジュレートする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比を増大させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＲＰ：ＫＹＮ比またはＫＹＮ：ＴＲＰ比を低減させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酵素キヌレニナーゼをコードする配列を含む。キヌレニナーゼは、細胞において産生されてキヌレニンをアントラニル酸に代謝する。Schwarczら、Nature Reviews Neuroscience、１３巻、４６５〜４７７頁；２０１２年；ChenおよびGuillemin、２００９年：２巻；１〜１９頁；Intl. J. Tryptophan Res。一部の実施形態では、操作された微小生物は、キヌレニンを局所環境から細胞内に移入する（輸送する）ための機構を有する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つまたは複数のコピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼセクレターをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン生合成経路の酵素をコードする遺伝子配列と、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンオペロン、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンと、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからの、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変されうる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列と、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢ、およびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫ、およびＡｒｏＣ遺伝子をコードする配列と、キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。
必要に応じて、ｔｒｐＥ遺伝子を、それがキヌレニンからのトリプトファンの生成に必要とされない場合には、欠失させてもよい。したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡおよびｔｒｐＤならびにキヌレニナーゼをコードする、１つまたは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含むことができる（例えば、図８を参照されたい）。この欠失は、内在性コリスメート経路によるトリプトファンの産生を妨げることもあり、キヌレニナーゼによるキヌレニンからのトリプトファンの産生を増加させることもある。
代替実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子は、キヌレニンとコリスメートの両方を基質として使用することによりトリプトファン産生を最大にするために、欠失されない。本発明の一実施形態では、この回路を含む遺伝子操作された細菌は、がんにおける免疫回避を低減させるのに有用でありうる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＳｅｒＡ遺伝子またはフィードバック耐性ＳｅｒＡ遺伝子のどちらかをコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＡｒｏＧおよびＴｒｐＥは、必要に応じて、トリプトファン産生を向上させるためにフィードバック耐性バージョンで置換される。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）は、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変されうる。これらの実施形態のいずれにおいても、ｔｎａＡ遺伝子（Ｔｒｐをインドールに変換するトリプトファナーゼをコードする）は、必要に応じて、この経路に沿ってのトリプトファン異化を防止するために、およびさらに、産生されるトリプトファンレベルを増加させために、欠失されうる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞からトリプトファンを排出または分泌するための遺伝子配列をさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、芳香族アミノ酸排出輸送体であるＹｄｄＧを過剰発現することができる。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｙｄｄＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーを必要に応じて含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞にキヌレニンを移入または輸送するための遺伝子配列をさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼセクレターをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢまたはｍｔｒ遺伝子の１つまたは複数のコピーを含む。
一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、本明細書に記載の分泌系を使用して、細胞外環境、例えば、腫瘍微小環境に分泌され、例えば、細胞外でのキヌレニンの分解に有用である。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、キヌレニン消費を約１００００〜１０００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素は、本明細書に記載の分泌系を使用して、細胞外環境、例えば、腫瘍微小環境に分泌される。
遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼを産生するためのおよびトリプトファン産生のための任意の適切な遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼおよび／またはトリプトファン産生酵素を産生するための遺伝子は、例えば、安定性を増強させ、キヌレニン消費および／またはトリプトファン産生を増加させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、操作された細菌はまた、トリプトファンまたはキヌレニンの取込みまたは移入が増強されており、例えば、上段で詳細に論じられているような、トリプトファンまたはキヌレニンの細菌細胞への取込みを増加させるための輸送体または他の機構を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制またはがん組織に関連する条件下で、キヌレニナーゼおよびトリプトファン産生酵素を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件でキヌレニナーゼおよびトリプトファン産生酵素を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、ある特定の組織、免疫抑制に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、キヌレニナーゼおよびトリプトファン産生酵素を産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
ＡＬＥ
腫瘍微小環境において、アミノ酸トリプトファン（ＴＲＰ）およびその分解産物キヌレニン（ＫＹＮ）は、免疫モジュレーションシグナルとして極めて重要な役割を果たす。腫瘍は、多くの場合、ＴＲＰ（炎症誘発特性を有する）を、抗炎症特性を有するＫＹＮに分解することによって、免疫監視の回避を促進する。
ＫＹＮを効率的に移入し、それをＴＲＰに変換するように、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを操作することができる。Ｎｉｓｓｌｅは、ＫＹＮを通常は利用しないが、テトラサイクリンプロモーター（Ｐｔｅｔ）の制御下で中コピー数プラスミドを用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ｋｙｎＵ）からのキヌレニナーゼ（ＫＹＮａｓｅ）を導入することにより、このプラスミド（Ｐｔｅｔ−ＫＹＮａｓｅ）を有する新たな株は、Ｌ−キヌレニンをアントラニレートに変換することができる。
Ｅ．ｃｏｌｉは、そのＴＲＰ生合成経路においてアントラニレートを天然に利用する。簡単に述べると、ＴｒｐＥ（ＴｒｐＤとの複合体でのＴｒｐＥ）酵素は、コリスメートをアントラニレートに変換する。次いで、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＡおよびＴｒｐＢは、インドールとセリンが縮合してトリプトファンを形成することで終わる、５ステップ反応を触媒する。ラムダ−ＲＥＤリコンビニアリングによってＴｒｐＥ酵素を置換することにより、その後のＮｉｓｓｌｅ株（ΔｔｒｐＥ：：Ｃｍ）は、ＴＲＰまたはアントラニレートの補給のない最少培地では成長することができない栄養要求株である。あるいは、ΔｔｒｐＥ：：Ｃｍにおけるキヌレニナーゼの発現（ＫＹＮａｓｅ−ｔｒｐＥ）によって、ＫＹＮを供給することによりこの栄養要求体をレスキューすることができる。
ＫＹＮａｓｅ−ｔｒｐＥ中のＫＹＮの成長制限性を活用し、適応実験室進化を用いて、ＫＹＮを益々効率的に利用することができる株を進化させた。先ず、ＫＹＮ濃度の下限を確立し、漸減ＫＹＮ濃度で継代させることにより突然変異体を進化させた。これは、ＫＹＮ移入を増加させることができる突然変異体を選択することができるが、細菌細胞は、遊離している外因性ＴＲＰを利用するほうを依然として選ぶ。腫瘍環境において、ＫＹＮを枯渇させ、局所ＴＲＰ濃度を上昇させることにより、二重治療機能を得ることができる。したがって、ＴＲＰよりＫＹＮのほうを選ぶ株を進化させるために、ＴＲＰの毒性アナログ−５−フルオローＬ−トリプトファン（ＴｏｘＴＲＰ）−をＡＬＥ実験に組み込むことができる。次いで、結果として得られた最高性能の株を全ゲノム配列解析に供して、寄与する突然変異を逆重畳積分する。ラムダ−ＲＥＤを行って、ＴｒｐＥを再導入し、Ｔｒｐ調節（ｔｒｐＲ、ｔｙｒＲ転写アテニュエーター）を不活性化して、ＴｒｐＡＢＣＤＥ発現を上方調節し、コリスメート産生を増加させることができる。結果として得られる株は、今や外部ＴＲＰに対して非感受性であり、ＫＹＮを効率的にＴＲＰに変換し、そしてまた、今やＴＲＰを過剰産生する。
プリン作動性の系−ＡＴＰ／アデノシン代謝
がん免疫療法成功に対する重要な障害は、腫瘍が、免疫回避を助長するために、抗炎症性サイトカインの産生、調節性免疫サブセットの動員、および免疫抑制性代謝物の産生を含む、多くの機序を用いることである。１つのそのような免疫抑制経路は、強力な免疫抑制分子である細胞外アデノシンのＣＤ７３による産生である。プリン作動性の系は、細胞間相互作用、サイトカインおよびケモカイン分泌、表面抗原シェディング、細胞内病原体除去、および活性酸素種の生成などの、免疫細胞機能を調節し、洗練させる。損傷したまたは瀕死の細胞および細菌により放出される細胞外ＡＴＰは、免疫食細胞の動員を促進し、ＮＬＲＰ３インフラマソームの共活性化因子であるＰ２Ｘ７Ｒを活性化し、これにより、その後、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８などの炎症性サイトカインの産生が誘発される。細胞外ＡＴＰのＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシンへの異化は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ−）アンカー型エクトヌクレオチダーゼおよび膜結合キナーゼにより制御される。ＣＤ３９（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、Ｅ−ＮＴＰＤａｓｅ１）は、ＡＴＰをＡＭＰに加水分解し、このＡＭＰは、その後、ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ、Ｅｃｔｏ５’ＮＴａｓｅ）により、アデノシンに脱リン酸化される。したがって、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、協調して作用して、炎症性ＡＴＰを免疫抑制性アデノシンに変換する。注目すべきこととして、ＣＤ３９の活性は、ＮＤＰキナーゼおよびアデニル酸キナーゼの作用により可逆であるが、ＣＤ７３の活性は、事実上、不可逆的である。したがって、ＣＤ７３は、ＡＴＰにより駆動される炎症誘発性環境の、アデノシンにより誘導される抗炎症性環境への変換における、極めて重要なチェックポイントに相当する。別の言い方をすれば、ＣＤ７３は、細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の炎症誘発効果を負に調節する。
腫瘍の場合、ＣＤ３９およびＣＤ７３は、腫瘍微小環境に特有のアデノシンレベルを上昇させる。ＣＤ３９およびＣＤ７３の高度な発現および活性が、いくつかの血液または固形腫瘍において観察されている。加えて、ＣＤ３９を発現するおよびＣＤ７３を発現するがんのエキソソームも、腫瘍微小環境内のアデノシンレベルを上昇させうる。ＣＤ３９／ＣＤ７３複合体は、腫瘍特異的Ｔ細胞（特に、ヘルパーＴおよび細胞傷害性Ｔ細胞）の活性化、クローン拡大増殖およびホーミングを阻害すること、細胞溶解性エフェクターＴリンパ球による腫瘍細胞死滅を減じること、ならびにＴｒｅｇおよびＴｈ１７細胞の抑制能を誘導すること、ならびに１型マクロファージの腫瘍促進性２型マクロファージへの変換を増進することにより、腫瘍免疫回避プロセスに関与する（Antonioliら、Trends Mol Med. ２０１３年６月；１９巻（６号）：３５５〜３６７頁．CD39 and CD73 in immunity and inflammationに概説されている）。骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）も、ＣＤ３９媒介機序により腫瘍成長を促進するようである。
その免疫調節性の役割に加えて、エクトヌクレオチダーゼ経路は、がん細胞成長、分化、浸潤、遊走、転移および腫瘍血管新生のモジュレーションに直接寄与する。これらの酵素を標的とする薬剤は、悪性腫瘍のいくつかのマウスモデルにおいて抗腫瘍効力および好適な忍容性プロファイルを示す（Anonioliら、２０１３年）。一部の実施形態では、本開示の操作された微生物、例えば、操作された細菌は、ＣＤ３９の活性を阻害する、および／またはＣＤ７３の活性を阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ３９を阻害する抗がん分子、および／またはＣＤ７３を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＤ３９に対する抗体および／またはＣＤ７３に対する抗体、例えば、ＣＤ３９に対する単鎖抗体および／またはＣＤ７３に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ３９および／または抗ＣＤ７３抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ３９抗体および／または抗ＣＤ７３抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境から過剰なアデノシンを除去するための手段を含む。多くの細菌は、合成のサルベージ経路によりヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの合成環境から低濃度のヌクレオチドを捕捉する。加えて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、ヌクレオチドが、成長のための唯一の窒素および炭素源として使用されうる（Neuhard J, Nygaard P. Biosynthesis and conversion of nucleotides, purines and pyrimidines. In: Neidhardt FC、Ingraham JL、Low KB、Magasanik B、Schaechter M、Umbarger HE編. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology. Washington DC: ASM Press；１９８７年、４４５〜４７３頁）。濃縮型ヌクレオシド輸送体（ＣＮＴ）ファミリーと、ヌクレオシド：Ｈ＋共輸送体（ＮＨＳ）ファミリーという、２つの進化的に無関係のカチオン連結輸送体ファミリーが、ヌクレオシド取込みに関与する（例えば、Cabritaら、Biochem. Cell Biol. ８０巻、２００２年．Molecular biology and regulation of nucleoside and nucleobase transporter proteins in eukaryotes and prokaryotesを参照されたく、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＮｕｐＣおよびＮｕｐＧは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける輸送体ファミリーメンバーである。ｎｕｐＣ遺伝子とｎｕｐＧ遺伝子の両方が欠失している突然変異体は、単一炭素源としてヌクレオシドを用いて成長することができない。これら両方の輸送体は、プロトンに連結しているが、それらの選択性に差がある。ＮｕｐＣは、Ｈ＋／ヌクレオチド共輸送体ファミリーのヌクレオチド輸送体である。ＮｕｐＣピリミジンヌクレオシド−Ｈ＋輸送体は、ヌクレオシド、特にピリミジンの共輸送（すなわち、Ｈ＋結合基質取込み）を媒介する。このファミリーの２つの公知メンバーは、グラム陽性およびグラム陰性菌で見られる。ＮｕｐＧは、広範なヌクレオシドおよびデオキシヌクレオシドを輸送することができ、対照的に、ＮｕｐＣは、グアノシンもデオキシグアノシンも輸送することができない。Ｅ．ｃｏｌｉからのＮｕｐＧのホモログは、ヒト消化管病原体、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、歯周病に関連する生物、例えばＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓおよびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、ならびにＥｒｗｉｎｉａ属の植物病原体を含む、広範な真性細菌に見られる（Vaziriら、Mol Membr Biol. ２０１３年３月；３０巻（１〜２号）：１１４〜１２８頁．
Use of molecular modelling to probe the mechanism of the nucleoside transporter NupGに記載の通りであり、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＮＴスーパーファミリーからの推定的細菌輸送体およびＮｕｐＧ／ＸａｐＢファミリーからの輸送体は、下記表４および表５に収載されるものを含む。加えて、ｃｏｄＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ２５５２５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が、ウラシル／アラントイン輸送体ファミリーと称する酵母輸送体ファミリーとの相同性に基づいて同定された（Cabritaら、上掲）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、操作された細菌または操作されたウイルスに腫瘍微小環境からアデノシンを移入するための手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヌクレオシド輸送体をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン輸送体をコードするための配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉヌクレオシド透過酵素ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ヌクレオシド輸送体またはアデノシン輸送体をコードするための配列、例えば、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣ輸送体配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンを代謝または分解するための手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンを尿酸に変換することができる１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む（図１、図２および図３を参照されたい）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含み、ヌクレオシドまたはアデノシン輸送体をコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣ遺伝子をコードする配列を含み、ｎｕｐＧまたはｎｕｐＣをコードする配列を含む。例示的な操作された細菌は、図２に示されている。
アデノシン分解回路に有用な例示的配列は、配列番号７１〜７７を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約９０％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列またはその機能性断片と少なくとも約９５％の同一性を有する、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列からなる、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される配列と同じタンパク質をコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される配列またはその機能性断片によりコードされているポリペプチドに対して少なくとも約８０％である、ポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される配列またはその機能性断片によりコードされているポリペプチドと少なくとも約９０％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／もしくは配列番号７７から選択される配列またはその機能性断片によりコードされているポリペプチドと少なくとも約９５％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６および／または配列番号７７から選択される配列によりコードされているポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする、アデノシン分解酵素またはアデノシン輸送体をコードする核酸を含む。
１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、染色体のＨＡ１／２（ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ、染色体のＨＡ９／１０（ｅｘｏ／ｃｅａ）領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ、および染色体のｍａｌＥ／Ｋ領域に組み込まれたＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む。
一部の実施形態では、構築物は、ＰｆｎｒＳ（配列番号８５６）、ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ（配列番号８５７）、ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ（配列番号８５８）、ｘｄｈＡＢＣ（配列番号８５９）、ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤ（配列番号８６０）、およびａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤ（配列番号８６１）を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／もしくは配列番号８６１から選択されるポリヌクレオチド配列またはそのバリアントもしくは機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／または配列番号８６１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、および／または配列番号８６１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド配列からなる構築物を消費するアデノシンをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｕｐＣをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８０％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９０％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９５％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＮｕｐＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８をコードする配列を含むＮｕｐＣポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８からなるＮｕｐＣポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＡをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列を含むＸｄｈＡポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列からなるＸｄｈＡポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＢをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＢポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列を含むＸｄｈＢポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列からなるＸｄｈＢポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸｄｈＣをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８０％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９０％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９５％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸｄｈＣポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列を含むＸｄｈＣポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列からなるＸｄｈＣポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ａｄｄをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８０％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９０％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９５％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＡｄｄポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列を含むＡｄｄポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列からなるＡｄｄポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＸａｐＡをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８０％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９０％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９５％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＸａｐＡポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列を含むＸａｐＡポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列からなるＸａｐＡポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＤｅｏＤをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８０％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９０％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９５％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＤｅｏＤポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列を含むＤｅｏＤポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列からなるＤｅｏＤポリペプチドをコードする。
本明細書に記載のデータは、単独、または抗ＰＤ１および／もしくはＰＤ−Ｌ１抗体と組合せ、どちらかでの、本明細書に記載のアデノシン消費性株の抗腫瘍活性を示唆する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍、上昇させる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンの分解のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載のアデノシン分解回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるＡＴＰレベルを、例えば、微生物からのＡＴＰの産生および分泌を増加させることにより、上昇させる手段を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるアデノシンレベルを（例えば、アデノシンの取込みを増加させることにより、アデノシンを代謝および／または分解することにより）低下させるための、腫瘍微小環境におけるＡＴＰレベルを上昇させるための、および／または腫瘍微小環境におけるＡＴＰのアデノシンへの変換を妨げるもしくは遮断するための、１つまたは複数の手段を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により、低酸素条件により、または炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、アデノシンを代謝するための１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アデノシンを代謝するための１つまたは複数の遺伝子を発現する。
アルギニン／アルギナーゼＩ代謝
Ｌ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）は、免疫応答を含む、いくつかの生物システムにおいて中心的役割を果たす非必須アミノ酸である。免疫応答におけるＬ−Ａｒｇの重要性は、その経過がＬ−Ａｒｇの補給により迅速に好転される、肝臓移植または外傷後の患者および齧歯動物に見られた損なわれたＴ細胞機能と血清Ｌ−Ａｒｇレベルの低下との間の関連性によって最初に示唆された。Ｌ−Ａｒｇの非存在下で培養されたＴ細胞は、ＣＤ３ζ発現を欠き、増殖することができない。注目すべきこととして、腫瘍に浸潤するＴ細胞は、シグナル伝達タンパク質の発現減少、増殖能力低下、およびサイトカイン産生減少を有することも観察されている。
Ｌ−アルギニンは、アルギナーゼＩ、アルギナーゼＩＩ、および誘導性一酸化窒素シンターゼにより代謝される。アルギナーゼ１は、Ｌ−アルギニンを尿素およびＬ−オルニチンに加水分解し、Ｌ−オルニチンは、細胞周期進行に必要とされるポリアミン（プトレシン、スペルミジン、およびスペルミン）の産生のための主要な基質である。高いアルギナーゼ活性は、胃、結腸、乳および肺がんを含む様々な悪性腫瘍を有する患者において観察されており、悪性細胞がそれらの迅速な増殖を維持するためにポリアミンの産生を必要とすることにも関連付けられている。
最近の研究により、腫瘍浸潤骨髄性細胞の、腫瘍細胞でない、特徴的な亜集団であって、腫瘍微小環境においてそれらにＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を迅速に組み込ませ、細胞外Ｌ−Ａｒｇを枯渇させる、高レベルのアルギナーゼＩおよびカチオン性アミノ酸輸送体２Ｂを産生する、亜集団が明らかになった。これらの細胞は、Ｔ細胞受容体発現および抗原特異的Ｔ細胞応答の強力なインヒビターである。これらの細胞は、調節性Ｔ細胞の強力なインデューサーであることも示されている。悪性細胞、Ｔリンパ球、およびさらには他の骨髄性亜集団を含む、腫瘍微小環境内の他の細胞は、アルギナーゼＩを産生せず、Ｔ細胞機能を損なわせなかった。したがって、これらの腫瘍浸潤骨髄性細胞は、様々な機序によって防御免疫応答を抑制する能力がある独特な亜集団に相当すると考えられる。加えて、アルギナーゼインヒビターによるこれらの腫瘍関連骨髄性細胞の抑制機能のほぼ完全な阻害は、アルギナーゼＩが、Ｔ細胞機能を損なわせるためにこれらの細胞により使用される主要機構の１つに相当しうることを示唆した。したがって、アルギナーゼＩ発現の増加は、腫瘍成長を助長しない可能性があるばかりでなく、二次効果として、腫瘍による免疫応答の回避を可能にするＬ−Ａｒｇレベルの局所低下を有する可能性もある。
加えて、ＭＤＳＣは、主として、反応性酸素中間体の産生により、およびアルギニン代謝酵素一酸化窒素シンターゼおよびアルギナーゼの発現により、抗腫瘍適応免疫応答を有効に阻害する。２つの哺乳動物アルギナーゼアイソフォームが存在し、これらの両方が、アルギニンをオルニチンおよび尿素に加水分解する。ＭＤＳＣは、アルギナーゼの構成的発現と継続的Ｌ−アルギニン枯渇により、Ｔ細胞免疫機能を抑制することができる。腫瘍微小環境におけるアルギナーゼＩ媒介アルギニン枯渇は、Ｔリンパ球増殖、サイトカイン合成および抗腫瘍免疫応答の阻害につながる。ヒトＴリンパ球において、アルギニンの非存在は、シグナル伝達Ｔ細胞受容体会合ζ鎖の下方調節を誘導し、アクチン結合タンパク質コフィリンの脱リン酸化を損なわせ、細胞周期を経ての進行をＧ０−Ｇ１停止の誘導によって阻害する。加えて、ＭＤＳＣ由来のｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンをシトルリンおよびＮＯに変換し、これにより、Ｊａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達の阻害によってＴ細胞機能が抑制され、その結果、ＭＨＣクラスＩＩ発現が低下し、Ｔ細胞アポトーシスが誘導される（Munder, Br J Pharmacol. ２００９年１０月；１５８巻（３号）：６３８〜６５１頁．Arginase: an emerging key player in the mammalian immune system）。したがって、臨床用のアルギナーゼインヒビターの開発は、腫瘍関連ＭＤＳＣにおけるアルギナーゼの役割および炎症誘導免疫抑制におけるその病因的役割に関するすべての蓄積データに照らして、最も重要である。
したがって、ある特定の実施形態では、本開示の操作された微生物、例えば、操作された細菌は、腫瘍微小環境に見られるアルギナーゼＩのレベルを枯渇または低下させることができる。先に述べたように、Ｌ−アルギニンは、Ｌ−アルギニンを尿素およびＬ−オルニチンに加水分解するアルギナーゼＩによって、代謝される。したがって、Ｌ−アルギニンを腫瘍微小環境に加えることによりアルギナーゼＩレベルを枯渇させることができる。さらに、いくつかの研究により、Ｌ−アルギニンは、アルギナーゼＩの有効なインヒビターとして役立つことが示されている。（Rodriguezら、Arginase I Production in the Tumor Microenvironment by Mature Myeloid Cells Inhibits T-Cell Receptor Expression and Antigen-Specific T-Cell Responses、２００４年、Can Res、６４巻：５８３９頁）。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の操作された微生物は、Ｌ−アルギニンを産生することができる。アルギニンを産生するための微生物、産生するように操作するための遺伝子回路、および産生するように微生物を操作する方法は、米国特許出願第１４／９６０，３３３号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０に提供されており、前記特許文献の内容は、図面を含めて、それら全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｌ−アルギニンを産生する、遺伝子操作された細菌は、Ｌ−アルギニン生合成経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、グルタメートをアルギニンに変換することができる１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、下段で詳細に説明されるように、Ｅ．ｃｏｌｉのアルギニンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、下段で詳細に説明されるように、別の細菌のアルギニンオペロンを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）は、必要に応じて、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変されうる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌において、アルギニン生合成経路は、酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸リン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンターゼ、およびアルギノコハク酸リアーゼを伴う８ステップの酵素的プロセスで、グルタメートをアルギニンに変換することができる（Cuninら、１９８６年）。最初の５ステップは、オルニチン前駆体を生成するためのＮ−アセチル化を伴う。第６のステップでは、オルニチントランスカルバミラーゼ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼとしても公知）が、シトルリンの形成を触媒する。最後の２ステップは、シトルリンからアルギニンを生成するためのカルバモイルホスフェート利用を伴う。
ａｒｇＡは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードし、ａｒｇＢは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードし、ａｒｇＣは、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードし、ａｒｇＤは、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードし、ａｒｇＥは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードし、ａｒｇＦは、オルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＩもまた、オルニチントランスカルバミラーゼをコードし、ａｒｇＧは、アルギノコハク酸シンターゼをコードし、ａｒｇＨは、アルギノコハク酸リアーゼをコードし、ａｒｇＪは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする。ｃａｒＡは、グルタミナーゼ活性を有するカルバモイルリン酸シンターゼの小さいＡサブユニットをコードし、ｃａｒＢは、アンモニアからのカルバモイルホスフェート合成を触媒するカルバモイルリン酸シンターゼの大きいＢサブユニットをコードする。これらのアルギニン生合成遺伝子（すなわち、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢ）の１つまたは複数についての異なる組合せは、天然にまたは合成的に１つまたは複数のオペロンへと組織化されることがあり、このような組織化は、細菌の種、株および亜型によって異なりうる。各オペロンの調節領域は、少なくとも１つのＡＲＧボックスを含有し、調節領域１つ当たりのＡＲＧボックスの数は、オペロンおよび細菌によって異なる。
これらの酵素をコードする遺伝子のすべては、アルギニンにより、各遺伝子の調節領域と結合して転写を阻害する複合体を形成することになるＡｒｇＲとのその相互作用によって、抑止される。Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼは、タンパク質レベルでアルギニンのみによるアロステリックフィードバック阻害も受ける（Tuchmanら、１９９７年；Caldaraら、２００６年；Caldaraら、２００８年；Caldovicら、２０１０年）。
細菌におけるアルギニン生合成を調節する遺伝子は、染色体全体にわたって点在しており、単一のリプレッサーにより制御される複数のオペロンに組織化され、MaasおよびClark（１９６４年）は、前記オペロンを「レギュロン」と名付けた。各オペロンは、ヌクレオチド数１８の不完全な回文配列であって、ＡＲＧボックスと呼ばれ、プロモーターと重複しており、リプレッサータンパク質が結合する、回文配列を、少なくとも１つ含む調節領域によって調節される（Tianら、１９９２年；Tianら、１９９４年）。ａｒｇＲ遺伝子は、１つまたは複数のＡＲＧボックスと結合するリプレッサータンパク質をコードする（Limら、１９８７年）。アルギニンは、アルギニンリプレッサーを活性化するコリプレッサーとして機能する。各オペロンを調節するＡＲＧボックスは、同一でなくてもよく、コンセンサスＡＲＧボックス配列は、Ａ／Ｔ ｎＴＧＡＡＴ Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ Ｔ／Ａ Ｔ／Ａ ＡＴＴＣＡｎ Ｔ／Ａである（Maas、１９９４年）。加えて、ａｒｇＲの調節領域は、２つのプロモーターを含有し、そのうちの１つは、２つのＡＲＧボックスと重複しており、自己調節される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、突然変異型アルギニンレギュロンを含み、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌またはウイルスより多くのアルギニンを産生する。突然変異型アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンへの変換に関与する酵素をコードするオペロンの１つまたは複数に対する−ＡＲＧボックスとのＡｒｇＲの結合および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼとのアルギニンの結合による−アルギニンにより媒介される抑止を低下させるかまたは防止し、それによって、アルギニンおよび／または中間副産物生合成を増進する、１つまたは複数の核酸突然変異を含む。
一部の操作された細菌または操作されたウイルスにおいて、アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするａｒｇＡ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼをコードするａｒｇＢ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼをコードするａｒｇＣ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをコードするａｒｇＤ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードするａｒｇＥ、アルギニノコハク酸シンターゼをコードするａｒｇＧ、アルギニノコハク酸リアーゼをコードするａｒｇＨ、オルニチントランスカルバミラーゼを各々が独立してコードするａｒｇＦおよびａｒｇＩの一方もしくは両方、カルバモイルリン酸シンターゼの小さいサブユニットをコードするｃａｒＡ、カルバモイルリン酸シンターゼの大きいサブユニットをコードするｃａｒＢ、これらのオペロン、これらのオペレーター、これらのプロモーター、これらのＡＲＧボックス、および／またはこれらの調節領域を含むが、それらに限定されない。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼを（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／もしくはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えて、またはその代わりに）コードするａｒｇＪ、そのオペロン、そのオペレーター、そのプロモーター、そのＡＲＧボックス、および／またはその調節領域を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニン生合成経路を含み、アルギニンを産生することができる。より具体的な態様では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロンが、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より多くのアルギニンを産生するように抑制解除されている、突然変異型アルギニンレギュロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンを過剰産生する。
オペロン内のアルギニン生合成遺伝子の組織化が、細菌の種、株および亜型によって異なること、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２における双極ａｒｇＥＣＢＨ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦ、およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍにおける双極ｃａｒＡＢ−ａｒｇＣＪＢＤＦは、当業者には理解されるであろう。異なる細菌からのオペロン組織化の非限定的な例は、下の表６に示される（場合によっては、遺伝子は、推定的であり、および／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける公知の配列との配列相同性により定義されたものであり、場合によっては、アルギニンレギュロン内の遺伝子のすべてが、公知であるわけではなく、および／または下で示されるわけではない）。ある特定の場合には、アルギニン生合成酵素は、細菌の種、株および亜型によって異なる。
各オペロンは、前記オペロンにおけるアルギニン生合成遺伝子の抑止および発現を制御する、少なくとも１つのプロモーターおよび少なくとも１つのＡＲＧボックスを含む、調節領域によって調節される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンへの変換に関与する酵素をコードするオペロンの１つまたは複数に対するアルギニンにより媒介される抑止を低減または除去する１つまたは複数の核酸突然変異を含むアルギニンレギュロンを含む。アルギニンにより媒介される抑止の低減または除去は、ＡｒｇＲリプレッサー結合を（例えば、アルギニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより、またはアルギニン生合成酵素をコードするオペロンの各々についての少なくとも１つＡＲＧボックスを突然変異させることにより）、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼとのアルギニンの結合を（例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒ、を産生するようにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）低減または除去することによって果たすことができる。
ＡＲＧボックス
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、突然変異型アルギニンレギュロンを含み、この突然変異型アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含み、それによって、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物生合成が増進される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下もしくは不活性化されるような１つもしくは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンリプレッサーを含むか、または遺伝子操作された細菌は、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失されており）、その結果、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／もしくは中間副産物生合成が増進されることになる。これらの実施形態のどちらかにおいて、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニン生合成酵素およびアルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒ、をコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンレギュロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、突然変異型または欠失アルギニンリプレッサーを含み、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒを含み、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンの各々についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンレギュロンを含み、および／または突然変異型もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードしており、さらに、突然変異型アルギニンレギュロンを含み、この突然変異型アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、および野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての各ＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含み、その結果、ＡｒｇＲ結合が低減または除去され、それによって、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物生合成が増進される。例えば、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）をコードするオペロンの調節領域は、構成的であることによってアルギニン生合成を駆動しうる。
一部の実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む１つまたは複数のオペロン内のすべてのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去するために突然変異される。一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする１つまたは複数のオペロン内のすべてのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去するために突然変異される。一部の実施形態では、アルギニン生合成遺伝子を含む各オペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去するために突然変異される。一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素をコードする各オペロンにおけるすべてのＡＲＧボックスは、ＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去するために突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ、構成的プロモーターにより駆動されるアルギニノコハク酸シンターゼをコードし、さらに、突然変異型アルギニンレギュロンを含み、この突然変異型アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、および必要に応じて、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするオペロンの各々についての各ＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含み、その結果、ＡｒｇＲ結合が低減または除去され、それによって、レギュロンが抑制解除され、アルギニン生合成が増進される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、突然変異型アルギニンレギュロンおよびフィードバック耐性ＡｒｇＡを含み、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現されると、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より多くのアルギニンを産生することができる。
一部の実施形態では、ＡＲＧボックスは、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、および／または配列番号９９の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、１つより多くのＡＲＧボックスが、単一オペロンに存在することもある。これらの実施形態の一態様では、オペロン内のＡＲＧボックスの少なくとも１つは、オペロンの調節領域とのＡｒｇＲ結合の必要な低減を生じさせるために突然変異される。これらの実施形態の代替態様では、オペロン内のＡＲＧボックスの各々は、オペロンの調節領域とのＡｒｇＲ結合の必要な低減を生じさせるために突然変異される。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅにおけるｃａｒＡＢオペロンは、２つのＡＲＧボックスを含み、一方または両方のＡＲＧボックス配列が突然変異されうる。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅにおけるａｒｇＧオペロンは、３つのＡＲＧボックスを含み、１、２または３つのＡＲＧボックス配列が、突然変異、破壊または欠失されうる。一部の実施形態では、３つすべてのＡＲＧボックス配列が、突然変異、破壊または欠失され、構成的プロモーター、例えば、ＢＢａ＿Ｊ２３１００が、ａｒｇＧオペロンの調節領域に挿入される。１調節領域当たりのＡＲＧボックスの数が、細菌によって異なりうること、およびＡＲＧボックスのヌクレオチド配列が、オペロンごとに異なりうることは、当業者には理解されるであろう。
「アルギニンオペロン」、「アルギニン生合成オペロン」、および「ａｒｇオペロン」は、少なくとも１つのプロモーターと少なくとも１つのＡＲＧボックスとを含む共有調節領域の制御下にあるアルギニン生合成酵素をコードする遺伝子の１つまたは複数についての一群を指すために、同義で使用される。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、同時転写および／または同時翻訳される。アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の任意の組合せが、天然にまたは合成的にオペロンへと組織化されうる。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでは、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼおよびオルニチントランスカルバミラーゼをコードする遺伝子が、プロモーターとＡＲＧボックスとを含む共有調節領域の制御下で、単一オペロンに組織化され、ａｒｇＣＡＥＢＤ−ｃａｒＡＢ−ａｒｇＦになる。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２およびＮｉｓｓｌｅでは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼおよびアルギニノコハク酸リアーゼをコードする遺伝子が、２つの双極オペロンに組織化され、ａｒｇＥＣＢＨになる。アルギニン生合成に関与する酵素をコードするオペロンは、染色体全体にわたって異なる座位に分布しうる。未改変細菌では、各オペロンは、ＡｒｇＲを介してアルギニンにより抑止されうる。一部の実施形態では、アルギニンおよび／または中間副産物の産生は、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスにおいて、本明細書で提供されるようなアルギニン生合成オペロンにコードされている酵素の発現を改変することにより変更されうる。各アルギニンオペロンは、プラスミドまたは細菌染色体上に存在しうる。加えて、任意のアルギニンオペロン、またはアルギニンオペロン内の遺伝子もしくは調節領域の複数のコピーが細菌またはウイルスに存在することがあり、オペロンまたは遺伝子または調節領域の１つまたは複数のコピーは、本明細書に記載の通り突然変異または別様に変更されうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、コピー数を増すために同じ産物（例えば、オペロンもしくは遺伝子もしくは調節領域）の複数のコピーを含むように、または複数の異なる機能を果たすオペロンの複数の異なる成分を含むように、操作されている。
「ＡＲＧボックスコンセンサス配列」は、ＡＲＧボックス核酸配列を指し、この核酸配列の核酸は、ａｒｇＲ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、および／またはｃａｒＢの調節領域の１つまたは複数に高頻度で存在することが公知である。上記の通り、各ａｒｇオペロンは、ヌクレオチド数１８の不完全な回文配列であって、ＡＲＧボックスと呼ばれ、プロモーターと重複しており、リプレッサータンパク質が結合する、回文配列を、少なくとも１つ含む調節領域を含む（Tianら、１９９２年）。ＡＲＧボックスのヌクレオチド配列は、オペロンごとに異なりうるものであり、コンセンサスＡＲＧボックス配列は、Ａ／Ｔ ｎＴＧＡＡＴ Ａ／Ｔ Ａ／Ｔ Ｔ／Ａ Ｔ／Ａ ＡＴＴＣＡｎ Ｔ／Ａである（Maas、１９９４年）。アルギニンリプレッサーは、１つまたは複数のＡＲＧボックスと結合して、その１つまたは複数のＡＲＧボックスに作動可能に連結したアルギニン生合成酵素の転写を能動的に阻害する。
「突然変異型アルギニンレギュロン」または「突然変異アルギニンレギュロン」は、突然変異型アルギニンレギュロンが、同じ条件下で、同じ細菌亜型からの未改変レギュロンより多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生するように、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンへの変換に関与する酵素をコードするオペロンの各々に対するアルギニンにより媒介される抑止を低減させるまたは除去する１つまたは複数の核酸突然変異を含む、アルギニンレギュロンを指すために使用される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒと、突然変異型アルギニンレギュロンとを含み、突然変異型アルギニンレギュロンは、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含み、それによって、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物生合成が増進される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌もしくは遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンリプレッサー機能が低下もしくは不活性化されるような１つもしくは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンリプレッサーを含み、または遺伝子操作された細菌もしくは遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失されており）、その結果、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／もしくは中間副産物生合成が増進されることになる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒを含み、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンの各々についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンレギュロンを含み、および／または突然変異型もしくは欠失アルギニンリプレッサーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒと、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンの各々についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む突然変異型アルギニンレギュロンとを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒを含み、突然変異型または欠失アルギニンリプレッサーを含む。一部の実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンを含み、前記オペロンについての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンを含み、突然変異型または欠失アルギニンリプレッサー含む。一部の実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、オルニチンアセチルトランスフェラーゼを（Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼおよび／またはＮ−アセチルオルニチナーゼに加えて、またはその代わりに）コードするオペロンと、前記オペロンについての少なくとも１つのＡＲＧボックスにおける１つまたは複数の核酸突然変異とを含む。
ＡＲＧボックスは、各アルギニン生合成オペロンの調節領域におけるプロモーターと重複している。突然変異型アルギニンレギュロンでは、１つまたは複数のアルギニン生合成オペロンの調節領域は、回文ＡＲＧボックス配列を破壊するようにおよびＡｒｇＲ結合を低減させるように十分突然変異されているが、非突然変異型調節領域のプロモーターとの、ネイティブオペロン特異的プロモーターとして認識されるのに十分な高さの相同性を、依然として有する。オペロンは、少なくとも１つのＡＲＧボックスに、ＡＲＧボックスとのおよびオペロンの調節領域とのＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去するような少なくとも１つの核酸突然変異を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化から保護される塩基、およびＡｒｇＲ結合中にヒドロキシルラジカルの攻撃から保護される塩基は、ＡｒｇＲ結合を破壊するための突然変異の主標的である。突然変異調節領域のプロモーターは、非突然変異型調節領域のプロモーターとの十分な高さの相同性を保持し、したがって、ＲＮＡポリメラーゼは、作動可能に連結したアルギニン生合成酵素の転写を促進するのに十分な親和性でそれと結合する。一部の実施形態では、突然変異体のプロモーターのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比には、野生型プロモーターのＧ／Ｃ：Ａ／Ｔ比と１０％以上の差がない。
一部の実施形態では、１つより多くＡＲＧボックスが、単一オペロンに存在することもある。これらの実施形態の一態様では、オペロン内のＡＲＧボックスの少なくとも１つは、オペロンの調節領域とのＡｒｇＲ結合の必要な低減を生じさせるために変更される。これらの実施形態の代替態様では、オペロン内のＡＲＧボックスの各々は、オペロンの調節領域とのＡｒｇＲ結合の必要な低減を生じさせるために変更される。
ＡｒｇＲ結合「低減」は、同じ条件下で同じ亜型の細菌における未改変ＡＲＧボックスおよび調節領域とのリプレッサー結合と比較して、オペロン内のＡＲＧボックスとのリプレッサー結合の低減、または前記オペロンの調節領域との全リプレッサー結合の低減を指すために使用される。
「ＡｒｇＲ」または「アルギニンリプレッサー」は、アルギニンレギュロン内のアルギニン生合成遺伝子の転写を調節することによりアルギニン生合成を抑制することができるタンパク質を指すために使用される。アルギニンリプレッサータンパク質（「ａｒｇＲ」）をコードする遺伝子の発現が、野生型細菌において増加されると、アルギニン生合成は減少される。ａｒｇＲの発現が、野生型細菌もしくはウイルスにおいて減少されると、またはａｒｇＲが、アルギニンリプレッサー機能を不活性化するように欠失もしくは突然変異された場合、アルギニン生合成は増加される。
「いずれかの機能性ＡｒｇＲを欠く」細菌、および「ＡｒｇＲ欠失細菌」は、各アルギニンリプレッサーが、同じ条件下で同じ亜型の細菌からの未改変アルギニンリプレッサーと比較して有意な活性低減または除去を有する、細菌を指すために使用される。アルギニンリプレッサー活性低減または除去は、例えば、アルギニン生合成遺伝子の転写増加、および／またはアルギニン濃度増加をもたらしうる。アルギニンリプレッサー活性が低減または除去されている細菌は、細菌ａｒｇＲ遺伝子を改変することにより、またはａｒｇＲ遺伝子の転写を改変することにより、生成することができる。例えば、染色体ａｒｇＲ遺伝子を、欠失させることができ、突然変異させることができ、またはａｒｇＲ遺伝子を、野生型リプレッサー活性を示さないａｒｇＲ遺伝子で置換することができる。
一部の実施形態では、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えば、ａｒｇＡｆｂｒをさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、ＡｒｇＡのフィードバック耐性形態を含み、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての各ＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、ＡｒｇＡのフィードバック耐性形態、構成的プロモーターから発現されるアルギニノコハク酸シンターゼを含み、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの各々についての各ＡＲＧボックスに１つまたは複数の核酸突然変異を含む。これらの実施形態では、細菌は、アルギニンを産生することができる。
下記の表は、１つまたは複数の核酸突然変異によってアルギニンオペロンの各々に対するアルギニンにより媒介される抑止が低減または除去されている、突然変異型構築物の例を示す。突然変異型構築物は、酸素レベル依存性プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、により駆動されるＡｒｇＡのフィードバック耐性形態を含む。各突然変異型アルギニンレギュロンは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、カルバモイルリン酸シンターゼ、および野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに、ＡｒｇＲ結合が低減または除去され、それによって、アルギニンおよび／または中間副産物生合成が増進されるような１つまたは複数の核酸突然変異を含む。突然変異型アルギニンレギュロン構築物の非限定的な例は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３３３３２６号として発行された、２０１６年５月２５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１６年５月２５日出願の１５／１６４，８２８、ならびに２０１５年１２月４日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月４日出願の米国特許第９，４８７，７６４号に記載されており、これらの各々についての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
突然変異は、プラスミドまたは染色体上に存在しうる。一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一のリプレッサータンパク質により調節される。細菌の特定の種、株および／または亜型では、アルギニンレギュロンは、２つの推定リプレッサーにより調節されうることが提案されている（Nicoloffら、２００４年）。したがって、ある特定の実施形態では、本発明のアルギニンレギュロンは、１つより多くのリプレッサータンパク質により調節される。
ある特定の実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、遺伝子操作された細菌の１つの種、株または亜型において発現される。代替実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、遺伝子操作された細菌の２つまたはそれより多い種、株および／または亜型において発現される。
アルギニンリプレッサー結合部位（ＡＲＧボックス）
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン生合成酵素Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルオルニチナーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼをコードするオペロンの１つまたは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスに、アルギニンレギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物、例えばシトルリン、の生合成が増進されるような１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異型アルギニンレギュロンをさらに含む。そのような遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７／１２３６７５として発行された、２０１６年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
アルギニンリプレッサー（ＡｒｇＲ）
遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニン生合成経路におけるグルタメートからアルギニンおよび／または中間副産物への変換に関与する酵素をコードするオペロンの１つまたは複数に対するアルギニンにより媒介される抑止を低減させるまたは除去する１つまたは複数の核酸突然変異を含む、アルギニンレギュロンを含む。一部の実施形態では、アルギニンにより媒介される抑止の低減または除去は、ＡｒｇＲリプレッサー結合を低減させるもしくは除去することにより、例えば、アルギニン生合成酵素をコードするオペロンの１つもしくは複数についての少なくとも１つのＡＲＧボックスを（上段で論じたように）突然変異させることにより、または（ここで論じる）アルギニンリプレッサーを突然変異もしくは欠失させることにより、および／またはＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼとのアルギニン結合を低減させるもしくは除去することにより（例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒ、を産生するようにＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼを突然変異させることにより）達成されうる。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌１または遺伝子操作されたウイルスは、機能性ＡｒｇＲリプレッサーを認識し、それ故、アルギニン生合成オペロンの各々に対するＡｒｇＲリプレッサーにより媒介される転写抑止が低減または除去される。一部の実施形態では、操作された細菌は、アルギニンリプレッサー機能が低下されるまたは不活性になるような、１つまたは複数の核酸突然変異を含む、突然変異型アルギニンリプレッサーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンリプレッサーを有さず（例えば、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠失されており）、その結果、レギュロンが抑制解除され、アルギニンおよび／または中間副産物生合成が増進されることとなる。一部の実施形態では、対応する野生型細菌に通常は存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが、独立して、１つまたは複数のヌクレオチド欠失、挿入または置換により、欠失されているか、または不活性にされる。一部の実施形態では、対応する野生型細菌に通常は存在する機能性ａｒｇＲ遺伝子の各コピーが欠失される。
一部の実施形態では、アルギニンレギュロンは、単一のリプレッサータンパク質により調節される。細菌の特定の種、株および／または亜型では、アルギニンレギュロンは、２つの別個の推定リプレッサーにより調節されうることが提案されている（Nicoloffら、２００４年）。したがって、ある特定の実施形態では、異なるアミノ酸配列を各々が含む２つの別個のＡｒｇＲタンパク質が、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスでは突然変異または欠失されている。
一部の実施形態では、突然変異型または欠失アルギニンリプレッサーを含む、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒをさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、ＡｒｇＡのフィードバック耐性形態を含み、あらゆる機能性アルギニンリプレッサーを欠いており、アルギニンを産生することができる。一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子は、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスでは欠失されている。一部の実施形態では、ａｒｇＲ遺伝子は、ＡｒｇＲ機能を不活性化するために突然変異される。一部の実施形態では、ａｒｇＧ遺伝子は、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスでは欠失されている。一部の実施形態では、ａｒｇＧ遺伝子は、ＡｒｇＲ機能を不活性化するために突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、ａｒｇＡｆｂｒおよび欠失ＡｒｇＲを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、ａｒｇＡｆｂｒ、欠失ＡｒｇＲおよび欠失ａｒｇＧを含む。一部の実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧは、細菌ゲノムから欠失されるものであり、ａｒｇＡｆｂｒは、プラスミド内に存在する。一部の実施形態では、欠失ＡｒｇＲおよび／または欠失ａｒｇＧは、細菌ゲノムから欠失されるものであり、ａｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれている。１つの特定の実施形態では、遺伝子改変された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、染色体に組み込まれたａｒｇＡｆｂｒ、欠失ゲノムＡｒｇＲおよび欠失ゲノムａｒｇＧを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子改変された細菌は、プラスミド上に存在するａｒｇＡｆｂｒ、欠失ゲノムＡｒｇＲおよび欠失ゲノムａｒｇＧを含む。
フィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異体、例えばａｒｇＡｆｂｒ、を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡを含む突然変異型アルギニンレギュロンを含み、アルギニンフィードバック耐性ＡｒｇＡが発現されると、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より多くのアルギニンおよび／または中間副産物を産生することができる。アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼタンパク質（ａｒｇＡｆｂｒ）は、フィードバック感受性親株からの酵素より、Ｌ−アルギニンに対する感受性が有意に低い（例えば、Eckhardtら、１９７５年；Rajagopalら、１９９８年を参照されたい）。フィードバック耐性ａｒｇＡ遺伝子は、プラスミドまたは染色体上に存在しうる。一部の実施形態では、プラスミドからの発現は、ａｒｇＡｆｂｒ発現を増加させるのに有用でありうる。一部の実施形態では、染色体からの発現は、ａｒｇＡｆｂｒ発現の安定性を増大させるのに有用でありうる。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスのいずれかが、細菌染色体の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれる。例えば、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする配列の１つまたは複数のコピーを、細菌染色体に組み込むことができる。アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼの複数のコピーが染色体に組み込まれていることにより、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼのより多くの産生が可能になり、発現レベルの微調整も可能になる。あるいは、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼに加えて、本明細書に記載の異なる回路、例えば、キルスイッチ回路のいずれかを、複数の異なる機能を果たすように細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことができよう。
複数の別個のフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼが、当技術分野において公知であり、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスにそれらを兼備させることができる。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、腫瘍微小環境により誘導されるプロモーターの制御下で発現される。
一部の実施形態では、プラスミドまたは染色体は、野生型ＡｒｇＲ結合部位、例えば、ＡＲＧボックスも含む。一部の事例では、機能性ＡｒｇＲの存在および／または蓄積は、ＡＲＧボックス以外の部位に対するオフターゲット結合をもたらすことがあり、これは、遺伝子発現のオフターゲット変化の原因となりうる。機能性ＡＲＧボックスをさらに含むプラスミドまたは染色体を使用して、すなわち、それらがＡｒｇＲシンクとして作用することにより、オフターゲットＡｒｇＲ結合を低減させるまたは除去することができる。一部の実施形態では、プラスミドまたは染色体は、機能性ＡｒｇＲ結合部位を含まず、例えば、プラスミドまたは染色体は、改変されたＡＲＧボックスを含むか、ＡＲＧボックスを含まない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現されるａｒｇＡｆｂｒはもちろん、上段で論じたような１つまたは複数のＡＲＧボックス突然変異を含む突然変異型調節領域の制御下で発現される野生型ａｒｇＡも含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現されるａｒｇＡｆｂｒを含み、野生型ａｒｇＡを含まない。さらに他の実施形態では、突然変異型アルギニンレギュロンは、酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現されるａｒｇＡｆｂｒを含み、いかなるＡＲＧボックス突然変異も有さない野生型ａｒｇＡをさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、プラスミドおよび／または染色体からＡｒｇＡｆｂｒを発現する。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、構成的プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、ａｒｇＡｆｂｒは、低酸素または嫌気環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下で発現される。
例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列の核酸配列は、配列番号１０２で示される。例示的ａｒｇＡｆｂｒ配列のポリペプチド配列は、配列番号１０３で示される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０２の核酸配列またはその機能性断片を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０２と同じポリペプチドまたはその機能性断片をコードする、核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０２のＤＮＡ配列もしくはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０２と同じポリペプチドもしくはその機能性断片をコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３のポリペプチド配列またはその機能性断片をコードする。一部の実施形態では、ポリペプチド配列をコードする遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３またはその機能性断片と比較して１つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を含有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０３のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチド配列をコードする。
一部の実施形態では、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼのアルギニンフィードバック阻害は、遺伝子操作された細菌では、アルギニンフィードバック耐性Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼが活性であるとき、同じ条件下で、同じ亜型の細菌からの野生型Ｎ−アセチルグルタミン酸シンテターゼと比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減される。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、アルギニンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
アルギニン産生株は、米国特許出願公開第２０１６０３３３３２６号として発行された、２０１６年５月２５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３４２００および２０１６年５月２５日出願の１５／１６４，８２８、ならびに２０１５年１２月４日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６４１４０、ならびに２０１５年１２月４日出願の米国特許第９，４８７，７６４号にも記載されており、これらの各々についての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、アルギニンの産生のための遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
非限定的な例では、アルギニン産生回路を抗ＣＤ４７分泌回路と組み合わせることができる。
ＰＧＥ２の阻害または枯渇
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、多くの腫瘍において過剰産生され、そこでがん進行を助ける。ＰＧＥ２は、血管新生、アポトーシス、炎症および免疫抑制をはじめとする非常に多くの生物学的プロセスに関与する、多面的分子である。ＰＧＥ２は、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）により合成される。ＣＯＸ−２は、アラキドン酸（ＡＡ）をプロスタグランジンエンドペルオキシドＨ２（ＰＧＨ２）に変換する。次いで、ＰＨＧ２は、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）によってＰＨＥ２に変換され、これには、３つの形態がある。ＰＧＥ２は、１５−ＰＧＤＨおよびカルボニルレダクターゼによって生物学的に不活性な１５−ケト−ＰＧに異化されることもあり、またはセクレターＭＲＰ４によって分泌されることもある。
ＭＤＳＣは、腫瘍環境でのＰＧＥ２産生に肝要な役割を果たすと考えられる。腫瘍由来因子は、ＣＯＸ２、ＰＧＥＳ１およびＭＲＰ４を誘導し、ＭＤＳＣにおける１５−ＰＧＤＨの発現を下方調節し、ＭＤＳＣ抑制活性を伴う。ＣＯＸ−２インヒビターによるＰＧＥ２の阻害は、がん処置として有望であるが、全身投与は、重篤な副作用を伴い、ＣＯＸ−２インヒビターセレコキシブの場合、腫瘍予防に対する耐性が観察されている。
ＰＧＥ産生の阻害に加えて、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（１５−ＰＧＤＨ）によるＰＧＥ２の分解は、腫瘍におけるＰＧＥ２レベルを低下させるもう１つの方法である。プロスタグランジンデヒドロゲナーゼの欠如は、プロスタグランジンＥ２の異化を妨げ、これは、がん細胞が免疫系を回避することおよび薬物処置をすり抜けること両方を助ける。最近の研究により、腫瘍微小環境に局所送達された１５−ＰＧＤＨは、抗腫瘍免疫応答を生じさせることが実証された。例えば、ＣＤ１１ｂを発現する非リンパ球白血球を含むマウス腫瘍（腫瘍外からの細胞と比較して、ＰＧＥ２レベルの上昇、より高度なＣＯＸ−２発現、および１５−ＰＧＤＨ発現の有意な低減を有する）への、１５−ＰＧＤＨをコードするアデノウイルスの注射は、腫瘍成長の有意な緩徐化をもたらした。これらの研究は、１５−ＰＧＤＨ発現が、腫瘍細胞において最も高度であるが、腫瘍関連ＣＤ１１ｂ細胞においても有意であり、これらの細胞においてＰＧＥ２分泌を４分の１に低減させることを、さらに示した。これは、ＣＤ１１ｂ細胞による免疫抑制性サイトカインの分泌低減を伴い、その結果、運命が切り替えられて樹状細胞への分化が促進された。これらの研究は、腫瘍におけるＰＧＥ２の過剰産生が、抗原提示細胞の成熟を防止することにより免疫回避の一因となること、およびその回避を１５−ＰＧＤＨの強制発現により克服することができることを示す。（Eruslanovら、８８巻、２０１０年１１月 Journal of Leukocyte Biology；Tumor-mediated induction of myeloid-derived suppressor cells and M2-polarized macrophages by altering intracellular PGE2 catabolism in myeloid cells）。
他の研究は、がん処置における局所ＰＧＥ２異化の利点を確証する。疼痛および炎症を処置するために使用される非ステロイド性抗炎症ＣＯＸ−２インヒビターである、セレコキシブは、結腸腺腫の再発を低減させるが、低レベルの１５−ＰＧＤＨを有する一部の患者には効かない。これらの結果は、マウスにおいて１５−ＰＧＤＨの遺伝子ノックアウトが結腸腫瘍を予防するセレコキシブの能力に対するほぼ完全な耐性を付与することを示す研究と一致する。これらおよび他の研究は、がんにおいてＰＧＥ２レベルを合成の阻害もしくは触媒の促進のいずれかまたは両方によって低減させることの潜在的重要性を強調する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるＰＧＥ２レベルを低下または枯渇させることができる１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＧＥ２産生を阻害するまたは減少させることができる、例えば、ＣＯＸ−２インヒビターまたはアラキドン酸合成経路における酵素のインヒビターを産生することができる、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境からのＰＧＥ２取込みを促進する、例えば、ＰＧＥ２輸送体を発現する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＧＥ２分解を促進、増進または刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＧＥ２を分解する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼを産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＧＥ２産生を阻害することもしくは減少させること、および／または腫瘍微小環境からのＰＧＥ２取込みを促進すること、例えば、ＰＧＥ２輸送体を発現すること、および／またはＰＧＥ２分解を促進すること、例えば、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼを産生することができる、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下の、ＰＧＥ２輸送体をコードするための配列を含む、および／または１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ＰＧＥ２輸送体をコードするための配列を含む、および／または１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、ＰＧＥ２輸送体をコードするための配列を含む、および／または１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼをコードするための配列を含む。
免疫抑制性サイトカイン
免疫抑制性サイトカインとして公知の、ある特定のサイトカインは、腫瘍細胞から分泌され、自然および／または適応免疫応答を、場合によってはＴｒｅｇ、ＴＡＭおよびＤＣｒｅｇを介して、抑制するように機能する。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫抑制性サイトカインを阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても公知のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、単球およびリンパ球（例えば、２型ヘルパーＴ細胞、マスト細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））により産生される抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−１０は、これらの細胞においてＰＤ−１が誘発すると単球により産生されうる。Ｉｌ−１０は、Ｔｈ１サイトカイン、ＭＨＣクラスＩＩ抗原および共刺激分子のマクロファージ上での発現を下方調節することが示されている。ＩＬ−１０がサイトカイン分泌、抗原提示およびＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を抑制することも報告されている。さらなる研究により、ＩＬ−１０が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により誘発される骨髄細胞系列細胞からの炎症性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＩＦＮγ分泌の、リポ多糖（ＬＰＳ）および細菌産物により媒介される誘導を、阻害することが示されている。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１０を直接または間接的に阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＩＬ−１０に対する抗体、例えば、ＩＬ−１０に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＩＬ−１０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−１０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−１０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−１０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−１０抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＣＣＲ４も、正常および腫瘍免疫に重要な役割を有する。Ｃケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）は、免疫バランスの調節に重要であり、がん組織内と末梢血中両方のＴｈ２細胞およびエフェクターＴｒｅｇ細胞上に選択的に発現されることが公知である。ＣＣＲ４＋Ｔ細胞白血病／リンパ腫を有する患者のサブセットでは、腫瘍細胞自体が、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞として機能して、宿主抗腫瘍免疫応答に直面した際の腫瘍生存に寄与する。他の種類のがんでは、腫瘍細胞および腫瘍微小環境により産生されるＣＣＲ４の特異的リガンドである、ケモカインＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７およびＭＤＣ／ＣＣＬ２２が、ＣＣＲ４＋Ｔｒｅｇ細胞を腫瘍に誘引し、そこで、それらは、宿主免疫応答からの腫瘍回避に好適な環境を作る。研究により、腫瘍浸潤マクロファージおよび腫瘍細胞は、Ｔｒｅｇ細胞はもちろんＣ−Ｃケモカイン受容体４型（ＣＣＲ４）を発現するエフェクターＴ細胞も化学誘引する、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２２（ＣＣＬ２２）を産生することが示されている。したがって、ＣＣＲ４シグナル伝達の阻害には、Ｔｒｅｇを選択的に枯渇させること、およびそれらの腫瘍微小環境への遊走を防止することにより、抗腫瘍免疫応答を促進する可能性がある。実際、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＣＣＲ４ ｍＡｂ処置は、エフェクターＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させ、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を効率的に誘導することが示されている。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＣＲ４を阻害するおよび／またはＣＣＬ１７を阻害するおよび／またはＣＣＬ２２を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＣＲ４のアンタゴニストリガンド、および／またはＣＣＲ４に対するアンタゴニスト抗体および／またはＣＣＬ１７に対する抗体および／またはＣＣＬ２２に対する抗体、例えば、ＣＣＲ４に対する単鎖抗体および／またはＣＣＬ１７に対する単鎖抗体および／またはＣＣＬ２２に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンタゴニストＣＣＲ４リガンドおよび／または抗ＣＣＲ４抗体および／または抗ＣＣＬ１７抗体および／または抗ＣＣＬ２２抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＣＲ４アンタゴニストリガンドおよび／または抗ＣＣＲ４抗体および／または抗ＣＣＬ１７抗体および／または抗ＣＣＬ２２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＣＲ４アンタゴニストリガンドおよび／または抗ＣＣＲ４抗体および／または抗ＣＣＬ１７抗体および／または抗ＣＣＬ２２抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＣＣＲ４アンタゴニストリガンドおよび／または抗ＣＣＲ４抗体および／または抗ＣＣＬ１７抗体および／または抗ＣＣＬ２２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＣＣＲ４アンタゴニストリガンドおよび／または抗ＣＣＲ４抗体および／または抗ＣＣＬ１７抗体および／または抗ＣＣＬ２２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞上に高度に発現される受容体を介してシグナル伝達するヘテロ二量体サイトカインのＩＬ−１２ファミリーのメンバーである。ＩＬ−２７は、炎症の際にＴｈ１７細胞の発生および分化を抑制すること、ならびにＴｈ１およびＴｈ２エフェクター細胞においてＴｒｅｇ様活性を誘導することが示されている。ＩＬ−２７は、これらのＴｈ１およびＴｈ２細胞においてＩＬ−１０産生および分泌を誘導することも示されている。これらの結果は、ＩＬ−２７が、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−ガンマの産生を誘導することができ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７分泌を阻害することができることを示すさらなる研究により確証された。また、ＩＬ−２７で処置されたＴ細胞は、ＩＬ−１０依存的にＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する。まとめると、これらの研究は、ＩＬ−２７が抗炎症性ＩＬ−１０産生Ｔ細胞集団の産生に関与することを示す。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２７を直接または間接的に阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＩＬ−２７に対する抗体、例えば、ＩＬ−２７に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＩＬ−２７抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−２７抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−２７抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−２７抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−２７抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
インターロイキン３５（ＩＬ−３５）は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により産生されるが、エフェクターＴ細胞により産生されない、ＩＬ−１２ファミリーサイトカインであり、免疫抑制に関与する。ＩＬ−３５は、２つの別々の遺伝子によりコードされるＩＬ−１２αとＩＬ−２７β鎖で構成されている、二量体タンパク質である。ＩＬ−３５は、Ｔｒｅｇにより主として発現される免疫抑制性サイトカインであり、エフェクターＴ細胞はもちろん骨髄性細胞のそのモジュレーションによって抗腫瘍免疫の抑制に関与する。Ｔｒｅｇにより分泌されると、ＩＬ−３５は、免疫細胞の炎症応答を抑制する。ＩＬ−３５は、異なるＴ細胞サブセットに対する選択的活性を示しており、Ｔｒｅｇ細胞集団の増殖を誘導するが、Ｔｈ１７細胞集団の活性を低減させて抑制効果をもたらす。ＩＬ−３５の活性の遮断は、腫瘍微小環境における免疫抑制を逆転させ、強固なかつ有効な抗腫瘍免疫応答をもたらす可能性がある。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−３５を直接または間接的に阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＩＬ−３５に対する抗体、例えば、ＩＬ−３５に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＩＬ−３５抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−３５抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＩＬ−３５抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−３５抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＩＬ−３５抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ、これはマクロファージコロニー刺激因子受容体、Ｍ−ＣＳＦＲ、表面抗原分類１１５、ＣＤ１１５としても公知である）は、シングルパスＩ型膜タンパク質であり、マクロファージおよび単球の生存、増殖、分化および機能の調節に不可欠な役割を果たすサイトカインである、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）の受容体として作用する。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、単球性骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＭＤＳＣ）、および顆粒球性ＭＤＳＣ（Ｇ−ＭＤＳＣ）は、免疫抑制性腫瘍微小環境のドライバーと考えられる。これらの白血球はまた、腫瘍細胞増殖を促進し、細胞傷害性ストレスに対する耐性を付与し、転移性播種を助長する。ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒの遮断は、ＴＡＭの数を減少させ、残存するＴＡＭを、抗原提示を支持するように、および腫瘍微小環境におけるＴ細胞活性化を強めるように再プログラミングする。これは、その結果として、免疫抑制の低減およびインターフェロン応答の上昇をもたらし、それによって腫瘍進行が抑えられる（Yu Zhuら、Cancer Res ２０１４年９月１５日 ７４巻）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＳＦ１を阻害するおよび／またはＣＳＦ１Ｒを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＳＦ１に対する抗体および／またはＣＳＦ１Ｒに対する抗体、例えば、ＣＳＦ１に対する単鎖抗体および／またはＣＳＦ１Ｒに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＳＦ１抗体および／または抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＳＦ１抗体および／または抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＳＦ１抗体および／または抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＳＦ１抗体および／または抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＳＦ１抗体および／または抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１、ＣＣＬ２）は、サイトカイン／ケモカインスーパーファミリーのメンバーである。ＣＣＬ２は、最初は、単球の遊走を誘導するケモカインと特徴付けられた（Lobergら、CCL2 is an important mediator of prostate cancer growth in vivo via regulation of macrophage infiltration. Neoplasia. ２００７年；９巻：５５６〜６２頁）ら、２０１０年）。ＣＣＬ２−ＣＣＲ２軸を介して腫瘍に動員される単球は、ＴＡＭに分極され、これが腫瘍細胞生存の一因となる（McClellanら、２０１２年）。加えて、ＣＣＬ２は、炎症部位へのリンパ球（Ｔｒｅｇを含む）および内皮細胞のサブセットの誘引を含む多数の他の化学走性を発揮することも判明している。ＣＣＬ２はまた、ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞機能を阻害することによりＴ細胞機能に直接影響を与える（Hu K.ら、Recombined CC chemokine ligand 2 into B16 cells induces production of Th2-dominanted cytokines and inhibits melanoma metastasis. Immunology Letters. ２００７年；１１３巻：１９〜２８頁）。最近、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＤＳＣ蓄積およびＭＤＳＣにより媒介される抑制の調節因子としてのＣＣＬ２のさらなる役割が、結腸直腸がんに関して記載された。この研究の結果は、ＣＣＬ２指向性遮断および可能性のあるＣＣＬ−２指向性療法に対して感受性である、腫瘍発達の最初期段階でのＣＣＬ２−ＭＤＳＣ免疫チェックポイントを示唆する（Chunら、CCL2 Promotes Colorectal Carcinogenesis by Enhancing Polymorphonuclear Myeloid-Derived Suppressor Cell Population and Function Cell Reports １２巻、２４４〜２５７頁）。患者では、ＣＣＬ２が、臨床アウトカム不良と相関する複数の腫瘍型において高レベルで見つかっている。Lobergらによるものなどの研究は、抗ＣＣＬ２中和抗体の全身投与が腫瘍成長を有意に遅らせることを示した。２つのマウスＣＣＬ２マウスタンパク質に対する２つの抗体の組合せの使用は、前立腺がん異種移植モデルにおいて腫瘍発生および転移を低減させることが最近示された。特に、抗ＣＣＬ２療法は、ワクチン療法などの免疫刺激療法と組み合わせて有用であることが示唆されている（Fridlenderら、Cancer Res. ２０１０年１月１日；７０巻（１号）１０９頁．CCL2 Blockade Augments Cancer Immunotherapy）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＣＬ２を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＣＬ２に対する抗体、例えば、ＣＣＬ２に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＣＬ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＣＬ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＣＬ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＣＬ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＣＬ２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
ＣＤ７０は、分子の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である、サイトカインである。そのリガンドＣＤ２７が結合すると、ＣＤ７０は、細胞の増殖、生存および分化を促進する。ＣＤ７０の発現は、ある特定の腫瘍細胞に発現されるが、通常は活性化ＴおよびＢ細胞に限定され、ＣＤ２７との相互作用によって腫瘍細胞およびＴｒｅｇ細胞生存に関係づけられている。腫瘍細胞によるＣＤ７０の構成的発現は、抑制性Ｔｒｅｇの量を増加させることにより、Ｔ細胞アポトーシスの誘導により、およびＴ細胞をＴ細胞疲弊に偏らせることにより、免疫系の回避を可能にすると考えられる。ＣＤ７０の阻害は、腫瘍微小環境においてその免疫阻害効果を消失させうることが示されている。（CD70: An emerging target in cancer immunotherapy、Jacobsら；Pharmacology & Therapeutics、１５５巻、２０１５年１１月、１〜１０頁）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ７０および／またはＣＤ２７を阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＤ７０および／またはＣＤ２７に対する抗体、例えば、ＣＤ７０に対する単鎖抗体および／またはＣＤ２７に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ７０および／または抗ＣＤ２７抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ７０抗体および／または抗ＣＤ２７抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ７０抗体および／または抗ＣＤ２７抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ７０抗体および／または抗ＣＤ２７抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ７０抗体および／または抗ＣＤ２７抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
同様の機能を有する３つのＴＧＦ−βアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３）が哺乳動物に存在し、ＴＧＦ−β１は、免疫系で主として発現されるアイソフォームである。腫瘍細胞増殖および血管新生に対するその直接効果に加えて、ＴＧＦ−βは、腫瘍による免疫監視の回避を可能にする（例えば、Wrzesinskiら、Clin Cancer Res ２００７年９月１５日 １３巻；５２６２頁 Transforming Growth Factor-β and the Immune Response: Implications for Anticancer Therapyを参照）。多面的サイトカインとして、ＴＧＦ−βは、複数の免疫細胞型に対してその効果を発揮する。例えば、ＴＧＦ−βは、ＩＬ−２の産生を遮断することによって、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を遮断することができる。加えて、ＴＧＦ−βはまた、ＩＦＮ−γおよびパーフォリンなどのＣＤ８＋エフェクター分子の発現を阻害することによりＴ細胞エフェクター機能を制御し、そしてまたＴｒｅｇの生成を促進する。結局、ＴＧＦ−βは、分化樹状細胞の抗原提示機能を負に調節すると考えられる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＧＦ−βを阻害する抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＴＧＦ−βに対する中和抗体、例えば、ＴＧＦ−βに対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性（attacting）ケモカイン
ケモカインは、免疫細胞、例えば、免疫応答を活性化するもの、およびがん細胞アポトーシスを誘導するもの、の誘引および動員に非常に重要である。ケモカインの標的細胞は、ケモカインが結合して機能を媒介する、対応する受容体を発現する。それ故、ＣＣおよびＣＸＣケモカインの受容体は、それぞれ、ＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれる。ＣＣケモカインは、ＣＣケモカイン受容体と結合し、ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣケモカイン受容体と結合する。ほとんどの受容体は、通常は１つより多くのケモカインと結合し、ほとんどのケモカインは、通常は１つより多くの受容体と結合する。
ケモカインインターフェロン−γ誘導性タンパク質１０ｋＤａ（ＣＸＣＬ１０）は、ＣＸＣＲ３受容体と結合してその生物学的効果を発揮する、ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーである。ＣＸＣＬ１０は、走化性、アポトーシスの誘導、細胞成長の調節、および血管新生抑制効果の媒介に関与する。ＣＸＣＬ１０は、感染性疾患、慢性炎症、免疫不全、腫瘍発達、転移および播種を含む、様々なヒト疾患に関連する。より重要なこととして、ＣＸＣＬ１０は、疾患重症度を媒介する主要生物学的マーカーとして同定されており、様々な疾患の予後指標として利用されうる。この概説では、本発明者らは、がんの発病機序におけるＣＸＣＬ１０の新たな役割を解明する現行の研究に重点を置いている。疾患開始および進行におけるＣＸＣＬ１０の役割を理解することにより、関連ヒト悪性腫瘍についての可能性のあるバイオマーカーおよび治療標的としてＣＸＣＬ１０を開発するための基礎を得ることができる。
ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、主として、活性化Ｔリンパ球（Ｔｈ１）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、炎症性樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞上に発現される、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体である受容体、ＣＸＣＲ３を、各々が特異的に活性化する。インターフェロン誘導血管新生抑制性ＣＸＣケモカインおよびインターフェロン誘導性Ｔ細胞化学誘引物質（Ｉ−ＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１）も、ＣＸＣＲ３を活性化する。これらのＣＸＣケモカインは、優先的にＴｈ１リンパ球上に発現される。
免疫により媒介される組織特異的破壊は、Ｔｈ１分極、関連ケモカイン（ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５リガンド、例えば、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９）、および細胞傷害性機序の活性化に関連する遺伝子と、関連付けられている。他の研究により、がん、例えば、早期乳がん、結腸直腸、肺、肝細胞、卵巣および黒色腫における長い無病生存および全生存期間は、１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞関連因子、例えば、ＩＦＮ−ガンマ、シグナル伝達兼転写活性化因子１（ＳＴＡ１）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ調節因子１、転写因子Ｔ−ｂｅｔ、免疫エフェクターまたは細胞傷害性因子（グランザイム）、パーフォリン、およびグラニュライシン、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ６リガンドケモカイン（ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＣＬ５）、他のケモカイン（ＣＸＣＬ１およびＣＣＬ２）、ならびに接着分子（ＭＡＤＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１）の活性化に、一貫して関連することが示されている。化学誘引および接着は、腫瘍内免疫細胞の密度の決定に非常に重要な役割を果たすことが示されている。他の研究により、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１の上方調節は、処置応答性（特に、養子移入療法に応答性のもの）を予示することが示されている。さらに他の研究により、リンパ球による腫瘍浸潤を駆動するケモカインは、肝細胞癌を有する患者の生存期間を予示することが示されている。
がん進行が、がん細胞固有の因子と微小環境の因子の両方により調節されることは、今では認知されている。ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）および／または細胞傷害性Ｔ細胞の存在が、いくつかのがんにおいて再燃リスク低減と相関すること、ならびに炎症誘発性腫瘍微小環境が、肝細胞癌を有する患者のコホートにおいて生存期間延長と相関することは、実証されている。ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２発現は、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー細胞による腫瘍浸潤と相関することが示されている。データは、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２が、Ｔｈ１、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を腫瘍微小環境に誘引する主ケモカインであることを示す。また、ＣＸＣＬ１０およびＴＬＲ３（ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２を誘導する）発現は、がん細胞アポトーシスと相関する。
インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）または低分子誘導性サイトカインＢ１０としても公知のＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）は、ヒトにおいてＣＸＣＬ１０遺伝子にコードされている８．７ｋＤａタンパク質である。ＣＸＣＬ１０は、単球、内皮細胞および線維芽細胞を含むいくつかの細胞型によりＩＦＮ−γに応答して分泌されるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ１０は、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞の化学誘引、内皮細胞へのＴ細胞接着の促進、抗腫瘍活性、ならびに骨髄コロニー形成および血管新生の阻害を含む、いくつかの役割を果たす。このケモカインは、その効果を、細胞表面ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と結合することによって惹起する。
炎症誘発性条件下で、ＣＸＣＬ１０は、白血球、活性化好中球、好酸球、単球、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞（線維芽細胞）およびケラチノサイトなどの、様々な細胞から、ＩＦＮ−γに応答して分泌される。インターフェロン応答のこの極めて重要な調節因子は、活性化Ｔｈ１リンパ球を優先的に炎症のエリアに誘引し、その発現は、Ｔｈ１免疫応答と関連する。ＣＸＣＬ１０は、単球、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の化学誘引物質でもある。（Chewら、Gut、２０１２年、６１巻：４２７〜４３８頁）。さらに他の研究により、免疫防御シグネチャー遺伝子、例えば、Ｔｈ１型ケモカインＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、がんにおいて後成的にサイレンシングされうることが示されている。（Pengら、Nature、２０１５年、doi:10.1038/nature 15520）。
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）は、ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても公知であるＣＸＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ＩＦＮ−γにより誘導されるＴ細胞化学誘引物質（Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性ケモカイン）である。ＣＸＣＬ９は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１という２つの他のＣＸＣケモカインに密接に関連している。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１はすべて、それらの走化性機能を、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と相互作用することによって惹起する。
一部の実施形態では、操作された細菌は、Ｔｈ１／ＣＤ８誘引性（attacting）ケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＸＣＲ３リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＣＲ５リガンドケモカインである１つまたは複数のケモカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ１０を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ１０を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ１０を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ１０を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ１０を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ１０を分泌する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引することができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０に対して遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、Ｔ細胞の走化性を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい親和性によりＣＸＣＲ３と結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＣＸＣＲ３と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドまたはその断片もしくは機能性バリアントをコードする、遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子配列ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列は、配列番号１２０７または配列番号１２０８から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＣＸＣＬ１０をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグをコードする配列の１つまたは複数を除去してもよく、異なるタグで置換してもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０５もしくは配列番号１２０６から選択される配列と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＣＸＣＬ１０ポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるＣＸＣＬ１０ポリペプチドは、配列番号１２０５または配列番号１２０６から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＣＸＣＬ１０ポリペプチドをコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグを除去してもよく、異なる分泌タグで置換してもよい。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＣＸＣＬ１０回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０は、分泌される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０の産生のための遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５は、分泌される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥにおいて突然変異または欠失をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、トリプトファンの産生のための遺伝子配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、トリプトファンの産生のための遺伝子配列は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ａｒｏＧおよびＳｅｒＡから選択される。一部の実施形態では、ａｒｏＧは、ａｒｏＧのフィードバック耐性形態（ａｒｏＧｆｂｒ）である。一部の実施形態では、ｔｒｐＥは、ｔｒｐＥのフィードバック耐性形態（ｔｒｐＥｆｂｒ）である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＲにおいて突然変異または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｎａＡにおいて突然変異または欠失をさらに含む。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＸＣＬ９の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ９を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ９を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ９を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＸＣＬ９を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＸＣＬ９を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＸＣＬ９を分泌する。
一部の実施形態では、少なくとも約ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、活性化Ｔｈ１リンパ球を誘引する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく、Ｔ細胞の走化性を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、Ｔ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく、ＮＫ細胞の走化性を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の走化性を促進する。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい親和性によりＣＸＣＲ３と結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＣＸＣＲ３と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きい親和性で、ＣＸＣＲ３と結合することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＣＸＣＬ９回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＣＸＣＬ９をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
Ｔｈ２型サイトカインの阻害
サイトカインは、免疫系における生物学的作用の大部分に関与するホルモンメッセンジャーであり、機能的に、炎症性であるものと、本質的には抗炎症性だがアレルギー応答を促進するものという、２群に分けることができる。Ｔリンパ球は、主要なサイトカイン源である。Ｔリンパ球には２つの主要サブセットがあり、これらは、ＣＤ４およびＣＤ８として公知の細胞表面分子の存在によって区別される。ＣＤ４を発現するＴリンパ球は、ヘルパーＴ細胞としても公知であり、これらは、最も多産なサイトカイン産生物質と見なされている。このサブセットは、さらにＴｈ１およびＴｈ２に細分することができ、それらが産生するサイトカインは、Ｔｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインとして公知である。
Ｔｈ２細胞は、細胞外寄生虫、細菌、アレルゲンおよび毒素に対する液性、または抗体媒介、免疫応答の活性化および維持を媒介する。Ｔｈ２細胞は、強力な抗体産生、好酸球活性化、およびいくつかのマクロファージ機能の阻害に関与し、かくして食細胞非依存性防御応答をもたらす、様々なサイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５）を産生することにより、これらの機能を媒介する。Ｔｈ２型サイトカインがマクロファージをＭ２型（免疫抑制型マクロファージ）に分極させることも公知である。
一部の実施形態では、操作された細菌は、腫瘍におけるＴｈ２型サイトカインの産生を阻害する１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＴｈ２型サイトカイン阻害性回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、Ｔｈ２型サイトカイン阻害性回路をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、Ｔｈ２型サイトカイン阻害性回路をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、Ｔｈ２型サイトカイン阻害性回路をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
骨髄系由来サプレッサー細胞機能
累積証拠は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）が、Ｔ細胞抗腫瘍機能を抑制することおよび自然免疫応答をモジュレートすることによって、がん免疫回避に寄与することを示す。多くのがんにおいて、血液中のＭＤＳＣ数の増加は、後期および転移負荷と相関する。ＭＤＳＣは、担腫瘍マウスにおいて、ＣＤ１１ｂとＧｒ−１の同時発現を特徴とする未成熟骨髄性細胞の不均一集団を含み、成熟マクロファージおよび樹状細胞の特徴を欠く。ＭＤＳＣは、遺伝子発現プロファイルおよび免疫抑制活性が異なる２つの別個の亜集団、単球性ＭＤＳＣ（Ｍｏ−ＭＤＳＣ）と、顆粒球性（Ｇ）−ＭＤＳＣとしても公知の多形核（ＰＭＮ）−ＭＤＳＣとに、分けることができる（例えば、Chunら、CCL2 Promotes Colorectal Carcinogenesis by Enhancing Polymorphonuclear Myeloid-Derived Suppressor Cell Population and Function Cell Reports １２巻、２４４〜２５７頁に記載の通り）。これら２つのタイプのＭＤＳＣは、異なる手段によって免疫抑制を達成し、両方が、それらの免疫抑制活性のためにアルギナーゼ−１を使用するが、（ＰＭＮ）−ＭＤＳＣは、高レベルのＲＯＳを産生し、たとえあったとしても、わずかなＮＯしか産生しない一方で、Ｍｏ−ＭＤＳＣは、高レベルのＮＯを産生するが、たとえあったとしても、わずかなＲＯＳしか産生しない。がんにおけるＭＤＳＣの拡大増殖は、プロスタグランジン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉｌ−１７、ＰＧＥ２およびＴＮＦを含むがこれらに限定されない、可溶性がん由来サイトカインおよび成長因子によって、主として駆動される。ほとんどの場合、ＪＡＫ／Ｓｔａｔシグナル伝達は、Condamineら、2015 Annu Rev Med. ２０１５年１月１４日；６６巻：９７〜１１０頁．Regulation of Tumor Metastasis by Myeloid-derived Suppressor Cellsに概説されているように開始され、この参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＤＳＣ抑制の機序は、活性酸素種（ＲＯＳ）、Ａｒｇ−１、および一酸化窒素（ＮＯ）の生成を含む。加えて、最近の研究は、スーパーオキシドとＮＯの反応の結果として得られるペルオキシ亜硝酸（ＰＮＴ）が、Ｔ細胞受容体−ＣＤ８複合体のニトロ化を引き起こしうることを示す。これは、ペプチド結合クラスＩ ＭＨＣと会合するＴＣＲの能力を低減させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるがん細胞の認識を妨げる。さらに、腫瘍微小環境におけるＬ−アルギニンおよびシステインの枯渇加速は、ＣＤ３ζ鎖発現を低減させ、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生を減少させ、Ｔ細胞増殖を阻害することが示されている（Condamineら、２０１５年およびその中の参考文献）。いくつかの研究は、Ｍ−ＭＤＳＣが、様々な機序を使用してＴｒｅｇの分化および／または増殖を誘導することができることを示した（Condamineら、２０１５年およびその中の参考文献）。注目すべきことに、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、Ｔｒｅｇ分化を促進せず、ＴＧＦ−βにより誘導されるＴｒｅｇ生成または増殖を阻害することができた。ＭＤＳＣには、Ｔｒｅｇを腫瘍部位に動員する能力もあり、この能力は、ＣＣＲ５に依存する（Condamineら、２０１５年およびその中の参考文献）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるＭＤＳＣの活性化、産生、発達、分化、活性および／または遊走を阻害する抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍微小環境におけるＭＤＳＣの破壊を開始させる、促進する、または刺激する、抗がん分子を産生する。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、Ｉｌ−１７、ＰＧＥ２およびこれらの組合せから選択される１つまたは複数のサイトカインを阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。例えば、遺伝子操作された微生物は、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、Ｉｌ−１７、ＰＧＥ２およびこれらの組合せから選択されるサイトカインに対する抗体、例えば、これらのサイトカインの１つまたは複数に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化される、低酸素条件により活性化される、または炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、上記抗体の１つまたは複数、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、上記抗体の１つまたは複数、例えば、単鎖抗体を発現する。
食作用回避の阻害
ＣＤ４７−ＳＩＲＰα経路
がんには、腫瘍進行を促進するために、プログラム細胞死およびプログラム細胞除去の一部として誘導された内因性の「私を食べて」シグナルの回避を可能にするように「私を食べないで」シグナルを上方調節する能力がある。
ＣＤ４７は、細胞遊走ならびにＴ細胞および樹状細胞活性化に関与する細胞表面分子である。加えて、ＣＤ４７は、チロシンホスファターゼ活性化および食作用性シナプスの膜直下集合部位でのミオシン蓄積の阻害につながる、食細胞上に発現されるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のライゲーションによって、食作用のインヒビターとして機能する。結果として、ＣＤ４７は、「私を食べないでシグナル」を伝達する。ＣＤ４７の喪失は、加齢および損傷細胞の恒常的食作用に至る。
腫瘍が食作用の回避によって自然免疫系を回避することを可能にする、ＣＤ４７発現レベル上昇が、複数のヒト腫瘍型で観察される。このプロセスは、腫瘍細胞上のＣＤ４７が食細胞上のＳＩＲＰαと結合すること、その結果、食作用の阻害および腫瘍生存を促進することによって起こる。
抗ＣＤ４７抗体は、多くの異なるヒトがんに対する前臨床活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでも、マウス異種移植モデルにおいても明示している（Chaoら、Curr Opin Immunol．２０１２年４月；２４巻（２号）：２２５〜２３２頁．The CD47-SIRPα Pathway in Cancer Immune Evasion and Potential Therapeutic Implications、およびその中の参考文献）。ＣＤ４７に加えて、治療戦略としてＳＩＲＰαを標的とすることもでき、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与された抗ＳＩＲＰα抗体は、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を引き起こした（Chaoら、２０１２年）。
第３の手法では、ヒトＳＩＲＰαの単一１４ｋＤａ ＣＤ４７結合ドメイン（膜貫通タンパク質を有さない可溶性形態）をヒトＣＤ４７に対する競合的アンタゴニストとして使用する、ＣＤ４７標的療法が、開発されている（Weiskopfら、Engineered SIRPα variants as immunotherapeutic adjuvants to anti-cancer antibodies；Science．２０１３年７月５日；３４１巻（６１４１号）：10.1126/science.1238856に記載の通りであり、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。野生型ＳＩＲＰαは、ＣＤ４７に対して比較的低い親和性を示したため、突然変異ＳＩＲＰαが酵母表面提示によるｉｎ ｖｉｔｒｏ進化によって生成され、それらは、ＣＤ４７の強力な結合剤およびアンタゴニストとして作用することが示された。これらのバリアントは、ＣＶ１（コンセンサスバリアント１）および高親和性バリアントＦＤ６、ならびにこれらのバリアントのＦｃ融合タンパク質を含む。親和性増加につながるアミノ酸変化は、ヒトＳＩＲＰαのｄ１ドメインに位置する。ＳＩＲＰアルファバリアントの非限定的な例は、ＷＯ／２０１３／１０９７５２にも記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４７を阻害する、および／またはＳＩＲＰαを阻害する、および／またはＣＤ４７とマクロファージに発現されたＳＩＲＰαとの相互作用を阻害もしくは防止する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。例えば、遺伝子操作された微生物は、ＣＤ４７に対する抗体および／またはＳＩＲＰαに対する抗体、例えば、ＣＤ４７に対する単鎖抗体および／またはＳＩＲＰαに対する単鎖抗体をコードしうる。別の非限定的な例では、遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインを含む競合的アンタゴニストポリペプチドをコードしうる。そのような競合的アンタゴニストポリペプチドは、ＣＤ４７の競合的結合によって機能して、ＣＤ４７とマクロファージ上に発現されたＳＩＲＰαとの相互作用を防止することができる。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドは、可溶性であり、例えば、微生物から分泌される。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドは、微生物の表面に提示される。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの野生型形態をコードする。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、ＳＩＲＰアルファＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態をコードする。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、バリアント形態は、ＦＤ６バリアントである。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、Weiskopfら、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載のバリアントである。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインまたはそのバリアントをコードする。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインの野生型形態をコードする。非限定的な例では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、野生型ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、競合的アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子操作された微生物は、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰアルファＣＤ４７結合ドメインの突然変異またはバリアント形態をコードする。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているバリアント形態は、ＣＶ１ ＳＩＲＰαバリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているバリアント形態は、Ｆ６バリアントである。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドと融合されているＳＩＲＰαバリアントは、Weiskopfら、および／または国際特許出願公開ＷＯ／２０１３／１０９７５２に記載のバリアントである。非限定的な例では、バリアントＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃ部分である。一部の実施形態では、バリアントＳＩＲＰアルファＣＤ４７結合ドメインポリペプチドと融合されている安定化ポリペプチドは、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性を向上させるように突然変異されたもの）を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＤ４７抗体および／または抗ＳＩＲＰα抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下の、競合的アンタゴニストＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメイン（ＷＴ、またはＣＤ４７親和性が向上された突然変異バリアント）をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された微生物は、Ｆｃ媒介機能、例えばＡＤＣＣ、ならびに／またはＭ−ＣＳＦおよび／もしくはＧＭ−ＣＳＦを刺激することができ、その結果、食作用阻害を遮断することになる、１つまたは複数の抗がん分子を産生することもできる。
遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の阻害または防止のための、任意の適する抗ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体または競合的ＳＩＲＰαＣＤ４７結合ドメインポリペプチド（野生型、またはＣＤ４７結合親和性が向上された突然変異バリアント）をコードする、１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の実施形態では、抗体または競合的ポリペプチドは、例えば、安定性を増強させ、ＣＤ４７拮抗作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、抗体または競合的ポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、抗体または競合的ポリペプチドを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｂ６Ｈ１２−抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９４からなるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、５Ｆ９−抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９６からなるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳをコードする抗ＣＤ４７遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、遺伝子配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子配列は、非コード領域とタグをコードする配列とを除く、配列番号９９３および配列番号９９５から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有するＳＩＲＰアルファポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有するＳＩＲＰアルファポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するＳＩＲＰアルファポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９、配列番号１１２０から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＳＩＲＰアルファポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＳＩＲＰアルファポリペプチドは、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９および配列番号１１２０から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１１１８、配列番号１２３１、配列番号１１１９および配列番号１１２０から選択される配列からなる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌する。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファ、ＳＩＲＰアルファバリアント（例えば、ＣＶ１もしくはＦＤ６バリアント）、またはＳＩＲＰアルファ融合タンパク質（例えば、ＳＩＲＰアルファ ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質）を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく増加させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌する。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく増大させることができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく増大させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍細胞の食作用を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きく増大させる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症、または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管または腫瘍内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／または他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
ホスファチジルセリン外在化
細胞膜の外面へのホスファチジルセリン（ＰＳ）の再分布は、細胞に、食細胞によるそれらの認識、食作用および最終的な分解（エフェロサイトーシス）を警告する。さらに、ＰＳ発現細胞と免疫細胞との相互作用は、局所免疫活性化と全身性免疫活性化の両方を防止する免疫抑制経路を誘発する。これらの経路は、「自己」に対する潜在的免疫継続を止めるためにアポトーシス細胞により使用されるが、これらの同じ経路が、免疫応答を回避するために腫瘍によって乗っ取られる。
ＰＳは、がんの際に異常調節され、ＰＳ受容体の上方調節に伴って腫瘍微小環境に強力な免疫抑制をもたらす。腫瘍微小環境における炎症誘発性の適応免疫応答は、数種類のＰＳ発現未成熟腫瘍脈管構造、腫瘍由来エキソソーム、および腫瘍細胞によって抑制される。さらに、ＰＳ発現細胞に結合して取り込む腫瘍内ＤＣは、最適な機能的抗原提示およびＴ細胞応答活性化に必要とされる共刺激分子の発現を妨げる未成熟表現型のままである。受容体のＴＡＭおよびＴＩＭファミリーを含む、ＰＳ受容体は、浸潤する骨髄系由来細胞上で発現され、そこでそれらは炎症性シグナル伝達に従って組織恒常性を促進するように機能する。腫瘍微小環境では、これらの受容体は、ＰＳまたはＰＳ架橋分子と会合し、その結果、免疫抑制性サイトカインが発現され、生産性抗腫瘍免疫応答が妨げられることになる。
アネキシンＡ５（ＡｎｘＡ５）または他のＰＳリガンド、ＰＳを標的とする抗体、ならびにＰＳ受容体を標的とする薬剤の全身投与は、腫瘍進行を緩徐化することが示されている（Birgeら、Cell Death and Differentiation advance online publication ２６巻 ２０１６年２月：doi: 10.1038/cdd.2016.11 Phosphatidylserine is a global immunosuppressive signal in efferocytosis, infectious disease, and cancerに概説されている）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＳを阻害するおよび／またはＰＳ受容体を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＰＳに対する抗体および／またはＰＳ受容体に対する抗体、例えば、ＰＳに対する単鎖抗体および／またはＰＳ受容体に対する単鎖抗体をコードしうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＰＳ抗体および／または抗ＰＳ受容体抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＳ抗体および／または抗ＰＳ受容抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＰＳ抗体および／または抗ＰＳ受容体抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＳ受容体を介したＰＳシグナル伝達を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生し、例えば、遺伝子操作された微生物は、ＰＳ受容体アンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＰ５リガンドをコードしうる。ある特定の実施形態では、Ｐ５受容体アンタゴニストは、アネキシンＡ５である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンタゴニストＰ５リガンドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アンタゴニストＰ５リガンドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アンタゴニストＰ５リガンドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、Ｐ５受容体のアンタゴニストリガンドおよび／または抗ＰＳ抗体および／または抗ＰＳ受容体抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、Ｐ５受容体のアンタゴニストリガンドおよび／または抗ＰＳ抗体および／または抗ＰＳ受容体抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
免疫抑制および血管新生およびハイポキシア／ＨＩＦ調節
腫瘍は、進行するために血液供給を確立しなければならないので、新血管形成は、腫瘍発達に非常に重要である。血管新生は、腫瘍新血管形成における最も重要なステップである。血管新生プロセスは、内皮細胞活性化を促進または阻害する多数の因子によって調節される。血管新生促進因子は、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、およびＡＮＧファミリーメンバーを含む。血管新生抑制分子は、トロンボスポンジン−１、エンドスタチンおよびタムスタチン、ならびにある特定のＣＸＣＬケモカインを含む。腫瘍血管新生中の異常調節は、血管新生促進因子の過剰存在量をもたらし、その結果、内皮の出芽および拡大増殖が阻害されなくなる。そのような芽が出会い、吻合すると、新たな血管が生じ、その後、血管は、基底膜の形成、および壁細胞の動員を安定させる。
免疫細胞は、肝要な血管新生促進性役割を果たすこと、および診療所での血管新生インヒビターに対する一時的な応答に少なくともある程度関与することが、明らかになった（RiveraおよびBergers、Trends Immunol．２０１５年４月；３６巻（４号）：２４０〜９頁．Intertwined regulation of angiogenesis and immunity by myeloid cells）。低酸素腫瘍は、多数のサイトカインおよび成長因子の分泌によって、いくつかの自然免疫細胞集団の動員および浸潤を駆動する。例えば、腫瘍由来ＶＥＧＦ、ＣＳＦ−１、ＭＣＰ−１およびＳＤＦ１αは、マクロファージ、Ｇ−ＭＤＳＣおよびＭｏ−ＭＤＳＣを動員し、ＣＸＣＬ２は、血管新生性好中球および単球を動員し、ＡＮＧ２は、血管新生性ＴＩＥ２発現単球／マクロファージ（ＴＥＭ）を動員する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１アルファ、ガレクチン、ニューロピリン（Neutropilin）およびＴｉｅ２のうちの１つまたは複数の活性を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する、操作された微生物を提供する。
腫瘍細胞により分泌されるさらなるサイトカインは、ＩＬ−４およびＩＬ−６を含み、これらは、浸潤する単球の血管新生性および免疫抑制性マクロファージへの分化を誘導する。腫瘍微小環境に動員されると、ＭＤＳＣ、ＴＡＭ、ＴＥＭおよび好中球は、隔離された血管新生因子を分泌または遊離し、血管新生因子のうち最も多くみられるのはＶＥＧＦである。ＶＥＧＦの血管新生促進活性は、主として、内皮細胞上のＶＥＧＦＲ２とのその相互作用によって引き起こされる。加えて、ＶＥＧＦが複数の機序によって多数の異なる種類の免疫細胞を阻害することも公知である。例えば、ＶＥＧＦは、ＣＤ３４＋造血前駆細胞上のＶＥＧＦＲ１と結合し、ＮＦ−κＢシグナル伝達の阻害によって成熟樹状細胞への分化を阻害し、その結果、抗原提示不全に至る（OyamaらJ. Immunol.、１６０巻（１９９８年）、１２２４〜１２３２頁；Vascular endothelial growth factor affects dendritic cell maturation through the inhibition of nuclear factor-kappa B activation in hemopoietic progenitor cells）。加えて、ＶＥＧＦはまた、樹状細胞上でのプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）発現を誘導して、Ｔ細胞活性化を阻害し、自己免疫寛容を促進する。さらに、ＶＥＧＦは、Ｔ細胞接着を血管の管腔表面に制限することによりＴ細胞血管外遊出を妨げ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増殖および細胞傷害性を阻害し、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を刺激する（例えば、Motzら、Nat. Rev. Immunol.、１１巻（２０１１年）、７０２〜７１１頁；The parallel lives of angiogenesis and immunosuppression: cancer and other talesに概説されている）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＶＥＧＦを阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＥＧＦ抗体を発現する。例示的抗ＶＥＧＦ：重鎖および軽鎖は、配列番号１２４および１２５を含む。
ＨＩＦ−１−アルファとしても公知のハイポキシア誘導因子１−アルファは、ＨＩＦ１Ａ遺伝子によりコードされているヘテロ二量体転写因子ハイポキシア誘導因子１（ＨＩＦ−１）のサブユニットである。ＨＩＦ−１が、低酸素領域への酸素送達の促進および増加を支援する６０個より多くの遺伝子の転写を誘導することは公知であり、そのような遺伝子には、血管新生および赤血球生成に関与するＶＥＧＦおよびエリスロポエチンが含まれる。ＨＩＦ−１は、細胞増殖および生存はもちろんグルコースおよび鉄代謝にも関与する遺伝子の転写も誘導する。ＨＩＦ−１は、立体構造変化を受けることによって全身酸素レベルに応答し、ハイポキシア応答遺伝子のプロモーターのＨＲＥ領域と会合して転写を誘導する。
腫瘍微小環境内のハイポキシアは、血管新生の肝要な調節因子である。この調節は、転写因子のハイポキシア誘導因子（ＨＩＦ）ファミリーにより媒介される。ＨＩＦは、とりわけ、低酸素への代謝および血管の適応を調整する。ＨＩＦ安定化は、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦおよびＡＮＧ２をはじめとする様々な血管新生促進性成長因子およびケモカインの上方調節につながり、これに直接起因して、血管成長はもちろん、骨髄由来の骨髄性細胞の動員も生じることになる（C. Murdochら、Blood、１０４巻（２００４年）、２２２４〜２２３４頁；Mechanisms regulating the recruitment of macrophages into hypoxic areas of tumors and other ischemic tissues）。ＨＩＦにより誘導されたＶＥＧＦは、内皮細胞を活性化し、骨髄性細胞を誘引して、これらの細胞の血管新生特性を促進する（Avraham-Davidiら；J. Exp.Med.、２１０巻（２０１３年）、２６１１〜２６２５頁）。ＨＩＦ−１アルファもまた、Ｔｒｅｇ転写の主調節因子であるＦｏｘＰ３を誘導する。ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、その発現をＨＩＦ−１α活性化感受性にする推定ハイポキシア応答エレメントをそのプロモーター内に含有する（Clambeyら、Proc.Natl. Acad. Sci.U.S.A.、１０９巻（２０１２年）、Ｅ２７８４〜Ｅ２７９３頁；Hypoxia-inducible factor-1 alpha-dependent induction of FoxP3 drives regulatory T-cell abundance and function during inflammatory hypoxia of the mucosa）。
ＨＩＦ−１は、多くのヒトがんにおいて過剰発現される。ＨＩＦ−１過剰発現は、ハイポキシアを克服するための血管新生の開始および細胞代謝の調節におけるその役割によって、腫瘍成長および転移の促進に大きく関与する。有意なＨＩＦ−１発現が、結腸がん、乳がん、膵がん、腎がん、前立腺がん、卵巣がん、脳がんおよび膀胱がんを含む、研究されたほとんどの固形腫瘍において認められている。臨床的に、子宮頚がん、非小細胞肺癌、乳がん（ＬＶ陽性および陰性）、乏突起神経膠腫、中咽頭、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、頭頸部がんおよび胃がんを含む、多数のがんにおけるＨＩＦ−１ａレベルの上昇は、侵襲性腫瘍進行と関連付けられている。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＨＩＦ、例えば、ＨＩＦ−１を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＨＩＦ−１抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＨＩＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で抗ＨＩＦ抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＨＩＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＨＩＦ抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＨＩＦ抗体は、抗ＨＩＦ−１抗体である。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＨＩＦ抗体は、抗ＨＩＦ１−アルファ（抗ＨＩＦ−１α抗体）である。
セマフォリン３Ａ（ＳＥＭＡ３Ａ）は、マクロファージ動員およびその後の血管新生に関与する、腫瘍におけるもう１つのハイポキシア誘導性因子である。ＳＥＭＡ３Ａは、ＴＡＭ上の膜貫通型ガイダンスタンパク質ニューロピリン１（ＮＲＰ１）と相互作用し、その結果、ＶＥＧＦＲ１活性化、および低酸素腫瘍微小環境への遊走に至る（RiveraおよびBergers、２０１５年）。到着すると、ＮＲＰ１は、もはや発現されず、その結果、それらの遊走性表現型が失われることになる。すると、ＴＡＭは、血管新生性で免疫抑制性の表現型に再プログラミングされ、ＡＲＧ１、ＣＣＬ２２、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＳＥＭＡ３ＡおよびＭＭＰ−９を含む、免疫抑制因子および血管新生促進因子を産生する（A. Casazzaら、Cancer Cell、２４巻（２０１３年）、６９５〜７０９頁 Impeding macrophage entry into hypoxic tumor areas by Sema3A/Nrp1 signaling blockade inhibits angiogenesis and restores antitumor immunity）。ニューロピリン−１（ＮＲＰ１）およびニューロピリン−２（ＮＲＰ２）受容体は、膜貫通糖タンパク質であり、主としてセマフォリンの共受容体であり、一部の形態の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の受容体としても機能する。例えば、ＶＥＧＦ１６５は、ＮＲＰ１およびＮＲＰ２の両方と結合する。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、および／またはセマフォリン３Ａを阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＮＲＰ１抗体および／または抗ＮＲＰ２抗体および／または抗セマフォリン３Ａ抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＮＲＰ１抗体および／または抗ＮＲＰ２抗体および／または抗セマフォリン３Ａ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＮＲＰ１抗体および／または抗ＮＲＰ２抗体および／または抗セマフォリン３Ａ抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＮＲＰ１抗体および／または抗ＮＲＰ２抗体および／または抗セマフォリン３Ａ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＮＲＰ１抗体および／または抗ＮＲＰ２抗体および／または抗セマフォリン３Ａ抗体、例えば単鎖抗体を発現する。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、抗ＮＲＰ１抗体である。
加えて、ＨＩＦ−１αは、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１α）およびその受容体ＣＸＣＲ４を誘導し、ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４の両方が、骨髄性細胞の保持に関与する。最近の研究は、がん始原細胞（またはがん幹細胞）の維持、播種およびその後の転移コロニー形成におけるケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の役割についての強力な証拠を提供する（Gilら、J Immunol.２０１４年；１９３巻（１０号）：５３２７〜３７頁；CXCL12/CXCR4 blockade by oncolytic virotherapy inhibits ovarian cancer growth by decreasing immunosuppression and targeting cancer-initiating cells、およびその中の参考文献）。卵巣がんでは、ＣＸＣＬ１２は、細胞外基質経由での卵巣がん細胞遊走および浸潤を刺激することができるので、ＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４軸により媒介されるシグナルが、中心的に進行に関与する。腫瘍組織および周囲の間質により産生されるＣＸＣＬ１２は、ＶＥＧＦ媒介血管新生、および骨髄からの内皮前駆細胞の動員を刺激する（Gilら、およびその中の参考文献）。ＣＸＣＬ１２が腫瘍部位において抑制性骨髄性細胞および樹状細胞を動員し、腫瘍内Ｔｒｅｇ局在化を誘導することも示された（Gilら、およびその中の参考文献）。Gilらによって記載された研究では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＶＶ）、腫瘍の転移拡散、および卵巣がんモデルにおいて単独での腫瘍溶解と比較して向上された全生存期間（Gilら、J Immunol. ２０１４年、１５；１９３巻（１０号）：５３２７〜３７頁；CXCL12/CXCR4 blockade by oncolytic virotherapy inhibits ovarian cancer growth by decreasing immunosuppression and targeting cancer-initiating cells）。がん細胞におけるこの受容体の発現は、高濃度のＣＸＣＬ１２を含有する組織、例えば、肺、肝臓および骨髄への転移に関連付けられている。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２受容体／リガンド結合を阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。したがって、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＲ４および／またはＣＸＣＬ１２を阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＸＣＲ４抗体（アンタゴニスト）および／または抗ＣＸＣＬ１２抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＸＣＲ４抗体（アンタゴニスト）および／または抗ＣＸＣＬ１２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＣＸＣＲ４抗体（アンタゴニスト）および／または抗ＣＸＣＬ１２抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＸＣＲ４抗体（アンタゴニスト）および／または抗ＣＸＣＬ１２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＣＸＣＲ４抗体（アンタゴニスト）および／または抗ＣＸＣＬ１２抗体、例えば単鎖抗体を発現する。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、抗ＮＲＰ１抗体である。
少なくとも１５のβ−ガラクトシド結合タンパク質のファミリーである、ガレクチンは、成長発達はもちろん、がん進行および転移にも関与する。ガレクチンは、プロトタイプ、キメラタイプ、およびタンデムリピートタイプの３タイプに分類される。プロトタイプガレクチン（ガレクチン−１、−２、−５、−７、−１０、−１１、−１３、−１４、および−１５）は、１サブユニット当たり１つの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する。タンデムリピートタイプガレクチン（例えば、ガレクチン−４、−６、−８、−９、および−１２）は、リンカーペプチドによって連結された２つのＣＲＤを含有する。このファミリーの最も多く研究されているメンバーであるガレクチン−３は、Ｃ末端に１つのＣＲＤを有する、キメラタイプガレクチンの唯一の代表である。ガレクチン−３は、多くの腫瘍において発現され、腫瘍進行に重要な役割を果たす可能性がある。最近の研究により、ガレクチン−３は、とりわけ、免疫抑制特性を有することがあること、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することができること、またはＴ細胞機能不全の原因となることが明らかになった（例えば、Ahmedら、Clin.Med. Insights Oncol. ２０１５年；９巻；１１３〜１２１頁；Galectin-3 as a Potential Target to Prevent Cancer Metastasisを参照されたい）。細胞表面糖タンパク質、例えば、ＣＤ２９、ＣＤ７、ＣＤ９５、ＣＤ９８、およびＴ細胞受容体は、ガレクチン−３と会合し、これにより、細胞外ガレクチン−３によるアポトーシスの誘導が媒介されうることが示されている。例えば、細胞外ガレクチン−３は、ＣＤ２９／ＣＤ７複合体と結合し、これにより、細胞内アポトーシスシグナル伝達カスケードの活性化が誘発され、続いて、ミトコンドリアシトクロムｃが放出され、カスパーゼ−３が活性化される（Ahmedら、およびその中の参考文献を参照されたい）。加えて、いくつかの研究は、ガレクチン−３が、多くのがんにおいて腫瘍血管新生および転移を促進することを示唆する。ガレクチン−３発現を妨害することで、ＴＧＦβ１誘導ＴＡＭからのＶＥＧＦ分泌を低減させることにより腫瘍の血管新生を妨げることができた（Machadoら、Cancer Med．２０１４年４月；３巻（２号）：２０１〜１４頁．Galectin-3 disruption impaired tumoral angiogenesis by reducing VEGF secretion from TGFβ1-induced macrophages）。ガレクチン−１は、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の細胞表面滞留を延長し、ＶＥＧＦ非依存性血管新生を刺激する。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ガレクチン−３および／またはガレクチン−１を阻害する、１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ガレクチン−３抗体および／または抗ガレクチン−１抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で抗ガレクチン−３抗体および／または抗ガレクチン−１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ガレクチン−３抗体および／または抗ガレクチン−１抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ガレクチン−３抗体および／または抗ガレクチン−１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ガレクチン−３抗体および／または抗ガレクチン−１抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
ＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２は、アンジオポエチン、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４に結合し、それらによって活性化される、細胞表面受容体を含む。アンジオポエチンは、血管の形成（血管新生）に必要なタンパク質成長因子である。Ａｎｇ１およびＡｎｇ４は、Ｔｉｅ２のアゴニストリガンドまたは活性化リガンドとして機能し、Ａｎｇ２およびＡｎｇ３は、競合的アンタゴニストとして挙動する。ＴＩＥ２発現単球／マクロファージ（ＴＥＭ）は、アンジオポエチン受容体ＴＩＥ２を発現する高血管新生性で免疫抑制性の腫瘍浸潤マクロファージ亜集団であり、多くの場合、ＴＩＥ２リガンドＡＮＧ２（ＴＩＥ２が、ＡＮＧ１を結合させて、血管を安定させる結果となることもあり、またはＴＩＥ２が、安定化を妨害する結果となることもある）の内皮細胞発現によって血管と並んで存在する。ＴＥＭの免疫抑制効果は、Ｔ細胞活性化を阻害し、かつＴｒｅｇの拡大増殖を刺激するＩＬ−１０を分泌する、それらの能力の結果として生じる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｔｉｅ−２を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗Ｔｉｅ−２抗体および／または抗Ａｎｇ１抗体および／または抗Ａｎｇ４抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ｔｉｅ−２抗体および／または抗Ａｎｇ１抗体および／または抗Ａｎｇ４抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗Ｔｉｅ−２抗体および／または抗Ａｎｇ１抗体および／または抗Ａｎｇ４抗体、例えば単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ｔｉｅ−２抗体および／または抗Ａｎｇ１抗体および／または抗Ａｎｇ４抗体、例えば単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗Ｔｉｅ−２抗体および／または抗Ａｎｇ１抗体および／または抗Ａｎｇ４抗体、例えば単鎖抗体を発現する。
ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦ誘導突然変異誘発および透過性において最も重要な受容体であるようである。血管新生中の受容体活性化は、内皮細胞による血小板活性化因子（ＰＡＦ）の産生を誘導し、有糸分裂および遊走を刺激し、血管透過性を増大させる。ＰＡＦは、酸性線維芽細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、およびマクロファージ炎症性タンパク質２を含む、強力な血管新生因子およびケモカインの発現を促進する（Hoebenら、Pharmacological Reviews ５６巻４号５４９〜５８０頁；Vascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis）。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＶＥＧＦＲ−２を阻害する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体、例えば、単鎖抗体を発現する。
間質モジュレーション
多くの場合、腫瘍微小環境、または間質は、腫瘍塊の大部分を占める。腫瘍微小環境、または間質は、細胞外基質成分と、線維芽細胞、血管細胞および免疫細胞をはじめとする非新生物細胞との動的取合せからなり、その組成は、様々な疾患発症段階で変わることが多い。例えば、一部の間質は、非常に不均一であり、細胞および非細胞成分を含み、そのような細胞および非細胞成分には、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、星状細胞、免疫細胞、血管、細胞外基質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、およびヒアルロン酸、触媒活性酵素、プロテイナーゼ）、ならびに可溶性タンパク質、例えばサイトカインおよび成長因子が含まれる。間質によってがん細胞に及ぼされる多様な影響、および間質中の細胞間の複雑な「クロストーク」（細胞：細胞および細胞：基質相互作用）は、処置の成功または失敗に有意な影響を与える。多くの場合、間質は、局所浸潤、腫瘍成長を支持し、遠位転移を促進し、より高い腫瘍悪性度をもたらし、同時に、薬物送達に対する物理的バリアとしての機能を果たし、したがって、結果的に全生存期間不良となる。したがって、間質組成または機能を変更する分子および方法（例えば、腫瘍間質の酵素的リモデリング）は、処置戦略において重要な役割を果たしうる。例えば、膵管腺癌（ＰＤＡ）は、間質を最も多く含むがんの１つであり、通常は、間質成分の数のほうが、がん細胞より多い。
細胞外基質（ＥＣＭ）成分の蓄積は、腫瘍および間質組織の正常な構造を変形させ、これが血管およびリンパ管の異常な形状の原因となる。腫瘍の治療抵抗性に寄与しうる１つの要因は、血管を有意に圧迫するＥＣＭの剛性であり、この圧迫の結果として（拡散および対流に対する制約に起因して）灌流が低減されることになり、この低減により、最終的に腫瘍細胞への治療薬の送達が妨げられる。間質における血管圧迫を低減させて薬物送達を支援する１つの戦略は、一部の間質腫瘍環境における豊富なヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を有する高密度の複雑なＥＣＭ中に埋め込まれた線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞からなるＥＣＭ足場の酵素的破壊である。ＨＡは、その高いコロイド浸透圧に起因して水を保持する、反復Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸ユニットで構成されている大きな直鎖状グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。ＨＡは、特に、胚発生および発癌などの動的プロセス中の、組織の構造、完全性および順応性の維持に重要な役割を果たす。ＨＡは、腫瘍間質形成に関与すると考えられている。ＨＡ中の水の保持は、健常臓器における結合組織に弾力を与えるが、ＨＡが、多くの固形腫瘍、例えば、ＰＤＡ、前立腺、結腸、乳房、胃、卵巣および膵臓の腫瘍でのように、過度に蓄積すると、間質液圧を上昇させ、血管を圧迫する。例えば、ＰＤＡにおける間質液圧は、それぞれ４０〜８０ｍｍＨｇおよび１５〜４０ｍｍＨｇの正常な細動脈および毛細血管圧と比較して、７５〜１３０ｍｍＨｇであることが観察されている。ＨＡは、張力がかかっているコラーゲン線維をつなぎとめるのに寄与することによって剛性を維持すると考えられる。
ヒアルロニダーゼ（ＰＥＧＰＨ２０；ｒＨｕＰＨ２０）による酵素的ＨＡ分解は、マウス膵管腺癌（ＰＤＡ）腫瘍において間質液圧を低下させ、血管開存性、薬物送達および生存が同時に観察されることが示されている（Provenzanoら、Cancer Cell、２０１２年、２１巻：４１８〜４２９頁；Thompsonら、Mol Cancer Ther、２０１０年、９巻：３０５２〜６４頁）。ＰＥＧＰＨ２０は、伸長ポリマーを切断して置換ユニットにすることによって、ＨＡと結合している水を遊離させると考えられている。捕捉された水の放出は、２０〜３０ｍｍＨｇの範囲に間質液圧を低下させ、これにより、潰れた細動脈および毛細血管の開放が可能になる（Provenzanoら）。
一部の実施形態では、操作された細菌は、間質をモジュレートする１つまたは複数の分子をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）を分解する酵素の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒアルロニダーゼの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いヒアルロニダーゼを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いヒアルロニダーゼを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いヒアルロニダーゼを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ヒアルロニダーゼを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いヒアルロナンを分解する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いヒアルロナンを分解する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いヒアルロナンを分解する。一実施形態では、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ濃度の組換えヒアルロニダーゼとほぼ同程度にヒアルロナンを分解することができる。
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片をコードするヒアルロニダーゼ遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリペプチドを含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリペプチドからなる。ある特定の実施形態では、ヒアルロニダーゼ配列は、配列番号１１２２、配列番号１１２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数の配列を含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１１２７、配列番号１１２８、配列番号１１２９、配列番号１１３０、配列番号１１３１から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ヒトヒアルロニダーゼの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼは、ヒルヒアルロニダーゼである。これらの実施形態のいずれにおいても、ヒアルロニダーゼを含む遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグをさらにコードする。一部の実施形態では、分泌タグは、ヒアルロニダーゼポリペプチド配列のＮ末端に、かつヒアルロニダーゼコード配列の５’末端にある。一部の実施形態では、分泌タグは、ヒアルロニダーゼポリペプチド配列のＣ末端に、かつヒアルロニダーゼコード配列の３’末端にある。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌細胞表面への提示のためのヒアルロニダーゼをコードする。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の間質モジュレーション回路または遺伝子配列のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ回路を発現することができる。一部の実施形態では、間質モジュレーション回路、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をコードする遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の間質モジュレーション遺伝子配列のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ遺伝子配列は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の間質モジュレーション回路のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、アデノシンの消費のための遺伝子配列は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、アデノシンの消費のための遺伝子配列は、アデノシンを移入するための輸送体をコードする。一部の実施形態では、輸送体をコードする遺伝子配列は、ｎｕｐＣを含む。一部の実施形態では、輸送体をコードする遺伝子配列は、ｎｕｐＧを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、分泌される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面に提示される。
自然免疫応答の活性化
細胞溶解性ペプチド
本開示の細菌それら自体が、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの存在に起因して腫瘍部位で細胞溶解をもたらすことになり、これにより、自然免疫応答が発動されることになる。加えて、一部の細菌は、腫瘍細胞を溶解する能力がある細胞溶解性の微生物であるという追加の特徴を有する。したがって、一部の実施形態では、操作された微生物は、天然またはネイティブ細胞溶解性ペプチドを産生する。一部の実施形態では、腫瘍部位に送達されると局所的に腫瘍微小環境内のがんまたは腫瘍細胞を溶解する能力がある１つまたは複数の細胞傷害性分子、例えば細胞溶解性ペプチドを産生するように、細菌をさらに操作することができる。細胞が溶解すると、腫瘍細胞は、適応免疫応答を促進するのに役立つ腫瘍関連抗原を放出する。ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの存在は、樹状細胞などの抗原提示細胞の成熟を促進し、これにより、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答が活性化される。したがって、腫瘍部位への細胞溶解性ペプチドの送達は、局所的に腫瘍細胞を死滅させるのに役立つばかりでなく、腫瘍関連抗原およびネオ抗原を抗原提示細胞に曝露して、免疫媒介抗腫瘍応答をもたらすことにもなる。炎症誘発性環境の状況下で局所ＡＰＣはそのようなネオ抗原を取り込むことができ、これにより、ネオ抗原に対する免疫応答が誘発されて、細菌にもウイルスにも曝露されない遠位がん細胞を含む、抗原発現がん細胞を死滅させることができる。例示的細胞溶解性ペプチドは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、１つまたは複数の細胞毒を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、１つまたは複数の細胞溶解性ペプチド分子、例えば、本明細書で提供される細胞毒および細胞溶解性ペプチドのいずれかを産生することができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒および／または細胞溶解性ペプチド、例えば、本明細書で提供されるペプチドの１つまたは複数を産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒および／または細胞溶解性ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、１つもしくは複数の細胞毒および／または１つもしくは複数の細胞溶解性ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、１つもしくは複数の細胞毒および／または１つもしくは複数の細胞溶解性ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つもしくは複数の細胞毒および／または１つもしくは複数の細胞溶解性ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、１つもしくは複数の細胞毒および／または１つもしくは複数の細胞溶解性ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチドは、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、細胞溶解性ペプチドまたは毒性ペプチド遺伝子は、配列番号１０４〜１０７および配列番号１２６〜１５１の１つまたは複数から選択される配列からなる。
ＳＴＩＮＧアゴニスト
膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、インターフェロン調節因子３活性化メディエーター（ＭＩＴＡ）、ＭＰＹＳ、または小胞体インターフェロン刺激因子（ＥＲＩＳ）としても公知の、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、主としてマクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、内皮細胞、ならびにある特定の線維芽細胞および上皮細胞に発現される、二量体タンパク質である。ＳＴＩＮＧは、自然免疫応答に重要な役割を果たす−ＳＴＩＮＧを欠くマウスは、様々な微小生物への曝露後に生存可能であるが、致死性感染に罹りやすい。ＳＴＩＮＧは、サイトゾルサイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）の形態の二次メッセンジャーのサイトゾル受容体として機能する。ＣＤＮによって刺激されると、ＳＴＩＮＧは、ＴＢＫ１／ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）、ＮＦ−κＢ、およびＳＴＡＴ６シグナル伝達経路を活性化し、そしてそれによってＩ型インターフェロンおよび炎症性サイトカイン応答を促進する。ＣＤＮは、正規のサイクリックジＧＭＰ（ｃ［Ｇ（３０−５０）ｐＧ（３０−５０）ｐ］）またはサイクリックジＡＭＰまたはサイクリックＧＡＭＰ（ｃＧＭＰ−ＡＭＰ）を含む（Barber、STING-dependent cytosolic DNA sensing pathways; Trends Immunol．２０１４年２月：３５巻（２号）：８８〜９３頁）。
ＣＤＮは、外因性に（すなわち、細菌によって）産生されることもあり、および／または内因性に（すなわち、ｄｓＤＮＡへの曝露時に宿主酵素により宿主内で）産生されることもある。ＳＴＩＮＧは、様々な細菌産生ＣＤＮを認識することができ、この認識によって自然免疫シグナル伝達応答が誘発される（Maら、The cGAS-STING Defense Pathway and Its Counteraction by Viruses；Cell Host & Microbe １９巻、２０１６年２月１０日）。加えて、ＳＴＩＮＧは、サイクリックＧＭＰ−ＡＭＰまたはｃＧＡＭＰを生成することができるインターフェロン誘導性タンパク質であるｃＧＡＳによって産生されるＣＤＮと結合する（Caiら、The cGAS-cGAMP-STING Pathway of Cytosolic DNA Sensing and Signaling; Molecular Cell ５４巻、２０１４年４月２４日）。ｃＧＡＳは、ｄｓＤＮＡと相互作用し、ＧＴＰおよびＡＴＰを利用して、ＳＴＩＮＧ活性化が可能なｃＧＡＭＰを生成する。２つの正規の３０〜５０ホスホジエステル連結を有する原核生物ＣＤＮとは対照的に、ヒトｃＧＡＳ産物は、特有の２０〜５０結合を含有し、その結果、２’，３’ｃＧＡＭＰとして表される混合連結型のサイクリックＧＭＰ−ＡＭＰ分子となる（Kranzuschら、Ancient Origin of cGAS-STING Reveals Mechanism of Universal 2’,3’cGAMP Signaling; Molecular Cell ５９巻、８９１〜９０３頁、２０１５年９月１７日、およびその中の参考文献に記載の通り）。細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは、ｃＧＡＳの構造ホモログであるＤｎｃＶと呼ばれる酵素をコードし、正規の３’−５’結合を有する関連二次メッセンジャー（３’，３’ｃＧＡＭＰ）を合成する。
インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路の成分は、免疫系による腫瘍細胞の検出に重要な役割を果たす。前臨床研究では、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、天然に存在するまたは合理的に設計された合成誘導体は、攻撃的な抗腫瘍応答を促進することができる。例えば、ＳＴＩＮＧＶＡＸ形態の放射線照射ＧＭ−ＣＳＦ分泌全細胞ワクチンと合剤にされたとき、合成ＣＤＮは、抗腫瘍有効性を増大させ、ＰＤ−１遮断と組み合わせられたＳＴＩＮＧＶＡＸは、定着腫瘍の退縮を誘導した（Fuら、STING agonist formulated cancer vaccines can cure established tumors resistant to PD-1 blockade; Sci Transl Med．２０１５年４月１５日；７巻（２８３号）：２８３ｒａ５２）。別の例では、Smithらは、ＳＴＩＮＧアゴニストが、養子移入されたリンパ球によって認識されない腫瘍細胞を除去するように免疫応答を刺激することによってＣＡＲ Ｔ療法を増強することができること、およびそれによってＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性を向上させることができることを示す研究を行った（Smithら、Biopolymers co-delivering engineered T cells and STING agonists can eliminate heterogeneous tumors；J Clin Invest．２０１７年６月１日：１２７巻（６号）：２１７６〜２１９１頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる、腫瘍を標的とする細菌である。本開示の遺伝子操作された細菌により産生されうるＳＴＩＮＧアゴニストの非限定的な例としては、２’２’−ｃＧＡＭＰ、２’２’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（２’，５’）ｐ］）、２’３’−ｃＧＡＭＰ、２’３’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、２’３’−ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、３’３’−ｃＧＡＭＰ、３’３’−ｃＧＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリック［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］）、ｃ−ジＡＭＰ、ｃ−ジＡＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（サイクリックジアデニル酸一リン酸Ｔｈ１／Ｔｈ２応答）、２’３’−ｃ−ジＡＭＰ、２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）（ｃ−ジＡＭＰのビスホスホロチオエートアナログ、Ｒｐ異性体）、２’３’−ｃ−ジＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ，Ｒｐ）ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、ｃ−ジＧＭＰ、ｃ−ジＧＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）、２’３’−ｃ−ジＧＭＰ、およびｃ−ジＩＭＰが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子を含む、腫瘍を標的とする細菌である。
サイクリックジＧＡＭＰシンターゼ（ｃｄｉ−ＧＡＭＰシンターゼまたはｃＧＡＳ）は、１つのＡＴＰおよび１つのＧＴＰからサイクリックジＧＡＭＰを産生する。一部の実施形態では、酵素は、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、クラスＥＣ ２．７．７．８６の酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、そのような酵素は、細菌酵素である。一部の実施形態では、酵素は、細菌ｃ−ジＧＭＰシンターゼである。一実施形態では、細菌ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一部の実施形態では、酵素は、哺乳動物酵素である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトポリペプチドｃＧＡＳをコードする遺伝子を含む。
ジアデニル酸シクラーゼは、２つのＡＴＰ分子から１分子サイクリックジＡＭＰを産生する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ジアデニル酸シクラーゼの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、クラスＥＣ ２．７．７．８５の酵素の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、細菌ジアデニル酸シクラーゼである。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、ＤａｃＡである。一実施形態では、ＤａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
他の適切なジアデニル酸シクラーゼは、当技術分野において公知であり、ＥｇｇＮｏｇデータベース（http://eggnogdb.embl.de）に含まれているものを含む。細菌により発現されうるジアデニル酸シクラーゼの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．ＵＰＩＩ １３５−Ｅ（ＨＭＰＲＥＦ１０４０＿００２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ ＳＫ５２＝ＤＳＭ ２０５６３（ＨＭＰＲＥＦ９９６６＿０５５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ．２ ｓｔｒ．ＳＫ９５（ＨＭＰＲＥＦ９９６５＿１６７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ１０７６（ＨＭＰＲＥＦ９９６７＿１５６８）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ ｌｏｎｇｕｍ ＤＳＭ ６５４０（ＡＬＯ＿０３３５６）、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ ２６８１（ＨＭＰＲＥＦ９３７２＿２２７７）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒ．Ｓｃｏｔｔ Ａ（ＢＮ４１８＿２５５１）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｍｏｕｓｅ−Ｊａｐａｎ（ＳＦＢＭ＿１３５４）、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ＳＳＤ−１７Ｂ ２ ｓｅｑｓ ＨＬＰＣＯ＿０１７５０、ＨＬＰＣＯ＿０８８４９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ＺＷ３（ＷＡＮＧ＿０９４１）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎａｔｉｓ １３４０（ＧＩＧ＿０３１４８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｈａｒｙｎｇｉｓ ＳＫ１０６０＝ＣＣＵＧ ４６３７７（ＨＭＰＲＥＦ１０４２＿１１６８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ９７０（ＨＭＰＲＥＦ９９５４＿１６２８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ ＫＮＰ４１４（ＹＢＢＰ）、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０（ＡＬＬ２９９６）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ ＳＦ７（ＭＣＳＦ７＿０１３２１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ ＳＰＭ０２１１（ＬＲＵ＿０１１９９）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｒａｔ−Ｙｉｔ（ＲＡＴＳＦＢ＿１１８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＳＹ８５１９（ＣＸＩＶＡ＿０２１９０）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ ＬＭＧ １５４４１（ＢＲＬＡ＿Ｃ０２２４０）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １５５１０（ＷＫＫ＿０１９５５）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＰＷＳ／Ａ（ＢＩＮＴ＿２２０４）、Ｂｉｚｉｏｎｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ ＪＵＢ５９（ＢＺＡＲＧ＿２６１７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ５７．Ｉ（ＳＳＡＬ＿０１３４８）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ Ｔｃ−４−１（ＴＣ４１＿３００１）、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＴＰＹ（ＴＰＹ＿０８７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＩＳ７４９３（ＳＰＰＮ＿０７６６０）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ ＤＳＭ ２０４６０（ＭＥＬＳ＿０８８３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ ＣＪ１８（ＳＩＮＦ＿１２６３）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ） ｓｔｒ．ＭＡＤＡＲ（ＭＡＤＡＲ＿５１１）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｅｒｃｕｓ ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ） ｓｔｒ．Ｃｐｕ（ＢＬＢＣＰＵ＿０９３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９６０５（ＳＹＮＣＣ９６０５＿１６３０）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１（ＡＥＶ１７２２４．１）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈａｅｍｏｃａｎｉｓ ｓｔｒ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（ＭＨＣ＿０４３５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ ＡＣＡ−ＤＣ １９８（ＹＢＢＰ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ ＧＤＬ−１（ＭＹＭ＿０４５７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２（ＳＹＮＰＣＣ７９４２＿０２６３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（ＳＬＬ０５０５）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＷＬ０２９（ＹＢＢＰ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０（ＭＣ７４２０＿６８１８）、Ｐｅｒｓｅｐｈｏｎｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＥＸ−Ｈ１（ＰＥＲＭＡ＿１６７６）、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ Ｙ５１（ＤＳＹ４４８９）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＡＳ９６０１（Ａ９６０１＿１１９７１）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＢＢＦＬ７（ＢＢＦＬ７＿０２５５３）、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ ｓｔｒ．Ｂｕｄｄｙ（ＳＰＩＢＵＤＤＹ＿２２９３）、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈａ ｓｔｒ．Ｇｒａｐｅｓ（ＳＰＩＧＲＡＰＥＳ＿２５０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０（ＳＡＶ２１６３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ１ ＧＡＳ（ＳＰＹ＿１０３６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０９（ＳＨ８１０９＿２１９３）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１３７５（ＰＲＯ＿１１０４）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９５１５（Ｐ９５１５＿１１８２１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３０１（Ｐ９３０１＿１１９８１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＮＡＴＬ１Ａ（ＮＡＴＬ１＿１４８９１）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＥＧＤ−ｅ（ＬＭＯ２１２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＴＩＧＲ４ ２ ｓｅｑｓ ＳＰＮＥＴ＿０２０００３６８、ＳＰ＿１５６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６（ＳＰＲ１４１９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＲＰ６２Ａ（ＳＥＲＰ１７６４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １２２２８（ＳＥ＿１７５４）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＨＲＭ２（ＨＲＭ２＿３２８８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ ＬＳｖ５４（ＤＰ１６３９）、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＣＣ ７００１（ＣＰＣＣ７００１＿１０２９）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＴＷ−１８３（ＹＢＢＰ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｌａｉ ｓｔｒ．５６６０１（ＬＡ＿３３０４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＡＴＣＣ １３１２４（ＣＰＦ＿２６６０）、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＢＰ−１（ＴＬＲ１７６２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ．Ａｍｅｓ（ＢＡ＿０１５５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＡＴＣＣ ２７４０５（ＣＴＨＥ＿１１６６）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ ８２９３（ＬＥＵＭ＿１５６８）、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ ＰＳＵ−１（ＯＥＯＥ＿１６５６）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１（ＴＥＲＹ＿２４３３）、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＡＴＣＣ ４３０３７（ＢＦＯ＿１３４７）、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ ａｚｏｒｅｎｓｅ Ａｚ−Ｆｕ１（ＳＵＬＡＺ＿１６２６）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ Ｅｌｌｉｎ３４５（ＡＣＩＤ３４５＿０２７８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｌａｓｋｅｎｓｉｓ Ｇ２０（ＤＤＥ＿１５１５）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．１７−４（ＹＢＢＰ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９（ＳＭＵ＿１４２８Ｃ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＭＡＧ３０６０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＥＭ３１６（ＧＢＳ０９０２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８（ＣＴＣ＿０２５４９）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ １８Ｐ１３（ＲＵＭ＿１４４７０）、Ｃｒｏｃｅｉｂａｃｔｅｒ ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ ＨＴＣＣ２５５９（ＣＡ２５５９＿１３５１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ ０１４０Ｊ（ＳＵＢ１０９２）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ａｂｏｒｔｕｓ Ｓ２６／３（ＣＡＢ６４２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＷＣＦＳ１（ＬＰ＿０８１８）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１（ＯＢ０２３０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１６（ＲＳ９９１６＿３１３６７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１７（ＲＳ９９１７＿００９６７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ．１６８（ＹＢＢＰ）、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５（ＡＱ＿１４６７）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１（ＢＢ＿０００８）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３（ＥＦ＿２１５７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ ＶＰＩ−５４８２（ＢＴ＿３６４７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９（ＢＣ＿０１８６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｃａｖｉａｅ ＧＰＩＣ（ＣＣＡ＿００６７１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０１０１（ＳＣＢ０１＿０１０１０００００９０２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０２０５（ＳＣＢ０２＿０１０１０００１２６９２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ ｕｓｉｔａｔｕｓ Ｅｌｌｉｎ６０７６（ＡＣＩＤ＿１９０９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ＨＴＡ４２６（ＧＫ０１５２）、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ ＤＳＭ ４１３６（ＶＳＰＩＤ＿０１０１０００２２５３０）、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３（ＡＶＡ＿０９１３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ８３（ＰＧ＿１５８８）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｍｕｒｉｄａｒｕｍ Ｎｉｇｇ（ＴＣ＿０２８０）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ Ｒ１（ＤＲ＿０００７）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ ＰＣＡ ２ ｓｅｑｓ ＧＳＵ１８０７、ＧＳＵ０８６８）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ １５８Ｌ３−１（ＭＡＲＴＨ＿ＯＲＦ５２７）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ Ｇ３７（ＭＧ１０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ３５４０５（ＴＤＥ＿１９０９）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｓｔｒ．Ｎｉｃｈｏｌｓ（ＴＰ＿０８２６）、酪酸産生菌ＳＳ３／４（ＣＫ３＿２３０５０）、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ Ｚ−２９０１（ＣＨＹ＿２０１５）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ８（ＣＵＳ＿５３８６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＮＣＴＣ １２２６１（ＳＭ１２２６１＿１１５１）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＰＣＣ ７４２１（ＧＬＬ０１０９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ

ＮＣＣ ５３３（ＬＪ＿０８９２）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ２５５−１５（ＥＸＩＧ＿０１３８）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｊ（ＭＨＪ＿０４８５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ ５３（ＭＳ５３＿０４９８）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ２７（ＴＴ＿Ｃ１６６０）、Ｏｎｉｏｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＯＹ−Ｍ（ＰＡＭ＿５８４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＧ １８３１１（ＯＳＳＧ）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ ＵＷＥ２５（ＰＣ１６３３）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ Ｆｅ／Ｃ−５６（ＣＦ０３４０）、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒｕｓ ＨＤ１００（ＢＤ１９２９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ ２３（ＰＲＵ＿２２６１）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３（ＭＯＴＨ＿２２４８）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１−１３０（ＬＩＣ＿１０８４４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ １６３Ｋ（ＭＭＯＢ４５５０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１（ＳＹＣ１２５０＿Ｃ）、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ ３３４０６（ＣＨＵ＿３２２２）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＧＳ−１５ ２ ｓｅｑｓ ＧＭＥＴ＿１８８８、ＧＭＥＴ＿１１６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｃ−１２５（ＢＨ０２６５）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ ９３４３（ＢＦ０３９７）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ（ＹＢＢＰ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８２４（ＣＡ＿Ｃ３０７９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（ＣＤ０１１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（ＬＢＡ０７１４）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ Ｉｌ１４０３（ＹＥＤＡ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ Ｃｌｉｐ１１２６２（ＬＩＮ２２２５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ ＨＦ−２（ＭＹＰＥ２１２０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｕｌｍｏｎｉｓ ＵＡＢ ＣＴＩＰ（ＭＹＰＵ＿４０７０）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ ＭＢ４（ＴＴＥ２２０９）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５７４５（ＰＥＰＥ＿０４７５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １３＝ＡＴＣＣ １４５８０ ２ ｓｅｑｓ ＹＢＢＰ、ＢＬ０２７０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＪＣＳＣ１４３５（ＳＨ０８７７）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ６８４（ＤＡＣＥ＿０５４３）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ ＤＳＭ １１３４７（ＴＨＥＹＥ＿Ａ００４４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ＰＧ４５（ＭＢＯＶＰＧ４５＿０３９４）、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ ２ＣＰ−Ｃ（ＡＤＥＨ＿１４９７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２（ＣＢＥＩ＿０２００）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ ＰＢｉ（ＢＧ０００８）、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＩＡＭ １４８６３（ＳＴＨ１９２）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ ＱＹＭＦ（ＡＭＥＴ＿４３１３）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８（ＴＴＨＡ０３２３）、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ５２６５（ＣＯＰＲＯ５２６５＿１０８６）、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ５１５９（ＴＲＤ＿０６８８）、Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ ＤＳＭ １３８５５（ＳＲＵ＿１９４６）、Ｄｏｋｄｏｎｉａ ｄｏｎｇｈａｅｎｓｉｓ ＭＥＤ１３４（ＭＥＤ１３４＿０３３５４）、Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ ｉｒｇｅｎｓｉｉ ２３−Ｐ（ＰＩ２３Ｐ＿０１６３２）、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ ＡＴＣＣ ７００７５５（Ｐ７００７５５＿０２２０２）、Ｒｏｂｉｇｉｎｉｔａｌｅａ ｂｉｆｏｒｍａｔａ ＨＴＣＣ２５０１（ＲＢ２５０１＿１０５９７）、Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１５２（ＭＥＤ１５２＿１１５１９）、Ｍａｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＨＴＣＣ２１７０（ＦＢ２１７０＿０１６５２）、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＡＴＣＣ ２３１３４（Ｍ２３１３４＿０７０２４）、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６（Ｌ８１０６＿１８９５１）、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ ＣＣＹ９４１４（Ｎ９４１４＿２３３９３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＬ１０７（ＢＬ１０７＿１１７８１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１（Ｂ１４９１１＿１９４８５）、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ ａｒａｎｅｏｓａ ＨＴＣＣ２１５５（ＬＮＴＡＲ＿１８８００）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（ＬＣＡ＿１３５９）、Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｙｄａｎｓ ＰＶ−１（ＳＰＶ１＿１３４１７）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ ＤＡＨ（ＢＨ０００８）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｔｕｒｉｃａｔａｅ ９１Ｅ１３５（ＢＴ０００８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４（ＢＣＥＲＫＢＡＢ４＿０１４９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｕｓ ＮＶＨ ３９１−９８（ＢＣＥＲ９８＿０１４８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ＳＡＦＲ−０３２（ＹＢＢＰ）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＲＣ−３２ ２ ｓｅｑｓ ＧＥＯＢ＿２３０９、ＧＥＯＢ＿３４２１）、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＤＳＭ ７８５（ＨＡＵＲ＿３４１６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＣＣ３０７（ＳＹＮＲＣＣ３０７＿０７９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９９０２（ＳＹＮＣＣ９９０２＿１３９２）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ ＤＳＭ １１３００（ＤＧＥＯ＿０１３５）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７００２（ＳＹＮＰＣＣ７００２＿Ａ００９８）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０３（ＳＹＮＷＨ７８０３＿１５３２）、Ｐｅｄｏｓｐｈａｅｒａ ｐａｒｖｕｌａ Ｅｌｌｉｎ５１４（ＣＦＬＡＶ＿ＰＤ５５５２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ（ＣＹＡ＿２８９４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂａ（２−１３）（ＣＹＢ＿１６４５）、Ａｓｔｅｒ ｙｅｌｌｏｗｓ ｗｉｔｃｈｅｓ−ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ＡＹＷＢ（ＡＹＷＢ＿２４３）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２（ＰＪＤＲ２＿５６３１）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ Ｊ−１０−ｆｌ（ＣＡＵＲ＿１５７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ ３３３２３（ＬＧＡＳ＿１２８８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２（ＹＢＢＰ）、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ ＤＳＭ ９４８５（ＣＡＧＧ＿２３３７）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７（ＡＭ１＿０４１３）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ） ｓｔｒ．Ｂｇｅ（ＢＬＢＢＧＥ＿１０１）、Ｓｉｍｋａｎｉａ ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ Ｚ（ＹＢＢＰ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｅｃｏｒｕｍ Ｅ５８（Ｇ５Ｓ＿１０４６）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ ６ＢＣ ２ ｓｅｑｓ ＣＰＳＩＴ＿０７１４、Ｇ５Ｏ＿０７０７）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ７（ＣＡＴ７＿０６５７３）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８（ＦＭＧ＿１２２５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｗｏｌｆｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｗｏｌｆｅｉ ｓｔｒ．Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ（ＳＷＯＬ＿２１０３）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ ＭＰＯＢ（ＳＦＵＭ＿３４５５）、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３８０（ＰＣＡＲ＿０９９９）、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２３７９ ２ ｓｅｑｓ ＰＰＲＯ＿２６４０、ＰＰＲＯ＿２２５４）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ３３２２３（ＴＥＴＨ３９＿０４５７）、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ ｖａｄｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−５４８（ＶＶＡＤ＿ＰＤ２４３７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １５３０５（ＳＳＰ０７２２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ３６Ｄ１（ＢＣＯＡ＿１１０５）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ２３１１４（ＭＨＯ＿０５１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ １００−２３（ＬＲＥＵ２３ＤＲＡＦＴ＿３４６３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＩ−１（ＤＲＥＤ＿０２９２）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ ＫＭ２０（ＬＣＫ＿０１２９７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ Ｅ６８１（ＰＰＥ＿０４２１７）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８３５（ＡＭＵＣ＿０４００）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ ＯｈＩＬＡｓ（ＣＬＯＳ＿２４１７）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｎｉｉｒｅｄｕｃｅｎｓ Ｒｆ４ ２ ｓｅｑｓ ＧＵＲＡ＿１３６７、ＧＵＲＡ＿２７３２）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ８９０３（ＣＳＡＣ＿１１８３）、Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｓｃｏｌｅｎｓ Ｗ５４５５（ＨＭＰＲＥＦ７２１５＿００７４）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｓｅｒｏｖａｒ Ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ Ｌ５５０（ＬＢＬ＿０９１３）、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｓｐ．ＲＳ−１（ＲＯＳＥＲＳ＿１１４５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ（ＣＰＨＹ＿３５５１）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ １００５９９（ＢＢＲ４７＿０２６７０）、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ１ｂ（ＥＡＴ１Ｂ＿１５９３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＵＣＣ１１８（ＬＳＬ＿１１４６）、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ ＰＨＥ／ＭＮ１−００（ＬＩ０１９０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ Ｂ６（ＳＭＩ＿１５５２）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ ＳＩ（ＰＴＨ＿０５３６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｄ３９（ＳＰＤ＿１３９２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ｍａｌｉ（ＡＴＰ＿００３１２）、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ Ｔ−２７（ＧＡＵ＿１３９４）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｐ．Ｙ０４ＡＡＳ１（ＨＹ０４ＡＡＳ１＿０００６）、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ ＤＳＭ １３９４１（ＲＣＡＳ＿３９８６）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ ６ｂ ｓｔｒ．ＳＬＣＣ５３３４（ＬＷＥ２１３９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ（ＮＴ０

１ＣＸ＿１１６２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ ３６７（ＬＶＩＳ＿０６８４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ１４９０５（ＢＢ１４９０５＿０８６６８）、Ａｌｇｏｒｉｐｈａｇｕｓ ｓｐ．ＰＲ１（ＡＬＰＲ１＿１６０５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＳＫ３６（ＳＳＡ＿０８０２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ ＰＫｏ ２ ｓｅｑｓ ＢＡＰＫＯ＿０００７、ＡＥＬ６９２４２．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＡＴＣＣ １１８４２（ＬＤＢ０６５１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ ０５ＺＹＨ３３（ＳＳＵ０５＿１４７０）、Ｋｏｒｄｉａ ａｌｇｉｃｉｄａ ＯＴ−１（ＫＡＯＴ１＿１０５２１）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＢＡＬ３９（ＰＢＡＬ３９＿０３９４４）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＬＣ−１（ＦＢＡＬＣ１＿０４０７７）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＣＣＹ０１１０（ＣＹ０１１０＿３０６３３）、Ｐｌｅｓｉｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｃｉｆｉｃａ ＳＩＲ−１（ＰＰＳＩＲ１＿１０１４０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０（ＣＣＥＬ＿１２０１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２５（ＣＹＡＮ７４２５＿４７０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｎｏｓｕｓ ＴＭ３００（ＳＣＡ＿１６６５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４（ＹＢＢＰ）、Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉｅｌｌａ ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＭＥＤ２１７（ＭＥＤ２１７＿０４３５２）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ ＳＺ ２ ｓｅｑｓ ＧＬＯＶ＿３０５５、ＧＬＯＶ＿２５２４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（ＳＥＺ＿１２１３）、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ Ｎｏｒ１（ＴＣＡＲＤＲＡＦＴ＿１０４５）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ Ｂｅｍ（ＧＢＥＭ＿０８９５）、Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｆｗ１０９−５（ＡＮＡＥ１０９＿２３３６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＤＰＣ ４５７１（ＬＨＶ＿０７５７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ｍ３−１３（ＢＭ３−１＿０１０１０００１０８５１）、Ｇｒａｍｅｌｌａ ｆｏｒｓｅｔｉｉ ＫＴ０８０３（ＧＦＯ＿０４２８）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ ＡＴＣＣ ２９１７４（ＲＵＭＯＢＥ＿０３５９７）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ ＡＴＣＣ ２７７５６（ＲＵＭＴＯＲ＿００８７０）、Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ ＡＴＣＣ ２７７５５（ＤＯＲＦＯＲ＿００２０４）、Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ ＤＳＭ １３８１４（ＤＯＲＬＯＮ＿０１７４４）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ ＡＴＣＣ ２７５６０（ＥＵＢＶＥＮ＿０１０８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｉｇｅｒ ＡＴＣＣ ２９０９８（ＤＥＳＰＩＧ＿０１５９２）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ ＡＴＣＣ ３３２７０（ＰＥＰＭＩＣ＿０１３１２）、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ ＡＴＣＣ ２９７９９（ＢＡＣＣＡＰ＿０１９５０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ ＡＴＣＣ ３５７０４（ＣＬＯＳＣＩ＿０２３８９）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ ＤＳＭ ３３５３（ＥＵＢＨＡＬ＿０１２２８）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ ＡＴＣＣ ２９１４９（ＲＵＭＧＮＡ＿０３５３７）、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ ＤＳＭ １５１７６（ＳＵＢＶＡＲ＿０５１７７）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ ＡＴＣＣ ２７７５９（ＣＯＰＥＵＴ＿０１４９９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８４８３（ＢＡＣＯＶＡ＿０３４８０）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ ＡＴＣＣ ４３１８４（ＰＡＲＭＥＲ＿０３４３４）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ａ２−１６５（ＦＡＥＰＲＡＡ２１６５＿０１９５４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｌ２−５０（ＣＬＯＬ２５０＿００３４１）、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ ＤＳＭ １４６６２（ＡＮＡＣＡＣ＿００２１９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ ＡＴＣＣ ４３１８５（ＢＡＣＣＡＣ＿０３２２５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６１３（ＣＬＯＢＯＬ＿０４７５９）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｄｕｔｔｏｎｉｉ Ｌｙ（ＢＤＵ＿１４）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ８８０１（ＰＣＣ８８０１＿０１２７）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＭＧ１３６３（ＬＬＭＧ＿０４４８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＧ８０−２（ＧＴＮＧ＿０１４９）、Ｅｐｕｌｏｐｉｓｃｉｕｍ ｓｐ．Ｎ．ｔ．ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｅ Ｂ（ＥＰＵＬＯ＿０１０１００００３８３９）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ Ｌｇ２（ＬＣＧＬ＿０３０４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｐｔｕｍ ＤＳＭ ７５３（ＣＬＯＬＥＰ＿０３０９７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ ＤＳＭ １５５２（ＣＬＯＳＰＩ＿０１６０８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ ＤＳＭ ３９９１（ＥＵＢＤＯＬ＿００１８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ ＤＳＭ ５５５（ＣＫＬ＿０３１３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２７７（ＰＧＮ＿０５２３）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８４８２（ＢＶＵ＿０５１８）、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ ＡＴＣＣ ８５０３（ＢＤＩ＿３３６８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｍｉｎｉｓ Ｃ８０（ＨＭＰＲＥＦ０７９８＿０１９６８）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒａｅ Ｃ８７（ＨＭＰＲＥＦ０７８６＿０２３７３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃ１５０（ＨＭＰＲＥＦ０８４８＿００４２３）、Ｓｕｌｆｕｒｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｂｉｕｍ ｓｐ．ＹＯ３ＡＯＰ１（ＳＹＯ３ＡＯＰ１＿０１１０）、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＡＫ−０１（ＤＡＬＫ＿０３９７）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＬＳ１０（ＢＳＥＬ＿０３７２）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２（ＣＣＥ＿１３５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ １１５３（ＬＢＪＧ＿０１６４５）、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ ＰＧ−８Ａ（ＡＣＬ＿１３６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ ｍ４−４（ＢＣＯＡＭ＿０１０１００００１１２０）、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｍ１８ ２ ｓｅｑｓ ＧＭ１８＿０７９２、ＧＭ１８＿２５１６）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ｃ３−４１（ＢＳＰＨ＿４５６８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＮＣＴＣ ２９１６（ＣＢＮ＿３５０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｃ ｓｔｒ．Ｅｋｌｕｎｄ（ＣＢＣ＿Ａ１５７５）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２１６（ＡＬＩＰＵＴ＿００１９０）、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４４（ＡＮＡＳＴＥ＿０１５３９）、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４１（ＡＮＡＣＯＬ＿０２７０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ ＤＳＭ １６７９５（ＣＬＯＢＡＲ＿００７５９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ ＤＳＭ １４０２（ＣＬＯＲＡＭ＿０１４８２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖａｌａｉｓｉａｎａ ＶＳ１１６（ＢＶＡＶＳ１１６＿０００７）、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ Ｓｏ ｃｅ ５６（ＳＣＥ７６２３）、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３（ＭＡＥ＿２５３９０）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ ＡＴＣＣ ４３１８３（ＢＡＣＳＴＥ＿０２６３４）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌｕｓ ａｓｉａｔｉｃｕｓ ５ａ２（ＡＡＳＩ＿０６５２）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｐａｔｏｃ ｓｔｒａｉｎ Ｐａｔｏｃ １（Ｐａｒｉｓ）（ＬＥＰＢＩ＿Ｉ０７３５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．７＿２＿４３ＦＡＡ（ＣＳＢＧ＿００１０１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．３＿１＿ｓｙｎ３（ＨＭＰＲＥＦ０３２６＿０２２５４）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．５＿１＿３９ＢＦＡＡ（ＲＳＡＧ＿０２１３５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿７＿４７ＦＡＡ（ＣＢＦＧ＿００３４７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ３＿１＿１２（ＢＦＡＧ＿０２５７８）、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＪＷ／ＮＭ−ＷＮ−ＬＦ（ＮＴＨＥＲ＿０２４０）、Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＪＣＳＣ５４０２（ＭＣＣＬ＿０３２１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ ｓｔｒ．Ｃｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔｒ．ＣＨ１（ＳＧＯ＿０８８７）、Ｄｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｐｅｐｔｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １１００２（ＤＰＥＰ＿２０６２）、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２９＿１（ＨＭＰＲＥＦ９４８８＿０３４４８）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｃｏｌａ ＤＳＭ １７１３６（ＢＡＣＣＯＰ＿０３６６５）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ ＡＴＣＣ ２７７５８（ＣＯＰＣＯＭ＿０２１７８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＷＣＨ７０（ＧＷＣＨ７０＿０１５６）、非培養シロアリ第１群細菌系統型Ｒｓ−Ｄ１７（ＴＧＲＤ＿２０９）、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＤＳＭ １８０５３（ＤＦＥＲ＿０２２４）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ １７３９３（ＢＡＣＩＮＴ＿００７００）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ２９１７６（ＲＵＭＬＡＣ＿０１２５７）、Ｂｌａｕｔｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＤＳＭ １０５０７（ＲＵＭＨＹＤ＿０１２１８）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ ＭＰ１０４Ｃ（ＤＡＵＤ＿１９３２）、Ｍａｒｖｉｎｂｒｙａｎｔｉａ ｆｏｒｍａｔｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ １４４６９（ＢＲＹＦＯＲ＿０７４１０）、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ２０７４５（ＳＴＨＥ＿１６０１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ ＤＳＭ ２００８（ＶＰＡＲ＿０２９２）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ Ｖ４（ＭＩＮＦ＿１８９７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｙ４１２ＭＣ１０（ＧＹＭＣ１０＿５７０１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ ＤＳＭ １７５６５（ＢＡＣＦＩＮ＿０７７３２）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ ＤＳＭ ２０６９７（ＢＡＣＥＧＧ＿０３５６１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３２４３（ＢＡＣＰＥＣ＿０２９３６）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｌｅｂｅｉｕｓ ＤＳＭ １７１３５（ＢＡＣＰＬＥ＿００６９３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｒｅｔｂａｅｎｓｅ ＤＳＭ ５６９２（ＤＲＥＴ＿１７２５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ７７１（ＤＴＯＸ＿０６０４）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｐａｒｉｎｕｓ ＤＳＭ ２３６６（ＰＨＥＰ＿３６６４）、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｐｉｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ２５８８（ＣＰＩＮ＿５４６

６）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４−２Ａ（ＦＬＡＶ２ＡＤＲＡＦＴ＿００９０）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４−３Ｃ（ＦＬＡＶ３ＣＤＲＡＦＴ＿０８５１）、Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｔａ ３Ｌ（ＬＹＮＧＢＭ３Ｌ＿１４４００）、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ ＷＫ１（ＡＦＬＶ＿０１４９）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８（ＭＢＩＯ＿０４７４）、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ Ｅｌｌｉｎ４２８（ＣＦＥ４２８ＤＲＡＦＴ＿３０３１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２（ＣＹＡＮ７８２２＿１１５２）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ Ａ１４Ｓ（ＢＳＰＡ１４Ｓ＿０００９）、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ Ｉｃｅ１（ＨＭ１＿１５２２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ Ｙ５１ＭＣ２３（ＴＡＱＤＲＡＦＴ＿３９３８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ ＤＳＭ ５１９（ＣＬＯＳＴ＿０４８４）、Ｔｅｐｉｄａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｒｅ１（ＴＥＰＲＥ１＿０３２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｒａｎｏｎｉｓ ＤＳＭ １３２７５（ＣＬＯＨＩＲ＿００００３）、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ ｍｕｌｔａｃｉｄａ ＤＳＭ ２０５４４（ＭＩＴＳＭＵＬ＿０３４７９）、Ｈａｌｉａｎｇｉｕｍ ｏｃｈｒａｃｅｕｍ ＤＳＭ １４３６５（ＨＯＣＨ＿３５５０）、Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ ｌｉｎｇｕａｌｅ ＤＳＭ ７４（ＳＬＩＮ＿２６７３）、未同定の真正細菌ＳＣＢ４９（ＳＣＢ４９＿０３６７９）、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＣＤ２（ＡＣＥＬＣ＿０２０１０００１３８４５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３０９２９（ＬＢＵＣ＿１２９９）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ ＤＳＭ ２８７６（ＢＵＴＹＶＩＢ＿０２０５６）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｚｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｅ ｇｅｎｏｍｏｖａｒ．ＣＦＰ２（ＣＦＰＧ＿０６６）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ ＭＰ１４５（ＭＣＲＯ＿０３８５）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ−３２８（ＡＭＡＸＤＲＡＦＴ＿４１８４）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ ＡＴＣＣ ２７７５０（ＥＵＢＥＬＩ＿０１６２６）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ Ｂ３１６（ＢＰＲ＿Ｉ２５８７）、Ｃｈｌｏｒｏｈｅｒｐｅｔｏｎ ｔｈａｌａｓｓｉｕｍ ＡＴＣＣ ３５１１０（ＣＴＨＡ＿１３４０）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｏｒｍｅ ＤＳＭ ３９８９（ＥＵＢＩＦＯＲ＿０１７９４）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＤＳＭ ４２５２（ＲＭＡＲ＿０１４６）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ ＤＮ１２７（ＢＢＩＤＮ１２７＿０００８）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ ＤＳＭ ７２７１（ＣＯＣＨ＿２１０７）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ４４６（ＡＡＣＩ＿２６７２）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ ＤＳＭ ６７２５（ＡＴＨＥ＿０３６１）、Ｄｅｎｉｔｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｅｔｉｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ １２８０９（ＤＡＣＥＴ＿１２９８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ｓｔｒ．ＡＴＣＣ ２７７７４（ＤＤＥＳ＿１７１５）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ５１１７２（ＨＭＰＲＥＦ００７２＿１６４５）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｔｒａｄｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５０９８（ＨＭＰＲＥＦ００７７＿０９０２）、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ５３５１６（ＨＭＰＲＥＦ０３９１＿１０３７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ ＤＳＭ １６０４１（ＹＢＢＰ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＡＴＣＣ １１５７７（ＨＭＰＲＥＦ０４９７＿２７５２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １６０４７（ＨＭＰＲＥＦ０５４８＿０７４５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ４９５４０（ＨＭＰＲＥＦ０５４９＿０７６６）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ ＤＳＭ ２０６０１（ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１１６５２）、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ ＡＴＣＣ ３３８６１（ＨＭＰＲＥＦ０７６６＿１１７８７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ Ｍ２３８６４：Ｗ１（ＨＭＰＲＥＦ０７９３＿００９２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ ＡＴＣＣ ９８１２（ＨＭＰＲＥＦ０８１９＿０８１２）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ４０２８（ＤＢＡＣ＿０２５５）、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ ６５８９（ＴＡＣＩ＿０８３７）、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ ｔｅｒｒｅｎｕｍ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−７９８（ＴＴＥＲ＿１８１７）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＤＳＭ ２０５４８（ＡＰＲＥ＿０３７０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ ＤＳＭ ２６３８（ＤＥＳＡＬ＿１７９５）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ ＤＳＭ １２５６３（ＢＭＵＲ＿２１８６）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ ＤＳＭ ９９４６（ＭＥＳＩＬ＿０１６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｒｏｃｋ４−１８（ＢＣＥＲＥ００２４＿１４１０）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ ＣＳ−５０５（ＣＲＣ＿０１９２１）、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ ｂｒｏｏｋｉｉ Ｄ９（ＣＲＤ＿０１１８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ Ｐ７ ２ ｓｅｑｓ ＣＬＣＡＲ＿００１６、ＣＣＡＲＢＤＲＡＦＴ＿４２６６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｅ１ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ Ｂｅｌｕｇａ（ＣＬＯ＿３４９０）、Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ ＤＳＭ ２０５８３（ＢＬＡＨＡＮ＿０７１５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｃｏｐｒｉ ＤＳＭ １８２０５（ＰＲＥＶＣＯＰ＿０４８６７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔｏｓｕｍ ＤＳＭ ５４７６（ＣＬＯＳＴＭＥＴＨ＿０００８４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＢＬ２３（ＬＣＡＢＬ＿１１８００）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＱＭ Ｂ１５５１（ＢＭＱ＿０１９５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｒｉｍｉｔｉａ ＺＡＳ−２（ＴＲＥＰＲ＿１９３６）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ ＺＡＳ−９（ＴＲＥＡＺ＿０１４７）、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １２０４２（ＨＯＬＤＥＦＩＬＩ＿０３８１０）、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ ＡＴＣＣ ３５８９６（ＨＭＰＲＥＦ０３８９＿００３６６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ ＡＴＣＣ １０３７９（ＧＥＭＨＡ０００１＿０９１２）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ ＡＴＣＣ ３５１８５（ＳＥＬＳＰ＿１６１０）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｄｉｓｐａｒ ＡＴＣＣ １７７４８（ＶＥＩＤＩＳＯＬ＿０１８４５）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｓｅｒｔｉ ＶＣＤ１１５（ＤＥＩＤＥ＿１９７００）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ １８２２８（ＢＡＣＣＯＰＲＯ＿００１５９）、Ｎｏｓｔｏｃ ａｚｏｌｌａｅ ０７０８（ＡＡＺＯ＿４７３５）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５＿２＿５４ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０８６３＿０２２７３）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ１６（ＨＭＰＲＥＦ０８６６＿０１０６１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ ＪＣＶＩＨＭＰ０１０（ＨＭＰＲＥＦ０６４８＿０３３８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ ＡＴＣＣ ２５８４５（ＨＭＰＲＥＦ０６５９＿Ａ６２１２）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５４０６（ＰＯＲＥＮ０００１＿０２５１）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ ＡＴＣＣ ３３６１２（ＣＡＰＳＰ０００１＿０７２７）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３６２４（ＣＡＰＧＩ０００１＿１９３６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｙｌｅｍｏｎａｅ ＤＳＭ １５０５３（ＣＬＯＨＹＬＥＭ＿０４６３１）、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｏｃｅａｎｉ ＤＳＭ １６６４６（ＴＯＣＥ＿１９７０）、Ｄｅｔｈｉｏｂａｃｔｅｒ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ＡＨＴ １（ＤＥＡＬＤＲＡＦＴ＿０２３１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｏｓｐｉｒａ ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ ＡＳＯ３−１（ＤＴＨＩＯ＿ＰＤ２８０６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．Ｄ５（ＨＭＰＲＥＦ０２４０＿０３７８０）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ ＤＳＭ ７４５４（ＡＮＨＹＤＲＯ＿０１１４４）、Ｋｙｒｐｉｄｉａ ｔｕｓｃｉａｅ ＤＳＭ ２９１２（ＢＴＵＳ＿０１９６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ Ｍ３４１（ＨＭＰＲＥＦ０４２８＿０１４２９）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ Ｍ４２４（ＨＭＰＲＥＦ０４３２＿０１３４６）、Ｇｅｍｅｌｌａ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ Ｍ３２５（ＨＭＰＲＥＦ０４３３＿０１２２５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒｉｓ Ｃ７３５（ＨＭＰＲＥＦ０６６５＿０１７４１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｍ１４３（ＨＭＰＲＥＦ０８５０＿００１０９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｍ３３４（ＨＭＰＲＥＦ０８５１＿０１６５２）、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ ３＿１＿６（ＨＭＰＲＥＦ０１７９＿００８９９）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ＷＡ１（ＢＨＷＡ１＿０１１６７）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＥＧ２（ＥＧＢＧ＿００８２０）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ ＥＣ２０（ＥＣＢＧ＿００８２７）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ Ｃ６８（ＥＦＸＧ＿０１６６５）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＳＢ（ＳＹＮ＿０２７６２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ ２ ｓｅｑｓ ＯＳＳＧ、ＬＲＨＭ＿０９３７）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｉ ＲｙＣ−ＭＲ９５（ＡＣＩＮ＿２０６９）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｅ ＨＲＣ／５８１（ＭＣＪ＿００２９４０）、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｐｒａｅｖａｌｅｎｓ ＤＳＭ ２２２８（ＨＰＲＡＥ＿１６４７）、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｅ ＤＳＭ １２２６１（ＡＭＩＣＯ＿０７３７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ ７４３Ｂ（ＣＬＯＣＥＬ＿３６７８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ ＲＳ−１（ＤＭＲ＿２５７２０）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ ＤＳＭ １１２９３（ＳＰＩＲＳ＿１６４７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２７４ ｓｔｒ．Ｆ００５８（ＨＭＰＲＥＦ０１５６＿０１８２６）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １０７ ｓｔｒ．Ｆ０１６７（ＨＭＰＲＥＦ０４９１＿０１２３８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ １０１−４−ＣＨＮ（ＨＭＰＲＥＦ０５０１＿０１０９４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ ２７−２−ＣＨＮ（ＨＭＰＲＥＦ０５２５＿００６１６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｅ Ｄ１７（ＨＭＰＲＥＦ０６４

９＿０２０４３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ２９９ ｓｔｒ．Ｆ００３９（ＨＭＰＲＥＦ０６６９＿０１０４１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３１７ ｓｔｒ．Ｆ０１０８（ＨＭＰＲＥＦ０６７０＿０２５５０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０３２ ２ ｓｅｑｓ ＤＥＳＰＲ＿２５０３、ＤＥＳＰＲ＿１０５３）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ５７１（ＴＴＨＥ＿０４８４）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｔａｌｉｃｕｓ Ａｂ９（ＴＨＩＴ＿１９２１）、Ｔｈｅｒｍｏｖｉｒｇａ ｌｉｅｎｉｉ ＤＳＭ １７２９１（ＴＬＩＥ＿０７５９）、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １２２６０（ＡＰＡＵ＿１２７４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＳＫ３２１（ＳＭＳＫ３２１＿０１２７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＳＫ５９７（ＳＭＳＫ５９７＿０４１７）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ Ａ２−１８３（ＲＨＯＭ＿１２４０５）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｕｓ Ｆ０２６８（ＨＭＰＲＥＦ６１２３＿０８８７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３６１（ＨＭＰＲＥＦ０６４５＿２７０１）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｎｏｘｉａ ＡＴＣＣ ４３５４１（ＹＢＢＰ）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ ３３３１３（ＨＭＰＲＥＦ０８７７＿００１１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ １１６６４（ＨＭＰＲＥＦ０４９３＿１０１７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．Ｄ２０（ＨＭＰＲＥＦ０９６９＿０２０８７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ ＤＳＭ ２７８２（ＣＰＡＰ＿３９６８）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｖｉｂｒｉｏ ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ＡＨＴ２（ＤＡＡＨＴ２＿０４４５）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＤＳＭ ２０７３１（ＡＣＦＥＲ＿０６０１）、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ ｄｅｆｅｃｔｉｖａ ＡＴＣＣ ４９１７６（ＧＣＷＵ０００１８２＿０００６３）、Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８５０（ＨＭＰＲＥＦ１７０５＿０１１１５）、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ ｍｏｒｂｉ ＡＴＣＣ ５１２７１（ＧＣＷＵ０００２８２＿００６２９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｄ ｓｔｒ．１８７３（ＣＬＧ＿Ｂ１８５９）、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｉｎｖｉｓｕｓ ＤＳＭ １５４７０（ＧＣＷＵ０００３２１＿０１９０６）、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ Ｓ８５ ２ ｓｅｑｓ ＦＳＵ＿００２８、ＦＩＳＵＣ＿２７７６）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｆｒｕｃｔｏｓｏｖｏｒａｎｓ ＪＪ（ＤＥＳＦＲＤＲＡＦＴ＿２８７９）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｏｍａｔｉｓ ＤＳＭ １７６７８（ＨＭＰＲＥＦ０６３４＿０７２７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ Ｌ３７６０３（ＳＴＡＷＡ０００１＿００９４）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ ＡＴＣＣ ３５５８０（ＴＲＥＶＩ０００１＿１２８９）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｕｅｎｏｎｉｓ ６０−３（ＰＯＲＵＥ０００１＿０１９９）、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ６５３−Ｌ（ＨＭＰＲＥＦ０６３１＿１２２８）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｌａｃｒｉｍａｌｉｓ ３１５−Ｂ（ＨＭＰＲＥＦ０６２８＿０７６２）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｅ（ＰＡ００９０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１９８６（ＰＭＭ１０９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０５（ＷＨ７８０５＿０４４４１）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ） ｓｔｒ．ＢＰＬＡＮ（ＢＰＬＡＮ＿５３４）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｏｂｓｉｄｉａｎｓｉｓ ＯＢ４７（ＣＯＢ４７＿０３２５）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０７８ ｓｔｒ．Ｆ０２６２（ＧＣＷＵ０００３４１＿０１３６５）、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＴＫ−６ ２ ｓｅｑｓ ＡＤＯ４６０３４．１、ＨＴＨ＿１６６５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＷＭ１（ＣＬＯＳＡ＿１２４８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ４７２ ｓｔｒ．Ｆ０２９５（ＨＭＰＲＥＦ６７４５＿１６１７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ７８６ ｓｔｒ．Ｄ１４（ＰＯＴＧ＿０３８２２）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １６８４１ ２ ｓｅｑｓ ＲＯＳＥＩＮＡ２１９４＿０２６１４、ＲＯＳＥＩＮＡ２１９４＿０２６１３）、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ｅｌｅｇａｎｓ ＡＴＣＣ ７００６３３（ＨＭＰＲＥＦ０４４６＿０１３８１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｔａｎｎｅｒａｅ ＡＴＣＣ ５１２５９（ＧＣＷＵ０００３２５＿０２８４４）、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ ｓａｔｅｌｌｅｓ ＤＳＭ １４６００（ＧＣＷＵ０００３４２＿０１７２２）、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ ＹＩＴ １２０６７（ＨＭＰＲＥＦ９４４３＿０１５２２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｅ４ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ ＢＬ５２６２（ＣＬＰ＿３９８０）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ １０８（ＣＡＬＨＹ＿２２８７）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ １７７Ｒ１Ｂ（ＣＡＬＫＲ＿０３１４）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｏｗｅｎｓｅｎｓｉｓ ＯＬ（ＣＡＬＯＷ＿０２２８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ ６（ＥＵＢＣＥＤＲＡＦＴ＿１１５０）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ Ｃ５６−ＹＳ９３（ＧＥＯＴＨ＿０１７５）、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ ｐｏｔｅｎｓ ＪＲ（ＴＨＥＲＪＲ＿０３７６）、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＰＣＣ ７３１０２（ＮＰＵＮ＿Ｆ５９９０）、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ ａｄｉａｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ４９１７５（ＹＢＢＰ）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｅｇｇｅｉ ＡＴＣＣ ４３５３１（ＨＭＰＲＥＦ０９０８＿１３６６）、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ ａｌｂｕｓ ＤＳＭ １４４８４（ＴＨＡＬ＿０２３４）、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＳＳＭ１（ＤＥＦＤＳ＿１０３１）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ−１（ＲＦＬＡＦ＿０１０１０００１２４４４）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ ＮＤ１３２（ＤＮＤ１３２＿０８７７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ ５４２７（ＣＬＯＬＥ＿３３７０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｅｓｐｏｅｅｎｓｉｓ Ａｓｐｏ−２（ＤＡＥＳ＿１２５７）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ ＤＳＭ １２６８０（ＳＬＩＰ＿２１３９）、Ｍａｒｉｖｉｒｇａ ｔｒａｃｔｕｏｓａ ＤＳＭ ４１２６（ＦＴＲＡＣ＿３７２０）、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌｕｓ ｂａａｒｓｉｉ ＤＳＭ ２０７５（ＤＥＢＡ＿０７６４）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９３１１（ＳＹＮＣ＿１０３０）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉａｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １２８８５（ＴＭＡＲ＿０２３６）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＦＷ１０１２Ｂ（ＤＦＷ１０１＿０４８０）、Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ ａｎｔｈｒｏｐｉ Ｅ３＿３３ Ｅ１（ＧＣＷＵ０００２４６＿０１５２３）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ８２７１（ＳＧＬＹ＿０４８３）、Ｔｈｅｒｍｏｖｉｂｒｉｏ ａｍｍｏｎｉｆｉｃａｎｓ ＨＢ−１（ＴＨＥＡＭ＿０８９２）、Ｔｒｕｅｐｅｒａ ｒａｄｉｏｖｉｃｔｒｉｘ ＤＳＭ １７０９３（ＴＲＡＤ＿１７０４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ２５２２（ＢＣＥＬＬ＿０１７０）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｖｅｒｏｒａｌｉｓ Ｆ０３１９（ＨＭＰＲＥＦ０９７３＿０２９４７）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ ｓｔｒ．Ｆｕｊｉｓａｗａ（ＥＲＨ＿０１１５）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｓ５（ＳＥＬＩＮ＿２３２６）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４（ＰＣＣ７４２４＿０８４３）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ５１１７０（ＹＢＢＰ）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ １１５６３（ＹＢＢＰ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５０３７ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ８５７９＿１６８２、ＳＭＳＫ２３＿１１１５）、Ｚｕｎｏｎｇｗａｎｇｉａ ｐｒｏｆｕｎｄａ ＳＭ−Ａ８７（ＺＰＲ＿０９７８）、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ（ＨＡＬＳＡ＿１８８２）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ ＸＢ１Ａ（ＢＸＹ＿２９６５０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ Ｌ２−１４（ＲＴＯ＿１６４９０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ Ａ２−１６２（ＣＫ５＿３３６００）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ ＤＳＭ １７６２９（ＥＵＲ＿２４９１０）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＳＬ３／３（ＦＰＲ＿２７６３０）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＲ１／５（ＣＫ１＿３９３３０）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１（ＨＭＰＲＥＦ０９９４＿０１４９０）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ９＿１＿４３ＢＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０９８７＿０１５９１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿４＿５６ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ０９８８＿０１８０６）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５３（ＨＭＰＲＥＦ０９８３＿０１３２８）、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ ｈａｒｂｉｎｅｎｓｅ ＹＵＡＮ−３（ＥＴＨＨＡ＿１６０５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ＡＴＣＣ ２７９５７（ＳＤＤ２７９５７＿０６２１５）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＤＳＭ ６１９２（ＳＴＨＥＲＭ＿Ｃ１８３７０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２＿Ａ＿５７＿ＣＴ２（ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０５４４９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ ＫＳＭ−Ｋ１６（ＡＢＣ０２４１）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆａｔａｔｏｒ ｉｎｄｉｃｕｓ ＤＳＭ １５２８６（ＴＨＥＩＮ＿００７６）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ ＤＳＭ １８１７０（ＢＡＣＳＡ＿１４８６）、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ ＤＳＭ １４９７７（ＯＣＥＰＲ＿２１７８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ ＣＲＩＳ ５Ｃ−Ｂ１（ＨＭＰＲＥＦ９０１９＿２０２８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５３１０（ＨＭＰＲＥＦ０６５０＿０６７５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｍｎｉｉ ＣＲＩＳ ２１Ａ−Ａ（ＨＭＰＲＥＦ９０１８＿０３６５）、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ ｅｘｔｒｕｃｔａ Ｗ１２１９（ＨＭＰＲＥＦ９０１３＿００７８）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ ＤＳＭ １８０１１（ＢＣＯＰ＿０５５８）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｓａ

ｃｃｈａｒｉｖｏｒａｘ ＤＳＭ １７１２８（ＰＲＥＭＵ＿０８３９）、Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＳＭ １４２３７（ＣＥＬＡＬ＿０４８３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ５７０１（ＷＨ５７０１＿１０３６０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ｓｔｒ．Ｗａｌｖｉｓ Ｂａｙ（ＤＥＳＡＦ＿３２８３）、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ Ｓｊｍ１８−２０（ＯＢＶ＿２３３４０）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＭＲＰ（ＤＥＩＰＲ＿０１３４）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ Ｐ ３６−１０８（ＢＡＣＨＥ＿０３６６）、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４（ＰＡＬＰＲ＿１９２３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ ５７４（ＤＥＳＮＩＤＲＡＦＴ＿２０９３）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ＮＩＥＳ−３９（ＢＡＩ８９４４２．１）、Ｍａｈｅｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ ５０−１ ＢＯＮ（ＭＡＨＡＵ＿１８４６）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ Ｒｔ８．Ｂ１（ＴＨＥＷＩ＿２１９１）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ７（ＲＵＭＡＬ＿２３４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＨＫＵ０９−０１（ＳＬＧＤ＿００８６２）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．ｔｙｐｅ＿１ ｓｔｒ．２８Ｌ（ＨＭＰＲＥＦ０８８９＿１０９９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．ＢＶＡＢ３ ｓｔｒ．ＵＰＩＩ９−５（ＨＭＰＲＥＦ０８６８＿１４５３）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３４４（ＰＥＣＬ＿５７１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｕｌｏｒｕｍ Ｆ０３９０（ＨＭＰＲＥＦ９４３１＿０１６７３）、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＰＣ９０９（ＣＵＷ＿０３０５）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ＦＳＬ Ｎ１−０６７（ＮＴ０３ＬＳ＿２４７３）、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ Ｆ０２０４（ＨＭＰＲＥＦ９４３０＿０１２４５）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ Ｆ０３５９（ＨＭＰＲＥＦ９４２９＿００９２９）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３２９ ｓｔｒ．Ｆ００８７ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９０７４＿００８６７、ＨＭＰＲＥＦ９０７４＿０１０７８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ Ｆ０２１１（ＨＭＰＲＥＦ０８１３＿００１５７）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｕｉｓ ＫＩ３８０６（ＭＳＵＩ０４０４０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ ｓｔｒ．Ｆ（ＭＧＦ＿２７７１）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｃｏｐｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ２１２１１（ＤＥＩＭＡ＿０６５１）、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２（ＯＤＯＳＰ＿０２３９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＥＣＴ ５７１６（ＬＣ４０＿０２６５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ ＡＢ−１（ＬＩＮＥＡ＿０１０１００００６０８９）、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＵＣＹＮ−Ａ（ＵＣＹＮ＿０３１５０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＴＭＷ １．１３０４（ＹＢＢＰ）、Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｐａｌｕｄｉｓ ＤＳＭ １８６０３（ＭＵＣＰＡ＿１２９６）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ＺＣ１（ＢＦＺＣ１＿０３１４２）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｏｒｔｅｘ Ｖ４５３（ＰＶＯＲ＿３０８７８）、Ｗａｄｄｌｉａ ｃｈｏｎｄｒｏｐｈｉｌａ ＷＳＵ ８６−１０４４（ＹＢＢＰ）、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ ｓｉｎｕｓａｒａｂｉｃｉ ＤＳＭ ４９４７（ＦＬＥＸＳＩ＿０９７１）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ＹＫ９（ＰＡＥＣＵＤＲＡＦＴ＿１８８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｆ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｋ１０（ＣＬＳ＿０３２９０）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｈａｈｉｉ ＷＡＬ ８３０１（ＡＬ１＿０２１９０）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ Ｔ２−８７（ＥＣ１＿００２３０）、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ ＧＤ／７（ＣＣ１＿３２４６０）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｌ２−６（ＦＰ２＿０９９６０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ ＤＳＭ １９７３２（ＣＬＯＣＬ＿２９８３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ １９４２（ＢＡＴＲ１９４２＿１９５３０）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＦＨ（ＭＰＮＥ＿０２７７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ２＿１＿４６ＦＡＡ（ＨＭＰＲＥＦ９４７７＿０００５８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ ＷＡＬ−１４１６３（ＨＭＰＲＥＦ９４７４＿０１２６７）、Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ ｇａｄｅｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２８６（ＨＭＰＲＥＦ９４５５＿０２７６４）、Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｉｉ ＤＳＭ ２２８３６（ＨＭＰＲＥＦ９４５６＿００４０１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ ＳＡ−０１（ＴＳＣ＿Ｃ２４３５０）、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．２１（ＳＰＨ２１＿１２３３）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｃａｌｄａｒｉａ ＤＳＭ ７３３４（ＳＰＩＣＡ＿１２０１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１２（ＰＭＴ９３１２＿１１０２）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１３（ＰＭＴ＿１０５８）、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ ＫＬＥ１２５５（ＨＭＰＲＥＦ９４３６＿００９４９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＳＴ１（ＬＣＲＩＳ＿００７２１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ １３５２８（ＣＬＪＵ＿Ｃ４０４７０）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ Ｂ１４（ＰＢＲ＿２３４５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ Ｆ０４２１（ＨＭＰＲＥＦ９５５４＿０２０１２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＢＮＬ１１００（ＣＬＯ１１００＿２８５１）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｖａｇｉｎａｔｕｓ ＦＧＰ−２（ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿１３７７）、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ ９５／１０００（ＢＰ９５１０００＿０６７１）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １７３７４（ＳＰＩＣＯ＿１４５６）、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ ＤＳＭ １１００（ＨＡＬＨＹ＿５７０３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ ＤＳＭ ６１１５（ＤＥＳＫＵ＿２８８３）、Ｒｕｎｅｌｌａ ｓｌｉｔｈｙｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １９５９４（ＲＵＮＳＬ＿２８５９）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｋｉｍｃｈｉｉ ＩＭＳＮＵ １１１５４（ＬＫＩ＿０８０８０）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇａｓｉｃｏｍｉｔａｔｕｍ ＬＭＧ １８８１１（ＯＳＳＧ）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ ＤＳＭ １２１４５（ＰＥＤＳＡ＿３６８１）、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｘｙｌａｎｉｐｈｉｌａ ＹＩＴ １１８４１（ＨＭＰＲＥＦ９４４２＿００８６３）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃｌａｒｕｓ ＹＩＴ １２０５６（ＨＭＰＲＥＦ９４４５＿０１６９１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｌｕｘｕｓ ＹＩＴ １２０５７（ＨＭＰＲＥＦ９４４６＿０３３０３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｌｉｓ ２２８５−９７（ＳＴＲＵＲ＿１３７６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ ＮＣＴＣ １１５５８（ＳＴＲＭＡ＿０８６６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｃｔａｌｕｒｉ ７０７−０５（ＳＴＲＩＣ＿０９９８）、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ ＤＧ−６（ＯＳＣＴ＿２８２１）、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａｅ ＵＶ−７（ＹＢＢＰ）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｆ０２８９（ＨＭＰＲＥＦ９１３７＿０３１６）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １１０ ｓｔｒ．Ｆ０１３９（ＨＭＰＲＥＦ９１２６＿０５３４）、Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｖｉｂｒｉｏ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＤＳＭ １９６７２（ＣＡＬＮＩ＿１４４３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔｉｓ ＤＳＭ ７６５（ＤＥＳＯＲ＿０３６６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ｂｖ．２ ｓｔｒ．Ｆ０３９２（ＨＭＰＲＥＦ９１７８＿０６０２）、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＯＰＢ４５（ＴＯＰＢ４５＿１３６６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０２（ＳＹＮＷ０９３５）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ ＬＸ−１１（ＴＨＥＸＹ＿０３８４）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈａｅｍｏｆｅｌｉｓ Ｏｈｉｏ２（ＭＨＦ＿１１９２）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ Ｃｃ５（ＣＣＡＮ＿１６６７０）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＤＳＭ ２０２８４（ＨＭＰＲＥＦ０６２３＿１６４７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍａｒｓｈｉｉ ＤＳＭ １６９７３（ＨＭＰＲＥＦ０６５８＿１６００）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６４０（ＨＭＰＲＥＦ９２２５＿１４９５）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒａｘ ｍａｒｉｎｕｓ ＳＪ（ＢＭＳ＿２１２６）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １４９ ｓｔｒ．６７Ｈ２９ＢＰ（ＨＭＰＲＥＦ９１６６＿２１１７）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｙｕｒｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｇａｒｅｔｉａｅ ＡＴＣＣ ４３７１５（ＨＭＰＲＥＦ０３７９＿１１７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ ＡＴＣＣ ６２４９（ＨＭＰＲＥＦ８５７１＿１４１４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０７１ ｓｔｒ．７３Ｈ２５ＡＰ（ＨＭＰＲＥＦ９１８９＿０４１６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ ＦＢ０３５−０９ＡＮ（ＨＭＰＲＥＦ９２９６＿１１４８）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅ ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａ（ＨＭＰＲＥＦ９２４３＿００６１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａ ＡＣＳ−０４９−Ｖ−Ｓｃｈ６（ＨＭＰＲＥＦ９３２１＿０２８２）、Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈａｇａ ｌｙｔｉｃａ ＤＳＭ ７４８９（ＣＥＬＬＹ＿２３１９）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ ＤＳＭ １３９６５（ＴＨＥＳＵＤＲＡＦＴ＿０４１１）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｕｍ ＤＳＭ １１６９９（ＤＥＳＴＥＲ＿０３９１）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｕｃｃｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ２４８９（ＴＲＥＳＵ＿１１５２）、Ｍａｒｉｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ ＤＳＭ １４８８４（ＭＡＲＫＹ＿１８６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＳＫ１３０２（ＳＩＮ＿０８２４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ ＮＣＦＤ ２０２０（ＳＰＢ＿０８０８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｏｒｃｉｎｕｓ ｓｔｒ．Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ １７６（ＳＴＲＰＯ＿０１６４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｉ ＨＳ−６（ＳＴＲＣＲ＿１１３３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ Ｆ０２８７（ＨＭＰＲＥＦ１９７７＿０７８６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｏｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３２６９（ＨＭＰＲＥＦ０６６３＿１０６７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ ＤＳＭ ２０７０７（ＰＯＲＡＳ＿０６３４）、Ａｎａｅｒｏｃｏ

ｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＡＣＳ−０６５−Ｖ−Ｃｏｌ１３（ＨＭＰＲＥＦ９２９０＿０９６２）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３７５ ｓｔｒ．Ｆ０４３６（ＨＭＰＲＥＦ９１３０＿１６１９）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １５８ ｓｔｒ．Ｆ０４１２（ＨＭＰＲＥＦ９１９９＿０１８９）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １３７ ｓｔｒ．Ｆ０４３０（ＨＭＰＲＥＦ９１６２＿２４５８）、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ ＤＳＭ ７４５（ＣＹＣＭＡ＿２５２５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｃａ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ １１１０９（ＤＥＳＡＣ＿１４７５）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＰＡＭ ５５（ＬＩＶ＿２１１１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｔｒ．Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ（ＤＶＵ＿１２８０）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｔｒ．’Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｆ’（ＤＶＭＦ＿００５７）、Ｍｕｒｉｃａｕｄａ ｒｕｅｓｔｒｉｎｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １３２５８（ＭＵＲＲＵ＿０４７４）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ ＫＣＴＣ ３７７３（ＬＡＲＧＫ３＿０１０１００００８３０６）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ ＳＣ２（ＰＰＳＣ２＿Ｃ４７２８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｂｕｒｒｅｕｍ ＤＳＭ ３９８６（ＨＭＰＲＥＦ０３８１＿２５１８）、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ２３２６３（ＨＭＰ０７２１＿０３１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ９０３（ＨＭＰＲＥＦ８５７７＿０２３３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ ＡＴＣＣ ４９２９６（ＨＭＰＲＥＦ８５７８＿１８２０）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３３８ ｓｔｒ．Ｆ０２３４（ＨＭＰＲＥＦ９０７１＿１３２５）、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｉ ＤＳＭ ２７７８（ＨＭＰＲＥＦ９０８１＿２３３２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ ＤＳＭ １６６０８（ＨＭＰＲＥＦ９１４１＿０３４６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｒｏｒｉｓ ＡＴＣＣ ７００７８０（ＨＭＰＲＥＦ９１８０＿０４３４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓａｌｉｖａｅ ＤＳＭ １５６０６（ＨＭＰＲＥＦ９４２０＿１４０２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ７００６４１ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９９６１＿０９０６、ＨＭＰＲＥＦ９４２１＿１７２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｓｔａｔｕｓ ＡＴＣＣ ５１１００ ２ ｓｅｑｓ ＨＭＰＲＥＦ９４２２＿０７７６、ＨＭＰＲＥＦ９９６０＿０５３１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ３０ＳＣ（ＬＡＣ３０ＳＣ＿０３５８５）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ ＫＩＳＴ６１２（ＥＬＩ＿０７２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ Ｆ０４１５（ＨＭＰＲＥＦ９１７６＿１２０４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ０５６ ｓｔｒ．Ｆ０４１８（ＨＭＰＲＥＦ９１８２＿０３３０）、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １０８ ｓｔｒ．Ｆ０４２５（ＨＭＰＲＥＦ９１２４＿１２８９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ Ｆ０３９６（ＨＭＰＲＥＦ９１９２＿１５２１）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｒｅｎｎａｂｏｒｅｎｓｅ ＤＳＭ １２１６８（ＴＲＥＢＲ＿１１６５）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｆａｌｌａｘ ＫＣＴＣ ３５３７（ＬＦＡＬＫ３＿０１０１００００８６８９）、Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｌｅｏｃｏｌａ ＡＣＳ−１３９−Ｖ−Ｃｏｌ８（ＨＭＰＲＥＦ９２５７＿０２３３）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｅｉ ＡＣＳ−１４６−Ｖ−Ｓｃｈ２ｂ（ＨＭＰＲＥＦ９２８６＿００４２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＨＧＦ２（ＨＭＰＲＥＦ９４０６＿３６９２）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｐ．ＨＧＢ５（ＨＭＰＲＥＦ９７２０＿２７８５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔａｌｉｓ ＤＳＭ ３６８８（ＰＲＥＤＥ＿０１３２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ ＳＰＩＮ ２００２６（ＨＭＰＲＥＦ９３２０＿０６４３）、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ ＵＰＩＩ ３４５−Ｅ（ＨＭＰＲＥＦ９２２０＿００１８）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＫＡＣＣ １１８６２（ＷＣＩＢＫ１＿０１０１００００１１７４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ＫＣＴＣ ３１６７（ＬＣＯＲＣＫ３＿０１０１００００１９８２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５（Ｓ７３３５＿３８６４）、Ｏｗｅｎｗｅｅｋｓｉａ ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３６８（ＯＷＥＨＯ＿３３４４）、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ−１（ＡＮＴ＿０９４７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ Ｕｏ５（ＳＯＲ＿０６１９）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ ＫＣＴＣ ３５２７（ＬＧＥＬＫ３＿０１０１００００６７４６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＢＫＴ０１５９２５（ＣＢＣ４＿０２７５）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１１（Ｐ９２１１＿１０９５１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１５（Ｐ９２１５＿１２２７１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ ８３２５（ＳＡＯＵＨＳＣ＿０２４０７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＣＯＬ（ＳＡＣＯＬ２１５３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ ＫＣＴＣ ３５０１（ＬＡＮＩＫ３＿０１０１０００００２９０）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＫＣＴＣ ３５４４（ＦＦＲＵＫ３＿０１０１００００６７５０）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ ＤＳＭ １０３０（ＡＷＯ＿Ｃ２８２００）、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｎｇｈａｅｎｓｉｓ ＭＰＡ１Ｕ２（ＧＰＤＭ＿１２１７７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＫＣＴＣ ３６８１（ＬＦＡＲＫ３＿０１０１００００９９１５）、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５３１１（ＭＰＴＰ＿０８３５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＫＣＴＣ ３５４３（ＬＦＲＵＫ３＿０１０１００００２６５７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＨＧＦ７（ＨＭＰＲＥＦ９４１３＿５５６３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ Ｆ０４２３（ＨＭＰＲＥＦ９１０２＿１０８１）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ７８０ ｓｔｒ．Ｆ０４２２（ＨＭＰＲＥＦ９２００＿１１１２）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ３９３ ｓｔｒ．Ｆ０４４０（ＨＭＰＲＥＦ９１２７＿１１７１）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １２１７２（ＴＥＨ＿１３１００）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｃｈｌｏｒａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ Ｂ（ＣＡＢＴＨＥＲ＿Ａ１２７７）、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｃａｐｈａｒｃａｅ ＴＷ２５（ＯＴＷ２５＿０１０１０００２０３９３）、Ｌａｃｉｎｕｔｒｉｘ ｓｐ．５Ｈ−３−７−４（ＬＡＣＡＬ＿０３３７）、Ｋｒｏｋｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．４Ｈ−３−７−５（ＫＲＯＤＩ＿０１７７）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ ＥＤ９９（ＳＰＳＥ＿０６５９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ ＭＳＨＲ１１３２（ＣＣＥ５９８２４．１）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒａｅ ＨＰＬ−００３（ＨＰＬ００３＿０３６６０）、Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ ＴＡ２．Ａ１（ＣＡＴＨＴＡ２＿０８８２）、Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ ｓｐ．８４３７（ＨＭＰＲＥＦ９３７４＿２８９７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ ３３５６３（ＨＭＰＲＥＦ９４１９＿１４１５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｐａｌｌｅｎｓ ＡＴＣＣ ７００８２１（ＨＭＰＲＥＦ９１４４＿０１７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｘ（ＨＭＰＲＥＦ１１２４。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いサイクリックジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いサイクリックジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いサイクリックジＡＭＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリックジＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＧＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いサイクリックジＧＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いサイクリック−ジＧＡＭＰを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、サイクリック−ジＧＡＭＰを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰおよび／またはＧＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰおよび／またはＧＴＰを消費する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば細胞培養下の、マクロファージおよび／または樹状細胞中のＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡレベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡは、投与される細菌の用量に依存して増加する。一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば腫瘍内の、マクロファージおよび／または樹状細胞中のＩＦＮ−β１ ｍＲＮＡレベルを上昇させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮ−ベータ１増加は、投与される細菌の投薬量に依存する。
一実施形態では、腫瘍内でのＩＦＮ−ベータ１産生は、同じ条件下、同じ亜型の未改変細菌の投与時に、例えば、細菌の初回注射後２日目に、観察されるＩＦＮ−ベータ１産生レベルと比較して、約２倍、約３倍、約４倍である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば刺激後４時間の時点で、骨髄由来樹状細胞において約６，０００〜２５，０００、１５，０００〜２５，０００、６，０００〜８，０００、２０，０００〜２５，０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ ｂ１ ｍＲＮＡの産生を誘導する。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば刺激後２または４時間の時点で、骨髄由来樹状細胞におけるＩＦＮ−ｂ１産生を用量依存的に増加させることができる。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための別の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、例えば、細菌処置３回のレジメン後４または９日の時点で、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して腫瘍体積を低減させることができる。非限定的な例では、腫瘍体積は、９日後、約０〜３０ｍｍ３である。
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇させることができる。一部の実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１００％奏功率を達成する。
一部の実施形態では、奏功率は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、奏功率は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高い。
一部の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼ、ジアデニル酸シクラーゼ、または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高度の腫瘍退縮を達成する。一部の実施形態では、腫瘍退縮は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、腫瘍退縮は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度である。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍流入領域リンパ節における総Ｔ細胞数を増加させる。一部の実施形態では、腫瘍流入領域リンパ節における総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％であるか、またはそれより大きい。一部の実施形態では、総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、総Ｔ細胞数の増加は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍大きい。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍流入領域リンパ節における活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを上昇させる。
一部の実施形態では、腫瘍流入領域リンパ節における活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％であるか、またはそれより高い。一部の実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものに比べて約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍である。さらに別の実施形態では、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高い。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、活性化エフェクターＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより２〜４倍高い。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内の先天的サイトカインの早期上昇、およびその後のエフェクターＴ細胞応答の上昇を達成する。
一部の実施形態では、腫瘍微小環境における、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、免疫学的抑制を克服することができ、強固な自然および適応抗腫瘍免疫応答を生成することになる。一部の実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、調節性Ｔ細胞の増殖または蓄積を阻害する。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータおよびＭＣＰ−１を含むがこれらに限定されない、腫瘍内の先天的サイトカインの早期上昇を達成する。
一部の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより多く誘導される。一部の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＩＬ−６は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより多く誘導される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ｄａｃＡであり、誘導されるＩＬ−６のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２〜３倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内のＩＬ−１ベータのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、ＩＬ−１ベータのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより、約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１ベータのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＩＬ−１ベータのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内のＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより、約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＭＣＰ１のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、ｄａｃＡ（またはＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための他の酵素）をコードする遺伝子配列を含む、遺伝子操作された細菌は、グランザイムＢ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含むがこれらに限定されない、エフェクターＴ細胞応答に対して関連性のある分子の活性化を達成する。
一部の実施形態では、腫瘍内のグランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより、約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、グランザイムＢのレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍、３倍、または４倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内のＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより、約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＩＬ−２のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、または５倍高い。
一部の実施形態では、腫瘍内のＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより大きく上昇される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより、約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより大きく上昇される。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく上昇される。一実施形態では、細菌にコードされた遺伝子は、ＤａｃＡであり、ＩＬ−１５のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２ ３倍、４倍、または５倍高い。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＤａｃＡをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０の配列を含む。さらに別の実施形態では、ｄａｃＡ遺伝子は、配列番号１２１０の配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０９と少なくとも約８０％の同一性を有するＤａｃＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０９と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＤａｃＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０９と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＤａｃＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０９と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＤａｃＡポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２０９を含むＤａｃＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１２０９からなる。
一部の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼ、ジアデニル酸シクラーゼ、または他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドは、例えば、安定性を増強させるために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼまたは他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼまたは他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生ポリペプチドを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする。一部の実施形態では、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、例えば、安定性を増強させるために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのサイクリック−ジＡＭＰシンターゼをコードする。一部の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのジアデニル酸シクラーゼは、例えば、安定性を増強させるために、またはＳＴＩＮＧ作動作用を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生するための酵素、例えば、サイクリック−ジＡＭＰシンターゼおよび／またはを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えば、サイクリック−ジＡＭＰシンターゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管または腫瘍内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰシンターゼ、の発現のための回路網を含むがこれらに限定されない、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰシンターゼ、の発現のための回路網を含むがこれに限定されない、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物の染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、あるいは抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
一実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の投与は、アブスコパル効果を惹起する。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ（deadenylate cyclase）をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌の投与は、アブスコパル効果を惹起する。一実施形態では、アブスコパル効果は、２日目〜３日目の間に観察される。
エフェクター免疫細胞（免疫刺激因子）の活性化
Ｔ細胞活性化因子
サイトカインおよびサイトカイン受容体
ＣＤ４（表面抗原分類４）は、免疫細胞、例えば、細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、他の種類の免疫細胞にシグナルを送ることによって、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて、他の免疫細胞を支援するように働く、白血球である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原とともに提示されると活性化される。活性化されると、ヘルパーＴ細胞は分裂し、活性免疫応答を調節または支援するサイトカインを分泌する。ヘルパーＴ細胞は、いくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、そのようなサブタイプは、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９またはＴＦＨ細胞を含み、これらは、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を助長する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、それらの表面でＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。細胞傷害性Ｔ細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合している抗原と結合することにより、それらの標的を認識する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞をモジュレートする、１つまたは複数の抗がん分子を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のエフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する、１つまたは複数の抗がん分子を産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する、サイトカインである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）から選択される１つまたは複数のサイトカインを産生する。本明細書で使用される場合、１つまたは複数のサイトカインの産生は、別のサイトカインまたは他の免疫モジュレーション分子に連結されたペプチドを介して融合されている、１つまたは複数のサイトカインを含む融合タンパク質を含む。例としては、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、本明細書に記載のすべてのアゴニストおよびアンタゴニストを、ペプチドリンカーを介して目的の別のポリペプチドと融合させて、それらの機能を向上させることまたは変更することができる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−ガンマから選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、１つまたは複数のサイトカイン融合タンパク質をコードする。そのような融合タンパク質の非限定的な例としては、抗体ポリペプチドに作動可能に連結した１つまたは複数のサイトカインポリペプチドであって、抗体が、腫瘍特異的抗原を認識することによってサイトカインを腫瘍と近接させる、サイトカインポリペプチドが挙げられる。
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、その作用が自然免疫と適応免疫間の相互接続を生じさせる、サイトカインである。ＩＬ−１２は、活性化樹状細胞、単球、マクロファージおよび好中球はもちろん、他の細胞型も含む、多数の免疫細胞によって分泌される。ＩＬ−１２は、ｐ３５およびｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体タンパク質（ＩＬ−１２−ｐ７０；ＩＬ−１２−ｐ３５／ｐ４０）であり、ＩＬ−１２Ｒ−β１およびＩＬ−１２Ｒ−β２という２つのサブユニットで構成されている受容体と結合する。ＩＬ−１２受容体は、ＮＫ細胞、ＴおよびＢリンパ球を含む、多数の免疫細胞上に、構成的または誘導的に発現される。ＩＬ−１２が結合すると、受容体は、活性化され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介した下流のシグナル伝達が開始され、その結果として、ＩＬ−１２に対する細胞応答が生じる。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２作用の最も強力なメディエーターであるＩＦＮ−γのＮＫ細胞およびＴ細胞からの産生を増加させることによって作用する。加えて、ＩＬ−１２は、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の成長および細胞傷害性を促進し、ＣＤ４＋Ｔｈ０細胞の分化をＴｈ１表現型にシフトさせる。さらに、ＩＬ−１２は、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、およびＩｇＧの誘導、およびＢ細胞からのＩｇＥ産生の抑制を増強する。加えて、ＩＬ−１２はまた、骨髄系由来サプレッサー細胞の再プログラミングに関与し、Ｔｈ１型免疫応答を指示し、ＭＨＣクラスＩ分子の発現の増加を助長する（例えば、Waldmannら、Cancer Immunol Res ２０１５年３月、３巻；２１９頁に概説されている）。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２（すなわち、ｐ３５およびｐ４０サブユニット）をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−１２遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−１２を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−１２遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２の産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１２をコードするための配列、およびＩＬ−１２の分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、Ｌ−１２および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つのインターロイキン−１２単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））がリンカーにより共有結合で連結されている、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリングリシンリッチリンカーである。一実施形態では、遺伝子配列は、「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」のアミノ酸数１５のリンカーが、強制二量体ヒトＩＬ−１２（ｄｉＩＬ−１２）融合タンパク質を産生するように、２つの単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））の間に挿入されている、構築物をコードする。一部の実施形態では、遺伝子配列は、発現のために、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、コドン最適化される。遺伝子操作された細菌が、２つのサブユニットが連結されているＩＬ−１２の発現のための遺伝子配列を含む、実施形態のいずれにおいても、遺伝子配列は、分泌タグをさらに含むことができる。分泌タグは、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の分泌タグのいずれかを含む。非限定的な例としては、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ｆｄｎＧ、ｄｍｓＡ、ＰｅｌＢ、ＨｌｙＡ、アドヘシン（ＥＣＯＬＩＮ＿１９８８０）、ＤｓｂＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿２１５２５）、ＧｌｔＩ（ＥＣＯＬＩＮ＿０３４３０）、ＧｓｐＤ（ＥＣＯＬＩＮ＿１６４９５）、ＨｄｅＢ（ＥＣＯＬＩＮ＿１９４１０）、ＭａｌＥ（ＥＣＯＬＩＮ＿２２５４０）、ＯｐｐＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０７２９５）、ＰｅｌＢ、ＰｈｏＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）、ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）、ＴｏｌＢ、ｔｏｒｔ、ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、ｍｇｌＢ、およびｌａｍＢ分泌タグが挙げられる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがある、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがある、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットは、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットは、配列番号１１６９、配列番号１１７０、配列番号１１７１、配列番号１１７２、配列番号１１７３、配列番号１１７４、配列番号１１７５、配列番号１１７６、配列番号１１７７、配列番号１１７８、配列番号１１７９、配列番号１１９１、配列番号１１９２、配列番号１１９３、および配列番号１１９４から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌が、ＩＬ−１２（ｐ４０）サブユニットに連結されたＩＬ−１２（ｐ３５）サブユニットをコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、Ｖ５、ＦＬＡＧまたはＨｉｓタグなどの、タグをコードする配列の１つまたは複数は、除去される。他の実施形態では、分泌タグは除去され、異なる分泌タグにより置換される。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１２を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１２を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１２を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、例えば４時間の誘導後、培地１ｍｌ当たり少なくとも約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００ｐｇを産生する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば４時間の誘導後、培地１ｍｌ当たり少なくとも約１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００ｐｇを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−１２を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１２を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１２を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１２を分泌する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２に対して遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１５および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＩＬ−１５回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＩＬ−１２をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
ＩＬ−１５は、自然免疫系と適応免疫系両方の恒常性において多面的機能を示し、３つのサブユニットで構成されているヘテロ三量体受容体であるＩＬ−１５受容体と結合する。アルファサブユニットは、ＩＬ−１５に特異的であるが、ベータ（ＣＤ１２２）およびガンマ（ＣＤ１３２）サブユニットは、ＩＬ−２受容体と共有され、ＪＡＪ／ＳＴＡＴ経路を介して共同でシグナル伝達することができる。
ＩＬ−１５は、樹状細胞、単球およびマクロファージを含む、いくつかの細胞型により産生される。同じ細胞において産生されたＩＬ−１５ＲαおよびＩＬ−１５の同時発現は、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒαとの細胞内結合を可能にし、これは、その後、複合体として細胞表面にピストン輸送される。細胞表面にピストン輸送されると、次いで、これらの細胞のＩＬ−１５Ｒαは、ＩＬ−１５を発現しないＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞のＩＬ−１５Ｒβ−γｃに、ＩＬ−１５をトランス提示することができ、これにより、いわゆる免疫学的シナプスの形成が誘導される。マウスおよびヒトＩＬ−１５Ｒαは、両方とも、結合した膜中に存在し、およびまた可溶性形態で存在する。可溶性ＩＬ−１５Ｒα（ｓＩＬ−１５Ｒα）は、膜貫通受容体からタンパク質切断によって構成的に生成される。
ＩＬ−１５は、リンパ球発生、および自然免疫細胞の末梢維持、ならびにＴ細胞、特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の免疫学的記憶に、非常に重要である。ＩＬ−２とは対照的に、ＩＬ−１５は、Ｔｒｅｇの維持を促進せず、さらに、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２により媒介される活性化誘導細胞死からエフェクターＴ細胞を保護することが示されている。
それ故に、ＩＬ−１５の送達は、長期にわたる抗腫瘍免疫のための有望な戦略と考えられる。組換えヒトＩＬ−１５のヒトで初めての臨床試験において、ＮＫ細胞１０倍拡大増殖、ならびにγδＴ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の有意な増加が、処置時に観察された。加えて、サイトカイン−受容体融合複合体を含有するＩＬ−１５スーパーアゴニストが開発され、応答長を延長することが評価されている。これらは、Ｌ−１５ Ｎ７２Ｄスーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体（ＩＬ−１５ＳＡ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｆｃ；ＡＬＴ−８０３）を含む（Kimら、２０１６年 IL-15 superagonist/IL-15RαSushi-Fc fusion complex (IL-15SA/IL- 15RαSu-Fc; ALT-803) markedly enhances specific subpopulations of NK and memory CD8+ T cells, and mediates potent anti-tumor activity against murine breast and colon carcinomas）。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５を産生するように操作されている。
ＩＬ−１５の生物活性は、ＩＬ−１５を融合タンパク質ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃと前もって会合させることによって、または細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランス提示を模倣するためのＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合（ハイパーＩＬ−１５）によって、大きく向上される。単独で、またはＩＬ−１５Ｒαとの複合体として、いずれかで投与されたＩＬ−１５は、動物モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示す（Chengら、Immunotherapy of metastatic and autochthonous liver cancer with IL-15/IL-15Rα fusion protein；Oncoimmunology．２０１４年；３巻（１１号）：ｅ９６３４０９頁、およびその中の参考文献）。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−１５遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−１５を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−１５遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５の産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５Ｒａをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードするための配列、およびＩＬ−１５Ｒａをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａを含む融合ポリペプチドをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードするための配列、およびＩＬ−１５の分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。例示的な分泌タグには、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ｆｄｎＧ、ｄｍｓＡ、ＰｅｌＢ、ＨｌｙＡ、アドヘシン（ＥＣＯＬＩＮ＿１９８８０）、ＤｓｂＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿２１５２５）、ＧｌｔＩ（ＥＣＯＬＩＮ＿０３４３０）、ＧｓｐＤ（ＥＣＯＬＩＮ＿１６４９５）、ＨｄｅＢ（ＥＣＯＬＩＮ＿１９４１０）、ＭａｌＥ（ＥＣＯＬＩＮ＿２２５４０）、ＯｐｐＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０７２９５）、ＰｅｌＢ、ＰｈｏＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）、ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）、ＴｏｌＢ、ｔｏｒｔ、ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、ｍｇｌＢ、およびｌａｍＢ分泌タグが含まれるが、これらに限定されない。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、ＮＫ細胞の拡大増殖を促進する。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させることができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍高度に、γδＴ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きい親和性によりＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きい親和性でＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きい親和性で、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質受容体と結合することができる。
一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。一実施形態では、ＩＬ−１５分泌株は、同じ条件下で、同じ量で、ｒｈＩＬ１５のものに匹敵するＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する。
一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＣＤ３＋ＩＬ１５ＲＡアルファ＋Ｔ細胞において、ＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導することができる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれよりもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはもっと高レベルにＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。一実施形態では、ＩＬ−１５分泌株は、同じ条件下で、同じ量で、ｒｈＩＬ１５のものに匹敵するＳＴＡＴ３リン酸化を誘導する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する１つまたは複数のＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される１つもしくは複数のポリペプチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。他の特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１３３、配列番号１１３４、配列番号１１３５、配列番号１１３６から選択される１つまたは複数のポリペプチドからなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合タンパク質またはその断片もしくは機能性バリアントをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１５、ＩＬ−Ｒアルファ、リンカー、およびＩＬ−１５−ＩＬ１５Ｒアルファ融合タンパク質配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたはその機能性断片と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。他の特定の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号１３３８、配列番号１３３９、配列番号１３４０、配列番号１３４１、配列番号１３４２、配列番号１３４３、配列番号１３４４から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドからなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１５融合タンパク質、またはその断片もしくは機能性バリアントをコードする、遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、遺伝子配列ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列は、配列番号１３４５、配列番号１２００、配列番号１２０１、配列番号１２０２、配列番号１２０３、配列番号１２０４、および配列番号１１９９から選択される配列からなる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードし、タグをコードする配列の１つまたは複数は、除去される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する本明細書に記載のＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７、および配列番号１１９８から選択される配列またはその機能性断片と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７および配列番号１１９８から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質は、配列番号１１９５、配列番号１１９６、配列番号１１９７および配列番号１１９８から選択される配列からなる。遺伝子操作された細菌がＩＬ−１５またはＩＬ−１５融合タンパク質をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、分泌タグを除去してもよく、異なる分泌タグで置換してもよい。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１５および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１５を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＩＬ−１５回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
一部の実施形態では、ＩＬ−１５は、分泌される。一部の実施形態では、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５の産生のための遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０は、分泌される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグを含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
細菌がＩＬ−１５および／またはＣＸＣＬ１０をコードする、これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一部の実施形態では、細菌は、ｔｒｐＥにおいて突然変異または欠失をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、トリプトファンの産生のための遺伝子配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、トリプトファンの産生のための遺伝子配列は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ａｒｏＧおよびＳｅｒＡから選択される。一部の実施形態では、ａｒｏＧは、ａｒｏＧのフィードバック耐性形態（ａｒｏＧｆｂｒ）である。一部の実施形態では、ｔｒｐＥは、ｔｒｐＥのフィードバック耐性形態（ｔｒｐＥｆｂｒ）である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＲにおいて突然変異または欠失をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｎａＡにおいて突然変異または欠失をさらに含む。
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγまたはＩＩ型インターフェロン）は、ウイルス、一部の細菌および原虫感染に対する自然または適応免疫に、非常に重要なサイトカインである。ＩＦＮγは、マクロファージを活性化し、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子発現を誘導する。ＩＦＮγは、ウイルス複製を阻害することができ、免疫系において免疫刺激および免疫モジュレーション効果を有する。ＩＦＮγは、主として、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞により自然免疫応答の一部として、ならびにＣＤ４ Ｔｈ１およびＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞により産生される。抗原特異的免疫が発生すると、ＩＦＮγは、ヘルパーＴ細胞（特に、Ｔｈ１細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞）およびＮＫ細胞のみによって分泌される。ＩＦＮγは、非常に多くの免疫刺激効果を有し、免疫系においていくつかの異なる役割を果たし、そのような役割には、ＮＫ細胞活性の促進、マクロファージの抗原提示およびリソソーム活性の増大、誘導性一酸化窒素シンターゼｉＮＯＳの活性化、活性化血漿Ｂ細胞からのある特定のＩｇＧの産生、細胞免疫につながるＴｈ１分化の促進が含まれる。ＩＦＮγはまた、正常細胞に、抗原提示細胞上でのクラスＩ ＭＨＣ分子はもちろんクラスＩＩ ＭＨＣの発現を増加させ、白血球遊走に関連する接着および結合を促進し、マクロファージの、それらが細胞内生物を死滅させる点でより強力になるような、活性化による肉芽腫形成に関与する。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＦＮ−γを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＦＮ−γをコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＦＮ−γ遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＦＮ−γを過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＦＮ−γ遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＦＮ−γ遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＦＮ−γを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＦＮ−γを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＦＮ−γおよび／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＦＮ−γを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＦＮ−ガンマを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＦＮ−ガンマを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＦＮ−ガンマを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＦＮ−ガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＩＦＮ−ガンマを分泌する。
一部の実施形態では、ＩＦＮ−ガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮ−ガンマをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、マクロファージ細胞系においてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。これらの実施形態のいずれにおいても、ＩＦＮ−ガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％もしくはそれより高レベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍もしくはそれより高レベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより高いレベルにＳＴＡＴ１リン酸化を誘導する。
１つの特定の実施形態では、細菌は、腫瘍におけるＩＦＮガンマ産生を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して腫瘍１グラム当たり０．１、０．２、０．３ｎｇ増加させることができる。１つの特定の実施形態では、細菌は、ＩＦＮガンマ産生を、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して約５、１０または１５倍増加させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの存在下で、ならびに／あるいは腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物において、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載のＩＦＮ−ガンマ回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマをコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、ＩＦＮガンマをコードする遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、ＩＦＮガンマをコードする記載の遺伝子配列のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
インターロイキン−１８（ＩＬ１８、これは、インターフェロン−ガンマ誘導因子としても公知である）は、ＩＬ−１スーパーファミリーに属する炎症性サイトカインであり、マクロファージおよび他の細胞により産生される。ＩＬ−１８は、インターロイキン−１８受容体と結合し、ＩＬ−１２と一緒に、ＩＬ−１８は、リポ多糖（ＬＰＳ）のような微生物産物による感染後に細胞媒介免疫を誘導する。ＩＬ−１８で刺激されると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびある特定の１型ヘルパーＴ細胞は、マクロファージおよび他の免疫細胞の活性化に関与するインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはＩＩ型インターフェロンを放出する。ＩＬ−１８はまた、重篤な炎症反応を誘導しうる。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−１８遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−１８を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−１８遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−１８遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１８および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−１８を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte）、多くの場合、リンパ球）の活性を調節するサイトカインである。ＩＬ−２は、微生物感染に対する、および外来のもの（「非自己」）と「自己」とを区別する際の、身体の自然応答の一部である。ＩＬ−２は、リンパ球により発現されるＩＬ−２受容体と結合することによってその効果を媒介する。ＩＬ−２は、サイトカインファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１も含む。ＩＬ−２は、アルファ、ベータおよびガンマサブユニットからなる複合体であるＩＬ−２受容体を介してシグナルを伝達する。ガンマサブユニットは、このサイトカイン受容体ファミリーのすべてのメンバーによって共有される。ＩＬ−２は、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞への分化を促進し、最初のＴ細胞が抗原により刺激されたときにメモリーＴ細胞への分化を促進する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数および機能の拡大に依存する、Ｔ細胞の免疫学的記憶の発生におけるその役割によって、ＩＬ−２はまた、細胞媒介免疫において肝要な役割を果たす。ＩＬ−２は、食品医薬局（ＦＤＡ）によって、および欧州数カ国で、がん（悪性黒色腫、腎細胞がん）の処置に認可されている。ＩＬ−２は、黒色腫転移を処置するためにも使用され、高い完全奏功率を有する。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結したＩＬ−２、および／またはＩＬ−２遺伝子配列の１つより多くのコピーを含むＩＬ−２を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２遺伝子の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−２遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
インターロイキン−２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む、免疫系のある特定の細胞に対して強力な調節効果があるサイトカインである。ＩＬ−２１は、そのこれらの細胞における細胞分裂／増殖を誘導する。ＩＬ−２１は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に発現されるが、ほとんどの他の組織には発現されない。加えて、ＩＬ−２１発現は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセットでは上方調節される。ＩＬ−２１は、これらの細胞の機能を調節するＮＫ Ｔ細胞にも発現される。ＩＬ−２１と結合したとき、ＩＬ−２１受容体は、その標的遺伝子を活性化するためにＪａｋ１とＪａｋ３とＳＴＡＴ３ホモ二量体とを利用する、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路を介して作用する。ＩＬ−２１は、ＩＬ−２産生能力がある特有のＣＤ２８＋ＣＤ１２７ｈｉ ＣＤ４５ＲＯ＋表現型を有するメモリー型ＣＴＬの集団の濃縮によってヒトＴ細胞の分化プログラミングをモジュレートすることが示されている。ＩＬ−２１には、永続的腫瘍免疫を獲得するための、ＣＤ８＋細胞応答の継続および増加による抗腫瘍効果もある。ＩＬ−２１は、転移性黒色腫（ＭＭ）および腎細胞癌（ＲＣＣ）患者における第１相臨床試験に認可されている。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１をコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＩＬ−２１遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＩＬ−２１を過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１の２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＩＬ−２１遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１の産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＩＬ−２１をコードするための配列、およびＩｌ−１２の分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＩＬ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、Ｉｌ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２１および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＩＬ−２１を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（カケクチンまたはＴＮＦアルファとしても公知）は、ある特定の腫瘍細胞系の細胞溶解を引き起こすことができ、ある特定の条件下で細胞増殖を刺激し、細胞分化を誘導することができる、サイトカインである。ＴＮＦは、全身性炎症に関与し、急性相反応を構成するサイトカインの１つである。ＴＮＦは、主として活性化マクロファージによって産生されるが、多くの他の細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、好酸球およびニューロンによって産生されうる。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の調節にある。
ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型；ＣＤ１２０ａ；ｐ５５／６０）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型；ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０）という、２つの受容体に結合することができる。ＴＮＦＲ１は、ほとんどの組織で発現され、ＴＮＦの膜結合形態と可溶性三量体形態の両方によって完全に活性化されうるが、ＴＮＦＲ２は、免疫系の細胞にしか見られず、ＴＮＦホモ三量体の膜結合形態に応答する。その受容体と結合すると、ＴＮＦは、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ経路を活性化することができ、これらの経路は、非常に多くのタンパク質の転写を媒介し、ならびに炎症応答に関与する経路を含む、細胞分化および増殖に関与するいくつかの経路を媒介する。ＴＮＦは、細胞アポトーシスを誘導する経路も調節する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＴＮＦである。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＴＮＦ遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＴＮＦを過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦの２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＴＮＦ遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦの産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＴＮＦをコードするための配列、およびＴＮＦの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＴＮＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＴＮＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＴＮＦおよび／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＴＮＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＴＮＦを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＴＮＦを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＴＮＦを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より、少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＴＮＦを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＴＮＦを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＴＮＦを分泌する。
一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば２用量処置レジメンの７日目に、腫瘍体積を約４０〜６０％、約４５〜５５％、低減させることができる。一実施形態では、腫瘍体積は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細胞の投与時の約６００ｍｍ３と比較して、ＴＮＦを発現する細菌の投与時には約３００ｍｍ３である。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。
一部の実施形態では、ＴＮＦを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージ上でのＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、分泌のためのＴＮＦアルファをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、例えばＴＮＦ受容体を有する細胞において、ＮＦカッパＢ経路を活性化することができる。一部の実施形態では、ＴＮＦアルファをコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、ＩカッパＢアルファ分解を誘導することができる。一部の実施形態では、操作された細菌から分泌される分泌ＴＮＦアルファレベルは、同じ条件下で、同濃度の組換えＴＮＦアルファとほぼ同程度に、ＩカッパＢアルファ分解を引き起こす。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、それらの細胞の活性化に必要とされる。この遺伝子によってコードされるタンパク質受容体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。
マクロファージにおいて、活性化の一次シグナルは、Ｔｈ１型ＣＤ４ Ｔ細胞からのＩＦＮ−γである。二次シグナルは、マクロファージ細胞表面のＣＤ４０に結合する、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）である。結果として、マクロファージは、その表面で、より多くのＣＤ４０およびＴＮＦ受容体を発現し、これは、活性化レベルを増加させるのに役立つ。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、マクロファージおよび／または樹状細胞活性化をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４０リガンドである。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０リガンドを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０リガンドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＣＤ４０リガンド遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＣＤ４０リガンドを過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０リガンドの２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＣＤ４０リガンド遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０リガンドの産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０リガンドをコードするための配列、およびＣＤ４０リガンドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＤ４０リガンドを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＣＤ４０リガンドを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＣＤ４０リガンドおよび／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＣＤ４０リガンドを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＤ４０リガンドを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＤ４０リガンドを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＤ４０リガンドを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＣＤ４０リガンドを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＣＤ４０リガンドを分泌する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＣＤ４０リガンドを分泌する。
一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを分泌するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、奏功率を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく上昇させることができる。一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージ上でのＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＣＣＲ７は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより多く誘導される。一実施形態では、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより２５％〜５５％、約３０〜４５％高い、マクロファージにおいて誘導されるＣＣＲ７のレベル。
一実施形態では、樹状細胞において誘導されるＣＣＲ７のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約２倍高い。
一部の実施形態では、ＣＤ４０リガンドを産生するように遺伝子操作された細菌は、樹状細胞および／またはマクロファージ上でのＣＣＲ７発現を増加させることができる。
一部の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより多く誘導される。一部の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多く誘導される。さらに別の実施形態では、ＣＤ４０は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより多く誘導される。一実施形態では、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより３０％〜５０％高い、マクロファージにおいて誘導されるＣＤ４０のレベル。
一実施形態では、樹状細胞において誘導されるＣＤ４０のレベルは、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌で観察されるものより約１０％高い。
したがって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０９３の１つまたは複数と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＣＤ４０リガンドポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０９３を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１０９３からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）としても公知の、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞および線維芽細胞により分泌される単量体糖タンパク質である。ＧＭ−ＣＳＦは、免疫系の発達を助長しかつ感染に対する防御を促進するサイトカインとして機能する、白血球成長因子である。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）および単球を産生するように幹細胞を刺激し、単球は、血行路を出て組織に遊走し、するとすぐに成熟して、マクロファージおよび樹状細胞になる。ＧＭ−ＣＳＦは、免疫／炎症カスケードの一部であり、このカスケードは、少数のマクロファージの活性化がそれらの数の急速な増加につながるカスケードであり、このプロセスは、感染との戦いに極めて重要である。ＧＭ−ＣＳＦは、シグナル伝達兼転写活性化因子、ＳＴＡＴ５を介して、またはＳＴＡＴ３（マクロファージを活性化する）を介して、シグナル伝達する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＧＭ−ＣＳＦである。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦを産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはＧＭ−ＣＳＦ遺伝子配列の１つより多くのコピーを含む、ＧＭ−ＣＳＦを過剰発現するように、操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦの２つまたはそれより多いコピー、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦの産生を刺激する１つまたは複数の抗がん分子を産生する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦをコードするための配列、およびＧＭ−ＣＳＦの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＧＭ−ＣＳＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、ＧＭ−ＣＳＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＧＭ−ＣＳＦおよび／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、表７に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、ＧＭ−ＣＳＦを発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８および／または配列番号１５９の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、ある特定の前駆体配列は、細菌分泌シグナル配列を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の細菌配列で置換される。一部の実施形態では、サイトカインをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌発現のためにコドン最適化される。
一部の実施形態では、ある特定の前駆体配列は、哺乳動物分泌シグナル配列を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の哺乳動物配列で置換される。一部の実施形態では、サイトカインをコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳動物発現のためにコドン最適化される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫モジュレーションサイトカインをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｈＩＬ−１２の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５４のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｈＩＬ−１５の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５７のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＧＭＣＳＦの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５８のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＮＦ−アルファ、例えば細胞外部分、の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５９のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ガンマの発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６０のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６１のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ９の発現のための１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６２のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１、および配列番号１０６２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１、および配列番号１０６２から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０５３、配列番号１０５４、配列番号１０５５、配列番号１０５６、配列番号１０５７、配列番号１０５８、配列番号１０５９、配列番号１０６０、配列番号１０６１、および配列番号１０６２から選択される配列からなるポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０６３と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０６４と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝子配列配列番号１０６４を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０６７と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６７を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０６８と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６８を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０６９と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６９を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０７０と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０７０を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝コードの冗長性がなければ配列番号１０７１と同じポリペプチドをコードする、遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０７１を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０、および／または配列番号１０７１のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０および／または配列番号１０７１から選択される配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０６３、配列番号１０６４、配列番号１０６７、配列番号１０６８、配列番号１０６９、配列番号１０７０および／または配列番号１０７１から選択される配列からなる核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、配列番号８９９、配列番号９００、配列番号９０１、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、および／または配列番号９１３から選択されるＤＮＡ配列からなる核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、および配列番号９１９のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、および配列番号９１９から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８、および配列番号９１９から選択されるＤＮＡ配列からなる核酸配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２０を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２１を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ｂ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２ｂ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２４を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１２構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９２５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＧＭＣＳＦ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３４を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３６を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＬ−１５構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３７を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＴＮＦアルファ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３８を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＴＮＦａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９３９を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＴＮＦａ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４０を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌タグを有するヒトＩＦＮｇ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４１を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＩＦＮｇ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４２を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＩＦＮガンマ構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号９４３を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＯｍｐＦ分泌を有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７５を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＰｈｏＡ分泌タグを有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７６を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎ末端ＴｏｒＡ分泌タグを有するヒトＣＸＣＬ９構築物をコードする遺伝子配列、例えば、配列番号１０７７を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３もしくは１０７２〜１０７８から選択されるポリペプチド配列またはその機能性断片もしくはバリアントと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択されるポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択される配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９２０〜９４３または１０７２〜１０７８から選択される配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９５３〜９６０および配列番号１０８１〜１０８４から選択される１つまたは複数の核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９５３〜９６０および配列番号１０８１〜１０８４から選択される１つまたは複数のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒトＩＬ−１２ａとヒトＩＬ−１２ｂの両方を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６５のｐｈｏＡ−ｈＩＬ１２ｂ−ｐｈｏＡ−ｈＩＬ１２ａ部分または配列番号９６６のｐｈｏＡ−ｍＩＬ１２ｂ−ｐｈｏＡ−ｍＩＬ１２ａ部分を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＩＬ１５を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６７のｐｈｏＡ−ＩＬ１５部分を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＧＭＣＳＦを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６８のｐｈｏＡ−ＧＭＣＳＦ部分を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＴＮＦアルファを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９６９のｐｈｏＡ−ＴＮＦアルファ部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ＩＦＮガンマを含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９７０のｐｈｏＡ−ＩＦＮガンマ部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ｈＣＸＣＬ１０を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０８５のｐｈｏＡ−ｈＣＸＣＬ１０部分を含む遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｏＡ−ｈＣＸＣＬ９を含む構築物を含む遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０８７のｈＣＸＣＬ９部分を含む遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１０８５および配列番号１０８７のＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非コード領域を除く、配列番号９６５、配列番号９６６、配列番号９６７、配列番号９６８、配列番号９６９、配列番号９７０から選択されるＤＮＡ配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である、核酸配列を含む。
共刺激分子
ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見られる共刺激タンパク質であり、それらの細胞の活性化に必要とされる。ヘルパーＴ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）のＣＤ４０との結合は、抗原提示細胞を活性化し、様々な下流免疫刺激効果を誘導する。一部の実施形態では、抗がん分子（例えば、免疫モジュレーター）は、ＣＤ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、およびＣＤ４０Ｌポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片をコードする配列を含む。
したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、もしくはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、もしくはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、もしくはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、もしくはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
一部の実施形態では、操作された細菌は、ＣＤ４０に対する抗体の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ４０は、ヒトＣＤ４０である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、分泌される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面に提示される。これらの実施形態のいずれにおいても、ヒアルロニダーゼを含む遺伝子配列は、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、ＤｍｓＡおよびＰｅｌＢから選択される分泌タグをさらにコードする。一部の実施形態では、分泌タグは、抗ＣＤ４０ポリペプチド配列のＮ末端に、かつ抗ＣＤ４０コード配列の５’末端にある。一部の実施形態では、分泌タグは、抗ＣＤ４０ポリペプチド配列のＣ末端に、かつ抗ＣＤ４０コード配列の３’末端にある。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、欠失または突然変異した外膜タンパク質は、ＰＡＬである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／もしくは製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の間質モジュレーション回路または遺伝子配列のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ回路を発現することができる。一部の実施形態では、間質モジュレーション回路、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をコードする遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の間質モジュレーション遺伝子配列のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ遺伝子配列は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の間質モジュレーション回路のいずれか１つまたは複数、例えば、ヒアルロニダーゼ回路をさらに発現することができ、以下のものの１つもしくは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、分泌のためのまたは細胞表面への提示のためのヒアルロニダーゼをさらにコードする。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、アデノシンの消費のための遺伝子配列は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、アデノシンの消費のための遺伝子配列は、アデノシンを移入するための輸送体をコードする。一部の実施形態では、輸送体をコードする遺伝子配列は、ｎｕｐＣを含む。一部の実施形態では、輸送体をコードする遺伝子配列は、ｎｕｐＧを含む。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞に発現されるタンパク質の１つである。一部の実施形態では、抗がん分子（例えば、免疫モジュレーター）は、ＣＤ２８のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０（Ｂ７．１）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片、およびＣＤ８６（Ｂ７．２）ポリペプチドまたはそのポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片をコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体断片、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドまたはＣＤ８６ポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドもしくはＣＤ８６ポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドもしくはＣＤ８６ポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドもしくはＣＤ８６ポリペプチド断片および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体断片、ＣＤ８０ポリペプチド、ＣＤ８０ポリペプチド断片、ＣＤ８６ポリペプチドもしくはＣＤ８６ポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
ＩＣＯＳは、ＣＤ２８に構造的におよび機能的に関連する誘導性Ｔ細胞共刺激因子である。一部の実施形態では、抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターは、ＩＣＯＳのアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）ポリペプチド、およびＩＣＯＳＬポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、またはＩＣＯＳＬポリペプチド断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、またはＩＣＯＳＬポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、またはＩＣＯＳＬポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、またはＩＣＯＳＬポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、またはＩＣＯＳＬポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体断片、ＩＣＯＳＬポリペプチド、もしくはＩＣＯＳＬポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
ＣＤ２２６は、ナチュラルキラー細胞、血小板、単球、およびＴ細胞のサブセット（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）の表面に発現される糖タンパク質であって、そのリガンド、ＣＤ１１２およびＣＤ１５５を有する他の細胞との細胞接着を媒介する糖タンパク質である。数ある中でも特に、ＣＤ２２６は、免疫シナプス形成に関与し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化を誘発する。一部の実施形態では、抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターは、ＣＤ２２６のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドまたはＣＤ１５５ポリペプチド断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチド、およびＣＤ１５５ポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片を発現する、ならびに／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片を発現する、ならびに／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片、ならびに／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ２２６抗体、アゴニスト抗ＣＤ２６６抗体断片、ＣＤ１１２ポリペプチド、ＣＤ１１２ポリペプチド断片、ＣＤ１５５ポリペプチドおよびＣＤ１５５ポリペプチド断片を発現する、ならびに／または分泌ペプチドを発現する。
ＣＤ１３７または４−１ＢＢは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通糖タンパク質であって、活性化Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞）上に発現され、活性化Ｔリンパ球に対する共刺激活性を有する、２型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１３７または４−１ＢＢは、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌生存および細胞溶解活性を増強することが示されている。一部の実施形態では、抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド（ＣＤ１３７Ｌ）、およびＣＤ１３７Ｌポリペプチド断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、またはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、もしくはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、もしくはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、もしくはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片、および／または分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体断片、ＣＤ１３７リガンドポリペプチド、もしくはＣＤ１３７リガンドポリペプチド断片を発現する、および／または分泌ペプチドを発現する。
ＯＸ４０、またはＣＤ１３４は、Ｔ細胞の生存を保つこと、およびその後サイトカイン産生を増加させることに関与する、Ｔ細胞受容体である。ＯＸ４０には、生存を増進するその能力のため、免疫応答および記憶応答の維持に非常に重要な役割がある。ＯＸ４０はまた、Ｔｈ１媒介反応においてもＴｈ２媒介反応においても有意な役割を果たす。一部の実施形態では、抗がん分子、例えば、免疫モジュレーターは、ＯＸ４０のアゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体断片、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、およびＯＸ４０Ｌ断片から選択されるアゴニストである。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片をコードする配列を含む。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片を産生するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片をコードするための配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片、例えば、強力なプロモーターに動作可能に連結した、および／またはこれらの遺伝子配列のいずれかの１つより多くのコピーを含む、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片、を過剰発現するように操作されている。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片の２つまたはそれより多いコピー、例えば、これらの配列のいずれかの２、３、４、５、６またはそれより多いコピーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、操作された細菌は、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片をコードするための配列と、前記抗体およびポリペプチドの分泌のための分泌ペプチドをコードするための配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍を標的とする細菌である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／あるいは分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下で、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／あるいは分泌ペプチドを発現する、腫瘍を標的とする細菌である。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件によりまたは炎症性条件により活性化されるプロモーター、例えば、前記条件により活性化される、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片、および／あるいは分泌ペプチドを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、がん特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または構成的プロモーター、例えば、本明細書に記載のプロモーターのいずれかの制御下で、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体、アゴニスト抗ＯＸ４０もしくは抗ＣＤ１３４抗体断片、ＯＸ４０Ｌポリペプチド、またはＯＸ４０Ｌポリペプチド断片を発現する、および／あるいは分泌ペプチドを発現する。
これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、ヒト抗体であってもよく、またはヒト化抗体であってもよく、異なるアイソタイプ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むこともある。また、抗体は、ＦｃＲ結合、ＦｃＲｎ結合、補体機能、グリコシル化、Ｃ１ｑ結合などの、エフェクター機能；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節を増大または減少させるように改変されている定常領域を含むこともある。これらの実施形態のいずれにおいても、抗体は、単鎖抗体であってもよく、または単鎖抗体断片であってもよい。
抗原／ワクチン
腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、および／またはネオ抗原を局所腫瘍環境に導入することにより、ネオ抗原に関連することが公知である目的の特定のがんまたは腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせることができる。本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原」は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、およびネオ抗原を指すことを意図する。本明細書で使用される場合、腫瘍抗原は、「発癌ウイルス抗原」、腫瘍胎児抗原、組織分化抗原、およびがん精巣抗原も含む。
操作された微生物は、ペプチド、例えば腫瘍抗原を微生物細胞壁に（例えば、微生物細胞表面に）アンカーすることができるように操作されていることもある。これらは、壁アンカー抗原として公知である。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍抗原を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍特異的抗原を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍関連抗原を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のネオ抗原を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、発癌ウイルス抗原、腫瘍胎児抗原、改変細胞表面糖脂質および糖タンパク質、組織分化抗原、がん精巣抗原、およびイディオタイプ抗原から選択される１つまたは複数の抗原を産生するように操作されている。例示的な腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原は、本明細書で提供され、でなければ当技術分野において公知である。
一部の実施形態では、抗原は、腫瘍微小環境に分泌され、そこで抗原提示のために免疫細胞に取り込まれる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原をコードする配列、ならびに抗原の分泌を可能にする配列、例えば、本明細書に記載の分泌系、方法および配列のいずれかを含む。一部の実施形態では、抗原は、操作された微生物の細胞壁、膜またはカプシドにアンカーされる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、壁アンカー抗原である、１つまたは複数の腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原を産生するように操作されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および／またはネオ抗原をコードする配列、ならびに抗原を細胞壁、膜もしくはカプシドに標的化する配列、例えば、本明細書に記載の細胞壁標的化方法および配列のいずれかを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１６０〜５６１から選択される１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号１６０〜５６１のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
他の免疫モジュレーター
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカインおよび／または成長因子を誘導するＭ２マクロファージをモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカインおよび／または成長因子を誘導するＭ２マクロファージを阻害する免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｍ１マクロファージをモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｍ１マクロファージを誘導する免疫モジュレーターを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＭＤＳＣ機能を阻害する免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗原提示細胞およびＴ細胞相互作用をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカインおよび／または成長因子を誘導するＣＴＬ／ＣＤ８＋Ｔ細胞をモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカインおよび／または成長因子を誘導するＣＴＬ／ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫抑制細胞を攻撃するケモカインをモジュレートする免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫抑制細胞を攻撃するケモカインを刺激する免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、下記表８中で見つけられるもののいずれかなどの、免疫モジュレーターを産生することができる。
他の抗がん分子
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞傷害性、抗新生物分子を産生することができる。例えば、遺伝子操作された細菌は、ヒトがん細胞に侵入してアポトーシスを誘導することができる細菌性酸化還元タンパク質である、アズリン（Bernardesら、２０１３年；Zangら、２０１２年）、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａアズリンを、産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件により活性化されるプロモーターの制御下でアズリンを発現することができる、腫瘍を標的とする細菌である。
代替実施形態では、抗がん分子は、細胞傷害剤、Ｃｌｙ Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−アルファ、サイトカイン、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＬＩＧＨＴ、抗原、抗体、単鎖抗体、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、単鎖ＨＩＦ１−アルファ抗体、単鎖ＣＴＬＡ−４抗体、単鎖ＰＤ−１抗体、エンドスタチン、トロンボスポンジン−１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２、酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ、およびＨＳＶ−ＴＫから選択される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、単鎖ＨＩＦ１−アルファ抗体をコードする遺伝子を含む、腫瘍を標的とする細菌であり、抗がん分子をがん性細胞に特異的かつ局所的に送達することができる。
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、リンパ球抗原ＣＤ６のリガンドである、ＣＤ１６６は、同種親和性および異種親和性接着を媒介する。ＣＤ１６６は、活性化された白血球であるＴ細胞、Ｂ細胞、単球、造血幹細胞（ＨＳＣ）、転移性黒色腫、神経細胞、内皮細胞、造血支持性骨芽細胞系、およびＭＤＳＣに発現される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ１６６に対する単鎖抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子を含有する。別の実施形態では、遺伝子操作されたＯＶは、ＣＤ７０に対する単鎖抗体をコードする。ＣＤ１６６に対する単鎖抗体の非限定的な例は、Immunotherapy ２０１０年１１月、５９巻、１１号、１６６５〜１６７４頁に記載されている。
他の抗がん分子としては、治療用核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）、例えば、ＷＯ２０１７／１２３６７５として発行された２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマー、およびＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９分子が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、アプタマーおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子から選択される核酸分子を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ抗がん分子である、１つまたは複数の抗がん分子を産生するための配列を含む。そのような分子は、本明細書の下段にて提供される参考文献において例示され、論じられている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌を、治療的養子細胞療法、例えば、ＷＯ２０１７／１２３６７５として発行された２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、またはそうでなければ当技術分野において公知の、養子細胞療法のいずれかと、組み合わせて投与することができる。
他の実施形態では、ＷＯ２０１７／１２３６７５として発行された２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、またはそうでなければ当技術分野において公知の、１つまたは複数のＴＣＲ療法を、本発明の遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与することができる。
ＢｉＴＥ抗体は、可動性リンカーによって接続されている、それ故、２つの異なる結合部位を有する、２つの異なる抗体のｓｃＦｖからなる、組換え融合タンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のＢｉＴＥ抗体、例えば、本明細書に記載の免疫モジュレーターの１つまたは複数に対するＢｉＴＥ抗体をコードすることができる。例えば、一部の実施形態では、ＢｉＴＥ抗体は、免疫チェックポイントに対して、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対して方向付けられる。一部の実施形態では、ＢｉＴＥ抗体は、ＣＤ４７またはＳＩＲＰαに対して方向付けられる。他の実施形態では、１つまたは複数のＢｉＴＥ抗体を、本発明の遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、配列番号５６２の抗体またはその断片もしくはバリアントを産生する。
本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い抗がん分子を産生する。
さらに別の抗がん分子産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い抗がん分子を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い抗がん分子を産生する。
本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い基質を消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌、基質、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメート。
抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。本明細書に記載の抗がん分子産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
プロドラッグ
プロドラッグ療法は、反応性および細胞傷害性の低い形態の抗がん薬を提供する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、プロドラッグをその活性形態に変換することができる。適切なプロドラッグ系の一例は、５−ＦＣ／５−ＦＵ系である。
細胞傷害性の放射線増感剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、消化器、乳、頭頸部および結腸直腸がんを含む、多くのがんの処置に使用される（Duivenvorrdenら、２００６年、Sensitivity of 5-fluorouracil-resistant cancer cells to adenovirus suicide gene therapy；Cancer Gene Therapy（２００６年）１４巻、５７〜６５頁）。しかし、毒性が、より高濃度でのその投与を制限する。腫瘍においてより高濃度をより低い毒性で達成するために、プロドラッグ系が開発された。シトシンデアミナーゼは、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−ＦＵに脱アミノ化する。５−ＦＣを比較的高濃度で導入することができ、それによって、腫瘍部位で生成される５−ＦＵは、全身投与することができる濃度より高濃度を安全に達成することができる。次いで、腫瘍部位で、５−ＦＵは、細胞酵素によって、強力なピリミジン代謝拮抗物質５−ＦｄＵＭＰ、５−ＦｄＵＴＰおよび５−ＦＵＴＰに形質転換される。これらの代謝物は、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに変換するチミジル酸シンテターゼを阻害する代謝遮断剤として作用し、その結果としてＤＮＡ合成を阻害する（Horaniら２０１５年、Anticancer Prodrugs - Three Decades Of Design; wjpps；４巻、０７号、１７５１〜１７７９頁およびその中の参考文献）。
この系は、５−ＦＵを５−フルオロウリジン一リン酸に変換するＵＰＲＴ（哺乳動物オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの作用と類似）を含めること、活性化へのその経路の第１のステップ、によって、さらに改善された（Tirabyら、１９９８年；Concomitant expression of E．coli cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase improves the cytotoxicity of 5-fluorocytosine. FEMS Microbiol Lett １９９８年；１７６巻：４１〜４９頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、シトシンデアミナーゼ（ＥＣ ３．５．４．１）をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ｃｏｄＡである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酵母からのシトシンデアミナーゼを発現する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃｏｄＡ−ｕｐｐ融合タンパク質を発現する。
遺伝子操作された細菌における異種発現に適したシトシンデアミナーゼの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ ｓｕｂｓｐ．ｍａｎｄａｐａｍｅｎｓｉｓ ｓｖｅｒｓ．１．１．（ＰＭＳＶ＿１３７８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ＮＫ−０１（ＭＤＳ＿１５４８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（ＳＣＯ４６３４）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ ＡＸＸ−Ａ（ＡＸＸＡ＿１０７１５、ＡＸＸＡ＿１６２９２）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＳＸＣＣ−１（ＣＯＤＡ）、Ｇａｌｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎａｔｉｓ ＵＭＮ１７９（ＵＭＮ１７９＿０００４９）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＫＣＴＣ １６８６（ＫＯＸ＿１４０５０、ＫＯＸ＿０４５５５）、Ｔａｙｌｏｒｅｌｌａ ａｓｉｎｉｇｅｎｉｔａｌｉｓ ＭＣＥ３（ＴＡＳＩ＿１３１０）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ ＲＨＡ１（ＲＨＡ１＿ＲＯ００５９９、ＲＨＡ１＿ＲＯ００５９７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＫＣＴＣ ２１９０（ＥＡＥ＿１３２６５、ＥＡＥ＿０５１１５）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｍｏｕｓｅ−Ｊａｐａｎ（ＳＦＢＭ＿１２４９）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｐｏ８２（ＣＯＤＡ）、Ｓａｌｉｎｉｓｐｈａｅｒａ ｓｈａｂａｎｅｎｓｉｓ Ｅ１Ｌ３Ａ（ＳＳＰＳＨ＿０７０８６）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ ＫＮＰ４１４（ＫＮＰ４１４＿０３２３０、ＫＮＰ４１４＿０３２３３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ ６（ＢＪ６Ｔ＿６０１００、ＢＪ６Ｔ＿６００９０）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ ｓｐ．ＳＦＢ−ｒａｔ−Ｙｉｔ（ＲＡＴＳＦＢ＿１０７９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｓ１６（ＰＰＳ＿２７４０）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １５５１０（ＷＫＫ＿０５０６０）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＥｃＷＳＵ１（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｂｉｚｉｏｎｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ ＪＵＢ５９（ＢＺＡＲＧ＿２２１３）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｆ２（ＡＧＡＵ＿Ｌ１０１９５６）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＳＤ１（ＰＤＩ＿１２１６）、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＴＰＹ（ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｔｕｂｉａｓｈｉｉ ＡＴＣＣ １９１０９（ＶＩＴＵ９１０９＿１３７４１）、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉｉ Ｃ−１１３（ＮＷＡＴ＿２４７５）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ）ｓｔｒ．ＭＡＤＡＲ（ＣＯＤＡ）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｃｒｙｐｔｏｃｅｒｃｕｓ ｐｕｎｃｔｕｌａｔｕｓ）ｓｔｒ．Ｃｐｕ（ＣＯＤＡ）、Ｐｅｌａｇｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ Ｂ２（ＫＫＹ＿８５２、ＫＫＹ＿８５０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＹＩ２３（ＢＹＩ２３＿Ａ０１８４１０、ＢＹＩ２３＿Ａ００８９６０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９６０５（ＳＹＮＣＣ９６０５＿０８５４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｆ１１３（ＡＥＶ６１８９２．１）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＥＪＹ３（ＶＥＪＹ３＿１６４９１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２（ＳＹＮＰＣＣ７９４２＿０５６８）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＯＲＳ ２７８（ＢＲＡＤＯ１７８９、ＢＲＡＤＯ０８６２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（ＣＯＤＡ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０（ＭＣ７４２０＿２７４）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＡＳ９６０１（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ｓｔｒ．ＥＤＬ９３３（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０９（ＳＨ８１０９＿１３７１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１３７５（ＳＳＮＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９５１５（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３０１（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＮＡＴＬ１Ａ（ＣＯＤＡ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ．Ｃ５８（ＡＴＵ４６９８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＨＲＭ２（ＣＯＤＡ）、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＣＣ ７００１（ＣＰＣＣ７００１＿２６０５）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ＫＩＭ１０（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＡＴＣＣ １３１２４（ＣＯＤＡ）、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．ＪＳ６１４（ＮＯＣＡ＿１４９５）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ ＹＳ−３１４（ＣＯＤＡ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２（ＣＧＬ００７６、ＣＯＤＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｓｔｒ．Ａｍｅｓ（ＢＡＳ４３８９）、Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ ＩＭＳ１０１（ＴＥＲＹ＿４５７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ０−１（ＣＯＤＡ、ＰＦＬ０１＿３１４６）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＣＣ２７０５（ＣＯＤＡ）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．１７−４（ＣＡＲ＿Ｃ０４６４０、ＡＴＺＣ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｅ８８（ＣＴＣ＿０１８８３）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ ＣＯ９２（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ Ｊ２３１５（ＢＣＡＭ２７８０、ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ２５（ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＣＭＣＰ６（ＶＶ２＿０７８９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ ＮＣＴＣ １２４１９（ＣＯＤＡ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ｓｔｒ．ＣＴ１８（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ−５（ＣＯＤＡ）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１（ＯＢ１２６７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１６（ＲＳ９９１６＿３２９０２）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＳ９９１７（ＲＳ９９１７＿０２０６１）、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅ（ＳＳＮＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ＲＩＭＤ ２２１０６３３（ＶＰＡ１２４３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０（ＢＬＬ３８４６、ＢＬＬ７２７６）、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ ＨＰ１５（ＨＰ１５＿２７７２）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３ ３ｓｅｑｓ ＥＦ＿１０６１、ＥＦ＿１０６２、ＥＦ＿０３９０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９（ＢＣ＿４５０３）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０１０１（ＳＣＢ０１＿０１０１００００１８７５）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＢ０２０５（ＳＣＢ０２＿０１０１０００１３６２１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ ＡＴＣＣ ２３３４４（ＣＯＤＡ）、Ｌａｂｒｅｎｚｉａ ａｌｅｘａｎｄｒｉｉ ＤＦＬ−１１（ＳＡＤＦＬ１１＿５０５０）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ ＤＫ １６２２（ＭＸＡＮ＿５４２０）、Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｐｏｍｅｒｏｙｉ ＤＳＳ−３（ＳＰＯ２８０６）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ ＰＣＣ ７４２１（ＧＬＬ２５２８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｃ（ＳＳＮＧ＿０３２８７、ＳＳＮＧ＿０４１８６）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４（ＲＥＵＴ＿Ｂ３９９３）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ ＡＴＣＣ ３９０７３（ＭＯＴＨ＿０４６０）、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ ９９４１（ＲＸＹＬ＿０２２４）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ ＬＢ４００（ＢＸＥ＿Ａ２１２０、ＢＸＥ＿Ａ１５３３）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１（Ｒ０２５９６）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＭＡＦＦ３０３０９９（ＭＬＲ５３６３、ＭＬＬ２０６１）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＧＭＩ１０００（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ Ｇ４（ＢＣＥＰ１８０８＿４８７４）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０（ＲＲＵ＿Ａ２７８８）、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＥＬＢ１７（ＭＥＬＢ１７＿０６０９９）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＰＡｌ ５（ＧＤＩＡ＿２５１８、ＧＤＩ３６３２）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＭＧＨ ７８５７８（ＫＰＮ＿００６３２、ＣＯＤＡ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｔｒ．Ｐｍ７０（ＰＭ０５６５）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ２．４．１（ＲＳＰ＿０３４１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５７４５（ＰＥＰＥ＿０２４１）、Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ２００２（ＦＵＲＡＤＲＡＦＴ＿０７３９）、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ ＤＳＭ ６８４（ＤＡＣＥ＿０６８４）、Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｓ ｍａｎｇａｎｏｘｙｄａｎｓ ＳＩ８５−９Ａ１（ＳＩ８５９Ａ１＿０１９４７）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１（ＢＢＴＡ＿２１０５、ＢＢＴＡ＿７２０４）、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９４（ＥＳＡ＿０３４０５）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１（ＡＡＵＲ＿３８８９、ＡＡＵＲ＿０９２５）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４（ＡＲＴＨ＿３６００）、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ．ＣＣＳ１（ＪＡＮＮ＿１３０６）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６（ＢＰＲＯ＿１９６０）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ ＳＳ９（Ｙ３９４６）、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．ＥｕＩ１ｃ（ＦＲＡＥＵＩ１Ｃ＿４７２４、ＦＲＡＥＵＩ１Ｃ＿４６２５）、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ５１５９（ＴＲＤ＿１８４５）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ Ｓ４（ＡＶＩ＿２１０１、ＡＶＩ＿２１０２）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ Ｋ８４ ５ｓｅｑｓ ＡＲＡＤ＿９０８５、ＡＲＡＤ＿９０８６、ＡＲＡＤ＿８０３３、ＡＲＡＤ＿３５１８、ＡＲＡＤ＿９８９３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＥＳ１１４（ＣＯＤＡ）、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６（Ｌ８１０６＿１００８６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＬ１０７（Ｂ

Ｌ１０７＿１１０５６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１（Ｂ１４９１１＿０４０４４）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＭＥＤ１９３（ＭＥＤ１９３＿１７２２４）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｓｐ．２１７（ＲＯＳ２１７＿１０９５７）、Ｐｅｌａｇｉｂａｃａ ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ ＨＴＣＣ２６０１（Ｒ２６０１＿１６４８５、Ｒ２６０１＿００５３０）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＥＤ１２１（ＭＥＤ１２１＿２３６２９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ（ＬＣＡ＿１２１２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＫＢＡＢ４（ＢＣＥＲＫＢＡＢ４＿４３３１）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＨａＡ２（ＲＰＢ＿２０８４）、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ ＬＦＩ１２３８（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９９０２（ＳＹＮＣＣ９９０２＿１５３８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．Ｗ３１１０（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＰＤ１２２２（ＰＤＥＮ＿１０５７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０３（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ（ＣＹＡ＿１５６７、ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＡ−２−３Ｂａ（２−１３）（ＣＹＢ＿１０６３、ＣＯＤＡ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ ＢＬ２（ＢＬＩＮＢ＿０１０２００００９４８５）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ ＤＪ（ＣＯＤＡ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＪＤＲ−２ ６ｓｅｑｓ ＰＪＤＲ２＿６１３１、ＰＪＤＲ２＿６１３４、ＰＪＤＲ２＿３６１７、ＰＪＤＲ２＿３６２２、ＰＪＤＲ２＿３２５５、ＰＪＤＲ２＿３２５４）、Ｆｒａｎｋｉａ ａｌｎｉ ＡＣＮ１４ａ（ＦＲＡＡＬ４２５０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３（ＣＯＤＡ）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）ｓｔｒ．Ｂｇｅ（ＢＬＢＢＧＥ＿３５３）、アルファプロテオバクテリアＢＡＬ１９９（ＢＡＬ１９９＿０１６４４、ＢＡＬ１９９＿０９８６５）、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＡＴ７（ＣＡＴ７＿１０４９５、ＣＡＴ７＿０５８０６）、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｃ９１（ＮＥＵＴ＿１７２２）、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１１１６（ＶＩＢＨＡＲ＿０５３１９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ（ＢＡＭＢ＿３７４５、ＢＡＭＢ＿４９００）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ １３０Ｚ（ＡＳＵＣ＿１１９０）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ １７０２５（ＲＳＰＨ１７０２５＿０９５５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ １００−２３（ＬＲ０６６１）、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ ＪＦ−５（ＡＣＲＹ＿０８２８）、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ ＫＣＴＣ ２３９６（ＨＣＨ＿０５１４７）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ ＯｈＩＬＡｓ（ＣＬＯＳ＿１２１２、ＣＬＯＳ＿２４５７）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｏｌｏｓａ ＡＵＯ１５８（ＢＤＡＧ＿０４０９４、ＢＤＡＧ＿０３２７３）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂ（ＲＡＺＷＫ３Ｂ＿０８９０１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ１（ＰＰＵＴ＿２５２７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＩＳＤｇ（ＣＰＨＹ＿３６２２）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＮＢＲＣ １００５９９ ４ｓｅｑｓ ＢＢＲ４７＿１５８７０、ＢＢＲ４７＿１５６３０、ＢＢＲ４７＿１５６２０、ＢＢＲ４７＿１５６１０）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ １９７Ｎ（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ５３６（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＪ２（ＰＮＡＰ＿４００７）、Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ ｔａｔａｏｕｉｎｅｎｓｉｓ ＴＴＢ３１０（ＣＯＤＡ）、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ Ａ１５０１（ＣＯＤＡ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ７９６６（ＣＯＤＡ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６（ＣＯＤＡ、ＳＳＮＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ Ｌ４８（ＰＳＥＥＮ３５９８）、Ｌａｂｒｅｎｚｉａ ａｇｇｒｅｇａｔａ ＩＡＭ １２６１４（ＳＩＡＭ６１４＿１６３７２、ＳＩＡＭ６１４＿２１０００）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ ３６７（ＬＶＩＳ＿１９３２）、Ｓａｇｉｔｔｕｌａ ｓｔｅｌｌａｔａ Ｅ−３７（ＳＳＥ３７＿１８９５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｂ１４９０５ ３ｓｅｑｓ ＢＢ１４９０５＿２０９４８、ＢＢ１４９０５＿１２０１０、ＢＢ１４９０５＿１２０１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｗ６１９ ３ｓｅｑｓ ＰＰＵＴＷ６１９＿３２２８、ＰＰＵＴＷ６１９＿２２１０、ＰＰＵＴＷ６１９＿２１６２）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｒ５５１−３（ＳＭＡＬ＿２３４８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５（ＢＰＨＹ＿１４７７）、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＷＡＴ−３（ＶＳＷＡＴ３＿２６５５６）、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＧＡＩ１０１（ＲＧＡＩ１０１＿２５６８）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ ＡＫ１（ＶＳＡＫ１＿１７１０７）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＢＡＬ３９（ＰＢＡＬ３９＿００４１０）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｓｐ．ＴＭ１０３５（ＲＴＭ１０３５＿１８２３０、ＲＴＭ１０３５＿１７９００）、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ ２３８（ＯＡ２３８＿４９７０）、Ｐｈａｅｏｂａｃｔｅｒ ｇａｌｌａｅｃｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １７３９５（ＣＯＤＡ）、Ｏｃｅａｎｉｂｕｌｂｕｓ ｉｎｄｏｌｉｆｅｘ ＨＥＬ−４５（ＯＩＨＥＬ４５＿１４０６５、ＯＩＨＥＬ４５＿０１９２５）、Ｏｃｔａｄｅｃａｂａｃｔｅｒ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ ３０７（ＯＡ３０７＿７８）、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ ＥＦ０１−２（ＶＥＩＳ＿０４１６、ＶＥＩＳ＿４４３０）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｗｏｏｄｙｉ ＡＴＣＣ ５１９０８（ＳＷＯＯ＿１８５３）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ ８０８１（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０（ＣＣＥＬ＿０９０９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ １７６１６（ＣＯＤＡ、ＢＭＵＬ＿４２８１）、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ ｃｈｏｌｏｄｎｉｉ ＳＰ−６（ＬＣＨＯ＿０３１８）、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｃｉｔｒｕｌｌｉ ＡＡＣ００−１（ＡＡＶＥ＿３２２１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ ＰｓＪＮ（ＢＰＨＹＴ＿２５９８、ＢＰＨＹＴ＿２３８８）、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＳＰＨ−１（ＤＡＣＩ＿４９９５）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｅａｌｅａｎａ ＡＴＣＣ ７００３４５（ＳＰＥＡ＿２１８７）、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ ＤＦＬ １２（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ ｙｍｐ（ＰＭＥＮ＿３８３４）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ ５６８（ＳＰＲＯ＿００９６、ＳＰＲＯ＿４５９４）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．６３８（ＥＮＴ６３８＿３７９２、ＥＮＴ６３８＿３１４０）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＷＹＬ１（ＭＭＷＹＬ１＿１５８３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＮＲＲＬ ２３３８（ＳＥＲＹＮ２＿０１０１００００１２１７）、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ １９０６１（ＸＮＣ１＿２０９７）、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂｒｏａｄ−１（ＮＢＣＧ＿０２５５６）、Ｈｏｅｆｌｅａ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ ＤＦＬ−４３（ＨＰＤＦＬ４３＿１６０４７）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＴＲＰ（ＰＡＴＲＰ＿０１０１００００８９５６）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ８８０１（ＰＣＣ８８０１＿１９５２）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ３（ＳＳＥＤ＿２８０３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（Ｍ４４６＿３６０３、Ｍ４４６＿０９３３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ ２８３１（ＭＲＡＤ２８３１＿４８２４）、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ ＯＲＳ ５７１（ＡＺＣ＿１９４５）、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ ＡＴＣＣ ４９１８８（ＯＡＮＴ＿３３１１）、Ｒｕｅｇｅｒｉａ ｓｐ．Ｒ１１（ＲＲ１１＿１６２１）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２（ＣＯＤＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ ２７０６４（ＳＣＬＡＡ２＿０１０１０００２６６７１、ＳＣＬＡＶ＿５５３９）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ Ｃ３−４１（ＢＳＰＨ＿４２３１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ＮＣＴＣ ２９１６（ＣＯＤＡ）、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ ＤＳＭ １７２４１ ３ｓｅｑｓ ＡＮＡＣＯＬ＿０３９９８、ＡＮＡＣＯＬ＿０２２７９、ＡＮＡＣＯＬ＿０１３０９）、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ ４３８２７（ＡＭＩＲ＿０５３８）、Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ ｋｅｄｄｉｅｉｉ ＤＳＭ １０５４２（ＳＫＥＤ＿２８０２０、ＳＫＥＤ＿１７２６０）、Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ ＤＳＭ ４４７２８（ＳＮＡＳ＿１７０３）、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ−８４３（ＭＡＥ＿０５３６０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＮＣＴＣ ８２３９（ＣＯＤＡ）、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅ ＫＭ−６０５４（ＫＳＥ＿３６３００、ＫＳＥ＿３６３２０）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６（ＡＣＨＬ＿１０６１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＮＢＲＣ １３３５０（ＳＧＲ＿６４５８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．７＿２＿４３ＦＡＡ（ＣＳＢＧ＿０２０８７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿７＿４７ＦＡＡ（ＣＢＦＧ＿００９０１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｊ１０７４（ＳＳＨＧ＿０５６３３）、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ ＨＡＷ−ＥＢ４（ＳＨＡＬ＿２１６０）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ ＯＲＳ ２０６０（ＭＮＯＤ＿３３４９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｍｇ１（ＳＳＡＧ＿０５２７１）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ Ｅｔ１／９９（ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ４ｓｅｑｓ ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ、Ｂ２１＿００２９５、Ｂ２１＿００２８３）、Ｃｏｎｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｗｏｅｓｅｉ ＤＳＭ １４６８４ ３ｓｅｑｓ ＣＷＯＥ＿５７００、ＣＷＯＥ＿５７０４、ＣＷＯＥ＿０３４４）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．３０＿２（ＣＳＡＧ＿０３０１３、ＣＳＡＧ＿０２６９１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿１＿４７（ＨＭＰＲＥＦ０１８９＿０１３１３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ９＿２＿５４ＦＡ

Ａ（ＨＭＰＲＥＦ０８６４＿０３５６８）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ ＡＴＣＣ ４９１８５（ＦＵＡＧ＿０２２２０）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉｕｍ ＡＴＣＣ ２７７２５（ＦＶＡＧ＿００９０１）、Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅ ＤＳＭ １２３３３（ＢＣＡＶ＿１６８３、ＢＣＡＶ＿１４５１）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ ＡＴＣＣ ２５８２７（ＰＲＯＳＴＵ＿０４１８３）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ ＡＴＣＣ ３５１９８（ＰＲＯＰＥＮ＿０３６７２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ４３０２１（ＳＲＯＳ＿３１８４、ＳＲＯＳ＿４８４７）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｙ４１２ＭＣ１０ ３ｓｅｑｓ ＧＹＭＣ１０＿２６９２、ＧＹＭＣ１０＿４７２７、ＧＹＭＣ１０＿３３９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ８７３９（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ ４４９６３（ＫＲＡＣ＿３０３８）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｐｏｓｉｄｏｎｉｃａ ＩＶＩＡ−Ｐｏ−１８１（ＭＡＲ１８１＿２１８８）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２（ＣＹＡＮ７８２２＿１８９８）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ ＥＩＢ２０２（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ ＤＳＭ ４５４１（ＰＲＯＶＲＵＳＴ＿０５８６５）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ ＡＴＣＣ ３５３１６（ＥＮＴＣＡＮ＿０８３７６、ＥＮＴＣＡＮ＿０８６３１）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ ＡＴＣＣ ２９２２０（ＣＩＴ２９２＿１０６７２、ＣＩＴ２９２＿０９６９７）、Ｃｉｔｒｅｉｃｅｌｌａ ｓｐ．ＳＥ４５（ＣＳＥ４５＿２９７０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ ＴＷ０７６２７（ＥＳＣＡＢ７６２７＿０３１７）、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＯＭ５（ＯＣＡＲ＿４６２７、ＣＯＤＡ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＮＲＲＬ Ｂ−３０９２９（ＬＢＵＣ＿２０３８）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ−３２８（ＡＭＡＸＤＲＡＦＴ＿２８９７）、Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．ａＢ（ＰＡＮＡＢＤＲＡＦＴ＿０５６５、ＰＡＮＡＢＤＲＡＦＴ＿２９３８）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｏｒｍｅ ＤＳＭ ３９８９（ＥＵＢＩＦＯＲ＿０１７７２）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ３０１２０（ＰＲＯＶＡＬＣＡＬ＿０１１３１、ＰＲＯＶＡＬＣＡＬ＿０２８０４）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＤＳＭ １１３１（ＰＲＯＶＲＥＴＴ＿０８７１４、ＰＲＯＶＲＥＴＴ＿０８１６９）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ Ｋ２７９ａ（ＡＴＺＣ２）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ５１１７２（ＣＯＤＡ）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｔｒａｄｉｕｓ ＡＴＣＣ ３５０９８（ＨＭＰＲＥＦ００７７＿００９７）、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ ＡＴＣＣ ３５９１０（ＤＡＮ２）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＡＴＣＣ １１５７７（ＣＯＤＡ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ ４９５４０（ＣＯＤＡ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ ＤＳＭ ２０６０１（ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１０７５３、ＨＭＰＲＥＦ０５５６＿１０７５１、ＡＴＺＣ）、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ４０２８（ＤＢＡＣ＿２９３６）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ ＤＳＭ ２０５４８（ＡＰＲＥ＿１１１２）、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ ＡＴＣＣ ３３３８６（ＳＴＥＲＭ＿０７８９）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ ＤＳＭ ９９４６（ＭＥＳＩＬ＿２１０３）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ＨＩ４３２０（ＣＯＤＡ）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ ＷＳＭ２０７５（ＭＥＳＯＰ＿０１６２）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ Ｓ１１０（ＶＡＰＡＲ＿２６５４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＱＭ Ｂ１５５１（ＢＭＱ＿０９８０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ＤＳＭ ２０４３８＝ＪＣＭ １２００（ＢＩＦＰＳＥＵＤＯ＿０４３８２）、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ ＤＳＭ ９７９９（ＦＢＡＬ＿２１７３）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ１６（ＨＭＰＲＥＦ０８６６＿００５０１）、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ ＡＴＣＣ ４３９４９（ＰＡＵ＿００２９４）、Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎｕｓ ｃ２（ＨＮＥＡＰ＿０８４４）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ ＳＨ０１６５（ＣＯＤＡ）、Ｄｉｃｋｅｙａ ｚｅａｅ Ｅｃｈ１５９１（ＤＤ１５９１＿０７６３）、Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ ３＿１＿６（ＨＭＰＲＥＦ０１７９＿０３３９３）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＥＧ２（ＥＧＢＧ＿００３４９）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ ＥＣ２０（ＥＣＢＧ＿００３０７）、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｓｍａｒａｇｄｉｎａｅ ＤＳＭ １１２９３（ＳＰＩＲＳ＿１０５２、ＳＰＩＲＳ＿０１１０）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｕｎｉｉ ＳＨ２０５（ＨＭＰＲＥＦ００２６＿０２７８３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ ＬＧＰ３２（ＶＳ＿ＩＩ０３２７）、Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ Ｅｃｈ７０３（ＤＤ７０３＿０７７７）、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ ｓｐ．ＰＥ３６（ＰＥ３６＿１５６４３）、Ｈｉｒｓｃｈｉａ ｂａｌｔｉｃａ ＡＴＣＣ ４９８１４（ＨＢＡＬ＿００３６）、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ ＤＳＭ １２２６０（ＡＰＡＵ＿２０６４）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＡＴＣＣ ３３３１３（ＣＯＤＡ）、Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ Ｅｃｈ５８６（ＤＤ５８６＿３３８８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＰＢ７８（ＳＳＬＧ＿０６０１６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４（ＳＳＭＧ＿０５８５５、ＳＳＭＧ＿０３２２７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ４０７３６（ＳＳＱＧ＿０４７２７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ ＡＴＣＣ ３３３３１（ＳＦＬＡ＿１１９０）、Ａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８５０（ＨＭＰＲＥＦ１７０５＿０２２５６）、Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．Ａｔ−９ｂ（ＰＡＴ９Ｂ＿３６７８、ＰＡＴ９Ｂ＿１０２９、ＰＡＴ９Ｂ＿０８５５）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ ＥＰＳ（ＶＡＲＰＡ＿３２５７、ＶＡＲＰＡ＿０９２０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ｓｔｒ．ＣＣＭＰ１９８６（ＣＯＤＡ）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ７８０５（ＷＨ７８０５＿０５６７６）、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）ｓｔｒ．ＢＰＬＡＮ（ＣＯＤＡ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ ＢＧＲ１（ＢＧＬＵ＿１Ｇ１７９００）、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ＢＨ７２（ＣＯＤＡ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｅ４ ｓｔｒ．ＢｏＮＴ Ｅ ＢＬ５２６２（ＣＯＤＡ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｆｏｌｉａｅ Ｅｐ１／９６（ＣＯＤＡ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ Ｅｂ６６１（ＥＢＣ＿３５４３０、ＣＯＤＡ、ＥＢＣ＿３２８５０、ＥＢＣ＿３２７８０）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｉｃｔａｌｕｒｉ ９３−１４６（ＮＴ０１ＥＩ＿３６１５）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ ＩＣＣ１６８（ＣＯＤＡ）、Ｓｔａｒｋｅｙａ ｎｏｖｅｌｌａ ＤＳＭ ５０６（ＳＮＯＶ＿３６１４、ＳＮＯＶ＿２３０４）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００１（ＢＣ１００１＿２３１１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００２（ＢＣ１００２＿１９０８、ＢＣ１００２＿１６１０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＣＣＧＥ１００３（ＢＣ１００３＿１１４７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ ＬＦ７ａ（ＥＮＴＡＳ＿４０７４、ＥＮＴＡＳ＿３３７０）、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ ＬＭＧ ３３０１（ＯＩＮＴ＿２０００３９５、ＯＩＮＴ＿２００１５４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ ５４２７（ＣＬＯＬＥ＿１２９１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ａｅｓｐｏｅｅｎｓｉｓ Ａｓｐｏ−２（ＤＡＥＳ＿２１０１）、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｎｅｏｆｅｌｉｆａｅｃｉｓ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３９５（ＳＣＮＵ＿１９６７７）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＣ９３１１（ＳＹＮＣ＿０７４０）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉａｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １２８８５（ＴＭＡＲ＿１４７７）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ ＡＴＣＣ １７１００（ＲＶＡＮ＿３３９５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ２５２２（ＢＣＥＬＬ＿１０９１、ＢＣＥＬＬ＿１２３４）、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４（ＰＣＣ７４２４＿０２３５）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３＿１＿５７ＦＡＡ＿ＣＴ１（ＨＭＰＲＥＦ０９９４＿０４４１９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．２＿Ａ＿５７＿ＣＴ２（ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４９０１、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４９０２、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０１５３２、ＨＭＰＲＥＦ１０１３＿０４８８８）、Ａｆｉｐｉａ ｓｐ．１ＮＬＳ２（ＡＦＩＤＲＡＦＴ＿３０９２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ ＫＳＭ−Ｋ１６（ＡＢＣ４０３２）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ＤＳＭ ４５８２（ＹＡＨＪ、ＣＯＤＡ）、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ４０Ｂ（ＶＭＣ＿１９０８０）、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｄｉｏｘａｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＢ１１９０（ＰＳＥＤ＿５３８３）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４５０（ＶＩＣ＿００２７０９）、Ｖｉｂｒｉｏ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＣＩＰ １０２８９１＝ＡＴＣＣ ３３９３４（ＶＩＡ＿０００８５１）、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａｅ ｓｕｂｓｐ．ｄａｍｓｅｌａｅ ＣＩＰ １０２７６１（ＶＤＡ＿０００７９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｕｃｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ３５３１０（ＨＭＰＲＥＦ０６５０＿２３２９）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ ４Ｒｘ１３（ＳＯＤ＿Ｇ０１０５０、ＳＯＤ＿Ｈ００８１０）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ５７０１（ＷＨ５７０１＿１６１７３、ＷＨ５７０１＿０７３８６）、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ＮＩＥＳ−３９（ＢＡＩ８９３５８．１）、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．Ｎ４１８（ＶＩＢＲＮ４１８＿０８８０７）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＳＣＦ１（ＥＮＴＣＬ＿０３６２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３４４（ＣＯＤＡ）、Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ ＬＭＧ ２０１０３（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＳＧ−６Ｃ（ＣＳＩＲＯ＿２００９）、Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ Ｃ９−１（ＣＯＤＡ、ＹＡＨＪ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＥＣＴ ５７１６（ＬＣ４０＿０５９７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒ

ｓ ＡＢ−１（ＬＩＮＥＡ＿０１０１００００６０４４）、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ ＺＣ１（ＢＦＺＣ１＿０５１２３、ＢＦＺＣ１＿０５１１８）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｏｒｔｅｘ Ｖ４５３（ＰＶＯＲ＿１６２０４、ＰＶＯＲ＿２５８６３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ １３０４７（ＥＣＬ＿０４７４１、ＥＣＬ＿０３９９７）、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ ＭＭＢ−１（ＭＡＲＭＥ＿０４９３）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ ＮＣＴＣ ９３９４（ＥＮＣ＿２９０９０、ＥＮＣ＿３４６４０）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｙ９６０２（ＲＡＨＡＱ＿４０６３、ＲＡＨＡＱ＿０２７８）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｅｃｈａｕｄｉｉ ＡＴＣＣ ４３５５３（ＨＭＰＲＥＦ０００４＿２３９７、ＡＴＺＣ、ＣＯＤＡ）、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ ３＿１＿４５Ｂ（ＨＭＰＲＥＦ９４６４＿００５９５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｖａ １２−Ｘ（ＰＳＥＦＵ＿１５６４）、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ＣＩＰ ７８．６５＝ＡＴＣＣ ３３０７１（ＡＥＸ５０２４３．１、ＡＥＸ５３９３３．１）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１２（ＰＭＴ９３１２＿１４００）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９３１３（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＷＨ６（ＹＡＨＪ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ １３５２８（ＣＬＪＵ＿Ｃ１９２３０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｂｉｎｇｃｈｅｎｇｇｅｎｓｉｓ ＢＣＷ−１（ＳＢＩ＿０６１５０）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ Ｕ３２（ＡＭＥＤ＿１９９７）、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｖａｇｉｎａｔｕｓ ＦＧＰ−２（ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿２９８６、ＭＩＣＶＡＤＲＡＦＴ＿１２５３）、Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｇｅｎｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｕｍ ＷＳＨ−００１（ＣＯＤＡＢ、ＫＶＵ＿１１４３）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ Ａ８ ４ｓｅｑｓ ＡＸＹＬ＿０１２２３、ＡＸＹＬ＿０５７３８、ＡＸＹＬ＿０１９８１、ＣＯＤＡ）、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｔａｎｓ ＤＳＭ １２１４５（ＰＥＤＳＡ＿０１０６）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ ｂｉｏｖａｒ ｂｉｓｅｒｒｕｌａｅ ＷＳＭ１２７１（ＭＥＳＣＩ＿０１６３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧＢ−１（ＰＰＵＴＧＢ１＿２６５１、ＰＰＵＴＧＢ１＿３５９０）、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ Ｐｙ２（ＸＡＵＴ＿４０５８）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＷＨ ８１０２（ＣＯＤＡ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ ＤＳＭ ４４７０２（ＣＯＤＡ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｈ１３−３（ＡＧＲＯＨ１３３＿０９５５１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＤＳＭ ２０２８４（ＣＯＤＡ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｔ３Ｔ１（ＰＡＲＡ＿１８２５０）、Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ ｖｉｒｏｓａ ＤＳＭ １６９２２（ＷＥＥＶＩ＿１９９３）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅ ＡＣＳ−１２０−Ｖ−Ｃｏｌ１０ａ（ＣＯＤＡ）、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ ＤＳＭ １３９６５（ＴＨＥＳＵＤＲＡＦＴ＿１１６３）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ Ａｅ３９８（ＡＣＡＶＡ＿０１０１０００００６３６）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ ＨＫＩ ４５４（ＲＢＲＨ＿０３８０８）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ａｒｉｚｏｎａｅ ｓｅｒｏｖａｒ ｓｔｒ．ＲＳＫ２９８０（ＳＡＲＩ＿０４２９０）、Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ ＡＴＣＣ １９６２４（ＨＧＲ＿１１３２１）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ｓｅｇｎｉｓ ＡＴＣＣ ３３３９３（ＣＯＤＡ）、Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ ＩＳＭ（ＩＳＭ＿１１２３０）、Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ ｓｙｍｂｉｏｎｔ（ＰＳＴＡＳ＿０１０１０００１６１６１、ＰＳＴＡＳ＿０１０１０００１３５７４）、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｅｉ ＡＣＳ−１４６−Ｖ−Ｓｃｈ２ｂ（ＣＯＤＡ）、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＦＯ−ＢＥＧ１（ＰＳＥ＿０７６８）、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｉｂａｒｉａ ＫＡＣＣ １１８６２（ＷＣＩＢＫ１＿０１０１００００１５２９）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５（Ｓ７３３５＿２０５２、Ｓ７３３５＿１０９、Ｓ７３３５＿１７３１）、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＵＮＩ−１（ＡＮＴ＿０２９５０）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１１（ＣＯＤＡ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ｓｔｒ．ＭＩＴ ９２１５（ＣＯＤＡ）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＫＣＴＣ ３５４４（ＦＦＲＵＫ３＿０１０１００００４８３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ ＫＣＴＣ ３６８１（ＬＦＡＲＫ３＿０１０１００００１８４７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ ＫＣＴＣ ３５４３（ＬＦＲＵＫ３＿０１０１００００２０７５）、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ ＮＢＲＣ １２１７２ ３ｓｅｑｓ ＴＥＨ＿０５４３０、ＴＥＨ＿１４８５０、ＴＥＨ＿０２２２０）、Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＬＭＧ ２０５４６（ＶＩＢＲ０５４６＿１４５４５）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ ＬＭＧ １９４２４（ＣＯＤＡ）、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍ ＳｔＬＢ０３７（ＭＴＥＳ＿１２４７、ＭＴＥＳ＿３６００）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒａｅ ＨＰＬ−００３（ＨＰＬ００３＿２２０７０）、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ ｂｅｎｚｏａｔｉｌｙｔｉｃｕｓ ＪＡ２（ＲＢＸＪＡ２Ｔ＿０４７４３）、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ ｇｉｌｖｕｍ ＳＬ００３Ｂ−２６Ａ１（ＳＬ００３Ｂ＿２４６１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｓｔｒ．ＬＴ２（ＳＴＭ３３３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ Ｍ０４５（ＳＧＭ＿３２１０）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ Ｂ５６５（Ｂ５６５＿３９８７）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＤ０１（ＧＭＥ＿０８２０９）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ＢＳＲ３（ＢＧＬＡ＿２Ｇ１３６６０）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内投与され、５−ＦＣは、全身投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌と５−ＦＣの両方が、全身投与される。
これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＣから５−ＦＵを産生するように遺伝子操作された細菌、同じ条件下で、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＵ。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、５−ＦＵを産生するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％またはそれより大きく増加された量の５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍もしくはそれより大きく増加された量の５−ＦＣを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣの５−ＦＵへの変換実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣの５−ＦＵへの変換実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣｏｄＡをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８０％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８５％の同一性を有する。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９５％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３の配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣｏｄＡ遺伝子は、配列番号１２１３の配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約８０％の同一性を有するＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約９０％の同一性をほぼ有することがあるＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７と少なくとも約９５％の同一性をほぼ有することがあるＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６もしくは配列番号１２１７と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するＣｏｄＡポリペプチドまたはその機能性断片をコードする遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１６または配列番号１２１７を含むＣｏｄＡポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号１２１６または配列番号１２１７からなる。
一部の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、例えば、安定性を増強するために、または５−ＦＵ産生を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのシトシンデアミナーゼをコードする。一部の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉからのシトシンデアミナーゼは、例えば、安定性を増強するために、または５−ＦＵ産生を増大させるために、改変および／または突然変異される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、誘導条件下で、例えば、免疫抑制および／または腫瘍微小環境に関連する条件下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件もしくは低酸素条件で、ある特定の分子もしくは代謝物の存在下で、がん、もしくはある特定の組織、免疫抑制、もしくは炎症に関連する分子もしくは代謝物の存在下で、または消化管、血行路もしくは腫瘍内に存在することもあり、しないこともある何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、の存在下で、シトシンデアミナーゼを産生することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんの、および／または腫瘍微小環境の、および／または腫瘍微小環境もしくは組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管または腫瘍内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉからの、シトシンデアミナーゼの発現のための回路網を含むがこれに限定されない、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、細菌および／または他の微生物の拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらの実施形態のいずれにおいても、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからの、シトシンデアミナーゼの発現のための回路網を含むがこれに限定されない、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または細菌および／もしくは他の微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または他の微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、および（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、あるいは抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
組合せ回路−抗がん分子の組合せ
一部の実施形態では、１つまたは複数の微生物は、１つもしくは複数の免疫モジュレーションエフェクターをまたは２つもしくはそれより多いこれらのエフェクターの組合せをコードする遺伝子配列を発現するように遺伝子操作される。そのような遺伝子配列には、腫瘍微小環境におけるある特定の代謝物の産生もしくは異化のための遺伝子配列、ならびに／またはサイトカイン、抗体、例えば、免疫チェックポイントインヒビター、および本明細書に記載の他の抗がん分子を含むがこれらに限定されない、微生物細胞表面での分泌もしくは提示のためのポリペプチドが含まれるが、それらに限定されない。そのような遺伝子配列は、微生物のプラスミド上に位置することもあり、または染色体に組み込まれていることもあり、または両方であることもある。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、当技術分野において公知のまたは本明細書に記載の誘導性プロモーターの制御下にある。例えば、そのような誘導性プロモーターは、ＦＮＲプロモーターなどの、低酸素条件下で誘導されうる。他の実施形態では、プロモーターは、ある特定の分子または代謝物の存在下で、例えば、腫瘍微小環境に関連するおよび／または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の組織型において誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、ある特定の消化管特異的または腫瘍特異的分子または代謝物の存在下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、消化管または腫瘍内に存在することもあり、しないこともある、何らかの他の代謝物、例えばアラビノース、または当技術分野において公知のもしくは本明細書に記載の別の化学的もしくは栄養学的インデューサーの存在下で、誘導される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のカセットは、例えば、異なる強度のリボソーム結合部位を使用してそれらの発現を微調整することができる、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知の構成的プロモーターの制御下にある。そのような微生物は、必要に応じて、栄養要求体、例えば、アミノ酸栄養要求体またはヌクレオチド栄養要求体、例えばデルタＤａｐＡまたはデルタＴｈｙＡも含む。
実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞をモジュレートする、２つまたはそれより多い免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する、２つまたはそれより多い免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する、サイトカインである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１８から選択される２つまたはそれより多いサイトカインを産生することができる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される２つまたはそれより多いサイトカインをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む。代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。例えば、一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される２つまたはそれより多いアゴニスト、例えば、本明細書で開示されるＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストのいずれかをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニスト、例えば、本明細書で開示されるＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストのいずれかをコードする核酸配列とを含む。代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列と、樹状細胞活性化を促進する別の免疫モジュレーターをコードする核酸配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニスト、例えば、本明細書で開示されるＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストのいずれか、をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列と、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列と、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニスト、例えば、本明細書で開示されるＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストのいずれかをコードする核酸配列とを含む。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、樹状細胞活性化を促進する１つまたは複数の免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫サプレッサー分子、例えば、免疫チェックポイント分子を阻害する、２つまたはそれより多いイムノモジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される２つまたはそれより多い免疫チェックポイントインヒビター、例えば、本明細書で開示される免疫チェックポイントインヒビターのいずれかを産生することができる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する２つまたはそれより多い単鎖抗体をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対する単鎖抗体をコードする核酸配列を含む。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌を含み、遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌を含み、遺伝子操作された細菌は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫サプレッサー分子を阻害する２つまたはそれより多い免疫モジュレーター、例えば、調節性Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ、を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを産生することができ、キヌレニンを代謝または分解することもできる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンオペロン、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンと、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる遺伝子操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる遺伝子操作された細菌と、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌とを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる遺伝子操作された細菌と、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌と、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫サプレッサー分子を阻害する２つまたはそれより多い免疫モジュレーター、例えば、免疫チェックポイントおよびＴｒｅｇを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを産生することができ、ならびにまた、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビター、例えば、本明細書で開示される免疫チェックポイントインヒビターのいずれかを産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列、またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、トリプトファンを産生することができる遺伝子操作された細菌と、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを産生することができる遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンを代謝することができ、ならびにまた、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビター、例えば、本明細書で開示される免疫チェックポイントインヒビターのいずれかを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする核酸配列と、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、キヌレニナーゼをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌と、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンを産生することができ、キヌレニンを代謝することができ、ならびにまた、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲチェックポイントインヒビターから選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビター、例えば、本明細書で開示される免疫チェックポイントインヒビターのいずれかを産生する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列、またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列と、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。
上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細菌から１つまたは複数の抗がん分子を分泌するための分泌系をコードするための遺伝子配列をさらに含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、分泌系は、修飾ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、単一膜分泌系、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系から選択される。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細菌からトリプトファンを排出するための分泌系をコードする遺伝子配列をさらに含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ＹｄｄＧをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細菌にキヌレニンを移入するための輸送体をコードする遺伝子配列をさらに含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ａｒｏＰ、ｔｎａＢおよびｍｔｒ遺伝子から選択される遺伝子配列の１つまたは複数のコピーを含む。
上記組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、腫瘍部位からアデノシンを枯渇させることもできる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍内部位からアデノシンを枯渇するための、１つもしくは複数の遺伝子、または１つもしくは複数の遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、アデノシンを尿酸に変換するための１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細菌にアデノシンを移入するための輸送体をコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ヌクレオシド輸送体、例えばアデノシン輸送体、をコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｎｕｐＧまたはｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードするための遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、アルギニンを合成するための、１つもしくは複数の遺伝子、または１つもしくは複数の生合成遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択される１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子をコードする遺伝子配列を含む。アルギニンを産生するための上記組合せ実施形態のいずれにおいても、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変される。アルギニンを産生するための上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、フィードバック耐性ａｒｇＡをコードする遺伝子を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生する。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の抗がん分子を産生するための遺伝子配列および動作可能に連結したプロモーターは、細菌の染色体上に存在する。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の抗がん分子を産生するための遺伝子配列および動作可能に連結したプロモーターは、細菌のプラスミド上に存在する。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞生存および／または成長に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む栄養要求株であり、例えば、遺伝子は、ｔｈｙＡ、ｄａｐＤおよびｄａｐＡから選択される。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キルスイッチを含む。一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを枯渇させるための遺伝子を含む、または１つもしくは複数の遺伝子を含む遺伝子カセットを含む、操作された細菌と、トリプトファンを産生することおよび／またはキヌレニンを代謝もしくは分解することができる遺伝子操作された細菌、例えば、キヌレニナーゼをコードする核酸配列を含む細菌とを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲ分子から選択される任意のチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列を含む操作された細菌をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０アゴニストから選択される１つまたは複数のアゴニストをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つまたは複数のサイトカインをコードする核酸配列を含む遺伝子操作された細菌をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、アルギニンを産生することができる遺伝子操作された細菌をさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生することができ、ならびにまた、免疫サプレッサー分子、例えば、免疫チェックポイントおよびＴｒｅｇを阻害する１つまたは複数の免疫モジュレーターを産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列と、任意のチェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲから選択されるチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、エフェクターＴ細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つもしくは複数のサイトカインをコードする配列、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つもしくは複数のアゴニストをコードする配列、ならびに／または樹状細胞活性化を促進する免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする配列でありうる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５をコードする核酸配列と、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１に対する単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列を含み、また、トリプトファンを産生することができ、例えば、トリプトファンオペロン、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。これらの実施形態のいずれにおいても、エフェクターＴ細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つもしくは複数のサイトカインをコードする配列、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つもしくは複数のアゴニストをコードする配列、および／または樹状細胞活性化を促進する免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする配列でありうる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列とを含み、必要に応じて、欠失もしくは突然変異したトリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を含むこともあり、ならびに／またはトリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を必要に応じて含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、任意のチェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲから選択されるチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列をさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカイン、例えばＩＬ−２および／またはＩＬ−１５、をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、任意のチェックポイント分子、例えばＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列を含み、またキヌレニンを代謝または分解することができ、例えば、酵素キヌレニナーゼをコードする配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、エフェクターＴ細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つもしくは複数のサイトカインをコードする配列、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つもしくは複数のアゴニストをコードする配列、および／または樹状細胞活性化を促進する免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする配列でありうる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、任意のチェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲから選択されるチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列をさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカイン、例えばＩＬ−２および／またはＩＬ−１５、をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列と、任意のチェックポイント分子、例えばＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１、に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列を含み、またトリプトファンを産生することもでき、キヌレニンを代謝または分解することができる。これらの実施形態の一部において、遺伝子操作された細菌は、トリプトファンオペロン、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのトリプトファンオペロンと、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする配列と、酵素キヌレニナーゼをコードする配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。これらの実施形態のいずれにおいても、エフェクターＴ細胞の分化を活性化、刺激および／または誘導する１つまたは複数の免疫モジュレーターをコードする核酸配列は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１およびＩＬ−１８から選択される１つもしくは複数のサイトカインをコードする配列、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２２６、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＯＸ４０、アゴニストから選択される１つもしくは複数のアゴニストをコードする配列、および／または樹状細胞活性化を促進する免疫モジュレーター、例えばＧＭ−ＣＳＦ、をコードする配列でありうる。例えば、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含み、必要に応じて、欠失もしくは突然変異したトリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）の欠失を含むこともあり、ならびに／またはトリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を必要に応じて含む。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列と、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣ遺伝子をコードする核酸配列とを含み、必要に応じて、欠失もしくは突然変異したトリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）の欠失を含む。別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１２をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４０アゴニストをコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。別の特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２、ＣＤ４０アゴニストをコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、トリプトファンリプレッサー（ｔｒｐＲ）を、必要に応じて、欠失させて、突然変異させて、または改変して、そのリプレッサー機能を低下させることまたは消去することができる。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン前駆体であるコリスメートを産生するための遺伝子配列、例えば、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびＡｒｏＣをコードする配列を、必要に応じて含む。また、これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、任意のチェックポイント分子、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ−１、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００ＲおよびＡ２ａＲから選択されるチェックポイント分子に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列をさらに含むことができる。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、サイトカイン、例えばＩＬ−２および／またはＩＬ−１５、をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子またはｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＦ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸と、任意のチェックポイント分子、例えばＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１、に対する１つまたは複数の単鎖抗体をコードする核酸配列とを含む。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−２をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸と、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４をコードする核酸配列とを含む。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする核酸配列と、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＧ−Ｄ、ｔｒｐＣ−Ｆ、ｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ遺伝子をコードする核酸配列と、キヌレニナーゼをコードする核酸と、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４をコードする核酸配列とを含む。
上記組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、腫瘍部位からアデノシンを枯渇させることもできる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍内部位からアデノシンを枯渇するための、１つもしくは複数の遺伝子、または１つもしくは複数の遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、アデノシンを尿酸に変換するための１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細菌にアデノシンを移入するための輸送体をコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ヌクレオシド輸送体、例えばアデノシン輸送体、をコードする遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｎｕｐＧまたはｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードするための遺伝子配列を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、アルギニンを合成するための、１つもしくは複数の遺伝子、または１つもしくは複数の生合成遺伝子を含む遺伝子カセットを含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択される１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子をコードする遺伝子配列を含む。アルギニンを産生するための上記組合せ実施形態のいずれにおいても、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変される。アルギニンを産生するための上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、フィードバック耐性ａｒｇＡをコードする遺伝子を含む。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、アデノシンを尿酸に変換するための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする遺伝子配列を含み、さらに、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする遺伝子配列を含み、さらに、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、トリプトファン産生回路網を含むことができる。一部の実施形態では、任意選択のトリプトファン回路網は、ＴｒｐＥの欠失を含む。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびａｒｏＣの１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、そのようなトリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡおよびこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｓｅｒＡ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡの１つもしくは複数またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、そのようなトリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｓｅｒＡ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ＹｄｄＧまたはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡおよびこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現される回路網は、複数の機構を兼備するように選択される。例えば、腫瘍微小環境において複数の直交免疫モジュレーション経路を活性化することにより、免疫学的に冷たい腫瘍は、免疫学的に熱い腫瘍に形質転換される。免疫応答の異なる成分に対して影響を与える複数のエフェクターを選択することができる。遺伝子操作された細菌によって発現されるエフェクターにより標的とされうる異なる免疫応答成分は、免疫活性化およびプライミング（「免疫イニシエーター」）、ならびに免疫増強およびＴ細胞拡大増殖、（「免疫サステナー」）を含む（図３６を参照されたい）。一部の組合せ実施形態では、「免疫イニシエーター」は、「免疫サステナー」と組み合わせられる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを、さらに、間質モジュレーター、例えば、ヒアルロニダーゼと組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーおよび必要に応じて間質モジュレーターをコードする遺伝子を含む２つまたはそれより多い異なる細菌を、組み合わせ、同時にまたは逐次的に投与することができる。本明細書に記載の免疫活性化およびプライミング（免疫イニシエーター）を標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、可溶性ＳＩＲＰアルファ、抗ＣＤ４７抗体、および抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換、ならびにＳＴＩＮＧアゴニストが挙げられる。免疫サステナーは、免疫増強を促進する作用因子、およびＴ細胞拡大増殖を促進する作用因子、または両方を含む。本明細書に記載の免疫増強を標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、キヌレニン分解、アデノシン分解、アルギニン産生、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２分泌、および例えば抗ＰＤ−１分泌または提示による、チェックポイント遮断が挙げられる。本明細書に記載のＴ細胞拡大増殖を標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ならびにＩＬ−１５が挙げられる。間質モジュレーションを標的化するためのエフェクターの一例は、ヒアルロニダーゼである。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミングならびにＴ細胞拡大増殖を標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミングならびに間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫増強およびＴ細胞拡大増殖を標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫増強および間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、Ｔ細胞拡大増殖および間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミング、免疫増強、ならびにＴ細胞拡大増殖を標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミング、免疫増強、ならびに間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミング、Ｔ細胞拡大増殖、ならびに間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫増強、Ｔ細胞拡大増殖、および間質モジュレーションを標的化する。一部の実施形態では、選択されたエフェクターは、免疫活性化およびプライミング、免疫増強、Ｔ細胞拡大増殖、ならびに間質モジュレーションを標的化する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、分泌のためのＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、分泌のためのＣＸＣＬ１０をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＣＸＣＬ１０をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ｓｃＦｖをさらに含むことができる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＣＸＣＬ１０をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、抗ＰＤ−１抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。
１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼ（および必要に応じて、本明細書に記載のトリプトファンの産生のための回路網）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ＣＸＣＬ１０をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を、結腸直腸癌の処置、管理および予防に使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を、肝細胞癌の処置、管理および予防に使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を、進行黒色腫の処置、管理および予防に使用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、経口投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍内注射によって腫瘍内投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、全身投与される。これらの実施形態のいずれにおいても、任意選択のトリプトファン回路網は、ＴｒｐＥの欠失を含みうる。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、ａｒｏＨ、ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、ａｒｏＫおよびａｒｏＣの１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、そのようなトリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡおよびこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｓｅｒＡ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡの１つもしくは複数またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、そのようなトリプトファン産生回路網は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）、ｓｅｒＡ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ＹｄｄＧまたはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、トリプトファン産生回路網は、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡおよびこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、細菌は、アデノシンの尿酸への変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、分泌のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。ｓｃＦｖが由来しうる例示的な抗ＣＤ４０抗体は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。そのような抗体の分泌のための適切な分泌タグおよび他の配列は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、細菌は、アデノシンの尿酸への変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。そのような抗体の表面提示のための適切な膜提示アンカーおよび他の配列は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、細菌は、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、分泌のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含み、さらに、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、細菌は、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含み、さらに、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、細菌は、アデノシンの尿酸への変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列を含み、さらに、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、細菌は、アデノシンの尿酸への変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と、分泌のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列と、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列と、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。
一部の実施形態では、細菌は、アデノシンの尿酸への変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体（例えば、ｓｃＦｖ抗体）をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣの１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列と、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧ遺伝子の１つまたは複数のコピーをコードする遺伝子配列と、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子配列と、ヒアルロニダーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子配列とを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、膵管腺癌の処置、管理および予防に有用でありうる。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、経口、腫瘍内または全身投与される。
一部の実施形態では、細菌は、アルギニンの産生増加のための回路網をコードする遺伝子配列と、１つまたは複数の抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、アルギニンの産生増加のための回路網をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の抗ＣＤ４７抗体の分泌のための遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、アルギニンの産生増加のための回路網をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の抗ＣＤ４７抗体の表面提示のための遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌および／または表面提示または１つもしくは複数の抗ＣＤ４７抗体のための１つもしくは複数の遺伝子配列を含み、さらに、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択される１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子を含む。アルギニンおよび抗ＣＤ４７を産生するための一部の実施形態では、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変される。抗ＣＤ４７およびアルギニン生合成に基づく産生のための一部の実施形態では、細菌は、フィードバック耐性ａｒｇＡをコードする遺伝子をさらに含む。
一部の実施形態では、細菌は、アルギニンの産生増加のための回路網をコードする遺伝子配列と、例えば膜貫通および細胞質部分を欠いている、ＳＩＲＰアルファの１つまたは複数の可溶性形態をコードする遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、アルギニンの産生増加のための回路網をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、ＳＩＲＰアルファの１つまたは複数の可溶性形態の分泌のための遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＳＩＲＰアルファの１つまたは複数の可溶性形態をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含み、さらに、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択される１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子を含む。一部の実施形態、アルギニン産生のための回路網とＳＩＲＰアルファの１つまたは複数の可溶性形態の分泌のための１つまたは複数の遺伝子配列とを含む遺伝子操作された細菌、において、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を低下させるまたは消去するために欠失、突然変異または改変される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＳＩＲＰアルファの１つまたは複数の可溶性形態の分泌のための１つまたは複数の遺伝子を含み、さらに、フィードバック耐性ａｒｇＡをコードする遺伝子を含む、アルギニンの産生のための回路網を含む。
一部の実施形態では、抗がん分子の組合せを産生するための２つまたはそれより多い遺伝子配列は、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学的または栄養学的インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、同じプロモーター配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、２つまたはそれより多い異なるプロモーター配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列は、すべてが構成的（同じもしくは異なる構成的プロモーター）であることもあり、すべてが誘導性（同じもしくは異なるインデューサーによって誘導可能）であることもあり、または構成的プロモーターと誘導性プロモーターの混合物であることもある。
上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の抗がん分子を産生するための遺伝子配列および動作可能に連結したプロモーターは、細菌の染色体上に存在する。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の抗がん分子を産生するための遺伝子配列および動作可能に連結したプロモーターは、細菌のプラスミド上に存在する。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞生存および／または成長に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む栄養要求株であり、例えば、遺伝子は、ｔｈｙＡ、ｄａｐＤおよびｄａｐＡから選択される。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キルスイッチを含む。
遺伝子操作された細菌が、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／もしくは誘導する１つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができ、ならびに／または免疫サプレッサー分子、例えば免疫チェックポイントおよびＴｒｅｇ、を阻害する１つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができる、このセクションに記載の実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞溶解性ペプチド分子を産生することがさらにできることがある。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｄ−ペプチドＡ、Ｄ−ペプチドＢ、Ｄ−ペプチドＣ、Ｄ−ペプチドＤ、ＤＫ６Ｌ９、ＮＲＣ−０３、ＮＲＣ−０７、ゴメシン、ヘプシジンＴＨ２−３、デルマセプチンＢ２、ＰＴＰ７、ＭＧＡ２、ＨＮＰ−１、タキプレシン、テモポリン−１ＣＥａ、ＮＫ−２、ウシラクトフェリンＢ６、セクロピンＣＢ１、ポリビア−ＭＰＩ、ＳＶＳ−１、エピネシジン−１、
Ｄ−Ｋ６Ｌ９、ＭＰＩ−１、Ａ９Ｋ、Ｈｅｃｔａｔｅ、Ｐｈｏｒ１４、Ｐｈｏｒ２１、ＢＥＰＴＩＩ、ＢＥＰＴＩＩ−Ｉ、ＴｆＲ−細胞溶解性ペプチド、ＢＰＣ９６、ＲＧＤ−タキプレシン、Ａ９Ｋ、ＥＲα１７ｐ、ＣＲ１１６６、ペプチドアプタマー、ペントスタチン−１（pentastatin-1）、ケモキノスタチン−１（chemokinostatin-1）、プロパージスタチン（properdistatin）、ミリストイル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−（１，３ジメチル）Ｈｉｓ−ＯＭｅ、９ソマトスタチンペプチドアナログおよびＬＴＸ−４０１から選択される１つまたは複数の細胞溶解性ペプチド分子をコードする配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、Aliら Sci Transl Med 1、８ｒａ１９（２００９年）、In Situ Regulation of DC Subsets and T Cells Mediates Tumor Regression in Mice（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ＧＭ＿ＣＳＦ、ＣｐＧリッチオリゴヌクレオチド、および腫瘍細胞溶解物またはそれらに由来する抗原を産生する、１つまたは複数のカセットをコードしている。
遺伝子操作された細菌が、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞、の分化を活性化、刺激および／もしくは誘導する１つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができ、ならびに／または免疫サプレッサー分子、例えば免疫チェックポイントおよびＴｒｅｇ、を阻害する１つもしくは複数の免疫モジュレーターを産生することができる、このセクションに記載の実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の腫瘍抗原、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の腫瘍抗原のいずれかを、産生することがさらにできることがある。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で抗がん分子を産生し、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗がん分子を産生するための遺伝子をプラスミドおよび／または染色体上に発現する。抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを、細菌の染色体の１つまたは複数の組込み部位に組み込むことができる。例えば、抗がん分子をコードする配列の１つまたは複数のコピーを、細菌染色体に組み込むことができる。抗がん分子をコードする遺伝子の複数のコピーを染色体に組み込んでしまうことにより、この分子をより多く産生することができ、発現レベルの微調整も可能になる。あるいは、抗がん分子をコードする遺伝子に加えて、本明細書に記載の異なる回路、例えば、キルスイッチ回路のいずれかを、複数の異なる機能を果たすように細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことができよう。複数の別個の抗がん分子が、遺伝子操作された細菌によって産生されうる。
これらの実施形態およびすべての組合せ実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、外科手術、化学療法、標的療法、放射線療法、トモセラピー、免疫療法、がんワクチン、ホルモン療法、温熱療法、幹細胞移植（末梢血、骨髄、および臍帯血移植）、光線力学的療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、ならびに血液製剤輸血および輸注などの、従来のがん治療と併用することができる。抗がん分子、例えば、免疫インヒビター（抗体）、アゴニスト性抗体、アゴニスト抗体、および／または免疫刺激性サイトカインを産生するためのこれらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌の組合せは、がんを処置するために使用される他の従来の免疫療法、例えば、チェックポイントインヒビター、Ｆｃ媒介ＡＤＣＣ、ＢｉＴＥ、ＴＣＲ、養子細胞療法（ＴＩＬ、ＣＡＲ、ＮＫ／ＮＫＴなど）、および本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の他の免疫療法のいずれかと、併用することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、１つまたは複数の細胞毒または細胞溶解性ペプチドを産生することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、操作された細菌は、がんまたは腫瘍ワクチンと併用することができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、安定化ポリペプチドと融合されているエフェクターまたは抗がん分子をコードする遺伝子配列を含む。そのような安定化ポリペプチドは、当技術分野において公知であり、Ｆｃタンパク質を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によりコードされる融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質またはＩｇＡ Ｆｃ融合タンパク質である。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、抗がん分子を、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドと共有結合で融合させることができる。一部の実施形態では、抗がん分子は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドと共有結合で融合されている。一部の実施形態では、抗がん分子のＣ末端は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドのＮ末端と共有結合で融合されている。一部の実施形態では、抗がん分子のＮ末端は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって安定化ポリペプチドのＣ末端と共有結合で融合されている。一部の実施形態では、安定化ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、免疫グロブリン可変ヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域および免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドは、配列［ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ］ｎ（配列中、ｎは、１、２、３、４、５または６である）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰアルファＩｇＧ ＦＣ融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰアルファＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドを含む。一部の実施形態では、グリシンリッチペプチドリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰアルファのＮ末端は、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含むペプチドリンカーによってＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端と共有結合で融合されている。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、多量体ポリペプチドの成分をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、二量体である。二量体タンパク質の非限定的な例としては、ＩＬ−１５（ヘテロ二量体）などのサイトカインが挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み、１つまたは複数のポリペプチドは、第１の単量体および第２の単量体を含む。一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって第２の単量体ポリペプチドと共有結合で連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンリッチペプチドを含む。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、同じポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１および第２の単量体は、各々が異なるポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、第１の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ３５ポリペプチドであり、第２の単量体は、ＩＬ−１２ ｐ４０ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳを含む。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、抗がん分子のエフェクター機能を、エフェクター機能を助長する別のポリペプチドとの融合によって向上させることができる。そのような融合の非限定的な例は、本明細書に記載のＩＬ−１５ＲアルファのＳｕｓｈｉドメインとのＩＬ−１５の融合である。したがって、一部の実施形態では、第１の単量体ポリペプチドは、ＩＬ−１５単量体であり、第２の単量体は、ＩＬ−１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインポリペプチドである。
これらの実施形態およびすべての組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の１つまたは複数の分泌タグをコードする遺伝子配列を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、拡散性外膜表現型を可能にする、内在性膜会合タンパク質の１つまたは複数の突然変異を含む。適切な外膜突然変異は、本明細書に記載されている。
免疫アクチベーターと免疫サステナーの組合せ
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、免疫活性化およびプライミング（イニシエーター）および免疫サステナー（例えば、免疫増強またはＴ細胞拡大増殖）を標的化することができる回路網を含む。あるいは、本開示は、各細菌が１つもしくは複数の免疫アクチベーター／プライマー（イニシエーター）および／または１つもしくは複数の免疫サステナーをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。そのような別個のまたは異なる菌株を同時にまたは逐次的に投与することができる。免疫イニシエーターおよびサステナーの非限定的な例は、表Ａおよび表Ｂに記載される。
一部の組合せ実施形態では、表Ａの１つまたは複数のエフェクターを、表Ｂの１つまたは複数のエフェクターと組み合わせることができる。
免疫応答の異なる成分に対して影響を与える複数のエフェクターを選択することができる。１つまたは複数の遺伝子操作された細菌によって発現されるエフェクターにより標的化されうる異なる免疫応答成分は、免疫活性化およびプライミング（「免疫イニシエーター」）、免疫増強、Ｔ細胞拡大増殖、（「免疫サステナー」）を含む（図３６を参照されたい）。一部の組合せ実施形態では、「免疫イニシエーター」は、「免疫サステナー」と組み合わせられる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび／または免疫サステナーを、さらに、間質モジュレーター、例えば、ヒアルロニダーゼと組み合わせることができる。一部の実施形態では、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーおよび必要に応じて間質モジュレーターをコードする遺伝子を含む２つまたはそれより多い異なる細菌を、組み合わせ、同時にまたは逐次的に投与することができる。本明細書に記載の免疫活性化およびプライミングを標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、可溶性ＳＩＲＰアルファ、抗ＣＤ４７抗体、および抗ＣＤ４０抗体、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換、ならびにＳＴＩＮＧアゴニストが挙げられる。本明細書に記載の免疫増強を標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、キヌレニン分解、アデノシン分解、アルギニン産生、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２分泌、およびチェックポイント遮断、例えば、抗ＰＤ−１分泌または提示によるチェックポイント遮断が挙げられる。本明細書に記載のＴ細胞拡大増殖を標的化するためのエフェクターの非限定的な例としては、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ならびにＩＬ−１５が挙げられる。
１つの組合せ実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための１つまたは複数の遺伝子配列と組み合わせられた、１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む。代替実施形態では、本開示は、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む組成物を提供する。１つのそのような組成物実施形態では、１つまたは複数の免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、１つまたは複数の免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌と組み合わせてもよい。あるいは、組成物中の各細菌が、免疫サステナーと免疫イニシエーターの両方を有してもよい。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインであり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、ケモカインまたはサイトカインイニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ベータ１から選択される。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、単鎖抗体であり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、受容体リガンドであり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。１つの免疫イニシエーターが受容体リガンドである、一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＣＤ４０Ｌである。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、受容体リガンドは、ＳＩＲＰアルファ、またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、代謝的変換であり、１つの免疫サステナーは、例えばキヌレニン消費物質、トリプトファン産生物質、アルギニン産生物質およびアデノシン消費物質から選択される、代謝的変換である。一部の実施形態では、イニシエーター代謝的変換は、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生物質、例えば、デアデニレートシクラーゼ、例えばＤａｃＡである。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作免疫療法（engineered immunotherapy）でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法（engineered chemotherapy）であり、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、１つの免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法であり、１つの免疫サステナーは、代謝的変換である。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。一部の実施形態では、イニシエーター遺伝子操作化学療法は、例えば、ｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質による、５ＦＣから５ＦＵへの変換である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫サステナーまたはオーグメンターは、抗ＰＤ−１単鎖抗体、抗ＣＴＬＡ４単鎖抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０または代謝的変換から選択することができる。代謝的変換は、アルギニン産生、アデノシン消費、および／またはキヌレニン消費でありうる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、単鎖抗体であり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、抗ＣＴＬＡ４抗体である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、受容体リガンドであり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＰＤ１もしくはＰＤＬ１もしくはＣＴＬＡ４、またはそれらの断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインでありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、サイトカインまたはケモカインであり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＩＬ−１５またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、ＣＸＣＬ１０またはその断片、バリアントもしくは融合タンパク質である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、１つの免疫サステナーは、代謝的変換でありうる。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、サイトカインまたはケモカインである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、代謝的変換である。一部の実施形態では、１つの免疫サステナーは、代謝的変換であり、免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、キヌレニン消費である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、アルギニン産生である。一部の免疫サステナーおよび免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態では、免疫サステナーは、アデノシン消費である。これらの実施形態のいずれにおいても、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択することができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費（および必要に応じて、トリプトファンの産生）のための酵素をコードする遺伝子配列と、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、代謝的変換、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生物質、例えば、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法、例えば、５ＦＣの５ＦＵへの変換のためのｃｏｄＡである。一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＴＮＦ−アルファをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＩＦＮ−ベータ１をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、本明細書に記載のＳＩＲＰアルファまたはそのバリアントをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰの産生のためのｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、５ＦＣの５ＦＵへの変換のための酵素、例えばｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質、をコードする遺伝子配列とを含む。これらのキヌレニン消費および免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、ｔｒｐＥを欠失させることができる。
これらの組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列と、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列とを含む。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わせられる免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わせられる免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、代謝的変換、例えば、アルギニン産生物質、キヌレニン消費物質および／またはアデノシン消費物質である。一部の実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、アルギニン産生物質、アデノシン消費物質、およびキヌレニン消費物質から選択される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、抗ＰＤ−１抗体をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列と、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、例えば本明細書に記載の、アルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、キヌレニンの消費のための酵素、例えば、キヌレニナーゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼ、をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列と、本明細書に記載の、消費アデノシンのための酵素をコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、ｄａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
これらの組成物実施形態のいずれにおいても、キヌレニンの消費（および必要に応じてトリプトファンの産生）のための酵素をコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌を、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と、組み合わせることができる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、免疫イニシエーターの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、代謝的変換、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生物質、例えば、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡである。一部の実施形態では、キヌレニナーゼと組み合わせられる免疫イニシエーターは、遺伝子操作化学療法、例えば、５ＦＣの５ＦＵへの変換のためのｃｏｄＡである。一部の実施形態では、免疫イニシエーターは、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ１、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、および５ＦＣ−＞５ＦＵから選択される。一実施形態では、１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と、ＴＮＦ−アルファをコードする遺伝子配列とを含む。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ガンマをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＦＮ−ベータ１をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のＳＩＲＰアルファまたはそのバリアントをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素、例えばサイクリック−ジＡＭＰの産生のためのｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、５ＦＣの５ＦＵへの変換のための酵素、例えばｃｏｄＡまたはそのバリアントもしくは融合タンパク質、をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。これらのキヌレニン消費および免疫イニシエーター組合せおよび／または組成物実施形態のいずれにおいても、ｔｒｐＥを欠失させることができる。
これらの組成物実施形態のいずれにおいても、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする遺伝子配列を含むことができる、１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌を、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と、組み合わせることができる。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、免疫サステナーの産生のための遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、ケモカインまたはサイトカインである。一部の実施形態では、ｄａｃＡと組み合わせられる免疫サステナーは、単鎖抗体である。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、受容体リガンドである。一部の実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、と組み合わせられる免疫サステナーは、代謝的変換、例えば、アルギニン産生物質、キヌレニン消費物質および／またはアデノシン消費物質である。一部の実施形態では、免疫サステナーは、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、アルギニン産生物質、アデノシン消費物質、およびキヌレニン消費物質から選択される。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ−１抗体をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、ＣＸＣＬ１０をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、例えば本明細書に記載の、アルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、デアデニレートシクラーゼ、例えばｄａｃＡ、をコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素、例えば、キヌレニナーゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼ、をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、ｄａｃＡをコードする遺伝子配列を含む組成物の１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の消費アデノシンのための酵素をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の異なる遺伝子操作された細菌と組み合わせられる。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、ｄａｃＡは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約８０％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、４時間後、ＳＴＩＮＧアゴニスト産生を約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含み、これと組み合わせて、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリック−ジＧＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ｃ−ジＧＡＭＰシンターゼは、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＡＴＰを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ＳＴＩＮＧアゴニストの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、産生されるＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−ジＡＭＰである。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、ジアデニル酸シクラーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＡＴＰを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、キヌレニンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを５−ＦＵに変換する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アデノシンの消費のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＣの５−ＦＵへの変換のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いＳＴＩＮＧアゴニスト、例えば、サイクリック−ジＡＭＰを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのＳＴＩＮＧアゴニスト産生およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアデノシン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子と組み合わせて、５−ＦＵの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一実施形態では、組成物は、アルギニンの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、５−ＦＵの産生のための酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉからのものである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、酵母からのものである。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＵを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＵを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５−ＦＵを産生する。
さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い５−ＦＣを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い５ＦＣを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの５−ＦＣから５−ＦＵへの変換およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
免疫活性化およびプライミングを免疫増強と組み合わせるこれらの実施形態のいずれにおいても、免疫活性化およびプライミングを標的化するためのエフェクターをコードする遺伝子配列、ならびに免疫増強のためのエフェクターをコードする遺伝子配列を、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結させることができる。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学的または栄養学的インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結されている。適切な構成的プロモーターは、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、同じプロモーター配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、２つまたはそれより多い異なるプロモーター配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列は、すべてが構成的（同じもしくは異なる構成的プロモーター）であることもあり、すべてが誘導性（同じもしくは異なるインデューサーによって誘導可能）であることもあり、または構成的プロモーターと誘導性プロモーターの混合物であることもある。
上記免疫活性化および免疫増強組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌の染色体上に存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌のプラスミド上に存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の免疫活性化および免疫増強エフェクターを産生するための遺伝子配列は、細菌のプラスミド上にも染色体上にも存在しうる。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞生存および／または成長に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む栄養要求株でありえ、例えば、遺伝子は、ｔｈｙＡ、ｄａｐＤおよびｄａｐＡから選択される。上記組合せ実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、キルスイッチを含むことができる。
一部の免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物において、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物において、免疫イニシエーターおよび免疫サステナーの回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらの免疫イニシエーターおよびサステナー組合せおよび／または組成物のいずれにおいても、免疫イニシエーター回路および免疫サステナー回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
代謝回路の組合せ
アデノシンおよびキヌレニン消費
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の代謝物を産生および／または消費する回路網を含む。あるいは、本開示は、各細菌が１つまたは複数の代謝基質の産生および／または消費のための１つまたは複数の酵素をコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。そのような基質の非限定的な例としては、キヌレニン、トリプトファン、アデノシンおよびアルギニンが挙げられる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの分解およびキヌレニンの消費のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路と組み合わせてキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、アデノシンの分解のための回路網を含む遺伝子操作された細菌、および遺伝子操作された細菌、キヌレニンの消費を含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有しうる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させることができる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させることができる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。１つのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンおよびキヌレニンの分解のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、アデノシンおよび／またはキヌレニンの分解のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのアデノシンおよびキヌレニン消費実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびキヌレニン消費回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
アデノシン消費およびアルギニン産生
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシンの分解およびアルギニンの産生のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アデノシン分解経路と組み合わせてアルギニン産生回路をコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲの制御下にある。
一実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、アデノシンの分解のための回路網を含む遺伝子操作された細菌と、アルギニンの産生のための配列を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、組成物は、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む、遺伝子操作された細菌を含む。
１つの組成物実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。１つの組成物実施形態では、アデノシン分解経路酵素をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む。一実施形態では、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。一実施形態では、アデノシン経路酵素は、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのものであり、アデノシン分解経路をコードする遺伝子配列は、例えばＥ．ｃｏｌｉからの、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤおよびｎｕｐＣを含む。１つの特定の実施形態では、アデノシン経路酵素は、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアデノシンを消費する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアデノシンを消費する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多い尿酸を産生する。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多い尿酸を産生する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、分解速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、約１．８〜１０ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有しうる。１つの特定の実施形態では、細菌は、約５〜９ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。１つの特定の実施形態では、細菌は、約６〜８ｕｍｏｌ／ｈｒ／１０９細胞のアデノシン分解速度を有する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５０％〜７０％増加させることができる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６５％増加させる。１つの特定の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約５５％〜６０％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約１．５〜３倍増加させる。１つの特定の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、１時間後、アデノシン分解を約２〜２．５倍増加させる。
１つのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約８５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９７％〜９９％増加させる。
１つのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４０〜５０倍増加させることができる。１つの特定の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、２時間後、アデノシン分解を約４４〜４８倍増加させる。
１つのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、３時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
１つのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９５％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９８％〜１００％増加させる。一実施形態では、細菌は、同じ条件下で、すなわち、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、アデノシン分解を約９９％〜９９％増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、細菌は、低酸素条件下で誘導されたとき、４時間後、アデノシン分解を約１０００〜１００００倍増加させる。
いずれのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態においても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別のアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のアデノシン消費およびアルギニン産生消費実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、アデノシンの分解およびアルギニンの産生のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、アデノシンの分解およびアルギニンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのアデノシン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびアルギニン産生回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
キヌレニン消費およびアルギニン産生
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニンの消費およびアルギニンの産生のための回路網を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費（および必要に応じて、トリプトファン産生）経路と組み合わせてアルギニン産生回路をコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニン産生経路と組み合わせてキヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
代替実施形態では、本開示は、各細菌が異なる免疫モジュレーターをコードする、異なる遺伝子操作された細菌の組合せ（例えば、２つまたはそれより多く）を含む、組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、組成物は、キヌレニンの消費のための回路網を含む遺伝子操作された細菌と、アルギニンの産生のための回路網を含む遺伝子操作された細菌とを含む。一実施形態では、組成物は、キヌレニン消費（および必要に応じて、トリプトファン産生）経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、組成物は、アルギニン産生経路をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌と組み合わせて、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌を含む。一実施形態では、キヌレニナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである。１つの特定の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼは、染色体に組み込まれており、構成的プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アルギニン産生回路をコードする遺伝子配列は、フィードバック耐性ＡｒｇＡ（ＡｒｇＡｆｂｒ）を含み、内在性アルギニンオペロンリプレッサーＡｒｇＲの欠失を含む。一実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、Ｅ ｃｏｌｉからのものである。１つの特定の実施形態では、ＡｒｇＡｆｂｒは、染色体に組み込まれており、低酸素プロモーター、例えばＦＮＲ、の制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、ＴｒｐＥを欠失させることができる。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いキヌレニンを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いキヌレニンを消費する。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、キヌレニンを消費するように、および必要に応じて、トリプトファンを産生するように、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いトリプトファンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いトリプトファンを産生する。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を０％〜２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％上昇させる。さらに別のキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍大きく上昇させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費速度を約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍上昇させる。
１つのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約８０％〜１００％増加させる。１つのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９０％〜１００％増加させる。１つの特定のキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９５％〜１００％増加させる。１つの特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、４時間後、同じ細菌亜型の未改変細菌と比較して、キヌレニン消費を約９９％〜１００％増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０〜５０倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０〜１００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００〜５００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５００〜１０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１０００〜５０００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約５０００〜１００００倍増加させる。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、キヌレニン消費を、４時間後、約１００００〜１０００倍増加させる。
いずれのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態においても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いアルギニンを産生する。
さらに別のキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より少なくとも約１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いアルギニンを産生する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いアルギニンを産生する。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より０％〜２％、２％〜４％、４％〜６％、６％〜８％、８％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１４％、１４％〜１６％、１６％〜１８％、１８％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍、または２倍多いグルタメートを消費する。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で、同じ細菌亜型の未改変細菌より約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍多いグルタメートを消費する。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、細菌は、細胞増殖を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍成長を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍サイズを、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍体積を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、腫瘍重量を、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより大きく低減させることができる。
一部のキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、キヌレニン消費およびアルギニン産生のための記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、キヌレニン消費およびアルギニン産生のための回路網をコードする遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターにより制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
これらのキヌレニン消費およびアルギニン産生実施形態のいずれにおいても、記載のアデノシン分解回路およびキヌレニン消費回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体内の１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、アデノシンおよびキヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
抗がん分子の発現を調節すること
一部の実施形態では、細菌細胞は、ペイロードをコードする遺伝子を有する、安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、ペイロードを宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば消化管内で、もしくは腫瘍微小環境において、生存および／または成長することができる。一部の実施形態では、細菌細胞は、２つまたはそれより多い別個のペイロードまたはオペロン、例えば、２つまたはそれより多いペイロード遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、３つまたはそれより多い別個の輸送体またはオペロン、例えば、３つまたはそれより多いペイロード遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い別個のペイロードまたはオペロン、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多いペイロード遺伝子を含む。
本明細書において、用語「ペイロード（単数）」、「目的のポリペプチド（単数）」または「目的のポリペプチド（複数）」、「目的のタンパク質（単数）」、「目的のタンパク質（複数）」、「ペイロード（複数）」、「エフェクター分子」、「エフェクター」は、本明細書に記載の１つもしくは複数のエフェクター分子、および／またはそのようなエフェクター分子の産生に必要な１つもしくは複数の酵素もしくは酵素としてのポリペプチド機能を指す。ペイロードの非限定的な例としては、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、これに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン産生酵素、アデノシン分解酵素が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「目的のポリペプチド（単数）」または「目的のポリペプチド（複数）」、「目的のタンパク質（単数）」、「目的のタンパク質（複数）」、「ペイロード（単数）」、「ペイロード（複数）」は、本明細書に記載のトリプトファン合成酵素、キヌレニン分解酵素、アデノシン分解酵素、アルギニン産生酵素および他の代謝経路酵素のいずれか単数またはいずれか複数をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「目的の遺伝子」または「目的の遺伝子配列」は、本明細書に記載の１つまたは複数の抗がん分子をコードする遺伝子および／もしくは（an/or）遺伝子配列およびもしくは遺伝子カセットのいずれか単数またはいずれか複数を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じペイロード遺伝子の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノースまたは本明細書に記載の別の化学もしくは栄養インデューサーへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体内に存在し、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノースまたは本明細書に記載の別の化学もしくは栄養インデューサーへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードのすべてが染色体上に存在する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードのすべてが１つまたは複数の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いペイロードを含み、ペイロードの一部は、染色体上に存在し、ペイロードの一部は、１つまたは複数の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。
上記実施形態のいずれにおいても、抗がん分子組合せを産生するための１つまたは複数のペイロードは、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の特異的条件下で、誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数のペイロードは、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学または栄養インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノースまたは本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結されている。
一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件、例えば消化管のもとで誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、例えば、様々な細胞培養および／または製造条件下で誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件、例えば消化管のもとで、ならびに本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件、例えば、様々な細胞培養ならびに／または細胞産生および／もしくは製造条件下で誘導される。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）により、直接誘導される。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）により、間接的に誘導される。
一部の実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍および／または哺乳動物の小腸の低酸素環境に特異的な外因性環境条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物消化管の環境などの、低酸素または嫌気条件により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、腫瘍、哺乳動物の特定の組織または消化管に特異的である分子または代謝物により、直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により、直接または間接的に誘導される。
ＦＮＲ依存性調節
本発明の遺伝子操作された細菌は、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件により制御される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーターであり、抗がん分子は、低酸素、微好気または嫌気条件で発現される。例えば、低酸素条件では、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子により活性化され、それによって、抗がん分子の産生が駆動される。
細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるシグナル伝達経路を異なる酸素レベルにより誘発することができ、異なるシグナル伝達経路は、異なる動態で存在しうる。酸素レベル依存性プロモーターは、１つまたは複数の酸素レベル感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列である。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットであって、酸素レベル依存性プロモーターの制御下にある遺伝子または遺伝子カセットを含む。より特異的な態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素または嫌気環境下、例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物消化管の環境下で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下の、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。
ある特定の実施形態では、細菌細胞は、フマル酸・硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＦＮＲは、好気性代謝から嫌気性代謝への切り替えを制御する主転写アクチベーターである（Undenら、１９９７年）。嫌気状態で、ＦＮＲは、二量体化して活性ＤＮＡ結合タンパク質になり、このタンパク質が、嫌気成長への適応に関与する何百もの遺伝子を活性化する。好気状態では、ＦＮＲは、酸素により二量体化が妨げられ、不活性である。ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９のＦＮＲ応答性プロモーターを含むが、これらに限定されない。下線付き配列は、予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングに使用される制限部位である。
ＦＮＲプロモーター配列は、当技術分野において公知であり、任意の適するＦＮＲプロモーター配列を本発明の遺伝子操作された細菌において使用することができる。任意の適するＦＮＲプロモーターを任意の適するペイロードと組み合わせることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ペイロード」は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ヒアルロニダーゼ、これに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン産生酵素、アデノシン分解酵素を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の、例えば抗がん分子を指す。
ＦＮＲプロモーター配列の非限定的な例は、配列番号５６３〜５７９で提供される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、配列番号５６３、配列番号５６４、配列番号５６５、配列番号５６６、配列番号５６７、配列番号５６８、配列番号５６９、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号５７０）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号５７１）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号５７２）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号５７３）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号５７４）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｙｄｆＺプロモーター（配列番号５７５）、ｆｎｒＳ、嫌気誘導型低分子ＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号５７６またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号５７７）、ｃｒｐ結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号５７８）、およびｃｒｐ結合部位に融合されたｆｎｒＳ（配列番号５７９）のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５６３〜５７９から選択される配列を含むＦＮＲ応答性プロモーターを含む遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号５６３〜５７９をから選択される配列からなる。
一部の実施形態では、複数の異なるＦＮＲ核酸配列が遺伝子操作された細菌に挿入される。代替実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代替酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＤＮＲ（Trunkら、２０１０年）またはＡＮＲ（Rayら、１９９７年）の制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロード遺伝子の発現は、消化管内などの、低酸素または嫌気環境で特に活性化される。一部の実施形態では、遺伝子発現は、当技術分野において公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化することおよび／またはｍＲＮＡ安定性を増大させることにより、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物消化管は、ヒト哺乳動物消化管である。
別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元転写調節因子の嫌気的調節（ＡＮＲ）の制御下で発現される抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおいて、ＡＮＲは、「酸素制限条件または嫌気条件下で誘導されうる生理的機能の発現に必要である」（Wintelerら、１９９６年；Sawers １９９１年）。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＮＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）は、ＡＮＲおよびＦＮＲによって効率的に認識された」（Wintelerら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気状態では、ＡＮＲは、嫌気成長への適応に関与する非常に多くの遺伝子を活性化する。好気状態では、ＡＮＲは不活性である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａは、すべて、ＡＮＲの機能的アナログを有する（Zimmermannら、１９９１年）。ＡＮＲにより調節されるプロモーター、例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Hasegawaら、１９９８年を参照されたい）。
他の実施形態では、ペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列は、転写アクチベーター、例えばＣＲＰ、の結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。ＣＲＰ（サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質またはＣＡＰ）は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在するときに、あまり好ましくない炭素源の取込み、代謝および同化の原因となる遺伝子を抑止することにより、細菌において主要な調節的役割を果たす（Wuら、２０１５年）。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑止、ならびにカーボンカタボライト抑止と名付けられた（Deutscher、２００８年；GorkeおよびStulke、２００８年）。一部の実施形態では、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ペイロードの１つまたは複数の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合されたＦＮＲプロモーターにより制御される。これらの実施形態では、サイクリックＡＭＰは、環境にグルコースが存在しない場合、ＣＲＰと結合する。この結合によって、ＣＲＰの立体構造変化が生じ、ＣＲＰはその結合部位と密接に結合することが可能になる。その場合、ＣＲＰ結合は、ＲＮＡポリメラーゼを直接タンパク質間相互作用によってＦＮＲプロモーターに動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、サイクリックＡＭＰは、ＣＲＰと結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写は、抑止される。一部の実施形態では、転写アクチベーターの結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで成長培地にグルコースを添加することにより、十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気条件下で確実に発現されないようにするために使用される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル依存性プロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル感知転写因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からの酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子および／またはプロモーターは、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードを産生するための１つまたは複数の遺伝子配列、の転写を、同じ条件下で細菌のネイティブ遺伝子およびプロモーターと比較して増加させる。ある特定の実施形態では、非ネイティブ酸素レベル依存性転写調節因子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来するＦＮＲタンパク質である（例えば、Isabellaら、２０１１年を参照されたい）。一部の実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、無傷の状態で保たれ、野生型活性を保持する。代替実施形態では、対応する野生型転写調節因子は、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲと、同じ亜型の細菌からの野生型プロモーターと比較して突然変異されている対応するプロモーターとを含む。突然変異プロモーターは、野生型転写調節因子との結合を増進させ、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードをコードする遺伝子、の転写を、同じ条件下で、野生型プロモーターと比較して増加させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲプロモーターと、同じ亜型の細菌に由来する野生型転写調節因子と比較して突然変異されている対応する転写調節因子とを含む。突然変異転写調節因子は、野生型プロモーターとの結合を増進させ、低酸素または嫌気環境で、前記プロモーターに作動可能に連結した遺伝子、例えばペイロードをコードする遺伝子、の転写を、同じ条件下で、野生型転写調節因子と比較して増加させる。ある特定の実施形態では、突然変異型酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化を増進させかつＦＮＲ活性を増強するアミノ酸置換を含む、ＦＮＲタンパク質である（例えば、Mooreら、２００６年を参照されたい）。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子と対応するプロモーターの両方が、低酸素条件で、ペイロードの発現を、同じ亜型の細菌からの野生型配列と比較して増加させるために、突然変異される。
一部の実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子、の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、同じプラスミド上に存在する。
一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、異なる染色体上に存在する。一部の実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子、およびペイロードをコードする遺伝子は、同じ染色体上に存在する。一部の事例では、発現安定性を増強するために誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させるほうが有利でありうる。一部の実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードの発現を制御する同じプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、転写調節因子およびペイロードは、プロモーター領域から分岐転写される。
ＲＮＳ依存性調節
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、炎症性条件により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、炎症性環境で活性化される炎症依存性プロモーター、例えば活性窒素種またはＲＮＳプロモーター、の制御下で発現される。
本明細書で使用される場合、「活性窒素種」および「ＲＮＳ」は、分子窒素に由来する高活性分子、イオンおよび／またはラジカルを指すために同義で使用される。ＲＮＳは、ニトロソ化ストレスなどの有害な細胞効果の原因となりうる。ＲＮＳは、一酸化窒素（ＮＯ・）、ペルオキシナイトライトまたはペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、二酸化窒素（・ＮＯ２）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）およびニトロソペルオキシ炭酸（nitroperoxycarbonate）（ＯＮＯＯＣＯ２−）（・は、不対電子を示す）を含むが、これらに限定されない。細菌は、ＲＮＳレベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるＲＮＳシグナル伝達経路は、異なるＲＮＳレベルにより誘発され、異なる動態で存在する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を指し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合する、および／または調節領域を活性化する。一部の実施形態では、ＲＮＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域と結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代替実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域と結合し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、立体構造変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。ＲＮＳ誘導性調節領域を、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えば、ペイロード遺伝子配列、例えば本明細書に記載のペイロードのいずれか、に動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列の発現が駆動される。このようにして、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を誘導する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ抑制解除可能調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑止する、核酸配列を指し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合せず、調節領域を抑止しない。一部の実施形態では、ＲＮＳ抑制解除可能調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＮＳ抑制解除可能調節領域を、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えばペイロード遺伝子配列、に動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、調節領域ともはや結合せず、および／または調節領域をもはや抑止せず、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットが抑制解除される。このようにして、ＲＮＳは、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現を抑制解除する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ抑止性調節領域」は、１つまたは複数のＲＮＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑止する、核酸配列を指し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合し、調節領域を抑止する。一部の実施形態では、ＲＮＳ抑止性調節領域は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域と結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流にある調節領域と結合することができる。ＲＮＳ抑止性調節領域を、遺伝子配列または遺伝子カセットに動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、対応するＲＮＳ抑止性調節領域と結合し、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列（単数）または遺伝子配列（複数）の発現が遮断される。このようにして、ＲＮＳは、遺伝子または遺伝子配列の発現を抑止する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＳ応答性調節領域」は、ＲＮＳ誘導性調節領域、ＲＮＳ抑止性調節領域、および／またはＲＮＳ抑制解除可能調節領域を指す。一部の実施形態では、ＲＮＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＮＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＮＳならびにそれらの対応するＲＮＳ応答遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域を感知する転写因子の例としては、表９に示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの活性窒素種を感知することができる転写因子によって直接または間接的に制御される、調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接または間接的に駆動することができる、したがって、ＲＮＳレベルに対してペイロード発現を制御することができる、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）に作動可能に連結している。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ペイロードは、本明細書で提供されるペイロードのいずれかなどのペイロードであり、ＲＮＳが、例えば炎症組織に、存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は、調節領域と結合し、および／または調節領域を活性化し、ペイロード遺伝子（単数）またはペイロード遺伝子（複数）の発現を駆動する。その後、炎症が改善されると、ＲＮＳレベルは低下され、ペイロードの産生は、減少または消失される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結した遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現が駆動される。一部の実施形態では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、その後、ＲＮＳ誘導性調節領域と結合し、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。代替実施形態では、転写因子は、ＲＮＳの非存在下でＲＮＳ誘導性調節領域と結合し、転写因子は、ＲＮＳを感知すると立体構造変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｏｒＲである。ＮｏｒＲは、「ＮＯを亜酸化窒素に還元するフラボルブレドキシンおよび関連フラボタンパク質をコードするｎｏｒＶＷ遺伝子の発現を調節するＮＯ応答性転写アクチベーターである」（Spiro ２００６年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＮｏｒＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含むことができる。ＮｏｒＲにより活性化されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Spiro ２００６年；Vineら、２０１１年；Karlinseyら、２０１２年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えば１つまたは複数のペイロード遺伝子配列、に動作可能に連結しているｎｏｒＶＷからのＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｏｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＶＷ調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結した遺伝子の発現が駆動され、ペイロードが産生される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ誘導性調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＤＮＲである。ＤＮＲ（異化型硝酸呼吸調節因子）は、一酸化窒素の存在下で「ｎｉｒ、ｎｏｒおよびｎｏｓ遺伝子の発現を促進する」（Castiglioneら、２００９年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＤＮＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含むことができる。ＤＮＲにより活性化されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Castiglioneら、２００９年；Giardinaら、２００８年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えば酪酸産生遺伝子カセット、に動作可能に連結しているｎｏｒＣＢからのＲＮＳ誘導性調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＤＮＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＣＢ調節領域を活性化し、それにより、動作可能に連結した遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現が駆動され、１つまたは複数のペイロードが産生される。一部の実施形態では、ＤＮＲは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＮＲである。
別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、異化型硝酸呼吸調節因子（ＤＮＲ）の制御下で発現される抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。ＤＮＲは、ＦＮＲファミリーのメンバーであり（Araiら、１９９５年）、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの嫌気硝酸呼吸」のためにＡＮＲとともに必要とされる転写調節因子である（Hasegawaら、１９９８年）。ある特定の遺伝子については、ＦＮＲ結合モチーフは、「ほぼ確実に、ＤＮＲによってしか認識されない」（Hasegawaら、１９９８年）。外因性環境条件によって制御される任意の適切な転写調節因子、および対応する調節領域を、使用することができる。非限定的な例としては、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／Ｃ、およびＡｉｒＳＲが挙げられ、他のものは、当技術分野において公知である。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除可能調節領域であり、対応する転写因子の結合は、下流の遺伝子発現を抑止し、ＲＮＳの存在下で、転写因子は、調節領域ともはや結合せず、それによって、動作可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットが抑制解除される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑制解除可能調節領域であり、ＲＮＳを感知する転写因子は、ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲは、「ＮＯを感知することができ、ＮＯ代謝に関与する遺伝子の発現を制御することができる、Ｒｒｆ２型転写リプレッサーである」（Isabellaら、２００９年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＮｓｒＲにより抑止される遺伝子からの任意の適切なＲＮＳ応答性調節領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮｓｒＲは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＮｓｒＲである。ＮｓｒＲにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Isabellaら、２００９年；Dunnら、２０１０年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えばペイロード遺伝子（単数）またはペイロード遺伝子（複数）、に動作可能に連結したｎｏｒＢからのＲＮＳ抑制解除可能調節領域を含む。ＲＮＳの存在下で、ＮｓｒＲ転写因子は、ＲＮＳを感知し、ｎｏｒＢ調節領域にもはや結合せず、それによって、動作可能に連結したペイロード遺伝子（単数）またはペイロード遺伝子（複数）が抑制解除され、ペイロードをコードするものが産生される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、これらの細菌における有意な数のネイティブ遺伝子の発現を調節しないＲＮＳ感知転写因子を発現するほうが有利である。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＮＳ感知転写因子を発現し、この転写因子は、本発明の遺伝子操作された細菌における調節配列と結合しない。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、ＲＮＳ感知転写因子は、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの、ＮｓｒＲであり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、前記ＮｓｒＲのための結合部位を備えていない。一部の実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作された細菌における内在性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または消去する。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＮＳ抑止性調節領域であり、対応する転写因子の結合は、下流の遺伝子発現を抑止し、ＲＮＳの存在下では、転写因子は、ＲＮＳを感知し、ＲＮＳ抑止性調節領域と結合し、それによって、動作可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑止される。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域と結合することができる。代替実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流にある調節領域と結合することができる。
これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを発現させるために使用される２つのリプレッサー活性化調節回路を含むことができる。２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＮＳ感知リプレッサーと、例えばペイロードをコードする、遺伝子または遺伝子カセットに動作可能に連結している第２のリプレッサーとを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＮＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を阻害する第２のリプレッサーの転写を阻害する。これらの実施形態に有用な第２のリプレッサーの例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが挙げられるが、これらに限定されない。第１のリプレッサーによる結合の非存在（ＲＮＳの結合の非存在下で発生する）下では、第２のリプレッサーは転写され、これによって、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現が抑止される。第１のリプレッサーによる結合の存在（ＲＮＳの存在下で発生する）下では、第２のリプレッサーの発現は抑止され、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えば、ペイロード遺伝子（単数）またはペイロード遺伝子（複数）が発現される。
ＲＮＳ応答性転写因子は、遺伝子操作された細菌に使用される調節領域配列に依存して、遺伝子発現を誘導、抑制解除または抑止しうる。１つまたは複数のタイプのＲＮＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が、遺伝子操作された細菌に存在してもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知転写因子、例えばＮｓｒＲと、例えばｎｏｒＢからの、１つの対応する調節領域配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つのタイプのＲＮＳ感知転写因子、例えばＮｓｒＲと、例えばｎｏｒＢおよびａｎｉＡからの、２つまたはそれより多い異なる対応する調節領域配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いタイプのＲＮＳ感知転写因子、例えばＮｓｒＲおよびＮｏｒＲと、例えばそれぞれｎｏｒＢおよびｎｏｒＲからの、２つまたはそれより多い対応する調節領域配列とを含む。１つのＲＮＳ応答性調節領域が、１つより多くの転写因子に結合することができることもある。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いタイプのＲＮＳ感知転写因子と、１つの対応する調節領域配列とを含む。ＲＮＳにより調節されるいくつかの調節領域の核酸配列は、当技術分野において公知である（例えば、Spiro ２００６年；Isabellaら、２００９年；Dunnら、２０１０年；Vineら、２０１１年；Karlinseyら、２０１２年を参照されたい）。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、そのネイティブプロモーター、誘導性プロモーター、ネイティブプロモーターより強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的プロモーターによって制御される、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、ｎｓｒＲ遺伝子を含む。一部の事例では、発現安定性を増強するために誘導性プロモーターの制御下でＲＮＳ感知転写因子を発現させるほうが有利でありうる。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐転写される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＮＳ感知転写因子の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＮＳ応答性調節領域を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＮＳ感知転写因子および対応するＲＮＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＮＳ感知転写因子および調節領域は、ＲＮＳの存在下で前記調節領域に動作可能に連結した遺伝子の転写を、同じ条件下で同じ亜型の細菌からのネイティブ転写因子および調節領域と比較して、増加させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの、ＲＮＳ感知転写因子、ＮｓｒＲと、対応する調節領域、ｎｓｒＲとを含む。一部の実施形態では、ネイティブＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、無傷の状態で保たれ、野生型活性を保持する。代替実施形態では、ネイティブＲＮＳ感知転写因子、例えば、ＮｓｒＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする内在性遺伝子、例えばｎｓｒＲ遺伝子、の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＲＮＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えばＮｓｒＲ遺伝子と、同じ亜型の細菌からの野生型調節領域と比較して突然変異されている対応する調節領域、例えばｎｏｒＢ調節領域とを含む。突然変異調節領域は、ＲＮＳの存在下で、ペイロードの発現を、同じ条件下で野生型調節領域と比較して増加させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＲＮＳ応答性調節領域、例えばｎｏｒＢ調節領域と、同じ亜型の細菌からの野生型転写因子と比較して突然変異されている対応する転写因子、例えばＮｓｒＲとを含む。突然変異型転写因子は、ＲＮＳの存在下で、ペイロードの発現を、同じ条件下の野生型転写因子と比較して増加させる。一部の実施形態では、ＲＮＳ感知転写因子と対応する調節領域の両方が、ＲＮＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、同じ亜型の細菌からの野生型配列と比較して突然変異される。
一部の実施形態では、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＮＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、発現は、当技術分野において公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させることにより、さらに最適化される。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子のいずれかを、細菌染色体の１つまたは複数の組込み部位に組み込んでもよい。例えば、ペイロード遺伝子をコードする１つまたは複数についての１つまたは複数のコピーを、細菌染色体に組み込むことができる。遺伝子（単数）または遺伝子（複数）（gene or gen(s)）の複数のコピーを染色体に組み込んでしまうことにより、ペイロードのより多くの産生が可能になり、発現のレベルの微調整も可能になる。あるいは、治療用遺伝子または遺伝子カセットに加えて、本明細書に記載の異なる回路、例えば、分泌または排出回路のいずれかを、複数の異なる機能を果たすように細菌染色体の１つまたは複数の異なる組込み部位に組み込むことができよう。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ＲＮＳの存在下で少なくとも１つのペイロードを産生して、同じ条件下で、同じ亜型の未改変細菌と比較して局所消化管炎症を少なくとも約１．５分の１、少なくとも約２分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約１５分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約１００分の１、少なくとも約２００分の１、少なくとも約３００分の１、少なくとも約４００分の１、少なくとも約５００分の１、少なくとも約６００分の１、少なくとも約７００分の１、少なくとも約８００分の１、少なくとも約９００分の１、少なくとも約１，０００分の１、または少なくとも約１，５００分の１に低減する。炎症は、当技術分野において公知の方法、例えば、内視鏡検査を使用して疾患病変を計数すること；末梢血において、例えば蛍光活性化選別により、調節性Ｔ細胞分化を検出すること； 調節性Ｔ細胞レベルを測定すること；サイトカインレベルを測定すること；粘膜損傷の面積を測定すること；炎症バイオマーカーを、例えばｑＰＣＲにより、アッセイすること；ＰＣＲアレイ；転写因子リン酸化アッセイ；イムノアッセイ；および／またはサイトカインアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｑｉａｇｅｎ）によって測定することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＲＮＳの存在下で、同じ条件下で同じ亜型の未改変細菌より少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍多いペイロードを産生する。ある特定の未改変細菌は、検出可能なペイロードレベルを有さないであろう。これらの細菌の遺伝子改変された形態を使用する実施形態では、ペイロードは、ＲＮＳの存在下で検出可能であるだろう。
ＲＯＳ依存性調節
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子を含む。一部の実施形態では、細胞損傷の状態により活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、細胞または組織損傷が存在する環境において活性化される細胞損傷依存性プロモーター、例えば活性酸素種またはＲＯＳプロモーター、の制御下で発現される。
本明細書で使用される場合、「活性酸素種」および「ＲＯＳ」は、分子酸素に由来する高活性分子、イオンおよび／またはラジカルを指すために同義で使用される。ＲＯＳは、好気性呼吸または金属触媒酸化の副産物として産生されうるものであり、酸化的損傷などの有害な細胞効果の原因となりうる。ＲＯＳは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、有機過酸化物（ＲＯＯＨ）、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、スーパーオキシドまたはスーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、オゾン（Ｏ３）、炭酸ラジカル、過酸化物またはペルオキシルラジカル（・Ｏ２−２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）、一酸化窒素（ＮＯ・）、およびペルオキシナイトライトまたはペルオキシナイトライトアニオン（ＯＮＯＯ−）（・は、不対電子を示す）を含むが、これらに限定されない。細菌は、ＲＯＳレベルを感知することができる転写因子を発達させてきた。異なるＲＯＳシグナル伝達経路は、異なるＲＯＳレベルにより誘発され、異なる動態で存在する（Marinhoら、２０１４年）。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ誘導性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合および／または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する、核酸配列を指し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合する、および／または調節領域を活性化する。一部の実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域と結合し、それによって、下流の遺伝子発現が活性化される。代替実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域と結合し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、立体構造変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が活性化される。ＲＯＳ誘導性調節領域を、遺伝子配列または遺伝子配列、例えば、１つもしくは複数のペイロードをコードする配列（単数）または配列（複数）、に動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えばＯｘｙＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列（単数）または遺伝子配列（複数）の発現が駆動される。このようにして、ＲＯＳは、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現を誘導する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ抑制解除可能調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑止する、核酸配列を指し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合せず、調節領域を抑止しない。一部の実施形態では、ＲＯＳ抑制解除可能調節領域は、プロモーター配列を含む。ＲＯＳ抑制解除可能調節領域を、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）、例えば、１つまた複数のペイロードをコードする１つまたは複数の遺伝子に、動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えば、ＯｈｒＲは、ＲＯＳを感知し、調節領域ともはや結合せず、および／または調節領域をもはや抑止せず、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列または遺伝子カセットが抑制解除される。このようにして、ＲＯＳは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制解除する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ抑止性調節領域」は、１つまたは複数のＲＯＳ感知転写因子が結合することができる核酸配列であって、対応する転写因子の結合が下流の遺伝子発現を抑止する、核酸配列を指し、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、調節領域と結合し、調節領域を抑止する。一部の実施形態では、ＲＯＳ抑止性調節領域は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域と結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、プロモーター配列の上流または下流にある調節領域と結合することができる。ＲＯＳ抑止性調節領域を、遺伝子配列（単数）または遺伝子配列（複数）に動作可能に連結させることができる。例えば、ＲＯＳの存在下で、転写因子、例えばＰｅｒＲは、ＲＯＳを感知し、対応するＲＯＳ抑止性調節領域と結合し、それによって、動作可能に連結した遺伝子配列（単数）または遺伝子配列（複数）の発現が遮断される。このようにして、ＲＯＳは、遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現を抑止する。
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳ応答性調節領域」は、ＲＯＳ誘導性調節領域、ＲＯＳ抑止性調節領域、および／またはＲＯＳ抑制解除可能調節領域を指す。一部の実施形態では、ＲＯＳ応答性調節領域は、プロモーター配列を含む。各調節領域は、少なくとも１つの対応するＲＯＳ感知転写因子に結合することができる。ＲＯＳならびにそれらの対応するＲＯＳ応答遺伝子、プロモーターおよび／または調節領域を感知する転写因子の例としては、表１０に示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの活性酸素種を感知することができる転写因子によって直接または間接的に制御される、調整可能な調節領域を含む。調整可能な調節領域は、ペイロードの発現を直接または間接的に駆動することができる、したがってＲＯＳレベルに対してペイロード発現を制御することができる、遺伝子または遺伝子カセットに、動作可能に連結している。例えば、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、分子は、ペイロードであり、ＲＯＳが、例えば炎症組織に、存在する場合、ＲＯＳ感知転写因子は、調節領域と結合し、および／または調節領域を活性化し、ペイロードの遺伝子配列の発現を駆動し、それによってペイロードが産生される。その後、炎症が改善されると、ＲＯＳレベルは低減され、ペイロードの産生は、減少または消失される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳの存在下で、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ誘導性調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現が駆動される。一部の実施形態では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、その後、ＲＯＳ誘導性調節領域と結合し、それによって、下流の遺伝子発現が活性化される。代替実施形態では、転写因子は、ＲＯＳの非存在下でＲＯＳ誘導性調節領域と結合し、転写因子は、ＲＯＳを感知すると、立体構造変化を受け、それによって下流の遺伝子発現が誘導される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｘｙＲである。ＯｘｙＲは、「主として、過酸化物ストレス応答の包括的調節因子として機能し」、数十の遺伝子、例えば、「Ｈ２Ｏ２解毒に関与する遺伝子（ｋａｔＥ、ａｈｐＣＦ）、ヘム生合成に関与する遺伝子（ｈｅｍＨ）、還元剤供給に関与する遺伝子（ｇｒｘＡ、ｇｏｒ、ｔｒｘＣ）、チオール−ジスルフィド異性体化に関与する遺伝子（ｄｓｂＧ）、Ｆｅ−Ｓ中心修復に関与する遺伝子（ｓｕｆＡ〜Ｅ、ｓｕｆＳ）、鉄結合に関与する遺伝子（ｙａａＡ）、鉄移入系の抑止に関与する遺伝子（ｆｕｒ）」および「ＯｘｙＳ、低分子調節性ＲＮＡ」を調節することができる（Dubbsら、２０１２年）。遺伝子操作された細菌は、ＯｘｙＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。ＯｘｙＲにより活性化されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Zhengら、２００１年；Dubbsら、２０１２年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子、例えばペイロード遺伝子、に動作可能に連結しているｏｘｙＳからのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＨ２Ｏ２、の存在下で、ＯｘｙＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｘｙＳ調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結したペイロード遺伝子の発現が駆動され、ペイロードが産生される。一部の実施形態では、ＯｘｙＲは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｘｙＲ遺伝子によりコードされている。一部の実施形態では、ｏｘｙＳ調節領域は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｘｙＳ調節領域である。一部の実施形態では、ＲＯＳ誘導性調節領域は、ｋａｔＧ、ｄｐｓ、およびａｈｐＣの調節領域から選択される。
代替実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ誘導性調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＳｏｘＲである。ＳｏｘＲは、「その［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターの酸化により活性化されると、ＳｏｘＳの合成を増加させ、するとそのＳｏｘＳが、その標的遺伝子発現を活性化する」（Kooら、２００３年）。「ＳｏｘＲは、主としてスーパーオキシドおよび一酸化窒素に応答することが公知であり」（Kooら、２００３年）、Ｈ２Ｏ２に応答することもできる。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＳｏｘＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。ＳｏｘＲにより活性化されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Kooら、２００３年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子、例えばペイロード、に動作可能に連結しているｓｏｘＳからのＲＯＳ誘導性調節領域を含む。ＲＯＳの存在下で、ＳｏｘＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｓｏｘＳ調節領域を活性化し、それによって、動作可能に連結したペイロード遺伝子の発現が駆動され、ペイロードが産生される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除可能調節領域であり、対応する転写因子の結合は、下流の遺伝子発現を抑止し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、調節領域ともはや結合せず、それによって、動作可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットが抑制解除される。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除可能調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｈｒＲである。ＯｈｒＲは、「ｏｈｒＡプロモーター部位と重なる１対の逆方向反復ＤＮＡ配列と結合し、それによって転写事象が抑止される」が、酸化されたＯｈｒＲは、「そのＤＮＡ標的に結合することができない」（Duarteら、２０１０年）。ＯｈｒＲは、「．．．有機過酸化物とＮａＯＣｌの両方を感知する、転写リプレッサー」（Dubbsら、２０１２年）であり、「Ｈ２Ｏ２によって弱活性化されるが、有機ヒドロペルオキシドに対してはるかに高い反応性を示す」（Duarteら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＯｈｒＲにより抑止される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。ＯｈｒＲにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Dubbsら、２０１２年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えばペイロード遺伝子、に動作可能に連結しているｏｈｒＡからのＲＯＳ抑制解除可能調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＮａＯＣｌ、の存在下で、ＯｈｒＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｏｈｒＡ調節領域ともはや結合せず、それによって、動作可能に連結したペイロード遺伝子が抑制解除され、ペイロードが産生される。
ＯｈｒＲは、ＲＯＳ応答性調節因子のＭａｒＲファミリーのメンバーである。「ＭａｒＲファミリーのほとんどのメンバーは、転写リプレッサーであり、多くの場合、プロモーター内の−１０または−３５領域と結合し、これは、ＲＮＡポリメラーゼ結合の立体障害の原因となる」（Bussmannら、２０１０年）。このファミリーの他のメンバーは、当技術分野において公知であり、これらに限定されないがＯｓｐＲ、ＭｇｒＡ、ＲｏｓＲおよびＳａｒＺを含む。一部の実施形態では、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺであり、本発明の遺伝子操作された細菌は、ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺにより抑止される遺伝子からの１つまたは複数の対応する調節領域配列を含む。ＯｓｐＲ、ＭｇＲＡ、ＲｏｓＲおよび／またはＳａｒＺにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Dubbsら、２０１２年を参照されたい）。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑制解除可能調節領域であり、ＲＯＳを感知する対応する転写因子は、ＲｏｓＲである。ＲｏｓＲは、「コンセンサス配列ＴＴＧＴＴＧＡＹＲＹＲＴＣＡＡＣＷＡを有する１８−ｂｐ逆方向反復」と結合する「ＭａｒＲタイプの転写調節因子」であり、「酸化剤Ｈ２Ｏ２により可逆的に阻害される」（Bussmannら、２０１０年）。ＲｏｓＲは、「推定的ポリイソプレノイド結合タンパク質（ｃｇ１３２２、ｒｏｓＲの上流の、ｒｏｓＲとは異なる遺伝子）、感覚性ヒスチジンキナーゼ（ｃｇｔＳ９）、Ｃｒｐ／ＦＮＲファミリ−の推定的転写調節因子（ｃｇ３２９１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼファミリーのタンパク質（ｃｇ１４２６）、２つの推定的ＦＭＮレダクターゼ（ｃｇ１１５０およびｃｇ１８５０）、および４つの推定的モノオキシゲナーゼ（ｃｇ０８２３、ｃｇ１８４８、ｃｇ２３２９およびｃｇ３０８４）」を含むがこれらに限定されない、非常に多くの遺伝子および推定的遺伝子を抑止することができる（Bussmannら、２０１０年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＲｏｓＲにより抑止される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。ＲｏｓＲにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Bussmannら、２０１０年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセット、例えばペイロード、に動作可能に連結しているｃｇｔＳ９からのＲＯＳ抑制解除可能調節領域を含む。ＲＯＳ、例えばＨ２Ｏ２、の存在下で、ＲｏｓＲ転写因子は、ＲＯＳを感知し、ｃｇｔＳ９調節領域ともはや結合せず、それによって、動作可能に連結したペイロード遺伝子が抑制解除され、ペイロードが産生される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、これらの細菌における有意な数のネイティブ遺伝子の発現を調節しないＲＯＳ感知転写因子を発現するほうが有利である。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＯＳ感知転写因子を発現し、この転写因子は、本発明の遺伝子操作された細菌における調節配列と結合しない。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、ＲＯＳ感知転写因子は、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの、ＲｏｓＲであり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、前記ＲｏｓＲのための結合部位を備えていない。一部の実施形態では、異種転写因子は、遺伝子操作された細菌における内在性調節領域および遺伝子に対するオフターゲット効果を最小化または消去する。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑止性調節領域であり、対応する転写因子の結合は、下流の遺伝子発現を抑止し、ＲＯＳの存在下では、転写因子は、ＲＯＳを感知し、ＲＯＳ抑止性調節領域と結合し、それによって、動作可能に連結した遺伝子または遺伝子カセットの発現が抑止される。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の一部と重複する調節領域と結合することができる。代替実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子は、プロモーター配列の上流または下流にある調節領域と結合することができる。
一部の実施形態では、調整可能な調節領域は、ＲＯＳ抑止性調節領域であり、ＲＯＳを感知する転写因子は、ＰｅｒＲである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて、ＰｅｒＲは、「ＤＮＡと結合すると、酸化ストレス応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子（ｋａｔＡ、ａｈｐＣ、およびｍｒｇＡ）、金属恒常性に関与するタンパク質をコードする遺伝子（ｈｅｍＡＸＣＤＢＬ、ｆｕｒ、およびｚｏａＡ）およびそれ自体の合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子（ｐｅｒＲ）を抑止する」（Marinhoら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「主としてＨ２Ｏ２に応答する包括的調節因子であり」（Dubbsら、２０１２年）、「ＰｅｒＲ制御遺伝子のプロモーター配列内および付近に存在する特異的回文コンセンサス配列（ＴＴＡＴＡＡＴＮＡＴＴＡＴＡＡ）（配列番号１１３）であるｐｅｒボックスでＤＮＡと相互作用する」（Marinhoら、２０１４年）。ＰｅｒＲは、「プロモーターの一部と重複する、またはそこから直ぐ下流にある」調節領域に結合することができる（Dubbsら、２０１２年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＰｅｒＲにより抑止される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。ＰｅｒＲにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Dubbsら、２０１２年を参照されたい）。
これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを発現させるために使用される２つのリプレッサー活性化調節回路を含むことができる。これらの２つのリプレッサー活性化調節回路は、第１のＲＯＳ感知リプレッサー、例えばＰｅｒＲと、遺伝子または遺伝子カセット、例えばペイロード、に動作可能に連結している第２のリプレッサー、例えばＴｅｔＲ、とを含む。これらの実施形態の一態様では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、遺伝子または遺伝子カセットの転写を阻害する第２のリプレッサーの転写を阻害する。これらの実施形態に有用な第２のリプレッサーの例としては、ＴｅｔＲ、Ｃ１、およびＬｅｘＡが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知リプレッサーは、ＰｅｒＲである。一部の実施形態では、第２のリプレッサーは、ＴｅｔＲである。この実施形態では、ＰｅｒＲ抑止性調節領域は、ＴｅｔＲの発現を駆動し、ＴｅｔＲ抑止性調節領域は、遺伝子または遺伝子カセット、例えばペイロード、の発現を駆動する。ＰｅｒＲ結合の非存在（ＲＯＳの非存在下で発生する）下では、ｔｅｔＲは転写され、ＴｅｔＲは、遺伝子または、遺伝子カセット、例えばペイロード、の発現を抑止する。ＰｅｒＲ結合の存在（ＲＯＳの存在下で発生する）下では、ｔｅｔＲ発現は抑止され、遺伝子または遺伝子カセット、例えばペイロードが発現される
ＲＯＳ応答性転写因子は、遺伝子操作された細菌において使用される調節領域配列に依存して、遺伝子発現を誘導、抑制解除または抑止しうる。例えば、「ＯｘｙＲは、主として、酸化条件下では転写アクチベーターと考えられる．．．」が、「ＯｘｙＲは、酸化条件および還元条件両方のもとでリプレッサーまたはアクチベーターのどちらかとして機能することができ」（Dubbsら、２０１２年）、ＯｘｙＲは、「それ自体の発現のリプレッサーであることはもちろん、ｆｈｕＦ（第二鉄イオンレダクターゼをコードする）およびｆｌｕ（抗原４３外膜タンパク質をコードする）のリプレッサーであることも示されている」（Zhengら、２００１年）。本発明の遺伝子操作された細菌は、ＯｘｙＲにより抑止される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含むことができる。一部の実施形態では、ＯｘｙＲは、上記の２つのリプレッサー活性化調節回路において使用される。ＯｘｙＲにより抑止されうる遺伝子は、当技術分野において公知である（例えば、Zhengら、２００１年を参照されたい）。または、例えば、ＲｏｓＲは、多数の遺伝子を抑止することができるが、ある特定の遺伝子、例えばｎａｒＫＧＨＪＩオペロン、を活性化することもできる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＲｏｓＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。加えて、「ＰｅｒＲにより媒介される正の調節も観察されており．．．遠位上流部位とのＰｅｒＲ結合を伴うようである」（Dubbsら、２０１２年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰｅｒＲにより活性化される遺伝子からの任意の適切なＲＯＳ応答性調節領域を含む。
１つまたは複数のタイプのＲＯＳ感知転写因子および対応する調節領域配列が、遺伝子操作された細菌に存在してもよい。例えば、「ＯｈｒＲは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に見られ、ＯｘｙＲもしくはＰｅｒＲのどちらか、または両方と共在することができる」（Dubbsら、２０１２年）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知転写因子、例えばＯｘｙＲと、例えばｏｘｙＳからの、１つの対応する調節領域配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つのタイプのＲＯＳ感知転写因子、例えばＯｘｙＲと、例えばｏｘｙＳおよびｋａｔＧからの、２つまたはそれより多い異なる対応する調節領域配列とを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いタイプのＲＯＳ感知転写因子、例えばＯｘｙＲおよびＰｅｒＲと、例えばそれぞれｏｘｙＳおよびｋａｔＡからの、２つまたはそれより多い対応する調節領域配列とを含む。１つのＲＯＳ応答性調節領域は、１つより多くの転写因子に結合することができることもある。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つまたはそれより多いタイプのＲＯＳ感知転写因子と、１つの対応する調節領域配列とを含む。
ＯｘｙＲにより調節されるいくつかの例示的調節領域の核酸配列は、表１０に示されている。ＯｘｙＲ結合部位は、下線付きかつ太字である。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２もしくは配列番号５８３のＤＮＡ配列またはその機能性断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、調節領域配列は、配列番号５８０、配列番号５８１、配列番号５８２および／または配列番号５８３の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、そのネイティブプロモーター、誘導性プロモーター、ネイティブプロモーターより強力なプロモーター、例えばＧｌｎＲＳプロモーターもしくはＰ（Ｂｌａ）プロモーター、または構成的（cconstitutive）プロモーターによって制御される、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、例えば、ｏｘｙＲ遺伝子を含む。一部の事例では、発現安定性を増強するために誘導性プロモーターの制御下でＲＯＳ感知転写因子を発現させるほうが有利でありうる。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子の発現は、治療用分子の発現を制御する同じプロモーターにより制御される。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子および治療用分子は、プロモーター領域から分岐転写される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＯＳ感知転写因子の遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＯＳ応答性調節領域を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株または亜株からのＲＯＳ感知転写因子および対応するＲＯＳ応答性調節領域を含む。異種ＲＯＳ感知転写因子および調節領域は、ＲＯＳの存在下で前記調節領域に動作可能に連結した遺伝子の転写を、同じ条件下で同じ亜型の細菌からのネイティブ転写因子および調節領域と比較して、増加させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの、ＲＯＳ感知転写因子、ＯｘｙＲと、対応する調節領域、ｏｘｙＳとを含む。一部の実施形態では、ネイティブＲＯＳ感知転写因子、例えば、ＯｘｙＲは、無傷の状態で保たれ、野生型活性を保持する。代替実施形態では、ネイティブＲＯＳ感知転写調節因子、例えば、ＯｘｙＲは、野生型活性を低減または消失させるために欠失または突然変異される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする内在性遺伝子、例えばｏｘｙＲ遺伝子、の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なるプラスミド上に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じものの上に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子は、染色体上に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、異なる染色体上に存在する。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子をコードする遺伝子、および治療用分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、同じ染色体上に存在する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＲＯＳ感知転写因子をコードする野生型遺伝子、例えばｓｏｘＲ遺伝子と、同じ亜型の細菌からの野生型調節領域と比較して突然変異されている対応する調節領域、例えばｓｏｘＳ調節領域とを含む。突然変異調節領域は、ＲＯＳの存在下で、ペイロードの発現を、同じ条件下の野生型調節領域と比較して増加させる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＲＯＳ応答性調節領域、例えばｏｘｙＳ調節領域と、同じ亜型の細菌からの野生型転写因子と比較して突然変異されている対応する転写因子、例えばＯｘｙＲとを含む。突然変異型転写因子は、ＲＯＳの存在下で、ペイロードの発現を、同じ条件下の野生型転写因子と比較して増加させる。一部の実施形態では、ＲＯＳ感知転写因子と対応する調節領域の両方が、ＲＯＳの存在下でのペイロードの発現を増加させるために、同じ亜型の細菌からの野生型配列と比較して突然変異される。
一部の実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体内に存在し、ＲＯＳにより誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、発現は、当技術分野において公知の方法により、例えば、リボソーム結合部位を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および／またはｍＲＮＡ安定性を増大させることにより、さらに最適化される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生することができる遺伝子の複数のコピーを含むことができる。一部の実施形態では、ペイロードを産生することができる遺伝子は、プラスミド上に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に動作可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードを産生することができる遺伝子は、染色体内に存在し、ＲＯＳ応答性調節領域に動作可能に連結している。
したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、酸素レベル依存性プロモーター、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性プロモーターまたは活性窒素種（ＲＮＳ）依存性プロモーターおよび対応する転写因子の制御下で、１つまたは複数のペイロードを産生する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ペイロードを産生するための遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、ペイロードを宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、生存および／または成長することができる。一部の実施形態では、細菌は、ペイロードをコードする遺伝子の複数のコピーを含むことができる。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、低コピー数プラスミド上に発現される。一部の実施形態では、低コピー数プラスミドは、発現の安定性を増大させるのに有用でありうる。一部の実施形態では、低コピー数プラスミドは、非誘導条件下での漏出発現を減少させるのに有用でありうる。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、高コピー数プラスミド上に発現される。一部の実施形態では、高コピー数プラスミドは、ペイロードの発現を増加させるのに有用でありうる。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に発現される。
他のプロモーター
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、環境、例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物消化管において、特定の分子または代謝物に応答性である誘導性プロモーターの制御下で発現される抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。哺乳動物消化管内に、健常および／もしくは疾患状態の際に、または腫瘍微小環境に見られる任意の分子または代謝物を、ペイロード発現を誘導するために使用することができる。
代替実施形態では、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、環境、例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物消化管に存在しない栄養または化学インデューサーに作動可能に連結している。一部の実施形態では、栄養または化学インデューサーは、遺伝子操作された細菌の前に、それと同時に、またはそれと逐次的に投与される。
一部の実施形態では、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、低酸素または嫌気条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
他の誘導性プロモーター
一部の実施形態では、抗がん分子をコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、抗がん分子をコードする遺伝子は、染色体内に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、細菌細胞は、抗がん分子をコードする、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されうる、１つまたは複数の遺伝子配列を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、抗がん分子を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培地中で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば腫瘍内もしくは消化管内で、生存および／または成長することができる。一部の実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されうるプロモーターによって制御される、抗がん分子をコードする１つまたは複数の遺伝子配列の２つまたはそれより多い別個のコピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されうるプロモーターによって制御される、抗がん分子をコードする同じ１つまたは複数の遺伝子配列の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、抗がん分子をコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されうる直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、抗がん分子をコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、染色体上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により直接または間接的に誘導されうるものに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により直接または間接的に誘導されうるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、細菌細胞は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導される抗がん分子をコードする遺伝子を有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、したがって、抗がん分子を宿主細胞において発現させることができ、宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培養条件下で、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで、例えば消化管内もしくは腫瘍微小環境内で、生存および／または成長することができる。一部の実施形態では、細菌細胞は、目的のポリペプチドの産生のための２つまたはそれより多い遺伝子配列を含み、遺伝子配列の１つまたは複数は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導される目的のポリペプチドの産生のための同じ遺伝子配列の複数のコピーを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的のポリペプチドの産生のための異なる遺伝子配列の複数のコピーを含み、遺伝子配列の１つまたは複数は、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導される。
一部の実施形態では、目的のポリペプチドの産生のための遺伝子配列は、プラスミド上に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、目的のポリペプチドの産生のための遺伝子配列は、染色体内に存在し、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、目的のポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターは、１つまたは複数の栄養および／もしくは化学インデューサーならびに／または代謝物により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、目的の１つまたは複数の抗がん分子および／または他のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の抗がん分子および／または他のポリペプチドの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のアラビノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の抗がん分子および／または他のポリペプチドの発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される１つまたは複数のプロモーターによって直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導されるプロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにならびに細菌に目的の抗がん分子および／または他のポリペプチドを前負荷するために細菌培養に添加される分子により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、化学および／もしくは栄養インデューサーならびに／または代謝物により誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
アラビノース代謝の遺伝子は、ＰＡｒａＢＡＤプロモーターにより制御される１つのオペロン、ＡｒａＢＡＤに組織化される。ＰＡｒａＢＡＤ（またはＰａｒａ）プロモーターは、誘導性発現系の基準を適切に満たす。ＰＡｒａＢＡＤは、ペイロード遺伝子発現に対して多くの他の系より厳密な制御を示し、これは、インデューサーとしてもリプレッサーとしても機能するＡｒａＣの二重の調節的役割に起因する可能性が高い。加えて、ＰａｒａＢＡＤに基づく発現のレベルを、広範なＬ−アラビノース濃度にわたってモジュレートして、ペイロードの発現レベルを微調整することができる。しかし、亜飽和Ｌ−アラビノース濃度に曝露された細胞集団は、誘導細胞および非誘導細胞の２つの亜集団に分けられ、これは、Ｌ−アラビノース輸送体の利用能に関する個々の細胞間の差によって決まる（Zhangら、Development and Application of an Arabinose-Inducible Expression System by Facilitating Inducer Uptake in Corynebacterium glutamicum；Appl. Environ. Microbiol.２０１２年８月、７８巻１６号５８３１〜５８３８頁）。あるいは、ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現を、本明細書に記載のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御または微調整することができる。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の抗がん分子タンパク質、例えば１つまたは複数の治療用ポリペプチド、の発現は、１つまたは複数のアラビノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数の抗がん分子の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のアラビノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えばアラビノース、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数のアラビノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにおよび細菌にペイロードを前負荷するために細菌培養に添加される分子、例えばアラビノース、により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、アラビノースにより誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、アラビノースにより誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質を含む構築物の発現を、第２のプロモーター、例えば、第２の構成的または誘導性プロモーターと共同で駆動する。一部の実施形態では、２つのプロモーターは、構築物の近位に位置し、その発現を駆動し、この場合、アラビノース誘導性プロモーターが、第１の外因性条件セットのもとで発現を駆動し、第２のプロモーターが、第２の外因性条件セットのもとで発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの逐次的培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における培養の調製中、例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）でありうる。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えばアラビノースの存在を含む、培養条件でありえ、第２の誘導条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でありうる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気または嫌気条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝物の存在、および／または菌株と組み合わせて投与される代謝物が含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数のアラビノースプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターとの組合せで、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。
一部の実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物からの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質は、アラビノースオペロンにノックインされており、ネイティブアラビノース誘導性プロモーターにより駆動される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、アラビノース誘導性構築物は、目的の１つまたは複数のタンパク質として同じプロモーターから分岐転写されるＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８５を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８５からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８６を含む遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８６からなる遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８７によりコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８７を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号５８７からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ラムノース誘導性系によって誘導されうる１つまたは複数の遺伝子配列を含む。遺伝子ｒｈａＢＡＤは、ｒｈａＰ ＢＡＤプロモーターにより制御される１つのオペロンに組織化される。ｒｈａＰ ＢＡＤプロモーターは、ＲｈａＳおよびＲｈａＲという２つのアクチベーターにより調節され、対応する遺伝子は、ｒｈａＢＡＤの反対方向に分岐転写した１つの転写ユニットに属する。Ｌ−ラムノースの存在下で、ＲｈａＲは、ｒｈａＰ ＲＳプロモーターと結合し、ＲｈａＲおよびＲｈａＳの産生を活性化する。次いで、Ｌ−ラムノースとともに、ＲｈａＳは、ｒｈａＰ ＢＡＤおよびｒｈａＰ Ｔプロモーターと結合し、構造遺伝子の転写を活性化する。ＡｒａＣが供給され、遺伝子配列内に分岐転写される、アラビノース系とは対照的に、ラムノース発現系では、染色体から発現される量が、多コピープラスミド上でも転写を活性化するのに十分であるため、より大量の調節タンパク質を発現する必要はない。したがって、ｒｈａＰ ＢＡＤプロモーターのみが、発現させる遺伝子の上流にクローニングされる。ｒｈａＢＡＤ転写の完全誘導には、カタボライト抑止の肝要な調節因子であるＣＲＰ−ｃＡＭＰ複合体の結合も必要である。あるいは、ｒｈａＢＡＤからの誘導性発現を、本明細書に記載のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御または微調整することができる。
一実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、１つまたは複数のラムノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一実施形態では、ペイロードの発現は、ラムノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のラムノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えばラムノース、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数のラムノース誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにおよび細菌にペイロードを前負荷するために細菌培養に添加される分子、例えばラムノース、により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、ラムノースにより誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、ラムノースにより誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質を含む構築物の発現を、第２のプロモーター、例えば、第２の構成的または誘導性プロモーターと共同で駆動する。一部の実施形態では、２つのプロモーターは、構築物の近位に位置し、その発現を駆動し、この場合、ラムノース誘導性プロモーターが、第１の外因性条件セットのもとで発現を駆動し、第２のプロモーターが、第２の外因性条件セットのもとで発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの逐次的培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における培養の調製中、例えば、ラムノースおよびアラビノース）でありうる。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えばラムノースの存在を含む、培養条件でありえ、第２の誘導条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でありうる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気または嫌気条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝物の存在、および／または菌株と組み合わせて投与される代謝物が含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数のラムノースプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターとの組合せで、目的の１つまたは複数のタンパク質および／または転写調節因子、例えばＦＮＲＳ２４Ｙ、の発現を駆動する。
一部の実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物からの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号５８８の配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号５８８からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性系またはＬａｃプロモーターからの転写を誘導した他の化合物によって誘導されうる１つまたは複数の遺伝子配列を含む。ＩＰＴＧは、ｌａｃオペロンの転写を活性化するラクトース代謝物である、アロラクトースの分子模倣物である。アロラクトースとは対照的に、ＩＰＴＧ中の硫黄原子は、非加水分解性化学結合を生成し、この化学結合がＩＰＴＧの分解を妨げて、濃度を一定に保たせる。ＩＰＴＧは、ｌａｃリプレッサーと結合し、ｌａｃオペレーターからアロステリックな方法で四量体リプレッサー（ｌａｃＩ）を放出し、それによって、ｌａｃオペロン内の遺伝子の転写が可能になる。ＩＰＴＧは、Ｅ ｃｏｌｉによって代謝されないので、その濃度は、一定のままであり、Ｌａｃプロモーターにより制御される発現の速度は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも厳密に制御される。ＩＰＴＧ取込みは、他の輸送経路も関わるので、ラクトース透過酵素の作用に依存しない。ＰＬａｃからの誘導性発現は、本明細書に記載のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御または微調整することができる。ＬａｃＩを不活性化する他の化合物を、ＩＰＴＧの代わりに同様の方法で使用することができる。
一実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、１つまたは複数のＩＰＴＧ誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のＩＰＴＧ誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えばＩＰＴＧ、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数のＩＰＴＧ誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにおよび細菌にペイロードを前負荷するために細菌培養に添加される分子、例えばＩＰＴＧ、により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、ＩＰＴＧにより誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、ＩＰＴＧにより誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質を含む構築物の発現を、第２のプロモーター、例えば第２の構成的または誘導性プロモーター、と共同で駆動する。一部の実施形態では、２つのプロモーターは、構築物の近位に位置し、その発現を駆動し、この場合、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが、第１の外因性条件セットのもとで発現を駆動し、第２のプロモーターが、第２の外因性条件セットのもとで発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの逐次的培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における培養の調製中、例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）でありうる。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えばＩＰＴＧの存在を含む、培養条件でありえ、第２の誘導条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でありうる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気または嫌気条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝物の存在、および／または菌株と組み合わせて投与される代謝物が含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数のＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターとの組合せで、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。
一部の実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物からの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５８９の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５８９を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５８９からなる。
一部の実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性構築物は、目的の１つまたは複数のタンパク質として同じプロモーターから分岐転写されるｌａｃＩをコードする遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９０の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９０を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９０からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９１の配列のいずれかによりコードされているポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９１を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌により発現されるポリペプチドは、配列番号５９１からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、テトラサイクリン誘導性系によって誘導されうる１つまたは複数の遺伝子配列を含む。開発された最初の系ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Gossen MおよびBujard H.、PNAS、１９９２年６月１５日；８９巻（１２号）：５５４７〜５１頁）は、テトラサイクリン・オフとして公知であり、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔ誘導性プロモーターからの発現が低減される。テトラサイクリン制御性トランスアクチベーター（ｔＴＡ）は、ｔｅｔＲを単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６（ビリオンタンパク質１６）のＣ末端ドメインと融合させることにより作出された。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡのｔｅｔＲ部分は、ｔｅｔプロモーター中のｔｅｔＯ配列に結合することになり、その活性化ドメインが発現を促進する。テトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリンは、ｔｅｔＲと結合して、ｔＴＡがｔｅｔＯ配列と結合するのを妨げる。次に、リバースＴｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）が開発され、これは、抑止ではなく誘導のためのテトラサイクリンの存在への依存を生じさせた。ｒＴｅｔＲをＶＰ１６と融合させることにより、新たなトランスアクチベーターｒｔＴＡ（リバーステトラサイクリン制御性トランスアクチベーター）が作出された。テトラサイクリン・オン系は、ｒｔＴＡ依存性系としても公知である。
一実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、１つまたは複数のテトラサイクリン誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質、および／または転写調節因子、例えばＦＮＲＳ２４Ｙ、の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数のテトラサイクリン誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えばテトラサイクリン、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数のテトラサイクリン誘導性プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、プロモーターは、投与の前に、発現を誘導するためにおよび細菌にペイロードを前負荷するために細菌培養に添加される分子、例えばテトラサイクリン、により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、テトラサイクリンにより誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、テトラサイクリンにより誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質を含む構築物の発現を、第２のプロモーター、例えば、第２の構成的または誘導性プロモーターと共同で駆動する。一部の実施形態では、２つのプロモーターは、構築物の近位に位置し、その発現を駆動し、この場合、テトラサイクリン誘導性プロモーターが、第１の外因性条件セットのもとで発現を駆動し、第２のプロモーターが、第２の外因性条件セットのもとで発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの逐次的培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における培養の調製中、例えば、テトラサイクリンおよびＩＰＴＧ）でありうる。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えばテトラサイクリンの存在を含む、培養条件でありえ、第２の誘導条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でありうる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気または嫌気条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝物の存在、および／または菌株と組み合わせて投与される代謝物が含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数のテトラサイクリンプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターとの組合せで、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。
一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物から目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９６の太字の配列（ｔｅｔプロモーターが太字である）のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９６を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９６からなる。
一部の実施形態では、テトラサイクリン誘導性構築物は、目的の１つまたは複数のタンパク質として同じプロモーターから分岐転写されるＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９６のイタリック体の配列（Ｔｅｔリプレッサーがイタリック体である）のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９６のイタリック体の配列（Ｔｅｔリプレッサーがイタリック体である）のいずれかによりコードされているポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９６を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９６からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その発現が温度感受性機構により制御される、１つまたは複数の遺伝子配列を含む。温度調節因子は、外部の化学または専用培地の使用なしでの強力な転写制御のため、有利である（例えば、Nemaniら、Magnetic nanoparticle hyperthermia induced cytosine deaminase expression in microencapsulated E. coli for enzyme-prodrug therapy; J Biotechnol.２０１５年６月１０日；２０３巻：３２〜４０頁、およびその中の参考文献を参照されたい）。突然変異型ｃＩ８５７リプレッサーならびにｐＬおよび／またはｐＲファージλプロモーターを使用する温度調節型タンパク質発現は、組換え菌株を操作するために使用されている。その場合、λプロモーターの下流にクローニングされた目的の遺伝子を、バクテリオファージλの突然変異型熱不安定性ｃＩ８５７リプレッサーによって効率的に調節することができる。３７℃未満の温度で、ｃＩ８５７は、ｐＲプロモーターのｏＬまたはｏＲ領域と結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を遮断する。より高温では、機能性ｃＩ８５７二量体が不安定化され、ｏＬまたはｏＲ ＤＮＡ配列との結合が消失し、ｍＲＮＡ転写が開始される。
ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現は、本明細書に記載のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化によって制御またはさらに微調整することができる。
一実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動される。
一部の実施形態では、温度調節型プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現に有用であり、またはそのような発現中に誘導される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と併用投与される分子、例えば温度、により直接または間接的に誘導される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動される。一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の産生を停止させるほうが有利でありうる。これは、温度調節されたシステム内で、より低温、例えば３０Ｃ、で株を成長させることによって行うことができる。次いで、温度を３７Ｃおよび／または４２Ｃに上昇させることによって発現を誘導することができる。一部の実施形態では、温度調節型プロモーターは、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器において成長させられる、培養中に誘導される。一部の実施形態では、３７Ｃ〜４２Ｃの間の温度により誘導される培養は、好気的に成長させられる。一部の実施形態では、３７Ｃ〜４２Ｃの間の温度により誘導される培養は、嫌気的に成長させられる。
一実施形態では、温度調節型プロモーターは、目的の１つまたは複数のタンパク質を含む構築物の発現を、第２のプロモーター、例えば、第２の構成的または誘導性プロモーターと共同で駆動する。一部の実施形態では、２つのプロモーターが、構築物の近位に位置し、その発現を駆動し、この場合、温度調節型プロモーターが、第１の外因性条件セットのもとで発現を駆動し、第２のプロモーターが、第２の外因性条件セットのもとで発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの逐次的培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における培養の調製中、例えば、温度調節およびアラビノース）でありうる。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、培養条件、例えば、許容温度でありえ、第２の誘導条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でありうる。そのようなｉｎ ｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気または嫌気条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝物の存在、および／または菌株と組み合わせて投与される代謝物が含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の温度調節型プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターとの組合せで、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。
一部の実施形態では、温度調節型プロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。一部の実施形態では、温度調節型プロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物から目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９２の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９２を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９２からなる。
一部の実施形態では、温度調節型構築物は、目的の１つまたは複数のタンパク質として同じプロモーターから分岐転写される突然変異型ｃＩ８５７リプレッサーをコードする遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９３の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９３を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９３からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９５の配列のいずれかによりコードされているポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９５を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９５からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰｓｓＢプロモーターにより駆動される系によって間接的に誘導されうる１つまたは複数の遺伝子配列を含む。Ｐｓｓｂプロモーターは、好気条件下で活性であり、嫌気条件下で停止する。
このプロモーターを使用して、好気条件下で目的の遺伝子を発現させることができる。このプロモーターを使用して、遺伝子産物が嫌気条件下でしか発現されないように遺伝子産物の発現を厳密に制御することもできる。この場合、酸素により誘導されるＰｓｓＢプロモーターは、目的の遺伝子の発現を抑止するリプレッサーの発現を誘導する。結果として、目的の遺伝子は、リプレッサーの非存在下、すなわち嫌気条件下、でしか発現されない。この戦略には、微調整向上およびより厳密な制御のためのさらなる制御レベルという利点がある。
一実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質の発現は、１つまたは複数のＰｓｓＢプロモーターの制御下で発現されるリプレッサーにより間接的に調節される。
一部の実施形態では、ＲｓｓＢプロモーターの誘導は、目的の１つまたは複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を間接的に駆動する。一部の実施形態では、ＲｓｓＢプロモーターの誘導は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長、調製または製造中に目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を間接的に駆動する。一部の実施形態では、ＲｓｓＢプロモーターの誘導条件は、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、例えばフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器における、培養に関して規定される。
一部の実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターは、低コピー数プラスミドまたは高コピー数プラスミドまたは本明細書に記載のバイオセーフティシステムプラスミドからの目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を間接的に駆動する。一部の実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターは、細菌染色体に組み込まれている構築物から目的の１つまたは複数のタンパク質の発現を間接的に駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載されている。
別の非限定的な例では、例えば条件付き栄養要求株を作製するために、この戦略を使用してｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡの発現を制御することができる。ｄａｐＡまたはＴｈｙＡの染色体コピーは、ノックアウトされる。嫌気条件下では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡは−場合によって−発現され、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができる。好気条件下では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡの発現が停止され、株は、ｄａｐまたはチミジンの非存在下で成長することができない。このような戦略を利用して、例えば、嫌気条件下で、例えば、消化管のもとで、または腫瘍微小環境の条件下で、細菌の生存を可能にし、しかし、好気条件下では生存を防止すること（バイオセーフティスイッチ）を可能にすることができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号５９７の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つまたは複数の遺伝子配列を含む。別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９７を含む。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子配列は、配列番号５９７からなる。
構成的プロモーター
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、プラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は、染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、例えば消化管のもとで、および／または腫瘍微小環境の条件下で、活性である。一部の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で、例えば、様々な細胞培養および／または細胞製造条件下で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、例えば、消化管のもとで、および／または腫瘍微小環境の条件下で、ならびに本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で、例えば、様々な細胞培養ならびに／または細胞産生および／もしくは製造条件下で、活性である。
一部の実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結している構成的プロモーターは、様々な外因性環境条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）で、活性である。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件、および／または腫瘍微小環境条件で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、低酸素または嫌気条件、例えば、哺乳動物の消化管の環境、および／または腫瘍微小環境条件で、活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管および／または腫瘍微小環境条件に特異的である分子または代謝物の存在下で活性である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、細菌細胞と併用投与される分子により直接または間接的に誘導される。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、分子もしくは代謝物、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養中に存在する他の条件、細胞産生および／または製造条件の存在下で、活性である。
細菌の構成的プロモーターは、当技術分野において公知である。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的Ｅ．ｃｏｌｉ σ７０プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号５９８〜６９０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号５９８〜６９０から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。別の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号５９８〜６９０から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号５９８〜６９０から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、プロモーターは、構成的Ｅ．ｃｏｌｉ σSプロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号６９１および６９２から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号６９１および６９２のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的Ｅ．ｃｏｌｉ σ３２プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号６９３〜６９５から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号６９３〜６９５のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号６９６〜７０１から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号６９６〜７０１のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７０２〜７０４から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７０２〜７０４のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａからの構成的プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７０５および７０６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７０５および７０６のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、バクテリオファージＴ７からの構成的プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７０７および７２２から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７０７および７２２のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、プロモーターは、バクテリオファージＳＰ６からの構成的プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７２３から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７２３のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、酵母からの構成的プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７２４〜７３７から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７２４〜７３７のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶおよびＵｂｃから選択される構成的プロモーターまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７３８および７３９から選択される配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７３８および７３９のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
一部の実施形態では、プロモーターは、Ｐｌｐｐまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４０からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４０の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰａｐＦＡＢ４６またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４１からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４１の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＪ２３１０１＋ＵＰエレメントまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４２からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４２の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＪ２３１０７＋ＵＰエレメントまたはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４３からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４３の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＳＹＮ２３１１９またはその誘導体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号７４４からの配列を含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号７４４の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
リボソーム結合部位
一部の実施形態では、リボソーム結合部位は、付加、交換または置換される。少数のリボソーム結合部位を試験することにより、発現レベルを微調整して所望のレベルにすることができる。一部の実施形態では、原核生物発現に適しており、所望の発現レベルを達成するために使用することができるＲＢＳが、選択される。ＲＢＳの非限定的な例は、標準生物学的パーツ・レジストリ（Registry of standard biological parts）に収載されている。一部の実施形態では、ＲＢＳは、ＢＢａ＿Ｊ６１１００（配列番号１０１９）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０１（配列番号１０２０）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０２（配列番号１０２１）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０３（配列番号１０２２）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０４（配列番号１０２３）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０５（配列番号１０２４）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０６（配列番号１０２５）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０７（配列番号１０２６）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０８（配列番号１０２７）、ＢＢａ＿Ｊ６１１０９（配列番号１０２８）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１０（配列番号１０２９）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１１（配列番号１０３０）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１２（配列番号１０３１）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１３（配列番号１０３２）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１４（配列番号１０３３）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１５（配列番号１０３４）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１６（配列番号１０３５）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１７（配列番号１０３６）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１８（配列番号１０３７）、ＢＢａ＿Ｊ６１１１９（配列番号１０３８）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２０（配列番号１０３９）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２１（配列番号１０４０）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２２（配列番号１０４１）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２３（配列番号１０４２）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２４（配列番号１０４３）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２５（配列番号１０４４）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２６（配列番号１０４５）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２７（配列番号１０４６）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２８（配列番号１０４７）、ＢＢａ＿Ｊ６１１２９（配列番号１０４８）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３０（配列番号１０４９）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３１（配列番号１０５０）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３２（配列番号８７３）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３３（配列番号８６９）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３４（配列番号８７０）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３５（配列番号８７１）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３６（配列番号８７４）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３７（配列番号８７５）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３８（配列番号８７６）、ＢＢａ＿Ｊ６１１３９（配列番号８７７）、ＢＢａ＿Ｂ００２９（配列番号８８０）、ＢＢａ＿Ｂ００３０（配列番号８８１）、ＢＢａ＿Ｂ００３１（配列番号８８２）、ＢＢａ＿Ｂ００３２（配列番号８８３）、ＢＢａ＿Ｂ００３３（配列番号８８４）、ＢＢａ＿Ｂ００３４（配列番号８８５）、ＢＢａ＿Ｂ００３５（配列番号８８６）、ＢＢａ＿Ｂ００６４（配列番号８８７）またはこれらの誘導体から選択される。
一部の実施形態では、構成的プロモーターは、配列番号１０１８〜１０５０および８６９〜８７１、８７３〜８７７、８８０〜８８７から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。別の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号１０１８〜１０５０および８６９〜８７１、８７３〜８７７、８８０〜８８７から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号１０１８〜１０５０および８６９〜８７１、８７３〜８７７、８８０〜８８７から選択される配列からなる。
株培養中のペイロードの誘導
一部の実施形態では、投与の前に目的のペイロードもしくはタンパク質発現および／またはペイロード活性を前誘導するのが望ましい。そのような目的のペイロードまたはタンパク質は、分泌を目的としたエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するように代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態では、目的のタンパク質は、有害な代謝物を異化する酵素である。そのような状況では、株に目的の活性ペイロードまたはタンパク質が前負荷される。そのような事例では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の細胞成長、拡大増殖、精製、発酵および／または製造中の細菌培養に関して規定される条件下で、目的の１つまたは複数のタンパク質を発現する。そのような培養条件は、例えば、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に使用される、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器で、規定されうる。本明細書で使用される場合、用語「細菌培養」または「細菌細胞培養」または「培養」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞成長、細胞拡大増殖、回収、精製、発酵および／または製造を含む、いくつかの産生プロセス中に維持または成長させられる、細菌細胞または微生物を指す。本明細書で使用される場合、用語「発酵」は、被定義条件下での細菌の成長、拡大増殖および維持を指す。発酵は、嫌気または低酸素または酸素負荷条件を含む多数の細胞培養条件下で、インデューサー、栄養素の存在下で、被定義温度などで、行われうる。
培養条件は、高い細胞密度（高バイオマス）収率を維持しながら細胞の最適な活性および生存率を達成するように選択される。酸素レベル（例えば、低酸素、微好気性、好気性）、培地の温度、ならびに栄養素および／または種々の成長培地、培地に供給される化学および／または栄養インデューサーならびに他の成分を含む、多数の細胞培養条件および運転パラメーターが、最適な活性、高い収率および高い生存率を達成するためにモニターされ、調整される。
一部の実施形態では、目的の１つまたは複数のタンパク質は、株がｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために成長させられている間に、直接または間接的に誘導される。理論に縛られることは望まないが、前誘導は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を高めることができる。これは、細菌が最初に到達する消化管の近位領域、例えば小腸、において特に重要である。この区画での細菌滞留時間が比較的短い場合、細菌は、十分なｉｎ ｖｉｖｏ誘導能力に達することなく小腸を通過することもある。対照的に、株が前誘導されており、かつ株に前負荷されていた場合、株は、既に十分に活性であり、これによって、細菌が腸に到達したとき、より迅速に、より大きい活性が可能になる。それ故、株が最適な活性でない通過時間が「浪費され」ない。細菌は、腸を通って移動し続けるので、ｉｎ ｖｉｖｏでの誘導は、消化管の環境条件下（例えば、低酸素、または消化管代謝物の存在下）で起こる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。一実施形態では、目的の、いくつかの異なるタンパク質の発現は、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、同じプロモーターから多シストロン性メッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一部の実施形態では、株は、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前の株成長中にいかなる前誘導プロトコールもなく、投与される。
嫌気誘導
一部の実施形態では、細胞は、培養中に嫌気または低酸素条件下で誘導される。そのような事例では、細胞は、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで（例えば、１．５〜３時間）成長させられ、次いで、おおよそ３〜５時間にわたって嫌気または低酸素条件に切り替えられる。一部の実施形態では、株は、例えば、ＦＮＲプロモーター活性を誘導し、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下で１つまたは複数のペイロードおよび／または輸送体の発現を駆動するために、嫌気または低酸素条件下で誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、嫌気または低酸素条件下で誘導される。一実施形態では、目的のいくつかの異なるタンパク質の発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、嫌気または低酸素条件下で誘導される。
一実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気または低酸素条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気または低酸素条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、１つまたは複数の異なるプロモーターから嫌気または低酸素条件下で駆動される。
理論に縛られることは望まないが、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロードを含む株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、嫌気または低酸素培養条件下での、ならびにｉｎ ｖｉｖｏで、消化管に見られる低酸素条件および／または腫瘍微小環境の条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にしうる。
一部の実施形態では、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、嫌気または低酸素条件下、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、誘導することができる。詳細には、株は、遺伝子配列の一部がＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が、化学および／または栄養インデューサーにより誘導されるプロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の温度調節型プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、嫌気および／または低酸素条件下で誘導される。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、アラビノースであり、プロモーターは、アラビノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ＩＰＴＧであり、プロモーターは、ＩＰＴＧにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ラムノースであり、プロモーターは、ラムノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、テトラサイクリンであり、プロモーターは、テトラサイクリンにより誘導されうる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、嫌気および／または低酸素条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、嫌気および／または低酸素条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、嫌気および／または低酸素条件下で、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが嫌気または低酸素条件下で化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、第３の誘導性プロモーター、例えば、嫌気／低酸素プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、の制御下の遺伝子配列を含む。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学誘導性プロモーターまたは低酸素プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学的に誘導されるものの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより、を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより、誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列とを、含むことができる。加えて、株は、温度調節制御下にある構築物を含むことができる。一部の実施形態では、菌株は、低酸素条件下で活性の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下のペイロードおよびまたは輸送体配列をさらに含む。
好気誘導
一部の実施形態では、好気条件下で株を調製すること、株に前負荷すること、および株を前誘導することが望ましい。これは、より効率的な成長および生存率を可能にし、場合によっては、毒性代謝物の蓄積を低減させる。そのような事例では、細胞は、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで（例えば、１．５〜３時間）成長させられ、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフトによって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。
一部の実施形態では、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、ならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、好気条件下で、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導することができる。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、好気条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、好気条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、好気条件下で、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、アラビノースであり、プロモーターは、アラビノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ＩＰＴＧであり、プロモーターは、ＩＰＴＧにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ラムノースであり、プロモーターは、ラムノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、テトラサイクリンであり、プロモーターは、テトラサイクリンにより誘導されうる。
一部の実施形態では、温度により調節されるプロモーターは、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動され、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、好気条件下で誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動され、好気条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動され、好気条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数の温度調節型プロモーターにより直接または間接的に駆動され、好気条件下で、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが好気条件下で誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、好気培養条件下で誘導される３つまたはそれより多い異なるプロモーターを含む。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが、化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が好気培養条件下で、第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い化学誘導性プロモーター遺伝子配列は、本明細書に記載の温度調節型構築物と組み合わせられる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、アラビノースであり、プロモーターは、アラビノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ＩＰＴＧであり、プロモーターは、ＩＰＴＧにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、ラムノースであり、プロモーターは、ラムノースにより誘導されうる。一実施形態では、化学および／または栄養インデューサーは、テトラサイクリンであり、プロモーターは、テトラサイクリンにより誘導されうる。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学的に誘導されるものの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより、を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより、誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列とを含むことができる。加えて、株は、温度調節制御下にある構築物を含むことができる。一部の実施形態では、菌株は、好気条件下で活性の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下のペイロードおよびまたは輸送体配列をさらに含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された株は、好気培養条件下で誘導される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに備えていない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された株は、好気培養条件下で誘導されうるアラビノースである遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに備えていない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された株は、好気培養条件下で誘導されうるＩＰＴＧである遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに備えていない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された株は、好気培養条件下で誘導されうるアラビノースである遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、そのような株は、好気培養条件下で誘導されうるＩＰＴＧである配列をさらに含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子ペイロードおよび／または輸送体配列をさらに含む。一部の実施形態では、これらの株は、ｉｎ ｖｉｖｏで消化管内および／または腫瘍微小環境条件での活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに備えていない。
上記の非限定的な例から明らかであるように、遺伝子操作された株は、誘導される非常に多くの組合せでありうる、誘導性遺伝子配列を含む。例えば、アラビノースおよび／もしくはＩＰＴＧに加えて、またはそれらの代わりに、適切なプロモーターとともに、あるいは温度調節とともに、ラムノースまたはテトラサイクリンをインデューサーとして使用することができる。加えて、そのような菌株を、嫌気条件下で、化学および／または栄養インデューサーで誘導することもできる。
微好気誘導
一部の実施形態では、生存率、成長および活性は、微好気条件下で菌株を前誘導することにより最適化される。一部の実施形態では、微好気条件は、特に、１つまたは複数のペイロードおよび／または輸送体の発現が、嫌気性および／または低酸素プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、により駆動される場合、最適な成長、活性および生存率の条件と、誘導のための最適な条件との「バランスを取る」のに最もよく適している。そのような事例では、細胞は、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し、そして指数関数的成長に達し終えるまで成長させられ（例えば、１．５〜３時間）、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフトによって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
理論に縛られることは望まないが、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロードを含む株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、微好気培養条件下で、ならびにｉｎ ｖｉｖｏで、消化管に見られる低酸素条件および／または腫瘍微小環境の条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にしうる。
一部の実施形態では、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、微好気条件下で、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、誘導することができる。詳細には、株は、遺伝子配列の一部がＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が化学および／または栄養インデューサーにより誘導されるプロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを、含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の温度調節型プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、微好気条件下で、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが微好気条件下で化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、第３の誘導性プロモーター、例えば、嫌気／低酸素プロモーターまたは微好気プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、の制御下の遺伝子配列を含む。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学誘導性プロモーターまたは低酸素もしくは微好気プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学的に誘導されるものの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。加えて、株は、温度調節制御下にある構築物を含むことができる。一部の実施形態では、菌株は、低酸素条件下で活性の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下のペイロードをさらに含む。
フェージング、パルシングおよび／またはサイクリングを使用する株の誘導
一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前に、株を効率的に誘導し、成長させるために、細胞成長、拡大増殖、回収、精製、発酵および／または製造中にサイクリング、フェージングまたはパルシング技術が利用される。この方法は、特に、成長、細胞健康状態または生存率が誘導条件下で悪影響を受ける場合、最適な成長、活性、細胞健康状態、および生存率の条件と、誘導のための最適な条件との「バランスを取る」ために使用される。そのような事例では、細胞は、第１のフェーズまたはサイクルで、ある特定の密度、例えば１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度、を示す、ある特定のＯＤ、例えば０．１〜１０の範囲内のＯＤに達し終えるまで成長させられ（例えば、１．５〜３時間）、次いで、インデューサーの添加によって、または他の手段、例えば、許容温度へのシフト（プロモーターが温度調節型である場合）、または酸素レベルの変化（例えば、ＦＮＲプロモーターにより駆動される構築物の誘導の場合、酸素レベルの低減）によって、おおよそ３〜５時間にわたって誘導される。第２のフェーズまたはサイクルでは、条件は、最適な成長、細胞健康状態および生存率を支持する当初の条件に戻される。あるいは、化学および／または栄養インデューサーが使用される場合には、第２のフェーズまたはサイクルで、インデューサーの第２の用量を培養にスパイクすることができる。
一部の実施形態では、２サイクルの最適条件および誘導条件が利用される（すなわち、成長、誘導、回収および成長、誘導）。一部の実施形態では、３サイクルの最適条件および誘導条件が利用される。一部の実施形態では、４サイクルまたはそれより多いサイクルの最適条件および誘導条件が利用される。非限定的な例では、そのようなサイクリングおよび／またはフェージングは、嫌気および／または低酸素条件下での誘導（例えば、ＦＮＲプロモーターの誘導）に使用される。一実施形態では、細胞は、最適な密度に成長させられ、次いで、嫌気および／または低酸素条件下で誘導される。成長および／または生存率が、ストレスの多い誘導条件のために悪影響を受ける前に、細胞は、酸素負荷条件に戻されて回復させられ、その後、２回目の誘導嫌気および／または低酸素条件に戻される。一部の実施形態では、これらのサイクルが必要に応じて繰り返される。
一部の実施形態では、成長中の培養に、１回、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。一部の実施形態では、成長中の培養に、２回、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。一部の実施形態では、成長中の培養に、３回またはそれより多い回数、化学および／または栄養インデューサーがスパイクされる。非限定的な例では、細胞は、先ず、最適成長条件下で、ある特定の密度まで、例えば、細胞が１×１０８〜１×１０１１の範囲の密度になるまで、０．１〜１０に達するように１．５〜３時間、成長させられる。次いで、化学インデューサー、例えば、アラビノースまたはＩＰＴＧが、培養に添加される。３〜５時間後、追加のインデューサー用量が、誘導の再開始のために添加される。スパイキングを必要に応じて繰り返すことができる。
一部の実施形態では、フェージングまたはサイクリングは、培養中の温度で変わる。別の実施形態では、温度の調整を使用して、ペイロードの活性を向上させることができる。例えば、培養中の温度を低下させることで、ペイロードの適正なフォールディングを向上させることができる。そのような事例では、細胞は、先ず、成長に最適な温度（例えば、３７Ｃ）で成長させられる。一部の実施形態では、次いで、細胞は、ペイロードを発現させるために、例えば化学インデューサーにより、誘導される。同時に、または一定の誘導時間の後、培地中の温度は、発現されるペイロードのフォールディング向上を可能にするために、例えば２５〜３５Ｃの間に、低下される。
一部の実施形態では、ペイロードは、異なる誘導性プロモーター、例えば２つの異なる化学インデューサー、の制御下にある。他の実施形態では、ペイロードは、低酸素条件または微好気条件下で誘導され、第２のペイロードは、化学インデューサーにより誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術により誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動される。
一部の実施形態では、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または他の化学および／もしくは栄養インデューサーにより誘導されうるプロモーターを、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって、化学および／または栄養インデューサーの存在下で、誘導することができる。詳細には、株は、遺伝子配列の一部がＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が、化学および／または栄養インデューサーにより誘導されるプロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。一部の実施形態では、株は、１つまたは複数のＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列および／または輸送体遺伝子配列および／または転写調節因子遺伝子配列とを含むことができ、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって誘導される。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、本明細書に記載の１つまたは複数の温度調節型プロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができ、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって誘導される。
本明細書に記載の株のいずれも、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって成長させることができる。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、嫌気および／または低酸素条件下で、細胞成長、細胞拡大増殖、発酵、回収、精製、製剤化および／または製造中に誘導される。
一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、同じプロモーターから多シストロン性メッセージの形態で駆動され、プロモーターは、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって誘導される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、同じプロモーターから２つまたはそれより多い別々のメッセージとして駆動され、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって増加される。一実施形態では、１つまたは複数のペイロードの発現は、化学および／または栄養インデューサーにより調節される１つまたは複数のプロモーターの制御下にあり、１つまたは複数の異なるプロモーターから駆動され、これらのプロモーターのすべてが、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって誘導される。
一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターがフェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって、化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーターの制御下にあり、両方のプロモーターが、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって化学および／または栄養インデューサーにより誘導される、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、第３の誘導性プロモーター、例えば、嫌気／低酸素プロモーター、例えばＦＮＲプロモーター、の制御下の遺伝子配列を含む。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学誘導性プロモーターまたは低酸素プロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、ＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一実施形態では、株は、遺伝子配列の一部が第１の誘導性プロモーター、例えば、化学的に誘導されるものの制御下にあり、他の遺伝子配列が第２の誘導性プロモーター、例えば、温度感受性プロモーターの制御下にある、遺伝子配列の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、株は、ＦＮＲプロモーターの制御下の１つまたは複数のペイロード遺伝子配列と、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリンならびに／または本明細書に記載のもしくは当技術分野において公知の他の化学および／もしくは栄養インデューサーを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化学および／または栄養インデューサーにより誘導される１つまたは複数のプロモーターの制御下の、１つまたは複数のペイロード遺伝子配列とを含むことができる。加えて、株は、温度調節制御下にある構築物を含むことができる。一部の実施形態では、菌株は、低酸素条件下で活性の１つまたは複数の構成的プロモーターの制御下のペイロード配列をさらに含む。これらの実施形態に記載の株のいずれも、フェージングまたはサイクリングまたはパルシングまたはスパイキング技術の利用によって誘導することができる。
生体分子を輸送する能力が増強された菌株の生成
それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さいゲノムのため、微小生物を簡易タイムスケールで固有の表現型に進化させることができる。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型を有する株を進化させるために選択圧下で微小生物を継代させる方法である。最も一般的には、これは、炭素／エネルギー源の利用または株の環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）への適応を増すために適用され、それにより、炭素基質を用いてまたはストレス下で成長する能力がより高い突然変異型株は、集団内の適応性の低い株を打ち負かすことになり、最終的には集団を支配するようになる。
この同じ方法を、栄養要求株を作出することにより任意の必須代謝物に拡大することができる。栄養要求株は、必須代謝物を合成することができない株であり、したがって、培地に代謝物が供給されなければ成長することができない。栄養要求株を作製し、代謝物の量を減少させながらそれを継代させことによるこのシナリオで得られる主要な株は、この必須代謝物の獲得および組込み能力がより高いはずである。
例えば、アミノ酸を産生するための生合成経路が破壊された場合、ＡＬＥによって前記アミノ酸の高親和性捕捉が可能な株を進化させることができる。先ず、株を、様々な栄養要求性アミノ酸濃度で、成長を支持するための最小濃度が確立されるまで、成長させる。次いで、株をその濃度で継代させ、一定の間隔で漸減アミノ酸濃度に希釈する。時間が経つにつれて、アミノ酸について−成長制限濃度で−最もよく競合する細胞が集団を支配するようになる。これらの株は、必須の制限アミノを移入する能力の増大をもたらす、それらのアミノ酸輸送体の突然変異を有する可能性が高いであろう。
同様に、上流の代謝物を使用してアミノ酸を形成することができない栄養要求株を使用することにより、株を、上流の代謝物をより効率的に移入することができるばかりでなく、その代謝物を必須の下流代謝物に変換することもできる株に進化させることができる。これらの株はまた、上流の代謝物の移入を増加させるための突然変異を発生させることになるが、下流の酵素の発現または反応速度を増加させる突然変異、または競合的基質利用経路を低減させる突然変異も含有する可能性がある。
以前の例では、微小生物に固有の代謝物は、突然変異による栄養要求性によって必須のものとされ、内因性代謝物の成長制限性補給での選択がかけられた。しかし、非ネイティブ化合物を消費することができる表現型を、それらの消費を必須化合物の産生に結び付けることにより、進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生することができる、異なる生物からの遺伝子が単離されれば、この遺伝子を異種宿主に組換え導入し、その異種宿主において発現させることができる。この新たな宿主株には、以前は代謝できなかった基質から必須栄養素を合成する能力が今ではあることになる。これにより、直ぐ下流の代謝物を変換することができない栄養要求株を作出し、成長制限量の非ネイティブ化合物の中で組換え酵素の同時発現に関して選択することにより、同様のＡＬＥ方法を適用することができる。この結果、非ネイティブ基質の輸送、異種酵素の発現および活性、ならびに下流のネイティブ酵素の発現および活性の突然変異が生じることになる。強調すべきは、この方法における肝要な要件が、非ネイティブ代謝物の消費を成長に必須の代謝物の産生につなげることができるということである。
選択機構の基礎が確立され、最小補給レベルが確立された時点で、実際のＡＬＥ実験が進行し得る。このプロセスを通して、いくつかのパラメーターを注意深くモニターしなければならない。重要なのは、培養を指数成長期で維持し、飽和／定常期に到達させないことである。これは、各継代中に成長速度をチェックしなければならいこと、そしてそれに合うようにその後の希釈度を調整しなければならないことを意味する。希釈度が大きくなる程に成長速度が向上した場合には、成長速度が緩徐化され、選択圧が増大され、希釈度が継代中の亜集団を重度に偏らせるほど過酷なものにならないように、栄養要求株補給濃度を低下させるべきである。加えて、一定の間隔で、細胞を希釈し、固形培地で成長させ、個々のクローンを試験してＡＬＥ培養で観察される成長速度表現型を確認すべきである。
中断するタイミングを予測して、ＡＬＥ実験の停止にも警戒する必要がある。定方向進化の成功は、実験を通して「スクリーニングされる」突然変異の数に直接結び付けられ、突然変異は、一般に、ＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂数（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異体数のプロキシとして動作する。以前の研究により、異なる炭素源で成長に有益な表現型を約１０１１．２ＣＣＤ１で単離することができることが示されている。この速度は、ＤＮＡ複製エラー増加を引き起こす化学的突然変異誘発要因−例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）−の培養への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果として成長速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、何らかの最大適応度に収束し、ＡＬＥ実験は中断され得る。
ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固形培地上で単離し、培養フラスコのものにマッチする成長表現型についてアッセイするべきである。次いで、選択されたものから最も性能のよいものがゲノムＤＮＡ用に調製され、全ゲノム配列決定に送られる。配列決定は、向上した表現型をもたらすことができるゲノムの周囲に存在する突然変異を明らかにすることになるが、サイレント突然変異（恩恵をもたらさないが、所望の表現型を損なわないもの）も含有することになる。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異誘発要因の存在下で進化させた培養におけるほうが、有意にサイレント性の高いバックグラウンド突然変異が存在することになる。その現状で最優良株に満足した場合、使用者は、その株での応用に進むことができる。そうでなければ、進化させた株から、ゲノム操作技術による親株への突然変異の再導入により、寄与突然変異をデコンボリュートすることができる。Lee, D.-H.、Feist, A. M.、Barrett, C. L. およびPalsson, B. O. Cumulative Number of Cell Divisions as a Meaningful Timescale for Adaptive Laboratory Evolution of Escherichia coli. PLoS ONE ６巻、ｅ２６１７２頁（２０１１年）を参照されたい。
これらの方法は、本明細書の他の箇所に記載の、キヌレニンを消費し、トリプトファンを過剰産生する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ突然変異体を生成するために使用された。
核酸
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを消費するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン消費酵素をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、Ａｄｄをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＸａｐＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤｅｏＤをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＸｄｈＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＸｄｈＢをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＸｄｈＣをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＮｕｐＣをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＮｕｐＧをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、核酸は、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ｎｕｐＣおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ｎｕｐＧおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、ｎｕｐＣおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む核酸配列は、抗ＣＤ４０抗体をコードする核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｎｕｐＣを含む。したがって、一実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１を含む。さらに別の実施形態では、ｎｕｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７１からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｘｄｈＡを含む。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２を含む。さらに別の実施形態では、ｘｄｈＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７２からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｘｄｈＢを含む。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３を含む。さらに別の実施形態では、ｘｄｈＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７３からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｘｄｈＣを含む。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４を含む。さらに別の実施形態では、ｘｄｈＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７４からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、Ａｄｄを含む。したがって、一実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５を含む。さらに別の実施形態では、Ａｄｄ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７５からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｘａｐＡを含む。したがって、一実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６を含む。さらに別の実施形態では、ｘａｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７６からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを分解するまたは腫瘍微小環境から枯渇させるための、新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素をコードする核酸配列は、ｄｅｏＤを含む。したがって、一実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７を含む。さらに別の実施形態では、ｄｅｏＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７７からなる。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＮｕｐＣを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７８からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＸｄｈＡを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号７９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号７９をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＸｄｈＢを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８０をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＸｄｈＣを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８１をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、Ａｄｄを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８２をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＸａｐＡを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８３をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン異化酵素は、ＤｅｏＤを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号８４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号８４をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを異化するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素カセットをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素カセットをコードする核酸配列は、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７の配列を含む。別の実施形態では、ｘｄｈＡＢＣを含む核酸配列は、配列番号８５７の配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アデノシンを異化するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアデノシン異化酵素カセットをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アデノシン分解酵素カセットをコードする核酸配列は、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１の配列を含む。別の実施形態では、ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む核酸配列は、配列番号８６１の配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、アルギニンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアルギニン産生回路をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＢをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＣをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＤをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＥをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＦをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＧをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＨをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＩをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＪをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｃａｒＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｃａｒＢをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、核酸は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢおよびフィードバック耐性ａｒｇＡならびにこれらの任意の組合せから選択されるアルギニン生合成遺伝子をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢおよびフィードバック耐性ａｒｇＡならびにこれらの任意の組合せから選択されるアルギニン生合成遺伝子をコードする遺伝子配列を含む核酸配列は、抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸配列をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、アルギニンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のアルギニン産生ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アルギニン産生酵素をコードする核酸配列は、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）（フィードバック耐性ａｒｇＡ）を含む。したがって、一実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２を含む。さらに別の実施形態では、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号１０２からなる。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、アルギニン産生酵素は、ａｒｇＡ（ｆｂｒ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号１０３をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生する新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＤをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＣをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＢをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＦをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＨをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＢをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＤをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＥをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＫをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＡをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｓｅｒＡ（ｆｂｒ）をコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＹｄｄＧをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢおよびＴｒｐＡならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＨおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＨおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＨ、ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫおよびａｒｏＡならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＴｒｐＥ、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＨ、ＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫおよびａｒｏＡおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＳｅｒＡ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＳｅｒＡ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＳｅｒＡ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＹｄｄＧおよびこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）、ＳｅｒＡ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）、ＴｒｐＤ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＡ、ＹｄｄＧおよびキヌレニナーゼならびにこれらの任意の組合せから選択される遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列を含む核酸は、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む核酸配列をさらに含んだ。
一部の実施形態では、本開示は、ＩＬ−１５を分泌するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、分泌のためのＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、分泌のためのＩＬ−１５をコードする核酸配列は、ＰｈｏＡ−Ｉｌ−１５を含む。したがって、一実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７を含む。さらに別の実施形態では、Ｉｌ−１５遺伝子を含む核酸配列は、配列番号９５７からなる。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、核酸は、ＩＬ−１５（ＯｍｐＦ分泌タグ）をコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３５をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、核酸は、ＩＬ−１５（ＰｈｏＡ分泌タグ）をコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３６をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、核酸は、ＩＬ−１５（ＴｏｒＡ分泌タグ）をコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号９３７をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを枯渇させるための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン枯渇酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン異化酵素をコードする核酸配列は、ｋｙｎＵ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含む。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８を含む。さらに別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６８からなる。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを枯渇させるための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン枯渇酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン異化酵素をコードする核酸配列は、ｋｙｎＵ（Ｈｕｍａｎ）を含む。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９を含む。さらに別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号６９からなる。
一部の実施形態では、本開示は、キヌレニンを枯渇させるための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のキヌレニン枯渇酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン異化酵素をコードする核酸配列は、ｋｙｎＵ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）を含む。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０を含む。さらに別の実施形態では、ｋｙｎＵ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号７０からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン異化酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＥを含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＥ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５０からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＤを含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＤ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５１からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＣを含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５２からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＢを含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＢ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５３からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＡを含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号５４からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）を含む。したがって、一実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２を含む。さらに別の実施形態では、ａｒｏＧ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６２からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｓｅｒＡを含む。したがって、一実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４を含む。さらに別の実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８６４からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファンを産生するための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素をコードする核酸配列は、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）を含む。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９と少なくとも約９０％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９と少なくとも約９５％の同一性を有する。したがって、一実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９を含む。さらに別の実施形態では、ｔｒｐＥ（ｆｂｒ）遺伝子を含む核酸配列は、配列番号８７９からなる。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン分解酵素は、キヌレニナーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６５をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン分解酵素は、キヌレニナーゼ（Ｈｕｍａｎ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６６と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６６と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６６と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６６をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６６をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、キヌレニン分解酵素は、キヌレニナーゼ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ
）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６７と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６７と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６７と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６７をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６７をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＴｒｐＥを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５５と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５５と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５５と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号５５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５５をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５５をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ｔｒｐＤを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５６と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５６と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５６と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号５６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５６をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５６をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＴｒｐＣを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５７と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５７と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５７と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号５７と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５７をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５７をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＴｒｐＢを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５８と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５８と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５８と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号５８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５８をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５８をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＴｒｐＡを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５９と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号５９と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５９と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号５９と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５９をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号５９をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＡｒｏＧ（ｆｂｒ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６０と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６０と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６０と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６０と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６０をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６０をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＴｒｐＥ（ｆｂｒ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６１と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６１と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６１と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６１と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６１をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６１をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＳｅｒＡを含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６２をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６２をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素は、ＳｅｒＡ（ｆｂｒ）を含む。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６３と少なくとも約８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、核酸配列は、配列番号６３と少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６３と少なくとも約９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、核酸配列は、配列番号６３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６３をコードする配列を含むポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号６３をコードする配列からなるポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファン産生のための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数のトリプトファン産生酵素カセットをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素カセットをコードする核酸配列は、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３の配列を含む。別の実施形態では、Ｆｂｒ−ａｒｏＧ−ｓｅｒＡを含む核酸配列は、配列番号８６３の配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファン産生のための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、トリプトファン産生酵素カセットをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素カセットをコードする核酸配列は、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２の配列を含む。別の実施形態では、ＴｒｐＥＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７２の配列からなる。
一部の実施形態では、本開示は、トリプトファン産生のための新規核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、トリプトファン産生酵素カセットをコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載の核酸実施形態の１つでは、トリプトファン産生酵素カセットをコードする核酸配列は、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列を含む。したがって、一実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８と少なくとも約８０％の同一性を有する。一実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８と少なくとも約９０％の同一性を有する。一実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８と少なくとも約９５％の同一性を有する。一実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。別の実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８の配列を含む。別の実施形態では、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡを含む核酸配列は、配列番号８７８の配列からなる。
上記核酸実施形態のいずれにおいても、抗がん分子組合せを産生するための１つまたは複数の核酸配列は、１つまたは複数の直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、外因性環境条件下で、例えば、消化管内に見られる条件、腫瘍微小環境または他の組織特異的条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、消化管内に見られる代謝物、腫瘍微小環境または他の特異的条件によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに、作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、低酸素または嫌気条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、本明細書に記載の炎症性条件（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列は、本明細書に記載の、例えば腫瘍内に見られるような、免疫抑制性条件下で誘導される直接または間接誘導性プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ条件（例えば、株培養、拡大増殖、製造）中に存在することもある、化学または栄養インデューサー、例えば、テトラサイクリンもしくはアラビノースまたは本明細書に記載の他のものへの曝露によって誘導される直接または間接誘導性プロモーターに連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いペイロードは、すべてが構成的プロモーターに連結されている。このような構成的プロモーターは、本明細書中の表４８〜表５８に記載されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝子配列は、同じプロモーター配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い遺伝配列は、２つまたはそれより多い異なるプロモーター配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列は、すべてが構成的（同じもしくは異なる構成的プロモーター）であることもあり、すべてが誘導性（同じもしくは異なるインデューサーによって誘導可能）であることもあり、または構成的プロモーターと誘導性プロモーターの混合物であることもある。
一実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子をコードする１つまたは複数の核酸配列は、細菌細胞のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つまたは複数の抗がん分子をコードする１つまたは複数の核酸配列は、細菌細胞の染色体内に位置する。これらの核酸実施形態のいずれにおいても、１つまたは複数の抗がん分子をコードするそのような１つまたは複数の核酸配列を、本明細書に記載の他の抗がん分子をコードする任意の他の核酸と組み合わせることができる。
分泌
遺伝子操作された微生物が、その微生物から分泌されるように意図されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗がん、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子もしくは他の分子を産生する、本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、操作された微生物は、分泌機構と、分泌系をコードする対応する遺伝子配列とを含むことができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境で細菌細胞質から抗がん分子を分泌することができる、ネイティブ分泌機構または非ネイティブ分泌機構をさらに含む。多くの細菌は、細菌細胞エンベロープを横断して基質を輸送するための洗練された分泌系を発達させてきた。小分子、タンパク質およびＤＮＡなどの基質を、細胞外空間もしくは周辺質（例えば、消化管内腔または他の空間）に放出すること、標的細胞に注入すること、または細菌の膜と会合させることができる。
グラム陰性菌において、分泌機構は、内膜および外膜の一方または両方に及びうる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非ネイティブ２回膜貫通分泌系をさらに含む。２回膜貫通分泌系は、Ｉ型分泌系（Ｔ１ＳＳ）、ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）、ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）、ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、および多剤排出ポンプの耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）ファミリーを含むが、これらに限定されない（参照により本明細書に組み込まれる、Pugsley １９９３年；Gerlachら、２００７年；Collinsonら、２０１５年；Costaら、２０１５年；Reevesら、２０１５年；ＷＯ２０１４１３８３２４Ａ１）。グラム陰性様細胞エンベロープを有するマイコバクテリアは、ＶＩＩ型分泌系（Ｔ７ＳＳ）もコードしうる（Stanleyら、２００３年）。Ｔ２ＳＳを除いて、２回膜貫通分泌は、一般に、基質を細菌の細胞質から直接細胞外空間へまたは標的細胞へ輸送する。対照的に、外膜のみに及ぶＴ２ＳＳおよび分泌系は、基質が、先ず、内膜貫通輸送体により周辺質に移行され、次いで、外膜に移行されるか、または細胞外空間に分泌される、２ステップ機構を使用しうる。外膜貫通分泌系は、Ｖ型分泌またはオートトランスポーター系またはオートセクレター系（Ｔ５ＳＳ）、ｃｕｒｌｉ分泌系、および線毛集合体のためのシャペロン・アッシャー経路を含むが、これらに限定されない（Saier、２００６年；Costaら、２０１５年）。
目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質が、微生物から分泌または排出される、一部の実施形態では、操作された微生物は、分泌タグを含む遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質は、目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質を特定の分泌系に方向付けるための、ＲＮＡまたはペプチドのどちらかに由来する「分泌タグ」を含む。例えば、Ｉ型溶血素分泌系についての分泌タグは、アルファ溶血素タンパク質（ＨｌｙＡ）のＣ末端５３アミノ酸にコードされている。
一部の実施形態では、溶血素に基づく分泌系は、目的の分子、例えば治療用ペプチド、を分泌するために使用される。Ｉ型分泌系は、パッセンジャーペプチドを、直接、細胞質から細胞外空間に移行させ、これにより、他の分泌型の２ステッププロセスが不要になるという、利点をもたらす。この経路は、ＨｌｙＢ、ＡＴＰ結合カセット輸送体；ＨｌｙＤ、膜融合タンパク質；およびＴｏｌＣ、外膜タンパク質を使用する。これら３種のタンパク質の集合体が、内膜と外膜の両方を通るチャネルを形成する。ＨｌｙＢは、内膜に入り込んで孔を形成し、ＨｌｙＤは、ＨｌｙＢをＴｏｌＣ（外膜孔）とともに整列させ、それによって、内膜および外膜を通るチャネルが形成される。本来、このチャネルは、ＨｌｙＡを分泌するために使用されるが、本開示の治療用ペプチドを分泌するために使用され、このペプチドの分泌を媒介するために、ＨｌｙＡの分泌シグナル含有Ｃ末端部分は、治療用ペプチド（星）のＣ末端部分と融合される。自己触媒性のまたはプロテアーゼにより触媒される、例えばＯｍｐＴ切断によって、Ｃ末端分泌タグを除去することができ、それによって、目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質が細胞外環境に放出される。一部の実施形態では、目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３のアルファ−溶血素（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３個のアミノ酸（Ｃ末端分泌タグ）を含有し、それらとの融合タンパク質として発現される。
一部の実施形態では、Ｖ型オートトランスポーター分泌系は、目的の分子、例えば治療用ペプチド、を分泌するために使用される。Ｖ型自己分泌系は、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性ペプチドタグ（内膜）およびＣ末端タグ（外膜）を利用する。この系は、細胞質から周辺質に達するためにＳｅｃ系を使用する。次いで、Ｃ末端タグが外膜に入り込んで孔を形成し、その孔を「パッセンジャータンパク質」が通り抜ける。比較的大きいタンパク質フラックスを処理するための機構および能力の単純性のため、Ｖ型分泌系は、組換えタンパク質の細胞外産生には魅力的である。例えば、治療用ペプチド（星）をＮ末端分泌シグナル、リンカー、およびオートトランスポーターのベータ−ドメインに融合させることができる。Ｎ末端、Ｓｅｃ依存性シグナル配列は、タンパク質をＳｅｃＡ−ＹＥＧ機構に方向付け、この機構が、タンパク質を、内膜を横断して周辺質に移動させ、続いて、その後、シグナル配列が切断される。ベータ−ドメインは、Ｂａｍ複合体（「ベータ−バレル組立て機構」）に動員され、そこでベータ−ドメインは、フォールディングされ、ベータ−バレル構造として外膜に挿入される。治療用ペプチドは、リンカー配列の前方のベータ−バレル構造の中空孔を通り抜ける。外膜を横断すると、パッセンジャーは、膜に埋め込まれたＣ末端タグから、自己触媒性のインテイン様機構（Ｂａｍ複合体の左側）により、または膜結合プロテアーゼ（ブラックシーザー；Ｂａｍ複合体の右側）（すなわち、ＯｍｐＴ）によって、放出される。例えば、リンカー内の相補的プロテアーゼ切断部位に対する膜会合ペプチダーゼ。したがって、一部の実施形態では、分泌される分子、例えば、異種タンパク質またはペプチドは、Ｎ末端分泌シグナルと、リンカーと、細菌からの分子の分泌を可能にするためのオートトランスポーターのベータドメインとを含む。
Ｎ末端タグは、Ｓｅｃ系により除去される。したがって、一部の実施形態では、分泌系は、操作された細菌から、目的の１つもしくは複数のタンパク質または１つもしくは複数の治療用タンパク質を分泌する前に、このタグを除去することができる。Ｖ型自己分泌媒介性分泌の場合、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、ネイティブＳｅｃ系による細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの移行時に除去される。さらに、自己分泌体が外膜を横断して移行したならば、自己触媒性のまたはプロテアーゼにより触媒される、例えばＯｍｐＴ切断によって、Ｃ末端分泌タグを除去することができ、それによって、抗がん分子が細胞外環境に放出される。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｉｖｒｉｏ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、ＣｈｌａｍｙｄｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからのＩＩＩ型またはＩＩＩ型様分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む。旧来のＴ３ＳＳは、タンパク質をニードル複合体によって細菌細胞質から宿主細胞質に輸送することができる。ＩＩＩ型の旧来の分泌系の場合、基底小体は、鞭毛に酷似しているが、「テール」／ホイップの代わりに、旧来のＴ３ＳＳは、パッセンジャータンパク質を宿主細胞に注入するためのシリンジを有する。分泌タグは、Ｎ末端ペプチドにコードされている（長さは様々であり、いくつかの異なるタグがある；ＰＣＴ／ＵＳ１４／０２０９７２を参照されたい）。Ｎ末端タグは、この分泌系ではポリペプチドから除去されない。
細菌の細胞質から分子を分泌するが、その分子を宿主の細胞質に注入しないように、Ｔ３ＳＳを修飾することができる。したがって、分子は、消化管内腔、腫瘍微小環境、または他の細胞外空間に分泌される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、前記修飾されたＴ３ＳＳを含み、細菌細胞質から目的の分子を分泌することができる。一部の実施形態では、分泌される分子、例えば、異種タンパク質もしくはペプチドは、細菌からの目的の分子の分泌を可能にするＩＩＩ型分泌配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、修飾されたＩＩＩ型分泌系を含む。鞭毛修飾ＩＩＩ型分泌の場合、タグは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域にコードされており、したがって、切断／除去するペプチドタグがない。この修飾系は、「シリンジ」部分を含有せず、その代わり、形成する鞭毛を通って両方の膜を横断してそこから出る移行のための孔として、鞭毛構造の基底小体を使用する。ｆｌｉＣ／ｆｌｉＤ遺伝子（鞭毛「テール」／ホイップをコードする）が破壊された場合、鞭毛は、十分に形成することができず、これは、全分泌を促進する。一部の実施形態では、テール部分を完全に除去することができる。
一部の実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌経路は、目的の分子を分泌するために使用される。一部の実施形態では、ペプチドをネイティブ鞭毛成分のＮ末端鞭毛分泌シグナルと組換え融合させることにより、不完全な鞭毛が、目的の治療用ペプチドの分泌に使用される。このようにして、細胞内で発現されたキメラペプチドを、内膜および外膜を横断して周囲宿主環境に移動できるようにすることができる。
例えば、遺伝子ｆｌｉＣ（フラジェリンをコードする）の上流の、例えば１７３ｂｐ領域の、非翻訳ＤＮＡ断片が、異種タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子と融合されている、修飾鞭毛ＩＩＩ型分泌装置を使用して、目的のポリペプチドを分泌することができる（例えば、Majanderら、Extracellular secretion of polypeptides using a modified Escherichia coli flagellar secretion apparatus. Nat Biotechnol. ２００５年４月；２３巻（４号）：４７５〜８１頁を参照されたい）。場合によっては、ｆｌｉＣ座位からの非翻訳領域は、鞭毛によるパッセンジャーペプチドの移行を媒介するのに十分でないこともある。この場合、例えば、ＦｌｉＣの最初の２０個のアミノ酸とともに非翻訳領域の１７３ｂｐを使用することにより、Ｎ末端シグナルをＦｌｉＣのアミノ酸コード配列内に延ばすことが必要でありうる（例えば、Duanら、Secretion of Insulinotropic Proteins by Commensal Bacteria: Rewiring the Gut To Treat Diabetes、Appl. Environ.Microbiol.２００８年１２月、７４巻２３号７４３７〜７４３８頁を参照されたい）。
代替実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非ネイティブ１回膜貫通分泌系をさらに含む。１回膜貫通輸送体は、分泌系の成分として作用することもあり、または独立して基質を排出することもある。そのような輸送体は、ＡＴＰ結合カセットトランスロカーゼ、鞭毛／病原性関連トランスロカーゼ、コンジュゲーション関連トランスロカーゼ、一般的分泌系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳｅｃＹＥＧ複合体）、マイコバクテリアおよびいくつかの種類のグラム陽性菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）における付属分泌系、およびツイン−アルギニン移行（ＴＡＴ）系を含むが、これらに限定されない（Saier、２００６年；RigelおよびBraunstein、２００８年；Albiniakら、２０１３年）。一般分泌系およびＴＡＴ系両方が、切断可能なＮ末端シグナルペプチドを有する基質を周辺質に排出することができ、バイオ医薬品生産に関連して探究されてきたことは、公知である。ＴＡＴ系は、特定の利点、しかし、フォールディングされた基質を輸送することができ、したがって未熟なまたは不正確なフォールディングの可能性を排除することができるという利点をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＴＡＴまたはＴＡＴ様系を含み、目的の抗がん分子を細菌細胞質から分泌することができる。本明細書で開示される分泌系を、細菌の種々の種、株および亜型において作用するように修飾することができ、ならびに／または種々のペイロードの送達に適応させることができることは、当業者には理解されるであろう。
タンパク質、例えば治療用ポリペプチド、を細胞外空間に移行させるために、ポリペプチドを、先ず、細胞内で翻訳し、内膜を横断して移動できるようにし、最終的には外膜を横断して移動できるようにしなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）−特に、真核生物由来のもの−は、三次および四次構造を安定させるためにジスルフィド結合を含有する。これらの結合は、周辺質シャペロンのおかげで酸化性周辺質区画において正しく形成することができるが、外膜を横断してポリペプチドを移行させるために、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を再びアンフォールディングしなければならない。
グラム陰性菌において正確にフォールディングされたタンパク質を分泌する１つの方法−特に、ジスルフィド結合を必要とするもの−は、還元性環境周辺質を不安定化性外膜とともに標的化することである。この方法で、タンパク質を、酸化性環境に移動できるようにし、正確にフォールディングさせる。組織化された細胞外分泌系とは対照的に、タンパク質は、その後、正しくフォールディングされた形態で膜漏出によって細胞膜周辺腔から抜け出すことができる。したがって、これらの「漏出性の」グラム陰性突然変異体は、生物活性の、正確にジスルフィド結合したポリペプチドを分泌することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、「漏出性の」または不安定化された外膜を有する。漏出性を誘導するための細菌外膜の不安定化は、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌを含む、硬いペプチドグリカン骨格への外膜の繋留に関与する遺伝子を欠失させることによって、またはそのような遺伝子の突然変異を誘発することによって、遂行することができる。Ｌｐｐは、細胞１個当たり約５００，０００コピーで存在する、細菌細胞内に最も大量に存在するポリペプチドであり、ペプチドグリカンへの細菌細胞壁の主要「ステープル」として機能する。1. Silhavy, T. J.、Kahne, D.およびWalker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol ２巻、ａ０００４１４頁（２０１０年）。ＴｏｌＡ−ＰＡＬおよびＯｍｐＡ複合体は、Ｌｐｐと同様に機能し、漏出性表現型を生じさせるための他の欠失標的である。加えて、漏出性表現型は、周辺質プロテアーゼが不活性化されたときに観察されている。周辺質にはタンパク質が非常に密集しており、それ故、周辺質は、タンパク質代謝回転を助長するためのいくつかの周辺質タンパク質をコードする。ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰまたはｎｌｐＩなどの周辺質プロテアーゼの除去は、周辺質タンパク質の過剰な蓄積を促進することにより漏出性表現型を誘導することができる。プロテアーゼの突然変異もまた、これらのプロテアーゼによる標的化分解を防止することにより、エフェクターポリペプチドを失わないようにすることができる。
さらに、これらの突然変異の組合せは、細胞生存率を大きく犠牲にすることなく、細胞の漏出性表現型を相乗的に増強することができる。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または突然変異した膜遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、欠失または突然変異したｌｐｐ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＡ、およびｏｍｐＦ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢおよびｐａｌ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。一部の実施形態では、操作された細菌は、ｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌ遺伝子から選択される、１つまたは複数の欠失または突然変異した遺伝子を有する。
細胞生存率に対する障害を最小にするために、例えばｌｐｐ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰおよびｎｌｐｌから選択される、１つまたは複数の膜または周辺質プロテアーゼ遺伝子を、誘導性プロモーターの制御下に置くことにより、漏出性表現型を誘導可能にすることができる。例えば、ｌｐｐまたは他の細胞壁安定性タンパク質または周辺質プロテアーゼの発現を、治療用ポリペプチドを送達する（分泌する）必要がある状態の際に、抑止することができる。例えば、標的膜または周辺質プロテアーゼ遺伝子の転写または翻訳を低減させる、転写リプレッサータンパク質または設計されたアンチセンスＲＮＡを、誘導条件下で発現させることができる。逆に言うと、ある特定のペプチドの過剰発現、例えば、コリシン、またはＴｏｌＡの第３のトポロジカルドメインの過剰発現は、不安定化された表現型をもたらすことができ、治療用ポリペプチドを送達する（分泌する）必要がある状態の際にペプチド過剰発現を誘導することができる。これらの種類の戦略は、バイオマス産生から脆弱な漏出性表現型を分離することになる。したがって、一部の実施形態では、操作された細菌は、誘導性プロモーターの制御下の１つまたは複数の膜および／または周辺質プロテアーゼ遺伝子を有する。
下記の表１２および表１３は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の分泌系を収載するものである。
グラム陽性菌およびグラム陰性菌についての上記の表は、操作された細菌からポリペプチドおよび他の分子を分泌するために使用することができる分泌系を収載しており、これらは、Milton H.Saier,Jr. Microbe/１巻、９号、２００６年、「Protein Secretion Systems in Gram-Negative Bacteria Gram-negative bacteria possess many protein secretion-membrane insertion systems that apparently evolved independently」に概説されおり、この参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗がん分子、例えば、サイトカイン、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、代謝酵素、例えばキヌレニナーゼ、本明細書に記載の他のもの、の分泌のための、本明細書に記載のネイティブまたは非ネイティブ分泌系を含む。
一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ｆｄｎＧ、ｄｍｓＡ、ＰｅｌＢ、ＨｌｙＡ分泌シグナル、およびＨｌｙＡ分泌シグナルから選択される。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｈｏＡ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、配列番号７４５または配列番号７４６から選択される配列を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＯｍｐＦ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、ＯｍｐＦ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４７を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｃｖａＣ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４８を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｔｏｒＡ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７４９を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｆｄｎＧ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５０を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ｄｍｓＡ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５１を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＰｅｌＢ分泌シグナルである。一部の実施形態において、分泌タグは、配列番号７５２を含む。一部の実施形態では、分泌タグは、ＨｌｙＡ分泌シグナルである。一部の実施形態では、分泌タグは、配列番号７５３および配列番号７５４から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌タグをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号７４５、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、および／または配列番号７５４から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号７４５、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、および／または配列番号７５４から選択される配列を含む。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号７４５、配列番号７４６、配列番号７４７、配列番号７４８、配列番号７４９、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７５２、配列番号７５３、および／または配列番号７５４から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アドヘシン（ＥＣＯＬＩＮ＿１９８８０）、ＤｓｂＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿２１５２５）、ＧｌｔＩ（ＥＣＯＬＩＮ＿０３４３０）、ＧｓｐＤ（ＥＣＯＬＩＮ＿１６４９５）、ＨｄｅＢ（ＥＣＯＬＩＮ＿１９４１０）、ＭａｌＥ（ＥＣＯＬＩＮ＿２２５４０）、ＯｐｐＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０７２９５）、ＰｅｌＢ、ＰｈｏＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）、ＰｐｉＡ（ＥＣＯＬＩＮ＿１８６２０）、ＴｏｌＢ、ｔｏｒｔ、ＯｍｐＡ、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ ｍｇｌＢおよびｌａｍＢ分泌タグから選択される分泌タグを含むポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌タグをコードする核酸配列を含む。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６、配列番号１２２７、配列番号１２２８、配列番号１２２９、配列番号１２３０、配列番号１１４１、配列番号１１４２、配列番号１１４３、配列番号１１４４、配列番号１１４５、配列番号１２５３、配列番号１１５７、配列番号１１５８、配列番号１１５９、配列番号１１６０、配列番号１１６１、配列番号１１６２、配列番号１１６３、配列番号１１６４、配列番号１１６５、配列番号１１６６、および配列番号１１６７から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６、配列番号１２２７、配列番号１２２８、配列番号１２２９、配列番号１２３０、配列番号１１４１、配列番号１１４２、配列番号１１４３、配列番号１１４４、配列番号１１４５、配列番号１２５３、配列番号１１５７、配列番号１１５８、配列番号１１５９、配列番号１１６０、配列番号１１６１、配列番号１１６２、配列番号１１６３、配列番号１１６４、配列番号１１６５、配列番号１１６６、および配列番号１１６７から選択される配列を含む。一実施形態では、分泌タグをコードする核酸配列は、配列番号１２２２、配列番号１２２３、配列番号１２２４、配列番号１２２５、配列番号１２２６、配列番号１２２７、配列番号１２２８、配列番号１２２９、配列番号１２３０、配列番号１１４１、配列番号１１４２、配列番号１１４３、配列番号１１４４、配列番号１１４５、配列番号１２５３、配列番号１１５７、配列番号１１５８、配列番号１１５９、配列番号１１６０、配列番号１１６１、配列番号１１６２、配列番号１１６３、配列番号１１６４、配列番号１１６５、配列番号１１６６、および配列番号１１６７から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１２１８、配列番号１２１９、配列番号１１８１、配列番号１２２０、配列番号１２２１、配列番号１１８０、配列番号１１８４、配列番号１１８６、配列番号１１９０、配列番号１１８２、配列番号１１３５、配列番号１１８３、配列番号１１８８、配列番号１１８７、配列番号７４７、配列番号１１８５、および配列番号１１８９から選択される分泌タグポリペプチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する分泌タグを含むポリペプチドをコードする。別の実施形態では、分泌タグは、配列番号１２１８、配列番号１２１９、配列番号１１８１、配列番号１２２０、配列番号１２２１、配列番号１１８０、配列番号１１８４、配列番号１１８６、配列番号１１９０、配列番号１１８２、配列番号１１３５、配列番号１１８３、配列番号１１８８、配列番号１１８７、配列番号７４７、配列番号１１８５、および配列番号１１８９から選択される配列を含む。さらに別の実施形態では、分泌タグは、配列番号１２１８、配列番号１２１９、配列番号１１８１、配列番号１２２０、配列番号１２２１、配列番号１１８０、配列番号１１８４、配列番号１１８６、配列番号１１９０、配列番号１１８２、配列番号１１３５、配列番号１１８３、配列番号１１８８、配列番号１１８７、配列番号７４７、配列番号１１８５、および配列番号１１８９から選択される配列からなる。
任意の分泌タグまたは分泌系を、本明細書に記載の任意のサイトカインと組み合わせることができ、本明細書に記載の直接もしくは間接誘導性または構成的プロモーターにより駆動される構築物（プラスミドに基づくまたは組み込まれている構築物）を生成するために使用することができる。一部の実施形態では、分泌系は、ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡ、ＰＡＬを含むがこれらに限定されない漏出性または拡散性外膜表現型（ＤＯＭ）に至る１つまたは複数のゲノム突然変異と組み合わせて、使用される。
一部の実施形態では、分泌系は、ＩＩＩ型鞭毛、修飾ＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、単一膜分泌系、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系から選択される。
本明細書に記載の分泌系のいずれかを、目的のポリペプチドを分泌するために、本開示に従って利用してもよい。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌により分泌される治療用タンパク質は、プロテアーゼ、例えば腸プロテアーゼ、に対する耐性を増大させるように修飾されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、低酸素条件で、ならびに／あるいはがんおよび／または腫瘍微小環境、または組織特異的分子もしくは代謝物の存在下で、ならびに／あるいは炎症または免疫抑制に関連する分子または代謝物の存在下で、ならびに／あるいは消化管内に存在しうる代謝物の存在下で、ならびに／あるいはｉｎ ｖｉｖｏで存在することもあり、しないこともあり、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで株培養、拡大増殖、産生および／または製造中に存在することもある、代謝物、例えば、アラビノースおよび本明細書に記載の他のものの存在下で、記載の回路のいずれか１つまたは複数を発現することができる。一部の実施形態では、遺伝子配列は、そのような条件および／またはインデューサーにより誘導されうるプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、本明細書に記載の構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、遺伝子配列は、構成的プロモーターによって制御され、本明細書に記載の、ｉｎ ｖｉｖｏ条件および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ条件で、例えば、拡大増殖、産生および／または製造中に発現される。
一部の実施形態では、記載の回路のいずれか１つまたは複数は、１つもしくは複数のプラスミド（例えば、高コピー数もしくは低コピー数プラスミド）上に存在するか、または微生物染色体における１つもしくは複数の部位に組み込まれている。また、一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、記載の回路のいずれか１つまたは複数をさらに発現することができ、以下のものの１つまたは複数をさらに含む：（１）１つまたは複数の栄養要求体、例えば、当技術分野において公知の、および本明細書で提供される、任意の栄養要求体、例えばｔｈｙＡ栄養要求体、（２）１つまたは複数のキルスイッチ回路、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、キルスイッチのいずれか、（３）１つまたは複数の抗生物質耐性回路、（４）生体分子または基質を移入するための１つまたは複数の輸送体、例えば、本明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野において公知の、輸送体のいずれか、（５）１つまたは複数の分泌回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、分泌回路のいずれか、（６）１つまたは複数の表面提示回路、例えば、本明細書に記載の、でなければ当技術分野において公知の、表面提示回路のいずれか、および（７）本明細書に記載の１つまたは複数の代謝物（例えば、キヌレニン、トリプトファン、アデノシン、アルギニン）の産生または分解のための１つまたは複数の回路、（８）このような追加の回路の１つまたは複数の組合せ。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌を単独で投与することができ、または抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の１つもしくは複数の免疫チェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。
目的のタンパク質の非限定的な例としては、サイトカイン、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＳＩＲＰアルファおよびバリアント、ヒアルロニダーゼ、これらに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、および本明細書に記載の他のもの）および抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４０を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、ならびに代謝物産生または消費酵素、例えば、キヌレニナーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン合成酵素、ならびにアデノシン分解酵素が挙げられる。これらのポリペプチドを、安定性、プロテアーゼ消化に対する耐性、および／または活性を増大させるように、突然変異させることができる。
一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、鞭毛ＩＩＩ型分泌系の成分を使用して分泌される。非限定的な例では、目的のそのような治療用ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ヒアルロニダーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン合成酵素、これらに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、アデノシン分解酵素は、ｆｌｉＣ−５’ＵＴＲの後方（例えば、ｆｌｉＣ座位からの１７３ｂｐ非翻訳領域）に組立てられ、ネイティブプロモーターにより駆動される。他の実施形態では、鞭毛ＩＩＩ型分泌系の成分を使用して分泌される目的の（of interested）治療用ペプチドの発現は、ｔｅｔ−誘導性プロモーターにより駆動される。代替実施形態では、誘導性プロモーター、例えば、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、ＩＢＤ特異的分子により誘導されるプロモーター、または炎症もしくは炎症応答により誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、および消化管内に天然に存在することもあり、しないこともある（例えば、体外から加えることができる）代謝物、例えばアラビノース、により誘導されるプロモーターが、使用される。一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、プラスミド（例えば、中等度コピー数プラスミド）から発現される。一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、ｆｌｉＣ座位に（ｆｌｉＣを欠失させることにより）組み込まれている構築物から発現され、ネイティブＦｌｉＣプロモーターにより駆動される。一部の実施形態では、ＦｌｉＣのＮ末端部（例えば、ＦｌｉＣの最初の２０個のアミノ酸）が、分泌効率をさらに高めるために、構築物に含まれている。
一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ヒアルロニダーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン合成酵素、これらに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、アデノシン分解酵素は、拡散性外膜（ＤＯＭ）系を使用して／ＤＯＭ系によって分泌される。一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｎ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルと融合されている。そのようなＮ末端Ｓｅｃ依存性分泌シグナルの非限定的な例としては、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＡ、およびｃｖａＣが挙げられる。代替実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｔａｔ依存性分泌シグナルと融合されている。例示的なＴａｔ依存性タグとしては、ＴｏｒＡ、ＦｄｎＧ、およびＤｍｓＡが挙げられる。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、外膜および／または周辺質タンパク質の１つまたは複数における欠失または突然変異を有する。１つまたは複数が欠失または突然変異されうる、そのようなタンパク質の非限定的な例としては、ｌｐｐ、ｐａｌ、ｔｏｌＡおよび／またはｎｌｐＩが挙げられる。一部の実施形態では、ｌｐｐが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｐａｌが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｔｏｌＡが、欠失または突然変異される。他の実施形態では、ｎｌｐＩが、欠失または突然変異される。さらに他の実施形態では、ある特定の周辺質プロテアーゼは、例えば、周辺質におけるポリペプチドの安定性を増大させるために、欠失または突然変異される。そのようなプロテアーゼの非限定的な例としては、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが挙げられる。一部の実施形態では、ｄｅｇＰが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｏｍｐＴが、欠失または突然変異される。一部の実施形態では、ｄｅｇＰおよびｏｍｐＴが、欠失または突然変異される。
一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ヒアルロニダーゼ、トリプトファンおよび／またはアルギニン合成酵素、これらに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、アデノシン分解酵素は、Ｖ型オートセクレター（ｐｉｃタンパク質）分泌によって分泌される。一部の実施形態では、目的の治療用タンパク質は、ネイティブＮｉｓｓｌｅオートセクレターＥ．ｃｏｌｉ＿０１６３５との融合タンパク質（ネイティブＮｉｓｓｌｅオートセクレターＥ．ｃｏｌｉ＿０１６３５における本来のパッセンジャータンパク質が、目的の治療用ポリペプチドで置換されている）として発現される。
一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチド、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＯＸＯ４０アゴニスト、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、トリプトファンおよび／またはアルギニン合成酵素、これらに限定されないがチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３および本明細書に記載の他のもの）を含む抗体、例えばｓｃＦｖ、キヌレニナーゼ、アデノシン分解酵素は、Ｉ型溶血素分泌によって分泌される。一実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３のアルファ−溶血素（ｈｌｙＡ）のＣ末端の５３個のアミノ酸との融合タンパク質として発現される。
表面提示
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物は、細菌および／または微生物の表面にアンカーまたは提示される抗がん分子をコードする１種もしくは複数の遺伝子および／または遺伝子カセットをコードする。細菌および／または微生物に提示またはアンカーされる抗がん分子の例は、本明細書に記載されている抗がん分子のいずれかであり、抗体、例えば、ｓｃＦｖ断片、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。非限定的な例では、細菌細胞表面にアンカーまたは提示される抗体またはｓｃＦｖ断片は、ＣＬＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されているチェックポイントインヒビターに対する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の表面にアンカーまたは提示されており、そのエフェクター機能を発揮する際にアンカーを維持する、治療用ポリペプチドまたはエフェクター分子、例えば、ＳｃＦｖをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。他の実施形態では、表面提示された治療用ポリペプチド、例えば、抗体またはｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子操作された細菌は、そのエフェクター機能を発揮する前に、その最中にまたはその後に、溶解する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞表面に一時的に付着されており、その機能を発揮する前に、その最中にまたはその後に、細菌から解離する治療用ペプチドをコードする。
一部の実施形態では、より短いペプチドまたはポリペプチド、例えば、６０アミノ酸未満の長さのペプチドまたはポリペプチドが、遺伝子操作された細菌の細胞表面に提示される。一部の実施形態では、このようなより短いペプチドまたはポリペプチドは、免疫モジュレーションエフェクター分子を含む。このような治療用ポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
グラム陰性細菌の表面におけるより短いペプチドまたはポリペプチドの提示のためのいくつかの戦略は、当該技術分野で公知であり、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Georgiouら、Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines：Nat Biotechnol.１９９７年１月；１５巻（１号）：２９〜３４頁に記載されている。これらのシステムは全て、表面タンパク質の膜アンカードメイン由来の配列を使用した遺伝子融合体の構築により、組換えタンパク質を細胞表面に標的化させるという、共通のテーマを共有する。
このような戦略の非限定的な例は、表１５〜１７に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、腸内細菌に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ）の表面露出したループへと融合された１つまたは複数の短い治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌によって発現される短い治療用ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する外膜タンパク質ＬａｍＢへと挿入され、細菌細胞表面に提示される。ＬａｍＢの表面露出したループへのペプチドの挿入によるペプチドの細胞外提示は、例えば、Hofnungら、Expression of foreign polypeptides at the Escherichia coli cell surface；Methods Cell Biol.３４巻：７７〜１０５頁およびCharbit, A.ら、１９８７年、Presentation of two epitopes of the preS2 region of hepatitis B virus on live recombinant bacteria、J. Immunol.１３９巻：１６５８〜１６６４頁に記載されている。
別の非限定的な例では、遺伝子操作された細菌に含まれる、１つまたは複数の遺伝子配列によってコードされる短い治療用ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する外膜タンパク質ＰｈｏＥへと挿入され、細菌細胞表面に提示される。ＰｈｏＥタンパク質は、三量体構造を有し、低分子のための孔として機能する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２の別の豊富な外膜タンパク質である。ＰｈｏＥの一次構造の解析は、膜を横断する１６個のベータシート、および細胞の表面に露出した８個の高頻度可変領域を明らかにした。ＰｈｏＥタンパク質のこれらの細胞表面露出領域のうち１個または複数を使用して、異種ペプチドを挿入することができる。例えば、病原性生物の抗原決定基が、ＰｈｏＥタンパク質の１個または複数の細胞表面露出領域において提示された（例えば、Aterbergら、１９９０年；Outer membrane PhoE protein of Escherichia coli as a carrier for foreign antigenic determinants: immunogenicity of epitopes of foot-and-mouth disease virus；Vaccine.１９９０年２月；８巻（１号）：８５〜９１頁に記載されている通り）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外付属物のタンパク質構成成分に融合された１つまたは複数の短い治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。線毛および鞭毛などの細胞外付属物が、細菌細胞表面における目的のペプチドの提示に使用されている、いくつかのシステムが記載されてきた。使用される鞭毛および線毛（pillar）タンパク質の例として、Ｅ．ｃｏｌｉ鞭毛の主要構造構成成分であるＦｌｉＣ、およびＰａｐ線毛の主要サブユニットであるＰａｐＡが挙げられる。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＦＬＩＴＲＸシステムの１つまたは複数の構成成分をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。ＦＬＩＴＲＸシステムは、ＦｌｉＣと、他のタンパク質への結合と適合性であることの確証をペプチド挿入物に担わせる、高度に多用途の足場を表す小型のレドックスタンパク質であるチオレドキシンとの融合タンパク質の使用に基づくＥ．ｃｏｌｉ提示システムである。ＦＬＩＴＲＸシステムにおいて、チオレドキシンは、ＦｌｉＣの不要な領域へと融合される。次いで、異種ペプチドは、ＦｌｉＣ融合体におけるチオレドキシンドメイン内に挿入することができ、表面露出される。他の足場タンパク質は当該技術分野で公知であり、そのうちいくつかは、このシステムにおける足場タンパク質としてチオレドキシンに取って代わることができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ペプチドが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する１型毛縁のアドヘシンであるＦｉｍＨに融合された、ＦｉｍＨ融合タンパク質を含む。ある特定の位置に５６個もの多さの外来性アミノ酸を含有するＦｉｍＨアドヘシンキメラは、毛縁オルガネラの構成成分として細菌表面に輸送される（Pallesenら、Chimeric FimH adhesion of type I fimbriae: a bacterial surface display system for heterologous sequences. Microbiology １４１巻：２８３９〜２８４８頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ペプチドが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＦ１１毛縁の主要サブユニットに融合された融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。Ｆ１１毛縁の主要サブユニットの高頻度可変領域は、異種ペプチド、例えば、抗原エピトープの挿入に使用することができる（Van Dieら、Expression of foreign epitopes in P-fimbriae of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet.２２２巻：２９７〜３０３頁）。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ペプチドがｐａｐＡに融合されたｐａｐＡ融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＰａｐＡのアミノ酸７および６８のエリアにおけるペプチドが、線毛の外側に局在化されるため、目的のペプチドは、ＰａｐＡの成熟部分のコード配列のコドン７または６８のいずれかの後に挿入される（Steidlerら、Pap pili as a vector system for surface exposition of an immunoglobulin G-binding domain of protein A of Staphylococcus aureus in Escherichia coli；J Bacteriol. １９９３年１２月；１７５巻（２３号）：７６３９〜４３頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、６０アミノ酸より大きいポリペプチド、例えば、免疫モジュレーションエフェクターをコードし、細菌細胞表面に提示される１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ペプチド、例えば、６０アミノ酸の長さを超えるポリペプチドが、グラム陰性細菌由来のリポタンパク質またはその１つもしくは複数の断片に融合された融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用タンパク質が、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）またはその断片に融合された融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。融合タンパク質は、ペリプラズムに位置し、外膜の透過処理により外部に提示され得る。例えば、ＰＡＬ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、その抗原に結合し、細胞外被のムレイン層に緊密に結合されることが示された（Fuchsら、Targeting recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli fusion to a peptidoglycan-associated lipoprotein；Biotechnology（N Y）．１９９１年１２月；９巻（１２号）：１３６９〜７２頁）。ＰＡＬ−ｓｃＦｖ融合体は、ペリプラズムに位置し、ムレイン層に結合され、外膜の透過処理後に、ｓｃＦｖは、外部に加えられた抗原に到達可能になった。一部の実施形態では、表面提示のための融合タンパク質を含む遺伝子操作された細菌は、透過性外膜をさらに有する。漏出性外膜をもたらす突然変異および／または欠失は、本明細書の他の箇所に記載されている。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用タンパク質、例えば、免疫モジュレーションエフェクターが、グラム陰性細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの主要リポタンパク質の残基に融合された、融合タンパク質をコードする。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用タンパク質が、シグナルペプチド、およびグラム陰性細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの主要リポタンパク質の９個のＮ末端アミノ酸残基に融合された、融合タンパク質をコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ主要リポタンパク質のこれらの残基は、疎水性膜アンカーとして機能する。例えば、治療用ポリペプチド、この場合はｓｃＦｖ断片とこれらの残基との融合構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける免疫反応性かつ細胞結合したポリペプチドの特異的蓄積をもたらした（Laukkanenら、Lipid-tagged antibodies：bacterial expression and characterization of a lipoprotein-single-chain antibody fusion protein. Mol. Microbiol. ４巻：１２５９〜１２６８頁）。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用タンパク質が、グラム陰性細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｒａＴタンパク質へと、例えば、１８０位に挿入された、融合タンパク質をコードする。ＴｒａＴタンパク質は、血清抵抗性および表面除外を媒介するＩｎｃＦ群のプラスミドによって指定された、表面露出リポタンパク質である。Ｔａｙｌｏｒらは、例えば、１８０位におけるポリオウイルスのＣ３エピトープの挿入が、野生型タンパク質のオリゴマー立体構造を維持しつつ、細胞表面への抗原の露出を可能にしたことを示した（Taylorら、The TraT lipoprotein as a vehicle for the transport of foreign antigenic determinants to the cell surface of Escherichia coli K12：structure-function relationship in the TraT protein. Mol Microbiol. １９９０年８月；４巻（８号）：１２５９〜６８頁）。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ポリペプチドに融合された、外膜タンパク質ＯｍｐＡ由来のドメインに融合された主要リポタンパク質（Ｌｐｐ）由来のＮ末端外膜シグナルを含むＬｐｐ−ＯｍｐＡ提示ビヒクルを含む融合タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子および／または遺伝子カセットを含む。このシステムにおいて、Ｌｐｐシグナルペプチドは、局在化を媒介し、ＯｍｐＡは、目的の治療用タンパク質の提示のためのフレームワークを提供する。Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ融合体は、Ｅ．ｃｏｌｉの表面における、２０〜５４ｋＤａの間のサイズのいくつかのタンパク質の提示に使用された（例えば、Staphopoulosら、Characterization of Escherichia coli expressing and Lpp-OmpA (46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membraneを参照）。例えば、Ｆｒａｎｓｃｏらは、ＬｐｐのＮ末端標的化配列、およびネイティブタンパク質の８個の膜貫通ループのうち５個を含有するＯｍｐＡ断片に、ベータ−ラクタマーゼを融合させた。この融合タンパク質を細胞表面にアセンブルし、ベータ−ラクタマーゼドメインを細胞壁中に安定にアンカーした（Fransiscoら、Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli；Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻、２７１３〜２７１７頁、１９９２年）。
一実施形態では、ＩＩ型分泌経路またはその変形形態は、例えば、ＮｅｉｓｓｅｒｉａのＩｇＡプロテアーゼ分泌経路またはＳｈｉｇｅｌｌａのＶｉｒＧタンパク質経路など、細菌細胞表面における目的の治療用タンパク質の一過性またはより長い持続時間の提示に使用される。一実施形態では、ＩｇＡプロテアーゼ分泌経路は、グラム陰性細菌の細胞表面における目的の治療用ペプチドの搬出および提示に使用される。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａのＩｇＡプロテアーゼは、最も一般的なＩＩ型分泌経路の変形形態を使用して、他のいかなる遺伝子産物からも独立して細胞外搬出を達成する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓのＩｇＡ遺伝子は、ヒトＩｇＡ１抗体を切断する細胞外タンパク質をコードする。ｉｇａ遺伝子単独は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＥ．ｃｏｌｉ ｓｐｅｃｉｅｓにおけるＩｇＡプロテアーゼの選択された細胞外分泌を方向付けるのに十分である（Klauserら、１９９３年、Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA protease beta-domain：conformation-dependent outer membrane translocation. EMBO J ９巻：１９９１〜１９９９頁およびその中の参考文献）。成熟ＩｇＡプロテアーゼは、シグナルペプチダーゼおよび自己タンパク質分解性切断によって、大きい前駆体からいくつかのステップでプロセシングされる。前駆体は、次の４個のドメインからなる：（１）内膜輸送を媒介するアミノ末端シグナルペプチド、（２）プロテアーゼドメイン、（３）プロテアーゼにより分泌されるベーシックアルファヘリックス領域であるアルファドメイン、および（４）外膜輸送のための必須機能を有するオートトランスポーターベータドメイン。基本的に、ＩｇＡプロテアーゼのＣ末端ベータオートトランスポータードメインは、膜を渡ったＮ末端ドメインの搬出を媒介する外膜におけるチャネルを形成し、これは次いで、細菌の外部表面に一過性に提示されるようになる。次に、アルファドメインおよびプロテアーゼドメインは、タンパク質分解性切断により放出される。Ｋｌａｕｓｅｒら（１９９３年）は、コレラ毒素ＢによるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡプロテアーゼのネイティブＮ末端ドメインの置き換えが、Ｓ．ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍにおけるパッセンジャーポリペプチドの表面提示をもたらしたことを示した。別の研究において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡプロテアーゼのシグナル配列およびＣ末端ベータオートトランスポータードメインを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの細菌細胞表面において、ブタ流行性下痢ウイルスエピトープに対してｓｃＦｖを移行および提示した（Pyoら、Escherichia coli expressing single chain Fv on the cell surface as a potential prophylactic of porcine epidemic diarrhea virus；Vaccine（２７巻）（２００９年）２０３０〜２０３６頁）。
よって、一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルファドメインが目的の治療用タンパク質に置換され、外膜を通した搬出を媒介する機能的ＩｇＡプロテアーゼベータ−ドメインに融合された、ＩｇＡプロテアーゼ断片をコードする。理論に制約されることは望まないが、ＩｇＡプロテアーゼ活性は、このような融合タンパク質において排除され、したがって、培地への融合タンパク質の自己タンパク質分解性放出は起こらず、グラム陰性宿主細菌の細胞表面における目的の治療用タンパク質の提示をもたらす。
ＳｈｉｇｅｌｌａからのＶｉｒＧタンパク質の分泌は、ＮｅｉｓｓｅｒｉａのＩｇＡプロテアーゼによって利用される搬出システムと同様である（例えば、Suzukiら、１９９５年；Extracellular transport of VirG protein in Shigella J Biol. Chem ２７０巻：３０８７４〜３０８８０頁およびその中の参考文献を参照）。よって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＶｉｒＧの膜貫通領域に融合された目的の治療用タンパク質を含む融合タンパク質をコードし、目的の治療用タンパク質の表面提示をもたらす。Ｓｈｉｇｅｌｌａの大きいプラスミドにおけるＶｉｒＧ遺伝子は、侵入細菌細胞の一極から辿って、宿主上皮細胞質を通ってフィラメントにおいて伸びる、繊維状アクチン（Ｆ−アクチン）の局在化された沈着の原因となることが示されてきた。ＶｉｒＧは、３個の特有のドメイン、Ｎ末端シグナル配列（アミノ酸１〜５２）、ｉｄ α−ドメイン（アミノ酸５３〜７５８）およびｄＣ末端β−コア（アミノ酸７５９〜１１０２）からなる表面露出外膜タンパク質である（例えば、Suzukiら、１９９６年；Functional Analysis of Shigella VirG Domains Essential for Interaction with Vinculin and Actin-based Motility；J. Biol. Chem.、２７１巻、２１８７８〜２１８８５頁およびその中の参考文献を参照）。Ｓｕｚｕｋｉら（１９９５年）は、Ｎ末端３７ｋＤａ ＶｉｒＧ部分へのＭａｌＥまたはＰｈｏＡタンパク質などの外来性タンパク質の融合が、ペリプラズムから外膜の外側へのパッセンジャーポリペプチドの輸送をもたらしたことを示し、外膜に埋伏したＣ末端３７ｋＤａ ＶｉｒＧ部分が、ＩｇＡプロテアーゼベータ−ドメインと相同な様式で、ペリプラズム空間から外膜の外側への先行するＶｉｒＧ部分または異種もしくはパッセンジャーポリペプチドの移行に関与することを示す。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｃ末端３７ｋＤａ ＶｉｒＧタンパク質断片が目的の治療用タンパク質に融合された融合タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用タンパク質が一時的表面提示のためにプルラナーゼに融合された融合タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。プルラナーゼは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって培地へと特異的に放出され、初期定常成長相以降より培地へと放出される前に、完全に露出した細胞表面結合した中間体として存在する。細胞表面アンカーは、その化学組成が他の細菌タンパク質のものと同一である、Ｎ末端脂肪酸アシル修飾によって達成される。
ＩｇＡプロテアーゼとは異なり、同様にＩＩ型分泌機構を介して搬出されるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのリポタンパク質プルラナーゼ（ＰｕｌＡ）は、外膜を越えたその移行のために１４種の遺伝子を要求する。例えば、Ｐｕｇｓｌｅｙおよび共同研究者らは、リポタンパク質プルラナーゼ（ＰｕｌＡ）が、外膜を越えたペリプラズム酵素ベータ−ラクタマーゼの移行を容易にし得ることを示した。特に、全プルラナーゼ分泌遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉ株において、Ｎ末端８３４アミノ酸プルラナーゼセグメントを含有するプルラナーゼ−ベータ−ラクタマーゼハイブリッドタンパク質分子は、細胞表面へと効率的に輸送された。注目すべきことに、プルラナーゼハイブリッドは、細菌表面にほんの一時的に付着されたままであり、その後に培地へと放出される（KornackerおよびPugsley：The normally periplasmic enzyme beta-lactamase is specifically and efficiently translocated through the Escherichia coli outer membrane when it is fused to the cell surface enzyme pullulanase. Mol. Microbiol.４巻：１１０１〜１１０９頁ならびにその中の参考文献）。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、ＫｏｒｎａｃｋｅｒおよびＰｕｇｓｌｅｙによって記載されている通り、分泌に要求されるプルラナーゼ遺伝子の完全セット、およびＮ末端プルラナーゼポリペプチド断片に融合された目的の治療用タンパク質を含む融合タンパク質を含む１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、目的の治療用タンパク質に融合されたＮ末端プルラナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質は、細菌細胞の表面に一過性に提示され、その後に培地または細胞外空間へと放出される。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ由来の氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）が細胞壁に目的の治療用タンパク質をアンカーする融合タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。ＩＮＰは、氷核としての細胞外氷形成を触媒する分泌タンパク質である。ＩＮＰは、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含む多数のグラム陰性種において見出された。Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ株における４種の遺伝子、ｉｎａＫ、ｉｎａＶおよびｉｎａＺおよびｉｎａＱは、配列および一次組織化における高い類似性を示す（Liら、Molecular Characterization of an Ice Nucleation Protein Variant (InaQ) from Pseudomonas syringae and the Analysis of Its Transmembrane Transport Activity in Escherichia coli Int J Biol Sci.２０１２年；８巻（８号）：１０９７〜１１０８頁）。全ＩＮＰ（１２００ａａ〜１５００ａａ）は、３種の別個の構造ドメインを含む：（１）相対的に疎水性であり、Ｎ−グリカン（Ａｓｐ）またはＯ−グリカン（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）連結を介して外膜におけるマンナン−ホスファチジルイノシトール基に潜在的にカップリングされ得る、Ｎ末端ドメイン（配列総体のおよそ１５％）；（２）相対的に親水性末端である、Ｃ末端ドメイン（およそ４％）；および（３）コンセンサスオクタペプチド（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）による１６残基（または４８残基）周期性によって生じる近接反復を構成する、中央反復ドメイン（ＣＲＤ）（およそ８１％）。ＩＮＰは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａおよびラン藻を含む様々な細菌細胞表面提示システムにおいて用いられてきており、これらの全てにおいて、ＩＮＰは、宿主細胞の表面に異種タンパク質を標的化することができた。さらに、Ｎ末端領域単独は、細胞表面へと外来性タンパク質の移行を方向付けることが示されており、潜在的細胞表面提示モチーフとして用いることができる（Liら、２００４年、Functional display of foreign protein on surface of Escherichia coli using N-terminal domain of ice nucleation protein；Biotechnol Bioeng.２００４年１月２０日；８５巻（２号）：２１４〜２１頁）。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的の治療用ペプチドの表面提示のためのＩＭＰ融合体を含む。一部の実施形態では、ＩＮＰタンパク質のＮ末端領域は、表面提示のために目的のポリペプチドに融合される。
ＩＭＰタンパク質は、修飾可能な内部反復単位をさらに有する、すなわち、ＣＲＤの長さは調整可能であり、これにより、タンパク質融合体の長さに柔軟性が得られ（Jungら、１９９８年）、また、より大きいポリペプチドを収容することができる。例えば、ＩＮＰに基づく提示システムを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞表面における９０ｋＤＡタンパク質の発現に成功した（Wuら、２００６年；Cell surface display of Chi92 on Escherichia coli using ice nucleation protein for improved catalytic and antifungal activity；FEMS Microbiology Letters、２５６巻、１号；１１９〜１２５頁）。
当業者によって、本明細書に記載されているこのような融合またはハイブリッドタンパク質の移行が、「移行適格性」立体構造を要求する、例えば、ペリプラズム空間における例えば、ジスルフィド結合の形成は、望ましくない場合があり、外膜を通った移行を阻害し得る（例えば、Klauserら、１９９０年を参照）、またはその代わりに、外膜を通った移行に要求され得る（または少なくとも妨害しない）ことが理解される（例えば、Puggsley、１９９２年；Translocation of a folded protein across the outer membrane in Escherichia coli；Proc Natl Acad Sci U S A.１９９２年１２月１５日；８９巻（２４号）：１２０５８〜１２０６２頁を参照）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞表面への移行に先立つジスルフィド結合の形成が防止された融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞表面への移行に先立ちジスルフィド結合が形成される融合タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。
グラム陽性細菌におけるタンパク質の提示のための発現系も開発された。結果的に、一部の実施形態では、グラム陽性細菌は、その細胞表面に目的の治療用タンパク質を提示するように操作される。Ｕｈｌｅｎらは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株の表面への最大８８アミノ酸長の外来性ペプチドの提示のために、プロテインＡの細胞壁結合したＸ−ドメインへの融合体を使用した。例えば、ある一研究は、コアグラーゼ陰性グラム陽性細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓの細胞表面への異種タンパク質の標的化を可能にする発現系について記載する（Hanssonら、Expression of recombinant proteins on the surface of the coagulase-negative bacterium Staphylococcus xylosus；J Bacteriol.１９９２年７月；１７４巻（１３号）：４２３９〜４５頁）。
ブドウ球菌プロテインＡのシグナルペプチドと細胞表面結合領域をコードする遺伝子断片との間に融合された組換え遺伝子断片の発現は、得られた融合タンパク質を、ブドウ球菌プロテインＡの膜アンカー領域および高度に荷電した細胞壁貫通領域により外側細菌細胞表面に標的化する。したがって、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ブドウ球菌プロテインＡのシグナルペプチドと細胞表面結合領域をコードする遺伝子断片との間に融合された治療用ポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
Ｓ．ｈｙｉｃｕｓに由来するリパーゼ遺伝子構築物由来のプロモーター、シグナル配列およびプロペプチド領域、ならびにブドウ球菌プロテインＡの細胞表面付着部分を活用することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ−ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓシャトルベクターが構築された。このシステムは、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓにおける異種ポリペプチドの表面提示について調査された（Samuelsonら、Cell surface display of recombinant proteins on Staphylococcus carnosus；J Bacteriol.１９９５年３月；１７７巻（６号）：１４７０〜６頁）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓに由来するリパーゼ遺伝子構築物由来のプロモーター、シグナル配列およびプロペプチド領域、ならびにブドウ球菌プロテインＡの細胞表面付着部分を含む治療用ポリペプチド融合タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
他の研究では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｓの繊維状Ｍ６タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞における抗原送達のための担体として用いられた（Pozziら、１９９２年；Delivery and expression of a heterologous antigen on the surface of streptococci. Infect. Immunm.６０巻：１９０２〜１９０７頁）。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、治療用ポリペプチドの細胞表面提示のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｓの繊維状Ｍ６タンパク質を含む治療用ポリペプチド融合タンパク質を含む１つまたは複数の遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インチミン（ｉｎｔｉｍｉｎ）またはインベイシンとの融合により細胞表面に提示される目的のポリペプチドをコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。インチミンおよびインベイシンは、様々な真核細胞表面受容体と特異的に相互作用し、これにより、細菌接着性および侵入を媒介する細菌アドヘシンのファミリーに属する。インチミンおよびインベイシンの両方が、細胞表面提示に理想的に適する構造的足場を提供する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インチミン、例えば、腸管出血性（Enterohemorragic）Ｅ．ｃｏｌｉインチミンＥａｅＡタンパク質またはそのカルボキシ末端トランケーションとの融合により細胞表面に提示される目的のポリペプチドをコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む（例えば、Wentzelら、Display of Passenger Proteins on the Surface of Escherichia coli K-12 by the Enterohemorrhagic E. coli Intimin EaeA J Bacteriol.２００１年１２月；１８３巻（２４号）：７２７３〜７２８４頁に記載されている通り）。例えば、インベイシンのＮ末端４８９アミノ酸は、細胞表面への融合タンパク質の局在化の促進に十分である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インベイシン、例えば、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉインベイシン（invasion）またはそのカルボキシ末端トランケーションとの融合により細胞表面に提示される目的のポリペプチドをコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。例えば、インチミンのＮ末端５３９アミノ酸は、融合タンパク質の外膜局在化の促進に十分であった（Liuら、The Tir-binding region of enterohaemorrhagic Escherichia coli intimin is sufficient to trigger actin condensation after bacterial-induced host cell signaling；Mol Microbiol.１９９９年１０月；３４巻（１号）：６７〜８１頁）。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アンカーモチーフとしてのＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ外壁タンパク質（exosporal protein）（ＢｃｌＡ）との融合により細胞表面に提示される目的のポリペプチドをコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。ＢｃｌＡは、外壁タンパク質、すなわち、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子周囲の毛髪様タンパク質である。非限定的な例では、目的のポリペプチドは、例えば、Parkら（Surface display of recombinant proteins on Escherichia coli by BclA exosporium of Bacillus anthracis）に記載されている通り、ＢｃｌＡのＮ末端ドメイン（２１アミノ酸）のＣ末端に連結される。
ＯｐｒＦ、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＸを含む、様々な他のアンカーモチーフが開発された。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＯｐｒＦ、ＯｍｐＣおよびＯｍｐＸとの融合により細胞表面に提示される目的のポリペプチドをコードする１種もしくは複数の遺伝子または遺伝子カセットを含む。
一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、遺伝子操作された細菌の細胞表面に永続的に提示される。一部の実施形態では、目的の治療用ポリペプチドは、遺伝子操作された細菌の細胞表面に一過性に提示される。
一部の実施形態では、治療用ポリペプチドは、例えば、漏出性表現型を提示する、本明細書に記載されている株において提示される。このような株は、ペプチドグリカン骨格に外膜を係留するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ｌｐｐ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＢ、ｐａｌのうち１つもしくは複数、および／または、ペリプラズムプロテアーゼをコードする１つもしくは複数の遺伝子、例えば、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＰ、ｎｌｐｌに不活性化突然変異を有する。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インベイシン提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬｐｐＯｍｐＡ提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９１を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、インチミンＮ提示タグを含む治療用ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９２を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％相同である提示アンカーを含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列を含む提示アンカーをコードする遺伝子配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって発現される提示アンカーは、配列番号９９０、配列番号９９１および配列番号９９２から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳｃＦｖが、単独で、または他の目的の治療用ポリペプチドと組み合わせて、細菌細胞表面に提示される。
一部の実施形態では、細胞表面提示戦略または回路は、１個の細菌において分泌戦略または回路と組み合わされる。一部の実施形態では、同じポリペプチドが、提示かつ分泌される。一部の実施形態では、第１のポリペプチドが提示され、第２のポリペプチドが分泌される。一部の実施形態では、提示戦略または回路戦略は、酵素の細胞内産生および結果として、その基質の細胞内異化作用の回路と組み合わされる。一部の実施形態では、提示戦略または提示回路は、腸障壁エンハンサー分子および／または抗炎症性エフェクター分子の細胞内産生の回路と組み合わされる。
一部の実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたは融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）である。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、腸特異的および／または腫瘍特異的によって誘導されるプロモーター、または炎症もしくは炎症性応答によって誘導されるプロモーター（ＲＮＳ、ＲＯＳプロモーター）、または腸に天然に存在していても存在していなくてもよい（例えば、外因的に添加され得る）代謝物、例えば、アラビノースによって誘導されるプロモーターである。代替実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたはポリペプチド融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターによって駆動される。
一部の実施形態では、表面提示されるポリペプチドまたは融合タンパク質の発現は、プラスミドに基づく。一部の実施形態では、表面提示のための抗体またはｓｃＦｖ断片をコードする遺伝子配列は、染色体に挿入される。
必須遺伝子、栄養要求株、キルスイッチ（Ｋｉｌｌ Ｓｗｉｔｃｈ）および宿主−プラスミド依存性
本明細書で使用される場合、用語「必須遺伝子」は、細胞成長および／または生存に必要な遺伝子を指す。細菌必須遺伝子は、当業者にとって周知であり、遺伝子の定方向欠失および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定することができる（例えば、これらそれぞれの内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、ZhangおよびLin、２００９年、DEG 5.0、a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes、Nucl. Acids Res.、３７巻：Ｄ４５５〜Ｄ４５８頁ならびにGerdesら、Essential genes on metabolic maps、Curr. Opin. Biotechnol.、１７巻（５号）：４４８〜４５６頁を参照）。
他の実施形態では、栄養要求性修飾を使用して、抗がん分子を産生する突然変異体細菌をスクリーニングすることもできる。
「必須遺伝子」は、生物が生きる状況および環境に依存することができる。例えば、必須遺伝子の突然変異、その修飾、またはその切除は、栄養要求株となる本開示の組換え細菌をもたらし得る。栄養要求性修飾は、生存または成長に必須な、外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が、当該必須栄養素の産生に必要な遺伝子を欠くせいで、死滅するように意図される。
栄養要求性修飾は、生存または成長に必須な、外因的に添加される栄養素の非存在下では、細菌が、当該必須栄養素の産生に必要な遺伝子を欠くせいで、死滅するように意図される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子操作された細菌のいずれかは、細胞生存および／または成長に要求される遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子、例えば、ｔｈｙＡである。別の実施形態では、必須遺伝子は、細胞壁合成遺伝子、例えば、ｄａｐＡである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されないのであれば、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢおよびｔｈｉ１が挙げられるがこれらに限定されない、細胞生存および／または成長に要求されるいかなる遺伝子を標的としてもよい。栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。そのようなものとして、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成および細胞壁合成に要求される遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。ＴｈｙＡ栄養要求性を導入するプロセスの非限定的な例は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２の実施例６３に記載されている。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ成長する、１つまたは複数の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求株である（その内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、LopezおよびAnderson「Synthetic Auxotrophs with Ligand-Dependent Essential Genes for a BL21 (DE3 Biosafety Strain」ACS Synthetic Biology（２０１５年）ＤＯＩ：10.1021/acssynbio.5b00085を参照）。
一部の実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子における突然変異を含む。一部の実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧおよびａｄｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異のうち１つまたは複数を含むｄｎａＮである：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃ。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異のうち１つまたは複数を含むｐｈｅＳである：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異のうち１つまたは複数を含むｔｙｒＳである：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異のうち１つまたは複数を含むｍｅｔＧである：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。一部の実施形態では、必須遺伝子は、次の突然変異のうち１つまたは複数を含むａｄｋである：Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ。一部の実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇを含むａｄｋである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、リガンドによって補完される。一部の実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸またはＬ−ヒスチジンメチルエステルによって補完される。ｄｎａＮにおける突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７ＩおよびＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ａｄｋにおける突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、これをリガンドに対して栄養要求性にする、２つ以上の突然変異体必須遺伝子を含む。一部の実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）における突然変異を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３種の必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、一部の実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８ＡおよびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９ＧおよびＡ５１Ｃ）およびｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６ＡおよびＩ１８８Ｌ）における突然変異を含む。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、キルスイッチも含む。適したキルスイッチは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月２４日に出願され、ＷＯ２０１６／２１０３７３として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４２７に記載されている。キルスイッチは、外部刺激に応答して、操作された微生物を能動的に死滅させるように意図される。生存のための必須栄養素を欠くせいで細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、キルスイッチは、細胞死を引き起こす微生物内における毒性分子の産生を誘導する、環境中における特定の因子によって引き金を引かれる。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、宿主−プラスミド相互依存性を作るように修飾されたプラスミドも含む。ある特定の実施形態では、相互に依存性の宿主−プラスミドプラットフォームは、Wrightら、２０１５年に記載されている通りである。一部の実施形態では、バイオセイフティーシステムは、プラスミドに基づくおよび染色体に組み込まれた構成成分を含む。非限定的な例では、プラスミドに基づく構成成分は、配列番号９９７〜１００１から選択される１つもしくは複数の遺伝子配列、または配列番号１００２〜１００４から選択されるポリペプチド配列を含むことができ、染色体に組み込まれた構成成分は、配列番号１００５〜１０１０から選択される１つまたは複数の遺伝子配列を含むことができる。これらのおよび他のシステムならびにプラットフォームは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１１日に出願され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つまたは複数のバイオセイフティープラスミドと組み合わせて細菌染色体に組み込まれた、１つまたは複数のバイオセイフティー構築物を含む。一部の実施形態では、プラスミドは、プラスミド複製開始タンパク質がトランスで配置されたコンディショナル複製起点（ＣＯＲ）を含む、すなわち、染色体に組み込まれたバイオセイフティー構築物によってコードされる。一部の実施形態では、染色体に組み込まれた構築物は、栄養要求性が生じるように（例えば、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ栄養要求性）、宿主へとさらに導入され、これは次いで、バイオセイフティープラスミド構築物から発現される遺伝子産物によって補完される。一部の実施形態では、バイオセイフティープラスミドは、広域スペクトル毒素（例えば、Ｋｉｓ）をさらにコードする一方、組み込まれたバイオセイフティー構築物は、抗毒素（例えば、抗Ｋｉｓ）をコードし、両方の構築物を含有する細菌細胞におけるプラスミドの繁殖を可能にする。
本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、遺伝子操作された微生物は、栄養要求性、キルスイッチまたは宿主−プラスミド依存性から選択される、例えば、封じ込めのための、１つまたは複数の調節性機構をもたらす遺伝子配列または突然変異を含む。
遺伝的調節性回路
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載されている構築物を発現するための、多層状遺伝的調節性回路を含む。適した多層状遺伝的調節性回路は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月２４日に出願され、ＷＯ２０１６／２１０３７８として公開された、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４に記載されている。遺伝的調節性回路は、抗がん分子を産生するまたは栄養要求株をレスキューする突然変異体細菌のスクリーニングに有用である。ある特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択するための方法を提供する。
医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作された微生物を含む医薬組成物を使用して、がんを処置、管理、寛解および／または予防することができる。１つもしくは複数の遺伝子操作された細菌および／または１つもしくは複数の遺伝子操作されたＯＶを単独で、または予防剤、治療剤および／または薬学的に許容される担体と組み合わせて含む本発明の医薬組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、１つまたは複数の抗がん分子をコードする１つまたは複数の遺伝子を含むように操作された、１つの種、株またはサブタイプの細菌を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されている遺伝子改変、例えば、１つまたは複数の抗がん分子をコードする１つまたは複数の遺伝子を含むようにそれぞれ操作された、２つまたはそれより多い種、株および／またはサブタイプの細菌を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、胞子として全身性または腫瘍内に投与される。非限定的な例として、遺伝子操作された細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａであり、投与は、腫瘍内の低酸素／壊死エリアの選択的コロニー形成をもたらす。一部の実施形態では、胞子は、固形腫瘍に存在する低酸素／壊死領域において排他的に発芽し、他のいかなる身体箇所においても発芽しない。
本発明の医薬組成物は、医薬品使用のための組成物への活性成分の加工を容易にする、賦形剤および補助物を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来様式で製剤化することができる。医薬組成物を製剤化する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照）。一部の実施形態では、医薬組成物は、打錠、凍結乾燥、直接圧縮、従来混合、溶解、造粒、水簸、乳化、カプセル被包、封入または噴霧乾燥に付されて、腸溶的にコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい、錠剤、粒状（granulate）、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤、マイクロ錠剤、ペレット剤または散剤を形成する。適切な製剤は、投与経路に依存する。
遺伝子操作された微生物は、いずれか適した剤形（例えば、経口投与のための液剤、カプセル剤、サシェ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、錠剤、腸溶コーティングされた錠剤、懸濁剤、散剤、粒剤またはマトリックス持続放出形成）で、いずれか適した種類の投与（例えば、経口、局所、注射用、静脈内、皮下、腫瘍内、腫瘍周囲、即時放出、パルス放出、遅延放出または持続放出）のために、医薬組成物へと製剤化することができる。遺伝子操作された細菌に適した投薬の量は、約１０４〜１０１２個細菌の範囲であり得る。組成物は、毎日、毎週または毎月１回またはそれより多く投与することができる。組成物は、食事の前、その最中またはその後に投与することができる。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、食事と同時に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事をとった後に投与される。
遺伝子操作された細菌または遺伝子操作されたウイルスは、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝用薬剤、表面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透エンハンサー、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物へと製剤化することができる。例えば、医薬組成物として、炭酸水素カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えば、ポリソルベート２０を含む界面活性物質の添加を挙げることができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、炭酸水素ナトリウムの溶液、例えば、炭酸水素ナトリウムの１モル濃度溶液中に製剤化することができる（例えば胃など、酸性の細胞環境を緩衝するために）。遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、アニオンにより形成される塩、および水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩など、カチオンにより形成される塩を含む。
遺伝子操作された微生物は、例えば、注入または注射によって、静脈内投与することができる。その代わりに、遺伝子操作された微生物は、腫瘍内および／または腫瘍周囲に投与することができる。他の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、動脈内、筋肉内または腹腔内投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより大きくコロニー形成する。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腫瘍被膜、コラーゲンおよび／または間質の浸透を増強するために腫瘍中隔（ｓｅｐｔａｅ）を破壊するために、ペグ化形態のｒＨｕＰＨ２０（ＰＥＧＰＨ２０）または他の薬剤と同時投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗がん分子と共に、線維性組織を分解する１つまたは複数の酵素を産生することができる。
本開示の遺伝子操作された微生物は、標的腫瘍内に直接的に置かれた細菌またはウイルスをもたらす腫瘍内注射により投与することができる。操作された細菌またはウイルスの腫瘍内注射は、強力な局在化された炎症性応答と共に、腫瘍細胞に対する適応免疫応答を誘発することができる。細菌またはウイルスは、１ｍｌシリンジ内に引き抜かれる前に、溶液に懸濁される。一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージ多叉針
（ｍｕｌｔｉｐｒｏｎｇｅｄ ｎｅｅｄｌｅ）（Ｑｕａｄｒａ−Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて注射される。注射部位は、無菌的に準備される。利用できるのであれば、超音波またはＣＴを使用して、注射のための腫瘍の壊死性領域を同定することができる。壊死性領域が同定されない場合、注射は、腫瘍の中心に方向付けることができる。針を予め定義された領域に１回挿入し、一定の圧力で分注する。注射針をゆっくり除去し、注射部位を滅菌する。
固形腫瘍への本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスの直接腫瘍内注射は、静脈内投与と比較して有利となり得る。静脈内注射方法を使用すると、ごく僅かな割合の細菌が、標的腫瘍に達することができる。例えば、４Ｔ１腫瘍を有するマウスの尾静脈へのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ注射後に、大部分の細菌（＞９９％）は動物から迅速に排除され、ごく僅かなパーセンテージの投与細菌が腫瘍にコロニー形成する（Stritzkerら、２００７年）。特に、マウスと比較して相対的に大きい血液体積および相対的に小さい腫瘍を有する大型動物およびヒト患者において、腫瘍内注射が特に有益となり得る。腫瘍への直接的な注射は、より高濃度の治療剤の送達を可能にし、全身性投与に起因し得る毒性を回避する。加えて、細菌の腫瘍内注射は、腫瘍内に頑強かつ局在化された免疫応答を誘導する。
場所、腫瘍型および腫瘍サイズに応じて、皮膚、皮下および経皮注射、治療的超音波内視鏡検査、または気管支内腫瘍内送達が挙げられるがこれらに限定されない、異なる投与技法を使用することができる。腫瘍内投与手順に先立ち、患者の局所麻酔薬ならびに標準心、圧力および酸素モニタリング、または全身麻酔と組み合わせた鎮静が行われる。
一部の腫瘍に対して、最小侵襲的な投与方法である経皮注射を用いることができる。超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または蛍光透視法をガイダンスとして使用して、針を導入および位置決めすることができる。経皮腫瘍内注射は、例えば、Lencioniら、２０１０年において肝細胞癌について記載されている。皮膚、皮下および結節性腫瘍の腫瘍内注射は、例えば、後期黒色腫についてＷＯ／２０１４／０３６４１２（Ａｍｇｅｎ）において記載されている。
単一の挿入ポイントまたは複数の挿入ポイントを経皮注射プロトコールにおいて使用することができる。単一の挿入ポイントを使用すると、針の放射状リーチが及ぶ限りにおいて、溶液を複数のトラックに沿って経皮注射することができる。他の実施形態では、腫瘍が、針の放射状リーチより大きい場合、複数の注射ポイントを使用することができる。総用量が注射および分散されるまで必要な頻度で、針を抜き出さずに引き戻して向け直すことができる。滅菌性を維持するために、注射毎に別々の針が使用される。針のサイズおよび長さは、腫瘍の型およびサイズに応じて変動する。
一部の実施形態では、腫瘍は、１８ゲージ多叉針（Ｑｕａｄｒａ−Ｆｕｓｅ、Ｒｅｘ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて経皮注射される。デバイスは、１８ゲージ穿刺針、２０ｃｍの長さからなる。針は、４個の末端側孔およびコネクタと延長チューブクランプをそれぞれ備える格納式３叉を有する。叉は、針の外側壁から展開される。針は、腫瘍の中心へと経皮導入し、腫瘍の最深縁に位置決めすることができる。叉は、腫瘍の縁へと展開される。叉は、最大の長さで展開され、次いで、規定の間隔で格納される。必要に応じて、１回または複数の回転−注射−回転手技を行うことができ、その際、叉が格納され、針が６０度回転し、続いて、叉の反復展開および追加的な注射がなされる。
治療的超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）は、ある特定の他の腫瘍へのアクセスを得る際に固有の解剖学的制約を克服するために用いられる（Shirleyら、２０１３年）。ＥＵＳガイドされた細針注射（ＥＵＳ−ＦＮＩ）は、頭頸部、食道、膵、肝および副腎腫瘤の処置のための抗腫瘍療法の使用に成功した（Vernaら、２００８年）。ＥＵＳ−ＦＮＩは、膵がん注射のために広範に使用された。細針注射は、曲線エコー（ｅｃｈｏ）内視鏡の使用を要求する。食道に注意深く挿管され、エコー内視鏡が、胃および十二指腸へと通過し、そこで膵検査が行われ、標的腫瘍が同定される。最も大きい平面が測定され、腫瘍体積を推定し、注射体積を計算する。適切な体積がシリンジ内に引かれる。準備の整った２２ゲージ細針吸引（ＦＮＡ）針が、エコー内視鏡のワーキングチャネルへと通過する。超音波ガイダンス下で、針は、腫瘍へと通過する。腫瘍のサイズに応じて、投与は、腫瘍をセクションへと分け、次いで体積の対応する画分を各セクションへと注射することにより行うことができる。ドプラ技術によるインストールされた内視鏡超音波プロセッサの使用は、腫瘍への針通過に干渉し得る動脈または静脈構造がないことを保証する（Shirleyら、２０１３年）。一部の実施形態では、ＥＵＳ−ＦＮＩのための「複数注射用針」（ＭＩＮ）を使用して、ストレート型の針と比較して、腫瘍への注射分布を改善することができる（Oharaら、２０１３年）。
非小細胞肺がんなど、肺がんのための腫瘍内投与は、Celikogluら、２００８年に記載されている通り、気管支内腫瘍内送達方法により達成することができる。気管支鏡検査（経鼻または経口）は、処置されるべき病変を可視化するために遂行される。腫瘍体積は、気管支表面にわたる目に見える長さ−幅高さ測定値から視覚的に推定することができる。次に、気管支鏡のワーキングチャネルを通して針デバイスが導入される。プラスチックカテーテルに取り付けられた金属性の針からなる針カテーテルは、前進の際にワーキングチャネルへの針による損傷を防止するためにシース内に配置される。針のサイズおよび長さは変動し、腫瘍の腫瘍型およびサイズにより決定される。プラスチック製の針は、金属針より硬くなく、ワーキングチャネルにおけるより鋭角な屈曲の辺りを通過し得るため理想的である。針が病変内に挿入され、本発明の遺伝子操作された細菌が注射される。腫瘍塊が完全に灌流されるまで、針は、いくつかの挿入ポイントに反復的に挿入される。各注射後に、針は、腫瘍から完全に引き抜かれ、次いで、別の場所に埋伏される。気管支鏡注射セッションの終わりに、処置に起因するいずれかの壊死性デブリの除去は、機械的解剖、または灌注および吸引を伴う他のアブレーション技法を使用して除去することができる。
一部の実施形態では、標的腫瘍に免疫モジュレーターを送達することができる遺伝子操作された細菌またはウイルスは、経皮注射、ＥＵＳ−ＦＮＩまたは気管支内腫瘍内送達方法が挙げられるがこれらに限定されない方法を使用して腫瘍へと直接的に投与される。一部の事例では、腹腔鏡または外科的切開技法など、他の技法が、標的腫瘍のアクセスに使用されるが、これらの技法は、はるかにより侵襲的であり、はるかにより重い病的状態およびより長い入院をもたらす。
一部の実施形態では、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅまたは胞子、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴは、全身性または腫瘍内注射のために滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解される。
注射されるべき用量は、腫瘍の型およびサイズに由来する。薬物または本発明の遺伝子操作された細菌もしくはウイルスの用量は典型的に、全身性静脈内投与のための用量より低い、例えば、数桁低い。
各病変へと注射される体積は、腫瘍のサイズに基づく。腫瘍体積を得るために、最も大きい平面の測定を遂行することができる。次に、推定される腫瘍体積は、総体積のパーセンテージとして注射体積の決定を通知することができる。例えば、総腫瘍体積のおよそ２０〜４０％の注射体積を使用することができる。
例えば、ＷＯ／２０１４／０３６４１２（Ａｍｇｅｎ）に例えば記載されているように、その最も大きい寸法が５ｃｍより大きい腫瘍に対して、最大４ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５〜５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が２．５〜５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大２ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が１．５〜２．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大１ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５〜１．５ｃｍの間の腫瘍に対して、最大０．５ｍｌを注射することができる。その最も大きい寸法が０．５に等しいまたはそれより小さい腫瘍に対して、最大０．１ｍｌを注射することができる。その代わりに、超音波スキャンを使用して、周囲の組織へと漏出することなく腫瘍によって取り込まれ得る注射体積を決定することができる。
一部の実施形態では、処置レジメンは、１回または複数の腫瘍内投与を含むであろう。一部の実施形態では、処置レジメンは、初回用量と、それに続く少なくとも１回のその後の用量を含むであろう。１回または複数回の用量は、２つまたはそれより多いサイクルで逐次投与することができる。
例えば、第１の用量は、１日目に投与することができ、第２の用量は、１、２、３、４、５、６日または１、２、３もしくは４週間後に、またはより長い間隔の後に投与することができる。追加的な用量は、１、２、３、４、５、６日後にまたは１、２、３もしくは４週間後に、またはより長い間隔の後に投与することができる。一部の実施形態では、第１およびその後の投与は、同じ投薬量を有する。他の実施形態では、異なる用量が投与される。一部の実施形態では、１日に２回以上の用量が投与される、例えば、１日に２、３回またはそれより多い用量を投与することができる。
記載されている投与経路および投薬量は、単なるガイドとして意図される。最適な投与経路および投薬量は、当業者であれば直ちに決定することができる。投薬量は、様々なパラメーターに従って、特に、腫瘍の場所、腫瘍のサイズ、処置されるべき患者の年齢、体重および状態、ならびに投与の経路および方法に従って決定することができる。
一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ胞子は、全身性に送達される。別の実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ胞子は、腫瘍内注射により送達される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、腫瘍内注射により送達される。他の実施形態では、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Daninoら、２０１５年またはStritzkerら、２００７年におけるマウスモデルにおいて記載されている通り、腫瘍に向かうことが公知のＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅは、静脈内注射によりまたは経口で投与される。毒性を低減させるＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ突然変異として、Stritzkerら、２０１０年（Stritzkerら、Bioengineered Bugs １巻：２号、１３９〜１４５頁；Myristylation negative msbB-mutants of probiotic E. coli Nissle 1917 retain tumor specific colonization properties but show less side effects in immunocompetent mice）に記載されている通り、非ミリストイル化ＬＰＳおよび低下されたエンドトキシン活性をもたらすｍｓｂＢ突然変異体が挙げられるがこれに限定されない。
静脈内注射のため、細菌の好ましい用量は、最大数の細菌が腫瘍に見出され、最低量が他の組織に見出される用量である。マウスにおいて、Ｓｔｒｉｔｚｋｅｒら（International Journal of Medical Microbiology ２９７巻（２００７年）１５１〜１６２頁；Tumor specific colonization, tissue distribution, and gene induction by Escherichia coli Nissle 1917 in live mice）は、腫瘍コロニー形成成功に必要とされる細菌の最低数が、２×１０４ＣＦＵであり、この場合、マウスの半分が、腫瘍コロニー形成を示したことを見出した。２×１０５および２×１０６ＣＦＵの注射は、全腫瘍のコロニー形成をもたらし、腫瘍における細菌の数が増加した。しかし、より高濃度では、細菌計数が、肝臓および脾臓において検出可能になった。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された微生物は、経口投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、肝臓がんまたは肝臓転移の予防、処置または管理において有用となり得る。例えば、Ｄａｎｉｎｏらは、経口投与されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅが、肝臓転移のマウスモデルにおける胃腸管にわたることにより、肝臓転移にコロニー形成することができることを示した（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Daninoら、Programmable probiotics for detection of cancer in urine. Science Translational Medicine、７巻（２８９号）：１〜１０頁）。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腫瘍内注射によって送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、胸膜内送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、皮下送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、静脈内送達される。一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、胸膜内送達される。
本発明の操作された細菌またはウイルスが腫瘍内送達される腫瘍型は、Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞リンパ腫、結腸および直腸がん、転移性黒色腫を含む黒色腫、菌状息肉症、メルケル癌、肝細胞癌および結腸直腸がんに続発する肝臓転移を含む肝臓がん、膵がん、乳がん、濾胞性リンパ腫、前立腺がん、不応性肝臓がん、ならびにメルケル細胞癌が挙げられるがこれらに限定されない、局所的に進行性および転移性の腫瘍を含む。
本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、局所的に投与することができ、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアロゾル剤、液剤、エマルション剤の形態または当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.、Easton, PA.を参照されたい。ある実施形態では、スプレー用ではない局所剤形のため、局所的適用と適合性の担体または１つもしくは複数の賦形剤を含み、水より大きい動的粘性を有する、粘稠性から半固体または固体形態が用いられる。適した製剤として、滅菌され得る、または様々な特性、例えば、浸透圧に影響を与えるために補助剤（例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩）と混合され得る、液剤、懸濁剤、エマルション剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬等が挙げられるがこれらに限定されない。他の適した局所剤形は、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フロン等のガス状噴霧剤）との混合物においてまたはスクイーズボトルにおいて包装された、スプレー用エアロゾル調製物を含む。保湿剤または保水剤が、医薬組成物および剤形に添加されてもよい。このような追加的な成分の例は、当該技術分野で周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生製品として製剤化することができる。例えば、衛生製品は、抗細菌製剤、または発酵ブロス等の発酵製品であってもよい。衛生製品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローションおよびリップクリームであってもよい。
本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、経口投与することができ、錠剤、丸剤、ドラジェ剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口使用のための薬理学的組成物は、固体賦形剤を使用し、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、所望に応じて適した補助物を添加した後に顆粒の混合物を加工して作製して、錠剤またはドラジェコアを得ることができる。適した賦形剤として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などのフィラー；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の生理学的に許容されるポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩等の崩壊剤が添加されてもよい。
錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリンおよびトラガント）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊物質（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、従来手段によって調製することができる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。コーティング殻が存在することができ、一般的な膜として、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ酸無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸塩−ポリリシン−アルギン酸塩（ＡＰＡ）、アルギン酸塩−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギン酸塩（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシ（hydroy）メチルアクリレート−メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層状ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、ケイ質カプセル被包、セルロースサルフェート／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、セルロースアセテートフタレート、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラゲナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラゲナン、デンプンポリ酸無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、腸または腸の特定の領域、例えば、大腸への放出のために腸溶的にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルは修飾され得る。一部の実施形態では、コーティングは、放出部位を指定するために、特異的ｐＨ環境において分解される。一部の実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。一部の実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のコーティング層（例えば、外側、内側および／または（o）中間コーティング層）において、腸溶コーティング材料を使用することができる。腸溶コーティングされたポリマーは、低ｐＨでは非イオン化を維持し、したがって、不溶性を維持する。しかし、胃腸管においてｐＨが増加するにつれて、酸性官能基は、イオン化が可能になり、ポリマーは膨張する、または腸液に可溶性になる。
腸溶コーティングに使用される材料は、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メチルメタクリレート）、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ポリ（ビニルアセテートフタレート）（ＰＶＡＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、脂肪酸、ワックス、Ｓｈｅｌｌａｃ（アロイリット酸（aleurtic acid）のエステル）、プラスチックおよび植物繊維を含む。その上、ゼイン、アクア−ゼイン（アルコールを含有しない水性ゼイン製剤）、アミロースデンプンおよびデンプン誘導体、ならびにデキストリン（例えば、マルトデキストリン）も使用される。他の公知の腸溶コーティングは、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アミロースアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレート、エチルアクリレートおよびメチルメタクリレートを含む。
コーティングポリマーは、フタレート誘導体、ＣＡＴ、ＨＰＭＣＡＳ、ポリアクリル酸誘導体、アクリル酸および少なくとも１種のアクリル酸エステルを含むコポリマー、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：２）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００（商標）Ｓ（ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）１：１）；Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ（商標）（ポリ（メタクリル酸、エチルアクリレート）１：１）；および（Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００−５５）（ポリ（メタクリル酸、エチルアクリレート）１：１）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｌは、メタクリル酸およびメタクリル酸メチルエステルから合成されるアニオン性ポリマーである）、アクリル酸およびアクリル酸エステルコポリマーとブレンドされたポリメチルメタクリレート、アルギン酸、アルギン酸アンモニア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウムもしくはアルギン酸カルシウム、ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルアセテート３０Ｄ（水における３０％分散）、ポリ（ジメチルアミノエチルアクリレート）を含む中性メタクリル酸エステル（“Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｅ（商標））、メチルメタクリレートおよびエチルアクリレートとトリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロライドのコポリマー、メチルメタクリレートおよびエチルアクリレートのコポリマー、ゼイン、ｓｈｅｌｌａｃ、ガムもしくは多糖、またはそれらの組合せのうち１つまたは複数を含むこともできる。
コーティング層は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ＨＭＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）（エツロース）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシメチルエチルセルロース（ＨＭＥＣ）、プロピルヒドロキシエチルセルロース（ＰＨＥＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、疎水性に修飾されたヒドロキシエチルセルロース（ＮＥＸＴＯＮ）、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、水溶性ビニルアセテートコポリマー、ガム、アルギン酸、およびアルギン酸アンモニア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどのアルギン酸など等の多糖、炭水化物の酸フタレート、アミロースアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースエステルフタレート、セルロースエーテルフタレート、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート（ＨＰＣＰ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロースフタレート（ＨＰＥＣＰ）、ヒドロキシプロピル（proply）メチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）を含有するポリマーを含むこともできる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腸または腸の特定の領域、例えば、大腸への放出のために腸溶的にコーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）および５．５〜６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルは修飾され得る。一部の実施形態では、コーティングは、放出部位を指定するために、特異的ｐＨ環境において分解される。一部の実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。一部の実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
経口投与のための液体調製物は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、または使用前の水もしくは他の適したビヒクルによる構成のための乾燥製品の形態をとることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水添食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存料（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いて、従来手段によって調製することができる。調製物は、適宜、緩衝剤の塩、調味剤、着色剤および甘味剤を含有することもできる。経口投与のための調製物は、本明細書に記載されている遺伝子操作された微生物の緩徐放出、制御放出または持続放出のために適切に製剤化することができる。
一実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、小児対象への投与に適した組成物において製剤化することができる。当該技術分野で周知の通り、子供は、異なる胃排出速度、ｐＨ、胃腸管透過性などを含む多くの側面において成人とは異なる（Ivanovskaら、Pediatrics、１３４巻（２号）：３６１〜３７２頁、２０１４年）。さらに、投与経路および味覚特質など、小児製剤の認容性および嗜好性は、許容される小児服薬遵守の達成に重要である。よって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、嚥下し易いもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料もしくは味覚遮断物が添加された組成物など、より口当たりが良い組成物を含むことができる。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、成人への投与に適する場合もある。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、液剤、シロッ剤プ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤もしくは液剤としての再構成のための散剤、分散性／発泡性錠剤、咀嚼錠剤、グミキャンディ、ロリポップ、フリーザーポップ（ｆｒｅｅｚｅｒ ｐｏｐ）、トローチ剤、チューインガム、経口の細長い条片（ｔｈｉｎ ｓｔｒｉｐ）、経口で崩壊する錠剤、サシェ剤、軟ゼラチンカプセル剤、振りかけ用（ｓｐｒｉｎｋｌｅ）経口散剤、または粒剤を含むことができる。一実施形態では、組成物は、キャンディに弾性、所望の腰の強い稠度およびより長い有効期間を与えるゼラチン基剤から作られた、グミキャンディである。一部の実施形態では、グミキャンディは、甘味料または香味料を含むこともできる。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、香味料を含むことができる。本明細書で使用される場合、「香味料」は、製剤に別個の味覚および芳香をもたらす物質（液体または固体）である。香味料は、製剤の嗜好の改善にも役立つ。香味料として、ストロベリー、バニラ、レモン、グレープ、バブルガムおよびチェリーが挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。化合物は、硬もしくは軟殻ゼラチンカプセルに封入する、錠剤中に圧縮する、または対象の食事に直接的に組み込むこともできる。経口治療投与のため、化合物は、賦形剤と共に組み込み、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハその他の形態で使用することができる。非経口的投与以外によって化合物を投与するために、その不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングする、または化合物をそれと同時投与することが必要となり得る。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば、食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酸乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉乳、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子類、キャンディ、乳児食（乳児用ケーキなど）、栄養性食品、動物飼料または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品など、発酵食である。一実施形態では、発酵乳製品は、ヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキまたはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生きた細菌細胞を含有する調製物において組み合わされる。別の実施形態では、食品は、飲料である。一実施形態では、飲料は、フルーツジュースに基づく飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品は、ゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は、当該技術分野で周知である。例えば、これらそれぞれの内容全体が明確に参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．２０１５／０３５９８９４およびＵＳ２０１５／０２３８５４５を参照されたい。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルトまたはチーズなどの食品の中へと注射される、その上にスプレーされる、またはその上に振りかけられる。
一部の実施形態では、組成物は、腸溶的にコーティングされているまたはコーティングされていない、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤またはマイクロ錠剤による、小腸内（ｉｎｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）投与、空腸内（ｉｎｔｒａｊｅｊｕｎａｌ）投与、十二指腸内投与、回腸内（ｉｎｔｒａｉｌｅａｌ）投与、胃シャント投与または結腸内投与のために製剤化される。医薬組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸などの直腸組成物において製剤化することもできる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁剤、液剤またはエマルション剤となることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有することができる。
本明細書に記載されている遺伝子操作された微生物は、鼻腔内投与することができ、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または液滴の形態で製剤化することができ、適した噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガス）の使用による、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達することができる。加圧エアロゾル投薬量単位は、計量した量を送達するバルブの設置により決定することができる。インヘラーまたは吸入器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化することができる。
遺伝子操作された微生物は、デポー調製物として投与および製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、植え込みによって、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射もしくは注入を含む注射によって投与することができる。例えば、組成物は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
一部の実施形態では、単一の剤形における薬学的に許容される組成物が本明細書に開示されている。単一の剤形は、液体または固体形態のものとなることができる。単一の剤形は、修飾することなく患者に直接的に投与することができる、または投与に先立ち希釈もしくは再構成することができる。ある特定の実施形態では、単一の剤形は、ボーラス形態で、例えば、単一の注射で、複数の錠剤、カプセル剤、丸剤などを含む経口用量を含む単一の経口用量で投与することができる。代替実施形態では、単一の剤形は、例えば、注入によって、ある期間にわたって投与することができる。
医薬組成物の単一の剤形は、腸溶的にコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい、錠剤、粒状、ナノ粒子、ナノカプセル剤、マイクロカプセル剤、マイクロ錠剤、ペレット剤または散剤など、より小さいアリコート、単一用量容器、単一用量液体形態または単一用量固体形態へと、医薬組成物を分割することにより調製することができる。固体形態における単一用量は、患者への投与に先立ち液体、典型的には滅菌水または生理食塩水溶液を添加することにより再構成することができる。
他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムにおいて送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御または持続放出を達成することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療法の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例として、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられるがこれらに限定されない。持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な（ｌｅａｃｈａｂｌｅ）不純物を含まず、貯蔵下で安定し、滅菌され、生分解性となることができる。一部の実施形態では、制御または持続放出システムは、予防または治療標的に近接して配置することができ、よって、全身性用量の僅かな一部分のみを要求する。当業者に公知のいかなる適した技法を使用してもよい。
投薬量レジメンは、治療応答をもたらすように調整することができる。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、処置の時間的経過（数日間〜数カ月間〜数年間）、ならびに疾患寛解までの時間を含むいくつかの因子に依存し得る。例えば、単一のボーラスを一度に投与することができる、いくつかの分割用量を所定の期間にわたって投与することができる、または治療状況によって示される通りに用量を低減もしくは増加させることができる。投薬量の仕様は、活性化合物の特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果によって指示される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度と共に変動し得る。いずれか特定の対象に対して、個々の必要および処置担当の臨床医の専門的判断に従って、特異的な投薬量レジメンを経時的に調整することができる。本明細書に提供される化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおいて標準医薬品手順によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０およびＩＣ５０を決定することができ、毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）を治療指数として計算することができる。毒性副作用を示す組成物は、潜在的損傷を最小化して副作用を低減させるための慎重な修飾により使用することができる。投薬は、細胞培養アッセイおよび動物モデルから初期に推定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。
成分は、例えば、活性薬剤の含量を示すアンプルまたはサシェなど、密閉シールされた容器における乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々に、または単位剤形において一緒に混合して供給される。投与機序が、注射によるものである場合、投与に先立ち成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は、薬剤の含量を示すアンプルまたはサシェなど、密閉シールされた容器内に包装することができる。一実施形態では、医薬組成物の１つまたは複数は、密閉シールされた容器内に乾燥し滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与に適切な濃度に再構成（例えば、水または生理食塩水で）され得る。ある実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の１つまたは複数は、２℃〜８℃の間で貯蔵され、再構成後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内または１週間以内に投与される、密閉シールされた容器内に乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥剤形のために凍結保護物質、主に０〜１０％スクロース（最適には０．５〜１．０％）が含まれていてよい。他の適した凍結保護物質は、トレハロースおよびラクトースを含む。他の適した増量剤は、グリシンおよびアルギニンを含み、そのいずれかは、０〜０．０５％の濃度で含まれ得、ポリソルベート−８０（最適には、０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）も含まれ得る。追加的な界面活性物質として、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性物質が挙げられるがこれらに限定されない。医薬組成物は、注射用溶液として調製することができ、吸収または分散の増加に使用される薬剤、例えば、ヒアルロニダーゼなど、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物およびその組成物は、静脈内投与、腫瘍内投与または腫瘍周囲投与のために製剤化される。遺伝子操作された微生物は、デポー調製物として製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、植え込みまたは注射によって投与することができる。例えば、組成物は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂により、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）として製剤化することができる。
一部の実施形態では、遺伝子操作されたＯＶは、効率的送達および宿主抗ウイルス免疫応答の克服の必要を考慮に入れて、送達のために調製される。抗ウイルス応答を逃れるためのアプローチは、処置レジメンの一部としての異なるウイルス血清型の投与（血清型スイッチング）、抗体認識からウイルスをマスクするためのポリマーコーティングなどの製剤、および送達ビヒクルとしての細胞の使用を含む。
別の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムにおいて送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して、制御または持続放出を達成することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療法の制御または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例として、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられるがこれらに限定されない。持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、貯蔵下で安定し、滅菌され、生分解性となることができる。一部の実施形態では、制御または持続放出システムは、予防または治療標的に近接して配置することができ、よって、全身性用量の僅かな一部分のみを要求する。当業者に公知のいかなる適した技法を使用してもよい。
本発明の遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩など、アニオンにより形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩など、カチオンにより形成される塩を含む。
処置方法
本発明の別の態様は、がんを処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、がんに関連する１つまたは複数の症状を低減、寛解または排除するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記がんが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される。一部の実施形態では、それらに関連する症状として、貧血、食欲不振、膀胱裏層の刺激作用、出血および内出血（血小板減少症）、味覚もしくは嗅覚の変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、毛髪脱落（脱毛症）、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、う歯、尿路感染症、および／または記憶および集中に関する問題が挙げられるがこれらに限定されない。
本方法は、本明細書に記載されている細菌の少なくとも１つの遺伝子操作された種、株またはサブタイプにより医薬組成物を調製するステップと、この医薬組成物を対象に治療有効量で投与するステップとを含むことができる。遺伝子操作された微生物は、組織もしくは供給を担う血管へと局所に、例えば、腫瘍内もしくは腫瘍周囲に、または全身性に、例えば、注入もしくは注射により静脈内に投与することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、経口または局所的に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、静脈内に、すなわち、全身性に投与される。
ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、対象における細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を低減させる。一部の実施形態では、本開示の方法は、細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を、無処置または対照の対象におけるレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく低減させることができる。一部の実施形態では、低減は、医薬組成物の投与前および後に、対象における細胞増殖、腫瘍成長および／または腫瘍体積を比較することにより測定される。一部の実施形態では、対象におけるがんを処置または寛解する方法は、がんの１つまたは複数の症状を、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより大きく改善させる。
医薬組成物の投与の前、その最中およびその後に、血液、血清、血漿、尿、腹水、および／または組織もしくは臓器由来の生検などの生体試料において、対象におけるがん性細胞および／またはバイオマーカーを測定することができる。一部の実施形態では、本方法は、対象における腫瘍体積を、検出不能サイズまで、または処置に先立つ対象の腫瘍体積の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％未満まで低減させるための、本発明の組成物の投与を含むことができる。他の実施形態では、本方法は、対象における細胞増殖速度または腫瘍成長速度を、検出不能速度まで、または処置に先立つ速度の約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％もしくは９０％未満まで低減させるための、本発明の組成物の投与を含むことができる。
免疫に基づく抗がん分子を発現する遺伝子操作された微生物に対して、応答パターンは、伝統的細胞傷害性療法に対するものとは異なる場合がある。例えば、免疫に基づく治療法で処置された腫瘍は、これが退縮する前に拡大し得る、および／または新たな病変が出現し得る（Agarwalaら、２０１５年）。腫瘍サイズ増加は、腫瘍組織には通常存在しないリンパ球およびマクロファージによる重度の浸潤が原因となり得る。その上、応答時間は、標準療法、例えば、細胞傷害性療法に関連する応答時間より遅くなる場合がある。一部の実施形態では、抗がん分子の送達は、腫瘍の体積および／またはサイズを一時的に増加させるが、対象の腫瘍の成長をモジュレートするおよび／またはがんの症状を寛解することができる。
遺伝子操作された細菌は、例えば、投与の数時間または数日後に、組織もしくは血清における防御因子によって（Sonnenbornら、２００９年）、またはキルスイッチの活性化によって破壊され得る。よって、抗がん分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与することができる。代替実施形態では、遺伝子操作された細菌は、投与後数時間または数日以内に破壊されず、腫瘍において繁殖し、腫瘍にコロニー形成することができる。
医薬組成物は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる治療剤、例えば、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知の、例えば、化学療法薬もしくはチェックポイントインヒビターと組み合わせて投与することができる。１つまたは複数のさらなる治療剤の選択における重要な考慮は、薬剤が、本発明の遺伝子操作された細菌と適合性となるべきであり、例えば、薬剤が、細菌を死滅させてはならないことである。一部の研究では、抗がん免疫療法、例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１インヒビターの有効性は、マイクロバイオームにおける特定の細菌株の存在を要求する（Ildaら、２０１３年；Vetizouら、２０１５年；Sivanら、２０１５年）。一部の実施形態では、細菌を含む医薬組成物は、チェックポイントインヒビターまたは化学療法剤の効果を増大させ、例えば、全身性に投与される化学療法または免疫療法剤の用量の低下を可能にする。一部の実施形態では、医薬組成物は、１種もしくは複数の共生またはプロバイオティクス細菌、例えば、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓと共に投与される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５−フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）およびＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）から選択される１つまたは複数の化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ゲムシタビン（ジェムザール）による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、シクロホスファミドによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、代謝物の産生または消費のための酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、１つまたは複数の化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤は、全身性に投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤および細菌は、全身性に投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者、キヌレニン消費者、アルギニン生産者は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、免疫活性化およびプライミングのためのエフェクターの産生のための遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、化学療法剤は、全身性に投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、化学療法剤および細菌は、全身性に投与される。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたは他のＳＴＩＮＧアゴニスト産生酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、化学療法剤による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、ジアデニル酸シクラーゼまたはＳＴＩＮＧアゴニストの生成のための他の酵素を発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のための記載されているシトシンデアミナーゼのうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、化学療法剤投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、化学療法剤は、シクロホスファミドである。
一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、５−ＦＣから５−ＦＵへの変換のためのシトシンデアミナーゼを発現する遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のアデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、細胞外環境への抗ＣＤ４０抗体の産生および分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。別の非限定的な例では、表面提示のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。別の非限定的な例では、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（分泌または表面提示のための）を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧのうち１つまたは複数を含む。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（表面提示または分泌のための）と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、本明細書に記載されている１つまたは複数の化学療法試薬による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素のうち１つもしくは複数をコードする遺伝子配列またはヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列または表面提示もしくは分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の化学療法試薬と組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。一実施形態では、１つまたは複数のアデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、または本明細書に記載されている１つもしくは複数の化学療法試薬と組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の化学療法試薬は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
遺伝子操作された細菌が化学療法剤と組み合わされる、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のアデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＣのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるアデノシン消費のための酵素は、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢおよびｘｄｈＣおよびｎｕｐＧのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、分泌のためまたは表面提示のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。
一部の実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。これらの実施形態のいずれかでは、ゲムシタビンは、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、表面提示または分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素（複数可）をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列（を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。これらの実施形態のいずれかでは、ゲムシタビンは、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための酵素をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列と組み合わせて、表面提示または分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、ゲムシタビンによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列または表面提示もしくは分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列または表面提示もしくは分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。一実施形態では、アデノシン分解酵素をコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のためのヒアルロニダーゼをコードする遺伝子配列および表面提示または分泌のための抗ＣＤ４０抗体をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、単独で、またはゲムシタビンと組み合わせて、膵管腺癌の処置、管理または予防のために投与される。これらの実施形態のいずれかでは、ゲムシタビンは、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数の細菌は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
遺伝子操作された細菌がゲムシタビンと組み合わされる、一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同時投与された化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、または本明細書に記載されているもしくは当該技術分野で公知の別の薬剤）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、１つもしくは複数のチェックポイントインヒビター、または当該技術分野で公知のもしくは本明細書に記載されている他の抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。免疫チェックポイントインヒビターの非限定的な例として、ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブおよびトレメリムマブ（ＣＰ６７５２０６）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）抗体（ＰＦ−０５０８２５６６およびウレルマブが挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＯＸ４０抗体（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）が挙げられるがこれに限定されない抗ＣＤ１３４（ＯＸ４０）抗体、抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブ、ピディリズマブ、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５／ＳＣＨ９００４７５）、ランブロリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤ−１（Ａｇｅｎｕｓ）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）およびアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６、ＲＯ５５４１２６７）が挙げられるがこれらに限定されない）、および抗ＫＩＲ抗体（リリルマブが挙げられるがこれに限定されない）、ＬＡＧ３抗体（ＢＭＳ−９８６０１６が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＣＲ４抗体（モガムリズマブが挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ２７抗体（バルリルマブが挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＣＸＣＲ４抗体（ウロクプルマブが挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。一部の実施形態では、少なくとも１種の細菌細胞は、抗ホスファチジルセリン抗体（バビツクスマブが挙げられるがこれに限定されない）による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、少なくとも１種の細菌細胞は、ＴＬＲ９抗体（ＭＧＮ１７０３が挙げられるがこれに限定されない）、ＰＤ−１抗体（ＳＨＲ−１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ／Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＯＸ４０抗体（ＯＸ４０（Ａｇｅｎｕｓ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｔｉｍ３抗体（抗Ｔｉｍ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｌａｇ３抗体（抗Ｌａｇ３（Ａｇｅｎｕｓ／ＩＮｃｙｔｅ）が挙げられるがこれに限定されない）、抗Ｂ７Ｈ３抗体（エノブリツズマブ（ＭＧＡ−２７１）、ＷＯ２００９１０１６１１に記載されている抗ＣＴ−０１１（ｈＢＡＴ、ｈＢＡＴ１）が挙げられるがこれらに限定されない）、抗ＰＤＬ−２抗体（ＡＭＰ−２２４（ＷＯ２０１００２７８２７およびＷＯ２０１１０６６３４２に記載）が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ４０抗体（ＣＰ−８７０、８９３が挙げられるがこれに限定されない）、抗ＣＤ４０抗体（ＣＰ−８７０、８９３が挙げられるがこれに限定されない）から選択される１つまたは複数の抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、代謝物の産生または消費のための酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、１つまたは複数のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターは、全身投与され、細菌は、腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターおよび細菌は、全身投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、抗ＣＴＬＡ−４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、代謝変換因子をコードする遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌、例えば、キヌレニンもしくはアデノシン消費者またはアルギニン生産者は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ−１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アデノシンの分解のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの消費のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニンの産生のための記載されている回路のうちいずれか１つまたは複数を発現する遺伝子操作された細菌は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者および／またはキヌレニン消費者および／またはアルギニン生産者は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下でのチェックポイントインヒビター療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者および／またはキヌレニン消費者および／またはアルギニン生産者は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌、例えば、アデノシン消費者および／またはキヌレニン消費者および／またはアルギニン生産者は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下でのチェックポイントインヒビター療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、アデノシンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下でのチェックポイントインヒビター療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、キヌレニンを消費するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、アルギニンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下でのチェックポイントインヒビター療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、１．０〜１．２倍、１．２〜１．４倍、１．４〜１．６倍、１．６〜１．８倍、１．８〜２倍もしくは２倍にまたはそれより大きく改善することができる。一部の実施形態では、アルギニンを産生するように遺伝子操作された細菌は、同時投与されたチェックポイントインヒビター（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４）の抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖、サイズ、体積、重量）を、例えば、同じ条件下での化学療法単独と比較して、または同じ条件下での同じサブタイプの無修飾細菌と比較して、約３倍、４倍、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍にまたはそれより大きく改善することができる。
一部の実施形態では、表面提示のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、表面提示のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニン産生増加のための本明細書に記載されている遺伝子回路網（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、抗体は、ニボルマブである。一部の実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブ（prembrolizumab）である。このような抗ＰＤ−１抗体の他の非限定的な例は、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、分泌のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、表面提示のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニン産生増加のための本明細書に記載されている遺伝子回路網を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、抗体は、ニボルマブである。一部の実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブである。このような抗ＰＤ−１抗体の他の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアルギニン産生増加のための遺伝子回路網と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アルギニンの産生および抗ＣＤ４７の分泌のための回路網を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブまたはペムブロリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、進行性固形腫瘍の処置、管理および予防に使用される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、経口投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、全身投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、抗ＰＤ−１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択することができる。一部の実施形態では、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を縮小または抹消するように、欠失、突然変異または修飾される。一部の実施形態では、細菌は、フィードバック抵抗性ａｒｇＡをコードする遺伝子をさらに含む。
一部の実施形態では、分泌のための可溶性形態のＳＩＲＰアルファをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、分泌のための可溶性形態のＳＩＲＰアルファをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニン産生増加のための本明細書に記載されている遺伝子回路網を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、抗体は、ニボルマブである。一部の実施形態では、抗体は、ペムブロリズマブである。このような抗ＰＤ−１抗体の他の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアルギニン産生増加のための遺伝子回路網と組み合わせて、分泌のための可溶性形態のＳＩＲＰアルファをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アルギニンの産生および可溶性形態のＳＩＲＰアルファの分泌のための回路網を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、進行性固形腫瘍の処置、管理および予防に使用される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、経口投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、全身投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、抗ＰＤ−１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子は、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡおよびｃａｒＢから選択することができる。一部の実施形態では、アルギニンリプレッサー（ａｒｇＲ）は、そのリプレッサー機能を縮小または抹消するように、欠失、突然変異または修飾される。一部の実施形態では、細菌は、フィードバック抵抗性ａｒｇＡをコードする遺伝子をさらに含む。
一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素および必要に応じてトリプトファンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素および必要に応じてトリプトファンの産生のための回路網をコードする遺伝子配列と組み合わせて、分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、ペムブロリズマブおよびニボルマブが挙げられるがこれらに限定されない。これらの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、結腸直腸癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインも産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むレジメンは、結腸直腸癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、肝細胞癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインを産生する１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、肝細胞癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、進行性黒色腫の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインを分泌する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むレジメンは、免疫療法不応性進行性黒色腫の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して腫瘍内である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して全身性である。
一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のためのＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のためのＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための）１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、ペムブロリズマブおよびニボルマブを含む。これらの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくは分泌のためのＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、結腸直腸癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、ＩＬ−１５も産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むレジメンは、結腸直腸癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくはＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、肝細胞癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、分泌のためのＩＬ−１５を産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、肝細胞癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくは分泌のためのＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−１抗体の投与と組み合わせて、進行性黒色腫の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、ＩＬ−１５を分泌する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペムブロリズマブと組み合わせて含むレジメンは、免疫療法不応性進行性黒色腫の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して腫瘍内である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して全身性である。
一部の実施形態では、分泌のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、分泌のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、表面提示のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、アルギニン産生増加のための本明細書に記載されている遺伝子回路網を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、抗体は、デュルバルマブである。一部の実施形態では、抗体は、アベルマブである。一部の実施形態では、抗体は、アテゾリズマブである。このような抗ＰＤ−Ｌ１抗体の他の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアルギニン産生増加のための遺伝子回路網と組み合わせて、表面提示または分泌のための抗ＣＤ４７抗体をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一実施形態では、アルギニンの産生および抗ＣＤ４７の分泌のための回路網を含む、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、進行性固形腫瘍の処置、管理および予防に使用される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、経口投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、全身投与される。一部の実施形態では、進行性固形腫瘍の処置のための遺伝子操作された細菌は、腫瘍内に投与される。これらの実施形態のいずれかでは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。
一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ−４が挙げられるがこれらに限定されない、本明細書に記載されている当該技術分野で公知のチェックポイントインヒビターによる投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解および必要に応じてトリプトファンの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、キヌレニンの分解および必要に応じてトリプトファンの産生のための１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインをコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、デュルバルマブ、アベルマブまたはアテゾリズマブが挙げられるがこれらに限定されない。これらの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、結腸直腸癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインも産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むレジメンは、結腸直腸癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、肝細胞癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、分泌のための本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインを産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、肝細胞癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）または本明細書に記載されている１つもしくは複数のサイトカインのいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、進行性黒色腫の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、本明細書に記載されている１つまたは複数のサイトカインを分泌する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むレジメンは、免疫療法不応性進行性黒色腫の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して腫瘍内である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して全身性である。
一部の実施形態では、細胞外環境への分泌のためのＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための）１つまたは複数の酵素をコードする遺伝子配列と組み合わせて、ＩＬ−１５をコードする遺伝子配列を含む、本明細書に記載されている１つまたは複数の操作された細菌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による投薬と逐次に、それと同時にまたはその後に投与される。このような抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、デュルバルマブ、アベルマブおよびアテゾリズマブを含む。これらの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、全身性にまたは経口的にまたは腫瘍内に投与される。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくは分泌のためのＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、結腸直腸癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、ＩＬ−１５も産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むレジメンは、結腸直腸癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、結腸直腸癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくはＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、肝細胞癌の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、分泌のためのＩＬ−１５を産生する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むこのようなレジメンは、肝細胞癌の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して全身性である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、肝細胞癌の処置に対して腫瘍内である。一部の実施形態では、キヌレニンの分解のための酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）もしくは分泌のためのＩＬ−１５のいずれか、またはその両方をコードする遺伝子配列を含む１つまたは複数の遺伝子操作された細菌は、ＰＤ−Ｌ１抗体の投与と組み合わせて、進行性黒色腫の処置に使用することができる。一実施形態では、キヌレニンの分解のための１つまたは複数の酵素（および必要に応じて、トリプトファンの産生のための回路網を含む遺伝子配列）を産生し、ＩＬ−１５を分泌する、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌を、単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、デュルバルマブ、アベルマブもしくはアテゾリズマブと組み合わせて含むレジメンは、免疫療法不応性進行性黒色腫の処置、管理および予防に使用される。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して経口である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して腫瘍内である。一実施形態では、１つまたは複数の遺伝子操作された細菌の投与は、進行性黒色腫の処置に対して全身性である。
一部の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、他の処置モダリティまたは他のモダリティの組合せを含むレジメンの一部として投与することができる。そのようなモダリティまたは薬剤の非限定的な例は、従来の治療法（例えば、放射線療法、化学療法）、他の免疫療法、幹細胞療法および標的化療法（例えば、ＢＲＡＦまたは血管内皮増殖因子インヒビター；抗体または化合物）、本明細書に記載されている細菌、ならびに腫瘍溶解性ウイルスである。治療法は、Ｆｃ媒介性ＡＤＣＣ療法、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結する二特異性可溶性ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ）、およびエフェクター機能を有する可溶性ＴＣＲを使用した治療法を含む抗体−免疫係合関連も含む。免疫療法は、ワクチン（例えば、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、ネオ抗原またはそれらの組合せ）、チェックポイントインヒビター、サイトカイン療法、養子細胞療法（ＡＣＴ）を含む。ＡＣＴとして、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、ネイティブまたは操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ−Ｔ療法、ナチュラルキラー細胞療法、および樹状細胞ワクチン、または他の抗原提示細胞の他のワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。標的化療法は、抗体および化合物を含み、例えば、血管新生抑制戦略およびＢＲＡＦ阻害を含む。
細菌ＤＮＡの免疫賦活活性は、非メチル化ＣｐＧモチーフを発現する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって模倣される。Bodeら、Expert Rev Vaccines.、２０１１年４月；１０巻（４号）：４９９〜５１１頁、CpG DNA as a vaccine adjuvant。ワクチンアジュバントとして使用されると、ＣｐＧ ＯＤＮは、プロフェッショナル抗原提示細胞の機能を改善し、液性および細胞性ワクチン特異的免疫応答の生成をブーストする。一部の実施形態では、ＣｐＧは、本発明の遺伝子操作された細菌と組み合わせて投与することができる。
一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、腫瘍細胞溶解物と組み合わせて投与される。
医薬組成物の投薬量および投与の頻度は、症状の重症度およびがんの進行に基づき選択することができる。適切な治療有効用量および投与の頻度は、処置担当の臨床医によって選択することができる。
Ｉｎ Ｖｉｖｏでの処置
遺伝子操作された細菌は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。がんに関連する疾患または状態のいずれか適した動物モデルを使用することができる、例えば、腫瘍同系または異種移植マウスモデル（例えば、Yuら、２０１５年を参照）。遺伝子操作された細菌は、全身性にまたは局所的に、例えば、経口投与（経管栄養）により、静脈内もしくは皮下注射によりまたは腫瘍内注射により動物に投与することができ、例えば、腫瘍体積を測定することにより、処置有効性を決定することができる。
動物モデルの非限定的な例として、Dangら、２００１年、Heapら、２０１４年およびDaninoら、２０１５年に記載されているマウスモデルが挙げられる。
前臨床マウスモデルは、いずれの免疫療法および併用免疫療法が、種々のがんにおいて最適な治療指数（最大の抗腫瘍有効性および最小の免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ））を生成するかを決定する。
マウス組織部位への様々なヒトがん細胞型に由来する培養細胞または患者の腫瘍塊の移植は、がんマウスモデル（異種移植モデリング）の生成に広く使用されてきた。異種移植モデリングにおいて、ヒト腫瘍または細胞系は、移植片拒絶を回避するために免疫低下宿主動物（例えば、ヌードまたはＳＣＩＤマウス）へと皮下または同所性のいずれかで植え込まれる。本来のヒト腫瘍微小環境は、このようなモデルにおいて再現されないため、免疫モジュレーターを標的とする抗がん剤の活性は、これらのモデルにおいて正確に測定されない可能性があり、インタクトな免疫系を有するマウスモデルをより望ましいものとする。
したがって、同系免疫適格性宿主におけるマウスがん細胞の移植（同種移植）が使用されて、所与のマウス系統（ｓｔｒａｉｎ）と同じ遺伝的背景に由来する腫瘍組織を有するマウスモデルを生成する。同系モデルにおいて、宿主免疫系は正常であり、このことは、腫瘍の微小環境の実際の生活状況をより密接に表すことができる。腫瘍細胞またはがん細胞系は、同系免疫適格性宿主動物（例えば、マウス）へと皮下または同所性のいずれかで移植される。免疫チェックポイントベンチマーク評価のための同系マウスモデルにおいて使用することができる代表的なマウス腫瘍細胞系として、表１８に収載されている細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
追加的な細胞系として、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Joseph F. GrossoおよびMaria N. Jure-Kunkelら、２０１３年においてＣＴＬＡ−４ベンチマーク評価に関して記載されている、表１９に挙げる細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
ある特定の細胞系に由来する腫瘍に関して、オボアルブミンを添加して、免疫応答をさらに刺激し、これにより、応答ベースラインレベルを増加させることができる。
同系マウスモデルにおいて使用することができるマウス系統の例として、Ｃ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ／Ｎ、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＨｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＮＯＤ／ＳｈｉＬＴ、Ａ／Ｊ、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ、ＮＯＤを含む細胞系に依存する。その上、いくつかのさらに遺伝子操作されたマウス系統は、分子および組織学的レベルの両方でヒト腫瘍発生を擬態することが報告された。これらの遺伝子操作されたマウスモデルも、本分野に優れたツールを提供し、その上、これらのモデルにおいて開発された侵襲的腫瘍に由来するがん細胞系も、同系腫瘍モデルのための細胞系の良好な資源である。遺伝子操作された系統の例を表２０に提示する。
ヒトタンパク質に対する抗体は、そのマウス対応物を検出しない場合がある。ヒト免疫チェックポイント分子に対する抗体を含む抗体の研究において、これを考慮に入れることが必要である。例えば、イピリムマブは、ラット、マウスまたはウサギ由来のＣＴＬＡ−４との交差反応性またはそれへの結合を示さなかった。
一部の事例では、目的の遺伝子に関してトランスジェニックのマウスを使用して、イピリムマブについて為されたように、この問題を克服することができる。しかし、ヒト導入遺伝子がない同系マウスモデルにおいては、マウスタンパク質反応性抗体が、治療抗体戦略の検査に使用される必要がある。例えば、目的の遺伝子操作された細菌による発現に適したＣＴＬＡ−４抗体として、９Ｈ１０、ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、９Ｄ９およびＫ４Ｇ４が挙げられるがこれらに限定されない（表３３）。
さらに最近では、免疫不全マウスがヒト免疫系により再構成された、マウスとヒト免疫系との間の差に関する問題の克服に役立ち、ヒト免疫のｉｎ ｖｉｖｏ研究を可能にした、「ヒト化」マウスモデルが開発された。ＩＬ２受容体ヌルおよび重症の組み合わせた免疫欠乏性突然変異（ｓｃｉｄ）を組み合わせる、重症の免疫不全なマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇヌルマウス）は、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞または機能的ＮＫ細胞を欠き、サイトカインシグナル伝達を欠乏する。このようなマウスは、ヒト造血幹細胞および末梢血単核細胞を生着することができる。ＣＤ３４＋造血幹細胞（ｈｕ−ＣＤ３４）が免疫欠乏性マウスに注射され、長期研究において非常に良好なＴ細胞成熟および機能を含むヒト免疫細胞集団の多系列生着をもたらす。このモデルは、１２カ月間の研究スパンを有し、機能的ヒト免疫系が、宿主に対するドナー細胞免疫反応性なしで、Ｔ細胞依存性炎症性応答を示す。患者由来異種移植は、これらのモデルにおいて直ちに移植することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ設定において研究される免疫モジュレーション剤の効果は、ヒト腫瘍微小環境をさらに反映する（免疫および非免疫細胞に基づく両方で）（Baiaら、２０１５年）。
ヒト化マウスモデルにおける使用のための目的のヒト細胞系として、ＨＣＴ−１１６およびＨＴ−２９結腸がん細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。
ラットＦ９８神経膠腫モデル、および自然発症イヌ腫瘍の有用性は、これらそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Robertsら、２０１４年に記載されている。ルシフェラーゼを発現するように操作されたＦ９８ラット神経膠腫細胞の移植によって生成される局所に侵襲的な腫瘍に、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子を腫瘍内注射したところ、発芽およびルシフェラーゼ活性急落をもたらした。Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ発芽は、この細菌の栄養型の出現によって実証された。これらの研究において、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴは、近隣細胞を温存しつつ、腫瘍へと正確に向かう。
例えば、イヌ軟部組織肉腫は、多くの品種において一般的であり、特に、遺伝的変更および突然変異のスペクトルの観点から、ヒトにおけるものと同様の臨床的、病理組織学的および遺伝的特色を有する（Robertsら、２０１４年；Staedtkeら、２０１５年）。Ｒｏｂｅｒｔｓらは、イヌにおける研究を遂行し、それによると、Ｃ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子は、１〜４処置サイクルにおいて、自然発症で起こる固形腫瘍に腫瘍内注射され（１×１０８個のＣ．ｎｏｖｙｉ−ＮＴ胞子）、９０日間追跡した。強力な炎症性応答が観察されており、腫瘍内注射が自然免疫応答を開始したことを示す。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子操作された微生物は、本明細書に記載されているモデルのいずれかへと全身性に、例えば、経口、皮下、静脈内または腫瘍内に投与されて、抗腫瘍有効性およびいずれかの処置関連の有害副作用をアセスメントする。
全引用
全引用、または本明細書を通して引用されている参考文献を次に挙げる：
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本明細書に提供する本開示は、以下の実施例に記載される配列番号のいずれかの配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同性を有する配列を提供する。
（実施例１）
抗がん分子
一本鎖抗ＣＴＬＡ−４抗体の構築に使用するための例示的な核酸配列は、例えば実施例１において、その内容のその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されている。一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、そのＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。なお別の実施形態では、遺伝子操作された細菌によって発現されるポリペプチドは、配列番号７６５、配列番号７６６、配列番号７６７、配列番号７６８、配列番号７６９、配列番号７７０、配列番号７７１、配列番号７７２、配列番号７７３、配列番号７７４、配列番号７７５、および／または配列番号７７６から選択される配列からなる。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、そのＤＮＡ配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同である核酸配列、または配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％相同であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸配列を含む。別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８から選択される配列を含む。別の実施形態では、遺伝子配列は、配列番号７７７、配列番号７７８、配列番号７７９、配列番号７８０、配列番号７８１、配列番号７８２、配列番号７８３、配列番号７８４、配列番号７８５、配列番号７８６、配列番号７８７、および／または配列番号７８８から選択される配列からなる。
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍薬物動態
腫瘍薬物動態をアッセイし、その内容の全体が参照により本明細書に、例えば実施例５８〜６１に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるように決定した。Ｎｉｓｓｌｅ（１ｅ７および１ｅ８個細胞／用量）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して７日にわたって決定した。腫瘍組織中の細菌数は、両方の用量で類似であった。血液中ではいずれの時点においても細菌は検出されなかった。
ストレプトマイシン抵抗性ＮｉｓｓｌｅおよびＮｉｓｓｌｅ ＤＯＭ変異体（ＮｉｓｓｌｅデルタＰＡＬ：：ＣｍＲ）の腫瘍薬物動態を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて比較した。腫瘍組織中の細菌数は両方の株において類似であった。血液中に細菌は検出されなかった。これらの結果は、野生型およびＤＯＭ変異体Ｎｉｓｓｌｅの両方が腫瘍環境において生存することができることを示している。
ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅの腫瘍内投与に対するｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン応答を、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して１ｅ６（群１）または１ｅ７個細胞／用量（群２）のいずれかでアセスメントした。表記の用量でマウスＣＴ−２４モデルにおいてＳＹＮ９４腫瘍内投与後の時間経過において、レベルを血清中および腫瘍中で測定した。結果は、サイトカイン応答が腫瘍において高用量で誘発されたが血清中では誘発されなかったことを示す。低用量は、実質的なサイトカイン応答を誘発しない。
様々な組織における腫瘍ＰＫ、細菌レベル、およびこれらの組織におけるサイトカインレベルを、ＩＴ投与（１ｅ７個細胞／用量）の４８時間後にアセスメントした。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に認められるように、細菌は、腫瘍に主に存在し、試験した他の組織には存在しなかった。測定したＴＮＦアルファレベルは、ＳＹＮ９４、食塩水処置およびナイーブ群の間で全ての血清、腫瘍、および肝臓において類似であった。ＴＮＦアルファレベルは、Ｎｉｓｓｌｅを、ＩＶを介して１ｅ８で投与した場合に１．５時間で測定されたＴＮＦアルファレベルと比較して無視できる程度である。しかし、ＩＶ投与によっても、ＴＮＦアルファレベルは４時間で検出不能レベルへと低下した。類似の低レベルのＴＮＦアルファが、ＳＹＮ９４の１ｅ６ ＩＶ用量で検出される。
（実施例３Ａ）
代謝物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量
細菌上清および腫瘍組織中のアデノシン、キヌレニン、トリプトファン、およびアルギニンの定量化を、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって実施した。
（実施例３Ｂ）
染色体挿入を使用する細菌株の操作
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムに構築物を組み込む方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される。
（実施例４）
アデノシン分解株の生成
アデノシン分解経路における３つのオペロンの概略図を図４Ａおよび４Ｂに示す。アデノシン消費株を生成するために、オペロンの各々１つ（またはｎｕｐＣの場合には単一の遺伝子）をＰｆｎｒＳプロモーターの制御下でＫＩＫＯベクターにクローニングした。ノックインＰＣＲ産物をＫＩＫＯベクターから作製し、アレル交換を行ってこれらのオペロンをＥ．ｃｏｌｉゲノムに組み込んだ。アレル交換は、本明細書に記載されるラムダｒｅｄリコンビナーゼ系を使用することにより容易となった。複数の株の組合せを生成し、表２１は、生成し、アデノシン分解アッセイにおいて比較した株を要約する。表２２は、構築物の各々に関して使用した組み込み部位を要約する。
（実施例５）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアデノシン分解の測定
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアデノシン消費
グルコースは、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましい炭素源である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉはまた、グルコースの非存在下では唯一の炭素源としてアデノシンも使用することができる。新たに生成された株がアデノシンを分解する能力をアセスメントするために、および好ましい炭素源であるグルコースの存在下であってもそのようにできるか否かをアセスメントするために。
これを達成するために、野生型対照を含む各株の一晩培養物を、ＬＢ中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１００ｍＬ）に逆希釈（ｂａｃｋ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、初期対数期まで１．５時間成長させた。培養物が初期対数期に達すると、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を嫌気的に４時間インキュベートし、操作されたアデノシン分解経路遺伝子を誘導させた。
培養物を嫌気的チャンバーから取り出し、アデノシン分解活性に関して試験した。これを達成するために、約１ｅ８個の活性化細菌細胞を１．５ｍＬ微量遠心管において遠心沈降させ、アデノシンアッセイ緩衝液（１０ｍＭアデノシンを含み、グルコースを含まないかまたは０．５％グルコースを含む１×Ｍ９最少培地（スライドを参照されたい））に再懸濁させた。管を３７℃で５時間静置してインキュベートし、上清試料を５時間の間、毎時間回収した。上清試料を、アデノシン濃度の決定のためにＬＣ−ＭＳを介して分析した。
結果を図３に示し、操作された全ての株が、野生型対照株より速い速度でアデノシンを分解（上清試料中にそれが存在しないことによって決定する）できることを示す。全ての株は、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましい炭素源であるグルコースが存在するか否かにかかわらず、アデノシンを分解することができた。
基質制限条件下でのＩｎ ｖｉｔｒｏ活性
これまでの試験では、基質は無限であった、すなわち株はＶｍａｘで機能することができた。そのような基質濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏで予想される濃度の大過剰量であった。次に、操作された細菌のアデノシン分解能を、より制限的な基質濃度（ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍中のアデノシン濃度により一貫する）およびより低用量（敗血症を引き起こしていないマウスにおいてＩＶまたはＩＴ投与することができる用量とより一貫する）でアセスメントした。
各株の一晩培養物をＬＢ中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７Ｃで成長させた。培養物を１：１００（１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中に１０ｍＬ）に逆希釈し、初期対数期まで１．５時間成長させた。培養物が初期対数期に達すると、培養物を、嫌気的雰囲気（８５％Ｎ２、１０％ＣＯ２、５％Ｈ２）を供給するＣｏｙ嫌気的チャンバーに移動させた。培養物を嫌気的に４時間インキュベートし、操作されたアデノシン分解経路遺伝子を誘導させた。
活性化細胞をｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒにおいて定量し、ＰＢＳ中で５ｅ８ ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。この懸濁液（５ｅ６個の細菌を含む）１０μＬを、Ｍ９最少培地、０．５％グルコース、および１００μＭアデノシンで構成されるアデノシンアッセイ緩衝液１ｍＬ中に再懸濁させた。細胞を、３７Ｃで静置してインキュベートした。上清試料を５時間の間、毎時間除去して、アデノシン分解速度を決定した。上清試料を、アデノシン濃度の決定のためにＬＣ−ＭＳを介して分析した。報告された分解速度は、試料採取の０から５時間の間の最大線形速度である（極めて低い基質（アデノシン）分解では速度は線形ではない場合があることから、これは後の時点を含まなくてもよい）。
結果を図５および６に示し、操作された株は全て、対照株ＳＹＮ０１の速度より速い速度でアデノシンを分解することができた（上清試料中にそれが存在しないことによって決定）ことを示している。ＳＹＮ１６５６は、アデノシン分解経路を含む３つ全ての組み込みを含む最も高度に操作された株であり、アデノシンを最高速度で分解することができ、アデノシンレベルは３時間で検出不能レベルとなった。
線形速度を表２３に示す。
（実施例６）
Ｉｎ ｖｉｖｏでのアデノシン消費株の効果
アデノシン消費株ＳＹＮ１６５６（ＰｆｎｒＳ−ｎｕｐＣ；ＰｆｎｒＳ−ｘｄｈＡＢＣ；ＰｆｎｒＳ−ａｄｄ−ｘａｐＡ−ｄｅｏＤを含む）のｉｎ ｖｉｖｏでの効果を、単独および抗ＰＤ１との組合せにおいてアセスメントした。
ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１ｅ６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
細胞を調製するために、ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ０９４）を、ＬＢブロス中で６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）となるまで成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。懸濁液をＰＢＳまたは食塩水中で希釈し、１００μＬを、腫瘍を有するマウスの腫瘍内に適切な用量で注射することができる。ＳＹＮ１６５６を調製するために、細胞をＬＢ（２Ｌ）中で１：１００に希釈し、好気的に１．５時間成長させた後、嫌気的チャンバーに４時間移動させた。投与前に、細胞を２００倍濃縮し、凍結した（ＰＢＳ中に１５％グリセロール、２ｇ／Ｌグルコース）。
ＣＴ２６移植のおよそ１０日後、１日目に細菌をＰＢＳ ０．１ｍｌに懸濁させて、マウスを秤量し、測定し、以下のような処置群に無作為化した：群１、食塩水注射（１００μｌ）（ｎ＝１４）；群２、ＳＹＮ９４ ＩＴ １０ｅ７（ｎ＝１４）；群３、ＳＹＮ１６５６ ＩＴ １０ｅ７（ｎ＝１４）；群４、ＳＹＮ１６５６ ＩＴ １０ｅ７＋ａＰＤ−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（ｎ＝１４）；群５、ａＰＤ−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ（ｎ＝９）。
１日目および４日目に、動物にその群分けに従って食塩水または株を腫瘍内に（ＩＴ）単独で、または抗ＰＤ１（Ｉ．Ｐ）と組み合わせて投与した。血漿をさらなる分析のために収集した。図５は、１、４、および７日目のマウスの腫瘍体積を示す。結果は、腫瘍体積が、食塩水処置対照と比較して７日目に３つ全ての処置群（ＳＹＮ１６５６、抗ＰＤ１、およびＳＹＮ１６５６＋抗ＰＤ１）において減少することを示している；腫瘍サイズは、ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１処置群において最小であり、次いでＳＹＮ１６５６単独および抗ＰＤ１単独であり、２つの処置の間に相乗効果が存在しうることを示しており、単剤としてのおよびａＰＤ−１との組合せにおけるアデノシン消費株の抗腫瘍活性を示唆している。腫瘍体積は、ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１によって処置した動物では食塩水単独より有意に低かった（ｐ＝０．０１）。ＳＹＮ１６５６および抗ＰＤ１によって処置した動物の腫瘍体積もまた、抗ＰＤ１単独によって処置した動物より有意に低かった。
他の試験では、動物がおよそ２０００ｍｍ３の腫瘍サイズに達するまで、本試験を、１０、１５、および１８日目での投与および分析を含めるように延長した。
（実施例７）
トリプトファン生合成のための構築物の合成
様々な構築物を合成し、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングする。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物をゲノムに組み込む。トリプトファン産生構築物配列の非制限的な例には、ｆｂｒＡｒｏＧ（ＲＢＳおよびリーダー領域を有する；配列番号８６８）、ｆｂｒＡｒｏＧ（配列番号８６２）、ｆｂｒＡｒｏＧ−ｓｅｒＡ（ＲＢＳを有する；ＳｅｒＡは第２のＲＢＳの後に始まる；配列番号８６３）、ＳｅｒＡ（ＲＢＳを有する；配列番号８６４）、ＴｒｐＥＤＣＢＡ（ＲＢＳおよびリーダー領域を有する；配列番号８７２）、ｆｂｒＳ４０ＦＴｒｐＥ−ＤＣＢＡ（リーダー領域およびＲＢＳを有する；配列番号８７８）、ｆｂｒＴｒｐＥ（配列番号８７９）が挙げられる。一部の実施形態では、トリプトファン産生構築物は、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８７２、配列番号８７３、配列番号８６８、配列番号８７８、配列番号８７９の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
（実施例８）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの操作された株におけるトリプトファン産生
多数のトリプトファン代謝物が、宿主由来（例えば、トリプタミンまたはキヌレニンなど）または腸内細菌由来（例えば、インドール酢酸またはインドール）であるかによらず、ＡｈＲ受容体の活性化を介してＩＢＤの状況において炎症をダウンレギュレートすることが示されている。他のトリプトファン代謝物、例えば細菌由来インドールプロピオン酸は、実験的結腸炎モデルにおいて、腸管障壁の完全性を回復するために役立つことが示されている。本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎｉｓｓｌｅを、それらの有益な代謝物の全ての前駆体であるトリプトファンを産生するように操作した。
第１に、転写因子ＴｒｐＲによって媒介されるトリプトファン生合成遺伝子の負の調節を除去するために、ｔｒｐＲ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅゲノムから欠失させた。トリプトファンオペロンｔｒｐＥＤＣＢＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ｔｅｔプロモーターの制御下、ｔｅｔＲリプレッサー遺伝子の下流で低コピー数プラスミドｐＳＣ１０１にクローニングした。次いで、このｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡプラスミドをΔｔｒｐＲ変異体に形質転換し、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株を得た。次いで、芳香族アミノ酸産生への第１の方向決定（ｃｏｍｍｉｔｔｉｎｇ）ステップを触媒する酵素をコードする、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ由来のａｒｏＧ遺伝子のフィードバック抵抗性型（ａｒｏＧｆｂｒ）を合成し、ｔｅｔプロモーターの制御下、ｔｅｔＲリプレッサー遺伝子の下流で、中コピー数プラスミドｐ１５Ａにクローニングした。このプラスミドを、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ株に形質転換し、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。最後に、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡ構築物のフィードバック抵抗性型（ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ）をｔｅｔ−ｔｒｐＥＢＣＤＡから生成した。ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＢＣＤＡ構築物の両方をΔｔｒｐＲ変異体に形質転換し、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。
生成した全ての株をＬＢ中で適切な抗生物質と共に一晩成長させ、培養管において抗生物質を含むＬＢ ３ｍＬ中、１／１００で二次培養した。３７Ｃ、２５０ｒｐｍで２時間成長させた後、１００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（ＡＴＣ）を培養物に添加し、構築物の発現を誘導した。２時間の誘導後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレットにし、Ｍ９最少培地３ｍＬに再懸濁させた。細胞を再度、４，０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、０．５％グルコースを含むＭ９最少培地３ｍＬに再懸濁させ、３７Ｃ、２５０ｒｐｍに置いた。２００μＬを、２時間、４時間、および１６時間目に収集し、細菌上清中のトリプトファンを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。図６Ａは、トリプトファンが、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株から産生および分泌されることを示している。トリプトファンの産生は、ｔｒｐＥのフィードバック抵抗性型を発現させることによって有意に増強される。
（実施例９）
非ＰＴＳ炭素源の使用による、およびトリプトファンをインドールに変換するトリプトファナーゼ酵素をコードするｔｎａＡ遺伝子を欠失させることによるトリプトファンの改善
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるトリプトファンに対する前駆体分子の１つは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）である。通常、芳香酸（トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む）を産生するために使用されるのは、利用可能なＰＥＰのわずか３％である。Ｅ．ｃｏｌｉを、唯一の炭素源としてグルコースを使用して成長させると、ＰＥＰの５０％が、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を使用して細胞にグルコースを輸送するために使用される。トリプトファン産生を増加させるために、非ＰＴＳ酸化糖であるグルクロネートを使用して、操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒによるトリプトファン分泌を試験した。さらに、トリプトファンのインドールへの変換を遮断するために、トリプトファナーゼ酵素をコードするｔｎａＡ遺伝子を、ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株において欠失させ、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を得た。
ΔｔｒｐＲ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒおよびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を、適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩成長させ、培養管において抗生物質を含むＬＢ ３ｍＬ中、１／１００で二次培養した。３７Ｃ、２５０ｒｐｍで２時間成長後、１００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に添加し、構築物の発現を誘導した。２時間の誘導後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレットにし、Ｍ９最少培地３ｍＬ中に再懸濁させた。細胞を再度、４，０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、１％グルコースまたは１％グルクロネートを含むＭ９最少培地３ｍＬに再懸濁させ、３７Ｃ、２５０ｒｐｍに置くか、または３７Ｃの嫌気的チャンバーに入れた。２００μＬを、３時間および１６時間目に収集し、細菌上清中のトリプトファンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。図６Ｂは、非ＰＴＳ酸化糖であるグルクロネートを使用すると、トリプトファン産生が好気的条件下で倍加することを示している。加えて、ｔｎａＡの欠失は、好気的および嫌気的条件の両方で３時間の時点でトリプトファン産生に対して正の効果を有し、１６時間の時点では嫌気的条件に限り正の効果を有した。
（実施例１０）
セリン生合成の増加を通してのトリプトファン産生の改善
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるトリプトファン生合成の最後のステップは、セリン１分子を消費する。本実施例では、本発明者らは、セリンの利用能がトリプトファン産生の制限要因であることを証明し、トリプトファン産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡ、およびΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒｓｅｒＡｆｂｒ株の構築を説明する。
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株を、適切な抗生物質を含むＬＢ中で一晩成長させ、培養管において抗生物質を含むＬＢ ３ｍＬ中、１／１００で二次培養した。３７Ｃ、２５０ｒｐｍで２時間成長後、１００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に添加し、構築物の発現を誘導した。２時間の誘導後、細菌細胞を４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレットにし、Ｍ９最少培地３ｍＬに再懸濁させた。細胞を再度、４，０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、１％グルクロネートまたは１％グルクロネートおよび１０ｍＭセリンを含むＭ９最少培地３ｍＬに再懸濁させ、３７Ｃの嫌気的チャンバーに入れた。２００μＬを、３時間および１６時間目に収集し、細菌上清中のトリプトファンを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。図６Ｃは、トリプトファン産生が、セリンの添加によって３倍改善することを示している。
ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ株におけるセリン生合成速度を増加させるために、セリン生合成経路における第１のステップを触媒する酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ ＮｉｓｓｌｅからのｓｅｒＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ギブソンアセンブリによってｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒプラスミドにクローニングした。次いで、新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物を、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ株に形質転換し、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ株を生成した。ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ構築物を、ｓｅｒＡのフィードバック抵抗性型（ｓｅｒＡｆｂｒ）をコードするようにさらに改変した。新たに生成したｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ構築物を使用して、セリン生合成速度を改善するように、およびトリプトファン産生を最大限にするように最適化されたΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡｆｂｒ株を産生した。
（実施例１１）
様々なトリプトファン産生株の比較
生成された様々な株におけるトリプトファン産生速度を比較するために、以下の構築物および株を、本明細書に記載される方法および順序に従って生成し、好気的条件下で炭素源としてのグルクロネートの存在下でトリプトファン産生に関してアッセイした。ＳＹＮ２１２６は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡを含む（ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ）。ＳＹＮ２３２３は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、およびプラスミドにおいてフィードバック抵抗性のａｒｏＧを発現させるためのテトラサイクリン誘導性構築物を含む（ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ）。ＳＹＮ２３３９は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、および第１のプラスミドにおいてフィードバック抵抗性のａｒｏＧを発現させるための第１のテトラサイクリン誘導性構築物、および第２のプラスミドにおいてｔｒｐＥのフィードバック抵抗性型と共にｔｒｐオペロンの遺伝子を有する第２のテトラサイクリン誘導性構築物を含む（ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ）。ＳＹＮ２４７３は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、および第１のプラスミドにおいてフィードバック抵抗性のａｒｏＧおよびＳｅｒＡを発現させるための第１のテトラサイクリン誘導性構築物、および第２のプラスミドにおいてｔｒｐＥのフィードバック抵抗性型と共にｔｒｐオペロンの遺伝子を有する第２のテトラサイクリン誘導性構築物を含む（ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ａｒｏＧｆｂｒ−ｓｅｒＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ）。ＳＹＮ２４７６は、ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、およびプラスミドにおいてｔｒｐＥのフィードバック抵抗性型と共にｔｒｐオペロンの遺伝子を有するテトラサイクリン誘導性構築物を含む（ΔｔｒｐＲΔｔｎａＡ、ｔｅｔ−ｔｒｐＥｆｂｒＤＣＢＡ）。
一晩培養物を、抗生物質を含むＬＢ ３ｍＬ中、１／１００に希釈し、２時間（３７Ｃ、２５０ｒｐｍ）成長させた。次に、細胞を１００ｎｇ／ｍＬ ＡＴＣによって２時間誘導し（３７Ｃ、２５０ｒｐｍ）、遠心沈降させ、ｃｍＬ Ｍ９によって洗浄し、再度遠心沈降させ、Ｍ９＋１％グルクロネート３ｍＬに再懸濁させた。ＣＦＵ計数のために細胞を播種した。アッセイのために、細胞を、３７Ｃに置き、２５０ｒｐｍで振とうさせた。トリプトファンのＨＰＬＣ解析のために上清を１時間、２時間、３時間、４時間、１６時間目に収集した。図６Ｄに認められるように、結果は、ａｒｏＧの発現が、これらの条件下でＴｒｐ産生を得るために十分でも必要でもないこと、およびｓｅｒＡの発現がトリプトファン産生にとって有益であることを示している。
（実施例１２）
ＡＬＥ
最初に、ｔｒｐＥノックアウトを含み、構成的プロモーターによって駆動されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＫＹＮアーゼの発現のための構築物を組み込んだ株を生成した（表２４）。ＫＹＮアーゼ構築物をＨＡ３／４部位に組み込み、異なる２つのプロモーターを使用した；内因性のｌｐｐ遺伝子のプロモーターを親株ＳＹＮ２０２７（ＨＡ３／４：：Ｐｌｐｐ−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）に使用し、合成ｐＳｙｎＪ２３１１９を親株ＳＹＮ２０２８（ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）に使用した。これらの株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＫＹＮアーゼの染色体組み込み型を含む株が進化するように生成した（表２４を参照されたい）。
これらの株をチェッカーボードアッセイ（例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載される）において、それらのプラスミドに基づくＰｔｅｔ相対物と類似のＡＬＥパラメータを有することを確証した。ＡＬＥ実験に使用するためのキヌレニン（ＫＹＮ）およびＴｏｘＴｒｐ濃度の下限を、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されるチェッカーボードアッセイを使用して確立し、下限濃度は、中コピー数プラスミドからのｔｅｔ誘導性ＫＹＮアーゼを発現する株に関して観察された濃度に対応した。
親株ＳＹＮ２０２７およびＳＹＮ２０２８に由来する変異体を、以下のように、ＫＹＮの漸減濃度および異なる３つのＴｏｘＴｒｐ濃度で継代することによって進化させた。
ＡＬＥ親株を、プレートにおいてグルコースおよびＬ−キヌレニンを補充したＭ９最少培地（Ｍ９＋ＫＹＮ）中で培養した。各親からの単一コロニーを選択し、滅菌リン酸緩衝食塩水溶液２０μＬに再懸濁させた。次に、このコロニーを使用してＭ９＋ＫＹＮの２つの培養物に接種し、後期対数期へと成長させ、６００ｎｍでの吸光度を決定した。次に、これらの培養物を、Ｍ９＋ＫＹＮＵ １ｍＬを有する９６ウェル深型プレートの３つの行で１０３に希釈した。３つの列の各１つは、異なるＴｏｘＴｒｐ濃度（２倍増加）を有し、各行は、漸減濃度のＫＹＮ（２分の１づつ）を有した。１２時間ごとに、培養物のＯＤ６００がほぼ０．１となるまで成長したウェルからの３０μＬを使用してプレートを逆希釈した。このプロセスを５日間繰り返した後、ＴｏｘＴｒｐ濃度は、選択圧を維持するために倍加させた。２週間後、増殖速度の増加は検出されず、培養物をＭ９＋ＫＹＮに播種した。培養は全て３７Ｃ、３５０ＲＰＭで振とうさせながら実施した。個々のコロニーを、Ｍ９＋ＫＹＮ＋ＴｏｘＴｒｐ培地中で選択およびスクリーニングして、増加した成長速度表現型を確認した。
各親株（ＳＹＮ２０２０７−Ｒ１、ＳＹＮ２０２７−Ｒ２、ＳＹＮ２０２８−Ｒ１、およびＳＹＮ２０２８−Ｒ２）の２つのレプリケートを選択し、キヌレニン産生に関してアッセイした。
簡単に説明すると、一晩培養物をＬＢ ４００ｍＬ中で１：１００に希釈し、４時間成長させた。次に、培養物２ｍＬを遠心沈降させ、Ｍ９緩衝液２ｍＬに再懸濁させた。培養物のＯＤ６００を測定した（ＰＢＳ中で１／１００希釈）。ＯＤ約０．８（約１Ｅ８）の開始細胞数を目標とする３ｍｌアッセイのために必要な細胞培養物の量を遠心沈降させた。細胞ペレットを、培養管中でアッセイ体積（３ｍｌ）のＭ９＋０．５％グルコース＋７５μＭ ＫＹＮ中に再懸濁させた。各時点（ｔ＝０、２、および３時間）で２２０μｌを３連で円錐形の９６ＷＰに採取し、４μｌを各時点でｃｆｕ測定のために除去した。各時点で、試料を円錐底の９６ＷＰ中、３０００ｇで５分間遠心沈降させ、各ウェルからの２００μｌを透明な平底９６ＷＰに移した。キヌレニンの検量線およびブランク試料を、同じプレートで調製した。次に、３０％トリクロロ酢酸（体積／体積）４０ｕｌを各ウェルに添加し、ピペットを上下させることによって混合した。プレートをアルミニウムホイルで密閉し、６０Ｃで１５分間インキュベートした。プレートを４Ｃ、１１５００ｒｐｍで１５分間遠心沈降させ、各ウェルから１２５μｌをアリコートにし、別の９６ＷＰにおいて氷酢酸中の２％エールリッヒ試薬１２５μｌと混合した。試料を、ピペットを上下させることによって混合し、ＯＤ４８０での吸光度を測定した。成長速度を、親株ＳＹＮ２０２７およびＳＹＮ２０２８、ならびに対応する進化株に関して図９に示す。
（実施例１３）
キヌレニン消費株はＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍性キヌレニンレベルを減少させる
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを含む遺伝子操作された細菌がｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境でキヌレニンを消費する能力をアセスメントした。ＳＹＮ１７０４、すなわちＴｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する中コピー数プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅデルタＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ＫａｎＲ）を第１の試験（試験１）に使用した。
第２の試験（試験２）では、ＳＹＮ２０２８、すなわちＴｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する組み込まれた構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫＹＮａｓｅ ＫａｎＲ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲ）の活性をアセスメントした。
両方の試験において、ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を、提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１ｅ６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
腫瘍内注射の場合、細菌を、６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）に達するまでＬＢブロス中で成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。１００マイクロＬを、腫瘍を有するマウスの腫瘍内に適切な用量で注射することができるように、懸濁液をＰＢＳまたは食塩水中で希釈した。
試験１：ＣＴ２６移植の約１０日後、細菌をＰＢＳ ０．１ｍｌに懸濁させて、マウスに以下のように１００μｌを腫瘍内に注射した（５ｅ６個細胞／マウス）：群１−ビヒクル対照（ｎ＝８）、群２−ＳＹＮ９４（ｎ＝８）、および群３−ＳＹＮ１７０４（ｎ＝８）。２日目から試験終了まで、動物に、ビヒクル対照または細菌５ｅ６個細胞／マウスの１００μｌを隔週で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させ、キヌレニン濃度を、本明細書に記載されるようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図１０Ａに示す。腫瘍内濃度の有意な低減が、キヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに関して観察された。腫瘍内キヌレニンレベルは、野生型Ｎｉｓｓｌｅと比較してＳＹＮ１７０４において低減されたが、その差は、１つの外れ値のために有意性に達しなかった。
試験２：ＣＴ２６移植のおよそ１０日後、細菌を、食塩水０．１ｍｌに懸濁させて、マウスの腫瘍内に細菌懸濁液（１ｅ８個細胞／マウス）を以下のように注射した：群１−ビヒクル対照（ｎ＝１０）、群２−ＳＹＮ９４（ｎ＝１０）、群３−ＳＹＮ２０２８（ｎ＝１０）。群５（ｎ＝１０）には、対照としてＩＮＣＢ０２４３６０（ＩＤＯインヒビター）を、１日２回強制経口投与した。２日目から試験終了まで、動物にビヒクル対照または細菌１ｅ８個細胞／マウス１００μｌを隔週で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。群５には、対照としてＩＮＣＢ０２４３６０を試験終了まで１日２回強制経口投与した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させた。腫瘍の断片を、予め重量を測定したビードバスター（ｂｅａｄ−ｂｕｓｔｅｒ）管に入れ、分析のために氷中で保存した。キヌレニン濃度を本明細書に記載されるようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図１０Ｂに示す。腫瘍内濃度の有意な低減が、野生型Ｎｉｓｓｌｅまたは野生型対照と比較してキヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８に関して観察された。ＳＹＮ２０２８において観察された腫瘍内キヌレニンレベルは、ＩＤＯインヒビターＩＮＣＢ０２４３６０に関して観察されたレベルと類似であった。
（実施例１４）
染色体挿入およびプラスミドを有する操作された細菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有する操作された細菌株と、ｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒを含む低コピー数プラスミドを有する株との間のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を比較するために、培地中のアルギニンレベルを嫌気的誘導後の様々な時点で測定した。さらに、チミジンに関する栄養要求性が、アルギニン産生効率に対して影響を及ぼしうるか否かをアセスメントするために、ＴｈｙＡ欠失を有するまたは有しない、低コピー数プラスミドにおいてｆｎｒ−ＡｒｇＡｆｂｒを含むか、または染色体に組み込まれた、操作された細菌株のアルギニン産生を比較した。
一晩培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で成長させた。１．５時間成長させた後、細菌培養物を以下のように誘導した：（１）ＦＮＲ誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を、３７℃のＣｏｙ嫌気的チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２、および２０ｍＭ硝酸塩を供給する）中での嫌気的条件で、ＬＢ中３７℃で４時間誘導した；（２）テトラサイクリン誘導性ａｒｇＡｆｂｒを含む細菌を、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／ｍＬ）によって誘導した。誘導後、細菌をインキュベータから取り出し、最高速度で５分間遠心沈降させた。細胞をＭ９グルコース１ｍＬに再懸濁させ、ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００が０．６〜０．８の間になるまで細胞を希釈した。Ｍ９グルコース培地中に再懸濁させた細胞を、３７Ｃで振とうさせながら好気的に成長させた。細胞懸濁液１００μＬを採取し、時間＝０でのＯＤ６００を測定する。１００μＬアリコートを、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍結した。その後の各時点（例えば、３０、６０、および１２０分）で、細胞懸濁液１００μＬを除去し、ＯＤ６００を測定した；１００μＬアリコートを、質量分析のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０Ｃで凍結した。試料を、アルギニン濃度に関して分析した。各時点で、質量分析によって決定した正規化濃度対ＯＤ６００を使用して、単位時間あたり細胞あたりのアルギニン産生速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を上記に提供する。
３０、６０、および１２０分間の誘導後のアルギニン産生を、（１）Ｓｙｎ−ＵＣＤ３０１（ＳＹＮ８２５；ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、（２）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５（低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６（低コピー数プラスミドにおいてＦＮＲ誘導プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３を対照Ｎｉｓｓｌｅ構築物として使用し、結果を示す。
本明細書において、０、３０、６０、および１２０分で測定したＳＹＮ−ＵＣＤ２０５、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６、およびＳＹＮ−ＵＣＤ３０１のアルギニン産生レベルを示す。アルギニン産生は、３つ全ての株の間で同等であり、最大のアルギニン産生は、ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１に関して１２０分で得られ、このことはＦＮＲ ＡｒｇＡ ｆｂｒの染色体組み込みによって、同じ構築物を発現する低コピー数プラスミド株について認められるものと類似のレベルのアルギニン産生が得られ、アルギニン産生速度をさらにわずかに増加させうることを示している。ＳＹＮ−ＵＣＤ２０６は、ＳＹＮ−ＵＣＤ２０５およびＳＹＮ−ＵＣＤ−３０１（６０分でより低いアルギニンレベル）と比較して減弱されたアルギニン産生を示したが、１２０分では同等のアルギニン産生レベルに達し、ΔＴｈｙＡがアルギニン産生に対してわずかに減弱作用を有しうることを示している。ＳＹＮ−ＵＣＤ１０３対照ではアルギニン産生は検出されなかった。
次に、試料を上記のように調製し、誘導後１２０分でのアルギニン産生を、（１）ＳＹＮ−ＵＣＤ２０４（低コピー数プラスミドにおいてテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲおよびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（２）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０１（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ＣｍＲ、およびａｒｇＡｆｂｒを含む）、（３）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０２（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＣｍＲ（クロラムフェニコール抵抗性）およびａｒｇＡｆｂｒを含む）、および（４）ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３（ｍａｌＥＫ座で染色体に組み込まれたＦＮＲ誘導性プロモーターの制御下で発現されたΔＡｒｇＲ、ΔＴｈｙＡ、ＫａｎＲ（カナマイシン抵抗性）およびａｒｇＡｆｂｒを含む）の間で比較した。
ΔＡｒｇＲおよびΔＴｈｙＡを含むＳＹＮ−ＵＣＤ１０６を、対照のＮｉｓｓｌｅ構築物として使用した。結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂにおいて認められるように、アルギニン産生は、０．７〜０．９μｍｏｌ／１×１０９個細胞の間まで上昇し、アルギニン産生が、プラスミドにおいてＡｒｇＡｆｂｒを有する株およびＡｒｇＡｆｂｒの組み込まれたコピーを有する株において類似のレベルであることを示している。
（実施例１５）
染色体挿入およびプラスミドを有する操作された細菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
ｍａｌＥＫ座でｆｎｒ誘導性プロモーターによって駆動されるＡｒｇＡｆｂｒの染色体挿入を有し、ΔＡｒｇＲおよびＴｈｙＡ欠失を有し、抗生物質耐性を有しない操作された細菌株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（アンモニアからのアルギニン産生）をアセスメントした（ＳＹＮ−ＵＣＤ３０３）。
一晩培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で成長させた。１．５時間成長させた後、細菌培養物を、３７℃のＣｏｙ嫌気的チャンバー（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２、５％Ｈ２、および２０ｍＭ硝酸塩を供給する）中での嫌気的条件で、ＬＢ中３７℃で４時間誘導した。誘導後、細菌をインキュベータから取り出し、最高速度で５分間遠心沈降させた。細胞をＭ９グルコース１ｍＬに再懸濁させ、ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００が０．６〜０．８の間になるまで細胞を希釈した。Ｍ９グルコース培地中に再懸濁させた細胞を、３７Ｃで振とうさせながら好気的に成長させた。細胞懸濁液１００μＬを除去し、時間＝０でのＯＤ６００を測定した。１００μＬアリコートを、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０℃で凍結した。その後の各時点（例えば、２０、４０、６０、８０、１００、および１２０分）で、細胞懸濁液１００μＬを除去し、ＯＤ６００を測定した；１００μＬアリコートを、質量分析のために丸底９６ウェルプレートにおいて−２０Ｃで凍結した。試料を、アルギニン濃度に関して分析した。各時点で、質量分析によって決定した正規化濃度対ＯＤ６００を使用して、単位時間あたり細胞あたりのアルギニン産生速度を決定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を本明細書に提供する。結果を図１４に示す。
（実施例１６）
サイトカイン分泌のための構築物および細菌の生成
免疫モジュレーションポリペプチド、例えばサイトカイン、例えばｈＩＬ−１２、ｍＩＬ−１２、ｈＩＬ−１５、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０を分泌することができる株を産生するために、異なる分泌戦略を用いるいくつかの構築物を設計した。様々なサイトカイン構築物を合成し、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のためにベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物をゲノムに組み込む。一部の実施形態では、エフェクター分子をコードする構築物は、プラスミド、例えば中コピー数プラスミドに存在する。
（実施例１７）
ＭＣ３８モデルにおける抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４の全身投与と組み合わせたキヌレニン消費株の活性
キヌレニン消費株ＳＹＮ２０２８が、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１との組合せの抗腫瘍応答を増強する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６−ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験において使用する細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
表５２における試験デザインに従って、マウスにＭＣ３８腫瘍を移植し、マウスにキヌレニン消費細菌を腫瘍内注射し、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体を腹腔内に注射した。ＭＣ３８細胞（１×１０５個／マウス／１００μＬ）を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が１日目に約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを表５２に示す処置群に無作為化した。
腫瘍体積および体重を、２回の測定間に１〜２日間空けて週に３回記録した。
図３９Ａ、３９Ｂ、３９Ｃ、３９Ｄ、および３９Ｅの結果は、キヌレニン消費株が、ＭＣ３８モデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ−１抗体媒介抗腫瘍活性を改善する能力を有することを示す。具体的には、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４群では、マウスの２５％が処置に応答した；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ９４群では同じ応答率が観察された。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ２０２８群では、マウスの７１％が応答した。
（実施例１８）
骨髄非破壊性化学療法と組み合わせたアルギニン産生体およびキヌレニン消費体の活性
アルギニン産生体（ＳＹＮ８２８）およびキヌレニン消費体（ＳＹＮ２０２８）の活性を、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてシクロホスファミド処置と組み合わせてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
以下および図４０Ａに記載のタイムラインに従って、マウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、マウスにアルギニン産生細菌（ＳＹＮ８２８）およびキヌレニン消費細菌（ＳＹＮ２０２８）ならびに対照を、１００ｍｇ／ｋｇシクロホスファミド（ＣＰ）と組み合わせて腫瘍内に注射した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞（ＰＢＳ中に１ｅ６個細胞／マウス）を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達するまでモニタリングした。０日目に、マウスを１００ｍｇ／ｋｇ（１００μＬ／マウス）シクロホスファミドのＩ．Ｐ．によって前処置し、群に無作為化した。処置の１日目に、マウスにＳＹＮ９４（ＷＴ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）（Ｉ．Ｔ．）、ＳＹＮ２０２８（Ｋｙｎ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）、またはＳＹＮ８２５（Ａｒｇ、１ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬ）（Ｉ．Ｔ．）のいずれかの１００μＬを投与した。４、８、１１、および１５日目に動物の体重を測定し、腫瘍を測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。個々のマウスの腫瘍体積を、図４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄ、４０Ｅ、および４０Ｆに示し、シクロホスファミドと組み合わせたキヌレニン消費株およびアルギニン産生株の抗腫瘍活性をシクロホスファミド単独と比較して示す。
（実施例１９）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる細菌細胞ペレットおよび腫瘍組織ホモジネートにおける環状ジＡＭＰの定量
試料の調製
標準物質を生成するために、１０ｍｇ／ｍＬ環状ジＡＭＰを１．５ｍＬ微量遠心管において調製し、２５０、１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２μｇ／ｍＬ溶液を水中で調製した。ＱＣ溶液は、２００、２０、および２μｇ／ｍＬレベルで調製した。
試料調製：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試料に関して、細菌ペレットを、２：１ アセトニトリル：水１００μＬを添加することによって抽出し、ボルテックスし、遠心分離した。上清２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、０．１％ギ酸１８０μＬを添加することによって１０倍希釈した。Ｉｎ ｖｉｖｏ試料の場合、組織ホモジネートは、２：１ アセトニトリル：水９０μＬを腫瘍ホモジネート１０μＬに添加することによって抽出した。試料をボルテックスし、遠心分離した。上清２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、０．１％ギ酸１８０μＬを添加することによって１０倍希釈した。プレートをＣｌｅａｒＡＳｅａｌシートによって熱密封し、十分に混合した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
検体を、Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍａｘトリプル四重極質量分析計を使用してタンデム質量分析にカップリングした液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。表５５〜表５７は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の要約を提供する。
データ解析のために、ＳＲＭクロマトグラムを組み込み、標準物質のピーク面積を濃度に対してプロットした。線形の曲線をフィットさせ、未知物質の濃度を、そのピーク面積および検量線の式の勾配切片を使用して計算した。
（実施例２０）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ細胞表面上の抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの提示
Ｎｉｓｓｌｅ細胞表面上に抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖを提示することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表３１に示すように本明細書に記載される方法に従って構築物を生成した。配列は、配列番号９８７〜９８９である。提示アンカーポリペプチドは配列番号９９０〜９９２を含む。
一部の実施形態では、提示アンカーは、配列番号９９０、配列番号９９１、および／または配列番号９９２の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。
ｔｅｔ誘導性ｐｔｅｔ−ＬｐｐＯｍｐＡ−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを含むプラスミドに基づく構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅを、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ｐｔｅｔ−ＬｐｐＯｍｐＡ−Ｊ４３−ｓｃＦｖの発現を１８時間誘導した。
一本鎖抗体が遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの表面上に提示されるか否か、およびＰＤ１に機能的に結合するか否かを決定するために、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。細胞１０９個を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用して室温で１時間遮断し、ビオチン化−ｍＰＤ１を添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）によって３回洗浄し、ブロッキング溶液中のストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰと共に４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって３回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質キットを使用し、製造元の説明書（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に従って染色した。ビオチン化ＩｇＧおよび無添加のＰＢＳを陰性対照としてｍＰＤ１の代わりに使用した。細胞を遠心分離によって除去し、上清を収集した。上清のシグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果（データは利用できない）は、Ｊ４３−ｓｃＦｖ（抗ｍＰＤ１）が、遺伝子操作された細菌の表面上に提示され、ｍＰＤ１に結合することができることを示している（表３２）。
（実施例２１）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるα−ＰＤ１−ｓｃＦｖ発現
機能的ｓｃＦｖをＥ ｃｏｌｉにおいて発現させることができるか否かを決定するために、抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ断片を、マウスＰＤ−１と反応するＪ４３モノクローナル抗体に基づいて生成した。
マウスモノクローナル抗体Ｊ４３配列を、特許ＥＰ第１４４５２６４Ａ１から得た。次に、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を設計した。ｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、設計したＪ４３−ｓｃＦｖ、Ｃ末端Ｖ５タグおよびＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含む断片を、ＩＤＴＤＮＡにより合成した。構築物を、ｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、本明細書に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｊ４３ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９７６〜９８０）を生成した。
ｔｅｔ誘導性Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５を含むＥ．ｃｏｌｉまたは野生型対照をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：４０に希釈し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５の発現を誘導した。同量のテトラサイクリンを野生型対照培養物に添加した。４時間誘導後、細菌をペレットにし、ＰＢＳ中で洗浄して収集し、超音波緩衝液（ＰＢＳ）２ｍＬに再懸濁させ、氷上で超音波によって溶解した。不溶性のデブリを、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、２回遠心沈降させた。
タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定し、野生型およびＰｔｅｔ−Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦＶ−Ｖ５を含む株から単離した抽出物をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。レーン２（Ｊ４３−抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５株からの抽出物）において単一のバンドが２７ｋＤａで検出された。レーン１（野生型抽出物）ではバンドは検出されなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αから精製した一本鎖抗体が標的タンパク質ＰＤ１に機能的に結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。プレートに、２μｇ／ｍＬ ＰＤ１（Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μＬ／ウェル、４℃で一晩吸収させた。ウェルを、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の２％ＢＳＡによって室温で２時間遮断した。３回洗浄後、ウェルを細菌抽出物（Ｊ４３−ｓｃＦｖ−Ｖ５または野生型陰性対照）と共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）によって４回洗浄し、ブロッキング溶液中のＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって４回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して染色した。シグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果を表７７に示し、遺伝子操作された細菌によって発現された抗体がＰＤ１に特異的に結合することができることを示している。
次に、組換えＪ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５を、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを回収するｐＥＴ２２ｂベクターを使用して発現させ、固定した金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定し、純度をクーマシーゲルによって確認した（データは示していない）。
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖが、マウスＥＬ４細胞上の表面ＰＤ１に結合するか否かを決定するために、ＥＬ４細胞を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＥＬ４は、その細胞表面上にＰＤ１を発現するマウスリンパ腫細胞系である。
ＥＬ４細胞を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍｌに再懸濁させ、冷却したアッセイ管に移し（１×１０６個細胞）、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中で２〜３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁させ、これに精製ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。陰性対照はｓｃＦｖ−Ｖ５を除外した。細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌに再懸濁させ、フローサイトメーターにおいて分析した。結果を図１８に示す。ＥＬ４単独およびＥＬ４＋二次抗体のみの試料と比較して、精製抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣの両方が存在した場合に限り、集団のシフトが観察される（異なる２つのバッチを示す）。
（実施例２２）
抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの分泌
抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの分泌のために本明細書に記載される方法に従って生成した株を表３０に示す。
ｔｅｔ誘導性Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５をＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、もしくはＰｅｌＢ分泌タグと共に含むプラスミドに基づく構築物（配列番号９８１〜９８６を参照）を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅまたは野生型対照をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＰｈｏＡ−、ＯｍｐＦ−、またはＰｅｌＢ−Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５の発現を誘導した。野生型Ｎｉｓｓｌｅ培養物にはテトラサイクリンを添加しなかった。室温で１８時間誘導後、細菌をペレットにし、上清を収集して氷上に置いた。
培地および細胞溶解物中のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定し、野生型およびＰｔｅｔ−Ｊ４３−抗ｓｃＦｖ−Ｖ５を含む株から単離した抽出物および培地をウェスタンブロットによって解析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Ｊ４３−抗ｓｃＦｖを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。結果を図１９に示す。レーン１〜６においてＳＹＮ２７６７、ＳＹＮ２７６９、ＳＹＮ２７７１、ＳＹＮ２７７３、ＳＹＮ２７７５、およびＳＹＮ２７７７からの抽出物にそれぞれ対応する単一のバンドが３４ｋＤａ付近に検出された。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅにおける分泌されたＪ４３−抗ｓｃＦｖが、マウス細胞上のＰＤ１に結合するか否かを決定するために、フローサイトメトリー分析を、ＥＬ４細胞を使用して実施した。ＥＬ４は、その細胞表面上にＰＤ１を発現するマウスリンパ腫細胞系である。
ＥＬ４細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁させ、冷アッセイ管（１×１０６個）に移し、Ｄ−ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁させ、これに精製ｓｃＦｖ−Ｖ５および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。陰性対照は、分泌されたＪ４３−ｓｃＦｖ−Ｖ５を除外した。次いで細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。結果を（図２０）に示す。ＥＬ４単独およびＥＬ４＋二次抗体のみによる試料と比較して、分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５（一次抗体）および抗Ｖ５−ＦＩＴＣ（二次抗体）の両方が存在する場合に限って集団シフトが観察された。類似の試験を、分泌されたｓｃＦｖの異なる量（０、２、５、および１５μＬ）について実施し、ＥＬ４細胞の用量依存的染色を観察した（図２１）。
次に、ＰＤＬ１が、遺伝子操作された細菌によって分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖのマウスＰＤ１に対する結合を阻害するか否かを決定するために競合アッセイを実施した。ＥＬ４細胞を成長させ、フローサイトメトリープロトコールを、分泌された抗ＰＤ１−ｓｃＦｖ−Ｖ５のインキュベーションの間にＰＤＬ１を様々な濃度（０、５、１０、および３０μｇ／ｍＬ）で添加したことを除き、本質的に上記の通りに実施した。ラット−ＩｇＧを、分泌されたｓｃＦｖの陰性対照として使用した。結果を図２２Ａおよび図２２Ｂに示す。ＰＤＬ１は、分泌された抗ｍＰＤ１−ｓｃＦｖの、ＥＬ４細胞表面上のｍＰＤ１に対する結合に対して用量依存的に競合した。ラット−ＩｇＧタンパク質の陰性対照は、類似の用量依存的な結合競合を示さなかった。
（実施例２３）
サイトカイン分泌（ＩＬ−１５）
操作された細菌によって発現されたｈＩＬ−１５が分泌されるか否かを決定するために、ｈＩＬ−１５分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＩＬ−１５濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＩＬ−１５を発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：２００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら２時間成長させた。培養物を、吸光度が０．５となるまで希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、ｈＩＬ−１５の発現を誘導した。１２時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。さらに、細胞内組換えタンパク質産生を検出するために、ペレットにした細菌を洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を含むＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁させ、当初の培養条件と比較して１０倍濃縮された溶解物を得た。室温で１０分間インキュベーション後、不溶性のデブリを１２，０００ｒｃｆ、４℃で２０分間遠心沈降させた後、さらに処理するまで氷上に置いた。
無細胞培地および細菌細胞抽出物中のｈＩＬ−１５の濃度を、ｈＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって製造元の説明書に従って測定した。試料を全て３連で実施し、検量線を使用して分泌されたｈＩＬ−１５レベルを計算した。検量線は、組換えｈＩＬ−１５を使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２５は、それぞれの上清中で測定したｈＩＬ−１５のレベルを要約する。データは、ｈＩＬ−１５が、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例２４）
サイトカイン分泌（ＧＭＣＳＦ）
操作された細菌によって発現されるｈＧＭＣＳＦが分泌されるか否かを決定するために、ｈＧＭＣＳＦ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＧＭＣＳＦの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。株は全て、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＧＭＣＳＦを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＧＭＣＳＦの濃度を、ｈＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＧＭＣＳＦレベルを計算した。検量線は組換えｈＧＭＣＳＦを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２６は、それぞれの上清中で測定されたｈＧＭＣＳＦのレベルを要約する。データは、ｈＧＭＣＳＦが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例２５）
サイトカインの分泌（ＴＮＦａ）
操作された細菌によって発現されたｈＴＮＦａが分泌されるか否かを決定するために、ｈＴＮＦａ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＴＮＦａの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＴＮＦａを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＴＮＦａの濃度を、ｈＴＮＦａ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＴＮＦａレベルを計算した。検量線は組換えｈＴＮＦａを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２７は、それぞれの上清中で測定されたｈＴＮＦａのレベルを要約する。データは、ｈＴＮＦａが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
（実施例２６）
分泌されたＴＮＦ−アルファの機能的アッセイ
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＴＮＦ−アルファが機能的であることを証明するために試験を実施した。ＴＮＦ−アルファ媒介ＮＦ−カッパＢ活性化に基づいて細胞に基づくアッセイを用いた。ＴＮＦ−アルファのその受容体に対する結合により、ＩＫＫによるＩｋＢアルファのリン酸化および分解をもたらす。ＴＮＦ−アルファの生物活性を、フローサイトメトリーを介してＩｋＢ分解の定量によって決定することができる。
簡単に説明すると、ＨｅＬａ細胞を、ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ｐｈｏＡ ＴＮＦａを含む）に由来するＴＮＦａ分泌上清によって１０分間処置した。次に、細胞をパラホルムアルデヒドに基づく緩衝液中で固定した後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性にした。ＩｋＢａ分解のモジュレーションをフローサイトメトリーによって決定し、結果を図５６に示す。
図５６に認められるように、ＳＹＮ２３０４はｒｈＴＮＦａの生物活性に近づく生物活性を示し、ＳＹＮ１５５７処置によって、細菌上清のオフターゲット成分からの交絡因子（すなわち、ＬＰＳ）を示さない、測定可能なシグナルはもたらさなかった。
（実施例２７）
サイトカイン分泌（ｈＩＦＮｇ）
操作された細菌によって発現されるｈＩＦＮｇが分泌されるか否かを決定するために、ｈＩＦＮａ分泌構築物／株を含む操作された株からの細菌上清中のｈＩＦＮｇの濃度を測定した。株は、Ｌｐｐ（ｌｐｐ：：Ｃｍ）、ｎｌｐＩ（ｎｌｐＩ：：Ｃｍ）、ｔｏｌＡ（ｔｏｌＡ：：Ｃｍ）、またはＰＡＬ（ＰＡＬ：：Ｃｍ）のいずれかの欠失を含む。全ての株は、ＰｈｏＡ分泌タグと共にｈＩＦＮｇを発現するプラスミドをさらに含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を、ＩＬ−１５に関する上記の実施例に記載したとおりに成長、誘導および処理した。
無細胞培地中および細菌細胞抽出物中のｈＩＦＮｇの濃度を、ｈＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、製造元の説明書に従って測定した。全ての試料を３連で実行し、検量線を使用して分泌されたｈＩＦＮｇレベルを計算した。検量線は組換えｈＩＦＮｇを使用して生成した。野生型ＮｉｓｓｌｅをＥＬＩＳＡに陰性対照として含め、シグナルは観察されなかった。表２８は、それぞれの上清中で測定されたｈＩＦＮｇのレベルを要約する。データは、ｈＩＦＮｇが、異なる細菌株から様々なレベルで分泌されることを示している。
表２９は、各サイトカインに関して得られた分泌レベルの要約を提供し、観察された分泌レベルの差のいくつかを説明しうるサイトカインのいくつかの構造特徴を記載する。
（実施例２８）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖの発現
機能的な抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させることができるか否かを決定するために、抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖ断片を、ヒトＣＤ４７と反応するＢ６Ｈ１２および５Ｆ９モノクローナル抗体に基づいて生成した。
モノクローナル抗体Ｂ６Ｈ１２および５Ｆ９（抗ヒトＣＤ４７）配列を、公開された特許（ＵＳ２０１３０１４２７８６Ａ１）から得た。次に、ヒトＣＤ４７を標的とする一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を設計した。ｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、設計された抗ｈＣＤ４７−ｓｃＦｖ、Ｃ末端Ｖ５タグ、およびＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含む断片を、ＩＤＴＤＮＡが合成した。構築物をｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、本明細書に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｂ６Ｈ１２抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９９３）およびｐＵＣ−ｐｔｅｔ−５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳ（配列番号９９４）を生成した。
ｐＵＣ−ｐｔｅｔ−Ｂ６Ｈ１２抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳまたはｐＵＣ−ｐｔｅｔ−５Ｆ９抗ｈＣＤ４７ｓｃＦｖ−Ｖ５−ＨＩＳを含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら、吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温まで冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、ｐｔｅｔ−ｓｃＦｖの発現を１８時間誘導した後、細菌をペレットにし、ＰＢＳ中で洗浄して回収し、ＰＢＳ緩衝液 ２ｍＬ中に再懸濁させて、氷上で超音波によって溶解した。不溶性のデブリを１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間、２回遠心沈降させる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにおいて発現された抗ＣＤ４７一本鎖抗体が、標的タンパク質に機能的に結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。プレートに、２μｇ／ｍＬ標的タンパク質（ヒトＣＤ４７、マウスＣＤ４７、ＩｇＧ、およびＰＢＳ、Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓから）を１００μＬ／ウェル、４℃で一晩吸収させた。ウェルをＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０中の２％ＢＳＡによって室温で２時間遮断した。３回洗浄後、ウェルを細菌抽出物と共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）によって４回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にブロッキング溶液中で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴによって４回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して染色した。シグナル強度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。結果を表３３に示し、遺伝子操作された細菌によって発現された抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖが、ヒトＣＤ４７に特異的に結合することができることを示している。
（実施例２９）
キヌレニン消費株はＣＴ２６マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍性キヌレニンレベルを減少させる
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを含む遺伝子操作された細菌がｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境でキヌレニンを消費する能力をアセスメントした。Ｔｒｐ：Ｅに欠失を含み、構成的プロモーターの制御下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのキヌレニナーゼを発現する中コピー数プラスミドを含むＳＹＮ１７０４、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（ＮｉｓｓｌｅデルタＴｒｐＥ：：ＣｍＲ＋Ｐｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＫＹＮＵ ＫａｎＲ）を使用した。
両方の試験において、ＡＴＣＣから得たＣＴ２６細胞を、提供されたガイドラインに従って培養した。ＰＢＳ中のおよそ１×１０６個細胞／マウスを各動物（ＢａｌｂＣ／Ｊ（雌性、８週齢））の右脇腹に皮下移植し、腫瘍の成長をおよそ１０日間モニタリングした。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達すると、動物を投与のための群に無作為化した。
腫瘍内注射のために、細菌を、ＬＢブロス中で６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００ｎｍ）が０．４（２×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに対応する）となるまで成長させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。懸濁液をＰＢＳまたは食塩水で希釈して、１００μＬを、腫瘍を有するマウスに適切な用量で腫瘍内注射することができる。
ＣＴ２６移植の約１０日後、細菌をＰＢＳ ０．１ｍＬ中に懸濁させ、マウスに１００μＬを以下のように腫瘍内注射した（１ｅ７個細胞／マウス）：群１−食塩水対照（ｎ＝７）、群２−ＳＹＮ１７０４（ｎ＝７）。動物に、それらの群分けに従って食塩水または株のいずれかを隔週（ＢＩＷ）で腫瘍内に投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍が約２０００ｍｍ３に達すると動物を安楽死させた。血漿および腫瘍組織を収集し、キヌレニンおよびトリプトファン濃度を本明細書に記載のようにＬＣ／ＭＳによって測定した。結果を図４２Ａおよび４２Ｃに示す。キヌレニンの腫瘍内（Ｐ＜０．００１）および血漿中（Ｐ＜０．００５）濃度の有意な低減が、キヌレニン消費株ＳＹＮ１７０４について観察された。トリプトファンレベルは一定のままであった（データは示していない）。
（実施例３０）
ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＳＹＮ９４およびＳＹＮ１７０４による動態試験
ＣＴ２６腫瘍におけるＫＹＮ消費株の１回投与が腫瘍ＫＹＮレベルおよび腫瘍重量に及ぼす効果をアセスメントした。ＣＲＬからの８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１８〜２５ｇ）を、施設に少なくとも３日間順化させた。動物に通常の食餌および水を与えた。
−８日目に、ＣＴ２６細胞（ＰＢＳ中に約１ｅ６個細胞／マウス）を各動物の右脇腹にＳＣ移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に達するまで１週間モニタリングした。次いで、動物を秤量し、測定し、表３４に従って処置群に無作為化した（１日目）。動物に、腫瘍内投与を介してＳＹＮ９４またはＳＹＮ１７０４を適切な濃度で投与した。腫瘍内注射のために、ＳＹＮ９４細胞を３．０×１０ｅ１１ ＣＦＵ／ｍＬ保存液から１×１０ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬの濃度に希釈し、ＳＹＮ１７０４細胞を保存液から１×１０ｅ８ ＣＦＵ／ｍＬの濃度に希釈した。
動物を腫瘍の成長に関連する異常または過剰な疼痛の兆候に関して投与後毎日観察した。動物を１日目（Ｔ＝０群；群１）、２日目（Ｔ＝２４時間；群２および５）、４日目（Ｔ＝７２時間；群３および６）、および８日目（Ｔ＝１６８時間；群４および７）に犠牲にした。
各群に関して全血を適切なエンドポイントで心採血により収集した。得ることができる最大の血液をＬｉＨｅｐ管（ＢＤ）に収集した。試料を氷上で維持した後、遠心分離機で遠心沈降させた（２０００ｇ、４Ｃで１０分間）。次に、血漿を１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、後に分析するまで−８０Ｃで保存した。腫瘍試料を２つの部分に分割し、第１の部分を、再度秤量したビードバスター管において適切なエンドポイントで収集した。管中の組織の秤量後、さらなる分析のために−８０Ｃで保存した。腫瘍の他の部分を切片作製および分析のために１０％ホルマリン中で固定した。採血からの血漿試料をＬＣＭＳによって分析し、細胞に基づくアッセイを使用してサイトカイン分析を実施した。腫瘍試料を、キヌレニンレベルに関してＬＣＭＳによって分析した。結果を図４３Ａ〜４３Ｃに示す。
（ 実施例３１）
マウスＣＤ４０Ｌの分泌
ＣＤ４０Ｌを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表８９に示されるｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１２２−２６０）構築物を、本明細書に記載される方法に従って生成した。ｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１２２−２６０）はそれぞれ、完全長のｍＣＤ４０Ｌの細胞外部分およびｍＣＤ４Ｌの可溶性型に対応する。
ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）（ＳＹＮ３３６６）およびｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）（ＳＹＮ３３６７）を含むプラスミドに基づくｔｅｔ誘導性構築物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅならびに親対照株ＳＹＮ１５５７を、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ｍＣＤ４０Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ２の発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬからのタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写し、ｍＣＤ４０−Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ−２を、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって検出した。結果を図２５に示す。ｍＣＤ４０Ｌ１およびｍＣＤ４０Ｌ２に関してそれぞれ、３２ｋＤａおよび２４ｋＤａ付近に単一のバンドが検出された。
清澄な上清中の捕捉された遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌されたｍＣＤ４０Ｌが、ｍＣＤ４０に機能的に結合することができるか否か、および／または抗ｍＣＤ４０Ｌ抗体によって検出されるか否かを決定するために、プレートをｍＣＤ４０または抗ｍＣＤ４０Ｌ抗体によってコーティングすることによってＥＬＩＳＡアッセイを実施した。結果を表３５に示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されたｍＣＤ４０Ｌ１（４７−２６０）およびｍＣＤ４０Ｌ２（１１２−２６０）が、ｍＣＤ４０に結合することができることを示している。
（実施例３２）
ＳＩＲＰαおよびバリアントならびに抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖの分泌
抗ＳＩＲＰＡを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、表３６に示される構築物を本明細書に記載される方法に従って生成した。配列番号１０９４〜１１０４および配列番号１１０５〜１１２１を含む配列を示す。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１５５７、ＳＹＮ２９９６、ＳＹＮ３１５９、ＳＹＮ３１６０、ＳＹＮ３０２１、ＳＹＮ３０２０、およびＳＹＮ３１６１をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ＳＩＲＰα、もしくはＳＩＲＰαバリアント、またはＣＤ４７ ｓｃＦｖの発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、清澄な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬ中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＳＩＲＰαおよびＳＩＲＰαバリアントならびに抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して検出した。結果を図２６に示す。ＷＴ ｍＳＩＲＰαに関して４６ｋＤａ、ＣＶ１ＳＩＲＰαに関して２０ｋＤａ、ＦＤ６ｘ２ ＳＩＲＰαに関して３３ｋＤａ、ＦＤ６ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４に関して４２ｋＤａ、ＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４に関して４２ｋＤａ、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖに関して３０ｋＤａ付近に、それぞれ単一のバンドが検出された。
遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌された野生型ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７−ｓｃＦｖが、ＣＤ４７に機能的に結合することができるか否か、ならびに／または抗ＳＩＲＰα抗体によって検出されるか否かを決定するために、プレートを対応する抗体またはリガンドによってコーティングすることによってＥＩＳＡアッセイを実施した。結果を表３７に示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されたｍＳＩＲＰαおよび抗ｍＣＤ４７ｓｃＦｖの両方がｍＣＤ４７に結合することができることを示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから分泌されたＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖが、マウス細胞上のＣＤ４７に結合するか否かを決定するために、ＣＴ２６細胞を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＣＴ２６は、その細胞表面上にＣＤ４７を発現するマウス結腸癌細胞系である。
ＣＴ２６細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。細胞を遠心沈降させ、上清を吸引し、ペレットをＤ−ＰＢＳ １ｍＬ中に再懸濁させ、冷却したアッセイ管に移し（１×１０６個細胞）、Ｄ−ＰＢＳ中で３回洗浄した。細胞を、０．５％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁させ、これに上清１０μＬ（１０倍濃縮）を添加し、４Ｃで１時間インキュベートした。ＳＹＮ１５５７からの上清をベースライン陰性対照として使用した。次に細胞をＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁させ、適当な濃度に希釈し、フローサイトメーターにおいて分析した。結果を（図２７および図２８）に示す。ベースラインと比較して、分泌されたＳＩＲＰα、ＳＩＲＰαバリアント、および抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖを含む試料では集団のシフトが観察され、ＣＶ１ＳＩＲＰα−ＩｇＧ４を発現するＳＹＮ３０２１については最大のシフトが観察される。
次に、競合アッセイを実施して、遺伝子操作された細菌によって分泌されたマウスＳＩＲＰαが、ＣＴ２６細胞上のマウスＣＤ４７に対する組換えｍＳＩＲＰαまたは抗ＣＤ４７抗体の結合と競合できるか否かを決定した。ＣＴ２６細胞を成長させ、組換えＳＩＲＰα（Ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ）または抗ＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、分泌されたＦＤ６ｘ２ｓｉｒｐαまたはＦＤ６ｓｉｒｐαｈＩｇＧ４のインキュベーションの間に添加したことを除き、本質的に上記の通りにフローサイトメトリープロトコールを実施した。図２９および図３０はそれぞれ、組換えＳＩＲＰアルファおよび抗ＣＤ４７抗体との競合の結果を示す。組換えＳＩＲＰアルファおよび抗ＣＤ４７抗体はいずれも、ＣＴ２６細胞上のＣＤ４７に対する結合に関して分泌されたＳＩＲＰアルファと競合することができた。
（実施例３３）
ヒアルロニダーゼの分泌
ヒアルロニダーゼを分泌することができる遺伝子操作された細菌を生成するために、構築物を、図３１Ａに示す本明細書に記載される方法に従って生成した（ＳＹＮ２９９８：ＮｉｓｓｌｅデルタＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−−ＦＬＡＧ−ヒトヒアルロニダーゼ−Ｖ５− Ｈｉｓ ｔａｇｓ；ＳＹＮ２９９７：ＮｉｓｓｌｅデルタＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−ＦＬＡＧ−ヒトヒアルロニダーゼ−Ｖ５−Ｈｉｓ；ＳＹＮ３３６９：ＮｉｓｓｌｅデルタＰＡＬ：：ＣｍＲ；ｐ１５Ａ−ｐｔｅｔ−ＲＢＳ−ＰｈｏＡ−ＦＬＡＧ−ｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼ−Ｖ５−Ｈｉｓ）。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ１５５７、ＳＹＮ２９９７（マウスヒアルロニダーゼを分泌する）、ＳＹＮ２９９８（ヒトヒアルロニダーゼを分泌する）およびＳＹＮ３３６９（ｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼを分泌する）を、ＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物をＬＢ中で１：１００に希釈し、振とう（２００ｒｐｍ）させながら吸光度が０．８となるまで成長させ、その時点で培養物を室温に冷却し、無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ヒアルロニダーゼの発現を誘導した。
１８時間誘導後、細胞を遠心沈降させ、上清を収集した。無細胞培地を生成するために、澄明な上清を、０．２２ミクロンフィルターを通してさらに濾過し、いかなる残留細菌も除去し、氷上に置いた。
次に、上清をウェスタンブロットによって解析した。上清２５μＬ中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してヒアルロニダーゼを検出した。結果を図３１Ｂに示す。分泌されたマウスおよびヒトヒアルロニダーゼの両方に関して５０ｋＤａ付近、ならびにｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼに関して５７ｋＤａ付近で単一のバンドを検出した。
遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅによって分泌されたヒアルロニダーゼが活性であるか否かを決定するために、ビオチン化ヒアルロネートコーティングプレートを使用して、製造元の説明書に従って、ヒアルロナンの切断能に関するヒアルロニダーゼ活性アッセイを実施した。簡単に説明すると、ヒアルロニダーゼはポリマーを切断し、それによってプレート上のビオチンが失われ、次いで、これをストレプトアビジン−ＨＰＲおよび基質によって検出することができる。結果を図３２に示し、遺伝子操作された細菌によって分泌されるヒアルロニダーゼが、ヒアルロナンを分解することができることを示している。親株ＳＹＮ１５５７を陰性対照として使用した。分泌されたｌｅｅｃｈヒルヒアルロニダーゼに関して得られた結果を図３３Ａ、図３３Ｂおよび図３３Ｃに示す。
（実施例３４）
操作されたＩＬ−１５産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株
株の構築および生化学分析：
生物活性インターロイキン１５（ＩＬ−１５）を分泌することができる操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、ＩＬ−１５が、Ｓｕｓｈｉドメインとして公知の機能的受容体の形成にとって必要なＩＬ−１５Ｒαの最小の領域に融合されている融合タンパク質を構築した。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは、機能的複合体を形成し、これはトランスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスにおいて、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを発現する隣接するリンパ球の細胞のシグナル伝達、活性化および増殖を刺激する（例えば、Ochoaら、High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology、２０１３年４月１日；２巻（４号）：ｅ２３４１０頁を参照されたい）。ＩＬ−１５の生物活性は、２つの異なる改変：ＩＬ−１５のアミノ酸７２位でのアスパラギンからアスパラギン酸への置換（Zhu X、Marcus WD、Xu W, Lee HI、Han K、Egan JO、 Yovandich JL、Rhode PR、Wong HC. Novel human interleukin-15 agonists. J Immunol.、２００９年；１８３巻：３５９８〜３６０７頁）および／または細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランスプレゼンテーションの模倣によるＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合（Mortierら、Soluble interleukin-15 receptor alpha(IL-15R alpha)-sushi as a selective and potent agonist of IL-15 action through IL-15R betagamma. Hyperagonist IL-15 x IL-15R alpha fusion proteins. J Biol Chem ２００６年；２８１巻：１６１２〜９頁）によって大きく改善される。
改変された組換えＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質を産生するために、Ｎ７２Ｄ変異を有するＩＬ−１５単量体を、２０アミノ酸リンカーによって連結されたｓｕｓｈｉドメインのＣ末端（７８アミノ酸）に融合した。ＩＬ−１５Ｒ ｓｕｓｈｉドメインのＮ末端に、タグの検出、精製、および除去を促進するために、ＦＬＡＧ−タグおよび第Ｘａ因子切断部位を含めた。ペリプラズムへの移行を促進するために、ＩＬ１５融合タンパク質を１０種のメンバーのプラスミドライブラリにクローニングした。分泌された融合タンパク質のコード配列をＥ．ｃｏｌｉでの発現に関してコドン最適化し、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに二本鎖ＤＮＡ断片として注文した。ＤＮＡを受領した後、標準的なクローニング手順を使用して、これを消化し、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにライゲートした。プラスミドライブラリの各メンバーは、低コピー数プラスミド骨格、ならびに多様な最適化リボソーム結合部位および分泌タグの発現を駆動するＰｔｅｔプロモーターを含む。ＩＬ−１５融合体を分泌タグのＣ末端にクローニングした後、プラスミドをＳＹＮ１５５７（デルタＰＡＬ、拡散性外膜（ＤＯＭ）表現型）に形質転換し、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ分泌株ＳＹＮ３５１６−ＳＹＮ３５２５を作製した。構築物配列の非制限的な例には、配列番号１１３２〜１１３７および配列番号１１３８〜１１４４が挙げられる。表３７は、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ株の説明を提供する。表３８は、ＷＴ ＩＬ−１５を使用して生成した株の一覧を提供する。
ＳＹＮ３５２５によるＩＬ−１５の産生およびｉｎ ｖｉｔｒｏ定量
ＩＬ−１５の産生をアッセイするため、および／または生物活性を定量するために、培養物を成長させ、誘導し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉドメイン産生株（ＳＹＮ３５１６−ＳＹＮ３５２５）の両方をＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞を、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００ｎｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地中に再懸濁させた。これらの培養物を３０℃に置き、４時間振とうさせ、ＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉ融合タンパク質産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターの中に通過させて、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
プラスミドライブラリによるＩＬ−１５融合体の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＩＬ−１５産生ライブラリの培養物を誘導し、２連で収集した。これらの上清を連続希釈し、ＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−Ｄ１５００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して定量化した。表３９に示した分泌ライブラリのスクリーニングからのデータは、リーダーペプチドとしてＥ．ｃｏｌｉからのＰｐｉＡ分泌シグナルを含むＳＹＮ３５２５から最大の産生を示した。ＳＹＮ１５５７上清は、ＥＬＩＳＡにおいて交叉反応性を示さなかった（データは示していない）。
ＳＹＮ３５２５からのＩＬ−１５産生をさらに評価するために、株を成長させて、バッフル付きフラスコにおいて最大の収率を生成するように誘導した。ＳＹＮ３５２５の濾過した上清から、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３５２５の試料を３連で希釈し、ＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−Ｄ１５００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）において実行した。これらの分析の結果を表４０に示す。結果は、最大の誘導条件下で、ＳＹＮ３５２５上清がＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応した材料の７３３〜７９５ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は、検出可能なレベルを有しなかった（示していない）。
比較のために、ＷＴ ＩＬ−１５を発現する構築物からの分泌を表４１に示す。
（実施例３５）
細菌によって分泌されたＩＬ−１５の機能的アッセイ
次に、機能的アッセイを実施してＳＹＮ３５２５から分泌されたＩＬ−１５が機能的であることを証明した。ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５は、リガンドが結合するとＩＬ−１５Ｒアルファによってリン酸化されることが示されている。
Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｐａｎ−Ｔ細胞キット（収率＝約５ｅ７個細胞／調製物）を介してヒトロイコフェレーシスから精製した。ＩＬ１５Ｒａ発現を、フィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ）による４８時間の軽度の刺激によって誘導した。活性化Ｔ細胞を、ＩＬ１５発現細菌ＳＹＮ３５２５からの上清によって１５分間処置した。処置した細胞をパラホルムアルデヒドに基づく溶液中で固定した後、９０％メタノール中で厳しい透過処理を行った。ホスホ−ＳＴＡＴ５のモジュレーションを、ＩＬ１５Ｒ＋ＣＤ３＋細胞におけるマルチカラーフローサイトメトリーによって定量化した。結果を図５５に示し、ＳＹＮ３５２５由来ＩＬ１５が、ｒｈＩＬ１５のそれと同等の生物活性を呈することを示す。２つの個々の細菌調製物からの上清の間で一貫した結果が観察された。
（実施例３６）
分泌のための二量体化ＩＬ−１２の構築
株の操作：生物活性インターロイキン１２（ＩＬ−１２）ヘテロ二量体を分泌することができる、操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、２つのインターロイキン−１２単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０））がリンカーによって共有結合により連結されている構築物を生成した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅから産生された組換えヒトＩＬ−１２タンパク質の二量体化を促進するために、１５アミノ酸のリンカー「ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ」（配列番号１２４７）を２つの単量体サブユニット（ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）の間に挿入し、強制的な二量体ヒトＩＬ−１２（ジＩＬ−１２）融合タンパク質を産生し、配列をコドン最適化した。
ペリプラズムへの移行を促進するために、分泌タグをジＩＬ−１２融合タンパク質のＮ末端に付加した。誘導性Ｐｔｅｔプロモーター、リボソーム結合部位、ジＩＬ−１２コード配列、および他の必要なリンカーのエレメントを含むＤＮＡ配列を、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成し、その後高コピー数プラスミドベクターにクローニングした。プラスミドを、ＳＹＮ１５５５、ＳＹＮ１５５６、ＳＹＮ１５５７、またはＳＹＮ１６２５（ｎｌｐｌ、ｔｏｌＡ、ＰＡＬ、またはｌｐｐ欠失をそれぞれ含み、拡散性膜表現型を作製する）に形質転換し、二量体化ヒトＩＬ−１２（ジＩＬ−１２）分泌株を作製した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのためのＳＹＮ３４６６からＳＹＮ３５０５によるジＩＬ−１２の産生：
ＩＬ−１２の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、その後上清を収集し、シェーカープレートを使用して以下のようにＥＬＩＳＡを介して定量化した。陰性対照株（ＳＹＮ１５５５、ＳＹＮ１５５６、ＳＹＮ１５５７、またはＳＹＮ１６２５）およびジＩＬ−１２産生株（ＳＹＮ３４６６からＳＹＮ３５０５）の両方をＬＢ寒天プレート上に播き、それぞれ、クロラムフェニコールまたはクロラムフェニコールとカルベニシリンと共に３７℃で成長させた。一晩成長させた後、個々のコロニーを採取して、成長させる将来のシェーカープレートにおいて２ＹＴブロスの４ｍＬ開始培養物に接種するために使用した。開始培養物には、寒天プレートで使用した同じ抗生物質を接種した。開始培養物が飽和に達すると、培養物を、適切な抗生物質を含む２ＹＴを含む新しいシェーカープレートに１：２５に逆希釈した。この開始培養物を、ＯＤ６００＝約０．８〜１となるまで３７℃で２時間成長させた。次に培養物を、ａＴｃインデューサー（１００マイクロｇ／ｍＬ）を添加することによって誘導した。これらの誘導した培養物を、振とうさせながら３０℃で４時間インキュベートし、ＩＬ−１２産生を促進した。
産生期が終了した後、培養物のシェーカープレートをインキュベータから取り出し、２００００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにした。上清をＥＬＩＳＡ分析のために維持した。
ＥＬＩＳＡによる上清中のジＩＬ−１２の定量：
上清中のジＩＬ−１２の量を評価するために、試料を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのヒトＩＬ−１２ ｐ７０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイした。これらの分析の結果を、表４５に示す。結果は、上清が、ＩＬ−１２ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の１７から３０９ｐｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は、検出不能レベルを有した。
（実施例３７）
操作されたＩＬ−１５産生Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株
株の操作
生物活性インターロイキン１５（ＩＬ−１５）を分泌することができる操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株を生成するために、Ｓｕｓｈｉドメインとして公知の、機能的受容体の形成にとって必要なＩＬ−１５Ｒαの最小領域に、ＩＬ−１５を融合させる融合タンパク質を構築した。ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαは、機能的複合体を形成し、これはトランスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスにおいて、ＩＬ−２Ｒβおよびγｃを発現する隣接するリンパ球の細胞のシグナリング、活性化、および増殖を刺激する（例えば、Ochoaら、High-density lipoproteins delivering interleukin-15；Oncoimmunology.２０１３年４月１日；２巻（４号）：ｅ２３４１０頁を参照されたい）。ＩＬ−１５の生物活性は、細胞会合ＩＬ−１５ＲαによるＩＬ−１５のトランスプレゼンテーションを模倣することによって、ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインとの直接融合によって大きく改善する（Mortierら、Soluble interleukin-15 receptor alpha (IL-15R alpha) -sushi as a selective and potent agonist of IL-15 action through IL-15R betagamma. Hyperagonist IL-15 x IL-15R alpha fusion proteins. J Biol Chem、２００６年；２８１巻：１６１２〜９頁）。
組換えＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質を産生するために、ＩＬ−１５単量体を２０アミノ酸リンカーによって連結されたｓｕｓｈｉドメインのＣ末端に融合させた。ペリプラズムへの移行を促進するために、１９４１０、ｔｏｒｔ、またはｐｅｌＢ分泌タグをＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ融合タンパク質のＮ末端に添加した。Ｐｔｅｔプロモーター、ＲＢＳ、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉのコード配列、および他の必要なリンカーを含むＤＮＡ配列は、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが合成し、その後、ｔｅｔ誘導性プロモーターの制御下でＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓが提供する高コピー数プラスミドベクターにクローニングした。プラスミドをＳＹＮ１５５７（デルタＰＡＬ、拡散可能な外膜（ＤＯＭ）表現型）またはＳＹＮ９４（ＰＡＬ欠失なしのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株）に形質転換し、ＩＬ−１５−Ｓｕｓｈｉ分泌株ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３を作製した。表４６および表４７は、構築物配列の多数の非制限的な例を記載する。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのためのＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３によるＩＬ−１５の産生：
ＩＬ−１５の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、上清を収集してＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉドメイン産生株ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の両方を、ＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導した培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞をアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００μｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地に再懸濁した。これらの培養物を３０℃置き、４時間振とうさせ、ＩＬ−１５−ｓｕｓｈｉ融合タンパク質の産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出して、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
ＥＬＩＳＡによるＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の上清中のＩＬ−１５の定量化：
濾過した上清中のＩＬ−１５の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の試料を３連で希釈し、ヒトＩＬ−１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒａ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。これらの分析の結果を表４８に示す。結果は、ＳＹＮ３４５８からＳＹＮ３４６３の上清が、ＩＬ−１５ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の４〜２７５ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ９４およびＳＹＮ１５５７上清は、検出不能レベルを有した（示していない）。
（実施例３８）
ＣＸＣＬ１０の分泌
組換えＣＸＣＬ１０ケモカインを産生するために、合成構築物を考案した（データは提供していない）。ＣＸＣＬ１０タンパク質の分泌型／可溶性型を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に関してコドン最適化し、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに二本鎖ＤＮＡ断片として注文した。ペリプラズムへの移行を促進するために、ＣＸＣＬ１０可溶性タンパク質を、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにクローニングした。ＤＮＡを受領後、標準的なクローニング手順を使用して、これを消化し、１０種のメンバーのプラスミドライブラリにライゲートした。プラスミドライブラリの各メンバーは、低コピー数プラスミド骨格、および様々な最適化リボソーム結合部位の発現を駆動するＰｔｅｔプロモーター、および分泌タグを含む。ＣＸＣＬ１０を分泌タグのＣ末端にクローニングした後、プラスミドをＳＹＮ１５５７（ΔＰＡＬ、拡散性外膜（ＤＯＭ）表現型）に形質転換し、ＣＸＣＬ１０分泌株、ＳＹＮ３４０４およびＳＹＮ３４０６〜ＳＹＮ３４１４を作製した。構築物の配列は、配列番号１２０５、配列番号１２０６、配列番号１２０８、および配列番号１２０９を含む。
ＣＸＣＬ１０の産生に関してアッセイするためおよび／または生物活性を定量化するために、培養物を成長させて誘導し、上清を収集してＥＬＩＳＡによって定量化した。アッセイ日の前に、陰性対照株（ＳＹＮ１５５７）およびＣＸＣＬ１０産生株（ＳＹＮ３４０４〜ＳＹＮ３４１４）の両方を、ＬＢ寒天プレート上に播き、適切な抗生物質と共に３７℃で成長させた。２ＹＴブロスの２ｍＬ開始培養物に、成長させる誘導した培養物５０ｍＬ毎に単一のコロニーを接種し、３７℃で２時間成長させ、８０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞をアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）インデューサー（１００ｎｇ／ｍＬ）を有する当初の体積の２ＹＴ培地に再懸濁した。これらの培養物を３０℃に置き、４時間振とうさせ、ＣＸＣＬ１０タンパク質の産生を誘導した。次に、培養物をインキュベータから取り出して、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、全ての細胞をペレットにして、上清を、０．２２μｍフィルターの中に通過させて、滅菌した上清を生じた。これらの上清を細胞に基づくアッセイにおいて使用した。
プラスミドライブラリによるＣＸＣＬ１０の産生を評価するために、ＳＹＮ１５５７およびＣＸＣＬ１０産生ライブラリの培養物を誘導し、２連で収集した。これらの上清を連続希釈し、ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−ＤＩＰ１００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して定量化した。表５０に示す本発明者らの分泌ライブラリのスクリーニングからのデータは、リーダーペプチドとしてＥ．ｃｏｌｉからのＰｈｏＡ分泌シグナルを含むＳＹＮ３４１３から最大の産生を示す。ＳＹＮ１５５７の上清は、ＥＬＩＳＡにおいて交叉反応性を示さなかった（データは示していない）。
ＳＹＮ３４１３からのＣＸＣＬ１０の産生をさらに評価するために、株をバッフル付きフラスコ中で最大収率を生成するように成長させて誘導した。ＳＹＮ３４１３の濾過した上清から、ＳＹＮ１５５７およびＳＹＮ３４１３の試料を３連で希釈し、ＥＬＩＳＡキット（ヒトＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット−ＤＩＰ１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）において実行した。これらの分析の結果を表１１２に示す。結果は、最大の誘導条件では、ＳＹＮ３４１３上清が、ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡアッセイにおいて正に反応する材料の１９９〜２３２ｎｇ／ｍＬの間を含むことを示した。これに対し、ＳＹＮ１５５７上清は検出可能なレベルを有しなかった（示していない）。
CXCL10の機能的アッセイ
上記の株のいずれかから分泌されたＣＸＣＬ１０が、機能的であるか否かを決定するために、走化性アッセイを、本質的にＭｉｋｕｃｋｉら（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mikuckiら、Non-redundant Requirement for CXCR3 Signaling during Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor Vascular Checkpoints；Nat Commun．２０１５年；６巻：７４５８頁）に記載されているとおりに実施する。
簡単に説明すると、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ標識ナイーブ（または拡大増殖した）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＴＸまたは抗ＣＸＣＬ１０の存在下または非存在下で、上部にＴ細胞（５×１０５個細胞）を有し、下部にｒＣＸＣＬ１０／上清を有する２４ウェルトランスウェルプレート（５μＭ孔）に移す。−＞細胞を３時間インキュベートし、遊走した細胞をフローサイトメトリーによって計数する。あるいは、ホスホＡＫＴを、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、またはＥＬＩＳＡによって測定する。
（実施例３９）
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株の生成
ＳＴＩＮＧアゴニスト株を生成するために、ＤａｃＡ（ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ環状ジＡＭＰシンターゼ）を、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５にクローニングし、表５３に記載される株を生成した。構築物の配列を要約する。
（実施例４０）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＴＩＮＧアゴニスト産生
新たに生成した株がｃ−ジ−ＡＭＰを産生する能力を、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２７（ＤａｃＡ構築物を含む）および対照株をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）を補充したＭ９最少培地中で１：２５に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させた。培養物を吸光度が０．５となるように希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＤａｃＡの発現を誘導した。４時間誘導後、試料を、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために採取した。試料を５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジ−ＡＭＰを決定し、培地上清を使用して、環状ジ−ＡＭＰの細胞外蓄積を決定した。濃度を、ＬＣ／ＭＳを介して決定した。
結果を図４２Ｂに示し、操作された株が、ｃ−ジ−ＡＭＰを細胞内で産生することができること、および程度は低いものの細胞外でも産生することができることを示している。野生型対照では、環状ジ−ＡＭＰは、細胞内または細胞外分画のいずれにも見出されなかった（データは示していない）。
（実施例４１）
細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストは免疫応答を誘導する
細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストまたは細菌の骨格そのものが免疫応答の誘導の原因であるか否かを決定するために、生きたおよび熱殺菌したＳＹＮ３５２７をＲＡＷ ２６７．４マウスマクロファージ細胞系の上清に添加し、ＩＦＮ−ベータ１ ｍＲＮＡのレベルを測定した。
図４３に示すように、ＩＦＮｂ１ ｍＲＮＡ発現は、ｃ−ジ−ＡＭＰ分泌株によって用量依存的に増加するが、熱殺菌した場合には増加しない。
（実施例４２）
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＳＴＩＮＧアゴニスト産生株ＳＹＮ３５２７（プラスミドに基づく、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のテトラサイクリン誘導性ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−ＤａｃＡを含むＥ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ）の忍容性、定着、および活性を決定するために、腫瘍体積、重量、およびＴ細胞応答を、Ｂ１６腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験のための細胞を産生するため、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティングによって濃度を試験した。
マウスにＢ１６腫瘍を移植し、以下に記載のタイムラインおよび図４４Ａに従ってマウスに細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストおよび対照を腫瘍内注射した。様々な時点で採取した試料を、腫瘍１グラムあたりのＣＦＵ数、サイトカイン分析（ＩＦＮ−ベータおよびＴ細胞パネル）、および腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）のフローサイトメトリー分析のために処理した。
簡単に説明すると、Ｂ１６細胞を−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中に２×１０ｅ５個細胞／マウス）移植した。−３日目に腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が１日目に約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを、以下のような腫瘍内投与のための群（１群あたりＮ＝１５／マウス５匹／時点）に無作為化した：食塩水（対照、群１）、ＳＹＮ９４（ストレプトマイシン抵抗性Ｎｉｓｓｌｅ、群２、１×１０ｅ７）、およびＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧアゴニスト、群３、１×１０ｅ７）。動物に、群に基づいて適切な細菌または食塩水（注射のための対照）を投与した。４時間後、マウスを、１０μｇ ＡＴＣ（アンヒドロテトラサイクリン）の腹腔内注射により処置した。２日目に、各処置群からのマウス５匹を、ＡＴＣ投与の２４時間後に１群あたりマウス５匹犠牲にし（群１〜４）、試料を分析のために処理した。４日目に、マウスの体重を測定し、腫瘍体積を測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。４時間後、マウスに１０μｇ ＡＴＣを注射した。５日目に、マウス５匹／群をＡＴＣ投与の２４時間後に犠牲にした。８日目に残りのマウスの腫瘍を秤量し、測定し、マウスに適切な処置／群を投与した。９日目にマウス５匹／群を、ＡＴＣ投与の２４時間後に犠牲にした。
１、４、および９日目での腫瘍体積を図４４Ｂに示し、個々のマウスに関して図４４Ｃに示し、ＳＹＮ３５２７の投与によって、この期間にわたって腫瘍成長の拒絶または制御が起こったことを示している（９日目でのＳＹＮ３５２７に関してｐ＜０．０２対食塩水対照）。ＳＴＩＮＧアゴニスト産生細菌の投与後９日目での図４４Ｄに示す腫瘍重量は、食塩水対照処置と比較して有意な腫瘍の退縮を示す（ｐ＜０．０２）。腫瘍流入領域リンパ節からのリンパ球のフローサイトメトリー分析は、細胞を単細胞懸濁液に入れ、以下の抗体によって染色することによって実施した：抗ＣＤ４−ＡＰＣ、ＴＣＲ−ベータ−ＰＥＣｙ７、ＣＤ８−アルファ−ＢＶ７８５、ＣＤ２５−ＢＶ６５０、およびＦｏｘＰ３−ＰＥ（全て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから）。腫瘍の退縮は、フローサイトメトリー分析によって測定すると、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）におけるＴ細胞総数の増加と相関し（ＳＹＮ３５２７に関してｐ＜０．０３対食塩水対照）、このことは腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化および拡大増殖を示しうる（図４４Ｅ）。
サイトカイン分析に関して、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを、製造元の説明書に従って実施した。細菌産生ＳＴＩＮＧアゴニストによる生得の免疫系の活性化を決定するために、ＩＮＦ−ベータ１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、およびＭＣＰ−１（Ｃｃｌ２））のレベルをアセスメントし、２日目および９日目の結果を、図４５Ａおよび図４５Ｂならびに図４６Ａおよび図４６Ｂに示す。結果は、ＳＹＮ３５２７によって産生されたＳＴＩＮＧアゴニストが、２日目で腫瘍中のＩＦＮ−ベータ産生を有意に増加することができること（Ｐ＜０．００８対対照またはＳＹＮ９４）、ならびに２日目で食塩水およびＮｉｓｓｌｅ単独と比較してＩＬ−６（ｐ＜０．００６対対照）、ＴＮＦ−アルファ（＊＊ ｐ＜０．００２対対照、＊ ｐ＜０．０１対ＳＹＮ９４）およびＭＣＰ−１誘導によって示されるように、一般的な生得の免疫応答を誘導することができるが、９日目では誘導できないことを示している。２日目での腫瘍内の生得の応答は、Ｔ細胞関連サイトカインであるグランザイムＢ（ｐ＜０．００６対対照；ｐ＜０．０３対ＳＹＮ９４）、ＩＬ−２（ｐ＜０．０３対対照）、およびＩＬ−１５（ｐ＜０．０５対対照またはＳＹＮ９４）の産生によって示されるように、９日目でＴ細胞関連応答に切り替えられた（図４６Ｂ）。
（実施例４３）
ＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４の全身投与と組み合わせたアデノシン消費株の活性
アデノシン消費株ＳＹＮ１６５６が、抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１の組合せの抗腫瘍応答を増強する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６−ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいてアセスメントした。
試験において使用する細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
表５４における試験デザインに従って、マウスにＭＣ３８腫瘍を移植し、マウスにアデノシン消費細菌を腫瘍内に注射し、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体を腹腔内に注射した。ＭＣ３８細胞を、−９日目に各動物の右脇腹にＳＣ（１×１０５個／マウス／１００μＬ）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；１日目に腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを表５４に示す処置群に無作為化した。
腫瘍体積および体重を２回の測定の間に１〜２日の間隔を空けて週に３回記録した。
結果は、アデノシン消費株が、ＭＣ３８モデルにおいて抗ＣＴＬＡ−４／抗ＰＤ−１抗体媒介性抗腫瘍活性を改善する能力を有することを示している。具体的には、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４群では、完全な応答を示した１２匹中１匹を含むマウス１２匹中５匹が処置に応答した。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＳＹＮ１６５６群では、同数（１２匹中５匹）が応答したが、５匹の応答体のうち少なくとも４匹は完全な応答体であった。
（実施例４４）
５−ＦＣを５−ＦＵに変換するための株の生成
５−ＦＵは、その全身毒性によって制限される一般的な化学療法剤である。しかし、５−ＦＣは、かなり良好に忍容される。ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）、またはｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）とｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）の融合体を使用すると、５−ＦＣを、関連する副作用を最小限にしながら、腫瘍において活性薬型の５Ｆ−ＵＭＰに変換することができる。
５−ＦＵ産生株を生成するために、ｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）またはｃｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）とｕｐｐ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）の融合体を、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５ベクターにクローニングし、表５８に記載される株を生成した。
（実施例４５）
５−ＦＣの５−ＦＵへのｉｎ ｖｉｔｒｏでの変換
新たに生成した株が５−ＦＣを５−ＦＵに変換する能力を、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。
上記のＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ３５２９、ＳＹＮ３６２０、およびＳＹＮ９４対照（ストレプトマイシン抵抗性を有する野生型Ｎｉｓｓｌｅ）をＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）を補充したＭ９最少培地中で１：５０に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させ、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を培養物に１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＣｏｄＡまたはＣｏｄＡ−Ｕｐｐ融合体の発現を誘導した。２時間誘導後、培養物を遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞ペレットをＭ９＋０．５％グルコース（重量／体積）＋ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋１０ｍＭ ５−フルオロシトシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））に再懸濁させた。次いで、これらの培養物を３７℃のインキュベータに戻し、振とうさせながらさらに２時間インキュベートし、その時点で試料を、５−ＦＵ産生のＬＣ／ＭＳ分析のために除去した。試料を５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離して、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に細胞ペレットを使用して、細胞内５−ＦＣおよび５−ＦＵを決定し、培地上清を使用して、５−ＦＵの細胞外蓄積または５−ＦＣの消費を決定した。
結果を、図４７Ａおよび図４７Ｂに示し、操作された株が、野生型対照株より速い速度で５−ＦＣを分解することができ（図４７Ａ）、５−ＦＵを産生することができる（図４７Ｂ）ことを示している。５−ＦＵＭＰに関して利用可能な標準物質がないために、本発明者らは、ＳＹＮ３６２０からの５−ＦＵＭＰの蓄積を測定することができなかった。
（実施例４５）
ＣＴ２６腫瘍モデルにおける５Ｆ−Ｃから５−ＦＵへの変換体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
５−ＦＣから５−ＦＵへの変換株ＳＹＮ３５２９（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ（シトシンデアミナーゼ）を含む）およびＳＹＮ３６２０（ｐＵＣ−Ｋａｎ−ｔｅｔ−ＣｏｄＡ：：Ｕｐｐ融合体を含む）のｉｎ ｖｉｖｏ活性および有効性を決定するために、腫瘍体積をＣＴ２６腫瘍モデルにおいてアセスメントし、ＰＢＳ対照と比較した。
試験のための細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
以下および図４９Ａに記載されるタイムラインに従って、マウスにＣＴ２６腫瘍を移植し、５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができる細菌産生酵素またはビヒクル対照を腫瘍内に注射し、５−ＦＣを投与した。腫瘍体積を様々な時点で測定し、実験終了時に腫瘍を秤量し、処理して、株の生物活性の測定として５−ＦＣの相対的消費を評価した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を−１５日目に各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長を、腫瘍が約１５０〜４５０ｍｍ３に達するまでモニタリングした。０日目に、マウスを以下のように腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝５）に無作為化した：ＰＢＳ（群１、ビヒクル対照）、ＳＹＮ３５２９（群２、１×１０７ＣＦＵ）、ＳＹＮ３６２０（群３、１×１０７ＣＦＵ）。腫瘍サイズを測定し、０、２、および５日目にＡＴＣ（１μｇ Ｉ．Ｐ．）投与の４時間後に、マウスに細菌またはＰＢＳをＩ．Ｔ．注射した。３日目に開始して、５−ＦＣ（５００ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射によって毎日投与した。マウスを６日目に最終分析のために犠牲にした。
０、２、および５日目での平均腫瘍体積を図４９Ｂに示し、個々のマウスに関して図４９Ｃに示し、５−ＦＣと共にＳＹＮ３５２９またはＳＹＮ３５６０のいずれかを投与することにより、ＰＢＳ対照と比較してこの期間にわたって腫瘍成長の鈍化が起こることを示している。図４９Ｄに示す、細菌投与の６日後で５−ＦＣ投与の３日後の腫瘍重量は、ＰＢＳ対照処置と比較して腫瘍質量の低減を示す。腫瘍ホモジネートの質量分析により、ＰＢＳ対照と比較して細菌定着腫瘍では５−ＦＣレベルが低減することが証明され、５−ＦＣがその活性型５−ＦＵへとその場で変換されたことを示唆している（図４９Ｅ）。
（実施例４６）
キヌレニン消費体とＳＴＩＮＧアゴニスト産生体の組合せの生成および株の活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定
キヌレニンを消費してＳＴＩＮＧアゴニストを産生する株を生成するために、ＳＹＮ２０２８（Ｎｉｓｓｌｅ ＨＡ３／４：：ＰＳｙｎＪ２３１１９−ｐＫｙｎａｓｅ ＴｒｐＥ：：ＣｍＲを含む）を、ＳＹＮ３５２７において既に使用された構築物（Ｐｔｅｔプロモーターの制御下でｐ１５ベクターにクローニングされたＤａｃＡ）によって形質転換し、表５７に記載される株を生成した。
次に、新たに生成された株がキヌレニンを消費してＳＴＩＮＧアゴニストを産生する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏでアセスメントした。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株ＳＹＮ０９４（野生型対照）、ＳＹＮ２０２８（ＫＹＮ）、ＳＹＮ３５２７（ＳＴＩＮＧ）、およびＳＹＮ３８３１（ＫＹＮ＋ＳＴＩＮＧ）を、適切な抗生物質を含むＬＢ培地中で一晩成長させた。培養物を、０．５％グルコース（重量／体積）および適切な抗生物質を補充したＭ９最少培地またはＬＢおよび抗生物質中で１：２５に希釈し、振とう（３５０ｒｐｍ）させながら３７℃で２時間成長させた。
環状ジ−ＡＭＰ産生の測定のために、Ｍ９培地中での培養物を同じＭ９補充培地によって吸光度（６００ｎｍ）が０．５となるまで希釈し、その時点で無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で培養物に添加し、ＤａｃＡの発現を誘導した。細胞をさらに４時間誘導して、環状ジ−ＡＭＰを蓄積させた。
試料を、環状ジヌクレオチド産生のＬＣ／ＭＳ分析のために除去した。試料を１００００×ｇで５分間遠心分離し、細胞分画と細胞外分画とを分離した。次に、細胞ペレットを使用して、細胞内環状ジ−ＡＭＰを決定した。濃度を、ＬＣ／ＭＳを介して決定した。
キヌレニン消費を定量化するために、ＬＢ培養物を遠心沈降させて、１００μＭ Ｌ−キヌレニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含むＬＢ中に、吸光度（６００ｎｍ）が１．０となるように再懸濁させた。次いで、これらの培養物を３７℃に置き、４時間振とうさせ、キヌレニンを消費させた。キヌレニン消費の測定に関して、試料を各培養物から除去し、１００００×ｇで５分間遠心沈降させ、細胞分画と細胞外分画とを分離した。培地上清を除去し、ＬＣ／ＭＳ分析を介してキヌレニンの消費を決定するために使用した。
図５０Ａに示す結果は、操作された株ＳＹＮ３８３１が、ＳＹＮ３５２７と類似の環状ジ−ＡＭＰを産生することができることを示し、そのキヌレニン消費親株ＳＹＮ２０２８は、環状ジ−ＡＭＰを産生することができなかった。図５０Ｂの結果は、新たな組合せ株ＳＹＮ３８３１もまた、その親株ＳＹＮ２０２８と同様にキヌレニンを消費する能力を保持したことを示している。まとめると、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組合せ株ＳＹＮ３８３１は、ＳＴＩＮＧアゴニストである環状ジ−ＡＭＰを産生する能力と共にＡＨＲアゴニストであるキヌレニンを消費する能力の両方を保有することを支持する。
（実施例４７）
分泌されたＩＦＮ−ガンマの機能的アッセイ
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＩＦＮ−ガンマが機能的であることを証明する試験を実施した。細胞に基づくアッセイを、ＩＦＮガンマがその受容体に結合した場合のＳＴＡＴ１のリン酸化の増加に基づいて用いた。ＩＦＮ−ガンマの生物活性は、フローサイトメトリーを介するＳＴＡＴ１リン酸化の定量によって決定することができる。
次に、遺伝子操作された細菌から分泌されたＩＦＮ−ガンマが機能的であることを証明する試験を実施した。細胞に基づくアッセイを、ＩＦＮガンマがその受容体に結合した場合のＳＴＡＴ１のリン酸化の増加に基づいて用いた。ＩＦＮ−ガンマの生物活性は、フローサイトメトリーを介してＳＴＡＴ１リン酸化の定量によって決定することができる。
簡単に説明すると、マウスＲＡＷ２６４．７細胞を、マウスＩＦＮｇ発現細菌（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇを含むＳＹＮ３５４３）からの上清によって１５分間処置した。処置した細胞をパラホルムアルデヒドに基づく溶液中で固定した後、９０％メタノール中で厳しい透過処理を行った。ホスホ−ＳＴＡＴ１のモジュレーションをフローサイトメトリーによって定量化し、結果を図５７Ａおよび５７Ｂに示す。
図５７Ａおよび図５７Ｂは、２つの独立したアッセイにおけるＳＹＮ３５４３の生物活性を示す。
（実施例４８）
ＣＤ４０Ｌ分泌株ＳＹＮ３３６７のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＣＤ４０Ｌ分泌株ＳＹＮ３３６７（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐＵＣ−ｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ｍＣＤ４０Ｌ １１２−２６０を含む；本実施例および図５１においてＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を決定するために、腫瘍内抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を、フローサイトメトリーによってアセスメントし、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいてＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本実施例および図５１においてＳＹＮと呼ぶ）、または組換えマウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかによる処置と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約８０〜１００ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝６）に無作為化した：ＳＹＮ１５５７（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）、ＳＹＮ３３６７（ｍＣＤ４０Ｌ分泌体、群２、１×１０７個）、および組換えｍＣＤ４０Ｌ（１μｇ；群３）。０日目に、マウスに細菌をＩ．Ｔ．注射した。１、４、および７日目に全ての群にＡＴＣ １μｇを、ＩＰ注射により注射した（３回のパルス）。１、４、および７日目に、群３を組換えＣＤ４０Ｌ １μｇのＩ．Ｔ．注射により処置した。８日目に、全てのマウスを犠牲にし、マウス３匹を、腫瘍内ＡＰＣの活性化をフローサイトメトリーによって分析するために利用し、マウス３匹を、ＣＦＵプレーティングを介して細菌定着を測定するために利用した。
３つの代表的な腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図５１Ｂに示されるように、ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、最大１×１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍に達した。３つの代表的な腫瘍からの腫瘍内ＡＰＣのフローサイトメトリー分析を、腫瘍をＤＮアーゼとリベラーゼＴＬ（Ｓｉｇｍａ）の混合物中、３７℃で３０分間消化し、細胞を単細胞懸濁液に入れ、以下の抗体によって染色することによって実施した：抗ＭＨＣＩＩ（ＩＡ／ＩＥ）、ＣＤ４５．２、ＣＤ４０、Ｇｒ１、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄから）。ＣＴ２６腫瘍をＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌによって処置すると、腫瘍内樹状細胞においてより高レベルのＣＣＲ７発現が得られ（ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌに関してｐ＜０．０４対ＳＹＮ対照）、マクロファージにおいても同様に高い発現傾向が見られた（図５１Ｃ）。さらに、ＣＤ４０に関するより高い発現傾向は、腫瘍中の樹状細胞とマクロファージの両方について観察された。これらの結果は、ＳＹＮ−ＣＤ４０Ｌによる処置によって、腫瘍内の重要なＡＰＣサブセットの活性化の増加が起こることを示唆している。
（実施例４９）
ＣＴ２６腫瘍におけるｈＴＮＦαの活性
ｈＴＮＦａ発現株ＳＹＮ２３０４（ＰＡＬ：：ＣＭ ｐ１５ａ ＴｅｔＲ Ｐｔｅｔ−ＰｈｏＡ−ＴＮＦアルファを含む；本実施例および図５２においてＳＹＮ−ＴＮＦαと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を決定するために、ＣＴ２６腫瘍において腫瘍体積をアセスメントし、ＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本実施例および図５２においてＳＹＮと呼ぶ）と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するために、一晩培養物を使用して、抗生物質と共にＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期終期（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）に達するまで振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）によって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を、各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝５）に無作為化した：ＳＹＮ（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）およびＳＹＮ−ＴＮＦα（ＴＮＦ−アルファ分泌体、群２、１×１０７個）。０および４日目に、マウスに細菌をＩ．Ｔ．注射した。１および４日目に両方の群にＡＴＣ １μｇを、ＩＰ注射により投与した（２回のパルス）。腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図５２Ｂに示すように、ＳＹＮ−ＴＮＦαは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、１ｘ１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍にまで達した。ｈＴＮＦαの腫瘍内発現は、ｈＴＮＦα ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した場合にＳＹＮ−ＴＮＦα処置ＣＴ２６腫瘍に限って検出された（図５２Ｃ）。図５２Ｄに示す結果は、ＳＹＮによる処置（Ｐ＜０．０２）と比較するとＳＹＮ−ＴＮＦαによって処置したＣＴ２６腫瘍では最初の細菌投与の７日後で、腫瘍の成長の有意な低減を示す。まとめると、これらの結果は、ＳＹＮ−ＴＮＦαが、ＣＴ２６腫瘍において定着および持続することができ、そこでそれらがｈＴＮＦαの検出可能なレベルを発現し、それによって腫瘍の成長の有意な低減をもたらすことを証明する。
（実施例５０）
ｍＩＦＮガンマ分泌株ＳＹＮ３３６７のｉｎ ｖｉｖｏでの活性
ＩＦＮガンマ発現株ＳＹＮ３３６７（ＰＡＬ：：Ｃｍ ｐ１５ａ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡ−ｍＩＦＮｇを含む；本明細書においてＳＹＮ−ＩＦＮγと呼ぶ）のｉｎ ｖｉｖｏ動力学を決定するために、ＣＴ２６腫瘍を処置し、ＳＹＮ１５５７（ＤＯＭ変異体；本明細書においてＳＹＮと呼ぶ）処置腫瘍と比較した。
試験のための細菌細胞を産生するため、一晩培養物を使用して、抗生物質を含むＬＢ培地５００ｍＬに接種した。株を、培養物が、対数期の終期に達するまで（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）、振とうさせながら３７Ｃでインキュベートした。収集するために、細胞を５０００ｒｐｍで２０分間遠心沈降させ、培地を吸引し、細胞をＰＢＳによって洗浄し、１５％グリセロールおよびＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにして、−８０Ｃで凍結した。細胞は、連続プレーティングによって濃度を試験した。
簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞を、各動物の右脇腹にＳＣ（ＰＢＳ中で１×１０６個細胞／マウス）移植した。腫瘍の成長をモニタリングした；腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３に達すると、マウスを以下の腫瘍内投与の群（１群あたりＮ＝６）に無作為化した：ＳＹＮ（漏出表現型ＤＯＭ変異体、群１、１×１０７個）およびＳＹＮ−ＩＦＮγ（ＩＦＮガンマ分泌体、群２、１×１０７個）。０日目および３日目に、マウスに適切な細菌株を投与した。１、４および７ ４日目に、全てのマウスにＡＴＣ １μｇを、Ｉ．Ｐ．で注射した（３回のパルス）。８日目に全てのマウスを犠牲にし、マウス３匹を、ＣＦＵプレーティングを介して腫瘍内細菌定着を測定するために利用し、マウス３匹をＥＬＩＳＡによって腫瘍内ＩＦＮγ産生を分析するために利用した。腫瘍をホモジナイズし、腫瘍ホモジネートを連続希釈し、コロニー形成単位濃度を測定するために適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。図ＸＢに示すように、ＳＹＮ−ＩＦＮγは、ＳＹＮと類似の程度に腫瘍に定着し、１ｘ１０８ＣＦＵ／グラム腫瘍にまで達した。ＩＦＮγの腫瘍内発現は、マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した場合にＳＹＮ−ＩＦＮγ処置ＣＴ２６腫瘍に限って検出された（図５３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＳＹＮ−ＩＦＮγが、ＣＴ２６腫瘍において定着および持続することができ、そこでそれらがＡＴＣによる誘導後にＩＦＮγの検出可能なレベルを発現することを証明する。
（実施例５１）
分泌されたＣＸＣＬ１０の機能的アッセイ
上記の株のいずれかから分泌されたヒトＣＸＣＬ１０が機能的であるか否かを決定するために、走化性アッセイを、本質的にＭｉｋｕｃｋｉら（その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mikuckiら、Non-redundant Requirement for CXCR3 Signaling during Tumoricidal T Cell Trafficking across Tumor Vascular Checkpoints；Nat Commun．２０１５年；６巻：７４５８頁）に記載されているとおりに実施した。このアッセイにおいて、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（抗ＣＤ３／ＣＤ２８による拡大増殖の８日後）をＣｅｌｌ ｔｒａｃｅバイオレットによって標識し、抗ｈＣＸＣＲ３の存在下または非存在下で、上部にＴ細胞を有し、下部に細菌上清を有する２４ウェルトランスウェルプレート（５μＭ孔）に移した。細胞を３時間インキュベートし、ウェルの底から回収した遊走細胞をフローサイトメトリーによって計数した。
細菌上清を調製するために、株（ＳＹＮ１５５７対照株およびＳＹＮ２９４２（ＰＡＬ：：Ｃｍ Ｐｔｅｔ−８７Ｋ ＰｈｏＡを含む（ＥＣＯＬＩＮ＿０２２５５）））を融解して一晩成長させ、次いで、テトラサイクリンを３時間添加することによってｈＣＸＣＬ１０を発現するように誘導した。上清を滅菌した後、以下に記されるように使用した。Ｔ細胞を調製するために、予め単離した初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）を計数し、収集し、刺激後およそ８日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共にＴ細胞培地に再懸濁させた。ウェルの下部に０．５ｍｌおよび上部に０．１ｍｌの空隙を有し、５μＭ孔径の２４ウェルトランスウェルプレートをアッセイのために使用した。ウェルの下部の細菌上清を調製するために、ＳＹＮ２９４２からの上清を、ＳＹＮ１５５７対照細菌から得た上清中で希釈し、１００％、３３％、１１％、３．７％、および０％ＳＹＮ２９４２を含む混合物を生成した。ウェルの上部を調製するために、Ｔ細胞１００μＬを上部ウェル（およそ２．５×１０個細胞を含む）に添加した。抗ＣＸＣＲ３（マウスＩｇＧ１；クローンＧ０２５Ｈ７）を対照ウェルに最終濃度１μｇ／ｍＬで添加した。プレートを３７Ｃのインキュベータ内に３時間入れた後分析した。分析のために、各下部のウェルの内容物を９６ウェルプレートの２つのウェルに移した。プレートを遠心沈降させ、２つのウェルを合わせて、ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターにおいて分析し、遊走した細胞数を定量化した。初代ヒトＴ細胞は、ＳＹＮ２９４２上清に向かって用量依存的に移動し、これはＣＸＣＬ１０の受容体ＣＸＣＲ３の遮断によって消失した。このデータ（示していない）は、ＳＹＮ２９４２によって産生されたｈＣＸＣＬ１０が生物学的に活性であり、初代Ｔ細胞の移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発するために十分な濃度で豊富に存在することを示唆している。

Claims (136)

  1. １つまたは複数の抗がん分子を産生するための遺伝子配列（複数可）を含む遺伝子操作された微生物であって、前記遺伝子配列（複数可）が、自然には前記遺伝子配列と関連していないプロモーターに作動可能に連結しており、前記１つまたは複数の抗がん分子が、
    （ａ）免疫活性化およびプライミング、
    （ｂ）免疫増強、
    （ｃ）Ｔ細胞拡大増殖、
    （ｄ）間質モジュレーション、および
    （ｅ）これらの組合せ
    から選択されるエフェクター機能を促進する、遺伝子操作された微生物。
  2. 細菌である、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
  3. 前記細菌が、腫瘍を標的とする細菌である、請求項２に記載の遺伝子操作された微生物。
  4. 前記細菌が、グラム陽性菌である、請求項２または請求項３に記載の遺伝子操作された細菌。
  5. 前記細菌が、グラム陰性菌である、請求項２または請求項３に記載の遺伝子操作された微生物。
  6. 前記細菌が、偏性嫌気性細菌である、請求項２〜５のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  7. 前記細菌が、通性嫌気性細菌である、請求項２〜５のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  8. 前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ ＮＴ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍから選択される、請求項４に記載の遺伝子操作された細菌。
  9. 前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２から選択される、請求項５に記載の遺伝子操作された細菌。
  10. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  11. 前記誘導性プロモーターが、低酸素または嫌気条件により誘導される、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  12. 前記誘導性プロモーターが、腫瘍の低酸素環境により誘導される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  13. 前記誘導性プロモーターが、ＦＮＲ誘導性プロモーター、ＡＮＲ誘導性プロモーター、およびＤＮＲ誘導性プロモーターから選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  14. 前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  15. 前記遺伝子配列（複数可）が、ヒアルロニダーゼをコードする、請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子操作された微生物。
  16. 前記遺伝子配列（複数可）が、ヒトヒアルロニダーゼをコードする、請求項１５に記載の遺伝子操作された微生物。
  17. 前記遺伝子配列（複数可）が、ヒアルロニダーゼをコードする、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  18. 前記ヒアルロニダーゼが、分泌される、請求項１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  19. 前記ヒアルロニダーゼが、細胞表面に提示される、請求項１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  20. 前記遺伝子配列（複数可）が、抗ＣＤ４０抗体をコードする、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  21. 前記抗ＣＤ４０抗体が、ｓｃＦｖである、請求項２０に記載の遺伝子操作された細菌。
  22. 前記抗ＣＤ４０抗体が、分泌される、請求項２０または２１に記載の遺伝子操作された細菌。
  23. 前記抗ＣＤ４０抗体が、細胞表面に提示される、請求項２０または２１に記載の遺伝子操作された細菌。
  24. 前記遺伝子配列（複数可）が、ＣＤ４７を標的とする抗がん分子をコードする、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  25. ＣＤ４７を標的とする前記抗がん分子が、ＳＩＲＰアルファの可溶性形態である、請求項２４に記載の遺伝子操作された細菌。
  26. ＳＩＲＰアルファの前記可溶性形態が、分泌される、請求項２５に記載の遺伝子操作された細菌。
  27. ＳＩＲＰアルファの前記可溶性形態が、表面提示される、請求項２５に記載の遺伝子操作された細菌。
  28. ＣＤ４７を標的とする前記抗がん分子が、抗ＣＤ４７抗体である、請求項２４に記載の遺伝子操作された細菌。
  29. 前記抗ＣＤ４７抗体が、ｓｃＦｖである、請求項２８に記載の遺伝子操作された細菌。
  30. 前記抗ＣＤ４７抗体が、分泌される、請求項２８または２９に記載の遺伝子操作された細菌。
  31. 前記抗ＣＤ４７抗体が、表面提示される、請求項２８または２９に記載の遺伝子操作された細菌。
  32. 前記遺伝子配列（複数可）が、ＣＸＣＬ１０をコードする、請求項２〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  33. 前記ＣＸＣＬ１０が、分泌される、請求項３２に記載の遺伝子操作された細菌。
  34. 前記ＣＸＣＬ１０が、表面提示される、請求項３２に記載の遺伝子操作された細菌。
  35. 前記遺伝子配列（複数可）が、ＩＬ−１５をコードする、請求項２〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  36. 前記ＩＬ−１５が、分泌される、請求項３５に記載の遺伝子操作された細菌。
  37. 前記ＩＬ−１５が、表面提示される、請求項３５に記載の遺伝子操作された細菌。
  38. 前記遺伝子配列が、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ｏｍｐＡ、ｃｖａＣ、ＴｏｒＡ、ｆｄｎＧ、ｄｍｓＡ、ＰｅｌＢ、ｔｏｌＢ、ｔｏｒＴ、ｄｓｂＡ、ＧｌｔＩ、ＧｓｐＤ、ＨｄｅＢ、ＭａｌＥ、ｍｇｌＢ、ＯｐｐＡ、ＰｐｉＡ、ｌａｍｂ、ＥＣＯＬＩＮ＿０５７１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１６４９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１９４１０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１９８８０分泌シグナルから選択される分泌タグを含む、請求項２〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  39. 前記分泌タグが、ＰｈｏＡである、請求項３８に記載の遺伝子操作された細菌。
  40. ｌｐｐ、ｎｌＰ、ｔｏｌＡおよびＰＡＬから選択される外膜タンパク質の１つまたは複数の欠失をさらに含む、請求項２〜３９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  41. 欠失または突然変異した外膜タンパク質が、ＰＡＬである、請求項４０に記載の遺伝子操作された細菌。
  42. アデノシンの消費のための遺伝子配列（複数可）を含む、請求項２〜４１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  43. 前記アデノシンの消費のための遺伝子配列（複数可）が、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、およびｘｄｈＣから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項４２に記載の遺伝子操作された細菌。
  44. 前記アデノシンの消費のための遺伝子配列（複数可）が、アデノシンを移入するための輸送体をコードする、請求項２〜４３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  45. 輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、ｎｕｐＣを含む、請求項４４に記載の遺伝子操作された細菌。
  46. 輸送体をコードする前記遺伝子配列（複数可）が、ｎｕｐＧを含む、請求項４４または請求項４５に記載の遺伝子操作された細菌。
  47. 前記遺伝子配列（複数可）が、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、およびｎｕｐＣを含む、請求項４４または請求項４５に記載の遺伝子操作された細菌。
  48. 前記遺伝子配列（複数可）が、ａｄｄ、ｘａｐＡ、ｄｅｏＤ、ｘｄｈＡ、ｘｄｈＢ、ｘｄｈＣ、およびｎｕｐＧを含む、請求項４４または請求項４６に記載の遺伝子操作された細菌。
  49. アルギニンの産生のための遺伝子配列（複数可）を含む、請求項２〜４８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  50. 前記遺伝子配列が、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ａｒｇＩ、ａｒｇＪ、ｃａｒＡ、およびｃａｒＢから選択される１つまたは複数のアルギニン生合成遺伝子をコードする、請求項４９に記載の遺伝子操作された細菌。
  51. アルギニンリプレッサー遺伝子（ａｒｇＲ）において欠失または突然変異を含む、請求項４９または請求項５０に記載の遺伝子操作された細菌。
  52. 前記遺伝子配列（複数可）が、フィードバック耐性ａｒｇＡをコードする、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  53. キヌレニナーゼをコードする遺伝子配列（複数可）を含む、請求項２〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  54. 前記キヌレニナーゼが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのものである、請求項５３に記載の遺伝子操作された細菌。
  55. ｔｒｐＥにおいて突然変異または欠失を含む、請求項５３または請求項５４に記載の遺伝子操作された細菌。
  56. トリプトファンの産生のための遺伝子配列（複数可）を含む、請求項２〜５５のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  57. ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡ、ａｒｏＧ、およびＳｅｒＡから選択される１つまたは複数の遺伝子配列（複数可）をさらに含む、請求項５６に記載の遺伝子操作された細菌。
  58. ａｒｏＧのフィードバック耐性形態（ａｒｏＧｆｂｒ）を含む、請求項５６または５７に記載の遺伝子操作された細菌。
  59. ｔｒｐＥのフィードバック耐性形態（ｔｒｐＥｆｂｒ）を含む、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  60. ｔｒｐＲにおいて突然変異または欠失を含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  61. ｔｎａＡにおいて突然変異または欠失を含む、請求項５６〜６０のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  62. 抗生物質耐性遺伝子配列を含む、請求項２〜６１のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  63. 前記遺伝子配列（複数可）の１つまたは複数が、染色体上に存在する、請求項２〜６２のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  64. 前記遺伝子配列（複数可）の１つまたは複数が、プラスミド上に存在する、請求項２〜６３のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  65. 請求項２〜６４のいずれかに記載の細菌と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  66. １つまたは複数の化学療法剤をさらに含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  67. 前記化学療法剤が、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５−フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）、およびゲムシタビンから選択される、請求項６６に記載の医薬組成物。
  68. 前記化学療法剤が、ゲムシタビンである、請求項６７に記載の医薬組成物。
  69. 膵管癌の処置のための、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  70. 請求項２〜６９のいずれか一項に記載の細菌と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  71. １つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターをさらに含む、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 前記チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ−４インヒビター、ＰＤ−１インヒビター、およびＰＤ−Ｌ１インヒビターから選択される、請求項７１に記載の医薬組成物。
  73. 前記１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択される、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 前記１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項７３に記載の医薬組成物。
  75. 前記１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＰＤ−１抗体である、請求項７３に記載の医薬組成物。
  76. 前記１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項７３に記載の医薬組成物。
  77. 結腸直腸癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項６５〜７６のいずれかに記載の医薬組成物。
  78. 肝細胞癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項６５〜７６のいずれかに記載の医薬組成物。
  79. 進行固形腫瘍の処置、管理および予防において使用するための、請求項６５〜７６のいずれかに記載の医薬組成物。
  80. 請求項６５〜７６のいずれかに記載の医薬組成物と１つまたは複数の化学療法剤とを含む医薬品キット。
  81. 前記化学療法剤が、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５−フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）、およびゲムシタビンから選択される、請求項８０に記載の医薬品キット。
  82. 前記化学療法剤が、ゲムシタビンである、請求項８１に記載の医薬品キット。
  83. 膵管癌の処置のための、請求項８０または請求項８１に記載の医薬品キット。
  84. 請求項６５〜７６のいずれかに記載の医薬組成物と１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターとを含む医薬品キット。
  85. 前記免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ−４インヒビター、ＰＤ−１インヒビター、およびＰＤ−Ｌ１インヒビターから選択される、請求項８４に記載の医薬品キット。
  86. 前記免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択される、請求項８４または請求項８５に記載の医薬品キット。
  87. 結腸直腸癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項８０〜８６のいずれかに記載の医薬品キット。
  88. 肝細胞癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項８０〜８６のいずれかに記載の医薬品キット。
  89. 進行固形腫瘍の処置、管理および予防において使用するための、請求項８０〜８６のいずれかに記載の医薬品キット。
  90. がんの処置またはモジュレートを必要とする対象のがんを処置またはモジュレートする方法であって、請求項８０〜８６のいずれかに記載の医薬品キットの成分を含む処置レジメンを前記対象に施すステップを含む方法。
  91. 前記がんが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される、請求項９０に記載の方法。
  92. がんの処置またはモジュレートを必要とする対象のがんを処置またはモジュレートする方法であって、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
  93. 前記がんが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記細菌が、腫瘍内投与される、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記細菌が、経口投与される、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記細菌が、全身投与される、請求項９３に記載の方法。
  97. がんの処置またはモジュレートを必要とする対象のがんを処置またはモジュレートする方法であって、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む処置レジメンを含む方法。
  98. 前記細菌の前に、後に、またはそれと同時に、１つまたは複数の化学療法剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記化学療法剤が、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ（登録商標）、Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（登録商標）、５−フルオロウラシル、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（登録商標）、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（登録商標）、Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（登録商標）、およびゲムシタビンから選択される、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記化学療法剤が、ゲムシタビンである、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記細菌が、経口投与される、請求項９７〜１００のいずれかに記載の方法。
  102. 前記細菌が、腫瘍内投与される、請求項９７〜１００のいずれかに記載の方法。
  103. 前記細菌が、全身投与される、請求項９７〜１００のいずれかに記載の方法。
  104. 前記がんが、副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳がん（例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化器がん、消化器カルチノイド腫瘍、消化器間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓がん、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、下咽頭がん、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄系白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝がん、肺がん、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、のどのがん、胸腺がん、甲状腺がん、非通常型小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される、請求項１０３に記載の方法。
  105. がんの処置またはモジュレートを必要とする対象のがんを処置またはモジュレートする方法であって、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む処置レジメンを含む方法。
  106. 前記細菌の前に、後に、またはそれと同時に、１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターを投与するステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ−４インヒビター、ＰＤ−１インヒビター、およびＰＤ−Ｌ１インヒビターから選択される、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記１つまたは複数の免疫チェックポイントインヒビターが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択される、請求項１０７に記載の方法。
  109. 結腸直腸癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の方法。
  110. 肝細胞癌の処置、管理および予防において使用するための、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の方法。
  111. 進行固形腫瘍の処置、管理および予防において使用するための、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の方法。
  112. 前記遺伝子配列が、安定化ポリペプチドをコードする配列を含む、請求項２〜６４のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  113. 前記遺伝子配列が、ペプチドリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項１１２に記載の遺伝子操作された細菌。
  114. 前記コードされている抗がん分子が、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して前記安定化ポリペプチドに連結されている、請求項１１３に記載の遺伝子操作された細菌。
  115. 前記コードされている抗がん分子のＣ末端が、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して前記安定化ポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１１３または請求項１１４に記載の遺伝子操作された細菌。
  116. 前記抗がん分子のＮ末端が、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して前記安定化ポリペプチドのＣ末端に連結されている、請求項１１３または請求項１１４に記載の遺伝子操作された細菌。
  117. 前記安定化ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含む、請求項１１２〜１１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  118. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項１１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  119. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項１１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  120. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項１１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  121. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分を含む、請求項１１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  122. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、免疫グロブリン可変ヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域および免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項１１７に記載の遺伝子操作された細菌。
  123. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである、請求項１１７〜１２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  124. 前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃポリペプチドである、請求項１１７〜１２２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  125. 前記リンカーが、グリシンリッチペプチドを含む、請求項１１３〜１２４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  126. 前記グリシンリッチペプチドが、配列［ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ］ｎ（配列中、ｎは、１、２、３、４、５または６である）を含む、請求項１２５に記載の遺伝子操作された細菌。
  127. 前記グリシンリッチペプチドが、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む、請求項１２５または請求項１２６に記載の遺伝子操作された細菌。
  128. 前記抗がん分子が、ＳＩＲＰアルファであり、ＳＩＲＰアルファのＮ末端が、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含むペプチドリンカーを介してＩｇＧ４ ＦｃのＣ末端に連結されている、請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  129. 前記１つまたは複数の抗がん分子が、第１の単量体ポリペプチドおよび第２の単量体ポリペプチドを含む、請求項２〜６４および１１２〜１２７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  130. 前記第１の単量体ポリペプチドが、ペプチドリンカーまたはペプチド結合を介して第２の単量体ポリペプチドに共有結合で連結されている、請求項１２９に記載の遺伝子操作された細菌。
  131. 前記リンカーが、グリシンリッチペプチドを含む、請求項１３０に記載の遺伝子操作された細菌。
  132. 前記第１および前記第２の単量体各々が、異なるポリペプチド配列を有する、請求項１２９〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  133. 前記第１および前記第２の単量体が、同じポリペプチド配列を有する、請求項１２９〜１３１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  134. 前記第１の単量体が、ＩＬ−１２ ｐ３５ポリペプチドであり、前記第２の単量体が、ＩＬ−１２ ｐ４０ポリペプチドである、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  135. 前記リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳを含む、請求項１３４に記載の遺伝子操作された細菌。
  136. 前記第１の単量体が、ＩＬ−１５ポリペプチドであり、前記第２の単量体が、ＩＬ−１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインポリペプチドである、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
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