UA34493C2 - Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти) - Google Patents

Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA34493C2
UA34493C2 UA96114211A UA96114211A UA34493C2 UA 34493 C2 UA34493 C2 UA 34493C2 UA 96114211 A UA96114211 A UA 96114211A UA 96114211 A UA96114211 A UA 96114211A UA 34493 C2 UA34493 C2 UA 34493C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
gene
dna
sequences
pero
Prior art date
Application number
UA96114211A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Дуглас А. ТРЕКО
Мішель В. Хартлейн
Мишель В. Хартлейн
Річард Ф. Селден
Ричард Ф. СЕЛДЕН
Original Assignee
Транскаріотік Терапіс, Інк
Транскариотик Терапис, Инк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22918596&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA34493(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Транскаріотік Терапіс, Інк, Транскариотик Терапис, Инк filed Critical Транскаріотік Терапіс, Інк
Publication of UA34493C2 publication Critical patent/UA34493C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
    • C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Даний винахід стосується вдосконалених способів як отримання in vitro терапевтичних білків, так і отримання і доставки терапевтичних білків за допомогою генної терапії.

Description

Существующие подходь к лечению заболевания путем введения терапевтических белков включают в себя получение іп мо терапевтических белков для общепринятой фармацевтической доставки (напри- мер, посредством внутривенной, подкожной или внутримьішечной иньекции) и, более недавно, генной те- рапии.
Белки терапевтического значения в общем получают путем введения зкзогенной ДНК, кодирующей белок, представляющий интерес для терапии, в подходящие клетки. Например, зкзогенную ДНК, кодирую- щую желаемьй терапевтический белок, вводят в клетки, такие как иммортализованнье ("бессмертнье") клетки, в векторе, таком как плазмида, из которого зкспрессируется кодируемьй белок. Далее, бьло сдела- но предположение, что зндогенньсе клеточньсєе гень и их зкспрессия могут бить модифицировань! генньім наце- ливанием. См., например, О.5. Раїепі Мо 5272 071, УУО 91/06666, УМО 91/06667 и УМО 90/11354.
Доступнье в настоящее время подходь к генной терапиий используют инфекционньсе векторь, такие как ретровируснье векторьі, содержащие генетический материал, которьій должен бьіть зкспрессирован.
Такие подходьї имеют ограничения, такие как возможность генерирования компетентного в отношений реп- ликации вируса во время получения вектора; рекомбинация между геномом терапевтического вируса и зндогенньім ретровирусньім геномом, потенциально генерирующая инфекционньє агенть! с новой клеточ- ной специфичностью, диапазонами хозяев или увеличенньіми вирулентностью и цитотоксичностью; неза- висимая интеграция в большие количества клеток, увеличивающая риск онкогенного инсерционного собь- тия; лимитированная клонирующая емкость в ретровирусе (которая ограничиваєт терапевтическую приме- нимость) и непродолжительная зкспрессия іп мімо целевого продукта. Ценньїм бьл бьї лучший подход для обеспечения генньх продуктов, в частности, подход, которьй не имел бьі ограничений и риска, связанньх с доступньіми в настоящеє время способами.
Краткое изложение существа изобретения.
Данное изобретение касаєтся усовершенствованньх способов как получения іп міго терапевтических белков, так и получения и доставки терапевтических белков посредством генной терапии. В данном спосо- бе зкспрессию желаемого гена-мишени в клетке (т.е. желаеємого зндогенного клеточного гена) изменяют введением посредством гомологической рекомбинации в заранеє вьібранньїй сайт клеточного генома ДНК, которая включаєет в себя по меньшей мере регуляторную последовательность, зкзон и донорньй сайт сп- лайсинга. Зти компоненть! вводят в хромосомную (геномную) ДНК таким образом, что зтом приводит в сущности к получению новой транскрипционной единицьі! (в которой регуляторная последовательность, зкзон и донорньй сайт сплайсинга, присутствующие в конструкции ДНК, оперативно соединень с зндоген- ньім геном). В результате введения зтих компонентов в хромосомную ДНК изменяется зкспрессия желае- мого зндогенного гена.
Измененная зкспрессия гена, в применений зтого вьіражения здесь, включаеєт в себя активацию (или индукцию зкспрессии) гена, которьій в норме является молчащим (незкспрессируемь!м) в полученной клет- ке, увеличенную зкспрессию гена, которьій не зкспрессируется при физиологически значимьх уровнях, в полученной клетке, изменение характера регуляции или индукции, которьй отличается от имеющего место в зтой клетке, и снижение (в том числе исключение) зкспрессии гена, зкспрессируемого в зтой клетке.
Далее данное изобретение касаєтся конструкций ДНК, применимьїх в способе изменения зкспрессийи целевого гена. Зти конструкции ДНК содержат: (а) направляющую последовательность, (Б) регуляторную последовательность, (с) зкзон и (а) неспаренньй донорньй сайт сплайсинга.
Направляющая последовательность в конструкции ДНК направляеєет интеграцию злементов (а) - (а) в ген-мишень в клетке, так что злементь (Б) и (8) оперативно связьіваются с последовательностями зндоген- ного гена-мишени. В другом варианте конструкции ДНК включают в себя: (а) направляющую последовательность; (Б) регуляторную последовательность; (с) зкзон; (4) донорньй сайт сплайсинга; (е) интрони () акцепторньійй сайт сплайсинга, причем направляющая последовательность направляєет интегра- цию злементов (а) - (Ї) таким образом, что злементь (Б) - (ї) оперативно связьіваются с зндогенньїм геном.
Направляющая последовательность гомологична заранеє вьібранному сайту в клеточной хромосомной
ДНК, с которьімм должна иметь место гомологичная рекомбинация. В зтой конструкции зкзон обьічно нахо- дится в 3З'-положенийи от регуляторной последовательности, а донорньій сайт сплайсинга находится 3'- от зкзогена.
Дальнейшее описание служит для иллюстрации двух вариантов данного изобретения, в которьїх пос- ледовательности, расположеннье против хода транскрипции от гена зритропозтина человека П(ЕРО), из- меняют для возможности зкспрессии ПЕРО в первичньх, вторичньїх или иммортализованньмх клетках, кото- рьге не зкспрессируют ЕРО в детектируемьїх количествах в их нетрансфицированном состоянии. В вариан- те 1 направляющая конструкция содержит две направляющие последовательности. Первая направляющая последовательность гомологична последовательностям 5 второй направляющей последовательности и обе последовательности находятся против хода транскрипции от кодирующего ПЕРО района. Направляю- щая конструкция также содержит регуляторньй район (промотор тмтТ--1), зкзон (зкзон 1 гормона роста че-
ловека (ПОН) и неспаренньй донорньй сайт сплайсинга. Продукт гомологичной рекомбинации с зтой нап- равляющей конструкцией показан на фиг.1.
В варианте 2 направляющая конструкция также содержит две направляющие последовательности.
Первая направляющая последовательность гомологична последовательностям внутри регуляторного ра- йона зндогенного ПЕРО, а вторая направляющая последовательность гомологична интрону 1 ПЕРО. Зта направляющая конструкция содержит также регуляторньїйй район (промотор тмтТ-1), зкзон 1 ПОН) и неспа- ренньій донорньїй сайт сплайсинга. Продукт гомологичной рекомбинации с зтой направляющей конструк- цией показан на фиг. 2.
В зтих двух вариантах продукть! собьтий нацеливания представляют собой химернье транскрип- ционнье единиць, которне генерируют зрелую мРНК, в которой первьй зкзон гена гормона роста человека (пон) расположен против хода транскрипции от зкзонов 2-5 ПЕРО. Продукт транскрипции, сплайсинга и трансляции является белком, в котором аминокислотньсе остатки 1-4 сигнального пептида ПЕРО заменень аминокислотньіми остатками 1-3 ПОН. Зти два варианта отличаются как по относительньм положениям регуляторньїх последовательностей направляющей конструкции, которье вводятся, так и по специфичес- кому характеру сплайсинга, коториій должен иметь место для получения конечного процессированного транскрипта.
Далее зто изобретение касаєтся способа получения белка іп міо или іп мімо посредством введения описанной вьіше конструкции в хромосомную ДНК клетки хозяина гомологичной рекомбинацией для полу- чения гомологично рекомбинантной клетки. Гомологично рекомбинантная клетка поддерживаєется затем при условиях, позволяющих транскрипцию, трансляцию и секрецию, что приводит к продуцированию целе- вого белка.
Данное изобретение касаєтся трансфицированньх клеток, таких как трансфицированнье первичнье или вторичньсе клетки (т.е. неиммортализованньсеє клетки) и трансфицированнье иммортализованньє клет- ки, применимьсе для получения белков, в частности, терапевтических белков, способов получения таких клеток, способов использования зтих клеток для получения белков іп міо и способов генной терапии. Клет- ки данного изобретения являются клетками, происходящими из позвоночньх, в частности, из млекопитаю- щих, и, более конкретно, из человека. Клетки, полученньсе по способу данного изобретения, содержат ДНК, кодирующую терапевтический продукт, ДНК, которая сама является терапевтическим продуктом, и/или
ДНК, которая заставляет трансфицированнье клетки зкспрессировать ген на более вьісоком уровне или с характером регуляции или индукции, которьйй отличается от имеющего место в соответствующей нетранс- фицированной клетке.
Данное изобретение касается также способов, при помощи которьх клетки, такие как первичньсє, вто- ричнье и иммортализованнье клетки, трансфицируют для включения зкзогенного генетического материа- ла, способов получения клональньїх клеточньїх штаммов или гетерогенньїх клеточньїх штаммов и способов иммунизации животньїх или получения антител в иммунизированньїх животньїх с использованием трансфи- цированньх первичньх, вторичньїх или иммортализованньмх клеток.
Данное изобретение касаєтся, в частности, способа генного нацеливания или гомологической реком- бинации в зукариотических клетках, таких как клетки, происходящие из грибов, растения или животного, например, позвоночного животного, в частности, млекопитающего, и, даже более конкретно, из человека. т.е. оно касается способа введения ДНК в первичньсе, вторичнье или иммортализованньєе клетки, происхо- дящие из позвоночньїх, посредством гомологичной рекомбинации, так, что зту ДНК вводят в геномную ДНК первичньх, вторичньїх или иммортализованньх клеток в заранеє вьібранном сайте. Используемьсе направ- ляющие последовательности вьібирают относительно сайта, в которьйй должна бьїть вставлена ДНК в нап- равляющей конструкции ДНК. Далее данное изобретение касаєтся гомологично рекомбинантньїх первич- ньІїх, вторичньїх или иммортализованньх клеток, назьіваемьх гомологично рекомбинантньїми (НЕ) первич- ньіми, вторичньіми или иммортализованньїми клетками, полученньїх данньім способом, и применений зтих
НК первичньїх, вторичньх или иммортализованньх клеток.
В одном варианте данного изобретения, в котором изменяют зкспрессию гена, зтот ген активируется.
То-есть, ген, присутствующий в первичньх, вторичньїх или иммортализованньх клетках, происходящих из позвоночньх, которьй обьічно (в норме) не зкспрессируется в зтих клетках, активируется и в результате зкспрессируется кодируемьй им белок. В зтом варианте гомологичную рекомбинацию используют для вь- теснения, вьіведения из строя или разрушения регуляторного района, обьічно ассоциированного с зтим ге- ном в клетках, путем введения регуляторной последовательности, которая заставляет ген зкспрессиро- ваться при более вьісоких уровнях, чем уровни в соответствующей нетрансфицированной клетке.
В одном варианте активированньй ген может бить амплифицирован включением амплифицируемо- го селективного маркерного гена, которьій обладаєт таким свойством, что клетки, содержащие амплифици- рованнье копии селектируемого маркерного гена, могут отбираться путем культивирования их в присутст- вии подходящего селектирующего агента. Активированньйй зндогенньійй ген амплифицируется в тандеме с амплифицируемьм селективньм маркернькм геном. Клетки, содержащие много копий активированного зндогенного гена, применимь! для получения белка іп міо и генной терапии.
Генное нацеливание и амплификация, описаннье в данном изобретении, применимь!, в частности, для активации зкспрессии генов, которне образуют транскрипционнье единиць, которье достаточно вели- ки, так что их трудно вьіделять и зкспрессировать, или для активации генов, для которьїх недоступен или не бьіл клонирован полньій кодирующий район белка.
В дальнейшем варианте зкспрессия гена, которьйй зкспрессируется в клетке как таковой, усиливает- ся или обнаруживаєт характер регуляции или индукции, которьйй отличаєтся от наблюдаємого в соответст- вующей нетрансфицированной клетке. В другом варианте зкспрессию гена, которьій зкспрессируется в клетке как таковой, уменьшают (т.е. ослабляют или исключают). Данное изобретение описьіваєт также спо- соб, при помощи которого гомологичную рекомбинацию используют для превращения гена в кКДНК-копию, не содержащую интронов, для переноса в дрожюкевье или бактериальнье клетки для получения белка іп
УШО.
Трансфицированнье клетки данного изобретения применимь! в ряде приложений в человеке и жи- вотньїх. В одном варианте зти клетки можно имплантировать в человека или в животное для доставки бел- ка человеку или животному. Например, ПОН, ПЕРО, инсулинотропин человека и другие белки могут достав- ляться системно или локально в больньїх для терапевтических целей. Кроме того, могут бьіть получень! трансфицированнье клетки, не происходящие из человека, продуцирующие гормон роста, зритропозтин, инсулинотропин и другие белки, имеющие иное происхождение (не из человека).
Для удерживания клеток в фиксированном положениий іп мімо или для защить! и изолирования зтих клеток от иммунной системь! хозяина могут бьіть использованьі! барьернье устройства. Барьерньсе уст- ройства, в частности, применимьї для имплантации трансфицированньїх иммортализованньїх клеток, трансфицированньх ксеногенньїх клеток или трансфицированньх аллогенньїх клеток для лечения патоло- гических состояний человека или животного или для сельскохозяйственньїх применений (например, приме- нения бьічьего гормона роста для производства молочньїх продуктов). Барьернье устройства позволяют таюке проводить кратковременную (т.е. временную) терапию путем обеспечения легкого доступа к клеткам для удаления в случає прекращения режима лечений по той или иной причине. Кроме того, трансфициро- ваннье ксеногенньсе и аллогеннье клетки можно использовать в отсутствие барьерньх устройств для крат- ковременной генной терапии, так чтобь! продукт гена, продуцируемьй клетками, доставлялсея іп мімо до от- торжения зтих клеток иммунной системой хозяина.
Трансфицированньсєе клетки данного изобретения применимь! также для индуцирования антител или для иммунизаций людей и животньїх против патогенньїх агентов. Имплантированнье трансфицированнье клетки можно использовать для доставки иммунизирующих антигенов, что приводит к стимуляции клеточ- ного и гуморального иммунного ответа хозяина. Зти иммуннье ответнье реакции могут предназначаться для защить! хозяина от инфекционньх агентов в будущем (т.е. для вакцинации) для стимуляции и повьіше- ния способности противостояния инфекции в будущем или для продуцирования антител, направленньх против антигена, продуцируемого іп мімо трансфицированньїми клетками, что может бьіть полезнь/м для те- рапевтических или диагностических целей. Удаляемье барьернье приспособления, содержащие зти клет- ки, можно использовать для обеспечения простого средства прекращения зкспонирования с антигеном.
Альтернативно, использование клеток, которне будут к конце концов отторгнуть (ксеногенньїх или аллоген- ньїх трансфицированньх клеток), можно применять для ограничения контакта с антигеном, поскольку про- дуцирование антигена будет прекращаться при отторжений зтих клеток.
Способь! данного изобретения можно использовать для получения первичньїх, вторичньїх или им- мортализованньїх клеток, продуцирующих широкое разнообразие терапевтически применимьх продуктов, в том числе (но не только): гормонов, цитокинов, антигенов, антител, ферментов, свертьвающих кровь факторов, транспортньїх белков, рецепторов, регуляторньїх белков, структурньїх белков, факторов транск- рипции, рибозимов или антисмьісловьїх РНК. Дополнительно, способьї данного изобретения можно исполь- зовать для получения клеток, которнше продуцируют не встречающиеся в природе рибозимь!, белки или нуклеийновье кислоть!, которне применимь! для получения іп міо терапевтического продукта или для ген- ной терапии.
Фиг. 1 является схематической диаграммой стратегии транскрипционной активации гена ПЕРО; жир- нье линии, промотор мьішиного металлотионейина-1; заштрихованньій блок, 5'-нетранслируемьй район
ПОН; сплошной блок, зкзон 1 ПОН; полосатьй блок, донорная последовательность 10 п.н. сплайсинга из интрона 1 ПЕРО; перекрестно заштрихованньій блок, 5'-нетранслируемьй район ПЕРО; многочисленнье незаштрихованньсе (открьітье) блоки, коюдирующие ПЕРО последовательности; блок с диагональньіми по- лосами, 3і-лсетранслируемье последовательности ПЕРО; НІ111, сайт Ніпа 111.
Фиг. 2 является схемой стратегии транскрипционной активации гена ПЕРО; жирньсе линии, промотор мьішиного металлотионейина-1; заштрихованньій блок, 5'-нетранслируемьй район пен; сплошной блок, зкзон 1 ПОН; многочисленньіюе незаштрихованнье блоки, кодирующие ПЕРО последовательности; блок с диагональньїми полосами, 3'--нетранслируемье последовательности ПЕРО; НІ111, Ніпа 111 сайт.
Фиг. З является схематическим представлением плазмидьі рХхОнН»5, которая включаеєт в себя ген ПОН под контролем мьішиного промотора металлотионейна.
Фиг. 4 является схематическим представлением плазмидьї рЕЗпеоЕРО. Указань! положения гена зритропозтина человека и гена неомицинфосфотрансферазь (пео) и генов устойчивости к ампициллину (атр). Стрелки указьівают направления транскрипции различньїх генов. рт МТ1 обозначаєт промотор мь- шиного металлотионеина (регулирующий зкспрессию ПЕРО) и ртК обозначаєт промотор тимидинканазь вируса простого герпеса (регулирующий зкспрессию пео). Покрьїтие точками районь! картьї отмечают поло- жения последовательностей, происходящих из локуса гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазь (НРЕКТ) человека. Указаньї относительнье положения сайтов узнавания рестриктаз.
Фиг.5 является схематическим изображением плазмидь!ї рес ОМЕО, которая включаєт в себя кодирую- щий пео район (фрагмент Ватні1-Ва111) из плазмидьі реМм2пео, вставленньй в сайт Ватні плазмидь рсо; последовательности Атр-К и рвКк3220гі из рВК322; и полиА, границь! сплайсинга 165 и районь! раннего промотора из 5У40.
Фиг. 6 является схематическим изображением плазмидь реЕРОЯ4.
Фиг. 7 является графическим изображением зкспрессии зритропозтина в клеточной линии-мишени человека, подвергнутой ступенчатому отборув 0,02,0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкМ метотрексате.
Фиг.8 является схематическим изображением плазмидьі РКЕРО15. Фрагменть!, полученньсе из геном- ньїх последовательностей ПЕРО, показань! заштрихованньіми блоками. Район между Ватні! (3537) и Ва111 (Ніпа 111 соответствует последовательности при положениях 1-4008 во вводе НОМЕКРАЦ Сепбрапк. Район между Ва!111" (Ніпа 111 (11463) соответствует последовательностям ДНК в положениях 4009-5169 во вводе
НОМЕКРАЦІИ Сепбрапк. Район между Ніпа 111" (11463) и Хпої (624) содержит последовательность, соот- ветствующую положениям 7-624 бепрапк ввода НИОМЕАРА. Последовательности промотора СММ показа- ньі в виде открьїтого блока и содержат последовательность из нуклеотидов 546-2105 последовательности
НЗ5ОМІЕР Сепбрапк. Ген пео показан в виде открьттого блока стрелкой. Промотор тимидинкиназь! (ІК), регу- лирующий ген песо, показан в виде заштрихованного блока. Последовательности рВ5115К.ї, включающие в себя ген атр, указань! тонкой линией.
Фиг. 9А представляют рестрикционнье карть! и схематические изображения продуктов, наблюдае- мьїх при расщеплений зндогенного гена ПЕРО (сверху) и активированного гена ПЕРО после гомологичной рекомбинации нацеливающим фрагментом из рРРЕРО115 (внизу).
Фиг. 98 представляеєт результать! рестрикционного анализа и гибридизационного анализа по Саузер- ну необработанного (НЕ) и активированного (ТІ) клона фибробластов человека НЕ342-15 (см. Пример 7).
Фиг. 10 является схематическим изображением плазмидьі РЕЕРО18. Заштрихованньіми блоками по- казаньї фрагментьї, произведенньсе из геномньїх последовательностей ПЕРО. Район между Ватні! (3537) и
Сіа! (7554) соответствует последовательностям в положениях 1-4008 в бСепрапк вводе НОМЕНРАГИ. Ра- йон между АТО (12246) и Ніпа 111 (13426) соответствует последовательности ДНК в положениях 4009-- 5169 в бСепрапк вводе НИОМЕАРАГЦИ. Район между Ніпа 111 (13426) и Хпої (624) содержит последователь- ность, соответствующую положениям 7-624 бепрапк ввода НОМЕАВРА. Последовательности промотора
СММУ показань! в виде незаштрихованного (открьітого) блока и содержат последовательность из нуклеоти- дов 546-2015 бСепрапк последовательности НО 5МІЕР. Единица транскрипции дигидрофолатредуктазь! (апт) показана в виде заштрихованного блока стрелкой. Ген пео показан в виде открьітого блока стрелкой.
Промотор їкК, регулирующий ген пео, показан в виде заштрихованного блока. Последовательности рво115К, включающие в себя ген атр, указань! тонкой линией.
Фиг. 11 является схематической иллюстрацией конструкции изобретения для активации и амплифи- кации не содержащего интронов гена, гена с-интерферона, содержащей первую направляющую последо- вательность (1), амплифицируемьй маркерньй ген (АМ), селектируемьй маркерньй ген (ЗМ), регулятор- ную последовательность, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга (50), интрон (тонкие линии), акцепторньй сайт сплайсинга (ЗА) и вторую направляющую последовательность (2). Черньій блок обозначает кодирую- щую ДНК, а заштрихованньсе блоки обозначают нетранслируемье последовательности.
Фиг. 12 является схематической иллюстрацией конструкции изобретения для активации и амплифи- кации зндогенного гена, в котором первьй зкзон содействует образованию сигнального пептида, гена коло- ниестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (5М-С5Е), причем зта конструкция содержит пер- вую направляющую последовательность (1), амплифицируемьй маркерньй ген (АМ), селектируемьй мар- керньїйй ген (ЗМ), регуляторную последовательность, сайт САР, донорньій сайт сплайсинга (50) и вторую направляющую последовательность (2). Черньіе блоки обозначают кодирующую ДНК и заштрихованньсе блоки обозначают нетранслируемье последовательности.
Фиг. 13 является схематической иллюстрацией конструкции изобретения для активации и амплифи- кации зндогенного гена, в котором первьїй зкзон дает сигнальньй пептид, гена колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека, причем зта конструкция содержит первую направляющую последователь- ность (1), амплифицируемьй маркерньй ген (АМ), селектируемьй маркерньй ген (ЗМ), регуляторную пос- ледовательность, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга (50) и вторую направляющую последовательность (2). Чернье блоки обозначают кодирующую ДНК, а заштрихованнье блоки обозначают нетранслируемье последовательности.
Фиг. 14 является схематической иллюстрацией конструкции изобретения для активации и амплифи- кации зндогенного гена, в котором первьїй зкзон является некодирующим, гена ЕЗНр, причем зта конструк- ция содержит первую направляющую последовательность (1), амплифицируемьй маркерньй ген (АМ), се- лектируемьй маркерньй ген (ЗМ), регуляторную последовательность, сайт САР, донорньїйй сайт сплайсин- га (50) и вторую направляющую последовательность (2). Чернье блоки обозначают кодирующую ДНК и заштрихованнье блоки обозначают нетранслируемье последовательности.
Подробное описание изобретения.
Данное изобретение основано на открьітии, что регуляция или активность зндогенньїх представляю- щих интерес генов в клетке может бьіть изменена встраийванием в клеточньйй геном в заранее заданном сайте посредством гомологичной рекомбинации конструкций ДНК, содержащих: (а) направляющую последовательность; (Б) регуляторную последовательность; (с) зкзон и (4) неспаренньйй донорньійй сайт сплайсинга, в которьіх направляющая последовательность направ- ляет интеграцию злементов (а) - (б) таким образом, что злементьї (Б) - (4) оперативно соединяются с зндо- генньіїм геном. В другом варианте зти конструкции ДНК содержат: (а) направляющую последовательность, (Б) регуляторную последовательность, (с) зкзон, (4) донорньй сайт сплайсинга, (е) интрони
() акцепторньійй сайт сплайсинга, причем направляющая последовательность направляєет интегра- цию злементов (а) - (Ї) таким образом, что злементь (Б) и (Ї) оперативно соединяются с первьім зкзоном зндогенного гена. Используемье направляющие последовательности вьібирают относительно сайта, в ко- торьїй должна бьїіть вставлена зта ДНК. В обоих вариантах используют собьтие нацеливания для создания новой транскрипционной единиць, которая представляєт собой слитьйй продукт последовательностей, вве- денньїх направляющими конструкциями ДНК, и зндогенного клеточного гена. Как обсуждалось здесь, нап- ример, образование новой транскрипционной единиць! позволяет активировать транскрипционно молча- щие геньї (геньї, не зкспрессируемьсе в клетке перед трансфекцией) в клетках хозяина путем введения в ге- номную ДНК клетки хозяина конструкций ДНК данного изобретения. Как также обсуждалось здесь, зкспрес- сия зндогенного гена, которьй зкспрессируется в клетки как таковой, может бьіть изменена таким образом, что она увеличиваєтся, уменьшаєется, в том числе устраняется, или характер регуляции или индукции мо- жет бьіть изменен через использование зтого способа и конструкцией ДНК данного изобретения.
Данное изобретение, как описано вьіше, касаєтся способа генного или дНК-нацеливания в клетках зукариотического происхождения, таких как клеток, происходящих из грибов, растения или животного, тако- го как позвоночного животного, в частности, млекопитающего и, даже более конкретно, человека. То есть, оно касается способа введения ДНК в клетку, такую как первичнье, вторичнье или иммортализованнье клетки, происходящие из позвоночньїх, посредством гомологичной рекомбинации или нацеливания зтой
ДНК, которую вводят в геномную ДНК клеток в заранее вьібранном сайте. Оно касаєтся, в частности, гомо- логичной рекомбинации, в которой продукть! транскрипции и/или трансляции зндогенньїх генов модифици- руют путем использования конструкций ДНК, содержащих направляющую последовательность, регулятор- ную последовательность, зкзон и донорньйй сайт сплайсинга. Далее данное изобретение касается гомоло- гично рекомбинантньх клеток, получаемьсх данньім способом, и применений гомологично рекомбинантньх клеток.
Данное изобретение касаєтся также способа активации гена, присутствующего в первичньх клетках, вторичньїх клетках или иммортализованньх клетках позвоночньїх животньх, но обьічно не зкспрессируемо- го в зтих клетках. Гомологичную рекомбинацию или нацеливание используют для введения в геном клетки последовательностей, которье заставляют ген зкспрессироваться в реципиентньїх клетках. В следующем варианте, усиливается зкспрессия гена в клетке или изменяєтся характер регуляции или индукции гена посредством введения такой конструкции ДНК. В результате кодируемьй продукт зкспрессируется на бо- лее вьісоких уровнях, чем в соответствующей нетрансфицированной клетке. Данньй способ и конструкции
ДНК применимь! также для получения клеток, в которьїх зкспрессия желаемого продукта ниже в трансфи- цированной клетке, чем в соответствующей нетрансфицированной клетке. То-есть, в трансфицированной клетке продуцируется меньше белка (или вообще не продуцируется зтот белок), чем в нетрансфицирован- ньіїх клетках.
В другом варианте обьічно молчащий ген, кодирующий желаемьй продукт, активируется в трансфи- цированньїх первичньїх, вторичньїх или иммортализованньїх клетках и амплифицируется. Зтот вариант представляет собой способ введения гомологичной рекомбинацией с геномной ДНК последовательностей
ДНК, которьсе обьічно не соединеньі функционально с зндогенньїм геном и которье (1) при введений в геном хозяйна при зндогенном гене или вблизи от него изменяют (например, акти- вируют) зкспрессию зндогенного гена, и, кроме того, (2) делают возможньм отбор клеток, в которьїх амплифицируется активированньй зндогенньй ген.
Альтернативно, зкспрессия гена, обьічно зкспрессируемого в клетке как таковой, усиливаєтся и ген амплифицируется.
Далее следует описание конструкций ДНК данного изобретения, способов, в которьїх они применяют- ся для получения трансфицированньх клеток, трансфицированньсє клетки и применения зтих клеток.
Конструкция ДНК.
Конструкция ДНК данного изобретения включаєт в себя по меньшей мере следующие компоненть!: направляющую последовательность; регуляторную последовательность; зкзон и неспаренньйй донорньй сайт сплайсинга. В зтой конструкции зкзон находится в 3'-положенийи от регуляторной последовательности и неспаренньй донорньїй сайт сплайсинга находится 3' от зкзона. Кроме того, могут присутствовать мно- жественнье зкзонь! и/или интроньї перед зтим зкзоном (5' от него), фрланкированньім неспаренньїм донор- ньім сайтом сплайсинга. Как описано здесь, часто присутствуют дополнительнье компоненть! конструкции, такие как селектируемье маркерьї или амплифицируемье маркерь!.
Находящаяся в конструкции ДНК может бьїть названа зкзогенной. Термин "зкзогенная" определяется здесь как дНК, которую вводят в клетку по способу данного изобретения, например, с конструкциями ДНК, описанньїми здесь. Зкзогенная ДНК может иметь последовательности, идентичнье зндогенньім последова- тельностям ДНК, присутствующим в клетке перед трансфекцией, или отличающиеся от них.
Направляющая последовательность или направляющие последовательности.
Направляющими последовательностями или последовательностями являются последовательности
ДНК, которье делают возможной приемлемую гомологичную рекомбинацию в геном вьібранной клетки, со- держащей представляющий интерес ген. Направляющими последовательностями являются, в общем, пос- ледовательности ДНК, которье гомологичнь! (т.е. идентичньі или достаточно близки клеточной ДНК, так что направляющая последовательность и клеточная ДНК могут подвергаться гомологичной рекомбинации) последовательностям ДНК, обьічно присутствующим в геноме самих клеток (например, кодирующей или некодирующей ДНК, лежащим против хода транскрипции от сайта инициации транскрипции, внутри или по ходу транскрипции от сайта терминации транскрипции представляющего интерес гена, или последователь-
ностям, присутствующим в геноме вследствие предшествующей модификации). Используемье направляю- щие последовательность или последовательности вьібирают с учетом сайта, в которьій должна бьть вс- тавлена ДНК в конструкции ДНК.
Могут бьіть использованьї одна или более направляющих последовательностей. Например, в кольце- вой плазмиде или во фрагменте ДНК предпочтительно используют одну направляющую последователь- ность. В линейной плазмиде или ее фрагменте ДНК предпочтительно используют две направляющие пос- ледовательности. Направляющие последовательности или последовательности могут, независимо одна от другой, находиться внутри представляющего интерес гена (например, последовательности зкзона и/или интрона), непосредственно рядом с представляющим интерес геном (т.е. без дополнительньїх нуклеотидов между направляющей последовательностью и кодирующим районом представляющего интерес гена), про- тив хода транскрипции от представляющего интерес гена (например, последовательности находящегося против хода транскрипции некодирующего района или зндогенньіе промоторнье последовательности) или против хода транскрипции от представляющего интерес гена и на расстояний от него (например, последо- вательности, находящиеся против хода транскрипции от зндогенного промотора). Направляющие последо- вательность или последовательности могут включать в себя районьі! направляемого гена, известнье или секвенированньсе в настоящее время, и/или районьї, расположеннье далее против хода транскрипции, ко- торье структурно не охарактеризовань, но могут бьіть картировань! при помощи рестриктаз и определень специалистами в зтой области.
Как описано здесь, генное нацеливание можно использовать для введения регуляторной последова- тельности, виіделенной от отличающегося гена, составленной из компонентов, вьіделенньїх из различньх клеточньх и/или вирусньїх источников или синтезированной в виде новой регуляторной последовательнос- ти методами генной инженерии, внутрь, непосредственно рядом с зндогенньім клеточньім геном, против хода транскрипции от него или на значительном расстояниий от зндогенного клеточного гена. Альтернатив- но или дополнительно, последовательности, влияющие на структуру или стабильность продуцируемьх
РНК или белка, могут бьіть заменень, удалень, добавлень или иньім образом модифицировань посредст- вом нацеливания. Например, злементь! стабильности РНК, сайть! сплайсинга и/или лидернье последова- тельности молекул РНК могут бить модифицировань! для улучшения или изменения функции, стабильнос- ти и/или транслируемости молекульі РНК. Могут бьіть также изменень!ї белковніе последовательности, та- кие как сигнальнье последовательности, пропептиднье последовательности, активнье сайть! и/или струк- турньіе последовательности для усиления или модификации транспорта, секреции или функциональньх свойств белка. В соответствии с зтим способом введение зкзогенной ДНК приводит к изменению свойств обьічной зкспрессии гена и/или структурньїх свойств белка или РНК.
Регуляторная последовательность.
Регуляторная последовательность конструкций дНК может бьть составлена из одного или более промоторов (таких как конститутивньійй или индуцируемьй промотор), знхансеров, районов присоединения "лесов" или сайтов присоединения матрикса, отрицательньїх регуляторньїх злементов, сайтов связьивания факторов транскрипции или комбинаций зтих последовательностей.
Регуляторная последовательность может содержать индуцируемьй промотор, что приводит к ре- зультату, что полученнье клетки или введеннье в индивидуума клетки не зкспрессируют продукт, но могут бьіть индуцировань! для его зкспрессии (т.е. зкспрессия индуцируется после получения трансфицирован- ньїх клеток, но перед имплантацией или после имплантации). ДНК, кодирующую желаемьй продукт, можно, конечно, вводить в клетки таким образом, что она зкспрессируется при введений (например, при конститу- тивном промоторе). Регуляторная последовательность может бьїіть вьіделена из клеточного или вирусного геномов (такие регуляторньєе последовательности включают в себя последовательности, которье регули- руют зкспрессию ранних или поздних генов 5М40, основньїх поздних генов аденовируса, мьішиного гена металлотионейна-1-, гена фактора-1о; злонгации, генов цитомегаловируса, генов коллагена, генов актина, генов иммуноглобулина или гена НМО-СоА-редуктазьі). Регуляторная последовательность предпочти- тельно содержит сайть! связьівания факторов транскрипции, таких как ТАТА-бокс, ССААТ-бокс, сайть! свя- зьівания АРІ, Зр1 или МЕ-кВ.
Дополнительнье злементь! конструкции ДНК.
Конструкция ДНК дополнительно содержит один или более зкзонов. Зкзон определяется здесь как последовательность ДНК, которая копируется в РНК и присутствует в зрелой молекуле мРНК. Зкзонь! мо- гут, необязательно, содержать ДНК, которая кодирует одну или более аминокислот и/или частично коди- рует аминокислоту (т.е. имеет одно или два основания кодона). Альтернативно, зкзон содержит ДНК, кото- рая соответствует 5'і-некодирующей области. В случає, когда зкзогенньіїй зкзон или зкзоньії кодируют одну или более аминокислот и/или часть аминокислотьї, конструкция ДНК конструируется таким образом, чтобь при транскрипции и сплайсинге рамки считьівания бьла внутри рамки считьівания со вторьмм зкзоном или кодирующим районом нацеленного гена. В применений здесь вьіражение "внутри рамки считьівания" озна- чает, что кодирующие последовательности первого зкзона и второго зкзона при слияниий соединяют вместе нуклеотидь! таким образом, чтобьі! не изменять рамку считьівания части мРНК, произведенной из второго зкзона.
В случає, когда первьій зкзон гена-мишени содержит последовательность АТО для инициации транс- ляции, зкзогенньій зкзон конструкции предпочтительно содержит АТО и, если необходимо, один или более нуклеотидов, так что полученньій кодирующий район мРНК, включающий в себя второй и последующие зкзоньї гена-мишени, находится внутри рамки считьввания. Примерь! таких генов-мишеней, в которьїх пер- вьій зкзон содержит АТО, включают в себя геньії, коюдирующие ПЕРО, ПОН, колониестимулирующей фактор гранулоцитов/макрофагов человека (ПОМ-С5Е) и гранулоцитарньйй колониестимулирующий фактор чело- века (пОо-С5БЕ).
Донорньій сайт сплайсинга является последовательностью, которая регулирует сплайсинг одного зкзона с другим зкзоном. В типичном случає первьїй зкзон лежит 5' от второго зкзона и донорньй (левьїй) сайт сплайсинга, перекривающий и фланкирующий первьїй зкзон на его 3'-стороне, узнает акцепторньй (правьй) сайт сплайсинга, рланкирующий второй зкзон на 5'-стороне второго зкзона. Донорнье сайть! сп- лайсинга имеют характерную консенсусную последовательность, представленную как: (А/СД)ДАСОКАСИ (где КЕ обозначаєт пуриновьій нуклеотид) с 5) в четвертом и пятом положениях, что является необходи- мьїм (Часкзоп, 1.9У., Мисівіс Асід5 Кезеагсі, 19: 3715-3798 (1991). Первье три основания донорного консен- сусного сайта сплайсинга являются последними тремя основаниями зкзона. Донорнье сайть! сплайсинга функционально определяются по их способности осуществлять соответствующую реакцию в пути сплай- синга мРНК.
Неспаренньй донорньй сайт сплайсинга определяется здесь как донорньй сайт сплайсинга, которьй присутствует в направляющей конструкции и не сопровождаєтся в зтой конструкции акцепторньім сайтом сплайсинга, расположенньім 3 по отношению к неспаренному донорному сайту сплайсинга. Зтот неспа- ренньй донорньй сайт сплайсинга приводит к сплайсингу до зндогенного акцепторного сайта сплайсинга.
Акцепторньій сайт сплайсинга является последовательностью, которая, подобно донорному сайту сплайсинга, регулирует сплайсинг одного зкзона с другим зкзоном. Действуя вместе с донорньїм сайтом сп- лайсинга, механизм сплайсинга использует акцепторньій сайт сплайсинга для осуществления удаления интрона. Акцепторньюе сайтьї сплайсинга имеют характерную последовательность, представленную как:
УУУУУУУУУУМУАСЄ, где У обозначаєт любой пиримидин и М обозначаєт любой нуклеотид (Часкзоп, 1.У.,
Мисієїс Асіа5 Незеагсй 19: 3715-3798 (1991)).
Интрон определяєтся как последовательность из одного или более нуклеотидов, лежащая между двумя зкзонами и удаляемая сплайсингом из молекуль-предшественника РНК при образований молекуль!
МРНК.
Регуляторная последовательность, например, оперативно соединена с инициирующим кодоном АТО, которьй инициирует трансляцию. Необязательно, сайт САР (специфический инициирующий сайт мРНК, ко- торьй связан с регуляторньім районом и используется им) оперативно соединен с регуляторной последо- вательностью и инициирующим кодоном АТО. Альтернативно, сайт САР, соединенньй с регуляторной пос- ледовательностью и используемьй ею, не включаєтся в направляющую конструкцию и аппарат транскрип- ции будет определять новьій сайт САР. Для большинства генов сайт САР обьічно обнаруживаєтся прибли- зительно как 25 нуклеотидов 3' от ТАТА-бокса. В одном варианте донорньїй сайт сплайсинга расположен непосредственно рядом с АТО, например, когда присутствие одного или более нуклеотидов не требуется, для того, чтобь!ї зкзогенньій зкзон находился внутри рамки со вторьм зкзоном нацеленного гена. Предпоч- тительно, ДНК, кодирующая одну или более аминокислот или части аминокислоть! внутри рамки считьва- ния с кодирующей последовательностью нацеленного гена, расположена непосредственно рядом с АТО на его 3-стороне. В таком варианте донорньій сайт сплайсинга расположен непосредственно рядом с коди- рующей ДНК на ее 3'-стороне.
Вьражения "оперативно соединеннье" или "функционально расположеннье" определяются как кон- фигурация, в которой зкзогенная регуляторная последовательность, зкзон, донорньій сайт сплайсинга и, необязательно, последовательность и акцепторньій сайт сплайсинга подходящим образом ориентировань в положений по отношению к зндогенному гену таким образом, что регуляторньій злемент регулирует об- разование первичного РНК-транскрипта, которьйй инициируется при сайте САР (необязательно включен- ном в направляющую конструкцию) и включаєт в себя последовательности, соответствующие зкзону и донорному сайту сплайсинга направляющей конструкции, ДНК, лежащую против хода транскрипции от регуляторного района зндогенного гена (если он присутствует), регуляторньій район зндогенного гена (если он присутствует), нетранскрибируемьй 5'-район зндогенного гена (если он присутствует) и зкзонь и интроньї (если они присутствуют) зндогенного гена. В оперативно соединенной конфигурации донор- ньій сайт сплайсинга направляющей конструкции регулирует собьтие сплайсинга до акцепторного сайта сплайсинга, фланкирующего один из зкзонов зндогенного гена, так что желаемьй белок может бьіть об- разован из полностью сплайсированного зрелого транскрипта. В одном варианте акцепторньйй сайт сп- лайсинга является зндогеннь/м, так что сплайсинг регулируется до зндогенного зкзона, например, зндо- генного гена. В другом варианте, когда акцепторньїй сайт сплайсинга включен в направляющую конструк- цию, собитие сплайсинга удаляет интрон, введенньій направляющей конструкцией.
Используемая кодирующая ДНК (например, в зкзоне 1 направляющей конструкции) может необяза- тельно кодировать одну или несколько аминокислот и/или часть аминокислоть, которне одинаковь! с ами- нокислотами зндогенного белка. Используемая в зтом изобретении кодирующая последовательность ДНК может, например, соответствовать первому зкзону представляющего интерес гена. Альтернативно, коди- рующая ДНК может кодировать одну или более аминокислот или часть аминокислотьі, отличающихся от первого зкзона представляющего интерес белка. Такой вариант представляет особьй интерес, когда ами- нокислоть! первого зкзона представляющего интерес белка не являются решающими для активности или активностей зтого белка. Например, при конструирований слитьїх конструкций с зндогенньім геном ПЕРО можно использовать последовательности, кодирующие первьїй зкзон ПОН. В зтом примере слияние зкзона
Т1пОН с зкзоном 2 ПЕРО приводит к образованию гибридного сигнального пептида, которьійй является функ- циональньїм. В родственньїх конструкциях зта техника может бьіть применена также для коррекции мута- ции, обнаруженной в гене-мишени.
В случає, когда желаемьм продуктом является слитьй белок зндогенного белка и продукта кодирую- щих последовательностей в направляющей конструкции, зкзогенная кодирующая ДНК, включенная в клет- ки согласно данному способу, включаєт в себя ДНК, которая кодирует один или более зкзонов или после- довательность кКДНК, соответствующую продукту трансляции или транскрипции, которьйй должен бьїть слит с продуктом зндогенного гена мишени. В зтом варианте нацеливание используют для получения химерньх или многофункциональньїх белков, которне обьединяют структурнье, ферментативнье или лиганд- или рецепторсвязьівающие свойства двух или более белков в один полипептид. Например, зкзогенная ДНК мо- жет кодировать "якорь" для мембраньі! для белка-мишени или сигнальньйй пептид для обеспечения или улучшения клеточной секреции, лидернье последовательности, ферментативнье районь, районь! транс- мембранного домена, связьвающие кофактор районьі или другие функциональньсе районьї. Примерь! бел- ков, которье обьічно не секретируются, но которье могли бьї бьїть слить с сигнальньі!м белком для обеспе- чения секреции, включают в себя допадекарбоксилазу, транскрипционнье регуляторнье белки, р-галакто- зидазу и тирозингидроксилазу.
В случає, когда первьій зкзон гена-мишени соответствует некодирующему району (например, первьй зкзон гена фолликулостимулирующего гормона бета (Е5НрД), зкзогенньій АТО не является необходимь!м и, предпочтительно, отсутствует.
ДНК озтой конструкции может бьіть получена из источников, в которьїх она присутствует в природе, или она может бьіть получена способами генной инженерии или синтетическими способами.
Ген-мишень и образующийся продукт.
Конструкция ДНК при трансфекции в клетки, такие как первичнье, вторичнье или иммортализован- нье клетки, может регулировать зкспрессию желаемого продукта, например, активной или функциональ- ной части белка или РНК. Зтот продукт может представлять собой, например, гормон, цитокин, антиген, ан- титело, фермент, фактор свертьивающей системь! крови, транспортньїй белок, рецептор, регуляторньй бе- лок, структурньій белок, фактор транскрипции, антисмьісловую РНК или рибозим. Дополнительно зтот про- дукт может бьіть белком или нуклеийновой кислотой, не встречающейся в природе (т.е. слитьім белком или слитой нуклеиновой кислотой).
Описанньй в зтом изобретениий способ может производить один или более терапевтических продук- тов, таких как зритропозтин, кальцитонин, гормон роста, инсулин, инсулинотропин, инсулин-подобньюе фак- торьї роста, паратиреоидньй гормон, интерферон р и интерферон у факторь! роста нерва, фолликулости- мулирующий гормон (ЕЗНрД), ТаБР-р, фактор некроза опухоли, глюкагон, фактор роста костей 2, фактор рос- та костей 7, тиреотропньй гормон бета (Т5Н-р), интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 3, интерлейкин 6, интерлейкин 11, интерлейкин 12, гранулоцитарньй колониестимулирующий фактор, макрофагальньй ко- лониестимулирующий фактор, гранулоцитарньій/макрофагальньйй колониестимулирующий фактор, имму- ноглобулинь, каталитические антитела, протеинкиназа С, глюкоцереброзидаза, супероксиддисмутаза, тка- невьійй активатор плазминогена, урокиназа, антитромбин 111, ДНКаза, с-галактозидаза, тирозингидрокси- лаза, факторь! свертьівания крови У, фактор свертьівания крови МІЇ, фактор свертьівания крови МІ, фактор свертьівания крови ІХ, фактор свертьівания крови Х, фактор свертьівания крови ХІЇЇ, аполипопротеин Е или аполипопротейн А-1, глобиньї, рецептор липопротеина низкой плотности, рецептор 11--2, антагонисть 11-- 2, альфа-1-антитрипсин, модификаторь! иммунного ответа и растворимьй СО4.
Селектируемье маркерь! и амплификация.
Обнаружение нацеливающего собьітия может бьіть облегчено путем использования одного или бо- лее селектируемьхх маркерньїх генов. Зти маркерь! могут бить включеньії в направляющую конструкцию или присутствовать на разньїх конструкциях. Селектируемье маркерь! могут бьіть разделень на две катего- рии: позитивно селектируемьсе и негативно селектируемье (другими словами, маркерь! либо для позитив- ного, либо для негативного отбора). В позитивном отборе клетки, зкспрессирующие позитивно селектируе- мьїй маркер, способнь!ї вьіїживать при обработке селективньіїм (отбирающим) агентом (при таких маркерах, как пео, ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (др), аденозиндезаминаза (ада), пуромицин (рас), гиг- ромицин (пуд), САОЮ, кодирующий карбамилфосфатсинтазу, аспартаттранскарбамилазу и дигидрооротазу, глутаминсинтеза (55), устойчивость к множественньім лекарственньим средствам 1 (та) и гистидин О (пізО), что позволяєт отбирать клетки, в которьїх направляющая конструкция интегрирована в геном клет- ки-хозяина. В негативном отборе клетки, зкспрессирующие негативно селектируемьй маркер, разрушаются в присутствии отбирающего агента. Идентификация собьтия нацеливания (попадания в мишень) может об- легчаться путем использования одного или более маркерньїх генов, проявляющих свойство негативного от- бора, так что негативно селектируемьй маркер соединен с зкзогенной ДНК, но имеет такую конфигурацию, что негативно селектируемьй маркер фланкирует направляющую последовательность и точная гомологич- ная рекомбинация с последовательностями в геноме клетки-хозяина не приводит к стабильной интеграции негативно селектируемого маркера (Мапзоитг, 5.Г... еї аІ., Маїшге 336:348-352 (1988)). Маркерьі, применимье для зтой цели, включают в себя ген тимидинкиназь! вируса простого герпеса (ТК) или бактериальньй орі ген.
Множество селектируемьхх маркеров можно включать в первичнье, вторичнье или иммортализован- нье клетки. Например, можно использовать селектируемьй маркер, которьій придает селектируемьй фе- нотип, такой как устойчивость к лекарствам, пищевую ауксотрофию, устойчивость к цитотоксическому аген- ту или зкспрессия поверхностного белка. Селектируемьми маркерньїми генами, которне можно использо- вать, являются пео, орі, ада, апіт, рас, пуа, САО, 5, та и пізО. Приобретенньій селектируемьй фенотип позволяет идентифицировать и вьіделить реципиентнье клетки.
Амплифицируемье геньї, кодирующие селектируемье маркерь! (например, ада, 5, аптї и много- функциональньй ген САО) имеют дополнительное свойство, заключающееся в том, что они позволяют от-
бор клеток, содержащих амплифицированньюе копии селектируемого маркера, введенного в геном. Зта особенность обеспечиваєт механизм значительного увеличения копийности смежного или связанного гена, для которого желательна амплификация. Можно также использовать мутированнье версии зтих последо- вательностей, обнаруживающие улучшеннье селектируемьсе свойства, и другие амплифицируемье после- довательности.
Порядок компонентов в конструкции ДНК может вариировать. Если конструкция является кольцевой плазмидой, порядок злементов в полученной структуре может бить следующим: направляющая последо- вательность - плазмидная ДНК (состоящая из последовательностей для отбора и/или репликации направ- ляющей плазмидь! в микробном или ином подходящем хозяийине) - селектируемьй маркер (маркерьї) - регу- ляторная последовательность - зкзон - донорньій сайт сплайсинга. Предпочтительно плазмида, содержа- щая направляющую последовательность и зкзогеннье злементь! ДНК, расщепляется рестриктазой, кото- рая разрезаєт один или несколько раз внутри направляющей последовательности для образования линей- ной или содержащей пробель! (бреши) молекуль! перед введением в реципиентную клетку, так что свобод- нье концьі ДНК увеличивают частоту собьітий гомологичной рекомбинации, как описано в зтом изобрете- ний. Кроме того, свободнье концьї! ДНК могут бьіть обработань!ї зкзонуклеазой для создания вьіступающих 5'- или 3'-одноцепочечньх концов ДНК для увеличения частоть! желаемого собьтия гомологичной рекомби- нации. В зтом варианте гомологичная рекомбинация между направляющей последовательностью и клеточ- ной мишенью будет приводить к двум копиям направляющих последовательностей, фланкирующих зле- ментьі, содержащиеся внутри введенной плазмидь!.
Если конструкция является линейной, порядок может бить следующим: первая направляющая пос- ледовательность - селектируемьй маркер - регуляторная последовательность - зкзон - донорньй сайт сплайсинга - вторая направляющая последовательность или, альтернативно, первая направляющая пос- ледовательность - регуляторная последовательность - зкзон - донорньй сайт сплайсинга - ДНК, кодирую- щая селектируемьй маркер - вторая направляющая последовательность. Клетки, которье стабильно ин- тегрируют зту конструкцию, будут виідерживать обработку отбирающим агентом; субпопуляция стабильно трансфицированньїх клеток будет представлять собой гомологично рекомбинированнье клетки. Гомоло- гично рекомбинированньсе клетки могут бить идентифицировань! разнообразньіми способами, в том числе
ПЦР (РСЕ), гибридизацией по Саузерну и фенотипическим скринингом.
В другом варианте порядок злементов конструкциий может бьіть следующим: первая направляющая последовательность - селектируемьй маркер - регуляторная последовательность - зкзондонорньій сайт сплайсинга - интрон - акцепторньй сайт сплайсинга - вторая направляющая последовательность.
Альтернативно, порядок компонентов в конструкциий ДНК может бьїть следующим: первая направ- ляющая последовательность - селектируемьй маркер 1 - регуляторная последовательность -- зкзон - до- норньйй сайт сплайсинга - вторая направляющая последовательность - селектируемьй маркер 2 или, аль- тернативно, первая направляющая последовательность - регуляторная последовательность - зкзон - до- норньїй сайт сплайсинга - селектируемькй маркер 1 - вторая направляющая последовательность - селек- тируемьй маркер 2. В зтом варианте селектируемьй маркер 2 обнаруживаєт свойство негативного отбора.
Т.е. продукт гена селектируемого маркера 2 может бьїть отобран при росте в подходящей среде, содержа- щей агент (обьічно лекарственное средство или аналог метаболита), которьій убиваєт клетки, зкспресси- рующие селектируемьй маркер 2. Рекомбинация между направляющими последовательностями, фланки- рующими селектируемьй маркер 1, с гомологичньмми последовательностями в геноме клетки-хозяина при- водит к нацеленной интеграции селектируемого маркера 1, тогда как селектируемьй маркер 2 не интегри- руется. Такая рекомбинация генерирует клетки, которне стабильно трансфицировань! селектируемьм мар- кером 1, но нестабильно трансфицировань!і селектируемьм маркером 2, и такие клетки могут отбираться по росту в средах, содержащих селективньій (отбирающий) агент, которьій отбирает по селектируемому маркеру 1, и селективньй агент, которьй отбираєт против селектируемого маркера 2.
Конструкция ДНК может также включать в себя позитивно селектируемьй маркер, которьй позволяеєт отбирать клетки, содержащие амплифицированнье копии зтого маркера. Амплификация такого маркера приводит к совместной амплификации фланкирующих последовательностей ДНК. В зтом варианте порядок компонентов конструкции является, например, следующим: первая направляющая последовательность - амплифицируемьїйй позитивно селектируемьй маркер - второй селектируемьй (необязательньй) маркер - регуляторная последовательность - зкзон - донорньій сайт сплайсинга - вторая направляющая последо- вательность ДНК.
В зтом варианте активированньїйй ген может дополнительно амплифицироваться включением селек- тируемого маркерного гена, которьйй обладаєт таким свойством, что клетки, содержащие амплифицирован- нье копии селектируемого маркерного гена, могут отбираться путем культивирования зтих клеток в при- сутствии подходящего селектирующего агента. Активированньй зндогенньй ген будет амплифицироваться в тандеме с амплифицируемьм селектируемьм маркерньїм геном. Клетки, содержащие много копий акти- вированного зндогенного гена, могут продуцировать очень вьісокие уровни желаемого белка и применимь! для получения белка іп міїго и в генной терапии.
В любом варианте селектируемье и амплифицируемьсе маркернье геньї не должнь! лежать непос- редственно рядом друг с другом.
Необязательно, конструкция ДНК может включать в себя бактериальное начало репликации и бакте- риальнье маркерь! устойчивости к антибиотику или другие селектируемье маркерь, которне делают воз- можньм широкомасштабное размножение плазмид в бактериях или любьх других подходящих для зтого системах клонирования/хозяина. Конструкция ДНК, включающая в себя ДНК, кодирующую селектируемьй маркер, вместе с дополнительньіми последовательностями, такими как промотор и границь! сплайсинга,
может бьіть использована для придания селектируемого фенотипа трансфицированньїм клеткам (напри- мер, плазмида рсоМЕО, схематически изображенная на Рис. 4). Такая конструкция ДНК может котрансфи- цироваться в первичнье или вторичнье клетки вместе с направляющей последовательностью ДНК с при- менением описанньмх здесь способов.
Трансфекция и гомологичная рекомбинация.
В соответствии со способом данного изобретения, конструкцию ДНК вводят в клетку, такую как пер- вичную, вторичную или иммортализованную клетку, в виде единой конструкции ДНК или в виде отдельньх последовательностей ДНК, которне становятся включенньми в хромосомную или ядерную ДНК трансфи- цированной клетки.
Направляющая конструкция ДНК, включающая в себя направляющие последовательности, регуля- торную последовательность, зкзон, донорньїйй сайт сплайсинга и селектируемье маркерньеє гень! (ген) мо- жет бьіть введена в клетки на одной конструкции ДНК или на отдельньїх конструкциях. Общая длина конст- рукции ДНК будет вариировать в зависимости от числа компонентов (направляющих последовательностей, регуляторньїх последовательностей, зкзонов, селектируемьх маркерньх генов и других злементов, напри- мер) и длиньї каждого из злементов. Полная длина конструкции в общем будет, по меньшей мере, прибли- зительно 200 нуклеотидов. Далее, зта ДНК может бьіть введена в виде линейной, двухцепочечной (с одно- цепочечньіми районами на одном или обоих концах или без них), одноцепочечной или кольцевой ДНК.
Конструкцию любого типа данного изобретения вводят затем в клетку для получения трансфициро- ванной клетки. Трансфицированную клетку поддерживают при условиях, позволяющих гомологичную ре- комбинацию, как зто известно в зтой области знаний (Саресспі М.Е., 5сіепсе 244:1288-1292 (1989)). При поддержаний гомологично рекомбинантной клетки в условиях, достаточньїх для транскрипции ДНК, регуля- торньій район, введенньій нацеливающей конструкцией, как в случає промотора, будет активировать транскрипцию.
Конструкции ДНК могут бьїіть введень! в клетки разнообразньмми физическими или химическими спо- собами, в том числе злектропорацией, микроиньекцией, бомбардировкой микроснарядами, осаждением фосфатом кальция и мидиируемой липосомами, полибреном или ДЗАЗ-декстраном трансфекцией. Аль- тернативно, для введения зтой ДНК можно использовать инфекционньсе векторь, такие как ретровирусь, вирус герпеса, аденовирус, аденовирусассоциированнье, полиовирусньсе векторь! и вирус зпидемического паротита.
Иногда (необязательно) направляющая ДНК может вводиться в клетки в виде двух или более от- дельньїх фрагментов ДНК. В случае использования двух фрагментов зти два фрагмента имеют общую го- мологию последовательности ДНК (перекрьівание) при 3--конце одного фрагмента и 5-конце другого фраг- мента, в то время как один фрагмент несет первую направляющую последовательность, а другой несет вторую направляющую последовательность. При введений в клетку зти два фрагмента могут подвергаться гомологичной рекомбинации с образованием единого фрагмента с первой и второй направляющими после- довательностями, фланкирующими район перекрьівания между двумя исходньіми фрагментами. Затем об- разовавшийся фрагмент находится в форме, пригодной для гомологичной рекомбинации с клеточньіми последовательностями-мишенями. Можно использовать более двух фрагментов, сконструированньх таким образом, что они подвергаются гомологичной рекомбинации друг с другом с образованием в конце концов продукта, пригодного для гомологичной рекомбинации с клеточньмми последовательностями-мишенями, как описано вьіше.
Гомологично рекомбинантньсе клетки.
Собьтие нацеливания приводит к вставке (инсерции) регуляторной последовательности направляю- щей (нацеливающей) конструкции, помещению зндогенного гена под их контроль (например, путем инсер- ции промотора или знхансера или обоих против хода транскрипции зндогенного гена или регуляторного ра- йона). Необязательно, собиітие нацеливания может одновременно приводит к делеции зндогенного регуля- торного злемента, такого как тканеспецифический негативньй регуляторньійй злемент. Нацеливание может витеснять существующий злемент; например, тканеспецифический знхансер может бьіть вьітеснен знхансе- ром, имеющим более широкую или отличающуюся специфичность в отношений типа клеток, чем природно встречающиеся злементь, или обнаруживать характер регуляции или индукции, которьй отличается от вст- речающегося в соответствующей нетрансфицированной клетке. В зтом варианте природно существующие последовательности делетируются, а новне последовательности добавляются. Альтернативно, зндогеннье регуляторнье злементь не удаляются или не заменяются, а разрушаются или вьіводятся из строя собьітием нацеливания, таким как направление зкзогенньїх последовательностей внутрь зндогенньх регуляторньх зле- ментов.
После введения зтой ДНК в клетку, клетку поддерживают при условиях, пригодньїх для гомологичной рекомбинации между геномной ДНК и частью введенной ДНК, как зто известно в данной области (Саресспі,
М.В., Зсіеєпсе 244:11288-1292 (1989)).
Гомологичная рекомбинация между геномной ДНК и введенной ДНК приводит к образованию гомоло- гично рекомбинантной клетки, такой как клетка гриба, растения или животного, и, в частности, первичная, вторичная или иммортализованная клетка человека или другого млекопитающего, в которой последова- тельности, которне изменяют зкспрессию зндогенного гена, оперативно соединень! с зндогенньїм геном, кодирующим продукт, с образованием новой транскрипционной единиць! с зкспрессией и/или кодирующим потенциалом, которьій отличаеєтся от кодирующего потенциала зндогенного гена. В частности, данное изобретение включаєт в себя гомологично рекомбинантную клетку, содержащую регуляторнье последова- тельности и зкзон, фланкированнье донорньїм сайтом сплайсинга, которье вводят при определенном сай-
те при помощи нацеливающей конструкции ДНК и которне оперативно соединень со вторьі!м зкзоном зндо- генного гена. Необязательно могут присутствовать множественнье зкзогеннье зкзоньі (кодирующие или некодирующие) и интроньї, оперативно соединеннье с каким-либо зкзоном зндогенного гена. Полученнье гомологично рекомбинантнье клетки культивируют при условиях, которне проводят отбор на амплифика- цию, если нужно, ДНК, кодирующей амплифицируемьй маркер, и новую транскрипционную единицу. С амплификацией или без нееє, клетки, получаеємье зтим способом, можно культивировать при условиях, из- вестньїх в зтой области, пригодньїх для зкспрессии целевого белка, получая тем самьм зтот белок іп Ууйго или зти клетки можно использовать для доставки іп мімо терапевтического белка (т.е. для генной терапии).
В применений здесь, термин "первичная клетка" включает в себя клетки, присутствующие в суспен- зии клеток, виіделенньїх из источника ткани позвоночного животного (перед их посевом, т.е. присоединен- нье к субстрату для культурь! ткани в чашке или колбе), клетки, присутствующие в зксплантате, получен- ном из ткани, клетки обоих типов, вниісеянньсе в первьй раз, и клеточнье суспензии, полученньє из зтих по- сеянньїх клеток. Термин "вторичная клетка или клеточньійй штамм" относится к клеткам на всех последую- щих стадиях в культивирований. Т.е. посеянную в первьій раз первичную клетку удаляют с клеточного субстрата и пересевают (пассируют), ее назьівают здесь вторичной клеткой, так же как и все клетки в пос- ледующих пассажах. Вторичньюе клетки являются клеточньми штаммами, которье состоят из вторичньх клеток, которье бьіли пассировань один или более раз. Клеточньйй штамм состоит из вторичньх клеток, ко- торьге: 1) биіли пассировань один или более раз; 2) обнаруживают конечное число средних удвоений популяции в культуре; 3) обнаруживают свойства ингибируемого контактом, зависимого от прикрепления роста (зависи- мость от прикрепления не приложима к клеткам, которне размножаются в суспензионной культуре); и 4) не являются иммортализованньми.
Иммортализованнье клетки представляют собой клеточнье линии (в противоположность клеточньі!м штаммам, с обозначением "штамм", резервируемь/м для первичньїх и вторичньїх клеток), решающим приз- наком которьх является то, что они обнаруживают явно неограниченную продолжительность жизни в куль- туре.
Клетки, вьібранньсе для описьіваемого способа, могут подразделяться на 4 типа или категории: 1) клетки, которне сами по себе не производят или не содержат данного белка или продукта (такого, как белок, которьйй обьічно не зкспрессируется зтой клеткой, или такого, как слитьй белок, обьічно не обна- руживаєемьїйй в природе), 2) клетки, которне продуцируют или содержат зтот белок или продукт, но в количествах иньх, чем желательнье количества (например, в количествах, меньших, чем физиологически нормальньй низший уровень для полученной клетки регзе), 3) клетки, которне продуцируют зтот белок или продукт при физиологически нормальньїх уровнях для самой клетки, но должньї иметь увеличенное или усиленное содержание или продуцирование зтого белка, и 4) клетки, в которьїх желательно изменить характер регуляции или индукции гена, кодирующего зтот белок. Первичньсєе, вторичнье и иммортализованньсе клетки для трансфекции данньїм способом могут бьть получень из разнообразньїх тканей и включают в себя все клеточньсе типьї, которне могут поддерживаться в культуре. Например, первичньсе и вторичньсе клетки, которне можно трансфицировать данньім способом, включают в себя фибробластьії, кератиноцитьі, зпителиальнье клетки (например, зпителиальнье клетки молочной железьі, кишечнье зпителиальнье клетки), зндотелиальньсе клетки, глиальнье клетки, нервнье клетки, форменнье злементь! крови (например, лимфоцить», клетки костного мозга), мьішечнье клетки и предшественники зтих типов соматических клеток. При использованиий гомологично рекомбинантньх кле- ток в генной терапий первичньюе клетки предпочтительно получают из индивидуума, которому вводят трансфицированнье первичнье или вторичнье клетки. Однако первичнье клетки могут бьіть получень из донора (а не из реципиента) того же вида.
Гомологично рекомбинантнье иммортализованнье клетки можно также получать данньім способом и использовать либо для получения белка, либо для генной терапии. Примерьі! иммортализованньх челове- ческих клеточньїх линий для получения белка или генной терапийи по способу данного изобретения вклю- чают в себя (но не ограниченьії ими) клетки НТ1080 (АТСС СС 121), клетки Неіа и производнье клеток
Неїа (АТСС СС 2, 2.1 и 2.2), клетка рака молочной железьї МСЕ-7 (АТСС ВТН 22), клетки лейкоза К-562 (АТС СС. 243), клетки карциномь! КВ (АТСС СС. 17), клетки рака яичника 2780А0 (Мап аєег ВіїскК, А.М. еї аі.,, Сапсег Вез. 48:5927-5932 (1988), клетки Каії (АТС СС 86), клетки Уигкаї (АТОС ТІВ 152), клетки
Матама (АТСС СК 1432), клетки НІ -60 (АТСС СС 240), клетки Юацаї (АТС СС 213), клетки КРМІ 8226 (АТСС СС 155), клетки О-937 (АТСС СК. 1593), клетки меланомь! Боуеса (АТСС СК. 9607), клетки подлиний 224 М/И-38МА13 (АТС СІ 75.1) и клетки МОЇ! Т-4 (АТСС СВІ 1582), а также клетки гетерогиб- ридомьї, полученной слиянием клеток человека и клеток других видов. Могут бьіть использовань! вторич- нье штаммьї человеческих фибробластов, такие как УМ1-38 (АТС СС 75) и МЕС-5 (АТС СС. 171). Кро- ме того, первичнье, вторичньіе или иммортализованнье клетки человека, а также первичньсе, вторичнье или иммортализованньсе клетки из других видов, проявляющие свойства амплификации генов іп йо мож- но использовать для получения белка іп міо или для генной терапии.
Способ превращения гена в кДНК-копию.
Данное изобретение касаєтся также способа, при помощи которого гомологичную рекомбинацию ис- пользуют для превращения гена в кКДНК-копию (копию гена, не содержащую интронов). КкДНК-копия может бьіть перенесена в дрожжи или бактерии для получения белка іп міго или КДНК-копия может бьіть введена в клетку млекопитающего для получения белка іп міо или іп мімо. Если зта кКДНК должна бьїть перенесена в микробньсе клетки, две ДНК-конструкции, содержащие направляющие последовательности, вводят гомо- логичной рекомбинацией, причем одна конструкция против хода транскрипции и одна конструкция по ходу транскрипции гена человека кодирует терапевтический белок. Например, последовательности, введеннье против хода транскрипции, включают в себя последовательности ДНК, гомологичнье геномньїм последова- тельностям ДНК при или против хода транскрипции ДНК, кодирующей первую аминокислоту зрелого про- цессированного терапевтического белка; ретровирусньій длинньїй концевой повтор (ТК); последователь- ности, кодирующие маркер для отбора в микробньїх клетках; регуляторньійй злемент, функционирующий в микробньх клетках; и ДНК, кодирующую лидерньїйй пептид, ускоряющий секрецию из микробньх клеток, с донорньім сайтом сплайсинга. Последовательности, вводимье против хода транскрипции, вводят вблизи или против хода транскрипции геномной ДНК, кодирующей первую аминокислоту зрелого, процессирован- ного терапевтического белка. Последовательности, вводимьсе по ходу транскрипции, включают в себя пос- ледовательности ДНК, гомологичнье последовательностям геномной ДНК при или по ходу транскрипции
ДНК, кодирующей последнюю аминокислоту зрелого, процессированного белка; микробную последова- тельность терминации транскрипции; последовательности, способнье управлять репликацией ДНК в мик- робньїх клетках; и ретровирусньїй длинньйй концевой повтор (ТЕ). Последовательности, вводимье по ходу транскрипции, вводят смежно или по ходу транскрипции ДНК, кодирующей термирующий кодон зрелого, процессированного терапевтического белка. После введения зтих двух конструкций ДНК в клетки получен- нье клетки поддерживают при условиях, пригодньїх для гомологичной рекомбинации между введенной
ДНК и геномной ДНК, с образованием в результате рекомбинантньїх клеток. Иногда (не обязательно) одна или обе конструкции ДНК могут кодировать один или более маркеров для позитивного или негативного от- бора клеток, содержащих конструкцию ДНК, и стадию отбора можно добавить к способу, после того как од- на или обе конструкции ДНК бьли введень! в клетки. Альтернативно, последовательности, кодирующие маркер для отбора в микробньїх клетках, и последовательности, способньєе управлять репликацией ДНК в микробньїх клетках, могут присутствовать против хода транскрипции или по ходу транскрипции направляю- щей конструкции или маркер для отбора в микробньїх клетках может присутствовать по ходу транскрипции в направляющей конструкции, а последовательности, ответственнье за репликацию ДНК, могут присутст- вовать против хода транскрипции направляющей конструкции. Затем гомологично рекомбинантнье клетки культивируют при условиях, пригодньїх для регулируемой ТЕ транскрипции, процессинга и обратной транскрипции РНК-продукта гена, кодирующего терапевтический белок. Продукт обратной транскрипции представляет собой конструкцию ДНК, содержащую не имеющую интронов ДНК-копию, кодирующую тера- певтический белок, оперативно связанную с последовательностями ДНК, содержащими две описанньє вь!- ше зкзогенньіе конструкции ДНК. Не содержащую интронов конструкцию ДНК, полученную данньїм спосо- бом, вводят затем в микробную клетку. Затем микробную клетку культивируют при условиях, пригодньх для зкспрессиий и секреции терапевтического белка.
Получение белка іп мімо.
Гомологично рекомбинантнье клетки данного изобретения применимь! в виде популяций гомологич- но рекомбинантньх клеточньїх линий, в виде популяций гомологично рекомбинантньїх первичньх или вто- ричньїх клеток, гомологично рекомбинантньїх клональньїх клеточньїх штаммов или линий, гомологично ре- комбинантньх гетерогенньїх клеточньїх штаммов или линий и в виде клеточньїх смесей, в которьх по мень- шей мере присутствует одна репрезентативная клетка одной из четьірех указанньїх вьіше категорий гомо- логично рекомбинантньїх клеток. Такие клетки можно использовать в системе доставки для лечения инди- видуума с патологическим или нежелательньм состоянием, отвечающим на доставку терапевтического продукта, представляющего собой: 1) терапевтический белок (например, белок, которьйй отсутствует, продуцируется на низком уровне по отношению к физиологическим потребностям индивидуума, является дефектньмм или утилизируется незффективно или неправильньм образом в индивидууме; белок с новими функциями, такими как фер- ментативньсе или транспортньюе функции) или 2) терапевтическую нуклеиновую кислоту (например, РНК, ингибирующую зкспрессию гена или имею- щую собственную ферментативную активность). В способе данного изобретения обеспечения терапевти- ческого белка или нуклеийновой кислоть! гомологически рекомбинантнье первичнье клетки, клональнье клеточньіе штаммь! или гетерогенньюе клеточнье штаммь! вводят индивидууму, в котором необходимо ле- чение или предотвращение патологического или нежелательного состояния, в достаточном количестве и подходящим способом для зкспрессии или создания доступности зтого белка или зкзогенной ДНК при соот- ветствующих физиологическим уровням. Физиологически приемлемьм уровнем является уровень, которьй либо приближается к уровню, при котором продукт обьічно продуцируется в теле, либо ведет к улучшению патологического или нежелательного состояния. Согласно варианту изобретения, описанному здесь, вво- димье гомологично рекомбинантнье иммортализованнье клеточнье линии могут бьіть заключень! в одно или более полупроницаемьїх барьерньх (защитньїх) приспособлений. Свойства проницаємости зтого прис- пособления таковьї, что клетки не могут вніходить из приспособления при имплантации в животное, но те- рапевтический продукт легко проникаєт через него и может покидать барьерное устройство и входить в ло- кальное пространство, окружающее имплантат, или вступать в системную циркуляцию. Например, ПОН,
ПЕРО, инсулинотропин человека, ПОМ-С5Е, п2-С5Е, о-интерферон человека или Е5Нр человека могут доставляться системно в больньїх для получения терапевтических преимуществ.
Барьерньсе устройства, в частности, применимь! и позволяют имплантировать гомологично рекомби- нантнье иммортализованнье клетки, гомологично рекомбинантнье клетки из других видов (гомологично рекомбинантнье ксеногеннье клетки) или клетки из не имеющего гистосовместимости донора (гомологич-
но рекомбинантньсе аллогенньсе клетки) для лечения состояний человека или животньїх или для сельскохо- зяйственньїх целей (т.е. для производства мяса и молока). Барьернье устройства позволяют также осу- ществлять краткосрочную (т.е. временную) терапию путем обеспечения легкого доступа к клеткам для их удаления в случає, когда режим лечения должен бьть по тем или иньім причинам прекращен.
Множество синтетических, полусинтетических или природньїх фильтрующих мембран можно исполь- зовать для зтой цели, в том числе (но не только) целлюлозу, ацетат целлюлозьі, нитроцеллюлозу, поли- сульфон, поливинилдендифторид, поливинилхлориднье полимерь и полимерь! производньїх поливинилх- лорида. Барьернье устройства можно использовать для возможности применения первичньх, вторичньх или иммортализованньх клеток из других видов в генной терапии человека.
Получение белка іп Уго.
Гомологично рекомбинантньюе клетки из человека или других видов согласно зтому изобретению можно использовать также для получения белка іп міо. Зти клетки поддерживают при условиях, хорошо известньїх в данной области знаний, которье приводят к зкспрессии белка. Белки, зкспрессируемье при помощи описанньх способов, могут бьіть очищень из клеточньїх лизатов или клеточньїх супернатантов для получения очищенного желаемого белка. Белки, полученнье согласно зтому способу, включают в себя те- рапевтические белки, которне могут доставляться в человека или в животное общепринятьми фармацев- тическими способами, известньіми в зтой области (например, перорально, внутривенно, внутримьшечно, интраназально или подкожно). Такие белки включают в себя ПОН, ПЕРО, инсулинотропин человека, ПОМ-
СЕ, па2-С5Е, Е5НО или со-интерферон. Зти клетки могут бить иммортализованньіми, первичньіми или вторичньіми клетками. Использование клеток из других видов может бьіть желательньм в случаях, когда предпочтительнь! клетки не из человека для целей получения белка, если белок не из человека является терапевтически или коммерчески применимь!м, например, использование клеток, полученньїх из лосося, для получения кальцитонина лосося, использование клеток, полученньх из свиней, для получения свиного инсулина и использование бьічьих клеток для получения бьічьего гормона роста.
Преимущества.
Методологии, конструкции ДНК, клетки и образующиеся белки зтого изобретения обладают разнос- торонностью и многими другими преимуществами по сравнению со способами, применяемьми в настоя- щее время в зтой области в генном нацеливаний. Способность активации зндогенного гена помещением зкзогенной регуляторной последовательности при различньїх положениях, вариирующих от непосредст- венно смежного положения по отношению к представляющему интерес гену (непосредственно слитой с транскрибируемьмм районом обьічного гена) до положения 30 т.п.н. или далее против хода транскрипции от транскрибируемого района зндогенного гена или внутри интрона индогенного гена, является вьігодной для зкспрессии гена в клетках. Например, способ можно использовать для помещения регуляторного злемента против хода транскрипции или по ходу транскрипции районов, которье обьічно молчат или негативно регу- лируют ген. Помещение регуляторного злемента против хода транскрипции или по ходу транскрипции тако- го района может преодолеть такие доминантньюе негативнье зффекть!, которье обьічно ингибируют транскрипцию. Кроме того, районь! ДНК, которье обьічно ингибируют транскрипцию или имеют пагубное действие на зкспрессию гена, могут бьіть делетировань! при помощи направляющих конструкций, описан- ньїх здесь.
Дополнительно, т.к. известно, что промоторная функция сильно зависит от локального окружения, можно испьітьївать широкие диапазоньї положений для нахождения локальньїх окружений, оптимальньх для функционирования промотора. Однако, поскольку обнаружено, что стартовье кодоньії АТО находятся часто внутри ДНК млекопитающего (приблизительно один на 48 п.н.), транскрипция не может просто ини- циироваться при любом положений против хода транскрипции гена и продуцировать транскрипт, содержа- щий длинную лидерную последовательность, предшествующую правильному стартовому кодону АТО, т.к. частое присутствие кодонов АТО в такой лидерной последовательности будет предотвращать трансляцию корректного продукта гена и делать матрицу бесполезной. Таким образом, введение зкзогенного зкзона, донорного сайта сплайсинга и, необязательно, интрона и акцепторного сайта сплайсинга в надцеливающие конструкции, содержащие регуляторньйй район, позволяет оптимизировать зкспрессию гена посредством идентификации оптимального сайта для функции регуляторного района, без ограничения, налагаємого необходимостью избежать неподходящих стартовьїх кодонов АТО в продуцируемой мРНК. Зто обеспечи- вает значительно увеличенную гибкость в помещений конструкции и делает возможной активацию широ- кого диапазона генов. Конструкции ДНК данного изобретения применимь! также, например, в способах по- лучения слитьїх белков, кодируемьх рекомбинантньіми, или зкзогенньіми, последовательностями и зндо- генньїми последовательностями.
Генное нацеливание и амплификация генов, описаннье вьіше, применимьї, в частности, для измене- ния зкспрессии генов, которне образуют транскрипционнье единиць, которне настолько большие, что их трудно вьіделять и зкспрессировать, или для включения генов, для которьїх вся кодирующая область белка недоступна или не бьіла клонирована. Таким образом, зти конструкции ДНК, описаннье вьіше, применимь! для оперативного соединения зкзогенньїх регуляторньїх злементов с зндогенньіми генами способом, кото- рьій точно определяет транскрипционную единицу, обеспечиваєт гибкость в относительном размещений зкзогенньїх регуляторньїх злементов и зндогенньх генов в конечном счете и делает возможной вьісококонт- ролируемую систему для получения и регуляции зкспрессии генов, представляющих терапевтический ин- теребс.
Обьяснение примеров.
Как описано здесь, заявители показали, что ДНК может бьїть введена в клетки, такие как первичньє, вторичньіе или иммортализованнье клетки позвоночньх, и интегрироваться в геном трансфицированньх клеток посредством гомологичной рекомбинации. Далее они продемонстрировали, что зкзогенная ДНК имеет желаемую функцию в гомологично рекомбинированньїх (НЕ) клетках и что точно "пораженнье" клет- ки-мишени могут бьіть идентифицировань! на основе детектируемого фенотипа, сообщаєемого правильно нацеленной ДНК.
Заявители описьівают конструированиеє плазмидьі, применимой для нацеливания (направления) в определенньй локус (локус НРЕТ) в геноме человека и отбора на основе устойчивого к лекарственному средству фенотипа (Пример Та). Зта плазмида названа рЕЗМео и ее интеграция в клеточньй геном при ло- кусе НРЕТ даєет клетки, которне имеют Пргії, 6-Т2-устойчивьій фенотип и являются также устойчивьми к 6418. Как описано, заявители показали, что плазмида рЕЗзЗМео функционирует правильно в нацеливаний гена в установленной клеточной линии фибробластов человека (Пример 15) путем демонстрации локали- зации ДНК, введенной в клетки зтой линии, внутри зкзона З гена НРЕТ.
Кроме того, заявители демонстрируют генное нацеливаниєе в первичньх и вторичньїх фибропластах кожи человека с использованиеєм рЕЗМео (Пример 1с). Данная заявка демонстрируеєт далеє, что модифика- ция концов ДНК усиливаєт направление ДНК в геномную ДНК (Примерь! 1с и 12).
Заявители описьівают также способь, при помощи которьх ген может бьїть вставлен в заранее вьб- ранном сайте в геноме клетки, такой как первичная, вторичная или иммортализованная клетка, посредст- вом генного нацеливания (пример 14).
Кроме того, данное изобретение касается способа получения белка с применением трансфицирован- ньїх клеток. Способ использует трансфицированньє клетки, такие как первичнье клетки, вторичнье клетки или иммортализованньє клетки, с зкзогенной ДНК, которая кодирует терапевтический продукт, или с ДНК, которая может бьіть нацелена на зндогенньй ген, кодирующий терапевтический продукт. Например, приме- рь! 19, 1п, 1), 1К, 2, 3, 4 и 6 - 9 описьувают получение белка нацеливанием (направлением) на вьібранньй зкзогенньій ген злементов последовательности ДНК, которье будут изменять зкспрессию зтого зндогенно- го гена.
Заявители также описьівают конструкции ДНК и способьї амплификации зндогенного клеточного ге- на, которьй бьіл активирован генньім нацеливанием (примерь! 3, 6, 8 и 9).
Примерь 11-10, 2, 4 и 6 иллюстрируют варианть, в которьїх обьічнье регуляторнье последователь- ности против хода транскрипции от гена ЕРО человека изменяют для обеспечения зкспрессии ПЕРО в пер- вичньїх или вторичньїх фибробластньїх штаммах, которье не зкспрессируют ЕРО в детектируемьх коли- чествах в их нетрансфицированном состоянии. В одном варианте продукт нацеливания оставляєт обьч- ньій белок ЕРО интактньїм, но под контролем мьішиного промотора металлотионейина. Примерь! Її и 1) де- монстрируют использование сходньїх направляющих конструкций для активации зндогенного гена гормона роста в первичньїх и вторичньїхх фибробластах человека. В других вариантах для активации зкспрессий
ЕРО в фибробластах человека продукть! собьітий нацеливания являются химерньіми транскрипционньіми единицами, в которьх первьїй зкзон гена гормона роста человека расположен против хода транскрипции от зкзонов 2-5 ЕРО. Продуктом транскрипции (регулируемой промотором мьішиного металлотионеийна), сп- лайсинга и трансляции является белок, в котором аминокислоть 1-4 сигнального пептида ЕРО заменень! аминокислотньіми остатками 1-3 ПОН. Химерная часть зтого белка, сигнальньйй пептид, удаляется перед секрецией из клеток. Пример 5 описьівает направляющие конструкции и способь! получения клеток, кото- рье будут превращать ген (с интронами) в зкспрессируемую кКДНК-копию зтого гена (без интронов), и изв- лечение таких зкспрессируемьїх КДНК-молекул в микробньїх (например, дрожжевьїх или бактериальньмх) клетках. Пример 6 описьівает конструирование нацеливающего вектора, названного РКЕРОЯ4, для двойного отбора и отбора клеток, в которьїх амплифицировался ген апії. Плазмиду РЕРЕРОЯ4 использовали для амп- лификации локуса ЕРО человека в клетках НТ1080 (иммортализованной линии клеток человека) после ак- тивации зндогенного гена ПЕРО гомологичной рекомбинацией. Как указано, ступенчатьй отбор в содержа- щих метотрексат средах привел к 70-кратному увеличению в образованиий ПЕРО в клетках, устойчивьх к 0,4 мкМ метотрексату.
Примерь 7 и 8 описьівают способь! введения регуляторной последовательности против хода транск- рипции обьічного промотора ЕРО и способьі получения ЕРО с использованием такой конструкции. Кроме того, пример 8 описьівает амплификацию гена-мишени ЕРО, полученного по способу примера 7. Пример 9 описьівает способь! нацеливания генов с-интерферона, 5М-С5Е, 2-С5Е и Е5Нр человека для создания клеток, применимьїх для получения белков.
Зти примерьї обеспечивают способь!ї активации или активации и амплификации зндогенньмх генов ген- ньім нацеливанием, которое не требует манипуляции или других использований кодирующих белки районов генов-мишеней. При помощи описанньїх здесь способов и конструкций ДНК или плазмид или их модифика- ций, которне очевиднь! для специалистов с обьічной квалификацией в зтой области, зкспрессия генов может бьіть изменена в клетках, которне обладают свойствами, желательньми для получения белков іп міго (нап- ример, в фармации), или для способов доставки белков іп мімо (например, в генной терапийи). Примернь зи 6 иллюстрируют две стратегии транскрипционной активации гена ПЕРО.
При помощи способов и конструкций ДНК или плазмид, описанньх здесь, или модификаций, которье очевидньї для среднего специалиста в зтой области, зкзогенная ДНК, кодирующая терапевтический про- дукт (например, белок, рибозим, антисмьісловую РНК), может бьїіть вставлена при заранее вьібранньїх сай- тах в геноме первичньх или вторичньїх клеток позвоночньїх (например, млекопитающих, как человека, так и других видов).
Данное изобретение будет теперь иллюстрироваться следующими далее примерами, которье не предназначень для какого-либо ограничения изобретения.
Примернь!.
Пример 1. Получение трансфицированньмх клеточньїх штаммов генньїм нацеливанием.
Генное нацеливание имеет место, когда трансфицированная ДНК либо интегрируется в хромосом- нье последовательности ДНК, либо частично заменяет хромосомнье последовательности ДНК в результа- те гомологичной рекомбинации. Хотя такие собьтия могут иметь место в ходе любого конкретного зкспери- мента по трансфекции, они обьічно маскируются огромньїм избьітком собьтий, в которьїх плазмидная ДНК интегрируется посредством негомологичной, или неправильной, рекомбинацией. а. Генерирование конструкции, применимой для отбора собьтий генного нацеливания в клетках че- ловека.
Одним подходом для отбора нацеленньїх собьітий является генетический отбор на потерю функции гена, виізьіваемую интеграцией трансфицирующей ДНК. Локус НРЕТ человека кодирует фермент гипоксан- тин-фосфорибозилтрансферазу. Клетки Прії- могут бьіть отобрань! по росту в среде, содержащей нуклео- зидньїйй аналог 6б-тиогуанин (6-Т5): клетки с аллелем дикого типа (НРЕТ») убиваются 6-Т0, тогда как клет- ки с мутантньіми аллелями (Прі) могут вьіживать. Таким образом, клетки, подвергнутье нацеленньм со- бьітиям, которне разрушают функцию гена НРЕТ, можно отбирать в среде 6-Та.
Для конструирования плазмидь! для нацеливания на локус НРЕТ фрагмент 6,9 т.п.н. Ніпа 111, прос- тирающийся от положений 11960-18869 в последовательности НРКТ (Сеперапк пате НОМНРКТВ:
Едймагав, А., єї аі., Чепотісв 6:593-608 (1990)) и включающий в себя зкзонь 2 и З гена НРКТ, субклониро- вали в сайт Ніпа 111 русС12. Полученньй клон расщепляют при уникальном сайте Хпо1 в зкзоне З фраг- мента гена НРКТ и фрагмент 1,1 т.п.н. За!/1-Хпо1, содержащий ген пео из РМС1Мео (5іга(едепе) встав- ляют, разрушая кодирующую последовательность зкзона 3. Бьіла вьібрана и обозначена рЕЗзМео одна ориентация, с направлением транскрипции пео, противоположньім направлению транскрипции НРКТ. За- мена обьічного зкзона З НРКТ пео-разрушенной версией будет приводить к фенотипу прі, 6-70 устойчи- вому. Такие клетки будут также устойчивь! к 5418. р. Генное нацеливание в установленной клеточной линии фибробластов человека.
В качестве демонстрации нацеливания в иммортализованньмх клеточньх линиях и для установления, что рРЕЗМео функционирует правильно в генном нацеливаний линию клеток фибросаркомь! человека
НТ1080 (АТСС СС. 121) трансфицировали рЕЗМео посредством злектропорации.
Клетки НТ1080 поддерживали в НАТ (гипоксантин/аминоптерин/ксантин) с добавлением ОМЕМ с 1595 телячьей сьівороткой (Нусіопе) перед злектропорацией. За два дня перед злектропорацией клетки перено- сили на ту же самую среду без аминоптерина. Зкспоненциально растущие клетки трипсинизировали и ре- суспендировали и разбавляли в ОМЕМ/15 95 телячья сьіворотка, центрифугировали и ресуспендировали в
РВ5 (фосфатно-солевом буфере) при конечном клеточном обьеме 13,3 млн клеток на мл. РЕЗзМео-расщеп- ляли Ніпа 111, отделяя фрагмент 8 т.п.н. НРКТ-пео от структурьї рРОС12, очищали фенольной зкстракцией и осаждением зтанолом и ресуспендировали при концентрации 600 мкг/мл. 50 мкл (30 мкг) добавляли в кю- вету для злектропорации (расстояние между злектродами 0,4 см; Віо-Кай І арогаїюгіе5) вместе с 750 мкл клеточной суспензии (10 млн клеток). Злектропорацию вьіполняли при 450 вольт, 250 мкф (Віо- Кай Сепе
Риївзег: Віо-Кай І арогагіез). Содержимое кюветь! сразу же добавляли к ОМЕМ с 1595 телячьей сьіворот- кой, получая клеточную суспензию 1 млн. клеток на 25 мл средь. 25 мл обработанной клеточной суспензийи висевали на чашки для культурь! ткани с диаметром 150 мм и инкулировали при 372С и 595 СО». Через 24 часа добавляли раствор 5418 непосредственно в чашки, получая конечную концентрацию 800 мкг/мл 418. Через 5 дней среду заменяли смесью ОМЕМ/1595 телячья сьіворотка/800 мкг/мл 5418. Через 9 дней после злектропорации среду заменяли ОМЕМ/159о телячья сьіворотка/800 мкг/мл 5418 и 10 мкМ б-тиогуа- нином. Колонии, устойчивье к 5418 и 6-Т0, вьіскребали при помощи клонирующих цилиндров через 14-16 дней после инициации двойного отбора.
Результать! 5 репрезентативньїх зкспериментов по нацеливанию в клетках НТ1080 показань! в табли- це 1.
Таблица 1 фекция обработанньх 6-Та-клонов клеток 1 1х107 32 2 1 х107 28
З 1 х107 24 4 1х107 32 1 х107 66
Для трансфекции 5, контрольнье чашки, предназначеннье для определения общего вьїхода 5418'- колоний, показали, что 33700 418" колоний могли генерироваться из первоначальньїх 1 х 107 обработан- ньіїх клеток. Таким образом, отношение нацеленньх собьітий к ненацеленньім равно 66/33700 или 1 к 510.
В 5 обьєдиненньх зкспериментах нацеленнье собьтия происходят при частоте 3,6 х 105 или 0,0003695 об- работанньх клеток.
Зксперименть с рестриктазами и с гибридизацией по Саузерну с применением зондов, произведен- ньІїх из генов пео и НРЕТ, показали, что ген пео локализован на локусе НРКТ при предсказанном сайте внутри зкзона З НРКЕТ.
с. Генное нацеливание в первичньх и вторичньїх фибробластах кожи человека. рніМео расщепляли Ніпа 111, отделяя фрагмент 8 т.п.н. НРЕТ-пео от структурьї рОС12, и очищали фенольной зкстракцией и осаждением зтанолом. ДНК суспендировали при 2 мг/мл. Три млн вторичньх клеток фибробластов крайней плоти человека в обьеме 0,5 мл подвергали злектропорации при 250 вольт и 960 мкф с 100 мкг Ніпа 111 рЕЗМео (50 мкл). Вьіполняли три отдельнье трансфекции, для 9 млн обрабо- танньїх клеток в целом. Клетки процессировали и проводили отбор на устойчивость к 53418. 500000 клеток на 150 мм-чашку для культурь! вьісевали для отбора на устойчивость к 5418. После 10 дней в присутствий 6418 культуральную среду заменяли питательной средой для фибробластов человека, содержащей 400 мкг/мл 5418 и 10 мкм 6-Т0. Отбор с комбинацией двух лекарственньїх средств продолжали еще в течение дней. Чашки сканировали микроскопически для локализации колоний фибробластов человека, устойчи- вьїх к обоим лекарственньім средствам. Фракции 5418! 6-Т(1-колоний составляла 4 на 9 млн обработан- ньїх клеток. Зти колонии составляют 0,000190о (или 1 в млн) всех клеток, способньїх к образованию колоний.
Контрольнье чашки, предназначеннье для определения общего вьїхода 5418'-колоний, показали, что 2850 (418-колоний могли образоваться из первоначальньїх 9 х 1092 обработанньх клеток. Таким образом, отно- шение нацеленньїх собьттий к ненацеленньїм равно 4/2850 или 1/712. Зксперименть! с рестриктазой и гиб- ридизацией по Саузерну с применением зондов, полученньмх из генов пео и НРКТ, использовали для лока- лизации гена пео в локусе НРКТ при предсказанном сайте внутри зкзона З НРЕКТ и демонстрации того, что нацеливаниеє имело место в зтих 4 клональньх клеточньїх штаммах. Колонии, устойчивье к обоим лекарст- венньїм средствам, также вьіделяли посредством трансфекции первичньїх клеток (1/3,0 х 107).
Результать! нескольких зкспериментов с нацеливанием при помощи рЕЗзМео суммировань! в таблице 2. Расщепленную Ніпа 111 плазмиду рРЕЗзМео либо трансфицировали непосредственно, либо обрабатьва- ли зкзонуклеазой 111 для генерирования 5'-одноцепочечньїх вьіступов перед трансфекцией (см. пример 1с). Испьітьіївали препарать! ДНК с одноцепочечньіми районами от 175 до 930 п.н. длиной. При использова- ний только рЕЗМео, расщепленной Ніпа 111, идентифицировали 1/799 5418'-устойчивьїх колоний при по- мощи рестрикционного анализа и гибридизации по Саузерну, имеющих нацеленную инсерцию гена пео при локусе НРЕТ (всего вьіделили 24 нацеленньх клона). Нацеливание максимально стимулировалось (приб- лизительно в 10 раз) при использований вьіступов длиной 175 п.н. с 1/80 5418-колониями, обнаруживаю- щими фрагменть! рестрикции, которье бьіли диагностическими для нацеливания при НРЕТ (всего вьідели- ли 9 нацеленньх клонов). Таким образом, при помощи условий и рекомбинантньїх конструкций ДНК, описан- ньІїх здесь, нацеливание действительно имело место в обьічньїх фибробластах человека и общая частота на- целивания (число обнаруживающих нацеливание клонов, разделенное на общее число клонов, стабильно трансфицированньх до устойчивости к 5418) могла стимулироваться трансфекцией нацеливающими конст- рукциями, содержащими одноцепочечньсе вьіступающие конць, способом, описаннь!м в примере 1е.
Таблица 2
Нацеливание на локус НРАТ в фибробластах человека с418-колоний клонов
Продукт расщепления
Ніпа111 (5) 1/799 24 вьіступ 175 1 1/80 9 п.н. З 1/117 20 вьіступ 350 1 1144 1 п.н. вьіступ 930 п.н. а. Образование конструкции для направленной инсерции представляющего терапевтический интерес гена в геном человека и ее использование в генном нацеливании.
Вариант рЕЗМео, в котором представляющий терапевтический интерес ген вставлен в кодирующую
НРЕТ область, смежную с геном пео или вблизи гена пео, можно использовать для направления представ- ляющего интерес в терапии гена в специфическое положение в реципиентном геноме первичной или вто- ричной клетки. Такой вариант РЕЗзМео можно сконструировать для нацеливания гена пон на локус НРКТ. рхон5 (схематически представленную на рис. 3) расщепляют ЕсоК!1 и вьіделяют фрагмент 4,1 т.п.н., содержащий ген ПОН и соединенньй с ним мьішиньй промотор металлотионеина (тптМТ). Вьіступающие концьї ЕсоКк1 заполняют при помощи фрагмента Кленова из ДНК-полимеразь! Е.Соїї. Отдельно рЕЗзМео расщепляют Хпо1, которая разрезает при границе фрагмента пео и зкзона З НРКТ (3'--соединение вставки в зкзон 3). Хпо1 вьіступающие концьї линеаризованной плазмидь! заполняют фрагментом Кленова из ДНК- полимеразь! Е.соїї и полученньй фрагмент лигируют с фрагментом пОН-тМТт 4,1 т.п.н. с затупленньіїми концами. Бактериальнье колонии, полученньюе из смеси для лигирования, скринируют рестрикционньм анализом на инсерцию одной копий фрагмента ПпОН-тМТ, и одну ориентацию, при которой ген ПОН транск- рибирован в том же направлений, что и ген пео, вьиібирают и обозначают как РЕзЗМео/ЛОН. Зту плазмиду расщепляют Ніпа 111, получая фрагмент 12,1 т.п.н., содержащий последовательности НРЕКТ, пео и тмМТ-
ПОН. Расщепленную ДНК обрабатьівают и трансфицируют в первичнье или вторичнье фибробласть! чело- века, как описано в примере 1с. Отбирают 5418" ТО"-колоний и анализируют их на инсерцию последова-
тельностей тмМтТ-О5Н и пео в гене НРКТ, как описано в примере 1с. Отдельнье колониий анализируют на зкспрессию ПОН с использованием коммерчески доступного иммунотеста (Міспої5 Іпбійше).
Вторичнье фибробласть! человека трансфицировали рЕЗзМео/пОН и устойчивье к тиогуанину коло- ний анализировали на стабильную зкспрессию ПОН и с применением рестрикционного анализа и гибриди- зации по Саузерну. Из 13 анализированньїх ТО"-колоний 8 колоний имели инсерцию гена ПОН в локусе зндогенного НРЕТ. Все 8 штаммов стабильно зкспрессировали значительнье количества ПОН со средним уровнем зкспрессии 22,7 мкг/109 клеток/24 часа. Альтернативно, плазмиду рРЕЗМеОЕРО, рис. 4, можно ис- пользовать для направления ЕРО в локус НРЕТ человека.
Использование гомологичной рекомбинации для направления представляющего терапевтический интерес гена в специфическое положение в геномной ДНК клетки может бьіть расширено и сделано более применимь!м для получения продуктов для терапевтических целей (например, для фармации, генной тера- пии) посредством инсерции (вставка) гена, через которьйй клетки, содержащие амплифицированнье копий зтого гена, могут бьіть отобраньі путем вьідерживания их в подходящем режиме отбора при помощи ле- карственньїх средств. Например, плазмида РЕЗзМео/1ОН (пример 14) может бить модифицирована встрай- ванием гена апіт, ада или САО в положение, непосредственно рядом с генами ПОН или пео в РЕЗзМмМео/пОН.
Первичнье, вторичнье или иммортализованнье клетки трансфицируют такой плазмидой и идентифици- руют точно нацеленньсе собьтия. Затем зти клетки обрабатьвают увеличивающимися концентрациями ле- карственньїх средств, пригодньїх для отбора клеток, содержащих амплифицированньє гень (для апіг се- лектирующим агентом является метотрексат, для САО селектирующим агентом является М-(фосфонаце- тил)-І -аспартат (РАГА) и для ада селектирующим агентом является адениновьй нуклеозид (например, аденозин). В зтом случає интеграция терапевтического гена будет косамплифицироваться вместе с геном, амплифицированньюе копии которого отбираются. Таким образом, генетическое конструирование клеток для получения генов для терапевтических целей может легко контролироваться посредством предвари- тельного вьібора сайта, при котором происходит интеграция направляющей конструкции и при котором на- ходятся амплифицированнье копийи в амплифицированньх клетках. е. Модификация концов ДНК для усиления нацеливания.
Несколько линий доказательства позволяют предположить, что вьиіступающие 3'-концьі участвуют в некоторьхх путях гомологичной рекомбинации Ес.соїї, бактериофага, 5. сегемізіаеє и Хепориз Іаемі5, в ооцитах
Хепоризв Іаєміз молекуль! с вьіступающими 3'-концами длиной в несколько сотен пар оснований подверга- лись рекомбинации с подобньімм образом обработанньми молекулами гораздо более бьістро после мик- роиньекции, чем молекуль! с очень короткими вьіступающими концами (4 п.н.), образованньіми при рас- щепленийи рестриктазами. В дрожжах образование вьіступающих 3'-концов длиной в несколько сотен п.н. является, по-видимому, ограничивающей скорость стадией в мейотической рекомбинации. Не бьіло сооб- щений об участии виіступающих 3'-концов в рекомбинации в клетках человека и ни в одном случає не бьло показано, что модифицированнье ДНК-субстрать! какого-либо сорта усиливают нацеливание (одну форму гомологичной рекомбинации) в каком-либо виде. Зксперимент, описанньійй в следующем примере и в при- мере 1с, позволяет предположить, что виіступающие 5'-концьї зффективнь! для стимуляции нацеливания в первичньх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластах человека.
Не бьіло сообщений об усилений нацеливания путем модификации концов трансфицирующих моле- кул ДНК. Зтот пример служит для иллюстрации того, что модификация концов линейньїх молекул ДНК пу- тем превращения концов молекул из двухцепочечной формь! в одноцепочечную форму может стимулиро- вать нацеливание и включение в геном первичньїх и вторичньїх фибробластов человека. 1100 мкг плазмидьі! рЕЗзМео (пример Та) расщепляли Ніпа 111. Зту ДНК можно использовать сразу после фенольной зкстракции и осаждения зтанолом или фрагмент Ніпа 111 8 т.п.н., содержащий только
НРЕТ и ген пео, может бьіть отделен от последовательностей вектора рисС12 гель-злектрофорезом. Рас- щепление при помощи Ехо111 расщепленной Ніпа 111 ДНК приводит к интенсивному зкзонуклеотическому расщеплению на каждом конце, начинающемуся на каждом свободном 3'-конце и оставляющему вьсту- пающие 5'-концьї. Степень зкзонуклеотического действия и, следовательно, длина образующихся 5'-вьІсту- пов могут регулироваться вариированием времени расщепления при помощи Ехо111. Расщепление при помощи Ехо111 100 мкг расщепленной Ніпа 111 рЕЗзМео проводят в соответствии с рекомендуемьми пос- тавщиком условиями в течение времени 30 сек., 1 мин., 1,5 мин., 2 мин., 2,5 мин., З мин., 3,5 мин., 4 мин., 4,5 мин., 5 мин. Для наблюдения степени расщепления аликвоту из каждой временной точки, содержащую 1 мкг обработанной Ехо111 ДНК, обрабатьввают нуклеазой маша (Рготеда) при рекомендуемьх поставщи- ком условиях и пробу фракционируют гель-злектрофорезом. Измеряют различие в размере между необра- ботанной, расщепленной Ніпа 111 рЕЗМео и теми же самьмми молекулами, обработанньми Ехо111 и нук- леазой маша. Зто различие в размере, разделенное на 2, дает среднюю длину 5'-вьіступа на каждом конце молекуль!. При использований указанньїх виіше временньїх точек и расщепления при 302С полученньве 5'- вьіступьї должньї находиться в пределах от 100 до 1000 оснований. 60 мкг обработанной Ехо111 ДНК (общего продукта расщепления рЕЗМео при помощи Ніпа 111) из каждой временной точки очищали и вводили злектропорацией в первичньєе, вторичнье или иммортализо- ваннье фибробласть! человека при условиях, описанньїх в примере 1с. Степень, до которой усиливаєтся нацеливание каждьм обработанньм Ехо111 препаратом, определяют количественно подсчетом числа с418! 6-ТСи-колоний и сравнением зтих чисел с нацеливанием расщепленной Ніпа 111 рЕЗМео, не обрабо- танной Ехо 111.
Действие вьіступающих 3'-концов можно также оценить количественно при помощи аналогичной сис- темьії. В зтом случаеє расщепленную Ніпа 111 рЕЗзМео обрабатьівают зкзонуклеазой гена 6 бактериофага 17
(плей зіасгез Віоспетіса!5) в течение разньїх временньїх интервалов при рекомендуемьїх поставщиком ус- ловиях. Определение степени расщепления (средней длиньї! 3'-вьіступа, образуемого на один конец) и ус- ловиях злектропорации соответствовали описанньім для обработанной Ехо111 ДНК. Степень, до которой усиливается нацеливание каждьй обработанньім зкзонуклеазой гена 6 77 препаратом, определяют коли- чественно путем подсчета числа 5418! 6-ТСи-колоний и сравнения зтих чисел с нацеливанием расщеплен- ной Ніпа 111 рЕЗзМео, не обработанной зкзонуклеазой гена 6 17.
Возможнь другие способьї образования вьіступающих 5'- и 3'-концов, например, денатурация и отжиг двух линейньїх молекул, которне частично перекрьіваются друг с другом, будут создавать смесь молекул, имеющих 3'-вьіступ на обоих концах или 5'-вниіступ на обоих концах, а также повторно гибридизованньх фрагментов, неотличимьїх от исходньїх линейньїх молекул. Длину зтих виіступающих концов определяют по длине ДНК, которая не является общей между двумя фрагментами ДНК.
Її. Конструирование направляющих плазмид для помещения гена зритропозтина человека под конт- роль мьішиного промотора металлотионейна в первичньх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластах человека.
Дальнейшее описание служит для иллюстрации одного варианта данного изобретения, в котором обьічнье позитивнье и негативнье регуляторнье последовательности, расположенньюе против хода транскрипции от гена озритропозтина человека (ПЕРО), изменяют для обеспечения зкспрессии зритропозтина человека в первичньїхх, вторичньїх или иммортализованньїх фибробластах человека, кото- рье обьічно не зкспрессируют ПЕРО в значительньх количествах.
Район, лежащий исключительно против хода транскрипции от кодирующего района ЕРО человека, может бьїть амплифицирован при помощи ПЦР. Три набора праймеров, применимьїх для зтой цели, бьіли сконструировань после анализа опубликованной последовательности ЕРО человека |(Сепебрапк дезідпайоп
НОМЕВАРА; п, Е-К, еї. аї., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 82:7580-7584 (1985)). Зти парьї праймеров могут амп- лифицировать фрагменть 609, 603 или 590 п.н.
Таблица З
Праймер Координата Последовательность Размер
НИМЕВРА фрагмента г 2-20 5 АоСТТСТОООСТТССАСАС (ЗЕО ІО Мое1) нг 610 -» 595 5 СОООТоССТСАССОАС 609 пн. (ЗЕО ІО Мог2) гг 8-24 5 ТОСОСТТССАСАСССА (ЗЕО ІО Мое3) в 610 -» 595 Б ОООСТоСсСтТСАСсСсАС 603 п.н.
ЕЗ 21-55 40 5' ССАОСТАСТТТОТОСААСТС (ЗЕО ІО Мод) 590 п.н. нг 610 -» 595 5' вОСТоССтТСАССОАС
Зти три фрагмента, существенно перекрьваются и взаймозаменяємь для поставленньїх целей.
Фрагмент 609 п.н., простирающийся от -623 до -14 по отношению к сайту инициации трансляции (положения нуклеотидов НИМЕКРА 2-610) лиги- руют на обоих концах с линкерами Сіа1. Полученньій фрагмент с линкерами Сіа! расщепляют Сіа1 и вст- раивают в сайт Сіа! рВіпезсгірі 1155К/- (5ігаїадепе) с такой ориентацией, что положение нуклеотида
НОМЕРРА 610 находится рядом с сайтом зЗа!/1 в плазмидном полилинкере. Зта плазмида, рУЕРО, может бьіть расщеплена, отдельно, при уникальньїх сайтах Е5р1 или 511 в расположенном против хода транск- рипции фрагменте ЕРО человека (положения нуклеотидов НОМЕКРА 150 и 405, соответственно) и лигиро- вана с промотором мьішиного металлотионейина. В типичном случає, зтот фрагмент Есок1-Ва111 1,8 т.п.н. из гена тМтТ-1 (не содержащий кодирующих последовательностей тмТ; Натег, О.Н. и Умаїїїпд М. 9. Мо).
Аррі. Сеп. 1: 273-288 (1982); зтот фрагмент можно также вьіделить известньіми способами из мьішиной ге- номной ДНК с применением праймеров ПЦР, сконструированньх на оснований анализа последовательнос- тей тМТ, доступньїх из сСепрапк; т.е. МОБ-МТ1, МО5МТІР, МОЗМТІРЕМІ делают фрагментом с затуплен- ньіми концами при помощи известньїх способов и лигируют с расщепленной 511 (также с затупленньіми концами) или расщепленной Е5рі! плазмидой роУЕРО. Анализируют ориентацию полученньїх клонов и те клонь, в которьїх первьій сайт Ваі11 тМТт является проксимальньм к сайту за!1 в плазмидном полилинке- ре, используют для нацеливания первичньх и вторичньїх фибробластов человека. Зта ориентация направ- ляет транскрипцию тМмТ в направлений положения нуклеотида НОМЕКРА 610 в конечной конструкции. По- лученнье плазмидь! обозначеньі рУ'ЄРО-тпМТЕ и ру'ЕРО-тМТ5 для встрайвания тМмТ в сайть! Е5р1ї и 51, соответственно.
Дополнительньсе последовательности против хода транскрипции применимь! в случаях, когда жела- тельно модифицировать, делетировать и/или заменить негативнье регуляторнье злементь! или знхансе- рьї, которне лежат против хода транскрипции от исходной последовательности-мишени. В случає ЕРО, мо- жет бьіть делетирован негативньй регуляторньїй злемент, которьйй ингибирует зкспрессию ЕРО во внепе-
ченочньх и внепочечньх тканях |(Зетепга, У.І.., єї. аІ., Мої. Сеї! Віої. 10: 930-938 (1990)). Получен ряд деле- ций во фрагменте 6 т.п.н. Делетированнье районь! могут бьіть заменень!і знхансером с широкой активност- ью (спектром) клеток-хозяев |например, знхансером из Суїотедаїаміги5 (СММ)|.
Ориентация фрагмента УЕРО 609 т.п.н. в векторе рВіцезсгірі 11 5К/ била вьібрана, т.к. перед пос- ледовательностями НОМЕКРА на их 5-конце находится сайт Ватні! (дистальньй) и сайт Ніпа 111 (прокси- мальньй). Таким образом, фрагмент 6 т.п.н. ВатН1--Ніпа 111, обьічно лежащий против хода транскрипции от фрагмента 609 п.н. |бетепла У.І., єї аі., Мої. СеїІ. Вісі. 10:930-938 (1990)), может бьтть вьіделен из ге- номной ДНК известньіми способами. Например, бактериофаговую, космидную или дрожжевую искусствен- ную хромосомную библиотеку можно скринировать амплифицированньм при помощи ПЦР фрагментом 609 п.н. в качестве зонда. Желаемьй клон будет иметь фрагмент 6 т.п.н. Ватн1--Ніпа 111 и его идентич- ность может бьіть подтверждена сравнением его рестрикционной карть! с рестрикционной картой вокруг ге- на ЕРО человека, определенной известньіми способами. Альтернативно, конструирование рестрикционной картьї генома человека против хода транскрипции от гена ЕРО с использованием фрагмента 609 п.н. в ка- честве зонда может идентифицировать ферменть!, которне образуют фрагмент, начинающийся между координатами НОМЕРКРА 2 и 609 и простирающийся за сайт Ватні против хода транскрипции; зтот фраг- мент можно вьіделить при помощи гель-злектрофореза из подходящего продукта расщепления геномной
ДНК человека и лигировать в бактериальньй или дрожжевой клонирующий вектор. Точньй клон будет гиб- ридизоваться с 609 п.н. УЕРО-зондом и содержать фрагмент 6 т.п.н. Ватн1-Ніпа 111. Вьіделенньій фраг- мент 6 т.п.н. встраивают в правильной ориентации в рЕРО, рУЕРО-ТМТЕ или рУЕРО-ТМТЗ5 (так чтобь сайт Ніпа 111 находился рядом с нуклеотидньімм положением НОМЕРКРА 2). Дополнительнье последова- тельности против хода транскрипции могут бьїть вьіделеньї известньїіми способами, использующими спосо- бьї прогулки по хромосоме, или вьіделением дрожжевьїх искусственньїх хромосом, гибридизующихся с зон- дом 609 п.н. УЕРО.
Стратегии клонирования, описанньєе вьіше, позволяют модифицировать іп міго последовательности против хода транскрипции ЕРО для последующей направленной трансфекции первичньїхх, вторичньїх или иммортализованньїх фибробластов человека. Зти стратегии описьівают простье встрайвания промотора тТМТ, а также делецию негативного регуляторного района и делецию негативного регуляторного района и замену его знхансером с широкой активностью клеток-хозяев. д. Активация гена ЕРО человека и вьіделение получивших нацеленнье конструкции ДНК первичньх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластов человека при помощи скрининга.
Для нацеливания плазмидь! разрезают рестриктазами для освобождения вставки (инсерции) от плазмидного каркаса. В случає плазмидьі! р'ЕРО-ТтМТ5, расщепление Ніпа 111 и 5011 вьісвобождаеєет нап- равляющий фрагмент 2,4 т.п.н., состоящий из промотора тМмТтТ 1,8 т.п.н., фланкированного на 5'- и 3'-сторо- нах последовательностями из 405 п.н. и 204 п.н., соответственно, ДНК для направления зтой конструкции к регуляторному району гена ЕРО человека. Зту ДНК или направляющий Фрагмент 2,4 т.п.н. очищают фе- нольной зкстракцией и осаждением зтанолом и трансфицируют в первичнье или вторичнье фибробласть человека при условиях, описанньїх в примере 1с. Трансфицированнье клетки вьісевают на чашки с диа- метром 150 мм в питательную среду для фибробластов человека. Через 48 часов зти клетки вьсевают в 24-пуночньіе чашки при плотности 10000 клеток/см? |(приблизительно 20000 клеток на лунку; если нацели- вания происходит при скорости 1 собьітие нацеливания на 109 клонируемьїх клеток (пример 1 с), то прибли- зительно 50 лунок нужно будет проанализировать для вьіделения одной зкспрессирующей колоний)|. Клет- ки, в которьїх трансфицирующая ДНК попала в гомологичньій район против хода транскрипции гена ЕРО человека, будут зкспрессировать ПЕРО под контролем промотора тмтТ. После 10 дней луночнье суперна- тантьі! тестируют на зкспрессию ЕРО с использованием коммерчески доступного набора для иммунотеста (Атдеп). Клоньї из лунок, обнаруживающих синтез ПЕРО, вьіделяют известньіми способами, обьічно тести- рованием фракций гетерогенньїх популяций клеток, распределенньмх по отдельньім лункам, тестированием фракций позитивньїх лунок с повторением, если зто необходимо, и виіделением в конце концов колонийи со встроенной ДНК путем скрининга 96-луночньїх микротитрационньїх планшетов, засеянньїх при концентра- ции одна клетка на лунку. ДНК из лизатов всего планшета может бьіть также подвергнута анализу с приме- нением ПЦР на амплификацию фрагмента и применением тм'-специфического праймера вместе с прай- мером, лежащим против хода транскрипции от положения нуклеотида НОМЕРКРА 1. Зта пара праймеров должна амплифицировать фрагмент ДНК с размером, точно предсказанньім на основе последовательнос- ти ДНК. Позитивнье чашки трипсинизируют и пересевают при последовательно более низких разведениях и получение ДНК и стадии ПЦР повторяют для вьіделения получивших нацеленнье конструкции ДНК кле- ток.
Схемь! нацеливания, описаннье здесь, можно также использовать для активации зкспрессии ПОН в иммортализованньх клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС СС. 121), клетках Неї а и произ- водньїх клеток Неї а (АТОСС СС 2,21 и 2.2), клетках рака молочной железьї МСЕ-7 (АТСС НВ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС СС 232), клетках карциномь (АТСС СС 17), клетках рака яичника 2780А0 (Мап Оег
ВІїсК, А.М., єї. аІ., Сапсег Незв., 48: 5927-5932 (1988), клетках Каїї (АТСС СС 86), клетках Уигкаї (АТС Т1В 152), клетках Мата!ма (АТСС СВ. 1432), клетках НІ -60 (АТСС СС. 240), клетках Оацаї (АТСС СС. 213), клетках КРМІ 8226 (АТС СС 155), клетках О-937 (АТСС СР 1593), клетках меланомь! Боуеса (АТОС
СВ. 9607), подлиний 2К4 клеток УУ1-38МА13 (АТС СІ. 75.1), клетках МОЇ! Т-4 (АТС СВ 1582) и раз- нообразньїх гетерогибридомньїх клетках) для целей получения ПОН для общепринятой фармацевтической доставки.
п. Активация гена ЕРО человека и вьіделение получивших нацеленнье конструкции ДНК первичньх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластов человека при помощи системь! позитивного или комбини- рованного позитивного/негативного отбора.
Стратегия конструирования плазмид р'ЕРО-тМТЕ, ру'ЕРО-тМТЗ5 и их производньх с дополнитель- ньім фрагментом Ватн!1-Ніпа 111 6 т.п.н. против хода транскрипции может иметь дополнительную стадию встраивания гена пео рядом с промотором тМтТ. Кроме того, негативньійй селектируемьй маркер, например, орі
Їиз РМ5О (РПпаптасіа) или другого подходящего источника| может бьіть встроен рядом с НОМЕРКРА последова- тельностями в рВішезсгірі 115К/-полилинкере. В первом случае 5418'-колонии вьіделяют и скринируют с применением ПЦР-амплификации или рестрикционного и гибридизационного анализа по Саузерну ДНК, полученной из пулов колоний, для идентификации получивших нацеленньюе конструкции колоний. В пос- леднем случає 5418"-колоний помещают в среду, содержащую б6-тиоксантин, для отбора против интегра- ции гена орі (негативньй отбор) (Везпагой, С., еї аї!., Мої. СеїІ Вісі. 7:4139-4141 (1989)). Кроме того, ген НБМ-
ТК может бьіть помещен на противоположной стороне зтой инсерции в виде дрі, что позволяет проводить отбор на пео и против как орі, так и ТК растущими клетками в среде для фибробластов человека, содержа- щей 400 мкг/мл 5418, 100 мкМ 6б-тиоксантин и 25 мкг/мл ганцикловира. Двойной негативньій отбор обеспе- чиваєт почти абсолютньй отбор на истиннье собьтия нацеливания, а блоттинг по Саузерну обеспечиваєет окончательное подтверждение.
Описанньє здесь схемь! нацеливания для гомологичной рекомбинации могут бьіть также использова- нь! для активации зкспрессиий ПЕРО в иммортализованньїх клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТС СС 121), клетках Неїа и производньйх клеток Неїа (АТСС СС 2, 21 и 2,2), клетках рака молочной железь! МСЕ-7 (АТС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС СС. 232), клетках карциномь! КВ (АТС СС. 17), клетках рака яичника 2780-А0О (Мап аег Віїск, А.М. еї.аІ., Сапсег Вез. 48: 5927-5932 (1988), клетках Каїі (АТСС СС 86), клетках Уигкаї (АТОС Т18 152), клетках Матама (АТС СЕ. 1432), клетках НІ-60 (АТС СО. 240), клетках Бацаї (АТОС СС. 213), клетках ЕРМІ 8226 (АТС СС. 155), клетках О-937 (АТОС СВІ 1593), клетках меланомь! Воуез (АТОС СІ 9607), подлиний 2К4 М/1-38МА13 (АТСС СІ 75.1), клетках МОЇ Т--4 (АТСС СІ 1582) и разнообразньїх гетерогибридомньїх клетках для целей получения ПЕРО для общеприня- той фармацевтической доставки. і. Конструирование направляющих (нацеливающих) плазмид для помещения гена гормона роста че- ловека под контроль мьішиного промотора металлотионеина в первичньх, вторичньїх или иммортализо- ванньїх фибробластах человека.
Следующий пример служит для иллюстрации одного варианта данного изобретения, в котором обьч- нье регуляторньєе последовательности против хода транскрипции от гена гормона роста человека в пер- вичньїхх, вторичньїх или иммортализованньїх фибробластах человека.
Направляющие молекуль), похожие на описаннье в примере 1ї, для нацеливания на регуляторньй район гена ЕРО получают с применением клонированньїх фрагментов ДНК, полученньмх из 5-конца гена М гормона роста человека. Фрагмент с длиной приблизительно 1,8 т.п.н., охватьівающий положения нуклео- тидов НИОМОНСЗА (Сепрапк Епігу) 3787-5432 (положения двух сайтов ЕсоК1, которне образуют фрагмент удобного размера для клонирования или диагностического расщепления включающих в себя зтот фраг- мент субклонов), амплифицируют при помощи праймеров ПЦР, сконструированньїх согласно анализу пос- ледовательности НИМОНСЗА в зтом районе. Зтот район простирается от серединь интрона 1 гена МИСН до положения против хода транскрипции приблизительно 1,4 т.п.н. 5 по отношению к сайту старта трансля- ции. рИиС12 расщепляют ЕсоК1 и Ватні, обрабатьвшвают с фрагментом Кленова для образования тупьх концов и повторно замькают в кольцо при разбавленньїх условиях, получая плазмидь, которне потеряли сайть! Есок1 и Ватні. Такая плазмида названа рОосС12ХЕВ. Ніпа 111--линкерьї лигируют на амплифициро- ванньій фрагмент ПОН и полученньйй фрагмент расщепляют Ніпа 111 и, лигируют с расщепленной Ніпа 111 плазмидой рОС12ХЕВ. Полученную плазмиду, РОС12ХЕВ-5пОН, расщепляют ЕсоКк1 и Ватні для удале- ния фрагмента 0,5 т.п.н., лежащего непосредственно против хода транскрипции от инициирующего сайта транскрипции ПОН. Расщепленную ДНК лигируют с фрагментом ЕсоН1-Ва111, 1,8 т.п.н. из гена тМТ-1 Іне содержащего кодирующих тМтТ последовательностей; Натег, О.Н., апа Умаїїпо, М., У. Мої. Аррі. сбеп. 1:273-288 (1982); зтот фрагмент можно также вьіделить известньіми способами из мьішиной геномной ДНК с применением ПЦР-праймеров, сконструированньїх на оснований анализа последовательностей тМТ, доступньїх из сепрапк те. МОЗМТІ, МОЗМТІР, МОЗМТІРЕМІ. Ота плазмида ро" пОнН-т/МТ имеет промотор тМтТ, фланкированньй на обеих сторонах расположенньіми против хода транскрипции последовательнос- тями ПОН.
Описаннье здесь стратегиий клонирования позволяют модифицировать іп міо последовательности против хода транскрипции от ПОН для последующей направленной трансфекции первичньх, вторичньмх или иммортализованньїх фибробластов человека. Зта стратегия описала простое встрайвание промотора тТМТ. Могут бьіть рассмотрень! другие стратегии, например, в которьїх знхансер с широкой специфичност- ью клеток-хозяев встрайвают против хода транскрипции от встроенной последовательности тмт. )Активация гена ПОН человека и вьіделение получивших нацеленнье конструкции ДНК первичньх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластов человека при помощи скрининга.
Для нацеливания, плазмидь разрезают рестриктазами, которне освобождают инсерцию от плазмид- ного каркаса. В случає плазмидь ро" пн-пт МТ расщепление Ніпа 111 вьісвобождает наделивающий фраг- мент 2,9 т.п.н., состоящий из промотора тмтТ 1,8 т.п.н., рланкированного на 5'- и 3'-сторонах ДНК, предназ- наченной для направления зтой конструкции к регуляторному району гена ПОН. Зту ДНК или только наце- ливающий фрагмент 2,9 т.п.н. очищают фенольной зкстракцией и осаждением зтанолом и трансфицируют в первичнье или вторичнье фибробласть! человека при условиях, описанньїх в примере 1. Трансфициро-
ванньсе клетки вниісевают на чашки с диаметром 150 мм в питательную среду для фибробластов человека.
Через 48 часов клетки вьісевают в 24-луночнье чашки при плотности 10000 клеток/см? (приблизительно 20000 клеток на лунку; если нацеливание происходит при скорости 1 собьтие на 1092 клонируемьх клеток (пример 1 с), то нужно анализировать приблизительно 50 лунок для вьіделения одной зкспрессирующей колониийи)|. Клетки, в которьіх трансфицирующая ДНК направлялась к гомологичному району против хода транскрипции от ПОН, будут зкспрессировать ПОН под контролем промотора тМТт. После 20 дней все лу- ночнье супернатанть! анализировали на зкспрессию ПОН с использованием коммерчески доступного набо- ра для иммунотеста (Міспої!5). Клоньї из лунок, обнаруживающих синтез ПОН, вьіделяют известньі!ми спосо- бами, обьічно тестированием фракций гетерогенньїх популяций клеток, распределенньх в отдельнье лун- ки или планшеть, анализом зтих позитивньх лунок и повторением зтого, если необходимо, и в конце кон- цов вьіделяют колонии, получившие нацеленнье конструкции ДНК, посредством скрининга 96-луночньмх микротитрационньїх планшетов, засеянньїх по одной клетке на лунку. ДНК из полньїх лизатов планшетов можно также анализировать при помощи ПЦР для амплификации фрагмента с использованием тмМтТ-спе- цифического праймера вместе с праймером, лежащим по ходу транскрипции от положения 5432
НОМОНОЗА. Зта пара праймеров должна амплифицировать фрагмент ДНК с размером, точно предсказан- ньім на основе последовательности ДНК. Позитивнье чашки трипсинизировали и повторно засевали при последовательно снижающихся разведениях, и получение ДНК и стадии ПЦР повторяли, если необходи- мо, для вниіделения получивших нацеленную конструкцию ДНК клеток.
Схемь! нацеливания, описаннье здесь, можно также использовать для активации зкспрессии ПОН в иммортализованньх клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС СС. 121), клетках Неїа и произ- водньїх клеток Неї а (АТСС СС 2, 2.1 и 2.2), клетках рака молочной железьї МСЕ-7 (АТСС НВТ 22), клет- ках лейкоза К-562 (АТС СС 232), клетках карциномь! КВ (АТС СС. 17), клетках рака яичника 2780А0 (Мап аег ВіїсК, А.М. єї.аІ., Сапсег Вев. 48: 5927-5932 (1988), клетках Каїї (АТСС СС 86), клетках Уигкаї (АТСС Т18 152), клетках Матама (АТСС СК. 1432), клетках НІ-60 (АТСС СС. 240), клетках Оацаї (АТоС
СС 213), клетках КРМІ 8226 (АТСС СС 155), клетках 0О-937 (АТСС СК. 1593), клетках меланомь! Вожев (АТСС СІ 9607), подлиний 2К4 клеток М/1-38МА13 (АТС СІ. 75.2), клетках МО! Т-4 (АТС СВІ 1582) и разнообразньх гетерогибридомньїх клетках) для целей получения ПОН для общепринятой фармацевтичес- кой доставки.
К. Активация гена ПОН человека и вьіделение получивших нацеленнье конструкции ДНК первичньїх, вторичньїх и иммортализованньїх фибробластов человека при помощи системь! позитивного или комбини- рованного позитивного/негативного отбора.
Стратегия конструирования плазмидьі ро"понН-тМТт может иметь дополнительную стадию встрайива- ния гена пео рядом с промотором тМТ. Кроме того, маркер негативного отбора, например, адаруЦиз рмбО (Рпагтасіа) или другого подходящего источника|, может бьіть встроен рядом с НИМОНСЗА последователь- ностями в рОС12 полилинкер. В первом случае 5418'"-колонии вьіделяют и скринируют при помощи ПЦР- амплификации или рестрикционного и гибридизационного анализа по Саузерну ДНК, полученной из пулов колоний для идентификации получивших нацеленнье конструкции колоний. В последнем случає 5418'-ко- лонии помещают в среду, содержащую тиоксантин, для отбора против интеграции гена орі (негативньй от- бор) |Везпага, С., еї аї., Мої. Сеї! Вісі. 7:4139-4141 (1989)). Кроме того, ген НЗУ-ТК может бьіть помещен на противоположной стороне инсерции в виде орі, что позволяет проводить отбор на пео и против как орі, так и ТК растущими клетками в питательной среде для фибробластов человека, содержащей 400 мкг/мл 5418, 100 мкМ б-тиоксантин и 25 мкг/мл ганцикловира. Двойной негативньійй отбор должен обеспечивать почти абсолютньй отбор на правильньсе собьтия нацеливания. Гибридизационньїй анализ по Саузерну является подтверждающим.
Описаннье здесь схемь! нацеливания могут бьть использованьі также для активации зкспрессий
ПОН в иммортализованньх клетках человека (например, клетках НТ1080 (АТСС СС. 121), клетках Нега и производньїх клеток Неї а (АТСС СС 2, 2.1 и 2.2), клетка рака молочной железьї МСЕ-7 (АТСС НВТ 22), клетках лейкоза К-562 (АТСС СС 232), клетках карциномьї КВ (АТСС СС 17), клетках рака яичника 2780А0 (Мап дег Віїск, А.М. еї.аІ., Сапсег Нев. 48: 5927-5932 (1988), клетках Каїі (АТСС СС 86), клетках
Уигкаї (АТОСС Т18 152), клетках Матама (АТСС СВ. 1432), клетках НІ--60 (АТСС СС. 240), клетках Бацаї (АТС СС 213), клетках КРМІ 8226 (АТСС СС 155), клетках О-937 (АТС СК. 1593), клетках меланомь!
Вожез (АТСС СВІ 9607), клетках сублиниий 2К4 УУ1-38МА13 (АТСС СІ. 75.1), клетках МО! Т-4 (АТСС СВІ 1582) и разнообразньїх гетерогибридомньїх клетках) для целей получения ПН для общепринятой фарма- цевтической доставки.
Направляющие конструкции, описанньсе в примерах 11 и 1і и использованнье в примерах 19, 1п, Ті и 1), могут бить модифицировань!ї для включения в них амплифицируемого селектируемого маркера (напри- мер, ада, апітг или САбБ), которьій применим для отбора клеток, в которьіх амплифицируются активирован- ньій зндогенньй ген и амплифицируемьй селектируемьй маркер. Такие клетки, зкспрессирующие или спо- собнье зкспрессировать зндогенньій ген, кодирующий терапевтический продукт можно использовать для получения белков (например, ПОН и ПЕРО) для общепринятой фармацевтической доставки или для генной терапии.
І. Трансфекция первичньїх и вторичньїх фибробластов зкзогенной ДНК и селектируемь/!м маркерньм ге- ном посредством злектропорации.
Зкспоненциально растущие фибробласть! или фибробласть! ранней стационарной фазь! трипсини- зируют и споласкивают (смьівают) с пластиковой поверхности питательной средой.
Аликвоту зтой клеточной суспензии берут для счета, а остальнье клетки подвергают центрифугиро- ванию. Супернатант отсасьвают и осадок ресуспендируют в 5 мл буфера для злектропорации (20 мМ
НЕРЕЗ рН 7,3, 137 мМ Масі, 5 мм КСІ, 0,7 мМ МагНРО», 6 мМ декстроза). Зти клетки повторно центрифуги- руют, супернатант отсасьвают и клетки ресуспендируют в буфере для злектропорации, содержащем 1 мг/мл ацетилированного бьчьего сьвороточного альбумина. Конечная клеточная суспензия содержит приблизительно З х 10 не клеток/мл. Злектропорация должна проводиться сразу после ресуспендирования.
Суперспирализованную плазмидную ДНК добавляют в стерильную кювету с интервалом между злектродами 0,4 см (Віо-Каай). Конечная концентрация ДНК обьічно по меньшей мере 120 мкг/мл. Затем в кювету добавляют 0,5 мл клеточной суспензии (содержащей приблизительно 1,5 х 1092 клеток) и клеточную суспензию и растворь ДНК осторожно перемешивают. Злектропорацию проводят в устройстве бепе-
Риїзег (Віо-Кай). Емкость и напряжение устанавливают на 960 мкф и 250-300 В, соответственно. По мере увеличения напряжения вьіживание клеток уменьшается, но процент вьіживших клеток, которне стабильно включают введенную ДНК в их геном, сильно увеличиваєтся. С учетом зтих параметров, должен наблю- даться период импульсов 14-20 мСек.
Подвергнутье злектропорации клетки поддерживают при комнатной температуре в течение прибли- зительно 5 минут и затем содержимое кюветь! осторожно удаляют стерильной пипеткой. Клетки добавляют непосредственно к 10 мл предварительно нагретой питательной средь! (с 1595 телячьей сьівороткой, как указа- но вьіше) в чашку с диаметром 10 см и инкубируют, как описано вьіше. На следующий день среду отсасьввают и заменяют 10 мл свежей средьі и инкубируют еще 16-24 часа. Субкультивирование клеток для определения зффективности клонирования и для отбора устойчивьїх с 5418 колоний вьіполняют на следующий день. Клетки трипсинизируют, считьввают и вьісеивают; обьічно фибробласть! вьісевают при 103 клеток/10 см-чашку для опре- деления зффективности клонирования и при 1--2 х 107 клеток на 10 см-чашку для 5418-отбора.
Фибробластьі человека отбирают на устойчивость к 5418 в среде, состоящей из 300-400 мкг/мл 6418 (Сепеїсіп, соль дисульфат, приблизительно 5095 раствор; бірсо) в питательной среде для фиброб- ластов (с 1595 телячьей сьівороткой). Зффективность клонирования определяют в отсутствие 5418. По- сеянньюе клетки инкубируют в течение 12-14 дней, затем колоний фиксируют формалином, окрашивают кристаллическим фиолетовьї!м красителем и считьіївают (для посеянной зффективности клонирования) или вьіделяют при помощи клонирующих цилиндров (для чашек с 5418). Злектропорацию и отбор фибробластов кролика вьіполняют в основном, как описано для фибробластов человека, за исключением того, что исполь- зуют другие условия отбора. Кроличьи фибробласть! отбирают на устойчивость к 5418 в среде, содержащей 1 г/мл 5418.
Фибробласть! вьіделяют из свежесрезанной крайней плоти человека. Культурь! засевают при 50000 клеток/см в среде ОМЕМ х 1095 телячья сьіворотка. Когда культурь! становятся конфлюзнтньіми, фиброб- ласть! собирают трипсинизацией и трансфицируют посредством злектропорации. Условия злектропорации оценивали с использованием трансфекции плазмидой рсОМЕО (Рис. 5). Характерньій зксперимент по злектропорации с использованием приблизительно оптимальньх условий (60 мкг плазмидьі рес ОМЕО при напряжений злектропорации 250 В и емкости, установленной на 960 мкф) приводил к одной 5418'-колоний на 588 обработанньх клеток (0,17905 от всех обработанньх клеток) или 1 5418'-колоний на 71 клонируемую клетку (1,495).
При проведений 9 отдельньїх злектропораций при близких к оптимальнь!м условиям (60 мкг плазми- дьі РСОМЕО при напряжений при злектропорации 300 В и установке емкости при 960 мкф) наблюдали в среднем одну 5418'-колонию на 1899 обработанньїх клеток (0,0595) с диапазоном 1/882 - 1/7500 обрабо- танньїх клеток. Зто соответствует в среднем одной 5418'-колониий на 38 клонируемьїх клеток (2,690).
Первичнье фибробласть! человека с низким числом пассажей превращали в зкспрессирующие ПОН клетки котрансфекцией с плазмидами рсОМЕО и рхон»5. В типичном случає 60 мкг зквимолярной смеси двух плазмид трансфицировали при близких к оптимальньїм условиях (злектропорация при напряжений 300 В и емкости 960 мкФ). Результать! такого зксперимента дали одну 5418-колонию на 14705 обработанньх клеток.
Данньсе по зкспрессии ПЗН для зтих и других клеток, виіделенньїх при идентичньїх условиях транс- фекции, суммировань ниже. В конечном счете, 9895 всех (з418-колоний можно бьіло размножать для обра- зования массовой культурь.
Число анализи- рованньїх 5418"-клонов 154
Число з418'/зкспрес- сирующих П5Н клонов 65
Средний уровень зкспрессии ПОН 2,3 мкг пОН/105 клеток/24ч
Максимальньй уровень зкспрессии ПОН 23,0 мкг пОН/105 клеток/24 ч
Стабильнье трансфектьї можно бьло получить также злектропорацией первичньїх или вторичньх фибробластов человека с рхХоНЗО1, конструкцией ДНК, в которой геньї пео и ПОН присутствуют на одной и той же плазмидной молекуле. Плазмиду рХОНЗО1 конструировали двухступенчатой процедурой. Фрагмент
Зап-Сіа! из рВК322 (положения 23-651 в рвВ322) вьіделяли и встрайвали в расщепленную За!11-Спа1 плазмиду рРСОМЕО, вводя сайт Ватні против хода транскрипции от района раннего промотора 5МУ40 рРСОМЕО. Зту плазмиду РВМЕО расщепляли Ватні! и фрагмент 2,1 т.п.н., содержащий ген пео под контро- лем раннего промотора 5М40, вьіделяли и встраийвали в расщепленную Ватні! рхоОнН5. Вьіделяли плазми- ду с одной вставкой фрагмента 2,1 т.п.н., Ватні, в которой пео и ПОН транскрибируются в одном и том же направлений по отношению друг к другу. Зта плазмида бьла названа рхоОнНзЗоОї. Например,
1,5 х 105 клеток подвергали злектропорации с 60 мкг рХОНЗОї1 при 300 В и 960 мкФ. С418'-колоний вьіделя- ли из трансфицированньх вторичньїх фибробластов при частоте 652 5418'-колоний на 1,5 х 1092 обработан- ньїх клеток (1 на 2299 обработанньх клеток). Приблизительно 5995 зтих колоний зкспрессируют ПОН.
Пример 2. Конструирование нацеливающих плазмид, приводящих к образованию химерньх транск- рипционньх единиц, в которьїх слить! последовательности ДНК гормона роста человека и зритропозтина.
Дальнейшее описание служит для иллюстрации двух следующих вариантов данного изобретения, в которьїх обьічньіе регуляторньєе последовательности против хода транскрипции от гена ЕРО человека из- меняют для обеспечения зкспрессии ПЕРО в первичньїх или вторичньїх штаммах фибробластов, которье обьічно не зкспрессируют ПЕРО в детектируемьїх количествах в их нетрансфицированном состоянии. В зтих вариантах продукть! собьітий нацеливания представляют собой химернье транскрипционнье едини- ць, в которьїхх первьїй зкзон гена гормона роста человека расположен против хода транскрипции зкзонов 2-
ПЕРО. Продукт транскрипции, сплайсинга и трансляции является белком, в котором аминокислоть! 1-4 сигнального пептида ПЕРО замененьї аминокислотньіми остатками 1-3 ПОН. Зти два варианта отличаются в отношений обоих относительньїх положений чужеродньїх регуляторньїх последовательностей, которье встроень, и в отношений специфического характера сплайсинга, которьіїй должен иметь место для получе- ния конечного процессированного транскрипта.
Плазмида РрХЕРО-10 сконструирована для замень зкзона 1 ПЕРО зкзоном 1 ПОН посредством генно- го нацеливания на зндогенньій ген ПЕРО на хромосоме 7 человека. Плазмиду РХЕРО-10 конструируют следующим образом. Сначала конструируют промежуточную плазмиду рТт163 встрайванием фрагмента 6 т.п.н. Ніпа111-Ватні (см. Пример 17), лежащего против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, в расщепленную Ніпа111-ВатнН!1 плазмиду рВіпезсприн155К-- (5ігагїадепе, Га удоїа, СА). Продукт зтого лиги- рования расщепляют ХПО1 и Ніпа111 и лигируют с фрагментом 1,1 т.п.н. Ніпа1!11-Хпої1 из рРМСТпео РоїуА (Ппотаз К.В. апа Саресспі, М.В. СеїІ 51:503-512 (1987)), доступной из бігаїадепе, Іа доїа, САЇ, для созда- ния ртТ163. Олигонуклеотидь! 13.1-13.4 используют в полимеразньх цепньїх реакциях для образования слитого фрагмента, в котором последовательности мьішиного промотора металлотионеина 1 (тМТ-1) - зкзона 1 ПОН дополнительно слить! с последовательностями интрона 1 ПЕРО. Сначала олигонуклеотидь! 13.1 и 13.3 используют для амплификации фрагмента промотор приблизительно 0,73 т.п.н тМТ - зкзон 1
ПОН из рхХоОн5 (Рис. 5). Затем олигонуклеотидьі! 13.2 и 13.4 используют для амплификации фрагмента приблизительно 0,57 т.п.н., содержащего преймущественно интрон ПЕРО из геномной ДНК человека. На- конец, зти два амплифицированньїх фрагмента смешивают и амплифицируют далее с олигонуклеотидами 13.1 и 13.4 для образования конечного слитого фрагмента (слитого фрагмента 3), фланкированного сайтом за на 5'-стороне тмт-1-части и сайта-Хпо1 на 3'-стороне последовательности интрона 1 ПЕРО. Слитьй фрагмент З расщепляют Хпо1 и за!/1 лигируют с расщепленной Хпої1 плазмидой рТ163. Смесь для лигиро- вания трансформируют в Е.соїї и клон, содержащий одну инсерцию слитого фрагмента 3, в котором сайт
Хпо1 регенерирован на 3'-стороне последовательностей интрона 1 ПЕРО, идентифицируют и обозначают как РХЕРО-10. 183.1 БтттатсадС астТАССТТ ТТТТААААС С занї Крп1 (ЗЕО ІО Ме 5) 13.2 БоСстТАааСОасаСА АТИССТАСАаС аталдатТАСТо сСсосаОаСстаса Са (5ЕО ПО Ме 6) 13.3 БсеассСАсоСо асраАатТАСТО АССТаТтАОаСС АТТаССОСтТА СС (ЗЕО ІЮ Ме 7) 13.4 5Б' ТІСТО! СТАСААСАСА ТАОССАСОаСТ с
Хпо!1 (ЗЕО ІО Мо 8)
Не вьіделенньій жирньіми буквами район олигонуклеотида 13.1 идентичен промотору тмМТ-1, с при- родньїм сайтом Крпі1 в виде его 5-границьі. Жирньсе буквь! обозначают конец сайта За!1 для превращения 5-границь в сайт За!1. Жирньй район олигонуклеотидов 13.2 и 13.3 обозначает последовательности П5Н, тогда как нежирнье районь! представляют собой последовательности интрона 1 из гена ПЕРО. Нежирньй район нуклеотида 13.4 идентичен последним 25 основаниям интрона 1 ПЕРО. Жирньй район включаєт в себя конец сайта ХПО1 для превращения 3'-границьї амплифицированного фрагмента в сайт Хпо1.
Плазмида рХЕРО"''! сконструирована для помещения, генньім нацеливанием, промотора тмт-1 и зкзона 1 ПОН против хода транскрипции от структурного гена ПЕРО и промоторного района при зндогенном локусе ПЕРО на хромосоме 7 человека. Плазмиду РХЕРО-11 конструируют следующим образом. Олиго- нуклеотидь! 13.1 и 13.5 - 13.7 используют в полимеразньїх цепньїх реакциях для образования слитого фрагмента, в котором последовательности промотора мьішиного металлотионеина 1 (тМТ-1) - зкзона 1
ПОН дополнительно слить! с последовательностями ПЕРО от -1 до -630 по отношению к кодирующему ра- йону ПЕРО. Сначала олигонуклеотидьі 13.1 и 13.6 используют для амплификации фрагмента промотор тМт-1 приблизительно 0,75 т.п.н - зкзон 1 ПОН из рХОнН5 (Рис.5). Затем олигонуклеотидь! 13.5 и 13.7 ис- пользуют для амплификации, из геномной ДНК человека, фрагмента приблизительно 0,65 т.п.н., состояще- го преимущественно из последовательностей ПЕРО от -1 до -630 по отношению к кодирующему району
ПЕРО. Оба олигонуклеотида 13.5 и 13.6 содержат линкерную последовательность 10, п.н., расположенную при районе интрон 1 ПОН - промотор ПЕРО, которьй соответствует донорному сайту сплайсинга. Наконец, зти два амплифицированньїх фрагмента смешивают и амплифицируют далее с олигонуклеотидами 13.1 и
13.7 для образования конечного слитого фрагмента (слитого фрагмента 6), фланкированного сайтом за!1 при 5'-стороне тМтТ-1-части и сайтом Хпо1 при 3-стороне района промотора ПЕРО. Слитьій фрагмент 6 расщепляют Хпої и зЗа!1!ї и лигируют с расщепленной Хпої плазмидой рТт163. Смесь для лигирования трансформируют в Е.соїї и клон, содержащий одну инсерцию слитого фрагмента 6, в которой сайт Хпо1 ре- генерирован при 3'-стороне последовательностей промотора ПЕРО, идентифицируют и обозначают как рРХЕРО-11. 13.5 5 САСАССТСАС СТАаСОасСАА ТИССТАСАСО ТОАСТАСТО
ААХдасттотас асттсСАаАС ССАС (5ЕО ІЮ МО 9)
Ніпа 111 13.6 5 стасатотТОаай ААДОСССАСАА ССТТОАСТАС ТСАССТатАса
Ніпа 111
ССАТТОССОС ТАСОатадаст ато (5ЕО Ю МО 10) 13.7 5 тттстсада стосе7сесст васссавато сто
Хпо1 (5ЕОО МО 11)
Районь с жирньіми буквами олигонуклеотидов 13.5 и 13,6 обозначают последовательности ПОН. Ра- йоньї с буквами курсивом соответствуют первьїм 10 п.н. интрона 1 ПЕРО. Остальная часть зтих олигонук- леотидов соответствует последовательностям ПЕРО от -620 до -597 по отношению к кодирующему району
ПЕРО. Нежирньй район олигонуклеотида 13.7 идентичен основаниям -1 - -24 по отношению к кодирующе- му району ПЕРО. Район с жирньіми буквами включаеєет в себя конец сайта Хпо1 для превращения 3'-грани- цьї амплифицированного фрагмента в сайт Хпо1.
Плазмиду РХЕРО-10 можно использовать для генного нацеливания расщеплением Ват! и Хпої1 для вьісвобождения фрагмента 7,3 т.п.н., содержащего слитьій фрагмент тм'тТ-1/пОН, фланкированньй на обейих сторонах последовательностями ПЕРО. Зтот фрагмент (нацеливающий фрагмент 1) не содержит ко- дирующих последовательностей ПЕРО, имея только последовательности, лежащие между -620 и прибли- зительно -6620 против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, и последовательности интрона 1
ПЕРО для регуляции нацеливания на локусе ЕРО человека. Нацеливающий фрагмент 1 трансфицируют в первичнье или вторичнье фибробласть! кожи человека при условиях, сходньїх с описанньми в Примере 1с. Устойчивье к 5418 колонийи вьіскребают в отдельнье лунки 96-луночньіїх микротитрационньїх планше- тов и скринируют на зкспрессию ЕРО при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ЕГІЗА) (КО Бузіет5, Міппеароїїз ММ). Клетки, в которьїх трансфицированная ДНК интегрируется произвольно в геном человека, не могут продуцировать ЕРО. Клетки, в которьїх трансфицированная ДНК подверглась го- мологичной рекомбинации с интроном 1 зндогенного ПЕРО и последовательностями ПЕРО против хода транскрипции, содержат химерньй ген, в котором последовательности промотора тмт-1 и нетранскриби- руемье последовательности и 5'-нсетранслируемье последовательности ПОН и зкзон 1 ПОН заменяют обьічньій промотор ПЕРО и зкзон 1 ПЕРО (см. фиг. 1). Последовательности, не относящиеся к ПЕРО, в на- целивающем фрагменте 1 соединеньі! с последовательностями ПЕРО по ходу транскрипции интрона 1
ПЕРО. Замена нормального регуляторного района ПЕРО промотором тмт-1 будет активировать ген ЕРО в фибробластах, которье обьічно не зкспрессируют ПЕРО. Замена зкзона 1ПЕРО зкзоном 1 ПОН приводит к образованию белка, в котором первье 4 аминокислоть! сигнального пептида ПЕРО замененьї аминокисло- тами 1-3 ПОН, что создаєт функциональньй химерньй сигнальньй пептид, которьйй удаляется посттранс- ляционнь!м процессингом из зрелого белка и секретируется из зкспрессирующих клеток.
Плазмиду РХЕРО-11 можно использовать для генного нацеливания расщеплением Ватні! и Хпо1 для вьісвобождения фрагмента 7,4 т.п.н., содержащего слияние тмтТ-1/пОН, фланкированное на обеих сторонах последовательностями ПЕРО. Зтот фрагмент (нацеливающий фрагмент 2) не содержит кодирую- щих последовательностей ПЕРО, имея только последовательности, лежащие между -1 и приблизительно - 6620 против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, для управления нацеливанием на локус
ЕРО человека. Нацеливающий Фрагмент 2 трансфицируют в первичнье или вторичнье фибробласть! кожи человека при условиях, сходньїх с описанньіми в Примере 19. Устойчивье к 5418 колониий помещают в от- дельнье лунки 96-луночньїх планшетов и скринируют на зкспрессию ЕРО при помощи твердофазного им- муноферментного анализа (ЕГІЗА) (КО Зузіет5, Міппеароїї5, ММ). Клетки, в которьїх трансфицирующая
ДНК интегрируется в геном человека произвольно, не могут продуцировать ЕРО. Клетки, в которьх транс- фицирующая ДНК подверглась гомологичной рекомбинации с зндогенньім промотором ПЕРО и последова- тельности против хода транскрипции, содержат химерньй ген, в котором промотор тМт-1 и нетранскриби- руемье последовательности, 5--нетранслируемье последовательности ПОН и зкзон 1 ПОН и линкер из 10 п.н., состоящий из первьїх 10 оснований интрона 1ПЕРО, встроень при сайте Ніпа111, лежащем при поло- жений -620 по отношению к кодирующему району ПЕРО (см. фиг. 2). Локализация промотора тмт-1 про- тив хода транскрипции от обьічно молчащего промотора ПЕРО будет управлять синтезом, в первичньх или вторичньїх фибробластах кожи человека, мРНК, считьівая (5' -» 3) нетранслируемье последовательности металлотионеина и ПОН, зкзон 1 ПОН, 10 оснований ДНК, идентичньїх первьім 10 основаниям интрона 1
ПЕРО, и обьічньйй промотор ПЕРО и зкзон 1 ПЕРО (-620 - 413 по отношению к кодирующей последователь- ности ПЕРО). Линкерная последовательность из 10 п.н. из интрона 1 ПЕРО действует как донорньй сайт сплайсинга для слияния зкзона 1 ПОН со следующим по ходу транскрипции акцепторньїм сайтом сплайсин- га, которьій лежит непосредственно против хода транскрипции от зкзона 2 ПЕРО. Процессинг образующе- гося транскрипта будет, следовательно, сплайсировать промотор ПЕРО, зкзон 1 и последовательности инт-
рона 1. Замена зкзона 1пПЕРО зкзоном 1 ПОН приводит к образованию белка, в котором первье 4 амино- кислоть! сигнального пептида ПЕРО замененьї аминокислотами 1-3 ПОН, что создает функциональньй, хи- мерньйй сигнальньй пептид, которьій удаляется пост-трансляционньмм процессингом из зрелого белка и секретируется из зкспрессирующих клеток.
Ряд конструкций, относящихся к РХЕРО-10 и РХЕРО-11, можно сконструировать при помощи извест- ньІх способов. В зтих конструкциях относительнье положения промотора тм'--ї1 и последовательностей
ПОН, а также положение, при котором последовательности тМтТ-1/1ОН встраийвают в последовательности против хода транскрипции ПЕРО, вариируют для создания других химерньїх транскрипционньїхх единиц, ко- торье облегчают генное нацеливание, приводят к более зффективной зкспрессии слитьїх транскриптов или имеют другие желаемье свойства. Такие конструкции будут давать сходнье результатиь, так что сли- тьій ген ПБН-ЕРО помещают под контроль зкзогенного промотора генньім нацеливанием на нормальньй локус ПЕРО. Например, фрагмент Ніпа 111 - Ватні 6 т.п.н. (см. Пример 17) против хода транскрипции гена
ПЕРО имеет многочисленнье последовательности узнавания рестриктаз, которне могут использоваться как сайть! встраивания гена пео и слитого фрагмента промотор тМТ-1/пОН. Один такой сайт, Вді11, лежа- щий приблизительно 1,3 т.п.н. по ходу транскрипции от сайта Ніпа 111, является единственньїм в зтом ра- йоне и может бьіть использован для встрайвания одного или более селектируемьх маркеров и регулятор- ного района, происходящего из другого гена, которьій будет служить для активации зкспрессии ПЕРО в первичньх, вторичньїх или иммортализованньмх клетках человека.
Сначала конструируют промежуточную плазмиду р/164 встрайванием фрагмента Ніпа111-Ватн!і 6 т.п.н. (Пример 17), лежащего против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, в расщепленную
Ніпат!11-Ватн!1 плазмиду рВіпезспірнН 15К.- (5ігагадепе, І а доа, СА). Плазмиду рМСіІпео РоЇуУА | потаз
К.А. апа Сарессні, М.А. Сеї! 51:503-512 (1987)), доступную из Бігаїадепе, а доПа, СА) расщепляют
Ватні и Хпо1, затупляют концьії при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразь Е.соїї и полученньй фрагмент 1,1 т.п.н. очищают рт164 расщепляют Вді1ї1 и затупляют концьі! с фрагментом Кленова ДНК- полимеразь Е.соїї. Зти два фрагмента с тупьіми концами лигируют вместе и трансформируют в компе- тентную Е.соїї. Клоньї с единственной инсерцией фрагмента пео 1,1 т.п.н. виіделяют и анализируют рест- рикционньїм анализом для идентификации тех клонов, в которьїх сайт ВдіІ11, воссозданньй слиянием ту- пьїх сайтов Хпої1 и Ваді11, локализован на расстояние 1,3 т.п.н. от единственного сайта Ніпа 111, при- сутствующего в плазмиде р/164. Полученную плазмиду, рТ165, можно теперь расщеплять при единст- венном сайте ВаІ11, рланкирующем 5'-сторону транскрипционной единиць пео.
Олигонуклеотидь 13.8 и 13.9 используют в полимеразньїх цепньїх реакциях для образования фраг- мента, в котором последовательности мьішиньй промотор металлотионейина 1 (тМТ-1) - зкзон ТПОН до- полнительно слить! с фрагментом 10 п.н., содержащим донорньй сайт сплайсинга. Вьібранньй донорньй сайт сплайсинга соответствует донорному сайту сплайсинга природного интрона 1ПЕРО, хотя можно использовать большее число донорньїх сайтов сплайсинга или консенсуснье донорнье сайть! сплай- синга. Олигонуклеотидь! (13.8 и 13.9у используют для амплификации фрагмента из рхоОн5 (Риб. 5) промотор тмт-1 приблизительно 0,73 т.п.н. - зкзон 1 ПОН. Амплифицированньй фрагмент (фрагмент 7) расщепляют ВадіІ117 и лигируют с расщепленной ВаІ11 плазмидой р/165. Смесь для лигирования трансформируют в Е.соїї и клон, содержащий одну инсерцию фрагмента 7, в котором сайт Крп 1 в про- моторе тМтТ-1 находится рядом с 5'-концом гена пео и промотор тмМтТ-1 ориентирован таким обра- зом, что транскрипция направляется по направлению к уникальному сайту Ніпа 111, идентифицируют и обозначают как РХЕРО--12. 13.8 5 АААААСАТСТ СОТАССТТ ТТТТТААААС САаССТасА
Ва! 11 Крп! (ЗЕО ІО Мо 12)
Район с нежирньми буквами олигонуклеотида 13.8 идентичен промотору тмМтТ-1, с природньм сайтом Крп1 в качестве его 5'-границьі. Жирнье буквьії обозначают конец сайта ВаІ11 для превраще- ния 5'-границь в сайт Ва111. 13.9 5 ТТТТАВАТСТ САСТАСТСАС СТатТАасСсСАТ ТАОССОасСтТАСа
Ва!11 (ЗЕО ІО Мо 13)
Жирньйй район олигонуклеотида 13.9 обозначаєт последовательности ПОН. Курсив соответствует первьїм 10 п.н. интрона 1пПЕРО. Подчеркнутьй сайт Ва111 добавлен для целей конструирования плазмидь!.
Плазмиду РХЕРО-12 можно использовать для генного нацеливания расщеплением Ватні и Ніпа111 для вьісвобождения фрагмента 7,9 т.п.н., содержащего ген пео, и слияния тмтТ-1/псН, фланкированное на обеих сторонах последовательностями ПЕРО. Зтот фрагмент (нацеливающий фрагмент 3) не содержит кодирующих ПЕРО последовательностей, имея только последовательности, лежащие между приблизи- тельно -620 и приблизительно -6620 против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, для регуля- ции нацеливания против хода транскрипции локуса ЕРО человека. Нацеливающий фрагмент З трансфици- руют в первичньсе, вторичнье или иммортализованнье фибробласть! кожи человека при условиях, сходньх с описанньіми в Примерах Тр и 16.
Устойчивьсе к 5418 колонии вьіскребают и помещают в отдельнье лунки 96-луночньїх планшетов и скринируют на зкспрессию ЕРО твердофазньм иммуноферментньм анализом ЕІ БА (НУО Бузієетв,
Міппеароїїх ММ). Клетки, в которьїх трансфицирующая ДНК интегрируется произвольно в геном человека, не могут продуцировать ПЕРО. Клетки, в которьїх трансфицирующая ДНК подвергалась гомологичной ре- комбинации с зндогенньмм промотором ПЕРО и последовательностями против хода транскрипции, содер- жат химерньй ген, в котором промотор тМТт-1 и нетранскрибируемье последовательности, 5'-нетрансли- руемье последовательности ПН и зкзон ТЗН и линкер 10 п.н., состоящий из первьїх 10 п.н. интрона
Т1пЕРО, встроень при сайте Ва!11, лежащем в положений приблизительно -1920 по отношению к кодирующему району ПЕРО. Локализация промотора тмт-1 против хода транскрип- ции обьічно молчащего промотора ПЕРО будет направлять в первичньх, вторичньїх или иммортализован- ньїх фибробластах человека синтез транскрипта, считьівая (5' -» 3) последовательности нетранслируемого металлотионеина и ПОН, зкзон ТЗН, 10 п.н., идентичньїх первь!м 10 п.н. интрона 1ПЕРО, и район против хода транскрипции ПЕРО и зкзон 1пПЕРО (от приблизительно -1920 до 413 по отношению к кодирующей
ЕРО последовательности). Линкерная последовательность 10 п.н. из интрона 1 ПЕРО действует как донор- ньій сайт сплайсинга для слияния зкзона 1 ПОН с расположенньїм по ходу транскрипции акцепторньїм сай- том сплайсинга, которьій лежит непосредственно слева (против хода транскрипции) от зкзона 2ПЕРО. Про- цессинг полученного транскрипта, таким образом, будет сплайсировать последовательности против хода транскрипции ПЕРО, промоторньій район, зкзон 1 и последовательности интрона 1. При использований
РХЕРО-10, -11 и -12 пост-транскрипционньій процессинг транскрипта может бьіть улучшен посредством мутагенеза іп міо для исключения акцепторньїхх сайтов сплайсинга, лежащих в последовательностях про- тив хода транскрипции ПЕРО между промотором тМТт-1 и зкзоном 1ПЕРО, которне снижают уровень про- дуктивньїх собьітий сплайсинга, необходимьїх для образования желаемого транскрипта. Замена зкзона 1
ПЕРО зкзоном 1 ПОН приводит к образованию белка, в котором первье 4 аминокислоть! сигнального пепти- да ПЕРО замененьі аминокислотами 1-3 ПОН, что приводит к образованию функционального, химерного сигнального пептида, которьй вьіделяется пост-трансляционньім процессингом из зрелого белка и секрети- руется из зкспрессирующих клеток.
Пример 3. Направленная модификация последовательностей против хода транскрипции и амплифи- кация получившего нацеленную конструкцию ДНК гена.
Клетки человека, в которьїх ген ПЕРО бьл активирован описанньіми вьіше способами, может бьть индуцирован для амплификации транскрипционной единицьї пео/тМТ-1/ЕРО, если нацеливающая плаз- мида содержит маркерньй ген, которьій придаєт устойчивость к вьісокому уровню цитотоксичного агента, посредством феномена амплификации генов. Бьіло документировано, что среди других генов селектируе- мьсе маркерньсе геньї, такие как ген дигидрофолатредуктазь (апії, селектирующий агент - метотрексат), мультифункциональньй ген САЮ І(кодирующий карбамилфосфатсинтазу, аспартаттранскарбамилазу, ди- гидрооротазу; селектирующий агент -М-(фосфоноацетил)-І -аспартат (РАГА)|, ген глутаминсинтазь (селек- тирующий агент - метионинсульфоксимин (М5Х)) и ген аденозиндезаминазь (ада; селектирующий агент - адениннуклеозид), являются амплифицируеєемьми в иммортализованньїх клеточньїх линиях человека (МУтідні, 9.А., єї аІ. Ргос. Маї). Асай. сі. ОБА 87:1791-1795 (1990); Соскеїй, М.І. еїа!., Віо/ТесппоіІоду 8:662- 667 (1990)). В зтих исследованиях бьіло документировано, что амплификация генов происходит в большом числе иммортализованньх клеточньїх линиях человека. НТ1080, Не а, клетки рака молочной железьї МСЕ-- 7, клетки лейкоза К-562, клетки карциномь! КВ или клетки рака яичника 2780А0, среди других клеток, обна- руживают амплификацию при подходящих условиях отбора.
Плазмидьї РХЕРО-10 и рХЕРО-11 могут бить модифицировань!ї встрайванием нормального или му- тантного гена апіт в уникальньсе сайть Ніпа 111 зтих плазмид. После трансфекции клеток НТІ1080 подходя- щей ДНК, отбора на устойчивость к 5418 (сообщаємую геном пео) и идентификации клеток, в которьх ген
ПЕРО бьл активирован генньім нацеливанием последовательностей пео, апії и тМт-1, зти клетки могут бьіть подвергнуть! ступенчатому отбору в метотрексате (МТХ) для отбора на амплификацию ап и ко-амп- лификацию связанньїх последовательностей пео, тМтТ-1 и последовательностей ПЕРО (Кашйтап, К.).,
Тесппідне 2: 221-236 (1990)). Используют схему ступенчатого отбора, в котором клетки сначала вьідержи- вают с низкими уровнями МТХ (0,01-0,08 мкМ) с последующим последовательньм вьідерживанием при возрастающих концентрациях МТХ до 250 мкМ или вьіше. Линейнье возрастающие стадийи 0,04-0,08 мкМ
МТХ и последующие 2-кратнье увеличения в концентрации МТХ будут зффективнь! в отборе на амплифи- цированнье трансфицированньсе клеточнье линии, хотя различнье относительно неглубокие приращения будут также зффективньми. Амплификацию наблюдают по увеличению в числе копий гена и подтверж- дают измерением зкспрессии ПЕРО іп мйго. Зтой стратегией может бьть достигнута значительная сверхокспрессия ПЕРО посредством направленной модификации последовательностей, лежащих полност- ью вне кодирующего района ПЕРО.
Конструкции, похожие на описаннье конструкции (Примерь! 17, 1П, 1, ІТК, 2 и 7), для активации зксп- рессии ПОН в клетках человека также могут бить модифицировань далее для включения гена апії с целью получения клеток, которне сверхокспрессируют ген ПОН, посредством генного нацеливания на некодирую- щие последовательности и последующей амплификации.
Пример 4. Нацеливание и активация локуса ЕРО человека в иммортализованной линии фиброблас- тов человека.
Бьіла изготовлена нацеливающая (направляющая) конструкция РХЕРО-13 для проверки гипотезь,, что зндогенньій ген ПЕРО мог бь бьіть активирован в фибробластной клетке человека. Сначала конструй- ровали плазмиду рТ22.1, содержащую геномную последовательность ПЕРО 63 п.н. против хода транскрип- ции первого кодона гена ПЕРО, слитого с мьішиньім промотором металлотионейина (тМТ-1). Олигонуклео- тидьі 22.1-22.4 использовали в ПЦР для слияния последовательностей тМтТ-1 и ПЕРО. Свойства зтих праймеров следующие: 22.1 представляет собой олигонуклеотид из 21 оснований, гомологичньій сегменту промотора тМТт-1, начинающемуся 28 п.н. против хода транскрипции от сайта Крп 1 тМмт-1; 22.2 и 22.3 являются комплементарньми праймерами из 58 нуклеотидов, которне определяют слияние последова- тельностей ПЕРО и тМТт-1 таким образом, что зто слияние содержит 28 п.н. последовательностей ПЕРО, начинающихся 35 оснований против хода транскрипции от первого кодона гена ПЕРО, и последовательнос- ти тМтТ-1, начинающиеся при оснований 29 олигонуклеотида 22.2, содержащие природньій сайт Ва!/11 тМт-1 и простирающиеся на 30 оснований в последовательность тмТ--1; 22.4 представляет собой 21 нук- леотидов в длину и является гомологичньмм последовательностям ПЕРО, начинающимся при 725 п.н. по ходу транскрипции от первого кодона гена ПЕРО. Зти праймерьї используют для амплификации фрагмен- та ДНК 1,4 т.п.н., содержащего слияние последовательностей тмТтТ-1 и ПЕРО, описанное вьіше. Получен- ньій фрагмент расцепляют Крп 1 (фрагмент ПЦР, содержащий два сайта Крп1: один природньй сайт Крп1 в районе промотора тМмТт-1 и один природньй сайт Крп1 в последовательности ПЕРО) и очищают. Плаз- миду РХЕРО!1 также расщепляли Крп1, виісвобождая фрагмент 1,4 т.п.н. и фрагмент 6,4 т.п.н. Фрагмент 6,4 т.п.н. очищали и лигировали со слитьїм фрагментом 1,4 т.п.н. Кр! ПЦР. Полученная конструкция бьла наз- вана рТ22.1. Вторую промежуточную плазмиду, рТ22.2, конструировали лигированием фрагмента Ніпа111--
Ватні 6 т.п.н., лежащего против хода транскрипции структурного гена ПЕРО (см. Пример 15) с расщеплен- ной Ватні и Ніпа 111 плазмидой рВ5115К « (5ігагадепе. Іа доПа, СА). Третью промежуточную плазмиду, рт22.3, конструировали вьрезанием сначала фрагмента Хпоії/ВатнНі 1,1 т.п.н. из рМСІМЕРроїуА (Зігаїадепе, Га доа, СА), содержащего ген неомицинфосфотрансферазьі. Затем конць! зтого фрагмента затупляли при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразь 1 (Мем Епдіапа Віоїавв).
После зтого зтот фрагмент лигировали с сайтом Ніпс 111 рВ511 5Ка- (также затупленньій ДНК-поли- меразой 1) с образованием ртТ22.3. Четвертую промежуточную плазмиду, рТ22.4, получали очисткой фраг- мента Хпо1/Ніпа 111 1,1 т.п.н., содержащего ген песо из рТ22.3, и лигированием зтого фрагмента с расщеп- ленной Хпої1 и Ніпа 111 рт22.2. Таким образом, рТ22.4 содержит ген пео рядом со стороной Ніпа 111 фраг- мента Ватні1і-Ніпа1!11 фрагмента против хода транскрипции ПЕРО. Наконец, РрХЕРО-13 получали вьіреза- нием сначала фрагмента Есок1-Асс! 2,0 т.п.н. из плазмидь! рт22.1. Сайт ЕсокК1 зтого фрагмента опреде- ляет 5-границу промотора тмт-1, тогда как сайт Асс1! зтого фрагмента лежит внутри зкзона 5 ПЕРО. Та- ким образом, фрагмент Асс1/ЕсрК1 содержит почти полную зкспрессионную единицу ПЕРО, не имея толь- ко части зкзона 5 и природного сайта полиаденилирования. Зтот фрагмент ЕсокК1/Ассі1 2,0 т.п.н. очищали, концьї затупляли обработкой фрагментом Кленова ДНК-полимеразь! 1 и лигировали с расщепленной Хпо!1, имеющей затупленньсєе конць рт22.4.
Клетки НТ1080 трансфицировали расщепленной РМО1-ВатнНі плазмидой рРХЕРО-13, рРХЕРО-13, расщепленная таким образом, образуеєет три фрагмента; векторньій фрагмент 1 т.п.н., включающий в себя ген атр; векторньій фрагмент 1,7 т.п.н. из оставшихся векторньїх последовательностей и фрагмент приб- лизительно 9 т.п.н., содержащий последовательности ПЕРО, пео и тмМТ-1. Зтот фрагмент ВатН1/Рми1 из 9 т.п.н. содержал следующие последовательности в указанном порядке от сайта Ватн!: геномную после- довательность против хода транскрипции ПЕРО приблизительно 5,2 т.п.н., транскрипционную единицу пео 1,1 т.п.н., промотор тМТ-1 0,7 т.п.н. и фрагмент 2,0 т.п.н., сосдержащий кодирующую последовательность
ПЕРО, укороченную в зкзоне 5. 45 мкг РХЕРО-13, расщепленную таким образом, использовали в злектро- порации 12 млн клеток (условия злектропорации описань! в Примере 15). Зту злектропорацию повторяли в целом 8 раз, получая злектропорацию в целом 96 млн клеток. Клетки смешивали со средой, получая плот- ность клеток 1 млн клеток на мл, и аликвоть по 1 мл распределяли в целом на 96 чашек для культивирова- ния ткани с диаметром 150 мм (РаЇсоп), причем каждая чашка содержала как минимум 35 мл средьі
ОМЕМ/1595 телячья сьіворотка. На следующий день зту среду отсасьівали и заменяли свежей средой, со- держащей 0,8 мг/мл 5418 (сірсо). После 10 дней инкубирования из сред из каждой чашки брали пробь на
ПЕРО для твердофазного иммуноферментного анализа ЕГІЗА (К8О Зувіетв).
Шесть из 96 чашек содержали по меньшей мере 10 МЕ/мл ПЕРО. Одну из зтих чашек, Мо 18, вьібрали для очистки зкспрессирующих ПЕРО колоний. Каждая из 96 чашек с диаметром 150 мм содержала прибли- зительно 600 устойчивьїх к 5418 колоний (всего 57600 устойчивьїх к 5418 колоний определено на всех 96 чашках). Приблизительно 600 колоний на чашке Мо 18 трипсинизировали и пересевали при 50 клеток на мл в 364-луночнье планшеть (еегіїїп).
После одной недели инкубирования отдельньсе колонийи бьли видимьми при приблизительно 10 ко- лониях на большую лунку 364-луночньїх планшетов (зти планшеть! состоят из 16 мальїх лунок внутри каж- дой из 24 больших лунок). Каждую лунку подвергали скринингу на зкспрессию ПЕРО в зтой точке. Две из больших лунок содержали средьі, по меньшей мере, с 20 мЕ/мл ЕРО. Лунка Мо А2 содержала 15 колоний, распределенньйх среди 16 мальїх лунок. Содержимое каждой из зтих мальх лунок трипсинизировали и пе- реносили в 16 отдельньїх лунок 96-луночного планшета, после 7 дней инкубирования из сред из каждой из зтих лунок брали пробь! для анализа ЕІ! БА на ПЕРО. Только одна лунка, лунка Мо 10, содержала ПЕРО.
Зтот клеточньій штамм бьл назван НТ165-18А2-10 и его размножали в культуре для количественного ана- лиза ПЕРО, вьіделения РНК и вьіделения ДНК. Количественное измерение продуцирования ПЕРО дало ве- личину 2500 миллиединиц на миллион клеток за 24 часа.
ДНК-зонд 0,2 т.п.н., простирающийся от сайта Асс1 в зкзоне 5ПЕРО до сайта Ва111 в 3і-нетранслируе- мом районе, использовали для зондирования РНК, вьіделенной из клеток НТ165-18А2-10. Направляющая конструкция, РХЕРО-13, укороченная при сайте Асс1і в зкзоне 5, не содержит зти последовательности
Асс1/Вад111 и, следовательно, является диагностической для нацеливания при локусе ПЕРО. Только клеточ- нье штаммь, которне рекомбинировались гомологично с природньіми последовательностями ПЕРО, про- дуцировали бьії мРНК ПЕРО, содержащую последовательность, гомологичную последовательностям
Асс1/Ва111. Бніло обнаружено, что НТ165-1842-19 зкспрессируют мРНК предсказанного размера, гибриди-
зующуюся с З2р-меченьім зондом Асс1/В9І11 ПЕРО на нозерн-блотах. Рестрикционньїйй анализ и блоттинг по Саузерну подтвердили, что ген пео и промотор тМТт-1 попали в одну из двух аллелей ПЕРО в клетках
НТ165-18А2-10.
Зти результать! демонстрируют, что гомологичную рекомбинацию можно использовать для нацели- вания и включения регуляторного района в ген, которьй в норме является молчащим в фибробластах че- ловека, что приводит к функциональной активации зтого гена. 224 5 САССТААААТ САТСТСТСТО о (5ЕО ІЮ Ме 14) 22.2 5 саса,ассооат аАССАСАССОа ас;аасссСстАс АТСТаатаАА аСТОаДаТстА
СОбБАСТАА (5ЕО ІЮ Мо 15) 22.3 5 ТТАСТОСОТА аСтТоСАСТІ САССАСАТСТАсССОСоСССа ататТаатсСАС ссассоеса (ЗЕО ІО Ме 16) 22.4 5 СТСТСАСССОСТ САТАТТСТСО о (5ЕО ІЮ Мо 17)
Пример 5. Получение не содержащих интронов генов.
Генное нацеливание можно также использовать для получения проциссированного гена, не содержа- щего интронов, для переноса в дрожжи или бактерии для зкспрессии гена и получения белка іп міо. Нап- ример, ПОН можно продуцировать в дрожжах при помощи описанного ниже подхода.
Получают две отдельнье направляющие конструкции. Направляющая конструкция 1 (ТСІ) включаєет в себя последовательность 1ТР, например, ЇТЕ из вируса мьішиной лейкемии Моіопеу (МОМІМ) маркер для отбора в клетках человека (например, ген пео из Тп5), маркер для отбора в дрожжах (например, дрож- жевой ген ОКАЗ), регуляторньїй район, способньій регулировать генную зкспрессию в дрожжах (например, промотор СА 4) и иногда (необязательно) последовательность, которая при слиянии с геном ПОН будет обеспечивать секрецию ПОН из дрожжевьїх клеток (лидерную последовательность). Зтот вектор может так- же включать в себя последовательность ДНК, которая делает возможной ретровирусную упаковку в клет- ках человека. Зта конструкция организована таким образом, что указаннье вьіше последовательности фланкировань! на обеих сторонах геномньіми последовательностями ПОН, которье при гомологичной ре- комбинации с М-последовательностями геномного гена ПОН будут интегрировать зти зкзогеннье последо- вательности в ТСІ непосредственно слева от М-кодона 1 гена ПОН (соответствующего положению амино- кислоть! 1 в зрелом, процессированном белке). Порядок последовательностей ДНК при интеграции являет- ся следующим: последовательности, против хода транскрипции ПОН и регуляторнье последовательности, ген пео, ГТК, ген ОКАЗ, промотор САГ 4, дрожжевая лидерная последовательность, последовательности
ПОН, включающие в себя аминокислоту 1 зрелого белка и по ходу транскрипциий ПОН. Нацеливающая конструкция 2 (ТС2) включает в себя последовательности, достаточнье для репликации плазмидь! в дрож- жах (например, кольцо в 2 микрона или последовательности АК5), терминирующие последовательность транскрипции дрожжей, вирусньйй ТЕ и маркерньй ген для отбора в клетках человека (например, бакте- риальньй ген дрі). Зта конструкция организована таким образом, что указаннье вьіше последовательности фланкировань! на обеих сторонах геномньіми последовательностями ПОН, которье при гомологичной ре- комбинации с М-последовательностями геномного гена ПОН будут интегрировать зкзогенньіе последова- тельности в ТС2 непосредственно по ходу транскрипции от М-стоп-кодона гена ПОН. Порядок последова- тельностей ДНК при интеграции является следующим: последовательности зкзона 5 ПОН, последователь- ности терминации транскрипции дрожжей, последовательности репликации плазмидь! в дрожжах, І ТЕ, ген дрі, 3і'-нетранслируемье последовательности ПОН.
Линейнье фрагменть, полученнье из ТС1 и ТС2, последовательно направляются для включения в их соответствующие положения, фланкирующие ген п5Н. После суперинфекции зтих клеток с хелперньім ретровирусом регулируемая І ТЕ транскрипция через зтот район будет приводить к образованию РНК с последовательностями І ТЕ на обоих концах. Сплайсинг зтой РНК будет приводить к образованию молеку- льі, в которой удаленьі обьічнье интроньії ПОН. Обратная транскрипция процессированного транскрипта приведет к накоплению двухцепочечньїх ДНК-копий процессированного слитого гена ПОН. ДНК вьіделяют из двукратно получивших нацеленнье конструкции, инфицированньїх ретровирусом клеток и расщепляют ферментом, которьй расщепляет зту транскрипционную единицу один раз в ГТК. Расщепленньїйй материал лигируют при условиях, усиливающих циркуляризацию, вводят в дрожжевніе клетки и зти клетки затем под- вергают отбору на ген РАЗ. Расти могут только клетки, получившие ген ОКАЗ (соединенньй с последова- тельностями, вводимьіми ТС1 и ТС2 и процессированньім геном ПОН). Зти клетки содержат плазмиду, ко- торая будет зкспрессировать белок ПОН при галактозной индукции и секретировать белок ПОН из клеток благодаря слитой последовательности дрожжевого лидерного пептида, которая отщепляєтся при секре- ции, давая зрелую, биологически активную молекулу ПОН.
Зкспрессия в бактериальньїх клетках достигаєется простой заменой, в ТС1 и ТС2, геном устойчивости к ампициллину из РВК322 дрожжевого гена ОКАЗ, промотором їас (де Воег еї аї., Ргос. Маї). Асай. 5бі. 80:21-25 (1983)) дрожкевого промотора СА 4, бактериальной лидерной последовательностью дрожжевой лидерной последовательности, началом репликации рвВк322 2-микронного кольца или последовательнос- ти АК5 и бактериальной терминацией транскрипции (например, терминатором транскрипции ігрА; Спгізйе,
СЕ. еї аї. Ргос. Май). Асад. Осі. 78: 4180-4184 (1981)) последовательности для дрожжевой терминации транскрипции. Подобньім образом, ПЕРО может зкспрессироваться в дрожжах и бактериях простой заме- ной нацеливающих последовательностей ПОН нацеливающими последовательностями ПЕРО, так чтобь дрожжевая или бактериальная лидерная последовательность била расположена непосредственно против хода транскрипции кодона 1 ПЕРО (соответствующего положению аминокислоть! 1 в зрелом процессиро- ванном белке).
Пример 6. Активация и амплификация гена ЕРО в иммортализованной клеточной линии человека.
Включение зкспрессионной единиць апйіт в уникальньй сайт Ніпа!11 рХЕРО-13 (см. Пример 4) при- водит к образованию нового нацеливающего вектора, способного к двойному отбору и к отбору клеток, в которьїх амплифицируется ген апіт. Единственньй сайт Ніпа 111 в РрХЕРО-13 определяет место соедине- ния гена пео и геномной последовательности, природно находящейся против хода транскрипции гена ЕРО человека. Помещение гена в зтом сайте обеспечиваєт конструкцию с генами пео и ап, окруженньіми пос- ледовательностью ДНК, происходящей из природного локуса ЕРО. Подобно рХЕРО-13, производнье с встроенньїм геном апітї применимь! для нацеливания на локус ПЕРО посредством гомологичной рекомбина- ции. Такая конструкция, названная рРКЕРОЯ4, представлена на фиг.6. Зта плазмида включаєт в себя зкзонь 1-4 и часть зкзона 5 гена ЕРО человека, а также фрагмент Ніпа 111-Ватн/!, лежащий против хода транск- рипции кодирующего района ПЕРО. р5МЕ, ртК и ртМТтТ-1 соответствуют промоторам из раннего района
ЗМ40, гена тимидинкиназь! (ТК) вируса простого герпеса (НБУ) и гена мьішиного металлотионеина-ї1. Ее получали следующим образом: расщепленную Ніпа 111 плазмиду РХЕРО-13 очищали, концьї ее затупляли при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразь 1. Для получения зкспрессионной единиць апіт плазмид- ную конструкцию рЕ8С159080 (Еаюп еї. а!., Віоспетівігу 25:8343-6347 (1986) расщепляли Есок!1 и за!1п1.
Фрагмент 2 т.п.н., содержащий зкспрессионную единицу очищали из продукта расщепления и конць его затупляли фрагментом Кленова ДНК-полимеразь 1. Зтот содержащий апіт фрагмент затем лигировали с затупленньім сайтом Ніпа 111 РрХЕРО-13. Аликвоту смеси для лигирования трансформировали в Е.сої и вьсевали на чашки для отбора на устойчивость к ампициллину. После инкубации в течение ночи при 372 отдельнье колонии наблюдали, вьіскребали и виращивали. Препаратьї миниплазмид готовили из зтих культур и полученную ДНК подвергали рестрикционному расщеплению ферментами Ва111--Ніпа 111 и 51 для определения ориентации встроенньїх фрагментов ап. Бьіло обнаружено, что плазмидная ДНК из од- ного из зтих препаратов содержит такую инсерцию 2 т.п.н. фрагмента апітг. Бьіло найдено, что ориентация транскрипции зкспрессионной единиць піт в зтой плазмиде бьіла противоположна ориентации смежного гена пео.
Плазмиду рРКЕРОЯ4 использовали для амплификации локуса ПЕРО в клетках после активации зндо- генного гена ПЕРО гомологичной рекомбинацией. Активация гена такой конструкцией делает возможньм отбор на увеличенную зкспрессию ОНЕРК с использованием лекарственного средства метотрексата (МТХ).
В типичном случає усиленная зкспрессия ОНЕРЕ могла бьї иметь место в результате увеличения числа ко- пий вследствие амплификации ДНК. Чистьїм результатом бьіла бьї ко-амплификация активированного гена
ПЕРО вместе с последовательностями апіт. Ко-амплификация активированного локуса ЕРО должна приво- дить к увеличенной зкспрессии ЕРО.
Зксперименть! по нацеливанию проводили в клетках НТ1080 с плазмидой РКЕРОЯ4. Вьіделяли линию
НТАВЕРО--52, зкспрессирующую ПЕРО. Зту линию анализировали количественно на продуцирование ЕРО и при помощи блоттинга по Саузерну и нозерн-блоттинга. Биіло обнаружено, что зтот штамм получал наце- ленную одну копию последовательностей апі/пео/тМТт-1. Полученнье уровни зкспрессии при отборе с 0,8 мг/мл 5418 бьіли приблизительно 1300 мЕ/млн клеток/день. Поскольку нацеленньій локус ЕРО содержал зкспрессионную единицу Япії, біл возможен отбор на увеличенную зкспрессию ОНЕЕК с антифолатом,
МТХ. Таким образом, зтот штамм подвергали ступенчатому отборув 0,02,0,05,0,1, 0,2 и 0,4 мкМ МТХ. Ре- зультать! исходного отбора зтого штамма представлень! в таблице 4 и на рис. 7.
Таблица 4
Клеточная МтХ МЕ/млн. 52020-5-0 (0) 1368 52020-5-.01 0.01 1744 52020-5-.02 0.02 11643 52020-5-0.05 0.05 24449 52-3-5-0.10 0.1 37019 52-3-2-0.20 0.2 67867 52-3-2-0.АВ 0.4 99919
Отбор с повнішающимися уровнями МТХ показал увеличение зкспрессии в линий НТЕЕРО--52, с 70-крат- ньїм увеличением в продуцирований ЕРО, наблюдаемь!/м в клеточной линии, устойчивой к 0,4 мкМ МТХ. Подт- верждение амплификации локуса ПЕРО получали блоттингом по Саузерну в устойчивьїх к МТХ клеточньмх ли- ниях, которье обнаружили приблизительно 10-кратное увеличение в числе копий активированного локуса ПЕРО по сравнению с исходньїм (не получившим нацеленной конструкции) аллелем ПЕРО.
Пример 7. Получение слитого гена ПЕРО встраиванием промотора СММ на 1,8 т.п.н. против хода транскрипции кодирующего района геномного ПЕРО.
Конструирование нацеливающей плазмидьі РКЕРО15: рЕЕРО115 конструировали слиянием сначала промотора СММ с зкзоном 1 ПОН при помощи ПЦР-амп- лификации. Фрагмент 1,6 т.п.н. амплифицировали из зкспрессионной конструкциий ПОН рхоОнНЗОвВ, которая имеет район промотора СМУ, начинающийся при нуклеотиде 546 и заканчивающийся при нуклеотиде 2105 последовательности сепрапк НЗ5ОМІЕР, слитьйй с последовательностями ПОН, начинающимися при нук-
леотиде 5225 и заканчивающимися при нуклеотиде 7322 Сепрапк последовательности НИОМОНСЗА, с ис- пользованием олигонуклеотидов 20 и 35. Олигонуклеотид 20 (35 п.н., ЗЕО ІЮ Мо 18), гибридизовался с про- мотором СММ при -614 по отношению к кзп-сайту (в последовательности сепрапк НЕНСММУ РІ) и включал в себя сайт За1 при его 5'-конце. Олигонуклеотид 35 (42 п.н., ЗЕО ІЮ Ме 19), гибридизовался с промотором
СММ при 14966 смежном зкзоне 1 ПОН и включал в себя первьге 10 п.н. интрона 1 пЕРО (содержащие часть донорного сайта сплайсинга) и сайт Ніпа 111 при его 5і-конце. Полученньй фрагмент ПЦР расщепляли
Ніпа 111 и 5а/1 и очищали на геле. Плазмиду р7163 (Пример 2) расщепляли Хпої1 и Ніпа 111 и фрагмент приблизительно 1,1 т.п.н., содержащий зкспрессионную единицу пео, очищали на геле. Фрагмент СММ про- мотор 1,6 т.п.н./'зкзон 1 поН/донорньй сайт сплайсинга и фрагмент пео 1,2 т.п.н. лигировали вместе и вст- раивали в сайт Ніпа 111 рв51155К-- (5ігаїадепе, Іпс.). Полученная промежуточная плазмида (названная рРВМСНОЗ) содержала зкспрессионную единицу пео в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации фрагмента СММ промотор/зкзон 1 поН/донорньій сайт сплайсинга. Вторую промежуточную плазмиду, РКЕРО5 АнНіпа 111, конструировали расщеплением сначала РКЕРО5 при помощи Ніпа 111. Зто вьісвобождало два фрагмента 1,9 т.п.н. и 8,7 т.п.н., и фрагмент 8,7 т.п.н., содержащий нацеливающие пос- ледовательности ЕРО, очищали на геле и циркуляризовали рециркуляцией. Полученная плазмида,
РАЕРО5Б - Ніпа 111, содержала только некодирующие последовательности геномной ДНК, обьічно находя- щиеся против хода транскрипции гена ПЕРО. Она включала последовательность от -6786 до -1 по отноше- нию к зкзону 1 ЕРО. Фрагмент 2,8 т.п.н., содержащий пео, промотор СМУ, зкзон 1 ПОН и донорньй сайт сп- лайсинга, витрезали из РЄВМОН5 при помощи Ніпа 111 и очищали на геле. Зтот фрагмент затупляли на кон- цах при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразь 1 (Мем Епдіапа Віоїарв, Іпс.) и лигировали с расщеп- ленной ВадаІ11 и имеющей затупленнье концьі плазмидной РКЕРО5Б А Ніпа 111. ВадІ11 разрезают при поло- жений -1779 против хода транскрипции зкзона 1ПЕРО в рКЕРО5Б А Ніпа 111. Полученная конструкция, рЕЕРО115 (Фиг.8), содержала последовательности ЕРО против хода транскрипции от -5786 до -1779 по от- ношению к кодирующей области ПЕРО, зкспрессионную единицу пео, промотор СММУ, зкзон 1 ПОН, донор-
НЬІЙ сайт сплайсинга и последовательности от -1778 до -1 п.н. против хода транскрипции от кодирующего района ПЕРО, с различньіми собранньми зле- ментами, в перечисленном порядке, - 3 по отношению к нуклеотидной последовательности района против хода транскрипции ПЕРО. Для трансфекции клеток человека РЕЕРО15 расщепляли Мої 1 и Руші для вьісвобождения нацеливающего фрагмента 8,6 т.п.н. Нацеливающий фрагмент содержал первую и вторую направляющие последователь- ности 4,0 т.п.н. и 1,8 т.п.н., соответственно, с гомологией к ДК против хода транскрипции гена ПЕРО.
Культура клеток, трансфекция и идентификация зкспрессирующих ЕРО получивших нацеленнье конструкции клонов.
Все клетки поддерживали при 372С, 595 СО» и 9895 влажности в среде ОМЕМ, содержащей 1090 те- лячью сьіворотку (ОМЕМ/10, НусСіопе І арогаюгіез). Трансфекцию вторичньїх фибробластов крайней плоти человека вьіполняли злектропорацией 12 х 10 клеток в РВ5 (51ВСО) с 100 мкг ДНК при 250 В и 960 мкф.
Обработанньє клетки вьісевали при 1 х 109 клеток на чашки с диаметром 150 мм. На следующий день сре- дьі заменяли на ОМЕМ/10, содержащую 0,8 мг/мл 5418 (5180). Отбор протекал в течение 14 дней, после чего из сред брали пробьї для определения продуцирования ЕРО. Все колонии на чашках, проявляющие значимье уровни ПЕРО (более 5 мЕ/мл) при определениий ЕРО при помощи ЕГЕ5А (сепгуте) вьіделяли стерильньіми стеклянньмми клонирующими цилиндрами (ВеїЇсо) и переносили в отдельнье лунки 96-луноч- ного планшета. После инкубации в течение 1-2 дней из зтих лунок брали пробьї на продуцирование ПЕРО, определяемое при помощи ЕГІЗА. Полученнье продуцирующие ПЕРО клеточнье штаммь! размножали в культуре для замораживания, вьіделения нуклеийновьїх кислот и определения количества продуцируемого
ЕРО.
Трансфекцию клеток НТ1080 (АТСС СС. 121) проводили обработкой 12 х 105 клеток в РВ5 (С18СО) с 45 мкг ДНК при 450 В и 250 мкФ. Рост и идентификация клонов вторичньїх фибробластов крайней плоти человека описана вьіше. Вьіделение продуцирующих ПЕРО клональньх клеточньїх линий проводили лими- тирующим разведением. Его вьиіполняли первьїм посевом колоний, собранньх из исходньїх чашек для отбо- ра, в виде пулов из 10-15 колоний на лунку 24 -луночного планшета. Затем продуцирующие ПЕРО пульі вьсевали при плотности клеток, приводящей к числу колоний менее 1 на лунку 96-луночного планшета. От- дельнье клоньї размножали для дальнейшего анализа, как описано для фибробластов крайней плоти че- ловека вьіше.
Характеристика зкспрессирующих ЕРО клонов:
Плазмида рКЕРО15 не содержит каких-либо кодирующих последовательностей ПЕРО. При получе- ний нацеленной конструкции с фрагментом пео/СММ-промотор/зкзон 1 пПОН/донорньй сайт сплайсинга про- тив хода транскрипции зкзона 1 ПЕРО зкспрессии ПЕРО происходит инициацией транскрипции от промото- ра СМУ, с образованием первичного транскрипта, которьій включает в себя последовательности СМУ, зкзон 1 ПЕРО и донорньй сайт сплайсинга, последовательности 1,8 т.п.н. ПЕРО против хода транскрипции и обьічнье зкзоньі! ПЕРО, интронь и 3'-нетранслируемье последовательности. Сплайсинг зтого транскрип- та имеет место от донорного сайта сплайсинга, находящегося рядом с зкзоном 1 ПОН, до следующего по ходу транскрипции акцепторного сайта сплайсинга, коториьій расположен рядом с зкзоном 2 ПЕРО. Зто при- водит к образованию нового интрона, состоящего из геномной последовательности против хода транскрип- ции гена ПЕРО, обьічного промотора ПЕРО, зкзона 1 ПЕРО и интрона 1 ПЕРО. В зрелом транскрипте зкзон 1 пен будет заменять зкзон ПЕРО. Зкзон 1 ПЕРО кодируєт только первиьее 4 и 1/3 аминокислот их 26 ами- нокислот сигнального пептида, которьій отщепляется от белка-предшественника перед секрецией из кле- ток. Зкзон 1 ПОН кодирует первье З и 1/3 аминокислот сигнального пептида ПОН, которьй также отщеп-
ляется от белка-предшественника перед секрецией из клетки. Трансляция зтого транскрипта, в котором зкзон 1 ПОН заменяет зкзон 1ПЕРО, привело бьї к белку, в котором сигнальньйй пептид является химерой последовательности ПОН и ПЕРО. Удаление сигнального пептида посредством нормального собьтия пост- трансляционного расщепления будет продуцировать зрелую молекулу ПЕРО, первичная последователь- ность которой неотличима от нормального продукта.
Трансфекция рРРЕРО15 в фибробласть! человека приводила к зкспрессии ЕРО зтими клетками. Таб- лица 5 показьіваєт результатьї зкспериментов по нацеливанию с РКЕРО15 в фибробластах человека и клетках НТ1080. Частота получения нацеленньїх конструкций в нормальньїх фибробластах человека бьіла 1/264 С418-колоний и частота получения нацеленньїх конструкций в случає клеток НТ1080 бьіла 1/450 (4418-колоний. Уровни продуцирования ПЕРО из каждого из зтих клеточньїх штаммов оценивали количест- венно. Бьіло обнаружено, что продуцент ПЕРО, полученньй в результате трансфекции фибробластов че- ловека, секретировал 7679 мЕ/109 клеток/день (Таблица 5). Активированная по ПЕРО клеточная линия из клеток НТ1080 продуцировала 12582 МЕ/10Є2 клеток/день (Таблица 5). Зти результать! показали, что актива- ция локуса ПЕРО бьіла зффективной и вьіїзвала конститутивное продуцирование ПЕРО при относительно вьісоких уровнях. Рестрикционньій анализ и гибридизационньй анализ по Саузерну использовали для подтверждения, что собьітие нацеливания имело место при локусе ЕРО.
Блоттинг по Саузерну клонов фибробластов человека и клеток НТ1080, которне получили нацелен- ную рРЕЕРО115 бьіл проведен. Фиг. 9А показьявает рестрикционную карту исходного и получившего наце- ленную конструкцию локуса ПЕРО, а Рис. 98 показьвваєт результать! рестрикционного анализа и гибридиза- ционного анализа по Саузерну нацеленного (получившего нацеленную конструкцию) клона фибробластов человека. Продуктьї расщепления Вді11/ЕсоК1 и Ватні обнаружили фрагменть 5,9 и 6,6 т.п.н., соответст- венно, как результат собьтия нацеливания при локусе ПЕРО (дорожки Т1). Оба зти фрагмента происходи- ли из встраивания 2,7 т.п.н. ДНК, содержащей ген пео и последовательности промотора СМУ. Поскольку только один из двух аллелей ПЕРО получал нацеленнье конструкции, фрагменть 4,3 т.п.н. (Вд11/Есок1) или 10,6 т.п.н. (Ватні), отражающие неизменньй локус ПЕРО, бьіли виднь! в зтих штаммах и в исходной
ДНК (дорожки НЕ). Зти результать! подтверждают, что собьітие гомологичной рекомбинации имело место при локусе ПЕРО, приводя к образованию новой транскрипционной единиць, которая управляла образова- нием зритропозтина человека.
Олигонуклеотид
Последовательность 5 ттттСтСОда
ТОСАССАСАТ ТОАТТАТТОА СТАТ
(ЗЕО ІО Мо 18)
У ТТТТААССТТ вАатАСТСАС СТатТАСССАТ СИТОСАТОССИТ (5ЕО ПО Ме 19)
Таблица 5
Трансфекция рКЕРО115 и активация зкспрессии ЕРО в клетках человека
Тип трансфициро- | Обработан- «Колони Чашки Продуценть! | Продуценть! | "Зкспрессия ванньїх клеток ньге клетки сА418' с продуцен- ЕРО/коло- ЕРО/обрабо- | ЕРО (мЕЛОЄ тами ЕРО ний 6418" таннье клеток/ клетки 24 час
Фибробласть человека 3,3х107 264 1 1/264 1/3,3 х 107 7679 клетинтово | зх | 2011 450 | вах | 12582. аопределено подсчетом колоний на 2 чашках, получением средних величин и зкстраполяцией к об- щему числу чашек
Биз средьі! в чашках с с418-колониями брали пробьі для анализа ЕРО (ЕГІ5А) и пробьі, обнаружи- вающие уровни ПЕРО больше 5 мЕ/мл, считали как собьітие активации ЕРО спродуцирование ЕРО определяли количественно из штамма фибробластов человека, клеточной ли- ний НЕ342-15 или клеточной линиий НТ1080, НТКЕРО15--1-6-6
Пример 8. Получение и амплификация слитого гена ПЕРО встраийванием промотора СММ 1,8 т.п.н. против хода транскрипции кодирующего района геномного ПЕРО.
Конструирование нацеливающей плазмидьі РКЕРО18:
Плазмиду рРКЕРО18 (Фиг.10) конструировали встрайванием зкспрессионной единиць апіг при сайте
Сіа!1, локализованном при 5'-конце гена пео РКЕРО15. Для получения зкспрессионной единиць ап плаз- мидную конструкцию рЕ8С159080 (Еап, еї. аіІ. Віоспетівіу, 25: 8343-8347 (1986)| расщепляли ЕсойНі1 и
Зап. Фрагмент 2 т.п.н., содержащий зкспрессионную единицу апії, очищали из продукта расщепления и концьї его затупляли при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразь! 1. Затем линкер Сіа! (Мем Епдіопа
Віоїар5) лигировали с затупленньім фрагментом апіт. Продукть! зтого лигирования расщепляли затем Сіа!1, лигированной с расщепленной Сіа! плазмидой РКЕРО15. Аликвоту зтой смеси для лигирования трансфор-
мировали в Е.соїї и вьісевали на чашки для отбора на устойчивость к ампициллину. Бактериальнье коло- ний анализировали расщеплением рестриктазами для определения ориентации встроенного фрагмента апт. Одну плазмиду с апіт в транскрипционной ориентации, противоположной ориентации гена пео, назва- ли РКЕРО18(-). Вторую плазмиду с апії в той же самой транскрипционной ориентации, что и ориентация гена пео, назвали РКЕРО18(5).
Культура клеток, трансфекция и идентификация зкспрессирующих ЕРО получивших нацеленнье конструкции клонов:
Все клетки поддерживали при 372С, 5956 СО» и 98956 влажности в ОМЕМ, содержащей 1095 телячью сьіворотку (ОМЕМ/10, Нусіопе І арогаюгіе5). Трансфекция клеток НТ1080 (АТСС СС. 121) происходила об- работкой 12 х 106 клеток в РВ5 (С18СО) с 45 мкг ДНК при 450 В и 250 мкФ. Обработанньсе клетки вьісева- ли при 1 х 105 клеток на 150 мм-чашку. На следующий день среду заменяли на ОМЕМ/10, содержащую 0,8 мг/мл 5418 (С18С0). Отбор продолжали в течение 14 дней, после чего брали пробь! средь! для определе- ния образования ПЕРО. Чашки, обнаруживающие значимьсе уровни образования ПЕРО (более 5 мЕ/мл) при определениий ПЕРО твердофазньм иммуноферментньїм анализом ЕГІЗА (Сепгуте Іпс), трипсинизировали и клетки пересевали для вьіделения клонов. Вьіделение продуцирующих ПЕРО клональньх клеточньх ли- ний происходило с применением лимитирующего разведения, путем посева сначала клонов в пулах из 10-- колоний на лунку 24-луночного планшета с последующим вьісевом клеток из продуцирующих ЕРО пулов при плотностях клеток, приводящих к менее, чем 1 колонии, на лунку 96-луночного планшета. Отдельнье клоньї размножали для замораживания, вьіделения нуклеийновьїх кислот и количественного определения продуцирования ПЕРО.
Вьіделение клеток, содержащих амплифицированнье последовательности апітг отбором с метотрек- сатом:
Получившие нацеленнье конструкции устойчивье к 5418 клеточнье линии, продуцирующие ПЕРО после трансфекции рЕЕРО118, вьісевали при разньїх плотностях клеток для отбора в метотрексате (МТХ).
По мере определения новьїх клонов после отбора при одной концентрации МТХ зти клоньі анализировали на продуцирование ПЕРО и пересевали при разньїх плотностях клеток в более виісокую концентрацию МТХ (обьічно с удвоением предьдущей концентрации). Зтот процесс повторяли до тех пор, пока не достигался желаемьй уровень продуцирования ПЕРО. При каждой стадии МТХ устойчивости вьіделяли ДНК и РНК для соответствующих анализов с использованием блоттинга по Саузерну и нозерн-блоттинга.
Характеристика зкспрессирующих ЕРО клонов: рЕЕРОТ18 с двумя различньіми ориентациями апітї трансфицировали в клетки НТ1080. Перед транс- фекцией рЕЕРО18(ж) и рРРЕРО18(-) расщепляли Храї1, виісвобождая нацеливающий фрагмент 7,9 т.п.н., содержащий, в следующем порядке, район 2,1 т.п.н. геномной ДНК против хода транскрипции от зкзона 1
ПЕРО (от -3891 до -1779 по отношению к стартовому кодону АТО ПЕРО), район 2 т.п.н., содержащий ген ап район 1,1 т.п.н., содержащий ген пео, район 1,5 т.п.н., содержащий промотор СМУ, слитьй с зкзоном 1
ПОН, 10 п.н. интрона 1 пЕРО (содержащего донорньй сайт сплайсинга) и затем район 1,1 т.п.н. геномной
ДНК против хода транскрипции зкзона 1 ПЕРО (от -1778 до -678 по отношению к стартовому кодону АТО
ЕРО). Трансфекция и частота нацеливания (получения нацеленньїх конструкций) из двух зкспериментов показань! в таблице 6. 5 первичньїх устойчивьїх к 3418 клонов вьіделили из зтих зкспериментов. Их разм- ножали в культуре для количественного анализа зкспрессии ПЕРО (таблица 7). Поскольку РЕРЕРО18 содер- жала ген піт, можно бьіло проводить отбор на клетки, содержащие амплифицированньсе копии направляю- щей конструкции с использованием МТУ, как описано в примере 6. Устойчивье к 5418 клоньії использовали для подтверждения присутствия в них нацеленньїх конструкций ДНК в локусе ПЕРО при помощи рестрик- ционного анализа и гибридизационного анализа по Саузерну, после чего их подвергали ступенчатому отбо- ру в МТУ, как описано вьіше.
Таблица 6
Нацеливание рКЕРОТ18 в клетках НТ1080 расщепления ньге клетки колонии с продуцен- ПЕРО/С418- первичньх днк тами пнЕРО колонии клонов (9
Ф
Таблица 7
Продуцирование ПЕРО в клеточньїх линиях НТ1080, получивших нацеленнье конструкции РКЕРО18
Пример 9. Активация и амплификация зндогенньіїх генов со-интерферона, З6М-С5Е, 2-С5Е и ЕЗНр в иммортализованньх клетках человека.
Широкое разнообразие зндогенньїх клеточньїх генов можно активировать и амплифицировать с использованием способов и конструкций ДНК зтого изобретения. Следующее далее описание раскрь- вает общую стратегию для активации и амплификации генов с-интерферона человека (лейкоцитарно- го интерферона), ЗМ-С5Е (колониестимулирующего фактора гранулоцитов/ макрофагов), С-С5Е (ко- лониестимулирующего фактора гранулоцитов) и ЕЗНВ (р-субьединицьї фолликулостимулирующего гормона). о-интерферон.
Ген о-интерферона человека (сепрапк зедоепсе НОМІЕМАА) кодирует белок-предшественник из 188 аминокислот, содержащий сигнальньй пептид из 23 аминокислот. Зтот ген не содержит интронов. Фиг. 11 схематически иллюстрирует одну стратегию для активации гена с-интерферона. Сконструирована на- целивающая конструкция для включения первой направляющей последовательности, гомологичной после- довательностям против хода транскрипции зтого гена, амплифицируемого маркерного гена, селектируемо- го маркерного гена, регуляторного района, сайта САР, донорного сайта сплайсинга, интрона, акцепторного сайта сплайсинга и второй направляющей последовательности, соответствующей последовательностям по ходу транскрипции первой направляющей последовательности. Вторая направляющая последователь- ность не должна простираться дальше против хода транскрипции, чем до положения -107, по отношению к нормальному стартовому кодону, во избежание образования нежелательньх стартовьх кодонов АТО.
В зтой стратегии первая и вторая нацеливающая последовательности находятся непосредственно рядом друг с другом в обьічном гене-мишени, но зто не является необходимь!м (см. ниже). Здесь описань амплифицируемье маркерньсе геньї и селектируемье маркерньсе геньї. Амплифицируемьй маркерньй ген и селектируемьй маркерньй ген может бьіть одним и тем же геном, их положения могут бьіть обраще- нНньІмМи и один или оба зтих гена могут находиться в интроне нацеливающей конструкции. Селектируемьй маркерньїй ген является необязательньм, а амплифицируемьй маркерньй ген необходим только в том случає, когда желательна амплификация. Включение в конструкцию специфического сайта САР является необязательньім. Необязательно, последовательности зкзона из второго гена могут бьіть включень 3" до акцепторного сайта сплайсинга и 5' до второй направляющей последовательности в нацеливающей конст- рукции. Регуляторньй район, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга, интрон и акцепторньйй сайт сплайсинга могут бьіть вьіделеньі! в виде полной единицьї из гена фактора злонгации 1хх человека (ЕК-1о; Сепрапк зедоепсе НОМЕРІА) или немедленно-раннего (предраннего) района цитомегаловируса (СММ; Сепрапк зедпепсе НЕНСМУРІ), или зти компоненть! могут бьіть собрань! из соответствующих компонентов, вьіде- ленньх из различньх генов.
Геномная ДНК, соответствующая району против хода транскрипции гена с-интерферона для исполь- зования в качестве направляющих последовательностей, и сборка нацеливающей конструкции могут бьіть вьіполненьї с применением способов рекомбинантньїх ДНК, известньїх специалистам в зтой области зна- ний. Как описано здесь, множество селектируемьїх и амплифицируемьх маркеров можно использовать в нацеливающих конструкциях, и активацию и амплификацию можно вьіполнять в большом числе клеточньх типов. Трансфекцию первичньх, вторичньїх или иммортализованньх клеток человека и вьіделение гомоло- гично рекомбинантньїх клеток, зкспрессирующих с-интерферон, можно вьіполнять с использованием спо- собов, описанньїх в Примере 4, с применением твердофазного иммуноферментного анализа ЕГІБА для с- интерферона человека (Віозоцгсе Іпіегпайопа!, Сатапію, СА). В другом варианте гомологично рекомби- нантнье клетки можно идентифицировать скринингом с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в Примере 19 и 1). Вниіделение клеток, содержащих амплифицированнье копии ампли- фицируемого маркерного гена и активированного локуса с-интерферона, вьіполняют, как описано в При- мере 6.
В гомологично рекомбинантньїх клетках продуцируется предшественник мРНК, которьйй включаєт в себя зкзогенньїй зкзон, донорньій сайт сплайсинга, интрон, акцепторньій сайт сплайсинга, вторую направ- ляющую последовательность и кодирующий район с-интерферона человека и 3' нетранслируемье после- довательности (фиг. 11). Сплайсинг зтого транскрипта будет генерировать функциональную мРНК, которая может транслироваться с образованием с-интерферона человека.
Размер интрона и, следовательно, положение регуляторного района по отношению к кодирующему району зтого гена могут вариировать для оптимизации функции регуляторного района. В нацеливающей конструкции могут присутствовать многочисленнье зкзоньі. Кроме того, вторая направляющая последова- тельность не обязательно должна лежать смежно с первой направляющей последовательностью или вб- лизи нее в нормальном гене, так что части нормального района против хода транскрипции гена делети- руются при гомологичной рекомбинации. ам-сС5Е
Ген ОМ-С5Е человека (сепрапк зедчепсе НИМОМО5БЕС) кодирует белок-предшественник из 144 аминокислот, содержащий сигнальньй пептид из 17 аминокислот. Зтот ген содержит 4 зкзона и З интрона,
и М-концевье 50 аминокислот предшественника кодируются в первом зкзоне. Фиг. 12 схематически ил- люстрирует стратегию для активации гена 5М-С5Р. В зтой стратегии конструируют направляющую (наце- ливающую) конструкцию для включения в нееє первой направляющей последовательности, гомологичной последовательностям против хода транскрипции зтого гена, амплифицируемого маркерного гена, селекти- руемого маркерного гена, регуляторного района, гена САР, зкзона, которьй кодирует аминокислотную пос- ледовательность, которая идентична или функционально зквивалентна последовательности первьїх 50 аминокислот ЗМ-С5Е, донорного сайта сплайсинга и второй направляющей последовательности, соот- ветствующей последовательностям по ходу транскрипции первой направляющей последовательности. По зтой стратегиий гомологично рекомбинантнье клетки продуцируют предшественник мРНК, которьй соот- ветствует зкзогенному зкзону и донорному сайту сплайсинга, второй направляющей последовательности, любьм последовательностям между второй направляющей последовательностью и стартовьм кодоном ге- на 5М-С5Е (Фиг. 11). Сплайсинг зтого транскрипта приводит к слиянию зкзогенного зкзона с зкзоном 2 зндогенного гена ЗМ-АС5Е, которое при трансляции будет продуцировать ЄМ-С5Е.
В зтой стратегии первая и вторая направляющая последовательности находятся непосредственно рядом в нормальном гене-мишени, но зто не является необходимь!м (см. ниже). Здесь описаньї амплифи- цируемье маркерньсе геньі и селектируемье маркерньсе геньі, пригоднье для отбора. Амплифицируемьй маркерньй ген и селектируемьй маркерньй ген могут бьіть одним и тем же геном или их положения могут бьіть обращенньіми. Селектируемьй маркерньй ген является необязательньмм, а амплифицируемьй мар- керньїйй ген необходим только тогда, когда требуется амплификация. Селектируемьй маркерньй ген и/или амплифицируемьїй маркерньй ген могут бьіть расположеньії между донорньім сайтом сплайсинга и второй направляющей последовательностью в нацеливающей конструкции. Введение специфического сайта САР является необязательньїм. Регуляторньїй район, сайт САР и донорньй сайт сплайсинга могут бьїть вьіде- лень в виде полной единиць из гена фактора злонгации 15 человека (ЕЕ-1о; Сепрапк зедпепсе
НОМЕРА) или немедленно-раннего (предраннего) района цитомегаловируса (СММ; Сепрапк зедпепсе
НЕНСММУ РІЇ) или зти компоненть! могут бьіть собраньї из подходящих компонентов, вьіделенньх из разньх генов (таких как промотор тМТт-1 и сайт САР, и зкзон 1 и донорньій сайт сплайсинга из генов ПОН или
ПЕРО).
Можно использовать другие подходь, например, первая и вторая направляющие последовательнос- ти могут соответствовать последовательностям в первом интроне гена 5М-С5Е. В другом варианте, можно использовать направляющую конструкцию, подобную описанной для о-интерферона, которая сконструирована таким образом, что она включает в себя первую направляющую последовательность, гомологичную последовательностям против хода транскрипции гена ОМ-СО5Е, ампли- фицируемьй маркерньй ген, селектируемьй маркерньй ген, регуляторньійй район, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга, интрон, акцепторньій сайт сплайсинга и вторую направляющую последовательность, соответст- вующую последовательностям по ходу транскрипции первой направляющей последовательности.
В любом случає вторая направляющая последовательность не должна обязательно лежать непос- редственно рядом с первой направляющей последовательностью в нормальном гене или вблизи нее, так что части нормального района против хода транскрипции зтого гена делектируются при гомологичной ре- комбинации. Кроме того, в нацеливающей конструкции могут присутствовать многочисленнье некодирую- щие или кодирующие зкзоньі. Получение геномной ДНК, соответствующей районам против хода транскрип- ции или интронам гена СМ-С5Е человека, для использования в качестве направляющих последователь- ностей и сборку нацеливающей конструкции можно вьіполнять при помощи способов рекомбинантньх ДНК, известньїх специалистам в зтой области знаний. Как описано здесь, множество селектируемьх и амплифи- цируемьїх маркеров можно использовать в нацеливающих конструкциях и активация может бьїть достигну- та в большом количестве клеточньїх типов. Трансфекцию первичньх, вторичньїх или иммортализованньх клеток, зкспрессирующих СМ-С5Е, можно вьіполнять с использованием способов, описанньїх в Примере 4, с применением твердофазного иммуноферментного анализа ЕГІЗА для ЗМ-СО5Е человека (КО бузіетв,
Міппеароїїз, ММ). Альтернативно, гомологично рекомбинантнье клетки можно идентифицировать ПЦР-ск- ринингом, как описано вьіше. Вьіделение клеток, содержащих амплифицированнье копиий амплифицируе- мого маркерного гена и активированного локуса ЗМ-С5РЕ, вьіполняют, как описано вьіше. а--С5Е
Ген 6-С5Е человека (Сепрапк зедоепсе НОМОС5ЕС) кодирует белок-предшественник из 204-207 аминокислот, содержащий сигнальньй пептид из 30 аминокислот. Зтот ген содержит 5 зкзонов и 4 интрона.
Первьй зкзон кодирует 13 аминокислот сигнального пептида. Фиг. 13 схематически иллюстрирует страте- гию активации гена С-С5Р. Конструировали нацеливающую конструкцию, которая включаєт в себя первую направляющую последовательность, гомологичную последовательности против хода транскрипции зтого гена, амплифицируемьй маркерньй ген, селектируемьй маркерньй ген, регуляторньій район, сайт САР, зкзон, кюдирующий аминокислотную последовательность, которая идентичная или функционально зквива- лентна последовательности первьїх 13 аминокислот сигнального пептида С-С5Е, донорньій сайт сплай- синга и вторую направляющую последовательность, соответствующую последовательности по ходу транскрипции первой направляющей последовательности. При помощи зтой стратегии гомологично реком- бинантнье клетки продуцируют предшественник мРНК, которьй соответствует зкзогенному зкзону и донор- ному сайту сплайсинга, второй направляющей последовательности, любьім последовательностям, между второй направляющей последовательностью и стартовь!м кодоном гена 5-С5Е и зкзоном, интроном и 3- нетранслируемому району гена С-С5БЕ (Ффиг. 13). Сплайсинг зтой матрицьї приводит к слиянию зкзогенного зкзона с зкзоном 2 зндогенного гена С-С5Е, которое при трансляции будет продуцировать 5-С5Е. Воз- можность функциональной замень! первьїх 13 аминокислот сигнального пептида нормального С-С5Е ами-
нокислотами, присутствующими в зкзогенном зкзоне, позволяет модифицировать сигнальньй пептид и, следовательно, секреторнье свойства продуцируемого белка.
В зтой стратегии первая и вторая направляющиєе последовательности находятся непосредственно рядом в нормальном гене-мишени, но зто не является обязательньім. Вторая направляющая последова- тельность не должна обязательно лежать смежно или вблизи от первой направляющей последовательнос- ти в нормальном гене, так что части района против хода транскрипции зтого гена делетируются при гомо- логичной рекомбинации. Амплифицируемьй маркерньій ген и селектируемьй маркерньй ген могут бьть одним и тем же геном или их положения могут бьіть обращенньіми. Селектируемьй маркерньй ген являет- ся необязательньмм, а амплифицированньій маркерньій ген необходим только в том случає, когда жела- тельна амплификация. Селектируемьй маркер и/или амплифицируемьй маркер могут бьіть расположень между донорньм сайтом сплайсинга и второй направляющей последовательностью в нацеливающей конструкции. Введение специфического сайта САР являєтся необязательньім. Регуляторньій район, САР- сайт и донорньй сайт сплайсинга могут бьіть вьіделень в виде полной единиць из гена фактора злонгации 1ох; человека (ЕР-1о; Сепрапк зедоепсе НОМЕНІА) или немедленно-раннего (предраннего) района цитоме- галовируса (СМУ; сепрапк зедоепсе НЕНСМУРІ), или зти компоненть! могут бьіть собрань! из соответст- вующих компонентов из различньїх генов, таких как промотор тМТт-1 и сайт САР, и зкзон 1 и донорньй сайт сплайсинга из генов ПОН или ЕРО. Множественнье зкзогеннье зкзоньії, коюдирующие или некодирую- щие, могут бьіть использовань!ї в нацеливающей конструкции при условий, что стартовьй кодон АТО, кото- рьій при сплайсинге должен бьїіть внутри рамки со зрельім белком, бьл включен в один из зтих зкзонов.
Можно использовать другие подходь, например, первая и вторая направляющие последовательнос- ти могут соответствовать последовательностям в первом интроне гена 6-С5Р. Альтернативно, можно ис- пользовать нацеливающую конструкцию, подобную описанной для с-интерферона, которая сконструиро- вана таким образом, что она включаєет в себя первую направляющую последовательность, гомологичную последовательностям против хода транскрипции гена С-С5Е, амплифицируемьй маркерньй ген, селекти- руемьй маркерньй ген, регуляторньїй район, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга, интрон, акцепторньй сайт сплайсинга и вторую направляющую последовательность, соответствующую последовательностям по ходу транскрипции первой направляющей последовательности.
Получение геномной ДНК, соответствующей районам против хода транскрипции или интронам гена с2-С5РЕ человека, для использования в качестве направляющих последовательностей и сборку нацеливаю- щей конструкции можно вьіполнять при помощи способов рекомбинантньх ДНК, известньїх специалистам в отой области знаний. Как описано здесь, большое количество селектируемьїх и амплифицируемьх марке- ров можно использовать в нацеливающих конструкциях и активация может бьіть достигнута в большом числе клеточньїх типов. Трансфекцию первичньх, вторичньїх или иммортализованньїх клеток человека и вьїіделение гомологично рекомбинантньїх клеток, зкспрессирующих 5-С5Е, можно вьіполнять при помощи способов, описанньїх в Примере 4, с использованием анализа ЕГІЗА для С-С5Е человека (КО Бузіетв,
ММ). В другом варианте, гомологично рекомбинантнье клетки могут бить идентифицированьї ПЦР-скри- нингом, как описано вьіше. Вьіделение клеток, содержащих амплифицированнье копий амплифицируемого маркерного гена и активированного локуса С-С5Е, вьіполняют, как описано вьіше.
ЕН
Ген ЕЗНД человека (Сепрапк зедоепсе НОМЕ5НІ) кодирует белок-предшественник из 129 аминокис- лот, содержащий сигнальньй пептид из 16 аминокислот. Зтот ген содержит три зкзона и два интрона, при- чем первьй зкзон является некодирующим. Активацию гена Е5НІВ можно вьіполнять при помощи ряда ст- ратегий. Одна стратегия представлена на Фиг. 14. В зтой стратегии, конструируют нацеливающую конст- рукцию, которая включает в себя первую направляющую последовательность, гомологичную последова- тельностям против хода транскрипции зтого гена, амплифицируемьй маркерньй ген, селектируемьй мар- керньй ген, регуляторньй район, сайт САР, зкзон, донорньій сайт сплайсинга и вторую направляющую пос- ледовательность, соответствующую последовательностям по ходу транскрипции первой направляющей последовательности. По зтой стратегии, гомологично рекомбинантнье клетки продуцируют предшествен- ник МРНК, которьйй соответствует зкзогенному зкзону и донорному сайту сплайсинга, второй направляю- щей последовательности, любь!м последовательностям между второй направляющей последовательност- ью и стартовьм кодоном гена ЕЗНР, и зкзонь, интронь и 3'--нетранслируемьсе районь! гена Е5Нр (Ффиг. 14).
Сплайсинг зтого транскрипта приводит к слиянию зкзогенного зкзона с зкзоном 2 зндогенного гена ЕН, которое при трансляции может продуцировать ЕН. В зтой стратегии первая и вторая направляющие пос- ледовательности находятся непосредственно рядом в нормальном гене-мишени, но зто не является обяза- тельньм (см. ниже).
Могут бьїть использовань! другие подходьі, например, первая и вторая направляющиєе последова- тельности могут соответствовать последовательностям первого интрона гена ЕЗНр. В другом варианте можно использовать нацеливающую конструкцию, подобную описанной для с-интерферона. В зтой стра- тегии, нацеливающая конструкция сконструирована таким образом, что она включаєт в себя первую нап- равляющую последовательность, гомологичную последовательностям против хода транскрипции гена
Е5НрД, амплифицируемьй маркерньй ген, селектируемьй маркерньй ген, регуляторньй район, сайт САР, донорньй сайт сплайсинга, интрон, акцепторньй сайт сплайсинга и вторую направляющую последователь- ность, соответствующую последовательностям по ходу транскрипции от первой направляющей последова- тельности. Вторая направляющая последовательность не должна простираться дальше против хода транскрипции, чем до положения -40 по отношению к сайту инициации транскрипции нормального ЕН, для того, чтобьії избежать появления нежелательньмх стартовьх кодонов АТО. В зтих гомологично рекомби-
нантньїх клетках продуцируеєется предшественник мРНК, которьй включает в себя зкзогенньйй зкзон, донор- ньій сайт сплайсинга, интрон, акцепторньїй сайт сплайсинга, вторую направляющую последовательность и кодирующие зкзоньі ЕЗНр человека, интрон и 3'-нетранслируемье последовательности. Сплайсинг зтой матрицьі будет генерировать функциональную мРНК, которая может транслироваться с образованием
Е5Нр человека. Размер интрона и, следовательно, положение регуляторного района относительно коди- рующего района зтого гена могут изменяться для оптимизации функции регуляторного района.
В любой стратегии активации вторая направляющая последовательность не должна обязательно ле- жать непосредственно смежно или близко к первой направляющей последовательности в нормальном ге- не, так что части района против хода транскрипции нормального гена делектируются при гомологичной ре- комбинации. Кроме того, одна направляющая последовательность может находиться против хода транск- рипции гена, а одна может находиться в зкзоне или интроне гена ЕЗНр.
Амплифицируемьй маркерньй ген и селектируемьй маркерньй ген могут бьіть одним и тем же ге- ном, их положения могут бьіть обращенньми и один из них или оба могут бьіть расположень! в интроне на- целивающей конструкции. Здесь описаньї амплифицируемьсе маркерньєе геньї и селектируемье маркернье геньії, пригодньіе для отбора. Селектируемьй маркерньй ген является необязательньм, а амплифицируе- мьїй маркерньй ген необходим только в том случає, когда желательна амплификация. Введение специфи- ческого сайта САР является необязательньїм. Иногда (необязательно) последовательности зкзонов из дру- гого гена могут бьіть включень! 3' относительно акцепторного сайта сплайсинга и 5' относительно второй направляющей последовательности в нацеливающей конструкции. Регуляторньйй район, сайт САР, зкзон, донорньй сайт сплайсинга могут бьїіть вьіделень в виде полной единиць из гена фактора злонгации 10; че- ловека (ЕН-То; сСепрапк зедоепсе НОМЕНРІА) или немед- ленно-раннего (предраннего) района цитомегаловируса (СМУ; сепрапк зедоепсе НЕНСМИУРІ) или зти ком- поненть! могут бьіть собрань из соответствующих компонентов, вьіделенньмх из разньїхх генов. В любом слу- чає зкзогенньй зкзон может бьіть таким же или отличающимся от первого зкзона нормального гена Е5НВ, и в нацеливающей конструкции могут присутствовать многочисленньєе зкзонь!.
Получение геномной ДНК, соответствующей району против хода транскрипции гена Е5НВ, для ис- пользования в качестве направляющих последовательностей и сборку нацеливающей конструкций можно вьіполнять при помощи способов рекомбинантньх ДНК, известньїх специалистам в зтой области. Как опи- сано здесь, большое количество селектируемьїх и амплифи- цируемьїх маркеров можно использовать в нацеливающих конструкциях, и активация может бьіть достигну- та в большом количестве клеточньїх типов. Если желательно, продукт активированного гена ЕЗНД может бьіть получен в клеточном типе, которьій зкспрессирует о-субьединицу гликопротейина человека, продукт которой образует гетеродимер с продуктом гена Е5НД. Может бьіть использован встречающийся в природе клеточньій штамм или линия. Альтернативно, ген о-субьединицьі гликопротеина человека (сепрапк зедоепсе НОМО МСА!) может ко-зкспрессироваться с продуктом гена ЕЗНрО, причем такая совместная зкспрессия вьіполняется путем зкспрессии гена с-субьединиць! гликопротеина человека или кКДНК под контролем подходящего промотора, или посредством активации гена о-субьединиць! гликопротейина чело- века описанньіми здесь способами. Трансфекцию первичньїхх, вторичньїх или иммортализованньх клеток человека и вьіделение гомологично рекомбинированньмх клеток, зкспрессирующих ЕЗНрД, можно вьіполнять при помощи описанньїх вьише способов с применением анализа ЕГІЗА для Е5Нр человека (Ассигаїе
Спетісаї апа Зсіепійс Ууезіригу, МУ). В другом варианте, гомологично рекомбинантнье клетки можно иден- тифицировать при помощи ПЦР-скрининга, описанного вьіше. Вьіделение клеток, содержащих амплифици- рованнье копиий амплифицируемого маркерного гена и активированного локуса ЕН, вьіполняют, как опи- сано вьіше.
Зквиваленть.
Специалисть в зтой области смогут найти или будут способнь! установить не более, чем рутинньм зкспериментированием, многие зквивалентьї специфических вариантов зтого изобретения, описанньх здесь. Такие зквиваленть! должнь!ї охватьнваться следующей формулой изобретения.
.
ХХ ко іш ле е| х -15. Е ша т: ще ві хо вра ч НЕ
У ЩЕ
(в) че Її о Фо появ ш -їш 515 о іш о хо
ЧЙ с/х ОЇ ох
Че че ге
ЧЕ хх чо а!" ро 5 чі
Фі Б 5 5 і аг ре о х Її че х орах 5 8 ве
Е шко 2 я 55 «| 5 8 ве) с
Ж - Я ЩЕНЯ Же Бо - 9 асо вх «іх - ах о х сх І х 5 о б бо т о
І У 1 2 х : 5 ;
Е Є Ши Е ; - т а. ШИ Е ї
Н Її б от х
Я ЩЕ 8 , У КЕНЕ : а ох бо ово ; о т вх х
ВА о Я Ї г ч п. 9 о | її б : В й т 2 ох с : ї ! 5 БЕЗ в : ТЕ
Г кож хі й оз й ї о що
І хх ся : Й 5 іє : це х б - ох 58 : що т І 5.5 ох хо ЗЕ
ОО х і: щх б ж в ад 5:
Б ах то її
Б би
Б Іс
Гоа ха чех ех
Я пи
Ге гей егІЛ с іо. о Ге шк (0) -0 (5 єс те -- ше (в) є -- х х -| х за щ тра в| ах - « вот с5о 5 Ох т (5 9-8 5 У 5) 5-2 х.- Фо те Ше о 7 І т: см о. х -коя хх о. Ех " - 52 Фо б'ю що - я ».Ф. р - Фо
І х 2,9 є ' м -
І- х
Гл г: 59 5 т е
Фо х ох оо
Є 5 -а Е
Генна кі а (2) уся о м о 5 5 9) - 5 З : ШЕ о. Ф х є ве 8 ні 8 о о о Є ХЕ
БА їй ЕЕ о т вх
Ех Ф Е (в) р х о95 х е г ж бе
Ф е) х 5о9е х а. ЕЕ нт її се - (2) тоЕ а о є БЗ с п оо щш (в) вах (в) а- «е- а. іш пох с о ОО таз «т а- х О ча бо г а о ш оз ра ' а -Ж- о 5 - х хх -- . б бо Ух Оп 5) а хв що 2 х хе ох -жЕ 5 : я о х б са
І о хо
Ф Ф а. а. о м є 5) о що т Фо а ох о о а р щі то промотор тМі - | Засі пон
ДЕ шу зосі
Краї ра (0/6.67) У ре 6 Е да й ду
Й 4- Ваг й рхонь щ
Есокі. р5 васі 6.7 Кь
Ватні 2 хвої за ЕсокіІ
Ніпаз
А
3
М
Фиг. З вн над й в я с
Яке ще то, ЧИ
РЕЗлеОЕРО 0 15.8 Кь я
Ген зритропозтина |, й человека М в, кс к. Лу ми А -вод рі й
РТК 72 у,
Інн я ді
БА вза пео - ген неомицинфосфотрансферазь атр - ген устойчивости к ампициллину рт МТ - промотор мьшиного металлотионейиноа
Фиг. 4
МІЯ ПІ за! , р ЗМ 40 огі ї дише !
Кк шт от
АМР ВО! / че Ватні/ ВО! 68 врісе СВ часійоп та
ЕЕ рРСсОМЕО ЕЕ 4дкь Б пео
ЕЕ хз ді рвк322 дей огі ПОН й
ЕТО ватні ро А пео - ген неомицинфосфотрансферазь
Фиг. 5
Нілаш (14018)
Ніпаш (12474) ре -кай
ОНЕКаго 22) рУМЯ4бе
Есокі (11070) їмо !
РІК
РЕКЕГОЇЯ ртМмті 14 КЬ х против хода транскрипции м ЕРО ехопз 1-4 от кодирующего ЕРО ройоно /й є атр ДД вані (5163)
С - 2-06 й ше ру пео - ген неомицинфосфотрансферазь атр - ген устойчивости к ампициллину рт МТ! - промотор мьшиного металлотионейна
Фиг. 6
Зкспрессия зритропозтина в клеточной линий-мишени человека, подвергнутой ступенчитому отбору зЇШЗ--ИШ2З-ї- в з Корей дою ще -нлж 80000 Ай
І й ч 5 70000 ще х 50000 й не К : я
Ж 40000 Б З р. не
Те каси ШО Яке ЩІ зе
ШІ 30000 аж, ; ;. я ре. -
Ф 20000 В І р. Що. Б. Як ТЯ дк 10000 шия у ГІ г г й З о їн. ї- Як ЩО й о 0.01 0.02 0.05 0 02 04
Метотрексат (мкМ)
Фиг. 7
НіпапіІ (11463)
Випуніивапт 0 ХеАТО1408)1 501(398) Хвої (620)
АТО (10283) «оБІИИттю Щі
Ватні (10274) сш С оогівів (1296) пу и
У зкзон 1 он
САР атр
ОТАТАВК СМУ промотор
ЕсовІ(8528)Й РЕЕРО15 пІБКЬ пео ог1 (3517) їй ка у, Ватні (3537) чо му во глнімацЇ «З», б ун -
Хьаї (5432) атр - ген устойчивости к ампициллину пео - ген неомицинфосфотрансферазь
Фиг. 8 хм !
Зндогенньй ген ЕРО Ргсье кт нер Фі вет їй пит їй Вин пойт пани
Кодирующая облость ЕРО
Ватні 106 Кь
Вків 4зКь фанат ьо они
Активировонньй ген ЕРО й Гісбе -ож
Ватні) Есойі(сю2р 00 бані з вишасвиз інт пз . песо СМУ шу рготосг
Кодирующая область ЕРО
Ватні 65.7 КЬ ши нин ПН пні й Й
Ватні бвеКкь урні о
ЯЕсопі / ВЕ. 5аКЬ чкощиаааааааа вай а а
Фиг. 9А
Ватні ВешШЕсоВіІ и р - З
А о я КН 23.1 де опт Тих ; 10.6 КД иа песни ення 9.4 в ВК У КОМУНИ «б фрлукаи А оолв и 6.6 фдикестрао тий 6.0 заду кня рек тн а сов 5.9 о Ткя ОКУ но шИте и аа Води с дксннй
Ко А и ян сен о вок ан Ви ні 4 4 Я
Коня иа КК оон - а па» Сі: Ой сий ау
Аз лей хлів Кт у
Шемет АК А КУ теркіл ік реи нр в н он ее боже ФЕМ ля
КооаДА НУ ВОК ми В кВ ВА о она я КК и АНЯ Бефаноєютья
Хкирв клея ек те ро и оо и р и ННЯ
Кепки ня 2.
Аня ОА нки аа Кк ла имя а вок мий о НЯ 2 Го) даси мкА я Ето . нн М ан ов тя
ЕК и Дт
Фиг. 9Б
Ніпаш (13426)
Хьа!(13371) | 501(398) рої (624)
АТа (12246) спи я огіріп (1295)
Валіні (12237) оди ще:
САР ЬСН ехов1 атр
ТАТА Бох Промотор СММУ
Есові(й10491).Гроу пео
РЕЕРО 18 кн Моб (3517) 134 КЬ Е Ват Ні (3537) стат (9526 ха ДУ
Ба)і (9520) х у,
Ох У
Ду (Ьаї (5432) 501(7910
ЕсовІ (7560)
Сівї (7554) атр - ген устойчивости к ампициллину пео - ген неомицинфосфотрансферазь дн о - дигидрофолатредуктаза
Фиг. 10 ' САР 5В є А, "
Ноцеленноя конструкция іа Ївм БИ І регуляторная поспедовательность
Зндогенний ген Й мінкієкк- 1 2 и область против хода « - интерферон
Активировонньй зндогенньй ген.
СА зо ВА - Ам ЇЇ зм СИЛА Гр нкиалях 1 1 регуляторная | а - интерферон последовательность в.лурранннн Папчичннний -1 Б
Фиг. 11
Ге! о
С о в.
Ф с 2
Ге) що и Ж З
Бо 95 385 а -к оо : - 8 З во- 3 м в г; р а й т 8 О є - 59 б ож
В іншлян! :
НІ 5 5 В 55 б п і ;
І- хх о "
Хо х Й
ХО 5
Хо г ще шк ГК
Фо ов е (9, ці с : Кн а Сї. 7
ГІ : зе в 9 5 9 й ха. 9
Хе
МЕ
М 5 б т ФУ (0) 0 о
І /х е
Е- о р г! З : з Ф : ; е х " ' (9) Е І : -З зх І о З : тх х хе З о т ; ра х Б :
З ж б З
Ф 55 з З : - х : (в) В х ' т. Ох І я о пх оо ще 95 р
І і ОО. в А - хо о. - 465 о о 2-х І-
Ф т Гані - -йО Ех 8 Ф 4 « ж і с дк 8 ж о Ба І хо ВТ зе с м нс 25 Фо --
Мо г- З 5
Мах (9)
Ме 2
Як о « о "
Фо Я ра а о нем ОО 5 хо с КМ о р 2ще)
ХУ. 5
Фо в (в) о. с (о),
З со
Ф с й ; - ї- і : е : 5 т : 5 х (в) ш ч б р (в) ч ей х т й д о г) т - ї т Х х г; бо 2
Фк ж 5 (о; В а ее)
І ж Б (в) б б о а.
Фо х 5 55 ї - чо В (в; в. м г Ф х «
КВ я На
ТЕ Ме
З т. зі | ме їЕ
БВ а ЕВ с вом - с
У іч: - - 2 :5 Ід ще дже х і Ге Го
Ух З
З (9) е и « є ЕВ 5 тв) еще) 5 «ч " .
М
Ма д о 8 се
Ф жене 5 « ЕЕ е с «а . о хо о г
ХЕ -
І-4
МЕ е т- ще о -
Фо 5 о. с т Ф е я З
Е і т ль ре ві
Кк о д о
З ч ч - 5. х З : р. в хх о д В
І 5 5 т о Фо т м І о. Ге)
Ф і ва в о гі тб а |- ри Фо Ж
Ф -к в) се Оочо х
Ф чо С
ШшШ . т « о б 5 я щі
Тираж 50 екз.
Відкрите акціонерне товариство «Патент»
Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3-72 -89 (03122)2-57- 03
UA96114211A 1994-05-13 1995-05-11 Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти) UA34493C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/243,391 US5641670A (en) 1991-11-05 1994-05-13 Protein production and protein delivery
PCT/US1995/006045 WO1995031560A1 (en) 1994-05-13 1995-05-11 Dna construct for effecting homologous recombination and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA34493C2 true UA34493C2 (uk) 2001-03-15

Family

ID=22918596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA96114211A UA34493C2 (uk) 1994-05-13 1995-05-11 Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти)

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5641670A (uk)
EP (1) EP0759082A1 (uk)
JP (1) JPH10500570A (uk)
KR (1) KR100379356B1 (uk)
AU (1) AU709058B2 (uk)
BR (1) BR9507874A (uk)
CA (1) CA2190289A1 (uk)
CZ (1) CZ295115B6 (uk)
FI (1) FI964536A (uk)
HU (1) HUT76844A (uk)
IL (1) IL113708A0 (uk)
MX (1) MX9605542A (uk)
NO (1) NO964802L (uk)
NZ (1) NZ285945A (uk)
RU (1) RU2267533C2 (uk)
SK (1) SK146196A3 (uk)
UA (1) UA34493C2 (uk)
WO (1) WO1995031560A1 (uk)
ZA (1) ZA953879B (uk)

Families Citing this family (322)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
RU2212411C2 (ru) * 1989-10-16 2003-09-20 Эмджен Инк. Полипептид, обладающий гемопоэтической биологической активностью фактора стволовых клеток (варианты), днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), фармацевтическая композиция для гемопоэтической терапии, способ получения полипептида и способ его использования (варианты)
US6852313B1 (en) 1989-10-16 2005-02-08 Amgen Inc. Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US20040181044A1 (en) * 1989-10-16 2004-09-16 Zsebo Krisztina M. Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor
US6270989B1 (en) * 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
US5968502A (en) * 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5981730A (en) 1994-04-13 1999-11-09 The General Hospital Corporation RPS gene family, primers, probes, and detection methods
US7597886B2 (en) * 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7820798B2 (en) * 1994-11-07 2010-10-26 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
WO1998007858A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Chiron Corporation HUMAN POLYHOMEOTIC 1(hphl) ACTS AS A TUMOR SUPPRESSOR
EP0966521A1 (en) * 1996-09-13 1999-12-29 Novo Nordisk Biotech, Inc. Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide
EP0935651B1 (en) 1996-09-13 2004-12-29 Transkaryotic Therapies, Inc. THERAPY FOR alpha-GALACTOSIDASE A DEFICIENCY
KR20000048820A (ko) 1996-10-01 2000-07-25 게론 코포레이션 텔로머라제 역전사 효소
US6136566A (en) * 1996-10-04 2000-10-24 Lexicon Graphics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US6855545B1 (en) 1996-10-04 2005-02-15 Lexicon Genetics Inc. Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
US7332338B2 (en) 1996-10-04 2008-02-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Vectors for making genomic modifications
US20040072243A1 (en) * 1996-10-11 2004-04-15 Lexicon Genetics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
JP4771563B2 (ja) 1996-12-06 2011-09-14 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
JP2001505783A (ja) * 1996-12-11 2001-05-08 カイロン コーポレイション 分泌ヒトタンパク質
US20020168718A1 (en) * 1997-04-03 2002-11-14 California Institute Of Technology Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering
AU7381098A (en) 1997-05-16 1998-12-08 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having prolyl pipeptidyl aminopeptidase activity and nucleic acids encoding same
US7378506B2 (en) * 1997-07-21 2008-05-27 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US6639050B1 (en) 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
PT1000167E (pt) * 1997-07-23 2006-05-31 Roche Diagnostics Gmbh Producao de proteinas mutantes humanas em celulas humanas por recombinacao homologa
US6548296B1 (en) * 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
CA2298412C (en) * 1997-07-23 2010-10-19 Roche Diagnostics Gmbh Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation
CN1151258C (zh) * 1997-07-23 2004-05-26 罗切诊断学有限公司 通过内源基因活化制备促红细胞生成素
AU776280B2 (en) * 1997-07-23 2004-09-02 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
KR100622203B1 (ko) * 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
KR100641969B1 (ko) * 1997-07-23 2006-11-06 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법
US6897066B1 (en) * 1997-09-26 2005-05-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
US7316923B1 (en) 1997-09-26 2008-01-08 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
DK1017803T3 (da) * 1997-09-26 2010-08-23 Abt Holding Co Ekspression af endogene gener ved ikke-homolog rekombination af et vektorkonstrukt med cellulært DNA
ZA989497B (en) * 1997-10-20 2000-04-19 Roche Diagnostics Gmbh Positive-negative selection in homologous recombination.
ATE384732T1 (de) 1997-11-03 2008-02-15 Human Genome Sciences Inc Vegi, ein inhibitor der angiogenese und des tumorwachstums
WO1999028346A1 (de) * 1997-12-03 1999-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Erythropoietin mit hoher spezifischer aktivität
CN1291229A (zh) 1998-02-19 2001-04-11 东弗吉尼亚医学院 重组的活性人透明带蛋白3
US7037663B2 (en) * 1998-02-19 2006-05-02 Eastern Virginia Medical School Human zona pellucida protein 3 and uses thereof
AU3066699A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Johns Hopkins University, The Smallpox inhibitor of complement enzymes (spice) protein and methods of inhibiting complement activation
DE69943022D1 (de) 1998-03-19 2011-01-20 Human Genome Sciences Rockville Der gemeinsamen gamma-kette ähnlicher zytokinrezeptor
US6808921B1 (en) * 1998-03-27 2004-10-26 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
US6436707B1 (en) * 1998-03-27 2002-08-20 Lexicon Genetics Incorporated Vectors for gene mutagenesis and gene discovery
CN1308673A (zh) 1998-05-07 2001-08-15 变更染色体医疗公司 通过同源重组修饰FSHβ基因的表达
IL139431A0 (en) * 1998-05-07 2001-11-25 Transkaryotic Therapies Inc Genomic sequences upstream of the coding region of the g-csf gene for protein production and delivery
AU3788899A (en) * 1998-05-07 1999-11-23 Transkaryotic Therapies, Inc. Genomic sequences upstream of the coding region of the ifn-alpha2 gene for protein production and delivery
AU4213999A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide by modifying the copy number of a gene
WO2000005393A2 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Cobra Therapeutics Limited A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (ucoe)
US7241730B2 (en) 1998-08-27 2007-07-10 Universitat Zurich Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: fibrin formulations with peptides
US6894022B1 (en) 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7601685B2 (en) * 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
SE9803099D0 (sv) 1998-09-13 1998-09-13 Karolinska Innovations Ab Nucleic acid transfer
EP1953229A3 (en) 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6416975B1 (en) 1998-11-12 2002-07-09 Gliatech, Inc. Human glycine transporter type 2
AU764039B2 (en) 1998-12-07 2003-08-07 Zymogenetics Inc. Growth factor homolog ZVEGF3
WO2001027150A2 (en) 1999-10-14 2001-04-19 Clontech Laboratories Inc. Anthozoa derived chromo/fluoroproteins and methods for using the same
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
EP1961813B1 (en) 1998-12-16 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Human cyclin-dependent kinase (hPNQALRE)
CA2364267A1 (en) * 1999-02-19 2000-08-24 Athersys, Inc. Compositions and methods for non-targeted activation of endogenous genes
AU3501700A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Human Genome Sciences, Inc. Human endokine alpha and methods of use
US6489308B1 (en) 1999-03-05 2002-12-03 Trustees Of University Of Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric-oxide-induced clinical conditions
AU3864000A (en) * 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses
AU3731400A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Trustees Of University Technology Corporation, The Methods and compositions useful in inhibiting apoptosis
US6849605B1 (en) * 1999-03-05 2005-02-01 The Trustees Of University Technology Corporation Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections
EP1165791B1 (en) 1999-03-09 2007-10-31 ZymoGenetics, Inc. Human cytokine as ligand of the zalpha receptor and uses thereof
JP4620253B2 (ja) 1999-03-22 2011-01-26 ノボザイムス，インコーポレイティド 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター
AU779869B2 (en) 1999-04-13 2005-02-17 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
CN1399681A (zh) * 1999-06-15 2003-02-26 基因特罗生物治疗公司 在细胞培养物中增强细胞因子产生的方法
DE60045931D1 (de) 1999-07-07 2011-06-16 Zymogenetics Inc Menschliches Rezeptor für Zytokine
EP2275559A3 (en) 1999-09-28 2011-03-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
IL149679A0 (en) * 1999-11-19 2002-11-10 Transkaryotic Therapies Inc Nucleic acid construct and methods utilizing the same
JP4800537B2 (ja) 1999-11-22 2011-10-26 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｚｓｉｇ３３によるペプチド−受容体複合体の形成方法
US8168178B2 (en) 1999-11-30 2012-05-01 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
US6951839B1 (en) 1999-11-30 2005-10-04 Curis, Inc. Methods and compositions for regulating lymphocyte activity
AU1647501A (en) 1999-12-10 2001-06-18 Cytos Biotechnology Ag Replicon based activation of endogenous genes
EP1242600B1 (en) 1999-12-23 2010-03-03 ZymoGenetics, Inc. Cytokine zcyto18
ES2311016T3 (es) 2000-01-10 2009-02-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Genes expresados diferencialmente en cancer de mama.
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
US6569681B1 (en) 2000-03-14 2003-05-27 Transkaryotic Therapies, Inc. Methods of improving homologous recombination
US20030084471A1 (en) 2000-03-16 2003-05-01 David Beach Methods and compositions for RNA interference
EP1728862A1 (en) 2000-03-16 2006-12-06 Genetica, Inc. Methods and compositions for RNA interference
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
US20030195707A1 (en) * 2000-05-25 2003-10-16 Schork Nicholas J Methods of dna marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
US20020077775A1 (en) * 2000-05-25 2002-06-20 Schork Nicholas J. Methods of DNA marker-based genetic analysis using estimated haplotype frequencies and uses thereof
EP1294949A4 (en) 2000-06-15 2004-08-25 Human Genome Sciences Inc HUMAN TUMORNESCROSE FACTOR DELTA AND EPSILON
GB0018876D0 (en) * 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
US6902734B2 (en) 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
UA81743C2 (uk) 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
US7138262B1 (en) 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
CA2420325A1 (en) 2000-08-25 2002-02-28 Basf Plant Science Gmbh Plant polynucleotides encoding novel prenyl proteases
US20020150541A1 (en) * 2000-09-12 2002-10-17 Gene Trol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
CA2422060A1 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Compositions comprising mixtures of human cytokines and methods of producing the same
US20030129162A1 (en) * 2000-09-12 2003-07-10 Lau Allan S. Compositions comprising mixtures of therapeutic proteins and methods of producing the same
US7381713B2 (en) * 2000-12-04 2008-06-03 Sioan-Kettering Institute For Cancer Research Treatment of cancer by reduction of intracellular energy and pyrimidines
EP1349555A4 (en) * 2000-12-04 2007-04-25 Sloan Kettering Inst Cancer TREATMENT OF CANCER BY REDUCING INTRA-CELLULAR ENERGY AND PYRIMIDINES
ATE505204T1 (de) 2000-12-20 2011-04-15 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
AU2002233230B2 (en) * 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2002059337A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Georgetown University School Of Medicine Anti-apoptopic gene scc-s2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
EP1366058B1 (en) 2001-02-09 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Human g-protein chemokine receptor (ccr5) hdgnr10
WO2002072790A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Myriad Genetics, Inc Tsg101-gag interaction and use thereof
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US7338771B2 (en) 2001-07-10 2008-03-04 Alexey Pronin Use of specific T2R taste receptors to identify compounds that block bitter taste
WO2002081640A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene shinc-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002305151A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002258728A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 Georgetown University Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2002081639A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 Georgetown University Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
AU2002257142B2 (en) 2001-04-13 2008-09-04 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
AU2002342613A1 (en) * 2001-05-09 2002-11-25 Geron Corporation Treatment for wounds
US7309783B2 (en) * 2001-05-09 2007-12-18 The University Of Connecticut Mammalian early developmental regulator gene
EP2293067B1 (en) 2001-06-26 2016-04-20 Senomyx, Inc. T1R hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
US6867189B2 (en) * 2001-07-26 2005-03-15 Genset S.A. Use of adipsin/complement factor D in the treatment of metabolic related disorders
CA2456821A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-13 Trinity Biomedical Technology Corporation Human zona pellucida proteins and methods of their use in diagnosing male infertility
US7285631B2 (en) * 2001-08-10 2007-10-23 Serono Genetics Institute S.A. Human cDNAs and proteins and uses thereof
US20050064587A1 (en) * 2001-09-07 2005-03-24 Lawrence Rosenberg Pancreatic small cells and uses thereof
KR20100120246A (ko) 2001-11-14 2010-11-12 센토코 오르토 바이오테크 인코포레이티드 항 ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
IL162134A0 (en) * 2001-11-28 2005-11-20 Genset Sa Human cDNAs and proteins, and uses thereof
US7247609B2 (en) * 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
ES2329666T3 (es) * 2001-12-19 2009-11-30 The University Of Chicago Proteinas fluorescentes de maduracion rapida y procedimientos de uso de las mismas.
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
EP1476541B1 (en) 2002-01-18 2008-07-16 ZymoGenetics, Inc. Cytokine (zcytor17 ligand)
AU2003244516A1 (en) 2002-02-07 2003-09-02 Novozymes Delta Limited Hiv inhibiting proteins
WO2003069984A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 American Integrated Biologics, Inc. Transgenic production in saliva
WO2003078619A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
US20100151556A1 (en) * 2002-03-15 2010-06-17 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
WO2009095742A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
US7244565B2 (en) * 2002-04-10 2007-07-17 Georgetown University Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US7138512B2 (en) * 2002-04-10 2006-11-21 Georgetown University Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof
US8148155B2 (en) 2002-04-22 2012-04-03 Novozymes, Inc. Methods for increasing homologous recombination of a nucleic acid sequence
ES2367257T3 (es) 2002-04-25 2011-10-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Tratamiento de deficit de alfa-galactosidasa a.
US20030228317A1 (en) * 2002-05-22 2003-12-11 Prafulla Gokhale Gene BRCC-1 and diagnostic and therapeutic uses thereof
WO2004009775A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Targacept, Inc. Methods and compositions relating to chimeric nicotinic receptor subunits
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
CN101497908B (zh) 2002-11-18 2014-05-21 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子变体
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
JP2006510357A (ja) * 2002-11-22 2006-03-30 ザ ジョーンズ ホプキンズ ユニバーシティ 認識障害の処置のための標的
JP4754219B2 (ja) * 2002-12-02 2011-08-24 アムジエン・フレモント・インコーポレイテツド 腫瘍壊死因子を対象とする抗体、およびそれらの使用
CA2508690A1 (en) * 2002-12-10 2004-06-24 Ottawa Health Research Institute Modulation of stem cell differentiation by modulation of caspase-3 activity
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
CA2802143C (en) 2003-01-14 2018-06-19 Dana-Farber Cancer Institute Sparc encoding polynucleotide as a cancer therapy sensitizer
US7259002B2 (en) * 2003-01-21 2007-08-21 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel acyl coenzyme A, monoacylglycerol acyltransferase-3 (MGAT3), and uses thereof
JP2006518372A (ja) 2003-01-28 2006-08-10 セレクティス 脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびその応用
NZ570201A (en) 2003-02-11 2011-03-31 Shire Human Genetic Therapies Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (fge)
WO2004098634A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Government Of The United States Of America As Represented By The Sercretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Protein arginine n-methyltransferase 2 (prmt-2)
US20060252120A1 (en) * 2003-05-09 2006-11-09 Kieliszewski Marcia J Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
WO2004111194A2 (en) * 2003-06-11 2004-12-23 Biogen Idec Ma Inc. Method to increase protein production in culture
NZ545747A (en) 2003-08-06 2010-06-25 Senomyx Inc T1R hetero-oligomeric taste receptors, cell lines that express said receptors, and taste compounds
US11311574B2 (en) 2003-08-08 2022-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
RU2006114432A (ru) * 2003-09-30 2007-11-20 Лексикон Дженетикс Инкорпорейтед (Us) Способы и композиции для определения функции гена
US20050148512A1 (en) * 2003-11-10 2005-07-07 Angiotech International Ag Medical implants and fibrosis-inducing agents
WO2005052140A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament and uses thereof
ES2380022T3 (es) * 2003-12-03 2012-05-07 Monika KRÖZ Proteínas de fusión a interleucina-11
EP1696947B1 (en) * 2003-12-19 2014-02-26 F.Hoffmann-La Roche Ag Use of erythropoietin in the treatment of disturbances of iron distribution in chronic inflammatory intestinal diseases
EP2133427B1 (en) * 2004-01-14 2013-12-11 Ohio University Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby
US7250298B2 (en) * 2004-04-07 2007-07-31 The University Of Chicago Monomeric red fluorescent proteins
EP1751177A4 (en) 2004-04-19 2008-07-16 Univ Ohio NETWORKABLE GLYCOPROTEINS AND METHOD FOR THEIR PRODUCTION
JP2008500362A (ja) * 2004-05-26 2008-01-10 ウィスコンシン・アラムナイ・リサーチ・ファウンデイション Ｍａｇｅ遺伝子の発現もしくはその作用を阻害するガンの治療方法
WO2006017673A2 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Biogen Idec Ma Inc. Taj in neuronal function
CA2579677A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1828244A2 (en) * 2004-12-22 2007-09-05 Kuros Biosurgery AG Michael-type addition reaction functionalised peg hydrogels with factor xiiia incorporated biofactors
EP2298888A1 (en) 2004-12-30 2011-03-23 Agency for Science, Technology and Research Chinese hamster apoptosis-related genes
WO2006073711A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Kuros Biosurgery Ag Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
ES2593051T3 (es) * 2005-01-06 2016-12-05 Kuros Biosurgery Ag Matrices suplementadas para la reparación de fracturas óseas
EP2428563A1 (en) 2005-02-10 2012-03-14 Regents Of The University Of Minnesota Vascular/lymphatic endothelial cells
US20060194740A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Ulevitch Richard J NOD1 as an anti-tumor agent
US20060234973A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Kevin Fitzgerald Transcription factor RNA interference reagents and methods of use thereof
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
US20070011752A1 (en) * 2005-05-06 2007-01-11 American Integrated Biologics, Inc. Production of human proteins in transgenic animal saliva
JP2008544746A (ja) 2005-05-12 2008-12-11 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 免疫応答を調節するための組成物および方法
EP1896073B1 (en) 2005-06-30 2013-03-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-il-23 antibodies, compositions, methods and uses
US7482124B2 (en) * 2005-07-08 2009-01-27 Bristol-Myers Squibb Company Method of identifying a PPARgamma-agonist compound having a decreased likelihood of inducing dose-dependent peripheral edema
WO2007008708A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Ohio University Methods of predicting hyp-glycosylation sites for proteins expressed and secreted in plant cells, and related methods and products
US20070202512A1 (en) * 2005-08-19 2007-08-30 Bristol-Myers Squibb Company Human single nucleotide polymorphisms associated with dose-dependent weight gain and methods of use thereof
WO2007030820A2 (en) 2005-09-09 2007-03-15 The Johns Hopkins University Manipulation of regulatory t cell and dc function by targeting neuritin gene using antibodies, agonists and antagonists
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
KR20140077946A (ko) 2005-10-13 2014-06-24 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 자가항체 양성 질환 환자의 치료에 유용한 방법 및 조성물
EP1937718B1 (en) 2005-10-20 2017-12-06 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
WO2007060495A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
US7749704B2 (en) 2005-11-01 2010-07-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Promoter polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods
JP2009514535A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 レッドポイント バイオ コーポレイション Ｔｒｐｍ５イオンチャネルのためのハイスループットスクリーニングアッセイ
ES2517420T3 (es) 2005-12-29 2014-11-03 Janssen Biotech, Inc. Anticuerpos anti-IL-23 humanos, composiciones, procedimientos y usos
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
EP1986612B1 (en) 2006-02-07 2012-09-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stabilized composition of glucocerebrosidase
EP2007877B1 (en) 2006-02-28 2013-04-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for compact aggregation of dermal cells
DK2004683T3 (en) * 2006-03-24 2016-08-22 Biogen Hemophilia Inc PC5 AS A FACTOR IX PROPEPTID PROCESSING ENZYM
KR101387563B1 (ko) 2006-04-21 2014-04-25 세노믹스, 인코포레이티드 고효능의 조미용 향료를 포함하는 식품 조성물 및 이의 제조 방법
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
PT2054074E (pt) * 2006-08-04 2014-11-07 Prolong Pharmaceuticals Llc Eritropoietina modificada
JP5256199B2 (ja) * 2006-08-07 2013-08-07 テヴァ バイオファーマシューティカルズ ユーエスエー，インコーポレーティッド アルブミン−インスリン融合タンパク質
JP2008044926A (ja) * 2006-08-14 2008-02-28 Trustees Of Columbia Univ In The City Of New York Ｗｎｔ信号伝達に関係した分泌タンパク質
KR101248252B1 (ko) 2006-11-28 2013-03-27 한올바이오파마주식회사 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도
WO2008116116A2 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
US20080234194A1 (en) * 2007-03-20 2008-09-25 Harold Brem Growth factor mediated cosmeceuticals and use thereof to enhance skin quality
JP2010523243A (ja) 2007-04-13 2010-07-15 クロス・バイオサージェリー・アクチェンゲゼルシャフト 高分子組織シーラント
PT2137655E (pt) 2007-04-16 2012-09-14 Momenta Pharmaceuticals Inc Produtos de glicoproteína definidos e métodos relacionados
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2182943B1 (en) 2007-07-23 2016-10-26 Janssen Biotech, Inc. Methods and compositions for treating fibrosis related disorders using il-17 antagonists
NZ583350A (en) 2007-08-21 2012-03-30 Senomyx Inc Heteroaryl-hydantoin derivatives as bitter taste inhibitors
US8679749B2 (en) * 2007-11-01 2014-03-25 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
US8003325B2 (en) * 2007-11-30 2011-08-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Polymorphisms of the BLyS gene and use in diagnostic methods
CA2710798A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
WO2009089380A2 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for p2ry5 mediated regulation of hair growth and mutants thereof
CN102083969A (zh) 2008-05-06 2011-06-01 乔斯林糖尿病中心股份有限公司 诱导褐色脂肪形成的方法和组合物
US8563697B2 (en) 2008-08-14 2013-10-22 Cephalon Australia Pty. Ltd. Anti-IL-12/IL-23 antibodies
US8278419B2 (en) 2008-10-31 2012-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
DK2396011T3 (en) 2009-02-12 2016-04-25 Janssen Biotech Inc Fibronectin TYPE III DOMAIN-BASED SCAFFOLD COMPOSITIONS, METHODS AND USES
WO2011006204A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Newsouth Innovations Pty Limited Method of providing agents to the cochlea
NZ713967A (en) 2009-07-28 2017-01-27 Shire Human Genetic Therapies Compositions and methods for treating gaucher disease
LT3482767T (lt) * 2009-08-28 2022-01-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Didinamos dozės fermentų pakaitinė terapija, skirta rūgštinės sfingomielinazės nepakankamumui gydyti
US8883739B2 (en) 2010-01-19 2014-11-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
WO2011123507A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Centocor Ortho Biotech Inc. Humanized il-25 antibodies
KR101578586B1 (ko) 2010-09-14 2015-12-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 Peg화된 에리트로포이에틴의 정제 방법
WO2012061537A2 (en) 2010-11-02 2012-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
WO2012075151A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Novozymes, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell
US9862928B2 (en) 2010-12-03 2018-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Generation of natural killer cells and lymphoid tissue inducer-like (LTi-like) NK-22 cells
EP2649419B1 (en) 2010-12-07 2020-05-20 Vnomics Corp. System for measuring and reducing vehicle fuel waste
US9284588B2 (en) 2010-12-16 2016-03-15 Novozymes, Inc. Promoters for expressing genes in a fungal cell
CA2823044C (en) 2010-12-31 2022-08-16 Jay M. Short Express humanization of antibodies
WO2012101671A1 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
AU2012222833B2 (en) 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
WO2012123028A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Kuros Biosurgery Ag Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion
RU2495933C2 (ru) * 2011-05-30 2013-10-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТКАНЕВОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ТАП) ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia, - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ) ИЛИ [-1]МЕТИОНИЛ-ФРАГМЕНТ ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), ПРЕДШЕСТВЕННИК РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФРАГМЕНТА ТАП ЧЕЛОВЕКА (РЕТЕПЛАЗЫ)
WO2013013017A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modifying the glycosylation of lysosomal storage disorder therapeutics
CA2865614A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Compositions and methods for treating type iii gaucher disease
WO2013177287A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 Georgia Regents University Methods and vectors for gene targeting with inducible specific expression
JP6498601B2 (ja) 2012-07-13 2019-04-10 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロ多量体足場設計および構築物
WO2014016873A1 (en) 2012-07-26 2014-01-30 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human alpha-galactosidase a
CN103864913A (zh) 2012-12-18 2014-06-18 联亚生技开发股份有限公司 重组蛋白
EP2769732A1 (en) 2013-02-22 2014-08-27 Sanofi Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
US20160002316A1 (en) 2013-02-22 2016-01-07 Joslin Diabetes Center Serpins: methods of therapeutic beta-cell regeneration and function
EP2851086A1 (en) 2013-09-20 2015-03-25 Sanofi Serpins: methods of therapeutic ß-cell regeneration and function
EP2970420A4 (en) 2013-03-15 2016-08-17 Apotex Inc STABILITY OF THE ENHANCED LIQUID FORMULATION OF ERYTHROPOIETIN ALPHA VIA A PURIFICATION TREATMENT
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
EP2994164B1 (en) 2013-05-08 2020-08-05 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
US11013917B2 (en) 2013-06-21 2021-05-25 Newsouth Innovations Pty Limited Method and apparatus for close-field electroporation
US11306328B2 (en) * 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2016116966A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
WO2017044807A2 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
CA2999277A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Surface Oncology, Inc. Anti-cd47 antibodies and methods of use
US10188750B1 (en) 2015-10-23 2019-01-29 University Of South Florida Self-replicating cell selective gene delivery compositions, methods, and uses thereof
WO2017079202A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of cd40 activation and immune checkpoint blockade
AU2017241776A1 (en) 2016-03-29 2018-10-11 Janssen Biotech, Inc. Treating psoriasis with increased interval dosing of anti-IL12 and/or -23 antibody
CN109715670A (zh) 2016-07-15 2019-05-03 波赛达治疗公司 对muc1特异性的嵌合抗原受体(car)及其使用方法
JP2019524721A (ja) 2016-07-15 2019-09-05 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド キメラ抗原受容体および使用方法
KR20220158870A (ko) 2016-07-15 2022-12-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
EP3519561A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
US20180094052A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Janssen Biotech, Inc. Safe and Effective Method of Treating Psoriasis with Anti-IL23 Specific Antibody
WO2018068022A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Poseida Therapeutics, Inc. Inducible caspases and methods for use
MA46861A (fr) 2016-11-16 2019-09-25 Janssen Biotech Inc Procédé de traitement du psoriasis avec un anticorps anti-il-23 spécifique
KR20240038146A (ko) 2017-01-30 2024-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 건선성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
WO2018147915A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
IL269203B1 (en) 2017-03-13 2024-05-01 Poseida Therapeutics Inc Preparations and methods for the selective elimination and replacement of hematopoietic stem cells
CN111727256A (zh) 2017-09-08 2020-09-29 波赛达治疗公司 用于嵌合配体受体（clr）-介导的条件性基因表达的组合物和方法
TW201922780A (zh) 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same
MX2020005463A (es) 2017-12-01 2020-09-07 Seattle Genetics Inc Anticuerpos anti grupo de diferenciacion 47 (anti-cd47) y sus usos para tratar cancer.
WO2019126574A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Vcar compositions and methods for use
WO2019129877A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
JP7137625B2 (ja) 2017-12-29 2022-09-14 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法
ES2909454T3 (es) 2017-12-29 2022-05-06 Hoffmann La Roche Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
JP2021515770A (ja) 2018-03-05 2021-06-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ−２３特異的抗体を用いたクローン病の治療方法
WO2019173636A1 (en) 2018-03-07 2019-09-12 Poseida Therapeutics, Inc. Cartyrin compositions and methods for use
SG11202010019YA (en) 2018-04-20 2020-11-27 Janssen Biotech Inc Transition analysis method for chromatography column qualification
WO2020016838A2 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Janssen Biotech, Inc. Sustained response predictors after treatment with anti-il23 specific antibody
CA3111384A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
FI3883606T3 (fi) 2018-09-24 2023-09-07 Janssen Biotech Inc Turvallinen ja tehokas menetelmä haavaisen paksusuolitulehduksen hoitamiseksi anti-il12/il23-vasta-aineella
BR112021009287A2 (pt) 2018-11-20 2021-10-26 Janssen Biotech, Inc. Método seguro e eficaz para tratar psoríase com anticorpo específico anti-il-23
US20200197517A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Janssen Biotech, Inc. Safe and Effective Method of Treating Lupus with Anti-IL12/IL23 Antibody
EP3898993A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Poseida Therapeutics, Inc. Nanotransposon compositions and methods of use
AU2020208828A1 (en) 2019-01-15 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibody compositions and methods for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
EA202192038A1 (ru) 2019-01-23 2021-10-05 Янссен Байотек, Инк. Композиции антител к фно для применения в способах лечения псориатического артрита
EP3938384A4 (en) 2019-03-14 2022-12-28 Janssen Biotech, Inc. METHODS OF MANUFACTURING FOR PRODUCING ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY COMPOSITIONS
US20220153830A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
CN113840837A (zh) 2019-03-14 2021-12-24 詹森生物科技公司 用于产生抗tnf抗体组合物的方法
WO2020183270A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
WO2020188466A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis in pediatric subjects with anti-il12/il23 antibody
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
CN113939531A (zh) 2019-06-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
KR20220030952A (ko) 2019-06-03 2022-03-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 강직성 척추염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
US20220233709A1 (en) 2019-06-05 2022-07-28 Seagen Inc. Masked Antibody Formulations
US20220306727A1 (en) 2019-06-05 2022-09-29 Seagen Inc. Methods of Purifying Masked Antibodies
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
CN115551530A (zh) 2019-08-27 2022-12-30 通尼克斯制药有限公司 经修饰的tff2多肽
EP4025593A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
WO2021127505A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-muc1 compositions and methods of use
WO2021178707A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of metabolic liver disorders
US20230121433A1 (en) 2020-03-11 2023-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
CN115996747A (zh) 2020-04-14 2023-04-21 波赛达治疗公司 用于治疗癌症的组合物和方法
US20240000969A1 (en) 2020-10-21 2024-01-04 Poseida Therapeutics San Diego Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
AU2022227607A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
US20240060090A1 (en) 2021-02-23 2024-02-22 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
WO2022187671A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of hemophilia
CN117751138A (zh) 2021-03-12 2024-03-22 詹森生物科技公司 用抗il23特异性抗体治疗银屑病关节炎的安全且有效的方法
KR20230156764A (ko) 2021-03-12 2023-11-14 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-il23 특이적 항체에 의해 tnf 요법에 부적절한 반응을 보이는 건선성 관절염 환자를 치료하는 방법
EP4367138A1 (en) 2021-07-09 2024-05-15 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-il12/il23 antibody compositions
US20230042465A1 (en) 2021-07-09 2023-02-09 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
KR20240034218A (ko) 2021-07-09 2024-03-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물을 생산하기 위한 제조 방법
EP4370211A1 (en) 2021-07-14 2024-05-22 Seagen Inc. Antibody masking domains
WO2023049825A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Seagen Inc. Improved antibody masking domains
WO2023060088A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
AU2022358729A1 (en) 2021-10-04 2024-04-11 Poseida Therapeutics, Inc. Transposases and uses thereof
WO2023073615A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating crohn's disease with anti-il23 specific antibody
US20230151087A1 (en) 2021-11-15 2023-05-18 Janssen Biotech, Inc. Methods of Treating Crohn's Disease with Anti-IL23 Specific Antibody
US20230159633A1 (en) 2021-11-23 2023-05-25 Janssen Biotech, Inc. Method of Treating Ulcerative Colitis with Anti-IL23 Specific Antibody
WO2023141576A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2023164573A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified cells and methods of use thereof
WO2023223265A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Janssen Biotech, Inc. Method for evaluating and treating psoriatic arthritis with il23 antibody
WO2024036273A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric cd8-alpha co-receptor compositions and methods of use
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4656134A (en) * 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
AU572108B2 (en) * 1983-01-19 1988-05-05 Genentech Inc. Human tpa production using vectors coding for dhfr protein
US4680174A (en) * 1984-05-24 1987-07-14 Damon Biotech, Inc. Induction of immune response by immunization with encapsulated antigen-producing cells
US4822736A (en) * 1984-07-05 1989-04-18 Baylor College Of Medicine Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin
ATE68013T1 (de) * 1985-07-05 1991-10-15 Whitehead Biomedical Inst Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen.
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
GB8615942D0 (en) * 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
CA1341356C (en) * 1987-05-01 2002-04-09 Richard F. Selden Transkaryotic implantation
GB8718779D0 (en) * 1987-08-07 1987-09-16 Grosveld F G Dna sequence & expression vector
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5043270A (en) * 1989-03-31 1991-08-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intronic overexpression vectors
DK0478696T3 (da) * 1989-06-23 1995-06-26 Us Health Effektiv fremgangsmåde til identificerbar udtrykkelse af ikke-selekterbare gener
ES2127458T3 (es) * 1989-11-06 1999-04-16 Cell Genesys Inc Produccion de proteinas utilizando recombinacion homologa.
CA2071989C (en) * 1989-12-22 1999-07-27 Scott C. Chappel Endogenous gene expression modification with regulatory element
US5272071A (en) * 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
HUT60523A (en) * 1990-02-22 1992-09-28 Biogen Inc Improved process for expressing polypeptides
IT1241123B (it) * 1990-04-19 1993-12-29 Consiglio Nazionale Ricerche Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali,loro preparazione e loro impiego
EP0535144A4 (en) * 1990-06-12 1993-08-11 Baylor College Of Medicine Method for homologous recombination in animal and plant cells
CA2090473A1 (en) * 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
DE69128037T2 (de) * 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
CA2097803C (en) * 1990-12-07 2010-08-03 Lonnie O. Ingram Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
KR100259933B1 (ko) * 1991-05-06 2000-06-15 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 게놈 엘리먼트를 이용한 유전자 조작 및 발현방법
AU664847B2 (en) * 1991-05-15 1995-12-07 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous DNA targeting
WO1993004169A1 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
MX9305183A (es) * 1992-08-27 1994-05-31 Us Agriculture Intron portatil, molecula de adn genomico viral, virus vivo y vacuna que los contiene y metodo para su obtencion.
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery

Also Published As

Publication number Publication date
FI964536A0 (fi) 1996-11-12
MX9605542A (es) 1998-05-31
FI964536A (fi) 1997-01-09
US5641670A (en) 1997-06-24
CA2190289A1 (en) 1995-11-23
JPH10500570A (ja) 1998-01-20
CZ325896A3 (en) 1997-12-17
NO964802L (no) 1997-01-09
KR970703429A (ko) 1997-07-03
EP0759082A1 (en) 1997-02-26
AU2550495A (en) 1995-12-05
AU709058B2 (en) 1999-08-19
KR100379356B1 (ko) 2003-06-09
HU9603144D0 (en) 1997-01-28
CZ295115B6 (cs) 2005-05-18
ZA953879B (en) 1996-01-18
BR9507874A (pt) 1997-08-19
IL113708A0 (en) 1995-08-31
NO964802D0 (no) 1996-11-12
NZ285945A (en) 1998-03-25
WO1995031560A1 (en) 1995-11-23
RU2267533C2 (ru) 2006-01-10
HUT76844A (en) 1997-11-28
SK146196A3 (en) 1998-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA34493C2 (uk) Спосіб одержання гомологічно рекомбінантної клітини (варіанти), плазміда для використання у способі (варіанти), штам гомологічно рекомбінантних клітин фібросаркоми людини (варіанти), спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти)
US5968502A (en) Protein production and protein delivery
EP0672160B1 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
US6063630A (en) Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
EP0750044B1 (en) DNA constructs and transfection of cells therewith for homologous recombination
JP2023075263A (ja) 人工組換え染色体およびその使用
JP2003510072A (ja) 遺伝子発現を改変するための組成物および方法
EA020311B1 (ru) Вектор на основе искусственной хромосомы
US20050129669A1 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
US10717991B2 (en) Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof
US20030110524A1 (en) Transgenic organisms and their uses
KR20180121748A (ko) ＨＯ-1 유전자 및 ＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자 및 CMAH 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도
AU726446B2 (en) Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination
AU738395B2 (en) DNA construct for effecting homologous recombination and uses thereof
AU4734199A (en) Transfection of vertebrate cells e.g. by homologous recombination