JP4800537B2 - Zsig33によるペプチド−受容体複合体の形成方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
栄養恒常性の維持にとって重要な多くの制御ペプチドが胃腸管環境内に見いだされている。これらペプチドは消化系にて合成され局所的に作用するが、同時に脳内でも同様に作用することができる。さらに逆、即ちペプチドは脳内で合成されるが胃腸管内の細胞を制御することも見いだされている。この減少は“脳-胃軸"と呼ばれており、満腹感の伝達や体温調整、および脳と胃の間のフィードバックを必要とするその他の生理学的プロセスにとって重要である。
【0002】
ガストリン、コレシストキニン(CCK)、セクレチン、胃抑制ペプチド(GIP)、血管作用性小腸ペプチド(VIP)、モチリン、ソマトスタチン、膵臓ペプチド(PP)、サブスタンスPおよび神経ペプチドY(NPY)を含む胃ペプチドホルモンは複数の異なる作用機序を利用している。例えばガスとリン、モチリンおよびCCKは内分泌-および神経分泌-型ホルモンとして機能する。ガストリンおよびGIPといったその他のものは内分泌性にのみ作用すると考えられている。
【0003】
その他の作用様式としては、内分泌性、神経分泌性およびパラクリン性の作用の組合せ(例えばソマトスタチン)、神経分泌作用のみ(例えばNPY)や神経分泌とパラクリン作用との組合せ(例えばVIPやサブスタンスP)が挙げられる。胃ホルモンの多くは膜結合受容体を開始伝達され、第2メッセンジャー系により促進される。胃ペプチドのレビューについては、Mulvihillら、Basic and Clinical Endocrinology,pp.551-570、第四版、Greenspan F.SとBaxter、J.D編集、Appleton&Lange、Norwalk、Connecticut、1994を参照せよ。
【0004】
これら胃ペプチドの多くは、活性化されるには複数のペプチド切断を必要とする不活性な前駆体分子として合成される。VIP、ガストリン、セクレチン、モチリン、グルカゴンおよびガラニンを含む「グルカゴン-セクレチン」ファミリーとして知られるファミリーは、複数の切断と翻訳後修飾により制御されるペプチドを例示する。
【0005】
モチリンは哺乳動物種の胃組織内に見いだされた22アミノ酸ペプチドである(Domschke、W.、Digestive Dlseases 22(5):454-461、1977)。ブタのプレモチリンのDNAおよびアミノ酸の配列が特定されている(米国特許第5,006,469号)。モチリンは胃の運動を増加させること、ペプシン分泌を促進して胃の分泌機能に影響すること(Brownら、Canadian J.of Physiol.Pharmacol.49:399-405、1971)ができる因子として特長付けされており、最近では胃および小腸の筋電気性制御に役割を持つことが実証されている。
【0006】
モチリンの周期的増加は消化中の筋電気コンプレックスの第III相および十二指腸の空腹時の収縮と関連付けられている(Cheyら、Gut Hormones内、(編集)Bloom、S.R.、pp.355-358、Edinburgh、Churchill Livingstone、1978;Leeら、Am.J.Digestive Diseases、23:789-795、1978;およびItohら、Am.J.Digestive Diseases、23:929-935、1978)。モチリンおよびモチリン類似体については、胃腸管平滑筋は収縮させるがその他のタイプの平滑筋については収縮させないことが示されている(Strunzら、Gastroenterology 68:1485-1491、1975)。
【0007】
胃ホルモンについて証明されている臨床有用性に関する見解では、当業界では更なるこれら分子について、治療薬および研究用手段や試薬の両方としての使用について需要がある。胃ホルモンは研究室では発生学的プロセスを研究するために、そして研究所や産業界では細胞培養基の成分として使用されている。
【0008】
発明の概要
これらおよびその他発明の側面は、以下の発明の詳細な説明を参照することで明らかになるだろう。
発明の1側面では、可逆性ペプチド-受容体複合体を形成すること;固定化受容体を提供すること、およびペプチドと受容体とを接触させることに関する方法が提供されるが、前記ペプチドは配列番号2の残基24ないし37を含む。方法の実施態様の一つでは、受容体はGHS-Rである。方法の更なる実施態様では配列番号5の残基41ないし326を含む。方法の別実施態様では配列番号5の残基1ないし366を含む。方法の別の実施態様では、受容体は細胞膜上に固定されている。
【0009】
別の側面では、発明は配列番号2の残基24ないし37を含むペプチドを固定すること;ペプチドを受容体を発現している細胞に接触させ、それによりペプチドは受容体と結合しペプチド-受容体複合体を形成すること;ペプチド-受容体複合体を緩衝液で洗浄し未結合受容体を取り除くこと;ペプチド-受容体複合体を解離させること;および精製された受容体-発現細胞を回収することを含む、細胞をより分ける方法を提供する。方法の実施態様の一つでは、受容体はGHS-Rである。方法の更なる実施態様では配列番号5の残基41ないし326を含む。
【0010】
発明の別の側面では、配列番号5の残基41ないし326を含む受容体を発現している細胞を固定すること;固定化した細胞に、配列番号2の残基24ないし37を含むペプチドを含む溶液と接触させること;それによりペプチドは受容体と結合し、ペプチド-受容体複合体を形成すること;ペプチド-受容体複合体を緩衝液で洗浄し未結合ペプチドを取り除くこと;ペプチド-受容体複合体を解離させること;および精製されたペプチドを回収することを含む、ペプチド精製方法を提供する。
【0011】
発明の別の側面では、固定化された受容体を提供すること;受容体と配列番号2の残基24ないし37を含むペプチドとを接触させること;それによりペプチドと受容体がペプチド-授与対複合体を形成すること;およびそれによりシグナルが細胞内に伝達されることを含む、受容体を発現している細胞内のシグナル伝達をシミュレーションする方法を提供する。
発明の別の側面では、配列番号2の残基24ないし37を含むペプチドを細胞に投与すること;および細胞により発現される受容体とペプチド-受容体複合体を形成することを含む、インビトロまたはインビボに於ける細胞内でのホルモン分泌を変更する方法を提供する。
別の側面では、発明は配列番号2の残基24ないし37を含むペプチドを、それを必要とする患者に投与すること;およびペプチド-受容体複合体を形成することを含む神経発生および/または利用を変更する方法を提供する。
【0012】
発明の詳細な説明
発明を詳細する前に、以下の用語について定義することは、その発明の理解に役立つだろう。
ここでは用語“アフィニティータグ"は、第2ポリペプチドに結合させることができ、第2ポリペプチドの精製を提供するか、または基質への第2ポリペプチドの結合に関する部位を提供するポリペプチドセグメントを表すために用いられる。原則的には、抗体またはその他特異的結合作用物質が利用できるペプチドまたは蛋白質はアフィニティータグとして利用することができる。
【0013】
アフィニティータグとしては、ポリ-ヒスチジントラクト、プロテインA(Nilssonら、EMBO J.4:1075、1985;Nilssonら、Methods Enzymol。198:3、1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(SmithとJohnson、Gene 67:31,1988)、Glu-Gluアフィニティータグ(Grussenmeyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952-4、1985)(配列番号x)、サブスタンスP、FlagTMペプチド(Hoppら、Biotechnology 6:1204-1210、1988)、ストレプトアビジン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質(Guanら、Gene 67:21-30、1987)、セルロース結合蛋白質、チオレドキシン、ユビキチン、T7ポリメラーゼまたはその他抗原性エピトープまたは結合ドメインが含まれる。一般にはFordら、Protein Expression and Purification 2:95-107、1991を参照せよ。
【0014】
DNAコードアフィニティータグおよびその他試薬は市販されている(例えばファルマシアバオテク(Pharmacia Biotech)、ピスキャタウェイ(Psicataway)、ニュージャージー州;ニューイングランドバイオラブス(New England Biolabs)、バヴァリー(Beverly)、マサチューセッツ州;イーストマンコダック(Eastman Kodak)、ニューへブン(New Haven)、コネチカット州)。
【0015】
用語“アミノ末端"および“カルボキシル末端"はここではポリペプチド内の位置を表すのに用いられている。文脈が許す場合には、これら用語はポリペプチドの特定の配列または部分を参照し近接位置または相対位置を表すことに用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定配列は、参照配列のカルボキシル末端近傍に位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端にある必要はない。
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体"は、相補的塩基配列を有し、参照配列に対し逆方向であるポリヌクレオチド分子である。例えば配列5‘ATGCACGGG3'は5‘CCCGTGCAT3'に相補的である。
【0016】
用語“縮重ヌクレオチド配列"は、1以上の縮重コドン(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドと比較して)を含む、ヌクレオチドの配列を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同一アミノ酸残基をコードする(即ちGAUとCACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
用語“発現ベクター"は、その転写の為に提供された付加セグメントに作動性に結合した所望ポリペプチドをコードしているセグメントを含む、直鎖状または環状のDNA分子を表すのに用いられる。この様な付加セグメントには、プロモーターおよびターミネーター配列が含まれ、さらに1以上の複製開始点、1以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニレーションシグナル等も含む。発現ベクターは一般にはプラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、またはこの両方の要素を含む。
【0017】
用語“単離された"は、ポリヌクレオチドについて使用される場合には、天延の遺伝環境より取り出されたポリヌクレオチド、即ちその他外来性または不要のコーディング配列を持たない、遺伝子工学による蛋白質生産システム内での使用に好適な形をしたポリヌクレオチドを表す。この様な単離された分子は、それらの天然環境より分離された分子であり、そしてcDNAおよびゲノミッククローンを含む。本発明の単離DNA分子は、本来それらに結合している他遺伝子を持たないが、しかしプロモーターおよびターミネーターの様な天然に生ずる5‘および3'非翻訳領域を含むだろう。附属領域を特定することは、当業者にとって明らかである(例えばDynanとTijan、Nature 316:774-78、1985参照)。
【0018】
“単離された"ポリペプチドまたは蛋白質は、血液や動物組織から分離された様な、その本来の環境以外の条件下に見いだされるポリペプチドまたは蛋白質である。好ましい形状では、単離ポリペプチドはその他ポリペプチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを実質含まない。高度に精製された形状、即ち95%より高い純度、より好ましくは99%より高い純度のポリペプチドを提供することが好ましい。この関係で使用する場合、用語“単離された"は、ダイマーまたは別にグリコシル化あるいはその他誘導体の様な別の物理形状にある同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【0019】
“作用可能に結合した"とは、2以上の成分がそれら本来の目的に関し協調して機能する様に一つに結合されることを意味する。DNAセグメントに用いられた場合には、この句は例えばコーディング配列が正確な読み取り枠内に結合され、転写がプロモーター内にて開始し、コーディングセグメントを通りターミネーターまで進むことを示す。ポリペプチドに用いられる場合、“作動性に結合する"には配列の所望機能が保持される様な、共有結合(例えばジスルフィド結合)および非共有結合(例えば水素結合、疎水相互作用、または塩橋相互作用)配列の両方が含まれる。
【0020】
用語“オルトログ"または“種ホモログ"とは、異なる種に由来するポリペプチドまたは蛋白質の機能的対応体である、ある種より得たポリペプチドまたは蛋白質を表す。オルトログ間の配列差は種分化の結果である。
“パラログ"は生物により作られる、異なっているが構造的に関連した蛋白質である。パラログは遺伝子重複を通し生じると信じられている。例えばα-グロビン、β-グロビンおよびミオグロビンは相互にパラログである。
“ペプチド-受容体複合体"はペプチドまたはリガンドが受容体に結合して形成され、受容体の特性に変化を生じる。この変化が細胞機能に変化をもたらす、または別のペプチドに対する受容体の結合を不能にする一連の連続する反応を開始させる。ペプチド-受容体複合体の形成は可逆的であろう。
【0021】
“ポリヌクレオチド"は5‘から3'末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖-または二重鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドにはRNAおよびDNAが含まれ、天然資源より単離されても、インビトロで合成されても、あるいは天然および合成分子の組合せより調製されてもよい。ポリヌクレオチドの大きさは塩基対(“bp"と略される)、ヌクレオチド(“nt")またはキロベース(“kb")として表現される。
【0022】
文脈がゆるす場合には、後者2用語は単鎖または二重鎖であるポリヌクレオチドを表す。この用語を二重鎖分子に使用する場合、それは全長を表すために用いられ、用語“塩基対"に等しいと理解されるだろう。二重鎖ポリヌクレオチドの2本の鎖は長さが若干異なってもよく、酵素切断の結果として段違いになってもよいこと;即ち二重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドがペアを形成しなくともよいことが当業者に理解されるだろう。
【0023】
“ポリペプチド"は、天然または合成的に産生された、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマーである。10アミノ酸残基より短いポリペプチドは通常“ペプチド"と呼ばれる。
用語“プロモーター"はここでは、当分野慣用の意味として用いられ、RNAポリメラーゼの結合および転写開始の為のDNA配列を含む遺伝子部分を表す。
“蛋白質"は1以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。蛋白質はまた炭水化物基の様な非ペプチド性成分も含む。炭水化物およびその他非ペプチド性置換体は、蛋白質を産生する細胞により蛋白質に加えられるが、それらは細胞のタイプにより様々であろう。ここでは蛋白質はそれらのアミノ酸主鎖構造により規定される;一般に炭水化物基の様な置換体は、存在はするものの、その存在は特異的でない。
【0024】
用語“受容体"は生物活性分子(即ちリガンド)と結合し、細胞上のリガンドに作用を伝達する細胞結合蛋白質を意味する。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメインおよび一般にシグナル伝達に関係している細胞内エフェクタードメインを含む複数のドメインまたは複数のペプチド構造を特長とする。受容体へのリガンドの結合は受容体内に立体構造変化をもたらし、これがエフェクタードメインと細胞内のその他分子間の相互作用を引き起こす。次にこの相互作用は細胞の代謝に変化をもたらす。
【0025】
受容体-リガンド相互作用に関係する代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生増加、細胞カルシウム代謝、膜脂質の可動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解およびリン脂質の加水分解が含まれる。一般に受容体は膜に結合しているか、細胞室内または核にあり、単量体(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン性受容体)または多量体(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポイエチン受容体およびIL-6受容体)である。
【0026】
用語“分泌性シグナル配列"は、大型ポリペプチド成分として、それが合成された細胞の分泌経路を通り大型ポリペプチドに方向付けするポリペプチド(“分泌ペプチド")をコードしているDNA配列を表す。大型ポリペプチドは通常分泌経路通過中に切断され、分泌シグナルが除かれる。
“セグメント"は特定の属性を有する大型分子(例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド)の一部である。例えば特定ポリペプチドをコードしているDNAセグメントは、プラスミドまたはプラスミドの様なより長いDNA分子の一部であり、それは5‘から3'方向に読まれた時に特定ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしている。
【0027】
用語“スプライス変異体"はここでは遺伝子から転写されたRNAの別の形を表すのに用いられる。スプライス変異は天然には転写RNA分子内にある、または一般的ではないが別々に転写されたRNA分子間にある別のスプライシング部位を用いることで生じ、その結果同一遺伝子から複数のmRNAが転写される。スプライス変異体は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。ここでは用語スプライス変異体は、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変異体によりコードされた蛋白質を表すのにも用いられる。
不正確な分析方法(例えばゲル電気泳動)により決定されたポリマーの分子量および長さは、およその値であると理解されるだろう。この様な値は“約"Xまたは“およそ"Xとして表現され、Xの表示値の正確性は±10%であると理解される。
【0028】
ここに引用される全ての参考資料は、その全体が参照され取り込まれている。
本発明は従来報告の分泌蛋白質、zsig33(Sheppard、P.O.WO98/42840:1998)および受容体、GHS-R(Howard、A.D.ら、Science 273:974-977、1996)を用いたペプチド-受容体複合体を形成する新規方法を目的とする。本発明はまた前記ペプチドおよび受容体の限定数の変異体を目的ともしている。ペプチド-受容体複合体を形成する本新規方法の発見は、体がその栄養恒常性を維持する方法をさらに明らかにするため、そしてそれらプロセスに介入する治療薬の開発にとって、そしてここの教示より明らかになるその他利用に関し重要である。
【0029】
本発明はzsig33として知られる前記分泌ポリペプチド(Sheppard、P.O.,WO98/42840)がGHS-Rとして知られる(Feighner、S.Dら、Science 284:2184-2188、1999)オーファン(稀用)受容体のペプチドリガンドとして同定されたことに基づく。zsig33リガンドはモチリンに相同性を有しており、胃腸関係にて転写されることが知られている。オーファン受容体はモチリン受容体、GPR38に相同性を有している。Zsig33に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ配列番号1および2に示されている。配列番号3は配列番号2の縮重ポリヌクレオチド配列である。GHS-Rオーファン受容体のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列はそれぞれ配列番号4および5に示されている。配列番号6は配列番号5の縮重ポリヌクレオチド配列である。
【0030】
モチリンのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ配列番号7および8に示されている。モチリン受容体であるGPR38は、異なるスプライシングの結果生じた2種類のイソ型を有している。上記Feighner、F.Dを参照。長型のGPR-38Aのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ配列番号9および10に示されている。短型のGPR-38Bのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、それぞれ配列番号11および12に示されている。
【0031】
モチリンは胃腸の生理を制御するポリペプチドファミリーのメンバーである。モチリンが属する胃腸管制御に重要であるポリペプチドのファミリーには、グルカゴン、ガストリン、ガラニンおよび血管作用性小腸ペプチド(VIP)が含まれる。これらポリペプチドは活性型に至るまでに複数の処理段階を必要とする前駆体型として合成される。本発明のペプチドに関係する具体的なものは、モチリン、VIPおよびガラニンであり、この場合処理には、シグナル配列の除去、それに続く1以上のアクセサリーペプチドの切断による活性型ペプチドの放出が含まれる。生じた活性型ペプチドは一般には小型(6-30アミノ酸)であり、さらにグルタミン残基のアミド化、硫酸化またはピロリジナカルボン酸修飾の様な翻訳後修飾を必要とするだろう。
【0032】
G蛋白質共役受容体に分類される受容体がモチリンについて同定されている(Feighner、S.D.ら、上記)。2種類のモチリン受容体(GPR38-AとGPR38-B)は、別のスプラインシングにより生じることが示されている。この受容体分類のメンバーはホスホリパーゼCシグナル伝達経路を活性化すると考えられている。
【0033】
前記分泌されたzsig33蛋白質に対応するmRNAの組織分布の分析からは、発現が胃で最も高く、次いで小腸および膵臓でも明らかであるが、その発現レベルは低下することが示されている。分泌されたzsig33蛋白質の部分配列は膵臓ライブラリーより得たものであり、肺のcDNAライブラリー中にも示されている。インビトロ結合研究は、zsig33ペプチドが腎臓、十二指腸および空腸に結合することが示されている(実施例9参照)。即ちzsig33リガンドがGHS-Rへ結合することが予想されるものの、それは胃、小腸、膵臓、肺、腎臓、十二指腸および脳といった組織に限定される。
【0034】
本発明の実施態様は、G蛋白質共役受容体へのzsig33ポリペプチドの結合である。GHS-Rは、7個の膜貫通型アルファ螺旋構造を形成すると考えられている、7カ所の膜広域疎水域を有するG蛋白質共役受容体である。すなわち配列番号5の残基1ないし40に由来するポリペプチドのアミノ末端は細胞外にある。最初の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基41ないし66により形成される;第2の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基73ないし96により形成される;第3の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基118ないし139により形成される;第4の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基163ないし183により形成される;第5の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基212ないし235により形成される;第6の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基264ないし285により形成される;そして第7の膜貫通アルファ螺旋は配列番号5の残基303ないし326により形成される。
【0035】
即ちポリペプチドの細胞外部分は配列番号5の残基1ないし40;配列番号5の残基97ないし117;配列番号5の残基184ないし211;および配列番号5の残基286ないし302である。ポリペプチドの細胞室内部分は配列番号5の残基67ないし72;配列番号5の残基140ないし162;配列番号5の残基236ないし263;および配列番号5の残基327ないし366である。α螺旋5および6の間のループ(即ち配列番号5の残基236ないし263)およびC末端セグメント(即ち配列番号5の残基327ないし366)は細胞質に面しており、G蛋白質との相互作用にとって重要である。当業者はこの様な境界がおおよそのものであり、+/-4アミノ酸残基の幅で変わることを認識するだろう。
【0036】
さらに翻訳後ジスルフィド結合は配列番号5の残基116および198間にあると予想されている。zsig33リガンドまたはその変異体のGHS-Rへの結合は、G蛋白質にそれに結合するGDPを放出させてGTPに結合させ、その結果G蛋白質を活性化する。一般に、活性化されたG蛋白質は次に第2メッセンジャーの形成を触媒するエフェクター酵素に結合する。GHS-Rへzsig33リガンドが結合する場合、この様な第2メッセンジャーの結果は例えば胃収縮、栄養摂取の変化、成長ホルモンの変化、消化酵素およびホルモンの分泌変化、および/または膵臓中の酵素および/またはホルモンの分泌変化といった生物学的事象により、ならびにその他ここに示す他のアッセイにより測定できる。
【0037】
成長ホルモンの放出は多くの組織の成長を促し、蛋白質合成や遊離脂肪酸代謝を促進および炭水化物から脂肪酸まで各種エネルギー供給源の代謝を促進する様に、代謝プロセスに効果を及ぼす。
成長ホルモン放出の制御はホルモンおよび神経伝達物質により、直接または関節的に厳密に制御されている。例えば成長ホルモンの放出は成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)により促進され、そしてソマトスタチンにより阻害されるが、これらは共に視床下部より放出され1次的には脳下垂体に作用する。成長ホルモンの放出はまた、例えばL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、グルカゴン、バソプレッシン、脳下垂体アドレニルシクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)、ムスカリン受容体アゴニストおよび合成ペプチド(即ち成長ホルモン放出ペプチド)の様なその他化合物によっても刺激することができる。
【0038】
成長ホルモン分泌促進剤は、GHRH以外の作用メカニズム、即ち脳下垂体および視床下部内の別の受容体(GHS-R)に結合することによる脳下垂体からの成長ホルモンの放出を促進する小ペプチドの1分類である。すなわちこの受容体の結合は、例えば睡眠や食物摂取といった神経分泌活動外での成長ホルモン分泌の制御に役割を果たすことができる。従って成長ホルモンの分泌は、zsig33およびGHS-Rによるペプチド-受容体複合体の形成により制御される。
当業者は、本発明がリガンド(zsig33)および受容体(GHS-R)の両方について変異体ポリヌクレオチド配列を含むことを認識するだろう。これら変異体には、保存的アミノ酸弛緩、対立遺伝子変異体および縮重ポリヌクレオチド配列により生じた変異体が包含される。
【0039】
活性型zsig33ペプチドは配列番号2のアミノ酸残基37(GLN)または残基41(Ser)後でのC-末端切断により生じると推測される。しかし、多くの胃-脳ペプチドは複数の切断を必要とする。例えばプロガストリンペプチドは101アミノ酸であるが、N-末端での切断により連続する小ペプチド(G34、G17およびG14)となる(Suganoら、J.Biol.Chem.260:11274-11729、1985)。複数段階の処理を必要とするその他ペプチドにはグルカゴンが含まれるが、この場合にはC-末端の切断によりグルカゴン様ペプチド1およびグルカゴン様ペプチド2を生じ、その処理中にはGMAPとして知られるC-末端ペプチドの切断も起こる。即ち配列番号2のアミノ酸37(Gln)後で切断したzsig33ペプチドが合成され、生物活性を持つ14アミノ酸ペプチド(配列番号2のアミノ酸残基24(Gly)ないしアミノ酸残基37(Gln))を得た。実施例4を見よ。
【0040】
本発明では、複数のシグナルペプチダーゼ切断が予想されている。即ちzsig33ペプチドのアミノ末端は配列番号2の残基24のグリシン、配列番号2の残基25または26のセリン、あるいは配列番号2の残基27のフェニルアラニンで始まる。
【0041】
胃-ホルモンペプチドファミリーの生物活性分子を作り出すには、二塩基性ペプチド部位を必要とされることが多い。この様な部位は配列番号2の残基38と39(Arg-Lys)および残基42と43(Lys-Lys)に存在する。即ちzsig33の活性化に重要なプロテアーゼ(即ちメタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはシステインプロテアーゼ)がこれら二塩基性部位の後ろでzsig33ポリペプチドを切断し、配列番号2の残基39または43に終止するペプチドを生じる(切断は同時に単塩基性またはその他部位の後でも同様に起こることができる)。カルボキシ-ペプチダーゼは活性型ペプチドのカルボキシル末端から1以上の残基を取り除くと思われる。即ち、プロテアーゼとカルボキシル-ペプチダーゼによる活性型ペプチド処理により、配列番号2の残基37(Glu)または41(Ser)に終止する活性型zsig33ペプチドが生じる。
【0042】
モチリンファミリーの分析に拠れば、配列番号2の残基27ないし32は受容体結合および活性化にとって必須であろう。(Miller、Pら、Peptides 16 ( 1 ):11-18、1995;およびPeeters、T.Lら、Peptides 13 ( 6 );1103-1107、1992)。セリン(配列番号8の残基29、モチリン)はSchubert、Hら、Can.J.Biochem.52:7-8、1974によりイソロイシンであることが示されていることに注意すべきである。さらに同分析は配列番号2の残基27(Phe)、28(Leu)、29(Ser)および32(His)が受容体結合および/または活性にとって特に重要な残基であることも示唆している。この6残基ペプチド内の残基を置換すると、受容体に対するペプチドの親和性が変化した、あるいは受容体の活性化が変化した変異体を作り出すことができる。この様な変更は作動性および拮抗性の活性を生ずる。
【0043】
ここにはzsig33ペプチドの残基の更なる置換も記載される。配列番号2の残基27(Phe)および残基37(Gln)間の特定残基の保存的アミノ酸置換は、潜在的に拮抗体である変異体を生ずる。これら変異体は受容体に高親和性に結合するが、受容体の活性化は低いだろう。好ましくはこれらの位置は配列番号2の残基27(Phe)、28(Leu)、30(Pro)および32(His)である。
【0044】
zsig33ペプチドの残基の置換はまた作動性である変異体も生ずる。この様な置換は表2に示す様に保存的アミノ酸置換に基づくか、または表A掲載のモチリンの活性ペプチドとの比較による推測に基づくだろう。これら置換は配列番号2の位置27(Phe)、28(Leu)および32(His)を含む。例えば配列番号2の残基27(Phe)、28(Leu)、30(Pro)および32(His)で置換でき:配列番号2の残基28(Leu)はフェニルアラニン、バリン、チロシンまたはイソロイシンで置換でき:そして配列番号2の残基32(His)はフェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、バリン、またはロイシンで置換することができる。
【0045】
さらにzsig33ペプチドには、突然変異について結合親和性または、それら突然変異体の結合による受容体活性化に変化が生じないと予想される位置が存在する。これらの位置としては、例えば配列番号2の残基29(Ser)が挙げられるが、この位置をアラニン、プロリン、スレオニンまたはグリシンと置換しても野生型zsig33と比較し突然変異体または変異体の結合を変化させないと推測されている。
【0046】
Miller、Pら、上記は、モチリン(配列番号8)の残基33(Gly)および34(Glu)が移行領域を形成すること、そしてモチリン(配列番号8)の残基35(Leu)ないし47(Gln)が、その受容体に対するモチリンの受容体結合部位(配列番号8の残基26ないし32)の相互作用を安定化するアルファ螺旋を形成することを示唆している。同様に螺旋領域であるzsig33(配列番号2)の残基33(Gln)ないし残基41(Ser)は、螺旋を形成するのに必要な疎水性、親水性および静電性を維持している残基と置換することができる。
【0047】
これら置換体としては、配列番号2の残基33(Gln)、34(Arg)、36(Gln)、37(Gln)、38(Arg)、39(Lys)、40(Glu)および41(Ser)に関してはグルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、ヒスチジン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンおよびアルギニンが含まれ、配列含号2の位置35(Val)に関してはメチオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、トリプトファンおよびフェニルアラニンが含まれる。これら置換は螺旋立体構造および受容体に対するリガンドの結合部位の提示を維持するだろう。Zsig33ペプチドはインビトロまたはインビボ発現、ならびに化学合成により製造できる。
【0048】
モチリンの重要カルボキシル-末端残基はFeighner、S.Dら、上記により同定されている。モチリンがこれら残基で切断された場合には、受容体結合および活性は大きく低下する。その様な位置は、配列番号8に示すモチリンの残基36(Gln)および残基37(Arg)である。zsig33ペプチドのアミノ酸配列の分析は、配列番号2の残基33(Gln)および34(Arg)が配列番号8のモチリンの残基36および37に相当することを示している。即ちzsig33ペプチドは、これら位置について保存的アミノ酸置換を持ってもよい。これら具体的置換は表A中に掲載されている。
【0049】
結合研究は、モチリンが様々な親和性で2種類の受容体集団に結合することを示唆しており(Poitras、P.、Peptides 17:701-707、1996)、モチリンのこれら受容体への結合には2種類の形状があることが提案されている。この様な受容体の一つは洞の神経細胞に局在し、第2の受容体は十二指腸の平滑筋細胞内に局在している。同様にzsig33ペプチドまたはその変異体に結合し、そして結合親和性が変わる受容体が1以上存在するだろう。即ち、その受容体へのzsig33ペプチドの結合は、それが結合する受容体変異体に応じて、異なりそして変化した生物学的事象を生じるだろう。
本発明で予想される変異体zsig33リガンドの完璧なリストは、下表A掲載のペプチド置換対より導き出すことができる。
【0050】
【表1】
【0051】
本発明はDNAおよびRNA分子を含む、ここに開示されたzsig33およびGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は、遺伝コードの縮重性の寒天より、これらポリヌクレオチド分子について相当の配列変異体が可能であることを容易に理解するだろう。配列番号3は配列番号2のzsig33ポリペプチドをコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。配列番号6は配列番号5のGHS-Rポリペプチドをコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者は配列番号3および6の縮重配列がTをUに置換することで配列番号2をコードする全てのRNA配列も提供することを認識するだろう。
【0052】
即ち、本発明では配列番号3のヌクレオチド1ないしヌクレオチド351を、そして配列番号6のヌクレオチド1ないしヌクレオチド1098を含むzsig33ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれらのRNA配列等価体が予想される。第1表は、縮重ヌクレオチド位置を表すために配列番号3および6内に用いた1文字コードである。“解"は一文字で表されたヌクレオチドである。“相補体"は相補性ヌクレオチドのコードを表す。例えばコードYはCまたはTを表し、そしてその相補体RはAまたはGを表し、AがTの相補体であり、そしてGがCの相補体である。
【0053】
【表2】
【0054】
特定のアミノ酸配列に関し可能な全てのコドンを包含する、配列番号3および6に用いられた縮重コードは第2表に記載される。
【表3】
【0055】
当業者は、各アミノ酸をコードする、考え得る全てのコドンを表す縮重コドンを決定する場合には、いくらかの曖昧さが生じてしまうことを理解するだろう。例えばセリン(WSN)に関する縮重コドンは、ある場合にはアルギニン(AGR)をコードすることができ、そして有る場合にはアルギニン(MGN)に関する縮重コドンはセリン(AGY)をコードすることができる。同様の関係はフェニルアラニンとロイシンをコードしているコドン間にも存在する。即ち、縮重配列に包含される幾つかのポリペプチドは、変異体アミノ酸配列をコードするが、当業者は配列番号2および5のアミノ酸配列を参照することで、この様な変異体配列を容易に特定することができる。変異体配列はここに記載の如く、機能性について容易に試験することができる。
【0056】
当業者はまた、種により“優先使用コドン"が異なることを認識するだろう。当分野既知の各種方法によって、特定種の優先コドンを本発明のポリペプチドに導入することができる。組換え体DNA内への優先コドン配列の導入は、例えば特定の細胞型または種に於ける蛋白質翻訳をより効率的にすることで、蛋白質の産生を高めることができる。従って、配列番号3および6に開示された縮重コドン配列は、当分野で一般に使用され、そしてここに開示されている各種細胞型および種に於けるポリヌクレオチドの発現を最適化するためのひな形となる。優先コドンを含む配列は様々な種での発現について試験し、最適化することができ、そしてここに開示された機能性について試験することができる。
【0057】
発明の好ましい実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは配列番号1および3、または配列番号4および6の同様の大きさを持つ領域、またはそれに相補的な配列と、厳密条件下にハイブリダイズするだろう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは当分野周知であり、広く応用されているが、例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor,NY,1989;Ausubelら、編集、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、Inc.、NY,1987;BergerとKimmel、編集、Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enymology、152巻、1987およびWetmur、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227-59、1990を参照せよ。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは単鎖の標準的粗補配列の二重螺旋ハイブリッドを形成する能力を利用するものである。この様なハイブリッドにはDNA-DNA、RNA-RNAおよびDNA-RNAが含まれる。
【0058】
例示の如く、変異体GHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号4または6(あるいはその相補体)のヌクレオチド配列を有する核酸分子と、50%フォルムアミド、5×SSC(1×SSC:0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト(Denhardt‘s液(100×デンハルト液:2%(w/v)フィコール(Ficoll)400、2%(w/v)ポリビニルピロリドンおよび2%(w/v)ウシ血清アルブミン)、10%硫酸デキストランおよび20μg/ml変性、切断サケ血清DNAを含む溶液中にて42℃、一晩ハイブリダイズさせることができる。
【0059】
当業者はこれらハイブリダイゼーション条件を様々に工夫することができる。例えばハイブリダイゼーション混合液は、フォルムアミドを含まない液中に置いて、約65℃の様なより高い温度でインキュベーションすることができる。さらに混合済みハイブリダイゼーション液(例えばクローンテックラボラトリーズ(CLONTECH Laboratories)社、パロアルト(Palo Alto)、カリフォルニア州、製ExpressHybTMハイブリダイゼーション溶液)をメーカー指示書に従い利用することができる。
【0060】
ハイブリダイゼーション後、厳密条件下または高厳密条件下に核酸分子を洗浄して非ハイブリダイズ核酸分子を除くことができる。典型的な厳密洗浄条件には、0.1%硫酸ドデシルナトリウム(SDS)を含む0.5×-2×SSCの溶液内にて55-65℃で洗浄することを含む。即ち、変異体GHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号4または6のヌクレオチド配列を有する核酸(またはそれらの相補体)と、洗浄条件が0.1%SDSを含む0.5×SSC、55℃または0.1%SDSを含む2×SSC、65℃であることを含む、0.1%SDSを含む0.5×-2×SSC、55-65℃に等しい厳密洗浄条件の下にハイブリダイズする。当業者は例えば洗浄液中のSSCをSSPEに交換することで同等の条件を容易に工夫することができる。
【0061】
本発明はまた2つの判断基準:コードされたポリペプチドと配列番号5のアミノ酸配列との類似性(以下記載)、および上記ハイブリダイゼーションアッセイを利用し同定できるGHS-R変異体核酸分子も予想している。この様なGHS-R変異体には、(1)配列番号4または6のヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)と洗浄厳密性が0.1%のSDSを含む0.5×-2×SSC,55-65℃に等しい厳密洗浄条件下にハイブリダズする、および(2)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%または95%より高い同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子が含まれる。
【0062】
あるいはGHS-R変異体は(1)洗浄厳密性が0.1%のSDSを含む0.5×-2×SSC,55-65℃に等しい厳密洗浄条件下に配列番号4または6のヌクレオチド配列(またはそれらの相補体)とハイブリダズする、および(2)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%または95%より高い同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子として特長付けることができる。
【0063】
GHS-Rの保存されたアミノ酸領域は、新たなファミリーメンバーの同定のための道具として利用することができる。これら領域は、配列番号5の残基275ないし280;配列番号5の残基319ないし324;配列番号5の残基139ないし144;配列番号5の残基124ないし129;および配列番号5の残基302ないし307である。当業者はこれら目的に適した縮重ヌクレオチドおよび縮重ヌクレオチド配列の相補体を決定することができる。例えば逆転写ポリメラーゼチェインリアクション(RT-PCR)を用い、各種組織源または細胞株から得たRNAより保存領域をコードする配列を増幅することができる。具体的には、GHS-R配列より設計された高度縮重プライマーはこの目的に有用である。
【0064】
前記の如く、本発明の単離ポリヌクレオチドにはDNAおよびRNAが含まれる。DNAおよびRNAを調製する方法は当分野周知である。一般にRNAはzsig33またはGHS-RのRNAを大量に生じる組織または細胞から単離される。この様な組織および細胞はノーザンブロッティング(Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201、1980)により同定され、そしてzsig33ペプチドに関しては胃、小腸および膵臓が、そしてGHS-Rについては脳下垂体、視床下部、海馬および中枢神経系が挙げられる。
【0065】
全RNAはグアニジンイソチオシアネート抽出とそれに続くCsCl勾配中での遠心分離(Chirgwinら、Biochemistry 18:52-94、1979)により調製できる。ポリ(A)+RNAはAvivとLederの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:1408-12、1972)を用い、全RNAより調製される。相補的DNA(cDNA)は既知方法を利用し、ポリ(A)+RNAから調製される。あるいはゲノミックDNAが単離できる。次に例えばハイブリダイゼーションまたはPCRによりGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、単離される。
【0066】
幾つかの応用では(例えばトランスジェニック動物での発現)ゲノミッククローンを使用すること、またはcDNAクローンを少なくとも1個のゲノミックイントロンを含む様に変更することが好ましいものの、相補的DNA(cDNA)クローンが好適である。cDNAおよびゲノミッククローンを調製する方法は周知であり当分野通常の技術レベルであり、ここに開示された配列またはその一部のライブラリーを探索しまたはプライミングへの使用を含む。発現ライブラリーはGHS-Rに対する抗体、またはその他特異的結合パートナーを使い探ることができる。
【0067】
ここに開示されたGHS-Rポリヌクレオチドまたはzsig33ポリヌクレオチド配列はそれぞれ、GHS-Rまたはzsig33遺伝子の5‘非コーディング領域をクローン化するプローブまたはプライマーとしても利用できる。従って、GHS-Rまたはzsig33遺伝子由来のプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物または遺伝子治療を受けた患者内での異種遺伝子の組織特異的発現の方向付けに利用できる。5'側方配列のクローニングはまた、米国特許第5,641,670号に開示される“遺伝子活性化"によりGHS-Rまたはzsig33蛋白質の産生を促進する。
【0068】
簡単に述べると、細胞での内因性GHS-Rまたはzsig33遺伝子の発現は、少なくとも1つの標的配列、制御配列、エクソンンおよび不対合型スプライスドナー部位を含むDNA構築体をGSH-Rまたはzsig33座内に導入することで変更される。標的配列は内因性GHS-Rまたはzsig33遺伝子座と構築体との相同的組み換えを可能にするGHS-R5‘またはzsig33非コーディング配列であり、組み換えにより構築体内の配列は内因性GHS-Rまたはzsig33コーディング配列と作動性に連結するようになる。この様にして、内因性GHS-Rまたはzsig33コーディングプロモーターを他の制御配列で置き換え、または補充することが可能となり、増強された組織特異的またはその他の形で制御された発現を提供することができる。
【0069】
本発明のポリヌクレオチドはDNA合成装置を使い合成することもできる。例えばホスフォールアミド法が利用できる。遺伝子または遺伝子断片の合成の様に化学的に合成された2本鎖DNAが必要な応用例では、相補鎖はそれぞれ別に合成される。短い遺伝子(60ないし80bp)の製造は技術的には簡単であり、相補的鎖を合成し、続いてそれらをアニーリングすることで達成できる。しかしより長い遺伝子(>300bp)の製造については、化学的DNA合成の各サイクルの結合効率が100%になることは殆ど無いため、特別な方策が考案されている。
【0070】
この問題を解決するために、20ないし100ヌクレオチド長の単鎖断片から合成遺伝子(2本鎖)がモジュラーとして組み立てられる。GlickとPasternak、Molecular Biotechnology、Principles and Applications of Recombinant DNA、(ASM Press、Washington、D.C.1994);Itakuraら、Annu.Rev。Biochem。53:323-356(1984)およびClimieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:633-7、1990参照。
【0071】
本発明はさらに多種由来の相当ポリペプチドおよびポリヌクレオチド(オルトログ)も提供する。これらの種には哺乳動物、鳥類、両生類、は虫類、魚類、昆虫およびその他の脊椎動物および無脊椎動物種がふくまれるが、これらに限定されない。特に興味深いものは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマおよびその他霊長類ポリペプチドを含む、他哺乳動物由来のGHS-Rポリペプチドである。ヒトGHS-Rのオルトログは本発明より提供される情報および組成体と通常のクローニング技術とを組み合わせることで、クローン化できる。例えばcDNAはここの開示されているGHS-Rを発現する組織または細胞型より得たmRNAを用いクローン化できる。mRNAの好適供給源はここに開示の配列より設計されたプローブを用いたノーザンブロットで探索することで特定できる。
【0072】
次に陽性の組織または細胞株のmRNAよりライブラリーを調製する。次に完全または部分的ヒトcDNAを用いた、あるいはここに開示された配列に基づく縮重プローブの1以上のセットを用いてプロービングする様な各種方法により、GHS-RをコードするcDNAを単離することができる。cDNAはまたポリメラーゼチェインリアクション、またはここに開示された代表的ヒトGHS-R配列より設計されたプライマーを用いるPCR(Mullis、米国特許第4,683,202号)を用いクローン化することができる。その他方法ではcDNAライブラリーを用い、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、所望のcDNAの発現をGHS-Rポリペプチドに対する抗体を用い検出することができる。同様の技術は、ゲノミッククローンの単離にも応用できる。
【0073】
当業者は配列番号4および6に開示された配列がヒトGHS-Rの単一対立遺伝子を表すこと、そして対立遺伝子変異体および別スプライシングが発生することが想定されることを認識するだろう。この配列の対立遺伝子変異体は、各種個体より得たcDNAまたはゲノミックライブラリーを標準的方法によりプロービングすることでクローン化できる。配列番号4および6に示すDNA配列の対立遺伝子変異体は、サイレント突然変異を含む対立遺伝子変異体、および突然変異がアミノ酸配列に変化をもたらすものを含め本発明の範囲内であり、同様に配列番号5の対立遺伝子変異体である蛋白質もまた本発明の範囲内である。
【0074】
GHS-Rポリペプチドの特性を保持しながら別の型にスプライスされたmRNAより得られたcDNAは本発明の範囲内であり、同様にこの様なcDNAおよびmRNAにコードされたポリペプチドも本発明の範囲内である。これら配列の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体は、当分野標準的方法により各種個体または組織より得たcDNAまたはゲノミックライブラリーをプロービングすることで、クローン化できる。
【0075】
本発明はまた配列番号5のポリペプチドに実質類似している単離型GHS-Rポリペプチドおよびそれらのオルトログも提供する。その様なポリペプチドはより好ましくは配列番号5またはそのオルトログに少なくとも90%同一であり、より好ましくは95%以上同一である。配列の同一性の%は通常の方法によって決定される。例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48 :603-16, 1986, HenikoffとHenikoff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9, 1992を参照せよ。簡単に述べると、2つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティー10、ギャップエクステンションペナルティー1、そして表3(アミノ酸は通常の1文字コードで示している)に示すHenikoffとHenikoff(上記)の“BLOSUM62"スコアリングマトリックスを用い、アラインメントスコアが最適になるよう整列させる。次に同一性%を:
【0076】
【数1】
より計算する。
【0077】
【表4】
【0078】
アミノ酸間の同一性のレベルはPearsonとLipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)及びPearson(Meth. Enzymol. 183:63, 1990)により開示された“FAST"類似性検索アルゴリズムを利用し、決定できる。
【0079】
簡単に述べると、FASTAは最初に保存的なアミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を考慮せずに、同一性(ktup変数が1の場合)または同一ペア(ktup=2の場合)の密度が最大になる問題配列(例えば配列番号5)と試験配列間に共通する領域を特定することにより配列の類似性を特徴付ける。次に類似性が最高であった領域から順に10カ所の領域を対象とし、アミノ酸置換マトリックスを用いてペアを組んだ全アミノ酸の類似性について比較し、スコアが最大になる様な残基だけが含まれる様に領域端部を切りそろえる。
【0080】
“カットオフ"値(配列の長さとktup値より事前に定められた式より計算された)よりも大きなスコアを示す領域が複数ある場合には、続いて切りそろえられた最初の領域を再度検討し、領域を連結してギャップを持つ適当なアラインメントが作れるか決定する。最後に、アミノ酸挿入と欠失を考慮したNeedlema-Wunsh-Sellersのアルゴリズム(NeedlemanとWuncsch, J. Mo ; . Biol. 48:444(1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787(1974))の改良版を利用し、2アミノ酸配列の最高のスコア域を整列させる。FASTA分析の好適パラメータは:ktup=1、ギャップオープニングペナルティー=10、ギャップエクステンションペナルティー=1、置換マトリックス=BLOSUM62である。これらパラメータは、Pearson、(1990)の付録2内に説明されている様に、スコア化マトリックスファイル(“SMATRIX")を改良することでFASTAプログラム内に導入することができる。
【0081】
FASTAは、上記同様に比率を利用した核酸分子の配列同一性決定にも利用できる。ヌクレオチド配列の比較では、ktup値は1から6の間の範囲であり、好ましくは3から6、最も好ましくは3であり、その他のパラメータはデフォルトである。
【0082】
本発明は配列番号5のアミノ酸配列と比較して、1以上の保存的なアミノ酸の変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。BLOSUM62表は500以上の関連蛋白質グループの、高度に保存された領域を表す約2,000の蛋白質配列セグメントの局所的に多数整列させ得られたアミノ酸置換マトリックスである。ここで使用する場合、用語“保存的アミノ酸置換"とはBLOSUM62の値が-1より大きい置換を指す。たとえばその置換がBLOSUM62値0、1、2または3を特徴とする場合、そのアミノ酸置換は保存的である。好ましい保存的アミノ酸置換はBLOSUM62値1以上(例えば1,2または3)を特徴とし、より好ましい保存的アミノ酸置換はBLOSUM62値2以上(例えば2または3)を特徴とする。
【0083】
GHS-R遺伝子内の保存的アミノ酸は、配列番号4に引用されたヌクレオチドを置換することで導入できる。この様な“保存的アミノ酸"変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼチェインリアクションを用いた突然変異誘発等により得ることができる(Ausubel(1995)ページ8-10ないし8-22;およびMcPherson(編集)、Directed Mutagenesis:A Practical Approach(IRL Press 1991)参照)。この様な変異体の細胞-細胞相互作用を促進する能力は、ここに記載のアッセイの様な通常の方法により決定できる。あるいは変異体GHS-Rポリペプチドは、抗GHS-R抗体に特異的に結合する能力により特定できる。
【0084】
本発明ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位指定突然変異誘発あるいはアラニン-スキャニング突然変異誘発(CunninghamとWells、Science 244:1081-5、1989;Bassら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4498-502、1991)の様な当分野既知の方法により特定できる。後者の技術では、単一のアラニン突然変異が分子中の全ての残基に導入され、得られた突然変異分子を以下開示の様な生物活性について試験して分子の活性に重要であるアミノ酸残基を特定する。
【0085】
Hiltonら、J.Biol.Chem.271:4699-708も参照せよ。zsig33-GHS-R結合部位もまた、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と組合せた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折または補とアフィニティーラベリングの様な技術を用いた物理的構造分析によって決定できる。例えばde Vosら、Science 255:306-12;Smithら、J.Mol.Biol.224:899-904、1992;Wlodaverら、FEBS Lett.309:59-64、1992を参照せよ。必須アミノ酸の同定は、関連するG蛋白質共役受容体との相同性解析からも推測できる。
【0086】
多アミノ酸置換は、Reidhaar-OlsonとSauer(Science 241:53-7、1988)またはBowieとSauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6、1989)記載の方法のような、既知の突然変異誘発およびスクリーニング法を用い作り、そして試験することができる。簡単に説明すると、これら著者はポリペプチド中の2以上の位置を同時に無作為化すること、機能的ポリペプチドを選択すること、そして次に突然変異化したポリペプチドを配列分析し、各位置について許容される置換のスペクトルを決定するための方法を開示している。その他利用可能な方法としては、ファージディスプレー(例えばLowmanら、Biochem.30:10832-7、1991;Ladnerら、米国特許第5、223、409号;Huse、WIPO公開第WO92/06204号)および領域指定突然変異誘発法(Derbyshireら、Gene 46:145、1986;Nereら、DNA 7:127、1988)が挙げられる。
【0087】
開示のGHS-RのDNAおよびポリペプチドの配列の変異体は、Stemmer、Nature 370:389-91、1994、Stemmer、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747ー51、1994およびWIPO公開第WO 97/20078により開示されたDNAシャッフリングにより作製することができる。簡単に説明すると、変異体DNAは親DNAを無作為に断片化した後PCRを用いて再度構築して点突然変異を無作為に導入する、インビトロでの相同的組み換えによりこの技術は、異種由来の対立遺伝子変異体またはDNAの様な親DNAのファミリーを用いることで改良することができ、工程中にさらに可変性を加えることができる。所望する活性について選別またはスクリーングした後、さらに突然変異誘発とアッセイを繰り返し、有害な変化を選別しながら同時に所望する突然変異を選択することで配列の迅速“進化"がもたらされる。
【0088】
ここに開示の突然変異誘発法は高処理能力を持つ自動化スクリーニング法と組合せることができ、宿主細胞中のクローン化された突然変異ポリペプチドの活性を検出することができる。活性ポリペプチド(例えば胃の収縮、栄養摂取の変化、成長ホルモンの変化、消化酵素およびホルモンの分泌の変化、および/または膵臓中の酵素および/またはホルモンの分泌の変化)をコードする突然変異を起こしたDNA分子を宿主細胞し、現代的装置を用い迅速に配列分析することができる。これらの方法により目的ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の持つ重要性を迅速に決定することができ、そしてこれら方法は未知構造のポリペプチドに応用することができる。
【0089】
変異体GHS-R遺伝子の具体的なヌクレオチド配列に限らず、遺伝子はzsig33リガンドまたは抗GHS-R抗体と特異的に結合できる能力を特徴とするポリペプチドをコードする。より具体的には、変異体GHS-R遺伝子は、ここに記載のヒトGHS-R遺伝子によりコードされたポリペプチドの活性の少なくとも50%、そして好ましくは70、80または90%より高い活性を示すポリペプチドをコードする。
【0090】
変異体GHS-Rポリペプチドまたは実質相同であるGHS-Rポリペプチドは、1以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有することを特徴とする。これらの変化は好ましくは微小な性質のもの、即ち保存的アミノ酸置換およびポリペプチドの折りたたみまたは活性に有意な影響を与えないその他の置換;典型的には1ないし約30アミノ酸である小規模の欠失;およびアミノ末端へのメチオニン残基、約最大20-25残基までの小型リンカー、またはアフィニティータグの様なアミノ-またはカルボキシル-末端の延長である。
【0091】
即ち本発明は配列番号5の対応領域に少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、そしてより好ましくは95%以上同一である配列を含む、366ないし1800アミノ酸残基のポリペプチドを含む。アフィニティータグを含むポリペプチドはさらにGHS-Rポリペプチドとアフィニティータグの間に、蛋白質分解切断部位を含むことができる。好ましい部位としては、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位が挙げられる。
【0092】
変異体および融合蛋白質を含むGHS-Rポリペプチドについて当業者は上表1および2記載の情報を用いることで、その変異体をコードする完全な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に作り出すことができる。さらに当業者は標準的ソフトウエアーを用い、ここに記載のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づきGHS-R変異体を考案することもできる。従って本発明は、少なくとも以下の配列の一つを提供するデータ構造がコード化されたコンピューター読み出し可能媒体を包含する:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14および配列番号15。
【0093】
コンピューター読み出し可能媒体の好適形状には、磁気媒体および光学読み出し媒体が含まれる。磁気媒体の例にはハードまたは固定ディスク、ランダムアクセスメモリー(RAM)チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ(DLT)、ディスクキャッシュおよびZIPが含まれる。光学読み出し可能媒体の例としては、コンパクトディスク(例えばCD-読み出し専用記憶装置(ROM)、CD-再書き込み可能(RW)およびCD-書き込み可能)および多機能デジタル/ビデオディスク(DVD)(例えばDVD-ROM、DVD-RAMおよびDVD+RW)がある。
【0094】
本発明はさらに、1以上のポリペプチド融合体を含む各種その他ポリペプチド融合体および関連多量体蛋白質も提供する。例えば受容体に結合したG蛋白質は、米国特許第5,155,027号および第5,567,584号に開示の様にして、融合蛋白質ないし2量体蛋白質として調製できる。この観点での好ましい2量体蛋白質としては、その他G蛋白質結合受容体、G蛋白質結合受容体断片、または例えばGPR38(即ちGPR38AまたはGPR38B、モチリン受容体)およびIg-Heptaの様な、G蛋白質結合受容体ファミリー蛋白質の他のメンバーを含むポリペプチドが挙げられる。Abe,J.ら、J.Biol Chem。Vol.274:19957-19964、1999も参照。これらドメイン融合体またはドメイン断片融合体、あるいはその他G蛋白質結合受容体ペプチドとの融合体は遺伝的に加工された細胞中に発現させることができ、各種多量体G蛋白質結合受容体様類似体を生じる。
【0095】
融合蛋白質は、融合蛋白質の各構成要素を調製し、化学的にそれらを結合させる当業者周知の方法により調製できる。あるいは、適当な読み取り枠内にある融合蛋白質の両構成要素をコードするポリヌクレオチドは既知方法により作成し、ここに記載の方法により発現させることができる。例えば生物学的機能を付与する一部または全てのドメインは本発明のGHS-RとGPR38の様な、その他のファミリーメンバーの機能的に等価なドメインとの間で交換できるだろう。この様なドメインは分泌シグナル配列、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインの様な保存モチーフを含むが、これらに限定されるものではない。この様な蛋白質は、構築された融合体に依存して、本発明のポリペプチドまたはその他既知G蛋白質結合受容体様ファミリー蛋白質(例えばGPR38)と同一である、または類似する生物学的機能プロフィールを有することが期待される。さらに、この様な融合蛋白質はここに開示された他の特性も示すだろう。
【0096】
さらにポリペプチド融合体またはハイブリッドGHS-R蛋白質は、当分野に報告の方法を用いて、発明のGHS-R蛋白質の領域またはドメインを他のG蛋白質結合受容体(例えばGRP38)、または例えばβアドレナリン作動性受容体ファミリーの様な他受容体ファミリーのメンバー、あるいはその他の異質蛋白質の領域またはドメインと組み合わせることで構築される(Sambrookら、上記、Altschulら、上記、Picard、Cur.Opin.Biology,5:511-5、1994および当明細書中参考文献)。これらの方法により、問題のポリペプチド中にあるより大きなドメインまたは領域の生物学的意義を決定することができる。この様なハイブリッドは反応動態、結合を変化させ、基質特異性を制限または拡大し、あるいはポリペプチドの組織および細胞局在を変えることがあり、そして構造未知のポリペプチドに応用することができる。
【0097】
補助ドメインをzsig33ポリペプチドに融合させ、それらに特定の細胞、組織または本書実施例に規定される様な高分子を標的にさせることができる。例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼ断片は、それを標的細胞表面上のGHS-Rポリペプチドに特異的に結合するzsig33ポリペプチドドメインまたは断片と融合させることで、所定細胞を標的とすることができる。この様にして、ポリペプチド、ポリペプチド断片および蛋白質を、治療または診断目的として標的化することができる。この様なzsig33ポリペプチドドメインまたは断片は精製のためのアフィニティータグ、および標的化GHS-Rといった2以上の成分と融合させることができる。ポリペプチド融合体はさらに1以上の切断部位を、特にドメイン間に含むことができる。Tuanら、Connective Tissue Research 34:1-9、1996参照。
【0098】
本発明のポリペプチド融合体は一般に約1、500を越えない、好ましくは約1,200残基を越えない、さらに好ましくは約1,000残基を越えないアミノ酸残基を含み、そして多くの例では更に少ないだろう。例えばzsig33またはGHS-Rポリペプチドの残基はE.coliβガラクトシダーゼ(1,021残基;Casadabanら、J.Bacteriol。143:971-980、1980参照)、10残基スペーサー、および4残基第Xa因子切断部位に融合させることができ、第2の例では、zsig33またはGHS-Rポリペプチドの残基はマルトース結合蛋白質(約370残基)、4残基切断部位および6残基ポリヒスチジンタグと融合させることができる。
【0099】
宿主細胞由来のzsig33またはGHS-Rポリペプチドを外に向けさせるために、zsig33DNAはt-PA分泌ペプチドまたはzsig33またはGHS-R分泌ペプチド由来分泌ペプチドの様な分泌ペプチドをコードする第2DNA断片と結合させられる。分泌されたポリペプチドの精製を容易にするためには、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスP、フラッグペプチド(Hoppら、BIお・Technology 6:1204-1210、1988;イーストマンコダック社(Eastman Kodak Co)、ニューヘブン(New Haven)、コネチカット州より販売)、マルトース結合蛋白質または抗体あるいはその他特異的結合作用物質が利用できるその他ポリペプチドの様なC末端エクステンションをzsig33またはGHS-Rポリペプチドに融合することができる。
【0100】
本発明はさらにzsig33およびGHS-Rポリペプチドの“機能的断片"およびこの様な機能断片をコードしている核酸分子を含む。核酸分子の通常の欠失分析を実施し、zsig33またはGHS-Rポリペプチドをコードする核酸分子の機能断片を得ることができる。例示の如く、配列番号1または3、あるいは配列番号4または6のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化し、一連のネステッド型欠失を得ることができる。次に断片は適当な読み取り枠の中、発現ベクターに挿入され、発現されたポリペプチドは単離され、細胞-細胞相互作用、または抗zsig33あるいは抗GHS-R抗体に結合する能力について試験される。エクソヌクレアーゼ消化の代替法の一つは、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて欠失または停止コドンを導入し、所望断片を特異的に製造するものである。あるいはポリメラーゼチェインリアクションを用いzsig33あるいはGHS-R遺伝子の特定断片を合成することができる。
【0101】
機能ドメインを特定する通常の方法は当業者周知である。例えばインターフェロンの一端または両端の切断に関する研究がHorisbergerとDi Marco、Pharmc.Ther.66:507(1995)によりまとめられている。さらに蛋白質の機能分析に関する標準的技術は、例えばTreuterら、Molec.Gen.Genet.240:113(1993)、Contentら、“ヒトインターフェロンに誘導された42kDa 2-5A合成酵素の発現および予備的欠失分析(Expression and preliminary deletion analysis of the 42kDa 2-5A synthetase induced by human interferon)"内、Biological Interferon Systems、Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems、Cantell(編集)、65-72ページ(Nijhoff 1987)、Hershman、“EGF受容体(EGF Receptor"、Control of Animal Cell Proliferation、Vol.1内,Boyntonら、(編集)169-199ページ(Academic Press 1985)、Coumailleauら、J.Biol.Chem.270:29270(1995);Fukunagaら、J.Biol.Chem.270:25291(1995);Yamaguchiら、Biochem.Pharmacol.50;1295(1995)、およびMeiselら、Plant Molec.Biol.30:1(1996)により記載されている。
【0102】
本発明はまたそれぞれ配列番号2または5のアミノ酸配列に比し、アミノ酸が変更しているzsig33またはGHS-R遺伝子の機能断も予想する。変異体zsig33遺伝子は、上記の様に配列番号1または2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列との同一性レベルを決定すること、ならびに本書表Aと比較することで、構造を基礎として特定することができる。変異体GHS-R遺伝子は上記の如く、配列番号4または5のヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性レベルを決定することで、構造を基礎として特定することができる。構造を基礎とする変異体遺伝子を特定する別の方法は、潜在的変異体zsig33またはGHS-R遺伝子をコードしている核酸分子が上記配列番号1および3または配列番号4および6のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズできるか否か決定するものである。
【0103】
ここに論じた方法を用いることで、当業者は配列番号5または野生型GHS-R蛋白質の活性を保持する各種ポリペプチド断片または変異体を特定し、および/または調整することができる。この様なポリペプチドは、例えば分泌ドメイン、細胞内シグナル伝達を担当するアミノ酸を含む膜貫通および細胞内ドメインの一部または全部;融合ドメイン;アフィニティータグ等の様な追加のアミノ酸を含むだろう。
【0104】
本発明はまたここに記したzsig33ポリペプチドのエピトープ保有部分を含むポリペプチド断片またはペプチドも提供する。この様な断片またはペプチドは、タンパク全体を免疫原として用いた場合に抗体反応を惹起する蛋白質部分である“免疫源性エピトープ"を含むだろう。免疫源性エピトープ保有ペプチドは通常の方法を用い特定することができる(例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998(1983)参照)。
【0105】
これに対しペプチド断片またはペプチドは抗体が特異的に結合できる蛋白質領域である“抗原性エピトープ"を含むだろう。特定のエピトープはアミノ酸の直線または連続範囲から成り、この様なエピトープの抗原性は変性剤により破壊されない。蛋白質のエピトープを模擬する比較的短い合成ペプチドを用い、蛋白質に対する抗体の産生を刺激できることが、当分野で知られている(例えばSutcliffeら、Science219:660(1983)参照)。従って本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、ここに記したポリペプチドと結合する抗体の誘導に有用である。
【0106】
抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは少なくとも配列番号2または5の4ないし10個のアミノ酸、好ましくは少なくとも10ないし15個のアミノ酸、より好ましくは15ないし30個のアミノ酸を含む。この様なエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、ここに記した様にzsig33またはGHS-Rポリペプチドを断片化すること、または化学的に合成することで作ることができる。さらにエピトープはランダムペプチドライブラリーのファージディスプレーより選択することができる(例えばLaneとStephen、Curr.Opin.Immunol.5:268(1993)、およびCorteseら、Curr.Opin.Biotechnol.7:616(1996)参照)。
【0107】
エピトープを同定し、そしてエピトープを含む小ペプチドから抗体を産生する標準的方法は、例えばMole、“Epitope Mapping"、Method in Molecular Biology、10巻内、Manson(編集)、105-116ページ(The Humana Press、Inc.1992)、Price、“合成ペプチド由来抗体の産生と特性分析(Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal Antibodies:Production,Engineering,and Clinical Application、RitterとLadyman(編集)、60-84ページ(Cambrige University Press 1995)およびColiganら(変種)、Current Protocols in Immunology、9.3.1-9.3.5ページおよび9.4.1-9.4.11ページ(John Wiley&Sons 1997)。
【0108】
例示の如く、zsig33の潜在的抗原部位は、LASERGENE(DNASTAR;Madison、WI)のPROTEANプログラム(バージョン3.14)を使い、Jameson-Wolf法、JamesonとWolf、CABIOS 4:181(1988)を用い特定された。この分析ではデフォルトのパラメータが使用された。
本文積の結果は、配列番号2のアミノ酸残基30ないし50;配列番号の残基57ないし73および配列番号2の残基109ないし117より成るペプチドが抗原性ペプチドであることを示した。
【0109】
zsig33ポリペプチドはまた、zsig33エピトープ、ペプチドまたはポリペプチドに結合する抗体の調整に使用できる。zsig33ポリペプチドまたはその断片は抗原として動物に接種され(免疫源)、免疫反応を惹起する。当業者は抗原性のエピトープ保有ポリペプチドがzsig33ポリペプチド(例えば配列番号2)の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、そしてより好ましくは少なくとも15ないし約30個の連続するアミノ酸残基を含むことを理解するだろう。より大きなzsig33ポリペプチド、即ち10ないし30残基から全長のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【0110】
抗原または免疫源性エピトープにはここに記した様な結合されたタグ、アジュバントおよびキャリアーも含まれる。好適抗原にはアミノ酸番号24ないしアミノ酸番号117、またはその9ないし94連続アミノ酸断片である配列番号2にコードされるzsig33ポリペプチドがある。その他好適抗原には、配列番号2の残基1ないし残基23;配列番号2の残基24ないし残基37;配列番号2の残基24ないし残基41;配列番号2の残基24ないし残基117;および配列番号2の残基42ないし117が含まれる。抗原としての使用に好適なペプチドは疎水性プロットより当業者により推測できる様な親水性ペプチドである。
【0111】
GHS-R親水性ペプチドには、配列番号2の残基28ないし49;配列番号2の残基57ないし75;配列番号2の残基89ないし97;および配列番号2の残基107ないし117より成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。さらに、折りたたまれた蛋白質の表面に存在するアミノ酸の配列は抗原性であろう。zsig33ペプチドの場合、好適表面存在ペプチドには配列番号2の残基27ないし52;配列番号2の残基56ないし79;配列番号2の残基87ないし98;および配列番号2の残基105ないし117より成るグループから選択されるアミノ酸を含むペプチドが包含される。
【0112】
これら抗原を動物に接種し誘導された免疫反応より生じた抗体は、ここに記載の如くにして単離、精製できる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調整し、単離する方法は当分野周知である。例えばCurrent Protocols in Immunology、Cooliganら、(編集)、National Institutes of Health、John Wiley and Sons、Inc.,1995;Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor、NY、1989;およびHurrell、J.G.R.,編集、Monocolonal Hybridoma Antibodies ; Techniques and Applications、CRC Press、Inc.,Boca Raton、FL、1982を参照せよ。
【0113】
当業者に明らかな様に、ポリクローナル抗体はウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスおよびラットのような各種温血動物にzsig33ポリペプチドまたはその断片を接種することで作ることができる。zsig33ポリペプチドの免疫源性は、アルム(水酸化アルミニウム)またはフレンド完全または不完全アジュバントの様なアジュバントの利用により増強されるだろう。免疫に有用なポリペプチドには、zsig33と、またはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合蛋白質との融合体の様な融合ポリペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫源は完全長分子でも、またはその一部でも良いだろう。ポリペプチド部分が“ヘアピン様"である場合、この様な部分は免疫感作に適した高分子キャリアー(キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風毒素の様な)との結合または連結に好都合であろう。
【0114】
ここで用いる用語“抗体"にはポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびF(ab‘)2およびFab蛋白質分解断片の様な抗原結合断片を含む。遺伝子工学的に作られた、キメラ抗体、Fv断片、単鎖型抗体等の様な未変性抗体または断片、ならびに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドも含まれる。非ヒト型抗体は、非ヒト型CDRをヒトフレームワークおよび定常領域上に移植するか、または全非ヒト可変ドメインを取り込むこと(随意露出残基を交換することでそれらのヒト様表面に“偽装"されるが、こうして得られたものは“化粧張りされた"抗体である)によりヒト化される。
【0115】
幾つかの例では、ヒト化抗体は結合特性を適切に高めるために、ヒト型可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト型残基を保持している。抗体をヒト化することで、生物学的半減期は延長され、ヒトに投与した時有害な免疫反応が起こる確率は低下する。さらにヒト抗体は、WIPO公開番号WO98/24893号に開示の様にしてヒト免疫グロブリン遺伝子を含む様に加工されたトランスジェニック非ヒト動物に作らせることができる。これら動物の内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同的組み換えの様な方法で不活性化されるか、または除かれることが望ましい。
【0116】
本発明に有用な抗体作製または選択に関するその他技術には、インビトロに於いてリンパ細胞をzsig33蛋白質またはペプチドに暴露すること、及びファージまたは同様のベクター中の抗体ディスプレーライブラリーを選別(例えば、固定化あるいは標識化されたzsig33ポリペプチドの利用して)することが含まれる。潜在的zsig33ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレー)または大腸菌の様な細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることでも得られる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発法やランダムポリヌクレオチド合成法といった様々な方法により得ることができる。
【0117】
これらランダムペプチドディスプレーライブラリーを利用し、リガンドまたはレセプターの様な蛋白またはポリペプチド、生物学的または合成高分子、あるいは有機または無機基質である既知標的体と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。この様なランダムペプチドディスプレーライブラリーを作製し、そしてスクリーニングする技術は当分野既知であり(Ladnerら、米国特許第5,223,409号;Ladnerら、米国特許第4,946,778号;Ladnerら、米国特許第5,403,484号及びLadnerら、米国特許第5,571,698号)、そしてランダムペプチドディスプレーライブラリーや同様のライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばクローンテックラボラトリーズ社(CLONTECH Labortories、Inc.)(Palo Alto, CA)、インビトロジェン社(Invitrogen Inc.)(San Diego, CA)、ニューイングランドバイオラブス社(New England Biolabs, Inc)(Beverly, MA)、およびファルマシアLKBバイオテクノロジー社(Pharmacia LKB Biotechnology Inc)より市販されている。
【0118】
ランダムペプチドディスプレーライブラリーを、ここに開示されたzsig33配列を用いスクリーニングすることで、GHS-Rに結合する蛋白質を同定することができる。zsig33を含むこれら"結合蛋白質"はGHS-Rポリペプチドと相互作用し、そして細胞の標的化やアフィニティー精製による相同ポリペプチドの単離に利用することができる。これらは薬物、毒素、放射性核種等で直接、または間接的に標識化することができる。
【0119】
これら結合蛋白質はまた、発現ライブラリーおよび中和活性スクリーニングといった分析方法にも利用できる。また結合蛋白質は、ポリペプチドの血中レベル測定;基礎病因または病気のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出または定量するための診断アッセイにも利用できる。さらにこれら結合蛋白質はインビトロおよびインビボでのzsig33結合及びシグナル伝達を阻止するzsig33"アンタゴニスト"としても機能できる。これら抗zsig33結合蛋白質は、例えば血小板業凝集、アポトーシス、神経発生、筋肉発生、免疫学的認識、腫瘍形成および一般的細胞-細胞相互作用を変更するのに有用であろう。
【0120】
抗体がコントロール(非zsig33)ポリペプチドに対する結合親和性に比べ少なくとも10倍高い結合活性(zsig33ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに対する)の閾値レベルを有する時、その抗体は特異的に結合しているとされる。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード(Scatchard)分析(Scatchard、G.,Ann.NY Acad.Sci、51;660ー672、1949)を用いることで、当業者により容易に決定できる。
【0121】
当業者既知の様々なアッセイは、ssig33蛋白質またはペプチドに特異的に結合する抗体の検出に利用できる。アッセイ例はAntibodies : A Laboratory Manual、Harlow and Lane (編集) Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988内に詳細に記述されている。これらアッセイの代表例としては:同時免疫電気泳動法、ラジオ免疫アッセイ、ラジオ免疫沈殿法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法、ドットブロットまたはウエスタンブロット、阻害又は競合アッセイ、及びサンドイッチアッセイがある。抗体はまた野生型に比較する形で、変異型zsig33蛋白質またはポリペプチドへの結合についてスクリーニングすることもできる。さらに、zsig33/GSH-R複合体に対する抗体も同定できる。
【0122】
zsig33に対する抗体は、zsig33を発現する細胞を標的化すること;アフィニティー精製を利用したzsig33を単離すること、zsig33ポリペプチドの血中レベルを決定するため診断アッセイに;基礎病因または病気のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出すること、または定量すること:FACSを利用した分析法に;発現ライブラリーのスクリーニングに;抗イディオタイプ抗体の作製に;そしてインビトロ及びインビボでzsig33のGHS-Rへの結合を阻止する中和抗体またはアンタゴニスト;およびGSH-Rへのzsig33の結合により形成されたzsig33/GHS-R複合体を検出することに利用できるだろう。
【0123】
好適な直接タグまたはラベルには、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害体、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性微粒子等が含まれ;間接的タグまたはラベルとしては中間体としてビオチン-アビジンまたはその他の相補体/抗相補体ペアの使用が挙げられるだろう。ここでの抗体はさらに薬物、毒素、放射性核種等と直接または間接的に結合されてもよく、これら標識体はインビボでの診断または治療に使用される。更に、zsig33または断片に対する抗体は、例えばウエスタンブロットまたはその他の当分野既知のアッセイ法での変性zsig33またはその断片のインビトロ検出に使用できるだろう。
【0124】
ここでの抗体又はポリペプチドはまた薬物、毒素、放射性核種等直接、又は間接的に結合でき、これら標識体はインビボ診断または治療法に利用できる。例えば、本発明のポリペプチド又は抗体は対応する抗-相補的分子(例えばGHS-R)を発現している組織または臓器の特定、または処理に使用できる。より具体的には、zsig33ポリペプチドまたは抗-zsig33抗体、またはその生物活性断片または一部分は、検出可能または細胞毒性分子に共役でき、抗-相補的分子を発現している細胞、組織または臓器を有する哺乳動物に与えることができる。
【0125】
好適な検出可能分子はポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合してもよく、それらとしては放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性微粒子等が挙げられる。好適細胞毒性分子はポリペプチド又は抗体に直接または間接的に結合され、それには細菌性または植物性毒素(例えばジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン等)およびヨード-131、レニウム-188またはイットリウム-90の様な治療用放射性核種(ポリペプチドまたは抗体に直接結合させるか、または例えばキレート成分を利用し間接的に結合させる)が含まれる。
【0126】
ポリペプチドまたは抗体はまたアドリアマイシンの様な細胞毒性薬物に結合させることもできる。検出可能分子または細胞毒性分子を間接的に結合させる場合、この検出可能もしくは細胞傷害性分子を相補体/抗相補体ペアのメンバーの1方に結合させ、残りのメンバーをポリペプチド又は抗体の一部分に結合させることができる。これら目的に関しては、ビオチン/ストレプトアビジンが典型的な相補体/抗相補体ペアである。
【0127】
別の実施態様では、ポリペプチド-毒素融合蛋白質または抗体-毒素融合蛋白質は、標的細胞または組織の阻害又は消耗に利用できる(例えば、ガン細胞または組織の治療)。あるいは配列番号2の残基24ないし41を含むペプチドのみを含む複合蛋白質は、例えば一般には脳下垂体、視床下部、海馬および中枢神経系の様な所望する型の細胞または組織に検出可能分子、細胞毒性分子、又は相補的分子を方向付けるのに好適である。
【0128】
別の実施態様では、zsig33ポリペプチドまたは抗-zsig33抗体がこれら組織由来の高増殖組織を標的にできれば、zsig33-サイトカイン融合蛋白質または抗体-サイトカイン融合蛋白はインビボでの標的組織(例えば胃、腎臓、空腸、十二指腸、膵臓、小腸および肺)の殺滅促進に利用できる。(一般的には、Hornickら、Blood、89:4437-47、1997)を見よ。Hornickらはサイトカインを所望作用部位に方向付けることができ、それによりサイトカインの局所レベルを増加できる融合蛋白質を記載している。好適なzsig33ポリペプチド又は抗-zsig33抗体は、望ましくない細胞または組織(即ち、腫瘍または白血病細胞)を標的とし、融合サイトカインはエフェクター細胞により伝達される標的細胞融解を増強する。この目的に好適なサイトカインには、例えばインターロイキン2および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が含まれる。
【0129】
さらに別の実施態様では、zsig33ポリペプチドまたは抗-zsig33抗体が血管細胞または組織を標的とする場合には、再狭窄減少を目的としてこれらポリペプチドまたは抗体に放射線核種、特にベータ線放出核種を結合することができる。この様な治療的方法は、放射性治療を行う医師への危険を軽減する。
ここに記載された生物活性型ポリペプチドまたは抗体標識体は、静脈内、動脈内または線管内に投与することができるか、または作用目的部位に局所的に導入されるだろう。
【0130】
全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片、および融合ポリペプチドを含む本発明のzsig-33ポリペプチドは、通常技術により遺伝子工学宿主細胞にて産生できる。好適宿主細胞としては、外因性DNAで形質転換またはトランスフェクションし、培養増殖可能な細胞であり、そして細菌、真菌細胞ならびに培養高等真核細胞が含まれる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化DNA分子を取り扱うこと、および外因性DNAを各種宿主細胞に導入するための技術は、Sambrookら、Molecular Clonign: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,およびAusubelら、編集、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されている。
【0131】
一般に、zsig-33またはGHS-RポリペプチドをコードしているDNA配列は発現ベクター内では、転写プロモーターおよびターミネーターを含む発現に必要なその他遺伝的要素と作動可能に連結されている。当業者は特定のシステムでは選択可能マーカーが別のベクター上に備えられており、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノム内への組み込みによって提供されることを認識するだろうが、ベクターもまた通常1またはそれより多い選択可能なマーカー、および1またはそれより多い複製起点を有しているだろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能マーカー、ベクターおよびその他要素の選択は、当分野通常技術の範囲にある通常設計の問題である。多くのこれら要素は文献中に記載されており、また販売会社を通じ入手できる。
【0132】
zsig33またはGHS-Rポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に乗せる為に、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる)が発現ベクター内に備えられる。分泌シグナル配列はzsig33またはGHS-Rの分泌シグナル配列、またはその他の分泌蛋白質(例えばt-PA)に由来するもの、または新たに合成されたものであろう。分泌シグナル配列は、zsig33またはGHS-RのDNA配列に作動性に結合しており、即ち分泌シグナル配列とzsig33(またはGHS-R)配列は正しい読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞内の分泌経路内に向く様に配置される。分泌シグナル配列は通常所望ポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置するが、特定分泌シグナル配列は所望するDNA配列内の別の場所に位置する(Welchら、米国特許第5,037,743号;Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照)。
【0133】
本発明のポリペプチドの未変性分泌シグナル配列は、他のポリペプチドを分泌経路に向かわせるのに利用される。本発明はこの様な融合ポリペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドは、当分野既知でありここに開示されている方法を使い、zsig33ポリペプチド(即ち配列番号2の残基1ないし23)に由来する分泌シグナル配列を作動性に他ポリペプチドに連結されることで作製できる。本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は、追加のペプチドとアミノ末端にて好ましく融合して追加ペプチドを分泌経路内に導く。この様な構築体は当分野で広く応用されることが知られている。例えばこれら新規分泌シグナル配列融合構築体は、通常は非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌型に誘導することができる。この様な融合体は、インビボまたはインビトロでのペプチドの分泌経路への方向付けに用いられるだろう。
【0134】
同様にGHS-Rのα-螺旋型膜貫通ドメインのいくつかは、他のG蛋白質結合受容体由来あるいは例えばβアドレナリン作動性受容体ファミリーメンバー由来の、別のα-螺旋型膜貫通ドメインを備えた異種配列により置換することができる。
【0135】
培養哺乳動物細胞は本発明での利用に好適な宿主である。外因性DNAを哺乳動物宿主細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム介在トランスフェクション法(Wiglerら、Cell 14:725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレクトロポレーション法(Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982)、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法(Ausubelら、上記)、およびリポソーム介在トランスフェクション法(Hawley-Nelsonら、Foucs 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993、およびウイルスベクター(MillerとRosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; WangとFiner, Nature Med. 2: 714-6, 1996)が含まれる。培養哺乳動物細胞内での組換え体ポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、米国特許第4,713,339号;Hagenら、米国特許第4,784,950号;Palmiterら、米国特許第4,579,821号;およびRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。
【0136】
好適哺乳動物培養細胞にはCOS-1(ATCC No.CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1651), BHK(ATCC No. CRL 1632), BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No. CRL 1573; Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72,1977)およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO-K1;ATCC No. CCL 61)細胞株が含まれる。追加の好適細胞株は当分野既知であり、米国標準培養体コレクション、マナサス、バージニア州、(American Type Culture Collection, Manassas, VA )等の公的供託機関より入手することができる。一般には、SV-40またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターの様な強い転写プロモーターが好まれる。米国特許4,956,268号参照。その他好適プロモーターとしては、メタロチオネン遺伝子(米国特許第4,579,821号および、4,601,978号)およびアデノウイルス主後期プロモーターが挙げられる。
【0137】
外来DNAが挿入された培養哺乳細胞に関しては、一般には薬物選別を用いて選別が行われる。この様な細胞は一般には"トランスフェクタント"と呼ばれる。選別薬剤存在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝達することができる細胞は、"安定トランスフェクタント"と呼ばれる。好適選択マーカーは抗生物質であるネオマイシンに対する耐性をコードしている遺伝子である。選別は、G-418等のネオマイシン型薬物の存在下に行われる。選別システムは所望遺伝子の発現レベルの増加にも利用でき、この工程は"増幅"と呼ばれている。増幅はトランスフェクタントを低レベルの選別薬剤存在下に培養し、続いて選別薬剤量を増加し、導入遺伝子の産物を高レベルに産生する細胞を選別することで実施される。
【0138】
好ましい増幅可能な選別マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素であり、これはメトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子(例えばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)も利用できる。変更された表現形を導入する、例えば緑色蛍光蛋白質、またはCD4、CD8、クラスIMHCまたは胎盤性アルカリフォスファターゼの様な細胞表面蛋白質の様な代替マーカーを使用し、FACSソーティングまたは磁性ビーズ分離法の様な手段により非トランスフェクト細胞からトランスフェクト細胞を選別してもよい。
【0139】
植物細胞、昆虫細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として利用できる。植物細胞での遺伝子発現に関するベクターとしてのAgrobacterium rhizogenesの利用はSinkarら, J. Biosci. (Bangalore)11:47-58,1987にレビューされている。昆虫細胞の形質転換およびそれによる外来性ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO94/06463号により開示されている。昆虫細胞は、一般にAutographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcMNPV)由来する組換え体バキュロウイルスベクターを使い感染させられる。
【0140】
King, L.A.およびPossee、R.D., The Baculovirus Expression System ; A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R.ら、Baculovirus Expression Vectors ; A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994;および、Richardson, C. D.,編集., Baculovirus Expression Protcols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照せよ。組換え体zsig33バキュロウイルスを作製する第2の方法は、Luckow(Luckow, V.Aら、J Virol 67: 4566-79, 1993)記載のトランスポゾンをベースとした系を利用する。
【0141】
トランスファーベクターを利用するこの系はBac-to-BacTMキットとして市販されている(Life Technologies,Rockwille、MD)。このシステムはTn7トランスポゾンを含むトランスファーベクターpFastBac1TM(Life Technologies)を利用し、zsig33ポリペプチドをコードするDNAを、“bacmid"と呼ばれる大形プラスミドとして大腸菌中に維持されているバキュロウイルスゲノム中に移す。pFastBacITMトランスファーベクターはAcNPVポリヘドリンプロモーターを利用して、所望遺伝子、この例ではzsig33またはGHS-Rを発現させる。しかしpFastBacITMはある程度変更することができる。
【0142】
ポリヘドリンプロモーターを取り除き、バキュロウイルス感染初期に発現されるバキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーター(Pcor、p6.9またはMPプロモーターとしても知られる)と交換することができるが、これは分泌蛋白質の発現に有益であることが示されている。Hill-Perkins, M.S.およびPossee、R.D. Gen Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.Cら、 J Gen Virol. 75:1551-6, 1994および、Chazenbalk, G.D.,とRapoport,B., J Biol Chem 270:1543-9, 1995参照。更にこの様なトランススファーベクター構築体では、短いあるいは長いタイプの塩基性蛋白質プロモーターが使用できる。
【0143】
さらに未変性zsig33分泌シグナル配列が昆虫蛋白質由来の分泌シグナル配列で置換されたトランスファーベクターを構築することができる。例えば未変性zsig33分泌シグナル配列を置換には、エクジステロイドグリコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Innbitorogen、Garlsbad、CA)またはバキュロウイルスgp67(PharMingen、San Diego、CA)由来分泌シグナル配列が構築体中に使用できる。さらにトランスファーベクターは、発現するzsig33ポリペプチドのC-またはN-末端にエピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ(Grussenmeyer, Tら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985) をコードするDNAを持つインフレーム融合体を含むことができる。
【0144】
zsig33を含むトランスファーベクターは、当分野既知の技術を用いて大腸菌内に導入され、組換え体バキュロウイルスの指標である切断されたlacZ遺伝子を含むbacmidsについてスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含むbacmidDNAは、一般的方法により分離され、これを用いSpodoptera frugiperda細胞、例えばSf9細胞をトランスフェクトする。続いてzsig33を発現する組換え体ウイルスが作られる。組換え体ウイルスのストックは、当分野一般的に用いられる方法により作成される。
【0145】
組換え体ウイルスは、宿主細胞、典型的にはアワヨトウ、Spodoptera frugiperdaの幼虫より得た細胞株の感染に用いられる。一般にはGlickおよびPasternak, Molecular Miotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994を見よ。別の好適細胞株はTrichoplusia ni由来のHigh FiveOTM細胞株(Invitrogen)である(米国特許第5,300,435号)。市販の無血清培地を使い、細胞を増殖および維持する。
【0146】
好適な培地は、Sf9細胞についてはSf900IITM(Life Technologies)またはEST921TM(Expression Systems)である;T.ni細胞に関してはEx-cell0405TM(JBH Biosciences, Lenexa, KS)またはExpress FiveOTM(Life Technologies)である。細胞は約2-5×105細胞の接種密度から1-2×106細胞密度まで増殖され、その時点で組換え体ウイルスのストック0.1ないし10、より一般的には約3感染多重度(MOI)加えられる。上清からのその後のzsig33ポリペプチド精製は、ここに記述した方法を用い行うことができる。
【0147】
酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に利用できる。この観点において特に興味ある酵母種には、Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisおよびPichia methanolicaが含まれる。S. cerevisiae細胞を外因性DNAにて形質変換し、それより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号;Brake、米国特許第4,870,008号;Welchら、米国特許第5,037,743号;およびMurrayら、米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選別可能マーカー、一般的には薬剤耐性、あるいは特定栄養素(例えばロイシン)欠損状態での増殖能によって決定される表現形により選別される。
【0148】
Saccharomyces cerevisiaeでの利用に好適なベクターシステムはKawasakiらにより開示されている(米国特許第4,931,373号)、グルコース含有培地中の増殖により形質変換細胞が選別できるPOT1ベクターシステムである。酵母での利用に適した好適プロモーターおよびターミネーターには、糖分解酵素遺伝子由来(例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号;Kingsmanら、米国特許第4,615,974号;およびBitter、米国特許第4,977,092号を見よ)およびアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものがある。
【0149】
米国特許第4,990,446号、5,063,154号、第5,139,936号および第4,661,454号も参照せよ。Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragillis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondiiおよびCandida maltosaを含むその他酵母に適した形質変換システムが当分野で知られている。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol,132: 3459-3465,1986およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照せよ。
【0150】
Aspergillus細胞はMcKnightら、米国特許第4,935,349号の方法により利用されるだろう。Acremonium chrysogenumを形質変換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号により開示されている。Neurosporaを形質転換する方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号により開示されている。Pichia methanolicaの組換え体蛋白質産生に関する宿主としての利用は、米国特許第5,716,808号、第5,736,383号、第5,854,039号、および第5,888,768号に開示されている。
【0151】
Escherichia coli, Bacillusおよびその他の属の細菌株を含む前核生物宿主細胞も、本発明での有用な宿主細胞である。これら宿主を形質転換し、その中にクローン化された外来性DNA配列を発現させる技術は当分野公知である(Sambrookら、上記参照)。E.coliの様な細菌でzsig33またはGHS-Rポリペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性の顆粒球として細胞質内に保持されるか、細菌由来の分泌配列によって細胞周辺腔内に送られる。
【0152】
前者の場合、細胞は溶解され、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素により変性させられる。次に、尿素および還元型と酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に透析し、続いて緩衝生理食塩水に対し透析する様にして変性剤を希釈することで、変性ポリペプチドを再度折りたたませ、ダイマー化することができる。後者の場合、細胞を破壊し(例えば超音波処理、または浸透圧ショックにより)細胞周辺腔含有物を放出させ、蛋白質を回収することでポリペプチドを可溶性および機能的な形で回収することができるため、変性や再折りたたみの必要がない。
【0153】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、通常の方法に従い栄養素および選択した細胞の増殖に必要とされるその他成分とを含む培地中にて培養される。限定培地や複合培地を含む各種好適培地が当分野既知であり、一般には炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルが含まれる。培地は更に成長因子または血清の様な成分を随意含むだろう。一般に増殖培地は、例えば薬剤選択により、あるいは発現ベクター上に乗せられ、または宿主細胞にコトランスフェクトされた選択マーカーによって補償されている必須栄養素の欠失により、外来性に加えられたDNAを含む細胞を選別する。
【0154】
P.methanolica細胞は適当な炭素源、窒素源、微量栄養素源を含む培地中、約25℃ないし35℃の温度にて培養される。液体培地には、小型フラスコの振盪、またはファーメンターの噴霧散布の様な通常の方法によって十分な通気が行われる。P.methanolicaに好ましい培地はYEPD(2%D-グルコース、2%BactoTMペプトン(Difco Laboratories, Detroit, MI),1% BactoTM 酵母抽出物(Difco Laboratories)、0.004%アデニンおよび0.006%L-ロイシンである)。
【0155】
本発明の側面の一つでは、GHS-R受容体(膜貫通および細胞内ドメインを含む)は培養細胞により産生され、そしてこの細胞を用い天然リガンドおよび天然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストを含むzsig33リガンドの変異体についてスクリーニングされる。この方法を概略すると、レセプターをコードするcDNAまたは遺伝子を発現に必要な他遺伝的エレメント(例えば転写プロモーター)に結合し、得られた発現ベクターを宿主細胞内に挿入するDNAを発現し、機能的受容体を産生する細胞を選別し、核種スクリーニングシステムに使用される。
【0156】
一般には、同一種に由来する宿主細胞および受容体が使用される。しかし細胞株はいずれかの種に由来する複数の受容体サブユニットを発現する様に加工することができ、これにより種特異性に起因する潜在的限界を克服できる。あるいはBaF3細胞株でマウスcDNAを利用する様に、ヒト受容体cDNAの種相同体をクローニングし同種由来細胞株に用いることができる。この様にしてIL-3の様な造血性増殖因子に依存する細胞株をzsig33リガンド依存性にすることができる。
【0157】
機能的GHS-Rを発現している細胞はスクリーニングアッセイに使用される。各種好適アッセイが当分野で知られている。これらアッセイは標的細胞中での生物学的反応の検出をベースとしている。この様なアッセイの一つは細胞増殖アッセイである。細胞は試験化合物存在下または非存在下に増殖され、細胞の増殖を例えばトリチウム標識チミジンの取り込みを測定すること、またはAlymar BlueTM(AccuMed、シカゴ、IL)または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)(Mosman、J.Immuno.Meth.65:55-63、1983)の代謝分解に基づく比色アッセイにより検出される。その他アッセイもここに掲載されている。
【0158】
別のアッセイはホスホリパーゼCシグナル伝達を利用し、受容体結合を測定する。典型的なこの種のアッセイは、生物発光性Ca2+感受性受容体他泊質であるエコーリンを用いてCa2+の放出を測定する。このアッセイについてはFeighner、S.D.ら、上記に詳しく記載されている。従って、zsig33ペプチドはホスホリパーゼC伝達を測定するアッセイを利用し試験することができる。
【0159】
本発明の蛋白質は、非天然型アミノ酸残基も含むことができる。非天然型アミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2、4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3、3-ジメチルプロリン、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。
【0160】
非天然型アミノ酸を蛋白質に取り込む方法は幾つか当分野で知られている。例えば化学的にアミノアシル化された抑制tRNAを用いてナンセンス突然変異を抑制するインビトロシステムが使用できる。アミノ酸を合成する方法およびtRNAをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、E.coliS30抽出物および市販の酵素およびその他試薬を含む無生物系で実施される。
【0161】
蛋白質はクロマトグラフィーにより精製される。例えばRobertosnら、J.Am.Chem,Soc.113:2722、1991;Ellmanら、Methods Enzymol.202:301、1991;Chungら、Science 259:806-9、1993;およびChungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9、1993を参照)。第2の方法では、翻訳は変異させたmRNAおよび化学的にアミノアシル化された抑制tRNAをマイクロインジェクションをして、Xenopus(アフリカツメガエル)卵細胞内にて実施される(Turcattiら、J.Biol.Chem.271:19991-8、1996)。
【0162】
第3の方法では、E.coliを置き換え様とする天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)を含まず、そして所望の非天然型アミノ酸(例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニンまたは4-フルオロフェニルアラニン)を含む培地で培養する。非天然型アミノ酸は、その天然型に代わって蛋白質内に取り込まれる。Koideら、Biochem.33:7470-6、1994参照。天然型アミノ酸残基はインビトロ化学修飾により非天然型種に変換することができる。化学修飾は部位指定突然変異誘発と組み合わせることができ、置換範囲をさらに拡張できる(WynnとRichards,Protein Sci.2:395-403、1993)。
【0163】
zsig33またはGHS-Rアミノ酸残基と置換できる非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、非天然型アミノ酸および異常アミノ酸の数は限定されるだろう。
本発明のポリペプチドは、混入高分子に関して、特にその他蛋白質及び核酸について純度80%以上に精製されることが好ましく、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、そして特に好ましくは薬学的に純粋な状態、即ち99.9より高い純度であり、そして感染性および発熱性作用物質は含まないことが好ましい。好ましくは精製ポリペプチドは実質他のポリペプチド、特に動物起源の他ポリペプチドを含まない。
【0164】
発現組換え体zsig33およびGHS-R蛋白質(キメラポリペプチド及び多量体蛋白質)は通常の蛋白質精製方法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組合せにより精製される。一般的にはAffinity Chromatography ; Principles & Mehtods、Pharmacia LKB Biotechnology、Uppsala、Sweden、1988;およびScopes、Protein Purification ; Principles and Practice、Springer-Verlag、New York、1994を見よ。ポリヒスチジンアフィニティータグ(典型的には約6個のヒスチジンタグ)を含む蛋白質は、ニッケルキレート樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【0165】
例えばHouchuliら、Bio/Technol.6:1321-1325、1988参照。glu-gluタグを含む蛋白質は通常の方法による免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。例えばGrussenmeyerら、上記を参照。マルトース結合融合体は当分野既知の方法により、アミロースカラムで精製される。
【0166】
本発明のポリペプチドはアニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない方法の組合せにより単離できる。例えば固定金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーは、ポリヒスチジンタグを含む蛋白質を含むヒスチジンに富む蛋白質の精製に利用できる。簡単に説明すると、まずゲルに2価金属イオンを加えキレートを形成させる(Sulkowski、Trends in Biochem.3:1-7、1985)。
【0167】
富ヒスチジン蛋白質は、使用した金属イオンに依存して様々な親和性でこのマトリックスに吸着され、競合溶出液やpHの低下、又は強力なキレート剤の使用により溶出されるだろう。その他精製法としては、レクチンアフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化蛋白質の精製がある(Mehtods in Enzymol.,182巻、“Guide to Protein Purification"、M.Deutshcer(編集)、Acad。Press、San Diego、1990、っp。529-39)。本発明の別の実施態様では、精製を容易にするために所望ポリペプチドとアフィニティータグ(例えばマルトース結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン)の融合体が構築される。
【0168】
zsig33およびGHS-Rポリペプチドはまた、排他的固相合成、部分固相法、断片濃縮または古典的な液系合成を含む当分野既知の方法による化学合成によっても調製できる。例えばMerrifield、J.Am.Chem.Soc.85:2149、1963;Stewartら、Solid Phase Peptide Synthesis(第2版)、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL、1984;BayerとRapp、Chem.Pept.Prot.3:3、1986;およびAthertonら、Solid Phase Peptide Synthesis : A Practical Approach、IRL Press,Oxford、1989を参照せよ。
【0169】
当分野既知の方法を用い、zsig33およびGHS-R蛋白質を単量体または多量体;グリコシル型または非グリコシル型;ペジレート型または非ペジレート型;および開始メチオニンアミノ酸残基を含むあるいは含まない形に調製できる。
【0170】
zsig33ポリペプチドへのGHS-Rポリペプチドの結合は、例えば細胞-細胞相互作用;リガンド-受容体結合および胃ホルモンファミリーメンバーに関連するその他生物学的機能を測定する各種アッセイを用い、測定することができる。特に興味深いものは、胃腸管収縮性の変化、成長ホルモンの変化、体重維持およびグルコース吸収である。リガンド結合および胃腸管収縮性を測定するアッセイは当分野既知であり、ここの実施例中に更に記載されている。成長ホルモン分泌、受容体結合および体重を測定するその他アッセイについては、Hansen、B.S.ら、Eur.J.Endocrinol.141:180-189、1999に記載されている。
【0171】
本発明の、選択的にスプライスされたペプチドを包含するタンパク質は、胃腸の収縮性、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンのモジュレーション、および一般に、胃、十二指腸、空腸、腎臓、小腸、骨格筋、肺、下垂体、視床下部、海馬、および中枢神経系のような組織において、分離において、または他の分子(増殖因子、サイトカイン、およびその他)と組み合わせて働く胃逆流に有効である。zsig33 mRNAの選択的スプライシングは細胞型特異的であり、特定の組織に対する活性を与える。
【0172】
問題の他のアッセイは、筋肉または筋細胞の増殖、分化、発生および/または電子的カップリングの変化を測定または検出する。さらに、繊維芽細胞、筋芽細胞、神経細胞、白血球、免疫細胞、および腫瘍細胞の細胞-細胞相互作用に対するzsig33ポリペプチドの作用は測定するために重要性を有するであろう。なお他のアッセイは、収縮、およびホルモンおよび酵素の分泌の変化を検査する。
【0173】
収縮に対するzsig33ポリペプチド、そのアンタゴニストおよびアゴニストの作用は、電場の刺激の存在または非存在下に、トランジオメーターを使用してin vitroにおいて測定可能である。このようなアッセイはこの分野において知られており、そして組織試料、例えば、胃腸および他の収縮性組織の試料に適用することができ、そしてzsig33ポリペプチド、そのアンタゴニストおよびアゴニストが収縮を増強または抑制するかどうかを決定するために使用することができる。それゆえ、本発明の分子は、収縮性組織に関連する機能障害の治療に有効であるか、あるいはin vivoにおいて収縮を増強または抑制するために使用することができる。それ自体、本発明の分子は胃腸疾患および成長に関係する疾患の治療において実用性を有する。
【0174】
胃腸組織を包含する組織の収縮に対するzsig33ポリペプチド、アンタゴニストおよびアゴニストの作用は、組織の収縮および弛緩を測定する張力計により測定することができる。下記の文献を参照のこと:Dainty他、J. Pharmacol. 100:767、1990;Rhee他、Neurotox. 16:179、1995;Anderson,M. B.、Endocrinol. 114:364-368、1984;およびDowing、S. J.およびSherwood、O. D.、Endocrinol. 116:1206-1214、1985。例えば、大動脈リングの血管拡張の測定はこの分野においてよく知られている。
【0175】
簡単に述べると、4月齢のSDラットラットから大動脈リングを取り、緩衝液、例えば、変性クレーブス溶液(118.5mMのNaCl、4.6mMのKCl、1.2mMのMgSO4・7H2O、1.2mMのKH2PO4、2.5mMのCaCl2・2H2O、24.8mMのNaHCO3および10mMのグルコース)の中に入れる。当業者は認識するように、この方法は他の動物、例えば、ウサギ、他のラット系統、モルモット、およびその他とともに使用することができる。次いでリングを等長力トランスデューサー(Radnoti Inc.、カリフォルニア州モンロビア)に取付け、モネマ(Ponemah)生理学的プラットホーム(Gould Instrument systems,Inc.、オハイオ州ヴァレイビュー)でデータを記録し、緩衝液を含有する酸素化(95%O2、5%CO2)組織浴の中に入れる。
【0176】
組織を1gの静止張力に調節し、試験前に約1時間安定化する。ノレピネフェリン(Sigma Co.、ミゾリー州セントルイス)およびカルバコール、ムスカリンアセチルコリンアゴニスト(Sigma Co.)を使用して、リングの完全性を試験することができる。完全性をチェックした後、リングを新鮮な緩衝液で3回洗浄し、約1時間放置する。試料を大動脈リング組織の血管拡張、または弛緩について試験するために、リングを2gの張力に対して収縮させ、15分間安定化させる。
【0177】
次いでzsig33ポリペプチドの試料を4つの浴の1、2または3に、フラッシュせずに、添加し、リング上の張力を記録し、緩衝液のみを含有する対照リングと比較する。zsig33ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストにより収縮の増大または弛緩をこの方法により直接測定し、それを他の収縮性組織、例えば、胃腸組織に適用することができる。
【0178】
胃腸細胞の収縮の刺激、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化性酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションを測定する種々のアッセイを使用して、本発明の分子の活性を測定することができる。平滑筋細胞の収縮の変化は特に重要である。例えば、哺乳動物十二指腸または他の胃腸平滑筋組織のセグメントの収縮性応答(Depoortere他、J. Gastrointestinal Mortility 1:150-159、1989)。典型的なin vivoアッセイにおいて、横連合間において半径方向および弁基部の平面に対して縦方向における寸法変化を測定するために、超音波マイクロメーターを使用する(Hansen他、Society of Thoracic Surgeons 60:S384-390、1995)。
【0179】
一般に、臨床的設定において胃内容排出に必要な時間および引き続く胃腸管を通る移行時間として胃の運動性を測定する。胃内容排出走査はこの分野においてよく知られており、そして簡単に述べると、経口的造影剤、例えば、バリウム、または放射線標識化食事を使用することを含む。固体および液体を個々に測定することができる。被験食物または液体をアイソトープ(例えば、99mTc)で放射線標識化し、摂取または投与後、ガンマ線カメラを使用して可視化することによって、胃腸管を通過する時間および胃内容排出時間を測定する(Meyer他、Am. J. Dig. Dis. 21:296、1976;Collins他、Gut 24:1117、1983;Maughan他、Diabet. Met. 13 9 Supp. 5:S6-10、1996およびHorowitz他、Arch. Intern. Med. 145:1467-1472、1985)。運動促進剤(promotility agent)の投与の前および後に、これらの研究を実施して薬剤の効能を定量することができる。
【0180】
培養した心臓細胞を使用するか、あるいはin vivoにおいて特許請求の範囲に記載する発明の分子を適当な動物モデルに投与することによって、増殖を測定することができる。一般に、増殖作用は細胞数の増加として観測され、したがって、アポトーシス、ならびに有糸分裂誘発の阻害を包含することができる。培養された細胞は、下垂体、視床下部、海馬から、ならびに胃腸管、腎臓、胃、十二指腸、および空腸に由来する細胞を包含する。当業者は、例えば、ATCC(バージニア州マンナッサス)からの細胞系統を同定することができるであろう、これはzsig33に結合するGHS-Rの結合の効果を研究するときの計装である。細胞増殖を測定するアッセイはこの分野においてよく知られている。
【0181】
例えば、増殖を測定するアッセイは下記のようなアッセイを包含する:中性赤色色素に対する化学感受性(Cavanugh他、Investigational New Drug 8:347-354、1990)、放射能標識化ヌクレオチドの組込み(Cook他、Analytical Biochem. 179:1-7、1989)、増殖する細胞のDNA中の5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)の組込み(Porstmann他、J. Immunol. Methods 82:169-179、1985)、およびテトラゾリウム塩の使用(Mosmann、J. Immunol. Methods 65:55-63、1983;Alley他、Cancer Res. 48:589-601、1988;Marshall他、Growth Reg. 5:69-84、1995;およびScudiero他、Cancer Res. 48:4827-4833、1988)。
【0182】
zsig33がin vivoにおいて化学走性であるかどうかを決定するために、zsig33を皮内または腹腔内注射により投与することができる。系譜特異的細胞表面のマーカーおよび蛍光免疫サイトメトリーを使用するか、あるいは免疫組織化学的方法により、注射部位に蓄積した白血球を特性決定することができる(Jose、J. Exp. Med. 179:881-87、1994)。また、骨髄から末梢血の中への特異的白血球集団の解放をzsig33注射後に測定することもできる。
【0183】
末端分化または脱分化に向かって経路を下る特異的細胞型を刺激する因子は、共通の前駆体または幹細胞に由来する全細胞集団に影響を与えることを示唆する証拠が存在する。こうして、zsig33ポリペプチドは、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の内分泌および外分泌細胞の阻害または増殖を刺激することができる。
【0184】
本発明の分子は、胃腸/上皮細胞の増殖または分化を刺激するが、共通の前駆体/幹細胞に対する影響のために、神経細胞の増殖または分化を阻害する。本発明の新規なポリペプチドは、神経および上皮幹細胞および胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の子孫細胞を、in vivoおよびex vivoの両方において、研究するために有効である。
分化を測定するアッセイは、例えば、組織の段階特異的発現に関連する細胞マーカー、酵素活性、機能的活性または形態学的変化を測定することを包含する(Watt、FASEB 5:281-284、1991;Francis、Differentiation 57:63-75、1994;Raes、Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses、161-171、1989)。
【0185】
本発明のzsig33ポリペプチドを使用して、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓における増殖または分化を研究することができる。このような本発明の方法は、一般に、これらの組織に由来する細胞をzsig33ポリペプチド、そのモノクローナル抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの存在および非存在下にインキュベートし、細胞の増殖または分化の変化を観測することを含んでなる。これらの組織からの細胞系統は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(バージニア州マナサス)から商業的に入手可能である。
【0186】
本発明の、選択的にスプライスされたペプチドを包含するタンパク質は、胃腸の収縮性、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションを研究するために有効である。zsig33の分子、変異型、およびフラグメントは、胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓における単離において、あるいは他の分子(増殖因子、サイトカイン、およびその他)と組み合わせて適用することができる。
【0187】
成長ホルモンの潜在的用途は広範であり、骨形成(例えば、骨粗鬆症の治療、骨の形成および修復の加速、骨芽細胞の刺激、骨の改造および軟骨の成長、および骨格形成異常);免疫(例えば、免疫系の刺激、免疫抑制患者の治療);肥満症、および代謝障害(例えば、グルココルチコイドの異化的副作用の予防、肥満症および肥満症に関係する成長遅延の治療、外科手術後のタンパク質異化的応答の減衰、慢性病、例えば、癌またはエイズのための悪液質およびタンパク質喪失の減少);小人症(例えば、成長遅延および生理学的に短い身長、例えば、ホルモン欠乏症およびクローミック病、および子宮内成長遅延);創傷治癒(例えば、創傷修復の加速、熱傷患者の回復の加速および遅延した創傷治癒の患者の治療);生殖(例えば、排卵誘導の補助的治療);
【0188】
ならびにストレスに関連する症状;腎臓および肺の機能障害に関連する症状;老化および中年過ぎに関連する症状、例えば、筋強度、骨脆弱化および皮膚厚さ;および神経内分泌活性、例えば、睡眠に関連する疾患および症状の治療を包含する。こうして、成長ホルモンの分泌促進物質、例えば、zsig33ポリペプチドは、これらの障害に関連する症状の治療に有効であろう。成長ホルモンの放出を測定するアッセイはこの分野において知られている。
【0189】
胃腸機能と脳機能との間の関連は、このクラスにおける他のホルモンについて観測された。1例として、自閉症の子供におけるセクレチン注入は胃腸症候の改善ならびに行動の劇的改善を生じた(眼接触、警戒および表現言語の改善)。下記の文献を参照のこと:Hovrath、K. 他、J. Assoc. Acad. Minor Phys 9(1):9-15、1998。同様に、胃腸症候を有する自閉症の子供における上部の胃腸管の研究により、多数が逆流性食道炎、慢性胃炎、および慢性十二指腸炎、ならびに非自閉症の子供に比較して十二指腸陰窩におけるパネート細胞の数の増加を有することが示された。
【0190】
下記の文献を参照のこと:Horvath、K. 他、J. Pediatr. ad. Minor Phys 9(1):9-15、1998。自閉症の子供へのセクレチン投与は、膵-胆汁出力を増加させ、流体出力を高めた。胃腸障害、特に逆流性食道炎および二糖吸収不良は、非失語症自閉症患者の行動本発明問題に寄与することがある。セクレチン注入後に観測された膵-胆汁分泌の増加は、セクレチンレセプターのアップレギュレーションを示唆する。タンパク質の腸-ホルモンファミリーのメンバーとして、zsig33は、そのレセプターへの結合により、神経発育および/または利用に対する作用を有することがある。
【0191】
本発明のタンパク質は治療剤のデリバリーに有効であり、このような治療剤はプロテアーゼ、ラジオヌクレオチド、化学療法剤、および小分子を包含するが、これらに限定されない。これらの治療剤の効果はin vitroにおいて培養した細胞を使用して、ex vivoにおいて組織スライスについて、またはin vivoにおいて特許請求した発明の分子を適当な動物モデルに投与することによって測定することができる。本発明のタンパク質をアッセイする別のin vivoアプローチはウイルスデリバリーシステムを包含する。この目的に典型的なウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ関連ウイルス(AAV)を包含する。
【0192】
アデノウイルスは、二本鎖DNAウイルスであり、現在異種核酸の送達のために最良に研究されている遺伝子転移ベクターである(概観については、下記の文献を参照のこと:T. C. Becker他、Mol. Cell. Biol. 43:161-89、1994;およびJ. T. DouglasおよびD. T. Curiel、Science and Medicine 4:44-53、1997)。アデノウイルス系はいくつかの利点を提供する:アデノウイルスは(i)比較的大きいDNAインサートを収容することができる;(ii)高い力価に増殖することができる;(iii)広い範囲の哺乳動物細胞型を感染することができる;そして(iv)異なるプロモーターを含有する多数の異なる入手可能なベクターロモーターとともに使用することができる。
【0193】
また、アデノウイルスは血流中で安定であるので、静脈内注射により投与できる。アデノウイルスゲノムの一部分を欠失させることによって、異種DNAの大きいインサート(7kbまで)を収容することができる。直接的結合によるか、あるいは共トランスフェクトされたプラスミドを使用する相同的組換えにより、これらのインサートはウイルスDNAの中に組込まれる。典型的な系において、必須E1遺伝子はウイルスベクターから欠失されており、そしてE1遺伝子が宿主細胞(ヒト293細胞系統は典型である)により提供されないかぎり、ウイルスは複製しないであろう。
【0194】
無傷の動物に静脈内投与されるとき、アデノウイルスは肝臓を主としてターゲットする。アデノウイルスデリバリーシステムがE1遺伝子の欠失を有する場合、ウイルスは宿主細胞中で複製することができない。しかしながら、宿主細胞の組織(例えば、肝臓)は異種タンパク質を発現しかつプロセスするであろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する)。分泌されたタンパク質は高度に血管化した肝臓中の循環の中に入り、感染した動物に対する作用を測定することができる。
【0195】
その上、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターを使用して、ベクターに対する免疫応答を排除することを試みることができる。このようなアデノウイルスはE1が欠失されており、さらにE2AまたはE4の欠失を含有する(Lusky、M. 他、J. Virol. 72:2022-2032、1998;Raper、S. E. 他、Human Gene Therapy 9:671-679、1998)。さらに、E2bの欠失は免疫応答を減少させると報告されている(Amalfitano、A. 他、J. Virol. 72:926-933、1998)。
【0196】
その上、全体のアデノウイルスゲノムを欠失させることによって、異種DNAの非常に大きいインサートを収容することができる。すべてのウイルス遺伝子が欠失されているいわゆる「グートレス(gutless)」アデノウイルスの発生は、異種DNAの大きいインサートの挿入のために特に好都合である。概観については、下記の文献を参照のこと:Yeh、P.およびPerricaudet、M.、FASEB J. 11:615-623、1997。
【0197】
また、アデノウイルス系をタンパク質のin vitro産生のために使用することができる。細胞が急速に分裂しない条件下にアデノウイルス感染非293細胞を培養することによって、細胞は延長した時間の間タンパク質を産生することができる。例えば、BHK細胞を細胞ファクトリー中でコンフルエンスに成長させ、次いで問題の分泌されたタンパク質をコードするアデノウイルスベクターに対して暴露させる。次いで細胞を無血清条件下に成長させ、これにより感染した細胞は有意な細胞分裂なしに数週間生き残ることができる。
【0198】
選択的に、アデノウイルスベクターが感染した293細胞を比較的高い細胞密度において懸濁培養で成長させて、有意な量のタンパク質を産生することができる(Garnier他、Cytotechnol. 15:145-55、1994参照)。いずれのプロトコルを使用しても、発現され、分泌された異種タンパク質を細胞培養の上清から反復して単離することができる。感染した293細胞産生プロトコルにおいて、非分泌タンパク質をまた効果的に得ることができる。
【0199】
可溶性または細胞表面のタンパク質として、zsig33およびGHS-Rペプチドの活性はシリコンをベースとするバイオセンサーミクロフィジオメーターにより測定できる。このバイオセンサーミクロフィジオメーターは、細胞表面タンパク質の相互作用に関連する細胞外酸性化速度またはプロトン外分泌を測定し、引き続いて生理学的細胞応答を測定する。典型的な装置はCytosensorTM(Molecular Devices、カリフォルニア州サニーヴェイル製)である。種々の細胞応答、例えば、細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症性応答、調節およびレセプターの活性化、およびその他をこの方法により測定することができる。
【0200】
例えば、下記の文献を参照のこと:McConnell、H. M. 他、Science 257:1906-1912、1992;Pitchford、S. 他、Meth. Enzymol. 228:84-108、1997;Arimilli、S. 他、J. Immunol. Meth. 212:49-59、1998;Van Liefde、I. 他、Eur. J. Pharmacol. 346:87-95、1998。付着性または非付着性真核細胞または原核細胞をアッセイするために、ミクロフィジオメーターを使用することができる。細胞培地中の細胞外酸性化の変化を経時的に測定することによって、ミクロフィジオメーターは、zsig33タンパク質、それらのアゴニストおよびアンタゴニストを包含する種々の刺激因子に対する細胞の応答を直接測定する。
【0201】
好ましくは、ミクロフィジオメーターを使用して、GHS-Rを発現しないしない対照真核細胞に比較して、GHS-Rを表面上で発現する真核細胞の応答を測定する。このようなGHS-R発現性真核細胞は、内因的GHS-Rポリヌクレオチド配列を発現する細胞、およびポリヌクレオチド配列、またはGHS-Rポリヌクレオチド配列の一部分を含有するフラグメントまたはキメラ配列、すなわち、配列番号4または6が挿入された細胞を包含する。zsig33に対して暴露しない対照に関係して、zsig33ポリペプチドに対して暴露した細胞の応答の変化により測定した差は、zsig33仲介細胞応答の直接的測定値である。
【0202】
その上、zsig33仲介細胞応答を種々の刺激下に測定することができる。本発明は、zsig33ポリペプチドに対して応答性である細胞を準備し、被検化合物の非存在下に細胞の第1部分を培養し、被検化合物の存在下に細胞の第2部分を培養し、そして細胞の第1部分に比較して細胞の第2部分の細胞の応答の変化を検出することを含んでなる、zsig33タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を提供する。細胞応答の変化は、細胞外酸性化速度の測定可能な特徴として示される。
【0203】
その上、zsig33ポリペプチドの存在下および被検化合物の非存在下における細胞の第3部分を培養することは、zsig33刺激細胞のための陽性対照、および被検化合物のアゴニスト活性とzsig33ポリペプチドのそれとを比較するための対照を提供する。被検化合物の存在および非存在下にzsig33タンパク質に対して細胞を暴露することによってzsig33のアンタゴニストを同定することができ、それによりzsig33刺激活性の減少は被検化合物におけるアゴニスト活性を示す。
【0204】
その上、zsig33を使用して、GHS-Rを発現する追加の細胞、組織、または細胞系統、またはzsig33刺激経路に対して応答する他の細胞を同定することができる。前述のミクロフィジオメーターを使用して、本発明のzsig33に対して応答性である細胞を急速に同定することができる。細胞をzsig33ポリペプチドの存在または非存在下に培養することができる。zsig33の存在下に細胞外酸性化の測定可能な変化を誘発する細胞は、zsig33に対して応答性である。前述したように、このような細胞系統を使用して、亜鉛酵素の追加のイソ型、zsig33ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを同定することができる。同様に、この方法においてミクロフィジオメーターを使用して、zsig33により活性化を維持するGHS-Rの変異型を同定することができる。
【0205】
本発明により提供される追加のアッセイは、ハイブリッドレセプターポリペプチドの使用を包含する。これらのハイブリッドポリペプチドは2つの一般的クラスに入る。第1クラスにおいて、GHS-Rの細胞内ドメインは、配列番号5のほぼ残基327〜366を含んでなり、第2レセプターのリガンド結合性ドメインに結合されている。第2レセプターはGタンパク質結合レセプター、例えば、モチリンレセプター、GPR38であることが好ましい。ハイブリッドレセプターはさらにトランスメンブランドメインを含んでなり、このドメインはいずれのレセプターからも由来されることができる。次いでハイブリッドレセプターをコードするDNA構築物を宿主細胞の中に挿入する。
【0206】
ハイブリッドレセプターを発現する細胞をモチリンの存在下に培養し、応答についてアッセイする。この系はGHS-Rにより仲介されるシグナルトランスダクションを分析すると同時に、容易に入手可能なリガンドを使用する手段を提供する。また、特定の細胞系統がGHS-Rによりトランスデュースされたシグナルに対して応答することができるかどうかを決定するために、この系を使用することができる。ハイブリッドレセプターポリペプチドの第2クラスは、GHS-Rの細胞外(リガンド結合性)ドメイン(配列番号5のほぼ残基1〜326)を含んでなり、第2レセプター、好ましくはGタンパク質結合レセプターの細胞質ドメイン、およびトランスメンブランドメインを有する。
【0207】
トランスメンブランドメインはいずれのレセプターにも由来することができる。この第2クラスのハイブリッドレセプターは、第2レセプターによりトランスデュースされたシグナルに対して応答することができる細胞において発現される。一緒に、これらの2つの細胞のハイブリッドレセプターはレセプターに基づくアッセイ系において広いスペクトルの細胞型を使用することができる。
【0208】
他の細胞応答、例えば、化学走性、接着、イオンチャンネル流入の変化、第2メッセンジャーレベルの調節および神経伝達物質の放出を測定するために、アッセイを使用することができる。このようなアッセイはこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと:″Basic & Clinical Endocrinology Ser.、Vol. Vol. 3、″Cytochemical Bioassay:Techniques & Applications、Chayen;Chayen、Bitensky、編者、Dekker、New York、1983。
【0209】
zsig33およびGHS-Rの発現について観測された組織分布(すなわち、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓)にかんがみて、zsig33のアゴニスト(天然または合成のペプチドを包含する)およびアンタゴニストはin vitroおよびin vivoの双方の用途において多数の潜在的能力を有する。zsig33のアゴニストとして同定された化合物は、in vitroまたはin vivoにおける胃腸の収縮性、栄養吸収、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションを研究するために有効である。
【0210】
例えば、zsig33およびアゴニスト化合物は規定された細胞培地の成分として有用であり、そして単独で、あるいは他のサイトカインおよびホルモンと組み合わせて使用して、細胞培養において普通に使用される血清を置換することができる。こうして、アゴニストは培養において胃腸細胞、G細胞、腸管クロム親和性細胞および胃、十二指腸、空腸、ならびに腎臓、肺、および膵臓の上皮粘膜の細胞の増殖および/または発生を特異的に促進するために有効である。さらに、小分子を包含する、zsig33ポリペプチドおよびzsig33アゴニストは、例えば、胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の拡大、分化、および/または細胞-細胞の相互作用のための、研究因子として有効である。zsig33ポリペプチドをこれらの細胞型のための組織培養培地に添加する。
【0211】
腸-脳ペプチドのファミリーは神経学的およびCNS機能に関係づけられてきた。例えば、NPY、脳および腸の両方におけるレセプターを有するタンパク質は、中枢神経系に投与したとき、食欲を刺激することが示された(Gehlert、Life Sciences 55(6):551-562、1994)。モチリン免疫反応性は脳の異なる領域、特に小脳、および下垂体において同定された(Gasprini他、Hum. Genetics 94(6):671-674、1994)。モチリンは小脳において神経伝達物質γ-アミノ酪酸と共存することが発見された(Chan-Patay、Proc. Sym. 50th Anniv. Meet. Br. Pharmalog. Soc.:1-24、1982)。
【0212】
モチリンは栄養補給行動(Rosenfield 他、Phys. Behav. 39(6):735-736、1987)、膀胱制御、下垂体成長ホルモンの放出に対してある作用を有することを示す、いくつかの証拠が生理学的研究により提供された。他の腸-脳ペプチド、例えば、CCK、エンケファリン、VIPおよびセクレチンは、消化系において活性であることに加えて、血圧、心拍数、行動、および疼痛モジュレーションの制御に関係することが示された。したがって、GHS-Rまたはそのいくつかの部分に対するzsig33の結合は、いくつかの神経学的関連性を有することを期待できる。
【0213】
さらに、腸-脳ペプチドの他のメンバー、例えば、CCK、ガストリン、およびその他は、膵臓の酵素およびホルモンの分泌をモジュレートすることが示された。膵臓内のGHS-Rの位置(Guan、X. M. 他、Mol. Brain Res. 48:23-29、1997参照)は、膵臓の酵素およびホルモンの分泌をモジュレートするためにGHS-Rに対するzsig33ペプチドの結合を使用できることを示唆する。
【0214】
同様に、腸-脳ペプチドの他のメンバーは、例えば、グルカゴンがインスリンの分泌をモジュレートする方法で、内因的タンパク質の分泌をモジュレートすることが知られている。一般に、成長ホルモンの分泌促進物質の1つの利点は、内因的拍動性成長ホルモン分泌を増幅すると同時に正常のフィードバックメカニズムを維持する能力をそれらが有することである。他の重要な効果は、中年過ぎの大人におけるインスリン様増殖因子-I(IGF-I)レベルを若い大人のそれに類似する濃度に回復させる能力である。Hansen、前掲、参照。こうして、GHS-Rのリガンドとして、zsig33は成長ホルモンおよびインスリン様増殖因子Iの分泌をモジュレートするために有効である。さらに、非zsig33タンパク質、例えば、GLP-1、ソマトスタチン、およびその他の分泌をモジュレートするために、zsig33ペプチドを使用することができる。
【0215】
本発明のアミノ酸およびDNA配列の部位特異的変化を使用して、アンタゴニスト、アゴニストまたは部分的アゴニストであるアナローグをつくることができる(Macielay他、Peptides:Chem. Struct. Biol. pp. 659、1996)。アンタゴニストは、胃腸の運動過度に関連する臨床的症状、例えば、下痢およびクローン病に有効である。また、アンタゴニストはリガンド-レセプター相互作用の部位を特性決定するための研究試薬として有用である。
【0216】
また、アンタゴニストは補体/抗補体の対間の相互作用部位にならびに細胞-細胞の相互作用部位を特性決定するための研究試薬として有効である。zsig33活性のインヒビター(zsig33アンタゴニスト)は、抗zsig33抗体および可溶性zsig33ポリペプチド(例えば、配列番号2)ならびに他のペプチドおよび非ペプチド因子(リボザイムを包含する)を包含する。
【0217】
また、zsig33はその活性のインヒビター(アンタゴニスト)を同定するために使用できる。被験化合物を本明細書に開示するアッセイに添加して、zsig33活性を阻害する化合物を同定する。本明細書に開示するアッセイに加えて、リガンド/レセプターの結合またはzsig33依存的細胞応答の刺激/阻害を測定するように設計された種々のアッセイにおいて、試料をzsig33活性の阻害について試験することができる。例えば、zsig33刺激細胞経路に対して応答性であるリポーター遺伝子構築物で、zsig33応答性細胞系統をトランスフェクトすることができる。この型のリポーター遺伝子構築物はこの分野において知られており、そしてアッセイ可能なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、または代謝物質、例えば、環状AMPをコードする遺伝子に作用可能に連鎖されたDNA応答因子を一般に含んでなる。
【0218】
DNA応答因子は下記のものを包含するが、これらに限定されない:環状AMP応答因子(CRE)、ホルモン応答因子(HRE)、インスリン応答因子(IRE)(Nasrin他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7、1990)および血清応答因子(SRE)(Shaw他、Cell 56:563-72、1989)。環状AMP応答因子は下記の文献において概観されている:Roestler他、J. Biol. Chem. 263(19):9063-6、1988、およびHabener、Molec. Endocrinol. 4(8):1087-94、1990。ホルモン応答因子はBeato、Cell 56:335-44、1989において概観されている。ポーター遺伝子構築物と思われる1つは、リガンドに結合すると、例えば、環状AMP応答要素を通して細胞内的にシグナルを発生するGタンパク質結合レセプターを含有するであろう。
【0219】
ポーター遺伝子と思われる1つはルシフェラーゼ遺伝子である(de Wet他、Mol. Cell. Biol. 7:725、1987)。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、この分野において知られている方法を使用してルミネセンスにより検出される(例えば、Baumgartner他、J. Biol. Chem. 269:19094-29101、1994;SchenbornおよびGoiffin、Promega Notes 41:11、1993)。ルシフェラーゼアッセイキットは、例えば、プロメガ・コーポレーション(Promega Corp.、ウイスコンシン州マディソン)から商業的に入手可能である。この型のターゲット細胞系統を使用して、化学物質、細胞のコンディショニングされた培地、菌類のブロス、土壌の試料、水の試料、およびその他のライブラリーをスクリーニングすることができる。
【0220】
候補の化合物、溶液、混合物または抽出物をターゲット細胞に対するzsig33活性を阻害する能力について試験する。これはリポーター遺伝子の発現のzsig33刺激の減少により証明される。この型のアッセイは、GHS-Rに対するzsig33に対する結合を直接的にブロックする化合物、ならびに細胞経路におけるプロセスをブロックする化合物を検出するであろう。別法において、検出可能な標識(例えば、125I、ビオチン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、FITC、およびその他)で標識化したzsig33を使用して、GHS-Rに対するzsig33の結合の直接的ブロッキングについて、化合物または他の試料を試験することができる。
【0221】
この型のアッセイにおいて、GHS-Rに対する標識化zsig33の結合を阻害する被験試料の能力は阻害活性を指示し、これは二次アッセイにより確認することができる。結合アッセイにおいて使用するレセプターは、細胞のレセプター、例えば、GHS-R、可溶性レセプター、または単離された固定化レセプターであることができる。さらに、この種類のアッセイを使用して、zsig33ペプチドの機能的変異型、ならびにGHS-R変異型を同定することができる。
【0222】
他のアッセイは、Gα16を発現する細胞系統、およびアゴニスト活性についてのスクリーニング系において、カルシウム感受性光タンパク質、エクオリンを使用する。この系(Stable、J.他、Anal. Biochem. 252:115-126、1997)は、任意のGタンパク質結合レセプターとカップリングするためにGα16タンパク質を使用する。レセプターの結合は、細胞内カルシウム濃度を増加させる。細胞をケレンテラジンと前インキュベートし、細胞内カルシウムはエクオリン(これはまた細胞の中にトランスフェクトされている)と反応し、そしてケレンテラジンは発光応答を生ずる。下垂体、視床下部、および膵臓からの細胞系統はこのアッセイにおけるGHS-Rのために有効であろう。
【0223】
また、zsig33ポリペプチド、それらのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、胃、肺、下垂体、視床下部、海馬、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の組織における、創傷の治癒を促進するために療法上有効であろう。本発明のzsig33ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストにおけるこの能力の存在を確認するために、このようなzsig33ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストをこの分野において知られている手順に従い創傷治癒を促進する能力に関して評価する。所望ならば、これに関するzsig33ポリペプチドの性能を増殖因子、例えば、EGF、NGF、TGF-α、TGF-β、インスリン、IGF-I、IGF-II、繊維芽細胞増殖因子(FGF)およびその他と比較する。さらに、zsig33ポリペプチドまたはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストを1またはそれ以上の増殖因子と組合わせて評価して相乗作用を同定することができる。
【0224】
また、GHS-Rをzsig33の精製に使用することができる。ポリペプチド(すなわち、配列番号5)を、使用条件下に安定である、固体支持体、例えば、アガロース、架橋アガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド樹脂、およびその他の物質のビーズ上に固定化する。固体支持体にポリペプチドを結合する方法はこの分野において知られており、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化およびヒドラジド活性化を包含する。得られる媒質は一般にカラムの形態に形造られ、そしてzsig33ポリペプチドを含有する流体をカラムに1回またはそれ以上の回数通過させて、zsig33ポリペプチドをGHS-Rポリペプチドに結合させる。次いで塩濃度変化、カオトロープ剤(グアニジンHCl)、またはレセプターの結合を崩壊させるpHを使用して、zsig33ポリペプチドを溶離する。
【0225】
リガンド結合性レセプター(または抗体、補体/抗補体の対の一方のメンバーまたは他の細胞表面結合性タンパク質)またはその結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセンサー計装(BIAcoreTM、Pharmacia Biosensor、ニュージャージイ州ピスカタウェイ)を使用するアッセイシステムを好都合に用いることができる。このようなレセプター(すなわち、GHS-R)、抗体、補体/抗補体の対のメンバーまたはフラグメントをレセプターのチップ表面上に固定化する。この計装の使用は、Karlsson、J. Immunol. Methods 145:229-40、1991およびCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234:554-63、1993、に開示されている。
【0226】
レセプター、抗体、メンバーまたはフラグメントを、アミンまたはスルフヒドリルの化学を使用して、フローセル内の金薄膜に結合させたデキストラン繊維に共有結合させる。試験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトープ、または補体/抗補体の反対のメンバーが試料の中に存在する場合、それはそれぞれ固定化されたレセプター、抗体またはメンバーに結合し、媒質の屈折率を変化させ、これを金薄膜表面のプラズモンの共鳴の変化として検出する。このシステムは、オンおよびオフの割合の測定(これから結合アフィニティーを計算することができる)および結合の化学量論的評価を可能とする。
【0227】
GHS-Rポリペプチドおよび他のレセプターポリペプチドを、また、この分野において知られている他のアッセイシステムにおいて使用することができる。このようなシステムは、結合アフィニティーを測定するスキャッチャード分析(Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72、1949、参照)および比色アッセイ(Cunningham他、Science 253:545-48、1991;Cunningham他、Science 245:821-25、1991、参照)を包含する。
【0228】
「可溶性タンパク質」は細胞膜に結合しないタンパク質である。可溶性タンパク質は、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠如する、最も普通にリガンド結合性ポリペプチドである。可溶性タンパク質は追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するか、または基質にポリペプチドを基質に結合させる部位を提供する親和標識、または免疫グロブリンの定常領域の配列を含んでなることができる。多数の細胞表面のタンパク質は、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選択的にスプライスされたmRNAから翻訳された、天然に存在する、可溶性対応物を有する。タンパク質は、それぞれ、膜定着またはシグナルトランスダクションを提供するために十分なこれらのセグメントの部分を欠如するとき、タンパク質はトランスメンブランおよび細胞内ポリペプチドのセグメントを実質的に含まないと言われる。
【0229】
本発明の分子は、GHS-Rの他のイソ型、または他のGタンパク質、細胞表面結合性タンパク質、または腸-ホルモン相互作用に関係する補体/抗補体の対のメンバーを同定し、単離するために使用することができる。例えば、zsig33のタンパク質およびペプチドをカラム上に固定化し、そして膜調製物をカラム上に展開することができる(Immobilized Affinity Ligand Techniques、Hermanson他、編、Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ、1992、pp. 195-202)。タンパク質およびペプチドを放射線標識化する(Methods in Enzymol.、vol. 182、″Guide to Protein Purification″、M. Deutscher、編、Acad. Press、サンディエゴ、1990、721-37)か、あるいはフォトアフィニティー標識化し(Brunner他、Ann. Rev. Biochem. 62:483-514、1993およびFedan他、Biochem. Pharmacol. 33:1167-80、1984)そして特異的細胞表面タンパク質を同定することができる。
【0230】
本発明の分子は、胃腸の収縮性、栄養吸収、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションにおいて有効であろう。本発明の分子は、リガンド-レセプターの結合をモジュレートするか、あるいは多様な組織、例えば、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓における病理学的症状の発生を治療または予防するために使用することができる。特に、ある種の疾患はこのような診断、治療または予防が可能である。
【0231】
本発明の分子を使用して、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓におけるニューロンおよび筋細胞の阻害および増殖をモジュレートすることができる。本発明のポリペプチド、核酸および/または抗体は、例えば、胃逆流、胃不全麻痺、下垂体ホルモン、例えば、成長ホルモン、および/または成長ホルモン刺激ホルモンの分泌のモジュレーション、クローン病、代謝的消耗、胃潰瘍、体重管理、受精能、発育生殖系の疾患、および成人病に関連する障害の診断、治療または予防において使用することができる。
【0232】
zsig33および/またはGHS-Rポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zsig33/GHS-R結合活性を増加または阻害させようとする遺伝子治療の用途において有効である。哺乳動物が突然変異したzsig33またはGHS-R遺伝子をもつか、あるいはzsig33遺伝子またはGHS-Rをもたない場合、その遺伝子を哺乳動物の細胞の中に導入することができる。1つの態様において、zsig33またはGHS-Rポリペプチドをコードする遺伝子をin vivoにおいてウイルスベクターの中に導入する。
【0233】
このようなベクターは、弱毒化または欠陥DNAウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、肺炎ウイルス、EBウイルス(EBV)、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)、およびその他を包含するが、これらに限定されない。欠陥ウイルスは、ウイルス遺伝子を完全にまたはほとんど完全に欠如し、このようなウイルスは好ましい。欠陥ウイルスは、細胞の中に導入された後、感染性ではない。
【0234】
欠陥ウイルスベクターを使用すると、ベクターが他の細胞を感染することができるということを無視して、特定の局在化区域における細胞への投与が可能となる。特定のベクターの例は下記のものを包含するが、これらに限定されない:欠陥単純ヘルペスウイルス1(HSV1)のベクター(Kaplitt他、Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30、1991);弱毒化アデノウイルス、例えば、Stratford-Perricaudet他、J. Clin. Invest. 90:626-30、1992、に記載されているベクター;および欠陥アデノ関連ウイルスのベクター(Samulski他、J. Virol. 61:3096-101、1987;Samulski他、J. Virol. 63:3822-8、1989)。
【0235】
さらに、細胞表面分子として、GHS-Rポリペプチドは遺伝子治療を細胞の中に導入するターゲットとして使用することができる。この用途はGHS-Rが通常発現される細胞、例えば、下垂体、視床下部、および海馬の細胞の中に療法的遺伝子を導入するために特に適当である。例えば、ウイルス遺伝子治療、例えば、前述したような遺伝子治療を、ウイルスレセプターよりむしろ、細胞レセプター、例えば、GHS-Rポリペプチドを発現する特定細胞型にターゲッティングすることができる。ターゲット細胞表面上のGHS-R分子を認識する抗体、または他の分子、例えば、zsig33ペプチドを使用して、ウイルスがそのターゲット細胞を感染しかつ遺伝子治療物質をその細胞に投与させるようにすることができる。
【0236】
下記の文献を参照のこと:Woo、S. L. C.、Nature Biotech. 14:1538、1996;Wickham、T. J. 他、Nature Biotech. 14:1570-1573、1996;Douglas、J. T. 他、Nature Biotech. 14:1574-1578、1996;Rihova、B.、Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169、1997;およびVile、R. G. 他、Mol. Med. Today 4:84-92、1998。例えば、GHS-R特異的抗体に対してカップリングされたウイルス中和性Fabフラグメントを含有する二重特異的抗体を使用して、GHS-Rを発現する細胞にウイルスを向け、遺伝的因子を含有するウイルスを細胞の中に効率よく導入することができる。例えば、下記の文献を参照のこと:Wickham,T. J. 他、J. Virol. 71:7663-7669、1997;およびWickham,T. J. 他、J. Virol. 70:6831-6838、1996。
【0237】
他の態様において、zsig33またはGHS-R遺伝子を、例えば、下記の文献に記載されているように、レトロウイルスのベクターの中に導入することができる:Anderson他、米国特許第5,399,346号;Mann他、Cell 33:153、1983;Temin他、米国特許第4,650,764号;Temin他、米国特許第4,980,289号;Markowitz他、J. Virol. 62:1120、1988;Temin他、米国特許第5,124,263号;Dougherty他、国際特許公開No.WO 95/07358、公開、1995年3月16日;およびKuo他、Blood 82:845、1993。選択的に、ベクターはリポソームを使用するin vivoにおけるリポフェクションにより導入することができる。
【0238】
合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のin vivoトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる(Felgner他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7、1987;Mackey他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31、1988)。in vivoにおいて特定の器官の中に外因的遺伝子を導入するためにリポフェクションを使用することは、ある種の特定の利点を有する。リポソームを特定の細胞にターゲッティングする分子は、利益の1つの領域を表す。さらに詳しくは、特定の細胞にトランスフェクションを向けることは利益の1つの領域を表す。
【0239】
例えば、特定の細胞型にトランスフェクションを向けることは、細胞の異種性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳において特に好都合である。脂質をターゲッティングの目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる。ターゲッテッドペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)、タンパク質、例えば、抗体、または非ペプチドをリポソームに化学的にカップリングさせる。
【0240】
同様に、zsig33ポリヌクレオチド(配列番号1または配列番号3)を使用して、特定の組織、例えば、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓をターゲッティングすることができる。体からターゲット細胞を除去すること;裸DNAプラスミドとしてベクターを導入すること;次いで形質転換された細胞を体の中に再移植することが可能である。この分野において知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈澱法、遺伝子ガンの使用またはDNAベクターのトランスポーターの使用により、遺伝子治療のための裸DNAベクターは所望の宿主細胞の中に導入することができる。例えば、下記の文献を参照のこと:Wu他、J. Biol. Chem. 267:963-7、1992;Wu他、J. Biol. Chem. 263:14621-4、1988。
【0241】
アンチセンスおよびリボザイムの方法を包含する、種々の技術を使用して、zsig33遺伝子の転写および翻訳を阻害すること、例えば、in vivoにおける細胞増殖を阻害することができる。zsig33をコードするmRNAに結合しかつこのようなmRNAの翻訳を阻害するように、zsig33をコードするポリヌクレオチドのセグメント(例えば、配列番号1または3に記載するようなポリヌクレオチド)に対して相補的であるポリヌクレオチドを設計する。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを使用して、細胞培養物または被検体におけるzsig33ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害する。
【0242】
また、zsig33またはGHS-R遺伝子を発現するように操作されたマウス(「トランスジェニックマウス」と呼ぶ)、およびzsig33またはGHS-R遺伝子機能の完全な非存在を示すマウス(「ノックアウトマウス」と呼ぶ)を発生させることもできる(Snouwaert他、Science 257:1083、1992;Lowell他、Nature 366:740-42、1993;Capecchi、M. R.、Science 244:1288-1292、1989;Palmiter、R. D. 他、Annu. Rev. Genet. 20:465-499、1986)。例えば、偏在的にまたは組織特異的または組織制限的プロモーター下に、zsig33またはGHS-Rを過剰に発現するトランスジェニックマウスを使用して、過剰発現が表現型を引き起こすかどうか決定することができる。
【0243】
例えば、野生型zsig33またはGHS-Rポリペプチド、そのペプチドフラグメントまたは突然変異体の過剰発現は正常の細胞プロセスを変更し、組織を同定する表現型を生じ、ここでzsig33またはGHS-Rの発現は機能的に関係づけられ、zsig33、そのアゴニストまたはアンタゴニストの療法上のターゲットを示すことができる。例えば、操作するために好ましいトランスジェニックマウスは、GHS-Rポリペプチド(配列番号5のほぼアミノ酸1〜366)、またはzsig33ポリペプチド(配列番号2のほぼアミノ酸1〜117)を過剰に発現するものである。
【0244】
その上、このような過剰発現は、ヒト疾患に対して類似性を示す表現型を生ずることがある。同様に、ノックアウトzsig33およびGHS-Rマウスを使用して、zsig33がin vivoにおいて絶対的に必要であるかどうか決定することができる。ノックアウトマウスの表現型は、zsig33アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載するものが有することができるin vivo作用を示す。ヒトzsig33 cDNAを使用して、ネズミzsig33 mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離することができ、引き続いてこれらを使用してノックアウトマウスを発生させる。
【0245】
これらのマウス用いてzsig33遺伝子およびin vivo系においてこれによりコードされるタンパク質を研究することができ、そしてこれらのマウスは対応するヒト疾患のためのin vivoモデルとして使用することができる。その上、本明細書に記載するzsig33に対して向けられたzsig33またはGHS-Rアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニックマウスの発現を、前述のトランスジェニックマウスと同様に使用することができる。
【0246】
zsig33ポリペプチド、それらの変異型、およびフラグメントは、例えば、胃腸の収縮性、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションを包含する、細胞-細胞の相互作用に関連する障害についての代替療法として有効であることがある。
【0247】
組織形態形成のそれほど広く認識されていない決定因子は細胞再配列のプロセスである:細胞運動性および細胞-細胞の接着の両方は形態形成的細胞再配列において重要な役割を演ずるようである。細胞は急速に破壊し、多分同時に付近の細胞と急速に接触することができる必要がない。Gumbiner、B. M.、Cell 69:385-387、1992、参照。胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓において分泌されたタンパク質として、zsig33およびGHS-Rはこれらの組織および他の組織における細胞間再配列においてある役割を演ずることができる。
【0248】
zsig33遺伝子は、欠陥zsig33遺伝子を有するヒトを同定するプローブとして有効であることがある。胃、腎臓、小腸、および膵臓におけるzsig33の強い発現は、zsig33ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをこれらの組織における異常な成長の指示として使用できることを示唆する。こうして、zsig33のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれらに対する突然変異体は、これらの組織における癌の診断インジケーターとして使用することができる。
【0249】
また、zsig33の循環レベルの検出を検出する診断系において、zsig33結合性タンパク質、例えば、抗zsig33抗体、またはGHS-Rを使用することができる。関係する態様において、GHS-Rに対する抗体または他の因子を使用して、循環するレセプターポリペプチドを検出することができる。リガンドまたはレセプターポリペプチドのレベルの増加または減少は、癌を包含する病理学的状態症状を指示することがある。
本発明のポリペプチドは細胞接着および転移におけるその役割を研究するとき有用であり、そして転移、特に胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の腫瘍の転移の防止において有効である。同様に、zsig33のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍または悪性組織におけるそれらの欠陥対応物の代わりに使用することができる。
【0250】
zsig33ポリペプチドは、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓において発現される。こうして、本発明のzsig33ポリペプチドの医薬組成物は、胃、下垂体、視床下部、海馬、肺、腎臓、十二指腸、空腸、小腸、骨格筋、および膵臓の病理学的調節または発現に関連する障害の予防または治療において有効である。
本発明のポリヌクレオチドは、また、調節可能なプロモーターと組み合わせて使用することができ、こうしてタンパク質の送達量の調節が可能である。
【0251】
配列番号2のzsig33ポリヌクレオチドを染色体3p26.1にマッピングされた。こうして、本発明は、また、診断用途において使用される試薬を提供する。例えば、zsig33遺伝子、zsig33 DNAまたはRNAまたはそれらのサブ配列を含んでなるプローブを使用して、zsig33遺伝子が染色体3p26.1上に存在するかどうか、または突然変異が起こったかどうかを決定することができる。
【0252】
zsig33遺伝子座における検出可能な染色体異常は下記のものを包含するが、これらに限定されない:異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化および再配列。このような異常は、本発明のポリヌクレオチドを使用して、分子遺伝学的技術、例えば、制限フラグメント長さの多形性(RFLP)分析、PCR技術を使用する短い縦列反復(STR)分析、およびこの分野において知られている他の遺伝学的結合分析技術に従い検出することができる(Sambrook他、前掲;Ausubel他、前掲;Marian、Chest 108:255-65、1995)。
【0253】
本発明のペプチド、変異型、核酸および/または抗体は、胃腸の収縮性、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素、ホルモンおよび酸の分泌のモジュレーション、胃腸の運動性、消化酵素のレクルートメントに関連する障害;炎症、特に胃腸系影響を与える炎症;逆流性疾患の治療および栄養吸収の調節またはそれより多いであるすることができる/本発明の分子を使用する治療から利益を得る特定の症状は下記のものを包含するが、これらに限定されない:胃不全麻痺、手術後の胃不全麻痺、迷走神経切断、慢性特発性腸性偽閉塞および胃食道逆流性疾患。追加の使用は、放射線医学的研究のための胃内容排出、胆嚢収縮の刺激および幽門洞切除を包含する。
【0254】
本発明の分子は、それらの運動性および神経学的作用のために、神経学的フィードバックが栄養吸収をモジュレートする肥満症および他の代謝的障害の治療に有効である。本発明の分子は、満腹、グルコース吸収および代謝、および神経疾患に関連する胃腸疾患の調節に有効である。
本発明のペプチドは、胃腸系をzsig33ペプチド(変異型を包含する)でチャレンジし、胃の運動性および収縮性、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションを測定することによって、視床下部-下垂体-副腎の軸の機能を評価するために有効である。
【0255】
さらに、zsig33ペプチドの分子を使用して、GHS-Rを発現している腫瘍細胞の増殖および/または分化を検出またはモジュレートすることができる。zsig33ペプチドをラジオヌクレオチド、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他で標識化することができる;間接的タグまたは標識は中間体としてビオチン-アビジンまたは他の補体/抗補体の対を使用することを特徴とする。これらの標識化ポリペプチドはin vitroまたはin vivoにおいて適用することができ、そして、例えば、脳、膵臓、腎臓、十二指腸、空腸、および肺のような組織中の腫瘍上に位置するGHS-Rレセプターを同定するために特に有効である。
【0256】
また、本発明の分子はグルコースを含有する抗高血糖調製物に対する添加剤として、そして速い栄養作用を必要とする経口薬剤の吸着増強剤として有効である。さらに、グルコース誘導インスリン放出を刺激するために、本発明の分子を使用することができる。
【0257】
薬学的に使用するために、本発明のタンパク質は、経口的、経直腸的、非経口的(特に静脈内または皮下)、肋間に、膣内、腹腔内、局所的(粉末、軟膏、点滴剤または経皮的パッチとして)、頬に、または胸または鼻の吸入剤として投与することができる。静脈内投与は、1〜数時間の典型的な期間にわたる、ボーラス注射または注入によるであろう。一般に、医薬処方物はzsig33タンパク質と、薬学上許容されるビヒクル、例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中の5%デキストロースまたはその他との組合わせを包含するであろう。
【0258】
処方物は、さらに、1または2以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝化剤、バイアル表面上のタンパク質の損失を防止するためのアルブミン、およびその他を含むことができる。処方法はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に開示されている:Remington、The Science and Practice of Pharmacy、Gennaro、編、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995。治療的投与量は一般に0.1〜100μg/kgの患者体重/日、好ましくは0.5〜20mg/kg/日の範囲であり、正確な投与量は、承認された標準に従い、治療すべき症状の特質および苛酷性、患者の体質、およびその他を考慮して、臨床医により決定される。
【0259】
投与量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は、急性治療のために、1週またはそれより短い期間にわたって、しばしば1〜3日の期間にわたって投与することができるか、あるいは慢性的治療において、数カ月または数年間にわたって使用することができる。一般に、zsig33の治療的に有効な量は、胃腸の収縮性、栄養吸収のモジュレーション、成長ホルモンのモジュレーション、消化酵素およびホルモンの分泌のモジュレーション、および/または膵臓における酵素および/またはホルモンの分泌のモジュレーションにおいて、胃、肺、腎臓、十二指腸、空腸、骨格筋、および膵臓の組織において臨床的に有意な変化を産生するために十分な量である。
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。
【0260】
実施例
実施例 1:zsig33 の組織分布
クロンテク(Clontech)(カリフォルニア州パロアルト)からののヒト多組織ブロット(Human Multiple Tissue Blots)およびヒトRNAマスター(Human RNA Master)ドットブロットを使用して、zsig33の組織分布を分析した。プローブはほぼ40bpのオリゴヌクレオチドZC12,494(配列番号13)であった。T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Life Technologies,Inc.、マリイランド州ガイサースバーグ)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ前方向緩衝液(Life Technologies,Inc.)を使用して、プローブを末端標識化した。
【0261】
NUCTRAPプッシュカラム(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)を使用して、プローブを精製した。EXPRESSHYB(Clontech)溶液をプレハイブリダイゼーションに、そしてノザンブロットについてハイブリダイゼーション溶液として使用した。ハイブリダイゼーションは42℃において実施し、ブロットを室温において2×SSCおよび0.05%SDSで洗浄し、次いで71℃において1×SSCおよび0.1%SDSで洗浄した。ほぼ600bpの転写物が胃において強いシグナルとして観測され、膵臓および小腸においてより弱いシグナルとして見られた。
【0262】
実施例 2:
A )腸のノザン組織ブロット
下記の源からのmRNAを使用して、ノザンブロットを調製した:
1. ヒト結腸直腸アンデノカルシノマ細胞系統SW480からのRNA(Clontech、カリフォルニア州パロアルト)
2. ヒト小腸組織からのRNA(Clontech)
3. ヒト胃からのRNA(Clontech)
4. ヒト腸平滑筋細胞系統(Hism;ATCC No. CCL-1692、American Type Culture Collection、マリイランド州、ロックビレ、パークローンドライブ12301)
5. 正常ヒト結腸細胞系統(PHC;ATCC No. CCL-1831;American Type Culture Collection)
6. ヒト正常胎児小腸細胞系統(FHs74 Int;ATCC No. CCL-241;American Type Culture Collection)。
【0263】
全RNAをHism、FHCおよびFHs74 Intから酸グアニジニウム法により単離した(Chomczynski他、Anal. Biochem. 162:156-159、1987)。ポリA+RNAを保持するカラムを通して全RNAを溶離することによって、ポリA+RNAを選択した(Aviv他、Proc. Natl. Acad. Sci. 69:1408-1412、1972)。各試料からの2μgのポリA+RNAを2.2Mのホルムアルデヒドおよびリン酸塩緩衝液中の1.5%のアガロースゲル中で分離した。RNAを20×SSC中の一夜ナイトラン(Nytran)膜(Schleicher and Schuell、ニューハンプシャイヤー州ケーネ)上に移した。ブロットを紫外線ストラタリンカー(Stratalinker)2400(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)中の0.12ジュールにおいて処理した。次いでブロットを80℃において1時間ベーキングした。
【0264】
PCRにより増幅した全長cDNA(配列番号1)を使用して、レディプライム(Rediprime)ペレットキット(Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ)を製造業者の使用説明書に従い使用して、ほぼ50ngのzsig33 DNAおよび42.5μlの水を32P dCTPで放射能標識化した。ブロットをEXPRESSHYB(Clontech)中で55℃において一夜ハイブリダイゼーションした。ブロットを室温において2×SSCおよび0.1%SDS中で洗浄し、次いで65℃において2×SSCおよび0.1%SDS中で洗浄し、最後に65℃において0.1×SSCおよび0.1%SDS中で洗浄した。zsig33は胃RNAに対してハイブリダイゼーションするが、他の組織由来からの他のRNAに対してハイブリダイゼーションしないことが結果により示された。
【0265】
B. 腫瘍ノザンブロット
Nothern TerritoryTM-ヒト腫瘍パネルブロットII(Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ)およびNothern TerritoryTM-ヒト胃腫瘍パネルブロット(Invitrogen)を、zsig33RNAの発現パターンについて分析した。
ヒト腫瘍パネルブロットは20μg/レーンの全RNAを含有し、1%の変性ホルムアルデヒドゲル上に展開させた。ブロットは下記からのRNAを含有した:食道腫瘍、正常食道、胃腫瘍、正常胃、結腸腫瘍、正常結腸、直腸腫瘍および正常直腸。胃腫瘍パネルブロットは4つの別々のドナーのR単離されたヒトおよび正常組織の全RNAを含有した。20μgのRNAを各試料レーンについて使用し、そしてレーンを各ドナーからの正常および腫瘍の組を交互させた。
【0266】
ほぼ40bpのオリゴヌクレオチドZC12,494(配列番号11)であるプローブを調製した。T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Life Technologies,Inc.、マリイランド州ガイサースバーグ)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ前方向緩衝液(Life Technologies,Inc.)を使用して、プローブを末端標識化した。NUCTRAPプッシュカラム(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)を使用して、プローブを精製した。EXPRESSHYB(Clontech)溶液をプレハイブリダイゼーションに、そしてノザンブロットについてハイブリダイゼーション溶液として使用した。ハイブリダイゼーションは42℃において実施し、ブロットを60℃において0.1×SSCおよび0.01 いて洗浄し、次いで70℃において0.1×SSCおよび0.1%SDSで洗浄した。ヒト腫瘍パネルおよびヒト胃腫瘍パネルの両方における正常胃組織において、zsig33は独占的に発現された。
【0267】
実施例 3:タンパク質の精製
N-およびC-末端EEタグを使用するzsig33についての精製条件:
Glu-Gluタグ(配列番号12)をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された、配列番号1のDNA配列またはその一部分を含有する発現ベクターで、大腸菌(E. coli)、ピキア(Pichia)、CHOおよびBHKをトランスフェクトする。zsig33タンパク質は大腸菌(E. coli)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、および/またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のコンディショニングされた培地において発現される。大腸菌(E. coli)およびピキア(Pichia)において発現されるzsig33について、精製前に培地を濃縮しない。
【0268】
特記しない限り、すべての操作は4℃において実施する。4インチの0.2mMのミリポア(Millipore)(マサチュセッツ州ベッドフォード)OptiCapカプセルフィルターおよび0.2mMのゲルマン(Gelman)(ミシガン州アンアーバー)Supercup 50を通して、BHK細胞からの合計25リットルのコンディショニングされた培地を順次に滅菌濾過する。次いで、3000kDaカットオフのアミコン(Amicon)(マサチュセッツ州ベッドフォード)S10Y3膜を装備するミリポアProFlux A30接線流濃縮装置を使用して、物質を約1.3リットルに濃縮する。濃縮した物質を、前述したように、ゲルマン・フィルターで再び滅菌濾過する。
【0269】
プロテアーゼインヒビターの混合物を、2.5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA、Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス)、0.001mMのロイペプチン(Boehringer-Mannheim、インジアナ州インジアナポリス)、0.001mMのペプスタチン(Boehringer-Mannheim)および0.4mMのPefabloc(Boehringer-Mannheim)の最終濃度まで、コンディショニングし濃縮した培地に添加する。50.0mlの抗EEセファローズ(Sepharose)(後述するように調製した)を添加し、混合物をウィートン(Wheaton)(ニュージャージイ州ミリヴィレ)ローラー培養装置上で4℃において18.0時間おだやかに撹拌する。
【0270】
この混合物を次いで5.0×20.0cmのエコノ-カラム(Econo-Column)(Bio-Rad,Laboratories、カリフォルニア州ハーキュレス)の中に注ぎ、ゲルを30カラム体積のリン酸塩緩衝液(PBS)で洗浄する。無関係の貫流画分を廃棄する。280nMにおける流出液の吸収がいったん0.05より低くなると、カラムを通る流れはゼロに減少し、抗EEセファロース(Sepharose)ゲルを2.0カラム体積の0.2mg/mlのEEペプチド(AnaSpec、カリフォルニア州サンジョーズ)を含有するPBSで洗浄する。
【0271】
使用するペプチドは配列GluTyrMetProValAspを有する。4℃において1.0時間後、流れを回復させ、溶離されたタンパク質を収集する。この画分をペプチド溶出液と呼ぶ。次いで抗EEセファロースゲルを2.0カラム体積の0.1Mのグリシン、pH2.5で洗浄し、グリシン洗液を別に収集する。グリシン溶離画分のpHを小さい体積の10×PBSの添加により7.0に調節し、必要に応じて、将来の分析のために4℃において貯蔵する。
【0272】
15,000分子量カットオフの数濃縮装置(Millipore、マサチュセッツ州ベッドフォード)を製造業者の使用説明書に従い使用して、ペプチド溶出液を5.0mlに濃縮する。次いで、BioCad Sprint HPLC(PerSeptive BioSystems、マサチュセッツ州ファーミンガム)を使用して1.0ml/分の流速でPBS中で平衡化した1.5×50cmセファデックス(Sephadex)G-50(Pharmacia、ニュージャージイ州ピスカタウェイ)カラム上のクロマトグラフィーにより、濃縮したペプチド溶出液を遊離ペプチドから分離する。
【0273】
2mlの画分を収集し、280nMにおける吸収をモニターする。280nMにおいて吸収しかつカラムの空隙体積付近で溶出する物質の第1ピークを収集する。この画分は純粋なzsig33 NEEまたはzsig33 CEEである。純粋な物質を前述したように濃縮し、SDS-PAGEおよび抗EE抗体を使用するウェスタンブロッティングにより分析し、アリコートを取り、標準的手順に従い-80℃において貯蔵した。
【0274】
抗EEセファロースの調製:
100mlベッド体積のプロテインG-セファロース(Pharmacia、ニュージャージイ州ピスカタウェイ)を、500mlのナルジーン(Nalgene)0.45ミクロンフィルターユニットを使用して、100mlの0.02%のアジ化ナトリウムを含有するPBSで3回洗浄する。ゲルを6.0体積の200mMのトリエタノールアミン、pH8.2(TEA、Sigma、ミゾリー州セントルイス)で洗浄し、そして等しい体積の900mgの抗体を含有するEE抗体を添加する。4℃において一夜インキュベートした後、前述したように樹脂を5体積の200mMのTEAで洗浄することによって、非結合抗体を除去する。
【0275】
この樹脂を2体積のTEAの中に再懸濁させ、適当な容器に移し、TEA中に溶解したジメチルピリミデート-2HCl(Pierce、イリノイ州ロックフォード)を36mg/mlのゲルの最終濃度に添加する。ゲルを室温において45分間揺動させ、前述したようにフィルターを使用して液体を除去する。次いで室温において5体積の200mMのTEA中の20mMのエタノールアミンと10分間インキュベートすることによって、ゲル上の非特異的部位をブロックする。次いで5体積の0.02%のアジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄し、この溶液中で4℃において貯蔵する。
【0276】
非タッグドzsig33の精製:
配列番号1のDNA配列またはその一部分を含有する発現ベクターで、大腸菌(E. coli)、ピキア(Pichia)、CHOおよびBHKをトランスフェクトする。大腸菌(E. coli)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびベイビーハムスター腎(BHK)細胞のコンディショニングされた培地において発現されたタンパク質について、後述する手順を使用する。しかしながら、大腸菌(E. coli)およびピキア(Pichia)において発現されるzsig33について、精製前に培地を濃縮しない。特記しない限り、すべての操作は4℃において実施する。
【0277】
4インチの0.2mMのミリポア(Millipore)(マサチュセッツ州ベッドフォード)OptiCapカプセルフィルターおよび0.2mMのゲルマン(Gelman)(ミシガン州アンアーバー)Supercup 50を通して、BHK細胞からの合計25リットルのコンディショニングされた培地を順次に滅菌濾過する。次いで、3000kDaカットオフのアミコン(Amicon)(マサチュセッツ州ベッドフォード)S10Y3膜を装備するミリポアProFlux A30接線流濃縮装置を使用して、物質を約1.3リットルに濃縮する。
【0278】
濃縮した物質を、前述したように、ゲルマン・フィルターで再び滅菌濾過する。プロテアーゼインヒビターの混合物を、2.5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA、Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス)、0.001mMのロイペプチン(Boehringer-Mannheim、インジアナ州インジアナポリス)、0.001mMのペプスタチン(Boehringer-Mannheim)および0.4mMのPefabloc(Boehringer-Mannheim)の最終濃度まで、コンディショニングし濃縮した培地に添加する。
【0279】
実施例 4:ペプチドの合成
431A型ペプチド合成装置(Applied Biosystems/Perkin Elmer、フォスターシティー、カリフォルニア州)を使用する固相ペプチド合成により、zsig33-1、すなわち、配列番号2のアミノ酸残基24(Gly)〜アミノ酸残基37(Gln)に対応するペプチドを合成した。Fmoc-グルタミン樹脂(0.63mmolg;Advanced Chematech、ケンタッキー州ルイスヴィレ)を初期支持樹脂として使用した。1mmolのアミノ酸カートリッジ(Anaspec,Inc.、カリフォルニア州サンジョーズ)を合成のために使用した。
【0280】
2-(1-Hベンゾトリアゾール-y-イル1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、2m N,N-ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルピロリドン、ジクロロメタン(すべてApplied Biosystems/Perkin Elmerから)およびピペリジン(Aldrich Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス)の混合物を合成試薬として使用した。
ペプチド・コンパニオン(Peptide Companion)ソフトウェア(Peptide International、ケンタッキー州ルイスヴィレ)を使用して、zsig33-1ペプチド合成について凝集ポテンシャルおよび困難性レベルを予測した。単一カップリングプログラムを使用して、合成を実行した。
【0281】
標準的TFA切断手順に従い固相からペプチドを切断した(Peptide Clevage manual、Applied Biosystems/Perkin Elmer)。カラムを使用して溶離した画分を収集し、正しい質量について分析し、エレクトロスプレー質量分析により精製した。溶離した物質の2プールを収集した。質量分析の結果により、両方のプールは精製された形態の分子量1600ダルトンのzsig33を含有することが示された。これは期待された質量であったので、プールを一緒にし、凍結させ、凍結乾燥した。
【0282】
実施例 5:全長 GHS-R を発現する発現ベクターの構築
またBamHIおよびEcoRI部位を含有するプライマーを使用するPCRにより、GHS-R cDNAを含有するプラスミドから全GHS-Rを単離する。反応条件次の通りであった:95℃において1分間;35サイクルの95℃において1分間、55℃において1分間、72℃において2分間;引き続いて72℃において10分間;次いで10℃のソーキング。PCR生成物を1%の低融点アガロース(Boehringer Mannheim)上で展開し、QiaquickTMゲル抽出キット(Qiagen)を製造業者の使用説明書に従い使用して、ほぼ1.05kbのGHS-R cDNAを単離する。
【0283】
BamHI(Boehringer Mannheim)およびEcoRI(BRL)を製造業者の使用説明書に従いを使用して、精製したGHS-R cDNAを消化する。全消化物を1%の低融点アガロース(Boehringer Mannheim)上で展開し、Qiaquickゲル抽出キットを製造業者の使用説明書に従い使用して、フラグメントを精製する。後述するように、生ずる切断されたGHS-Rを発現ベクターの中に挿入する。
【0284】
BamHI(Boehringer Mannheim)およびEcoRI(BRL)を製造業者の使用説明書に従いを使用して、レシピエント発現ベクターpZP-5Nを消化し、前述したようにゲル精製する。結合反応において、このベクターフラグメントを上で単離したBamHIおよびEcoRI切断GHS-Rフラグメントと組合わせる。15℃において一夜T4リガーゼ(BRL)を使用して、結合を実施する。結合試料をDH10B electroMAXTMエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)細胞の中にエレクトロポレートする(25μF、200Ω、2.3V)。形質転換体をLB+アンピシリンプレート上にプレートし、前述したPCR条件下にPCRにより単一コロニーをGHS-R配列の新しいプライマーについてチェックする。
配列分析により、GHS-R配列を確認する。インサートはほぼ1.1kbであり、全長である。
【0285】
実施例 6:GHS-R を発現する BaF3 細胞の構築
完全培地(10%の熱不活性化ウシ胎児血清、2ng/mlのネズミIL-3(mIL-3)(R & D、ミネソタ州ミネアポリス)、2mMのL-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL)、およびPSN抗体(Gibco BRL)を補充したRPMI培地(JRH Bioscience Inc.、カンサス州レネクサ))中で、BaF3、すなわち、ネズミ骨髄に由来するインターロイキン-3(IL-3)依存性前リンパ系細胞系統(PalaciosおよびSteinmetz、Cell 41:727-734、1985;Mathey-Prevot他、Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135、1986)を維持する。
【0286】
エレクトロポレーション前に、クイアゲン・マクシ・プレプ・キット(Qiagen Maxi Prep Kit)(Qiagen)を製造業者の使用説明書に従いを使用して、pZP-5N/GHS-R cDNA(実施例5)を調製し、精製する。エレクトロポレーションのためのBaF3細胞をRPMI培地中で1回洗浄し、次いでRPMIの中に107細胞/mlの細胞密度で再懸濁させる。1mlの再懸濁BaF3細胞を30μgのpZP-5N/GHS-RプラスミドDNAと混合し、別の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー(GIBCO BRL)に移す。
【0287】
室温において15分間インキュベートした後、エレクトロポレーション装置(CELL-PORATORTM:GIBCO BRL)により2系列のショック(800 lFad/300V)を細胞に与える。5分の回復時間後、エレクトロポレートした細胞を50mlの完全培地に移し、インキュベーターの中に15〜24時間入れた(37℃、5%CO2)。次いで細胞を回転し、T-162フラスコ中の50mlのゲネチシン(GeneticinTM)選択(500μg/mlのG418)を含有する完全培地の中に再懸濁させてG418耐性プールを単離する。トランスフェトしたBaF3細胞のプール(以後BaF3/GHS-R細胞と呼ぶ)を、後述するように、zsig33結合能力についてアッセイする。
【0288】
実施例 7:アラマー・ブルー( Alamar Blue )増殖アッセイにより BaF3/GHS-R 細胞を使用する GHS-R 活性についてのスクリーニング
BaF3/GHS-R細胞を回転し、無mIL-3測定中で3回洗浄して、mIL-3を確実に除去する。次いで細胞を血球計算盤で計数し、無mIL-3培地を使用して100μl/ウェルの体積で5000細胞/ウェルにおいて96ウェルのフォーマットの中にプレートする。
【0289】
無mIL-3培地で50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.5%、0.75%および0.375%(zsig33の)濃度に希釈した合成zsig33を含有する培地を使用して、BaF3/GHS-R細胞の増殖を評価する。100μlの希釈した合成zsig33をBaF3/GHS-R細胞に添加する。全アッセイ体積は200μlである。zsig33を添加しないで、無mIL-3培地のみを使用して、陰性対照を平行に実施する。アッセイプレートを37℃、5%CO2において3日間インキュベートし、この時間においてアラマー・ブルー(Alamar Blue)(Accumed、イリノイ州シカゴ)を20μl/ウェルに添加する。アラマー・ブルーは生きている細胞の数に基づいて蛍光測定読出しを与え、こうして陰性対照に比較した細胞増殖の直接的測定である。再びプレートを37℃、5%CO2において24時間インキュベートする。波長544(励起)および590(放射)においてSoftMaxTMプログラムを使用してFmaxTMプレートリーダー(Molecular Devices Sunnyvalc、カリフォルニア州)により、プレートを読む。
【0290】
陽性結果は、BaF3野生型細胞が同一濃度において増殖しないときのバックグラウンドのほぼ4倍と測定される。また、合成的または組換え的に産生された追加の変異型をこの方法でスクリーニングする。同様に、zsig33またはGHS-Rに対する抗体をこの方法でzsig33リガンドの阻害/拮抗作用について試験することができる。
【0291】
実施例 8:zsig33 抗ペプチド抗体
2匹のニュージーランド白ウサギをペプチド、huzsig33-2(配列番号16)で免疫化することによって、ポリクローナル抗ペプチド抗体を調製する。アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)431Aペプチド合成装置(Applied Biosystems,Inc.、フォスターシティー、カリフォルニア州)を製造業者の使用説明書に従いを使用して、ペプチドを合成した。次いでシステイン残基を通して担体タンパク質マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にペプチドを結合した(Pierce、イリノイ州ロックフォード)。ウサギに最初に完全フロインドアジュバント(Pierce、イリノイ州ロックフォード)中の200mgの結合ペプチドを腹腔内(IP)注射し、次いで不完全フロインドアジュバント中の100mgの結合ペプチドを3週毎にブースター注射(IP)した。第3回目のブースター注射後7〜10日に、動物の血を取り、血清を収集した。次いでウサギにブースター注射し、3週毎に血を取った。
【0292】
10mgのzsig33ペプチド/gのCNBr-SEPHAROSEを使用して調製したCNBr-SEPHAROSE 4Bペプチドカラム(Pharmacia LKB)を使用して、ウサギ血清からzsig33ペプチド特異的抗体をアフィニティー精製し、次いでPBS中で一夜透析した。抗体ターゲットとして1mg/mlの適当なペプチドを使用するELISA力価チェックにより、ペプチド特異的zsig33抗体を特性決定した。
【0293】
実施例 9:zsig33 の in situ 結合研究
10週齢のBalb/C雄マウスを筋肉内注射により麻酔し、zsig33ペプチドin vivo結合について試験した。
2つのペプチドを試験した:第1ペプチド、zsig33-1(実施例4参照)は配列番号2の残基24〜37から成り、そして第2ペプチド、zsig33-2は配列番号2の残基24〜41から成っていた。単一グリシンを陰性対照として使用した。さらに、再配列した第1ペプチドの残基から成る「スクランブルド」陰性対照(配列番号15)をまた試験した。ペプチドおよび対照を下記の方法でフルオレセインイソチオシアネート(FITC、Molecular Probe、Eugene、オレゴン州)にカップリングした。
【0294】
ペプチド、グリシン対照およびFITCを0.1Mの重炭酸ナトリウムpH9.0の中にペプチドおよびグリシン対照について2.0mg/ml、FITCについて5mg/mlの濃度に溶解して、強い光に対するFITCの暴露を回避した。FITC/重炭酸ナトリウム溶液を1mgのFITC/1mgのペプチドまたはグリシン対照の比でペプチドに添加し、室温において暗所で1時間反応させた。FITC結合ペプチドおよびグリシン対照を、4℃において1Kの透析膜および0.1Mの重炭酸ナトリウム緩衝液中で透析した。緩衝液を毎日交換し、透析後の緩衝液中の非結合FITCをHPLCにより測定した。
【0295】
6日後、緩衝液をリン酸塩緩衝液(PBS)に交換し、2日間透析し、次いでPBSを交換し、さらに2日間透析した。498nmにおける透析FITC結合物質の吸収を測定し、フルオレセイン,0.083μMの吸光係数で割ることによって、ペプチド結合FITCまたはグリシン結合FITCを決定した。次いで、フルオレセイン/ペプチドのモル比(FITCのmol/ペプチドのmol)を決定した。
【0296】
マウスにおいて注射後15分で循環させることができる0.5ml(0.5mg)の標識化ペプチドを各マウスが受け取るように、標識化ペプチドを尾静脈注射により投与した。
麻酔下にある間、各の右心房を切り取って出口通路を形成し、20mlのPBSを左心室の中に注入し、循環系をフラッシュするために使用した。次いでマウスをほぼ10mlの中性緩衝液中のホルマリン(10%の中性緩衝化ホルマリン(NBF)、Surgipath;イリノイ州リッチモンド)で灌流した。
【0297】
肝臓、腎臓、心臓、肺、胸腺、脾臓、十二指腸、回腸、空腸、結腸および胃を解剖により収集し、組織学的評価のためのプロセシング前に、10%NBF中で一夜固定した。組織をV.I.P.2000(Miles,Inc.、インジアナ州エルクハート)中でプロセシングして、組織をパラフィン(ParaffinTM)浸潤させた。組織/パラフィン(ParaffinTM)ブロックをジュング・バイオカット(Jung Biocut)(Leica、ドイツ国ヌッスロヒ)中で5μmの切片にスライスし、ガラススライド上に配置し、60℃において1時間インキュベートして、組織をスライドに接着させた。スライドを100%キシレン中で5分間3回洗浄することによって、パラフィン(ParaffinTM)を除去した。
【0298】
次いでスライドを100%エタノール中で3分間2回洗浄し、次いで95%エタノール中で1回洗浄することによって再水和した。スライドを乾燥させ、次いで5〜10μlの退色防止媒質でマウントした。ここで退色防止媒質は、9部の2%の溶解したDABCO(1,4-ジアゾビシオ-(2,2,2)-オクタン、Sigma、ミゾリー州セントルイス)を含有する55〜70℃において、1部の0.2MのTris/HCl、pH7.5 DAPI(Sigma、ミゾリー州セントルイス)またはヨウ化プロピジウム(0.5μg/ml)に添加することによって調製した。また、退色防止媒質については下記の文献を参照のこと:Kievits、T.他、Cytogenet. Cell Genet. 53:134-136(1990)。スライドをカバースリップでカバーし、直ちに495nmにおいて蛍光顕微鏡検査により検査した。
【0299】
結果により、標識化zsig33ペプチド、zsig33-1およびzsig33-2は、グリシン対照および「スクランブルド」対照に比較して、十二指腸、空腸においておよび腎臓の集合管および曲尿細管において増加した蛍光を示した。他の組織は、陰性対照に比較して同様な蛍光を示した。
【0300】
実施例 10:胃腸収縮性に対する zsig33 の作用
2匹のSDラット、ほぼ12週齢(Harian、インジアナ州インジアナポリス)をウレタンで麻酔し、腹の小さい切開を通してそれらの胃を露出させた。環状ctrcを2つの結晶間距離の変化としてモニターできるように、2つの2.4mmのトランスデューシング結晶(Sonometrics、カナダ国オンタリオ)を胃の腔部分上に配置した。結晶をベトボンド組織接着剤(VETBOND TISSUE ADHESIVE)(3M、ミネソタ州セントポール)で取り付けた。
【0301】
10μlの1μMのアセチルコリンを胃の結晶間に局所的に適用し、2つの結晶間距離を急速であるが、一時的に増加させた。10μlのノレピネフリン(NE)は1μMにおいて2つの結晶間距離を減少させた。NE誘導減少の振幅は、アセチルコリン誘導距離増加のほぼ50%であった。両方の応答は一時的であった。
結晶間に適用した10μlのリン酸塩緩衝液(PBS)の陰性対照は作用をもたなかった。
【0302】
14アミノ酸のzsig33ペプチド(zsig33-1、実施例4に示すような)をPBS中に溶解し、10μlを1μg、10μgまたは100μgの最終濃度について局所的に適用した。zsig33ペプチドは1μgにおいて結晶距離の持続的、リズム的な増加および減少を誘導した。この作用は投与量依存的であり、収縮10μgおよび100μgを試験したとき、速度および振幅の両方の応答が増強された。
【0303】
実施例 11:グルコース吸収に対する zsig33 の作用
8匹の雌ob/obマウス、ほぼ6週齢(Jackson Labs、メイン州バールハーバー)を、4時間の毎日の給飼スケジュールに2週間順応させた。2週間の給飼スケジュール後、食物摂取期間直後に、経口的栄養により、マウスに100μlの無菌の0.1%のBSA中の100μgのzsig33ペプチド(zsig33-1、実施例4に示すような)を与えた。30分後、マウスを0.5ml体積の25%グルコースで経口的にチャレンジした。眼窩後方採血を実施して、血清グルコースレベルを測定した。zsig33投与前、経口的グルコースチャレンジ前、およびグルコースチャレンジ後1、2、4、および20時間に、採血した。
zsig33ペプチドを経口的グルコースチャレンジ前30分に100μgで経口的に与えたとき、食後のグルコース吸収の増強が見られた。
【0304】
実施例 12:胃内容排出に対する zsig33 の作用
断食させた雄SDラット(Harlan、インジアナ州インジアナポリス)の胃を通るフェノールレッドの移行に対する局所的適用したzsig33ペプチド(配列番号2のアミノ酸24〜37)の作用を評価した。ラット(6匹の動物、8週齢)を24時間断食させた後、ウレタン(0.5ml/100gの25%溶液)で麻酔させた。麻酔後、1mlのフェノールレッド溶液(2%のメチルセルロース溶液中の50mg/ml)を動物に強制的に経口投与した。
【0305】
小さい腹切開を通して各動物の胃を露出させ、そして1μgのzsig33または14アミノ酸のスクランブルド配列のペプチドの対照を強制投与後5分に局所的に適用した。強制投与後30分に抽出した胃内容物の光学密度を測定することによって、胃の中に残留するフェノールレッドの量を決定した。
zsig33ペプチドは、スクランブルドペプチドに比較して、胃の中に残留するフェノールレッドの量をほぼ25%だけ減少し、zsig33ペプチドはこれらのラットにおける胃内容排出を増強することが示された。
【0306】
実施例 13:体重、食物摂取、およびグルコースのクリアランスに対する作用
16匹の雌ob/obマウス、8週齢(Jackson Labs、メイン州バールハーバー)を、特別の4時間の毎日の給飼スケジュールに2週間順応させた。毎日7:30〜11:30AMに不断給飼した。2週間の給飼スケジュール後、マウスを8匹の2グループに分割した。給飼直前と、4時間の給飼期間後に、一方のグループに100μlの無菌の0.1%のBSQA中の1.0μg/マウスのzsig33-1(14アミノ酸のペプチド)を与え、他方のグループに100μlの無菌の0.1%のBSQA中のベヒクル(14アミノ酸のスクランブルド配列のペプチド)を経口的強制投与した。マウスに毎日2回14日間注射し、その期間内に食物摂取および体重を毎日測定した。第14日に、zsig33-1ペプチドの第2経口強制投与直後に、マウスを0.5ml体積の25%グルコースで経口的にチャレンジした。zsig33-1ペプチドまたはベヒクル(t=30分)の投与直前、およびまたグルコースチャレンジ後0、1、2、および4時間に、眼窩後方採血を実施して、血清グルコースレベルを測定した。
【0307】
結果により、1μg/マウスで経口的にを与えたとき、zsig33-1は毎日の体重または食物摂取の測定に対して、または第14日に測定したグルコースクリアランスに対して作用を示さいことが明らかにされた。
以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変化および変更が可能である。したがって、本発明は、添付された特許請求の範囲以外、限定されない。
【配列表】
Claims (13)
- 細胞の同定又は選択方法において、
(1)配列番号2のアミノ酸残基24〜37を含んで成るペプチドを固体支持体に固定化し;
(2)前記ペプチドを、配列番号5のアミノ酸残基41〜326を含んで成るレセプターを発現する細胞と接触せしめ、それにより当該ペプチドが当該レセプターに結合し、そしてペプチド−レセプター複合体を形成し;
(3)前記レセプターへの前記ペプチドの結合を検出し;
ここで、前記レセプターへの前記ペプチドの結合の検出が、前記細胞がGHS-Rを発現することを示す;
ことを含んで成る方法。 - 前記レセプターが、配列番号5のアミノ酸残基1〜366を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号2のアミノ酸残基24〜41を含んで成る、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記レセプターが、配列番号5のアミノ酸残基41〜366を含んでなる、請求項1又は3に記載の方法。
- 前記固体支持体が、
a)アガロース;
b)ガラス;
c)セルロース樹脂;
d)シリカをベースとする樹脂;
e)ポリスチレン;及び
f)架橋されたポリアクリルアミド;
から成る群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ペプチド−レセプター複合体を洗浄して未結合のレセプターを除去する追加の工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチド−レセプター複合体を解離させる追加の工程を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レセプターを発現する細胞を回収する追加の工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドの精製方法において、
(1)レセプターを発現する細胞を固定化し、ここで、当該レセプターは、配列番号5の残基41〜326を含んでなるポリペプチドであり;
(2)前記固定化された細胞を、ペプチドを含む溶液と接触せしめ、ここで、当該ペプチドは配列番号2のアミノ酸残基24〜37を含んで成り、これによりペプチド−レセプター複合体を形成し;
(3)前記ペプチド−レセプター複合体を緩衝液で洗浄して未結合のペプチドを除去し;
(4)前記ペプチド−レセプター複合体を解離させ;そして
(5)前記ペプチドを回収する;
ことを含んで成る方法。 - 前記レセプターが、配列番号5のアミノ酸残基41〜366を含んでなる、請求項9に記載の方法。
- 前記ペプチドが、配列番号2のアミノ酸残基24〜41を含んで成る、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記レセプターが固体支持体上にある、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、
a)アガロース;
b)ガラス;
c)セルロース樹脂;
d)シリカをベースとする樹脂;
e)ポリスチレン;及び
f)架橋されたポリアクリルアミド;
から成る群から選択される、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
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