JP2003503055A - Ｓｇｉｐペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、変異体、及びモチリンに対する相同性を有する新規ペプチドフラグメントのためのその使用に向けられる。新規ポリペプチドフラグメントのためのmRNAの組織分布は、胃、小腸及び膵臓に対して特異的である。ペプチドフラグメントの結合は、腎臓及び小腸に示されている。本発明はさらに、アゴニスト、アンタゴニスト、変異体、抗体、及び新規SGIPペプチドをコードするcDNAを発現する宿主細胞を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： 栄養恒常性の維持において重要である多くの調節ペプチドは、胃腸環境に見出
される。それらのペプチドは、消化系において合成され、そして局部的に作用す
るが、しかしまた、脳においても同様に同定され得る。さらに、逆もまた見出さ
れ、すなわちペプチドは脳において合成されるが、しかし胃腸管において細胞を
調節することが見出されている。この現象は、“脳−腸軸”と呼ばれており、飽
満のシグナル化、体温の調節、及び脳と腸との関のフィールドバックを必要とす
る他の生理学的工程の調節のために重要である。

【０００２】 腸ペプチドホルモンは、ガストリン、コレシストキニン（CCK）、セクレチン
、胃阻害ペプチド（GIP）、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド
（VIP）、モチリン、ソマトスタチン、膵臓ペプチド（PP）、サブスタンスP及び
神経ペプチドY（NPY）を包含し、そしていくつかの異なった作用機能を用いる。
たとえば、ガストリン、モチリン及びCCKは、内分泌及び神経内分泌−型ホルモ
ンとして機能する。

【０００３】 他のもの、例えばガストリン及びGIPは内分泌態様で独占的に作用すると思わ
れる。他の作用態様は、内分泌、神経内分泌及びパラクリン作用の組合せ（ソマ
トスタチン）；独占的な神経内分泌作用（NPY）；及び神経内分泌及びパラクリ
ン作用の組み合わせ（VIP及びサブスタンスP）を包含する。ほとんどの腸ホルモ
ン作用は、膜結合の受容体により仲介され、そして第２メッセンジャーシステム
を活性化する。腸ペプチドの再考のためには、Mulvihillなど．，Basic and Cli
nical Endocrinology, pp. 551-570, 4^th edition Greenspan F.S. and Baxter,
J. D. Editors., Appleton & Lange: Norwalk, Connecticut, 1994 を参照のこ
と。

【０００４】 それらの腸ペプチドの多くは、複数のペプチド分解の活性化を必要とする不活
性前駆体分子として合成される。VIP、ガストリン、セクレチン、モチリン、グ
ルカゴン及びガラニンを包含する“グルカゴン−セクレチン”ファミリーとして
知られているファミリーは、複数の分解及び後−翻訳修飾により調節されるペプ
チドを例示する。

【０００５】 モチリン（Motilin）は、哺乳類の腸組織に見出される22個のアミノ酸ペプチ
ドである（Domschke, W., Digestive Diseases 22 (5): 454-461, 1977）。豚プ
レプロモチリンについてのDNA及びアミノ酸配列は同定されている（アメリカ特
許第5,006,469号）。モチリンは、ペプシン分泌を刺激することによって胃の分
泌機能に影響を及ぼす、胃運動性を高めることができる因子として同定されてお
り（Brownなど., Canadian J. of Physiol. Pharmacol. 49:399-405, 1971）、
そして最近の証拠は、胃及び小腸の筋電気調節における役割を示唆している。

【０００６】 モチリンの循環上昇は、消化間筋電気複合体の相III及び十二指腸の空腹収縮
性と相互関係している（Cheyなど., Gut Hormones, (eds.) Bloom, S. R., pp.
355-358, Edinburgh, Churchill Livingstone, 1998; Leeなど., Am. J. Digges
tive Diseases, 23: 789-795, 1978; 及びItohなど., Am. J. Digestive Diseas
es, 23 : 929-935, 1978）。モチリン及びモチリンの類似体は、胃腸平滑筋の収
縮を生成するが、しかし他のタイプの平滑筋細胞の収縮を生成しないことが示さ
れている（Strunzなど., Gastroenterology 68: 1485-1491, 1975）。

【０００７】 本発明は、前に記載された分泌されたタンパク質、すなわちzsig33の新規ペプ
チドフラグメント及びそれをコードするDNAセグメントに向けられる（Sheppard,
P.O., WO98/42840号；1998）。本発明はまた、前記ペプチドフラグメントの限
定された数の変異体にも向けられる。この新規ペプチドフラグメントの発見は、
いかにして身体がその栄養恒常性を維持するかのさらなる解明及びそれらの工程
において介在する治療剤の開発、並びに本明細書における技術から明らかになる
であろう他の用途のために重要である。

【０００８】 発明の要約： １つの観点においては、本発明は、（ａ）残基１（Gly）〜残基９（His）；（
ｂ）残基２（Ser）〜残基９（His）；（ｃ）残基３（Ser）〜残基９（His）；及
び（ｄ）残基４（Phe）〜残基９（His）；配列番号２のすべてから成る群から選
択された単離されたペプチド分子をコードする単離された核酸分子を提供する。
１つの態様においては、本発明は、前記単離された核酸分子によりコードされる
単離された分子を提供する。

【０００９】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号６の残基X〜９（ここで、Xは
１〜４の整数であり、そして前記残基の少なくともYが配列番号２に示されるよ
うなその対応する領域における通りであり、ここでYは９−Xである）を含んで成
る単離されたポリペプチド分子を提供する。１つの態様においては、本発明は、
前記単離されたポリペプチドを胃、十二指腸又は空腸組織に投与することを含ん
で成る、前記組織の収縮性及びタンパク質分泌の調節方法を提供する。もう１つ
の態様においては、前記単離されたポリペプチドを哺乳類に投与することを含ん
で成る、ホルモンン及び消化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。

【００１０】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号６の残基X〜Y（ここで、Yは1
0又は11であり、そしてXは１〜４の整数であり、そして少なくとも（Y−X）−３
の残基が配列番号２のその対応する領域における通りである）を含んで成る単離
されたポリペプチド分子を提供する。

【００１１】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号６の残基X〜Y（ここで、Yは1
0又は11であり、そしてXは１〜４の整数であり、そして少なくとも（Y−X）−２
の残基が配列番号２のその対応する領域における通りである）を含んで成る単離
されたポリペプチド分子を提供する。１つの態様においては、本発明は、前記単
離されたポリペプチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前
記組織の収縮性及びタンパク質分泌の調節方法を提供する。もう１つの態様にお
いては、前記単離されたポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホ
ルモンン及び消化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。

【００１２】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号６の残基X〜Y（ここで、Yは1
0又は11であり、そしてXは１〜４の整数であり、そして少なくとも（Y−X）−１
の残基が配列番号２のその対応する領域における通りである）を含んで成る単離
されたポリペプチド分子を提供する。１つの態様においては、本発明は、前記単
離されたポリペプチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前
記組織の収縮性及びタンパク質分泌の調節方法を提供する。もう１つの態様にお
いては、前記単離されたポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホ
ルモン及び消化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。

【００１３】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に示される
ような９個までのアミノ酸から成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの
態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号２に示されるような残基１（Gl
y）、残基２（Ser）、残基３（Ser）、又は残基４（Phe）を、そのアミノ末端で
有し、そして前記ポリペプチドは、配列番号２に示されるような残基９（His）
をそのカルボキシル末端で有する。１つの態様においては、前記ポリペプチドは
、１つまでのアミノ酸置換を有する。

【００１４】 もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか又は有さない前記ポリペ
プチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前記組織の収縮性
の調節方法が提供される。もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか
又は有さない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモン
及び消化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。もう１つの態様においては、
置換を有するか又は有さない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで
成る、成長ホルモン分泌を刺激する方法が提供される。

【００１５】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２に示されるような残基２（
Ser）、残基３（Ser）、又は残基４（Phe）を、そのアミノ末端で有し、そして
配列番号２に示されるような残基10（Gln）をそのカルボキシル末端に有する単
離されたポリペプチドを提供する。１つの態様においては、前記ポリペプチドは
、３個までのアミノ酸置換を有する。

【００１６】 もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか又は有さない前記ポリペ
プチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前記組織の収縮性
の調節方法が提供される。もう1つの態様においては、置換を有するか又は有さ
ない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモンン及び消
化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。もう１つの態様においては、置換を
有するか又は有さない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、
成長ホルモン分泌を刺激する方法が提供される。

【００１７】 もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２に示されるような残基３（
Ser）、又は残基４（Phe）を、そのアミノ末端に有し、そして配列番号２に示さ
れるような残基10（Gln）をそのカルボキシル末端に有する単離されたポリペプ
チドを提供する。１つの態様においては、前記ポリペプチドは、３個までのアミ
ノ酸置換を有する。もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか又は有
さない前記ポリペプチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、
前記組織の収縮性の調節方法が提供される。

【００１８】 もう1つの態様においては、置換を有するか又は有さない前記ポリペプチドを
哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモンン及び消化酵素の膵臓分泌の調節
方法が提供される。もう１つの態様においては、置換を有するか又は有さない前
記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、成長ホルモン分泌を刺激
する方法が提供される。

【００１９】 もう1つの態様においては、本発明は、 ａ）配列番号２に示されるような残基１〜９から成るポリペプチド分子； ｂ）配列番号２に示されるような残基２〜９から成るポリペプチド分子; ｃ）配列番号２に示されるような残基３〜９から成るポリペプチド分子; ｄ）配列番号２に示されるような残基４〜９から成るポリペプチド分子; ｅ）配列番号２に示されるような残基２〜10から成るポリペプチド分子; ｆ）配列番号２に示されるような残基３〜10から成るポリペプチド分子; ｇ）配列番号２に示されるような残基４〜10から成るポリペプチド分子; ｈ）配列番号２に示されるような残基３〜11から成るポリペプチド分子;及び ｉ）配列番号２に示されるような残基４〜11から成るポリペプチド分子 から成る群から選択された、単離されたポリペプチド分子を提供し；

【００２０】 ここで前記ポリペプチド分子は、残基Xで１つまでのアミノ酸置換を有し、こ
こで残基Xは１〜11のセお数であり、そして前記アミノ酸は配列番号６に示され
るような残基Xでのその対応するアミノ酸により置換される。

【００２１】 もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか又は有さない前記ポリペ
プチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前記組織の収縮性
の調節方法が提供される。もう1つの態様においては、置換を有するか又は有さ
ない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモンン及び消
化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。もう１つの態様においては、置換を
有するか又は有さない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、
成長ホルモン分泌を刺激する方法が提供される。１つの態様においては、前記単
離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基１〜９から成る
。

【００２２】 もう1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２
に示されるような残基２〜９から成る。もう1つの態様においては、前記単離さ
れたポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基３〜９から成る。も
う1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示
されるような残基４〜９から成る。もう1つの態様においては、前記単離された
ポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基２〜10から成る。もう1
つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示され
るような残基３〜10から成る。

【００２３】 もう1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２
に示されるような残基４〜10から成る。もう1つの態様においては、前記単離さ
れたポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基３〜11から成る。も
う1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示
されるような残基４〜11から成る。本発明のもう1つの態様においては、残基３
（Ser）はアシル化される。さらなる態様においては、残基３（Ser）はｎ−オク
タン酸アシル化される。

【００２４】 もう1つの態様においては、本発明は、 ａ）配列番号２に示されるような残基１〜９から成るポリペプチド分子； ｂ）配列番号２に示されるような残基２〜９から成るポリペプチド分子; ｃ）配列番号２に示されるような残基３〜９から成るポリペプチド分子; ｄ）配列番号２に示されるような残基４〜９から成るポリペプチド分子; ｅ）配列番号２に示されるような残基２〜10から成るポリペプチド分子; ｆ）配列番号２に示されるような残基３〜10から成るポリペプチド分子; ｇ）配列番号２に示されるような残基４〜10から成るポリペプチド分子; ｈ）配列番号２に示されるような残基３〜11から成るポリペプチド分子;及び ｉ）配列番号２に示されるような残基４〜11から成るポリペプチド分子 から成る群から選択された、単離されたポリペプチド分子を提供する。

【００２５】 もう1つの態様においては、アミノ酸置換を有するか又は有さない前記ポリペ
プチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前記組織の収縮性
の調節方法が提供される。もう1つの態様においては、置換を有するか又は有さ
ない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモンン及び消
化酵素の膵臓分泌の調節方法が提供される。もう１つの態様においては、置換を
有するか又は有さない前記ポリペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、
成長ホルモン分泌を刺激する方法が提供される。

【００２６】 １つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示
されるような残基１〜９から成る。もう1つの態様においては、前記単離された
ポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基２〜９から成る。もう1
つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示され
るような残基３〜９から成る。もう1つの態様においては、前記単離されたポリ
ペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基４〜９から成る。もう1つの
態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示されるよ
うな残基２〜10から成る。

【００２７】 もう1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２
に示されるような残基３〜10から成る。もう1つの態様においては、前記単離さ
れたポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基４〜10から成る。も
う1つの態様においては、前記単離されたポリペプチド分子は、配列番号２に示
されるような残基３〜11から成る。もう1つの態様においては、前記単離された
ポリペプチド分子は、配列番号２に示されるような残基４〜11から成る。本発明
のもう1つの態様においては、残基３（Ser）はアシル化される。さらなる態様に
おいては、残基３（Ser）はｎ−オクタン酸アシル化される。

【００２８】 もう1つの態様においては、本発明は、配列番号１に示されるようなポリヌク
レオチド配列；配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド配列に対して相補
的であるポリヌクレオチド分子；及び配列番号７に示されるようなポリヌクレオ
チド配列から成る群から選択されたポリヌクレオチド配列を有する単離されたポ
リヌクレオチド分子を提供する。1つの態様においては、また、前記単離された
ポリヌクレオチド分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成る
ポリヌクレオチドベクターを提供し、ここで前記プロモーターが前記核酸分子に
より作用可能に連結され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターにより
作用可能に連結される。

【００２９】 発明の特定の記載： 本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助ける
ことができる： 用語“オルト体（orthology）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。 “パラ体（paralogs）”とは、生物によって製造される、異なっているが，し
かし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じる
と思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互い
パラ体である。

【００３０】 用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現
象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされ
たポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子
の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書におい
て使用される。

【００３１】 用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又
は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロ
モーター及びターミネーター配列を含み、そして任意には、複製の１又は複数の
起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及
び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDN
Aから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。

【００３２】 用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を
含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロ
モーター及びターミネーターを含むことができる。

【００３３】 関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan,
Nature 316: 774―78, 1985を参照のこと)。タンパク質に適用される場合、用語
“単離された”とは、タンパク質がその生来の環境以外の条件、例えば血液及び
動物組織とは別の条件下で見出されることを示す。好ましい形においては、単離
されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的
に含まない。高く精製された形、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％
以上の純度でタンパク質を供給することが好ましい。

【００３４】 用語“〜に対応する”とは、配列におけるアミノ酸残基の位置に適用される場
合、配列が最適に整列される場合の多くの配列における対応する位置を意味する
。 “作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグ
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。

【００３５】 用語“ポリヌクレオチド”とは、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシ
リボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す
。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、イン
ビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。 用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に
比較して逆の配向を有するポリペプチド分子を示す。例えば、配列5’ ATGCACGG
G 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。

【００３６】 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示
す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じ
アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAsp
をコードする）。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’
非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。

【００３７】 用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなペ
プチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解
される。

【００３８】 用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づ
けられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと
他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化を
もたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。

【００３９】 受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、
脱リン酸化、AMP生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付
着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。ほとん
どの核受容体はまた、多−ドメイン構造、例えばアミノ末端のトランス活性化ド
メイン、DNA結合ドメイン及びリガンド結合ドメインを示す。一般的に、受容体
は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー(例えば甲状腺刺激ホ
ルモン受容体、β−アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体
、成長ホルモン受容体、IL−３受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリト
ロポイエチン受容体及びIL―6受容体)であり得る。

【００４０】 用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０⁹Ｍ^-1の結合親和性を有する。 本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれ
る。

【００４１】 本発明は、zsig33 (Sheppard, P.O., WO98/42840号)として知られている前に
記載された分泌されたポリペプチドの新規ペプチドフラグメント及びそれをコー
ドするDNAセグメントの発見に一部、基づかれている。zsig33 (配列番号３及び
４で示される)は、モチリン（配列番号５で示される）に対する相同性を有し、
そして胃腸管系において転写されることが見出されている。本発明の新規のペプ
チドフラグメントは、モチリンのその受容体への結合のために必要とされるモチ
リンの最少塩基単位に対する相同性を有する（Miller, P.など., Peptides 16 (
1): 11-18）。この新規ペプチドフラグメント及びそれをコードするcDNAは、SGI
Pとして命名され、そしてそれぞれポリヌクレオチド及びポリペプチドについて
配列番号１及び２と相互関係する。さらに、このペプチドフラグメントの新規変
異体は、本明細書において、配列番号６で記載される。

【００４２】 モチリンは、胃腸生理学を調節するポリペプチドのファミリーメンバーである
。モチリンが属する、胃腸調節において重要なポリペプチドのファミリーは、グ
ルカゴン、ガストリン、ガラニン及びバソアクティブ・インテスティナル・ペプ
チド（VIP）を包含する。それらのポリペプチドは、活性形への複数処理段階を
必要とする前駆体形で合成される。モチリン、VIP及びガラニンが本発明のポリ
ペプチドに特に関連しており、ここで処理は、シグナル配列の除去、活性ペプチ
ドを開放するためへの１又は複数の補助ペプチドの続く切除を包含する。得られ
る活性ペプチドは、さらなる後−翻訳修飾、例えばグルタミン酸のアミド化、ア
シル化、硫酸化又はピロリダンカルボン酸修飾を必要とする。

【００４３】 前記分泌されたタンパク質、すなわちzsig33に対応するmRNAの組織分布の分析
は、発現が胃において最高であり、続いて小腸及び膵臓において、明白であるが
、しかし低められた発現レベルであったことを示した。分泌されたタンパク質zs
ig33についてのESTは、膵臓ライブラリーに由来し、そしてまた、肺cDNAライブ
ラリーにも示されている。従って、新規ペプチドフラグメントについてのmRNAは
また、それらの組織にも局在され得る。

【００４４】 豚モチリンのその受容体への結合に関する研究は、受容体結合のために必要と
されるモチリンの最少塩基単位が配列番号５の残基26（Phe）と32（Tyr）との間
の配列であり、そしてその活性が主にそれらの残基により決定されることを示し
ている（Miller, P.など., peptides 16 (1): 11-18, 1995；及びPeeters, T.L.
など., Peptides 13 (6): 1103-1107, 1992）。モチリンの受容体結合部位のセ
リン（配列番号５の残基29）が、Schabert, H. など., Can. J. Biochem. 52: 7
-8, 1974によりイソロイシンであることが示されていることは注目されるべきで
ある。

【００４５】 zsig33のポリペプチド配列（配列番号４）とモチリンのポリペプチド配列（配
列番号５）との比較は、配列番号４の残基４（Phe）〜９（His）がモチリンの受
容体結合部分（配列番号５の残基26〜32）に対応することを示している。従って
、活性ペプチド、又はzsig33のその受容体への結合のために必要とされる最少塩
基単位は、配列番号４の残基４（Phe）と残基９（His）との間のできるだけ短い
配列であり得る。その６個の残基ペプチド内の残基の置換は、受容体のためのペ
プチドの変更された親和性、又は受容体の変更された活性化を有する変異体をも
たらすことができる。そのような変更は、アゴニスト及びアンタゴニスト活性を
もたらすことができる。さらに、この比較は、配列番号２の残基４（Phe）、５
（Leu）、６（Ser）及び９（His）（配列番号４の残基４，５，６及び９に対応
する）が受容体結合/又は活性のために特に重要な残基であることを示す。

【００４６】 SGIPポリペプチド及びペプチドの残基の追加の置換がさらに、本明細書に記載
される。高い親和性を有する受容体を結合するが、しかし低い受容体活性化を引
き起こすSGIP変異体をもたらすことができるアミノ酸の置換は、たぶん、配列番
号２の残基４〜残基９間の位置、好ましくは残基４（Phe）、５（Leu）、７（Pr
o）及び９（His）での保存性置換である。それらの位置での置換は、SGIPの可能
性あるアンタゴニストである。

【００４７】 SGIPペプチド及びポリペプチドの残基の置換はまた、アゴニストである変異体
をもたらすことができる。そのような置換は、表２におけるような保護性アミノ
酸置換に基づかれるか、又は表Aにおけるようなモチリンの活性ペプチドへの比
較により得られる予測に基づかれ得る。それらの置換は、位置４（Phe）、５（L
eu）及び９（His）を包含する。例えば、残基４（Phe）は、ロイシン、バリン、
イソロイシン、トリプトファン又はチロシンにより置換され得；残基５（Leu）
はフェニルアラニン、バリン、チロシン又はイソロイシンにより置換され得；そ
して残基９（His）はフェニルアラニン、アルギニン、チロシン又はリシンによ
り置換され得ることが予測される。同様に、残基７（Pro）は、アラニン、グリ
シン、イソロイシン、バリン又はロイシンにより置換され得る。

【００４８】 さらに、突然変異がそれらの変異体の結合に基づいて受容体の結合親和性又は
活性化の変更をもたらすことが予測されないSGIPの位置が存在する。それらの位
置は、配列番号２の残基６（Ser）を包含し、この位置でのアラニン、プロリン
、トレオニン、メチオニン又はグリシンによる置換は、野生型SGIPに比較して、
変異体又は変異株の結合を変更することが予測されない。

【００４９】 シグナルペプチダーゼの複数の切断は、本発明において予測される。従って、
SGIP活性ペプチドのアミノ末端は、グリシン、すなわち配列番号２の残基１、セ
リン、すなわち配列番号２の残基２又は３、又はフェニルアラニン、すなわち配
列番号２の残基４により開始することができる。それらの位置は、配列番号６の
残基１〜４に相互関係する。

【００５０】 モチリン受容体の結合に関与することが知られているモチリンの残基とSGIPの
残基との比較に基づけば、高められた受容体親和性又は活性化を有する配列番号
２の残基１〜11のフラグメントペプチドの変異体が存在する。それらの変異体は
また、配列番号６にも列挙される。従って、配列番号２及び６の残基１〜11は、
配列番号４の残基１〜11に対応する。表Aは、それらの変異体についての可能な
置換を記載する。SGIPの変異体ペプチドは、１つよりも多くの置換を有すること
ができる。

【００５１】 11又はそれよりも少ないアミノ酸を有する変異体ペプチドは、好ましくは、３
又はそれよりも少なくアミノ酸置換を有する。11又はそれよりも少ないアミノ酸
を有する変異体ペプチドは、より好ましくは、２又はそれよりも少ないアミノ酸
置換を有する。さらにより好ましくは、11又はそれよりも少ないアミノ酸を有す
る変異体ペプチドは、1つのアミノ酸置換を有するであろう。そのような置換は
また、Peeters, 前記によりさらに記載されるモチリンの既知類似体とそれらの
変異体との比較により支持される。

【００５２】 モチリンのための受容体は、胃腸系において同定されている（Feighner, S.D.
など., Science 284: 2184-8, 1999）。モチリン受容体の２種の形（GPR38−A
及びGPR38−B）は、他のスプライシング現象に起因することが示されている。従
って、SGIP受容体はたぶん、７個のトランスメンブランGタンパク質−結合の受
容体相同体種類のメンバーである。この種類の受容体は、結合及び活性のための
SGIPペプチドの変異体をスクリーニングするために使用され得る。

【００５３】 この受容体種類のメンバーは、ホスホリパーゼCシグナルトランスダクション
経路を活性化すると思われる。従って、SGIPペプチドの変異体はまた、ホスホリ
パーゼCトランスダクションを測定するアッセイを用いても試験され得る。この
種類の典型的なアッセイは、エクオリン、すなわち生物発光Ca²⁺−感受性レポー
タータンパク質によるCa²⁺開放を測定する。このアッセイは、さらに、Feighner
, S.D.など., 前記によりよっても記載されている。

【００５４】 モチリンのカルボキシル末端の決定的残基が存在し、ここでペプチドがそれら
の残基で切断される場合、受容体結合（クローン化されたヒト及び生来のウサギ
）の鋭い低下が存在する（Feighner, S.D.など., 前記）。それらの位置は、配
列番号５に示されるようなモチリンの残基36（Gln）及び残基37（Arg）である。
同様に、モチリンの残基36及び37に対応する残基で結合するSGIPペプチドは、SG
IPペプチドの結合及び活性の低下をもたらすことができる。特に、それらの残基
は、残基10（Gln）及び残基11（Arg）である。それらの残基の可能性あるアミノ
酸置換は、表Aに記載される。

【００５５】 結合研究は、モチリンが種々の親和性を有する２種の異種受容体を結合するこ
とを示唆し（Poitras, P., Peptides 17: 701-707, 1996）、このことは、それ
らの異なった受容体を結合する２種の形のモチリンが存在することを示す。１つ
のそのような受容体は噴門端の神経細胞に位置し、そして第２の受容体は十二指
腸の平滑筋細胞に位置する。同様に、SGIPリガンドを結合する１つよりも多くの
受容体又はその変異体が存在し、そしてその結合親和性は多様である。従って、
SGIPポリペプチド及びペプチドのその受容体への結合が、SGIPの形、及びそれが
結合する特定の受容体形に依存して、異なった及び種々の生物学的現象をもたら
すことができる。

【００５６】

【表１】

【００５７】 当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動が、UとTとを置換
することによって、すべてのDNA配列を包含する、配列番号2をコードするそれら
のポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。従って
、SGIPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれらのRNA相当物は、
本発明により包含される。第１表は、縮重ヌクレオチド位置を示すために使用さ
れる1文字コードを示す。“群”は、コード文字により示されるヌクレオチドで
ある。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コ
ードYはC又はTのいずれかを示し、そしてその補体RはA又はGを示し、AはTに対し
て相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。

【００５８】

【表２】

【００５９】 与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する縮重コドンが第
２表に示される。

【００６０】

【表３】

【００６１】 当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。例えば、セリン（WSN）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギ
ニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN）のための縮重コ
ドンは、ある環境下で、セリン（AGY）をコードすることができる。類似する関
係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って
、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配
列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列へ
の参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列
は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。

【００６２】 本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
１又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下
でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度
及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択さ
れる。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダ
イズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的な緊縮条件は
、塩濃度がｐH7で少なくとも約0.02Mであり、そして温度が少なくとも約60℃で
ある条件である。

【００６３】 前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを
包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知られてい
る。一般的には、胃からのRNAを単離することが好ましいが、但しDNAは他の組織
からのRNAを用いて調製されるか、又はゲノムDNAとして単離され得る。そのよう
な組織及び細胞は、ノザンブロット（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
5201, 1980）により同定され、そして下記に論じられる。

【００６４】 全RNAは、グアニジウムHCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離によ
る単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979）。
ポリ（A）⁺ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−14
12, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(ｃDNA)は、既知の
方法を用いて、ポリ（A）⁺ RNAから調製される。次に、SGIPポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ
鎖反応（PCR）により同定され、そして単離される。

【００６５】 本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物ポリペプチド及びポリヌク
レオチドを供給する。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ラッ
ト、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類タンパク質からのSGIPポリペ
プチドである。ヒトタンパク質のオルト体は、従来のクローニング技法と組合し
て、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例え
ば、ｃDNAは、タンパク質を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いて
クローン化され得る。ｍRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画
されたプローブによりノザン ブロットをプローブすることによって同定され得
る。

【００６６】 次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。次に、S
GIPオルト体−コードのｃDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃDN
Aにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、
プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される
配列から企画されたプライマーを用いて、PCR（Mullis, アメリカ特許第4,683,2
02号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブ
ラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そ
して興味あるｃDNAの発現がSGIPに対する抗体により検出され得る。類似する技
法がまた、ゲノム クローンの単離に適用され得る。

【００６７】 当業者は、配列番号１に開示される配列及びそれによりコードされるポリペプ
チドがヒト遺伝子及びポリペプチドの単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝
子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであ
ろう。対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又は
ゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号
１に示されるDNA配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそ
れらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配
列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内で
ある。

【００６８】 本発明はまた、配列番号２のポリペプチド、及びそれらのオルト体に対して実
質的に相同である単離されたSGIPポリペプチドも提供する。用語“実質的に相同
である”とは、配列番号２に示される配列又はそれらのオルト体に対して、50％
、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するポリペ
プチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、
より好ましくは、配列番号２、又はそのオルト体に対して、少なくとも 90％、
及び最も好ましくは95％又はそれ以上同一であろう。

【００６９】 ％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bul
l. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. A
cad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種
のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルテ
ィー、及び第３表（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示される
ようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum 62”評点マトリックスを用
いて、その整合評点を最適化するために整合される。 次に、％同一性は次のようにして計算される：

【００７０】

【数１】

【００７１】

【表４】

【００７２】 ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて
、類似する方法により決定される。 実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、
欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは
、保存性アミノ酸置換（第４表を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチド
の折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型
的には１〜約30個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末
端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さな
リンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、例え
ばポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 10
75, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991),

【００７３】 グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88）,マルトース結合タンパク質（Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 9
0: 459-463, 1982; Guan など., Gene 67: 21-30, 1987）,チオレドキシン、ユ
ビキチン、セルロース結合タンパク質、T7ポリメラーゼ、又は他の抗原性エピト
ープ又は結合ドメインである。一般的に、Ford など., Protein Expression a
nd Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは
、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, Ne
w Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。

【００７４】

【表５】

【００７５】 20個の標準アミノ酸の他に、非標準アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリ
ン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセ
リン）が、SGIPのアミノ酸残基により置換され得る。限定された数の非保存性ア
ミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が
、SGIPアミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質
合成の後に修飾され、そして/又は標準アミノ酸の側鎖とは異なる側鎖の化学構
造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成されるか、又は好ましくは、市
販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリ
ン、３−及び４−メチルプロリン及び３，３−ジメチルプロリンを包含する。

【００７６】 本発明のSGIPポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られて
いる方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発によ
り同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989）。
後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入
され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミ
ノ酸残基を同定するために、生物学的活性（例えば、胃腸収縮の刺激、栄養物摂
取の変調、消化酵素及びホルモンの分泌の変調、膵臓における酵素及びホルモン
の分泌の変調、SGIP受容体の結合、又は配列番号２の残基１〜11に特異的に結合
する抗体の結合）について試験される。

【００７７】 また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699−5708, 1996を参照のこと。
リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異
に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法
により決定され得る。例えば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992; Sm
ith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett.
309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の正体はまた、腸−脳ペプチド
ホルモンのグルカゴン−セクレチンファミリーの関連するメンバーとの相同性の
分析から推定され得る。

【００７８】 複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばRe
idhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer
（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を
用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペ
プチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリー
ンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異
誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他
の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837
,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／062
04号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 14
5, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。

【００７９】 本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン
化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自
動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ペプチド又はポリペプ
チド（例えば、胃腸収縮の刺激、栄養物摂取の変調、消化酵素及びホルモンの分
泌の変調、膵臓における酵素及びホルモンの分泌の変調、SGIP受容体の結合、又
は配列番号２の残基１〜11に特異的に結合する抗体の結合）をコードする突然変
異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を
用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のア
ミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチド
に適用され得る。

【００８０】 上記方法を用いて、当業者は、配列番号２又はその対立遺伝子変異体の残基１
〜11に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質の性質を保持する種
々のペプチド及びポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。
そのようなポリペプチドはまた、一般的に本明細書に開示されるように追加のポ
リペプチドセグメントを包含することができる。

【００８１】 本発明のポリペプチド、例えば十分な長さのタンパク質及びそのフラグメント
は、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。
適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そ
して培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、
及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養され
た細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞
中に外因性DNAを導入するための技法は次の文献に開示される：Sambrool など.,
Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor La
boratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusubel など., eds., C
urrent Protocol in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Ins., NY, 198
7。

【００８２】 一般的に、本発明のSGIPポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現のた
めに必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プ
ロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常
、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、し
かし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され
得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得
ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベ
クター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くの
そのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手でき
る。

【００８３】 SGIPポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナ
ル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列として
も知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、分泌さ
れたタンパク質（例えばt−PA ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグ
ナル配列は、SGIP DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグ
ナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’ 側に位置す
るが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所に位置する
こともできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど.
, アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。

【００８４】 培養された哺乳類細胞また、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、哺
乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフ
ェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somat
ic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973）,エ
レクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE−
デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など., 前記）、及びリポソ
ーム−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 199
3; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 ）を包含する。

【００８５】 培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson
など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950
号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ
特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−
1（ATCC No. CRL 165）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 16
32）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293（ATCC No. CRL 1573 ; Graham
など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 ）、及びチャイニーズ ハムスター卵
巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。

【００８６】 追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例
えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的
に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプ
ロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他
の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリ
カ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウィルス主要後期プロモー
ターを包含する。

【００８７】 薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様の
もの存在下で実施される。

【００８８】 “増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現
レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトラ
ンスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベル
で生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。

【００８９】 他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロ
マイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。変更された表
現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパ
ク質、例えばCD4, CD8,クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分
類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない
細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。

【００９０】 他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主と
して使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしての
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は、Sin
karなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている
。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarin
o など.,アメリカ特許第5,162,222号；及びWIPO公開WO94／06463号により公開さ
れる。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Autographa californica
）核多角体病ウィルス（AcNPV）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより
感染され得る。

【００９１】 SGIPポリペプチドをコードするDNAは、２種の方法の１つにより、AcNPVポリヘ
ドリン遺伝子コード配列の代わりにバキュロウィルスゲノム中に挿入される。最
初のものは、野生型AcNPV配列とAcNPV配列を端に有するSGIPを含むトランスファ
ーベクターとの間の相同DNA組換えの従来の方法である。適切な挿入細胞、例え
ばSF9細胞が、野生型AcNPVにより感染され、そしてAcNPVポリヘドリン遺伝子プ
ロモーター、ターミネーター、及びフランキング配列に作用可能に連結されるSG
IPポリヌクレオチドを含んで成るトランスファーベクターによりトランスフェク
トされる。

【００９２】 King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System: A Lab
oratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Baculovirus E
xpression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press
., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. M
ethods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照のこと
。昆虫細胞内の天然の組換えが、ポリヘドリンプロモーターにより駆動されるSG
IPを含む組換えバキュロウィルをもたらすであろう。組換えウィルスストックは
、当業界において通常使用される方法により製造され得る。

【００９３】 組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( Luckow, V
A, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポゾンに
基づくシステムを利用する。このシステムは、Bac−to−Bac^TMキット（Life Te
chnologies, Rockville, MD）として市販されている。このシステムは、“bacm
id” と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持されるバキュロウィル
スゲノム中に、SGIPポリペプチドをコードするDNAを移動せしめるために、Tn7ト
ランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBacI ^TM (Life Technologie
s )を利用する。pFastBacl^TM トランスファーベクターは、興味ある遺伝子、こ
の場合、SGIPの発現を誘導するためにAcNPVポリヒドリンプロモーターを使用す
る。

【００９４】 しかしながら、pFastBacl^TMは相当の程度まで修飾され得る。前記ポリヒドリ
ンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現
され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られ
ているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Pcor, p6.9又は
MPプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Hill−Perkins, M
.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. な
ど., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapop
ort, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。そのようなトラン
スファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又
は長いバージョンが使用され得る。

【００９５】 さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列によりトランスファーベ
クターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラ
ーゼ（EGT）、ミツバチMelittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウ
ィルスgp67（PharMingem, San Diego, CA)は、生来の分泌シグナル配列を置換す
るために、構造体に使用され得る。さらに、トランスファーベクターは発現され
たSGIPポリペプチドのC−又はN−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピ
トープ標識をコードするDNAとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Gru
ssenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985）。

【００９６】 当業界において知られている技法を用いて、SGIPを含むトランスファーベクタ
ーにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である
断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロウ
ィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離され、そしてスポ
ドプテラ・フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda ）細胞、例えばSf9 細胞を
トランスフェクトするために使用される。SGIPを発現する組換えウィルスが結果
的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用される
方法により製造される。

【００９７】 組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ
・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。も
う１つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）に由来するH
igh FiveO^TM細胞系(Invitrogen)である（アメリカ特許第5,300,435号）。市販の
血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。

【００９８】 適切な培地は、Sf9細胞のためには、SF900II^TM (Life Technologies),又はEST
921^TM(Expression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405^TM（
JRH Biosciences, Lenza, KS）又はExpress FiveO^TM(Life Technologies )であ
る。細胞は、約２〜５×１０⁵個の細胞〜１〜２×１０⁶個の細胞の接種密度から
増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1〜10,より典型的にはほ
ぼ３の感染の多重度（MCI）で添加される。組換えウィルス−感染された細胞は
典型的には、感染の後12〜72時間で、組換えSGIPポリペプチドを生成し、そして
それを種々の効率で培地中に分泌する。培養物は通常、感染の後48時間で収穫さ
れる。

【００９９】 遠心分離を用いて、培地（上清液）から細胞を分離する。SGIPポリペプチドを
含む上清液が微小孔フィルターを通して濾過される。使用される方法は一般的に
、入手できる実験用マニュアルに記載されている（King, L. A. and Possee, R.
D., 前記; O’Reilly, D. R. など., 前記；Richardson, C. D., 前記）。上清
液からのSGIPポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達
成され得る。

【０１００】 菌類細胞、例えば酵母細胞及び特にサッカロミセス（Saccharomyces）及びピ
チア（Pichia）はまた、SGIPフラグメント又はポリペプチド融合体の生成のため
に本発明内で使用され得る。外因性DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそ
れから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ
特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, ア
メリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurr
ay など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞
は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の
不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。

【０１０１】 酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地にお
ける増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメ
リカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母
への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（
例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許
第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及び
アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特
許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照
のこと。

【０１０２】 他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾ
サッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス
・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluy
veromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア
・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolic
a）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マ
ルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知ら
れている。

【０１０３】 例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCr
egg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mckni
ght など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモ
ニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は
、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（N
eurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,53
3号により開示される。

【０１０４】 形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の
増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の
方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培
地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須
アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子
又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加
されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーによ
り補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における
薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。

【０１０５】 P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地に
おいて、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーショ
ンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％D−グ
ルコース、２％のBacto^TMペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI）, 1%の
Bacto^TM 酵母抽出物（Difco Laboratories）, 0.004%のアデニン及び0.006％の
L−ロイシン）である。

【０１０６】 発現された組換えSGIPペプチド又はポリペプチドは、分別及び／又は従来の精
製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオト
ロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、
ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィ
ーを包含する。適切なアニオン交換媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガ
ロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含
する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好ましく、そしてDEAE Fast−Flow Sephar
ose (Pharmacia, Piscataway, NJ)が特に好ましい。

【０１０７】 典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基によ
り誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl
ブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Pharm
acia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso H
aas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基
材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、
ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用され
る条件下で不溶性である同様のものを包含する。

【０１０８】 それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基よ
り変性され得る。カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロ
キシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラ
ジド活性化及びカルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及
びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知
られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。

【０１０９】 支持媒体にリガンド又は受容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界に
おいて良く知られている。特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択さ
れた支持体の性質により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Pr
inciples & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を
参照のこと。

【０１１０】 本発明のポリペプチド、ペプチド及び変異体は、小サイズ及び低pIの開発によ
り単離され得る。例えば、本発明のポリペプチド、ペプチド及び変異体は、低pH
値でのアニオン交換体に結合され得る。他の精製方法は、レクチン親和性クロマ
トグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタン
パク質の精製を包含する（Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protei
n Purification”, M. Deutscher, ( ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp
. 529−39）。他方では、興味あるポリペプチド、ペプチド及び変異体、及び親
和性標識（例えば、ポリヒスチジン、マルトース−結合タンパク質、免疫グロブ
リンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。

【０１１１】 本発明のポリペプチド融合体は一般的に、約1,500よりも多くないアミノ酸残
基、好ましくは約1,200よりも多くない残基、より好ましくは約1,000よりも多く
ない残基を含み、そして多くの場合、相当に少ないであろう。例えば、SGIPポリ
ペプチドの残基は、E.コリβ−ガラクトシダーゼ（1,021個の残基；Casadabanな
ど., J. Bacteriol. 143:971-980, 1980を参照のこと）、10−残基のスペーサー
、及び４−残基の第Xa因子の切断部位に融合され得る。第２の例においては、SG
IPポリペプチドの残基は、マルトース結合タンパク質（約370個の残基）、４−
残基の切断部位及び６−残基のポリヒスチジン標識に融合され得る。

【０１１２】 タンパク質折りたたみ（及び任意には、再酸化）方法が好都合には使用され得
る。タンパク質を80％以上の純度、より好ましくは90％以上の純度、さらにより
好ましくは95％以上の純度に精製することが好ましく、そして医薬的に純粋な態
様、すなわち汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して、99.9％以上
の純度が好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さないことが好ましい。好ま
しくは、精製されたタンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパ
ク質を実質的に有さない。

【０１１３】 SGIPポリペプチド、ペプチド、変異体又はそのフラグメントはまた、化学合成
を通して調製され得る。SGIPポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得
；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペルギレ−ト化さ
れても又はペルギレ−トされなくても良く；アミド化されても又はアミド化され
なくても良く；硫酸化されても又は硫酸化されなくても良く；そして開始メチオ
ニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。例えば、SGIPポリペプチド
はまた、独占的固相合成、部分固相合成、フラグメント縮重又は従来の溶液合成
により合成され得る。

【０１１４】 ポリペプチドは、好ましくは、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 19
63; Kaiserなど., Anal. Biochem. 34: 585,1970により記載のように、固相ペプ
チド合成により合成される。合成は、α−アミノ末端で保護されているアミノ酸
により行われる。不安定側鎖を有する三官能アミノ酸はまた、ポリペプチドのア
センブリーの間に生ずる所望しない化学反応を妨げるために、適切な基により保
護され得る。α−アミノ保護基は、アミノ−末端での続く反応の発生を可能にす
るために選択的に除去される。α−アミノ保護基の除去のための条件は、側鎖保
護基を除去しない。

【０１１５】 α−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の技術において有用であること
が知られている基である。それらは、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリ
フルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳
香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換さら
たベンジルオキシカルボニル及び９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（
Fmoc）］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（tBoc
）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］及びア
ルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）を包含する。好まし
い保護基は、tBoc及びFmocである。

【０１１６】 選択される側鎖保護基は、カップリングの間、損なわれないまま存続し、そし
てアミノ末端保護基の保護解除の間、又はカップリング状態の間、除去されるべ
きではない。側鎖保護基はまた、最終ポリペプチドを変更しないであろう反応条
件を用いて合成の完結に基づいて除去できるべきである。tBoc化学においては、
三官能アミノ酸のための側鎖保護基は、ほとんどベンジルに基づかれている。Fm
oc化学においては、それらはほとんどtert−ブチル又はトリチルに基づかれてい
る。

【０１１７】 tBoc化学においては、好ましい側鎖保護基は、アルギニンについてはトシル、
アスパラギンサンについてはシクロヘキシル、システインについては４−メチル
ベンジル（及びアセトアミドメチル）、グルタミン酸、セリン及びトレオニンに
ついてはベンジル、ヒスチジンについてはベンジルオキシメチル（及びジニトロ
フェニル）、リシンについては２−C1−ベンジルオキシカルボニル、トリプトフ
ァンについてはホルミル、及びチロシンについては２−ブロモベンジルである。

【０１１８】 Fmoc化学においては、好ましい側鎖保護基は、アルギニンについては２，２，
５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Pmc）又は２，２，４，
６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Pbf）、アスパ
ラギン、システイン、グルタミン及びヒスチジンについてはトリチル、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン及びチロシンについてはtert−ブチ
ル、及びリシン及びトリプトファンについてはtBocである。

【０１１９】 ホスホペプチドの合成に関しては、リン酸基の直接的な又はアセンブリー後の
組み込みが用いられる。直接的な組み込み手段においては、セリン、トレオニン
又はチロシン上のリン酸基が、メチル、ベンジル又はてtert−ブチル（Fmoc化学
における）により、又はメチル、ベンジル又はフェニル（tBoc化学における）に
より保護され得る。リン酸保護を伴なわないでのホスホチロシンの直接的な組み
込みがまた、Fmoc化学において使用され得る。アセンブリー後の組み込み手段に
おいては、セリン、トレオニン又はチロシンの保護されていないヒドロキシル基
が、ジ−tert−ブチル−、ジベンジル−又はジメチル−N, N’−ジイソプロピル
ホスホラミジットにより固相上で誘導体化され、そして次に、tert−ブチルヒド
ロペルオキシドにより酸化される。

【０１２０】 固相合成は通常、α−アミノ保護された（側鎖保護された）アミノ酸を、適切
な固体支持体に結合することによって、カルボキシル末端から実施される。結合
がクロロメチル、クロルトリチル又はヒドロキシメチル樹脂に対して行われる場
合、エステル連鎖が形成され、そしてその得られるポリペプチドは、C−末端で
遊離カルボキシル基を有するであろう。他方では、アミド樹脂、例えばベンズヒ
ドリルアミン又はｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（tBoc化学に関する）及
びRinkアミド又はPAL樹脂（Fmoc化学に関する）が使用される場合、アミド結合
が形成され、そしてその得られるポリペプチドはC−末端でカルボキサミド基を
有するであろう。

【０１２１】 それらの樹脂は、結合される第１アミノ酸を有するか又は有さないハンドル又
はリンカーを伴なって又はそれを伴なわないで、ポリスチレン−又はポリアミド
−基材であろうと、又はポリエチレングリコール−グラフトされてもいずれにせ
よ、市販されており、そしてそれらの調製法は、Stewartなど., “Solid Phase
Peptide Synthesis” (Znd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1
984) and Bayer & Rapp Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)；及びAthertonなど., S
olid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1
989 により記載されている。

【０１２２】 必要なら、側鎖で及びα−アミノ基で保護されたC−末端アミノ酸は、種々の
活性化剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N, N’−ジイソプ
ロピルカルボジイミド（DIPCDI）及びカルボニルジイミダゾール（CDI）を用い
て、ヒドロキシメチル樹脂に結合される。それは、そのセシウムテトラメチルア
ンモニウム塩形で、又はトリエチルアミン（TEA）又はジイソプロピルエチルア
ミン（DIEA）の存在下で、クロロメチル又はクロロトリチル樹脂に直接的に結合
され得る。アミド樹脂への第１アミノ酸結合は、カップリング反応の間のアミド
結合形成と同じである。

【０１２３】 樹脂支持体への結合に続いて、α−アミノ保護基は、保護化学に依存して、種
々の試薬（例えば、tBoc, Fimoc）を用いて除去される。Fmoc除去の程度は、300
−320nmで又は導電率セルによりモニターされ得る。α−アミノ保護基の除去の
後、残る保護されたアミノ酸は、所望する配列を得るために、必要とされる順序
で段階的にカップリングされる。

【０１２４】 次の種々の活性化剤がカップリング反応のために使用され得る：DCC、DIPCDI,
２−クロロ−１，３−ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフェート（CIP）
、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホ
ニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（BOP）及びそのピロリジン類似体（PyBOP
）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（
PyBroP）、O−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメ
チル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）及びそのテトラフルオロ
ベンゾエート類似体（TBTU）又はそのピロリジン類似体（HBPyU）、O−（７−ア
ザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウ
ムヘキサフルオロホスフェート（HATU）及びそのテトラフルオロベンゾエート類
似体（TATU）又はそのピロリジン類似体（HAPyU）。

【０１２５】 カップリング反応に使用される最も通常の触媒添加剤は、４−ジメチルアミノ
ピリジン（DMAP）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，
３−ベンゾトリアジン（HODhbt）、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）
及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（HOAt）を包含する。個々の
保護されたアミノ酸は過剰（2.0当量以上）に使用され、そしてカップリングは
通常、N−メチルピロリドン（NMP）において、又はDMF、CH₂Cl₂又はその混合物
において行われる。カップリング反応の完結の程度は、例えばKaiserなど．，An
al. Biochem. 34: 595, 1970により記載されるように、ニンヒドリン反応により
、個々の段階でモニターされ得る。

【０１２６】 所望するペプチドの完全なアセンブリーの後、ペプチド−樹脂は適切なスカベ
ンジャーと共に試薬により切断される。Fmocペプチドは通常、スカベンジャー（
例えば、H₂O、エタンジチオール、フェノール及びチオアニゾール）と共にTFAに
より切断され、そして保護解除される。tBocペプチドは通常、液体HFにより−５
〜０℃で１〜２時間、切断され、そして保護解除され、ここで前記HFは樹脂から
ポリペプチドを切断し、そしてほとんどの側鎖保護基を除去する。スカベンジャ
ー、例えばアニソール、ジメチルスルフィド及びｐ−チオクレゾールが通常、分
解の間に形成されるカチオンがポリペプチドに存在するアミノ酸残基をアルキル
化し、そしてシアル化することを妨げるために液体HFと共に使用される。

【０１２７】 トリプトファンのホルミル基及びヒスチジンのジェニトロフェニル基は、それ
ぞれ、HF分解の前、DMF中、ピペリジン及びチオフェニルにより除去される必要
である。システインのアセトアミドメチル基は、酢酸第II水銀により、及び他方
では、システインをシスチンに同時に酸化する、ヨウ素、三フルオロ酢酸タリウ
ム（III）又は四フルオロ硼酸銀により除去され得る。tBoc ペプチド分解及び保
護解除のために使用される他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA
）及びトリメチルシリルトリフルオロアセテート（TMSOTf）を包含する。

【０１２８】 アミノ酸修飾は、種々の手段で合成ペプチドに付加され得る。そのようなアミ
ノ酸修飾は、例えば宿主細胞発現の間、付加されるグルコシル化、アシル化又は
他の修飾を付加するために有益であり得る。それらの修飾は、例えば血流におけ
るペプチドの半減期に対する効果を有することができ、又は脂質環境においてペ
プチドを輸送するために必要である。特に、ペプチドのアシル化は、それをより
低い極性にし、そして脂質とのその相互作用を増強し、そしてリポソーム中への
その組み込みを可能にする。

【０１２９】 ペプチドは、腸上皮を通過する増強される能力のために、アシル化された変異
体として経口利用できる。このアミノ酸修飾から選択された脂肪酸の型は、脂質
溶解性の程度及びSGIPペプチドの活性に影響を及ぼすことができる。当業者は、
脂肪酸側鎖の飽和の長さの又は程度を変更することができ、そしてペプチドを作
用の異なった部位に向けることができる。腸ホルモンファミリーの小さなペプチ
ドに関しては、そのような作用の部位は、例えば胃腸系における受容体−対−脳
及び下垂体における受容体を包含する。従って、本発明のSGIPペプチドは、ペプ
チドに対して行われる修飾に基づいて異なった組織に標的化され得る。

【０１３０】 本発明の分子の活性は、胃腸収縮性の刺激、栄養物摂取の変調、消化酵素及び
ホルモンの分泌の変調、膵臓における酵素及び/又はホルモンの分泌の変調、SGI
P受容体の結合、又は配列番号２の残基１〜11に対して特異的に結合する抗体の
結合を測定する種々のアッセイを用いて測定され得る。例えば、平滑筋細胞の修
飾の収縮性の変化、例えば哺乳類十二指腸又は他の胃腸平滑筋組織のセグメント
の収縮応答が特に興味の対象である（Depoortereなど., J. Gastrointestinal M
otility 1:150-159, 1989; 引用により本明細書に組み込まれる）。典型的なイ
ンビボアッセイは、交連間の放射状の寸法変化及び弁基底の平面に対して垂直な
寸法変化を測定するために超音波マイクロメーターを用いる（Hansenなど., Soc
iety of Thoracic Surgeons 60: S384-390, 19959）。

【０１３１】 胃の運動性は、一般的に胃の空腹化のために必要とされる時間及び胃腸管を通
しての続く転移時間として臨床学的設定において測定される。胃の空腹化走査は
、当業者に良く知られており、そして手短には、経口コントラスト剤、例えばバ
リウム又は放射性ラベルされた金属の使用を包含する。固体及び脂質は独立して
測定され得る。試験食品又は液体は同位体（例えば、^99mTc）により放射性ラベ
ルされ、そして摂取又は投与の後、胃腸管及び胃の空腹化を通しての転移時間は
、ガンマカメラを用いての可視化により測定される（Meyerなど., Am. J. Dig.
Dis. 21: 296, 1976; Collins など., Gut 24: 1117, 1983; Maughanなど., Dia
bet. Med. 139 Supp. 5: S6-10, 1996及びHorowitzなど., Arch. Intern. Med.
145: 1467-1472, 1985）。それらの研究は、薬剤の効能を安定化するために促進
剤の投与の前後で行われ得る。

【０１３２】 細胞増殖又は分化に影響を及ぼすSGIPポリペプチド能力を測定するアッセイは
、当業界において良く知られている。例えば、増殖を測定するアッセイは、中性
赤色顔料に対する化学感受性（Cavanaughなど., Investigational New Drugs 8:
347-354, 1990; 引用により本明細書に組み込まれる）、放射性ラベルされたヌ
クレオチドの組み込み（Cookなど., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989; 引
用により本明細書に組み込まれる）、増殖細胞のDNAにおける５−ブロモ−2’−
デオキシウリジン（BrdU）の組み込み（Porstmannなど., J. Immunol. Methods
82: 169-179, 1985; 引用により本明細書に組み込まれる）、及びテトラゾリウ
ム塩の使用（Mosmann、J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alleyなど., Can
cer Res. 48: 589-601, 1988; Marshallなど., Growth Reg. 5: 69-84, 1995;
及びScudieroなど., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1986; 引用により本明細書に
組み込まれる）のようなアッセイを包含する。

【０１３３】 例えば、分化を測定するアッセイは、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学
的変化の段階−特異的発現に関連する細胞−表面マーカーの測定を包含する（Wa
tt, FASEB 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Ra
es, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; 引用によ
り本明細書に組み込まれる）。

【０１３４】 アッセイは、走化性、付着性、イオンチャネル流入の変化、第２メッセンジャ
ーレベルの変調及び神経伝達物質の開放を包含する他の細胞応答を測定するため
に使用され得る。例えば、“Basic & Clinical Endocrinology Ser., Vol. 3”,
Cytochemical Bioassays: Techniques & Applications, Chayen; Chayen, Bite
nsky, eds., Dekker, New York, 1983を参照のこと。

【０１３５】 SGIPについて観察される組織分布の観点から、アゴニスト（例えば、天然のリ
ガンド/基質/補因子/合成及び天然に存在するペプチド及び変異体、等）及びア
ンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。
SGIPアゴニストとして同定される化合物は、胃腸収縮性の刺激、栄養摂取の変調
、消化酵素及びホルモンの分泌の変調、膵臓における酵素及び/又はホルモンの
分泌の変調、SGIP受容体の結合、又はインビボ及びインビトロでの配列番号２の
残基１〜11に特異的に結合する抗体の結合を促進するために有用である。例えば
、アゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の化合物として有用であり、そ
して栄養物の摂取を調節し、そして従って、胃腸細胞、例えばG細胞、腸クロム
親和性細胞、及び胃、十二指腸、近位空腸、噴門端及び低部の上皮粘膜の増殖及
び/又は成長を特異的に促進することにおいて有用である。

【０１３６】 腸−脳ペプチドのファミリーは、神経学的及びCNS機能に関連している。例え
ば、NPY, すなわち脳及び腸の両者に受容体を有するペプチドは、中枢神経系に
投与される場合、食欲を刺激することが知られている（Gehlert, Life Sciences
55 (6): 551-562, 1994）。モチリン免疫反応は、脳の異なった領域、特に小脳
において、及び下垂体において同定されている。（Gaspariniなど., Hum. Genet
ics 94(6): 671-674, 1994）。モチリンは、小脳における神経伝達物質γ−アミ
ノ酪酸との同時存在することが見出されている（Chan−Patay, Proc. Sym. 50^th Anniv. Meet. Br. Pharmalog. Soc. : 1-24, 1982）。

【０１３７】 生理学的研究は、モチリンが植物摂取挙動性（Resenfieldなど., Phys. Behav
. 39 (6): 735-736, 1987）、膀胱の制御、下垂体成長ホルモン開放に関する影
響を有するいくつかの証拠を提供して来た。他の腸―脳ペプチド、例えばCCK、
エンケファリン、VIP及びセクレチンは、消化系における活性の他に、血圧、心
拍数、挙動性の制御及び苦痛調節に関与することが示されている。従って、SGIP
、例えば変異体、又はそのいくらかの部分は、いくらかの神経学的関連性を有す
ることが予測される。

【０１３８】 NPYは、心血管効果、例えば心不全及び低血圧に関連する、心臓における高め
られた交換神経活性、及び血圧及び迷走神経作用における変化に関連している（
Feng, Q. など., Acta. Physiol. Scand. 166: 285-291, 1999; Mclean, K.J.
など., Neuroscience 92: 1377-1387, 1999; EKなど., Regul. Pept. 25: 167-1
77, 1989; Gardiner, SM Brain Res. Brain Res. Review 14: 79-116, 1989）。

【０１３９】 NPY及びモチリンは、ヒト身体におけるペプチドホルモンの重要性及び広い活
性、及び通常の生理学的機能及び疾病に対する影響力を強調する。ペプチドホル
モンは、心血管変調及び恒常性、消化、脳、ニューロン及び他の器官機能の変調
状況に関与している。種々のペプチドホルモンは、血圧の制御、心拍数、不整脈
、心血管伝達物の開放及び作用に影響を及ぼす浸透バランス、血管収縮及び血管
拡張、心筋虚血をもたらす血管収縮、血管運動の状態収縮性、食物摂取、呼吸、
挙動性及び苦痛調節及び同様のものに関与することが示される。

【０１４０】 ペプチドホルモンとして、SGIPペプチドは、同様に、心臓、又はそれが発現さ
れる他の組織において効果を発揮し、又は身体じゅうに自由に循環し、そして他
の場所で効果を発揮する。従って、SGIPペプチドは、種々の生物学的機能を正又
は負に調節することができ、又は心臓、腸、CNS及び他の器官又は組織からの他
の調節ホルモンの放出を引き起こすことができる。そのようなSGIP活性正につい
て試験するためのアッセイ及びモデルは、当業界において良く知られており、そ
して本明細書に記載されている。

【０１４１】 例えば、中でも次の当業界において知られている方法を参照のこと：Feng，Q.
など., 前記（血管交換神経活性を評価するための穿刺されたラット心不全モデ
ル）；Horackova, など., Call Tissue Res. 297: 409-421, 1999（テンジュク
ネズミ心房モデル）；McLean, K.J. など., 前記（心血管制御内のニューロン応
答又は活性化を評価するために低血圧攻撃に対するCNS応答）；Potter, E.K.な
ど., 前記（心臓での血管及び迷走神経作用に対するポリペプチド及びペプチド
フラグメントの効果の試験）；

【０１４２】 Maturi，MFなど., J. Clin. Invest. 83: 1217-1224 (イヌおける心筋虚血及
び冠状収縮モデル)；Haass, M. など., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol
. 339: 71-78, 1989 (現場灌流されたテンジュクネズミ心臓におけるプレ−シナ
プス調節)；Hassall, CJ.and Burnstock, G. Neurosci. Lett. 52: 111-115, 19
84 (内因性神経支配を研究するための培養されたテンジュクネズミ心房)；Lundb
erg, JM.など., Acta Physsion. Scand. 121:325-332, 1984 (テンジュクネズミ
心房、輸出管、膀胱、門静脈及び気管における筋肉状態及び自律神経性伝達に対
するペプチドの効果）；

【０１４３】 Matios,（J. J. Neurasci. Methods 34: 193-200, 1990 (心血管制御に対する
食物摂取の効果)；Miyata, A. など., Ann. N.Y. Acad. Sci. 865: 73-81, 1998
(ラット大動脈平滑筋細胞増殖に対するペプチドの効果)；Saita, M.など., Am.
J. Physiol. 274: R979-984, 1998 (ネットにおける血圧、心拍数、腎交感神経
活性に対する中枢投与されたペプチドの効果)；Krowicki, ZK など., Am. J. Ph
ysiol. 272: G1221-1229, 1997 (迷走神経介在性胃運動興奮)；Hall, MEなど.,
Brain Res. 497: 280-290, 1989 (孤立性管（NTS）の核中へのペプチドのマイク
ロインジェクション及び心血管機能に対する効果)。

【０１４４】 さらに、当業界において知られており、そして本明細書に記載される免疫組織
及び免疫ラベリング方法は、他の心血管エフェクター、例えばNPY及びVIPに対す
るSGIPペプチドの影響を評価するために使用され得る（Wharton, J. and Gulben
kian S. Experientia Suppl. 56: 292-316, 1989; 及びForsgren, S. Cell Tiss
ue Res. 256: 125-135, 1989）。ラベルされたSGIPペプチド及び抗体は、心血管
機能を評価するために使用され得る。さらに、そのようなラベルされたSGIPペプ
チド及び抗体は、正常な対照に比較してヒト疫病を評価するための診断物として
使用され得る。そのような組織学、免疫組織化学及び免疫ラベリング方法及び同
様の方法は、本明細書に記載されるインビボモデルに関して使用され得る。

【０１４５】 本発明の分子の心臓活性は、ランゲンドーフアッセイを用いて測定され得る。
好ましいアッセイは、実験動物についてのエクスビボ心臓機能を測定し、そして
当業界において良く知られている。実験動物は、ラット、ウサギ及びテンジュク
ネズミであるが、但しそれらだけには限定されない。心臓組織に対する慢性効果
は、SGIPペプチドにより試験動物を１〜７日間又はそれ以上の間、処理した後、
測定され得る。対照動物は、緩衝液のみを受けるであろう。処理の後、心臓が除
去され、そして大動脈を通して逆方向に灌流される。灌流の間、次のいくつかの
生理学的パラメーターが測定される：時間当たりの冠状動脈血流、左心室（LV）
圧力、及び心拍数。それらのパラメーターは、心臓機能に直接的に影響を及ぼす
。

【０１４６】 SGIPペプチドによるインビボ処理に続いてランゲンドーフアッセイにより測定
される場合、対照動物に対するそれらのパラメーターの変化は、心臓機能に対す
るポリペプチドの慢性効果を示す。さらに、ランゲンドーフアッセイはまた、心
臓に対するSGIPペプチドの急性効果を測定するためにも使用され得る。そのよう
な用途においては、処理されていない動物からの心臓が使用され、そしてSGIPペ
プチドがアッセイにおける灌流物に添加される。上記で評価されたパラメーター
が測定され、そしてSGIPペプチドが灌流物から除かれている対照心臓からの結果
と比較される。心拍数の差異、時間あたりの圧力の変化及び/又は冠状動脈血流
は、心臓機能に対する本発明の分子の急性効果を示す。

【０１４７】 さらに、腸−脳ペプチドの他のメンバー、例えばCCK、ガストリン及び同様の
ものは、膵臓酵素及びホルモンの分泌を調節することが示されている。 同様に、このファミリーの他のメンバーは、グルカゴンがインスリンの分泌を
調節するように、内因性タンパク質の分泌を調節することが知られている。SGIP
は、非−SGIPタンパク質、例えばGLP−１、成長ホルモン、ソマトスタチン及び
同様のものの分泌を調節するために使用され得る。

【０１４８】 リガンドとして、SGIPペプチドは、Gタンパク質結合された受容体、例えば成
長ホルモン分泌促進薬受容体（GHS−R）を結合することができる。成長ホルモン
分泌促進薬は、GHRHの作用以外の作用の機構により、すなわち下垂体及び視床下
部における異なった受容体（GHS−R）を結合することにより、下垂体細胞からの
成長ホルモンの放出を刺激する種類の小さなペプチドである。従って、この受容
体の結合は、神経内分泌外活性、例えば睡眠及び植物摂取における成長ホルモン
の調節において役割を演じることができる。従って、成長ホルモンの分泌は、SG
IPペプチドとGHS−Rとの間でのペプチド−受容体複合体の形成により調節され得
る。

【０１４９】 成長ホルモンの放出は、多くの組織における成長を刺激し、そして代謝工程、
例えばタンパク質合成及び遊離脂肪酸代謝の刺激、及び炭水化物から脂肪酸まで
の種々のエネルギー源からの代謝の刺激に対する効果を有する。成長ホルモンの
不足は、医薬的障害、例えば小人症をもたらす。

【０１５０】 一般的に、成長ホルモン分泌促進剤の１つの利点は、正常なフィードバック機
構を維持しながら、内因性拍動性成長ホルモン分泌を増幅するそれらの能力であ
る。もう１つの重要な効果は、若い成人の濃度に類似する濃度まで、年配の成人
における血清インスリン−様成長因子−I（IGF-I）レベルを回復する能力である
。Hansen, B.S.など., Eur. J. Endocrinol. 141: 180-189、1999を参照のこと
。従って、GHS−Rのためのリガンドとして、SGIPは、成長ホルモン及びインスリ
ン−様成長因子Iの分泌の調節のために有用である。

【０１５１】 本発明のアミノ酸及びDNA配列における部位−特異的変化を用いて、アンタゴ
ニスト、アゴニスト又は部分的アゴニストのいずれかである類似体が製造され得
る（Macielayなど., Peptides: Chem. Struct. Biol. Pp. 659, 1996）。アンタ
ゴニストは、胃腸過剰運動性に関連する臨床学的病状、例えば下痢及びクローン
病のために有用である。アンタゴニストはまた、リガンド−受容体相互作用の部
位を特徴づけるための調査試薬としても有用である。

【０１５２】 SGIPポリペプチドはまた、受容体の精製のためにも使用される。前記ポリペプ
チドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セル
ロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド
又は使用の条件下で安定している同様の材料上に固定される。固体支持体にポリ
ペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン
化学、臭化シアノゲン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシ
ド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒
体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体
ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、
通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、カオトロピック剤（グアニジンHC
l）、又はリガンド−受容体結合を破壊するｐHを用いて溶出される。

【０１５３】 リガンド−結合受容体(又は抗体、相補体／抗相補体対の１つのメンバー)、又
はその結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（BIAcore, Pharmacia
Biosensor, Piscataway, NJ）を用いるアッセイシステムが、好都合には、使用
され得る。そのような受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又はフラ
グメントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson
, J. Immunol. Methods 145: 229−40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mo
l.Biol. 234: 554−63,1993により開示される。

【０１５４】 受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学
を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合さ
れる。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ又は相補体／抗相
補体対の反対のメンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ固定され
た受容体、抗体又はメンバーに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変
化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン
−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして
結合の化学量の評価が可能にされる。

【０１５５】 リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のア
ッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定
のためのスカチャード分析（Scatchard, Ann. NY. Acad. Sci. 51:660−72, 194
9）及び熱量測定アッセイ（Cunningham など., Science 253: 545−48, 1991; C
unningham など., Science 245: 821−25, 1991）を包含する。

【０１５６】 機能的GHS−Rを発現する細胞が、スクリーニングアッセイ内で使用される。種
々の適切なアッセイが当業者において知られている。それらのアッセイは、標的
細胞における生物学的応答の検出に基づかれている。１つのそのようなアッセイ
は、細胞増殖アッセイである。細胞が、試験化合物の存在又は不在下で培養され
、そして細胞増殖が、例えばトリチウム化されたチミジンの組み込みを測定する
ことによって、又はAlamar Blue^TM (AccuMed, Chicago, IL) 又は３−（４，５
−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミ
ド（MTT）の代謝分解に基づいての比色アッセイにより検出される（Mosman，J.
Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983）。

【０１５７】 もう１つのアッセイは、受容体結合を測定するためにホスホリパーゼCシグナ
ルトランスダクションを用いる。この種類の典型的なアッセイは、エクオリン、
すなわち生物発光Ca²⁺−感受性レポータータンパク質によるCa²⁺の開放性を測定
する。このアッセイはさらに、Feighner, S.D. など., 前記により記載される。
従って、SGIPペプチドは、ホスホリパーゼCトランスダクションを測定するアッ
セイを用いて試験され得る。

【０１５８】 さらにもう１つのアッセイは、受容体結合を測定するためにホスホリパーゼC
シグナルトランスダクションを用いる。この種類の典型的なアッセイは、エクオ
リン、すなわち生物発光Ca²⁺−感受性レポータータンパク質によるCa²⁺の開放性
を測定する。このアッセイはさらに、Feighner, S.D. など., 前記により記載さ
れる。従って、SGIPペプチドは、ホスホリパーゼCトランスダクションを測定す
るアッセイを用いて試験され得る。他のアッセイもまた、本明細書において列挙
される。

【０１５９】 SGIPポリペプチド、ペプチド及び変異体はまた、SGIPエピトープ、ペプチド又
はポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ポリ
クローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良
く知られている。例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R
., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CR
C Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと。当業者に明らかなように
、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏
、ウサギ、マウス、及びラットから生成され得る。

【０１６０】 SGIPポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アル
ミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ
得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチ
ド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばSGIP又はその
一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一
部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部
分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KL
H）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結
合され得る。

【０１６１】 本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性
精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント
、例えばF(ab’)₂及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的
に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフ
ラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリ
ペプチドもまた包含される。

【０１６２】 非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCDRのみを移植することによ
って、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露
された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（cl
oaking）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒ
ト型化され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強す
るために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。

【０１６３】 ヒト型化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基
づく有害な免疫反応の可能性が低められる。本明細書において有用な抗体を生成
し又は選択するためのもう１つの技法は、SGIPタンパク質又はペプチドへのリン
パ球のインビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ラ
イブラリーの選択（例えば、固定された又はラベルされたSGIPタンパク質又はペ
プチドの使用を通して）を包含する。

【０１６４】 抗体は、それらが10⁶M^-1又はそれ以上、好ましくは10⁷M^-1又はそれ以上、より
好ましくは10⁸M^-1又はそれ以上、及び最も好ましくは10⁹M^-1又はそれ以上の結合
親和性（Ka）で、SGIPポリペプチドの結合する場合、特異的に結合するとして定
義される。抗体の結合親和性は、当業者によって容易に決定され得る（例えばSc
atchard 分析により）。

【０１６５】 当業者に知られている種々のアッセイがSGIPタンパク質又はペプチドに特異的
に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Antibodi
es: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor Labo
ratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な
例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイ
ムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロット又はウェス
ターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセイ。
さらに、野生型対変異体のSGIPタンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリ
ーンされ得る。

【０１６６】 SGIPに対する抗体は、SGIPを発現する細胞を標識するために；アフィニティー
精製によりSGIPを単離するために；SGIPポリペプチドの循環レベルを決定するた
めの診断アッセイのために；根本的な病理学のマーカーとして可溶性SGIPを検出
し又は定量化するために；FACS を使用する分析方法において、発現ライブラリ
ーをスクリーニングするために；抗-インディオタイプ抗体を生成するために；
及びインビトロ及びインビボでSGIP活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴ
ニスとして使用され得る。

【０１６７】 適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビ
ター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間
接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の相補体／
抗−相補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質は
また、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接
合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され
得る。

【０１６８】 本発明の分子は、SGIPの機能を介在する受容体を同定し、そして単離するため
に使用され得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固定さ
れ、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Immobilized Affinity Ligand
Techniques, Hermanson など., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992,
pp.195-202）。SGIPポリペプチド、ペプチド及び変異体に結合するポリペプチド
、及びペプチドが、当業界において知られている方法を用いて、溶出され、そし
て特徴付けられる。

【０１６９】 タンパク質及びペプチドがまた、放射性ラベルされ（Methods in Enzymol., v
ol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, ed., Acad. Pre
ss, San Diego, 1990, 721-737）、又は光親和性ラベルされ（Brunner など., A
nn. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993及びFedan など., Biochem. Pharnacol.
33: 1176-1180, 1984）、そして特定の細胞−表面タンパク質がインビトロ又は
インビボで同定され得る。他の検出できるラベルがまた、使用され得、そして例
えば、蛍光ラベル（FTTC、ローダミン及び蛍光−ビオチニル化されたラベル）を
包含する。

【０１７０】 SGIPを結合する組織は、例えば本明細書における例５に示されるように、結合
アッセイにより同定され得る。そのような組織は、細胞抽出物、膜画分、タンパ
ク質溶解物、精製されたタンパク質及び同様のものの源として使用され、そして
SGIPポリペプチド又はペプチドが同定され、そしてSGIP受容体が単離され、そし
て特徴づけられるカラムに適用される。他方では、そのような組織が収穫され、
そしてSGIPリガンドへの結合についてインビトロ又はインビボで試験される。

【０１７１】 SGIP受容体を同定し、そして精製するためのもう１つの方法は、 SGIP受容体
−依存性細胞応答の刺激/阻害を測定する。例えば、細胞系は、受容体刺激され
た細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る
。このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そし
て一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺
伝子に作用可能に連結される応答要素を含むであろう。DNA応答要素は、サイク
リックAMP応答要素（CRE）、ホルモン応答要素（HRE）、インスリン応答要素（I
RE）（Nasrin など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273−7, 1990）及び血
清応答要素（SRE）（Shaw など., Cell 56: 563−72, 1989）を包含するが、但
しそれらだけには限定されない。

【０１７２】 サイクリックAMP応答要素は、Roestler など., J. Biol. Chem. 263 (19): 90
63−6, 1988及びHabener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087−94, 1990に再考さ
れる。ホルモン応答要素は、Beato, Cell 56: 335−44l, 1989に再考される。候
補体化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のzalpha 31刺
激の低下により明らかなように、標的細胞に対するzalpha 31の活性を阻害する
能力について試験される。次に細胞系が、SGIPポリペプチド及びペプチドに結合
する組織型、例えば腎臓、十二指腸及び空腸から調製されたcDNAライブラリー、
又は結合アッセイ、例えば例５におけるアッセイにより同定されるような他のも
のによりトランスフェクトされ得る。

【０１７３】 SGIPポリペプチド、ペプチド及び変異体を含む、細胞抽出物、膜画分、タンパ
ク質溶解物、精製されたタンパク質及び同様のものは、受容体のcDNAを発現する
細胞に結合することによって、トランスフェクトされた細胞系を刺激する。SGIP
又はSGIP変異体のその受容体への結合は、アッセイできるタンパク質又は代謝物
における変化をもたらす。さらに、結合は、サイクリックアデノシン一リン酸（
cAMP）又はサイクリックグアノシン一リン酸（cGMP）の調節により明らかにされ
得る。cAMP及びcGMPの変化の測定は、当業者に知られており、そしてキットは、
それらの決定のために市販されている（Biotrak, Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ）。

【０１７４】 他方では、SGIPポリペプチド、ペプチド及び変異体の細胞抽出物、膜画分、タ
ンパク質溶解物、精製されたタンパク質及び同様のものは、cDNAライブラリー（
受容体を含む）、及びレポーター遺伝子の両者によりトランスフェクトされた細
胞への直接的な結合について、検出できるラベル（例えば、¹²⁵I、ビオチン、ホ
ースラディシュペルオキシダーゼ）により標識されたSGIPポリペプチド、ペプチ
ド又は変異体を用いて試験され得る。このタイプのアッセイにおいては、受容体
へのラベルされた試験サンプルの結合能力が、リガンド結合の表示である。結合
アッセイ内に使用される受容体は、細胞受容体、又は単離され、固定された受容
体であり得る。

【０１７５】 リガンドとして、SGIPポリペプチド、ペプチド又は変異体の活性が、受容体結
合及び続く生理学的細胞応答に関連する、細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を
測定する、珪素に基づくバイオセンサーのマイクロフィジオメーターにより測定
され得る。典型的な装置は、Molecular Devices, Sunnyvale, CAにより製造され
るCytosensor^TM マイクロフィジオメーターである。種々の細胞応答、例えば細
胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同
様のものが、この方法により測定され得る。

【０１７６】 例えば、McConnell, H.M.など., Science 257：1906-1912, 1992; Pitchford,
S. など., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997: Arimilli, S. など., J. Immu
nol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. など., Eur. J. Pharmacol. 34
6: 87-95, 1998を参照のこと。マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着
性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたって細胞培
地における細胞外酸性化の変化を測定することによって、マイクロフィジオメー
ターは、種々の刺激、例えばSGIPポリペプチド、ペプチド、変異体、アゴニスト
又はアンタゴニストに対する細胞応答を直接的に測定する。

【０１７７】 好ましくは、マイクロフィジオメーターは、SGIPポリペプチド、ペプチド又は
変異体に応答しない対照の真核細胞に比較して、SGIP−応答性真核細胞の応答を
測定するために使用される。SGIP−応答性真核細胞は、SGIPポリペプチド、ペプ
チド又は変異体に対して応答性である細胞を創造するか、又は天然においてSGIP
に対して応答性である細胞、例えば腎臓、小腸、又は下垂体に由来する細胞を創
造する、SGIPがトランスフェクトされている細胞を包含する。SGIPポリペプチド
、ペプチド又は変異体に暴露されていない対照に比較して、SGIPポリペプチド、
ペプチド又は変異体に暴露されている細胞の応答における細胞外酸性化の上昇又
は低下により測定される差異が、SGIP−調節された細胞応答の直接的に測定であ
る。

【０１７８】 さらに、そのようなSGIP−調節された応答は、種々の刺激下でアッセイされ得
る。マイクロフィジオメーターを用いれば、SGIPポリペプチドに対する応答性の
細胞を供給し、前記細胞の第１部分を試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の
第２部分を試験化合物の存在下で培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して
、前記細胞の第２部分の細胞応答の上昇又は低下の変化を検出することを含んで
なる、SGIPポリペプチドのアゴニストを同定するための方法が提供される。

【０１７９】 細胞応答の変化は、測定できる変化の細胞外酸性化割合として示される。さら
に、SGIPポリペプチドの存在及び試験化合物の不在下での前記細胞の第３部分の
培養が、SGIP−応答性細胞のための陽性対照として、及びSGIPポリペプチドのア
ゴニスト活性と試験化合物のその活性とを比較するための対照として使用され得
る。

【０１８０】 さらに、マイクロフィジオメーターを用いれば、SGIPポリペプチドに対する応
答性の細胞を供給し、前記細胞の第１部分をSGIPの存在下で及び試験化合物の不
在下で培養し、前記細胞の第２部分をSGIPの存在下で及び試験化合物の存在下で
培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答
の上昇又は低下の変化を検出することを含んでなる、SGIPポリペプチドのアンタ
ゴニストを同定するための方法が提供される。細胞応答の変化は、測定できる変
化の細胞外酸性化割合として示される。SGIP 31ポリペプチドのためのアンタゴ
ニスト及びアゴニストは、この方法を用いて急速に同定され得る。

【０１８１】 さらに、SGIPのポリペプチド、ペプチド又は変異体は、SGIPにより刺激された
経路に対して応答する、細胞、組織又は細胞系を同定するために使用され得る。
上記マイクロフィジオメーターは、リガンド−応答細胞、例えば本発明のSGIPポ
リペプチド、ペプチド又は変異体に対する応答性の細胞を同定するために使用さ
れ得る。細胞は、SGIPポリペプチド、ペプチド又は変異体の存在又は不在下で培
養され得る。SGIPポリペプチド、ペプチド又は変異体の存在下で細胞外酸性化の
測定できる変化を誘発するそれらの細胞は、SGIPに対して応答性である。そのよ
うな細胞系は、上記のようなSGIPポリペプチドのアンタゴニスト及びアゴニスト
を同定するために使用され得る。

【０１８２】 zsig33の染色体位置測定、及び従って、SGIPの染色体位置測定は、3p26.1であ
る。本発明はまた、診断に使用できるであろう試薬を提供する。例えば、SGIP
遺伝子、SGIP DNA又はRNAを含んで成るプローブ、又はその副配列は、SGIP遺伝
子が染色体3p26.1上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定
するために使用され得る。SGIP遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性
、遺伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但し
それらだけには限定されない。

【０１８３】 そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現
象（RELP）分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体（STR）分析、及び当業界
において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明の
ポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Sambrookなど., 前記；Ausubel など.
, 前記；Marian, Chest 108: 255-65, 1995）。従って、本発明の分子は、染色
体3p26.1に位置する特定の疾病についての診断として使用され得る。

【０１８４】 SGIPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、SGIP活性を高め、又は阻
害することが所望される遺伝子治療用途内で有用である。哺乳類が突然変異誘発
されたSGIP遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、SGIP遺伝子が哺乳類
の細胞中に導入され得る。1つの態様においては、SGIPポリペプチドをコードす
る遺伝子がウィルスベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベクタ
ーは、弱毒化された又は欠陥DNAウィルス、例えばヘルペス単純ウィルス(HSV)、
乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス(EBV)、アデノウィルス、アデ
ノ関連ウィルス(AAV)及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定さ
れない。

【０１８５】 ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好まし
い。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベク
ターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在
化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次の
ものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１
(HSV1)ベクター（Kaplitt など., Molc. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991）、
弱毒化されたアデノウィルス ベクター、例えばStratford-Perricaudat など.
(J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) により記載されるベクター、及び欠陥ア
デノ−関連ウィルスベクター（Samulski など., J. Virol. 61: 3096-101, 1987
; Samulski など., J. Virol. 63: 3822-28,1989）。

【０１８６】 もう1つの態様においては、SGIP遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レ
トロウィルスベクターに導入され得る：Anderson など., アメリカ特許第5,399,
346号；Mann など., Cell 33: 153, 1983; Temin など., アメリカ特許第4,650,
764号；Temin など., アメリカ特許第4,980,289号；Markowitz など., J. Virol
. 62: 1120, 1988; Temin など., アメリカ特許第5,124,263 号；Dougherty な
ど., WIPO Publication WO95/07358 号；及びkuo など., Blood 82: 845-52, 19
93。

【０１８７】 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションによ
り導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボ
トランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Felg
ner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey など
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器官
中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な
利点を有する。

【０１８８】 特定細胞へのリポソームの分子標的化は、1つの領域の利点を表す。特定細胞
へのトランスフェクションの方向づけが1つの領域の利点を表すことは明白であ
る。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組
織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である
。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチド
、例えばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体又は非ペプチ
ド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。

【０１８９】 同様に、SGIPポリヌクレオチド（配列番号１又は７）、又はその相補的タンパ
ク質は、特定の組織、例えば骨髄、末梢血液リンパ球、臍帯血液、前立腺、及び
悪性及び白血病細胞系の組織を標的化するために使用され得る。身体から細胞を
除去し、そして裸DNAプラスミドとしてベクターを導入し、そして次に、身体中
に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝子治療のための裸DN
Aベクターは、所望する宿主細胞中に、当業界において知られている方法、例え
ばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、
遺伝子ガンの使用、又はDNAベクタートランスポーターの使用により導入され得
る（例えば、Wu など., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu など., J. Biol
. Chem. 263: 14621-24, 1988）。

【０１９０】 種々の技法、例えばアンチセンス及びリボザイム方法論は、SGIP遺伝子転写及
び翻訳を阻害するために、例えば細胞増殖をインビボで阻害するために使用され
得る。SGIP−コードポリヌクレオチドのセグメント（例えば、配列番号１又は３
に示されるようなポリヌクレオチド）に対して相補的であるポリヌクレオチドは
、SGIP−コードのmRNAに結合し、そしてそのようなmRNAの翻訳を企画される。そ
のようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞培養物又は対象においてSGIPポ
リペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するために使用される。

【０１９１】 本発明のポリペプチド、ペプチド、変異体、核酸及び/又は抗体は、胃腸収縮
性、消化酵素、ホルモン及び酸の分泌、胃腸運動性、消化酵素のレクルートメン
ト；特に、胃腸系に影響を及ぼすような炎症；逆流性疾患及び栄養吸収の変調に
関連する疾患の処理に使用され得る。本発明の分子による処理から有益であろう
特定の状態は、糖尿病性胃不全麻痺、手術後の胃不全麻痺、迷走神経切断、慢性
特発性腸偽−閉塞症及び胃食道逆流性疾患を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。追加の使用は、放射線学研究のための胃の空腹化、胆嚢収縮の刺激
及び鼓室洞摘出を包含する。

【０１９２】 胃腸機能と脳機能との間の関連性は、この種類の他のホルモンについて観察さ
れて来た。例として、自閉症の子供におけるセクレチン注入が、胃腸病状の緩和
、及び行動性の劇的な改良（改良された眼の接触、言語表現の機敏性及び拡張）
をもたらした。Hovrath, K.など., J. Assoc. Acad. Minor Phys 9 (1): 9-15,
1998を参照のこと。同様に、胃腸症状を有する自閉症の子供における上部胃腸管
の研究は、多くのそれらの子供が、逆流性食道炎、慢性胃腸炎、及び慢性十二指
腸炎、並びに非自閉症の子供に比較して、十二指腸陰窩における高められた数の
Paneth細胞を有したことを示した。Horrath，K. など., J. Pediatr. 135 (5):5
59−563、1999を参照のこと。

【０１９３】 それらの自閉症の子供へのセレチンの投与は、高められた膵臓−胆汁生産量及
びより高い流体生産量をもたらした。胃腸疾患、特に逆流性食道炎及びニ糖類不
良吸収が、非−言語性自閉症患者の行動問題に寄与することができる。セクレチ
ン注入の後、膵臓−胆汁分泌の観察される上昇性が、セレクリン受容体のアップ
レギュレーションを示唆する。タンパク質の腸−ホルモンファミリーのメンバー
として、受容体に結合することによりSGIPペプチドは、神経の発育及び/又は利
用性に対する効果を有することができる。

【０１９４】 本発明の分子の運動及び神経学的効果はまた、神経学的フィードバックが栄養
吸収を調節する、肥満及び他の代謝疾患の処理のために有用である。本発明の分
子は、飽満、グルコース吸収及び代謝、及び神経障害−関連の胃腸疾患の調節の
ために有用である。 本発明のポリペプチドは、SGIP、例えば変異体により胃腸系を攻撃し、そして
胃の運動性及び収縮性、栄養摂取の変調、消化酵素及びホルモンの分泌の変調、
又は膵臓における酵素及び/又はホルモンの分泌変調を測定することによって、
視床下部−下垂体−副腎軸の機能を評価するために有用である。

【０１９５】 成長ホルモンの可能性ある用途は、広範囲であり、そして骨形成に関する疾病
及び状態（例えば、オステオポローシスの処理、骨形成及び修復の促進、骨芽細
胞の刺激、骨再造形及び軟骨成長、及び骨格形状異常）；免疫性（例えば、免疫
系の刺激、免疫抑制された患者の処理）；肥満及び代謝疾患（例えば、糖質コル
チコイドの異化副作用の防止、肥満及び肥満に関連する成長遅延の処理、手術後
のタンパク質異化反応の低下、慢性疾病、例えば癌又はAIDSによる悪液質及びタ
ンパク質損失の低下）；

【０１９６】 小人症（例えば、成長遅延及び生理学的低身長、例えば成長ホルモン欠乏及び
慢性疾患の処理、及び子宮内成長遅延の処理）；創傷治療（例えば、創傷修復の
促進、熱傷患者の回復の促進、及び遅延された創傷治療の患者の処理）；生殖（
例えば、排卵誘発のためのアジュバント処理）；及びストレスに関連する状態；
腎臓及び肺機能不全に関連する状態；老化及び年配の人に関連する状態、例えば
筋力、骨のもろさ及び皮膚肥厚化；及び神経内分泌活性、例えば睡眠の処理を包
含する。従って、成長ホルモン分泌促進薬として、SGIPペプチドは、それらの疾
病に関連する状態を処理するために有用である。成長ホルモンの放出を測定する
アッセイは、当業界において知られている。

【０１９７】 さらに、SGIPの分子は、SGIPに結合する受容体を発現する、腫瘍細胞の成長及
び/又は分化を検出し、又は調節するために使用され得る。SGIPポリペプチドは
、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マ
ーカー、磁気粒子及び同様のものによりラベルされ得；間接的な標識又はラベル
は、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体/抗−補体対の使用を特徴
づけ得る。それらのラベルされたポリペプチドは、インビトロ又はインビボで適
用され得、そして特に、胃、脳、膵臓、腎臓、十二指腸、空腸、及び肺のような
組織における腫瘍上に位置するSGIP又はzsig33受容体を同定するために有用であ
る。

【０１９８】 本発明の分子はまた、グルコースを含む抗−低血糖製剤への添加剤として、及
び早い栄養作用を必要とする経口薬剤のための吸収エンハンサーとして有用であ
る。さらに、本発明の分子は、グルコース誘発されたインスリンを刺激するため
に使用され得る。

【０１９９】 医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、
特に静脈内又は皮下供給及び鼻腔内吸入のために配合される。静脈内投与は、１
〜数時間の典型的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般
的に、医薬製剤は、SGIPタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は変異体を、医
薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロー
ス、又は同様のものと共にを含むであろう。

【０２００】 製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面
上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。配合方
法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Remington: The Scien
ce and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton,
PA, 19^th ed., 1995に開示される。治療用量は、一般的に、0.1〜100μg/kg患者
の体重/日、好ましくは0.5〜20mg/kg/日の範囲であり、そして正確な用量は処理
される病状の性質及び重症度、患者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従
って、臨床医により決定される。

【０２０１】 用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、
１週間又はそれ以下にわたって、しばしば１〜３日間にわたって投与され得、又
は慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。例えば、SGIPの
治療有効量は、栄養吸収における変化を測定するために使用される胃運動性及び
パラメーターの臨床学的に有意な変化を生成するのに十分な量である。そのよう
な測定を行うための特定の試験は、当業者に知られている。

【０２０２】 実施例 例１：胃腸収縮性： 生後、約12週目の２匹の雄Sprague−Dawleyラット（Harlam, Indianapolis, I
N）を、ウレタンにより麻酔し、そしてそれらの胃を小さな腹部切開により露出
する。２個の2.4mmの形質導入結晶（Sonometrics, Ontario, Canada）を、環状
収縮がそれらの２個の結晶間の距離の変化としてモニターされるよう、胃の腔部
分上に配置する。前記結晶は、VETBOND TISSUE ADHESIVE (3M, St. Paul, MN)
により結合される。

【０２０３】 １μMのアセチルコリン10μl、１μMでのノルエピネフリン（NE）10μl、又は
リン酸緩衝溶液（PBS−負の対照）10μlを、結晶間に局部適用し、そして２つの
結晶間の距離を測定する。 表Aに記載されるようなSGIPペプチドを別々にPBSに溶解し、そして10μlを、
１μg, 10μg又は100μgの最終濃度のために局部適用する。SGIPの効果を、上記
のようにして測定する。

【０２０４】 例２：グルコース吸収： 生後、約６週目の８匹の雄のob/obマウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）
を、毎日４時間の食物摂取スケジュールに２週間、適合せしめる。その食物摂取
に基づいての２週間後、マウスは、それらの食事時間の後すぐに（食事後）、経
口に栄養により、無菌の0.1％BSA100μl中、表Aに記載されるSGIPペプチドの別
々の調製物100μgを与えられる。30分後、マウス25％グルコース0.5mlにより経
口攻撃する。眼窩後放血を行い、血清グルコースレベルを決定する。血液を、ペ
プチド投与の前、経口グルコース攻撃の前、及びグルコース攻撃に続いて、１，
２，４及び20時間で採血する。 食事後のグルコース吸収性を、ペプチドが経口グルコース攻撃の30分前、100
μgで経口投与される場合、測定する。

【０２０５】 例３：ペプチド合成： 表Aに記載されるようなSGIPペプチドを、モデル431Aペプチド合成機（Applied
Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA）を用いて、固相ペプチド合成に
より合成する。Fmoc−グルタミン樹脂（0.63mモル/g; Advanced Chemtech, Loui
sville, KY）を初期支持体樹脂として使用する。１mモルのアミノ酸カートリッ
ジ（Anaspec, Inc. San Jose, CA）を、合成のために使用する。２−（１−ベン
ゾトリアゾール−ｙ−イル、１，１，３，３−テトラメチルヒロルオニウムヘキ
サフルオロリン酸（HBTU）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、2mの
N, N−ジイソプロピルアミン、N−メチルピロリドン、ジクロロメタン（すべて
は、Applied Biosystems/Perkin Elmer）及びピペラジン（Aldrich Chemical Co
., St. Louis, MO）の混合物を、合成試薬のために使用する。

【０２０６】 Peptide Copanionソフトウェア（Peptides International, Louisville, KY）
を用いて、それらのペプチドについての合成のための凝集可能性及び因難性レ
ベルを予測する。合成を、単一のカップリングプログラムを用いて、製造業者の
規定に従って行う。 ペプチドを、標準のTFA分解方法に従って固相から分解する（Peptide Cleavag
eマニュアル、Applied Biosystems/Perkin Elmer に従って）。ペプチドの精製
を、C18、10μm半−分離用カラム（Vydac, Hesperial, CA）を用いて、RP−HPLC
により行う。カラムからの溶出された画分を集め、そして電気スプレー質量分光
計により正しい質量及び純度について分析する。

【０２０７】 例４：胃の空腹化： 断食された雄のSprague−Dawleyラット（Harlan，Indianapolis, IN）の胃を
通してのフェノールレッドの輸送に基づいての局部適用されたSGIPペプチドの効
果を評価する。ラット（６匹、生後８週目）は、ウレタン（0.5ml/100gの25％溶
液）により麻酔する24時間前、断食される。麻酔の後、動物は、1mlのフェノー
ルレッド溶液（２％メチルセルロース溶液中、50mg/ml）と共に経口胃管栄養供
給される。

【０２０８】 個々の動物の胃を、小さな腹部切断を通して露出し、そして表Aに記載される
ようなSGIPペプチド１μg又はスクランブルされた配列ペプチドのアミノ酸対照
のいずれかを、胃管栄養供給の５分後に胃に局部適用する。胃に残存するフェノ
ールレッドの量を、胃管栄養供給の30分後、抽出された胃内容物の光学密度を測
定することによって決定する。

【０２０９】 例５：体重及びグルコースクリアランス： 生後、８週目の16匹の雌のob/obマウス（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）を
、特別な４時間の毎日の食物供給スケジュールに２週間、適合せしめる。それら
は、７：30〜11：30am, 毎日任意に食物供給される。食物供給スケジュールに基
づいて２週間後、マウス８匹の２つのグループに分ける。１つのグループは、表
Aに記載されるようなSGIPペプチドの調製物を1.0μg/マウスで与えられる。他の
グループは、食物を受ける直前、及び４時間の食物供給期間の最後で、経口胃管
栄養供給により、0.1％のBSQA100μl中、ビークル（すなわち、スクランブルさ
れた配列ペプチド）を与えられる。

【０２１０】 マウスは、毎日２度、14日間、注入され、この間、食物摂取及び体重が毎日測
定される。14日目、SGIPペプチドの第2の経口胃管栄養供給の直後、マウスは、2
5％グルコース0.5mlにより経口攻撃される。眼窩後放血を、SGIPペプチド又はビ
ークルの投与の直前（t=30分）、及びまた、グルコース攻撃の後、０，１，２及
び４時間で、血清グルコースレベルを決定するために行う。

【０２１１】 例６：インビボリガンド結合アッセイ： 生後、10週目のBalb 雄マウスを、筋肉内注射により麻酔をし、そしてSGIPの
結合についてインビボで試験する。 SGIPペプチド（表Aに記載されるような）を試験する。単一のグリシンを、負
の対照として使用する。さらに、SGIPペプチドの残基が転位されている負の対照
をまた試験する。ペプチド及び対照を、次の態様で、フルオレセインイソチオシ
アネート（FITC, Molecular Probes, Eugene, OR）にカップリングする。

【０２１２】 ペプチド、グリシン対照及びFITCを、pH9.0で0.1Mの炭素水素ナトリウムに溶
解し、ペプチド及びグリシン対照について2.0mg/ml及びFITCについて5mg/ml の
濃度にし、強い光へのFITCの暴露を回避する。FITC/炭素水素ナトリウム溶液を
、1mgのFITC：1mgのペプチド又はグリシン対照の割合でペプチドに添加し、そし
て周囲室温で１時間、暗室において反応せしめる。FITC−接合されたペプチド及
びグリシン対照を、１Kの透析膜及び0.1Mの炭素水素ナトリウム緩衝液に対して
４℃で透析する。

【０２１３】 緩衝液を毎日交換し、そして透析された後の緩衝液における結合されなかった
FITCをHPLCにより測定する。６日後、緩衝液を、リン酸緩衝溶液（PBS）に交換
し、そして２日間、透析し、続いて、PBSに交換し、そしてさらに２日間、透析
する。ペプチド−又はグリシン−結合されたFITCを、498nmでの透析されたFITC
−結合された材料の吸光度を測定し、そしてフルオレセインの消衰係数（0.083
μM）により割り算することによって決定する。次にフルオレセイン：ペプチド
のモル比（モルFITC/モルペプチド）を決定する。

【０２１４】 ラベルされたペプチドを、個々のマウスが注射に続いて15分間、マウスにおい
ての循環を可能にされるラベルされたペプチド0.5ml（0.5mg）を受けるように、
尾の静脈注射を通して投与する。 麻酔下で、個々のマウスの右心房を切り取り、そしてPBS20mlを左心室中に注
入し、そして循環系をフラッシュするために使用する。次に、マウスを、中性緩
衝液（10％Neutral Buffered Formalin (NBF), Surgipath, Richmond, IL）中、
約10mlのホルマリンにより灌流する。

【０２１５】 興味ある組織を切開により収穫し、そして組織学的評価のための処理の前、10
％NBFにおいて一晩、固定する。組織を、組織のParaffin（商標）浸潤をもたら
すV.I.P.200（Miles, Inc., Elkhart, IN）において処理する。組織−Paraffin
（商標）ブロックを、Jung Biocut (Leica, Nussloch, Germany) により５μmの
断片にスライスし、ガラススライド上に配置し、そして60℃で１時間インキュベ
ートし、スライドへの組織の付着を助ける。Paraffin（商標）を、100％キシレ
ンにより５分間、３度スライドを洗浄することによって除去する。次にスライド
を、100％エタノールにより３分間２度、続いて95％エタノールにより１度、洗
浄することにより再水和化する。

【０２１６】 スライドを乾燥し、そして次に、５〜10μlの抗−退色媒体［55〜70℃で溶解
された２％DABCO（１，４−ジアゾビシクロ−（２，２，２）−オクタン、Sigma
, St. Louis, Missouri）を含むグリセロール９部；１部の0.2Mのトリス/HCl, p
H7.5 DAPI（Sigma, St. Louis, Missouri）又はヨウ化プロピジシウム（0.3μg
/ml）］により固定する。また、抗−退色媒体については、Kievits，T.など., C
ytogenet Cell Cenet 53: 134-136 (1990) も参照のこと。スライドカバースリ
ップにより被覆し、そしてすぐに、495nmで蛍光顕微鏡により試験する。 変異体を、グリシンに比較して、十二指腸、空腸、及び腎臓の渦巻き管及び収
集管における高められた蛍光について測定する。

【０２１７】 例７：アシルされたペプチド合成： 表Aに示されるペプチドの１又は複数のセリン残基を、ｎ−オクタン酸側鎖を
含むよう修飾する。ペプチドを、保護されたすべてのアミノ酸（但し、配列番号
２の位置３におけるセリンのヒドロキシ基を除く）によりFmoc化学により合成す
る。樹脂にまだ結合されている間、セリンのこのヒドロキシル基を、４−（ジメ
チルアミノ）ピリジン（Fluka, Buchs, Switzerland）の存在下で、１−エチル
−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Pierce Chemical, Rockf
ord, IL）の作用により、ｎ−オクタン酸（TCI America, Portland, OR）により
アシル化する。アシル化の後、ペプチドを樹脂から切断し、そして保護基を除去
する。次に、ペプチドを、逆相HPLCにより精製する。 前述から、本発明の特定の態様が例示のために記載されて来たが、種々の修飾
が本発明の範囲内で行われ得ることは、理解されるであろう。従って、本発明は
、特許請求の範囲を除いて、限定されない。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月９日（２００１．８．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/18 1/14 3/04 1/18 3/10 3/04 5/00 3/10 5/06 5/00 5/48 5/06 11/00 5/48 13/12 11/00 15/00 13/12 17/00 15/00 17/02 17/00 19/00 17/02 25/00 19/00 25/20 25/00 31/18 25/20 35/00 31/18 37/02 35/00 43/00 １０５ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/63 43/00 １０５ 1/04 Ｃ０７Ｋ 14/63 1/06 // Ｃ０７Ｋ 1/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/06 Ａ６１Ｋ 37/43 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジャスパース，スティーブン アール． アメリカ合衆国，ワシントン 98026，エ ドモンズ，ワンハンドレッドフィフティー ス プレース サウスウエスト 5829 (72)発明者 デイシャー，テレサ エー． アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノースイースト シックスティフ ァースト ストリート 6317 (72)発明者 ビショップ，ポール ディー． アメリカ合衆国，ワシントン 98024，フ ォール シティ，サウスイースト エイス ストリート 28425 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 CA04 CA06 GA11 HA12 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA18 BA23 CA18 DB01 DB11 DB22 DB36 DB37 DB38 DB41 DB42 DB43 DB44 NA14 ZA011 ZA051 ZA591 ZA661 ZA681 ZA701 ZA751 ZA811 ZA891 ZA961 ZB071 ZB211 ZB261 ZC021 ZC041 ZC351 ZC521 ZC551 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA05 ZA59 ZA66 ZA68 ZA70 ZA75 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB21 ZB26 ZC02 ZC04 ZC35 ZC52 ZC55 4H045 AA10 AA30 BA10 BA17 CA40 CA45 DA45 EA22 EA25 EA27 EA30 EA50 FA34 FA58 FA74 GA21

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号６に示される残基X〜９（ここで、Xは１〜４の整数
   であり、そして前記残基の少なくともYが配列番号２に示される対応する領域に
   おける通りであり、ここでYは９−Xである）から成る単離されたポリペプチド分
   子。
2. 【請求項２】 配列番号６に示される残基X〜10（ここで、Xは２〜４の整数
   であり、そして少なくとも（10−X）−２の残基が配列番号２に示される対応す
   る領域における通りである）から成る単離されたポリペプチド分子。
3. 【請求項３】 少なくとも（10−X）−１の残基が、配列番号２に示される
   対応する領域における通りである請求項２記載の単離されたポリペプチド分子。
4. 【請求項４】 少なくとも10−Xの残基が、配列番号２に示される対応する
   領域における通りである請求項３記載の単離されたポリペプチド分子。
5. 【請求項５】 配列番号６に示される残基X〜11（ここで、Xは３又は４であ
   り、そして少なくとも（11−X）−２の残基が配列番号２に示される対応する領
   域における通りである）から成る単離されたポリペプチド分子。
6. 【請求項６】 少なくとも（11−X）−１の残基が、配列番号２に示される
   対応する領域における通りである請求項５記載の単離されたポリペプチド分子。
7. 【請求項７】 少なくとも11−Xの残基が、配列番号２に示される対応する
   領域における通りである請求項６記載の単離されたポリペプチド分子。
8. 【請求項８】 請求項１，２，３，４，５，６又は７記載の単離されたポリ
   ペプチドを十二指腸又は空腸組織に投与することを含んで成る、前記組織の収縮
   性の調節方法。
9. 【請求項９】 請求項１，２，３，４，５，６又は７記載の単離されたポリ
   ペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、ホルモンン及び消化酵素の膵臓
   分泌の調節方法。
10. 【請求項１０】 請求項１，２，３，４，５，６又は７記載の単離されたポ
    リペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、成長ホルモン分泌の誘発方法
    。
11. 【請求項１１】 請求項１，２，３，４，５，６又は７記載の単離されたポ
    リペプチドを哺乳類に投与することを含んで成る、胃の空腹化の調節方法。
12. 【請求項１２】 ａ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列； ｂ）配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド配列に対して相補的である
    ポリヌクレオチド分子；及び ｃ）配列番号７に示されるポリヌクレオチド配列から成る群から選択されたポ
    リヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子。
13. 【請求項１３】 請求項12記載の単離されたポリヌクレオチド分子、転写プ
    ロモーター及び転写ターミネーターを含んで成るポリヌクレオチドベクターであ
    って、前記プロモーターが前記核酸分子により作用可能に連結されており、そし
    て前記核酸分子が前記転写ターミネーターにより作用可能に連結されていること
    を特徴とするポリヌクレオチドベクター。