EA020311B1 - Вектор на основе искусственной хромосомы - Google Patents
Вектор на основе искусственной хромосомы Download PDFInfo
- Publication number
- EA020311B1 EA020311B1 EA201170505A EA201170505A EA020311B1 EA 020311 B1 EA020311 B1 EA 020311B1 EA 201170505 A EA201170505 A EA 201170505A EA 201170505 A EA201170505 A EA 201170505A EA 020311 B1 EA020311 B1 EA 020311B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- vector
- artificial chromosome
- chromosome
- expression
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 39
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 23
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 3
- -1 blood factors Proteins 0.000 claims description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 claims description 2
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 36
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 15
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010022894 Euchromatin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 101710197208 Regulatory protein cro Proteins 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 210000000632 euchromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100041624 Arabidopsis thaliana SAC8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 240000006890 Erythroxylum coca Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000010428 chromatin condensation Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000008957 cocaer Nutrition 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
- C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения белка в эукариотических клеточных линиях, включающий следующие этапы: a) обеспечение остова искусственной хромосомы, b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и упомянутого остова, c) введение указанного экспрессионного вектора в линию эукариотических клеток-хозяев для получения эукариотической экспрессирующей клеточной линии, d) культивирование указанной экспрессирующей клеточной линии для продуцирования указанного белка и e) выделение указанного белка. Кроме того, настоящее изобретение относится к соответствующим векторам и трансгенным клеточным линиям.
Description
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белков в культурах клеток млекопитающих.
Важным разделом биотехнологии является получение рекомбинантных белков в системах на основе клеток млекопитающих. Критическим моментом при получении рекомбинантных белков является создание клеточных линий, экспрессирующих представляющий интерес белок на высоком уровне, и изоляция из этих линий отдельных клеточных клонов со стабильной экспрессией на протяжении многих пассажей и времени (Уитт, Р.М. Ыа1иге Вю1ес1то1оду 22, 1393-1398 (2004)). Существует необходимость в способах создания клеточных линий, позволяющих стабильно, безопасно, надежно и воспроизводимо получать высокий выход секретируемого белка в клеточной культуре в промышленных масштабах. Такая необходимость быстро возрастает вместе с растущим числом биопрепаратов, разрабатываемых и производимых для лечения фармацевтической индустрией.
Обычно этого достигают посредством случайного встраивания вектора экспрессии, содержащего промотор, представляющий интерес ген и селективный маркер, в хромосомную ДНК стабильной клеточной линии-продуцента.
Часто используемые клеточные линии-продуценты получают из клеток млекопитающих или насекомых. Клеточная линия представляет собой стабильную культуру клеток, которая при обеспечении подходящей свежей среды и объема растет неопределенно долго. В клеточных линиях, в отличие от штаммов клеток, не действует предел Хайфлика (Наукйск Ь. (1965), Тйе Нтйей ίη νίίτο Шейте οί йитаи άίρίοίά се11 81га1иь. Ехр. Се11 Век. 37 (3): 614-636), они являются иммортализованными. Примерами стабильных клеточных линий-продуцентов являются СНО, N80, СО8 или 8ί9 клетки или линии клеток человека, такие как РегС-6 и НЕК 293.
Обычно для генетической инженерии как клеток, так и клеточных линий млекопитающих в качестве вектора используют плазмиды. Плазмида представляет собой нехромосомную молекулу ДНК, которая существует отдельно от хромосомной ДНК и способна реплицироваться в бактерии независимо от хромосомной ДНК. В большинстве случаев плазмиды являются кольцевыми и двунитевыми. В пролиферирующих клетках млекопитающих плазмида может поддерживаться неопределенно долго после случайного встраивания в геном клетки-хозяина и посредством своего промотора может приводить к продукции представляющего интерес гена/продукта, обычно белка.
Хотя данный способ генетической инженерии является простым и прямолинейным, он не обладает достаточной воспроизводимостью. Экспрессия белков с таких векторов в значительной степени зависит от хроматина, окружающего сайт интеграции, который может выключать экспрессию с течением времени (Уитт, Е.М., №1Шге Вю1есйио1оду 22, 1393-1398 (2004)). Поэтому отбор подходящих клонов становится трудоемкой и требующей много времени процедурой.
Чтобы избежать позиционных эффектов прилегающего хроматина, было предложено несколько стратегий. Например, использовали антирепрессорные элементы, фланкирующие вектор, либо вектора встраивали в конкретный локус хромосомы с открытой структурой хроматина (Ктакк, Т.Н. и др., №1Шге Вю1есйио1оду 21, 553-558 (2003), Ниаид, Υ. и др., 1оитиа1 ок 1тшипо1о§1са1 МеШойк 322, 28-39 (2007)).
Для получения трансгенных хозяев, таких как животные или растения, в данной технологии использовали искусственные хромосомы.
Публикация УО2002/097059А2 описывает искусственные хромосомы, которые были сконструированы с включением сайтов, доступных для сайт-специфичного встраивания ДНК посредством рекомбинации, что в особенности полезно при создании трансгенных животных.
Публикация И82008/0060093Л1 раскрывает способы создания растений, трансформированных автономными мини-хромосомами.
МотаШ с соавторами (ЕМВО теройк 2006 Уо1. 7(9) 911-918) описывают применение вектора на основе искусственной хромосомы человека в качестве системы переноса генов для экспрессии и изучения комплементации.
Разработка подходящего вектора для экспрессии белка составляет важную часть при получении рекомбинантного белка в эукариотических клеточных линиях. В целом, искомый вектор для получения рекомбинантного белка в клеточной культуре должен иметь следующие свойства:
1) экспрессия не должна зависеть от места встраивания в геном,
2) экспрессия должна коррелировать с количеством встроенных копий трансгена,
3) экспрессия должна сохраняться со временем и
4) уровень экспрессии должен быть высоким.
Целью настоящего изобретения является создание способа и вектора, позволяющих получать стабильные клеточные клоны для улучшения продукции рекомбинантного белка в эукариотических клеточных линиях-продуцентах.
Объекты настоящего изобретения позволяют решить указанную задачу.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения белка в линии эукариотических клеток, включающий следующие этапы:
a) обеспечение остова искусственной хромосомы,
b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой кислоты кодирующей
- 1 020311 указанный белок у указанного остова,
с) введение указанного вектора экспрессии в линию эукариотических клеток-хозяев для получения экспрессирующей эукариотической клеточной линии,
б) культивирование указанной экспрессирующей клеточной линии для продуцирования указанного белка и
е) выделение указанного белка.
Таким образом, используемая согласно настоящему изобретению экспрессирующая клеточная линия имеет интернированный экспрессионный вектор на основе искусственной хромосомы.
Клеточная линия согласно настоящему изобретению понимается как постоянная клеточная культура, которая при обеспечении подходящих культуральной среды и объема будет неопределенно долго делиться и, таким образом, является иммортализованной. Клеточную линия, используемую согласно настоящему изобретению, в дальнейшем будут также называть линией клеток-хозяев или клеткойхозяином .
Способ согласно настоящему изобретению, в частности, основан на конструкциях искусственных хромосом, содержащих чужеродные последовательности нуклеиновых кислот, и способах использования этих конструкций для получения белков ех νίνο, например секреторных белков.
Согласно настоящему изобретению искусственные хромосомы можно использовать для широкомасштабного получения рекомбинантного белка в клеточных линиях-продуцентах. Предпочтительно указанные искусственные хромосомы получают из бактерий наподобие бактериальной искусственной хромосомы, также называемой ВАС и содержащей, например, элементы Р-плазмиды, или наподобие искусственной хромосомы с элементами из плазмиды Р1, называемой РАС. Как в случае космид, указанная искусственная хромосома может содержать элементы из бактериофага. Кроме того, искусственные хромосомы, преимущественно используемые в настоящем изобретении, получают из дрожжей, например искусственную хромосому дрожжей, называемую еще УАС, и из млекопитающих, например искусственную хромосому млекопитающего, также называемую МАС, подобную получаемой из человека искусственной хромосоме человека, называемой НАС.
Указанные искусственные хромосомы объединяет присутствие последовательностей ориджинов репликации - последовательностей, необходимых для репликации и сохранения хромосомы в течение клеточного деления соответствующей клетки, используемой для амплификации ДНК. Космиды, бактериальные искусственные хромосомы и искусственные хромосомы с элементами плазмиды Р1 содержат репликаторы бактерий, дрожжевые искусственные хромосомы - репликаторы дрожжей, искусственные хромосомы млекопитающих - репликаторы из клеток млекопитающих, а искусственные хромосомы человека - репликаторы из человеческих клеток. В дополнение, искусственные хромосомы согласно настоящему изобретению могут иметь маркеры для селекции, обычно это устойчивость к антибиотикам, что позволяет отбирать клетки, несущие указанную искусственную хромосому.
Такие искусственные хромосомы представляют собой векторы, включившие в себя хромосомные элементы, которые отвечают за репликацию и сохранение в соответствующем организме и способны стабильно нести в себе крупные фрагменты геномной ДНК. Размер таких больших геномных фрагментов ДНК обычно варьирует в пределах 30-50 кЬ для космид, 50-350 кЬ для искусственных хромосом с элементами плазмиды Р1 и бактериальных искусственных хромосом, 100-3000 кЬ для дрожжевых искусственных хромосом и >10000 кЬ для искусственных хромосом млекопитающих и искусственных хромосом человека.
Согласно предпочтительному способу реализации настоящего изобретения используемую искусственную хромосому выбирают из группы искусственных хромосом микроорганизмов, включающей бактериальные искусственные хромосомы, дрожжевые искусственные хромосомы, искусственные хромосомы с элементами плазмиды Р1 и космиды. Искусственные хромосомы микроорганизмов обычно достигают размера 5000 кЬр. Предпочитаемый размер искусственной хромосомы согласно настоящему изобретению - 100-350 кЬр, но может быть и больше 350 кЬр.
Предпочитаемый к использованию в настоящем изобретении остов искусственной хромосомы происходит от бактерии, бактериофага или дрожжей. Указанные искусственные хромосомы микроорганизмов можно рассматривать вместе ввиду их схожих свойств, но они различны по допустимому размеру встраиваемых локусов ДНК. Помимо искусственных хромосом на основе бактериальных искусственных хромосом, космид, искусственных хромосом с элементами плазмиды Р1, дрожжевых искусственных хромосом, также можно использовать хромосомы, полученные из млекопитающих (искусственные хромосомы млекопитающих) или человека (искусственные хромосомы человека). Согласно настоящему изобретению в качестве остова бактериальной искусственной хромосомы предпочтительно используют конструкцию Ко8а26ВАС. Также можно использовать и другие локусы с открытым хроматином, такие как Ь-асДи, Сарбй, Нрй и рибосомальные белки.
Добавочными элементами искусственной хромосомы согласно настоящему изобретению представляют собой большие фрагменты ДНК, содержащие генетические локусы. Эти генетические локусы поддерживаются и функционируют после введения искусственных хромосом в соответствующую эукариотическую линию клеток-продуцентов. Для экспрессии нужного генетического продукта такие генетиче- 2 020311 ские локусы содержат элементы, регулирующие структуру хроматина и доступность для факторов транскрипции, а также элементы, определяющие уровень транскрипции, такие как последовательности энхансеров и промоторов.
Некоторые из уже упомянутых элементов искусственной хромосомы нужны лишь для правильной амплификации ДНК. Например, в бактериях и дрожжах это репликатор и маркерный ген для селекции, такой как устойчивость к антибиотикам. Таким образом, часть искусственной хромосомы, несущая такие элементы, называется остовом.
Искусственные хромосомы представляют собой большие векторы на основе ДНК, которые широко используются для создания ДНК-библиотек при комплексном картировании и анализе геномов. Бактериальные искусственные хромосомы использовали для определения последовательностей геномов организмов в крупномасштабных проектах по секвенированию, как, например, Проект Геном Человека. Небольшой фрагмент ДНК нужного организма амплифицируют как вставку в бактериальной искусственной хромосоме, а затем секвенируют. Затем секвенированные фрагменты выстраивают в нужную последовательность генома всего организма с помощью компьютера.
Также бактериальные искусственные хромосомы использовали как большие векторы для создания трансгенных мышей (Όίπιΐόο. Р. и МопЮ1ш, Ь., Ттапкдешс текеатсй 10, 83-103 (2001)). В данном примере эмбриональные клетки мышей экспрессировали представляющий интерес ген, регулируемый соответствующим локусом в бактериальной искусственной хромосоме.
Выяснилось, что искусственные хромосомы можно использовать для создания эукариотических экспрессирующих клеточных линий с улучшенными свойствами. Неожиданным образом было обнаружено, что полученный с использованием бактериальной искусственной хромосомы вектор согласно настоящему изобретению можно применять для трансфекции эукариотических клеточных линий и для высокоэффективной экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения основанный на бактериальной искусственной хромосоме вектор согласно настоящему изобретению использовали для получения фрагмента константной области человеческого 1дО1. Прямое сравнение масштабных культур клеток НЕК 293, полученных с использованием обычного вектора и вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы, показало, что вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы неожиданным образом улучшил выход белка в 10 раз. Дальнейший анализ стабильных клеточных клонов, несущих вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы, показал прямую зависимость продукции белка от количества интегрированных копий бактериальной искусственной хромосомы, а также стабильность продукции белка даже после 30 пассажей.
Таким образом, согласно настоящему изобретению возможно, в целом, улучшить экспрессию секреторных белков и полипептидов, и в частности, в целях промышленного производства рекомбинантного белка, что обычно подразумевает крупномасштабное производство, например ферментационный объем по меньшей мере 1 л, более предпочтительно 5 л, а еще более предпочтительно ферментацию проводят по меньшей мере в 100 л ферментационной среды. Ферментацию проводят партиями или с использованием техники непрерывного ферментирования.
Секреторные белки представляют собой белки или полипептиды, продуцируемые и выделяемые из эукариотической клетки-хозяина во внеклеточное окружение. Обычно эти процессы обеспечиваются сигнальными пептидами, которые представляют собой короткие пептидные последовательности, длиной в 2-100 аминокислот, управляющие посттрансляционным транспортом белка. В основном, сигнальные пептиды используют при получении белков, секретируемых клетками-продуцентами. Обычно при формировании зрелого секреторного белка сигнальные пептиды отщепляются. Примером сигнального пептида, найденного для легкой к (каппа) цепи человека и приводящего к секреции белка, является МЕЕСЕ8\У1ЕТЕЛ1Ы<СУОС (Бе1депкаиег, М., Кок1, 1. и Иикег, Б.; Иис1ео11бе кецненсек οί 111е сИИАк епсоФпд 1йе У-гещопк οί Н- апб Ь-скатк οί а китап топос1опа1 апБЬобу кресШс Ю Н1У-1-др41; Иис1е1с Λαόκ Иек. 18 (16), 4927 (1990)). Сигнальные пептиды также могут называться нацеливающими сигналами, сигнальными последовательностями, транзитными пептидами или сигналами локализации.
Аминокислотная последовательность сигнальных пептидов направляет синтезируемые в цитоплазме белки в ряд органелл: ядро, матрикс митохондрий, эндоплазмотический ретикулум, хлоропласт, апопласт и пероксисому. Сигнальные пептиды, используемые в экспрессионных векторах, обычно после доставки белка отщепляются от белка сигнальной пептидазой.
Таким образом, вектор согласно настоящему изобретению основан на искусственной хромосоме, включающей ген, который может кодировать секреторный белок, предпочтительно с использованием сигнальной последовательности, например, в связке с секретируемым белком. Сигнальный пептид предпочтительно отщепляется от секретируемого белка после экспрессии и транспорта в надосадочную жидкость клеточной культуры.
Способ согласно настоящему изобретению, в основном, используют для обеспечения рекомбинантных белков, выбранных из группы, включающей сывороточные белки, включающие в себя иммуноглобулины, фрагменты и производные иммуноглобулинов, альбумин, факторы крови, полипептидные гормоны, цитокины, хемокины, ферменты, и ростовые факторы, и их производные.
- 3 020311
К производным относится любой фрагмент, конъюгат, результат слияния, нуклеиновая кислота или гомолог полипептида, который происходит от или является подобием секретируемого белка.
Для получения белка в рамках настоящего изобретения культивируют линию экспрессирующих клеток, продуцирующую указанный белок, после чего белок выделяют. Таким образом, можно использовать способы выделения или сепарации, известные в данной области техники, такие как способы хроматографического разделения, необходимые для количественного выделения продукта.
В качестве эукариотической клетки-хозяина используют любую клетку-хозяин, способную при необходимости осуществлять эукариотическое гликозилирование белка. Предпочтительно применяют одиночные клетки млекопитающих или насекомых или клеточные линии клеток человека, приматов, мыши, хомяка. Распространенным примером являются эмбриональные клетки почки человека, такие как НЕК 293, СНО, СО8, N80 клетки, лимфобласты мыши, РегСб или 819 клетки.
Для рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутые рекомбинантные белки, с геном остова искусственной хромосомы предпочтительно используют такие технологии рекомбинации, как гомологичная рекомбинация или кассетный обмен, как, например, управляемый интегразой <рС31 кассетный обмен.
Вектор согласно настоящему изобретению стабильно интегрирован в хромосому клетки-хозяина, предпочтительно в хромосому млекопитающего или насекомого, еще предпочтительнее в хромосому, полученную от человека, мыши или хомяка с целью обеспечения трансгенного хозяина.
Трансгенная клеточная линия согласно настоящему изобретению предусматривает одиночные клетки, стабильные клоны одиночных клеток, клеточные линии и т.п. Тем не менее, настоящее изобретение явно исключает трансгенных людей. Трансгенная клетка-хозяин предпочтительно содержит вектор в генетической карте своей хромосомы, обычно конъюгированный или непосредственно встроенный в локус интенсивно экспрессируемого гена или белка, также называемого мажорным белком.
Здесь и далее под мажорным белком понимается белок с высокой степенью экспрессии на уровне мРНК и полипептида в клетке-хозяине, например рибосомальные белки, белки цитоскелета, белки, необходимые для синтеза ДНК, такие как ДНК-полимераза. Такой мажорный белок обычно является хорошо экспрессируемым собственным белком клетки-хозяина. Использование локуса мажорного белка обычно способствует стабильной экспрессии секреторного белка, закодированного в искусственной хромосоме, на высоком уровне. Также предпочтительно происхождение указанного локуса из млекопитающего или насекомого.
Выбранный локус предпочтительно содержит регуляторные элементы для образования открытого хроматина или экспрессии белка в целом. В частности, желательно присутствие энхансеров, препятствующих конденсации хроматина, в качестве как элементов, содержащихся в локусе в роли собственных энхансеров, так и экзогенных, гетерологичных или синтетических регуляторных элементов, обеспечивающих необходимую для экспрессии структуру хроматина. Таким образом, данный локус доступен для факторов транскрипции.
Участок открытого хроматина, или активного хроматина, или эухроматина может быть объектом структурных изменений, которые приводят к образованию менее конденсированных и активно транскрибируемых структур. Считается, что механизм образования эухроматина лежит в основе регуляции генов на уровне хроматина, поддерживая гены в активном состоянии, что является предпочтительным для получения вектора на основе искусственной хромосомы, предназначенного для экспрессии белка.
В области генетики и эволюционных вычислений локус понимают как фиксированное положение на хромосоме, в котором может содержаться один и более генов. Локус белка понимают как положение гена, участвующего в экспрессии по меньшей мере части указанного белка. Вариант последовательности ДНК в конкретном локусе называют трансгенной хромосомой. Упорядоченный список локусов, известных для отдельного генома, называют генетической картой.
Согласно настоящему изобретению предпочтительно используют локус, полученный из последовательностей ДНК линии клеток-продуцентов. Например, для млекопитающего хозяина используют локус белка млекопитающего, также называемый локусом млекопитающего. Для клеток насекомого предпочитают использовать локус белка насекомого, также называемый локусом насекомого. В настоящем изобретении предпочтительно применяют человеческие и мышиные локусы. Примерами локусов являются Вока 2б или локусы интенсивно экспрессируемых и необходимых генов, таких как бета-актин и другие белки цитоскелета, также гены рибосомальных белков.
Еще более предпочтительно использовать аллогенные локусы - локусы от того же вида, что и клетка-хозяин. Например, локус млекопитающего внедряют в вектор для создания клеток-хозяев млекопитающего, например человеческий локус внедряют в вектор согласно настоящему изобретению и вводят в линию клеток человека. Такую аллогенную систему предпочтительно используют для получения белков человека. Более того, предпочтительно используют вектор с мышиным локусом для интегрирования в линию мышиных клеток-хозяев, вектор с локусом хомяка предпочтительно используют для интегрирования в линию клеток-хозяев хомяка, а вектор с локусом насекомого предпочтительно используют для интегрирования в линию клеток насекомого.
Регуляторные элементы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтитель
- 4 020311 но включают в себя промотор, или собственный, содержащийся в нативном локусе, или гетерологический элемент, такой как эукариотический и/или прокариотический промотор, или даже двойной промотор. Примерами промоторов служат неспецифичные промоторы, например промотор цитомегаловируса (СМУ), промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером цитомегаловируса (Саддк), тимидинкиназы (Тк), убиквитина-С или второго фактора элонгации (ЕЕ2), которые обычно используют для трансфекции. Кроме искусственных промоторов, используют и природные промоторы, такие как промоторы бета-актина или рибосомальных белков. Предпочтительно выбирают сильные промоторы.
Было доказано, что для увеличения выхода продукта будет лучше внедрить в клетку-хозяина более 1 копии искусственной хромосомы, лучше 3 копии, еще лучше 5 или 10 копий, предпочтительно в клетку-хозяина интегрируют до 50 копий. Еще большее количество использованных искусственных хромосом, тем не менее, также может быть выгодным, в частности, когда в экспрессию белка вовлечен более чем один локус, их число может достигать 500 копий. Увеличенное количество встроенных в геном копий искусственной хромосомы напрямую коррелирует с увеличением экспрессии представляющего интерес гена и, таким образом, влияет на увеличение выхода соответствующего закодированного белка. Это явное преимущество в сравнении с использованием кпоск-ίη стратегий, в которых представляющий интерес ген интегрируют в одну или две копии хромосомного локуса линии клеток-хозяев, без использования искусственных хромосом.
Таким образом, использование искусственных хромосом, предложенное в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает высокий уровень экспрессии белка. Способ получения, предложенный в соответствии с настоящим изобретением, дает выход на уровне 1 пг/клетка/день, предпочтительно выход достигает 3, 5, 10, 30, 50 и до 100 пг/клетка/день. Выход может улучшиться после увеличения плотности указанных клеток-хозяев при соответствующем культивировании.
Выяснилось, что клон, полученный в соответствии с настоящим изобретением, стабильно продуцирует белок даже после множества пересевов. Неожиданно было отмечено, что даже после 10, 20 или 30 пассажа продуктивность уменьшалась незначительно, т.е. не больше чем на 30%, что, таким образом, демонстрировало стабильность системы экспрессии.
Вектор согласно настоящему изобретению может обеспечить средства для экспрессии, которые обеспечивают более простое получение рекомбинантного белка в дополнение к обычным способам экспрессии или, что более предпочтительно, в качестве полноценной и независимой единицы экспрессии. Таким образом, вектор, полученный в рамках настоящего изобретения, предпочтительно содержит регуляторные элементы гена, позволяющие случайную интеграцию искусственной хромосомы в стабильные клеточные линии, при отсутствии влияния хроматинового окружения.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения вектор обеспечивают как полноценную единицу экспрессии, содержащую все регуляторные элементы, обеспечивающие стабильную экспрессию белка. Таким образом, вектор, полученный в рамках настоящего изобретения, можно вводить в клеткухозяина без необходимости интеграции в хромосому.
Так, например, оказалось, что вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы, предложенный в соответствии с настоящим изобретением, дает явное преимущество по сравнению с обычным вектором. Он обеспечивает как минимум в 10 раз более высокий уровень экспрессии и менее подвержен нежелательным влияниям хроматина, упрощая тем самым выделение отдельных клеточных клонов, продуцирующих представляющий интерес белок на высоком уровне. Более того, векторы на основе искусственных хромосом могут использовать собственные регуляторные элементы клетки и посредством этого избегать гашения экспрессии в долго живущих культурах.
Использование векторов, основанных на искусственных хромосомах, в рамках настоящего исследования, в частности малых искусственных хромосом, таких как искусственные хромосомы микроорганизмов, например бактериальной искусственной хромосомы, дает все преимущества киоск-ίη стратегий. В дополнение, такие вектора могут быть интегрированы в геном хозяина в большом количестве копий, в то время как интеграция кпоск-ίη вектора происходит в одном или самое большее двух экземплярах. Уровень экспрессии с векторов прямо пропорционален числу интегрированных копий, таким образом, вектор, созданный на основе искусственной хромосомы, дает более высокие уровни экспрессии по сравнению с кпоскίη стратегией. Кроме того, создание стабильных клеточных линий согласно настоящему изобретению, в частности, с использованием векторов на основе бактериальной искусственной хромосомы представляет собой более простой процесс, требующий меньше времени, чем кпоск-ίη способы. Как уже отмечалось выше, экспрессия представляющего интерес гена с использованием обычных векторов в высокой степени подвержена нежелательному влиянию хроматина. Для преодоления этой проблемы обычные векторы фланкируют короткими последовательностями ДНК, называемыми хроматиновыми изоляторами. Существует обширный список элементов ДНК, которые считают хроматиновыми изоляторами: участки контроля локусов, элементы прикрепления к матриксу, антирепрессорные элементы, повторяющиеся хроматиновые элементы, граничные элементы и т.д. (\Уигт. Е.М., №1Шгс Вю1сс1то1оду 22, 1393-1398 (2004)). С переменным успехом все эти элементы использовали в обычных векторах. Такие хроматиновые изоляторы представляют собой короткие последовательности ДНК, используемые в отрыве от их реального геномного окружения, тем самым они не способны создать истинное хроматиновое окружение.
- 5 020311
С другой стороны, векторы на основе искусственных хромосом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением и содержащие определенный локус (например, Кока 26), уже по своему определению являются элементами хроматина. Они содержат большинство, если не все регуляторные элементы заданного локуса в настоящем эндогенном геномном контексте. Таким образом, векторы, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивают лучшую регуляцию хроматина или окружение, чем обычные векторы, фланкированные только хроматиновыми изоляторами. С использованием предпочтительного варианта реализации способа в рамках настоящего изобретения необходимость в использовании хроматиновых изоляторов отпадает.
На фиг. 1А показаны конструкции, использованные для получения белка. САОО8 Ес - обычный экспрессионный вектор, содержащий промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером цитомегаловируса (САОО8), сигнальный пептид, за которым идут Ес регион гена 1дО1, репортерный элемент, состоящий из внутреннего сайта посадки рибосомы (1КЕ8) и улучшенного желтого флуоресцирующего белка (еУЕР), полиаденилатная сигнальная последовательность вакуолизирующего обезьяньего вируса (8У40 ро1уА) и фосфоглицераткиназная (РОК) неомициновая кассета. Конструкция Кока26ВАС СА008 Ес получена рекомбинацией вектора САОО8 Ес в бактериальную искусственную хромосому, содержащую локус К.ока26. Вектор САОО8 Ес был помещен во второй экзон антисмысловой последовательности локуса Ро5а26 вместе с последовательностями по 100 кЬ слева и справа.
На фиг. 1В показано сравнение эффективности продукции белка обычным вектором и вектором на основе бактериальной искусственной хромосомы. Выход Ес анализировался в клеточных пулах клеток НЕК 293, полученных с использованием векторов САОО8 Ес и Ко§а26ВАС СА008 Ес. Вектор САОО8 Ес давал выход на уровне 0,5 пг/клетка/день, в то время как вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы давал выход на уровне 5,7 пг/клетка/день. Измерения повторяли трижды. Усы на столбцах гистограммы показывают стандартное отклонение.
Фиг. 1С показывает зависимость между продукцией белка и количеством интергированных копий трансгенной бактериальной искусственной хромосомы. Анализ 12 отдельных клонов показал разброс числа копий от 1 до 55 для вектора Ко§а26ВАС СА008 Ес с выходом белка от 5,5 до 30 пг/клетка/день. Продукция белка была в прямой зависимости от количества трансгенных бактериальных искусственных хромосом.
Фиг. 1Ό показывает сохранение продукции белка на стабильном уровне в процессе пересевов культуры. Выход белка Ес измеряли на 1 и 30 пассажах у 6 разных клонов, изолированных из культур К.о§а26ВАС СА008 Ес. Никаких явных отличий найдено не было. Усы на столбцах гистограммы показывают стандартное отклонение.
Дальнейшее описание настоящего изобретения производится посредством примеров.
Пример 1. Экспрессия человеческого Ес.
С целью протестировать эффективность бактериальных искусственных хромосом были созданы два вектора экспрессии: вектор САОО8 Ес, содержащий промотор β-актина цыпленка, объединенный с ранним энхансером цитомегаловируса (САОО8) (Ита, Н., Уашашита, К. & М|уахакт 1., Оеие 108, 193-199 (1991)), сигнальный пептид, за которым идет Ес фрагмент (т.е. шарнир, СН2 и СН3) человеческого 1дО1 как представляющий интерес ген (Ес), репортер, состоящий из внутреннего сайта посадки рибосомы и улучшенного желтого флуоресцирующего белка (1КЕ8/еУЕР), и фосфоглицераткиназная (РОК) неомициновая кассета. Второй вектор, Ко§а26ВАС СА008 Ес, состоит из вектора САОО8 Ес, который был помещен в остов бактериальной искусственной хромосомы, содержащей локус К.ока26 (фиг. 1А).
Клетки НЕК 293 трансфицировали векторами САОО8 Ес и Ко§а26ВАС СА008 Ес. После 14 дней селекции на 0418 устоялись два массива клеточных культур (клеточных пула) для САОО8 Ес и Ко§а26ВАС СА008 Ес. Анализ количества Ес-фрагмента в надосадочной жидкости показал выход в 0,5 и 5,7 пг/клетка/день в клеточных пулах с САОО8 Ес и К.ока26ВАС СА008 Ес, соответственно (фиг. 1В), демонстрируя, что использование вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы значительно улучшило продукцию белка.
Затем анализировали зависимость между количеством копий трансгена и выходом белка Ес. Из культуры с Ко§а26ВАС СА008 Ес было выведено 12 клонов с содержанием копий трансгена от 1 до 55. Выход белка, судя по надосадочным жидкостям данных культур, был взаимосвязан с числом копий трансгена и варьировал от 5,5 до 30 пг/клетка/день (фиг. 1С). Коэффициент корреляции К2 между числом копий вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы и продукцией белка был равен 0,88. Это указывает на то, что при использовании экспрессионного вектора на основе бактериальной искусственной хромосомы продукция белка пропорциональна числу интегрированных копий трансгена.
Наконец, изучили долгосрочную продукцию белка на протяжении времени и при увеличении числа пассажей. 6 клонов из культуры с Ко§а26ВАС СА008 Ес пересевали 30 раз и анализировали продукцию белка. Выход белка Ес от 1 до 30 пассажа значительно не уменьшался, указывая, что векторы на основе бактериальной искусственной хромосомы обеспечивают стабильную продукцию рекомбинантного белка с течением времени.
В этой работе использовали локус К.о§а26 в составе бактериальной искусственной хромосомы, чтобы оградить экспрессирующий участок (САОО8 Ес). С таким подходом было показано, что вектор на основе бактериальной искусственной хромосомы дает лучшие результаты в сравнении с обычными век
- 6 020311 торами для продукции рекомбинантного белка. Дальнейшие улучшения основанных на бактериальной искусственной хромосоме векторов для продукции рекомбинантного белка могут включать использование эндогенных/естественных промоторов с высокой активностью в клетке продуценте. Например, анализ транскрипции клеток НЕК 293 выявил высокие уровни экспрессии гена Вр123а, кодирующего рибосомальный белок. По этой причине использование бактериальной искусственной хромосомы, содержащей локус Вр123а, в клетках НЕК 293 может дополнительно улучшить продукцию рекомбинантного белка.
Материалы и методы
Плазмиды и культуры клеток.
Вектор экспрессии САСС8 Ес собирали классическими способами клонирования, с торцов помещены два сайта айВ (места, распознаваемые интегразой рЫС31). Вектор Вока2бВАС САО°8 Ес ВАС был создан по ранее описанному способу (В1аак, Ь, Ми81еаии, Μ., Ζοηζ. В., Е£ег1, В. и Сакаиоуа, Е., ВюТсс11пк|ис5 43, 659-660, бб2, бб4 (2007)). Коротко, вектор САСС8 Ес интегрировали в бактериальную искусственную хромосому, содержащую локус Вока2б, используя управляемый интегразой рЫС31 кассетный обмен со вторым экзоном антисмыслового транскрипта локуса Вока2б.
Для создания культур клеток 24 мкг векторов САСС8 Ес и Вока2бВАС САО°8 Ес ВАС были линеаризованы с помощью рестриктазы ИоЙ, после чего, с использованием Е1ро£ес1атте 2000 (1иуйгодеи), производилась трансфекция клеток НЕК 293. Через 2 дня после трансфекции в среду (ЭМЕМ - модифицированная Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки, дополненная глутамином, пируватом и неосновными аминокислотами) добавляли антибиотик С418 (800 мкг/мл). Селекцию производили 14 дней. После чего культуры росли в отсутствие С418, а измерение продукции белка Ес в массиве культур производили 1 неделей позже.
Белок Ес можно выделять, используя способы хроматографии.
Определение белка Ес.
В каждую лунку б-луночного планшета высевали 5х105 клеток в 2 мл среды. Через 72 ч после высевания с помощью твердофазного иммуноферментного анализа измерялась концентрация белка Ес в надосадочной жидкости. Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа Е(аЬ')2 фрагменты 1дС козла против антигенов человека (специфичные к Ес фрагменту) (8щта 1-3391) в концентрации 1 мкг/мл адсорбировали в лунках планшета Махщогр в течение ночи при 4°С с последующим блокированием неспецифичных валентностей 5% бычьим сывороточным альбумином на фосфатно-солевом буфере в течение 1 ч при 25°С. После отмывки планшета образцы и калибратор вносились в лунки с заблокированными неспецифичными валентностями в соответствующих сериях разведений и инкубировались 1 ч при 25°С. Планшет отмывали и связавшийся Ес фрагмент выявляли белком А с пероксидазой хрена (8ЮМА Р-8б51), разведенным на фосфатно-солевом буфере с добавлением бычьего сывороточного альбумина в соотношении 1:70000, после чего производилось окрашивание раствором субстрата - тетраметилбензидина (8щта Т044б). Оптическая плотность измерялась при 450 нм с длинной контрольной волны б30 нм.
Анализ числа копий Вока2бВАС САО°8 Ес.
Стабильные клоны из культуры Вока2бВАС САО°8 Ес получали способом сортировки клеток по возбужденной флуоресценции улучшенного желтого флуоресцирующего белка. Число копий трансгена в одиночных клеточных клонах вычисляли способом ПЦР в реальном времени с геномной ДНК в качестве матрицы. Бактериальная искусственная хромосома с Вока2б амплифицировалась с помощью праймеров ВокаЕ 5' ТСТТОТССТТТТАССТСССТТОТА (последовательность № 1) и ВокаВ 5' ОААСАТАТТСААААСАССАООАТТТ (последовательность № 2). Эти праймеры распознают бактериальную искусственную хромосому и эндогенный локус ВО8А2б. В качестве внутреннего контроля амплифицировали локус бета-актина, при этом использовали праймеры асйиЕ 5' ТСАТОТТТОАОАССТТСААСАСС (последовательность № 3) и асйиВ 5' 0АТСТТСАТ6А66ТА6ТСА6ТСА60Т (последовательность № 4).
Claims (15)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов, включающий следующие стадии:a) обеспечение остова искусственной хромосомы,b) получение экспрессионного вектора путем рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и указанного остова,c) введение указанного экспрессионного вектора в линию эукариотических клеток-хозяев для получения эукариотической экспрессирующей клеточной линии, в которой по меньшей мере 5 копий указанной искусственной хромосомы успешно интегрированы в хромосому клетки-хозяина,ά) культивирование указанной экспрессирующей клеточной линии для продуцирования указанного белка ие) выделение указанного белка.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную рекомбинацию осуществляют с применением техники рекомбинации, выбранной из гомологичной рекомбинации или кассетного обмена, управляемого интегразой.- 7 020311
- 3. Способ согласно п. 1 или 2, отличающийся тем, что в указанную линию клеток-хозяев происходит интеграция указанного вектора в количестве по меньшей мере от 10 до 500 копий.
- 4. Способ согласно любому из пп.1-3, отличающийся тем, что получают секретируемый белок.
- 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный секретируемый белок содержит сигнальный пептид.
- 6. Способ по любому из пп.4, 5, отличающийся тем, что указанный секретируемый белок выбирают из группы, состоящей из белков сыворотки, включая иммуноглобулины, производные или фрагменты иммуноглобулинов, альбумин, факторы крови, полипептидные гормоны, цитокины, хемокины, ферменты, ростовые факторы и их производные.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанную искусственную хромосому получают из бактерии, бактериофага, дрожжей или млекопитающего.
- 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанную искусственную хромосому выбирают из группы, состоящей из бактериальных искусственных хромосом (ВАС), искусственных хромосом на основе плазмиды Р1 (РАС), дрожжевых искусственных хромосом (УАС) и космид.
- 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что указанный вектор содержит регуляторные элементы для образования открытого хроматина.
- 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит либо нативный, либо гетерологичный промотор.
- 11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит локус мажорного белка.
- 12. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит локус, происходящий из насекомого или млекопитающего.
- 13. Применение экспрессионного вектора, основанного на искусственной хромосоме, которая содержит ген, кодирующий секреторный белок, при этом указанный вектор получен посредством обеспечения остова искусственной хромосомы;осуществления рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и указанного остова с получением экспрессионного вектора, в способе получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов согласно любому из пп.1-12.
- 14. Хромосома клетки-хозяина, содержащая стабильно интегрированный экспрессионный вектор, основанный на искусственной хромосоме, которая содержит ген, кодирующий секреторный белок, при этом указанный вектор получен посредством обеспечения остова искусственной хромосомы;осуществления рекомбинации нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и указанного остова с получением указанного экспрессионного вектора.
- 15. Применение трансгенной линии клеток-продуцентов, которая содержит вектор, включающий аллогенный локус, в способе получения белка в линии эукариотических клеток-продуцентов согласно любому из пп.1-12.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT18592008 | 2008-11-28 | ||
| PCT/EP2009/065410 WO2010060844A1 (en) | 2008-11-28 | 2009-11-18 | Artificial chromosome vector |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201170505A1 EA201170505A1 (ru) | 2011-12-30 |
| EA020311B1 true EA020311B1 (ru) | 2014-10-30 |
Family
ID=41594656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201170505A EA020311B1 (ru) | 2008-11-28 | 2009-11-18 | Вектор на основе искусственной хромосомы |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8647841B2 (ru) |
| EP (2) | EP2356241B1 (ru) |
| JP (1) | JP5791508B2 (ru) |
| KR (1) | KR101728079B1 (ru) |
| CN (2) | CN102239261A (ru) |
| CA (1) | CA2744976C (ru) |
| DK (1) | DK2356241T3 (ru) |
| EA (1) | EA020311B1 (ru) |
| ES (1) | ES2687447T3 (ru) |
| PL (1) | PL2356241T3 (ru) |
| SG (1) | SG171837A1 (ru) |
| WO (1) | WO2010060844A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087632B (zh) * | 2015-09-07 | 2019-12-10 | 清华大学 | 一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用 |
| EP3510161A4 (en) * | 2016-08-23 | 2020-04-22 | Akouos, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PERSONAL HEARING LOSS IN A PERSON |
| WO2019086694A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Geert Mudde | Il31 antigen and vaccine |
| MX2022010050A (es) | 2020-02-21 | 2022-09-05 | Akouos Inc | Composiciones y metodos para tratar deficiencia auditiva no asociada con la edad en un sujeto humano. |
| KR102384173B1 (ko) * | 2020-05-22 | 2022-04-06 | 인천대학교 산학협력단 | 박테리아 인공 염색체 재조합 스크리닝 방법 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002097059A2 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Chromosome-based platforms |
| WO2002096923A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
| WO2004056986A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2394877T3 (es) * | 2000-08-14 | 2013-02-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Recombinación homóloga mejorada mediada por proteínas de recombinación de lambda |
| ATE466089T1 (de) * | 2000-12-22 | 2010-05-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Positionsunabhängige und gewebespezifische expression eines transgens in der milch eines transgen-tieres |
| WO2002098217A1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method for targeting transcriptionally active loci |
| AU2003257155A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-23 | The General Hospital Corporation | Methods for the production of cells and mammals with desired genetic modifications |
| JPWO2004031385A1 (ja) * | 2002-10-04 | 2006-02-02 | 麒麟麦酒株式会社 | ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター |
| EP1439234A1 (en) * | 2003-01-08 | 2004-07-21 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Targeted transgenesis using the rosa26 locus |
| EP1587545A2 (en) * | 2003-01-13 | 2005-10-26 | Mahendra S. Rao | Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products |
| CA2557644C (en) * | 2004-02-23 | 2016-05-24 | Chromatin, Inc. | Plants modified with mini-chromosomes |
| EP1614755A1 (en) * | 2004-07-07 | 2006-01-11 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Target transgenesis of short hairpin RNA expression cassette using recombinase mediated cassette exchange |
| US8809045B2 (en) * | 2006-07-07 | 2014-08-19 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Human artificial chromosome (HAC) vector and human cell medicine comprising same |
| US9062122B2 (en) * | 2007-01-19 | 2015-06-23 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Targeting the Rosa26 gene in human embryonic stem cells |
-
2009
- 2009-11-18 CA CA2744976A patent/CA2744976C/en active Active
- 2009-11-18 SG SG2011038502A patent/SG171837A1/en unknown
- 2009-11-18 EP EP09756728.3A patent/EP2356241B1/en active Active
- 2009-11-18 ES ES09756728.3T patent/ES2687447T3/es active Active
- 2009-11-18 CN CN2009801478450A patent/CN102239261A/zh active Pending
- 2009-11-18 JP JP2011537935A patent/JP5791508B2/ja active Active
- 2009-11-18 WO PCT/EP2009/065410 patent/WO2010060844A1/en active Application Filing
- 2009-11-18 PL PL09756728T patent/PL2356241T3/pl unknown
- 2009-11-18 CN CN201710073136.9A patent/CN107012168A/zh active Pending
- 2009-11-18 EA EA201170505A patent/EA020311B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-11-18 DK DK09756728.3T patent/DK2356241T3/en active
- 2009-11-18 KR KR1020117011056A patent/KR101728079B1/ko active IP Right Grant
- 2009-11-18 EP EP18164934.4A patent/EP3372687B1/en active Active
- 2009-11-18 US US13/130,478 patent/US8647841B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002097059A2 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Chromosome-based platforms |
| WO2002096923A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
| WO2004056986A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BLAAS LEANDER ET AL.: "Bacterial artificial chromosomes improve recombinant protein production in mammalian cells.", BMC BIOTECHNOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD., LONDON, GB, vol. 9, no. 1, 14 January 2009 (2009-01-14), page 3, XP021049476, ISSN: 1472-6750, the whole document * |
| BLAAS LEANDER ET AL.: "PhiC31-mediated cassette exchange into a bacterial artificial chromosome.", BIOTECHNIQUES, vol. 43, no. 5, November 2007 (2007-11) - 9 March 2010 (2010-03-09), pages 659-664, XP002567158, ISSN: 0736-6205, cited in the application, the whole document * |
| TSYRULNYK ANDRIY ET AL.: "A detailed protocol for bacterial artificial chromosome recombineering to study essential genes in stem cells.", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (CLIFTON, N.J.) 2008, vol. 430, 2008, pages 269-293, XP002567157, ISSN: 1064-3745, the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2356241A1 (en) | 2011-08-17 |
| CA2744976A1 (en) | 2010-06-03 |
| CA2744976C (en) | 2017-09-12 |
| EP2356241B1 (en) | 2018-06-20 |
| JP5791508B2 (ja) | 2015-10-07 |
| CN107012168A (zh) | 2017-08-04 |
| US8647841B2 (en) | 2014-02-11 |
| KR101728079B1 (ko) | 2017-04-18 |
| JP2012511307A (ja) | 2012-05-24 |
| KR20110091675A (ko) | 2011-08-12 |
| PL2356241T3 (pl) | 2018-12-31 |
| US20110229932A1 (en) | 2011-09-22 |
| EA201170505A1 (ru) | 2011-12-30 |
| DK2356241T3 (en) | 2018-09-17 |
| EP3372687A1 (en) | 2018-09-12 |
| WO2010060844A1 (en) | 2010-06-03 |
| CN102239261A (zh) | 2011-11-09 |
| SG171837A1 (en) | 2011-07-28 |
| ES2687447T3 (es) | 2018-10-25 |
| EP3372687B1 (en) | 2022-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1468304B (zh) | 蛋白质功能域的制备方法 | |
| Feng et al. | Site-specific chromosomal integration in mammalian cells: highly efficient CRE recombinase-mediated cassette exchange | |
| CN100582230C (zh) | 通过载体构建体与细胞dna的非同源重组来表达内源基因 | |
| EP0672160B1 (en) | Activating expression of an amplifying endogenous gene by homologous recombination | |
| CN109983124A (zh) | 使用可编程dna结合蛋白增强靶向基因组修饰 | |
| KR100490188B1 (ko) | 진핵 세포에서의 서열 특이적 ｄｎａ 재조합 | |
| UA34493C2 (ru) | Способ получения гомологически рекомбинантной клетки (варианты), плазмида для использования в способе (варианты), штамм гомологически рекомбинантных клеток фибросаркомы человека (варианты), способ получения эритропоэтина человека (варианты) | |
| CN108823202A (zh) | 用于特异性修复人hbb基因突变的碱基编辑系统、方法、试剂盒及其应用 | |
| CN102459586A (zh) | 用于形成高生产性细胞的表达载体和所述高生产性细胞 | |
| EA020311B1 (ru) | Вектор на основе искусственной хромосомы | |
| US20200263155A1 (en) | Crispr/cas fusion proteins and systems | |
| Hartley | Why proteins in mammalian cells? | |
| EP3954765A1 (en) | Artificial recombinant chromosome and use thereof | |
| WO2005054463A1 (ja) | レトロトランスポゾンを用いた哺乳動物のゲノム改変技術の開発 | |
| US20230159958A1 (en) | Methods for targeted integration | |
| US20110136236A1 (en) | Genetically modified eukaryotic cells | |
| JP2022529063A (ja) | 安定的な標的組み込み | |
| JP6956995B2 (ja) | ゲノム編集方法 | |
| CN104975018A (zh) | 一种新型增强子及其应用 | |
| Gao et al. | Transfection and expression of exogenous gene in laying hens oviduct in vitro and in vivo | |
| WO2018119021A9 (en) | Composition for editing a nucleic acid sequence and method using the same | |
| Saito et al. | Plasmidal maintenance of composite DNA derived from polyoma related plasmid, L factor | |
| US20030170619A1 (en) | Nucleic acid capable of promoting gene expression | |
| Kim et al. | The microinjected Drosophila melanogaster 1731 retrotransposon is activated after the midblastula stage of the amphibian Pleurodeles waltl development | |
| Han et al. | Improving Gene Targeting Efficiency in Human Pluripotent Stem Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |