CN102459586A - 用于形成高生产性细胞的表达载体和所述高生产性细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供表达载体，其有效用于有效率地形成能够高水平表达目标蛋白基因的转化细胞。特别提供一种表达载体，其包含：含有mRNA去稳定序列的药物选择标记基因的表达盒；至少一个稳定基因表达的元件；和目标蛋白基因的表达盒。优选地，所述mRNA去稳定序列来源自存在于细胞因子、白细胞介素或原癌基因的3’-非翻译区中的富含AT的序列，稳定基因表达的元件来源自中国仓鼠基因组。

Description

用于形成高生产性细胞的表达载体和所述高生产性细胞
技术领域
本发明涉及在这样的方法中使用的表达载体，在所述方法中，通过基因重组技术将其中已经插入目标蛋白基因的表达载体转入宿主细胞，并由转化的细胞有效形成高水平表达目标蛋白基因的细胞。本发明还涉及所述转化的高生产性细胞。本发明的表达载体用于通过遗传工程方式在动物细胞或，具体地，哺乳动物细胞中产生有用的蛋白诸如药物。
背景技术
开发产生重组蛋白的表达系统在提供用于研究或治疗的蛋白供应源中非常重要。关于表达系统，已经使用了基于原核细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)和基于真核细胞包括酵母(酵母(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属，等)和动物细胞诸如哺乳动物细胞的表达系统。其中，基于动物细胞或，具体地，哺乳动物细胞的表达系统优选用于制备用于治疗的蛋白。这是因为，由于哺乳动物诸如人中发生的蛋白翻译后修饰有时强烈地促进蛋白的生物学活性，并且由于与对其施用蛋白的对象中的翻译后修饰相似的翻译后修饰在基于哺乳动物细胞的表达系统中是可能的，所以用于治疗的蛋白的功效能够通过使用基于哺乳动物细胞的表达系统来提高。
关于用于形成产生重组蛋白的细胞的方法，一般地，将表达目标蛋白基因的基因构建体转入宿主细胞中并且，从由此生成的转化细胞中选择其中基因构建体稳定转入宿主细胞基因组的细胞。在那时，起药物选择标记作用的药物抗性基因已经预先插入上述基因构建体，以使得所述基因在与目标蛋白基因的启动子相同或不同的启动子下表达并然后借助于药物选择存活的细胞被选为其中稳定转入目标蛋白基因的细胞。目标蛋白的表达水平根据其中转入编码目标蛋白的基因的宿主细胞基因组区域而明显变化，但是通常不可能控制所述转移区。因此，即使当进行基因转移时，大多数细胞不表达目标蛋白基因或表达水平很低。因此，在获得其中高水平表达目标蛋白基因的转化细胞中，从一千至数千细胞样品中选择一个或两个细胞系的选择操作已经反复进行了数月至一年，因此需要相当大量的劳动和时间来选择高水平表达目标蛋白基因的转化细胞。
在这样的情况下，已经开发了减弱药物选择标记的表达或功能的方法，从而有效选择高水平表达目标蛋白基因的转化细胞。当药物选择标记的表达或功能减弱时，其中在宿主细胞基因组的低表达区中转入该药物选择标记基因的转化细胞不能完全表达该药物选择标记(药物抗性基因)，因此它们是死亡的并且只有其中通过药物选择将该药物选择标记物基因转入高表达区的转化细胞存活。在存活的转化细胞中，存在这样的高度可能性，即目标蛋白基因邻近药物选择标记物基因存在并且，因此，目标蛋白基因也转入宿主细胞基因组中的高表达位点，并且存在这样的高度可能性，即目标蛋白基因高水平表达。预期当对其进行使用时，能够有效地选择高水平表达目标蛋白基因的转化细胞。
用于减弱药物选择标记的表达或功能的方法的实例包括其中使用具有弱转录活性的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)启动子来表达药物选择标记(非专利文件1)的方法和其中使用与野生型相比转录活性水平减弱的不同类型启动子抑制药物选择标记表达的方法(专利文件1、2)。然而，当本发明人进行这些方法的后续研究时，它们中的任一种很少显示减弱药物选择标记表达的效果。因此，认为利用这样的方法难以有效选择高水平表达目标蛋白基因的转化细胞。
另一种用于减弱药物选择标记表达或功能的方法是将突变转入药物选择标记诸如新霉素(neomycin)磷酸转移酶的编码序列，由此减弱药物选择标记自身的功能(专利文件3、4)。本发明人已经对该方法进行了后续研究并发现，当应用该方法时，药物选择标记的功能能够减弱至一定程度并且，作为药物选择的结果，能够产生表现出提高的表达量的少量细胞系。然而，高水平表达目标蛋白基因的转化细胞的选择效率不好并且通过该方法不获得显著作用。
在形成高生产性细胞中，除了改进细胞选择技术外，必需消除来自宿主细胞基因组上目标基因-转移位点周围的基因组环境的影响，从而稳定地维持目标基因的表达。重组蛋白的表达根据向其中转入编码重组蛋白的基因的宿主细胞基因组的位点而明显变化。然而，通常地，控制转移位点是不可能的。因此，即使在筛选时表现出充足表达的细胞的情形中，所述表达有时随着连续培养细胞而逐渐降低。为了克服这样的位置效应，已经使用减轻邻近染色体或调节元件对转基因的影响的染色体元件(顺式-作用DNA元件)来产生重组蛋白。具有这样的功能的核酸序列之一是称为绝缘子的序列，并且已经充分分析了家禽的β-珠蛋白LCR的DNA酶I超敏位点(cHS4；1.2kb长度)等的功能并将其用于表达重组蛋白(非专利文件2)，但是已经报道了CHO-K1细胞中蛋白表达的增加不是那样显著(非专利文件3)。
现有技术文件
专利文件
专利文件1：美国专利No.5,627,033
专利文件2：WO 2005/024015
专利文件3：WO 2001/032901
专利文件4：WO 2004/050884
专利文件5：日本专利申请公开号(JP-A)No.2001-37478
非专利文件
非专利文件1：Niwa H，Yamamura K，Miyazaki J.(1991)Gene(基因)108：193-200
非专利文件2：Pikaart MJ，Recillas-Targa F，Felsenfeld G.(1998)GenesDev(基因和发育)12：2852-2862
非专利文件3：Izumi M，Gilbert DM.(1999)J Cell Biochem(细胞生物化学杂志)76：280-289
非专利文件4：Bakheet T，Frevel M，Williams B.R.G，Greer W，KhabarK.S.A.(2001)Nucleic Acids Research(核酸研究)29：246-254
非专利文件5：Lagnado C.A，Brown C.L，Goodall G.J.(1994)Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)14：7984-7995
非专利文件6：Zubiaga A.M，Belasco J.G，Greenberg M.E.(1995)Molecular and Cellular Biology(分子和细胞生物学)15：2219-2230
非专利文件7：Blasco MA(2007)Nat Rev Genet(自然遗传学综述)8：299-309
非专利文件8：Gonzalo S，Jaco I，Fraga MF，Chen T，Li E，Esteller M，Blasco MA(2006)Nat Cell Biol(自然细胞生物学)8：416-424
非专利文件9：Perrod S，Gasser SM(2003)Cell Mol Life Sci(细胞分子生命科学)60：2303-2318
非专利文件10：Wakimoto BT(1998)Cell(细胞)93：321-324
非专利文件11：Bao L，Zhou M，Cui Y(2008)Nucleic Acids Research(核酸研究)，36，D83-D87
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供在有效形成高水平表达目标蛋白基因的转化细胞中有效的表达载体并还提供高生产性细胞。
用于解决问题的方式
为了解决以上问题，本发明人发明了其中转入有mRNA去稳定序列的药物选择标记的表达盒和稳定基因表达的元件。他们还构建了具备不同类型表达盒和具备稳定基因表达的元件的表达载体，所述表达盒是具有mRNA去稳定序列的药物选择标记的表达盒，并详细分析了通过上述表达载体转化的宿主细胞的基因表达。作为其结果，他们发现高度产生目标蛋白的细胞比率显著增加，由此完成了本发明。
因此，根据本发明，提供以下各项。
(1)表达载体，其特征在于具有包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因的表达盒、至少一个稳定基因表达的元件和目标蛋白基因的表达盒。
(2)根据(1)的表达载体，其中所述mRNA去稳定序列由细胞因子、白细胞介素或原癌基因的3’-非翻译区中存在的富含AT的序列衍生。
(3)根据(1)的表达载体，其中所述mRNA去稳定序列具有基序序列TTATTTA(A/T)(A/T)。
(4)根据(3)的表达载体，其中所述基序序列重复两次或更多次。
(5)根据(4)的表达载体，其中在所述基序序列的重复之间含有间隔序列的一个或多个碱基。
(6)根据(2)-(5)中任一项的表达载体，其中在所述mRNA去稳定序列中包含一个至数个碱基的置换、插入或缺失。
(7)根据(1)-(6)中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件源自中国仓鼠基因组。
(8)根据(1)-(7)中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件由以下(a)-(h)中任一项或其任意组合组成：
(a)由SEQ ID No：26中所示序列组成的DNA；
(b)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第41820个碱基至第41839个碱基区域的序列的DNA；
(c)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第41821个碱基至第41840个碱基区域的序列的DNA；
(d)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第45182个碱基至第45200个碱基区域的序列的DNA；
(e)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第91094个碱基至第91113个碱基区域的序列的DNA；
(f)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成的DNA，其中，当其排列到邻近于宿主细胞中外源基因的表达盒时，能够增加或稳定源自包含在外源基因的表达盒中的外源基因的目标重组蛋白的表达；
(g)在严格条件下与由与以上(a)-(f)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(h)由与以上(a)-(g)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA。
(9)根据(8)的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件由以下(i)-(k)中任一项或其任意组合组成：
(i)包含SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第46746个碱基区域的序列的DNA；
(j)在严格条件下与由与(i)中DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(k)由与以上(i)或(j)中的DNA互补的碱基序列组成的DNA。
(10)根据(9)的表达载体，其特征在于所述稳定基因表达的元件由以下(l)-(n)中任一项或其任意组合组成：
(l)包含SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第42700个碱基区域的序列的DNA；
(m)在严格条件下与由与(l)中DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(n)由与以上(l)或(m)中的DNA互补的碱基序列组成的DNA。
(11)根据(1)-(10)中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒的上游区域上排列。
(12)根据(1)-(10)中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒的上游区域和下游区域二者上排列。
(13)根据(1)-(10)中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒和所述药物选择标记基因的表达盒的上游区域和下游区域二者上排列。
(14)根据(1)-(13)中任一项的表达载体，其中所述药物选择标记基因是对蛋白合成抑制类型的抗生素物质具有抗性的基因。
(15)根据(14)的表达载体，其中所述药物选择标记基因选自由嘌呤霉素(puromycin)-N-乙酰转移酶，潮霉素(hygromycin)-B-磷酸转移酶和新霉素磷酸转移酶组成的组。
(16)根据(1)-(15)中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白基因的表达盒装配有用于插入目标蛋白基因的多克隆位点。
(17)根据(1)-(16)中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白是抗体的重链和/或轻链多肽。
(18)根据(1)-(17)中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白基因的表达盒是包含抗体轻链恒定区基因的抗体基因表达盒和/或包含抗体重链恒定区基因的抗体基因表达盒。
(19)转化细胞，其特征在于是通过根据(1)-(18)中任一项的表达载体转化宿主细胞获得的。
(20)根据(19)的转化细胞，其中所述宿主细胞是动物细胞。
(21)根据(20)的转化细胞，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
(22)根据(21)的转化细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
(23)根据(22)的转化细胞，其中所述中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适应无血清培养基。
(24)用于选择高水平表达目标蛋白基因的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括使根据(19)-(23)中任一项的转化细胞经历药物选择的步骤。
(25)细胞群，其特征在于，所述细胞群由根据(19)-(23)中任一项的转化细胞组成并高水平表达目标蛋白基因。
(26)用于生成蛋白的方法，其特征在于，使用根据(19)-(23)中任一项的转化细胞。
(27)根据(26)的方法，其中所述蛋白是抗体。
(28)根据(26)的方法，其中所述蛋白是疫苗。
本发明的优势
在根据本发明的药物选择标记基因的表达盒中，将mRNA去稳定序列插入其中。因此，由此的药物选择标记的表达与不具有mRNA去稳定序列的常规药物选择标记基因的表达盒相比减弱。因此，除非将所述盒整合到宿主细胞基因组的高表达区内，转化细胞难以在存在药物的条件下存活。由于该原因，只有这样的转化细胞，其中在宿主细胞基因组的高表达区整合药物选择标记基因和目标蛋白基因，能够通过药物选择而存活。结果，能够有效选择其中高水平表达目标蛋白基因的高表达细胞。
另外，根据本发明的用于稳定基因表达的元件减小细胞基因组中邻近染色体或调节元件对重组蛋白基因的影响，并稳定重组蛋白基因的基因表达，由此高表达能够长期维持。因此，当减弱的药物选择标记的表达盒和根据本发明的基因表达稳定元件一起使用时，在通过药物选择获得的细胞中非常高度表达目标蛋白基因的细胞得到浓缩并且，进一步，这样的高表达细胞中的表达由于其协同作用能够稳定维持。根据本发明，能够快速、容易和有效地形成显示非常高水平蛋白生产性的高生产性细胞株系。
附图简述
图1显示pBS-CMV-SNAPm2的构建。
图2显示pPUR.N4的构建。在下文中，附图中的Pur代表嘌呤霉素-抗性基因。而且，附图中的iPCR代表反向PCR。
图3显示pBS-CMV-SNAPm-Pur和pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4的构建。
图4显示通过pBS-CMV-SNAPm-Pur或pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转化的细胞群的FACS分析结果。
图5是这样的图，其中绘制在通过pBS-CMV-SNAPm-Pur或pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图6是当通过pBS-CMV-SNAPm-Pur或pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转化的细胞群经历药物选择时的明视场图象。
图7显示分离pBS-CMV-SNAPm-Pur集落并对其进行FACS分析的结果。
图8显示分离pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4集落并对其进行FACS分析的结果。
图9显示pEF1α-KOD3G8HC-RE2的构建。在下文中，附图中的Neo代表新霉素-抗性基因。
图10显示pEF1α-SNAP26m-Pur.N4和pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2的构建。
图11显示通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4转化的细胞群的FACS分析结果。
图12是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图13显示pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2的构建。在下文中，附图中的Hyg代表潮霉素-抗性基因。
图14显示pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2和pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4的构建。
图15显示通过pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4转化的细胞群的FACS分析结果。
图16是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图17显示pEF1α-SNAP26m-Neo.N4的构建。
图18显示通过pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4转化的细胞群的FACS分析结果。
图19是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图20显示pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6、和pEF 1α-SNAP26m-Pur.N8的构建。
图21显示通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8转化的细胞群的FACS分析结果。
图22是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图23显示序列SEQ ID No：26与CTCF的结合序列的预期位点。
图24显示用于验证核酸序列片段的基因表达稳定作用的基本构建体pBS-CMV-SNAPm的构建。
图25显示关于序列SEQ ID No：26、CTCFBS和测试序列的核酸片段之间位置的关系。
图26是这样的图，其显示通过CHO细胞的FACS分析获得的细胞数和SNAPm表达强度的分布，所述CHO细胞中稳定转入包含各核酸序列的片段的SNAPm表达构建体。
图27是这样的图，其中绘制通过CHO细胞的FACS分析显示10或更多SNAPm荧光信号的细胞比率(％)，所述CHO细胞中稳定转入包含各核酸序列的片段的SNAPm表达构建体。
图28显示CHO5的缺失构建体的构建和关于SEQ ID No：26中所述测试序列之间的位置的关系。
图29是这样的图，其中绘制作为CHO细胞的FACS分析的结果显示10或更多SNAPm荧光信号的细胞比率(％)，所述CHO细胞通过向其中稳定转入CHO5或CHO缺失构建体获得。
图30显示用于构建CHO5Δ3的3’-缺失构建体的反向PCR中使用的引物和通过缺失获得的插入测试序列的位置关系。
图31是这样的图，其中绘制作为CHO细胞的FACS分析的结果显示10或更多SNAPm荧光信号的细胞比率(％)，所述CHO细胞通过向其中稳定转入CHO5Δ3或CHO5Δ3的3’-缺失构建体获得。
图32显示pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k的构建。
图33显示pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k的构建。
图34显示通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群的FACS分析结果。
图35是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k  、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图36显示pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k的构建。
图37显示通过pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2、pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4、或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群的FACS分析结果。
图38是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2、pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4、或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图39显示pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k的构建。
图40显示通过pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2、pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Neo.N4、或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群的FACS分析结果。
图41是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2、pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k  、pEF1α-SNAP26m-Neo.N4、或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图42显示pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k、和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k的构建。
图43显示通过pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k转化的细胞群的FACS分析结果。
图44是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k、或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k转化的细胞群中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图45显示pEF1α-KOD3G8HC-Neo.N4-1.1k/1.1k的构建。
图46显示pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k的构建。
图47显示pEF1α-KOD3G8LC-Hyg.N4-1.1k/1.1k的构建。
图48显示pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k的构建。
图49是这样的图，其中使用多克隆培养物上清对不含基因表达稳定元件的个体(-/Neo，-/Hyg)；其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的个体(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)；其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并随后向药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并随后向药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)进行ELISA并绘制计算的抗体生成量。
图50是这样的图，其中绘制通过使用6孔板培养上清进行ELISA计算各克隆的抗体生成量。关于以下各项：不含基因表达稳定元件的个体(-/Neo，-/Hyg)和在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的个体(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)；不含基因表达稳定元件的个体(-/Neo，-/Hyg)和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并随后向药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)；和不含基因表达稳定元件的个体(-/Neo，-/Hyg)和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并随后向药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)，在同一图上绘制关于生成量的最佳5个克隆。
图51是这样的图，其中不含基因表达稳定元件且不含mRNA去稳定序列的个体(-/Neo，-/Hyg)；和向其添加基因表达稳定元件和mRNA去稳定序列由此显示高抗体生产率的个体(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)在96孔板中孵育两周并绘制由此产生的抗体生产率的频率分布。
图52是这样的图，其中将在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的个体(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并随后向药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)转入适应无血清的CHO-K1细胞并且，在药物选择后，利用多克隆培养物上清进行ELISA并绘制由此计算的抗体生成量。
图53显示pEF1α-KOD3G8LC和HC-Pur.N4-1.1k/1.1k的构建。
图54是这样的图，其中利用多克隆培养物的上清对双-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统进行ELSIA并绘制由此计算的抗体生成量。
图55是这样的图，其中绘制通过使用6孔板培养上清进行ELISA计算的各克隆的抗体生成量。关于双-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统中的每一项，在同一图上绘制关于生成量的最佳5个克隆。
图56是显示pEHX载体图谱的图表。
图57显示pEH(M-SNAP26m-N)和pEH(B-SNAP26m-N)的构建。
图58显示通过pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEH(M-SNAP26m-N)、或pEH(B-SNAP26m-N)转化的细胞群的FACS分析结果。
图59是这样的图，其中绘制在通过pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEH (M-SNAP26m-N)、或pEH(B-SNAP26m-N)转化的细胞中高度表达SNAPm的细胞的比率。
图60是显示pELX载体图谱的图表。
图61显示pELH(KOD3G8)的构建。
图62是这样的图，其中使用多克隆培养物的上清对其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中没有限制酶识别序列缺失的基因表达稳定序列CHO5Δ3-3的个体(1.1k)；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(1.1k-ΔRE)进行ELISA并绘制计算的抗体生成量。
图63是这样的图，其中绘制通过使用6孔板培养上清进行ELISA计算的各克隆的抗体生成量。关于其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中没有限制酶识别序列缺失的基因表达稳定序列CHO5Δ3-3的个体(1.1k)；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(1.1k-ΔRE)中的每一项，在同一图上绘制关于生成量的最佳5个克隆。
图64是显示pELX2的载体图谱的图表。
图65显示pELH2(KOD3G8)的构建。
图66是这样的图，其中使用多克隆培养物的上清对其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(pELH(KOD3G8))；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者以及L链表达盒和H链表达盒之间的区域(总共三个区域)中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(pELH2(KOD3G8))进行ELISA并绘制计算的抗体生成量。
图67是这样的图，其中绘制通过使用6孔板培养物上清进行ELISA计算的各克隆的抗体生成量。关于以下各项：其中在表达盒的上游区域和下游区域二者中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(pELH(KOD3G8))；和其中在表达盒的上游区域和下游区域二者以及L链表达盒和H链表达盒之间的区域(总共三个区域)中插入其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的个体(pELH2(KOD3G8))，在同一图上绘制关于生成量的最佳5个克隆。
图68显示pELH3(KOD3G8)的构建。
图69显示pELH4(KOD3G8)的构建。
图70是这样的图，其中使用多克隆培养物的上清对其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各1个拷贝的个体(pELH(KOD3G8))；其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各2个拷贝的个体(pELH3(KOD3G8))；和其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各2个拷贝并在L链表达盒和H链表达盒中编码基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的个体(pELH4(KOD3G8))进行ELISA并绘制计算的抗体生成量。
图71是这样的图，其中绘制通过使用6孔板培养物上清进行ELISA计算的单克隆中各细胞株系的抗体生成量。关于以下各项：其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各1个拷贝的个体(pELH(KOD3G8))；其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各2个拷贝的个体(pELH3(KOD3G8))；和其中编码抗KOD抗体的H链表达盒和L链表达盒以及嘌呤霉素-抗性基因表达盒的各2个拷贝并在L链表达盒和H链表达盒中编码基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的个体(pELH4(KOD3G8))，在同一图上绘制关于生成量的最佳5个克隆。
图72是显示pEHγX载体图谱的图表。
图73是显示pELκX载体图谱的图表。
图74显示pELκHγ(KOD3G8)的构建。
图75是显示pcHγX载体图谱的图表。
图76显示pcLκHγ(KOD3G8)的构建。
图77是这样的图，其中使用多克隆培养物的上清对其中不含基因表达稳定元件且不对Pur-抗性基因添加mRNA去稳定序列的个体(pcLκHγ(KOD3G8))；和其中将基因表达稳定元件CHO5Δ3-3插入至表达盒的上游区域和下游区域二者中并向嘌呤霉素-抗性基因添加mRNA去稳定序列(N4序列)的个体(pELκHγ(KOD3G8))进行ELISA并绘制计算的抗体生成量。
实施本发明的最佳模式
本发明将在下文中详细解释。
为了蛋白的功能分析和也为了有用的蛋白的生成，已经广泛使用这样的方法，其中使用基因重组技术将目标蛋白基因转入细胞或，具体地动物细胞，由此使其作为重组蛋白表达。更具体地，已经频繁使用这样的方法，其中将目标蛋白基因插入至由质粒载体代表的载体中，然后将该载体引入细胞并然后借助于重组使目标蛋白基因整合到细胞基因组中，由此转化该细胞。
细胞的基因组存在于染色体上，而在染色体中，基因的表达受到组蛋白乙酰化，高度聚集(异染色质)等的控制，并且基因表达水平根据在向其中插入基因的染色体中的位置而明显不同。在其中使用载体转化细胞的方法中，不可能控制在向其中转入目标蛋白基因的细胞基因组中的位置并且，因此，目标蛋白基因在转化的细胞中的表达水平和，作为结果，目标蛋白的生成量根据细胞株系而明显不同。
还存在许多这样的情形，其中基因重组没有充分进行，以及目标蛋白基因未与细胞基因组整合。
在这样的情况下，存在常规进行的如下操作：预先将药物-抗性(药物选择标记)基因插入表达载体中，该载体然后转入细胞，将药物施用于培养基(药物选择)，选择其中成功转化的细胞并且，随后，从由此产生的细胞群中反复选择显示高表达的细胞株系。然而，在该方法中，需要很多劳动和时间，因为必需制备许多细胞株系并且还因为对于需要长期培养的细胞的选择操作反复进行。而且，由于在许多情形中，即使当以小量表达时，药物抗性基因显示出针对药物的抗性，所以活细胞中还存在其中在细胞基因组的低表达区整合药物抗性基因和目标蛋白基因且目标蛋白基因表达量很小的细胞株系，这导致更多的劳动和时间。
即使是在选择时显示充足表达的细胞，相当多的它们随着培养的持续进行而逐渐降低表达。这应该归因于这样的事实，即表达受到基因沉默的抑制。由于通常不可能控制目标蛋白基因向基因组的转入位置，所以预测通过基因沉默的影响降低表达水平非常困难。因此，已经认为必需减轻这样的位置效应，从而稳定维持高水平表达。
因此，为了解决那些问题，本发明使得通过使用药物选择获取表现出高表达水平的细胞成为可能并还使得无论细胞基因组中基因的转入位置通过基因表达稳定元件维持高水平基因表达成为可能。本发明在这样的观点中表现出非常显著的作用，即能够快速、容易和有效地获取其中目标蛋白生产率很高的细胞株系。
在本发明中，将mRNA去稳定序列用于常规药物抗性(药物选择标记)基因表达盒，由此极大地抑制药物抗性基因的表达量，以致只有其中在宿主细胞基因组中高表达区中整合药物抗性基因的转化细胞能够在药物选择后存活。由于目标蛋白基因整合在药物抗性基因的附近，所以存在这样的高度可能性，即在存活的细胞中，目标蛋白基因也整合在高表达区中。因此，根据本发明，借助于药物选择，从以下细胞(i)-(iii)中能够有效地仅选择以下(iii)的细胞(即其中成功基因重组并且，另外，药物抗性基因和目标蛋白基因整合在宿主细胞基因组的高表达区中的细胞)。因此，(i)：其中基因重组没有充分进行由此目标蛋白基因不整合在细胞基因组中的细胞；(ii)：其中尽管成功基因重组，但是药物抗性基因和目标蛋白基因整合在宿主细胞基因组的低表达区中的细胞；和(iii)：其中成功基因重组且，另外，药物抗性基因和目标蛋白基因整合在宿主细胞基因组的高表达区中的细胞。在常规选择方法中，尽管可能借助于药物选择从(i)-(iii)的细胞中选择(ii)和(iii)的细胞，但是不可能借助于药物选择从(ii)和(iii)的细胞中仅选择(iii)的细胞并且，因此，对由药物选择存活的转化细胞分别验证目标蛋白基因的表达水平，由此选择(iii)的高表达细胞。根据本发明的方法，现在可能仅借助于药物选择从(i)-(iii)的细胞中立即选择(iii)的高表达细胞并且，因此，所述方法是有效的且，作为结果，能够快速选择高表达细胞。
而且，根据本发明，使用基因表达稳定元件，从而防止在持续培养选择的细胞时基因表达水平的降低。根据本发明的基因表达稳定元件不仅有效用于稳定维持目标蛋白基因的表达而且，如果对于药物抗性基因可获得作用，则减小邻近染色体和调节元件对药物抗性基因表达的影响并帮助获得药物抗性基因固有的功能，由此实现与药物选择的协同作用。
根据本发明的第一方面，表达载体，其特征在于其具有包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因的表达盒、至少一个用于稳定基因表达的元件和目标蛋白基因的表达盒。
在本发明中，所述表达盒代表从启动子经由基因编码序列并且到终止子序列(多腺苷酸化信号)的基因表达组件。此外，它还可以包括内含子、间隔序列、翻译增强区等。因此，例如，在“药物选择标记基因表达盒”的情况下，它意味着上面提及的表达盒的基因编码序列是药物选择标记基因的编码序列。此外，在“目标蛋白基因表达盒”的情况下，它意味着上面提及的表达盒的基因编码序列是目标蛋白基因的编码序列。
(药物选择标记基因表达盒)
在本发明中使用的药物选择标记基因表达盒除了含有mRNA去稳定序列外，与常规的已知药物选择标记基因表达盒具有同样的组成。因此，首先说明所述mRNA去稳定序列。
本发明是基于以下发现：所述mRNA去稳定序列能够十分有效地减小所述药物抗性基因的表达。当其中安装有包含本发明的mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的表达载体被转入到所述宿主细胞时，药物选择后的存活细胞数或其集落与其中不包含mRNA去稳定序列的情况相比减小到1/10至1/100的程度。这大概归因于以下事实，即因为所述药物选择标记的mRNA变得不稳定并且所述药物选择标记的表达水平由于所述mRNA去稳定序列的存在而降低，所述细胞在所述药物选择下的存活变得困难，除非它们是这样的细胞，其中在所述宿主细胞的基因组中，所述表达盒被整合到其中转录活性高的高表达区。
术语“mRNA去稳定序列”是指具有降低从具有此序列的DNA转录的mRNA的细胞内半衰期功能的核苷酸序列，在自然界中，已经发现它存在于早期应答基因(early response gene)等中。
尽管在一些基因中所述mRNA去稳定序列存在于编码序列或存在于5’-UTR(非翻译区)，但是在很多情况下它存在于3’-UTR。富含AU的元件(ARE)、组蛋白mRNA 3’-端茎-环、铁应答元件(iron-responsive element)(IRE)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、长茎-环等，已知为存在于3’-UTR中的mRNA去稳定序列。其中，优选ARE作为本发明中所用的mRNA去稳定序列，因为ARE能够不断地使mRNA去稳定。
ARE是指mRNA中“富含AU的元件”或换言之，其中包含高比率的腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)的序列或区域。ARE也用于指定以上元件的DNA编码中的“富含AT的元件”或换言之，其中包含高比率的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的序列或区域。
ARE发现于细胞因子基因诸如造血细胞生长因子基因、生长因子基因、白细胞介素基因或干扰素中并且也发现于一些原癌基因中(非专利文件4)。在本发明的药物选择标记基因表达盒中，因为能够避免将不需要的限制酶识别序列插入到表达载体中，所以尽管实际上可以使用相当于这种基因中的ARE的核酸序列，但已知作为所述ARE中的基序序列的TATTTAT(非专利文件5)和TTATTTA(T/A)(T/A)(非专利文件6)等等的使用是非常方便的。
具有ARE的基因的实例包括用于造血细胞生长因子的粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，用于白细胞介素的白细胞介素-1β、2、3、4、6、8、10、11，用于干扰素的干扰素-α，以及用于原癌基因的c-fos、c-myc、c-jun、c-myb、Pim-1等。此外，很多基因诸如肿瘤坏死因子、细胞周期蛋白D1、环加氧酶、2型纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activatorinhibitor type 2)已知具有ARE并且不仅限于示例的基因。
关于能够在本发明的药物选择标记基因表达盒中使用的mRNA去稳定序列，例示以下各项。
具有ATTT或两次或多次的它的重复的一个基序序列。
具有ATTTA或两次或多次的它的重复的一个基序序列。
具有TATTTAT或两次或多次的它的重复的一个基序序列。
具有TTATTTA(T/A)(T/A)或两次或多次的它的重复的一个基序序列。此处，(T/A)是指T或A中的任一个。
这样的序列可以包含一个或多个碱基的置换/插入/缺失并且由自然变异诸如DNA复制错误或突变造成的那些和由人工突变的转移造成的那些是可以预期的。此外，包含1至大约100个碱基的间隔序列或连接序列可以包含在所述基序序列的重复之间。此外，包含所述基序序列的倒位的个体是可用的。
尽管所述基序序列的重复数目可以只是一次，但是当重复两次或更多次或更优选地四次或更多次时对mRNA的去稳化作用能够进一步加强由此选择效率能够显著增加。
尽管对于重复数目的上限没有具体的限制，考虑到所述载体结合到所述细胞中，所需要的是所述表达载体最高变成10至25kbp的长度。然而，随着重复数目的增加，对mRNA的去稳化作用趋于饱和并且，当所述重复数目高于一定水平时，不能预期进一步显著的作用。尽管将不确定上限，10次或更多的重复数目实际上是无意义的。
尽管对在本发明的药物选择标记基因表达盒中的启动子没有具体限制只要它是这样的启动子，即能够在动物细胞或具体地在哺乳动物细胞中表达的启动子，其实例包括来源于病毒诸如人或小鼠的巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子或人单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)启动子的启动子；来源于非病毒细胞基因诸如小鼠的磷酸甘油酯激酶1基因(PGK)启动子的启动子；以及不同来源的启动子的杂合物。此处，所述启动子不限于启动子的核心区而是它可以包括增强区。为了减弱所述药物选择标记的表达，具有低转录活性的那种是更优选的。作为具有低转录活性的启动子，可以使用突变型等的启动子或者Kozak序列可以为此被取代。此外，预期的一个实施方案是将mRNA去稳定序列的所述基序序列的重复数目弄小并且一起使用具有弱的转录活性的启动子。
关于用于使用本发明的药物选择标记表达盒的药物选择的药物，杀稻瘟素(blasticidin)、遗传霉素(Geneticin)(G418)、潮霉素(Hyg)、嘌呤霉素(Pur)可以是蛋白质合成抑制型的抗生素物质的典型。用于所述选择的其他药物的实例包括甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、MSX(甲硫氨酸亚砜亚胺(methionine sulphoximine))等。此外，至于在本发明的药物选择标记基因表达盒中的药物选择标记基因，有利地使用显示对通常用于药物选择的药物的抗性的基因。当蛋白质合成抑制型的抗生素物质用作药物时，优选地是使用对所述蛋白质合成抑制型的抗生素物质有抗性的基因。尽管对其没有具体的限制，但是其实例包括来源自Tn5的作为新霉素抗性基因(同样具有作为遗传霉素抗性基因的功能)的新霉素磷酸转移酶(氨基糖苷3’-磷酸转移酶)(Neo)、来源自大肠杆菌(Escherichia coli)的作为潮霉素抗性基因的潮霉素-B-磷酸转移酶(Hph；在实施例和附图中，它作为Hyg被提及)、来源自链霉菌(Streptomyces)的作为嘌呤霉素抗性基因的嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因(pac；在实施例和附图中，它作为Pur被提及)和来源自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的作为杀稻瘟素抗性基因的杀稻瘟素抗性基因(bsr)。其中，嘌呤霉素-N-乙酰转移酶、潮霉素-B-磷酸转移酶和新霉素磷酸转移酶优选的。嘌呤霉素-N-乙酰转移酶和潮霉素-B-磷酸转移酶是更优选的，而嘌呤霉素-N-乙酰转移酶是更优选的多。
至于在本发明的药物选择标记基因表达盒中的多腺苷酸化信号(终止子序列)，尽管他们是非限制性的，但是其实例包括来源自SV 40病毒的晚期polyA信号、来源自SV 40病毒的早期polyA信号、来源自HSV-tk的poly A信号、来源自牛生长因子基因的poly A信号和来源自兔β-珠蛋白基因的poly A信号。
尽管对在本发明的药物选择标记基因表达盒中的启动子、药物选择标记基因、mRNA去稳定序列和多腺苷酸化信号布置的次序没有具体的限制，但是只要所述药物选择标记基因的表达是可能的，通常启动子、药物选择标记基因、mRNA去稳定序列和多腺苷酸化信号以从所述上游侧到所述下游侧的次序布置。虽然不需要所述四种元件彼此直接相连但是，如果需要，他们可以在他们之间具有内含子、间隔序列、翻译增强区等。
(基因表达稳定元件)
本发明中的术语“基因表达稳定元件”是指解决了位置效应并且具有稳定所述基因表达功能的核酸区域。所述位置效应是这样的，即为了增加所述目标蛋白的生产率，所述目标基因表达盒受与其中已经插入有所述盒的宿主基因组中的位点接近的基因组的转录激活状态的影响。
至于具有稳定所述基因表达功能的核酸序列，可以有使用的绝缘子、支架/基质结合区(S/MAR)、基因座控制区(locus control region)(LCR)、常染色质开放元件(Ubiquitous chromatin opening element)(UCOE)等。
所述绝缘子的实例包括来源自鸡β-珠蛋白LCR的1.2kb DNase I超敏位点(cHS4)和来源自绿海胆的UR1。所述S/MAR的实例包括鸡溶菌酶5’MAR元件、人β-珠蛋白MAR元件和人干扰素βSAR元件。
本发明的表达载体具有至少一个基因表达稳定元件。当具有稳定所述基因表达功能的核酸序列像这样布置在所述目标蛋白表达盒的上游或下游区域或在两者时，稳定地维持所述基因表达并增加所述目标蛋白的生产率是可能的。
质粒载体通常用作用于将目标基因转到宿主细胞基因组中的基因构建体。所述基因表达稳定元件的大小优选地是尽可能的短，因为所述质粒载体的大小最长是10至25kbp。优选的大小是5kbp或更短并且更优选地是大约1kbp。
本发明优选的实施方案中的基因表达稳定元件是由本发明人从专利文件5中提及的CHO细胞DR 1000L-4N株系(CHO细胞-4N株系)中鉴定出的核酸分子。所述株系是通过这样的方式获得的端粒型的克隆细胞，即将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte microphage colonystimulating factor)(hGM-CSF)基因作为外源基因转入具有DHFR基因的表达载体，将所述载体转入其中缺乏DHFR基因的CHO细胞DG 44株系，将所述转化株系在其中向IMDM培养基(不包含核酸)添加了10％胎牛血清的培养基中培养以获得转化株，通过其中添加有IMDM培养基(不包含核酸)和10％经透析的胎牛血清的培养基进一步选择所得的转化株并且进一步在包含50nM或100nM甲氨蝶呤(MTX)并且直到通过提高MTX浓度获得10至100倍程度的所述转基因的拷贝数的增加不包含核酸的IMDM培养基中培养。
真核细胞的基因组分为两类染色质即常染色质和异染色质。着丝点和端粒的序列是构成型异染色质的主要部分。具体地，端粒由TTAGGG的重复序列和亚端粒区组成并且是具有异染色质显著构型的缺乏基因的区域(非专利文件7、8)。除了它对基因组稳定性的贡献以及他的保护性的作用外，作为已知为端粒位置效应现象的结果端粒也影响转化到相近位点的基因的表达(非专利文件9、10)。
然而，虽然DR 1000L-4N株系是端粒型的克隆细胞的事实，转化到此的外源基因不接受来自转化位点附近的异源染色体(heterogeneouschromosome)的失活影响但是在培养物中长周期地以稳定的方式维持hGM-CSF高的产生。这提示强有力地停止失活进行的边界元件存在于其中转化有外源基因的位点附近由此使所述基因的表达稳定。
本发明人已经在DR 1000L-4N株系中分析了在其中转化有外源基因的位点附近的序列并且结果他们发现由序列列表中的SEQ ID No：26中所示的大约91kbp的序列组成的DNA参与所述基因表达的稳定。
在本发明的表达载体中包含的基因表达稳定元件的长度优选地是短的。因此，为了缩小甚至在较小的尺寸也具有基因表达稳定作用的区域，本发明人已经进行了进一步研究。
为了进一步分析SEQ ID No：26中所示的大约91kbp的序列，已经通常使用这样的方法，其中通过鸟枪(shotgun)技术制备大约3kbp的片段文库并且依次测定所述每个片段。然而，在分析每个片段是否具有基因稳定作用中，需要长的时间用于所述细胞的转化和培养由此一次测定需要数周至数月的周期。因此，实施全部测定需要大量的时间和劳动力。
在这样的情况下，本发明人已经发现了方法其中，在SEQ ID No：26的序列中，通过在其中预期存在所述基因表达序列的边界元件的位点上施加压力来进行分析。结果，他们已经发现在由SEQ ID No：26组成的DNA中，42kbp、45kbp和91kbp附近的区域具有基因表达稳定功能。
当更精确地分析所述序列时，发现在所述序列中，以下四个区域相当于绝缘子结合蛋白质的结合序列基序CTCF：(i)由第41820个碱基至第41839个碱基显示的区域、(ii)由第41821个碱基至第41840个碱基显示的区域、(iii)由第45182个碱基至第45200个碱基显示的区域以及(iv)由第91094个碱基至第91113个碱基显示的区域。因此，那些至少包含所述四个区域中的任一个的区域的邻居具体地参与所述基因表达的稳定。
在根据本发明的实施方案中，以下(a)至(e)中的任一个或其组合能够作为基因表达稳定元件使用：
(a)由SEQ ID No：26中所示序列组成的DNA；
(b)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并至少包含SEQ IDNo：26中所示序列的第41820个碱基至第41839个碱基区域的序列的DNA；
(c)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并至少包含SEQ IDNo：26中所示序列的第41821个碱基至第41840个碱基区域的序列的DNA；
(d)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并至少包含SEQ IDNo：26中所示序列的第45182个碱基至第45200个碱基区域的序列的DNA；以及
(e)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并至少包含SEQ IDNo：26中所示序列的第91094个碱基至第91113个碱基区域的序列的DNA。
尽管那些元件分离自所述CHO基因组并被识别，预期与那些元件同源的元件也存在于其他哺乳动物细胞基因组中。因此，(f)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成的DNA，其中当其排列到邻近于宿主细胞中外源基因的表达盒时，能够增加或稳定源自包含在外源基因的表达盒中的外源基因的目标重组蛋白的表达，也可以作为基因表达稳定元件使用。通过本技术领域中的已知技术诸如种间杂交或PCR能够容易地分离并识别像这样的同源元件。
同样并且当然可能使用(g)在严格条件下与由与以上(a)-(f)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA，作为基因表达稳定元件。本发明的基因表达稳定元件包括那些(a)至(g)中的任何一个或他们的任何组合。此外，(h)由与以上(a)-(g)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA同样具有基因表达稳定功能并且能够作为基因表达稳定元件使用并且，因此，它也包含在本发明中。
尽管根据所用探针和标签方法是不同的，但严格条件是这样的条件，即例如，40至50℃在含有0.1％SDS的0.2×SSC中或55至65℃在含有0.1％SDS的2×SSC中。更严格的条件能够基于要结合的核酸的熔化温度(Tm值)来确定。此外，作为杂交后的漂洗(washing)条件，这样程度的条件，即“6×SSC、0.1％SDS以及比Tm值低大约15至30℃的温度”可以是典型地。作为更严格的漂洗条件，这样程度的条件，即“2×SSC、0.1％SDS以及比Tm值低大约5至15℃的温度”可以是典型地。作为更加严格的漂洗条件，这样程度的条件，即“1×SSC、0.1％SDS以及比Tm值低大约5至15℃的温度”可以是典型地。作为还要更加严格的漂洗条件，这样程度的条件，即“0.1×SSC和0.1％SDS”，可以是典型地。
在本发明的基因表达稳定元件的优选的实施方案中，以上(b)或(c)中的DNA是SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第46746个碱基的区域；或在严格条件下与由与SEQ ID No：26所示序列的第41601个碱基至第46746个碱基的序列互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的碱基序列区域。还包括与由这些区域组成的DNA互补的碱基序列。在所示基因表达稳定元件的更优选的实施方案中，以上(b)或(c)中的DNA是SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第42700个碱基的区域；在严格条件下与由与SEQ ID No：26所示序列的第41601个碱基至第42700个碱基的序列互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的碱基序列区域；或与包含这些区域的DNA互补的碱基序列。
在本技术领域，装配有多克隆位点的表达载体经常用于将多种目标蛋白基因有效的插入表达载体中的目的。当用于多克隆位点的限制酶的识别序列存在于所述基因表达稳定元件的序列中时，所述序列不能用于多克隆位点。因此，在不破坏基因表达稳定功能的情况下将限制酶识别序列从所述基因表达稳定元件的序列中缺失，由此现在可能使用所述序列用于所述多克隆位点。
在生物药物的制备中，近年具体要求的是抗体分子以及，为了所述抗体基因的克隆，优选的是使用其中在所述抗体基因中不存在作为多克隆位点的识别序列的限制酶。因为所述用于药物的抗体多数由IgG担任，所以本发明人分析了用于所述表达载体构建的碱基的以下基因的碱基序列：免疫球蛋白重链γ1基因(例如，GeneBank Acc.No.AK057754)、γ2基因(例如，GeneBank Acc.No.BC062335)、γ3基因(例如，GeneBank Acc.No.BX538126)、γ4基因(例如，GeneBank Acc.No.BX640824)、免疫球蛋白轻链κ基因(例如，GeneBankAcc.No.AY894991)、λ1基因(例如，GeneBankAcc.No.BC007782)、λ2基因(例如，GeneBank Acc.No.X57809)和pUC18载体(除多克隆位点外)。作为在任何基因序列中不具有识别序列并且形成突出端(protruding end)的限制酶，限制酶诸如AscI、BsiWI、BssHII、BstBI(Csp45I、NspV)、CpoI、CspI(RsrII)、FseI、HindIII、MfeI、MluI、NotI、PacI、PaeR71、SgrA1、SphI、XbaI和XhoI是典型地。此外，BclI、BglII、BlpI、EcoRI、SalI和SpeI作为酶切一种或多种基因的酶是典型的但是能够相对容易地用于基因重组。
另一方面，在形成平端(blunt end)的限制酶的情况下，如果所述目标蛋白基因的末端是平的它能够连接而不管所述序列并且，因此，作为包含在所述多克隆位点中的识别序列它是优选的。产生像这样的平端的限制酶的实例包括EcoR105I(SnaBI)、EcoRV、NruI、PsiI、SmaI和SrfI。
因此，本发明中的基因表达稳定元件的其他优选的实施方案是具有基因表达稳定功能并且被修饰以便使所述识别序列缺失至少一个选自下组的限制酶的序列：AscI、BsiWI、BssHII、BstBI(或被叫做Csp45I或NspV)、CpoI、CspI(或被叫做RsrII)、FseI、HindIII、MfeI、MluI、NotI、PacI、PaeR71、SgrA1、SphI、XbaI、XhoI、BclI、BglII、BlpI、EcoRI、SalI、SpeI、EcoR105I  (或被叫做SnaBI)、EcoRV、NruI、PsiI、SmaI和SrfI。
为了使本发明的基因表达稳定元件获得其表达稳定作用的目的，必须将所述元件排列到邻近所述宿主细胞基因组中的外源基因表达盒的引入(introducing)位点的位置。尽管对本发明中的术语“邻近”没有具体的限制，它优选地是指本发明的基因表达稳定元件和外源基因表达盒之间的距离是5000bp或更短，并且更优选地是500bp或更短。
可能通过这种方式来获得这样邻近的排列，即通过电穿孔或转染将包含本发明元件的核酸序列片段和包含外源基因表达盒的核酸序列片段的混合物转入宿主细胞中并且选择显示所述外源基因的高表达水平的宿主细胞克隆。然而，为了确保获得所述邻近排列，需要的是事先准备包含本发明的基因表达稳定元件的外源基因表达载体和与它邻近排列的外源基因表达盒并且通过此载体转化所述宿主细胞。
(所述目标蛋白基因的表达盒)
在本发明中所述目标蛋白基因的表达盒包括启动子、基因编码序列和终止子序列(多腺苷酸化信号)。它可以进一步包括内含子、间隔序列和翻译增强区。关于所述目标蛋白基因的表达启动子，它优选地具有尽可能高的转录活性并且其实例包括来源自病毒诸如人的巨细胞病毒(CMV)启动子或小鼠或猴病毒40(SV40)启动子的启动子；来源自非病毒细胞基因诸如来自人、小鼠或CHO的延伸因子1alpha(EF1α)、泛素基因或β-肌动蛋白基因的启动子；以及其中来源不同的启动子/增强子的杂合体诸如CAG启动子。
在本发明中，给予所述目标蛋白基因的表达盒独立于所述药物选择标记表达盒的形式。在真核细胞的情况中，尽管有这样的方式，其中进行其中通过内部核糖体进入位点(IRES)将药物选择标记基因连接到所述目标蛋白基因的多顺反子表达，但是因为所述目标蛋白基因和所述药物选择标记基因的编码序列被合成为一条mRNA，所以当将以上mRNA去稳定序列插入时所述目标蛋白基因的mRNA减少于是不能够制备高表达的细胞。因此，在本发明中优选的是独立于药物选择标记表达盒地排列所述目标蛋白基因表达盒。尽管所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记表达盒可以在不同载体的形式中使用，更优选地所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记表达盒排列在同样的载体上。
在所述目标蛋白基因表达盒中，包含多个限制酶识别序列的多克隆位点能够排列在所述蛋白质基因的编码序列的位置。在转移编码序列或外源基因的cDNA时的克隆操作中那是简单和方便的并且是优选的。
另一个实施方案是其中所述目标蛋白是抗体重链和/或轻链的多肽的目标蛋白基因表达盒。在此情况下，所述目标蛋白表达盒可以排列在多个中或者可以是其中通过IRES连接多个多肽基因的多顺反子表达盒。
在抗体的制备中可采用的本发明的具体实施方案是这样的表达载体，其特征在于具有包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒、至少一个基因表达稳定元件以及包含抗体轻链的恒定区(constant region)基因的抗体基因表达盒和/或包含抗体重链的恒定区基因的抗体基因表达盒。
本发明中的抗体基因表达盒是指用于表达所述抗体分子的轻链多肽基因或重链多肽基因的表达盒或用于表达所述抗体分子的表达盒。术语“包含恒定区基因”代表所述抗体的重链或轻链的恒定区的基因作为所述表达盒的基因编码序列插入。当所需要的抗体的可变区的基因插入到其中所述表达盒的控制支配的位置时，能够表达完整的抗体分子。
抗体由轻链和重链组成并且，此外，各轻链和重链由恒定区(也叫做“C区”或“恒定部分”)和可变区(也叫做“V区”或“可变部分”)组成。轻链的恒定区具有κ和λ两种类型而重链的恒定区被分类为分别相当于免疫球蛋白的分类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的类型α、δ、ε、γ和μ。此外，将γ进一步分类，例如，分类成相当于IgG的亚分类的γ1、γ2、γ3和γ4。尽管对插入的恒定区的类型没有具体的限制，但考虑到IgG的制备优选地轻链的恒定区是κ或λ而重链的恒定区是γ，并且更优选地重链的恒定区是γ1。编码前导肽基因的序列能够插入到所述抗体基因表达盒中这样的区域，所述区域是启动子的下游区域和所述抗体的恒定区基因的上游区域。前导肽是包含15-20个氨基酸的疏水肽并且为这样的目的而工作，即使所述轻链或重链在翻译和合成后的即刻穿过粗面内质网膜并且，在那时，它被切去。
所需要的是将抗体的可变区基因插入到抗体基因表达盒中的恒定区基因的上游区域中并且，当前导肽基因插入所述抗体基因表达盒中时，需要将它插入所述前导肽基因的下游区域。当所述表达载体不具有前导肽时，优选地将前导肽与所述可变区基因一起插入。尽管对所述启动子和所述可变区基因之间的距离以及所述可变区基因和所述恒定区基因之间的距离没有限制，但是所述启动子和所述可变区基因之间的距离优选地是1.2kbp以下，并且更优选地是500bp以下。关于所述可变区基因和所述恒定区基因，优选地他们正好邻近。
(表达载体)
在本发明中，表达载体是在基因工程中使用的载体。所述表达载体可以是质粒载体但是不限于此，而病毒载体、黏粒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和其他非质粒载体也可以使用。
本发明中表达载体的实施方案是这样的表达载体，其中基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记基因表达盒的上游或下游区域上。优选地，它是这样的表达载体，其中基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记基因表达盒的上游区域上。在那种情况下，尽管所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记基因表达盒中的任一个可以在所述上游区域中，但优选地所述目标蛋白基因表达盒排列在所述上游区域中。
本发明中的另一个实施方案是这样的载体，其中基因稳定元件排列在所述药物选择标记基因表达盒和所述目标蛋白基因表达盒之间。至于具体实施方案，尽管可以考虑以下实施方案中的任一个：其中所述基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒的下游区域和所述药物选择标记基因表达盒的上游区域的实施方案，以及其中基因表达稳定元件排列在所述药物选择标记基因表达盒的下游区域和所述目标蛋白基因表达盒的上游区域的实施方案，但是优选的一个是这样的载体，其中所述基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒的下游区域和所述药物选择标记基因表达盒的上游区域。
本发明中表达载体的优选实施方案是这样的载体，其中基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记基因表达盒的上游区域和下游区域，以便将那些表达盒夹在中间。尽管所述目标蛋白基因表达盒和所述药物选择标记基因表达盒的次序是不受限制的，但是优选地所述目标蛋白基因表达盒排列在所述上游区域。也可能所述基因表达稳定元件分别排列在所述目标蛋白基因表达盒的上游区域和下游区域以及所述药物选择标记基因表达盒的上游区域和下游区域。
本发明的另一个优选的实施方案是这样的载体，其中所述基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒的上游区域和下游区域并且，在其下游区域，所述药物选择标记基因表达盒进一步排列。
还可能实施这样的表达载体，其中所述目标蛋白基因表达盒排列在所述药物选择标记基因表达盒的下游区域，并且所述基因表达稳定元件排列在所述药物选择标记基因表达盒和所述目标蛋白基因表达盒之间并且也在所述目标蛋白基因表达盒的下游区域。
所述基因表达稳定元件和所述药物选择标记基因表达盒之间的区域或所述目标蛋白基因表达稳定元件可以是邻近的，或者可以在其间插入间隔序列等。
当以上药物选择标记基因表达盒和目标基因蛋白表达盒排列在同样的载体上时，他们可以是邻近的或者在其间插入间隔序列。尽管所述目标蛋白基因表达盒排列在所述药物选择标记基因表达盒的上游区域和下游区域中的任一个中，但是在他们以邻近方式插入的情况下，优选的是其中所述目标蛋白基因表达盒在所述上游区域中的排列。还可能的是将用于抑制邻近表达盒的转录干扰的绝缘子序列作为间隔序列插入。
两个或更多个药物选择标记基因表达盒可以包含在一个载体中。在那种情况下，可以选择同样的药物选择标记或者可以选择彼此不同的药物选择标记。各个药物选择标记可以邻近地排列或可以分开地排列。
当所述目标蛋白包括多个多肽诸如在抗体的重链和轻链的情况中时，所述目标蛋白基因表达盒可以排列在多个中或者通过IRES连接多个多肽基因以形成多顺反子表达盒的形式。
也可能多个多肽表达盒中的每个插入到彼此不同的载体中，并且然后各载体被转入宿主细胞中以制备转化细胞，于是能够制备目标蛋白。在那种情况下，药物选择标记基因表达盒能够排列到各载体并且，尽管同样的药物选择标记可以用于每个，但为了能够有效地制备其中所有多肽显示高效率的细胞，有利的是使用不同的药物选择标记。
在其中所述抗体的重链多肽基因和轻链多肽基因插入到不同载体以表达由此制备抗体的情况，和其中所述抗体的重链多肽基因和轻链多肽基因插入到相同载体以表达由此制备抗体的情况之间的比较中，就所述抗体的生产率来说所述两者之间没有差异。因此，可能在任一个所述方法中获得显示高生产率的细胞株系但是，当通过将所述抗体的重链多肽基因和轻链多肽基因表达插入到同样载体中来进行表达时，结果是使用在同样载体上的一种药物抗性基因并且，因此，能够减小在转基因数目中的差异，所述抗体的重链多肽和轻链多肽的制备得到很好的平衡，并且当抗体由两套重链和轻链两个多肽组成时稳定了所述生产率，由此这是优选的。
本发明中的表达载体的一个具体实施方案是这样的表达载体，所述表达载体的特征在于具有包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒，三个或更多个基因表达稳定元件，以及两个或更多个目标蛋白基因表达盒。
在那种情况下，优选地，在所述三个或更多个基因表达稳定元件中，至少一个排列在任何所述两个或更多个目标蛋白基因表达盒之间。因此，但存在两个目标蛋白基因表达盒时，所述基因表达稳定元件排列在那些表达盒之间。当有三个目标蛋白基因表达盒时，所述元件排列在第一个和第二个目标蛋白基因表达盒之间，在第二个和第三个目标蛋白基因表达盒之间或在所述两者之间。当有四个或更多个目标蛋白基因表达盒时也同样如此。
在其中所述表达载体具有三个或更多个基因表达稳定元件的本发明的这个实施方案中，在制备表达由两个或更多个多肽诸如免疫球蛋白组成的蛋白质的表达载体的情况下，所述基因表达稳定元件排列在所述目标蛋白基因表达盒之间，由此可能获得对基因沉默的进一步抑制效果。结果，能够获得其中由于协同作用所述目标蛋白的产量显著增加的细胞株系。
本发明的表达载体的一个其他的具体实施方案是这样的表达载体，所述表达载体包含两个或更多个组件，在所述两个或更多个组件中进行排列以给出这样的位置：[(基因表达稳定元件)-(目标蛋白基因表达盒)n-(包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒)](其中n是1-4中的整数)。
上文中，(目标蛋白基因表达盒)n是指n个数目的所述(目标蛋白基因表达盒)连续排列，并且他们之间没有基因表达稳定元件或包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒排列。对于(目标蛋白基因表达盒)m、(目标蛋白基因表达盒)p和(目标蛋白基因表达盒)q也是同样。
另一个其他的具体实施方案是这样的表达载体，所述表达载体包含两个或更多个组件，在所述两个或更多个组件中进行排列以给出这样的位置：[(基因表达稳定元件)-(目标蛋白基因表达盒)m-(基因表达稳定元件)-(目标蛋白基因表达盒)p-(包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒)](其中m是1-4中的整数，并且p是1-4中的整数)。
还是本发明的另一个其他的具体实施方案是这样的表达载体，所述表达载体包含两个或更多个组件，在所述两个或更多个组件中进行排列以给出这样的位置：[(基因表达稳定元件)-(目标蛋白基因表达盒)q(其中q是1-4中的整数)，而包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒排列在他们的下游。
在本发明的那些实施方案中，无意使所述表达载体不包含除那些组件外的组件元件。例如，除那些外，也可能基因表达稳定元件也排列到包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的下游区域。
此外，在那些实施方案中当两个或更多个目标蛋白基因表达盒连续排列时，至少一个基因表达稳定元件可以另外地排列在任何所述目标蛋白基因表达盒之间。因此，如果两个或更多个目标蛋白基因表达盒连续排列，所述基因表达稳定元件能够排列在所述表达盒之间。如果三个目标蛋白基因表达盒连续排列，它可以排列在第一个和第二个目标蛋白基因表达盒之间或在第二个和第三个目标蛋白基因表达盒之间或可以排列在两者之间。当有四个目标蛋白基因表达盒时，所述排列是同样的。
因为在那些其中排列(串联地(concatemerized))多个所述组成元件的实施方案中的本发明的表达载体装配有多个目标蛋白基因表达盒，所以所述目标蛋白基因表达盒的多个拷贝能够同时插入到所述细胞基因组上并且能够预期蛋白质表达水平的增加。此外，在包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的情况中，以及在基因表达稳定元件的情况中，因为多个拷贝插入到所述细胞基因组中，所以产生另外的归因于其协同作用的对形成所述高生产性细胞株系的很大促进。
根据本发明的第二方面，提供有转化细胞，所述转化细胞的特征在于通过由根据本发明的第一方面的表达载体转化所述宿主细胞而获得。
本发明的转化细胞中的宿主细胞的实例包括小鼠骨髓瘤细胞(NSO)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人纤维肉瘤细胞(HT1080)和来源自除通常用于制备重组蛋白质的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)外的哺乳动物COS细胞。然而，它们是非限制性的，而来源自动物诸如人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、牛、，马、羊、猴或猪的细胞也广泛地成为转移的目标。此外，它还能够应用于使用细菌细胞诸如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等的蛋白质生产系统。
通常，在生物药物的工业生产中例如，为排除有害成分诸如病毒的污染，已经要求在不含动物成分的培养基中培养所制备的细胞或，更优选地，在其中确知化学组成的培养基中培养所制备的细胞。为此目的，已经据说是必要的，在高生产性细胞在通常使用的包含胎牛血清的培养基等中筛选后，使所述细胞在大约一至两个月期间适应于不含动物成分的培养基或化学成分确知培养基(无血清适应)。然而，也可以有这样的情况，其中曾经获得的高生产性细胞不能很好的适应。因此，当对预先经历了无血清适应的细胞实施基因转移时，能够通过排除无血清适应缩短用于形成生产细胞的时间并且那是十分有效的。为了完成如这样的问题，用于本发明的宿主细胞进一步包括CHO细胞等中已经经历了无血清适应的细胞。
如果由本领域技术人员来进行，可以合适地选择用于转化宿主细胞的方法并且其实例包括脂质体转染(1ipofection)法、磷酸钙法、电穿孔法、DEAE葡聚糖法和微注射(microinjection)。
根据本发明的第三方面，提供有用于选择高水平表达所述目标蛋白基因细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括使根据本发明的第二方面的转化细胞经历药物选择的步骤。同样地，根据本发明的第四方面，提供有细胞群，其特征在于，它由根据本发明的第二方面的转化细胞组成并且稳定地高水平表达所述目标蛋白基因。
根据药物选择标记基因表达盒中的药物选择标记基因的类型来确定用于所述药物选择的药物。关于所用药物的浓度，尽管高表达细胞能够浓缩到通常使用的浓度范围内，但高一些的浓度是优选的。最优浓度根据宿主细胞和所用培养基的类型而不同。用于确定浓度的方法已经为本领域技术人员所知并且能够合适地确定。例如，当用作工业生产细胞的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在包含10％胎牛血清的Ham’s F12培养基中培养并且使用嘌呤霉素抗性基因表达盒时，嘌呤霉素的浓度不低于5μg/ml，更优选地不低于7.5μg/ml并且，还要更优选地，不低于10μg/ml。当在同样的培养条件下使用潮霉素抗性基因表达盒时，潮霉素B的浓度不低于200μg/ml，更优选地不低于600μg/ml，而更加优选地不低于800μg/ml。当在同样的培养条件下使用新霉素抗性基因表达盒时，G 418的浓度优选地不低于400μg/ml，更优选地不低于800μg/ml，而更加优选地不低于1,000μg/ml。
在本发明的选择方法中，当与经历了使用不含有mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的常规药物选择的细胞群相比时，高水平表达所述目标蛋白基因的细胞的比率变得显著地高。因此，到目前为止，已经重复进行了从药物选择后的大量样品中选择高水平表达所述目标蛋白基因的细胞株系的操作。然而，根据本发明，仅通过包括所述药物选择标记的mRNA去稳定的药物选择就能够大量减少用于所述选择的候选样品数目。当使用本发明的选择方法时，所述目标蛋白的产量在细胞群(多克隆)甚至在所述药物选择后存活的状态下显著提高并且，当从这样的细胞群中分离细胞并随后培养时，能够容易地获得显示高表达的细胞株系(单克隆)。在本发明的实施方案的实施例中，将其中插入本发明的药物选择标记基因表达盒的载体转移到4.0×105个细胞中，然后从经历所述药物选择而产生的细胞群中随机选择100个细胞株系，并且检查各细胞株系的表达水平，由此能够容易地获得所述目标蛋白的高表达株系。
能够通过报告基因的表达水平来检查所述细胞的表达水平而其实例是将包含荧光蛋白质基因诸如SNAP26m基因(由Covalys制造)或GFP基因(绿色荧光蛋白质)的表达盒转入本发明的表达载体中，并且使用流式细胞仪诸如FACS(荧光激活细胞分类器)来分析荧光强度由此能够进行检查。另一个实例是将包含荧光素酶基因的表达盒转入本发明的表达载体中，然后将D-荧光素加入细胞裂解液中并通过发光计(luminometer)来测量发光量由此能够进行检查。还可能通过使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、酶免疫测定(EIA)等而不使用报告基因来检查所述目标蛋白诸如抗体的表达。
根据本发明，不仅能够显著缩短用于所述细胞选择的步骤和时间，而且显示高表达的细胞比率还升高了，由此能够有效地获得高水平表达所述目标蛋白基因的细胞并且在短的时间内，与现有技术相比，获得非常显著的效果。
例如，当通过FACS Calibur(由Becton，Dickinson and Company制备)在FL 1的荧光强度下来测量SNAP26m的表达水平时，所产生的本发明中的效果是，当与通过使用不包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒获得的细胞相比时，其中FL1是200或更多或1,000或更多的细胞的比率高1.1倍或更高或，在很多情况下，高1.5至2倍。此外，观察到这样的趋势，即其中FL1是1,000或更多的细胞的比率的增加率比其中FL1是200或更多的细胞的比率的增加率更高，并且它支持了这样的作用，即本发明选择的细胞群比通过使用不包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒获得的细胞显示更高的表达。
此外，在由具有根据本发明的基因稳定元件和mRNA去稳定序列的表达载体转化的细胞中，显示高生产率的细胞的比率被改进为，当与使用既不具有基因稳定元件也不具有mRNA去稳定序列的表达载体的情况相比时的7至8倍的程度。在由只具有基因表达稳定元件的表达载体转化的细胞中，注意到极好的效果，其中显示高生产率的细胞的比率增加到大约两倍的程度但是，在本发明中，由于所述mRNA去稳定序列和所述基因表达稳定元件的协同作用而获得极显著的效果。
根据本发明的第五方面，提供用于制备蛋白质的方法，所述方法的特征在于使用根据本发明的第二方面的转化细胞。
在实施方案中，制备的蛋白质是抗体。在那种情况下，所述抗体的重链多肽基因和轻链多肽基因可以插入到同样的载体(单载体)中或它们中的每个可以插入到不同的载体中从而形成两个构建体。
已经清楚的是，在哺乳动物的抗体中，有包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的五种分类。在多种人类疾病的诊断、预防和治疗中，鉴于功能性质诸如在血液中的半衰期长、多种效应器功能可用等，人IgG类的抗体已经最多地被使用。能够使用蛋白质A柱(protein A column)从所述转化细胞的培养物的上清中纯化抗体。此外，还可能使用已经通常用于蛋白质纯化的纯化方法。例如，组合地进行凝胶过滤、离子交换层析、超滤等由此能够进行纯化。通过二维电泳等能够测量纯化的人源化抗体H链或L链的分子量或抗体分子整体的分子量。
由本发明方法制备的抗体能够用作药物。尽管如这样的药物能够单独地作为治疗药剂给药，但通常优选的是将它作为通过将所述药物与一种或多种药用载体混合，并且随后经历药物制备技术领域中已知的任何方法而制备的药物制剂来提供。
关于给药途径，优选地使用对于所述治疗最有效的那种并且其实例包括口服给药和肠胃外给药诸如口内给药、气道内给药、直肠给药、皮下给药、肌肉内给药或静脉内给药。在抗体制剂的情况下，静脉内给药是优选的典型。剂型的实例包括喷雾、胶囊、片剂、粒剂、糖浆、乳状液、栓剂、注射剂、膏剂和带剂(tape)等。
适合口服给药的制剂的实例包括乳状液、糖浆、胶囊、片剂、稀释粉末和粒剂。液体制剂诸如乳状液或糖浆能够通过使用添加剂诸如水、糖类(例如，蔗糖、山梨糖醇和果糖)、乙二醇(例如，聚乙二醇和丙二醇)、油(例如，芝麻油、橄榄油和大豆油)、杀菌剂(例如，P-羟基苯甲酸甲酯)和香料(例如，草莓口味或薄荷)来制备。胶囊、片剂、稀释粉末、粒剂等能够使用添加剂诸如赋形剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇)、崩解剂(例如，淀粉和藻酸钠)、润滑剂(例如，硬脂酸镁和滑石)、结合剂(例如，聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶)、表面活性剂(例如，脂肪酸酯)或可塑剂(例如，甘油)来制备。
适合肠胃外给药的制剂的实例包括注射剂、栓剂和喷雾。注射剂能够使用包括盐溶液、葡萄糖溶液或其混合物的载体等来制备。还可能通过常规方法使人源化抗体经历冷冻干燥并且随后向其中添加氯化钠来制备粉状注射制剂。使用载体诸如可可脂(cacao butter)、氢化脂肪酸或羧酸来制备栓剂。喷雾由所述化合物本身来制备或使用不刺激待给药者的嘴部和气道粘膜并且使所述混合物分散成精细颗粒以便使其容易吸收的载体等来制备。
所述载体的具体实例包括乳糖和甘油。根据所述化合物的性质和所用载体的性质，可能制备制剂诸如气溶胶或干粉。在这种肠胃外制剂中甚至也可能添加这种化合物，所述化合物是典型的用于口服制剂的添加剂。
在另一个实施方案中，所制备的蛋白质是疫苗。
至于疫苗，由病原体表位的氨基酸序列组成的蛋白质能够用作疫苗。还可能不仅制备所有的病毒体的组成蛋白质而且还制备衣壳蛋白质等并且将它用作疫苗。
能够将疫苗制备成用于任何途径给药的制剂。其实例包括用于粘膜类型的给药诸如经口的途径、鼻内途径、气道内途径、阴道途径或直肠途径的疫苗制剂以及用于非粘膜途径的给药诸如皮下给药、静脉内给药或肌肉内给药的疫苗制剂。
根据本发明的第六方面，提供有制备氨基酸的方法，所述方法的特征在于使用根据本发明的第二方面的转化细胞。同样，根据本发明的第七方面，提供有制备核酸的方法，所述方法的特征在于使用根据本发明的第二方面的转化细胞。
能够以这样的方式进行氨基酸的制备，即首先，在转化细胞中制备多肽并且然后水解所述多肽。氨基酸的制备也通过制备对于转化细胞中的氨基酸的体外合成必要的酶等来进行。核苷酸的制备也能够通过制备对于转化细胞中的核苷酸的体外合成必要的酶等来进行。
实施例
下文中，将例示实施例以致使本发明的作用更清楚。
实施例1
mRNA去稳定序列在嘌呤霉素抗性基因中的作用
(1)pBS-CMV-SNAPm-Pur和pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4的构建
根据图1中所示的方案，构建质粒pBS-CMV-SNAPm2。因此，首先，使用限制酶EcoRI和NotI，从其中CMV启动子(SEQ ID No：1)被转移到Emerald Luc载体(pELuc-测试)(由Toyobo制造)的限制酶ClaI和EcoRI位点的pELuc-CMV质粒，将Emerald Luc(Eluc)基因切下。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：2和3的PCR，从SNAPm表达质粒pSNAPm(由Covalys制造)扩增SNAP26m基因，并且将其转移到pELuc-CMV质粒的限制酶EcoRI和NotI的位点，从而构建pSNAP26m-CMV。之后，通过使用引物SEQ ID No：4和5的PCR从pSNAP26m-CMV扩增CMV启动子/SNAP26m/SV40polyA，并且通过部分消化将其转移到质粒pBluescript II KS(-)(由Stratagene制造)的限制酶ClaI和BamHI的位点，从而构建质粒pBS-CMV-SNAPm2。
之后，根据图2中所示的方案，通过使用引物SEQ ID No：6和7以及KOD-Plus突变试剂盒(由Toyobo制造)的反向PCR，将ARE序列基序TTATTTATT的四次重复序列(N4)插入到pPUR(由Clontech制造)的嘌呤霉素抗性基因的编码序列的3’端中，从而构建pPUR.N4。
然后，通过使用引物SEQ ID No：8和9、KOD-Plus-ver.2(由Toyobo制造)以及pPUR和pPUR.N4作为模板的PCR，来扩增SV40启动子-Pur-SV40polyA和SV40启动子-Pur.N4-SV40polyA的药物表达盒片段。使用限制酶BamHI和SacI分别部分消化pBS-CMV-SNAPm2和以上扩增的片段中的每个，并且彼此相连由此构建pBS-CMV-SNAPm-Pur和pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4(图3)。
实施例2
(2)将pBS-CMV-SNAPm-Pur和pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转移到细胞(1) 中
将CHO-K1细胞(Riken Bioresource Center(Riken生物资源中心)，No.RCB0285)调整至1×105细胞/ml，在前一天将其各2ml接种到12孔板中并且培养一夜，从而准备用于转染的CHO-K1细胞。在那时，将其中添加有10％胎牛血清的Ham’s F12培养基(由Nissui Seiyaku制造)作为培养基使用。
以这样的方式进行转染，即用100μl Opti-MEM I低血清培养基(由GIBCO制造)稀释3μl GeneJuice转染试剂(由Merck制造)，将103μl此稀释的液体作为质粒添加到1μg pBS-CMV-SNAPm-Pur或pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4中，并且随后允许其静置10分钟并将所述混合物添加到以上CHO-K1细胞中，并且随后培养24小时。第二天，将所述培养基移去并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l-EDTA溶液(由Nakarai Tesk制造)处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘中并在补充有10％FBS和6μg/ml嘌呤霉素(由InvivoGen制造)的Ham’s F12培养基中经历三周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成三周的选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散细胞，并且按每孔2×105个细胞来接种12孔板，在第二天将2μM SNAP-Cell-505(由Covalys制造)添加到0.5mlHam’s F12培养基中，并且在37℃进行60分钟培养。之后，用Ham’s F12培养基漂洗以上的三次并且，与更换的培养基一起，进行三次10分钟的培养，从而移去未反应的荧光染料。用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理所述细胞使其分散，使其悬浮在D-PBS(-)(由Nakarai Tesk制造)中并且使用流式细胞仪BD FACSCalibur(由Becton，Dickinson andCompany制造)来分析SNAP26m的表达强度。
图4显示在转染pB S-CMV-SNAPm-Pur或pB S-CMV-SNAPm-Pur.N4和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。横坐标显示荧光强度(FL1)而纵坐标显示细胞计数。图5显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，在由其中插入有mRNA去稳定因子N4的pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转化的细胞群中，在所述药物选择后显示SNAPm的高表达的细胞显著富集。
实施例3
mRNA去稳定序列在细胞株系中的嘌呤霉素抗性基因中的作用
(1)将pBS-CMV-SNAPm-Pur和pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转移到细胞(2) 中
之后，通过如在实施例2中的同样方式进行基因转移，并且在补充有10％FBS和9μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中进行两周的选择性培养。从由此形成的克隆，在显微镜下使用移液管的前端刮取48个pBS-CMV-SNAPm-Pur的克隆和20个pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4的克隆，并接种到12孔板上。通过如在实施例2中的同样方式，对其中注意生长的以上的36个克隆和10个克隆使用SNAP-细胞-505来进行标记处理，并且随后进行FACS分析。
图6显示药物选择后的细胞的亮视野图。结果，提示与pBS-CMV-SNAPm-Pur相比，pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4在活细胞数和集落数上显示显著的减少并且选择作用高。
图7显示对其中峰值强度大于1000显示尤其高的SNAPm表达的pBS-CMV-SNAPm-Pur转化细胞克隆的FACS分析结果。图8显示对其中峰值强度大于1000显示尤其高的SNAPm表达的pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4转化细胞克隆的FACS分析结果。结果，在pBS-CMV-SNAPm-Pur中36个克隆中只注意到一个高表达克隆(2.8％)。然而，在pBS-CMV-SNAPm-Pur.N4的情况中，尽管获得的克隆数目小，但是确认SNAPm高表达克隆的击中比率高达40％(10个克隆中有4个)显示选择作用非常高。此外，从所述结果确认，如在实施例2中所注意的，在以下事实之间具有相关性：由所述药物选择后的细胞群的FACS分析显示的高表达细胞的比率的升高和高表达克隆的有效获得。因此，在其后的分析中，所述作用的确认由对所述细胞群的FACS分析来进行。
实施例4
mRNA去稳定序列在嘌呤霉素抗性基因中的作用
(1)pEF1α-SNAP26m-Pur.N4和pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2的构建
然后构建质粒，从而研究当所述目标基因表达盒的启动子被EF1α启动子代替时，是否也获得如上的同样作用。在此实验中，使用根据在图9中所示的方案构建的质粒pEF1α-KOD3G8HC-RE2。因此，首先，通过反向PCR使用引物SEQ ID No：10和11、KOD-Plus突变试剂盒，和其中抗KOD抗体的重链被插入到其中用EF-1α启动子代替CMV启动子作为模板的pCI-neo质粒(由Promega制造)的限制酶XbaI-NotI的位点的pEF1α-KOD3G8HC质粒，来构建其中限制酶SalI和NheI的位点被添加到表达盒的上游区域的pEF1α-KOD3G8HC-RE。至于所述抗KOD抗体的重链，使用制备自产生对来源自Thermococcus kodakaraensis KOD1株系的DNA聚合酶特异的抗体的小鼠杂交瘤细胞系3G8(保藏号：FERMBP-6056；可从International Patent Organism Depositary(国际专利生物体保藏所)，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(国立高等工业科学和技术研究所)获得)的抗体的重链。通过反向PCR使用引物SEQ ID No：12和13、KOD-Plus突变试剂盒以及本质粒作为模板，将限制酶BsiWI和XhoI的位点添加到所述表达盒的下游区域，从而进一步构建质粒pEF1α-KOD3G8HC-RE2。
使用此pEF1α-KOD3G8HC-RE2并且，根据图10中所示的方案，构建质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N4和pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2。因此，使用限制酶EcoRI和NotI，从质粒pEF1α-KOD3G8HC-RE2切下所述抗KOD抗体的重链基因。另一方面，通过PCR使用引物SEQ ID No：2和3从SNAPm表达质粒pSNAPm扩增SNAP26m基因，并且将其转入pEF1α-KOD3G8HC-RE2质粒的限制酶EcoRI和NotI的位点，从而构建pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2。使用限制酶AflII和BstBI从此质粒切下新霉素抗性基因。另一方面，通过PCR使用引物SEQ ID No：14和15从pPUR.N4扩增其中下游区域添加有N4序列的嘌呤霉素抗性基因，并且将其转移到pEF1α-SNAP26m-RE2质粒的限制酶AflII和BstBI的位点，从而构建pEF1α-SNAP26m-Pur.N4。之后，使用此质粒作为模板并且进行使用KOD-Plus突变试剂盒并且使用引物SEQ ID No：16和17的反向PCR，从而构建其中缺失了嘌呤霉素抗性基因的下游区域中的N4序列的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2。
实施例5
(2)将pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2和pEF1α-SNAP26m-Pur.N4转移到细胞 中
通过实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI(由New England Biolabs制造)线性化在实施例4中构建的SNAP26m表达构建体。以这样的方式进行转染，即用100μlOpti-MEM I低血清培养基稀释3μl GeneJuice转染试剂，随后向其中添加1μg上述线性化的质粒并且使其静置10分钟，将所述混合物添加到以上的CHO-K1细胞中，随后培养24小时。第二天，去除所述培养基，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘中，并在补充有10％FBS和5、7.5或10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用在实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m的表达强度。
图11显示在pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。同样，图12显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，在由其中插入mRNA去稳定因子N4的pEF1α-SNAP26m-Pur.N4转化的细胞群中，不管药物选择期间的嘌呤霉素浓度，在所述药物选择后，显示SNAPm高表达的细胞显著富集。
实施例6
mRNA去稳定序列在潮霉素抗性基因中的作用
(1)pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2和pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4的构建
为研究当使用潮霉素抗性基因时所述mRNA去稳定因子的作用是否也可获得而构建质粒。在此构建中，使用根据图13中所示的方案构建的质粒pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2。因此，首先，通过反向PCR使用引物SEQ ID No：10和11、KOD-Plus突变试剂盒，和其中抗KOD抗体的轻链插入到其中用EF1α启动子代替CMV启动子作为模板的pCI-neo质粒的限制酶XbaI-NotI的位点中的pEF1α-KOD3G8LC质粒，构建其中限制酶SalI和NheI的位点被添加到表达盒的上游区域的pEF1α-KOD3G8LC-RE。至于所述抗KOD抗体的轻链，使用制备自产生对来源自Thermococcuskodakaraensis KOD1株系的DNA聚合酶特异的抗体的小鼠杂交瘤细胞系3G8(保藏号：FERM BP-6056；可从International Patent Organism Depositary(国际专利生物体保藏所)，National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology(国立高等工业科学和技术研究所)获得)的抗体的轻链。通过反向PCR使用引物SEQ ID No：12和13、KOD-Plus突变试剂盒以及本质粒作为模板，将限制酶BsiWI和XhoI的位点添加到所述表达盒的下游区域，从而进一步构建质粒pEF1α-KOD3G8LC-RE2。
用AflII和BstBI处理此pEF1α-KOD3G8LC-RE2以切下新霉素抗性基因。另一方面，通过PCR使用引物SEQ ID No：18和19从pTK-Hyg(由Clontech制造)扩增潮霉素抗性基因，并且将其转移到pEF1α-KOD3G8LC-RE2的限制酶AflII和BstBI的位点，从而构建pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2。之后，根据图14中所示的方案构建质粒pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2和pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4。因此，使用限制酶MluI和NotI从所述质粒pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2切下所述抗KOD抗体的轻链基因。另一方面，通过PCR使用引物SEQ ID No：3和20从所述SNAPm表达质粒pSNAPm扩增所述SNAP26m基因并且将其转移到pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2质粒的限制酶MluI和NotI的位点，从而构建pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2。之后，使用此质粒作为模板，使用KOD-Plus突变试剂盒以及引物SEQ ID No：21和22进行反向PCR，从而构建其中N4序列被添加到潮霉素抗性基因的下游区域的pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4。
实施例7
(2)将pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2和pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4转移到细胞 中
通过实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化在实施例6中构建的SNAP26m表达构建体。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在转染的第二天，将所述培养基去除并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和800μg/ml潮霉素HygroGold(由InvivoGen制造)的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用在实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图15显示在pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。图16显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，在由其中插入有mRNA去稳定因子N4的pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4转化的细胞群中，在所述药物选择后显示SNAPm高表达的细胞显著富集。
实施例8
mRNA去稳定序列在新霉素抗性基因中的作用
(1)pEF1α-SNAP26m-Neo.N4的构建
为研究当使用新霉素抗性基因时所述mRNA去稳定因子的作用是否也可获得，根据图17中所示的方案构建质粒pEF1α-SNAP26m-Neo.N4。因此，将在实施例4中提及的pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2用作模板并且使用KOD-Plus突变试剂盒以及使用引物SEQ ID No：21和23进行反向PCR，从而构建其中N4序列被添加到新霉素抗性基因的下游区域的pEF1α-SNAP26m-Neo.N4。
实施例9
(2)将pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2和pEF1α-SNAP26m-Neo.N4转移到细胞 中
通过实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI  线性化pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2和pEF1α-SNAP26m-Neo.N4。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在转染的第二天，将所述培养基去除并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/lEDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转入90-mm Petri盘中并且在补充有10％FBS和1mg/ml遗传霉素G418(由Nakarai Tesk制造)的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图18显示在pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。图19显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，在由其中插入有mRNA去稳定因子N4的pEF1α-SNAP26m-Neo.N4转化的细胞群中，在所述药物选择后显示SNAPm高表达的细胞显著富集。
实施例10
对ARE序列基序的重复序列数目的研究
根据图20中所示的方案构建质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8。使用在实施例4中提及的pEF1α-SNAP26m-Pur.N4作为模板并且使用KOD-Plus突变试剂盒以及引物SEQ ID No：16和24进行反向PCR，从而制备其中N2序列(其中ARE序列基序TTATTTATT重复两次的序列)被添加到所述嘌呤霉素抗性基因的下游区域的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N2。同样，使用引物SEQID No：7和24，通过同样方法制备其中N6序列(其中ARE序列基序TTATTTATT重复六次的序列)被添加到所述嘌呤霉素抗性基因的下游区域的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N6。此外，通过同样方法使用引物SEQ IDNo：7和25来制备其中N8序列(其中ARE序列基序TTATTTATT重复八次的序列)被添加到所述嘌呤霉素抗性基因的下游区域的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N8。
通过实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化SNAP26m表达构建体pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8中的每个。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和7.5μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图21显示在pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。同样，图22显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，结果是这样的，即当使用其中插入了具有许多重复数目的N6或N8的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N6或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8进行转化时，与pEF1α-SNAP26m-Pur.N4相比，SNAPm高表达细胞的比率更多并且高表达细胞的选择效率高。
实施例11
核酸序列的确定
在从CHO细胞(CHO细胞-4N株系)的DR 1000L-4N株系制备的BAC文库中，分离含有hGM-CSF表达盒的克隆Cg0031N14。使从Cg0031N14BAC克隆制备的鸟枪克隆经历5’，3’单次测序(sequence)，从而由Phred/Phrap/Consed拼接序列信息，由此确定与其中转入了hGM-CSF表达盒的CHO细胞中的位点邻近的基因组序列的大约91kbp的序列。此序列显示在序列列表的SEQ ID No：26中。
实施例12
核酸序列分析
为检查绝缘子序列是否存在于以上确定的核酸序列中，通过检索绝缘子结合蛋白质CTCF的结合序列基序来进行搜索。使用In silico CTCFBS预测工具(http://insulatordb.utmem.edu/)(非专利文件11)作为分析工具。由以上工具提取的基序序列显示在表1和图23中。
[表1]
  基序PWN   基序序列   基序起点   基序长度   基序定位   得分
  REN_20   TCCACCACTAGGGGGCGCGC   41821   20   -   20.8898
  MIT_LM2   TAGCCAGAAGAGGGCATCA   45182   19   +   19.3604
  MIT_LM7   CATCCAGCAGAGGGAGATGG   91094   20   +   17.6996
  MIT_LM23   CCACCACTAGGGGGCGCGCT   41820   20   -   15.4348
实施例13
对转基因表达稳定作用的确定
通过PCR使用引物SEQ ID No：27和28从在实施例1的过程期间构建的pSNAP26m-CMV扩增CMV启动子/SNAP26m/SV 40polyA并通过部分消化将其转入质粒pBluescript II SK(-)的限制酶BamHI和SacI的位点，从而构建质粒pBS-CMV-SNAPm(图24)。
之后，在实施例11中制备的鸟枪文库的克隆中，提取在CTCF的结合序列基序附近的41820或45182位置处包含CHO基因组序列的克隆并通过PCR扩增来源自CHO基因组的序列(图25)，并且将其转移到pBS-CMV-SNAP26m的限制酶KpnI和XhoI或XhoI和ClaI的位点中。鸟枪文库克隆和其中整合有所述转移序列的SNAPm表达构建体之间的对应关系显示在表2中。顺便提及，在所述SNAPm表达构建体的栏中(-)是其中没有转移CHO的基因组序列的pBS-CMV-SNAPm。
[表2]
Figure BDA0000116117960000461
使用限制酶AhdI线性化那些SNAPm表达构建体和pPUR并且将其混合以便使它们的比率按重量计是9∶1，从而制备混合质粒。
另一方面，在前一天将调整到1×105个细胞/ml的每2ml所述CHO-K1细胞接种到12孔板并且培养一夜，从而制备用于转染的CHO-K1细胞。在那时，使用其中添加有10％胎牛血清的Ham’s F12培养基作为培养基。
以这样的方式进行转染，即用100μl Opti-MEM I低血清培养基稀释3μl GeneJuice转染试剂，将103μl此稀释液体添加到1μg上面提及的混合质粒中，随后使其静置10分钟，将所述混合物添加到上面的CHO-K1细胞，随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mmPetri盘并且在补充有10％FBS和6μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历三周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/lEDTA溶液处理来分散所述细胞并且将其按2×105个细胞每孔接种在12孔板上，在第二天将2μM SNAP-细胞-505添加到0.5ml Ham’s F12培养基，并且在37℃进行60分钟的培养。之后，用Ham’s F12培养基漂洗以上的三次并且，与更换的培养基一起，进行三次10分钟的培养，从而移去未反应的荧光染料。用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理所述细胞使其分散，使其悬浮在D-PBS(-)中并且使用流式细胞仪BDFACSCalibur来分析SNAPm的表达强度。
图26显示由其中转移有测试序列CHO1至CHO6中的每个的SNAPm表达构建体转化的细胞群的FACS分析结果。图27是这样的图，其中从未处理的CHO细胞(图27左边的无SNAP)的分析结果，采用显示十或更多信号的细胞(图26中的M2)作为SNAPm的表达细胞并且绘制所述细胞的比率。如从图26和27中将是明显的，在其中转移有部分的CHO基因组的构建体中或具体地，在其中转移有SEQ ID No：26的41601至46746位置的CHO4和5中，获得表达的显著提高。尽管认为在所述样品中CHO4和CHO5之间的差异在离差内，但在下文中以CHO5为基础进行最优区域的减小。
实施例14
具有基因表达稳定能力的序列区域的减小(1)
根据具有上文中最高的表达升高的构建体CHO5，进行使用KOD-Plus突变试剂盒的反向PCR。将引物SEQ ID No：39和40用于构建其中缺失了所述测试序列的位置41601至42902的CHO5Δ5。将引物SEQ ID No：41和42用于构建其中缺失了所述测试序列的位置42903至44200的CHO5ΔM。将引物SEQ ID No：43和44用于构建其中缺失了所述测试序列的位置44201至46746的CHO5Δ3(图28)。
使用限制酶AhdI线性化那些SNAPm表达构建体和pPUR并且将其混合以便使它们的比率按重量计是9∶1，从而制备混合质粒。
将以上的混合质粒(1μg)转染到前一天接种到12孔板上的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，并将其转移到90-mmPeri盘并且在补充有10％FBS和6μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历三周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/lEDTA溶液处理来分散所述细胞并且按2×105个细胞每孔接种到12孔板上，在第二天将2μM SNAP-细胞-505添加到0.5ml Ham’s F12培养基并且在37℃进行60分钟的培养。之后，用Ham’s F12培养基漂洗以上的三次并且，与更换的培养基一起，进行三次10分钟的培养，从而移去未反应的荧光染料。用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理所述细胞使其分散，使其悬浮在D-PBS(-)中并且使用流式细胞仪BD FACSCalibur来分析SNAPm的表达强度。
图29是由其中转移有测试序列CHO5Δ5、ΔM和Δ3中的每个的SNAPm表达构建体转化的细胞群的FACS分析结果，绘制显示10或更高信号值的细胞的比率。如从图29中将是明显的，CHO5Δ3显示与缺失前几乎相同的SNAPm表达强度而，在CHOΔM和Δ5中，表达升高的效果明显减小。从以上的结果，认为从5’侧到SEQ ID No：26的序列的位置41601至46746的前半区的部分主要参与所述表达的稳定。
实施例15
具有基因表达稳定能力的序列区域的减小(2)
使用引物SEQ ID No：44至49并且进行使用KOD-Plus突变试剂盒的反向PCR，从而构建其中CHO5Δ3的测试序列的3’进一步缺失的SNAPm表达构建体(图30和表3)。
[表3]
使那些SNAP26m表达构建体经历如在实施例14中的同样处理，从而分析SNAPm的表达强度。
在图31中，作为由测试序列CHO5Δ3和CHO5Δ3-1至5的SNAPm表达构建体转化的细胞群的FACS分析的结果，绘制显示10或更多信号值的细胞的比率。如从图31将是明显的，尽管在包含SEQ ID No：26的序列的位置41601至42700的CHO5Δ3-1至CHO5Δ3-3的样品间有离差，但注意到与缺失前几乎相同程度的SNAPm的表达强度，而在其中缺失了这种区域的3’侧的CHO5Δ3-4和CHO5Δ3-5的情况中，表达的升高效果明显减小。
实施例16
mRNA去稳定序列与基因表达稳定元件的组合在嘌呤霉素抗性基因中的 作用
(1)pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k的 构建
为研究N4序列和其对嘌呤霉素抗性基因的基因表达稳定能力在实施例15中被注意到的CHO5Δ3-3的组合的作用，构建质粒。在此实验中，使用在图32中提及的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k。因此，首先，通过PCR使用引物组SEQ ID No：50和51扩增的测试序列CHO5Δ3-3(下文中，在构建体中它将被称为1.1k)被插入到在实施例4的过程期间构建的pEF1α-KOD3G8HC-RE2的表达盒的上游区域上的限制酶NheI和BglII的位点中，由此构建质粒pEF1α-KOD3G8HC-1.1k。此外，质粒(pEF1α-KOD3GHC-1.1k/1.1k)通过将通过PCR使用引物组SEQ ID No：52和53扩增的测试序列CHO5Δ3-3插入到质粒pEF1α-KOD3G8HC-1.1k的表达盒的下游区域的限制酶BsiWI和XhoI的位点中来构建。
另一方面，使用在实施例4中构建的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N4和pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2作为模板并且进行使用KOD-Plus突变试剂盒并且使用引物SEQ ID No.54和55的反向PCR，从而构建其中缺失了存在于嘌呤霉素抗性基因中的限制酶BsiWI位点的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur2.N4和pEF 1α-SNAP26m-Pur2-RE2。
之后，根据在图33中所示的方案构建质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k。因此，使用限制酶EcoRI和BsiWI从pEF1α-SNAP26m-Pur2.N4和pEF1α-SNAP26m-Pur2-RE2切下SNAPm-pA-SV40启动子-Pur2.N4-pA和SNAPm-pA-SV40启动子-Pur2-pA  并且将其转移到pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k的限制酶EcαRI和BsiWI的位点中，从而构建pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k。
实施例17
(2)对N4序列和CHO5Δ3-3的组合在嘌呤霉素抗性基因中的作用的研究
通过在实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化在实施例4和16中构建的SNAP26m表达构建体。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS以及5、7.5或10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图34显示在pEF1α-SNAP26m-Pur-RE2、pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4或pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。同样，图35显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到在所述药物选择期间嘌呤霉素的浓度越高，高表达SNAPm的细胞的比率就越多而不管N4序列或CHO5Δ3-3的存在/不存在。然而注意到，当使用CHO5Δ3-3或N4序列时，高表达SNAPm的细胞的比率增加并且，当它们一起使用时，所述高表达细胞的比率由于它们的协同作用变得最高。
实施例18
mRNA去稳定序列和基因表达稳定元件的组合在潮霉素抗性基因中的作 用
(1)pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k 的构建
为研究N4序列和其对潮霉素抗性基因的基因表达稳定能力在实施例15中被注意到的CHO5Δ3-3的组合的作用，根据图36中所示的方案构建pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k。因此，使用限制酶MluI和BsiWI从pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4和pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2切下SNAPm-pA-SV40启动子-Hyg.N4-pA和SNAP26m-pA-SV40启动子-Hyg-pA并且将其转入到pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k的限制酶MluI和BsiWI的位点中，从而构建pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k。
实施例19
(2)对N4序列和CHO5Δ3-3的组合在潮霉素抗性基因中的作用的研究
通过在实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化在实施例6和18中构建的SNAP26m表达构建体。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和800μg/ml HygroGold的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图37显示在pEF1α-SNAP26m-Hyg-RE2、pEF1α-SNAP26m-Hyg-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4或pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。同样，图38显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，当mRNA去稳定因子N4序列与具有基因表达稳定作用的CHO5Δ3-3结合时，与其中单独使用N4序列或CHO5Δ3-3的情况相比，高表达SNAPm的细胞的比率进一步增加并且因此加强高生产性细胞的选择效率。
实施例20
mRNA去稳定序列和基因表达稳定元件的组合在新霉素抗性基因中的作 用
(1)pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k 的构建
为研究N4序列和其对新霉素抗性基因的基因表达稳定能力在实施例15中被注意到的CHO5Δ3-3的组合的作用，根据图39中所示的方案构建pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k。因此，使用限制酶EcoRI和BsiWI从pEF1α-SNAP26m-Neo.N4和pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2切下SNAP26m-pA-SV40启动子-Neo.N4-pA、SNAP26m-pA-SV40启动子-Neo-pA并且将其转移到pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k的限制酶EcoRI和BsiWI的位点中，从而构建pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k。
实施例21
(2)对N4序列和CHO5Δ3-3的组合在新霉素抗性基因中的作用的研究
通过在实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化在实施例8和20中构建的SNAP26m表达构建体。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和1mg/ml遗传霉素G418的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图40显示在pEF1α-SNAP26m-Neo-RE2、pEF1α-SNAP26m-Neo-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Neo.N4或pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。同样，图41显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到，当mRNA去稳定因子N4序列与具有基因表达稳定作用的CHO5Δ3-3结合时，与其中单独使用N4序列或CHO5Δ3-3的情况相比，高表达SNAPm的细胞的比率进一步增加并且因此加强高生产性细胞的选择效率。
实施例22
在存在CHO5Δ3-3的情况下对ARE序列基序的重复序列数目的研究
根据图42中所示的方案构建质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k。首先，使用在实施例10中构建的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8作为模板并且进行使用KOD-Plus突变试剂盒并且使用引物SEQ ID No.54和55的反向PCR，从而构建其中缺失了存在于嘌呤霉素抗性基因中的限制酶BsiWI位点的质粒pEF1α-SNAP26m-Pur2.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur2.N6和pEF1α-SNAP26m-Pur2.N8。之后，使用限制酶EcoRI和BsiWI从pEF1α-SNAP26m-Pur2.N2、pEF1α-SNAP26m-Pur2.N6和pEF1α-SNAP26m-Pur2.N8切下SNAP26m-pA-SV40启动子-Pur2.N2-pA、SNAP26m-pA-SV40启动子-Pur2.N6-pA和SNAP26m-pA-SV40启动子-Pur2.N8-pA并且将其转移到pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k的限制酶EcoRI和BsiWI的位点中，从而构建pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k 和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k。
通过在实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化SNAP26m表达构建体pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k和pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k中的每个。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mmPetri盘并且在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历一周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图43显示在pEF1α-SNAP26m-Pur-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N2-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1k/1.1k或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1k/1.1k的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。当在直到实施例19的条件下进行FACS分析时，细胞的荧光强度FL1过于强并且不可能正确地计算所述高表达细胞的比率。因此，降低流式细胞仪的荧光敏感度并且再做一次研究。其结果显示在图43中。此外，图44显示其中荧光强度FL1是1000或更高的细胞的比率的图表。结果，确认，甚至在其中所述表达盒被CHO5Δ3-3夹在中间的情况下，当使用pEF1α-SNAP26m-Pur.N6-1.1K/1.1k或pEF1α-SNAP26m-Pur.N8-1.1K/1.1k(即，其中插入有N6或N8的质粒)进行转化时，当与pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k的情况相比时，高表达SNAPm的细胞的比率更高并且所述高生产性细胞的选择效率显著加强。
实施例23
mRNA去稳定序列和基因表达稳定元件的组合在抗体制备系统中的作用
(1)pEF1α-KOD3G8HC-Neo.N4-1.1k/1.1k的构建
为研究mRNA去稳定序列(N4序列)和其基因表达稳定作用在实施例15的抗体制备系统中被认可的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的联合的用途，根据图45中所示的方案构建pEF1α-KOD3G8HC-Neo.N4-1.1k/1.1k。至于抗体基因，使用从产生对来源自Thermococcus kodakaraensis KOD1株系的DNA聚合酶特异的抗体的小鼠杂交瘤细胞系3G8(保藏号：FERMBP-6056；可从International Patent Organism Depositary(国际专利生物体保藏所)，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(国立高等工业科学和技术研究所)获得)获得的所述抗体(抗KOD抗体)的基因。
因此，使用限制酶EcoRI和NotI处理在实施例20中提及的pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k，从而切下SNAP26m基因。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：56和57的PCR扩增从在实施例4中提及的pEF1α-KOD3G8HC制备抗KOD抗体的重链基因随后用限制酶EcoRI和NotI处理，并且将此重链基因转移到pEF1α-SNAP26m-Neo.N4-1.1k/1.1k的EcoRI和NotI位点中，从而构建pEF1α-KOD3G8HC-Neo.N4-1.1k/1.1k。
实施例24
(2)pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k的构建
为研究N4序列和其基因表达稳定作用在实施例15的抗体制备系统中被认可的CHO5Δ3-3的联合的用途，根据图46中所示的方案构建pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k。因此，首先，将通过PCR使用引物组SEQ ID No：50和51扩增的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3(下文中，在构建体中它将被称为1.1k)插入到在实施例6的过程期间构建的pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2的表达盒的上游区域上的限制酶NheI和BglII的位点中，从而构建质粒pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k。此外，将由使用引物组SEQ ID No：52和53的PCR扩增的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3插入到质粒pEF1α-KOD3G8LC-1.1k的表达盒的下游区域的限制酶BsiWI和XhoI的位点中，从而构建pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k。
实施例25
(3)pEF1α-KOD3G8L-Hyg.N4-1.1k/1.1k的构建
为研究N4序列和其基因表达稳定作用在实施例15的抗体制备系统中被认可的CHO5Δ3-3的联合的用途，根据图47中所示的方案构建pEF1α-KOD3G8LC-Hyg.N4-1.1k/1.1k。因此，使用限制酶MluI和NotI处理在实施例18中提及的pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k，从而切下SNAP26m基因。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：56和57的PCR扩增从在实施例6中提及的pEF1α-KOD3G8LC制备所述抗KOD抗体的轻链基因随后用限制酶MlutI和NotI处理，并且将此轻链基因转移到pEF1α-SNAP26m-Hyg.N4-1.1k/1.1k的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEF1α-KOD3G8LC-Hyg.N4-1.1k/1.1k。
实施例26
(4)pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k的构建
为研究N4序列和其基因表达稳定作用在实施例15的抗体制备系统中被认可的CHO5Δ3-3的联合的用途，根据图48中所示的方案构建pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k。因此，用限制酶EcoRI和NotI处理在实施例16中提及的pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k，从而切下SNAP26m基因。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：56和57的PCR扩增从在实施例4中提及的pEF1α-KOD3G8HC制备所述抗KOD抗体的重链基因随后用限制酶EcoRI和NotI处理，并且将此重链基因转移到pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k的限制酶EcoRI和NotI的位点中，从而构建pEF 1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k。
实施例27
(5)对N4序列和CHO5Δ3-3在抗KOD抗体表达系统中的多克隆中的组合 作用的研究
使用限制酶AhdI线性化所述抗KOD抗体的重链(HC)表达构建体pEF1α-KOD3G8HC-RE2(下文中，它将被称为-/Neo)、pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Neo)、pEF1α-KOD3G8HC-Neo.N4-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Neo.N4)和pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Pur.N4)，以及所述抗KOD抗体的轻链(LC)表达构建体pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2(下文中，它将被称为-/Hyg)、pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Hyg)和pEF1α-KOD3G8LC-Hyg.N4-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Hyg.N4)中的每个。然后混合以下每个的重链和轻链表达构建体以便使按重量计所述抗体的重链表达构建体与所述抗体的轻链表达构建体的比率是1∶1由此制备以下混合质粒：
(1)其中不包含基因表达稳定元件(-/Neo和-/Hyg)的混合质粒；
(2)其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo和1.1k/Hyg)的混合质粒；
(3)其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(重链：Neo；轻链：Hyg)(1.1k/Neo.N4和1.1k/Hyg.N4)的混合质粒；以及
(4)其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(重链：Pur；轻链：Hyg)(1.1k/Pur.N4和1.1k/Hyg.N4)的混合质粒。
将以上混合质粒(2μg)转染到前一天接种在6孔板上CHO-K1细胞中并培养24小时。第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS以及遗传霉素G418和HygroGold或嘌呤霉素和HygroGold的Ham’s F12培养基中，经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。对于其中不包含基因表达稳定元件(-/Neo，-/Hyg)的情况以及对于其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的情况，使用600μg/ml遗传霉素G418和400μg/ml HygroGold进行选择性培养。对于其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(重链：Neo；轻链：Hyg)(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况，使用400μg/ml遗传霉素G418和200μg/mlHygroGold进行选择性培养。对于其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中，并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(重链：Pur；轻链：Hyg)(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况，使用7.5μg/ml嘌呤霉素和400μg/mlHygroGold进行选择性培养。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，并且按1.84×105个细胞每孔接种到6孔板上。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且通过ELISA(其中来源自Pyrococcus kodakaraensis KOD 1的DNA聚合酶被制成固相)测量所述多克隆中KOD3G8抗体的产量。
更具体地，将所述培养物的上清添加到其中来源自KOD1的DNA聚合酶以30μg/ml的浓度被制成固相的ELISA平板并在35℃培养两小时。之后，用PBS-T(含有0.1％Tween 20的磷酸缓冲盐水)冲洗，添加稀释了10,000倍的50μl抗鼠抗体-HRP(由DAKO制造)随后在35℃培养一小时，并且进一步用PBS-T冲洗三次，使所述混合物和TMB+(3，3’，5，5’-四甲联苯胺；由DAKO制造)反应5分钟。在通过添加50μl 1N硫酸终止反应后，使用酶标仪(plate reader)(产品名称：SPECTRA CLASSIC，由TECAN Auctria制造)(主波长：450nm；辅助波长：620nm)来测量它的吸收。
根据制备自标准物质的校准曲线计算所述抗体的浓度。至于标准物质，使用获得自产生对来源自KOD1的DNA聚合酶特异的抗体的小鼠杂交瘤细胞系3G8(保藏号：FERM BP-6056；可从International PatentOrganism Depositary(国际专利生物体保藏所)，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(国立高等工业科学和技术研究所)获得)的抗体。结果显示在图49中。如从图49将是明显的，与不包含基因表达稳定元件(-/Neo，-/Hyg)的情况相比，在其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的情况中所述抗体的产量增加到大约两倍的程度，而在其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况中，所述抗体的产量进一步增加到大约三倍的程度。此外，当在其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中，并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因的情况中，所述重链表达构建体的药物抗性基因由Neo变为Pur时，所述抗体的产量显著增加并显示比既不具有基因表达元件也不具有mRNA去稳定序列的表达构建体更高大约5倍的抗体生产。
实施例28
(6)对N4序列和CHO5Δ3-3的组合在抗KOD抗体表达系统中的单克隆中 的作用的研究
之后，关于不包含基因表达稳定元件(-/Neo，-/Hyg)的情况中的每个，其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的情况，其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中，并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况，以及其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况，使在所述选择后产生的细胞群经历有限稀释并且比较在单克隆中的生产率。
更具体地，用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理稳定表达KOD3G8抗体的实施例27的多克隆细胞，从而分散所述细胞随后以0.75个细胞/孔的浓度在96孔板上接种。在两周的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量KOD3G8抗体的产量。根据制备自标准物质的校准曲线计算每个克隆的抗体产量。使在以下每个情况中显示高表达量的克隆经历扩大培养：其中不包含基因表达稳定元件(-/Neo，-/Hyg)的情况、其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的情况、其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况，以及其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况。之后，按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种细胞。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量单克隆中的KOD3G8抗体产量。
图50显示其中绘制了根据制备自标准物质的校准曲线计算的每个克隆中的抗体产量的图表。结果，与其中比较多克隆中的生产率的情况相同，与其中不包含基因表达稳定元件(-/Neo，-/Hyg)的情况相比，在其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的情况中所述抗体产量增加。在其中测试序列CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Neo；L链：Hyg)(1.1k/Neo.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况中，所述抗体产量进一步增加。此外，在其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因的情况中，当所述重链表达构建体的药物抗性基因由Neo.N4变为Pur.N4时，每个克隆的抗体产量显著增加由此显示高抗体生产率的克隆的比率变得显著地大。从如这样的结果，确认在所述抗体生产系统中的高生产性细胞的选择效率显著增加。
为进一步确认所述作用，再次分析在以上的96孔板中的两周培养后由所述ELISA测量计算的以下情况的KOD3G8抗体的产量：其中既不包含基因表达稳定元件也不包含mRNA去稳定序列(-/Neo，-/Hyg)的情况以及其中包含基因表达稳定元件CHO5Δ3-3并且mRNA去稳定序列(N4序列)被进一步添加到所述药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)的情况并且根据频率分布绘制所述结果。所述结果显示在图51中。因此，作为其结果，在1.1k/Pur.N4和1.1k/Hyg.N4中克隆对KOD3G8产量的分布显著地移向高生产率侧由此具有很高抗体生产率的细胞的比率显著增加。因此确认，由于协同作用，基因表达稳定元件和包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的使用极大的促进了高生产性细胞株系的获得。
实施例29
使用无血清适应CHO细胞对N4序列和CHO5Δ3-3的组合在抗KOD抗体 表达系统的多克隆中的作用的研究
根据所附方案使用化学成分确知的用于CHO细胞的EX-CELL CDCHO无血清培养基(由SAFC Biosciences制造)使CHO-K1细胞经历无血清适应。使所述经过无血清适应的CHO-K1细胞以2.5×105个细胞/ml的浓度悬浮在Opti-MEM I低血清培养基(由GIBCO制造)中并且然后将所述悬浮液按每四孔各1ml接种到具有超低吸附表面的24孔板(由Corning Incorporated制造)上。
使用限制酶AhdI线性化所述抗KOD抗体的重链(HC)表达构建体pEF1α-KOD3G8HC-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Neo)和pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Pur.N4)中的每个，以及所述抗KOD抗体的轻链(LC)表达构建体pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Hyg)和pEF1α-KOD3G8LC-Hyg.N4-1.1k/1.1k(下文中，它将被称为1.1k/Hyg.N4)。然后混合以下每个的重链和轻链表达构建体以便使按重量计所述抗体的重链表达构建体与所述抗体的轻链表达构建体的比率是1∶1由此制备以下混合质粒：
(1)其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo和1.1k/Hyg)的混合质粒；以及
(2)其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(重链：Pur；轻链：Hyg)(1.1k/Pur.N4和1.1k/Hyg.N4)的混合质粒。
用68μl Opti-MEM I低血清培养基稀释每4μl以上的混合质粒。另一方面，用68μl Opti-MEM I低血清培养基稀释15μl lipofectamine 2000，与上述质粒混合溶液混合并使其在室温静置15分钟。之后，将其体积的各一半添加到2个孔的细胞中。
第二天，回收所述细胞，800g离心3分钟以除去上清并且使其悬浮在4ml化学成分确知的用于CHO细胞的EX-CELL CD CHO无血清培养基中。对于其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中(1.1k/Neo，1.1k/Hyg)的个体，将包含400μg/mlG418和200μg/ml HygroGold的抗生素添加到其中，而对于其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到所述药物抗性基因(H链：Pur；L链：Hyg)(1.1k/Pur.N4，1.1k/Hyg.N4)的个体，添加包含7.5μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml HygroGold的抗生素随后使其经历选择性培养。
在完成所述选择性培养后，按4×105个细胞每孔在6孔板上接种细胞。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且通过ELISA根据与实施例27中相同的方式测量多克隆中KOD3G8抗体的产量。图52显示其中绘制了根据制备自标准物质的校准曲线计算的抗体产量的图表。结果，确认，在使用经过无血清适应的CHO-K1细胞的情况中，如在实施例27所示的CHO-K1细胞不经历无血清适应的情况中，通过使用1.1k/Pur.N4和1.1k/Hyg.N4获得高生产率。通常，在生物药物等的工业制备中，筛选高生产性细胞然后使其在一至两个月期间经历无血清适应。当将基因转移到事先经历了无血清适应的细胞时，预期能够除去所述无血清适应步骤。从此实施例的结果，确认，甚至在经过无血清适应的CHO细胞中，能够通过使用本发明的基因表达稳定元件和包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒获得具有高生产率的细胞，并且确认能够在极短的时间内获得具有高生产率的细胞。
实施例30
2-构建体抗体表达系统与单载体抗体表达系统在抗KOD抗体表达系统中 的比较
(1)pEF1α-KOD3G8LC，HC-Pur.N4-1.1k/1.1k的构建
之后，为检测是否能够甚至在所述H链表达盒和所述L链表达盒被排列在一个载体上时获得高生产性细胞，根据图53所示的方案构建pEF1α-KOD3G8LC，HC-Pur.N4-1.1k/1.1k。
顺便提及，当所述H链(重链)表达盒和所述L链(轻链)表达盒被排列在不同载体上时，那称为“2-构建体抗体表达系统”或简单的“2-构建体(contract)”，而当所述H链表达盒和所述L链表达盒被排列在一个载体上时，那称为“单载体抗体表达系统”或简单的“单载体”。
首先，构建其中用于插入L链表达盒的限制酶位点被插入到pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k中的pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k-S。因此，用限制酶BglII和MluI处理在实施例26中提及的pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k，从而切下EF-1α启动子。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：58和59的PCR扩增从在实施例16的过程期间构建的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k制备EF-1α启动子随后用BglII和MluI处理，并且将此启动子转移到pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k的BglII和MluI的位点中，从而构建其中BglII、SphI和SpeI位点被插入到EF-1α启动子的上游区域的pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k-S。
之后，使用BglII和SpeI处理pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k-S。另一方面，通过使用引物SEQ ID No：60和61的PCR扩增从在实施例6的过程期间构建的pEF1α-KOD3G8LC-RE2制备抗KOD抗体的L链表达盒随后用BglII和SpeI处理，并且将此表达盒转移到pEF1α-KOD3G8HC-Pur.N4-1.1k/1.1k-S的BglII和SpeI位点，从而构建单载体pEF1α-KOD3G8LC，HC-Pur.N4-1.1k/1.1k。
实施例31
(2)2-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统在抗KOD抗体表达系统 中的多克隆中的比较
进行研究，从而检测是否能够在单载体抗体表达系统中获得与在2-构建体抗体表达系统的情况中同样的具有高抗体产量的克隆。使用在实施例27和28中获得最好结果的、其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3被插入到所述抗体表达盒的上游区域和下游区域两者中，并且mRNA去稳定序列(N4序列)被添加到药物抗性基因(重链：Pur，轻链：Hyg)(1.1k/Pur.N4和1.1k/Hyg.N4)的载体作为2-构建体抗体表达系统。然后，将其中所述抗体的重链表达构建体和所述抗体的轻链表达构建体混合成使它们按重量计的比率是1∶1的质粒(已经用限制酶AhdI线性化)用于转染。此外，作为单载体抗体表达系统，用限制酶AhdI线性化在实施例30中构建的pEF1α-KOD3G8LC，HC-Pur.N4-1.1k/1.1k并将其用于转染。将每种质粒(2μg)转染到由实施例2的方法制备的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在2-构建体表达系统的情况中在补充有10％FBS和7.5μg/ml嘌呤霉素以及400μg/ml HygroGold的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养，而在单载体系统的情况中，在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每3至4天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，并且按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清，并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量多克隆中KOD3G8抗体的产量。
根据制备自标准物质的校准曲线计算抗体浓度。结果显示在图54中。结果，发现在2-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统之间几乎没有抗体产量的差异。
实施例32
(2)2-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统在抗KOD抗体表达系统 中的单克隆中的比较
之后，关于2-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统中的每个，使在所述选择后产生的细胞群经历有限稀释并且比较在单克隆中的生产率。
更具体地，用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理稳定表达KOD3G8抗体的实施例31的多克隆细胞，从而分散所述细胞随后以0.75个细胞/孔的浓度在96孔板上接种。在两周的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量KOD3G8抗体的产量。根据制备自标准物质的校准曲线计算每个克隆的抗体产量。选择在2-构建体抗体表达系统和单载体抗体表达系统的每个中显示高表达量的克隆。在所选的克隆经历扩大培养后，按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种细胞。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量单克隆中的KOD3G8抗体的产量。
图55显示其中绘制了显示根据制备自标准样品的校准曲线计算的最佳表达量的五个克隆的抗体产量的图表。结果，发现，与在多克隆的结果中相同，在单载体抗体表达系统和2-构建体抗体表达系统之间几乎没有抗体产量的差异。从此事实，发现，在单载体抗体表达系统中，也可能获得与在2-构建体抗体表达系统的情况中相同的具有高抗体产量的克隆。
实施例33
对从表达载体中的每个序列元件中缺失限制酶识别序列的作用的确认
(1)从CHO5Δ3-3中缺失限制酶识别序列
之后，从基因表达稳定元件CHO5Δ3-3中缺失限制酶识别序列。首先，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE，其中通过反向PCR使用引物SEQ IDNo：62和63、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的在实施例16中提及的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k缺失存在于CHO5Δ-3-3中的限制酶SacI位点。接着，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：64和65、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE缺失存在于CHO5Δ-3-3中的限制酶SmaI位点。此外，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：66和67、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE2缺失存在于CHO5Δ-3-3中的限制酶BamHI位点。最后，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：68和69、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE3缺失存在于CHO5Δ-3-3中的限制酶HindIII位点。
实施例34
(2)pEHX的构建
构建了在图56中提及的pEHX，其包含多克隆位点和在实施例33中制备的其中缺失了四个限制酶识别序列的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3。将此序列排列到所述表达盒的上游区域和下游区域中。更具体地，构建了pEF1α-SNAP26m-Pur2.N4-ΔH，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：70和71、KOD-Plus突变试剂盒和在实施例16中提及的作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur2.N4缺失存在于SV40启动子下游的限制酶HindIII位点。接着，构建了pEF1α-SNAP26m-Pur3.N4-ΔH，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：72和73、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur2.N4-ΔH缺失存在于嘌呤霉素抗性基因中的限制酶SalI位点。此外，构建了pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：74和75、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur3.N4-ΔH缺失存在于嘌呤霉素抗性基因中的限制酶SmaI位点。之后，构建了pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH-Δf1，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：76和77、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH缺失f1复制起点。之后，构建了pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE，其中通过反向PCR使用引物SEQID No：78和79、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH-Δf1插入限制酶NheI、EcoRI和SpeI的位点。之后，构建了pEF1α-MCSpre-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：80和81、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF1α-SNAP26m-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE插入限制酶HindIII、BsiWI、XbaI和BcII的位点。然后，通过将通过混合引物SEQ ID No：82和引物SEQ IDNo：83并随后用95℃至60℃的逐渐降低的温度退火制备的DNA片段插入到pEF-1α-MCSpre-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE的HindIII和XbaI位点中，构建了pEF 1α-MCS-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE。之后，通过将通过PCR使用作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4以及引物SEQ ID No：84和85制备的其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到pEF1α-MCS-Pur4.N4-ΔH-Δf1-RE的NheI和EcoRI的位点中，构建了pEF1α-MCS-Pur4.N4-1.1k。此外，通过将通过PCR使用作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4以及引物SEQ ID No：52和86制备的其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到pEF1α-MCS-Pur4.N4-1.1k的BamHI和XhoI位点中，构建了pEHX。
实施例35
(3)pEH(M-SNAP26m-N)和pEH(B-SNAP26m-N)的构建
之后，为确认从所述元件缺失限制酶位点的作用，将SNAP26m基因插入到pEHX的多克隆位点中。更具体地，使用作为模板的pSNAPm以及引物组SEQ ID No：3和20扩增SNAP26m基因，并将其插入pEHX的MluI和NotI位点中，从而构建pEH(M-SNAP26m-N)。同样地，使用作为模板的pSNAPm以及引物组SEQ ID No：3和87扩增SNAP26m基因，并将其插入pEHX的BsiWI和NotI位点中，从而构建pEH(B-SNAP26m-N)。
实施例36
(4)对在SNAP26m表达系统中从CHO5Δ3-3中缺失限制酶识别序列的作 用的研究
通过在实施例2中提及的方法制备用于转染的CHO-K1细胞。另一方面，使用限制酶AhdI线性化在实施例16中构建的SNAP26m表达构建体pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k以及在实施例35中构建的SNAP26m表达构建体。通过实施例5中提及的方法进行转染，并且在所述转染的第二天，去除所述培养基并且通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和7.5或10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每三至四天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，使用实施例2中提及的方法分析所述细胞群的SNAP26m表达强度。
图58显示在pEF1α-SNAP26m-Pur.N4-1.1k/1.1k、pEH(M-SNAP26m-N)或pEH(B-SNAP26m-N)的转染和所述药物选择后产生的细胞群的FACS分析结果。图59显示其中荧光强度FL1分别不小于200和不小于1000的细胞的比率的图表。结果，注意到当使用包含从中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3的质粒时，不管在所述药物选择期间嘌呤霉素的浓度，高表达SNAPm的细胞的比率要高得多。还注意到，当SNAP26m基因被插入到pEHX中时，不管所用的插入SNAP26m基因的限制酶位点，高表达SNAPm的细胞的比率要高得多。
实施例37
对在抗体制备系统中从表达载体的各序列元件中缺失限制酶识别序列的 作用的确认
(1)pELX的构建
构建了在图60中提及的包含多克隆位点的pELX。更具体地，构建了pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：88和89、KOD-Plus突变试剂盒和在实施例6的过程期间制备的作为模板的pEF1α-KOD3G8LC-Hyg-RE2插入限制酶BglII和SalI的位点。之后，构建了pEF1α-KOD3G8LC-RE4，其中缺失了f1复制起点和潮霉素抗性基因的表达盒，并且其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：90和91、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF 1α-KOD3G8LC-Hyg-RE3插入限制酶EcoRI和SpeI的位点。之后，通过反向PCR使用引物SEQ ID No：80和81、KOD-Plus突变试剂盒和作为模板的pEF 1α-KOD3G8LC-RE4插入限制酶HindIII、BsiWI、XbaI和BclI的位点，构建了pEF1α-MCSpre-RE4。然后，通过将通过混合引物SEQ ID No：82和引物SEQ ID No：83并随后用95℃至60℃的逐渐降低的温度退火制备的DNA片段插入到pEF1α-MCSpre-RE4的限制酶HindIII和XbaI的位点中，构建了pELX。
实施例38
(2)抗KOD抗体表达载体：pELH(KOD3G8)的构建
然后，为确认在抗KOD抗体表达系统中从所述元件缺失限制酶位点的作用，构建pELH(KOD3G8)。
首先，将所述抗KOD抗体的重链基因和轻链基因中的每个插入到pEHX和pELX的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEH(KOD3G8)和pEL(KOD3G8)。更具体地，通过使用引物SEQ ID No：56和57的PCR扩增从在实施例4中提及的pEF1α-KOD3G8HC制备所述抗KOD抗体的重链基因并且随后用限制酶MluI和NotI处理，并且将此基因转移到pEHX的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEH(KOD3G8)。同样地，通过使用引物SEQ ID No：56和57的PCR扩增从在实施例6中提及的pEF1α-KOD3G8LC制备所述抗KOD抗体的轻链基因并且随后用限制酶MluI和NotI处理，并且将此基因转移到pELX的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEL(KOD3G8)。
然后根据图61中所示的方案通过用BglII、SpeI和ScaI处理pEL(KOD3G8)制备所述抗KOD抗体的轻链表达盒，并且将其插入到pEH(KOD3G8)的限制酶BglII和SpeI的位点中，从而构建pELH(KOD3G8)。
实施例39
(3)对在抗KOD抗体表达系统中的多克隆中从CHO5Δ3-3中缺失限制酶 识别序列的作用的研究
在抗KOD抗体表达系统中研究在CHO5Δ3-3中缺失限制酶识别序列的作用。使用在实施例30中构建的pEF1α-KOD3G8LC，HC-Pur.N4-1.1k/1.1k(1.1k)作为用于表达抗KOD抗体的单载体，其中将从中没有缺失限制酶识别序列的基因表达稳定序列CHO5Δ3-3插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中。此外，使用在实施例38中构建的pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)作为用于表达抗KOD抗体的单载体，其中将从中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到表达盒的上游区域和下游区域两者中。将用限制酶AhdI线性化的各质粒(2μg)转染到通过实施例2的方法制备的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每3至4天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞并且按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量多克隆中KOD3G8抗体的产量。
根据制备自标准物质的校准曲线计算抗体浓度。结果显示在图62中。结果，当使用其中将其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中的用于表达抗KOD抗体的单载体pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)时，发现抗体的产量更高。
实施例40
(4)对在抗KOD抗体表达系统中的单克隆中从CHO5Δ3-3缺失限制酶识 别序列的作用的研究
之后，关于其中CHO5Δ3-3中的限制酶识别序列未缺失/缺失的各情况，使在所述选择后产生的细胞群经历有限稀释并且比较单克隆中的生产率。
更具体地，用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理稳定表达KOD3G8抗体的实施例39的多克隆细胞，从而分散所述细胞随后以0.75个细胞/孔的浓度在96孔板上接种。在两周的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量KOD3G8抗体的产量。根据制备自标准物质的校准曲线计算每个克隆的抗体产量。选择在其中CHO5Δ3-3中的限制酶识别序列未缺失/缺失的各情况中显示高表达量的克隆。在所选择的克隆经历扩大培养后，按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种细胞。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量单克隆中KOD3G8抗体的产量。
图63显示其中绘制了显示根据制备自标准样品的校准曲线计算的最佳表达量的五个克隆的抗体产量的图表。结果，发现，与在多克隆的情况中的结果中相同，当使用其中将其中缺失了四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到所述表达盒的上游区域和下游区域两者中的用于表达抗KOD抗体的单载体pELH(KOD3G8)(1.1k-ΔRE)时，所述抗体的产量更高。从以上结果，结论将是，当所述限制酶位点从所述表达载体的各序列元件缺失时，能够，甚至在抗体表达系统中，容易并且有效地进行从克隆目标蛋白的基因到表达载体中到构建目标蛋白的高表达株系的过程。
实施例41
对在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间插入CHO5Δ3-3的作用的确 认
检验排列三个或更多个基因表达稳定元件的作用。更具体地，通过以下方法检验在其中基因表达稳定元件被排列到目标蛋白的两个基因表达盒和药物选择标记基因表达盒的上游区域和下游区域的表达载体中，在所述目标蛋白的两个基因表达盒之间进一步插入基因表达稳定元件的作用。
(1)pELX2的构建
构建图64所示的其中将其中缺失四个限制酶识别序列的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3排列在实施例37中构建的pELX的表达盒的下游区域中的pELX2。更具体地，使用引物SEQ IE No：90和92通过反向PCR使用KOD-Plus突变试剂盒和在实施例37中构建的作为模板的pELX将限制酶NheI位点添加到所述表达盒的下游区域，从而构建pELX-N。然后，通过PCR扩增使用引物组SEQ ID No：50和93以及在实施例33中构建的作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4将基因表达稳定元件CHO5Δ3-3插入到pELX-N的NheI和EcoRI位点中，从而构建了pELX2。在实施例41至44中使用的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3中，四个位置中的限制酶识别序列被缺失。
实施例42
(2)抗KOD抗体表达载体：pELH2(KOD3G8)的构建
之后，为确认在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间插入CHO5Δ3-3的作用，构建pELH2(KOD3G8)。
首先，将所述抗KOD抗体的轻链基因插入到pELX2的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEL2(KOD3G8)。更具体地，通过PCR扩增使用引物SEQ ID No：56和57从实施例6中提及的pEF1α-KOD3G8LC制备所述抗KOD抗体的轻链基因随后用限制酶MluI和NotI处理，并且将此基因转移到pELX2的限制酶MluI和NotI的位点中，从而构建pEL2(KOD3G8)。
然后根据图65中所示的方案通过用BglII、SpeI和ScaI处理pEL2(KOD3G8)来制备所述抗KOD抗体的轻链表达盒，并且将其插入到实施例38中构建的pEH(KOD3G8)的限制酶BglII和SpeI的位点中，从而构建pELH2(KOD3G8)。
实施例43
(3)对在抗KOD抗体表达系统中的多克隆中在所述L链表达盒和所述H 链表达盒之间插入CHO5Δ3-3的作用的确认
在多克隆阶段期间研究在抗KOD抗体表达系统中在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间插入CHO5Δ3-3的作用。使用在实施例42中构建的pELH2(KOD3G8)作为在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间包含CHO5Δ3-3的用于表达抗KOD抗体的单载体。此外，作为比较例，使用在实施例38中构建的pELH(KOD3G8)作为在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间不包含CHO5Δ3-3的用于表达抗KOD抗体的单载体。将使用限制酶AhdI线性化的各质粒(2μg)转染到通过实施例2的方法制备的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液来分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每3至4天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞并且按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量多克隆中KOD3G8抗体的产量。
根据制备自标准物质的校准曲线计算抗体浓度。结果显示在图66中。结果，当与比较例相比时，其中在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间也插入有CHO5Δ3-3的用于表达所述抗KOD抗体的单载体pELH2(KOD3G8)的使用显示大约1.5倍更高的抗体产量，由此所述抗体产量显著提高。
实施例44
(4)对在抗KOD抗体表达系统中的单克隆中在所述L链表达盒和所述H 链表达盒之间插入CHO5Δ3-3的作用的确认
之后，对由在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间具有CHO5Δ3-3的表达载体(pELH2(KOD3G8))转化的细胞群和由作为比较例的在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间不具有CHO5Δ3-3的表达载体(pELH(KOD3G8))转化的各细胞群中的每个进行有限稀释，并且在单克隆中根据生产率进行比较。
更具体地，用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理稳定表达KOD3G8抗体的实施例43的多克隆细胞，从而分散所述细胞随后以0.75个细胞/孔的浓度在96孔板上接种。在两周的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量KOD3G8抗体的产量。根据制备自标准物质的校准曲线测量各克隆的抗体产量。选择在其中在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间包含/不包含CHO5Δ3-3的各情况中显示高表达量的克隆。在所选择的克隆经历扩大培养后，按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量单克隆中KOD3G8抗体的产量。
图67显示其中绘制了显示根据制备自标准样品的校准曲线计算的最佳表达量的五个克隆的抗体产量的图表。结果，发现其中CHO5Δ3-3插入在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间的表达所述抗KOD抗体的单载体pELH2(KOD3G8)的使用显示所述抗体更高的生产。一些细胞株系显示两倍或甚至更高的产量。从如此的结果，显然当基因表达稳定序列也插入在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间时，能够获得具有高得多的抗体生产的细胞株系。
实施例45
对制备成串联体的表达载体的作用的确认
(1)抗KOD抗体表达载体：pELH3(KOD3G8)的构建
根据图68中所示的方案，构建了编码所述抗KOD抗体的H-链表达盒和L链表达盒和包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因表达盒的各两个拷贝的pELH3(KOD3G8)。因此，将通过用限制酶AseI、SalI和NheI处理pELH(KOD3G8)制备的由L链表达盒、H链表达盒、嘌呤霉素抗性基因表达盒和基因表达稳定元件CHO5Δ3-3组成的DNA片段插入到实施例38中构建的pELH(KOD3G8)的限制酶AseI和XhoI的位点中，从而构建pELH3(KOD3G8)。
实施例46
(2)抗KOD抗体表达载体：pELH4(KOD3G8)的构建
根据图69中所示的方案，构建了编码所述抗KOD抗体的H-链和L链表达盒和嘌呤霉素抗性基因表达盒的各两个拷贝的并且其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3插入在在所述L链表达盒和H链表达盒之间的pELH4(KOD3G8)。因此，通过用限制酶AseI、SalI和NheI处理pELH2(KOD3G8)制备的由L链表达盒、基因表达稳定元件CHO5Δ3-3、H链表达盒、嘌呤霉素抗性基因表达盒和基因表达稳定元件CHO5Δ3-3组成的DNA片段插入到实施例42中构建的pELH2(KOD3G8)的限制酶AseI和XhoI的位点中，从而构建pELH4(KOD3G8)。
实施例47
(3)对串联的表达载体在抗KOD抗体表达系统中的多克隆中的作用的确 认
在抗KOD抗体表达系统中研究串联的表达载体的作用。使用在实施例45中构建的pELH3(KOD3G8)和在实施例46中构建的pELH4(KOD3G8)作为串联的表达载体。此外，使用在实施例38中构建的编码所述抗KOD抗体的H链和L链表达盒和嘌呤霉素抗性基因表达盒的各一个拷贝的pELH(KOD3G8)作为比较例。将使用限制酶AhdI线性化的各质粒(2μg)转染到通过实施例2的方法制备的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/lEDTA溶液分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每3至4天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞并且按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量多克隆中的KOD3G8抗体的产量。
与实施例27相似，根据制备自标准物质的校准曲线计算抗体浓度。结果显示在图70中。结果，发现，当使用被制备成串联体的表达载体pELH3(KOD3G8)或pELH4(KOD3G8)时，当与对照pELH(KOD3G8)比较时，根据相对比率所述抗体的产量是1.5倍或甚至更高。此外，当使用其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3也插入在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间的pELH4(KOD3G8)时，所述抗体的产量是最高的并且，当与比较例相比时，获得两倍或更高的产量。
实施例48
(4)对串联的表达载体在抗KOD抗体表达系统中的单克隆中的作用的确 认
然后，关于通过在表达载体pELH(KOD3G8)、pELH3(KOD3G8)和pELH4(KOD3G8)的每个中的基因转移获得的多克隆细胞，使所述选择后产生的细胞群经历有限稀释并且比较单克隆中的生产率。
更具体地，用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理稳定表达KOD3G8抗体的实施例47的多克隆细胞，从而分散所述细胞随后以0.75个细胞/孔的浓度在96孔板上接种。在两周的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量KOD3G8抗体的产量。根据制备自标准物质的校准曲线计算各克隆的抗体产量。选择在分别转移有pELH(KOD3G8)、pELH3(KOD3G8)和pELH4(KOD3G8)的各情况中显示高表达量的克隆。在所选择的克隆经历扩大培养后，按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种细胞。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量单克隆中的KOD3G8抗体的产量。
图71显示其中绘制了显示根据制备自标准样品的校准曲线计算的最佳表达量的五个克隆的抗体产量的图表。结果，发现，当使用被制备成串联体的表达载体pELH3(KOD3G8)或pELH4(KOD3G8)时，与在多克隆中的情况相似，当与对照pELH(KOD3G8)相比时，所述抗体的产量高。此外，当使用其中基因表达稳定元件CHO5Δ3-3也插入在所述L链表达盒和所述H链表达盒之间的pELH4(KOD3G8)时，所述抗体的产量最高。从如此的结果，认为，当被制备成串联体的表达载体用于基因转移时，能够快速并且有效地获得具有高得多的抗体生产的细胞株系。
实施例49
包含抗体的恒定区基因的表达载体的制备和对包含抗体的恒定区基因的 表达载体的N4序列和CHO5Δ3-3的作用的研究
制备包含抗体轻链和/或重链的恒定区基因的表达载体并且将所述抗体的可变区基因插入到所述表达载体中，从而表达所述抗体分子，由此确认mRNA去稳定序列(N4序列)和基因表达稳定元件(CHO5Δ3-3)的作用。
(1)从CHO5Δ3-3中缺失限制酶识别序列
从如在实施例33中构建的其中缺失四个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3，进一步缺失存在于两个位置的限制酶BlpI位点。更具体地，首先，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE5，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：94和95、KOD-Plus突变试剂盒以及在实施例33中构建的作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE4缺失一个存在于CHO5Δ3-3中的限制酶BlpI位点。之后，构建了pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：96和97、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE5缺失另一个存在于CHO5Δ3-3中的限制酶BlpI位点。
实施例50
(2)人重链恒定区基因Cγ1的克隆
使用Sepasol RNAI Super(由Nakarai Tesk制造)从回收自用肝素治疗的健康人的血液的人外周血单核细胞提取总RNA。然后，通过ReverTraAce-α-(由Toyobo制造)使用总RNA作为模板合成cDNA。之后，通过PCR使用引物SEQ ID No：98和99扩增人γ1恒定区基因并且使纯化的PCR产物TA克隆到pTA载体(由Toyobo制造)。通过测序确认所构建质粒的序列并且具有与已知序列同样序列的克隆命名为pTA-γ1。
实施例51
(3)pEHγX的构建
将其中缺失六个限制酶识别序列的基因表达稳定元件CHO5Δ3-3排列在所述表达盒的上游区域和下游区域中，从而构建在图72中提及的编码人γ1恒定区基因的pEHγX。更具体地，通过PCR扩增使用在实施例49中构建的作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6以及引物SEQ ID No：50和51，将其中缺失六个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到实施例34中提及的pEF1α-MCS-Pur4.N4-1.1k的NheI和BglII的位点中，构建了pEF1α-MCS-Pur4.N4-1.1k-2。之后，通过PCR扩增使用在实施例50中提及的作为模板的pTA-γ1以及引物SEQ ID No：100和101将人γ1恒定区基因插入到pEF1α-MCS-Pur4.N4-1.1k-2的XbaI和BclI的位点中，构建了pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k。之后，构建了pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k-RE，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：102和103、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k用NotI位点替代所述EF1α启动子的上游区域的EcoRI位点。此外，构建了pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k-RE2，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：104和105、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k-RE将EcoRI位点插入到人γ1恒定区基因的上游区域。然后，通过PCR扩增使用在实施例49中构建的作为模板的pEF1α-KOD3G8HC-1.1k-ΔRE6以及引物SEQ ID No：52和86将其中缺失六个限制酶识别序列的CHO5Δ3-3插入到pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k-RE2的BamHI和XhoI的位点中，构建了pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k/1.1k。最后，通过将通过混合引物SEQ ID No：106和引物SEQ ID No：107并随后用95℃至60℃的逐渐降低的温度退火制备的DNA片段插入到pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k/1.1k的BsiWI和EcoRI位点中，构建了pEHγx。
实施例52
(4)人轻链恒定区基因Cκ的克隆
使用Sepasol RNAI Super(由Nakarai Tesk制造)从回收自用肝素治疗的健康人的血液的人外周血单核细胞提取总RNA。然后，通过ReverTraAce-α-(由Toyobo制造)使用总RNA作为模板合成cDNA。之后，通过PCR使用引物SEQ ID No：108和109扩增人κ恒定区基因并且使纯化的PCR产物TA克隆到pTA载体。通过测序确认所构建质粒的序列并且具有与已知序列同样序列的克隆命名为pTA-κ。
实施例53
(5)pELκX的构建
构建了在图73中提及的编码人κ恒定区基因的pELκX。更具体地，通过反向PCR使用KOD-Plus突变试剂盒、在实施例37中提及的作为模板的pELX以及引物SEQ ID No：110和111缺失位于多克隆位点中的限制酶HindIII和BsiWI的位点，构建了pELX-RE。之后，通过PCR扩增使用在实施例52中提及的作为模板的pTA-κ以及引物SEQ ID No：112和113将人κ恒定区基因插入到pELX-RE的XbaI和BclI的位点中，构建了pEF1α-κ。之后，构建了pEF1α-κ-RE，其中通过反向PCR使用引物SEQ IDNo：114和115、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-κ用NotI位点替代SV40pA的下游区域的EcoRI位点。此外，构建了pEF1α-κ-RE2，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：116和117、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-κ-RE将EcoRI、MluI和EcoRV位点插入到人κ恒定区基因的上游区域。最后，通过将通过混合引物SEQ ID No：118和引物SEQ ID No：119并随后用95℃至60℃的逐渐降低的温度退火制备的DNA片段插入到pEF1α-κ-RE2的MluI和EcoRV位点中，构建了pELκX。
实施例54
(6)抗KOD抗体表达载体：pELκHγ(KOD3G8)的构建
之后，为确认N4序列和CHO5Δ3-3在使用所述抗KOD抗体的可变区基因的小鼠-人嵌合体抗体表达系统中的作用构建pELκHγ(KOD3G8)。
首先，通过PCR扩增使用在实施例38中提及的作为模板的pEH(KOD3G8)以及引物SEQ ID No：56和120，制备所述抗KOD抗体的重链可变区基因，随后用限制酶HindIII和NheI处理，并且将此基因插入到在实施例51中构建的pEHγX的限制酶HindIII和NheI的位点中，从而制备pEHγ(KOD3G8)。
之后，通过PCR扩增使用在实施例38中提及的作为模板的pEL(KOD3G8)以及引物SEQ ID No：56和121，制备所述抗KOD抗体的轻链可变区基因，随后用限制酶MluI和BsiWI处理，并且将此基因插入到在实施例53中构建的pELκX的限制酶MluI和BsiWI的位点中，从而制备pELκ(KOD3G8)。
然后根据在图74中所示的方案通过使用BglII、NotI和ScaI处理pELκ(KOD3G8)来制备所述小鼠-人嵌合体抗体的轻链表达盒，并且将其插入到pEHγ(KOD3G8)的限制酶BglII和NotI的位点，从而构建pELκHγ(KOD3G8)。
实施例55
(7)pcHγX的构建
然后构建在图75中提及的其中从pEHγX缺失N4序列和基因表达稳定元件CHO5Δ3-3的pcHγX。更具体地，构建了pEF1α-γ-Pur4-1.1k，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：16和17、KOD-Plus突变试剂盒以及在实施例51中提及的作为模板的pEF1α-γ-Pur4.N4-1.1k-RE2缺失N4序列。之后，构建了pEF1α-γ-Pur4，其中通过反向PCR使用引物SEQ ID No：122和123、KOD-Plus突变试剂盒以及作为模板的pEF1α-γ-Pur4-1.1k缺失基因表达稳定元件CHO5Δ3-3。最后，通过将通过混合引物SEQ ID No：106和引物SEQ ID No：107并随后用95℃至60℃的逐渐降低的温度退火制备的DNA片段插入到pEF1α-γ-Pur4的BsiWI和EcoRI位点中，构建了pcHγX。
实施例56
(8)抗KOD抗体表达载体：pcLκHγ(KOD3G8)的构建
之后，为确认mRNA去稳定序列(N4序列)和基因表达稳定元件(CHO5Δ3-3)的作用，构建其中在使用所述抗KOD抗体的可变区基因的小鼠-人嵌合体抗体表达系统中缺失mRNA去稳定序列和基因表达稳定元件的pcLκHγ(KOD3G8)作为对照。
首先，通过PCR扩增使用在实施例38中提及的作为模板的pEH(KOD3G8)以及引物SEQ ID No：56和120制备所述抗KOD抗体的重链可变区基因随后用限制酶HindIII和NheI处理，并且将此基因插入到在实施例55中构建的pcHγX限制酶HindIII和NheI的位点中，从而制备pcHγ(KOD3G8)。
然后根据在图76中所示的方案通过用BglII、NotI和ScaI处理在实施例54中构建的pELκ(KOD3G8)来制备所述小鼠-人嵌合体抗体的轻链表达盒，并且将其插入到pcHγ(KOD3G8)的限制酶BglII和NotI的位点中，从而构建pcLκHγ(KOD3G8)。
实施例57
(9)对N4序列和CHO5Δ3-3在小鼠-人嵌合体抗体表达系统的多克隆中的 作用的确认
在使用所述抗KOD抗体的可变区基因的小鼠-人嵌合体抗体表达系统中研究N4序列和CHO5Δ3-3的作用。使用在实施例54中构建的pELκHγ(KOD3G8)作为包含N4序列和CHO5Δ3-3的构建体，使用在实施例56中构建的pcLκHγ(KOD3G8)作为不包含N4序列和CHO5Δ3-3的构建体。将使用限制酶AhdI线性化的各质粒(2μg)转染到通过实施例2的方法制备的CHO-K1细胞随后培养24小时。第二天，去除所述培养基并且使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液分散所述细胞，将其转移到90-mm Petri盘并且在补充有10％FBS和10μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12培养基中经历两周的选择性培养。在所述选择性培养期间，每3至4天更换所述培养基。在完成所述选择性培养后，通过使用2.5g/l胰蛋白酶和1mmol/l EDTA溶液处理来分散所述细胞并且按1.84×105个细胞每孔在6孔板上接种。在三天的培养后，回收所述培养物的上清并且根据与实施例27中相同的方式通过ELISA测量多克隆中KOD3G8抗体的产量。
根据制备自标准物质的校准曲线计算抗体浓度。结果显示在图77中。结果，当使用包含N4序列和CHO5Δ3-3的嵌合体抗体表达载体pELκHγ(KOD3G8)时，所述抗体的产量比对照pcLκHγ(KOD3G8)高大约四倍。已阐明，当使用除了包含N4序列和CHO5Δ3-3之外再包含编码人抗体的恒定区基因的表达载体时，能够容易并且方便地构建其中所述恒定区是人型的嵌合体抗体表达载体，以及使通过噬菌体展示(phage display)方法等获得的可变区基因作为完整抗体表达的载体，并且进一步能够在短周期内容易地实施建立产生高抗体表达株系的过程。
工业实用性
通过使用配备有具有基因表达稳定功能的核酸区域以及弱化的药物基因表达盒的本发明的表达载体，能够有效地获得高表达目标蛋白基因的细胞。因此，使用本发明表达载体的哺乳动物细胞中的表达系统不仅极大地促进多种动物细胞(或尤其是哺乳动物细胞)蛋白质的功能分析，而且还极大地促进药物发现工业和医疗服务产业如生物制药。
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Claims (28)

1.表达载体，其特征在于具有包含mRNA去稳定序列的药物选择标记基因的表达盒、至少一个稳定基因表达的元件和目标蛋白基因的表达盒。
2.根据权利要求1的表达载体，其中所述mRNA去稳定序列来自细胞因子、白细胞介素或原癌基因的3’-非翻译区中存在的富含AT的序列。
3.根据权利要求1的表达载体，其中所述mRNA去稳定序列具有基序序列TTATTTA(A/T)(A/T)。
4.根据权利要求3的表达载体，其中所述基序序列重复两次或更多次。
5.根据权利要求4的表达载体，其中在所述基序序列的重复之间含有间隔序列的一个或多个碱基。
6.根据权利要求2-5中任一项的表达载体，其中在所述mRNA去稳定序列中包含一个至数个碱基的置换、插入或缺失。
7.根据权利要求1-6中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件来自中国仓鼠基因组。
8.根据权利要求1-7中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件由以下(a)-(h)中任一项或其任意组合组成：
(a)由SEQ ID No：26中所示序列组成的DNA；
(b)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第41820个碱基至第41839个碱基区域的序列的DNA；
(c)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第41821个碱基至第41840个碱基区域的序列的DNA；
(d)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第45182个碱基至第45200个碱基区域的序列的DNA；
(e)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成并包含SEQ ID No：26中所示序列的第91094个碱基至第91113个碱基区域的序列的DNA；
(f)由SEQ ID No：26中所示序列的部分序列组成的DNA，其中，当其排列到邻近于宿主细胞中外源基因的表达盒时，能够增加或稳定目标重组蛋白的表达，所述目标重组蛋白来自包含在外源基因的表达盒中的外源基因；
(g)在严格条件下与由与以上(a)-(f)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(h)由与以上(a)-(g)中的任一DNA互补的碱基序列组成的DNA。
9.根据权利要求8的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件由以下(i)-(k)中任一项或其任意组合组成：
(i)包含SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第46746个碱基区域的序列的DNA；
(j)在严格条件下与由与(i)中DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(k)由与以上(i)或(j)中的DNA互补的碱基序列组成的DNA。
10.根据权利要求9的表达载体，其特征在于所述稳定基因表达的元件由以下(l)-(n)中任一项或其任意组合组成：
(l)包含SEQ ID No：26中所示序列的第41601个碱基至第42700个碱基区域的序列的DNA；
(m)在严格条件下与由与(l)中DNA互补的碱基序列组成的DNA杂交并具有基因表达稳定功能的DNA；和
(n)由与以上(l)或(m)中的DNA互补的碱基序列组成的DNA。
11.根据权利要求1-10中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒的上游区域上排列。
12.根据权利要求1-10中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒的上游区域和下游区域二者上排列。
13.根据权利要求1-10中任一项的表达载体，其中所述稳定基因表达的元件在所述目标蛋白基因的表达盒和所述药物选择标记基因的表达盒的上游区域和下游区域二者上排列。
14.根据权利要求1-13中任一项的表达载体，其中所述药物选择标记基因是对蛋白合成抑制类型的抗生素物质具有抗性的基因。
15.根据权利要求14的表达载体，其中所述药物选择标记基因选自由嘌呤霉素-N-乙酰转移酶，潮霉素-B-磷酸转移酶和新霉素磷酸转移酶组成的组。
16.根据权利要求1-15中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白基因的表达盒装配有用于插入目标蛋白基因的多克隆位点。
17.根据权利要求1-16中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白是抗体的重链和/或轻链多肽。
18.根据权利要求1-17中任一项的表达载体，其中所述目标蛋白基因的表达盒是包含抗体轻链恒定区基因的抗体基因表达盒和/或包含抗体重链恒定区基因的抗体基因表达盒。
19.转化细胞，其特征在于是通过根据权利要求1-18中任一项的表达载体转化宿主细胞获得的。
20.根据权利要求19的转化细胞，其中所述宿主细胞是动物细胞。
21.根据权利要求20的转化细胞，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
22.根据权利要求21的转化细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
23.根据权利要求22的转化细胞，其中所述中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适应无血清培养基。
24.用于选择高水平表达目标蛋白基因的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括使根据权利要求19-23中任一项的转化细胞经历药物选择的步骤。
25.细胞群，其特征在于，所述细胞群由根据权利要求19-23中任一项的转化细胞组成并高水平表达目标蛋白基因。
26.用于生成蛋白的方法，其特征在于，使用根据权利要求19-23中任一项的转化细胞。
27.根据权利要求26的方法，其中所述蛋白是抗体。
28.根据权利要求26的方法，其中所述蛋白是疫苗。
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