JP2011152122A - 遺伝子サイレンシング効果を改善した高発現ベクター及び高生産性細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】 目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に樹立するのに効果的な発現ベクターであって、遺伝子サイレンシングを効果的に抑制し、更なる安定的な高レベルの発現を実現する発現ベクターを提供する。
【解決手段】 ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、３つ以上の遺伝子発現安定化エレメント、及び２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
【選択図】 図６６

Description

本発明は、遺伝子組み換え技術によって、目的とするタンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを動物細胞、特に哺乳類動物細胞に導入し、組換えタンパク質を高発現する細胞を効率よく樹立するための発現ベクター、及び形質転換された高生産性細胞に関する。本発明の発現ベクターは、遺伝子工学的手法により、動物細胞、特に哺乳類動物細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。

組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核細胞に基づくもの、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属など）及び哺乳類細胞などの動物細胞を含む真核細胞に基づくものの両者が用いられている。これらの中でも動物細胞、特に哺乳類細胞に基づく発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳類動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与するため、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞に基づく発現システムを利用した方が、治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。

組換えタンパク質を産生する細胞を樹立する方法としては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を発現する遺伝子構築物を宿主細胞へ遺伝子導入し、得られた形質転換細胞の中からこの遺伝子構築物が宿主細胞のゲノム上に安定導入された細胞を選別する。この際、前記遺伝子構築物に、薬剤選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を目的タンパク質の遺伝子と同一プロモーター下あるいは別個のプロモーター下で発現するように挿入しておき、薬剤選択によって生き残った細胞を目的タンパク質の遺伝子が安定導入された細胞として選別する。目的タンパク質の発現レベルは、目的タンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの領域に導入されるかによって大きく変動するが、導入領域の制御は、通常不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は目的タンパク質遺伝子を発現しないか又は発現量が低い。このため、従来、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞の取得には、１０００〜数千の細胞サンプルから１〜２個の細胞株を選別する作業を数ヶ月〜１年かけて繰り返し行っており、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞の選別に膨大な労力と時間を要していた。

そこで、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別するため、薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化することに基づく方法が開発されてきた。薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化すると、薬剤選択マーカー遺伝子が宿主細胞ゲノム内の低発現領域に導入された形質転換細胞は、薬剤選択マーカー（薬剤耐性遺伝子）を十分に発現することができないので、死滅してしまい、高発現領域に導入された形質転換細胞のみが薬剤選択によって生き残る。この生き残った形質転換細胞では、薬剤選択マーカー遺伝子に隣接して目的タンパク質遺伝子を有する可能性が高いため、目的タンパク質遺伝子も宿主細胞ゲノム内の高発現部位に導入されており、目的タンパク質遺伝子が高レベルで発現されている可能性が高い。このことを利用して、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率良く選別することができると考えられる。

薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する１つの方法としては、薬剤選択マーカーの発現に用いるプロモーターとして、転写活性の弱いプロモーターであるＨｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターを利用する方法（非特許文献１）や、野生型の転写活性レベルよりも減弱化された変異型プロモーターを用いて薬剤選択マーカーの発現を抑える方法（特許文献１、２）が挙げられる。しかしながら、本発明者らがこれらの方法を追試したところ、いずれの方法も薬剤選択マーカーの発現を減弱化するという面で効果がほとんど見られなかった。このことから、これらの方法を用いて目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に選別するということは難しいと考えられた。

薬剤選択マーカーの発現や機能を減弱化する別の方法としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列に変異を導入して薬剤選択マーカー自体の機能を減弱化する方法（特許文献３、４）が挙げられる。本発明者らがこの方法を追試したところ、この方法を用いることにより薬剤選択マーカーの機能を多少減弱化することができ、薬剤選択の結果として少量の発現量の向上した細胞株を取得することができた。しかしながら、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を選別する点での効率は良くなく、この方法による顕著な効果は見られなかった。

高生産性細胞の樹立には細胞選択技術の改良の他に、目的遺伝子の発現を安定的に維持するため、宿主細胞ゲノム上の目的遺伝子導入部位の周囲のゲノム環境からの影響を排除する工夫が必要である。組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は通常、不可能である。従って、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも培養を継続していくうちに次第に発現が低下してしまうこともある。このような位置効果を克服するため、導入遺伝子への隣接する染色体や調節エレメントの影響を緩和する染色体エレメント（シス作用性ＤＮＡエレメント）が組換えタンパク質の製造に利用されつつある。このような機能を持った核酸配列の１つがインスレーターと呼ばれる配列で、ニワトリのβ−グロビンＬＣＲの１．２ｋｂ長のＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ｃＨＳ４）などがよく機能解析され、組換えタンパク質の発現に利用されているが（非特許文献２）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現の増加はそれほど大きなものではないとされている（非特許文献３）。

ＵＳ５，６２７，０３３ ＷＯ２００５／０２４０１５ ＷＯ２００１／０３２９０１ ＷＯ２００４／０５０８８４ 特開２００１−３７４７８号公報

Ｎｉｗａ Ｈ、Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ．（１９９１） Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００ Ｐｉｋａａｒｔ ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １２：２８５２−６２ Ｉｚｕｍｉ Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＤＭ．（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７６：２８０−２８９ Ｂａｋｈｅｅｔ Ｔ，Ｆｒｅｖｅｌ Ｍ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｂ．Ｒ．Ｇ、 Ｇｒｅｅｒ Ｗ，Ｋｈａｂａｒ Ｋ．Ｓ．Ａ．（２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２４６−２５４ Ｌａｇｎａｄｏ Ｃ．Ａ，Ｂｒｏｗｎ Ｃ．Ｌ，Ｇｏｏｄａｌｌ Ｇ．Ｊ．（１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：７９８４−７９９５ Ｚｕｂｉａｇａ Ａ．Ｍ，Ｂｅｌａｓｃｏ Ｊ．Ｇ，Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｅ．（１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：２２１９−２２３０ Ｂｌａｓｃｏ ＭＡ（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ８：２９９−３０９ Ｇｏｎｚａｌｏ Ｓ，Ｊａｃｏ Ｉ，Ｆｒａｇａ ＭＦ，Ｃｈｅｎ Ｔ，Ｌｉ Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ ＭＡ（２００６）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：４１６−４２４ Ｐｅｒｒｏｄ Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０：２３０３−２３１８ Ｗａｋｉｍｏｔｏ ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９３：３２１−３２４ Ｂａｏ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｍ，Ｃｕｉ Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３−Ｄ８７

本発明の目的は、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を効率的に樹立するのに効果的な発現ベクター、及び高生産性細胞を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため、ｍＲＮＡ不安定化配列を導入した薬剤選択マーカー発現カセット、及び遺伝子発現安定化エレメントを発明した。そして、ｍＲＮＡ不安定化配列を有する種々の薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを具備した導入遺伝子の発現ベクターを構築し、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞の遺伝子発現を詳しく解析したところ、目的タンパク質の高生産性細胞の割合が飛躍的に上昇することを見出し、特願２０１０−０２７３１７にて特許出願を行った。

より高い生産性を示す細胞を取得するため、本発明者らはさらに鋭意検討を行った。その結果、発現ベクターが２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有する場合、これらの発現カセットの間に遺伝子発現安定エレメントを挿入すると、目的タンパク質の生産性が顕著に高くなることを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明によれば、以下が提供される：
（１）ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、３つ以上の遺伝子発現安定化エレメント、及び２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
（２）３つ以上の遺伝子発現安定化エレメントのうちの少なくとも１つが、２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットのいずれかの間に配置されていることを特徴とする、（１）に記載の発現ベクター。
（３）ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３´非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする（１）又は（２）に記載の発現ベクター。
（４）ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする（１）又は（２）に記載の発現ベクター。
（５）モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする（４）に記載の発現ベクター。
（６）モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする（５）に記載の発現ベクター。
（７）ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする（３）〜（６）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（８）遺伝子発現安定化エレメントが、チャイニーズハムスターゲノム由来であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（９）遺伝子発現安定化エレメントが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つからなることを特徴とする（１）〜（８）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（ａ）配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域の配列を含むＤＮＡ
（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列から、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（若しくは、Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶともいう。），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（若しくは、ＲｓｒＩＩともいう。），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（若しくは、ＳｎａＢＩともいう。），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、及びＳｒｆＩからなる群より選ばれた少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列からなるＤＮＡ
（１０）薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（１１）薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする（１０）に記載の発現ベクター。
（１２）目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（１３）２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドであることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（１４）（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
（１５）宿主細胞が、動物細胞であることを特徴とする（１４）に記載の形質転換細胞。
（１６）動物細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする（１５）に記載の形質転換細胞。
（１７）哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする（１６）に記載の形質転換細胞。
（１８）（１４）〜（１７）のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
（１９）（１４）〜（１７）のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
（２０）（１４）〜（１７）のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
（２１）タンパク質が、抗体であることを特徴とする（２０）に記載の方法。
（２２）タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする（２０）に記載の方法。

本発明の薬剤選択マーカーは、野生型に比べｍＲＮＡが不安定化されて薬剤選択マーカーの発現が減弱されるため、薬剤選択マーカー発現カセットが発現しやすいゲノム領域に組み込まれないと、薬剤存在下で生存が困難となる。このため、本発明において薬剤選択によって生き残った細胞では、この薬剤選択マーカーと隣接したゲノム上の部位に目的遺伝子の発現カセットを保持し、その結果として目的遺伝子を効率よく発現するものが多く、高発現株の取得を容易にすることができる。

また本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、細胞ゲノムにおける組換えタンパク質遺伝子に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて組換えタンパク質遺伝子の遺伝子発現を安定化し、高発現を長期間維持することができる。そこで、本発明の弱化された薬剤選択マーカー発現カセットと遺伝子発現安定化エレメントを併用することにより、その相乗効果によって、薬剤選択によって選択された細胞において目的遺伝子を非常に高度に発現する細胞を濃縮し、かつそれらの高発現細胞における発現の安定的な維持ができる。本発明により、それら非常に高いレベルのタンパク質生産性を示す高生産細胞株を迅速、容易、且つ効率的に樹立することができる。

本発明によれば、免疫グロブリンのような２つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を発現する発現ベクターを作成する場合、目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に遺伝子発現安定化エレメントを配置することにより、遺伝子サイレンシングに対する更なる抑制効果を得ることができる。その結果、相乗作用により目的タンパク質生産量が極めて有意に上昇した細胞株を取得することができる。

ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２の構築を示す図である。 ｐＰＵＲ・Ｎ４の構築を示す図である。以下、図中、Ｐｕｒとは、ピューロマイシン耐性遺伝子のことである。また、図中、ｉＰＣＲとは、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲのことである。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築を示す図である。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団を薬剤選択した際の明視野像である。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒのコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。 ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４のコロニーを単離し、ＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｎｅｏとは、ネオマイシン耐性遺伝子のことである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の構築を示す図である。以下、図中、Ｈｙｇとは、ハイグロマイシン耐性遺伝子のことである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 配列番号２６の配列とＣＴＣＦの結合配列の予測部位を示す図である。 核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍの構築を示す図である。 配列番号２６の配列、ＣＴＣＦＢＳ、被験配列の核酸断片の位置関係を示す図である。 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析して得られたＳＮＡＰｍ発現強度と細胞数の分布を示すグラフである。 各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析によって、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ＣＨＯ５のデリーションコンストラクト構築と配列番号２６の当該被験配列の位置関係を示す図である。 ＣＨＯ５、及びＣＨＯ５デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクト構築のためのＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に用いたプライマーの位置関係とデリーションによって得られた被験挿入配列を示す図である。 ＣＨＯ５Δ３、及びＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、および遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した抗体生産量をプロットしたグラフである。 ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、および遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。 遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、および遺伝子安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を付加し、高い抗体生産性が認められたもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、９６ウェルプレートにおける２週間培養での抗体生産性の度数分布をプロットしたグラフである。 ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築を示す図である。 ２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した抗体生産量をプロットしたグラフである。 ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。 ｐＥＨＸのベクターマップを示す図である。 ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞のうち、ＳＮＡＰｍを高発現する細胞の割合をプロットしたグラフである。 ｐＥＬＸのベクターマップを示す図である。 ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。 制限酵素認識配列を削除していない遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、および遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した抗体生産量をプロットしたグラフである。 ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。制限酵素認識配列を削除していない遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ）、および４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ−ΔＲＥ）について、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。 ｐＥＬＸ２のベクターマップを示す図である。 ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築を示す図である。 ４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８））、および４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流、下流、およびＬ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセット間の計３箇所に挿入したもの（ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８））について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した抗体生産量をプロットしたグラフである。 ６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８））、および４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流、下流、およびＬ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセット間の計３箇所に挿入したもの（ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）について、それぞれ生産量上位５クローンを同一グラフ上にプロットしている。

以下に本発明を詳細に説明する。

タンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産のために、遺伝子組み換え技術を用いて、細胞、特に動物細胞に目的とするタンパク質の遺伝子を導入し、組換えタンパク質として発現させる方法が広く用いられている。具体的には、プラスミドベクターに代表されるベクターに目的タンパク質遺伝子を挿入し、細胞にベクターを取り込ませた後、組換えにより目的タンパク質遺伝子を細胞ゲノムに組み込み、細胞を形質転換させる方法がよく用いられている。

細胞のゲノムは染色体上に存在するが、染色体はヒストンのアセチル化や高度な凝集（ヘテロクロマチン）等により遺伝子の発現が制御されており、挿入される染色体の場所によって遺伝子の発現量は大きく異なる。ベクターを用いて細胞を形質転換する方法においては、細胞ゲノムのどの場所に目的タンパク質遺伝子が導入されるかを制御することはできず、そのため細胞の目的タンパク質の発現量ないし生産量は細胞によって大きく異なることになる。

また、遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない細胞も多く存在する。

そこで、従前、予め発現ベクターに薬剤耐性遺伝子を挿入しておき、細胞に前記ベクターを遺伝子導入した後、培地中に薬剤を投与して（薬剤選択）、形質転換が成功した細胞を選択し、その後、生じた細胞群から高い発現を示す細胞株を繰り返し選別する作業が行われてきた。しかしながら、多数の細胞を用意する必要があり、また長期間の培養を必要とする動物細胞の選別作業を繰り返し行うため、多大の労力と時間を要してきた。加えて、薬剤耐性遺伝子は多くの場合、少量の発現でも薬剤に対する耐性を示すため、生存した細胞であっても発現量が大きく異なる細胞が混在しており、更に労力と時間に拍車をかけてきた。

また、選択時には十分な発現をしていた細胞でも、培養を継続していくうちに次第に発現が低下するものが少なからず見られる。これは、遺伝子サイレンシングにより発現が抑制されるためであると考えられる。目的とするタンパク質遺伝子のゲノム導入位置の制御が通常不可能であるため、遺伝子サイレンシングの効果による発現量低下を予測することは極めて困難である。そこで、このような位置効果を緩和し、発現を高レベルで安定的に維持する技術が必要とされてきた。

本発明ではまず、従来公知の薬剤耐性（薬剤選択マーカー）遺伝子を使用した選別において、ｍＲＮＡ不安定化配列を利用することによって薬剤耐性遺伝子の発現量を大きく抑え、宿主細胞ゲノム内の高発現領域に薬剤耐性遺伝子が組込まれた形質転換細胞のみが薬剤選択後に生き残るようにしている。薬剤耐性遺伝子の近隣には目的タンパク質の遺伝子が組込まれているため、生き残った細胞では、目的タンパク質遺伝子も高発現領域に組込まれている可能性が高い。従って、本発明によれば、（ｉ）遺伝子組み換えがうまくいかず、目的タンパク質遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれていない細胞、（ｉｉ）遺伝子組み換えに成功したが、薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの低発現領域に組込まれている細胞、及び（ｉｉｉ）遺伝子組み換えに成功し、しかも薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの高発現領域に組込まれている細胞の中から、（ｉｉｉ）の遺伝子組み換えに成功し、しかも薬剤耐性遺伝子及び目的タンパク質遺伝子が宿主細胞ゲノムの高発現領域に組込まれている細胞のみを薬剤選択によって効率的に選別することができる。従来公知の選別方法では、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の細胞を薬剤選択によって選別することができるが、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉｉ）の細胞のみを薬剤選択によって選別することはできず、薬剤選択後に生き残った形質転換細胞について目的タンパク質遺伝子の発現レベルを別途確認して、（ｉｉｉ）の高発現細胞を選別していた。本発明の方法は、薬剤選択のみによって（ｉ）〜（ｉｉｉ）の細胞から（ｉｉｉ）の高発現細胞を一気に選別することができるため、効率的であり、結果として高発現細胞を迅速に選別することができる。
また、本発明では、遺伝子発現安定化エレメントを利用することにより、選別した細胞の継続培養時の遺伝子発現量の低下を防止している。本発明による遺伝子発現安定化エレメントは、目的タンパク質の発現の安定的維持のみならず、薬剤耐性遺伝子に効果を示す場合には、薬剤耐性遺伝子の発現に対する隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させ、薬剤耐性遺伝子本来の機能を発揮する助けとなり、薬剤選択との相乗効果を示すものともなる。

本発明の第一側面によれば、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、少なくとも１つの遺伝子発現安定化エレメント、及び目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクターが提供される。

本発明において、発現カセットとは、プロモーターから遺伝子コード配列、ターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）までの遺伝子発現の単位をいう。加えて、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を含むこともある。したがって、例えば「薬剤選択マーカー発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列であるものをいう。また、「目的タンパク質の遺伝子発現カセット」という場合、前記発現カセットの遺伝子コード配列が目的とするタンパク質の遺伝子のコード配列であるものをいう。

（薬剤選択マーカー発現カセット）
本発明で使用する薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、ｍＲＮＡ不安定化配列を有することを除いては、従来公知の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと同様の構成を有する。そこで、まず、ｍＲＮＡ不安定化配列について説明する。
本発明は、ｍＲＮＡ不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子の発現を減弱化することができることを見出したことに基づくものである。本発明のｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを搭載した発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入した場合、ｍＲＮＡ不安定化配列を含まない場合と比較して、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは１／１０〜１／１００に減少する。これはｍＲＮＡ不安定配列の存在により薬剤選択マーカーのｍＲＮＡが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い高発現領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。

「ｍＲＮＡ不安定化配列」とは、この配列を有するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの細胞内半減期を低減させる機能を有するヌクレオチド配列のことであり、自然界では初期応答遺伝子などに存在することが見出されている。

ｍＲＮＡ不安定化配列は、いくつかの遺伝子ではコード配列中、あるいは５’ＵＴＲ（非翻訳領域）に存在するものもあるが、多くは３’ＵＴＲに存在する。３’ＵＴＲに存在するｍＲＮＡ不安定化配列としては、ＡＵ−ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）、ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ３’−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ、ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＩＲＥ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、ｌｏｎｇ ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐなどが知られている。これらの中でもＡＲＥは、恒常的にｍＲＮＡを不安定化できることから、本発明に用いるｍＲＮＡ不安定化配列として好ましい。

ＡＲＥとは、ｍＲＮＡにおける「ＡＵが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びウラシル（Ｕ）を高い割合で含む配列もしくは領域を意味する。また、ＡＲＥは、前記エレメントをコードするＤＮＡにおける「ＡＴが豊富なエレメント」、すなわちアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を高い割合で含む配列もしくは領域を指すためにも用いられる。

ＡＲＥは、造血細胞増殖因子遺伝子、成長因子遺伝子、インターロイキン遺伝子、インターフェロン等のサイトカイン遺伝子、及びいくつかの癌原遺伝子（プロトオンコジーン）などに見られる（非特許文献４）。本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットでは、これらの遺伝子中のＡＲＥに相当する核酸配列をそのまま利用してもよいが、ＡＲＥ中のモチーフ配列として知られるＴＡＴＴＴＡＴ（非特許文献５）やＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）（非特許文献６）などを利用する方が、不要な制限酵素認識配列を発現ベクターに挿入してしまうことを避けることができ、利便性が高い。

ＡＲＥを持つ遺伝子の例としては、造血細胞増殖因子についてはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｉｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキンについてはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β、２，３、４、６、８、１０、１１、インターフェロンについてはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、癌原遺伝子についてはｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｂ，Ｐｉｍ−１などが例示される。このほかにもＴｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ，Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１，Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ２など多くの遺伝子がＡＲＥを持つことが知られており、例示された遺伝子に限定されない。

本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおいて使用することができるｍＲＮＡ不安定化配列としては、下記のものが例示される。

ＡＴＴＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。

ＡＴＴＴＡのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。

ＴＡＴＴＴＡＴのモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。

ＴＴＡＴＴＴＡ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ａ）のモチーフ配列の１ないし２回以上の繰り返し。（Ｔ／Ａ）はＴまたはＡのいずれかである。

これらの配列は、１ないし数塩基の置換／挿入／欠失を含んでもよく、ＤＮＡの複製の誤りや突然変異などの自然変異によるもの、人為的な変異導入によるもの等が想定される。また、モチーフ配列の繰り返し間には１〜１００塩基程度のスペーサー配列またはリンカー配列を含んでもよい。加えて、モチーフ配列の逆位を含むものであってもよい。

これらのモチーフ配列の繰り返し数は、１回でもよいが、２回以上、より好ましくは４回以上とすることにより、ｍＲＮＡの不安定化効果を一層高めることができ、選別効率を顕著に増大させることができる。

繰り返しの回数の上限は特に限定されないが、細胞へのベクターの取り込みの観点から、発現ベクターが最大１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐ長となるようなものが望ましい。ただし、繰り返し配列数が増えるにしたがって、ｍＲＮＡの不安定化の効果は飽和に向かい、一定の繰り返し数を超えるとそれ以上の顕著な効果を望めなくなる。上限値を定めるものではないが、１０回以上の繰り返し配列は実用上意味がない。

本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるプロモーターとしては、動物細胞、特に哺乳類細胞で発現可能なプロモーターであれば特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒトヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーター、などのウイルスに由来するものや、マウスｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ−ｋｉｎａｓｅ１遺伝子（ＰＧＫ）プロモーターなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーターのハイブリッドが挙げられる。ここで、プロモーターは、プロモーターのコア領域に限るものではなく、エンハンサー領域を含む場合もある。薬剤選択マーカーの発現を減弱化するため、転写活性が低いものがより好ましい。転写活性の低いプロモーターとして変異型のプロモーターなどを利用してもよいし、コザック配列を置換してもよい。さらに、ｍＲＮＡ不安定化配列のモチーフ配列の繰り返しの回数を少なくし、転写活性の弱いプロモーターを併用するのも１つの想定される実施態様である。

本発明の薬剤選択マーカー発現カセットを用いた薬剤選択に使用される薬剤としては、タンパク質合成阻害系抗生物質としてブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；Ｈｙｇ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；Ｐｕｒ）が例示される。その他の選択用薬剤としてメトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ；ＭＴＸ）、ＭＳＸ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）などが例示される。また、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおける薬剤選択マーカー遺伝子としては、薬剤選択に一般的に使用される薬剤に対して耐性を示す遺伝子が好適に用いられる。タンパク質合成阻害系抗生物質を薬剤として用いる場合には、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子を用いることが好ましい。特に限定されるものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子（ジェネティシン耐性遺伝子としての機能も有する）として、Ｔｎ５由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ、実施例および図面ではＨｙｇと記載）、ピューロマイシン耐性遺伝子として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ、実施例および図面ではＰｕｒと記載）、ブラストサイジン耐性遺伝子として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来ブラストサイジン耐性遺伝子（ｂｓｒ）などが例示される。これらの中でも、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが好ましく、より好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン‐Ｂ−ホスホトランスフェラーゼであり、さらに好ましくはピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。

本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるポリアデニレーションシグナル（ターミネーター配列）としては、ＳＶ４０ウイルス由来ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡシグナル、ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡシグナル、ＨＳＶ−ｔｋ由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長因子遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナル、ウサギβ−グロビン遺伝子由来ｐｏｌｙＡシグナルなどが例示されるが、特に限定されるものではない。

本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット中でのプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルの配置順序は、薬剤選択マーカー遺伝子の発現が可能である限り特に限定されないが、一般的にプロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ｍＲＮＡ不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルをこの順序で上流から下流に向かって配置する。これらの四つの要素は、相互に直接連結されている必要はなく、所望により、イントロン、スペーサー配列、翻訳増強領域等を間に有していてもよい。

（遺伝子発現安定化エレメント）
本発明における「遺伝子発現安定化エレメント」とは、目的タンパク質の生産性を高めるために、目的遺伝子発現カセットが宿主ゲノムに挿入された部位近傍のゲノムの転写の活性化の状況に影響を受けてしまう、という位置効果を解消し、遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸領域を意味する。

遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列としては、インスレーター、スキャフォールド／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、遍在作用性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）などが利用できる。

インスレーターとしては、ニワトリβ−グロビンＬＣＲに由来する１．２ｋｂ ＤＮａｓｅＩ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｔｅ（ｃＨＳ４），バフンウニ由来ＵＲ１などが例示される。Ｓ／ＭＡＲとしては、ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲエレメント、ヒトβ−グロビンＭＡＲエレメントやヒトインターフェロンβＳＡＲエレメントなどが例示される。

本発明の発現ベクターは、少なくとも一つの遺伝子発現安定化エレメントを有する。これら遺伝子発現を安定化する機能を有する核酸配列を目的タンパク質の発現カセットの上流若しくは下流、あるいは上流及び下流に配置することによって、遺伝子発現の安定的維持、及び目的タンパク質の生産性を向上させることが可能である。

目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物として、プラスミドベクターが一般に用いられるが、プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２５ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましい。好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂｐ程度である。

本発明の好ましい実施態様における遺伝子発現安定化エレメントは、特許文献５に記載のＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）から本発明者らによって同定された核酸分子である。当該株は、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現ベクターに導入し、このベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、導入株をＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得、この形質転換体を、次いでＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で選択し、さらに５０ｎＭ、１００ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて１０から１００倍程度に増加するまで培養し、ＭＴＸ濃度を上昇させることにより得られたテロメアタイプのクローン細胞である。

真核細胞のゲノムは、真正染色質と異質染色質の２つのクラスの染色質に分けられる。セントロメアとテロメアの配列は、構成的な異質染色質の主要な部分である。特に、テロメアは、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列とサブテロメア領域からなり、際立った異質染色質の立体構造をとる、遺伝子の乏しい領域である（非特許文献７，８）。テロメアは、ゲノムの安定性に対するその寄与や保護的な役割に加え、テロメア位置効果として知られる現象によって、近くに導入された遺伝子の発現にも影響を与える（非特許文献９，１０）。

ところが、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株は、テロメアタイプのクローン細胞であるにもかかわらず、導入された外来遺伝子は導入部位付近の異質染色体からの不活性化の影響を受けることなく、長期間の培養において、安定したｈＧＭ−ＣＳＦの高い産生を維持した。これは、外来遺伝子の導入された部位の近傍に、不活性化の進行を強力に遮断するような境界エレメントが存在し、遺伝子発現を安定化していることを示唆する。

本発明者らは、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株において外来遺伝子導入部位の近傍の配列を分析した結果、配列表の配列番号２６で示す約９１ｋｂｐの配列からなるＤＮＡが遺伝子発現の安定化に関与していることを見出した。

本発明の発現ベクターに含まれる遺伝子発現安定化エレメントの長さは短い方が好ましい。そこで、より小さいサイズでも遺伝子発現安定化機能を有する領域を絞り込むため、発明者らは更なる研究を行った。

配列番号２６に示す約９１ｋｂｐの配列を更に分析するにあたり、通常、ショットガン法による約３ｋｂｐ程度の断片のライブラリを作成し、各断片を１つずつアッセイする方法が取られる。しかしながら、各断片が遺伝子安定化機能を有するかどうかを解析する際に、細胞の形質転換や培養に時間がかかるため、１アッセイ当たり数週間から数ヶ月の期間を要する。従って、全アッセイを行うためには膨大な時間と労力を要することになる。

そこで、本発明者らは、配列番号２６の配列中、遺伝子発現配列の境界エレメントが存在することが期待される部位を中心に解析する方法を見出した。そして、配列番号２６からなるＤＮＡのうち４２ｋｂｐ、４５ｋｂｐ、及び９１ｋｂｐ付近の領域が遺伝子発現安定化機能を有することを見出すに至った。

この配列をさらに詳細に分析したところ、この配列の中でも、（ｉ）４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域、（ｉｉ）４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域、（ｉｉｉ）４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域、及び（ｉｖ）９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の４つの領域が、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフに相当することを見出した。従って、これらの４つの領域の少なくともいずれかを含む、これらの領域の近傍が特に遺伝子発現の安定化に関与していると考えられた。

本発明における実施態様では、遺伝子発現安定化エレメントとして、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか又はその組み合わせが使用できる。
（ａ）配列番号２６で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号２６で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。

これらのエレメントは、ＣＨＯゲノムから単離同定されたものであるが、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号２６で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。

また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡも当然、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。さらに、（ｈ）前記（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡも、遺伝子発現安定化機能を有し、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができるため、本発明に含まれる。

ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中４０〜５０℃または０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中５５〜６５℃の条件下ハイブリダイズする塩基配列である。さらにストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ値）に基づいて決定することができる。また、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、「６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約１５〜３０℃低い温度」程度の条件をあげることができる。より高いストリンジェントな条件としては「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度、更に高いストリンジェントな条件としては「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、Ｔｍ値よりも約５〜１５℃低い温度」程度の洗浄条件をあげることができる。更に高いストリンジェントな条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ」程度の洗浄条件が例示される。

本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域である。また、これらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列も含まれる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントのさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又は配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有する塩基配列領域であり、又はこれらの領域からなるＤＮＡと相補的な塩基配列である。

本技術分野では、様々な目的タンパク質遺伝子を発現ベクターに効率よく挿入するために、マルチクローニングサイトを具備した発現ベクターがよく用いられる。遺伝子発現安定化エレメントの配列中にマルチクローニングサイトに使用される制限酵素の認識配列が存在する場合、当該配列をマルチクローニングサイトに利用することができない。そこで、遺伝子発現安定化の機能を損なわないように遺伝子発現安定化エレメントの配列から制限酵素認識配列を削除することによって、当該配列をマルチクローニングサイトに使用することが可能になる。

バイオ医薬品製造において、近年特に供給が望まれるのは抗体分子であり、マルチクローニングサイトには、抗体遺伝子のクローニングのため、抗体遺伝子内に認識配列が存在しない制限酵素を用いることが好ましい。医薬品用抗体としてはＩｇＧが大半を占めることから、本発明者らは、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ γ１遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＫ０５７７５４），γ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＣ０６２３３５），γ３遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＸ５３８１２６），γ４遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＸ６４０８２４），Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ κ遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＹ８９４９９１），λ１遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＢＣ００７７８２），λ２遺伝子（例としてＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５７８０９）、及び発現ベクター構築のベースに用いられるｐＵＣ１８ベクター（マルチクローニングサイトを除く）の塩基配列を解析した。いずれの遺伝子配列にも認識配列が存在せず、突出末端を生成する制限酵素を抽出したところ、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶ），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（ＲｓｒＩＩ），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩといった制限酵素が挙げられた。また、１ないし２つの遺伝子を切断してしまうが、遺伝子組換えに比較的利用しやすい酵素として、ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩが挙げられる。

一方、平滑末端を生成するような制限酵素は、目的タンパク質遺伝子の末端を平滑化しておくことによって、配列を問わず、連結することが可能であるので、マルチクローニングサイトに含まれる１つの認識配列として好ましい。このような平滑末端を生成するような制限酵素としては、ＥｃｏＲ１０５Ｉ（ＳｎａＢＩ），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、ＳｒｆＩが挙げられる。

そこで、本発明における遺伝子発現安定化エレメントの別の好ましい態様は、遺伝子発現安定化機能を有する配列であって、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（若しくは、Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶともいう。），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（若しくは、ＲｓｒＩＩともいう。），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（若しくは、ＳｎａＢＩともいう。），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、及びＳｒｆＩからなる群より選ばれた少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列である。

本発明の遺伝子発現安定化エレメントがその発現安定化効果を奏するためには、エレメントが宿主細胞ゲノム中で外来遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。

このような近接配置は、本発明のエレメントを含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。

（目的タンパク質の遺伝子発現カセット）
本発明における目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、プロモーター、遺伝子コード配列、及びターミネーター配列（ポリアデニレーションシグナル）からなる。加えて、イントロンやスペーサー配列、翻訳増強領域を含むこともある。目的タンパク質遺伝子の発現プロモーターとしてはできるだけ転写活性の高いものが好ましく、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどのウイルスに由来するものや、ヒトやマウス、さらにはＣＨＯ由来のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １α（ＥＦ１α）遺伝子、ユビキチン遺伝子、β−アクチン遺伝子など、非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するプロモーター、及び由来の異なるプロモーター／エンハンサーのハイブリッド、例えばＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。

本発明では、目的タンパク質の遺伝子発現カセットは、薬剤選択マーカー発現カセットと独立した形で与えられる。真核細胞の場合、目的タンパク質遺伝子と薬剤選択マーカー遺伝子を内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）でつなぐポリシストロン性の発現を行う手法もあるが、目的タンパク質遺伝子と薬剤選択マーカー遺伝子のコード配列が１つのｍＲＮＡとして合成されるため、前記ｍＲＮＡ不安定化配列を挿入すると、目的タンパク質遺伝子のｍＲＮＡが減少してしまい、高発現細胞を得られない。そのため、本発明では、目的タンパク質の遺伝子発現カセットは、薬剤選択マーカー発現カセットと独立して配置されることが好ましい。目的タンパク質の遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー発現カセットは、別個のベクターの形で利用されてもよいが、目的タンパク質の遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー発現カセットが同一のベクター上に配置されることがより好ましい。

目的タンパク質が、免疫グロブリンに例示されるような２つ以上のポリペプチドからなる四次構造をとるタンパク質である場合、各構成ポリペプチドをコードする遺伝子の発現カセットをそれぞれ別の発現ベクターに配置することもできるが、各構成ポリペプチドをコードする遺伝子の発現カセットを単一ベクター上に配置することができる。例えば、免疫グロブリンＧ抗体を目的タンパク質とする場合、Ｈ鎖（重鎖）発現カセットとＬ鎖（軽鎖）発現カセットとをそれぞれ別々のベクターに配置することができるが（この場合を「２コンストラクト抗体発現系」もしくは単に「２コンストラクト」という）、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを単一のベクターに配置する方（この場合を「シングルベクター抗体発現系」もしくは単に「シングルベクター」という）が好ましい。

本発明における２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットとは、上述のような複数のサブユニットからなるタンパク質における各サブユニットを構成するポリペプチド鎖の遺伝子の発現カセットが複数個含まれている場合と、単一のポリペプチド鎖からなるタンパク質の遺伝子の発現カセットが複数個含まれている場合との両方を想定している。

目的タンパク質の遺伝子発現カセットには、該タンパク質遺伝子のコード配列の代わりに、複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを配置することができる。外来遺伝子のｃＤＮＡやコード配列を導入する際に、クローニング作業が簡便であり、好ましい。

（発現ベクター）
本発明において、発現ベクターとは、遺伝子工学に利用されるベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクターであることができる。しかし、これに限らず、例えば、ウイルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）及び他の非プラスミドベクターも使用できる。

本発明における発現ベクターの実施態様の１つは、遺伝子発現安定化エレメントが３つ以上配置された発現ベクターであり、そのうちの少なくも１つの遺伝子発現安定化エレメントが目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流若しくは下流に配置された発現ベクターである。好ましくは、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に、遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。この場合、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットのどちらが上流であってもよいが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されたものである。

これに加え、本発明の特徴的な実施態様は、２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットのいずれかの間に少なくとも１つの遺伝子発現安定化エレメントが配置された発現ベクターである。すなわち、目的タンパク質の遺伝子発現カセットが２つであれば、各発現カセットの間に遺伝子発現安定化エレメントが配置されている。目的タンパク質の遺伝子発現カセットが３つであれば、１番目と２番目の目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間、若しくは２番目と３番目の目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に配置されており、あるいはその両方に配置されている。目的タンパク質の遺伝子発現カセットが４つ以上の場合も同様である。

本発明における別の実施態様は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に遺伝子安定化エレメントが配置されたベクターである。具体的な態様としては、目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流、若しくは薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流であって目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流のいずれの態様も考えられるが、好ましくは目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流であって薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。

本発明における発現ベクターの好ましい実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流及び下流に、それらの発現カセットを挟むように遺伝子発現安定化エレメントが配置されたベクターである。目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの順序は問わないが、目的タンパク質遺伝子発現カセットが上流に配置されていることが好ましい。また、目的タンパク質遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットそれぞれの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されていてもよい。

本発明における好ましい別の実施態様は、目的タンパク質遺伝子発現カセットの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置され、さらにその下流に薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが配置されたベクターである。

更には、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの下流に目的タンパク質の遺伝子発現カセットが配置され、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットと目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間及び目的タンパク質遺伝子発現カセットの下流に遺伝子発現安定化エレメントが配置されている発現ベクターも実施しうる。

遺伝子発現安定化エレメントと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット若しくは目的タンパク質の遺伝子発現カセットとの間は、隣接していてもよいし、スペーサー配列等が挿入されていてもよい。

薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットは、１つのベクターに２つ以上含まれていても良い。この場合、同一の薬剤選択マーカーが選ばれる場合もあるし、それぞれ異なる薬剤選択マーカーが選ばれる場合もある。また、各薬剤選択マーカーは隣接して配置されても良いし、離れて配置されていても良い。

本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面による発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞が提供される。

本発明の形質転換細胞における宿主細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、マウスミエローマ細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）、ＣＯＳ細胞などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これらに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞などを広く導入対象とすることができる。また、大腸菌などの細菌細胞や酵母、昆虫細胞などを用いたタンパク質生産システムにも応用しうる。

一般にバイオ医薬品などの工業生産には、ウイルスなどの有害成分の混入を排除するため、動物成分を含まない培地、より好ましくは化学的に組成の明らかな（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ）な培地で生産細胞を培養することが求められる。このため、一般的に使用されるウシ胎児血清などを含有した培地で高生産細胞をスクリーニングした後、１〜２ヶ月程度かけて動物成分非含有培地やＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄとされる培地へ細胞を適応させること（無血清馴化）が必要とされる。しかしながら、せっかく取得した高生産性細胞も上手く馴化できないケースもある。そこで、あらかじめ無血清馴化された細胞に遺伝子導入することは、無血清馴化工程を省略して生産細胞の樹立時間を短縮でき、非常に有効である。このような課題達成のため、本発明に用いられる宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞等における無血清馴化済み細胞がさらに例示される。

宿主細胞の形質転換方法は、当業者であれば適宜選択しうるが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション等が挙げられる。

本発明の第三の側面によれば、本発明の第二の側面による形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法が提供される。また、本発明の第四の側面によれば、本発明の第二の側面による形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群が提供される。

薬剤選択に使用する薬剤は、薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット中の薬剤選択マーカー遺伝子の種類に応じて決定される。また、使用する薬剤の濃度としては、一般に使用される濃度の範囲で高発現細胞の濃縮が可能であるが、少し高めの濃度が好ましい。最適な濃度は、宿主細胞や用いる培地の種類によって変化する。これらの濃度の設定方法は当業者にとっては公知であり、適宜設定しうる。例えば、産業用の生産細胞として用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ‘ｓ Ｆ１２培地で培養し、ピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のピューロマイシンの濃度としては、５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは７．５μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。同様の培養条件でハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のハイグロマイシンＢの濃度としては、２００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは６００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上である。同様の培養条件でネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを利用した場合のＧ４１８の濃度としては、好ましくは４００μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１，０００μｇ／ｍｌ以上である。

本発明の選別方法では、薬剤選択により、ｍＲＮＡの不安定化を伴わない従来の薬剤選択を行った細胞群に比べて、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が有意に高くなる。従って、従来は、薬剤選択後の膨大なサンプルから目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞株を選別する作業を繰り返し行わなければならなかったが、本発明によれば、薬剤選択マーカーのｍＲＮＡ不安定化を含む薬剤選択のみによって、選別の候補となるサンプル数を大幅に絞ることができる。本発明の選別方法を用いれば、薬剤選択後も生存する細胞群（ポリクローン）の状態で目的タンパク質生産量が有意に上昇していて、これらの細胞群から細胞を単離し、培養することにより、容易に高発現を示す細胞株（モノクローン）を取得することができる。本発明の実施態様の一例として、４．０×１０^５個の細胞に本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットが挿入されたベクターを遺伝子導入した後、薬剤選択を行って生じた細胞群から１００の細胞株をランダムに選択して、個々の細胞株の発現量を調べることにより目的タンパク質の高発現株を容易に取得することができる。

細胞の発現レベルはレポーター遺伝子の発現量により調べることができるが、一例として、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子（Ｃｏｖａｌｙｓ社）やＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子を含む発現カセットを本発明の発現ベクターに導入し、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）等のフローサイトメーターを用いて蛍光強度を解析することにより調べることができる。別の例として、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを本発明による発現ベクターに導入後、細胞溶解液にＤ−ルシフェリンを添加してルミノメーターで発光量を測定することにより調べることができる。また、レポーター遺伝子に限らず、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を利用することで抗体等の目的タンパク質の発現を調べることもできる。

本発明により、細胞選別の工程及び時間を大幅に短縮することができると共に、高発現を示す細胞の割合が上昇することにより、短時間で効率的に目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞を取得することができ、従来技術と比べて極めて顕著な効果を示す。

例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）により、蛍光強度ＦＬ１にてＳＮＡＰ２６ｍの発現量を測定した場合、ＦＬ１が２００以上若しくは１０００以上を示す細胞の割合は、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有さない細胞に比べて、本発明による細胞では１．１倍以上、また多くの場合１．５倍から２倍以上大きくなる効果が認められた。また、ＦＬ１が２００以上を示す細胞の割合の増加率よりもＦＬ１が１０００以上を示す細胞の割合の増加率の方が高い傾向が見られており、本発明により選別される細胞群が、本発明の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有さない細胞に比べて高い発現を示すという効果を裏付けている。

さらに、本発明におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化エレメントを有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、ｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子安定化エレメントを有さない発現ベクターを使用した場合に比べ、高生産性を示す細胞の割合が７〜８倍向上する。遺伝子発現安定化エレメントのみを有する発現ベクターにより形質転換された細胞では、高生産性を示す細胞の割合が２倍程度向上し優れた効果を有しているが、本発明はｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化エレメントの相乗効果によって更に顕著な効果を有する。

本発明の第五の側面によれば、本発明の第二の側面による形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法が提供される。

一つの実施態様では、生産されるタンパク質は、抗体である。この場合、抗体の重鎖ポリペプチド遺伝子と軽鎖ポリペプチド遺伝子は同一のベクター（シングルベクター）に挿入されていても良いし、それぞれ異なるベクターに挿入されて２コンストラクトとされていても良い。

哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、二次元電気泳動等により測定することができる。

本発明の方法により生産された抗体は、医薬として使用することができる。かかる医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にて公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供されるのが好ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、好ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。

経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。

担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

別の実施態様では、生産されるタンパク質は、ワクチンである。

ワクチンとしては、病原体のエピトープのアミノ酸配列からなるタンパク質をワクチンとして使用することができる。また、ウイルス体の構成タンパク質すべてを生産するのみならず、エンベロープタンパク等を生産し、ワクチンとして使用することができる。

ワクチンは任意の経路の投与のための製剤とすることができる。粘膜型投与、例えば、経口経路、経鼻経路、経気道経路、経膣経路、経直腸経路の他、非粘膜経路による投与、例えば皮下、静脈内もしくは筋肉内投与のためのワクチン製剤が挙げられる。

以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。なお以下において用いられる「遺伝子発現安定化エレメント」は、「遺伝子発現安定化配列」と同義である。

ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の構築
図１に示すスキームに従って、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃベクター（ｐＥＬｕｃ−ｔｅｓｔ）（東洋紡績社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号１）が導入されたｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを配列番号４，５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）の制限酵素ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２を構築した。

続いて、図２に示すスキームに従って、ｐＰＵＲ（クロンテック社製）のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子のコード配列の３‘末端に、配列番号６、７のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの４回繰り返し配列（Ｎ４）を挿入してｐＰＵＲ・Ｎ４を構築した。

つづいて、ｐＰＵＲ，ｐＰＵＲ・Ｎ４を鋳型として、配列番号８、９のプライマーとＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ｖｅｒ．２（東洋紡績社製）を用いたＰＣＲによって、ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０プロモーター−Ｐｕｒ・Ｎ４−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡの薬剤発現カセット断片を増幅した。ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ２と前記増幅断片をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩで部分消化して連結し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ，ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した（図３）。

（２）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（１）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研バイオリソースセンター、Ｎｏ．ＲＣＢ０２８５）を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（日水製薬社製）を使用した。

トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、１μｇのプラスミドとしてｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−ＰｕｒあるいはｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４にこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。３週間の選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０^５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社製）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク社製）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図４は、薬剤選択後のｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。横軸が蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸がカウント数である。また、図５に蛍光強度ＦＬ１がそれぞれ２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。

細胞株でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ及びｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入（２）
つづいて、実施例２と同様に遺伝子導入を行い、９μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。ここで形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒについては４８クローン、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については２０クローンをかきとり、１２ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ３６クローン、１０クローンについて、実施例２と同様にＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５で標識処理をし、ＦＡＣＳ解析を実施した。

図６に、薬剤選択後の細胞の明視野像を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒに比べ、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４については生存細胞数、コロニー数が顕著に減少し、選択効果が高いことが示唆される。

図７にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。図８にｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４形質転換細胞クローンにおける、ピーク強度が１０００を超える、特にＳＮＡＰｍ発現の高いクローンのＦＡＣＳ解析の結果を示す。この結果、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒでは高発現クローンは３６クローン中１クローン（２．８％）しか認められなかった。しかしながら、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４は取得されたクローンは少ないものの、ＳＮＡＰｍ高発現クローンのヒット率が４０％（１０クローン中４クローン）と非常に選択効果が高いことが確認された。また、この結果から、実施例２で認められたように、薬剤選択後の細胞集団をＦＡＣＳ解析することによって高発現細胞の割合の上昇していることと、高発現クローンの取得が効率化されていることに相関が確認されたことから、以後の解析は細胞集団のＦＡＣＳ解析によって効果の確認を実施した。

ＥＦ１αプロモーター使用下でのピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２の構築
次に、目的遺伝子発現カセットのプロモーターをＥＦ１αプロモーターに置換した場合も、上述と同様の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図９に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに置換したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社製）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥを構築した。なお、抗ＫＯＤ抗体の重鎖としては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体のものを使用した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加した構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２である。

このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２を用いて、図１０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号２，３のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を構築した。本プラスミドから制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩでネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＰＵＲ・Ｎ４から下流にＮ４配列を付加したＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を配列番号１４，１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１６、１７のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流のＮ４配列を削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を構築した。

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でリニアライズ（直鎖状化）した。トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈した後、前記のリニア化したプラスミド１μｇを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、５、７．５、あるいは１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎをそれぞれ含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図１１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。

ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ‐ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の構築
ハイグロマシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、プラスミドを構築した。この構築には、図１３に示すスキームに従って構築されたプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を利用した。即ち、まず、ＣＭＶプロモーターをＥＦ１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミドの制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１０、１１のプライマーを使って発現カセット上流に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。なお、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖としては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体のものを使用した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１２、１３のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２である。

このｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２をＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社製）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号１８、１９のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２の制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、図１４に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。即ち、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍからＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号３，２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２プラスミドの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。続いて、本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを使ってＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４を構築した。

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌハイグロマイシン ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図１５は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１６に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。

ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列の効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の構築
ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もｍＲＮＡ不安定化因子の効果が認められるか検討するため、図１７に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。即ち、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２３のプライマーを使ってネオマイシン耐性遺伝子下流にＮ４配列を付加したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を構築した。

（２）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４の細胞導入
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図１８は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図１９に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４が挿入されたｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４で形質転換された細胞集団には、薬剤選択後、ＳＮＡＰｍの高発現を示す細胞が有意に濃縮されていることが分かる。

ＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図２０に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号１６、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ２配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの２回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２を構築した。また、同様の方法で、配列番号７、２４のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ６配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの６回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６を構築し、配列番号７、２５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子の下流にＮ８配列（ＡＲＥ配列モチーフＴＴＡＴＴＴＡＴＴの８回繰り返し配列）を付加したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を構築した。

実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８の各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図２１は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２２に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６あるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８で形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高発現細胞の選択効率が高いとの結果であった。

核酸配列の決定
ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）より作成されたＢＡＣライブラリーのうち、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含むクローンＣｇ００３１Ｎ１４を単離した。このクローンＣｇ００３１Ｎ１４に由来するＢＡＣより作成したショットガンクローンの５’，３’ワンパスシーケンスを実施し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄによる配列情報のアッセンブルを行い、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットが導入されたＣＨＯ細胞の近傍のゲノム配列約９１ｋｂｐの配列を決定した。この配列を、配列表の配列番号２６に示す。

核酸配列の解析
前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてＩｎ ｓｉｌｉｃｏ ＣＴＣＦＢＳ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／）（非特許文献１１）を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表１及び図２３に示す。

導入遺伝子発現の安定化効果の確認
実施例１の途中で構築されたｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡを配列番号２７，２８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍを構築した（図２４）。

次に、実施例１１で作成したショットガンライブラリーのクローンうち、４１８２０位、４５１８２位のＣＴＣＦの結合配列モチーフの付近のＣＨＯゲノム配列を含むクローンを抽出し、ＣＨＯゲノムに由来する導入配列（図２５参照）をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍの制限酵素ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩまたはＸｈｏＩ、ＣｌａＩサイトに導入した。ショットガンライブラリークローンと、当該導入配列が組み込まれたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの対応関係を表２に示す。なお、表２中のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトの欄の（−）は、ＣＨＯのゲノム配列が導入されていないｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰｍである。

これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。

一方、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＣＨＯ−Ｋ１細胞を１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を使用した。

トランスフェクションは、３μｌ ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍで希釈し、前記の混合プラスミド１μｇにこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり２×１０^５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。

図２６は、被検配列ＣＨＯ１〜ＣＨＯ６がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図２７は、未処理のＣＨＯ細胞（図２６左上の（−））の解析結果から１０以上のシグナル（図２６中のＭ２）を示す細胞をＳＮＡＰｍの発現細胞とし、その細胞の割合をプロットしたグラフである。図２６、２７から明らかな通り、ＣＨＯ細胞ゲノムの一部を導入したコンストラクト、特に配列番号２６の４１６０１〜４６７４６位を導入したＣＨＯ４及び５において、有意な発現の上昇が認められた。ＣＨＯ４とＣＨＯ５の差異はサンプル間のバラツキの範囲内と考えられるが、念のため、以後の最適領域の絞り込みはＣＨＯ５に基づいて実施した。

遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（１）
前記で発現の上昇が最も高かったコンストラクトＣＨＯ５をもとに、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号３９、４０のプライマーを使って被験配列４１６０１−４２９０２位をデリーションしたＣＨＯ５Δ５を、配列番号４１，４２のプライマーを使って４２９０３−４４２００位をデリーションしたＣＨＯ５ΔＭを、配列番号４３、４４のプライマーを使って４４２０１−４６７４６位をデリーションしたＣＨＯ５Δ３を構築した（図２８）。

これらのＳＮＡＰｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。

前記の混合プラスミド１μｇを前日１２ウェルプレートに播種したＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ・ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェルあたり２×１０^５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地に２μＭ ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰｍの発現強度を解析した。

図２９は、被検配列ＣＨＯ５Δ５、ΔＭ、Δ３がそれぞれ導入されたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図２９から明らかな通り、ＣＨＯ５Δ３についてはデリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、ＣＨＯΔＭ、Δ３では発現上昇の効果が明らかに低減した。このことから、発現の安定化には配列番号２６の配列の４１６０１〜４６７４６位のうちの５’側〜前半部分が主に寄与していると考えられる。

遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（２）
配列番号４４〜４９のプライマーを使用し、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、ＣＨＯ５Δ３の被験配列の３’がさらにデリーションされたＳＮＡＰｍ発現コンストラクトを構築した（図３０及び表３）。

これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを実施例１４と同様に処理し、ＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図３１は、被検配列ＣＨＯ５Δ３、ＣＨＯ５Δ３−１〜５のＳＮＡＰｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図３１から明らかな通り、配列番号２６の配列の４１６０１〜４２７００位を含むＣＨＯ５Δ３−１からＣＨＯ５Δ３−３までについては、サンプル間のバラツキはあるものの、デリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰｍの発現強度が認められたのに対し、かかる領域の３’側が欠失したＣＨＯ５Δ３−４及びＣＨＯ５Δ３−５では発現の上昇効果が明らかに低減した。

ピューロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ピューロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、プラスミドを構築した。本実験では図３２に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋを利用した。即ち、まず、実施例４の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被検配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して構築されたプラスミドがｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋである。

一方、実施例４で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２を構築した。

続いて、図３３に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｐｕｒ２−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（２）ピューロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例４および１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ５、７．５、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図３４は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３５に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３の有無に関わらず、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度が高いほど、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。しかしながら、ＣＨＯ５Δ３−３あるいはＮ４配列を用いることでＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が増大し、さらにこれらを併用することによって、その相乗効果により高発現細胞の割合は最大値となることが分かる。

ハイグロマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列及び遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ハイグロマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２から制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｈｙｇ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（２）ハイグロマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例６および１８で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、８００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図３７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図３８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。

ネオマイシン耐性遺伝子におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、ネオマイシン耐性遺伝子で、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果を検討するため、図３９に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ・Ｎ４−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｎｅｏ−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（２）ネオマイシン耐性遺伝子での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例８および２０で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図４０は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−ＲＥ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図４１に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ｍＲＮＡ不安定化因子であるＮ４配列と遺伝子発現安定化効果を有するＣＨＯ５Δ３−３を組み合わせることで、Ｎ４配列あるいはＣＨＯ５Δ３−３を単独で用いた場合と比較してＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に増大しており、高生産性細胞の選択効率が向上することが分かる。

ＣＨＯ５Δ３−３存在下でのＡＲＥ配列モチーフの繰り返し配列数の検討
図４２に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。まず、実施例１０で構築したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号５４、５５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＢｓｉＷＩサイトを削除したプラスミドｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ２、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ６およびｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ８から制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩで、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ２−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ６−ｐＡ、ＳＮＡＰ２６ｍ−ｐＡ−ＳＶ４０ プロモーター−Ｐｕｒ２・Ｎ８−ｐＡを切出し、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｉＷＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋの各ＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図４３は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ２−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋ及びｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。なお、実施例１９までの条件でＦＡＣＳ解析に供したところ、細胞の蛍光強度ＦＬ１が強すぎて、高発現細胞の割合を正確に算出することができなかった。そのため、フローサイトメーターの蛍光感度を下げて再検討した結果を図４３に示している。また、図４４に蛍光強度ＦＬ１が１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、ＣＨＯ５Δ３−３で発現カセットを挟んだ場合でも、繰り返し配列数の多い、Ｎ６あるいはＮ８が挿入されたプラスミドのｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ６−１．１ｋ／１．１ｋあるいはｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ８−１．１ｋ／１．１ｋで形質転換したとき、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの場合と比較して、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が更に多く、高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。

抗体生産系におけるｍＲＮＡ不安定化配列と遺伝子発現安定化エレメントとの組み合わせの効果
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、ｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められた遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４５に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。抗体遺伝子は、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られる抗体（抗ＫＯＤ抗体）の遺伝子を用いた。

即ち、実施例２０に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（２）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４６に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、まず、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の発現カセット上流の制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに配列番号５０、５１のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３（以下、コンストラクト中では１．１ｋと表記）を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋを構築した。更にプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−１．１ｋの発現カセット下流の制限酵素ＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに配列番号５２、５３のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を挿入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（３）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４７に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１８に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（４）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
抗体生産系における、Ｎ４配列と実施例１５で遺伝子発現安定化能の認められたＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果の検討に用いるため、図４８に示すスキームに従って、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。即ち、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理し、ＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を切出した。一方、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで処理して、調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（５）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のポリクローンにおける検討
抗ＫＯＤ抗体の重鎖（ＨＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２（以下、−／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｎｅｏ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と記載）、および、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖（ＬＣ）発現コンストラクトである、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２（以下、−／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇと記載）、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（以下、１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４と記載）をそれぞれ制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ（直鎖状化）した。そして、重鎖および軽鎖発現コンストラクトを、
（１）遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏと−／Ｈｙｇ）、
（２）遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏと１．１ｋ／Ｈｙｇ）、
（３）遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｎｅｏ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、
（４）遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）
のそれぞれについて、抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。

前記の混合プラスミド２μｇを、前日に６ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、ジェネティシン Ｇ４１８およびＨｙｇｒｏＧｏｌｄ、あるいは、ＰｕｒｏｍｙｃｉｎおよびＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、および、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では、６００μｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて、選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、４００μｇ／ｍｌジェネティシン Ｇ４１８・２００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では、７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄにて選択培養をした。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡ（パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを固相化したもの）で測定した。

具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ社製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名；ＳＰＥＣＴＲＡ ＣＬＡＳＳＩＣ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｃｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８（入手先：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５６）から得られた抗体を用いた。結果を図４９に示す。図４９から明らかな通り、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）では抗体生産量が２倍程度上昇したが、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）では抗体生産量が更に上昇し、約３倍に増加した。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもので、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏからＰｕｒに変更したとき、抗体生産量が顕著に増加し、遺伝子発現安定化エレメント及びｍＲＮＡ不安定化配列を有さない発現コンストラクトに比べて、約５倍の抗体生産量を示した。

（６）抗ＫＯＤ抗体発現系での、Ｎ４配列とＣＨＯ５Δ３−３との組合せ効果のモノクローンにおける検討
続いて、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。

具体的には、実施例２７のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）のそれぞれについて、発現量上位クローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５０に示す。その結果、ポリクローンでの生産性を比較した場合と同様、遺伝子発現安定化エレメントを含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と比較して、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ，１．１ｋ／Ｈｙｇ）で抗体生産量が上昇したが、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｎｅｏ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｎｅｏ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）で抗体生産量が更に上昇していた。また、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したものでは、重鎖発現コンストラクトの薬剤耐性遺伝子をＮｅｏ・Ｎ４からＰｕｒ・Ｎ４に変更したとき、各細胞の抗体生産量が著しく増加し、高い抗体生産性を示すクローンの割合が顕著に大きくなった。この結果から抗体生産系における高生産性細胞の選択効率が飛躍的に向上することが確認された。

さらに、効果を確認するため、遺伝子発現安定化エレメントもｍＲＮＡ不安定化配列も含まないもの（−／Ｎｅｏ，−／Ｈｙｇ）と、高い抗体生産量を示した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を含み、さらに薬剤耐性遺伝子（Ｈ鎖：Ｐｕｒ、Ｌ鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について、前記９６ウェルプレートにおける２週間培養後のＥＬＩＳＡ測定によって算出されたＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を再度解析し、度数分布としてプロットした結果を図５１に示す。この結果、ＫＯＤ３Ｇ８生産量に対するクローンの分布は、１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４，１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４において有意に高生産側へシフトしており、極めて高い抗体生産性を有する細胞の割合が顕著に増大している。遺伝子発現安定化エレメントとｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの利用が、その相乗効果により、高生産細胞株取得に極めて大きく寄与していることが確認された。

抗ＫＯＤ抗体発現系での、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
（１）ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋの構築
次に、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合でも高生産細胞を取得可能か検討するため、図５２に示すスキームに従ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

なお、Ｈ鎖（重鎖）発現カセットとＬ鎖（軽鎖）発現カセットとをそれぞれ別々のベクターに配置した場合を「２コンストラクト抗体発現系」もしくは単に「２コンストラクト」といい、Ｈ鎖発現カセットとＬ鎖発現カセットを一つのベクター上に配置した場合を「シングルベクター抗体発現系」もしくは単に「シングルベクター」という。

まず、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋにＬ鎖発現カセット挿入用の制限酵素サイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。即ち、実施例２６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理し、ＥＦ−１αプロモーターを切り出した。一方、実施例１６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋから配列番号５８、５９のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩで処理して調製したＥＦ−１αプロモーターを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋのＢｇｌＩＩ、ＭｌｕＩサイトに導入して、ＥＦ−１αプロモーター上流にＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−Ｓを構築した。

続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳをＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理した。一方、実施例６の途中で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２から配列番号６０、６１のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体のＬ鎖発現カセットを、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ−ＳのＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに導入して、シングルベクターｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。

（２）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能か検討した。２コンストラクト抗体発現系として、実施例２７および２８で最も良好な結果が得られた遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を抗体発現カセットの上流および下流の両方に挿入し、薬剤耐性遺伝子（重鎖：Ｐｕｒ、軽鎖：Ｈｙｇ）にｍＲＮＡ不安定化配列（Ｎ４配列）を付加したもの（１．１ｋ／Ｐｕｒ・Ｎ４と１．１ｋ／Ｈｙｇ・Ｎ４）について抗体の重鎖発現コンストラクトと軽鎖発現コンストラクトの重量比が１：１となるように混合したプラスミド（制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズ済）をトランスフェクションに用いた。また、シングルベクター抗体発現系として、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズし、トランスフェクションに用いた。各々のプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、２コンストラクト発現系では７．５μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ・４００μｇ／ｍｌ ＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、シングルベクター系では１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図５３に示す。その結果、２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系間で、抗体生産量に差異はほとんど見られないことがわかった。

（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおける２コンストラクト抗体発現系とシングルベクター抗体発現系の比較
続いて、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。

具体的には、実施例３０のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、２コンストラクト抗体発現系、シングルベクター抗体発現系のそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図５４に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、シングルベクター抗体発現系と２コンストラクト抗体発現系間で、抗体発現量はほとんど変わらないことがわかった。このことから、シングルベクター抗体発現系でも、２コンストラクト抗体発現系と同様に抗体生産量が高いクローンを取得可能であることがわかった。

発現ベクターにおける各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ＣＨＯ５Δ３−３からの制限酵素認識配列の削除
続いて、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列を削除した。まず、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６２、６３のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳａｃＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６４、６５のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６６、６７のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を構築した。最後に、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号６８、６９のプライマーを使ってＣＨＯ５Δ３−３内に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を構築した。

（２）ｐＥＨＸの構築
マルチクローニングサイトと、実施例３２で作成した４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流に配する図５５に記載のｐＥＨＸを構築した。具体的には、実施例１６に記載のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７０、７１のプライマーを使ってＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下流に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ２・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７２、７３のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳａｌＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ３・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７４、７５のプライマーを使ってＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子内に存在する制限酵素ＳｍａＩサイトを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７６、７７のプライマーを使ってｆ１ ｏｒｉを削除したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号７８、７９のプライマーを使って制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５℃から６０℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥを構築した。次に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−ΔＨ−Δｆ１−ＲＥのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、配列番号８４、８５のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋを構築した。更に、ｐＥＦ１α−ＭＣＳ−Ｐｕｒ４・Ｎ４−１．１ｋのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号５２、８６のプライマーセットを使ってｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型にＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＨＸを構築した。

（３）ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）およびｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）の構築
次に、エレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、図５６に示すスキームに従って、ｐＥＨＸのマルチクローニングサイトにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した。具体的には、ｐＥＨＸのＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，２０のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。同様に、ｐＥＨＸのＢｓｉＷＩ、ＮｏｔＩサイトに、配列番号３，８７のプライマーセットを使ってｐＳＮＡＰｍを鋳型に増幅したＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）を構築した。

（４）ＳＮＡＰ２６ｍ発現系での、ＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
実施例２に記載の方法でトランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。一方、実施例１６で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、および実施例３４で構築したＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例５に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、それぞれ７．５、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例２に記載の方法で、細胞集団のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。

図５７は、薬剤選択後のｐＥＦ１α−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ、ｐＥＨ（Ｍ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）、ｐＥＨ（Ｂ−ＳＮＡＰ２６ｍ−Ｎ）で形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図５８に蛍光強度ＦＬ１が２００以上、１０００以上の細胞の割合のプロットを示す。この結果、薬剤選択中のＰｕｒｏｍｙｃｉｎ濃度に関わらず、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を用いたプラスミドを用いたほうがＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことが分かる。また、ｐＥＨＸにＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を挿入した場合、クローニングに使用した制限酵素サイトに関わらず、ＳＮＡＰｍ高発現細胞の割合が多いことも分かる。

抗体生産性における発現ベクターの各配列要素からの制限酵素認識配列削除の効果の確認
（１）ｐＥＬＸの構築
マルチクローニングサイトを含む図５９に記載のｐＥＬＸを構築した。具体的には、実施例６の途中で構築されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８８、８９のプライマーを使って制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を構築した。続いて、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ３を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号９０、９１のプライマーを使って、ｆ１ ｏｒｉとハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセットを削除し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を構築した。その後、ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ４を鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号８０、８１のプライマーを使って制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩサイトを挿入したｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４を構築した。そして、ｐＥＦ１α−ＭＣＳｐｒｅ−ＲＥ４の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩサイトに、配列番号８２、８３のプライマーを混合後、９５℃から６０℃まで徐々に温度を下げアニールさせて作成したＤＮＡ断片を挿入し、ｐＥＬＸを構築した。

（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、抗ＫＯＤ抗体発現系でエレメントからの制限酵素サイト削除の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

まず、ｐＥＨＸおよびｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、それぞれ抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子を挿入し、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）、およびｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例４に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の重鎖遺伝子を、ｐＥＨＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。同様に、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸの制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

そして、図６０に示すスキームに従って、ｐＥＬ（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、ｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を削除した効果を抗ＫＯＤ抗体発現系で検討した。制限酵素認識配列を削除していない遺伝子発現安定化配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例２９で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ，ＨＣ−Ｐｕｒ・Ｎ４−１．１ｋ／１．１ｋ（１．１ｋ）を用いた。また、遺伝子発現安定化配列から４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３７で構築したｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図６１に示す。その結果、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いことがわかった。

（４）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおけるＣＨＯ５Δ３−３から制限酵素認識配列の削除効果の検討
続いて、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を削除していないもの、削除したもののそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。

具体的には、実施例３８のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、ＣＨＯ５Δ３−３内の制限酵素認識配列を削除していないもの、削除したもののそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図６２に示す。その結果、ポリクローンでの結果と同様、４箇所の制限酵素認識配列を削除したＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）（１．１ｋ−ΔＲＥ）を用いたほうが、抗体生産量が高いことがわかった。この結果から、発現ベクターの各配列要素から制限酵素サイトを削除し最適化することで、抗体発現系においてもクローニングから目的タンパク質の高発現株構築まで簡便かつ効率的に実施することが可能になったと言える。

Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へのＣＨＯ５Δ３−３挿入効果の確認
３つ以上の遺伝子発現安定化エレメントの配置による効果の実証を行った。具体的には、２つの目的タンパク質の遺伝子発現カセットと薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットの上流及び下流に遺伝子発現安定化エレメントを配置した発現ベクターにおいて、さらに目的タンパク質の遺伝子発現カセットの間に遺伝子発現安定化エレメントを挿入した効果を、下記の方法にて試験した。
（１）ｐＥＬＸ２の構築
実施例３６で構築したｐＥＬＸの発現カセット下流に、４箇所の制限酵素認識配列を削除した遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を配した、図６３に記載のｐＥＬＸ２を構築した。具体的には、実施例３６で構築したｐＥＬＸを鋳型に、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いたＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法によって、配列番号９０、９２のプライマーを使って発現カセット下流に制限酵素ＮｈｅＩサイトを追加したｐＥＬＸ−Ｎを構築した。そして、ｐＥＬＸ−ＮのＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、遺伝子発現安定化エレメントＣＨＯ５Δ３−３を挿入し、ｐＥＬＸ２を構築した。実施例４０〜４３で使用した遺伝子発現安定化エレメントエレメントＣＨＯ５Δ３−３は、実施例３２で構築したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ−ΔＲＥ４を鋳型に、配列番号５０、９３のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した、４箇所の制限酵素認識配列を削除したものである。

（２）抗ＫＯＤ抗体発現ベクター：ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）の構築
続いて、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へのＣＨＯ５Δ３−３挿入の効果を確認すべく、ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

まず、ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに、抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を挿入しｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。具体的には、実施例６に記載のｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣから配列番号５６，５７のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖遺伝子を、ｐＥＬＸ２の制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩサイトに導入して、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

そして、図６４に示すスキームに従って、ｐＥＬ２（ＫＯＤ３Ｇ８）をＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｃａＩで処理して調製した抗ＫＯＤ抗体の軽鎖発現カセットを、実施例３７で構築したｐＥＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）の制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＳｐｅＩサイトに挿入し、ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を構築した。

（３）抗ＫＯＤ抗体発現系での、ポリクローンにおけるＬ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へのＣＨＯ５Δ３−３挿入効果の確認
抗ＫＯＤ抗体発現系における、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へＣＨＯ５Δ３−３を挿入した効果をポリクローンの段階で検討した。Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間にＣＨＯ５Δ３−３を含む抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例４１で構築したｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた。また、比較例として、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間にＣＨＯ５Δ３−３を含まない抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターとして、実施例３７で構築したｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた。制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズしたプラスミド２μｇを、実施例２に記載の方法で準備しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、１０μｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で、２週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

実施例２７と同様の標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。結果を図６５に示す。その結果、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へＣＨＯ５Δ３−３を挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた方が、比較例と比べて１．５倍高い抗体生産量を示し、抗体生産量が飛躍的に上昇したことがわかった。

（４）抗ＫＯＤ抗体発現系での、モノクローンにおけるＬ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へのＣＨＯ５Δ３−３挿入効果の確認
続いて、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間にＣＨＯ５Δ３−３を有する発現ベクター（ｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８））により形質転換された細胞群、および比較例として、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間にＣＨＯ５Δ３−３を有さない発現ベクター（ｐＥＬＨ（ＫＯＤ３Ｇ８））により形質転換された細胞群のそれぞれについて、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。

具体的には、実施例４２のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ・１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにてＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を測定した。標準品から作成した検量線をもとに各クローンの抗体生産量を算出し、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間にＣＨＯ５Δ３−３を含むもの、含まないもののそれぞれについて、発現量上位クローンを選択した。選択したクローンを拡大培養した後、１ウェル当たり１．８４×１０^５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を実施例２７と同様の方法でＥＬＩＳＡにて測定した。

標準品から作成した検量線をもとに算出した発現量上位５クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図６６に示す。その結果、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へＣＨＯ５Δ３−３を挿入した抗ＫＯＤ抗体発現用シングルベクターのｐＥＬＨ２（ＫＯＤ３Ｇ８）を用いた方が、抗体生産量が高いことがわかった。細胞株によっては２倍以上の生産量を示すものもあった。この結果から、Ｌ鎖発現カセットとＨ鎖発現カセットの間へも遺伝子発現安定化配列を挿入することで、より抗体生産量の高い細胞株を取得できることが明らかである。

本発明の、遺伝子発現安定化エレメント、ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、および目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有する発現ベクターは、目的タンパク質遺伝子のクローニングから組換えタンパク質の生産性の高い細胞を樹立するに至るまでを、迅速、かつ効率よく行うために大いに効果を発揮する。従って、本発明の発現ベクターを使用した細胞発現システムは、種々の動物細胞、特に哺乳類動物細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。

Claims (22)

1. ｍＲＮＡ不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット、３つ以上の遺伝子発現安定化エレメント、及び２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
2. ３つ以上の遺伝子発現安定化エレメントのうちの少なくとも１つが、２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットのいずれかの間に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の発現ベクター。
3. ｍＲＮＡ不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の３´非翻訳領域に存在するＡＴリッチ配列に由来することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の発現ベクター。
4. ｍＲＮＡ不安定化配列が、ＴＴＡＴＴＴＡ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の発現ベクター。
5. モチーフ配列が、２回以上繰り返されていることを特徴とする請求項４に記載の発現ベクター。
6. モチーフ配列の繰り返し間に１塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の発現ベクター。
7. ｍＲＮＡ不安定化配列中に１ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
8. 遺伝子発現安定化エレメントが、チャイニーズハムスターゲノム由来であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
9. 遺伝子発現安定化エレメントが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか一つからなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
   （ａ）配列番号２６で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域の配列を含むＤＮＡ
   （ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現安定化機能を有するＤＮＡ
   （ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
   （ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列から、ＡｓｃＩ，ＢｓｉＷＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＢＩ（若しくは、Ｃｓｐ４５Ｉ，ＮｓｐＶともいう。），ＣｐｏＩ，ＣｓｐＩ（若しくは、ＲｓｒＩＩともいう。），ＦｓｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰａｅＲ７１，ＳｇｒＡ１，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｐＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＥｃｏＲ１０５Ｉ（若しくは、ＳｎａＢＩともいう。），ＥｃｏＲＶ，ＮｒｕＩ，ＰｓｉＩ，ＳｍａＩ、及びＳｒｆＩからなる群より選ばれた少なくとも１つの制限酵素の認識配列を削除するように変異された配列からなるＤＮＡ
10. 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
11. 薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の発現ベクター。
12. 目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、所望の目的タンパク質遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイトを備えていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
13. ２つ以上の目的タンパク質の遺伝子発現カセットが、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
15. 宿主細胞が、動物細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の形質転換細胞。
16. 動物細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の形質転換細胞。
17. 哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の形質転換細胞。
18. 請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
19. 請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
20. 請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
21. タンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。