JP5377806B2 - ベクター構築物の細胞dnaとの非相同組換えによる内因性遺伝子の発現 - Google Patents
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Description
本発明の技術分野は、遺伝子発現の活性化またはin situ組換え法による遺伝子の過剰発現の誘発である。本発明は、細胞に通常見られるよりも高いレベルでの細胞における内在性遺伝子の発現に関する。遺伝子の発現は、遺伝子の発現を活性化する調節配列が、非相同的(non−homologous)または非正統的(illegitimate)組換えにより組込まれた後に、活性化または増加する。標的配列が組込みに全く必要ないため、この方法により、現在の方法では発見できない遺伝子の同定および発現が可能となる。従って、ヒトの疾病および発達に関連する遺伝子産物が、よく特徴づけられた遺伝子からだけでなく、シークエンスされておらず、実際、その存在が知られていない遺伝子からも得ることができる。本法は、治療および診断のための該遺伝子の遺伝子産物を提供する。
ヒトの疾病に関連する新規遺伝子の同定および過剰発現は、新規な治療薬の開発に向けて重要なステップである。タンパク質を過剰発現する細胞のライブラリーの創製に対する現在のアプローチは、cDNAの産生およびクローニングを基本とする。従って、このアプローチを使用して新規な遺伝子を同定するためには、遺伝子が、ライブラリーの作成に使用した細胞中に発現されていなければならない。遺伝子はまた、ライブラリー中に妥当に示されるに十分なレベルで発現されなければならない。これは、多くの遺伝子が非常に少ない量で、僅かな細胞個体群中に、または短い発達期間中にしか発現されていないため問題である。
本発明は、それ故、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在の予備知識を必要としない。
非相同的組換えによる遺伝子の活性化には、他の遺伝子活性化法よりも非常に多くの利点がある。以前のタンパク質過剰発現法とは異なり、本明細書に記載した方法は、目的の遺伝子をクローン化(細胞から単離)する必要がない。また、過剰発現する遺伝子のDNA配列または構造の知識(すなわち、ORF、イントロン、エキソン、または上流および下流調節エレメントの配列)、または遺伝子発現パターン(すなわち、組織特異性、発現調節等)の知識を全く必要としない。さらに、この方法は、目的の遺伝子のゲノム組織に関する知識を全く必要としない(すなわちイントロンおよびエキソン構造)。
1)調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンを有する構築物。
2)調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンをスプライスドナー部位と共に有する構築物。
3)調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
4)調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
5)調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
6)調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
7)調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
8)調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
9)調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
10)調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
11)調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
12)調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
13)調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
14)調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
15)調節配列、並びにリーディングフレーム1(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
16)調節配列、並びにリーディングフレーム2(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
17)調節配列、並びにリーディングフレーム3(スプライスドナー部位に関して)の(5'から3')翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
18)選択マーカーに結合した調節配列を、内部リボソーム侵入部位、および不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
19)cre/lox組換えシグナルが、a)調節配列と選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間およびb)iresと不対スプライスドナー部位との間に位置する構築物18。
20)停止コドンを欠失した緑蛍光タンパク質を含むエキソンに機能的に結合した調節配列を不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
いったん活性化ライブラリ(または複数のライブラリ)が作成されると、多くのアッセイを用いてスクリーニングが可能である。興味のあるタンパク質(たとえば、分泌されたウィルス細胞内タンパク質)の特性とライブラリを作成するのに用いる活性化作成物の性質によって、以下で説明するアッセイのいずれか、あるいはすべてを利用できる。他のアッセイ形式も使用できる。
酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)を用いて、活性化タンパク質を検出できる。活性化遺伝子生成物が分泌されると、活性化ライブラリ細胞のプールによる培養上清が、興味のあるタンパク質に固有の結合抗体を含むウェルでインキュベートされる。細胞または細胞のグループが興味のある遺伝子を活性化すると、タンパク質が培地に分泌される。ライブラリクローンのプール(プールは、1から100,000を超えるライブラリメンバの範囲でよい)をスクリーニングすると、興味のある遺伝子を活性化した細胞を含むプールが識別できる。それから、同朋選択、限界希釈、または当業者に周知の他の技術によって、興味のある細胞を他のライブラリ メンバから精製できる。分泌されたタンパク質に加えて、ELISAは、細胞間および膜結合タンパク質を発現する細胞のスクリーニングに用いることができる。このような場合、培養上清をスクーリンニングする代わりに、少数の細胞をライブラリプール(各細胞は、プールごとに少なくとも100から1,000回表現される)から除去し、溶解・清澄させ、抗体で被覆したウェルに加える。
ELISAスポットは、興味のあるタンパク質に固有の抗体で被覆される。被覆後、ウェルを1% BSA/PBSで1時間、37℃でブロックする。ブロック後、ランダム活性化ライブラリから100,000から500,000の細胞を各ウェルに加える(プール全体の最高10%を表現)。一般に、各ウェルにプール1個を宛てる。興味のあるタンパク質を発現する細胞の頻度が1/10000の場合(すなわち、プールが10,000個のクローンで構成されている場合、その中の1個が興味のあるタンパク質を発現する)、ウェル当たり500,000個の細胞で被覆すると、50個の特異性の細胞が得られる。細胞は、動かしたり、分散させたりせずに、37℃で24から48時間、ウェルでインキュベートする。インキュベーション後、細胞を除去し、プレートをPBS/0.05% Tween 20で3回、PBS/1%BSAで3回洗浄する。第2の抗体を適当な濃度でウェルに加え、室温で2時間か、4℃で16時間インキュベートする。これらの抗体はビオチン化するか、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)で直接標識できる。第2の抗体を除去し、プレートをPBS/1%BSAで洗浄する。HRPで標識した、第3の抗体またはストレプトアビジンを加え、室温で1時間インキュベートする。
蛍光細胞分析分離装置(FACS)を用いて、ランダム活性化ライブラリを多くの方法でスクリーニングできる。興味のある遺伝子が細胞表面タンパク質をコード化する場合、蛍光標識された抗体を活性化ライブラリによる細胞と共にインキュベートする。興味のある遺伝子が分泌タンパク質をコード化する場合、細胞をビオチン化して、興味のあるタンパク質に固有の抗体に結合したストレプトアビジンとインキュベートできる(Manzら、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)92:1921(1995))。インキュベーション後、細胞を高濃度のゼラチン(またはアガロースやメチルセルロースなど、他のポリマー)に入れて、分泌タンパク質の拡散を抑える。タンパク質が細胞から分泌されると、細胞表面に結合している抗体によって捕捉される。そして、興味のあるタンパク質の存在は、蛍光標識された第2の抗体によって検出される。細胞は、分泌タンパク質と膜結合タンパク質の両方について、蛍光シグナルに従って分類される。その後、蛍光細胞は単離、伸張され、さらにFACS、限界希釈、または、当業者に周知の他の細胞精製技術によって濃縮される。
この技術の原理は、FACと類似している。(上で説明した)膜結合タンパク質や捕捉された分泌タンパク質は、活性化ライブラリを、興味のあるタンパク質固有の抗体結合磁気ビーズでインキュベートすることで検出される。タンパク質が細胞表面にある場合、磁気ビーズはその細胞に結びつく。磁石を用いると、興味のあるタンパク質を発現する細胞を、ライブラリ中の他の細胞から精製できる。これらの細胞をビーズから除去し、伸張、分析し、必要ならばさらに精製する。
(少なくともプール中の各クローン数と等しい)少数の細胞を収集・溶解して、RNAを精製する。単離後、逆転写酵素を用いて、RNAが逆転写される。このとき、興味のあるcDNAに固有のプライマーを用いて、PCRが行われる。
本例では、活性化遺伝子に付与された表現型に基づいて細胞を選択できる。選択可能な表現型の例としては、増殖、成長因子独立成長、コロニー形成、細胞分化(たとえば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞など)、足場独立成長、細胞因子の活性化(たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど)、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化(たとえば、静止対活性化T細胞)が挙げられる。上で説明したような表現型を示す活性化細胞を単離することが重要なのは、組込作成物による内在性遺伝子の活性化がおそらく、認められた細胞表現型の原因であるためである。したがって、活性化遺伝子は、認められた表現型を処理したり、誘起するために重要な治療薬または薬ターゲットとなる。
膜関連タンパク質をコードする遺伝子は、医薬品開発の観点から特に興味深い。これらの遺伝子およびこれら遺伝子のコードするタンパク質は、例えば、コンビナトリアルケミストリーライブラリーやハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、低分子の医薬品を開発するのに利用可能である。また、これらのタンパク質やその可溶型タンパク質(例えば、膜貫通領域を欠いた切断型)は、ヒトや動物において治療的に活性のある医薬品として利用可能である。膜タンパク質の同定は、ツーハイブリッド研究法やアフィニティーキャプチャー技術を用いて、新規リガンド(例えば、サイトカイン、成長因子、および他のエフェクター分子)を同定するのにも利用可能である。他にも多くの膜タンパク質利用法が考えられる。
(方法:pRIG-1の構築)
ヒトDHFRは、PCRにて作製したHT1080細胞由来cDNAから、プライマーDHFR-F1(5'TCCTTCGAAGCTTGTCATGGTTGGTTCGCTAAACTGCAT 3')(SEQ ID NO:1)およびDHFR-R1(5'AAACTTAAGATCGATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAA 3')(SEQ ID NO:2)を用いてPCRにより増幅し、pTARGETTM(Promega)のT部位にクローニングしてpTARGET:DHFRを作製したPREP9をNheIとXbaIで切断してRSVプロモーターを単離し、pT
ARGET:DHFRのNhe I 切断部位に挿入してpTgT:RSV+DHFRを作製した。オリゴヌク
レオチドJH169(5' ATCCACCATGGCTACAGGTGAGTACTCG 3')(SEQ ID NO:3)とJH170(5' GATCCGAGTACTCACCTGTAGCCATGGTGGATTTAA 3')(SEQ ID NO:4)をアニーリングしてpTgT: RSV+DHFRのI-Ppo-IとNheI切断部位に挿入し、pTgT: RSV+DHFR+Exlを作
製した。プライマーTet F1(5' GGCGAGATCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAAT 3')(SEQ ID NO:5)およびTet F2(5' GGCCAGATCTGCTACCTTAAGAGAGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA 3')(SEQ ID NO:6)を用いて、PBR322のヌクレオチド230から508番に相当する279bpの領域をPCRにより増幅した。増幅した産物をBglIIで切断し、pTgT: RS
V+ RSV+DHFR+ExlのBamHI切断部位に挿入してpRIG-1を作製した。
遺伝子発現を活性化するため、上記したコンストラクトのグループ内から適した活性化コンストラクトを選択する。次に、当業者に周知のいずれかのトランスフェクション法により、選択した活性化コンストラクトを細胞に導入する。トランスフェクション法の例として、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、DEAEデキストラン法、および受容体依存性エンドサイトーシス法が挙げられる。細胞への導入に続き、DNAは非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、自然に生じた染色体の切れ目、あるいは人為的に誘発した染色体の切れ目で起こる。
pRIG−1によるヒト細胞のトランスフェクション。HT1080細胞のHPRT−サブクローンであるHH1細胞2x109コを、150mm組織培養プレートで90%コンフルエントになるまで培養した。細胞から培地を除去し、培養上清として保存した(以下を参照)。トリプシンで短時間インキュベーションすることによりプレートから細胞を剥がし、培地/10%ウシ胎児血清を添加してトリプシンを中和し、Jouan遠心機で5分間、1,000Rpmで遠心分離して沈殿させた。1xPBSで細胞を洗浄し、カウントし、上記のように再度沈殿させた。最終的に2.5x107コ細胞/mlになるように、1xPBS(Gibco BRL, Cat #14200−075)で細胞の沈殿を再懸濁した。次に、細胞を137Cs由来の50ラドのγ照射に曝露した。pRIG−1はBamHIにより直鎖状にし、フェノール/クロロホルムで精製し、エタノールにより沈殿させ、PBSに再懸濁した。精製し直鎖状にした活性化コンストラクトを、最終濃度40μg/mlになるように細胞懸濁液に添加した。次にDNA/照射細胞混合液を混合し、0.4cmのエレクトロポレーションキュベット(Biorad)に400μlずつ分注した。エレクトロポレーション装置(Biorad)を用いて、キュベットを250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルスの後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco/BRL)を含むαMEM/10%FBSに加えた。続いて、約7x106コ細胞/35mlのαMEM/10%FBS/ペニシリンストレプトマイシン(33%培養上清/67%新鮮培地)を含むプレートの割合で、細胞をプレーティングした。37℃で24時間インキュベーションした後、60mg/mlストックから最終濃度が500μg/mlになるように、それぞれのプレートにG418(Gibco/BRL)を添加した。4日間の選択後、培地を新鮮なαMEM/10% FBS/ペニシリンストレプトマイシン/500μg/ml G418で置換した。さらに7から10日間細胞をインキュベーションし、新規タンパク質因子の存在について培養上清をアッセイした、あるいは後に解析するため−80℃にて保存した。薬剤耐性のクローンは、後に解析するため液体窒素で保存した。
方法:90%コンフルエントの段階でHH1細胞を回収し、1xPBSで洗浄し、7.5x106コ細胞/mlになるように1xPBSで再懸濁した。細胞に、15μgの直鎖状化DNA(pRIG−1)を添加し混合した。それぞれのキュベットに400μlずつ分注し、エレクトロポレーション装置(Biorad)を用いて、250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、2.5mlのαMEM/10% FBS/1xペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけたうち300μlの細胞を、直ちに、あるいはトランスフェクション後1時間または4時間の時点で0,50,500,5000ラドで照射した。照射後直ちに、細胞を完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから24時間後、G418を最終濃度500μg/mlになるよう培養細胞に添加した。選択から7日後、培養液を500μg/mlのG418を含む新鮮完全培地に置換した。選択から10日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー/90%メタノール/10%酢酸で染色し、50細胞以上からなるコロニーをカウントした。
方法:90%コンフルエントの段階でHH1細胞を回収し、1xPBSで洗浄し、7.5x106コ細胞/mlになるように1xPBSで再懸濁した。組み込み効率をテストするため、15μgの直鎖状化DNA(PGK−βgeo)をそれぞれ400μlずつ分注した細胞に添加し、混合した。いくつかの分注細胞については、続いて制限酵素、XbaI,NotI,HindIII,IppoI(10から500units)を別々の細胞/DNA混合液に添加した。それぞれのキュベットに400μlずつ分注し、エレクトロポレーション装置(Biorad)を用いて、250volts,600μファラッド,50オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で10分間インキュベーションし、2.5mlのαMEM/10%FBS/1xペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけた全量2.5mlの細胞のうち、300μlを完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから24時間後、G418を最終濃度600μg/mlになるよう培養細胞に添加した。選択から7日後、培養液を600μg/mlのG418を含む新鮮完全培地に置換した。選択から10日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー/90%メタノール/10%酢酸で染色し、50細胞以上からなるコロニーをカウントした。
ベクターを宿主細胞のゲノムへ組み込んだ後、組み込みベクター上に位置する一つあるいはそれ以上の増幅可能マーカーを同時にあるいは連続して選択することにより、遺伝子座のコピー数が増幅される。例えば、二つの増幅可能マーカーを含むベクターがゲノムに組み込まれると、ベクター上に位置する両増幅可能マーカーを選択することにより、規定の遺伝子(すなわち、ベクター組み込み部位に位置する遺伝子)の発現は増加し得る。この研究法により、適当な遺伝子座(すなわち、組み込みベクターを含む遺伝子座)を増幅する細胞のクローンを非常に容易に単離できる。
pRIG8R1-CD2(図5A〜5D; SEQ ID NO:7), pRIG8R2-CD2(図6A〜6C; SEQ ID NO:8), およびpRIG8R3-CD2(図7A〜7C; SEQ ID NO:9)ベクターは、不対スプライスドナー部位の上流にあるエキソンに連結して働くCMV前初期遺伝子プロモーターを含む。ベクター上のエキソンはCD2の細胞外ドメイン(フレームの合う終止コドンを欠く)に連結したシグナルペプチドをコードする。それぞれのベクターは、スプライスドナー部位について異なるリーディングフレームにあるCD2をコードする。
4mlのトリプシンEDTAで細胞をトリプシン処理した。
細胞が遊離した後、8mlのアルファMEM/10%FBSを添加してトリプシンを中和した。
無菌のPBSで細胞を1回洗浄し、800xgで7分間、遠心分離して回収した。
細胞ペレットを2mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。
1mlをソーティングに用い、もう1mlを500μg/mlG418を含むアルファMEM/10%FBSで再度プレーティングして拡大培養し、保存した。
ソーティングに用いる細胞を無菌のアルファMEM/10%FBSで1回洗浄し、800xgで7分間、遠心分離して回収した。
上清を除去し、ペレットを1mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。アイソタイプコントロールでの染色用に、100μlの細胞を除去した。
900μlの細胞に200μlの抗CD2 FITC(Pharmingen カタログ#30054X)を添加し、もう一方で100μlの細胞に20μlのマウスIgG1アイソタイプコントロール(Pharmingen カタログ#33814X)を添加した。細胞を氷上で20分間インキュベーションした。
抗ヒトCD2 FITCで染色した細胞を含むチューブに、5mlのPBS/10%FBSを添加した。アイソタイプコントロールには、900μlのPBS/10%FBSを添加した。600xgで6分間遠心分離することにより、細胞を回収した。
チュから上清を除去した。アイソタイプコントロールで染色した細胞を500μlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁し、抗CD2 FITCで染色した細胞を1.5mlのアルファMEM/10%FBSに再懸濁した。
上記のように細胞をソーティングした後、ソーティングした細胞からPCRベースのクローニング法により活性化遺伝子を単離した。しかし、FACSソーティングした細胞から活性化遺伝子を単離するためには、遺伝子クローニングのいずれの周知方法も同様に用いることができる。
(1) PolyATract System 1000 mRNA 単離キット(Promega)を使用し、ライブラリー#1および#2由来の3x107コのCD2+細胞(上記のように、FACSにより5回ソーティングした)からmRNAを単離した。
(2) mRNAを単離した後、0.5μlの単離mRNAを99.5μlの水に希釈し、OD260測定によりmRNA濃度を定量した。CD2+細胞から21μgのmRNAを回収した。
(3) 以下のようにして第一鎖cDNA合成を行った。
(a) PCR機を4℃に保温している間に、以下の成分を順に添加して第一鎖反応混合液を準備した。
41μl DEPC処理ddH20
4μl 10mM各dNTP
8μl 0.1M DTT
16μl 5xMMLV第一鎖バッファー(Gibco−BRL)
5μl (10pmol/μl) コンセンサスポリアデニル化部位プライマー
GD.R1(SEQ ID NO:10)*
1μl RNAsin(Promega)
3μl (1.25μg/μl) mRNA
*注釈:GD.R1, 5' TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT 3'(SEQ ID NO
:10)は、mRNAの第一鎖cDNA合成用(遺伝子発見「Gene Discovery」)プライマーである。このプライマーはポリアデニル化シグナルAATAAAおよび下流のポリA領域にアニールするように設計してある。このプライマーにより、第一鎖にNotI切断部位が導入される。
サンプル調製後、以下のようにインキュベーションした。
(b) 70℃、1分
(c) 42℃、保温
(d) 37℃、30分
(e) 94℃、2分
(f) 4℃、5分
続いてそれぞれのサンプルに2μlの20 U/μl RNace−IT(Stratagene)を添加し、サンプルを37℃で10分間インキュベーションした。
(a) 1.7mlのシリコン処理したエッペンドルフチューブに80μlの第一鎖反応液を移し、400μlのPBを添加した。
(b) サンプルをPCR cleanupカラムに移し、14,000Rpmで2分間、遠心分離した。
(c) カラムを分解して流出液をデカントし、ペレットに750μlのPEを添加して、チューブを14,000Rpmで2分間遠心分離した。
(d) カラムを分解して流出液をデカントし、チューブを14,000Rpmで2分間遠心分離して樹脂を乾燥させた。
(e) 50μlのEBを用いて、14,000Rpmで2分間遠心分離することにより、カラムから新しくシリコン処理したエッペンドルフチューブに溶出した。
(a) 以下の成分を順に添加して、第二鎖反応混合液を室温で準備した。
ddH2O 55μl
10 x PCRバッファー 10μl
50 mM MgCl2 5μl
10 mM dNTPs 2μl
25 pmol/μl RIG.751−Bio* 4μl
25 pmol/μlGD.R2** 4μl
第一鎖産物 20μl
*注釈:RIG.F751−Bio, 5′Biotin−CAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGG 3′(SEQ ID NO:11)は、pRIGベクターから発現される転写物のキャップ部位にアニールする。
**注釈:GD.R2, 5' TTTTCGTCAGCGGCCGCATC 3'(SEQ ID NO:12)は、GD.R1プライマー(SEQ ID NO:10)を用いて作製したcDNAをPCR増幅するのに用いるプライマーである。GD.R2はGD.R1のサブ配列であり、ポリAシグナル配列に先行する縮重塩基まで一致する。
(b) 第二鎖合成の開始:
94℃、1分
1μlのTaq(5 U/μl, Gibco−BRL)を添加;
1μlのVent DNA pol(0.1 U/μl, New England Biolabs)を添加
(c) 63℃で2分間インキュベーション
(d) 72℃で3分間インキュベーション
(e) (b)のステップを4回繰り返す
(f) 72℃で6分間インキュベーション
(g) 4℃でインキュベーション(保温)
(h) 終了
(7) 第二鎖反応の産物をSA−PMPに直接添加し、室温で30分間インキュベーションした。
(8) 結合後、マグネットでSA−PMPを捕集し、上清を除去した。
(9) 500μlのSTEでビーズを3回洗浄した。
(10) ビーズを50μlのSTEに再懸濁し、マグネットを用いてチューブの底に捕集した。次に、ピペットでSTE上清を注意深く除去した。
(11) 50μlのddH20でビーズを再懸濁し、100℃のウォーターバスに2分間入れてPMPから精製cDNAを遊離させた。
(12) マグネットにPMPを捕集し、cDNAを含む上清を注意深く除去し、精製cDNAを回収した。
(13) 精製産物をきれいなチューブに移し、14,000Rpmで2分間遠心分離して残りのPMPをすべて除去した。
(a) 以下の成分を順に添加して、PCR反応混合液を室温で準備した。
H2O 59μl
10 x PCRバッファー 10μl
50 mM MgCl2 5μl
10 mM dNTPs 2μl
25 pmol/μl RIG.F781* 2μl
25 pmol/μl GD.R2 2μl
第二鎖産物 20μl
*注釈:RIG.F781, 5' ACTCATAGGCCATAGAGGCCTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAG 3'(SEQ ID NO:13)は、GD.F1, GD.F3, GD.F5−Bio, およびRIG.F751−Bioの下流にアニールし、cDNAの5'クローニング用にSfiI切断部位を付加する。このプライマーは、RIG エキソン1特異的第二鎖cDNAのnested PCR増幅に用いる。
(b) サーマルサイクラーの開始:
94℃、3分
1μlのTaq(5 U/μl, Gibco−BRL)を添加;
1μlのVent DNA pol(0.1 U/μl, New England Biolabs)を添加
次に(c)〜(e)のステップを10サイクル繰り返し、PCRを行った。
(c) 94℃、30秒
(d) 60℃、40秒
(e) 72℃、3分
続いて次のステップを行い、PCRを完了した。
(f) 94℃、30秒
(g) 60℃、40秒
(h) 72℃、3分
(i) 72℃ + 各サイクル20秒として10サイクル分
(j) 72℃、5分
(k) 4℃、保温
(16) SfiI切断後、5μlの1 M NaClと2μlのNotIをそれぞれのサンプルに加えて37℃で1時間インキュベーションし、第一鎖プライマー(GD.R1; SEQ ID NO:10)でコードされるNotI切断部位でcDNAの3’末を切断した。
(17) 続いて切断したDNAを1%低融点アガロースゲルで分画した。1.2 kb〜8 kbの範囲にあるcDNAをゲルから切り出した。
(18) QiaexII Gel Extraction(Qiagen)を用いて切り出したアガロースゲルからcDNAを回収した。400単位のT4DNAリガーゼ(NEB)を用いて、全量10μlの1xT4リガーゼバッファー(NEB)中で、2μlのcDNA(約30mg)を7μl(35ng)のpBS−HSP(SfiI/NotIで直鎖状化)にライゲーションした。
(20) 103コロニー/0.5μlライゲーションDNAを回収した。
(21) 以下のように、12.5μl容量のPCRでプライマーM13F20およびJH182(RIGエキソン1特異的)を用いて、これらのコロニーをエキソンについてスクリーニングした。
(a) 適当数の96ウェルプレートに100μlのLB(選択抗生物質を含む)を分注した。
(b) 単一コロニーを拾って96ウェルプレートの個々のウェルに播種し、プレートを37℃のインキュベーターに振盪せずに2〜3時間置いた。
(c) 以下のように、PCR反応「マスターミックス」を氷上で調製した。
(e) 100μlのE.coli培養液から2.5μlを、PCR反応プレートの対応するウェルに移した。
(f) 典型的なPCRサイクル条件でPCRを行った。
(i) 94℃/2分(細菌の溶解とプラスミドの変性)
(ii) 92℃変性で15分間;60℃プライマーアニーリングを20秒;72℃プライマー伸張を40秒を30サイクル
(iii) 72℃の最終伸張を5分
(iv) 4℃で保温
(g) 次にPCR反応液にブロモフェノールブルーを添加した;サンプルを混合し、遠心分離した後、全反応混合液をアガロースゲルにのせた。
(24) NEBバッファー3中、全量22μlで2μlのDNAをNotI, BamHI,XhoI,XbaI,HindIII,EcoRIで同時に切断し、1%アガロースゲルで電気泳動することにより多くの重複クローンを除去した。
このプロトコールにより、2つの異なるcDNAライブラリーをスクリーニングした。1つめのライブラリー(TMT#1)では、単離した活性化遺伝子8つをシークエンシングした。これら8つの遺伝子のうち、4つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、6つは新規遺伝子であった。2つめのライブラリー(TMT#2)では、単離した活性化遺伝子11個をシークエンシングした。これら11個の遺伝子のうち、1つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、1つの遺伝子は内在性膜タンパク質に相同な部分的にシークエンシングされた遺伝子をコードし、9つは新規遺伝子であった。単離した遺伝子がキャラクタライズされた既知遺伝子に相当する場合はすべて、その遺伝子は内在性膜タンパク質であった。
179761|gb|M76559|Human neuronal DHP-sensitive
voltage-dependent, calcium channel alpha-2b subunit mRNA
complete CDs.
Length = 3600
>gi|3183974|emb|Y10183|HSMEMD H.sapiens mRNA for MEMD protein
Length = 4235
TMT#2の顕著なアラインメント:
>gi|476590|gb|U06715|HSU06715 Human cytochrome B561, HCYTO B561,
mRNA,
partial CDs.
Length = 2463
>gi|2184843|gb|AA459959|AA459959 zx66c01.s1 Soares total fetus
Nb2HF8 9w Homo sapiens cDNA clone 796414 3' similar to
gb:J03171 INTERFERON-ALPHA RECEPTOR PRECURSOR
(HUMAN);
Length = 431
Claims (28)
- 真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列と、1つ以上の自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)を含むベクター構築物とをインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)翻訳開始コドン、分泌シグナル配列、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を前記分泌シグナル配列が内在性遺伝子へ機能的に連結するように非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)翻訳開始コドン、エピトープ標識、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)翻訳開始コドン、分泌シグナル配列、エピトープ標識、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列によって内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 内在性遺伝子のタンパク質を産生するためのインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された非レトロウイルス構成転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませるために前記インビトロの真核細胞を維持し、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
(c)前記転写調節配列によって、前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記インビトロの真核細胞を維持することと、
(d)前記内在性遺伝子の前記発現産物を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと
を含む方法。
- 内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するためのインビトロにおける方法であって、
(a)分泌シグナル配列に機能的に連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませるために前記インビトロの真核細胞を維持し、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列および前記分泌シグナル配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されていることと、
(c)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記インビトロの真核細胞を維持することと、
(d)前記内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと
を含む方法。
- 内在性遺伝子のタンパク質を産生するインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記細胞のゲノムにランダムに組み込ませ、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列および不対スプライスドナー配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
(c)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させることと、
(d)前記内在性遺伝子によりコードされている前記タンパク質を産生させることと
を含む方法。
- 真核細胞内で内在性遺伝子由来のタンパク質を産生させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列、および1つ以上の自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 真核細胞内の内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
(e)前記インビトロの真核細胞を無血清培地中で培養することと
を含む方法。
- 内在性遺伝子由来のタンパク質を産生させるためのインビトロにおける方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
(e)104細胞/mlで10リットルに相当する細胞量から前記タンパク質を単離することと
を含む方法。
- 内在性遺伝子由来のタンパク質の過剰発現をスクリーニングするインビトロにおける方法であって、
(a)エンハンサー配列、不対スプライスドナー配列、および自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)を含み、標的化配列を有さないベクター構築物を非相同組換えにより複数のインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、
(b)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(c)前記内在性遺伝子由来のタンパク質が過剰発現している細胞をスクリーニングすることと
を含む方法。
- インビトロにおいて内在性タンパク質を発見する方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(c)前記転写調節配列による内在性遺伝子のアップレギュレーションによって前記細胞内で前記内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させる条件下において血清使用量低減培地中で細胞を培養し、これにより、細胞調整培地を作製することと、
(d)前記内在性遺伝子由来のタンパク質が存在する前記調整培地をスクリーニングすることと
を含む方法。
- インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質の発現を強める方法であって、
(a)エンハンサー配列、不対スプライスドナー配列、および1つ以上の自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)を含み、標的化配列を含まないベクター構築物を複数のインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに導入することと、
(b)前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(c)内在性遺伝子を発現する前記インビトロの真核細胞をスクリーニングすることと、
(d)前記自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)および前記内在性遺伝子由来のタンパク質の発現が増加した細胞を選択することと
を含む方法。
- 内在性遺伝子がコードする内在性膜タンパク質を発現する真核細胞をインビトロにおいて同定するための方法であって、
(a)(i)開始コドンを含むエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と、
(ii)シグナル配列と
(iii)不対スプライスドナー配列を付けたエピトープ標識と
を含むベクター構築物を複数のインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
(d)前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションにより内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
(e)前記インビトロの真核細胞表面上のエピトープ標識の発現で前記インビトロの真核細胞をスクリーニングすることと
を含む方法。
- インビトロにおいて内在性遺伝子からタンパク質を産生するための方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませ、これにより、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
(c)前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記細胞を維持することと、
(d)前記内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと、
(e)前記タンパク質を精製することと
を含む方法。
- インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するための方法であって、
(a)不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列、ウィルス複製起点、および自己増幅性選択マーカー(amplifiable marker)を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
(b)前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列が前記内在性遺伝子に機能的に連結されるように、前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
(c)前記転写調節配列により前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
- 前記転写調節配列はプロモーターである、請求項1〜10、12、14、および16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項17に記載の方法。
- 前記転写調節配列はエンハンサーである、請求項5、9、10、12、14および15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子由来のタンパク質を発現する真核細胞を単離し、クローニングすることをさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項5、7および15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内在性遺伝子由来のタンパク質を単離することをさらに含む、請求項1〜4、6〜9および11〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エピトープ標識を発現する前記真核細胞を単離することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記転写調節配列は非レトロウイルス性である、請求項6および7に記載の方法。
- インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質発現を活性化する方法であって、
(a)内在性遺伝子を活性化することができる、不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターをインビトロの真核細胞内に導入することと、
(b)前記ベクターを導入する前あるいは後に、前記インビトロの真核細胞の染色体内にDNA切断を導入することができる薬剤で前記インビトロの真核細胞を処理することと、
(c)前記ベクターおよび前記内在性遺伝子間での機能的な連結の形成を得られるように、前記DNA切断に前記ベクターをランダムに組み込ませ、これにより、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記内在性遺伝子がベクターにコードされた1つ以上のヌクレオチド配列により活性化されることと
を含む方法。
- (c)における前記活性化は、前記インビトロの真核細胞を単離して培養することにより行われる、請求項28に記載の方法。
- 医薬の候補化合物のためのスクリーニング方法であって、
(a)転写調節配列および機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクターをインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、ここで、前記ベクターの組み込みは、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されることによって前記真核細胞内の内在性遺伝子の発現を活性化するものであり、
(b)前記真核細胞を培養して、これにより前記活性化された遺伝子由来のタンパク質を作製すること、
(c)前記真核細胞を1つ以上のテスト化合物で処理し、薬物活性についてスクリーニングされることと、
(d)1つ以上の前記テスト化合物の、前記遺伝子由来のタンパク質により誘導される細胞表現型と相互作用するかあるいは細胞表現型に作用する能力を決定することと
を含む方法。
- 医薬の候補化合物のためのスクリーニング方法であって、
(a)転写調節配列および機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクターをインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、ここで、前記ベクターの組み込みは、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されることによって前記宿主細胞内の内在性遺伝子由来のタンパク質の発現を活性化することであり、
(b)血清使用量低減培地で前記真核細胞を培養し、これにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を含む細胞調整培地を作製することと、
(c)前記細胞調整培地において、前記遺伝子産物と相互作用する前記テスト化合物の能力を決定することにより1つ以上のテスト化合物の薬物活性を調べることと
を含む方法。
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