BR112020012555A2 - composições de vcar e métodos para uso - Google Patents

composições de vcar e métodos para uso Download PDF

Info

Publication number
BR112020012555A2
BR112020012555A2 BR112020012555-5A BR112020012555A BR112020012555A2 BR 112020012555 A2 BR112020012555 A2 BR 112020012555A2 BR 112020012555 A BR112020012555 A BR 112020012555A BR 112020012555 A2 BR112020012555 A2 BR 112020012555A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
amino acid
car
acid sequence
cell
Prior art date
Application number
BR112020012555-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Ostertag
Devon Shedlock
Original Assignee
Poseida Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Poseida Therapeutics, Inc. filed Critical Poseida Therapeutics, Inc.
Publication of BR112020012555A2 publication Critical patent/BR112020012555A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

São descritos receptores antigênicos quiméricos de VHH (VCARs), transposons de VCAR que codificam os VCARs da invenção, células modificadas para expressar os VCARs da invenção, bem como métodos de fabricação e métodos de uso dos mesmos para terapia celular adotiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE VCAR E MÉTODOS PARA USO".
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício dos pedidos provisórios USSN 62/608.571, depositado em 20 de dezembro de 2017, e USSN 62/608.894, depositado em 21 de dezembro de 2017, cujo conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A invenção é dirigida à biologia molecular e, mais especificamente, a receptores antigênicos quiméricos e a transposons que contêm um ou mais VCARs, bem como a métodos de produção e uso dos mesmos.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[003] O conteúdo do arquivo denominado "POTH- 034_001WO_SeqListing_ST25_R.txt", criado em 19 de dezembro de 2018 e com 54,4 MB, é incorporado por referência na íntegra.
ANTECEDENTES
[004] Há uma necessidade sentida, mas não atendida, na técnica, de um método para direcionar a especificidade de uma célula imune sem o uso de sequências de anticorpos tradicionais ou fragmentos dos mesmos. A invenção fornece um receptor antigênico quimérico superior.
SUMÁRIO
[005] A invenção fornece um receptor antigênico quimérico (Chimeric Antigen Receptor, CAR) que compreende: (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos um anticorpo com um único domínio; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma sequência humana ou humanizada. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma sequência que não ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma sequência recombinante ou quimérica. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma VHH ou uma sequência que codifica uma VHH. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma VH ou uma sequência que codifica uma VH. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma VH da invenção ou uma sequência que codifica uma VH da invenção.
[006] A invenção fornece um receptor antigênico quimérico (CAR) que compreende: (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VHH; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Conforme usado ao longo da invenção, um CAR que compreende uma VHH é denominado como um VCAR. Em determinadas modalidades, a região de reconhecimento de antígeno pode compreender duas VHHs para produzir um VCAR biespecífico ou em tandem. Em determinadas modalidades, a região de reconhecimento de antígeno pode compreender três VHHs para produzir um VCAR triespecífico.
[007] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o ectodomínio pode compreender ainda um peptídeo sinalizador. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana. Em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda um peptídeo sinalizador. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana.
[008] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglew vagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-A; SEQ ID NO: 18000)
[009] ou as VHHs compreendem ou consistem na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactgg aatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggcc gcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgaga gccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgca aaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggc aagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccct gcacatgcaggcc-Vgccctagat; SEQ ID NO: 18001).
[0010] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (VH-B; SEQ ID NO: 18002)
[0011] ou a VHH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: aggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatgggggggggggggacgggggggc gggggggggggggggcgg
[0012] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-C; SEQ ID NO: 18004)
[0013] ou as VHHs compreendem ou consistem na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttg aatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcag attcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagag ccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgca aaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggc aagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccct gcacggagagcg-Vccccg; SEQ ID NO: 18005).
[0014] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewv sgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (VH-D; SEQ ID NO: 18006)
[0015] ou as VHHs compreendem ou consistem na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaattacgccatgacctggatcagacaggcccctggcaaaggcctgg aatgggtgtccggaattacaggcgacggcggcagcaccttttacgccgattctgtgaagggcag attcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagag ccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgca aaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggc aagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccct gcacggagagcg-Vc Dcc; SEQ ID NO: 18007).
[0016] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglew vsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-E; SEQ ID NO: 18008)
[0017] ou as VHHs compreendem ou consistem na sequência de ácidos nucleicos: atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctg cgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagg gcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaag ggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcg ggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagag gggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacc cgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccgg cggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggca ggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaaga agctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacgg ctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggt ccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggcc ggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggca agcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgca aaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggc aagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccct gcacggagagcg-Vgcctgat; SEQ ID NO: 18009).
[0018] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglew vsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-F; SEQ ID NO: 18010)
[0019] ou as VHHs compreendem ou consistem na sequência de ácidos nucleicos: atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcg ccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaaggg cctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaa gggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctga gggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagaga ggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccaca cccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccg gcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggc aggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaag aagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacg gctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccg gtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctggg ccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggagg caagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgca aaaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggc aagggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccct gcacatgcaggcc-V; SEQ ID NO: 18011).
[0020] A invenção fornece um receptor antigênico quimérico (CAR) que compreende: (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Conforme usado ao longo da invenção, um CAR que compreende uma VH é denominado como um VCAR. Em determinadas modalidades, a região de reconhecimento de antígeno pode compreender duas VHs para produzir um VCAR biespecífico ou em tandem. Em determinadas modalidades, a região de reconhecimento de antígeno pode compreender três VHs para produzir um VCAR triespecífico. Em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda um peptídeo sinalizador. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana. Em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda um peptídeo sinalizador. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades, o ectodomínio pode compreender ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana.
[0021] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, incluindo aqueles que compreendem um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH, a VH compreende uma sequência humana ou humanizada.
[0022] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, incluindo aqueles que compreendem um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH, a VH compreende uma sequência que não ocorre naturalmente.
[0023] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, incluindo aqueles que compreendem um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH, a VH não ocorre naturalmente.
[0024] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, incluindo aqueles que compreendem um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH, a VH compreende uma sequência recombinante ou quimérica.
[0025] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, incluindo aqueles que compreendem um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH, a VH é produzida por meio de um procedimento in vitro de seleção e recombinação por afinidade.
[0026] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglew vagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-A; SEQ ID NO: 18000)
[0027] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactgg aatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggcc gcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgaga gccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaa aaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca agggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctg cacatgcaggcc-Vgccctagat; SEQ ID NO: 18001).
[0028] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (VH-B; SEQ ID NO: 18002)
[0029] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgacactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttg aatgggtgtccggcatcattggctctggcgccaccacctactacgccgattctgtgaagggcagat tcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgaacctgcagatgaacagcctgagagc cgaggacaccgccatctactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagag gccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccag ctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgga gctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacat gcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgt atatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgt aggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgat gcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagaga ggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcgg agaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaa aaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca agggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctg cacatgcaggcc-V; SEQ ID NO: 18003).
[0030] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-C; SEQ ID NO: 18004)
[0031] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttg aatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcag attcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagag ccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaa aaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca agggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctg cacggagagcg-Vccccg; SEQ ID NO: 18005).
[0032] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewv sgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (VH-D; SEQ ID NO: 18006)
[0033] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: caagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgtaggttc ccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgatgcacc tgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagagaggagt acgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcggagaa agaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcctattct gagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccagggc ctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctagatga (VH-D; SEQ ID NO: 18007).
[0034] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglew vsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-E; SEQ ID NO: 18008)
[0035] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctg cgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagg gcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaag ggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcg ggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagag gggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacc cgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccgg cggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggca ggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaaga agctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacgg ctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggt ccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggcc ggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggca agcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaa aaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca agggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctg cacatgcaggcc-V; SEQ ID NO: 18009).
[0036] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, as VHs compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglew vsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (VH-F; SEQ ID NO: 18010)
[0037] ou a VH compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos: atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcg ccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaaggg cctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaa gggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctga gggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagaga ggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccaca cccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccg gcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggc aggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaag aagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacg gctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccg gtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctggg ccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggagg caagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaa aaggacaagatggccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca agggacacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctg cacggagagc; SEQ ID NO: 18011).
[0038] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende um anticorpo com um único domínio, VHH, VH ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio, VHH ou VH compreende ou consiste em uma sequência recombinante e/ou uma sequência quimérica. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio, VHH ou VH compreende ou consiste em uma sequência humana e/ou uma sequência humanizada.
[0039] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende um anticorpo com um único domínio. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio é um anticorpo à VHH ou VH. Em algumas modalidades, o anticorpo à VH é um anticorpo UniDab. Em algumas modalidades, o anticorpo à VH não é um fragmento de um anticorpo monoclonal de ocorrência natural.
[0040] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o peptídeo sinalizador pode compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana. Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o peptídeo sinalizador pode compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD8α humana. O peptídeo sinalizador de CD8α humana pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 18012). O peptídeo sinalizador de CD8α humana pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 18012) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com uma sequência de aminoácidos que compreende MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 18012). O peptídeo sinalizador de CD8α humana pode ser codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca (SEQ ID NO: 18013).
[0041] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o domínio transmembrana pode compreender uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana. Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o domínio transmembrana pode compreender uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD8α humana. O domínio transmembrana de CD8α pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 18014) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 18014). O domínio transmembrana de CD8α pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos que compreende: atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgt actgc (SEQ ID NO: 18015).
[0042] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o endodomínio pode compreender um endodomínio de CD3zeta humana.
[0043] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o pelo menos um domínio coestimulatório pode compreender um segmento intracelular de 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 humana ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, o pelo menos um domínio coestimulatório pode compreender um domínio coestimulatório de CD28 e/ou 4-1BB. O domínio coestimulatório de CD3zeta pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM
GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 18016)
[0044] ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM
GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 18016).
[0045] O domínio coestimulatório de CD3zeta pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos que compreende: cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtata acgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgac cccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgc agaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagagg caaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctct gcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 18017).
[0046] O domínio coestimulatório de 4-1BB pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 18018)
[0047] ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende: KRGRKKCELLYIFKQGQPFQQFF (SEQ ID NO: 18018).
[0048] O domínio coestimulatório de 4-1BB pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos que compreende: aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactac ccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 18019).
[0049] O domínio coestimulatório de 4-1BB pode estar localizado entre o domínio transmembrana e o domínio coestimulatório de CD28.
[0050] Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, a dobradiça pode compreender uma sequência derivada de uma sequência de CD8α, IgG4 e/ou CD4 humana. Em determinadas modalidades dos VCARs da invenção, a dobradiça pode compreender uma sequência derivada de uma sequência de CD8α humana. A dobradiça pode compreender uma sequência de aminoácidos de CD8 humana que compreende:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 18020)
[0051] ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende:
TTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 18020).
[0052] A sequência de aminoácidos de dobradiça de CD8 humana pode ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos que compreende: actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagt ctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttc gcctgcgac (SEQ ID NO: 18021).
[0053] As VHHs e/ou VCARs da invenção podem se ligar a um antígeno pelo menos com uma afinidade selecionada a partir de uma KD de menos de ou igual a 10−9 M, menos de ou igual a 10−10 M, menos de ou igual a 10−11 M, menos de ou igual a 10−12 M, menos de ou igual a 10−13 M, menos de ou igual a 10−14 M e menos de ou igual a 10−15 M. A KD pode ser determinada por meio de ressonância plasmônica de superfície.
[0054] A invenção fornece um VCAR anti-BCMA. A invenção fornece uma composição que compreende o VCAR da invenção e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0055] A invenção fornece um transposon que compreende o VCAR da invenção.
[0056] Os transposons da invenção podem compreender um gene de seleção para identificação, enriquecimento e/ou isolamento de células que expressam o transposon. Genes de seleção exemplificativos codificam qualquer produto gênico (por exemplo, transcrição, proteína, enzima) essencial para a viabilidade e sobrevivência celular. Exemplos de genes de seleção codificam qualquer produto gênico (por exemplo, transcrição, proteína, enzima) essencial para conferir resistência a um fármaco de desafio contra o qual a célula é sensível (ou que pode ser letal para a célula) na ausência do produto gênico codificado pelo gene de seleção. Genes de seleção exemplificativos codificam qualquer produto gênico (por exemplo, transcrição, proteína, enzima) essencial para a viabilidade e/ou sobrevivência em um meio celular sem um ou mais nutrientes essenciais para a viabilidade e/ou sobrevivência celular na ausência do gene de seleção. Exemplos de genes de seleção incluem, dentre outros, neo (que confere resistência à neomicina), DHFR (que codifica diidrofolato redutase e que confere resistência ao metotrexato), TYMS (que codifica timidilato sintetase), MGMT (que codifica O(6)- metilguanina-DNA metiltransferase), gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR1), ALDH1 (que codifica a família de Aldeído desidrogenase 1, membro A1), FRANCF, RAD51C (que codifica RAD51 Parálogo C), GCS (que codifica glucosilceramida sintase) e NKX2.2 (que codifica NK2 Homeobox 2).
[0057] Os transposons da invenção podem compreender um polipeptídeo pró-apoptótico indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo pró-apoptótico, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, a sequência não humana compreende um sítio de restrição.
Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante pode ser uma região de ligação de ligante multimérica.
Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção também podem ser denominados como um "interruptor de segurança iC9". Em determinadas modalidades, os transposons da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, os transposons da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, os transposons da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase 9 truncado, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ligante que compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) pode compreender uma modificação na posição 36 da sequência.
A modificação pode ser uma substituição de fenilalanina (F) por valina (V) na posição 36 (F36V). Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HLDLGN.
[0058] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATT TCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCT GGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGC CCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGG GAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACT GACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAG
GGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 18023).
[0059] Em determinadas modalidades, o agente de indução específico para a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V) e compreende AP20187 e/ou AP1903, ambos fármacos sintéticos.
[0060] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação é codificada por um aminoácido que compreende GGGGS (SEQ ID NO: 18024) ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 18025). Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o ligante não compreende um sítio de restrição.
[0061] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma arginina (R) na posição 87 da sequência. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma alanina (A) na posição 282 da sequência. Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase 9 truncados ou polipeptídeos de caspase 9 indutíveis da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRT GSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALD CCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSL GGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLD
DIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKT S (SEQ ID NO: 18026)
[0062] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGA TCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGAT CATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACG GACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTC TAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAA GAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATG GAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGC CAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGAC GGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGC ACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATC CAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGC CAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAAC CAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGC TGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTC TTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTC AGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGT GGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCA
AACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGC TTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 18027).
[0063] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo de caspase 9 truncado, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGH CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAK KMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPE DESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFV
SWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYK QMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 18028)
[0064] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagactt gcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgc aacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgt ggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagca acaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagct ggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatg ccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaactt ctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggag aaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgct ggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtc ccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctg tcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagcca aaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagca ccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggag ggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtc ttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagac actggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtgg caaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaaga aactgttctttaagacttcc (SEQ ID NO: 18029).
[0065] Os transposons da invenção podem compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, entre uma ou mais VHH(s) ou VCAR(s) da invenção e um gene de seleção da invenção. Os transposons da invenção podem compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, entre uma ou mais VHH(s) ou VCAR(s) da invenção e um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção. Os transposons da invenção podem compreender pelo menos dois peptídeos de autoclivagem, um primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a montante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção e um segundo primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a jusante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção.
[0066] O pelo menos um peptídeo de autoclivagem pode compreender, por exemplo, um peptídeo T2A, um peptídeo GSG-T2A, um peptídeo E2A, um peptídeo GSG-E2A, um peptídeo F2A, um peptídeo GSG-F2A, um peptídeo P2A ou um peptídeo GSG-P2A. Um peptídeo T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030). Um peptídeo GSG- T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031). Um peptídeo GSG-T2A pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggac ca (SEQ ID NO: 18032). Um peptídeo E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033). Um peptídeo GSG- E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034). Um peptídeo F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035). Um peptídeo GSG-F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:
18036) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036). Um peptídeo P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037). Um peptídeo GSG-P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038).
[0067] Os transposons da invenção podem compreender um primeiro e um segundo peptídeos de autoclivagem, o primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a montante de uma ou mais VHH(s) ou VCAR(s) da invenção, e o segundo peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a jusante de uma ou mais VHH(s) ou VCAR(s) da invenção. O primeiro e/ou o segundo peptídeos de autoclivagem podem compreender, por exemplo, um peptídeo T2A, um peptídeo GSG-T2A, um peptídeo E2A, um peptídeo GSG-E2A, um peptídeo F2A, um peptídeo GSG-F2A, um peptídeo P2A ou um peptídeo GSG-P2A. Um peptídeo T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030). Um peptídeo GSG-T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99
% de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031). Um peptídeo GSG-T2A pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggac ca (SEQ ID NO: 18032). Um peptídeo E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033). Um peptídeo GSG- E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034). Um peptídeo F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035). Um peptídeo GSG-F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036). Um peptídeo P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037). Um peptídeo GSG-P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038).
[0068] A invenção fornece uma composição que compreende o transposon da invenção. Em determinadas modalidades, a composição pode compreender ainda um plasmídeo que compreende uma sequência que codifica uma enzima transposase. A sequência que codifica uma enzima transposase pode ser uma sequência de mRNA.
[0069] Os transposons da invenção podem compreender transposons piggyBac. Em determinadas modalidades deste método, o transposon é um transposon de DNA de plasmídeo que tem uma sequência que codifica o receptor antigênico quimérico flanqueado por dois elementos isolantes cis-reguladores. Em determinadas modalidades, o transposon é um transposon piggyBac. As enzimas transposase da invenção podem incluir transposases piggyBac ou enzimas compatíveis. Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais o transposon é um transposon piggyBac, a transposase é uma transposase piggyBac ou Super piggyBac (SPB). Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais a transposase é uma transposase Super piggyBac (SPB), a sequência que codifica a transposase é uma sequência de mRNA.
[0070] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB). A enzima transposase piggyBac (PB) pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[0071] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[0072] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[0073] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[0074] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[0075] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[0076] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[0077] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[0078] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[0079] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[0080] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[0081] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em uma ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência:
[0082] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[0083] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[0084] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[0085] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[0086] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[0087] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[0088] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[0089] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[0090] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[0091] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[0092] Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em duas ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em três ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em cada uma das seguintes posições 30, 165, 282, e 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 30 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 165 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 282 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácidos na posição 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N).
[0093] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase Super piggyBac (SPB). Em determinadas modalidades, as enzimas transposase Super piggyBac (SPB) da invenção podem compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 14487, em que a substituição de aminoácidos na posição 30 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I), a substituição de aminoácidos na posição 165 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G), a substituição de aminoácidos na posição 282 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) e a substituição de aminoácidos na posição 538 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a enzima transposase Super piggyBac (SPB) pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[0094] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[0095] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[0096] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[0097] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[0098] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[0099] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00100] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00101] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00102] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[00103] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14484).
[00104] A invenção fornece um vetor que compreende o VCAR da invenção. Em determinadas modalidades, o vetor é um vetor viral. O vetor pode ser um vetor recombinante.
[00105] Os vetores virais da invenção podem compreender uma sequência isolada ou derivada de um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus adenoassociado ou qualquer combinação dos mesmos. O vetor viral pode compreender uma sequência isolada ou derivada de um vírus adenoassociado (AAV). O vetor viral pode compreender um AAV recombinante (rAAV). Vírus adenoassociados e vírus adenoassociados recombinantes exemplificativos da invenção compreendem duas ou mais sequências de repetição terminal invertida (Inverted Terminal Repeat, ITR) localizadas em cis ao lado de uma sequência que codifica uma VHH ou VCAR da invenção. Vírus adenoassociados e vírus adenoassociados recombinantes exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, todos os sorotipos (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9). Vírus adenoassociados e vírus adenoassociados recombinantes exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, híbridos de AAV autocomplementares (scAAV) e AAV que contém o genoma de um sorotipo e o capsídeo de outro sorotipo (por exemplo, AAV2/5, AAV-DJ e AAV-DJ8). Vírus adenoassociados e vírus adenoassociados recombinantes exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, rAAV-LK03.
[00106] Os vetores virais da invenção podem compreender um gene de seleção. O gene de seleção pode codificar um produto gênico essencial para a viabilidade e sobrevivência celular. O gene de seleção pode codificar um produto gênico essencial para a viabilidade e sobrevivência celular quando desafiado por condições seletivas de cultura de células. As condições seletivas de cultura de células podem compreender um composto prejudicial para a viabilidade ou sobrevivência celular e em que o produto gênico confere resistência ao composto. Genes de seleção exemplificativos da invenção podem incluir, dentre outros, neo (que confere resistência à neomicina), DHFR (que codifica diidrofolato redutase e que confere resistência ao metotrexato), TYMS (que codifica timidilato sintetase), MGMT (que codifica O(6)-metilguanina-DNA metiltransferase), gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR1), ALDH1 (que codifica a família de Aldeído desidrogenase 1, membro A1), FRANCF, RAD51C (que codifica RAD51 Parálogo C), GCS (que codifica glucosilceramida sintase), NKX2.2 (que codifica NK2 Homeobox) ou qualquer combinação dos mesmos.
[00107] Os vetores virais da invenção podem compreender um polipeptídeo pró-apoptótico indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo pró-apoptótico, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades, a sequência não humana compreende um sítio de restrição. Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante pode ser uma região de ligação de ligante multimérica. Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção também podem ser denominados como um "interruptor de segurança iC9". Em determinadas modalidades, os vetores virais da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades, os vetores virais da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades, os vetores virais da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase 9 truncado, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ligante que compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) pode compreender uma modificação na posição 36 da sequência. A modificação pode ser uma substituição de fenilalanina (F) por valina (V) na posição 36 (F36V). Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HLDLGN.
[00108] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATT TCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCT GGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGC CCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGG GAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACT GACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAG
GGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 18023).
[00109] Em determinadas modalidades, o agente de indução específico para a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V) compreende AP20187 e/ou AP1903, ambos fármacos sintéticos.
[00110] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação é codificada por um aminoácido que compreende GGGGGS (SEQ ID NO: 18024) ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 18025). Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o ligante não compreende um sítio de restrição.
[00111] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma arginina (R) na posição 87 da sequência. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma alanina (A) na posição 282 da sequência. Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase 9 indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRT GSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALD CCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSL GGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLD
DIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKT S (SEQ ID NO: 18026)
[00112] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGA TCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGAT CATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACG
GACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTC TAGTCTGCACTTTATGGTCGAA (SEQ ID NO: 18027).
[00113] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo de caspase 9 truncado, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGH CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAK KMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPE DESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFV
SWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYK QMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 18028)
[00114] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagactt gcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgc aacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgt ggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagca acaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagct ggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatg ccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaactt ctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggag aaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgct ggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtc ccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctg tcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagcca aaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagca ccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggag ggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtc ttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagac actggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtgg caaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaaga aactgttctttaagacttcc (SEQ ID NO: 18029).
[00115] Os vetores virais da invenção podem compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem. Em algumas modalidades, o vetor pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um peptídeo de autoclivagem está localizado entre um CAR e um gene de seleção. Em algumas modalidades, o vetor pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um primeiro peptídeo de autoclivagem está localizado a montante de um CAR e um segundo peptídeo de autoclivagem está localizado a jusante de um CAR.
Os vetores virais da invenção podem compreender pelo menos (um) peptídeo(s) de autoclivagem localizado(s), por exemplo, entre um ou mais de um VCAR, VCAR ou VCAR da invenção e um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção.
Os vetores virais da invenção podem compreender pelo menos dois peptídeos de autoclivagem, um primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a montante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção, e um segundo peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a jusante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção.
O peptídeo de autoclivagem pode compreender, por exemplo, um peptídeo T2A, um peptídeo GSG-T2A, um peptídeo E2A, um peptídeo GSG-E2A, um peptídeo F2A, um peptídeo GSG-F2A, um peptídeo P2A ou um peptídeo GSG-P2A.
Um peptídeo T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030). Um peptídeo GSG- T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031). Um peptídeo GSG-T2A pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggac ca (SEQ ID NO: 18032). Um peptídeo E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende
QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033). Um peptídeo GSG- E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034). Um peptídeo F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035). Um peptídeo GSG-F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036). Um peptídeo P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037). Um peptídeo GSG-P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038).
[00116] A invenção fornece um vetor que compreende o VCAR da invenção. Em determinadas modalidades, o vetor é uma nanopartícula. Exemplos de vetores de nanopartículas da invenção incluem, porém sem limitações, ácidos nucleicos (por exemplo, RNA, DNA, nucleotídeos sintéticos, nucleotídeos modificados ou qualquer combinação dos mesmos), aminoácidos (L-aminoácidos, D- aminoácidos, aminoácidos sintéticos, aminoácidos modificados ou qualquer combinação dos mesmos), polímeros (por exemplo, polimerossomas), micelas, lipídios (por exemplo, lipossomas), moléculas orgânicas (por exemplo, átomos de carbono, folhas, fibras, tubos), moléculas inorgânicas (por exemplo, fosfato de cálcio ou ouro) ou qualquer combinação dos mesmos. Um vetor de nanopartículas pode ser transportado passiva ou ativamente através de uma membrana celular.
[00117] Os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender um gene de seleção. O gene de seleção pode codificar um produto gênico essencial para a viabilidade e sobrevivência celular. O gene de seleção pode codificar um produto gênico essencial para a viabilidade e sobrevivência celular quando desafiado por condições seletivas de cultura de células. As condições seletivas de cultura de células podem compreender um composto prejudicial para a viabilidade ou sobrevivência celular e em que o produto gênico confere resistência ao composto. Genes de seleção exemplificativos da invenção podem incluir, dentre outros, neo (que confere resistência à neomicina), DHFR (que codifica diidrofolato redutase e que confere resistência ao metotrexato), TYMS (que codifica timidilato sintetase), MGMT (que codifica O(6)- metilguanina-DNA metiltransferase), gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR1), ALDH1 (que codifica a família de Aldeído desidrogenase 1, membro A1), FRANCF, RAD51C (que codifica RAD51 Parálogo C), GCS (que codifica glucosilceramida sintase), NKX2.2 (que codifica NK2 Homeobox) ou qualquer combinação dos mesmos.
[00118] Os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender um polipeptídeo pró-apoptótico indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo pró-apoptótico, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, a sequência não humana compreende um sítio de restrição.
Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante pode ser uma região de ligação de ligante multimérica.
Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção também podem ser denominados como um "interruptor de segurança iC9". Em determinadas modalidades, os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades, os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender um polipeptídeo de caspase indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase 9 truncado, em que o polipeptídeo pró- apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ligante que compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) pode compreender uma modificação na posição 36 da sequência. A modificação pode ser uma substituição de fenilalanina (F) por valina (V) na posição 36 (F36V). Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HLDLGN.
[00119] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATT TCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCT GGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGC CCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGG GAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACT GACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAG
GGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 18023).
[00120] Em determinadas modalidades, o agente de indução específico para a região de ligação de ligante pode compreender um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V) compreende AP20187 e/ou AP1903, ambos fármacos sintéticos.
[00121] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, a região de ligação é codificada por uma sequência de aminoácidos que compreende GGGGGS (SEQ ID NO: 18024) ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 18025). Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o ligante não compreende um sítio de restrição.
[00122] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma arginina (R) na posição 87 da sequência. Alternativamente, ou além disso, em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis, polipeptídeos de caspase indutíveis ou polipeptídeos de caspase 9 truncados da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma alanina (A) na posição 282 da sequência. Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis, polipeptídeos truncados ou caspase induteis caspase 9 polipeptídeos da invenção, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRT GSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALD CCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSL GGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLD
DIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKT S (SEQ ID NO: 18026)
[00123] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGA TCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGAT CATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACG GACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTC TAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAA GAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATG GAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGC CAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGAC GGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGC ACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCA AAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCAC GGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGG GAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGA GGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTA GTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATG GCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACG ACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGC TGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAAC
AGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAA GACTTCC (SEQ ID NO: 18027).
[00124] Em determinadas modalidades dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis em que o polipeptídeo compreende um polipeptídeo de caspase 9 truncado, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGH CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAK KMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPE DESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFV
SWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYK QMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 18028)
[00125] ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagactt gcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgc aacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgt ggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagca acaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagct ggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatg ccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaactt ctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggag aaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgct ggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtc ccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctg tcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagcca aaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagca ccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggag ggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtc ttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagac actggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtgg caaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaaga aactgttctttaagacttcc (SEQ ID NO: 18029).
[00126] Os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem. Em algumas modalidades, o vetor de nanopartículas pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um peptídeo de autoclivagem está localizado entre um VCAR e a nanopartícula. Em algumas modalidades, o vetor de nanopartículas pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um primeiro peptídeo de autoclivagem está localizado a montante de um VCAR e um segundo peptídeo de autoclivagem está localizado a jusante de um VCAR. Em algumas modalidades, o vetor de nanopartículas pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um primeiro peptídeo de autoclivagem está localizado entre um VCAR e a nanopartícula e um segundo peptídeo de autoclivagem está localizado a jusante do VCAR. Em algumas modalidades, o vetor de nanopartículas pode compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem e em que um primeiro peptídeo de autoclivagem está localizado entre um VCAR e a nanopartícula e um segundo peptídeo de autoclivagem está localizado a jusante do VCAR, por exemplo, entre o VCAR e um gene de seleção.
[00127] Os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender pelo menos um peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, entre uma ou mais VHH(s) ou VCAR(s) da invenção e um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção. Os vetores de nanopartículas da invenção podem compreender pelo menos dois peptídeos de autoclivagem, um primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a montante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção, e um segundo primeiro peptídeo de autoclivagem localizado, por exemplo, a jusante ou imediatamente a montante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção. O peptídeo de autoclivagem pode compreender, por exemplo, um peptídeo T2A, um peptídeo GSG-T2A, um peptídeo E2A, um peptídeo GSG-E2A, um peptídeo F2A, um peptídeo GSG-F2A, um peptídeo P2A ou um peptídeo GSG-P2A. Um peptídeo T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18030). Um peptídeo GSG- T2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18031). UM peptídeo
GSG-T2A pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggac ca (SEQ ID NO: 18032). Um peptídeo E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18033). Um peptídeo GSG- E2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18034). Um peptídeo F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18035). Um peptídeo GSG-F2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 18036). Um peptídeo P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18037). Um peptídeo GSG-P2A pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038) ou uma sequência que tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos que compreende GSG ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18038).
[00128] A invenção fornece uma composição que compreende um vetor da invenção.
[00129] A invenção fornece uma célula que compreende um VCAR da invenção. A invenção fornece uma célula que compreende um transposon da invenção. Em determinadas modalidades, a célula que compreende um VCAR, um transposon ou um vetor da invenção pode expressar um VCAR na superfície celular. A célula pode ser qualquer tipo de célula. De preferência, a célula é uma célula imune. A célula imune pode ser uma célula T, uma célula Natural Assassina (NK), uma célula de tipo Natural Assassina (NK), uma célula Assassina induzida por citocinas (CIK), uma célula progenitora hematopoiética, uma célula T derivada de sangue periférico (PB) ou uma célula T derivada de sangue do cordão umbilical (UCB). De preferência, a célula imune é uma célula T. A célula T pode ser uma célula de memória inicial, uma célula T de tipo tronco, uma célula de tipo TSCM, uma TSCM ou uma TCM. A célula T pode ser uma TSCM. A célula pode ser uma célula apresentadora de antígeno artificial a qual, opcionalmente, pode ser usada para estimular e expandir uma célula imune modificada ou célula T da invenção. A célula pode ser uma célula tumoral a qual, opcionalmente, pode ser usada como uma célula apresentadora de antígeno artificial ou modificada.
[00130] As células modificadas da invenção que podem ser usadas para terapia adotiva podem ser autólogas ou alogênicas.
[00131] A invenção fornece um método para expressar um VCAR na superfície de uma célula que compreende: (a) obter uma população de células; (b) contatar com a população de células com uma composição que compreende um VCAR da invenção ou uma sequência que codifica o VCAR sob condições suficientes para transferir o VCAR através de uma membrana celular de pelo menos uma célula na população de células, deste modo, gerando uma população de células modificadas; (c) cultivar a população de células modificadas sob condições adequadas para integração do transposon; e (d) expandir e/ou selecionar pelo menos uma célula a partir da população de células modificadas que expressam o VCAR na superfície celular.
[00132] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, a população de células pode compreender leucócitos e/ou leucócitos CD4+ e CD8+. A população de células pode compreender leucócitos CD4+ e CD8+ em uma proporção otimizada. A proporção otimizada de leucócitos CD4+ para CD8+ não ocorre naturalmente in vivo. A população de células pode compreender uma célula tumoral.
[00133] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, um transposon ou vetor compreende o VCAR ou a sequência que codifica o VCAR.
[00134] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as condições suficientes para transferir a sequência que codifica o VCAR através de uma membrana celular de pelo menos uma célula na população de células compreende nucleofecção.
[00135] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as condições suficientes para transferir a sequência, que codifica o VCAR através de uma membrana celular de pelo menos uma célula na população de células, compreendem pelo menos uma de aplicação de um ou mais pulsos de eletricidade em uma tensão especificada, um tampão e um ou mais fatores suplementares. Em determinadas modalidades, o tampão pode compreender PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, Amaxa Nucleofector, tampão de nucleofecção de células T humanas ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, o um ou mais fatores suplementares podem compreender (a) uma citocina humana recombinante, uma quimiocina, uma interleucina ou qualquer combinação das mesmas; (b) um sal, um mineral, um metabólito ou qualquer combinação dos mesmos; (c) um meio celular; (d) um inibidor da detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, uma ou mais vias apoptóticas ou combinações dos mesmos; e (e) um reagente que modifica ou estabiliza um ou mais ácidos nucleicos.
A citocina humana recombinante, a quimiocina, a interleucina ou qualquer combinação das mesmas podem compreender IL2, IL7, IL12, IL15, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM- CSF, IFN-gama, IL-1 alfa/IL -1F1, IL-1 beta/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL- 35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, Heterodímero IL-17A/F, IL-17F, IL -18/IL- 1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 beta, IL-32 gama, IL-33, LAP (TGF-beta 1), Linfotoxina alfa/TNF-beta, TGF -beta, TNF-alfa, TRANCE/TNFSF11/RANK L ou qualquer combinação dos mesmos.
O sal, o mineral, o metabólito ou qualquer combinação dos mesmos podem compreender HEPES, Nicotinamida, Heparina, Piruvato de Sódio, L-Glutamina, Solução de Aminoácido Não Essencial MEM, Ácido Ascórbico, Nucleosídeos, FBS/FCS, Soro humano, substituto sérico, antibióticos, reguladores de pH, sais de Earle, 2-mercaptoetanol, transferrina humana, insulina humana recombinante, albumina sérica humana, suplemento Nucleofector PLUS, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, lactobionato de sódio, manitol, succinato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, Glicose, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, Polietilenimina, Polietileno glicol, Poloxâmero 188, Poloxâmero 181, Poloxâmero 407, Polivinilpirrolidona, Pop313, Crown-5 ou qualquer combinação dos mesmos.
O meio celular pode compreender PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V,
X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult- XF T Cell Expansion Medium ou qualquer combinação dos mesmos. O inibidor de detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, uma ou mais vias apoptóticas ou combinações dos mesmos compreende inibidores de TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, interferons de tipo 1, citocinas pró-inflamatórias, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase 1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, inibidores de quinase-3β de glicogênio sintase (GSK-3β) (por exemplo, TWS119), Bafilomicina, cloroquina, quinacrina, AC-YVAD-CMK, Z-VAD- FMK, Z-IETD-FMK ou qualquer combinação dos mesmos. O reagente que modifica ou estabiliza um ou mais ácidos nucleicos compreende um modificador de pH, uma proteína de ligação a DNA, um lipídio, um fosfolipídio, CaPO4, um peptídeo de ligação a DNA com carga neutra e com ou sem uma sequência NLS, uma enzima TREX1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00136] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as condições adequadas para a integração do VCAR ou uma sequência que codifica o VCAR da invenção compreendem pelo menos um de um tampão e um ou mais fatores suplementares. Em determinadas modalidades, um transposon ou vetor da invenção compreende o VCAR ou uma sequência que codifica o VCAR da invenção. Em determinadas modalidades, o tampão pode compreender PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, Amaxa Nucleofector, tampão de nucleofecção de células T humanas ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, o um ou mais fatores suplementares podem compreender (a) uma citocina humana recombinante, uma quimiocina, uma interleucina ou qualquer combinação das mesmas; (b) um sal, um mineral, um metabólito ou qualquer combinação dos mesmos; (c) um meio celular; (d) um inibidor da detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, uma ou mais vias apoptóticas ou combinações dos mesmos; e (e) um reagente que modifica ou estabiliza um ou mais ácidos nucleicos.
A citocina humana recombinante, a quimiocina, a interleucina ou qualquer combinação das mesmas podem compreender IL2, IL7, IL12, IL15, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-gama, IL-1 alfa/IL -1F1, IL-1 beta/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, Heterodímero IL-17A/F, IL-17F, IL -18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 beta, IL-32 gama, IL-33, LAP (TGF-beta 1), Linfotoxina alfa/TNF-beta, TGF -beta, TNF-alfa, TRANCE/TNFSF11/RANK L ou qualquer combinação dos mesmos.
O sal, o mineral, o metabólito ou qualquer combinação dos mesmos podem compreender HEPES, Nicotinamida, Heparina, Piruvato de Sódio, L-Glutamina, Solução de Aminoácido Não Essencial MEM, Ácido Ascórbico, Nucleosídeos, FBS/FCS, Soro humano, substituto sérico, antibióticos, reguladores de pH, sais de Earle, 2-mercaptoetanol, transferrina humana, insulina humana recombinante, albumina sérica humana, suplemento Nucleofector PLUS, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, lactobionato de sódio, manitol, succinato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, cloreto de sódio, Glicose, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, Polietilenimina, Polietileno glicol, Poloxâmero 188, Poloxâmero 181, Poloxâmero 407, Polivinilpirrolidona, Pop313, Crown-5 ou qualquer combinação dos mesmos.
O meio celular pode compreender PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium ou qualquer combinação dos mesmos.
O inibidor de detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, uma ou mais vias apoptóticas ou combinações dos mesmos compreende inibidores de TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, interferons de tipo 1, citocinas pró-inflamatórias, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase 1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, inibidores de quinase-3β de glicogênio sintase (GSK-3β) (por exemplo, TWS119), Bafilomicina, cloroquina, quinacrina, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK ou qualquer combinação dos mesmos. O reagente que modifica ou estabiliza um ou mais ácidos nucleicos compreende um modificador de pH, uma proteína de ligação a DNA, um lipídio, um fosfolipídio, CaPO4, um peptídeo de ligação a DNA com carga neutra e com ou sem uma sequência NLS, uma enzima TREX1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00137] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as etapas de expansão e seleção ocorrem sequencialmente. A expansão pode ocorrer antes da seleção. A expansão pode ocorrer após a seleção e, opcionalmente, uma outra seleção (isto é, segunda) pode ocorrer após a expansão.
[00138] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as etapas de expansão e seleção podem ocorrer simultaneamente.
[00139] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, a expansão pode compreender contatar pelo menos uma célula da população de células modificadas com um antígeno para estimular a pelo menos uma célula através do VCAR, deste modo, gerando uma população de células expandida. O antígeno pode ser apresentado na superfície de um substrato. O substrato pode ter qualquer forma incluindo, sem limitação, uma superfície, uma cavidade, uma esfera ou uma pluralidade dos mesmos e uma matriz. O substrato pode compreender ainda um componente paramagnético ou magnético. Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, o antígeno pode ser apresentado na superfície de um substrato, em que o substrato é uma esfera magnética e em que um ímã pode ser usado para remover ou separar as esferas magnéticas da população de células modificadas e expandidas. O antígeno pode ser apresentado na superfície de uma célula ou em uma célula apresentadora de antígeno artificial. As células apresentadoras de antígeno artificiais da invenção podem incluir, porém sem limitações, células tumorais e células-tronco.
[00140] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, o transposon ou vetor compreende um gene de seleção e a etapa de seleção compreende contatar pelo menos uma célula da população de células modificadas com um composto ao qual o gene de seleção confere resistência, deste modo, identificando uma célula que expressa o gene de seleção como sobrevivendo à seleção e identificando uma célula que falha em expressar o gene de seleção como não sobrevivendo à etapa de seleção.
[00141] Em determinadas modalidades deste método de expressão de um VCAR, as etapas de expansão e/ou seleção podem prosseguir por um período de 10 a 14 dias, incluindo os pontos terminais.
[00142] A invenção fornece uma composição que compreende a população de células modificadas, expandidas e selecionadas através dos métodos da invenção.
[00143] A invenção fornece um método de tratamento de câncer em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção, em que o VCAR se liga especificamente a um antígeno em uma célula tumoral. Em determinadas modalidades, a célula tumoral pode ser uma célula tumoral maligna. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção e a célula ou população de células pode ser autóloga. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser alogênica.
[00144] A invenção fornece um método de tratamento de uma condição autoimune em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção, em que o VCAR se liga especificamente a um antígeno em uma célula autoimune do indivíduo. Em determinadas modalidades, a célula autoimune pode ser um linfócito que se liga especificamente a um autoantígeno em uma célula-alvo do indivíduo. Em determinadas modalidades, a célula autoimune pode ser um linfócito B (isto é, uma célula B). Em determinadas modalidades, a célula autoimune pode ser um linfócito T (isto é, uma célula T). Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser autóloga. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser alogênica.
[00145] A invenção fornece um método de tratamento de uma infecção em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção, em que o VCAR se liga especificamente a um antígeno em uma célula que compreende um agente infeccioso, uma célula em comunicação com um agente infeccioso ou uma célula exposta a um agente infeccioso. Em algumas modalidades, uma célula em comunicação com um agente infeccioso pode estar em comunicação aérea (por exemplo, o agente infeccioso é transmitido pelo ar ou inalado) ou comunicação fluídica (por exemplo, o agente infeccioso é transportado em um fluido aquoso ou biológico) com o infeccioso agente. O agente infeccioso que causa a infecção da célula hospedeira pode ser uma bactéria, um vírus, uma levedura ou um micróbio. O agente infeccioso pode induzir, na célula ou no organismo hospedeiro da célula (o indivíduo), condições exemplificativas incluindo, porém sem limitações, uma infecção viral, uma condição de imunodeficiência, uma condição inflamatória e um transtorno proliferativo. Em determinadas modalidades, a infecção causa tuberculose, microencefalia, neurodegeneração ou malária. Em determinadas modalidades, a infecção causa microencefalia em um feto do indivíduo. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas nas quais a infecção causa microencefalia em um feto do indivíduo, o agente infeccioso é um vírus e em que o vírus é um Zika vírus. Em determinadas modalidades, a condição de imunodeficiência é síndrome da imunodeficiência adquirida (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS). Em determinadas modalidades, o transtorno proliferativo é um câncer. Em determinadas modalidades, o câncer é câncer cervical e em que o agente infeccioso é um papiloma vírus humano (HPV). Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser autóloga. Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser alogênica.
[00146] A invenção fornece um método de tratamento de uma doença de mastócitos em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção, em que o VCAR se liga especificamente a um antígeno em um mastócito.
Em determinadas modalidades, o VCAR se liga especificamente a um antígeno em um mastócito do indivíduo.
Em determinadas modalidades, a doença de mastócitos pode incluir, porém sem limitações, transtornos associados a uma proliferação excessiva de mastócitos, transtornos associados a mastócitos com atividade anormal e transtornos associados a números anormais de mastócitos e atividade anormal de mastócitos.
Transtornos exemplificativos associados a uma proliferação excessiva de mastócitos incluem, dentre outros, mastocitose, mastocitose cutânea (por exemplo, urticária pigmentosa ou mastocitose cutânea maculopapular), mastocitose sistêmica (incluindo leucemia mastocítica) e proliferações localizadas de mastócitos.
Transtornos exemplificativos associados a mastócitos com atividade anormal incluem, porém sem limitações, síndrome de ativação de mastócitos (MCAS) ou transtorno de ativação de mastócitos (MCAD), doença alérgica (incluindo anafilaxia), asma, doença inflamatória (incluindo inflamação relacionada à doença autoimune, por exemplo, tecidos articulares, artrite, etc.) ou qualquer combinação dos mesmos.
Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser autóloga.
Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a população de células ou células pode ser alogênica.
A invenção fornece um método de tratamento de uma doença degenerativa em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição da invenção, em que o VCAR se liga especificamente a um antígeno em uma célula deletéria ou em uma célula envelhecida.
Em determinadas modalidades, o VCAR se liga especificamente a um antígeno em uma célula deletéria ou em uma célula envelhecida do indivíduo.
Em determinadas modalidades, a doença degenerativa pode incluir, porém sem limitações, um transtorno neurodegenerativo, um transtorno metabólico, um transtorno vascular e envelhecimento.
Transtornos neurodegenerativos exemplificativos incluem, porém sem limitações, transtornos associados à perda de uma função ou eficácia de um ou mais de um neurônio, célula glial ou microglia.
Transtornos neurodegenerativos exemplificativos incluem, porém sem limitações, transtornos associados a um acúmulo de uma ou mais moléculas de sinalização, proteínas ou príons que interferem em uma função ou diminuem a eficácia de um ou mais neurônios, célula glial ou microglia.
Transtornos metabólicos exemplificativos incluem, porém sem limitações, transtornos associados a transtornos mitocondriais, interrupções da cadeia de transporte de elétrons, interrupções da produção celular de ATP, perda de uma função ou diminuição da eficácia de uma ou mais mitocôndrias de um ou mais de um neurônio, uma célula glial ou uma microglia.
Transtornos metabólicos exemplificativos incluem, porém sem limitações, transtornos associados a uma perda de fluxo sanguíneo em circulação ou a um fluxo sanguíneo reduzido para um neurônio, uma célula glial ou uma microglia (por exemplo, acidente vascular cerebral); um estado transitório ou permanente de hipóxia em um neurônio, uma célula glial ou uma microglia (por exemplo, suficiente para liberar radicais livres em uma célula); uma perda de fluxo em circulação no SNC ou um fluxo reduzido do SNC para um neurônio, uma célula glial ou uma microglia durante um estado de sono do indivíduo, suficiente para diminuir a eficácia da remoção de um produto residual de um neurônio, uma célula glial ou uma microglia durante este estado de sono.
Transtornos de envelhecimento exemplificativos incluem, porém sem limitações, transtornos associados a um aumento de telômeros encurtados ou encurtados em um ou mais cromossomos de um neurônio, uma célula glial ou uma microglia; perda de uma função ou diminuição da eficácia de telomerase em um neurônio, célula glial ou microglia; ou perda de uma função ou diminuição da eficácia de um mecanismo de reparo de DNA em um neurônio, célula glial ou microglia.
Em determinadas modalidades, a célula deletéria ou a célula envelhecida interfere com uma função ou diminui a eficácia de outra célula em uma rede que compreende a célula deletéria ou a célula envelhecida e a remoção direcionada da célula deletéria ou da célula envelhecida melhora ou restaura uma função ou aumenta a eficácia da rede.
Em determinadas modalidades, a célula deletéria ou a célula envelhecida pode transformar a função ou eficácia de uma segunda célula e a remoção direcionada da célula deletéria ou da célula envelhecida evita a transformação da segunda célula.
Em determinadas modalidades, a doença degenerativa é um transtorno neurodegenerativo e a célula deletéria ou a célula envelhecida é uma célula-tronco, uma célula imune, um neurônio, uma glia ou uma microglia.
Em determinadas modalidades, a doença degenerativa é um transtorno metabólico e a célula deletéria ou a célula envelhecida é uma célula-tronco, uma célula somática, um neurônio, uma glia ou uma microglia.
Em determinadas modalidades, a doença degenerativa é um transtorno vascular e a célula deletéria ou a célula envelhecida é uma célula-tronco, uma célula somática, uma célula imune, uma célula endotelial, um neurônio, uma glia ou uma microglia.
Em determinadas modalidades, a doença degenerativa é envelhecimento e a célula deletéria ou a célula envelhecida é um oócito, um espermatozoide, uma célula-tronco, uma célula somática, uma célula imune, uma célula endotelial, um neurônio, uma glia ou uma microglia.
Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser autóloga.
Em determinadas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo a composição que compreende uma célula ou população de células modificadas da invenção, em que a célula ou população de células pode ser alogênica.
[00147] A invenção fornece um método para modificar uma terapia celular em um indivíduo que precisa do mesmo que compreende administrar ao indivíduo uma composição que compreende uma célula que compreende um transposon ou vetor da composição que compreende um polipeptídeo pró- apoptótico indutível, em que a apoptose pode ser induzida seletivamente na célula ao contatá-la com um agente de indução. Em determinadas modalidades, a célula é autóloga. Em determinadas modalidades, a célula é alogênica. Em determinadas modalidades deste método, a terapia celular é uma terapia celular adotiva. Em determinadas modalidades deste método, a modificação da terapia celular compreende um término da terapia celular. Em determinadas modalidades deste método, a modificação da terapia celular compreende uma depleção de uma parte das células fornecida na terapia celular. Em determinadas modalidades, o método compreende ainda a etapa de administrar um inibidor do agente de indução para inibir a modificação da terapia celular, deste modo, restaurando a função e/ou eficácia da terapia celular.
[00148] Métodos de modificação de uma terapia celular da invenção podem ser usados para terminar ou reduzir uma terapia em resposta, por exemplo, a um sinal de recuperação ou um sinal de diminuição/gravidade/progressão da doença, um sinal de remissão/cessação da doença e/ou a ocorrência de um evento adverso. As terapias celulares da invenção podem ser retomadas ao inibir o agente de indução se um sinal ou sintoma da doença reaparecer ou a gravidade aumentar e/ou um evento adverso for resolvido.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00149] A Figura 1 é um gráfico que mostra a variação de peso em função dos dias após o tratamento com os VCARs da invenção.
[00150] A Figura 2 é um gráfico que mostra a carga tumoral em função dos dias após tratamento com os VCARs da invenção.
[00151] A Figura 3 é um gráfico que mostra a porcentagem de sobrevida em função dos dias após tratamento com os VCARs da invenção.
[00152] A Figura 4 é um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-A (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00153] A Figura 5 é um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-B (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00154] A Figura 6 é um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-C (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00155] A Figura 7 é um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-D (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00156] A Figura 8 mostra um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-E (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00157] A Figura 9 mostra um gráfico da carga tumoral, conforme mostrado pelo sinal de bioluminescência em função dos dias após tratamento com VH-F (triângulos), um CAR irrelevante (quadrados) ou nenhum tumor/nenhum CAR-T (círculos).
[00158] A Figura 10A é uma tabela que fornece sequências de consenso de regiões estruturais (framework) e sequências de CDR para VHs exemplificativas da invenção.
[00159] A Figura 10B é um alinhamento de VHs exemplificativas da invenção. De cima para baixo, as sequências correspondem às sequências de consenso de regiões estruturais (framework) de VH-B (SEQ ID NO: 18050), VH-D (SEQ ID NO: 18051), VH-A (SEQ ID NO: 18052), VH- E (SEQ ID NO: 18053), VH-F (SEQ ID NO: 18054) e VH-C (SEQ ID NO: 18055).
[00160] A Figura 11 é um gráfico de barras que representa a eficiência de silenciamento (knockout) das proteínas de sinalização do ponto de verificação em células T blindadas. As células T humanas primárias estão, tipicamente, em estado de repouso quando isoladas de doadores saudáveis normais. O Cas-CLOVER foi usado para silenciamento dos receptores do ponto de verificação PD-1, TGFBR2, LAG-3, TIM-3 e CTLA-4. A porcentagem de silenciamento é mostrada no eixo y. A edição gênica resultou em perda de 30 a 70 % de expressão da proteína na superfície celular, conforme medido por meio de citometria de fluxo.
[00161] A Figura 12 são diagramas esquemáticos de receptores de tipo selvagem, nulo e de permuta e seus efeitos sobre a sinalização intracelular, inibidores ou estimulatórios, em células T primárias. A ligação do receptor inibidor de tipo selvagem expresso endogenamente em uma célula T com seu ligante endógeno resulta na transmissão de um sinal inibidor o qual, em parte, reduz a função efetora da célula T. No entanto, a mutação (Nulo Mutante) ou a eliminação (Nulo Truncado) do domínio intracelular (IntraCellular Domain, ICD) de uma proteína receptora do ponto de verificação, tal como PD1 (painel superior) ou TGFBRII (painel inferior), reduz ou elimina sua capacidade de sinalização quando o(s) ligante(s) cognato(s) está(ão) ligado(s). Assim, a expressão de receptores nulos modificados ou truncados modificados na superfície das células T modificadas resulta em uma competição com receptores de tipo selvagem expressos endogenamente pela ligação do(s) ligante(s) endógeno(s) livre(s), reduzindo ou eliminando efetivamente a distribuição de sinais inibidores por receptores de tipo selvagem endogenamente expressos.
Especificamente, qualquer ligação através de um receptor mutante ou nulo evita que o(s) ligante(s) endógeno(s) se ligue(m) ao receptor de tipo selvagem e resulta em redução do nível global de sinalização do ponto de verificação efetivamente distribuído à célula T modificada, deste modo, reduzindo ou bloqueando a inibição do ponto de verificação e o esgotamento funcional das células T modificadas.
Um receptor de permuta é criado pela substituição do ICD de tipo selvagem por um ICD de uma molécula coestimulatória (tal como CD3z, CD28, 4-1BB) ou de uma molécula inibidora diferente (tal como CTLA4, PD1, Lag3). No primeiro caso, a ligação do(s) ligante(s) endógeno(s) pelo receptor de permuta modificado resulta na distribuição de um sinal positivo para as células T, deste modo, ajudando a aumentar a estimulação da célula T modificada e potencialmente a morte de células tumorais alvo.
No último caso, a ligação do(s) ligante(s) endógeno(s) pelo receptor de permuta modificado resulta na distribuição de um sinal negativo para as células T, deste modo, eliminando a estimulação da célula T modificada e reduzindo potencialmente a morte de células tumorais alvo.
O peptídeo sinalizador (seta roxa), domínio extracelular (ExtraCellular Domain, ECD) (verde claro), domínio transmembrana (amarelo), domínio de sinalização intracelular (ICD) (laranja) e ICD de substituição (verde) são exibidos nos diagramas de receptor. "*" indica um ICD mutante. "+" Indica a presença de um sinal do ponto de verificação. "-" indica a ausência de um sinal do ponto de verificação.
[00162] A Figura 13 é um diagrama esquemático que mostra o design dos receptores nulos PD1 e TGFBRII. São mostrados o domínio do peptídeo sinalizador (SP), domínio transmembrana (TM) e domínio extracelular (ECD) de receptores nulos truncados para PD1 (painel superior) e TGFBRII (painel inferior). A primeira das quatro principais moléculas é o receptor PD-1 de tipo selvagem, o qual codifica o SP e TM de PD-1 de tipo selvagem. Para o receptor nulo de PD1, é mostrada a substituição do domínio SP ou TM de tipo selvagem de PD1 (verde; verde claro) pelo domínio SP ou TM de um receptor de CD8a de célula T humana (vermelho). A segunda molécula codifica o SP de CD8a juntamente com o TM de PD-1 nativo, a terceira codifica o SP de PD-1 de tipo selvagem e o TM alternativo de CD8a e a quarta codifica os SP e TM alternativos de CD8a. Da mesma forma, para o receptor nulo de TGFRII, a substituição do SP TGFBRII de tipo selvagem (rosa) por um domínio SP de um receptor de CD8a de células T humanas (vermelho). Os nomes das construções e os comprimentos de aminoácidos (aa) de cada proteína da construção estão listados à esquerda do diagrama.
[00163] A Figura 14 é uma série de histogramas que representam a expressão dos receptores nulos de PD1 e TGFBRII na superfície de células T humanas primárias determinada por meio de citometria de fluxo. Cada uma das seis construções nulas truncadas da Figura 13 foi expressa na superfície de células T humanas primárias. As células T foram coradas com anti-PD1 (superior; histogramas azuis) ou anti- TGFRII (inferior; histogramas azuis) ou controle de isotipo ou secundário apenas (histogramas cinza). Células coradas positivamente para expressão de PD-1 ou TGF RII foram ativadas (frequência mostrada acima de ativação) e o valor de intensidade média de fluorescência (Mean Fluorescence Intensity, MFI) é apresentado acima de cada histograma positivo. Os nomes das construções de receptor nulo estão representados acima de cada gráfico. Ambas as estratégias gênicas de receptor nulo, substituição do SP de tipo selvagem pela CD8a alternativa, foram expressas com sucesso. 02.8aSP-PD-1 e
02.8aSP-TGFRII resultaram no maior nível de expressão na superfície da célula T. O receptor nulo 02.8aSP-PD-1 exibiu uma MFI de 43.680, a qual é 177 vezes maior do que a expressão de PD-1 na célula T endógena e 2,8 vezes maior do que o receptor nulo de PD-1 de tipo selvagem. O receptor nulo 02.8aSP-TGFRII exibiu uma MFI de 13.809, a qual é 102 vezes maior do que a expressão de TGFRII de células T endógenas e 1,8 vezes maior do que o receptor nulo TGFRII de tipo selvagem. A substituição de SP de tipo selvagem pelo SP de CD8a SP alternativo para PD1 e TGRBRII resulta em expressão aumentada na superfície do receptor nulo ou de permuta, o que ajuda a maximizar a inibição ou coestimulação do ponto de verificação, respectivamente, quando de ligação do(s) ligante(s) endógeno(s).
[00164] As Figuras 15A-B são um par de diagramas esquemáticos que descrevem vetores indutíveis de NF-B para expressão em células T. Foram desenvolvidos dois vetores indutíveis por NF-B de ativação de células T; um com o sistema de expressão gênica (Gene Expression System, GES) na orientação direta (A) e o outro na direção complementar (B), ambos precedendo o promotor constitutivo de EF1a. Estes vetores também direcionam a expressão de uma molécula de CAR e um gene de seleção de DHFR, separados por uma sequência T2A. Tanto o sistema indutível por NF-B condicional quanto os genes direcionados a EF1a fazem parte de um transposon piggyBac que pode ser permanentemente integrado às células T usando eletroporação (EP). Uma vez integradas ao genoma, as células T expressam constitutivamente o CAR na superfície da membrana e o DHFR dentro da célula, enquanto que a expressão do gene indutível por NF-B, GFP, será expressa no nível mais alto somente quando de ativação das células T.
[00165] A Figura 16 é um par de gráficos que representam a expressão indutível por NF-B de GFP em células T ativadas. As células T foram nucleofectadas com um vetor piggyBac que expressa um CAR anti-BCMA e um gene de muteína DHFR sob controle de um promotor EF1a, juntamente com a ausência (controle sem GES) ou a presença de um sistema de expressão indutível por NF-B que controla a expressão de GFP na orientação direta (pNFKB-GFP direto) ou reversa (pNFKB-GFP reverso). As células foram cultivadas na presença de seleção com metotrexato até que as células estivessem quase completamente em repouso (dia 19) e a expressão de GFP foi avaliada no dia 5 e no dia 19. No dia 5, todas as células T estão proliferando e altamente estimuladas, com as células que abrigam o cassete de expressão indutível por NF-B produzindo altos níveis de GFP em virtude da forte atividade de NF-B. As células de controle sem GES não expressaram níveis detectáveis de GFP. No dia 19, as células T GES estavam quase totalmente em repouso e a expressão de GFP era significativamente menor do que no dia 5 (~ 1/8 MFI), uma vez que a atividade de NF-B é menor. Expressão de GFP ainda é observada no dia 19, o que pode ser em virtude da meia-vida longa da proteína GFP (~ 30 horas) ou o nível basal de atividade de NF-B por meio, por exemplo, de um TCR, um CAR, um receptor de citocinas ou um sinal do receptor de fator de crescimento.
[00166] A Figura 17 é uma série de gráficos que representam a ativação mediada pelo CAR anti-BCMA da expressão indutível de GFP por NF-B na presença de células tumorais BCMA+. As células T não foram modificadas (células T simulado – mock) ou nucleofectadas com um vetor piggyBac que expressa um CAR anti-BCMA e um gene de muteína DHFR sob controle de um promotor EF1a, juntamente com a ausência (controle sem GES) ou a presença de um sistema de expressão indutível por NF-B que controla a expressão de GFP na orientação direta (pNFKB-GFP direto) ou reversa (pNFKB-GFP reverso). Todas as células foram cultivadas por 22 dias, com ou sem seleção com metotrexato (células T simulado - mock), até que as células estivessem quase completamente em repouso. As células foram, então, estimuladas por 3 dias na ausência (Sem estimulação) ou na presença de BCMA- (K562), BMCA+ (RPMI 8226) ou reagente de ativação anti- CD3 anti-CD28 de controle positivo (estimulação com CD3/28). A expressão de GFP foi indetectável em todas as condições com o controle sem GES ou células T simulado (mock). No entanto, embora as células que sofreram transposição com pNFKB-GFP direto e reverso tenham exibido pouca expressão de GFP em relação ao controle sem estimulação quando cultivadas com células BCMA-K562, ambas demonstraram uma expressiva regulação positiva da expressão gênica na presença de células tumorais BCMA+ ou sob condições de controle positivo. Pouca diferença na expressão de GFP foi observada entre as células que sofreram transposição de pNFKB-GFP direto e reverso que foram cocultivadas com células tumorais BCMA+.
[00167] A Figura 18 é uma série de gráficos que demonstram que o nível de expressão do gene indutível pode ser regulado pelo número de elementos de resposta que precedem as células T promotoras que foram nucleofectadas com um vetor piggyBac que codifica um CARTirina anti-BCMA seguido por um gene de seleção, ambos sob controle de um promotor EF1a humano. Além disso, os vetores codificaram também o sistema de expressão gênica condicional indutível por NF-B, o qual controla a expressão de uma proteína CD19 truncada (dCD19), e incluíam vários elementos de resposta NFKB (RE) variando a partir de 0 - 5, sem GES (Sem GES) ou receberam um pulso de eletroporação, mas nenhum ácido nucleico piggyBac (Mock). Os dados são mostrados apenas para o GES na direção/orientação reversa (oposta). Todas as células foram cultivadas por 18 dias e incluíam a seleção de células T modificadas com piggyBac usando adição de metotrexato. As células foram, então, estimuladas por 3 dias usando reagente de ativação de esferas anti-CD3 anti-CD28 e a expressão na superfície de dCD19 foi avaliada por meio de FACS nos dias 0, 3 e 18 e os dados são mostrados como histogramas de FACS e MFI da coloração da proteína-alvo. A expressão de dCD19 na superfície foi detectada em níveis baixos no dia 0 em todas as células T que sofreram transposição com vetores que codificam o GES. Em 3 dias após estimulação, foi observada uma regulação negativa dramática da expressão de dCD19 para todas as células T que expressam o GES, com um aumento maior na expressão na superfície naquelas com um maior número de REs. Assim, a expressão na superfície de dCD19 foi diretamente proporcional ao número de REs codificados no GES. Não foi detectada dCD19 na superfície das células T que não abrigavam os controles GES: Sem GES e Simulado (mock).
[00168] A Figura 19 é uma representação esquemática do mapa de construção de Csy4-T2A-Clo051-G4Sligante-dCas9 (Modalidade 2).
[00169] A Figura 20 é uma representação esquemática do mapa de construção de NLS duplo pRT1-Clo051-dCas9 (Modalidade 1).
[00170] A Figura 21 é um par de gráficos que comparam a eficácia de eliminar a expressão de B2M em células T Pan (esquerda) ou da cadeia α do receptor de células T em células Jurkat (direita) para a Modalidade 1 (NLS duplo pRT1-Clo051-dCas9, conforme mostrado na Figura 20) ou Modalidade 2 (Csy4-T2A-Clo051-G4Sligante-dCas9, conforme mostrado na Figura 19) de uma proteína de fusão Cas-Clover da invenção. Para o gráfico à direita, a proteína de fusão é fornecida a 10 µg ou 20 µg, conforme indicado.
[00171] A Figura 22 é uma fotografia de uma análise por eletroforese em gel de mRNA na presença de cada uma da Modalidade 1 (NLS duplo pRT1-Clo051-dCas9, conforme mostrado na Figura 20) e Modalidade 2
(Csy4-T2A-Clo051-G4Sligante-dCas9, conforme mostra a Figura 19). Como mostrado, ambos são eficazes em silenciar a expressão do mRNA.
[00172] A Figura 23 é um diagrama da plataforma de produção de Anticorpos de Cadeia Pesada Humana UniRatTM.
[00173] A Figura 24 é um diagrama do esquema de imunização, isolamento de células B, purificação de mRNA, sequenciamento de próxima geração (Next Generation Sequencing, NGS), análise bioinformática, montagem de vetor de alto rendimento e expressão e rastreamento de alto rendimento usados para identificar o repertório específico para antígeno completo de anticorpos de cadeia pesada gerados pela UniRatTM após imunização. Métodos únicos de montagem de genes convertem as informações de sequência do repertório de anticorpos em grandes coleções de anticorpos de cadeia pesada totalmente humanos que podem ser rastreados quanto a uma variedade de funções.
[00174] A Figura 25 é um par de mapas térmicos que mostram como a análise de sequenciamento de próxima geração (NGS) revela linhagens de sequências de VH expandidas. O grau de vermelho (alto) ou azul (baixo) no mapa térmico indica famílias de sequências de VH expandidas em virtude de imunização. Algumas sequências de VH altamente classificadas são únicas para um único animal. Outras sequências de VH altamente classificadas aparecem em mais de um animal, sugerindo seleção convergente destas famílias de sequências.
[00175] A Figura 26 é uma série de gráficos de citometria de fluxo que mostram que uma população de CAR-T que expressa P-PSMA-101 e que compreende uma mistura de TSCM/TCM, dá origem a CAR+ TCM, TEM e Teff para atacar tumor sólido. Após eliminação do tumor sólido, uma população de CAR-T+ TSCM persiste. Embora demonstrado com uma CARTirina, este princípio mostrado aqui se aplica às populações
VCAR+ TSCM e VCAR+ TCM da invenção.
Especificamente, um modelo de xenoenxerto de murino que usa uma linhagem de células LNCaP que expressa luciferase (LNCaP.luc) injetada subcutaneamente (SC) em camundongos NSG foi usado para avaliar a eficácia antitumoral in vivo de um CAR (P-PSMA5-101 e P-PSMA8 -101) em uma dose de 'estresse' (4x10-6) total de células CAR-T.
Para estes estudos in vivo, todas as células CAR-T foram produzidas usando administração PB do plasmídeo P-PSMA5-101 ou P-PSMA8-101 empregando o processo de fabricação Poseida.
Os camundongos foram injetados na axila com LNCaP e tratados quando os tumores foram estabelecidos (100-300 mm3 através de medição no paquímetro). Os camundongos foram tratados com uma dose de 'estresse' (4x10-6) de P-PSMA-101 através de injeção IV, a fim de provocar possíveis diferenças na eficácia entre os CARs PSMA5 e PSMA8. A atividade antitumoral foi avaliada pela sobrevivência, expansão e detecção de células T CD8+ no sangue, avaliação do volume tumoral através de medição no paquímetro e bioluminescência do tumor LNCaP.
P-PSMA5-101 e P-PSMA8-101 em uma dose de 'estresse' demonstraram eficácia e sobrevivência antitumoral significativamente aprimoradas comparado com os camundongos com células T de controle (sem CAR) contra tumores sólidos SC LNCaP.luc estabelecidos em camundongos NSG.
Especificamente, nos animais, não houve sobrevivência com as células T de controle (sem CAR), 25 % de sobrevivência no grupo tratado com P-BCMA-101, 75 % de sobrevivência no grupo tratado com P-PSMA5- 101 e 100 % de sobrevivência nos animais tratados com uma dose de estresse de P-PSMA8-101. No sangue periférico, P-PSMA5-101 e P- PSMA8-101 se expandiram e deram origem a células T CARTirina+ efetoras diferenciadas que eram concomitantes com uma diminuição da carga do tumor abaixo dos limites detectáveis pelo paquímetro e imagem bioluminescente.
Estas células, então, foram reduzidas, mas persistiram no sangue periférico.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00176] A invenção fornece receptores antigênicos quiméricos (CARs) que compreendem pelo menos uma VHH (VCAR). Os receptores antigênicos quiméricos da invenção podem compreender mais de uma VHH. Por exemplo, um VCAR biespecífico pode compreender duas VHHs que se ligam especificamente a dois antígenos distintos.
[00177] As proteínas VHH da invenção se ligam especificamente a um antígeno. Os receptores antigênicos quiméricos da invenção que compreendem uma ou mais VHHs que se ligam especificamente a um antígeno podem ser usados para direcionar a especificidade de uma célula (por exemplo, uma célula imune citotóxica) em direção ao antígeno específico.
[00178] A invenção fornece receptores antigênicos quiméricos (CARs) que têm uma região de reconhecimento de antígeno que compreende um anticorpo com um único domínio (VCARs). Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio é um anticorpo à VHH. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio é um anticorpo à VH.
[00179] Os receptores antigênicos quiméricos da invenção podem compreender um peptídeo sinalizador de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BBor GM-CSFR humana. Um domínio de dobradiça/espaçador da invenção pode compreender uma dobradiça/espaçador/haste de CD8α, IgG4 e/ou CD4 humana. Um domínio intracelular ou endodomínio da invenção pode compreender um domínio de sinalização intracelular de CD3zeta humana e pode compreender ainda um segmento intracelular de 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 humana ou qualquer combinação dos mesmos. Domínios transmembrana exemplificativos incluem, porém sem limitações, um domínio transmembrana de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana.
[00180] A invenção fornece células geneticamente modificadas, tais como células T, células NK, células progenitoras hematopoiéticas, células T derivadas de sangue periférico (PB) (incluindo células T de sangue periférico mobilizadas por G-CSF), células T derivadas de sangue do cordão umbilical (UCB) tornadas específicas para um ou mais antígenos ao introduzir nestas células um VCAR da invenção. As células da invenção podem ser modificadas por meio de eletrotransferência de um transposon que codifica um VCAR da invenção e um plasmídeo que compreende uma sequência que codifica uma transposase da invenção (de preferência, a sequência que codifica uma transposase da invenção é uma sequência de mRNA). VHs da Invenção
[00181] A invenção fornece receptores antigênicos quiméricos (CARs) que compreendem um anticorpo com um único domínio (VCARs). Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende uma VH. Em algumas modalidades, a VH é isolada ou derivada de uma sequência humana. Em algumas modalidades, a VH compreende uma sequência de CDR humana e/ou uma sequência estrutural humana e uma sequência não humana ou humanizada (por exemplo, um domínio Fc de rato). Em algumas modalidades, a VH é uma VH totalmente humanizada. Em algumas modalidades, as VHs não são um anticorpo de ocorrência natural nem um fragmento de um anticorpo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a VH não é um fragmento de um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, a VH é um anticorpo UniDabTM (TeneoBio).
[00182] Em algumas modalidades, a VH é totalmente concebida usando o sistema UniRatTM (TeneoBio) e o "NGS-based Discovery" para produzir a VH. Usando este método, a VH específica não ocorre naturalmente e é gerada usando sistemas totalmente manipulados. A VH não é derivada de anticorpos monoclonais de ocorrência natural (mAbs) que foram isolados diretamente do hospedeiro (por exemplo, camundongo, rato ou ser humano) ou diretamente a partir de um único clone de células ou linhagem de células (hibridoma). Estas VHs não foram subsequentemente clonadas a partir das ditas linhagens de células. Em vez disso, as sequências de VH são totalmente manipuladas usando o sistema UniRat™ como transgenes que compreendem regiões variáveis humanas (domínios VH) com um domínio Fc de rato e, portanto, quimeras de ser humano/rato sem cadeia leve e são diferentes do formato padrão de mAbs. Os genes nativos de rato são eliminados e os únicos anticorpos expressos no rato são de transgenes com domínios VH ligados a uma Fc de rato (UniAbs). Estes são os Abs exclusivos expressos no UniRat. Sequenciamento de próxima geração (NGS) e bioinformática são usados para identificar o repertório específico para antígeno completo dos anticorpos à cadeia pesada gerados pelo UniRat™ após imunização. Então, um método exclusivo de montagem de genes é usado para converter as informações de sequência do repertório de anticorpos em grandes coleções de anticorpos à cadeia pesada totalmente humanos que podem ser rastreados in vitro quanto a uma variedade de funções. Em algumas modalidades, a VH totalmente humanizada é gerada pela fusão dos domínios da VH humana com as Fcs humanas in vitro (para gerar um anticorpo à VH recombinante que não ocorre naturalmente). Em algumas modalidades, as VH são totalmente humanizadas, mas são expressas in vivo como quimeras de ser humano/rato (VH humana, Fc de rato) sem uma cadeia leve. As VHs completamente humanizadas expressas in vivo como quimeras de ser humano/rato (VH humana, Fc de rato) sem uma cadeia leve têm cerca de 80 kDa (vs 150 kDa).
[00183] Os VCARs da invenção podem compreender pelo menos uma VH da invenção. Em algumas modalidades, a VH da invenção pode ser modificada para remover um domínio Fc ou uma parte do mesmo. Em algumas modalidades, uma sequência estrutural (framework) da VH da invenção pode ser modificada, por exemplo, para melhorar a expressão, diminuir a imunogenicidade ou melhorar a função. VCARs Exemplificativos da Invenção
[00184] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-A: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamnwvrqapgkglew vagiigsggstyyadsvkgrfsisrdnskntldlqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18000).
[00185] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-A: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcacctttagcagctacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggactgg aatgggtggccggaatcatcggcagcggcggcagcacatattacgccgattctgtgaagggcc gcttcagcatcagccgggacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgaga gccgaggataccgccgtgtactactgcgtgaaggattggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgagg cctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtac cagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccct agatga (SEQ ID NO: 18001).
[00186] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-B: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggsltlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgiigsgattyyadsvkgrftisrdnskntlnlqmnslraedtaiyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18002).
[00187] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-B atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgacactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttg aatgggtgtccggcatcattggctctggcgccaccacctactacgccgattctgtgaagggcagat tcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgaacctgcagatgaacagcctgagagc cgaggacaccgccatctactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagagag gccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacaccag ctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgga gctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcacat gcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgctgt atatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctcttgt aggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccgat gcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggagaga ggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctcgg agaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgaggcct attctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtaccag ggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccctaga tgac (SEQ ID NO: 18003).
[00188] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-C: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgeslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglew vsgivggggtsyyadsvrgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18004).
[00189] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-C: atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcagcctggcgaatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaactacgccatgaactgggtccgacaggcccctggcaaaggccttg aatgggtgtccggaatcgttggcggcggaggcacaagctactacgccgattctgtgcggggcag attcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagag ccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgagg cctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtac cagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccct agatga (SEQ ID NO: 18005).
[00190] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-D:
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamtwirqapgkglewv sgitgdggstfyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvtvs stttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckr grkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlg rreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdgly qglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18006).
[00191] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-D atggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgcttcttcatgcggcgcgccctgaagtt cagctgcttgaatctggcggaggcctggttcaacctggcggatctctgagactgagctgtgccgcc agcggcttcaccttcagcaattacgccatgacctggatcagacaggcccctggcaaaggcctgg aatgggtgtccggaattacaggcgacggcggcagcaccttttacgccgattctgtgaagggcag attcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagag ccgaggacaccgccgtgtactactgcgtgaaggactggaacaccaccatgatcaccgagaga ggccagggcacactggtcaccgtgtcctctacaacaacaccggcgcctcggcctccaacacca gctcctacaatcgcgagtcagcccctgtctctcagacccgaagcctgtagacctgctgctggcgg agctgtgcataccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggctcctctggctggcac atgcggagttttgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaagaagctgct gtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacggctgctctt gtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggtccgccg atgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccggaga gaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcctc ggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggccgagg cctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtac cagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctgccccct agatga (SEQ ID NO: 18007).
[00192] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-E: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglaqpggslrlscaasgftfssyamnwirqapgkglew vsgisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18008).
[00193] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-E atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtccggaggaggcctggcccagcctggcggcagcctgaggctgtcctg cgccgcctctggcttcacctttagctcctacgccatgaactggatcagacaggcccctggcaagg gcctggagtgggtgtccggcatctccggctctggaggctctacatactatgccgacagcgtgaag ggccggttcaccatcagcagagataactccaagaataccgtgtacctccagatgaactctctgcg ggccgaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagagag gggccagggcaccctggtgacagtgtctagcaccacaacccctgcccccagacctcccacacc cgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccgg cggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggca ggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaaga agctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacgg ctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccggt ccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggcc ggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggca agcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatggc cgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggc ctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccctg ccccctagatga (SEQ ID NO: 18009).
[00194] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende pelo menos uma de uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos de: VH-F: malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpgrslrlscaasgftftnyamnwvrqapgkglew vsgisggggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycvkdwnttmitergqgtlvt vsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitly ckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynel nlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghd glyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 18010).
[00195] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, a sequência de aminoácidos do VCAR é codificada por uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade com a sequência de nucleotídeos de: VH-F atggcactgcctgtgacagccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagcacggcccga ggtgcagctgctggagtctggaggaggcctggtgcagcccggccggtccctgagactgtcttgcg ccgccagcggcttcacctttacaaactacgccatgaattgggtgcggcaggcccctggcaaggg cctggagtgggtgtctggcatcagcggaggaggaggcagcacctactatgcagactccgtgaa gggcaggttcaccatctcccgcgataactctaagaatacactgtacctccagatgaacagcctga gggcagaggacaccgccgtgtactattgcgtgaaggattggaataccacaatgatcacagaga ggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcaccacaacccctgcccccagacctcccaca cccgcccctaccatcgcgagtcagccactgtccctgcggcctgaggcctgccggcccgccgccg gcggagcagtgcacacacggggcctggactttgcctgtgacatctacatatgggcaccactggc aggaacctgcggcgtgctgctgctgagcctggtcatcaccctgtactgtaagagaggcaggaag aagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgagacccgtgcagaccacacaggaggaggacg gctgctcttgtaggttcccagaggaggaggagggaggatgcgagctgcgcgtgaagtttagccg gtccgccgatgcacctgcatacaagcagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctggg ccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggagg caagcctcggagaaagaacccacaggagggcctgtacaatgagctgcaaaaggacaagatg gccgaggcctattctgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatg gcctgtaccagggcctgagcaccgccacaaaggacacctatgatgccctgcacatgcaggccc tgccccctagatga (SEQ ID NO: 18011).
[00196] Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende uma sequência que codifica VH-A, VH-B, VH-C, VH-D, VH- E ou VH-F. Em algumas modalidades dos VCARs da invenção, o VCAR compreende duas sequências que codificam VH-A, VH-B, VH-C, VH-D, VH-E ou VH-F. Células Imunes e Precursoras Imunes
[00197] Em determinadas modalidades, as células imunes da invenção compreendem células progenitoras linfoides, células Naturais Assassinas (NK), linfócitos T (célula T), células T de memória-tronco (células TSCM), células T de memória central (TCM), células T de tipo células-tronco, linfócitos B (células B), células progenitoras mieloides, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, plaquetas, eritrócitos, glóbulos vermelhos (RBCs), megacariócitos ou osteoclastos.
[00198] Em determinadas modalidades, as células precursoras imunes compreendem quaisquer células que possam se diferenciar em um ou mais tipos de células imunes. Em determinadas modalidades, as células precursoras imunes compreendem células-tronco multipotentes que podem se autorrenovar e se desenvolver em células imunes. Em determinadas modalidades, as células precursoras imunes compreendem células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou seus descendentes. Em determinadas modalidades, as células precursoras imunes compreendem células precursoras que podem se desenvolver em células imunes. Em determinadas modalidades, as células precursoras imunes compreendem células progenitoras hematopoiéticas (HPCs). Células-Tronco Hematopoiéticas (HSCs)
[00199] As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são células multipotentes e autorrenováveis. Todas as células sanguíneas diferenciadas das linhagens linfoide e mieloide surgem das HSCs. As HSCs podem ser encontradas na medula óssea adulta, sangue periférico, sangue periférico mobilizado, efluente de diálise peritoneal e sangue do cordão umbilical.
[00200] As HSCs da invenção podem ser isoladas ou derivadas de uma célula-tronco primária ou cultivada. As HSCs da invenção podem ser isoladas ou derivadas de uma célula-tronco embrionária, uma célula- tronco multipotente, uma célula-tronco pluripotente, uma célula-tronco adulta ou uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC).
[00201] As células precursoras imunes da invenção podem compreender uma HSC ou uma célula descendente de HSC. Células descendentes de HSC exemplificativas da invenção incluem, porém sem limitações, células-tronco multipotentes, células progenitoras linfoides, células Naturais Assassinas (NK), células T linfocitárias T (células T), células B linfocitárias (células B), células progenitoras mieloides, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos.
[00202] As HSCs produzidas por meio dos métodos da invenção podem reter características de células-tronco "primitivas" as quais, embora isoladas ou derivadas de uma célula-tronco adulta e comprometidas com uma única linhagem, compartilham características de células-tronco embrionárias. Por exemplo, as HSCs "primitivas" produzidas por meio dos métodos da invenção mantêm sua "origem" após divisão e não diferenciam. Consequentemente, como terapia celular adotiva, as HSCs "primitivas" produzidas por meio dos métodos da invenção não apenas reabastecem seus números, mas expandem in vivo. As HSCs "primitivas" produzidas por meio dos métodos da invenção podem ser terapeuticamente eficazes quando administradas em dose única. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+ e CD38-. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+, CD38- e CD90+. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+, CD38-, CD90+ e CD45RA-. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- e CD49f+. Em algumas modalidades, as HSCs primitivas da invenção são CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- e CD49f+.
[00203] Em algumas modalidades da invenção, HSCs primitivas, HSCs e/ou células descendentes de HSC podem ser modificadas de acordo com os métodos da invenção para expressar uma sequência exógena (por exemplo, um receptor antigênico quimérico ou proteína terapêutica). Em algumas modalidades da invenção, HSCs primitivas modificadas, HSCs modificadas e/ou células descendentes de HSC modificadas podem ser diferenciadas diretamente para produzir uma célula imune modificada incluindo, porém sem limitações, uma célula T modificada, uma célula Natural Assassina modificada e/ou uma célula B modificada da invenção. Células T
[00204] As células T modificadas da invenção podem ser derivadas de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras modificadas (HSPCs) ou HSCs modificadas.
[00205] Ao contrário dos produtos biológicos e quimioterapêuticos tradicionais, as células T modificadas da invenção possuem a capacidade de se reproduzir rapidamente após reconhecimento de antígeno, deste modo, evitando a necessidade de tratamentos repetidos. Para conseguir isto, em algumas modalidades, as células T modificadas da invenção não apenas disparam uma resposta inicial, mas também persistem no paciente como uma população estável de células T de memória viável para evitar possíveis recaídas. Alternativamente, em algumas modalidades, quando não é desejado, as células T modificadas da invenção não persistem no paciente.
[00206] Esforços intensivos têm sido focados no desenvolvimento de moléculas receptoras antigênicas que não causam esgotamento das células T por meio de sinalização independente de antígeno (tônica), bem como de um produto de célula T modificado que contém células T de memória precoce, especialmente células-tronco (TSCM) ou células T de tipo célula-tronco. As células T modificadas de tipo células-tronco da invenção exibem a maior capacidade de autorrenovação e capacidade multipotente de derivar células T de memória central (TCM) ou células de tipo TCM, células efetoras (TEM) e células T efetoras (TE), deste modo, produzindo uma melhor erradicação do tumor e enxerto de células T modificadas a longo prazo. Uma via linear de diferenciação pode ser responsável pela geração destas células: Células T virgens (TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE, em que TN é a célula precursora parental que dá origem diretamente à TSCM a qual, em seguida, por sua vez, dá origem diretamente à TCM, etc. As composições de células T da invenção podem compreender um ou mais de cada subconjunto de células T parental com células TSCM ou TCM sendo as mais abundantes (por exemplo, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE).
[00207] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o precursor de célula imune é diferenciado ou é capaz de diferenciar em uma célula T de memória precoce, uma célula T de tipo célula-tronco, uma célula T virgem (TN), uma TSCM, uma TCM, uma TEM, uma TE ou uma TTE. Em algumas modalidades, o precursor de célula imune é uma HSC primitiva, uma HSC ou uma célula descendente de HSC da invenção.
[00208] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a célula imune é uma célula T de memória precoce, uma célula T de tipo célula- tronco, uma célula T virgem (TN), uma TSCM, uma TCM, uma TEM, uma TE ou uma TTE.
[00209] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a célula imune é uma célula T de memória precoce.
[00210] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a célula imune é uma célula T de tipo célula-tronco.
[00211] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a célula imune é uma TSCM.
[00212] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a célula imune é uma TCM.
[00213] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de memória precoce. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células T de memória precoce modificada compreende pelo menos uma célula T de tipo célula-tronco modificada. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células T de memória precoce modificada compreende pelo menos uma TSCM modificada. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células T de memória precoce modificada compreende pelo menos uma TCM modificada.
[00214] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de tipo célula-tronco. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células T de tipo célula- tronco modificadas compreende pelo menos uma TSCM modificada. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células T de tipo célula- tronco modificadas compreende pelo menos uma TCM modificada.
[00215] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de memória-tronco (TSCM). Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem CD62L e CD45RA. Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem um ou mais de CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 e IL-2Rβ. Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem um ou mais de CD45RA, CD95, IL- 2Rβ, CCR7 e CD62L.
[00216] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de memória central (TCM). Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem um ou mais de CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 e CD62L.
[00217] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T virgem (TN). Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem um ou mais de CD45RA, CCR7 e CD62L.
[00218] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T efetora (TEFF modificada). Em determinadas modalidades, os marcadores na superfície celular compreendem um ou mais de CD45RA, CD95 e IL- 2Rβ.
[00219] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos modificam e/ou os métodos produzem uma pluralidade de células T modificadas, em que pelo menos 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células T modificadas expressam um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de tipo célula-tronco, uma célula T de memória-tronco (TSCM) ou uma célula T de memória central (TCM).
[00220] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, um tampão compreende a célula imune ou precursor da mesma. O tampão mantém ou melhora um nível de viabilidade celular e/ou um fenótipo de tipo tronco da célula imune ou precursor da mesma, incluindo células T. Em determinadas modalidades, o tampão mantém ou aprimora um nível de viabilidade celular e/ou um fenótipo de tipo tronco das células T humanas primárias antes de nucleofecção. Em determinadas modalidades, o tampão mantém ou aprimora um nível de viabilidade celular e/ou um fenótipo de tipo tronco das células T humanas primárias durante a nucleofecção. Em determinadas modalidades, o tampão mantém ou aprimora um nível de viabilidade celular e/ou um fenótipo de tipo tronco das células T humanas primárias após nucleofecção. Em determinadas modalidades, o tampão compreende um ou mais de KCl, MgCl2, ClNa, Glicose e Ca(NO3)2 em qualquer abundância ou concentração absoluta ou relativa e, opcionalmente, o tampão compreende ainda um suplemento selecionado a partir do grupo que consiste de HEPES, Tris/HCl e um tampão de fosfato. Em determinadas modalidades, o tampão compreende KCl a 5 mM, MgCl2 a 15 mM, ClNa a 90 mM, glicose a 10 mM e Ca(NO3)2 a 0,4 mM. Em determinadas modalidades, o tampão compreende KCl a 5 mM, MgCl2 a 15 mM, ClNa a 90 mM, glicose a 10 mM e Ca(NO3)2 a 0,4 mM e um suplemento que compreende HEPES a 20 mM e Tris/HCl a 75 mM. Em determinadas modalidades, o tampão compreende KCl a 5 mM, MgCl2 a 15 mM, ClNa a 90 mM, glicose a 10 mM e Ca(NO3)2 a 0,4 mM e um suplemento que compreende Na2HPO4/NaH2PO4 a 40 mM em um pH de 7,2. Em determinadas modalidades, a composição que compreende células T humanas primárias compreende 100 μl do tampão e entre 5 x 106 e
25 x 106 células. Em determinadas modalidades, a composição compreende uma proporção escalonável de 250 x 106 células T humanas primárias por mililitro de tampão ou outros meios durante a etapa de introdução.
[00221] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os métodos compreendem contatar uma célula imune da invenção, incluindo uma célula T da invenção, e uma composição para expansão de células T. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a etapa de introdução de um transposon e/ou transposase da invenção em uma célula imune da invenção pode compreender ainda contatar a célula imune e uma composição para expansão de células T. Em algumas modalidades, incluindo aquelas nas quais a etapa de introdução dos métodos compreende uma etapa de eletroporação ou nucleofecção, a etapa de eletroporação ou nucleofecção pode ser realizada através de contato da composição para expansão de células T imunes com a célula imune da invenção.
[00222] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a composição para expansão de células T compreende, consiste essencialmente em ou consiste em fósforo; um ou mais de um ácido octanoico, um ácido palmítico, um ácido linoleico e um ácido oleico; um esterol; e um alcano.
[00223] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada da invenção, o suplemento de expansão compreende uma ou mais citocinas. A uma ou mais citocinas podem compreender qualquer citocina incluindo, porém sem limitações, linfocinas. Exemplos de linfocinas incluem, dentre outros, interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15), interleucina-21 (IL-21), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interferon-gama (INFγ). A uma ou mais citocinas podem compreender IL-2.
[00224] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a composição para expansão de células T compreende albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol e um suplemento de expansão. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico, nicotinamida, 2,4,7,9-tetrametil-5-decin-4,7-diol (TMDD), adipato de di-isopropila (DIPA), n-butil-benzenossulfonamida, ácido 1,2-benzenodicarboxílico, éster bis(2-metilpropílico), ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico, hidrazida de ácido esteárico, oleamida, um esterol e um alcano. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico e um esterol. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 0,9 mg/kg a 90 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração entre 0,2 mg/kg a 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração entre cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, incluindo os pontos finais. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 9 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 1 mg/kg. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 6,4 µmol/kg e 640 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,7 µmol/kg e 70 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração entre 0,25 µmol/kg e 25 µmol/kg, incluindo os pontos finais. Em determinadas modalidades deste método, a composição para expansão de células T compreende ainda um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 64 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 7 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 7,5 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 7,5 µmol/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 2,5 µmol/kg.
[00225] Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol e um suplemento de expansão para produzir uma pluralidade de células T modificadas expandidas, em que pelo menos 2 % da pluralidade de células T modificadas expressa um ou mais marcadores na superfície celular de uma célula T de memória precoce, uma célula T de tipo célula-tronco, uma célula T de memória-tronco (TSCM) e/ou uma célula T de memória central (TCM). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T inclui ou compreende ainda um ou mais de ácido octanoico, nicotinamida, 2,4,7,9-tetrametil-5-decin-4,7-diol (TMDD), adipato de di-isopropila (DIPA), n-butil-benzenossulfonamida, ácido 1,2-benzenodicarboxílico, éster bis(2-metilpropílico), ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico, hidrazida de ácido esteárico, oleamida, um esterol e um alcano. Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico e um esterol (por exemplo, colesterol). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 0,9 mg/kg a 90 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração entre 0,2 mg/kg a 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração entre cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, incluindo os pontos finais (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 9 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 2 mg/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 1 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 9,19 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração entre 1,86 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 2,12 mg/kg, oleico ácido em uma concentração entre cerca de 2,13 mg/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 1,01 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende ácido octanoico em uma concentração entre 9,19 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração entre 1,86 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração entre 2,12 mg/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 2,13 mg/kg e um esterol em uma concentração entre 1,01 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 6,4 µmol/kg e 640 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,7 µmol/kg e 70 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração entre 0,25 µmol/kg e 25 µmol/kg, incluindo os pontos finais. Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 64 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 7 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 7,5 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 7,5 µmol/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 2,5 µmol/kg. Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 63,75 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 7,27 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 7,57 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração entre cerca de 7,56 µmol/kg e um esterol em uma concentração entre cerca de 2,61 µmol/kg. Em determinadas modalidades, a composição para expansão de células T compreende ácido octanoico em uma concentração entre cerca de 63,75 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração entre cerca de 7,27 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração entre cerca de 7,57 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração entre 7,56 µmol/kg e um esterol em uma concentração entre 2,61 µmol/kg.
[00226] Conforme usado aqui, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol e um complemento de expansão a 37 °C. Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de fósforo, um ácido graxo octanoico, um ácido graxo palmítico, um linoleico ácido graxo e um ácido oleico. Em determinadas modalidades, o meio compreende uma quantidade de fósforo 10 vezes maior do que pode ser encontrado, por exemplo, no Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM); disponível a partir da ThermoFisher Scientific como catálogo número 12440053).
[00227] Conforme usado aqui, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2-Mercaptoetanol, MDM de Iscove e um complemento de expansão a 37 °C. Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados alternadamente com um meio que compreende um ou mais dos seguintes elementos: boro, sódio, magnésio, fósforo, potássio e cálcio. Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes elementos presentes nas concentrações médias correspondentes: boro a 3,7 mg/L, sódio a 3000 mg/L, magnésio a 18 mg/L, fósforo a 29 mg/L, potássio a 15 mg/L e cálcio a 4 mg/L.
[00228] Conforme usado aqui, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2-Mercaptoetanol e um complemento de expansão a 37 °C.
Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes componentes: ácido octanoico (N° CAS 124-07-2), nicotinamida (N° CAS 98-92-0), 2,4,7,9-tetrametil-5-decina-4,7-diol (TMDD) (N° CAS 126-86-3), adipato de di-isopropila (DIPA) (N° CAS 6938-94-9), n-butil- benzenossulfonamida (N° CAS 3622-84-2), ácido 1,2- benzenodicarboxílico, éster bis(2-metilpropílico) (N° CAS 84-69-5), ácido palmítico (N° CAS 57-10-3), ácido linoleico (N° CAS 60-33-3), ácido oleico (N° CAS 112-80-1), hidrazida de ácido esteárico (N° CAS 4130-54-5), oleamida (N° CAS 3322-62-1), esterol (por exemplo, colesterol) (N° CAS 57-88-5) e alcanos (por exemplo, nonadecano) (N° CAS 629-92-5). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes componentes: ácido octanoico (N° CAS 124-07-2), nicotinamida (N° CAS 98-92-0), 2,4,7,9- tetrametil-5-decin-4,7-diol (TMDD) (N° CAS 126-86-3), adipato de di- isopropila (DIPA) (N° CAS 6938-94-9), n-butil-benzenossulfonamida (N° CAS 3622-84-2), ácido 1,2-benzenodicarboxílico, éster bis(2- metilpropílico) (N° CAS 84-69-5), ácido palmítico (N° CAS 57-10-3), ácido linoleico (N° CAS 60-33-3), ácido oleico (N° CAS 112-80-1), hidrazida de ácido esteárico (N° CAS 4130 -54-5), oleamida (N° CAS 3322-62-1), esterol (por exemplo, colesterol) (N° CAS 57-88-5), alcanos (por exemplo, nonadecano) (N° CAS 629-92-5) e vermelho de fenol (número CAS 143-74-8). Em determinadas modalidades, os termos
"composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes componentes: ácido octanoico (N° CAS 124-07-2), nicotinamida (N° CAS 98-92-0), 2,4,7,9-tetrametil-5-decin-4,7-diol (TMDD) (N° CAS 126- 86-3), adipato de di-isopropila (DIPA) (N° CAS 6938-94-9), n-butil- benzenossulfonamida (N° CAS 3622-84-2), ácido 1,2- benzenodicarboxílico, éster bis(2-metilpropílico) (N° CAS 84-69-5), ácido palmítico (N° CAS 57-10-3), ácido linoleico (N° CAS 60-33-3), ácido oleico (N° CAS 112-80-1), hidrazida de ácido esteárico (N° CAS 4130 -54-5), oleamida (N° CAS 3322-62-1), vermelho de fenol (N° CAS 143-74-8) e álcool de lanolina.
[00229] Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol e um complemento de expansão a 37 °C. Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes íons: sódio, amônio, potássio, magnésio, cálcio, cloreto, sulfato e fosfato.
[00230] Conforme usado aqui, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol e um complemento de expansão a 37 °C. Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou
"composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes aminoácidos livres: histidina, asparagina, serina, glutamato, arginina, glicina, ácido aspártico, ácido glutâmico, treonina, alanina, prolina, cisteína, lisina, tirosina, metionina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina e triptofano.
Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes aminoácidos livres nas porcentagens molares correspondentes: histidina (cerca de 1 %), asparagina (cerca de 0,5 %), serina (cerca de 1,5 %), glutamina (cerca de 67 %), arginina (cerca de 1,5 %), glicina (cerca de 1,5 %), ácido aspártico (cerca de 1 %), ácido glutâmico (cerca de 2 %), treonina (cerca de 2 %), alanina (cerca de 1 %), prolina (cerca de 1,5 %), cisteína (cerca de 1,5 %), lisina (cerca de 3 %), tirosina (cerca de 1,5 %), metionina (cerca de 1 %), valina (cerca de 3,5 %), isoleucina (cerca de 3 %), leucina (cerca de 3,5 %), fenilalanina (cerca de 1,5 %) e triptofano (cerca de 0,5 %). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais dos seguintes aminoácidos livres nas porcentagens molares correspondentes: histidina (cerca de 78 %), asparagina (cerca de 0,4 %), serina (cerca de 1,6 %), glutamina (cerca de 67,01 %), arginina (cerca de 1,67 %), glicina (cerca de 1,72 %), ácido aspártico (cerca de 1,00 %), ácido glutâmico (cerca de 1,93 %), treonina (cerca de 2,38 %), alanina (cerca de 1,11 %), prolina (cerca de 1,49 %), cisteína (cerca de 1,65 %), lisina (cerca de 2,84 %), tirosina (cerca de 1,62 %), metionina (cerca de 0,85 %), valina (cerca de 3,45 %), isoleucina (cerca de 3,14 %), leucina (cerca de 3,3 %), fenilalanina (cerca de 1,64 %) e triptofano (cerca de 0,37 %).
[00231] Conforme usado aqui, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de albumina sérica humana, insulina humana recombinante, transferrina humana, 2- Mercaptoetanol, MDM de Iscove e um complemento de expansão a 37 °C. Alternativamente, ou além disso, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de fósforo, um ácido graxo octanoico, um ácido graxo palmítico, um ácido linoleico e um ácido oleico. Em determinadas modalidades, o meio compreende uma quantidade de fósforo 10 vezes maior do que pode ser encontrado, por exemplo, no Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM); disponível a partir da ThermoFisher Scientific como catálogo número 12440053).
[00232] Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido oleico e um esterol (por exemplo, colesterol). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 0,9 mg/kg a 90 mg/kg, inclusive dos pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,2 mg/kg e 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração de cerca de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, incluindo os pontos finais (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de cerca de 9 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração de cerca de 2 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração de cerca de 2 mg/kg, ácido oleico em uma concentração de cerca de 2 mg/kg e um esterol em uma concentração de cerca de 1 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de 9,19 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração de 1,86 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração de cerca de 2,12 mg/kg, ácido oleico em uma concentração de cerca de 2,13 mg/kg e um esterol em uma concentração de cerca de 1,01 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de 9,19 mg/kg, ácido palmítico em uma concentração de 1,86 mg/kg, ácido linoleico em uma concentração de 2,12 mg/kg, ácido oleico em uma concentração de cerca de 2,13 mg/kg e um esterol em uma concentração de 1,01 mg/kg (em que mg/kg = partes por milhão). Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração entre 6,4 µmol/kg e 640 µmol/kg, inclusive dos pontos finais; ácido palmítico em uma concentração entre 0,7 µmol/kg e 70 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido linoleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; ácido oleico em uma concentração entre 0,75 µmol/kg e 75 µmol/kg, incluindo os pontos finais; e um esterol em uma concentração entre 0,25 µmol/kg e 25 µmol/kg, incluindo os pontos finais. Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de cerca de 64 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração de cerca de 7 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração de cerca de 7,5 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração de cerca de 7,5 µmol/kg e um esterol em uma concentração de cerca de 2,5 µmol/kg.
[00233] Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de cerca de 63,75 µmol/kg, palmítico ácido em uma concentração de cerca de 7,27 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração de cerca de 7,57 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração de cerca de 7,56 µmol/kg e um esterol em uma concentração de cerca de 2,61 µmol/kg. Em determinadas modalidades, os termos "composição para expansão de células T suplementada" ou "composição para expansão de células T" podem ser usados de forma alternada com um meio que compreende um ou mais de ácido octanoico em uma concentração de cerca de 63,75 µmol/kg, ácido palmítico em uma concentração de cerca de 7,27 µmol/kg, ácido linoleico em uma concentração de cerca de 7,57 µmol/kg, ácido oleico em uma concentração de 7,56 µmol/kg e um esterol em uma concentração de 2,61 µmol/kg.
[00234] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula- tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o método compreende contatar uma célula T modificada e um inibidor da via P13K-Akt-mTOR.
Células T modificadas da invenção, incluindo células T de tipo célula- tronco modificadas, TSCM e/ou TCM da invenção, podem ser incubadas, cultivadas, semeadas, armazenadas ou combinadas em qualquer etapa nos métodos do procedimento com um meio de crescimento que compreende um ou mais inibidores de um componente de uma via PI3K.
Inibidores de um componente de uma via PI3K exemplificativos incluem, porém sem limitações, um inibidor de GSK3β, tal como TWS119 (também conhecido como inibidor de GSK 3B XII; número CAS 601514- 19-6 com uma fórmula química C18H14N4O2). Inibidores de um componente de uma via PI3K exemplificativos incluem, porém sem limitações, bb007 (BLUEBIRDBIO™). Inibidores de um componente de uma via PI3K exemplificativos adicionais incluem, porém sem limitações, um inibidor alostérico VIII de Akt (também conhecido como Akti-1/2 com o número de composto 10196499), inibidores competitivos de ATP (inibidores ortopédicos que têm como alvo a bolsa de ligação de ATP da proteína quinase B (Akt)), isoquinolina-5-sulfonamidas (H-8, H-89 e NL-71-101), derivados de Azepano (uma série de estruturas derivadas de (-)-balanol), aminofurazanos (GSK690693), anéis heterocíclicos (7-azaindol, derivados de 6-fenilpurina, derivados de pirrolo[2,3-d]pirimidina, CCT128930, 3-aminopirrolidina, derivados de anilinotriazol, derivados de espiroindolina, AZD5363, ipatasertibe (GDC- 0068) A-674563 e A-443654), derivados de fenilpirazol (AT7867 e AT13148), derivados de tiofenocarboxamida (Afuresertibe (GSK2110183), derivados de 2-pirimidil-5-amidotiofeno (DC120), uprosertibe (GSK2141795), inibidores inibidor (superiores aos inibidores alostéricos que conferem maior especificidade, redução de efeitos colaterais e menos toxicidade), análogos de 2,3-difenilquinoxalina
(derivados de 2,3-difenilquinoxalina, derivado de triazolo[3,4- f][1,6]naftiridin-3(2H)-ona (MK-2206)), Alquilfosfolipídios (edelfosina (1- O-octadecil-2-O-metil-rac-glicero-3-fosfocololina, ET-18-OCH3) ilmofosina (BM 41.440), miltefosina (hexadecilfosfocololina, HePC), perifosina (D-21266), erucilfosfocolina (eRPC), erufosina (ErPC3, erucilfosfo-homocolina), análogos de indol-3-carbinol (indol-3-carbinol, 3-cloroacetilindol, di-indolilmetano, 6-metoxi-5,7-di-hidroindol[2,3- b]carbazol-2,10-dicarboxilato de dietila (SR13668), OSU-A9), derivados de sulfonamida (PH-316 e PHT-427), derivados de tioureia (PIT-1, PIT- 2, DM-PIT-1, N-[(1-metil-1H-pirazol-4-il)carbonil]-N'-(3-bromofenil)- tioureia), derivados de purina (tricirribina (TCN, NSC 154020), análogo ativo de monofosfato de tricirribina (TCN-P), derivado de 4-amino-pirido [2,3-d]pirimidina API-1, derivados de 3-fenil-3H-imidazo[4,5-b]piridina, ARQ 092), BAY 1125976, 3-metil-xantina, quinolina-4-carboxamida e 2- [4-(1-il-ciclo-hexa-1,3-dien)-1H-pirazol-3-il]fenol, ácido 3-oxo-tirucálico, ácidos 3α- e 3β-acetoxi-tirucálicos, ácido acetoxi-tirucâmico e inibidores irreversíveis (antibióticos, Lactoquinomicina, Frenolicina B, calafungina, medermicina, Boc-Fen-vinil-cetona, 4-hidroxinonenal (4-HNE), derivados de 1,6-naftiridinona e derivados de imidazo-1,2-piridina).
[00235] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula- tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o método compreende contatar uma célula T modificada e um inibidor de diferenciação de efetores de células T. Inibidores dediferenciação de efetores de células T exemplificativos incluem, porém sem limitações, um inibidor de BET (por exemplo, JQ1, uma hienotriazolodiazepina) e/ou um inibidor da família de proteínas BET (por exemplo, BRD2, BRD3, BRD4 e BRDT).
[00236] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula- tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o método compreende contatar uma célula T modificada e um agente que reduz o acetil-CoA nucleocitoplasmático. Agentes que reduzem o acetil-CoA nucleocitoplasmático exemplificativos incluem, porém sem limitações, 2-hidroxi-citrato (2-HC), bem como agentes que aumentam a expressão de Acss1.
[00237] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula- tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o método compreende contatar uma célula T modificada e uma composição que compreende um inibidor de histona desacetilase (HDAC). Em algumas modalidades, a composição que compreende um inibidor de HDAC compreende ou consiste em ácido valproico, fenilbutirato de sódio (NaPB) ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição que compreende um inibidor de HDAC compreende ou consiste em ácido valproico. Em algumas modalidades, a composição que compreende um inibidor de HDAC compreende ou consiste em fenilbutirato de sódio (NaPB).
[00238] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula- tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o suplemento de ativação pode compreender uma ou mais citocinas. A uma ou mais citocinas podem compreender qualquer citocina incluindo, porém sem limitações, linfocinas. Exemplos de linfocinas incluem, dentre outros, interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-7 (IL-7), interleucina-15 (IL-15), interleucina-21 (IL-21), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e interferon-gama (INFγ). A uma ou mais citocinas podem compreender IL-2.
[00239] Em determinadas modalidades dos métodos de produção de uma célula T modificada (por exemplo, uma célula T de tipo célula-
tronco, uma TSCM e/ou uma TCM) da invenção, o suplemento de ativação pode compreender um ou mais complexos ativadores. Complexos ativadores exemplificativos e não limitativos podem compreender um complexo de anticorpo monomérico, dimérico, trimérico ou tetramérico que se liga a uma ou mais de CD3, CD28 e CD2. Em algumas modalidades, o suplemento de ativação compreende ou consiste em um complexo ativador que compreende um anticorpo humano, humanizado ou recombinante ou quimérico. Em algumas modalidades, o suplemento de ativação compreende ou consiste em um complexo ativador que se liga à CD3 e CD28. Em algumas modalidades, o suplemento de ativação compreende ou consiste em um complexo ativador que se liga à CD3, CD28 e CD2. Células Naturais Assassinas (NK)
[00240] Em determinadas modalidades, as células imunes ou precursoras imunes modificadas da invenção são células Naturais Assassinas (NK). Em determinadas modalidades, as células NK são linfócitos citotóxicos que se diferenciam de células progenitoras linfoides.
[00241] As células NK modificadas da invenção podem ser derivadas a partir de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras modificadas (HSPCs) ou HSCs modificadas.
[00242] Em determinadas modalidades, as células NK não ativadas são derivadas de leucoferese sem CD3 (contendo células CD14/CD19/CD56+).
[00243] Em determinadas modalidades, as células NK são eletroporadas usando um Lonza 4D Nucleofector ou BTX ECM 830 (500V, comprimento de pulso de 700 μseg, intervalo de eletrodo de 0,2 mm, um pulso). Todos os programas no Lonza 4D Nucleofector são considerados como dentro do escopo dos métodos da invenção.
[00244] Em determinadas modalidades, 5x10E6 células foram eletroporadas por meio de eletroporação em 100 µL de tampão P3 em cubetas. No entanto, esta proporção volumétrica de células é escalonável para métodos de fabricação comercial.
[00245] Em determinadas modalidades, as células NK foram estimuladas por meio de cocultura com uma linhagem de células adicional. Em determinadas modalidades, a linhagem de células adicional compreende células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPCs). Em determinadas modalidades, a estimulação ocorre no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 após a eletroporação. Em determinadas modalidades, a estimulação ocorre no dia 2 após a eletroporação.
[00246] Em determinadas modalidades, as células NK expressam CD56. Células B
[00247] Em determinadas modalidades, as células imunes ou precursoras imunes modificadas da invenção são células B. As células B são um tipo de linfócito que expressa receptores de células B na superfície celular. Os receptores de células B se ligam a antígenos específicos.
[00248] As células B modificadas da invenção podem ser derivadas de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras modificadas (HSPCs) ou HSCs modificadas.
[00249] Em determinadas modalidades, as HSPCs são modificadas usando os métodos da invenção e, em seguida, preparadas para diferenciação de células B na presença de IL-3 humana, Flt3L, TPO, SCF e G-CSF durante pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias ou pelo menos 7 dias. Em determinadas modalidades, as HSPCs são modificadas usando os métodos da invenção e, em seguida, preparadas para diferenciação de células B na presença de IL-3 humana, Flt3L, TPO, SCF e G-CSF durante 5 dias.
[00250] Em determinadas modalidades, após a preparação, as células HSPC modificadas são transferidas para uma camada de células alimentadoras e alimentadas duas vezes por semana, juntamente com transferência para uma nova camada de alimentadores uma vez por semana. Em determinadas modalidades, as células alimentadoras são células alimentadoras MS-5.
[00251] Em determinadas modalidades, as células HSPC modificadas são cultivadas com células alimentadoras MS-5 durante pelo menos 7, 14, 21, 28, 30, 33, 35, 42 ou 48 dias. Em determinadas modalidades, as células HSPC modificadas foram cultivadas com células alimentadoras de MS-5 durante 33 dias. Sistemas de Transposição
[00252] Os sistemas de transposon/transposase exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, transposons e transposases piggyBac, transposons e transposases de tipo piggyBac, transposons e transposases Sleeping Beauty, transposons e transposases Helraiser e transposons e transposases Tol2.
[00253] A transposase piggyBac reconhece sequências terminais repetidas invertidas (ITRs) específicas para transposon nas extremidades do transposon e move o conteúdo entre as ITRs para os locais cromossômicos TTAA. O sistema de transposon piggyBac não tem limite de carga útil para os genes de interesse que podem ser incluídos entre as ITRs. Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais o transposon é um transposon piggyBac, a transposase é uma transposase piggyBac ou Super piggyBac (SPB). Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais a transposase é uma transposase Super piggyBac (SPB), a sequência que codifica a transposase é uma sequência de mRNA.
[00254] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB). A enzima transposase piggyBac (PB) pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00255] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00256] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00257] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[00258] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00259] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00260] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00261] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00262] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00263] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[00264] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[00265] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em uma ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência:
[00266] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00267] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00268] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[00269] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00270] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00271] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00272] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00273] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00274] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[00275] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[00276] Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em duas ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em três ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac (PB) que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em cada uma das seguintes posições 30, 165, 282 e 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 30 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 165 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 282 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N).
[00277] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase Super piggyBac (SPB). Em determinadas modalidades, a enzima transposase Super piggyBac (SPB)s da invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 14487, em que a substituição de aminoácido na posição 30 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I), a substituição de aminoácido na posição 165 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G), a substituição de aminoácido na posição 282 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) e a substituição de aminoácido na posição 538 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a enzima transposase Super piggyBac (SPB) pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00278] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00279] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00280] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[00281] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00282] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00283] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00284] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00285] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00286] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[00287] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14484).
[00288] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 e 591 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 46, 119,
125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 e
570. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 3 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma asparagina (N) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 46 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 46 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma treonina (T) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 82 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma isoleucina (I). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 103 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 119 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma arginina (R). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 125 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 125 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 177 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 177 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma histidina (H) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID
NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 185 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 187 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 200 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma fenilalanina (F).Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 207 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 209 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 226 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 235 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 240 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 241 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 243 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 258 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma tirosina (Y) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 311 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 311 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 315 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma arginina (R).Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 319 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma treonina (T). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 327 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 328 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 340 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 340 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 421 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma histidina (H) por ácido aspártico (D). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 436 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 456 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma tirosina (Y) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 470 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 485 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 503 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades,
a substituição de aminoácido na posição 503 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 552 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 570 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma treonina (T) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 591 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma glutamina (Q). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 591 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma glutamina (Q).
[00289] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido nas posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 103 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 194 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 372 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 375 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 450 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma asparagina (N) por ácido aspártico (D). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 509 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 570 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a enzima transposase piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, a enzima transposase piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido nas posições 372, 375 e 450 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R) na posição 372 de SEQ ID NO: 14487 e uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K) na posição 375 de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R) na posição 372 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K) na posição 375 de SEQ ID NO: 14487 e uma substituição de uma asparagina (N) por ácido aspártico (D) na posição 450 de SEQ ID NO: 14487.
[00290] O transposon Sleeping Beauty é transposto para o genoma alvo pela transposase Sleeping Beauty que reconhece as ITRs e move o conteúdo entre as ITRs para os locais cromossômicos TA. Em várias modalidades, a transferência de genes mediada por transposon SB ou a transferência de genes usando qualquer um de vários transposons similares, pode ser usada nas composições e métodos da invenção.
[00291] Em determinadas modalidades e, em particular naquelas modalidades nas quais o transposon é um transposon Sleeping Beauty, a transposase é uma transposase Sleeping Beauty ou uma transposase Sleeping Beauty hiperativa (SB100X).
[00292] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase Sleeping Beauty compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00293] 1 MGKSKEISQD LRKKIVDLHK SGSSLGAISK
RLKVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
[00294] 61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM
LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGRSARKK
[00295] 121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL
WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
[00296] 181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID
GIMRKENYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
[00297] 241 FQMDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS
QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
[00298] 301 HQLCQEEWAK IHPTYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY (SEQ ID NO: 14485).
[00299] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase Sleeping Beauty (SB100X) hiperativa compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00300] 1 MGKSKEISQD LRKRIVDLHK SGSSLGAISK
RLAVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
[00301] 61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM
LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGHSARKK
[00302] 121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL
WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
[00303] 181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID
GIMDAVQYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
[00304] 241 FQHDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS
QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
[00305] 301 HQLCQEEWAK IHPNYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY (SEQ ID NO: 14486).
[00306] O transposon Helraiser é transposto pela transposase Helitron. As transposases Helitron mobilizam o transposon Helraiser, um elemento antigo do genoma dos morcegos que estava ativo cerca de 30 a 36 milhões de anos atrás. Um transposon Helraiser exemplificativo da invenção inclui Helibat1, o qual compreende uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
[00307] 1 TCCTATATAA TAAAAGAGAA ACATGCAAAT
TGACCATCCC TCCGCTACGC TCAAGCCACG
[00308] 61 CCCACCAGCC AATCAGAAGT GACTATGCAA
ATTAACCCAA CAAAGATGGC AGTTAAATTT
[00309] 121 GCATACGCAG GTGTCAAGCG CCCCAGGAGG
CAACGGCGGC CGCGGGCTCC CAGGACCTTC
[00310] 181 GCTGGCCCCG GGAGGCGAGG CCGGCCGCGC
CTAGCCACAC CCGCGGGCTC CCGGGACCTT
[00311] 241 CGCCAGCAGA GAGCAGAGCG GGAGAGCGGG
CGGAGAGCGG GAGGTTTGGA GGACTTGGCA
[00312] 301 GAGCAGGAGG CCGCTGGACA TAGAGCAGAG
CGAGAGAGAG GGTGGCTTGG AGGGCGTGGC
[00313] 361 TCCCTCTGTC ACCCCAGCTT CCTCATCACA
GCTGTGGAAA CTGACAGCAG GGAGGAGGAA
[00314] 421 GTCCCACCCC CACAGAATCA GCCAGAATCA
GCCGTTGGTC AGACAGCTCT CAGCGGCCTG
[00315] 481 ACAGCCAGGA CTCTCATTCA CCTGCATCTC
AGACCGTGAC AGTAGAGAGG TGGGACTATG
[00316] 541 TCTAAAGAAC AACTGTTGAT ACAACGTAGC
TCTGCAGCCG AAAGATGCCG GCGTTATCGA
[00317] 601 CAGAAAATGT CTGCAGAGCA ACGTGCGTCT
GATCTTGAAA GAAGGCGGCG CCTGCAACAG
[00318] 661 AATGTATCTG AAGAGCAGCT ACTGGAAAAA
CGTCGCTCTG AAGCCGAAAA ACAGCGGCGT
[00319] 721 CATCGACAGA AAATGTCTAA AGACCAACGT
GCCTTTGAAG TTGAAAGAAG GCGGTGGCGA
[00320] 781 CGACAGAATA TGTCTAGAGA ACAGTCATCA
ACAAGTACTA CCAATACCGG TAGGAACTGC
[00321] 841 CTTCTCAGCA AAAATGGAGT ACATGAGGAT
GCAATTCTCG AACATAGTTG TGGTGGAATG
[00322] 901 ACTGTTCGAT GTGAATTTTG CCTATCACTA
AATTTCTCTG ATGAAAAACC ATCCGATGGG
[00323] 961 AAATTTACTC GATGTTGTAG CAAAGGGAAA
GTCTGTCCAA ATGATATACA TTTTCCAGAT
[00324] 1021 TACCCGGCAT ATTTAAAAAG ATTAATGACA
AACGAAGATT CTGACAGTAA AAATTTCATG
[00325] 1081 GAAAATATTC GTTCCATAAA TAGTTCTTTT
GCTTTTGCTT CCATGGGTGC AAATATTGCA
[00326] 1141 TCGCCATCAG GATATGGGCC ATACTGTTTT
AGAATACACG GACAAGTTTA TCACCGTACT
[00327] 1201 GGAACTTTAC ATCCTTCGGA TGGTGTTTCT
CGGAAGTTTG CTCAACTCTA TATTTTGGAT
[00328] 1261 ACAGCCGAAG CTACAAGTAA AAGATTAGCA
ATGCCAGAAA ACCAGGGCTG CTCAGAAAGA
[00329] 1321 CTCATGATCA ACATCAACAA CCTCATGCAT
GAAATAAATG AATTAACAAA ATCGTACAAG
[00330] 1381 ATGCTACATG AGGTAGAAAA GGAAGCCCAA
TCTGAAGCAG CAGCAAAAGG TATTGCTCCC
[00331] 1441 ACAGAAGTAA CAATGGCGAT TAAATACGAT
CGTAACAGTG ACCCAGGTAG ATATAATTCT
[00332] 1501 CCCCGTGTAA CCGAGGTTGC TGTCATATTC
AGAAACGAAG ATGGAGAACC TCCTTTTGAA
[00333] 1561 AGGGACTTGC TCATTCATTG TAAACCAGAT
CCCAATAATC CAAATGCCAC TAAAATGAAA
[00334] 1621 CAAATCAGTA TCCTGTTTCC TACATTAGAT
GCAATGACAT ATCCTATTCT TTTTCCACAT
[00335] 1681 GGTGAAAAAG GCTGGGGAAC AGATATTGCA
TTAAGACTCA GAGACAACAG TGTAATCGAC
[00336] 1741 AATAATACTA GACAAAATGT AAGGACACGA
GTCACACAAA TGCAGTATTA TGGATTTCAT
[00337] 1801 CTCTCTGTGC GGGACACGTT CAATCCTATT
TTAAATGCAG GAAAATTAAC TCAACAGTTT
[00338] 1861 ATTGTGGATT CATATTCAAA AATGGAGGCC
AATCGGATAA ATTTCATCAA AGCAAACCAA
[00339] 1921 TCTAAGTTGA GAGTTGAAAA ATATAGTGGT
TTGATGGATT ATCTCAAATC TAGATCTGAA
[00340] 1981 AATGACAATG TGCCGATTGG TAAAATGATA
ATACTTCCAT CATCTTTTGA GGGTAGTCCC
[00341] 2041 AGAAATATGC AGCAGCGATA TCAGGATGCT
ATGGCAATTG TAACGAAGTA TGGCAAGCCC
[00342] 2101 GATTTATTCA TAACCATGAC ATGCAACCCC
AAATGGGCAG ATATTACAAA CAATTTACAA
[00343] 2161 CGCTGGCAAA AAGTTGAAAA CAGACCTGAC
TTGGTAGCCA GAGTTTTTAA TATTAAGCTG
[00344] 2221 AATGCTCTTT TAAATGATAT ATGTAAATTC
CATTTATTTG GCAAAGTAAT AGCTAAAATT
[00345] 2281 CATGTCATTG AATTTCAGAA ACGCGGACTG
CCTCACGCTC ACATATTATT GATATTAGAT
[00346] 2341 AGTGAGTCCA AATTACGTTC AGAAGATGAC
ATTGACCGTA TAGTTAAGGC AGAAATTCCA
[00347] 2401 GATGAAGACC AGTGTCCTCG ACTTTTTCAA
ATTGTAAAAT CAAATATGGT ACATGGACCA
[00348] 2461 TGTGGAATAC AAAATCCAAA TAGTCCATGT
ATGGAAAATG GAAAATGTTC AAAGGGATAT
[00349] 2521 CCAAAAGAAT TTCAAAATGC GACCATTGGA
AATATTGATG GATATCCCAA ATACAAACGA
[00350] 2581 AGATCTGGTA GCACCATGTC TATTGGAAAT
AAAGTTGTCG ATAACACTTG GATTGTCCCT
[00351] 2641 TATAACCCGT ATTTGTGCCT TAAATATAAC
TGTCATATAA ATGTTGAAGT CTGTGCATCA
[00352] 2701 ATTAAAAGTG TCAAATATTT ATTTAAATAC
ATCTATAAAG GGCACGATTG TGCAAATATT
[00353] 2761 CAAATTTCTG AAAAAAATAT TATCAATCAT
GACGAAGTAC AGGACTTCAT TGACTCCAGG
[00354] 2821 TATGTGAGCG CTCCTGAGGC TGTTTGGAGA
CTTTTTGCAA TGCGAATGCA TGACCAATCT
[00355] 2881 CATGCAATCA CAAGATTAGC TATTCATTTG
CCAAATGATC AGAATTTGTA TTTTCATACC
[00356] 2941 GATGATTTTG CTGAAGTTTT AGATAGGGCT
AAAAGGCATA ACTCGACTTT GATGGCTTGG
[00357] 3001 TTCTTATTGA ATAGAGAAGA TTCTGATGCA
CGTAATTATT ATTATTGGGA GATTCCACAG
[00358] 3061 CATTATGTGT TTAATAATTC TTTGTGGACA
AAACGCCGAA AGGGTGGGAA TAAAGTATTA
[00359] 3121 GGTAGACTGT TCACTGTGAG CTTTAGAGAA
CCAGAACGAT ATTACCTTAG ACTTTTGCTT
[00360] 3181 CTGCATGTAA AAGGTGCGAT AAGTTTTGAG
GATCTGCGAA CTGTAGGAGG TGTAACTTAT
[00361] 3241 GATACATTTC ATGAAGCTGC TAAACACCGA
GGATTATTAC TTGATGACAC TATCTGGAAA
[00362] 3301 GATACGATTG ACGATGCAAT CATCCTTAAT
ATGCCCAAAC AACTACGGCA ACTTTTTGCA
[00363] 3361 TATATATGTG TGTTTGGATG TCCTTCTGCT
GCAGACAAAT TATGGGATGA GAATAAATCT
[00364] 3421 CATTTTATTG AAGATTTCTG TTGGAAATTA
CACCGAAGAG AAGGTGCCTG TGTGAACTGT
[00365] 3481 GAAATGCATG CCCTTAACGA AATTCAGGAG
GTATTCACAT TGCATGGAAT GAAATGTTCA
[00366] 3541 CATTTCAAAC TTCCGGACTA TCCTTTATTA
ATGAATGCAA ATACATGTGA TCAATTGTAC
[00367] 3601 GAGCAACAAC AGGCAGAGGT TTTGATAAAT
TCTCTGAATG ATGAACAGTT GGCAGCCTTT
[00368] 3661 CAGACTATAA CTTCAGCCAT CGAAGATCAA
ACTGTACACC CCAAATGCTT TTTCTTGGAT
[00369] 3721 GGTCCAGGTG GTAGTGGAAA AACATATCTG
TATAAAGTTT TAACACATTA TATTAGAGGT
[00370] 3781 CGTGGTGGTA CTGTTTTACC CACAGCATCT
ACAGGAATTG CTGCAAATTT ACTTCTTGGT
[00371] 3841 GGAAGAACCT TTCATTCCCA ATATAAATTA
CCAATTCCAT TAAATGAAAC TTCAATTTCT
[00372] 3901 AGACTCGATA TAAAGAGTGA AGTTGCTAAA
ACCATTAAAA AGGCCCAACT TCTCATTATT
[00373] 3961 GATGAATGCA CCATGGCATC CAGTCATGCT
ATAAACGCCA TAGATAGATT ACTAAGAGAA
[00374] 4021 ATTATGAATT TGAATGTTGC ATTTGGTGGG
AAAGTTCTCC TTCTCGGAGG GGATTTTCGA
[00375] 4081 CAATGTCTCA GTATTGTACC ACATGCTATG
CGATCGGCCA TAGTACAAAC GAGTTTAAAG
[00376] 4141 TACTGTAATG TTTGGGGATG TTTCAGAAAG
TTGTCTCTTA AAACAAATAT GAGATCAGAG
[00377] 4201 GATTCTGCTT ATAGTGAATG GTTAGTAAAA
CTTGGAGATG GCAAACTTGA TAGCAGTTTT
[00378] 4261 CATTTAGGAA TGGATATTAT TGAAATCCCC
CATGAAATGA TTTGTAACGG ATCTATTATT
[00379] 4321 GAAGCTACCT TTGGAAATAG TATATCTATA
GATAATATTA AAAATATATC TAAACGTGCA
[00380] 4381 ATTCTTTGTC CAAAAAATGA GCATGTTCAA
AAATTAAATG AAGAAATTTT GGATATACTT
[00381] 4441 GATGGAGATT TTCACACATA TTTGAGTGAT
GATTCCATTG ATTCAACAGA TGATGCTGAA
[00382] 4501 AAGGAAAATT TTCCCATCGA ATTTCTTAAT
AGTATTACTC CTTCGGGAAT GCCGTGTCAT
[00383] 4561 AAATTAAAAT TGAAAGTGGG TGCAATCATC
ATGCTATTGA GAAATCTTAA TAGTAAATGG
[00384] 4621 GGTCTTTGTA ATGGTACTAG ATTTATTATC
AAAAGATTAC GACCTAACAT TATCGAAGCT
[00385] 4681 GAAGTATTAA CAGGATCTGC AGAGGGAGAG
GTTGTTCTGA TTCCAAGAAT TGATTTGTCC
[00386] 4741 CCATCTGACA CTGGCCTCCC ATTTAAATTA
ATTCGAAGAC AGTTTCCCGT GATGCCAGCA
[00387] 4801 TTTGCGATGA CTATTAATAA ATCACAAGGA
CAAACTCTAG ACAGAGTAGG AATATTCCTA
[00388] 4861 CCTGAACCCG TTTTCGCACA TGGTCAGTTA
TATGTTGCTT TCTCTCGAGT TCGAAGAGCA
[00389] 4921 TGTGACGTTA AAGTTAAAGT TGTAAATACT
TCATCACAAG GGAAATTAGT CAAGCACTCT
[00390] 4981 GAAAGTGTTT TTACTCTTAA TGTGGTATAC
AGGGAGATAT TAGAATAAGT TTAATCACTT
[00391] 5041 TATCAGTCAT TGTTTGCATC AATGTTGTTT
TTATATCATG TTTTTGTTGT TTTTATATCA
[00392] 5101 TGTCTTTGTT GTTGTTATAT CATGTTGTTA
TTGTTTATTT ATTAATAAAT TTATGTATTA
[00393] 5161 TTTTCATATA CATTTTACTC ATTTCCTTTC
ATCTCTCACA CTTCTATTAT AGAGAAAGGG
[00394] 5221 CAAATAGCAA TATTAAAATA TTTCCTCTAA
TTAATTCCCT TTCAATGTGC ACGAATTTCG
[00395] 5281 TGCACCGGGC CACTAG (SEQ ID NO: 17006).
[00396] Ao contrário de outras transposases, a transposase Helitron não contém um domínio catalítico de tipo RNase-H, mas compreende um motivo RepHel composto por um domínio iniciador de replicação
(Rep) e um domínio de DNA helicase. O domínio Rep é um domínio de nuclease da superfamília HUH de nucleases.
[00397] Uma transposase Helitron exemplificativa da invenção compreende uma sequência de aminoácidos que compreende:
[00398] 1 MSKEQLLIQR SSAAERCRRY RQKMSAEQRA
SDLERRRRLQ QNVSEEQLLE KRRSEAEKQR 61 RHRQKMSKDQ RAFEVERRRW RRQNMSREQS STSTTNTGRN
CLLSKNGVHE DAILEHSCGG 121 MTVRCEFCLS LNFSDEKPSD GKFTRCCSKG KVCPNDIHFP
DYPAYLKRLM TNEDSDSKNF 181 MENIRSINSS FAFASMGANI ASPSGYGPYC FRIHGQVYHR
TGTLHPSDGV SRKFAQLYIL 241 DTAEATSKRL AMPENQGCSE RLMININNLM HEINELTKSY
KMLHEVEKEA QSEAAAKGIA 301 PTEVTMAIKY DRNSDPGRYN SPRVTEVAVI FRNEDGEPPF
ERDLLIHCKP DPNNPNATKM 361 KQISILFPTL DAMTYPILFP HGEKGWGTDI ALRLRDNSVI
DNNTRQNVRT RVTQMQYYGF 421 HLSVRDTFNP ILNAGKLTQQ FIVDSYSKME ANRINFIKAN
QSKLRVEKYS GLMDYLKSRS 481 ENDNVPIGKM IILPSSFEGS PRNMQQRYQD AMAIVTKYGK
PDLFITMTCN PKWADITNNL 541 QRWQKVENRP DLVARVFNIK LNALLNDICK FHLFGKVIAK
IHVIEFQKRG LPHAHILLIL 601 DSESKLRSED DIDRIVKAEI PDEDQCPRLF QIVKSNMVHG
PCGIQNPNSP CMENGKCSKG 661 YPKEFQNATI GNIDGYPKYK RRSGSTMSIG NKVVDNTWIV
PYNPYLCLKY NCHINVEVCA 721 SIKSVKYLFK YIYKGHDCAN IQISEKNIIN HDEVQDFIDS
RYVSAPEAVW RLFAMRMHDQ
781 SHAITRLAIH LPNDQNLYFH TDDFAEVLDR AKRHNSTLMA
WFLLNREDSD ARNYYYWEIP 841 QHYVFNNSLW TKRRKGGNKV LGRLFTVSFR EPERYYLRLL
LLHVKGAISF EDLRTVGGVT 901 YDTFHEAAKH RGLLLDDTIW KDTIDDAIIL NMPKQLRQLF
AYICVFGCPS AADKLWDENK 961 SHFIEDFCWK LHRREGACVN CEMHALNEIQ EVFTLHGMKC
SHFKLPDYPL LMNANTCDQL 1021 YEQQQAEVLI NSLNDEQLAA FQTITSAIED QTVHPKCFFL
DGPGGSGKTY LYKVLTHYIR 1081 GRGGTVLPTA STGIAANLLL GGRTFHSQYK LPIPLNETSI
SRLDIKSEVA KTIKKAQLLI 1141 IDECTMASSH AINAIDRLLR EIMNLNVAFG GKVLLLGGDF
RQCLSIVPHA MRSAIVQTSL 1201 KYCNVWGCFR KLSLKTNMRS EDSAYSEWLV KLGDGKLDSS
FHLGMDIIEI PHEMICNGSI 1261 IEATFGNSIS IDNIKNISKR AILCPKNEHV QKLNEEILDI
LDGDFHTYLS DDSIDSTDDA 1321 EKENFPIEFL NSITPSGMPC HKLKLKVGAI IMLLRNLNSK
WGLCNGTRFI IKRLRPNIIE 1381 AEVLTGSAEG EVVLIPRIDL SPSDTGLPFK LIRRQFPVMP
AFAMTINKSQ GQTLDRVGIF 1441 LPEPVFAHGQ LYVAFSRVRR ACDVKVKVVN TSSQGKLVKH SESVFTLNVV YREILE (SEQ ID NO: 14501).
[00399] Nas transposições com Helitron, uma estrutura de "grampo de cabelo" próximo à extremidade 3' do transposon funciona como um terminador. No entanto, esta estrutura de "grampo de cabelo" pode ser contornada pela transposase, resultando na transdução de sequências de flanqueamento. Além disso, a transposição de Helraiser gera intermediários circulares covalentemente fechados. Além disso, as transposições com Helitron podem não ter duplicações no sítio-alvo. Na sequência Helraiser, a transposase é flanqueada por sequências terminais esquerda e direita denominadas LTS (sequência terminal 5') e RTS (sequência terminal 3'). Estas sequências terminam com um motivo 5'-TC/CTAG-3' conservado. Uma sequência palindrômica de 19 pb com potencial para formar a estrutura terminal de "grampo de cabelo" está localizada 11 nucleotídeos a montante da RTS e consiste na sequência GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCA CTAG (SEQ ID NO: 14500).
[00400] Os transposons Tol2 podem ser isolados ou derivados do genoma do peixe medaka e podem ser similares aos transposons da família hAT. Os transposons Tol2 exemplificativos da invenção são codificados por uma sequência que compreende cerca de 4,7 quilobases e contêm um gene que codifica a transposase Tol2, a qual contém quatro éxons. Uma transposase Tol2 exemplificativa da invenção compreende uma sequência de aminoácidos que compreende o seguinte:
[00401] 1 MEEVCDSSAA ASSTVQNQPQ DQEHPWPYLR
EFFSLSGVNK DSFKMKCVLC LPLNKEISAF
[00402] 61 KSSPSNLRKH IERMHPNYLK NYSKLTAQKR
KIGTSTHASS SKQLKVDSVF PVKHVSPVTV
[00403] 121 NKAILRYIIQ GLHPFSTVDL PSFKELISTL QPGISVITRP
TLRSKIAEAA LIMKQKVTAA
[00404] 181 MSEVEWIATT TDCWTARRKS FIGVTAHWIN
PGSLERHSAA LACKRLMGSH TFEVLASAMN
[00405] 241 DIHSEYEIRD KVVCTTTDSG SNFMKAFRVF
GVENNDIETE ARRCESDDTD SEGCGEGSDG
[00406] 301 VEFQDASRVL DQDDGFEFQL PKHQKCACHL
LNLVSSVDAQ KALSNEHYKK LYRSVFGKCQ
[00407] 361 ALWNKSSRSA LAAEAVESES RLQLLRPNQT
RWNSTFMAVD RILQICKEAG EGALRNICTS
[00408] 421 LEVPMFNPAE MLFLTEWANT MRPVAKVLDI
LQAETNTQLG WLLPSVHQLS LKLQRLHHSL
[00409] 481 RYCDPLVDAL QQGIQTRFKH MFEDPEIIAA
AILLPKFRTS WTNDETIIKR GMDYIRVHLE
[00410] 541 PLDHKKELAN SSSDDEDFFA SLKPTTHEAS
KELDGYLACV SDTRESLLTF PAICSLSIKT
[00411] 601 NTPLPASAAC ERLFSTAGLL FSPKRARLDT NNFENQLLLK LNLRFYNFE (SEQ ID NO: 14502).
[00412] Um transposon Tol2 exemplificativo da invenção, incluindo repetições invertidas, sequências subterminais e a transposase Tol2, é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende o seguinte:
[00413] 1 CAGAGGTGTA AAGTACTTGA GTAATTTTAC
TTGATTACTG TACTTAAGTA TTATTTTTGG
[00414] 61 GGATTTTTAC TTTACTTGAG TACAATTAAA
AATCAATACT TTTACTTTTA CTTAATTACA
[00415] 121 TTTTTTTAGA AAAAAAAGTA CTTTTTACTC
CTTACAATTT TATTTACAGT CAAAAAGTAC
[00416] 181 TTATTTTTTG GAGATCACTT CATTCTATTT
TCCCTTGCTA TTACCAAACC AATTGAATTG
[00417] 241 CGCTGATGCC CAGTTTAATT TAAATGTTAT
TTATTCTGCC TATGAAAATC GTTTTCACAT
[00418] 301 TATATGAAAT TGGTCAGACA TGTTCATTGG
TCCTTTGGAA GTGACGTCAT GTCACATCTA
[00419] 361 TTACCACAAT GCACAGCACC TTGACCTGGA
AATTAGGGAA ATTATAACAG TCAATCAGTG
[00420] 421 GAAGAAAATG GAGGAAGTAT GTGATTCATC
AGCAGCTGCG AGCAGCACAG TCCAAAATCA
[00421] 481 GCCACAGGAT CAAGAGCACC CGTGGCCGTA
TCTTCGCGAA TTCTTTTCTT TAAGTGGTGT
[00422] 541 AAATAAAGAT TCATTCAAGA TGAAATGTGT
CCTCTGTCTC CCGCTTAATA AAGAAATATC
[00423] 601 GGCCTTCAAA AGTTCGCCAT CAAACCTAAG
GAAGCATATT GAGGTAAGTA CATTAAGTAT
[00424] 661 TTTGTTTTAC TGATAGTTTT TTTTTTTTTT
TTTTTTTTTT TTTTTGGGTG TGCATGTTTT
[00425] 721 GACGTTGATG GCGCGCCTTT TATATGTGTA
GTAGGCCTAT TTTCACTAAT GCATGCGATT
[00426] 781 GACAATATAA GGCTCACGTA ATAAAATGCT
AAAATGCATT TGTAATTGGT AACGTTAGGT
[00427] 841 CCACGGGAAA TTTGGCGCCT ATTGCAGCTT
TGAATAATCA TTATCATTCC GTGCTCTCAT
[00428] 901 TGTGTTTGAA TTCATGCAAA ACACAAGAAA
ACCAAGCGAG AAATTTTTTT CCAAACATGT
[00429] 961 TGTATTGTCA AAACGGTAAC ACTTTACAAT
GAGGTTGATT AGTTCATGTA TTAACTAACA
[00430] 1021 TTAAATAACC ATGAGCAATA CATTTGTTAC
TGTATCTGTT AATCTTTGTT AACGTTAGTT
[00431] 1081 AATAGAAATA CAGATGTTCA TTGTTTGTTC
ATGTTAGTTC ACAGTGCATT AACTAATGTT
[00432] 1141 AACAAGATAT AAAGTATTAG TAAATGTTGA
AATTAACATG TATACGTGCA GTTCATTATT
[00433] 1201 AGTTCATGTT AACTAATGTA GTTAACTAAC
GAACCTTATT GTAAAAGTGT TACCATCAAA
[00434] 1261 ACTAATGTAA TGAAATCAAT TCACCCTGTC
ATGTCAGCCT TACAGTCCTG TGTTTTTGTC
[00435] 1321 AATATAATCA GAAATAAAAT TAATGTTTGA
TTGTCACTAA ATGCTACTGT ATTTCTAAAA
[00436] 1381 TCAACAAGTA TTTAACATTA TAAAGTGTGC
AATTGGCTGC AAATGTCAGT TTTATTAAAG
[00437] 1441 GGTTAGTTCA CCCAAAAATG AAAATAATGT
CATTAATGAC TCGCCCTCAT GTCGTTCCAA
[00438] 1501 GCCCGTAAGA CCTCCGTTCA TCTTCAGAAC
ACAGTTTAAG ATATTTTAGA TTTAGTCCGA
[00439] 1561 GAGCTTTCTG TGCCTCCATT GAGAATGTAT
GTACGGTATA CTGTCCATGT CCAGAAAGGT
[00440] 1621 AATAAAAACA TCAAAGTAGT CCATGTGACA
TCAGTGGGTT AGTTAGAATT TTTTGAAGCA
[00441] 1681 TCGAATACAT TTTGGTCCAA AAATAACAAA
ACCTACGACT TTATTCGGCA TTGTATTCTC
[00442] 1741 TTCCGGGTCT GTTGTCAATC CGCGTTCACG
ACTTCGCAGT GACGCTACAA TGCTGAATAA
[00443] 1801 AGTCGTAGGT TTTGTTATTT TTGGACCAAA
ATGTATTTTC GATGCTTCAA ATAATTCTAC
[00444] 1861 CTAACCCACT GATGTCACAT GGACTACTTT
GATGTTTTTA TTACCTTTCT GGACATGGAC
[00445] 1921 AGTATACCGT ACATACATTT TCAGTGGAGG
GACAGAAAGC TCTCGGACTA AATCTAAAAT
[00446] 1981 ATCTTAAACT GTGTTCCGAA GATGAACGGA
GGTGTTACGG GCTTGGAACG ACATGAGGGT
[00447] 2041 GAGTCATTAA TGACATCTTT TCATTTTTGG
GTGAACTAAC CCTTTAATGC TGTAATCAGA
[00448] 2101 GAGTGTATGT GTAATTGTTA CATTTATTGC
ATACAATATA AATATTTATT TGTTGTTTTT
[00449] 2161 ACAGAGAATG CACCCAAATT ACCTCAAAAA
CTACTCTAAA TTGACAGCAC AGAAGAGAAA
[00450] 2221 GATCGGGACC TCCACCCATG CTTCCAGCAG
TAAGCAACTG AAAGTTGACT CAGTTTTCCC
[00451] 2281 AGTCAAACAT GTGTCTCCAG TCACTGTGAA
CAAAGCTATA TTAAGGTACA TCATTCAAGG
[00452] 2341 ACTTCATCCT TTCAGCACTG TTGATCTGCC
ATCATTTAAA GAGCTGATTA GTACACTGCA
[00453] 2401 GCCTGGCATT TCTGTCATTA CAAGGCCTAC
TTTACGCTCC AAGATAGCTG AAGCTGCTCT
[00454] 2461 GATCATGAAA CAGAAAGTGA CTGCTGCCAT
GAGTGAAGTT GAATGGATTG CAACCACAAC
[00455] 2521 GGATTGTTGG ACTGCACGTA GAAAGTCATT
CATTGGTGTA ACTGCTCACT GGATCAACCC
[00456] 2581 TGGAAGTCTT GAAAGACATT CCGCTGCACT
TGCCTGCAAA AGATTAATGG GCTCTCATAC
[00457] 2641 TTTTGAGGTA CTGGCCAGTG CCATGAATGA
TATCCACTCA GAGTATGAAA TACGTGACAA
[00458] 2701 GGTTGTTTGC ACAACCACAG ACAGTGGTTC
CAACTTTATG AAGGCTTTCA GAGTTTTTGG
[00459] 2761 TGTGGAAAAC AATGATATCG AGACTGAGGC
AAGAAGGTGT GAAAGTGATG ACACTGATTC
[00460] 2821 TGAAGGCTGT GGTGAGGGAA GTGATGGTGT
GGAATTCCAA GATGCCTCAC GAGTCCTGGA
[00461] 2881 CCAAGACGAT GGCTTCGAAT TCCAGCTACC
AAAACATCAA AAGTGTGCCT GTCACTTACT
[00462] 2941 TAACCTAGTC TCAAGCGTTG ATGCCCAAAA
AGCTCTCTCA AATGAACACT ACAAGAAACT
[00463] 3001 CTACAGATCT GTCTTTGGCA AATGCCAAGC
TTTATGGAAT AAAAGCAGCC GATCGGCTCT
[00464] 3061 AGCAGCTGAA GCTGTTGAAT CAGAAAGCCG
GCTTCAGCTT TTAAGGCCAA ACCAAACGCG
[00465] 3121 GTGGAATTCA ACTTTTATGG CTGTTGACAG
AATTCTTCAA ATTTGCAAAG AAGCAGGAGA
[00466] 3181 AGGCGCACTT CGGAATATAT GCACCTCTCT
TGAGGTTCCA ATGTAAGTGT TTTTCCCCTC
[00467] 3241 TATCGATGTA AACAAATGTG GGTTGTTTTT
GTTTAATACT CTTTGATTAT GCTGATTTCT
[00468] 3301 CCTGTAGGTT TAATCCAGCA GAAATGCTGT
TCTTGACAGA GTGGGCCAAC ACAATGCGTC
[00469] 3361 CAGTTGCAAA AGTACTCGAC ATCTTGCAAG
CGGAAACGAA TACACAGCTG GGGTGGCTGC
[00470] 3421 TGCCTAGTGT CCATCAGTTA AGCTTGAAAC
TTCAGCGACT CCACCATTCT CTCAGGTACT
[00471] 3481 GTGACCCACT TGTGGATGCC CTACAACAAG
GAATCCAAAC ACGATTCAAG CATATGTTTG
[00472] 3541 AAGATCCTGA GATCATAGCA GCTGCCATCC
TTCTCCCTAA ATTTCGGACC TCTTGGACAA
[00473] 3601 ATGATGAAAC CATCATAAAA CGAGGTAAAT
GAATGCAAGC AACATACACT TGACGAATTC
[00474] 3661 TAATCTGGGC AACCTTTGAG CCATACCAAA
ATTATTCTTT TATTTATTTA TTTTTGCACT
[00475] 3721 TTTTAGGAAT GTTATATCCC ATCTTTGGCT
GTGATCTCAA TATGAATATT GATGTAAAGT
[00476] 3781 ATTCTTGCAG CAGGTTGTAG TTATCCCTCA
GTGTTTCTTG AAACCAAACT CATATGTATC
[00477] 3841 ATATGTGGTT TGGAAATGCA GTTAGATTTT
ATGCTAAAAT AAGGGATTTG CATGATTTTA
[00478] 3901 GATGTAGATG ACTGCACGTA AATGTAGTTA
ATGACAAAAT CCATAAAATT TGTTCCCAGT
[00479] 3961 CAGAAGCCCC TCAACCAAAC TTTTCTTTGT
GTCTGCTCAC TGTGCTTGTA GGCATGGACT
[00480] 4021 ACATCAGAGT GCATCTGGAG CCTTTGGACC
ACAAGAAGGA ATTGGCCAAC AGTTCATCTG
[00481] 4081 ATGATGAAGA TTTTTTCGCT TCTTTGAAAC
CGACAACACA TGAAGCCAGC AAAGAGTTGG
[00482] 4141 ATGGATATCT GGCCTGTGTT TCAGACACCA
GGGAGTCTCT GCTCACGTTT CCTGCTATTT
[00483] 4201 GCAGCCTCTC TATCAAGACT AATACACCTC
TTCCCGCATC GGCTGCCTGT GAGAGGCTTT
[00484] 4261 TCAGCACTGC AGGATTGCTT TTCAGCCCCA
AAAGAGCTAG GCTTGACACT AACAATTTTG
[00485] 4321 AGAATCAGCT TCTACTGAAG TTAAATCTGA
GGTTTTACAA CTTTGAGTAG CGTGTACTGG
[00486] 4381 CATTAGATTG TCTGTCTTAT AGTTTGATAA
TTAAATACAA ACAGTTCTAA AGCAGGATAA
[00487] 4441 AACCTTGTAT GCATTTCATT TAATGTTTTT
TGAGATTAAA AGCTTAAACA AGAATCTCTA
[00488] 4501 GTTTTCTTTC TTGCTTTTAC TTTTACTTCC
TTAATACTCA AGTACAATTT TAATGGAGTA
[00489] 4561 CTTTTTTACT TTTACTCAAG TAAGATTCTA
GCCAGATACT TTTACTTTTA ATTGAGTAAA
[00490] 4621 ATTTTCCCTA AGTACTTGTA CTTTCACTTG
AGTAAAATTT TTGAGTACTT TTTACACCTC
[00491] 4681 TG (SEQ ID NO: 17007).
[00492] Sistemas de transposon/transposase exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, transposons e transposases piggyBac e de tipo piggyBac.
[00493] As transposases piggyBac e de tipo piggyBac reconhecem sequências terminais repetidas invertidas (ITRs) específicas para transposon nas extremidades do transposon e movem o conteúdo entre as ITRs para os locais cromossômicos TTAA ou TTAT. O sistema de transposon piggyBac ou de tipo piggyBac não tem limite de carga útil para os genes de interesse que podem ser incluídos entre as ITRs.
[00494] Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais o transposon é um transposon piggyBac, a transposase é uma transposase piggyBac ou Super piggyBac (SPB). Em determinadas modalidades e, em particular em modalidades nas quais a transposase é uma piggyBac ou Super piggyBac (SPB), a sequência que codifica a transposase é uma sequência de mRNA.
[00495] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac.
[00496] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00497] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00498] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00499] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[00500] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00501] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00502] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00503] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00504] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00505] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[00506] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[00507] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácidos em uma ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência:
[00508] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00509] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00510] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[00511] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00512] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00513] 301 SG T KYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00514] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00515] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00516] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[00517] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[00518] Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em duas ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em três ou mais das posições 30, 165, 282 ou 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem uma substituição de aminoácido em cada uma das seguintes posições 30, 165, 282 e 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 30 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 165 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 282 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 538 da sequência de SEQ ID NO: 14487 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N).
[00519] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase Super piggyBac (SPB) ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase Super piggyBac (SPB) ou de tipo piggyBac da invenção pode compreender ou consistir na sequência de aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 14487, em que a substituição de aminoácido na posição 30 é uma substituição de uma valina (V) por uma isoleucina (I), a substituição de aminoácido na posição 165 é uma substituição de uma serina (S) por uma glicina (G), a substituição de aminoácido na posição 282 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) e a substituição de aminoácido na posição 538 é uma substituição de uma lisina (K) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a enzima transposase Super piggyBac (SPB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00520] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[00521] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[00522] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[00523] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[00524] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[00525] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[00526] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[00527] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[00528] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[00529] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA
NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14484).
[00530] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBC, Super piggyBac (SPB) ou de tipo piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 e 591 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBC, Super piggyBac (SPB) ou de tipo piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 e 570. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 3 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma asparagina (N) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 46 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 46 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma treonina (T) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 82 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma isoleucina (I). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 103 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 119 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma arginina (R). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 125 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 125 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 177 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 177 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma histidina (H) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 180 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 185 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 187 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 200 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição
207 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 209 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 226 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 235 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 240 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 241 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma fenilalanina (F). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 243 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 258 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de um triptofano (W) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma tirosina (Y) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 296 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 298 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 311 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 311 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina por uma prolina (P). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 315 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma arginina (R).Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 319 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma treonina (T). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 327 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 328 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma tirosina (Y). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 340 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 340 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma cisteína (C). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 421 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma histidina (H) por ácido aspártico (D). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 436 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 456 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma tirosina (Y) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 470 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma fenilalanina (F) por uma leucina (L). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 485 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 503 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma leucina (L) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 503 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma isoleucina (I) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 552 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma lisina (K) por uma valina (V). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 570 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma treonina (T) por uma alanina (A). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 591 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma glutamina (Q). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 591 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma arginina (R) por uma glutamina (Q).
[00531] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a transposase compreende as mutações descritas acima nas posições 30, 165, 282 e/ou 538, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac ou a enzima transposase Super piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido nas posições 103, 194, 372, 375, 450, 509 e 570 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 103 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma prolina (P) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 194 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 372 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 375 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 450 de SEQ ID NO: 14487 ou
SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma asparagina (N) por ácido aspártico (D). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 509 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma glicina (G) por uma serina (S). Em determinadas modalidades, a substituição de aminoácido na posição 570 de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484 é uma substituição de uma serina (S) por uma asparagina (N). Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, incluindo aquelas modalidades nas quais a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ainda uma substituição de aminoácido nas posições 372, 375 e 450 da sequência de SEQ ID NO: 14487 ou SEQ ID NO: 14484. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R) na posição 372 de SEQ ID NO: 14487 e uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K) na posição 375 de SEQ ID NO: 14487. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender uma substituição de uma valina (V) por uma metionina (M) na posição 194 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma arginina (R) na posição 372 de SEQ ID NO: 14487, uma substituição de uma alanina (A) por uma lisina (K) na posição 375 de SEQ ID NO: 14487 e uma substituição de uma asparagina (N) por ácido aspártico (D) na posição 450 de SEQ ID NO: 14487.
[00532] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um inseto. Em determinadas modalidades, o inseto é Trichoplusia ni (N° de Acesso GenBank AAA87375; SEQ ID NO: 16796), Argyrogramma agnata (N° de Acesso GenBank GU477713; SEQ ID NO: 14534, SEQ ID NO: 16797), Anopheles gambiae (N° de Acesso GenBank XP_312615 (SEQ ID NO: 16798); N° de Acesso GenBank XP_320414 (SEQ ID NO: 16799); N° de Acesso GenBank XP_310729 (SEQ ID NO: 16800)), Aphis gossypii (N° de Acesso GenBank GU329918; SEQ ID NO: 16801, SEQ ID NO: 16802), Acyrthosiphon pisum (N° de Acesso GenBank XP_001948139; SEQ ID NO: 16803), Agrotis ipsilon (N° de Acesso GenBank GU477714; SEQ ID NO: 14537, SEQ ID NO: 16804), Bombyx mori (N° de Acesso GenBank BAD11135; SEQ ID NO: 14505), Chilo suppressalis (N° de Acesso GenBank JX294476; SEQ ID NO: 16805, SEQ ID NO: 16806), Drosophila melanogaster (N° de Acesso GenBank AAL39784; SEQ ID NO: 16807), Helicoverpa armigera (N° de Acesso GenBank ABS18391; SEQ ID NO: 14525), Heliothis virescens (N° de Acesso GenBank ABD76335; SEQ ID NO: 16808), Macdunnoughia crassisigna (N° de Acesso GenBank EU287451; SEQ ID NO: 16809, SEQ ID NO: 16810), Pectinophora gossypiella (N° de Acesso GenBank GU270322; SEQ ID NO: 14530, SEQ ID NO: 16811), Tribolium castaneum (N° de Acesso GenBank XP_001814566; SEQ ID NO: 16812), Ctenoplusia agnata (também denominado Argyrogramma agnata), Messour bouvieri, Megachile rotundata, Bombus impatiens, Mamestra brassicae, Mayetiola destructor ou Apis mellifera.
[00533] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um inseto. Em determinadas modalidades, o inseto é Trichoplusia ni (AAA87375).
[00534] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um inseto. Em determinadas modalidades, o inseto é Bombyx mori (BAD11135).
[00535] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um crustáceo. Em determinadas modalidades, o crustáceo é Daphnia pulicaria (AAM76342, SEQ ID NO: 16813).
[00536] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um vertebrado. Em determinadas modalidades, o vertebrado é Xenopus tropicalis (N° de Acesso GenBank BAF82026; SEQ ID NO: 14518), Homo sapiens (N° de Acesso GenBank NP_689808; SEQ ID NO: 16814), Mus musculus (N° de Acesso GenBank NP_741958; SEQ ID NO: 16815), Macaca fascicularis (N° de Acesso GenBank AB179012; SEQ ID NO: 16816, SEQ ID NO: 16817), Rattus norvegicus (N° de Acesso GenBank XP_220453; SEQ ID NO: 16818) ou Myotis lucifugus.
[00537] Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de um urocordato. Em determinadas modalidades, o urocordato é Ciona intestinalis (N° de Acesso GenBank XP_002123602; SEQ ID NO: 16819).
[00538] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac insere um transposon na sequência 5’-TTAT-3’ dentro de um local cromossômico (uma sequência-alvo TTAT).
[00539] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac insere um transposon na sequência 5’-TTAA-3’ dentro de um local cromossômico (uma sequência-alvo TTAA).
[00540] Em determinadas modalidades, a sequência-alvo o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende ou consiste em 5’-CTAA-3’, 5’-TTAG-3’, 5’-ATAA-3’, 5’-TCAA-3’, 5’AGTT-3’, 5’-ATTA-3’, 5’-GTTA-3’, 5’-TTGA-3’, 5’-TTTA-3’, 5’-TTAC-3’, 5’-ACTA-3’, 5’-AGGG- 3’, 5’-CTAG-3’, 5’-TGAA-3’, 5’-AGGT-3’, 5’-ATCA-3’, 5’-CTCC-3’, 5’- TAAA-3’, 5’-TCTC-3’, 5’TGAA-3’, 5’-AAAT-3’, 5’-AATC-3’, 5’-ACAA-3’, 5’-ACAT-3’, 5’-ACTC-3’, 5’-AGTG-3’, 5’-ATAG-3’, 5’-CAAA-3’, 5’-CACA-
3’, 5’-CATA-3’, 5’-CCAG-3’, 5’-CCCA-3’, 5’-CGTA-3’, 5’-GTCC-3’, 5’- TAAG-3’, 5’-TCTA-3’, 5’-TGAG-3’, 5’-TGTT-3’, 5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’ e 5’-TTTT-3’.
[00541] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Bombyx mori. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00542] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00543] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00544] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00545] 181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
[00546] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00547] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FDVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00548] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00549] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELSANYNVSR
[00550] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRANKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00551] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KHSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00552] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14504).
[00553] A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a: 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN
YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00554] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00555] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00556] 181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
[00557] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00558] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00559] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00560] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00561] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00562] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00563] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14505).
[00564] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é fundida a um sinal de localização nuclear. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da transposase piggyBac ou de tipo piggyBac fundida a um sinal de localização nuclear é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que compreende:
[00565] 1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gacattgaaa gacaggaaga aagaatcagg
[00566] 61 gcgatgctcg aagaagaact gagcgactac tccgacgaat cgtcatcaga ggatgaaacc
[00567] 121 gaccactgta gcgagcatga ggttaactac gacaccgagg aggagagaat cgactctgtg
[00568] 181 gatgtgccct ccaactcacg ccaagaagag gccaatgcaa ttatcgcaaa cgaatcggac
[00569] 241 agcgatccag acgatgatct gccactgtcc ctcgtgcgcc agcgggccag cgcttcgaga
[00570] 301 caagtgtcag gtccattcta cacttcgaag gacggcacta agtggtacaa gaattgccag
[00571] 361 cgacctaacg tcagactccg ctccgagaat atcgtgaccg aacaggctca ggtcaagaat
[00572] 421 atcgcccgcg acgcctcgac tgagtacgag tgttggaata tcttcgtgac ttcggacatg
[00573] 481 ctgcaagaaa ttctgacgca caccaacagc tcgattaggc atcgccagac caagactgca
[00574] 541 gcggagaact catcggccga aacctccttc tatatgcaag agactactct gtgcgaactg
[00575] 601 aaggcgctga ttgcactgct gtacttggcc ggcctcatca aatcaaatag gcagagcctc
[00576] 661 aaagatctct ggagaacgga tggaactgga gtggatatct ttcggacgac tatgagcttg
[00577] 721 cagcggttcc agtttctgca aaacaatatc agattcgacg acaagtccac ccgggacgaa
[00578] 781 aggaaacaga ctgacaacat ggctgcgttc cggtcaatat tcgatcagtt tgtgcagtgc
[00579] 841 tgccaaaacg cttatagccc atcggaattc ctgaccatcg acgaaatgct tctctccttc
[00580] 901 cgggggcgct gcctgttccg agtgtacatc ccgaacaagc cggctaaata cggaatcaaa
[00581] 961 atcctggccc tggtggacgc caagaatttc tacgtcgtga atctcgaagt gtacgcagga
[00582] 1021 aagcaaccgt cgggaccgta cgctgtttcg aaccgcccgt ttgaagtcgt cgagcggctt
[00583] 1081 attcagccgg tggccagatc ccaccgcaat gttaccttcg acaattggtt caccggctac
[00584] 1141 gagctgatgc ttcaccttct gaacgagtac cggctcacta gcgtggggac tgtcaggaag
[00585] 1201 aacaagcggc agatcccaga atccttcatc cgcaccgacc gccagcctaa ctcgtccgtg
[00586] 1261 ttcggatttc aaaaggatat cacgcttgtc tcgtacgccc ccaagaaaaa caaggtcgtg
[00587] 1321 gtcgtgatga gcaccatgca tcacgacaac agcatcgacg agtcaaccgg agaaaagcaa
[00588] 1381 aagcccgaga tgatcacctt ctacaattca actaaggccg gcgtcgacgt cgtggatgaa
[00589] 1441 ctgtgcgcga actataacgt gtcccggaac tctaagcggt ggcctatgac tctcttctac
[00590] 1501 ggagtgctga atatggccgc aatcaacgcg tgcatcatct accgcaccaa caagaacgtg
[00591] 1561 accatcaagc gcaccgagtt catcagatcg ctgggtttga gcatgatcta cgagcacctc
[00592] 1621 cattcacgga acaagaagaa gaatatccct acttacctga ggcagcgtat cgagaagcag
[00593] 1681 ttgggagaac caagcccgcg ccacgtgaac gtgccggggc gctacgtgcg gtgccaagat
[00594] 1741 tgcccgtaca aaaaggaccg caaaaccaaa agatcgtgta acgcgtgcgc caaacctatc
[00595] 1801 tgcatggagc atgccaaatt tctgtgtgaa aattgtgctg aactcgattc ctccctg (SEQ ID NO: 14629).
[00596] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é hiperativa. Uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é uma transposase que é mais ativa do que a variante de ocorrência natural da qual ela é derivada. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é isolada ou derivada de Bombyx mori. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é a variante hiperativa de SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a:
[00597] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00598] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQMSGPHYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00599] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS
[00600] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
[00601] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00602] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00603] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00604] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00605] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00606] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00607] 601 ENCAELDSHL (SEQ ID NO: 14576).
[00608] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende SEQ ID NO: 14576. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00609] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00610] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00611] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
[00612] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
[00613] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00614] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVHNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00615] 361 NVTFDNWFTG YEVMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00616] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00617] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00618] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00619] 601 ENCAHLDS (SEQ ID NO: 14630).
[00620] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00621] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00622] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00623] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS
[00624] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
[00625] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00626] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00627] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00628] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00629] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00630] 541 PTYLRQRIAM QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00631] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14631).
[00632] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00633] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00634] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00635] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
[00636] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
[00637] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00638] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00639] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKTQIPENF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00640] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELQANYNVSR
[00641] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00642] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00643] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14632).
[00644] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00645] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00646] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00647] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
[00648] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
[00649] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00650] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00651] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00652] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00653] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00654] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00655] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14633).
[00656] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00657] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00658] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00659] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00660] 181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
[00661] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00662] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00663] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00664] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00665] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00666] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSSRHV NVKGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00667] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14634).
[00668] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é mais ativa do que a transposase de SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO:
14505.
[00669] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir de 92, 93, 96, 97, 165, 178, 189, 196, 200, 201, 211, 215, 235, 238, 246, 253, 258, 261, 263, 271, 303, 321, 324, 330, 373, 389, 399, 402, 403, 404, 448, 473, 484, 507,5 23, 527, 528, 543, 549, 550, 557,6 01, 605, 607, 609, 610 ou uma combinação das mesmas (em relação à SEQ ID NO: 14505). Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma substituição de aminoácido de Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H, L610I ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma substituição de aminoácido de Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H e L610I.
[00670] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma ou mais substituições de um aminoácido que não é de tipo selvagem, em que a uma ou mais substituições por um aminoácido que não é de tipo selvagem compreende uma substituição de E4X, A12X, M13X,L14X, E15X, D20X, E24X, S25X, S26X, S27X, D32X, H33X, E36X, E44X, E45X, E46X, I48X, D49X, R58X, A62X, N63X, A64X, I65X, I66X, N68X, E69X, D71X, S72X, D76X, P79X, R84X, Q85X, A87X, S88X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, I145X, S149X, D150X, L152X, E154X, T157X, N160X, S161X, S162X, H165X, R166X, T168X, K169X, T170X, A171X, E173X, S175X, S176X, E178X, T179X, M183X, Q184X, T186X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, A206X, N207X, Q209X, S210X, L211X, K212X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, V222X, D223X, I224X, T227X, M229X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, P302X, N303X, P305X, A306X, K307X, Y308X, I310X, K311X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X,D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, L326X, E327X, V328X, A330X, Q333X, P334X, S335X, G336X, P337X, A339X, V340X, S341X, N342X, R343X, P344X, F345X, E346X, V347X, E349X, I352X, Q353X, V355X, A356X, R357X, N361X, D365X, W367X, T369X, G370X, L373X, M374X, L375X, H376X, N379X, E380X, R382X, V386X, V389X, N392X, R394X, Q395X, S399X, F400X, I401X,
R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, V411X, F412X, F414X, Q415X, I418X, T419X, L420X, N428XV432X, M434X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, G448X, E449X, Q451X, K452X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, E471X, L472X, C473X, A474X, K483X, W485X, T488X, L489X, Y491X, G492X, V493X, M496X, I499X, C502X, I503X, T507X, K509X, N510X, V511X, T512X, I513X, R515X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, E529X, H532X, S533X, N535X, K536X, K537X, N539X, I540X, T542X, Y543X, Q546X, E549X, K550X, Q551X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, R565X, Y566X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K576X, K581X, S583X, A586X, A588X, E594X, F598X, L599X, E601X, N602X, C603X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X ou L610X (em relação à SEQ ID NO: 14505). Uma lista de substituições de aminoácidos hiperativas pode ser encontrada na Patente Norte- americana N° 10.041.077, os conteúdos da qual são incorporados aqui por referência na íntegra.
[00671] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é deficiente em integração. Em determinadas modalidades, uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração é uma transposase que pode excisar seu transposon correspondente, mas que integra o transposon excisado em uma frequência menor do que uma transposase de tipo selvagem correspondente. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma variante deficiente em integração de SEQ ID NO: 14505.
[00672] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração, competente em excisão compreende uma ou mais substituições de um aminoácido que não é de tipo selvagem, em que a uma ou mais substituições por um aminoácido que não é de tipo selvagem compreende uma substituição de R9X, A12X, M13X, D20X, Y21K, D23X, E24X, S25X, S26X, S27X, E28X, E30X, D32X, H33X, E36X, H37X, A39X, Y41X, D42X, T43X, E44X, E45X, E46X, R47X, D49X, S50X, S55X, A62X, N63X, A64X, I66X, A67X, N68X, E69X, D70X, D71X, S72X, D73X, P74X, D75X, D76X, D77X,I78X, S81X,V83X, R84X, Q85X, A87X, S88X, A89X,S90X,R91X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, W012X, G103X, Y107X, K108X, L117X, I122X, Q128X, I312X, D135X, S137X, E139X, Y140X, I145X, S149X, D150X, Q153X, E154X, T157X, S161X, S162X, R164X, H165X, R166X, Q167X, T168X, K169X, T170X, A171X, A172X, E173X, R174X, S175X, S176X, A177X, E178X, T179X, S180X,Y182X, Q184X, E185X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, N207X, Q209X, L211X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, T220X, V222X, D223X, I224X, T227X, T228X, F234X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, N303X, K304X, I310X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X,D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, N325X, L326X, E327X, V328X, A330X, G331X, K332X, Q333X, S335X, P337X, P344X, F345X, E349X, H359X, N361X, V362X, D365X, F368X, Y371X, E372X, L373X, H376X, E380X, R382X, R382X, V386X, G387X, T388X, V389X, K391X, N392X, R394X, Q395X, E398X, S399X, F400X, I401X, R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, Q415X,K416X, A424X, K426X, N428X, V430X, V432X, V433X, M434X, D436X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, S446X, T447X, G448X, E449X, K450X, Q451X, E454X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, C473X, A474X, N475X, N477X, K483X, R484X, P486X, T488X, L489X, G492X, V493X, M496X, I499X, I503X, Y505X, T507X, N510X, V511X, T512X, I513X, K514X, T516X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, L531X, H532X, S533X, N535X, I540X, T542X, Y543X, R545X, Q546X, E549X,
L552X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K575X, K576X, N585X, A586X, M593X, K596X, E601X, N602X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X ou L610X (em relação à SEQ ID NO: 14505). Uma lista de substituições de aminoácidos deficientes em integração pode ser encontrada na Patente Norte-americana N° 10,041,077, os conteúdos da qual são incorporados por referência na íntegra.
[00673] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência de:
[00674] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00675] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00676] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00677] 181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
[00678] 241 IRFDDISTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00679] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00680] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00681] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00682] 481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMMYEH LHSRNKKKNI
[00683] 541 PTYLRQRIEK QLGEPVPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00684] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14606).
[00685] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência de:
[00686] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00687] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00688] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00689] 181 FYMQETTLCE LKALIGLLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFYFLQNN
[00690] 241 IRFDDKSTLD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00691] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00692] 361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00693] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00694] 481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
[00695] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NYPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00696] 601 VNCAELDSSL (SEQ ID NO: 14607).
[00697] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que é deficiente em integração compreende uma sequência de:
[00698] 1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE
TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
[00699] 61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS
RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
[00700] 121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD
MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
[00701] 181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS
LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
[00702] 241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ
CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
[00703] 301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA
GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
[00704] 361 NVTFDNWFTG YECMLHLLNE YRLTSVGTVR
KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
[00705] 421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK
QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
[00706] 481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN
VTIKRTEFIR SLGLSMIKEH LHSRNKKKNI
[00707] 541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ
DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
[00708] 601 ENCAELDSSL (SEQ ID NO: 14608).
[00709] Em determinadas modalidades, a transposase deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 14608.
[00710] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Bombyx mori. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00711] 1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
[00712] 61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
[00713] 121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
[00714] 181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt
[00715] 241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt
[00716] 301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt
[00717] 361 cagtttttga tcaaa (SEQ ID NO: 14506).
[00718] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00719] 1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
[00720] 61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
[00721] 121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
[00722] 181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
[00723] 241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
[00724] 301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
[00725] 361 cgggttat (SEQ ID NO: 14507).
[00726] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00727] 1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
[00728] 61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
[00729] 121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
[00730] 181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcat (SEQ ID NO: 14508).
[00731] Em determinadas modalidades, the piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac transposon compreende uma sequência de:
[00732] 1 taaataataa taatttcata attaaaaact tctttcattg aatgccatta aataaaccat
[00733] 61 tattttacaa aataagatca acataattga gtaaataata ataagaacaa tattatagta
[00734] 121 caacaaaata tgggtatgtc ataccctgcc acattcttga tgtaactttt tttcacctca
[00735] 181 tgctcgccgg gttat (SEQ ID NO: 14509).
[00736] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência 5' que corresponde à SEQ ID NO: 14506 e uma sequência 3' que corresponde à SEQ ID NO:
14507. Em determinadas modalidades, uma extremidade do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % idêntica ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14506 e a outra extremidade do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14507. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14506 e SEQ ID NO: 14507 ou SEQ ID NO: 14509. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14508 e SEQ ID NO: 14507 ou SEQ ID NO: 14509. Em determinadas modalidades, as extremidades 5’ e 3’ do transposon compartilham uma sequência de repetição de 16 pb em suas extremidades de CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510) imediatamente adjacente ao sítio de inserção alvo 5'-TTAT-3, a qual tem a orientação invertida nas duas extremidades. Em determinadas modalidades, a extremidade 5’ do transposon começa com uma sequência que compreende 5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3 (SEQ ID NO: 14511) e a extremidade 3' do transposon termina com uma sequência que compreende o complemento reverso desta sequência: 5'- CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3' (SEQ ID NO: 14512).
[00737] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende pelo menos 14, 16, 18, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 14506 ou SEQ ID NO: 14508. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende pelo menos 14, 16, 18, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 14507 ou SEQ ID NO: 14509. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade com pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 14506 ou SEQ ID NO: 14508. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade com pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 14507 ou SEQ ID NO: 14509.
[00738] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00739] 1 ttaacccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
[00740] 61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
[00741] 121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
[00742] 181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt
[00743] 241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt
[00744] 301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt
[00745] 361 cagtttttga tcaaa (SEQ ID NO: 14515).
[00746] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00747] 1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
[00748] 61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
[00749] 121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
[00750] 181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataatt cattatttta
[00751] 241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
[00752] 301 atatgggtat gtcataccct tttttttttt tttttttttt ttttttcggg tagagggccg
[00753] 361 aacctcctac gaggtccccg cgcaaaaggg gcgcgcgggg tatgtgagac tcaacgatct
[00754] 421 gcatggtgtt gtgagcagac cgcgggccca aggattttag agcccaccca ctaaacgact
[00755] 481 cctctgcact cttacacccg acgtccgatc ccctccgagg tcagaacccg gatgaggtag
[00756] 541 gggggctacc gcggtcaaca ctacaaccag acggcgcggc tcaccccaag gacgcccagc
[00757] 601 cgacggagcc ttcgaggcga atcgaaggct ctgaaacgtc ggccgtctcg gtacggcagc
[00758] 661 ccgtcgggcc gcccagacgg tgccgctggt gtcccggaat accccgctgg accagaacca
[00759] 721 gcctgccggg tcgggacgcg atacaccgtc gaccggtcgc tctaatcact ccacggcagc
[00760] 781 gcgctagagt gctggta (SEQ ID NO: 14516).
[00761] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de SEQ ID NO: 14510. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTATCCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14511). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14511. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de CCTCATGCTCGCCGGGTTAT (SEQ ID NO: 14512). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14512. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14511 e uma extremidade que compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14512. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14511 e SEQ ID NO: 14512. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTAACCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14513). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de CCTCATGCTCGCCGGGTTAA (SEQ ID NO: 14514).
[00762] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac pode ter extremidades que compreendem SEQ ID NO:
14506 e SEQ ID NO: 14507 ou uma variante de qualquer uma ou ambas as mesmas que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14506 ou SEQ ID NO: 14507 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac tem a sequência de SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505 ou uma sequência pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentual intermediário de identidade com SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende um polinucleotídeo heterólogo inserido entre um par de repetições invertidas, onde o transposon é capaz de transposição por uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac que tem pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentual intermediário de identidade com SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO:
14505. Em determinadas modalidades, o transposon compreende duas extremidades de transposon, cada uma das quais compreende SEQ ID NO: 14510 em orientações invertidas nas duas extremidades de transposon. Em determinadas modalidades, cada repetição terminal invertida (ITR) é pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 14510.
[00763] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é capaz de inserção por uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac na sequência 5'-TTAT-3 dentro de um ácido nucleico alvo. Em determinadas modalidades, uma extremidade o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14506 e a outra extremidade do transposon compreende pelo menos 16 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14507. Em determinadas modalidades, uma extremidade o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14506 e a outra extremidade do transposon compreende pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14507.
[00764] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende extremidades de transposon (cada extremidade compreendendo uma ITR) que corresponde à SEQ ID NO: 14506 e SEQ ID NO: 14507 e tem uma sequência-alvo que corresponde a 5'-TTAT3'. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac também compreende uma sequência que codifica uma transposase (por exemplo, SEQ ID NO: 14505). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade de transposon que corresponde à SEQ ID NO: 14506 e uma segunda extremidade de transposon que corresponde à SEQ ID NO: 14516. SEQ ID NO: 14516 é muito similar à SEQ ID NO: 14507, mas tem uma inserção grande pouco antes da ITR. Embora as sequências ITR para as duas extremidades do transposon sejam idênticas (ambas são idênticas à SEQ ID NO: 14510), elas têm sequências-alvo diferentes: o segundo transposon tem uma sequência- alvo que corresponde a 5'-TTAA-3', fornecendo evidências de que nenhuma alteração na sequência ITR é necessária para modificar a especificidade pela sequência-alvo. A transposase piggyBac ou de tipo piggyBac (SEQ ID NO: 14504), a qual está associada ao sítio-alvo 5'- TTAA-3', difere da transposase associada a 5'-TTAT-3' (SEQ ID NO: 14505) por apenas 4 alterações de aminoácidos (D322Y, S473C, A507T, H582R). Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac (SEQ ID NO: 14504), a qual está associada ao sítio-alvo 5'-TTAA-3', é menos ativa do que a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac associada a 5'-TTAT-3' (SEQ ID NO:
14505) no transposon com extremidades 5'-TTAT-3'. Em determinadas modalidades, os transposons piggyBac ou de tipo piggyBac com sítios- alvo 5'-TTAA-3'podem ser convertidos em transposases piggyBac ou de tipo piggyBac com sítios-alvo 5'-TTAT-3 substituindo os sítios-alvo 5'- TTAA-3' por 5'-TTAT-3'. Tais transposons podem ser usados com uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac, tal como SEQ ID NO: 14504, a qual reconhece a sequência-alvo 5'-TTAT-3'ou uma variante de uma transposase originalmente associada ao transposon 5'-TTAA-3'. Em determinadas modalidades, a alta similaridade entre as transposases piggyBac ou de tipo piggyBac 5'-TTAA-3'e 5'-TTAT-3' demonstra que muito poucas alterações na sequência de aminoácidos de uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac alteram a especificidade pela sequência-alvo. Em determinadas modalidades, a modificação de qualquer sistema de transferência gênica de transposon-transposase piggyBac ou de tipo piggyBac, no qual as sequências-alvo 5'-TTAA- 3'são substituídas por sequências-alvo 5'-TTAT-3', as ITRs permanecem as mesmas, e a transposase é a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac original ou uma variante da mesma resultante do uso de uma mutagênese de baixo nível para introduzir mutações na transposase. Em determinadas modalidades, os sistemas de transferência de transposon através da transposase piggyBac ou de tipo piggyBac podem ser formados ao modificar um sistema de transferência gênica por transposase piggyBac ou de tipo piggyBac 5'-TTAT-3'-ativa no qual as sequências-alvo 5'-TTAT-3' são substituídas por sequências- alvo 5'-TTAA-3', as ITRs permanecem as mesmas e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é a transposase original ou uma variante da mesma.
[00765] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Bombyx mori. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00766] 1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
[00767] 61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
[00768] 121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
[00769] 181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta t (SEQ ID NO: 14577).
[00770] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00771] 1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat
[00772] 61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata
[00773] 121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt
[00774] 181 aacttttttt cacctcatgc tcgccggg (SEQ ID NO: 14578).
[00775] Em determinadas modalidades, o transposon compreende pelo menos 16 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14577 e pelo menos 16 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14578 e repetições terminais invertidas que são pelo menos 87 % idêntica a CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510).
[00776] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00777] 1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
[00778] 61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
[00779] 121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
[00780] 181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
[00781] 241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
[00782] 301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt
[00783] 361 ttttgatcaa a (SEQ ID NO: 14595).
[00784] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00785] 1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
[00786] 61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
[00787] 121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
[00788] 181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
[00789] 241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
[00790] 301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
[00791] 361 cggg (SEQ ID NO: 14596).
[00792] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14595 e SEQ ID NO: 14596 e é transposto por uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac de SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, as ITRs de SEQ ID NO: 14595 e SEQ ID: 14596 não são flanqueadas por uma sequência 5’- TTAA-3’. Em determinadas modalidades, as ITRs de SEQ ID NO: 14595 e SEQ ID: 14596 são flanqueadas por uma sequência 5’-TTAT-3’.
[00793] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00794] 1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
[00795] 61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
[00796] 121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
[00797] 181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
[00798] 241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
[00799] 301 g (SEQ ID NO: 14597).
[00800] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00801] 1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg
[00802] 61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga
[00803] 121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt
[00804] 181 ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt tttccgatta ttaatttcaa
[00805] 241 ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt ttatg (SEQ ID NO: 14598).
[00806] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00807] 1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg
[00808] 61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga
[00809] 121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt
[00810] 181 ataccctgcc tcattgttga cgtat (SEQ ID NO: 14599).
[00811] Em determinadas modalidades, a extremidade 5' do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14577, SEQ ID NO: 14595 ou SEQ ID NOs: 14597-
14599. Em determinadas modalidades, a extremidade 5' do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é precedida por uma sequência-alvo 5'.
[00812] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00813] 1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
[00814] 61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
[00815] 121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
[00816] 181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
[00817] 241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
[00818] 301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
[00819] 361 cggg (SEQ ID NO: 14600).
[00820] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00821] 1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat
[00822] 61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata
[00823] 121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt
[00824] 181 aacttttttt ca (SEQ ID NO: 14601).
[00825] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[00826] 1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
[00827] 61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
[00828] 121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
[00829] 181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
[00830] 241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
[00831] 301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt
[00832] 361 ttttgatcaa a (SEQ ID NO: 14602).
[00833] Em determinadas modalidades, a extremidade 3' do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de SEQ ID NO: 14578, SEQ ID NO: 14596 ou SEQ ID NOs: 14600-
14601. Em determinadas modalidades, a extremidade 3' do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é seguida por uma sequência-alvo 3'. Em determinadas modalidades, o transposon é transposto por uma transposase de SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, as extremidades 5’ e 3’ do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compartilham uma sequência de repetição de 16 pb de SEQ ID NO: 14510 na orientação invertida e imediatamente adjacente à sequência- alvo. Em determinadas modalidades, a extremidade 5’ do transposon começa com SEQ ID NO: 14510 e a extremidade 3' do transposon termina com o complemento reverso de SEQ ID NO: 14510, 5’- CCTCATGCTCGCCGGG-3’ (SEQ ID NO: 14603). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma ITR com pelo menos 93 %, pelo menos 87 % ou pelo menos 81 % ou qualquer porcentual intermediário de identidade com SEQ ID NO: 14510 ou SEQ ID NO: 14603. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência- alvo seguida pela extremidade 5’ do transposon que compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 88, 105 ou 107 e uma extremidade 3’ do transposon que compreende SEQ ID NO: 14578 ou 106 seguida por uma sequência-alvo. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende uma sequência que é pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14577 e uma extremidade que compreende uma sequência que é pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14578. Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou pelo menos 20 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14577 e uma extremidade de transposon compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou pelo menos 20 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14578.
[00834] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende duas extremidades de transposon, em que cada extremidades de transposon compreende uma sequência que é pelo menos 81 % idêntica, pelo menos 87 % idêntica ou pelo menos 93 % idêntica ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14510 na orientação invertida nas duas extremidades de transposon. Uma extremidade pode compreender ainda pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou pelo menos 20 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14599 e a outra extremidade pode compreender ainda pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou pelo menos 20 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14601. O transposon piggyBac ou de tipo piggyBac pode ser transposto por uma transposase de SEQ ID NO: 14505 e a transposase pode ser opcionalmente fundida a um sinal de localização nuclear.
[00835] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14595 e SEQ ID NO: 14596 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14597 e SEQ ID NO: 14596 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14595 e SEQ ID NO: 14578 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14602 e SEQ ID NO: 14600 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14504 ou SEQ ID NO: 14505.
[00836] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade 5' que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 sequências selecionadas a partir de ATGAGGCAGGGTAT (SEQ ID NO: 14614), ATACCCTGCCTCAT (SEQ ID NO: 14615), GGCAGGGTAT (SEQ ID NO: 14616), ATACCCTGCC (SEQ ID NO: 14617), TAAAATTTTA (SEQ ID NO: 14618), ATTTTATAAAAT (SEQ ID NO: 14619), TCATACCCTG (SEQ ID NO: 14620) e TAAATAATAATAA (SEQ ID NO: 14621). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade 3' que compreende 1, 2 ou 3 sequências selecionadas a partir de SEQ ID NO: 14617, SEQ ID NO: 14620 e SEQ ID NO: 14621.
[00837] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Xenopus tropicalis. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00838] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00839] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00840] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00841] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00842] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00843] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00844] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00845] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00846] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00847] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14517).
[00848] Em algumas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma variante hiperativa de SEQ ID NO: 14517. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma variante deficiente em integração de SEQ ID NO:
14517. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[00849] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMAPSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00850] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00851] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00852] 181 SLESYWNTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPDHD RLHKLRPLID
[00853] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLR
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00854] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00855] 361 PACGTINRTR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00856] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT SAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00857] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMLP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00858] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14518).
[00859] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Xenopus tropicalis. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência pelo menos 90 % idêntica a:
[00860] 1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00861] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00862] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00863] 181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00864] 241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
[00865] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00866] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00867] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00868] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00869] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14572).
[00870] Em determinadas modalidades, transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa. Uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é a transposase que é mais ativa do que a variante de ocorrência natural da qual ela é derivada. Em determinadas modalidades, uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa é mais ativa do que a transposase de SEQ ID NO: 14517. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00871] 1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00872] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00873] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00874] 181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00875] 241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
[00876] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00877] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00878] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00879] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00880] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14572).
[00881] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00882] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00883] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00884] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00885] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00886] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00887] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00888] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00889] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00890] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00891] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14624).
[00892] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00893] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00894] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00895] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00896] 181 SLESYWDTTT VLKIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00897] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00898] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00899] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00900] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00901] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00902] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14625).
[00903] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00904] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EQTSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00905] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00906] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00907] 181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00908] 241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00909] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00910] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00911] 421 QRVGRKPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00912] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00913] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14627).
[00914] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00915] 1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00916] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00917] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00918] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00919] 241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
[00920] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00921] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00922] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00923] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00924] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14628).
[00925] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma sequência de:
[00926] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00927] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00928] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00929] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00930] 241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00931] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
[00932] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00933] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00934] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00935] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 16820).
[00936] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada a partir dos aminoácidos 6, 7, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 31, 34, 67, 73, 76, 77, 88, 91, 141, 145, 146, 148, 150, 157, 162, 179, 182, 189, 192, 193, 196, 198, 200, 210, 212, 218, 248, 263, 270, 294, 297, 308, 310, 333, 336, 354, 357, 358, 359, 377, 423, 426, 428, 438, 447, 450, 462, 469, 472, 498, 502, 517, 520, 523, 533, 534, 576, 577, 582, 583 ou 587 (em relação à SEQ ID NO: 14517). Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma substituição de aminoácido de Y6C, S7G, M16S, S19G, S20Q, S20G, S20D, E21D, E22Q, F23T, F23P, S24Y, S26V, S28Q, V31K, A34E, L67A, G73H, A76V, D77N, P88A, N91D, Yl41Q, Y141A, N145E, N145V, P146T, P146V, P146K, P148T, P148H, Y150G, Y150S, Y150C, H157Y, A162C, A179K, L182I, L182V, T189G, L192H, S193N, S193K, V196I, S198G, T200W, L210H, F212N, N218E, A248N, L263M, Q270L, S294T, T297M, S308R, L310R, L333M, Q336M, A354H, C357V, L358F, D359N, L377I,
V 423H, P426K, K428R, S438A, T447G, T447A, L450V, A462H, A462Q, I469V, I472L, Q498M, L502V, E5171, P520D, P520G, N523S, I533E, D534A, F576R, F576E, K577I, I582R, Y583F, L587Y ou L587W ou qualquer combinação das mesmas, incluindo pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou todas estas mutações (em relação à SEQ ID NO: 14517).
[00937] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac hiperativa compreende uma ou mais substituições de um aminoácido que não é de tipo selvagem, em que a uma ou mais substituições por um aminoácido que não é de tipo selvagem compreende uma substituição de A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A11X, A13X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, E42X, E43X, S44X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, E62X, D63X, V64X, D65X, D66X, L67X, E68X, D69X, Q70X, E71X, A72X, G73X, D74X, R75X, A76X, D77X, A78X, A79X, A80X, G81X, G82X, E83X, P84X, A85X, W86X, G87X, P88X, P89X, C90X, N91X, F92X, P93X, E95X, I96X, P97X, P98X, F99X, T100X, T101X, P103X, G104X, V105X, K106X, V107X, D108X, T109X, N111X, P114X, I115X, N116X, F117X, F118X, Q119X, M122X, T123X, E124X, A125X, I126X, L127X, Q128X, D129X, M130X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, A138X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, Y150X, A151X, A155X, H157X, P158X , I161X, A162X, V168X, T171X, L172X, A173X, M174X, I177X, A179X, L182X, D187X, T188X, T189X, T190X, L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, S198X, A199X, T200X, S202X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, F215X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P224X, D225X, Q226X, P227X, H229X, R231X, H233X, L235X, P237X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X,
S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293XS294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, E304X, L310X, P313X, G314X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, K324X, E328X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, L340X, D343X, N344X, F345X, Y346X, S347X, L351X, F352X, A354X, L355X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, R422X, Y423X, G424X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G443X, R446X, T447X, L450X, Q451X, N455X, T460X, R461X, A462X, K465X, V467X, G468X, I469X, Y470X, L471X, I472X, M474X, A475X, L476X, R477X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, P490X, K491X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Y497T, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X, T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, K530X, H531X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, T539X, P540X,Q546X, K550X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, Y564X, P566X, K567X, P569X, R570X, N571X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, F580X, E581X, I582X, Y583X, T585X, Q586X, L587X, H588X ou Y589X (em relação à SEQ ID NO: 14517). Uma lista de substituições de aminoácidos hiperativas pode ser encontrada na Patente Norte-americana N° 10,041,077, os conteúdos da qual são incorporados por referência na íntegra.
[00938] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é deficiente em integração. Em determinadas modalidades, uma transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração é uma transposase que pode excisar seu transposon correspondente, mas que integra o transposon excisado em uma frequência menor do que uma transposase de ocorrência natural correspondente. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é uma variante deficiente em integração de SEQ ID NO: 14517. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração é deficiente em relação à SEQ ID NO: 14517.
[00939] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é ativa para excisão, mas deficiente em integração. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência de:
[00940] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00941] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRVDAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00942] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00943] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
KFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00944] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00945] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00946] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00947] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00948] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00949] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR
NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR (SEQ ID NO: 14605).
[00950] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência de:
[00951] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00952] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00953] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00954] 181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLEFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00955] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00956] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00957] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00958] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00959] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00960] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY (SEQ ID NO: 14604).
[00961] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência de:
[00962] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00963] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00964] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNVLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00965] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNDAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00966] 241 SLTERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00967] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00968] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00969] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00970] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00971] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR (SEQ ID NO: 14611).
[00972] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende SEQ ID NO:
14611. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência de:
[00973] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00974] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAP GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00975] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00976] 181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00977] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00978] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00979] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00980] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00981] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00982] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR (SEQ ID NO: 14612).
[00983] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende SEQ ID NO:
14612. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma sequência que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência de:
[00984] 1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY
VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
[00985] 61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC
NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
[00986] 121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY
ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
[00987] 181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL
RFLEFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
[00988] 241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ
FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
[00989] 301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI
SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
[00990] 361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL
RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
[00991] 421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL
QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
[00992] 481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV
EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
[00993] 541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR (SEQ ID NO: 14613).
[00994] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende SEQ ID NO:
14613. Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração compreende uma substituição de aminoácido, em que a Asn na posição 218 é substituída por uma Glu ou uma Asp (N218D ou N218E) (em relação à SEQ ID NO: 14517).
[00995] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac deficiente em integração, competente em excisão compreende uma ou mais substituições de um aminoácido que não é de tipo selvagem, em que a uma ou mais substituições por um aminoácido que não é de tipo selvagem compreende uma substituição de A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A8X, E9X, E10X, A11X, A12X, A13X, H14X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, V31X, P32X, P33X, A34X, S35X, E36X, S37X, D38X, S39X, S40X, T41X, E42X, E43X, S44X, W45X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, V60X, M122X, T123X, E124X, A125X, L127X, Q128X, D129X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, T143X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, R149X, Y150X, A151X, H154X, H157X, P158X, T159X, D160X, I161X, A162X, E163X, M164X, K165X, R166X, F167X, V168X, G169X, L170X, T171X, L172X, A173X, M174X, G175X, L176X, I177X, K178X, A179X, N180X, S181X, L182X, S184X, Y185X, D187X, T188X, T189X, T190X, V191X,
L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, F197X, S198X, A199X, T200X, M201X, S202X, R203X, N204X, R205X, Y206X, Q207X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, L213X, H241X, F215X, N216X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P223X, P224X, D225X, Q226X, P227X, G228X, H229X, D230X, R231X, H233X, K234X, L235X, R236X, L238X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, N255X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X, S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293X, S294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, I302X, E304X, G305X,K306X, D307X, S308X, K309X, L310X, D311X, P312X, P313X, G314X, C315X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, S322X, G323X, K324X, I325X, V326X, W327X, E328X, L329X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, H339X, L340X, V342X, N344X, F345X, Y346X, S347X, S348X, I349X, L351X, T353X, A354X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, P361X, A362X, C363X, G364X, I366X, N367X, R368X, D369X, K371X, G372X, L373X, R375X, A376X, L377X, L378X, D379X, K380X, K381X, L382X, N383X, R384XG385X, T387X, Y388X, A389X, L390X, K392X, N393X, E394X, A397X, K399X, F400X, F401X, D402X, N405X, L406X, L409X, R422X, Y423X, G424X, E425X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G442X, G443X, V444X, R446X, T447X, L450X, Q451X, H452X, N455X, T457X, R458X, T460X, R461X, A462X, Y464X, K465X, V467X, G468X, I469X, L471X, I472X, Q473X, M474X, L476X, R477X, N478X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, G489X, P490X, K491X, L492X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X,
T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, G529X, K530X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, P537X, P538X, T539X, P540X, G541X, F542X, Q543X, R544X, P545X, Q546X, K547X, G548X, C549X, K550X, V551X, C552X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, R562X, Y563X, Y564X, C565X, P566X, K567X, C568X, P569X, R570X, N571X, P572X, G573X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, C579X, F580X, E581X, I582X, Y583X, H584X, T585X, Q586X, L587X, H588X ou Y589X (em relação à SEQ ID NO: 14517). Uma lista de substituições de aminoácidos competentes para excisão, deficientes em integração pode ser encontrada na Patente Norte-americana N° 10.041.077, os conteúdos da qual são incorporados por referência na íntegra.
[00996] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é fundida a um sinal de localização nuclear. Em determinadas modalidades, SEQ ID NO: 14517 ou SEQ ID NO: 14518 é fundida a um sinal de localização nuclear. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da transposase piggyBac ou de tipo piggyBac fundida a um sinal de localização nuclear é codificada por uma sequência de polinucleotídeos que compreende:
[00997] 1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gccaaaagat tttacagcgc cgaagaagca
[00998] 61 gcagcacatt gcatggcatc gtcatccgaa gaattctcgg ggagcgattc cgaatatgtc
[00999] 121 ccaccggcct cggaaagcga ttcgagcact gaggagtcgt ggtgttcctc ctcaactgtc
[001000] 181 tcggctcttg aggagccgat ggaagtggat gaggatgtgg acgacttgga ggaccaggaa
[001001] 241 gccggagaca gggccgacgc tgccgcggga ggggagccgg cgtggggacc tccatgcaat
[001002] 301 tttcctcccg aaatcccacc gttcactact gtgccgggag tgaaggtcga cacgtccaac
[001003] 361 ttcgaaccga tcaatttctt tcaactcttc atgactgaag cgatcctgca agatatggtg
[001004] 421 ctctacacta atgtgtacgc cgagcagtac ctgactcaaa acccgctgcc tcgctacgcg
[001005] 481 agagcgcatg cgtggcaccc gaccgatatc gcggagatga agcggttcgt gggactgacc
[001006] 541 ctcgcaatgg gcctgatcaa ggccaacagc ctcgagtcat actgggatac cacgactgtg
[001007] 601 cttagcattc cggtgttctc cgctaccatg tcccgtaacc gctaccaact cctgctgcgg
[001008] 661 ttcctccact tcaacaacaa tgcgaccgct gtgccacctg accagccagg acacgacaga
[001009] 721 ctccacaagc tgcggccatt gatcgactcg ctgagcgagc gattcgccgc ggtgtacacc
[001010] 781 ccttgccaaa acatttgcat cgacgagtcg cttctgctgt ttaaaggccg gcttcagttc
[001011] 841 cgccagtaca tcccatcgaa gcgcgctcgc tatggtatca aattctacaa actctgcgag
[001012] 901 tcgtccagcg gctacacgtc atacttcttg atctacgagg ggaaggactc taagctggac
[001013] 961 ccaccggggt gtccaccgga tcttactgtc tccggaaaaa tcgtgtggga actcatctca
[001014] 1021 cctctcctcg gacaaggctt tcatctctac gtcgacaatt tctactcatc gatccctctg
[001015] 1081 ttcaccgccc tctactgcct ggatactcca gcctgtggga ccattaacag aaaccggaag
[001016] 1141 ggtctgccga gagcactgct ggataagaag ttgaacaggg gagagactta cgcgctgaga
[001017] 1201 aagaacgaac tcctcgccat caaattcttc gacaagaaaa atgtgtttat gctcacctcc
[001018] 1261 atccacgacg aatccgtcat ccgggagcag cgcgtgggca ggccgccgaa aaacaagccg
[001019] 1321 ctgtgctcta aggaatactc caagtacatg gggggtgtcg accggaccga tcagctgcag
[001020] 1381 cattactaca acgccactag aaagacccgg gcctggtaca agaaagtcgg catctacctg
[001021] 1441 atccaaatgg cactgaggaa ttcgtatatt gtctacaagg ctgccgttcc gggcccgaaa
[001022] 1501 ctgtcatact acaagtacca gcttcaaatc ctgccggcgc tgctgttcgg tggagtggaa
[001023] 1561 gaacagactg tgcccgagat gccgccatcc gacaacgtgg cccggttgat cggaaagcac
[001024] 1621 ttcattgata ccctgcctcc gacgcctgga aagcagcggc cacagaaggg atgcaaagtt
[001025] 1681 tgccgcaagc gcggaatacg gcgcgatacc cgctactatt gcccgaagtg cccccgcaat
[001026] 1741 cccggactgt gtttcaagcc ctgttttgaa atctaccaca cccagttgca ttac (SEQ ID NO: 14626).
[001027] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Xenopus tropicalis. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001028] 1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
[001029] 61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
[001030] 121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
[001031] 181 ctgtc (SEQ ID NO: 14519).
[001032] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001033] 1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
[001034] 61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
[001035] 121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
[001036] 181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttaa (SEQ ID NO: 14520).
[001037] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14519 e SEQ ID NO: 14520. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001038] 1 ttaacccttt gcctgccaat cacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
[001039] 61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
[001040] 121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
[001041] 181 ctgtc (SEQ ID NO: 14521).
[001042] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001043] 1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
[001044] 61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
[001045] 121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
[001046] 181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa agggttaa (SEQ ID NO: 14522).
[001047] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001048] 1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
[001049] 61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaattctt ctctctgcag cggcagcatg
[001050] 121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
[001051] 181 ctgtc (SEQ ID NO: 14523).
[001052] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14520 e SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14522 e SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende pelo menos 14, 16, 18, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade que compreende pelo menos 14, 16, 18, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14520 ou SEQ ID NO: 14522. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade com pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma extremidade com pelo menos 90 % de identidade com SEQ ID NO: 14520 ou SEQ ID NO:
14522. Em uma modalidade, uma extremidade de transposon é pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 14519 e a outra extremidade do transposon é pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 14520.
[001053] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTAACCTTTTTACTGCCA (SEQ ID NO: 14524). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTAACCCTTTGCCTGCCA (SEQ ID NO: 14526). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTAACCYTTTTACTGCCA (SEQ ID NO: 14527). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TGGCAGTAAAAGGGTTAA (SEQ ID NO: 14529). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TGGCAGTGAAAGGGTTAA (SEQ ID NO: 14531). Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de TTAACCYTTTKMCTGCCA (SEQ ID NO: 14533). Em determinadas modalidades, uma extremidade o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14524, SEQ ID NO: 14526 e SEQ ID NO: 14527. Em determinadas modalidades, uma extremidade do transposon piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14529 e SEQ ID NO:
14531. Em determinadas modalidades, cada repetição terminal invertida o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCYTTTKMCTGCCA (SEQ ID NO: 14563). Em determinadas modalidades, cada extremidade do transposon piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14563 em orientações invertidas. Em determinadas modalidades, uma ITR no transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14524, SEQ ID NO: 14526 e SEQ ID NO: 14527. Em determinadas modalidades, uma ITR no transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14529 e SEQ ID NO: 14531. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14533 na orientação invertida nas duas extremidades de transposon.
[001054] Em determinadas modalidades, O transposon piggyBac ou de tipo piggyBac pode ter extremidades que compreendem SEQ ID NO: 14519 e SEQ ID NO: 14520 ou uma variante de qualquer uma ou ambas as mesmas que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14519 ou SEQ ID NO: 14520 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac tem a sequência de SEQ ID NO: 14517 ou uma variante que mostra pelo menos %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentual intermediário de identidade de sequência com SEQ ID NO: 14517 ou SEQ ID NO: 14518. Em determinadas modalidades, uma extremidade do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523 e a outra extremidade do transposon compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14520 ou SEQ ID NO:
14522. Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523 e a outra extremidade do transposon compreende pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25 ou pelo menos 30 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14520 ou SEQ ID NO: 14522.
[001055] Em determinadas modalidades, a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac reconhece uma extremidade do transposon com uma sequência 5' que corresponde à SEQ ID NO: 14519 e uma sequência 3' que corresponde à SEQ ID NO: 14520. Ela excisará o transposon de uma molécula de DNA cortando o DNA na sequência 5'-TTAA-3' na extremidade 5' de uma extremidade do transposon e na sequência 5'- TTAA-3' na extremidade 3' da segunda extremidade do transposon, incluindo qualquer DNA heterólogo que esteja colocado entre elas, e inserirá a sequência excisada em uma segunda molécula de DNA. Em determinadas modalidades, as versões truncadas e modificadas das extremidades do transposon 5' e 3' também funcionarão como parte de um transposon que pode ser transposto pela transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Por exemplo, a extremidade 5' do transposon pode ser substituída por uma sequência que corresponde à SEQ ID NO: 14521 ou SEQ ID NO: 14523, a extremidade 3' do transposon pode ser substituída por uma sequência mais curta que corresponde à SEQ ID NO: 14522. Em determinadas modalidades, as extremidades 5' e 3' do transposon compartilham uma sequência quase perfeitamente repetida de 18 pb em suas extremidades (5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA: SEQ ID NO: 14533) que inclui o sítio de inserção 5'-TTAA-3', cuja sequência é invertida na orientação nas duas extremidades, em (SEQ ID NO: 14519) e SEQ ID NO: 14523, a extremidade do transposon 5' começa com a sequência 5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3' (SEQ ID NO: 14524) ou em (SEQ ID NO: 14521) onde a extremidade 5' do transposon começa com a sequência 5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3' (SEQ ID NO: 14526); o transposon 3' termina com aproximadamente o complemento reverso desta sequência: em SEQ ID NO: 14520, termina em 5' TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3' (SEQ ID NO: 14529); em (SEQ ID NO: 14522) termina em 5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3' (SEQ ID NO:
14531.) Uma modalidade da invenção é um transposon que compreende um polinucleotídeo heterólogo inserido entre duas extremidades de transposon cada que compreende SEQ ID NO: 14533 em orientações invertidas nas duas extremidades de transposon. Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOS: 14524, SEQ ID NO: 14526 e SEQ ID NO: 14527. Em algumas modalidades, uma extremidade de transposon compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14529 e SEQ ID NO:
14531.
[001056] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Xenopus tropicalis. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001057] 1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001058] 61 cgacgcgtcc catacgtt (SEQ ID NO: 14573).
[001059] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001060] 1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt
[001061] 61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggctggc agtgaaaggg (SEQ ID NO: 14574).
[001062] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende pelo menos 16 bases contíguas a partir de SEQ ID NO: 14573 ou SEQ ID NO: 14574 e repetição terminal invertida de CCYTTTBMCTGCCA (SEQ ID NO: 14575).
[001063] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001064] 1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001065] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
[001066] 121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
[001067] 181 c (SEQ ID NO: 14579).
[001068] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001069] 1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001070] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta attcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
[001071] 121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
[001072] 181 c (SEQ ID NO: 14580).
[001073] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001074] 1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001075] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
[001076] 121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
[001077] 181 c (SEQ ID NO: 14581).
[001078] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001079] 1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001080] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
[001081] 121 gccgctgcag agag (SEQ ID NO: 14582).
[001082] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001083] 1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001084] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt (SEQ ID NO: 14583).
[001085] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001086] 1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
[001087] 61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt (SEQ ID NO: 14584).
[001088] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001089] 1 ttatcctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
[001090] 61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
[001091] 121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
[001092] 181 ctgtc (SEQ ID NO: 14585).
[001093] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001094] 1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
[001095] 61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
[001096] 121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
[001097] 181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa aggg (SEQ ID NO: 14586).
[001098] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende a sequência da extremidade 5’ do transposon selecionada a partir de SEQ ID NO: 14573 e SEQ ID NOs: 14579-14585. Em determinadas modalidades, a sequência da extremidade 5’ do transposon é precedida por uma sequência-alvo 5'. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001099] 1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
[001100] 61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
[001101] 121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
[001102] 181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa ggg (SEQ ID NO: 14587).
[001103] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001104] 1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
[001105] 61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
[001106] 121 ttgaccaaaa cggctggcag taaaaggg (SEQ ID NO: 14588).
[001107] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001108] 1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
[001109] 61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
[001110] 121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
[001111] 181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttat (SEQ ID NO: 14589).
[001112] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001113] 1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
[001114] 61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
[001115] 121 ttgggacaaa tcggctggca gtgaaaggg (SEQ ID NO: 14590).
[001116] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência da extremidade 3’ do transposon selecionada a partir de SEQ ID NO: 14574 e SEQ ID NOs: 14587-14590. Em determinadas modalidades, a sequência da extremidade 3’ do transposon é seguida por uma sequência-alvo 3'. Em determinadas modalidades, as extremidades 5’ e 3’ do transposon compartilham uma sequência repetida de 14 pb de orientação invertida nas duas extremidades (SEQ ID NO: 14575) adjacente à sequência- alvo. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende a extremidade 5’ do transposon que compreende uma sequência-alvo e uma sequência que é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 14582-14584 e 14573 e uma extremidade 3’ do transposon que compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs: 14588-14590 e 14574 seguida por uma sequência-alvo 3'.
[001117] Em determinadas modalidades, a extremidade 5’ do transposon o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende:
[001118] 1 atcacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata
[001119] 61 cgtt (SEQ ID NO: 14591)
[001120] e uma ITR. Em determinadas modalidades, a extremidade 5’
do transposon compreende
[001121] 1 atgacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata
[001122] 61 cgttgttggc attttaagtc tt (SEQ ID NO: 14592)
[001123] e uma ITR. Em determinadas modalidades, a 3’ extremidade do transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende:
[001124] 1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt
[001125] 61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggc (SEQ ID NO: 14593)
[001126] e uma ITR.
[001127] Em determinadas modalidades, a 3’ extremidade do transposon compreende:
[001128] 1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
[001129] 61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
[001130] 121 ttgaccaaaa cggc (SEQ ID NO: 14594)
[001131] e uma ITR.
[001132] Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende uma sequência que é pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14573 e a outra extremidade do transposon compreende uma sequência que é pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica à SEQ ID NO: 14574. Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14573 e uma extremidade de transposon compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos a partir de SEQ ID NO: 14574. Em determinadas modalidades, uma extremidade de transposon compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20 a partir de SEQ ID NO: 14591 e a outra extremidade compreende pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, pelo menos 20 a partir de SEQ ID NO: 14593. Em determinadas modalidades, cada extremidade do transposon compreende SEQ ID NO: 14575 em orientações invertidas.
[001133] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14573, SEQ ID NO: 14579, SEQ ID NO: 14581, SEQ ID NO: 14582, SEQ ID NO: 14583 e SEQ ID NO: 14588 e uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO: 14587, SEQ ID NO: 14588, SEQ ID NO: 14589 e SEQ ID NO: 14586 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14517 ou SEQ ID NO: 14518.
[001134] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende ITRs de CCCTTTGCCTGCCA (SEQ ID NO: 14622) (5’ ITR) e TGGCAGTGAAAGGG (SEQ ID NO: 14623) (3’ ITR) adjacente à sequência-alvo.
[001135] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Helicoverpa armigera. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001136] 1 MASRQRLNHD EIATILENDD DYSPLDSESE
KEDCVVEDDV WSDNEDAIVD FVEDTSAQED
[001137] 61 PDNNIASRES PNLEVTSLTS HRIITLPQRS
IRGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR
[001138] 121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK
WTNVEIIVKR QNLKDISASY RDTNTMEIWA
[001139] 181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR
YVSVMSRERF EFLIRCIRMD DKTLRPTLRS
[001140] 241 DDAFLPVRKI WEIFINQCRQ NHVPGSNLTV
DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIKFPM
[001141] 301 MCAAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF
YVKDLTKTVH GTNRNITCDN WFTSIPLAKN
[001142] 361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE MPEEIKNSRS
RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSKMVFLL
[001143] 421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD
SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA
[001144] 481 FVNSYIIYCH NKINKQEKPI SRKEFMKKLS
IQLTTPWMQE RLQAPTLKRT LRDNITNVLK
[001145] 541 NVVPASSENI SNEPEPKKRR YCGVCSYKKR RMTKAQCCKC KKAICGEHNI DVCQDCI (SEQ ID NO: 14525).
[001146] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Helicoverpa armigera. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001147] 1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatctctgtc
[001148] 61 tctttcatgt ttaccgtcgg atcgccgcta acttctgaac caactcagta gccattggga
[001149] 121 cctcgcagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt actctctatt
[001150] 181 acaacacacg tcacgtcacg tcgttgcacg tcattttgac gtataattgg gctttgtgta
[001151] 241 acttttgaat ttgtttcaaa ttttttatgt ttgtgattta tttgagttaa tcgtattgtt
[001152] 301 tcgttacatt tttcatataa taataatatt ttcaggttga gtacaaa (SEQ ID NO: 14570).
[001153] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001154] 1 agactgtttt tttctaagag acttctaaaa tattattacg agttgattta attttatgaa
[001155] 61 aacatttaaa actagttgat tttttttata attacataat tttaagaaaa agtgttagag
[001156] 121 gcttgatttt tttgttgatt ttttctaaga tttgattaaa gtgccataat agtattaata
[001157] 181 aagagtattt tttaacttaa aatgtatttt atttattaat taaaacttca attatgataa
[001158] 241 ctcatgcaaa aatatagttc attaacagaa aaaaatagga aaactttgaa gttttgtttt
[001159] 301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt taaatatgat tgggcttcta
[001160] 361 gggttaa (SEQ ID NO: 14528).
[001161] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Pectinophora gossypiella. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001162] 1 MDLRKQDEKI RQWLEQDIEE DSKGESDNSS
SETEDIVEME VHKNTSSESE VSSESDYEPV
[001163] 61 CPSKRQRTQI IESEESDNSE SIRPSRRQTS
RVIDSDETDE DVMSSTPQNI PRNPNVIQPS
[001164] 121 SRFLYGKNKH KWSSAAKPSS VRTSRRNIIH
FIPGPKERAR EVSEPIDIFS LFISEDMLQQ
[001165] 181 VVTFTNAEML IRKNKYKTET FTVSPTNLEE
IRALLGLLFN AAAMKSNHLP TRMLFNTHRS
[001166] 241 GTIFKACMSA ERLNFLIKCL RFDDKLTRNV
RQRDDRFAPI RDLWQALISN FQKWYTPGSY
[001167] 301 ITVDEQLVGF RGRCSFRMYI PNKPNKYGIK
LVMAADVNSK YIVNAIPYLG KGTDPQNQPL
[001168] 361 ATFFIKEITS TLHGTNRNIT MDNWFTSVPL
ANELLMAPYN LTLVGTLRSN KREIPEKLKN
[001169] 421 SKSRAIGTSM FCYDGDKTLV SYKAKSNKVV
FILSTIHDQP DINQETGKPE MIHFYNSTKG
[001170] 481 AVDTVDQMCS SISTNRKTQR WPLCVFYNML
NLSIINAYVV YVYNNVRNNK KPMSRRDFVI
[001171] 541 KLGDQLMEPW LRQRLQTVTL RRDIKVMIQD
ILGESSDLEA PVPSVSNVRK IYYLCPSKAR
[001172] 601 RMTKHRCIKC KQAICGPHNI DICSRCIE (SEQ ID NO: 14530).
[001173] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Pectinophora gossypiella. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001174] 1 ttaaccctag ataactaaac attcgtccgc tcgacgacgc gctatgccgc gaaattgaag
[001175] 61 tttacctatt attccgcgtc ccccgccccc gccgcttttt ctagcttcct gatttgcaaa
[001176] 121 atagtgcatc gcgtgacacg ctcgaggtca cacgacaatt aggtcgaaag ttacaggaat
[001177] 181 ttcgtcgtcc gctcgacgaa agtttagtaa ttacgtaagt ttggcaaagg taagtgaatg
[001178] 241 aagtattttt ttataattat tttttaattc tttatagtga taacgtaagg tttatttaaa
[001179] 301 tttattactt ttatagttat ttagccaatt gttataaatt ccttgttatt gctgaaaaat
[001180] 361 ttgcctgttt tagtcaaaat ttattaactt ttcgatcgtt ttttag (SEQ ID NO: 14532).
[001181] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001182] 1 tttcactaag taattttgtt cctatttagt agataagtaa cacataatta ttgtgatatt
[001183] 61 caaaacttaa gaggtttaat aaataataat aaaaaaaaaa tggtttttat ttcgtagtct
[001184] 121 gctcgacgaa tgtttagtta ttacgtaacc gtgaatatag tttagtagtc tagggttaa (SEQ ID NO: 14571).
[001185] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Ctenoplusia agnata. A enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001186] 1 MASRQHLYQD EIAAILENED DYSPHDTDSE
MEDCVTQDDV RSDVEDEMVD NIGNGTSPAS
[001187] 61 RHEDPETPDP SSEASNLEVT LSSHRIIILP
QRSIREKNNH IWSTTKGQSS GRTAAINIVR
[001188] 121 TNRGPTRMCR NIVDPLLCFQ LFIKEEIVEE
IVKWTNVEMV QKRVNLKDIS ASYRDTNEME
[001189] 181 IWAIISMLTL SAVMKDNHLS TDELFNVSYG
TRYVSVMSRE RFEFLLRLLR MGDKLLRPNL
[001190] 241 RQEDAFTPVR KIWEIFINQC RLNYVPGTNL
TVDEQLLGFR GRCPFRMYIP NKPDKYGIKF
[001191] 301 PMVCDAATKY MVDAIPYLGK STKTQGLPLG
EFYVKELTQT VHGTNRNVTC DNWFTSVPLA
[001192] 361 KSLLNSPYNL TLVGTIRSNK REIPEEVKNS
RSRQVGSSMF CFDGPLTLVS YKPKPSKMVF
[001193] 421 LLSSCNEDAV VNQSNGKPDM ILFYNQTKGG
VDSFDQMCSS MSTNRKTNRW PMAVFYGMLN
[001194] 481 MAFVNSYIIY CHNMLAKKEK PLSRKDFMKK
LSTDLTTPSM QKRLEAPTLK RSLRDNITNV
[001195] 541 LKIVPQAAID TSFDEPEPKK RRYCGFCSYK KKRMTKTQCF KCKKPVCGEH NIDVCQDCI (SEQ ID NO: 14534).
[001196] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Ctenoplusia agnata. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001197] 1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtcattc tgacgtgtat gtcgccgaaa atactctgtc
[001198] 61 tctttctcct gcacgatcgg attgccgcga acgctcgatt caacccagtt ggcgccgaga
[001199] 121 tctattggag gactgcggcg ttgattcggt aagtcccgcc attttgtcat agtaacagta
[001200] 181 ttgcacgtca gcttgacgta tatttgggct ttgtgttatt tttgtaaatt ttcaacgtta
[001201] 241 gtttattatt gcatcttttt gttacattac tggtttattt gcatgtatta ctcaaatatt
[001202] 301 atttttattt tagcgtagaa aataca (SEQ ID NO: 14535).
[001203] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001204] 1 agactgtttt ttttgtattt gcattatata ttatattcta aagttgattt aattctaaga
[001205] 61 aaaacattaa aataagtttc tttttgtaaa atttaattaa ttataagaaa aagtttaagt
[001206] 121 tgatctcatt ttttataaaa atttgcaatg tttccaaagt tattattgta aaagaataaa
[001207] 181 taaaagtaaa ctgagtttta attgatgttt tattatatca ttatactata tattacttaa
[001208] 241 ataaaacaat aactgaatgt atttctaaaa ggaatcacta gaaaatatag tgatcaaaaa
[001209] 301 tttacacgtc atttttgcgt atgattgggc tttataggtt ctaaaaatat gattgggcct
[001210] 361 ctagggttaa (SEQ ID NO: 14536).
[001211] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCCTAGAAGCCCAATC (SEQ ID NO: 14564).
[001212] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Agrotis ipsilon. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001213] 1 MESRQRLNQD EIATILENDD DYSPLDSDSE
AEDRVVEDDV WSDNEDAMID YVEDTSRQED
[001214] 61 PDNNIASQES ANLEVTSLTS HRIISLPQRS
ICGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR
[001215] 121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK
WTNVEMIVKR QNLIDISASY RDTNTMEMWA
[001216] 181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR
YVSVMSRERF EFLIRCMRMD DKTLRPTLRS
[001217] 241 DDAFIPVRKL WEIFINQCRL NYVPGGNLTV
DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIRFPM
[001218] 301 MCDAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF
YVKELTKTVH GTNRNVTCDN WFTSIPLAKN
[001219] 361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE IPEEIKNSRS
RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSRMVFLL
[001220] 421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD
SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA
[001221] 481 FVNSYIIYCH NKINKQKKPI NRKEFMKNLS
TDLTTPWMQE RLKAPTLKRT LRDNITNVLK
[001222] 541 NVVPPSPANN SEEPGPKKRS YCGFCSYKKR RMTKTQFYKC KKAICGEHNI DVCQDCV (SEQ ID NO: 14537).
[001223] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Agrotis ipsilon. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001224] 1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatatctgtc
[001225] 61 tctttcacgt ttaccgtcgg attcccgcta acttcggaac caactcagta gccattgaga
[001226] 121 actcccagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt aatagacagg
[001227] 181 ttgcacgtca ttttgacgta taattgggct ttgtgtaact tttgaaatta tttataattt
[001228] 241 ttattgatgt gatttatttg agttaatcgt attgtttcgt tacatttttc atatgatatt
[001229] 301 aatattttca gattgaatat aaa (SEQ ID NO: 14538).
[001230] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001231] 1 agactgtttt ttttaaaagg cttataaagt attactattg cgtgatttaa ttttataaaa
[001232] 61 atatttaaaa ccagttgatt tttttaataa ttacctaatt ttaagaaaaa atgttagaag
[001233] 121 cttgatattt ttgttgattt ttttctaaga tttgattaaa aggccataat tgtattaata
[001234] 181 aagagtattt ttaacttcaa atttatttta tttattaatt aaaacttcaa ttatgataat
[001235] 241 acatgcaaaa atatagttca tcaacagaaa aatataggaa aactctaata gttttatttt
[001236] 301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt caaatatgat tgggcttcta
[001237] 361 gggttaa (SEQ ID NO: 14539).
[001238] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Megachile rotundata. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001239] 1 MNGKDSLGEF YLDDLSDCLD CRSASSTDDE
SDSSNIAIRK RCPIPLIYSD SEDEDMNNNV
[001240] 61 EDNNHFVKES NRYHYQIVEK YKITSKTKKW
KDVTVTEMKK FLGLIILMGQ VKKDVLYDYW
[001241] 121 STDPSIETPF FSKVMSRNRF LQIMQSWHFY
NNNDISPNSH RLVKIQPVID YFKEKFNNVY
[001242] 181 KSDQQLSLDE CLIPWRGRLS IKTYNPAKIT
KYGILVRVLS EARTGYVSNF CVYAADGKKI
[001243] 241 EETVLSVIGP YKNMWHHVYQ DNYYNSVNIA
KIFLKNKLRV CGTIRKNRSL PQILQTVKLS
[001244] 301 RGQHQFLRNG HTLLEVWNNG KRNVNMISTI
HSAQMAESRN RSRTSDCPIQ KPISIIDYNK
[001245] 361 YMKGVDRADQ YLSYYSIFRK TKKWTKRVVM
FFINCALFNS FKVYTTLNGQ KITYKNFLHK
[001246] 421 AALSLIEDCG TEEQGTDLPN SEPTTTRTTS
RVDHPGRLEN FGKHKLVNIV TSGQCKKPLR
[001247] 481 QCRVCASKKK LSRTGFACKY CNVPLHKGDC FERYHSLKKY (SEQ ID NO: 14540).
[001248] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Megachile rotundata. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001249] 1 ttaaataatg cccactctag atgaacttaa cactttaccg accggccgtc gattattcga
[001250] 61 cgtttgctcc ccagcgctta ccgaccggcc atcgattatt cgacgtttgc ttcccagcgc
[001251] 121 ttaccgaccg gtcatcgact tttgatcttt ccgttagatt tggttaggtc agattgacaa
[001252] 181 gtagcaagca tttcgcattc tttattcaaa taatcggtgc ttttttctaa gctttagccc
[001253] 241 ttagaa (SEQ ID NO: 14541).
[001254] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001255] 1 acaacttctt ttttcaacaa atattgttat atggattatt tatttattta tttatttatg
[001256] 61 gtatatttta tgtttattta tttatggtta ttatggtata ttttatgtaa ataataaact
[001257] 121 gaaaacgatt gtaatagatg aaataaatat tgttttaaca ctaatataat taaagtaaaa
[001258] 181 gattttaata aatttcgtta ccctacaata acacgaagcg tacaatttta ccagagttta
[001259] 241 ttaa (SEQ ID NO: 14542).
[001260] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Bombus impatiens. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001261] 1 MNEKNGIGEF YLDDLSDCPD SYSRSNSGDE
SDGSDTIIRK RGSVLPPRYS DSEDDEINNV
[001262] 61 EDNANNVENN DDIWSTNDEA IILEPFEGSP
GLKIMPSSAE SVTDNVNLFF GDDFFEHLVR
[001263] 121 ESNRYHYQVM EKYKIPSKAK KWTDITVPEM
KKFLGLIVLM GQIKKDVLYD YWSTDPSIET
[001264] 181 PFFSQVMSRN RFVQIMQSWH FCNNDNIPHD
SHRLAKIQPV IDYFRRKFND VYKPCQQLSL
[001265] 241 DESIIPWRGR LSIKTYNPAK ITKYGILVRV
LSEAVTGYVC NFDVYAADGK KLEDTAVIEP
[001266] 301 YKNIWHQIYQ DNYYNSVKMA RILLKNKVRV
CGTIRKNRGL PRSLKTIQLS RGQYEFRRNH
[001267] 361 QILLEVWNNG RRNVNMISTI HSAQLMESRS
KSKRSDVPIQ KPNSIIDYNK YMKGVDRADQ
[001268] 421 YLAYYSIFRK TKKWTKRVVM FFINCALFNS
FRVYTILNGK NITYKNFLHK VAVSWIEDGE
[001269] 481 TNCTEQDDNL PNSEPTRRAP RLDHPGRLSN
YGKHKLINIV TSGRSLKPQR QCRVCAVQKK
[001270] 541 RSRTCFVCKF CNVPLHKGDC FERYHTLKKY (SEQ ID NO: 14543).
[001271] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Bombus impatiens. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001272] 1 ttaatttttt aacattttac cgaccgatag ccgattaatc gggtttttgc cgctgacgct
[001273] 61 taccgaccga taacctatta atcggctttt tgtcgtcgaa gcttaccaac ctatagccta
[001274] 121 cctatagtta atcggttgcc atggcgataa acaatctttc tcattatatg agcagtaatt
[001275] 181 tgttatttag tactaaggta ccttgctcag ttgcgtcagt tgcgttgctt tgtaagctcc
[001276] 241 cacagtttta taccaattcg aaaaacttac cgttcgcg (SEQ ID NO: 14544).
[001277] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001278] 1 actatttcac atttgaacta aaaaccgttg taatagataa aataaatata atttagtatt
[001279] 61 aatattatgg aaacaaaaga ttttattcaa tttaattatc ctatagtaac aaaaagcggc
[001280] 121 caattttatc tgagcatacg aaaagcacag atactcccgc ccgacagtct aaaccgaaac
[001281] 181 agagccggcg ccagggagaa tctgcgcctg agcagccggt cggacgtgcg tttgctgttg
[001282] 241 aaccgctagt ggtcagtaaa ccagaaccag tcagtaagcc agtaactgat cagttaacta
[001283] 301 gattgtatag ttcaaattga acttaatcta gtttttaagc gtttgaatgt tgtctaactt
[001284] 361 cgttatatat tatattcttt ttaa (SEQ ID NO: 14545).
[001285] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Mamestra brassicae. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001286] 1 MFSFVPNKEQ TRTVLIFCFH LKTTAAESHR
PLVEAFGEQV PTVKTCERWF QRFKSGDFDV
[001287] 61 DDKEHGKPPK RYEDAELQAL LDEDDAQTQK
QLAEQLEVSQ QAVSNRLREG GKIQKVGRWV
[001288] 121 PHELNERQRE RRKNTCEILL SRYKRKSFLH
RIVTGEEKWI FFVNPKRKKS YVDPGQPATS
[001289] 181 TARPNRFGKK TRLCVWWDQS GVIYYELLKP
GETVNTARYQ QQLINLNRAL QRKRPEYQKR
[001290] 241 QHRVIFLHDN APSHTARAVR DTLETLNWEV
LPHAAYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQRF
[001291] 301 DSYESVEEWL DEWFAAKDDE FYWRGIHKLP ERWDNCVASD GKYFE (SEQ ID NO: 14546).
[001292] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Mamestra brassicae. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001293] 1 ttattgggtt gcccaaaaag taattgcgga tttttcatat acctgtcttt taaacgtaca
[001294] 61 tagggatcga actcagtaaa actttgacct tgtgaaataa caaacttgac tgtccaacca
[001295] 121 ccatagtttg gcgcgaattg agcgtcataa ttgttttgac tttttgcagt caac (SEQ ID NO: 14547).
[001296] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001297] 1 atgatttttt ctttttaaac caattttaat tagttaattg atataaaaat ccgcaattac
[001298] 61 tttttgggca acccaataa (SEQ ID NO: 14548).
[001299] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Mayetiola destructor. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001300] 1 MENFENWRKR RHLREVLLGH FFAKKTAAES
HRLLVEVYGE HALAKTQCFE WFQRFKSGDF
[001301] 61 DTEDKERPGQ PKKFEDEELE ALLDEDCCQT
QEELAKSLGV TQQAISKRLK AAGYIQKQGN
[001302] 121 WVPHELKPRD VERRFCMSEM LLQRHKKKSF
LSRIITGDEK WIHYDNSKRK KSYVKRGGRA
[001303] 181 KSTPKSNLHG AKVMLCIWWD QRGVLYYELL
EPGQTITGDL YRTQLIRLKQ ALAEKRPEYA
[001304] 241 KRHGAVIFHH DNARPHVALP VKNYLENSGW
EVLPHPPYSP DLAPSDYHLF RSMQNDLAGK
[001305] 301 RFTSEQGIRK WLDSFLAAKP AKFFEKGIHE LSERWEKVIA SDGQYFE (SEQ ID NO: 14549).
[001306] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Mayetiola destructor. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001307] 1 taagacttcc aaaatttcca cccgaacttt accttccccg cgcattatgt ctctcttttc
[001308] 61 accctctgat ccctggtatt gttgtcgagc acgatttata ttgggtgtac aacttaaaaa
[001309] 121 ccggaattgg acgctagatg tccacactaa cgaatagtgt aaaagcacaa atttcatata
[001310] 181 tacgtcattt tgaaggtaca tttgacagct atcaaaatca gtcaataaaa ctattctatc
[001311] 241 tgtgtgcatc atattttttt attaact (SEQ ID NO: 14550).
[001312] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001313] 1 tgcattcatt cattttgtta tcgaaataaa gcattaattt tcactaaaaa attccggttt
[001314] 61 ttaagttgta cacccaatat catccttagt gacaattttc aaatggcttt cccattgagc
[001315] 121 tgaaaccgtg gctctagtaa gaaaaacgcc caacccgtca tcatatgcct tttttttctc
[001316] 181 aacatccg (SEQ ID NO: 14551).
[001317] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Apis mellifera. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001318] 1 MENQKEHYRH ILLFYFRKGK NASQAHKKLC
AVYGDEALKE RQCQNWFDKF RSGDFSLKDE
[001319] 61 KRSGRPVEVD DDLIKAIIDS DRHSTTREIA
EKLHVSHTCI ENHLKQLGYV QKLDTWVPHE
[001320] 121 LKEKHLTQRI NSCDLLKKRN ENDPFLKRLI
TGDEKWVVYN NIKRKRSWSR PREPAQTTSK
[001321] 181 AGIHRKKVLL SVWWDYKGIV YFELLPPNRT
INSVVYIEQL TKLNNAVEEK RPELTNRKGV
[001322] 241 VFHHDNARPH TSLVTRQKLL ELGWDVLPHP
PYSPDLAPSD YFLFRSLQNS LNGKNFNNDD
[001323] 301 DIKSYLIQFF ANKNQKFYER GIMMLPERWQ KVIDQNGQHI TE (SEQ ID NO: 14552).
[001324] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Apis mellifera. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001325] 1 ttgggttggc aactaagtaa ttgcggattt cactcataga tggcttcagt tgaattttta
[001326] 61 ggtttgctgg cgtagtccaa atgtaaaaca cattttgtta tttgatagtt ggcaattcag
[001327] 121 ctgtcaatca gtaaaaaaag ttttttgatc ggttgcgtag ttttcgtttg gcgttcgttg
[001328] 181 aaaa (SEQ ID NO: 14553).
[001329] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001330] 1 agttatttag ttccatgaaa aaattgtctt tgattttcta aaaaaaatcc gcaattactt
[001331] 61 agttgccaat ccaa (SEQ ID NO: 14554).
[001332] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Messor bouvieri. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001333] 1 MSSFVPENVH LRHALLFLFH QKKRAAESHR
LLVETYGEHA PTIRTCETWF RQFKCGDFNV
[001334] 61 QDKERPGRPK TFEDAELQEL LDEDSTQTQK
QLAEKLNVSR VAICERLQAM GKIQKMGRWV
[001335] 121 PHELNDRQME NRKIVSEMLL QRYERKSFLH
RIVTGDEKWI YFENPKRKKS WLSPGEAGPS
[001336] 181 TARPNRFGRK TMLCVWWDQI GVVYYELLKP
GETVNTDRYR QQMINLNCAL IEKRPQYAQR
[001337] 241 HDKVILQHDN APSHTAKPVK EMLKSLGWEV
LSHPPYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQHF
[001338] 301 ADFEEVKKWL DEWFSSKEKL FFWNGIHKLS ERWTKCIESN GQYFE (SEQ ID NO: 14555).
[001339] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Messor bouvieri. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001340] 1 agtcagaaat gacacctcga tcgacgacta atcgacgtct aatcgacgtc gattttatgt
[001341] 61 caacatgtta ccaggtgtgt cggtaattcc tttccggttt ttccggcaga tgtcactagc
[001342] 121 cataagtatg aaatgttatg atttgataca tatgtcattt tattctactg acattaacct
[001343] 181 taaaactaca caagttacgt tccgccaaaa taacagcgtt atagatttat aattttttga
[001344] 241 aa (SEQ ID NO: 14556).
[001345] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001346] 1 ataaatttga actatccatt ctaagtaacg tgttttcttt aacgaaaaaa ccggaaaaga
[001347] 61 attaccgaca ctcctggtat gtcaacatgt tattttcgac attgaatcgc gtcgattcga
[001348] 121 agtcgatcga ggtgtcattt ctgact (SEQ ID NO: 14557).
[001349] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a enzima transposase é uma enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac. Em determinadas modalidades, a enzima transposase piggyBac ou de tipo piggyBac é isolada ou derivada de Trichoplusia ni. A enzima transposase piggyBac (PB) ou de tipo piggyBac pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária idêntica a:
[001350] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[001351] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[001352] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[001353] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[001354] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[001355] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[001356] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[001357] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[001358] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[001359] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14558).
[001360] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Trichoplusia ni. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001361] 1 ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc
[001362] 61 tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga
[001363] 121 gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc
[001364] 181 gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg
[001365] 241 ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct
[001366] 301 tgttatagat atc (SEQ ID NO: 14559).
[001367] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001368] 1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
[001369] 61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
[001370] 121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
[001371] 181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg gttaa (SEQ ID NO: 14560).
[001372] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001373] 1 ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt gctctctctt
[001374] 61 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc
[001375] 121 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt
[001376] 181 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa
[001377] 241 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt
[001378] 301 atagatatc (SEQ ID NO: 14561).
[001379] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001380] 1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
[001381] 61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
[001382] 121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
[001383] 181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g (SEQ ID NO: 14562).
[001384] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001385] 1 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc
[001386] 61 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt
[001387] 121 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa
[001388] 181 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt
[001389] 241 atagatatc (SEQ ID NO: 14609).
[001390] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência de:
[001391] 1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
[001392] 61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
[001393] 121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
[001394] 181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g (SEQ ID NO: 14610).
[001395] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14561 e SEQ ID NO: 14562 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO:
14558. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO: 14609 e SEQ ID NO: 14610 e a transposase piggyBac ou de tipo piggyBac compreende SEQ ID NO:
14558.
[001396] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Aphis gossypii. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCTTCCAGCGGGCGCGC (SEQ ID NO: 14565).
[001397] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Chilo suppressalis. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCCAGATTAGCCT (SEQ ID NO: 14566).
[001398] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Heliothis virescens. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCCTTAATTACTCGCG (SEQ ID NO: 14567).
[001399] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Pectinophora gossypiella. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCCTAGATAACTAAAC (SEQ ID NO: 14568).
[001400] Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac é isolado ou derivado de Anopheles stephensi. Em determinadas modalidades, o transposon piggyBac ou de tipo piggyBac compreende uma sequência ITR de CCCTAGAAAGATA (SEQ ID NO: 14569). Métodos de Modificação Genética Não Baseados em Transposição
[001401] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, uma HSC modificada ou célula descendente de HSC modificada da invenção pode ser produzida ao introduzir um transgene em uma HSC ou uma célula descendente de HSC da invenção. A etapa de introdução pode compreender distribuir uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica através de um sistema de distribuição sem transposição.
[001402] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma HSC ou uma célula descendente de HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ compreende uma ou mais de administração tópica, adsorção, absorção, eletroporação, spin-fecção, cocultura, transfecção, distribuição mecânica, distribuição sônica, distribuição vibracional, magnetofecção ou distribuição mediada por nanopartículas. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ compreende transfecção lipossômica, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção de fugene e transfecção mediada por dendrímero. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma HSC ou uma célula descendente de HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ por transfecção mecânica compreende técnicas de compressão celular, bombardeamento celular ou armas genéticas. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ por meio de transfecção mediada por nanopartículas compreende distribuição lipossômica, distribuição por micelas e distribuição por polimerossomas.
[001403] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ compreende um vetor não viral. Em algumas modalidades, o vetor não viral compreende um ácido nucleico. Em algumas modalidades, o vetor não viral compreende DNA de plasmídio, DNA fita dupla linear (dsDNA), DNA fita simples linear (ssDNA), DNA DoggyBone™, nanoplasmídeos, DNA de minicírculo, oligodeoxinucleotídeos fita simples (ssODN), oligonucleotídeos de DDNA, mRNA fita simples (ssRNA) e mRNA fita dupla (dsRNA). Em algumas modalidades, o vetor não viral compreende um transposon da invenção.
[001404] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ compreende um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor não cromossômico não integrador. Exemplos de vetores não cromossômicos não integradores incluem, porém sem limitações, vírus adenoassociado (AAV), adenovírus e vírus do herpes. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor cromossômico integrador. Vetores cromossômicos integradores incluem, porém sem limitações, vetores adenoassociados (AAV), lentivírus e gama-retrovírus.
[001405] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou uma construção de edição genômica em uma HSC ou uma célula descendente de HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ compreende uma combinação de vetores. Exemplos não limitativos de combinações de vetores incluem: vetores virais e não virais, uma pluralidade de vetores não virais ou uma pluralidade de vetores virais. Combinações de vetores exemplificativas, mas não limitativas, incluem: uma combinação de um vetor derivado de DNA e um derivado de RNA, uma combinação de um RNA e uma transcriptase reversa, uma combinação de um transposon e uma transposase, uma combinação de um vetor não viral e uma endonuclease e uma combinação de um vetor viral e uma endonuclease.
[001406] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma que compreende a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou um construto de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC não ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ integra estavelmente uma sequência de ácidos nucleicos, integra transitoriamente uma sequência de ácidos nucleicos, produz integração específica para local, uma sequência de ácidos nucleicos ou produz uma integração polarizada de uma sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é um transgene.
[001407] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma que compreende a introdução de uma sequência de ácidos nucleicos e/ou um construto de edição genômica em uma célula descendente HSC ou HSC ex vivo, in vivo, in vitro ou in situ integra estavelmente uma sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a integração cromossômica estável pode ser uma integração aleatória, uma integração específica para local ou uma integração tendenciosa. Em algumas modalidades, a integração específica para local pode ser não assistida ou assistida. Em algumas modalidades, a integração específica para local assistida é codistribuída com uma nuclease direcionada ao local. Em algumas modalidades, a nuclease direcionada ao local compreende um transgene com extensões de sequência de nucleotídeos 5' e 3' que contêm uma porcentagem de homologia com as regiões a montante e a jusante do local de integração genômica. Em algumas modalidades, o transgene com extensões nucleotídicas homólogas permite a integração genômica por meio de recombinação homóloga, junção de extremidade mediada por micro-homologia ou junção de extremidade não homóloga. Em algumas modalidades, a integração específica para local ocorre em um local de alojamento seguro. Locais de alojamento genômico seguros são capazes de acomodar a integração de novo material genético de maneira a assegurar que os elementos genéticos recém-inseridos funcionem de maneira confiável (por exemplo, sejam expressos em um nível de expressão terapeuticamente eficaz) e não causem alterações prejudiciais ao genoma hospedeiro que causem um risco para o organismo hospedeiro. Locais de alojamento genômico potenciais incluem, dentre outros, sequências intrônicas do gene da albumina humana, o sítio 1 do vírus adenoassociado (AAVS1), um sítio de integração natural do vírus AAV no cromossomo 19, sítio 5 de quimiocina (Motivo CC) receptor 5 (CCR5) e o sítio do ortólogo humano do locus Rosa26 de camundongo.
[001408] Em algumas modalidades, a integração do transgene específico para local ocorre em um local que interrompe a expressão de um gene alvo. Em algumas modalidades, a interrupção da expressão do gene alvo ocorre por meio de integração específica para local em íntrons, éxons, promotores, elementos genéticos, intensificadores, supressores, códons iniciais, códons terminais e elementos de resposta. Em algumas modalidades, genes alvo exemplificativos direcionados pela integração específica para local incluem, porém sem limitações, TRAC, TRAB, PDI, qualquer gene imunossupressor e genes envolvidos na alo-rejeição.
[001409] Em algumas modalidades, a integração do transgene específica para local ocorre em um local que resulta na expressão aprimorada de um gene alvo. Em algumas modalidades, o aprimoramento da expressão do gene alvo ocorre por meio de integração específica para local em íntrons, éxons, promotores, elementos genéticos, intensificadores, supressores, códons iniciais, códons terminais e elementos de resposta.
[001410] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, as enzimas podem ser usadas para criar rupturas de fita no genoma do hospedeiro para facilitar a distribuição ou integração do transgene. Em algumas modalidades, as enzimas criam rupturas de fita simples. Em algumas modalidades, as enzimas criam rupturas de fita dupla. Em algumas modalidades, exemplos de enzimas indutoras de ruptura incluem, porém sem limitações: transposases, integrase, endonucleases, CRISPR-Cas9, nucleases efetoras de tipo ativador de transcrição (TALEN), nucleases de dedo de zinco (ZFN), Cas- CLOVER™ e CPF1. Em algumas modalidades, as enzimas indutoras de ruptura podem ser distribuídas à célula codificada no DNA, codificada no mRNA, como uma proteína, como um complexo de nucleoproteínas com um RNA guia (gRNA).
[001411] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a integração do transgene específica para local é controlada por uma tendência do local de integração mediado por vetor. Em algumas modalidades, a tendência do local de integração mediado por vetores é controlada pelo vetor lentiviral escolhido. Em algumas modalidades, a tendência do local de integração mediado por vetores é controlada pelo vetor gama-retroviral escolhido.
[001412] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o local de integração do transgene específico para local é uma inserção cromossômica não estável. Em algumas modalidades, o transgene integrado pode ser silenciado, removido, excisado ou modificado adicionalmente.
[001413] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração não estável de um transgene. Em algumas modalidades, a integração não estável pode ser uma integração não cromossômica transitória, uma integração não cromossômica semiestável, uma inserção não cromossômica semipersistente ou uma inserção cromossômica não estável. Em algumas modalidades, a inserção não cromossômica transitória pode ser epicromossômica ou citoplasmática.
[001414] Em algumas modalidades, a inserção não cromossômica transitória de um transgene não se integra a um cromossomo e o material genético modificado não é replicado durante a divisão celular.
[001415] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração não estável ou persistente não cromossômica de um transgene. Em algumas modalidades, um vetor de DNA codifica um módulo de região de fixação de armação/matriz (S-MAR) que se liga a proteínas da matriz nuclear para retenção epissomal de um vetor não viral, permitindo replicação autônoma no núcleo das células em divisão.
[001416] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração cromossômica não estável de um transgene. Em algumas modalidades, o transgene integrado pode ser silenciado, removido, excisado ou modificado adicionalmente.
[001417] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a modificação no genoma por meio de inserção de transgene pode ocorrer via reparo de ruptura de fita dupla direcionada a célula hospedeira (reparo direcionado à homologia) por meio de recombinação homóloga (HR), união de extremidade mediada por micro-homologia (MMEJ), união não homóloga (NHEJ), modificação mediada por enzima transposase, modificação mediada por enzima integrase, modificação mediada por enzima endonuclease ou modificação mediada por enzima recombinante. Em algumas modalidades, a modificação no genoma pela inserção de transgene pode ocorrer via CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER e Cpf1.
[001418] Nos sistemas de edição gênica que envolvem a inserção de nucleotídeos/ácidos nucleicos novos ou existentes, ferramentas de inserção (por exemplo, vetores de DNA modelo, elementos transponíveis (transposons ou retrotransposons) devem ser distribuídos à célula, além da enzima de corte (por exemplo, uma nuclease, recombinase, integrase ou transposase). Exemplos de tais ferramentas de inserção para uma recombinase podem incluir um vetor de DNA. Outros sistemas de edição gênica requerem a distribuição de uma integrase juntamente com um vetor de inserção, uma transposase juntamente com um transposon/retrotransposon, etc. Em algumas modalidades, um exemplo de recombinase que pode ser usada como uma enzima de corte é a recombinase CRE. Em várias modalidades, exemplos de integrase que podem ser usados em ferramentas de inserção incluem enzimas com base em vírus retiradas de vários vírus incluindo, porém sem limitações, AAV, gama retrovírus e lentivírus. Exemplos transposons/retrotransposons que podem ser usados em ferramentas de inserção incluem, porém sem limitações, o transposon piggyBac, Transposon Sleeping Beauty e retrotransposon L1.
[001419] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, o transgene é distribuído in vivo. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição in vivo de transgene pode ocorrer através de: distribuição tópica, adsorção, absorção, eletroporação, spin- fecção, cocultura, transfecção, distribuição mecânica, distribuição sônica, distribuição sonora, distribuição vibracional, magnetofecção ou distribuição mediada por nanopartículas. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição de transgene in vivo por transfecção pode ocorrer por transfecção lipossômica, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção de fugene e transfecção mediada por dendrímero. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição mecânica de transgene in vivo pode ocorrer por meio de compressão de células, bombardeamento e pistola de genes. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição de transgene mediada por nanopartículas in vivo pode ocorrer através de distribuição lipossômica, distribuição por micelas e distribuição por polimerossomas. Em várias modalidades, as nucleases que podem ser usadas como enzimas de corte incluem, porém sem limitações, Cas9, nucleases efetoras de tipo ativador de transcrição (TALENs) e nucleases de dedo de zinco.
[001420] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, vetores não virais são usados para distribuição de transgene. Em determinadas modalidades, o vetor não viral é um ácido nucleico. Em determinadas modalidades, o vetor não viral de ácido nucleico é DNA de plasmídeo, DNA fita dupla linear (dsDNA), DNA fita simples linear (ssDNA), DNA DoggyBone™, nanoplasmídeos, DNA de minicírculo, oligodesoxinucleotídeos fita simples (ssODN), oligonucleotídeos de DDNA, mRNA fita simples (ssRNA) e mRNA fita dupla (dsRNA). Em determinadas modalidades, o vetor não viral é um transposon. Em determinadas modalidades, o transposon é piggyBac.
[001421] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição de transgene pode ocorrer via vetor viral. Em determinadas modalidades, o vetor viral é um vetor não cromossômico não integrador. Vetores não cromossômicos não integradores podem incluir vírus adenoassociado (AAV), adenovírus e vírus do herpes. Em determinadas modalidades, o vetor viral é um vetor cromossômico integrador. A integração de vetores cromossômicos pode incluir vetores adenoassociados (AAV), lentivírus e gama-retrovírus.
[001422] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a distribuição de transgene pode ocorrer por uma combinação de vetores. Combinações de vetores exemplificativas, mas não limitativas, podem incluir: vetores virais mais vetores não virais, mais de um vetor não viral ou mais de um vetor viral. Combinações de vetores exemplificativas, mas não limitativas, podem incluir: vetores derivados de DNA mais vetores derivados de RNA, RNA mais transcriptase reversa, um transposon e uma transposase, um vetor não viral mais uma endonuclease e um vetor viral mais uma endonuclease.
[001423] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma pode ser uma integração estável de um transgene, uma integração transitória de um transgene, uma integração específica para local de um transgene ou uma integração tendenciosa de um transgene.
[001424] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma pode ser uma integração cromossômica estável de um transgene. Em determinadas modalidades, a integração cromossômica estável pode ser uma integração aleatória, uma integração específica para local ou uma integração tendenciosa. Em determinadas modalidades, a integração específica para local pode ser não assistida ou assistida. Em determinadas modalidades, a integração específica para local assistida é codistribuída com uma nuclease direcionada ao local. Em determinadas modalidades, a nuclease direcionada ao local compreende um transgene com extensões de sequência de nucleotídeos 5' e 3' que contêm homologia por regiões a montante e a jusante do local de integração genômica. Em determinadas modalidades, o transgene com extensões nucleotídicas homólogas permite a integração genômica por meio de recombinação homóloga, junção de extremidade mediada por micro-homologia ou junção de extremidade não homóloga. Em determinadas modalidades, a integração específica para local ocorre em um local de alojamento seguro. Locais de alojamento genômico seguros são capazes de acomodar a integração de novo material genético de maneira a assegurar que os elementos genéticos recém-inseridos funcionem de maneira confiável (por exemplo, sejam expressos em um nível de expressão terapeuticamente eficaz) e não causem alterações prejudiciais ao genoma hospedeiro que causem um risco para o organismo hospedeiro. Locais de alojamento genômico potenciais incluem, dentre outros, sequências intrônicas do gene da albumina humana, o sítio 1 do vírus adenoassociado (AAVS1), um local de integração natural do vírus AAV no cromossomo 19, sítio de quimiocina (Motivo CC) receptor 5 (CCR5) e o sítio do ortólogo humano do locus Rosa26 de camundongo.
[001425] Em determinadas modalidades, a integração do transgene específico para local ocorre em um local que interrompe a expressão de um gene alvo. Em determinadas modalidades, a interrupção da expressão do gene alvo ocorre por meio de integração específica para local em íntrons, éxons, promotores, elementos genéticos, intensificadores, supressores, códons iniciais, códons terminais e elementos de resposta. Em determinadas modalidades, genes alvo exemplificativos direcionados por meio de integração específica para local incluem, porém sem limitações, TRAC, TRAB, PDI, qualquer gene imunossupressor e genes envolvidos na alo-rejeição.
[001426] Em determinadas modalidades, a integração do transgene específico para local ocorre em um local que resulta na expressão aprimorada de um gene alvo. Em determinadas modalidades, o aprimoramento da expressão do gene alvo ocorre por meio de integração específica para local em íntrons, éxons, promotores, elementos genéticos, intensificadores, supressores, códons iniciais, códons terminais e elementos de resposta.
[001427] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, as enzimas podem ser usadas para criar rupturas de fita no genoma do hospedeiro para facilitar a distribuição ou integração do transgene. Em determinadas modalidades, as enzimas criam rupturas de fita simples. Em determinadas modalidades, as enzimas criam rupturas de fita dupla. Em determinadas modalidades, exemplos de enzimas indutoras de ruptura incluem, porém sem limitações: transposases, integrases,
endonucleases, CRISPR-Cas9, nucleases efetoras de tipo ativador de transcrição (TALEN), nucleases de dedo de zinco (ZFN), Cas- CLOVER™ e CPF1. Em determinadas modalidades, as enzimas indutoras de ruptura podem ser distribuídas à célula codificada no DNA, codificada no mRNA, como uma proteína, como um complexo de nucleoproteínas com um RNA guia (gRNA).
[001428] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a integração de transgene específica para local é controlada por uma tendência do local de integração mediado por vetor. Em determinadas modalidades, a tendência do local de integração mediado por vetores é controlada pelo vetor lentiviral escolhido. Em determinadas modalidades, a tendência do local de integração mediado por vetores é controlada pelo vetor gama-retroviral escolhido.
[001429] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, o local de integração de transgene específico para local é uma inserção cromossômica não estável. Em determinadas modalidades, o transgene integrado pode ser silenciado, removido, excisado ou modificado adicionalmente. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração não estável de um transgene. Em determinadas modalidades, a integração não estável pode ser uma integração não cromossômica transitória, uma integração não cromossômica semiestável, uma inserção não cromossômica semipersistente ou uma inserção cromossômica não estável. Em determinadas modalidades, a inserção não cromossômica transitória pode ser epicromossômica ou citoplasmática. Em determinadas modalidades, a inserção não cromossômica transitória de um transgene não se integra a um cromossomo e o material genético modificado não é replicado durante a divisão celular.
[001430] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração não estável ou persistente não cromossômica de um transgene. Em determinadas modalidades, um vetor de DNA codifica um módulo de região de fixação de armação/matriz (S-MAR) que se liga a proteínas da matriz nuclear para retenção epissomal de um vetor não viral, permitindo replicação autônoma no núcleo das células em divisão.
[001431] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação do genoma é uma integração cromossômica não estável de um transgene. Em determinadas modalidades, o transgene integrado pode ser silenciado, removido, excisado ou modificado adicionalmente.
[001432] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a modificação no genoma por inserção de transgene pode ocorrer via reparo de ruptura de fita dupla direcionada a célula hospedeira (reparo direcionado à homologia) por meio de recombinação homóloga (HR), união de extremidade mediada por micro-homologia (MMEJ), união não homóloga (NHEJ), modificação mediada por enzima transposase, modificação mediada por enzima integrase, modificação mediada por enzima endonuclease ou modificação mediada por enzima recombinante. Em determinadas modalidades, a modificação no genoma pela inserção de transgene pode ocorrer via CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER e Cpf1.
[001433] Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, uma célula com uma modificação genômica in vivo ou ex vivo pode ser uma célula da linhagem germinativa ou uma célula somática. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser uma célula humana, não humana, de mamífero, rato, camundongo ou cão. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser diferenciada, indiferenciada ou imortalizada. Em determinadas modalidades, a célula indiferenciada modificada pode ser uma célula-tronco. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser diferenciada, indiferenciada ou imortalizada. Em determinadas modalidades, a célula indiferenciada modificada pode ser uma célula-tronco pluripotente induzida. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser uma célula T, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula Natural Assassina, um macrófago, uma célula dendrítica, um monócito, um megacariócito ou um osteoclasto. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser modificada enquanto a célula está inativa, em um estado ativado, em repouso, na interfase, na prófase, na metáfase, na anáfase ou na telófase. Em determinadas modalidades, a célula modificada pode ser fresca, criopreservada, a granel, classificada em subpopulações, de sangue total, de leucaferese ou de uma linhagem de células imortalizada. Produção e Geração de VCARs
[001434] Pelo menos uma proteína VHH ou VCAR da invenção pode ser opcionalmente produzida por uma linhagem de células, uma linhagem de células mista, uma célula imortalizada ou uma população clonal de células imortalizadas, conforme bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Ausubel et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., Eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
[001435] Os aminoácidos de uma proteína VHH podem ser alterados, adicionados e/ou eliminados para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aprimorar ou modificar a ligação, afinidade, constante de associação, constante de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida, estabilidade, solubilidade ou qualquer outra característica adequada, conforme conhecido na técnica.
[001436] Opcionalmente, as proteínas VHH podem ser manipuladas com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, as proteínas VHH podem ser opcionalmente preparadas por meio de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos de engenharia conceitual usando modelos tridimensionais das sequências parentais e de engenharia. Modelos tridimensionais estão geralmente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem as prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, programa Immunofilter da Xencor, Inc. de Monrovia, Califórnia). A inspeção destas triagens permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da proteína VHH candidata de se ligar ao seu antígeno. Deste modo, os resíduos podem ser selecionados e combinados a partir das sequências parentais e de referência, de modo que a característica desejada, tal como afinidade pelo(s) antígeno(s) alvo, seja alcançada. Alternativamente, ou além dos procedimentos acima, outros métodos adequados de engenharia podem ser usados. Triagem de Proteínas VHH
[001437] A triagem de VHH para ligação específica a proteínas ou fragmentos similares pode ser convenientemente alcançada usando bibliotecas de nucleotídeos (exibição de DNA ou RNA) ou de peptídeos, por exemplo, exibição in vitro. Este método envolve a triagem de grandes coleções de peptídeos quanto a membros individuais que têm a função ou estrutura desejada. As sequências nucleotídicas ou peptídicas exibidas podem ter a partir de 3 a 5000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento, frequentemente 5 a 100 aminoácidos de comprimento e, frequentemente, 8 a 25 aminoácidos de comprimento. Além dos métodos sintéticos químicos diretos para gerar bibliotecas de peptídeos, vários métodos de DNA recombinante foram descritos. Um tipo envolve a exibição de uma sequência peptídica na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência peptídica particular exibida. As proteínas VHH da invenção podem se ligar às proteínas humanas ou outras de mamífero com uma ampla faixa de afinidades (KD). Em uma modalidade preferida, pelo menos uma VHH da presente invenção pode se ligar opcionalmente a uma proteína-alvo com alta afinidade, por exemplo, com uma KD igual ou menor do que cerca de 10−7 M, tal como, porém sem limitações, 0,1-9,9 (ou qualquer faixa ou valor na mesma) X 10−8, 10−9, 10−10, 10−11, 10−12, 10−13, 10−14, 10−15 ou qualquer faixa ou valor, conforme determinado por meio de ressonância plasmônica de superfície ou pelo método Kinexa, conforme praticado por aqueles versados na técnica.
[001438] A afinidade ou avidez de uma VHH ou uma VCAR por um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado (consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody- Antigen Interactions", em Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, WH Freeman and Company: New York, NY (1992); e métodos descritos aqui). A afinidade medida de uma determinada interação VHH-antígeno ou VCAR-antígeno pode variar se medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de VHH ou VCAR e antígeno, e um tampão padronizado, tal como o tampão descrito aqui.
[001439] Ensaios competitivos podem ser realizados com a VHH ou
VCAR da invenção a fim de determinar quais proteínas, anticorpos e outros antagonistas competem pela ligação a uma proteína-alvo com a VHH ou VCAR da presente invenção e/ou compartilham a região de epítopo. Estes ensaios, conforme facilmente conhecido por aqueles versados na técnica, avaliam a competição entre antagonistas ou ligantes através de um número limitado de sítios de ligação a uma proteína. A proteína e/ou anticorpo é imobilizado ou insolubilizado antes ou após a competição e a amostra ligada à proteína-alvo é separada da amostra não ligada, por exemplo, por meio de decantação (onde a proteína/anticorpo foi pré-insolubilizado) ou centrifugação (onde o proteína/anticorpo foi precipitado após reação competitiva). Além disso, a ligação competitiva pode ser determinada se a função é alterada pela ligação ou falta de ligação da VHH ou VCAR à proteína-alvo, por exemplo, se a molécula de VCAR inibe ou potencializa a atividade enzimática, por exemplo, de um marcador. ELISA e outros ensaios funcionais podem ser usados, conforme bem conhecido na técnica. Moléculas de Ácidos Nucleicos
[001440] Moléculas de ácido nucleico da invenção que codificam proteínas VHH ou VCARs podem estar na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma ou na forma de DNA incluindo, porém sem limitações, cDNA e DNA genômico obtido por meio de clonagem ou produzido sinteticamente ou qualquer combinação dos mesmos. O DNA pode ser fita tripla, fita dupla ou fita simples ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou RNA pode ser a fita codificadora, também conhecida como fita senso, ou pode ser a fita não codificadora, também conhecida como fita antissenso.
[001441] Moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico que compreendem um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente, com um ou mais íntrons, por exemplo, porém sem limitações, pelo menos uma porção especificada de pelo menos um VCAR; moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência codificadora para um VCAR; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeos substancialmente diferente daquelas descritas acima, mas que, em virtude da degeneração do código genético, ainda codificam o VCAR conforme descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica. Obviamente, o código genético é bem conhecido na técnica. Assim, seria rotina para aqueles versados na técnica gerar tais variantes degeneradas de ácidos nucleicos que codificam VCARs específicos da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., Supra, e estas variantes de ácido nucleico estão incluídas na presente invenção.
[001442] Conforme indicado aqui, as moléculas de ácido nucleico da invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica um VCAR podem incluir, porém sem limitações, aquelas que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento de VHH em só; a sequência codificadora para todo o VCAR ou uma porção da mesma; a sequência codificadora para uma VHH, fragmento ou porção, bem como sequências adicionais, tal como a sequência codificadora de pelo menos um líder de sinal ou peptídeo de fusão, com ou sem as sequências codificadoras adicionais supracitadas, como pelo menos um íntron, juntamente com sequências não codificadoras adicionais incluindo, sem limitação, sequências não codificadoras 5' e 3', tais como as sequências transcritas e não traduzidas que desempenham um papel na transcrição, processamento de mRNA, incluindo sinais de emenda (splicing) e poliadenilação (por exemplo, ligação ao ribossomo e estabilidade do mRNA); uma sequência codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionais, tais como aquelas que conferem funcionalidades adicionais. Assim, a sequência que codifica um VCAR pode ser fundida com uma sequência de marcador, tal como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do VCAR fundido que compreende um fragmento ou porção de VHH. Polinucleotídeos que Hibridizam Seletivamente Com um Polinucleotídeo Conforme Descrito Aqui
[001443] A invenção fornece ácidos nucleicos isolados que hibridizam sob condições de hibridização seletiva com um polinucleotídeo descrito aqui. Assim, os polinucleotídeos desta modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos que compreendem estes polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou completos em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências genômicas ou de cDNA isoladas ou complementares de um cDNA de uma biblioteca de ácidos nucleicos de seres humanos ou mamíferos.
[001444] De preferência, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos as sequências de 80 % de comprimento total, de preferência sequências de pelo menos 85 % ou 90 % de comprimento total e, mais preferivelmente, sequências de pelo menos 95 % de comprimento total. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas para aumentar a representação de sequências raras. Condições de hibridização de rigor baixo ou moderado são tipicamente, mas não exclusivamente, empregadas com sequências com uma identidade de sequência reduzida em relação às sequências complementares. Condições moderadas e de alto rigor podem ser opcionalmente empregadas para sequências de maior identidade. Condições de baixo rigor permitem a hibridização seletiva de sequências com cerca de 70 % de identidade de sequência e podem ser empregadas para identificar sequências ortólogas ou parálogas.
[001445] Opcionalmente, os polinucleotídeos da presente invenção codificarão pelo menos uma porção de um VCAR codificado pelos polinucleotídeos descritos aqui. Os polinucleotídeos da presente invenção abrangem sequências de ácidos nucleicos que podem ser empregadas para hibridização seletiva com um polinucleotídeo que codifica um VCAR da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada um inteiramente incorporado aqui por referência. Construção de Ácidos Nucleicos
[001446] Os ácidos nucleicos isolados da invenção podem ser produzidos usando (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação e/ou (d) combinações dos mesmos, bem conhecidos na técnica.
[001447] Os ácidos nucleicos podem compreender, convenientemente, sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de clonagem múltipla que compreende um ou mais sítios de restrição de endonucleases pode ser inserido no ácido nucleico para ajudar no isolamento do polinucleotídeo. Além disso, sequências traduzíveis podem ser inseridas para ajudar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da invenção. Por exemplo, uma sequência de marcador hexa-histidina constitui um meio conveniente para purificar as proteínas da invenção. O ácido nucleico da invenção, excluindo a sequência codificadora, é opcionalmente um vetor, adaptador ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da invenção.
[001448] Sequências adicionais podem ser adicionadas para tal clonagem e/ou sequências de expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores e ligantes é bem conhecido na técnica (consulte, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).
Métodos Recombinantes Para a Construção de Ácidos Nucleicos
[001449] As composições de ácido nucleico isoladas da presente invenção, tais como RNA, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas usando qualquer variedade de metodologias de clonagem conhecidas por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, sondas de oligonucleotídeos que hibridizam seletivamente, sob condições rigorosas, com os polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a sequência desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA e a construção de cDNA e bibliotecas genômicas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (consulte, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra). Métodos de Triagem e Isolamento de Ácidos Nucleicos
[001450] Um cDNA ou biblioteca genômica pode ser rastreada usando uma sonda com base na sequência de um polinucleotídeo da invenção. As sondas podem ser usadas para hibridizar com sequências de DNA genômico ou cDNA para isolar genes homólogos no mesmo ou em diferentes organismos. Aqueles versados na técnica compreenderão que vários graus de rigor de hibridização podem ser empregados no ensaio; e a hibridização ou o meio de lavagem podem ser rigorosos. À medida que as condições para hibridização se tornam mais rigorosas, deve haver um maior grau de complementaridade entre a sonda e o alvo para que a formação de duplex ocorra. O grau de rigor pode ser controlado por um ou mais de temperatura, intensidade iônica, pH e presença de um solvente parcialmente desnaturante, tal como formamida. Por exemplo, o rigor da hibridização é convenientemente variado ao alterar a polaridade da solução reagente através, por exemplo, de manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0 % a 50 %. O grau de complementaridade (identidade de sequência) necessária para a ligação detectável variará de acordo com o rigor do meio de hibridização e/ou meio de lavagem. O grau de complementaridade será, de forma ideal, 100 % ou 70-100 % ou qualquer faixa ou valor na mesma. No entanto, deve ser entendido que pequenas variações de sequência nas sondas e nos iniciadores podem ser compensadas pela redução do rigor da hibridização e/ou meio de lavagem.
[001451] Métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem conhecidos na técnica e podem ser usados de acordo com a invenção sem experimentação indevida, com base nos ensinamentos e orientações apresentados aqui.
[001452] Métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA incluem, porém sem limitações, reação em cadeia de polimerase (PCR) e processos de amplificação relacionados (consulte, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159,
4.965.188, de Mullis, et al. 4.795.699 e 4.921.794 para Tabor et al.;
5.142.033 para Innis; 5.122.464 para Wilson et al.; 5.091.310 para Innis;
5.066.584 para Gyllensten et al.; 4.889.818 para Gelfand et al.;
4.994.370 para Silver et al.; 4.664.070 para Biswas; 4.656.134 para Ringold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA antissenso para a sequência-alvo como um modelo para a síntese de DNA fita dupla (Patente Norte-americana N° 5.130.238 para Malek et al., com o nome comercial NASBA), todo o conteúdo dos quais são aqui incorporados por referência. (Consulte, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra).
[001453] Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências de polinucleotídeos da invenção e genes relacionados diretamente a partir de bibliotecas de DNA ou cDNA genômico. PCR e outros métodos de amplificação in vitro também podem ser úteis, por exemplo, para clonar sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas a serem expressas, para produzir ácidos nucleicos a serem usados como sondas para detectar a presença do mRNA desejado em amostras, para sequenciamento de ácidos nucleicos ou outras finalidades. Exemplos de técnicas suficientes para orientar aqueles versados na técnica quanto a métodos de amplificação in vitro são encontrados em Berger, supra, Sambrook, supra e Ausubel, supra, bem como em Mullis et al., Patente Norte-americana N° 4.683.202 (1987); e Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Califórnia (1990). Kits comercialmente disponíveis para amplificação por PCR genômica são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Kit Advantage-GC Genomic PCR (Clontech). Além disso, por exemplo, a proteína do gene T4 32 (Boehringer Mannheim) pode ser usada para melhorar o rendimento de longos produtos de PCR. Métodos Sintéticos para a Construção de Ácidos Nucleicos
[001454] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem também ser preparados por meio de síntese química direta através de métodos conhecidos (consulte, por exemplo, Ausubel, et al., Supra). A síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo fita simples, o qual pode ser convertido em DNA fita dupla por meio de hibridização com uma sequência complementar ou polimerização com uma DNA polimerase usando a fita única como modelo. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, embora a síntese química de DNA possa estar limitada a sequências de cerca de 100 ou mais bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas. Cassetes de Expressão Recombinantes
[001455] A invenção fornece ainda cassetes de expressão recombinantes que compreendem um ácido nucleico da invenção. Uma sequência de ácidos nucleicos da invenção, por exemplo, um cDNA ou uma sequência genômica que codifica um VCAR da invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante compreenderá, tipicamente, um polinucleotídeo da invenção operativamente ligado a sequências reguladoras de início de transcrição que controlarão a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Tanto promotores heterólogos quanto não heterólogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para controlar a expressão dos ácidos nucleicos da invenção.
[001456] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos isolados que servem como promotor, intensificador ou outros elementos podem ser introduzidos na posição apropriada (a montante, a jusante ou no íntron) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo da invenção, de modo que regular positiva ou negativamente a expressão de um polinucleotídeo da invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro através de mutação, eliminação e/ou substituição. Nanotransposons
[001457] A invenção fornece um nanotransposon que compreende: (a) uma sequência que codifica uma inserção de transposon, que compreende uma sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR), uma sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) e uma intra-ITR sequência; (b) uma sequência que codifica uma estrutura principal, em que a sequência que codifica a estrutura principal compreende uma sequência que codifica uma origem de replicação que tem entre 1 e 450 nucleotídeos, incluindo os pontos finais, e uma sequência que codifica um marcador selecionável que tem entre 1 e 200 nucleotídeos, inclusive dos pontos finais e (c) uma sequência inter-ITR. Em algumas modalidades, a sequência inter-ITR de (c) compreende a sequência de (b). Em algumas modalidades, a sequência intra-ITR de (a) compreende a sequência de (b).
[001458] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência que codifica a estrutura principal compreende entre 1 e 600 nucleotídeos, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o esqueleto consiste em entre 1 e 50 nucleotídeos, entre 50 e 100 nucleotídeos, entre 100 e 150 nucleotídeos, entre 150 e 200 nucleotídeos, entre 200 e 250 nucleotídeos, entre 200 e 250 nucleotídeos, entre 250 e 300 nucleotídeos, entre 300 e 300 350 nucleotídeos, entre 350 e 400 nucleotídeos, entre 400 e 450 nucleotídeos, entre 450 e 500 nucleotídeos, entre 500 e 550 nucleotídeos, entre 550 e 600 nucleotídeos, cada faixa incluindo os pontos finais.
[001459] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência inter-ITR compreende entre 1 e 1000 nucleotídeos, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a sequência inter-ITR consiste em entre 1 e 50 nucleotídeos, entre 50 e 100 nucleotídeos, entre 100 e 150 nucleotídeos, entre 150 e 200 nucleotídeos, entre 200 e 250 nucleotídeos, entre 200 e 250 nucleotídeos, entre 250 e 300 nucleotídeos, entre 300 e 300 350 nucleotídeos, entre 350 e 400 nucleotídeos, entre 400 e 450 nucleotídeos, entre 450 e 500 nucleotídeos, entre 500 e 550 nucleotídeos, entre 550 e 600 nucleotídeos, entre 550 e 600 nucleotídeos, entre 600 e 650 nucleotídeos, entre 650 e 700 nucleotídeos, entre 650 e 700 nucleotídeos, entre 700 e 750 nucleotídeos, entre 750 e 800 nucleotídeos, entre 800 e 850 nucleotídeos, entre 850 e 900 nucleotídeos, entre 900 e 950 nucleotídeos ou entre 950 e 1000 nucleotídeos, cada faixa incluindo os pontos finais.
[001460] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo os nanotransposons curtos (SNTs) da invenção, a sequência inter-ITR compreende entre 1 e 200 nucleotídeos, incluindo os pontos finais. Em algumas modalidades, a sequência inter-ITR consiste em entre 1 e 10 nucleotídeos, entre 10 e 20 nucleotídeos, entre 20 e 30 nucleotídeos, entre 30 e 40 nucleotídeos, entre 40 e 50 nucleotídeos, entre 40 e 50 nucleotídeos, entre 50 e 60 nucleotídeos, entre 60 e 70 nucleotídeos, entre 70 e 80 nucleotídeos, entre 80 e 90 nucleotídeos ou entre 90 e 100 nucleotídeos, cada faixa incluindo os pontos finais.
[001461] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, o marcador selecionável que tem entre 1 e 200 nucleotídeos, incluindo os pontos finais, compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável em sacarose. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um marcador selecionável em sacarose compreende uma sequência que codifica uma sequência de RNA-OUT. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma sequência de RNA-OUT compreende ou consiste em 137 pares de bases (pb). Em algumas modalidades, o marcador selecionável que tem entre 1 e 200 nucleotídeos, inclusive os pontos finais, compreende uma sequência que codifica um marcador fluorescente. Em algumas modalidades, o marcador selecionável que tem entre 1 e 200 nucleotídeos, incluindo os pontos finais, compreende uma sequência que codifica um marcador na superfície celular.
[001462] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência que codifica uma origem de replicação que tem entre 1 e 450 nucleotídeos, inclusive os pontos finais, compreende uma sequência que codifica uma mini origem de replicação. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma origem de replicação que tem entre 1 e 450 nucleotídeos, inclusive os pontos finais, compreende uma sequência que codifica uma origem de replicação R6K. Em algumas modalidades, a origem de replicação R6K compreende uma origem de replicação gama R6K. Em algumas modalidades, a origem de replicação R6K compreende uma mini origem de replicação R6K. Em algumas modalidades, a origem de replicação R6K compreende uma mini origem gama de replicação R6K. Em algumas modalidades, a origem de replicação gama R6K gama compreende ou consiste em 281 pares de bases (pb).
[001463] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência que codifica a estrutura principal não compreende um sítio de recombinação, um sítio de excisão, um sítio de ligação ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, nem o nanotransposon nem a sequência que codifica o esqueleto compreende um produto de um sítio de recombinação, um sítio de excisão, um sítio de ligação ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, nem o nanotransposon nem a sequência que codifica a estrutura principal são derivados de um sítio de recombinação, um sítio de excisão, um sítio de ligação ou uma combinação dos mesmos.
[001464] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, um sítio de recombinação compreende uma sequência resultante de um evento de recombinação. Em algumas modalidades, um sítio de recombinação compreende uma sequência que é um produto de um evento de recombinação. Em algumas modalidades, o evento de recombinação compreende uma atividade de uma recombinase (por exemplo, um sítio de recombinase).
[001465] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência que codifica a estrutura principal não compreende ainda uma sequência que codifica DNA estranho.
[001466] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência inter-ITR não compreende um sítio de recombinação, um sítio de excisão, um sítio de ligação ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência inter-
ITR não compreende um produto de um evento de recombinação, um evento de excisão, um evento de ligação ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a sequência inter-ITR não é derivada de um evento de recombinação, um evento de excisão, um evento de ligação ou uma combinação dos mesmos.
[001467] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência inter-ITR compreende uma sequência que codifica DNA estranho.
[001468] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência intra-ITR compreende pelo menos uma sequência que codifica um isolante e uma sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula humana.
[001469] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência intra-ITR compreende uma primeira sequência que codifica um isolante, uma sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero e uma segunda sequência que codifica um isolante.
[001470] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência intra-ITR compreende uma primeira sequência que codifica um isolante, uma sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero, uma sequência de poliatosina (poliA) e uma segunda sequência que codifica um isolante.
[001471] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência intra-ITR compreende uma primeira sequência que codifica um isolante, uma sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero, pelo menos uma sequência exógena, uma poliadenosina
(poliA) e uma segunda sequência que codifica um isolante.
[001472] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero é capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula humana. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero compreende uma sequência que codifica um promotor indutível. Em algumas modalidades, a sequência intra-ITR compreende uma primeira sequência que codifica um primeiro promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero e uma segunda sequência que codifica um segundo promotor capaz de expressar uma sequência exógena na célula de mamífero, em que o primeiro promotor é um promotor constitutivo, em que o segundo promotor é um promotor indutível e em que a primeira sequência que codifica o primeiro promotor e a segunda sequência que codifica o segundo promotor são orientadas em direções opostas. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero compreende uma sequência que codifica um promotor específico para o tipo de célula ou tecido. Em algumas modalidades, a sequência que codifica um promotor capaz de expressar uma sequência exógena em uma célula de mamífero compreende uma sequência que codifica um promotor EF1a, uma sequência que codifica um promotor de CMV, uma sequência que codifica um promotor de MND, uma sequência que codifica um promotor de SV40, uma sequência que codifica um promotor PGK1, uma sequência que codifica um promotor Ubc, uma sequência que codifica um promotor CAG, uma sequência que codifica um promotor H1 ou uma sequência que codifica um promotor U6.
[001473] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência de poliadenosina (poliA) é isolada ou derivada de uma sequência de poliA viral. Em algumas modalidades, a sequência de poliadenosina (poliA) é isolada ou derivada de uma sequência poliA (SV40).
[001474] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase indutível compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase indutível compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase 9 truncado, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana.
[001475] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, a região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo da proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) compreende uma modificação na posição 36 da sequência. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HLDLGNGNGN.
[001476] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de FKBP12 é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATT TCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCT GGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGC CCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGG GAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACT GACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAG
GGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 14636).
[001477] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, a região de ligação é codificada por um aminoácido que compreende GGGGS (SEQ ID NO: 14637) ou um ácido nucleico sequência que compreende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 14638). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o ligante não compreende um sítio de restrição.
[001478] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, o polipeptídeo truncado de caspase 9 é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma arginina (R) na posição 87 da sequência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que não compreende uma alanina (A) na posição 282 da sequência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de aminoácidos que compreende:
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRT GSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALD CCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSL GGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLD
DIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKT S (SEQ ID NO: 14639).
[001479] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase 9 truncado é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende:
GGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGC CGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCT GATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAAC ACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTT CTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGC CAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACC ATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGG TGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACA GACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAAC GGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTT ATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGT GGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTG AACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACC AGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCG TGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCA AGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAA CAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGT GGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCG
GGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 14640).
[001480] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível é codificado por uma sequência de amino ácidos que compreende:
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPF KFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGH CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAK KMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGC PVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPE DESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFV
SWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYK QMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 14641).
[001481] Em algumas modalidades, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagactt gcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgc aacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgt ggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagca acaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctg gagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgc cgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttct gcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggaga aggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctg gccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcc cacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgt cagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaa aactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcacc agccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggaggg actgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtctta cagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacact ggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggca aacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaa ctgttctttaagacttcc (SEQ ID NO: 14642).
[001482] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, a sequência exógena compreende ainda uma sequência que codifica um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o marcador selecionável compreende uma sequência que codifica um marcador detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável compreende um marcador fluorescente ou um marcador de superfície celular. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o marcador selecionável compreende uma sequência que codifica uma proteína que é ativa na divisão de células e não ativa nas células não de divisão. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o marcador selecionável compreende uma sequência que codifica um marcador metabólico. Em algumas modalidades, a sequência que codifica o marcador selecionável compreende uma sequência que codifica uma enzima muteína di-hidrofolato redutase (DHFR). Em algumas modalidades, a enzima muteína DHFR compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
[001483] 1 MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN
ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL 61 VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL
SRSLDDALKL
121 TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM
QDFESDTFFP 181 EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND (SEQ ID NO: 17012).
[001484] Em algumas modalidades, a enzima muteína DHFR é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende ou consiste em (SEQ ID NO: 17095). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da enzima muteína DHFR compreende ainda uma mutação em uma ou mais das posições 80, 113 ou 153. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da enzima muteína DHFR compreende uma ou mais de uma substituição de uma fenilalanina (F) ou uma leucina (L) na posição 80, uma substituição de uma leucina (L) ou uma valina (V) na posição 113 e uma substituição de uma valina (V) ou um ácido aspártico (D) na posição 153.
[001485] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível e/ou a sequência exógena compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável, a sequência exógena compreende ainda uma sequência que codifica um receptor antigênico de ocorrência não natural e/ou uma sequência que codifica um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, o receptor antigênico de ocorrência não natural compreende um receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, uma sequência que codifica o TCR compreende uma ou mais de uma inserção, uma eliminação, uma substituição, uma inversão, uma transposição ou um deslocamento de quadro comparado com uma sequência de tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, uma sequência que codifica o TCR compreende uma sequência quimérica ou recombinante. Em algumas modalidades, o receptor antigênico de ocorrência não natural compreende um receptor antigênico quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o CAR compreende: (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, o ectodomínio de (a) do CAR compreende ainda um peptídeo sinalizador. Em algumas modalidades, o ectodomínio de (a) do CAR compreende ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o endodomínio compreende um endodomínio de CD3zeta humana. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio coestimulatório compreende um segmento intracelular de 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 humana ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio coestimulatório compreende um domínio coestimulatório de CD28 e/ou 4-1BB humana. Em algumas modalidades, a região de reconhecimento de antígeno compreende um ou mais dentre scFv, VHH, VH e Centirina.
[001486] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível e/ou a sequência exógena compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável, a sequência exógena compreende ainda uma sequência que codifica uma transposase.
[001487] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, a sequência intra-ITR compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável, uma sequência exógena, uma sequência que codifica um polipeptídeo de caspase indutível e pelo menos uma sequência que codifica um peptídeo de autoclivagem. Em algumas modalidades, a pelo menos uma sequência que codifica um peptídeo de autoclivagem é posicionada entre um ou mais dentre: (a) a sequência que codifica um marcador selecionável e a sequência exógena, (b) a sequência que codifica um marcador selecionável e a caspase indutível polipeptídeo e, e (c) a sequência exógena e o polipeptídeo de caspase indutível. Em algumas modalidades, uma primeira sequência que codifica um peptídeo de autoclivagem é posicionada entre a sequência que codifica um marcador selecionável e a sequência exógena e uma segunda sequência que codifica um peptídeo de autoclivagem é posicionada entre a sequência exógena e o polipeptídeo de caspase indutível.
[001488] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira invertida a repetição terminal (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase piggyBac ou uma transposase de tipo piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase de tipo piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende uma sequência de reconhecimento TTAA, TTAT ou TTAX. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende uma sequência de reconhecimento TTAA, TTAT ou TTAX e uma sequência com pelo menos 50 % de identidade para uma sequência isolado ou derivado de uma transposase piggyBac ou de uma transposase de tipo piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende pelo menos 2 nucleotídeos (nts), 3 nts, 4 nts, 5 nts, 6 nts, 7 nts, 8 nts, 9 nts, 10 nts, 11 nts, 12 nts, 13 nts, 14 nts, 15 nts, 16 nts, 17 nts, 18 nts, 19 nts ou 20 nts.
[001489] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase piggyBac ou uma transposase de tipo piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende a sequência de CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17096) ou uma sequência que tem pelo menos 70 % de identidade com a sequência de CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17096). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende a sequência de
CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATG CGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17097). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende a sequência de CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17096) e compreende a sequência de CCCTAGAAAGATAATCATATTCATCATGGGGGATA : 17097). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma repetição primeiro terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende a sequência de CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17096) e compreende a sequência de
CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATG TGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17098). Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma repetição primeiro terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) compreende a sequência de: CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG (SEQ ID NO: 17096)
[001490] e compreende a sequência de:
TTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAAT CATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGG TTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTA CATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTT
ATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAAC TTTTA (SEQ ID NO: 17099).
[001491] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira invertida a repetição terminal (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase piggyBac ou uma transposase de tipo piggyBac. Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) é reconhecida por uma transposase piggyBac com uma sequência de aminoácidos de pelo menos 20 % de identidade com a sequência de aminoácidos de:
[001492] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[001493] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[001494] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[001495] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[001496] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[001497] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[001498] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[001499] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[001500] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[001501] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[001502] Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) é reconhecida por uma transposase piggyBac com a sequência de aminoácidos de:
[001503] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[001504] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[001505] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
[001506] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[001507] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
[001508] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[001509] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[001510] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[001511] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
[001512] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14487).
[001513] Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) é reconhecida por uma transposase piggyBac com uma sequência de aminoácidos da transposase piggyBac de pelo menos 20 % de identidade com a sequência de aminoácidos de:
[001514] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[001515] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[001516] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[001517] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[001518] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[001519] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[001520] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[001521] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[001522] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[001523] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14484).
[001524] Em algumas modalidades, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) é reconhecida por uma transposase piggyBac com sequência de aminoácidos da transposase piggyBac de:
[001525] 1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV
SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
[001526] 61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI
RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
[001527] 121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW
TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
[001528] 181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS
VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
[001529] 241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ
LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
[001530] 301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK
ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
[001531] 361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV
GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
[001532] 421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD
QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
[001533] 481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL
TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
[001534] 541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF (SEQ ID NO: 14484).
[001535] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase Sleeping Beauty. Em algumas modalidades, a transposase Sleeping Beauty é uma transposase Sleeping Beauty hiperativa (SB100X).
[001536] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase Helitron.
[001537] Em algumas modalidades dos nanotransposons da invenção, incluindo aqueles nos quais a pelo menos uma sequência exógena compreende um ou mais de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível, uma sequência que codifica um marcador selecionável e uma sequência exógena, a sequência que codifica uma primeira repetição terminal invertida (ITR) ou a sequência que codifica uma segunda repetição terminal invertida (ITR) são reconhecidas por uma transposase Tol2.
[001538] A invenção fornece uma célula que compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, a célula compreende ainda uma composição de transposase. Em algumas modalidades, a composição de transposase compreende uma transposase ou uma sequência que codifica a transposase que é capaz de reconhecer a primeira ITR ou a segunda ITR do nanotransposon. Em algumas modalidades, a composição de transposase compreende um nanotransposon que compreende a sequência que codifica a transposase. Em algumas modalidades, a célula compreende um primeiro nanotransposon que compreende uma sequência exógena e um segundo nanotransposon que compreende uma sequência que codifica uma transposase. Em algumas modalidades, a célula é uma célula alogênica.
[001539] A invenção fornece uma composição que compreende o nanotransposon da invenção.
[001540] A invenção fornece uma composição que compreende a célula da invenção. Em algumas modalidades, a célula compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, a célula não é mais modificada. Em algumas modalidades, a célula é alogênica.
[001541] A invenção fornece uma composição que compreende a célula da invenção. Em algumas modalidades, a célula compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, a célula não é mais modificada. Em algumas modalidades, a célula é autóloga.
[001542] A invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de células da invenção. Em algumas modalidades, pelo menos uma célula da pluralidade de células compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, uma porção da pluralidade de células compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, a porção compreende pelo menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da pluralidade de células. Em algumas modalidades, cada célula da pluralidade de células compreende um nanotransposon da invenção. Em algumas modalidades, a pluralidade de células não compreende uma célula modificada da invenção. Em algumas modalidades, pelo menos uma célula da pluralidade de células não é mais modificada. Em algumas modalidades, nenhuma da pluralidade de células não é mais modificada. Em algumas modalidades, a pluralidade de células é alogênica. Em algumas modalidades, uma pluralidade alogênica de células é produzida de acordo com os métodos da invenção. Em algumas modalidades, a pluralidade de células é autóloga. Em algumas modalidades, uma pluralidade autóloga de células é produzida de acordo com os métodos da invenção.
[001543] A invenção fornece uma célula modificada que compreende: (a) um nanotransposon da invenção; (b) uma sequência que codifica um polipeptídeo pró-apoptótico indutível; e em que a célula é uma célula T, (c) uma modificação de uma sequência endógena que codifica um Receptor de célula T (TCR), em que a modificação reduz ou elimina um nível de expressão ou atividade do TCR. Em algumas modalidades, a célula compreende ainda: (d) uma sequência que não ocorre naturalmente que compreende um antígeno de histocompatibilidade HLA classe I, cadeia alfa E (HLA-E) e (e) uma modificação de uma sequência endógena que codifica Beta-2-Microglobulina (B2M), em que a modificação reduz ou elimina um nível de expressão ou atividade do Principal Complexo de Histocompatibilidade (MHC) classe I (MHC-I).
[001544] A invenção fornece uma célula modificada que compreende: (a) um nanotransposon da invenção; (b) uma sequência que codifica um polipeptídeo pró-apoptótico indutível; (c) uma sequência de ocorrência não natural que compreende um antígeno de histocompatibilidade do HLA classe I, cadeia alfa E (HLA-E) e (e) uma modificação de uma sequência endógena que codifica Beta-2-Microglobulina (B2M), em que a modificação reduz ou elimina um nível de expressão ou atividade do Principal Complexo de Histocompatibilidade (MHC) classe I (MHC-I).
[001545] Em algumas modalidades das células modificadas da invenção, a sequência de ocorrência não natural que compreende um HLA-E compreende ainda uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador B2M. Em algumas modalidades, a sequência de ocorrência não natural que compreende um HLA-E compreende ainda um ligante, em que o ligante é posicionado entre a sequência que codifica a sequência que codifica um polipeptídeo B2M e a sequência que codifica o HLA-E. Em algumas modalidades, a sequência de ocorrência não natural que compreende um HLA-E compreende ainda uma sequência que codifica um peptídeo e uma sequência que codifica um polipeptídeo B2M. Em algumas modalidades, a sequência que não ocorre naturalmente que compreende um HLA-E compreende ainda um primeiro ligante posicionado entre a sequência que codifica o peptídeo de sinal B2M e a sequência que codifica o peptídeo e um segundo ligante posicionado entre a sequência que codifica o polipeptídeo B2M e o sequência que codifica o HLA-E.
[001546] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula de mamífero.
[001547] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula humana.
[001548] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula- tronco.
[001549] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula diferenciada.
[001550] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula somática.
[001551] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula imune ou um precursor de célula imune. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula progenitora linfoide, uma célula Natural Assassina (NK), uma célula Natural Assassina induzida por citocinas (CIK), um linfócito T (célula T), um linfócito B (célula B) ou uma célula apresentadora de antígeno (APC). Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T, uma célula T de memória precoce, uma célula T de tipo célula-tronco, uma célula T de memória-tronco (Tscm) ou uma célula T de memória central (Tcm). Em algumas modalidades, o precursor da célula imune é uma célula-tronco hematopoiética (HSC). Em algumas modalidades, a célula é uma célula apresentadora de antígeno (APC).
[001552] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula compreende ainda uma composição para edição gênica. Em algumas modalidades, a composição para edição gênica compreende uma sequência que codifica um domínio de ligação a DNA e uma sequência que codifica uma proteína de nuclease ou um domínio de nuclease. Em algumas modalidades, a composição para edição gênica compreende uma sequência que codifica uma proteína de nuclease ou uma sequência que codifica um domínio de nuclease. Em algumas modalidades, a sequência e que codifica uma proteína de nuclease ou a sequência que codifica um domínio de nuclease compreende uma sequência de DNA, uma sequência de RNA ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a nuclease ou o domínio da nuclease compreende uma ou mais de uma proteína CRISPR/Cas, uma nuclease efetora de tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) e uma endonuclease. Em algumas modalidades, a proteína CRISPR/Cas compreende uma proteína Cas (dCas) inativada por nuclease.
[001553] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula compreende ainda uma composição para edição gênica. Em algumas modalidades, a composição para edição gênica compreende uma sequência que codifica um domínio de ligação a DNA e uma sequência que codifica uma proteína de nuclease ou um domínio de nuclease. Em algumas modalidades, a nuclease ou o domínio da nuclease compreende uma proteína Cas (dCas) inativada por nuclease e uma endonuclease. Em algumas modalidades, a endonuclease compreende uma nuclease Clo051 ou um domínio da nuclease. Em algumas modalidades, a composição para edição gênica compreende uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende uma proteína Cas9 inativada por nuclease (dCas9) e uma nuclease Clo051 ou um domínio nuclease Clo051. Em algumas modalidades, a composição para edição gênica compreende ainda uma sequência guia. Em algumas modalidades, a sequência guia compreende uma sequência de RNA. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende ou consiste na sequência de aminoácidos:
MAPKKKRKVEGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRL FEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAY SEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYF VFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTI EELERAMFNNSEFILKYGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKV PSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRR KNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEG DLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSR RLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLS ASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDG GASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQI HLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFA WMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPK HSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRK VTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFL DNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLT FKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVM GRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGI KELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSD YDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNY WRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKH VAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREIN NYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSE QEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWD KGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARK KDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIME RSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGE LQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYL DEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTN
LGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLG GDGSPKKKRKVSS (SEQ ID NO: 17013)
[001554] ou um ácido nucleico que compreende ou consiste na sequência:
[001555] 1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa
[001556] 61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg
[001557] 121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac
[001558] 181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac
[001559] 241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc
[001560] 301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat
[001561] 361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa
[001562] 421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga
[001563] 481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc
[001564] 541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac
[001565] 601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga
[001566] 661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca
[001567] 721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt
[001568] 781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct
[001569] 841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac
[001570] 901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag
[001571] 961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat
[001572] 1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag
[001573] 1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt
[001574] 1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg
[001575] 1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca
[001576] 1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag
[001577] 1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg
[001578] 1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa
[001579] 1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac
[001580] 1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg
[001581] 1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac
[001582] 1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag
[001583] 1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc
[001584] 1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa
[001585] 1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga
[001586] 1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac
[001587] 1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc
[001588] 1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag
[001589] 2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca
[001590] 2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg
[001591] 2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag
[001592] 2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc
[001593] 2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat
[001594] 2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac
[001595] 2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac
[001596] 2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat
[001597] 2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg
[001598] 2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat
[001599] 2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc
[001600] 2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc
[001601] 2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc
[001602] 2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc
[001603] 2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag
[001604] 2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc
[001605] 3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat
[001606] 3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg
[001607] 3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag
[001608] 3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat
[001609] 3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat
[001610] 3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg
[001611] 3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact
[001612] 3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag
[001613] 3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag
[001614] 3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac
[001615] 3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc
[001616] 3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa
[001617] 3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc
[001618] 3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag
[001619] 3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc
[001620] 3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag
[001621] 3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc
[001622] 4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag
[001623] 4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt
[001624] 4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa
[001625] 4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac
[001626] 4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg
[001627] 4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc
[001628] 4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag
[001629] 4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat
[001630] 4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat
[001631] 4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac
[001632] 4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc
[001633] 4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat
[001634] 4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa (SEQ ID NO: 17014).
[001635] Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende ou consiste na sequência de aminoácidos:
[001636] 1 MPKKKRKVEG IKSNISLLKD ELRGQISHIS
HEYLSLIDLA FDSKQNRLFE MKVLELLVNE
[001637] 61 YGFKGRHLGG SRKPDGIVYS TTLEDNFGII
VDTKAYSEGY SLPISQADEM ERYVRENSNR
[001638] 121 DEEVNPNKWW ENFSEEVKKY YFVFISGSFK
GKFEEQLRRL SMTTGVNGSA VNVVNLLLGA
[001639] 181 EKIRSGEMTI EELERAMFNN SEFILKYGGG
GSDKKYSIGL AIGTNSVGWA VITDEYKVPS
[001640] 241 KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA
EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSNE
[001641] 301 MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF
GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA
[001642] 361 DLRLIYLALA HMIKFRGHFL IEGDLNPDNS
DVDKLFIQLV QTYNQLFEEN PINASGVDAK
[001643] 421 AILSARLSKS RRLENLIAQL PGEKKNGLFG
NLIALSLGLT PNFKSNFDLA EDAKLQLSKD
[001644] 481 TYDDDLDNLL AQIGDQYADL FLAAKNLSDA
ILLSDILRVN TEITKAPLSA SMIKRYDEHH
[001645] 541 QDLTLLKALV RQQLPEKYKE IFFDQSKNGY
AGYIDGGASQ EEFYKFIKPI LEKMDGTEEL
[001646] 601 LVKLNREDLL RKQRTFDNGS IPHQIHLGEL
HAILRRQEDF YPFLKDNREK IEKILTFRIP
[001647] 661 YYVGPLARGN SRFAWMTRKS EETITPWNFE
EVVDKGASAQ SFIERMTNFD KNLPNEKVLP
[001648] 721 KHSLLYEYFT VYNELTKVKY VTEGMRKPAF
LSGEQKKAIV DLLFKTNRKV TVKQLKEDYF
[001649] 781 KKIECFDSVE ISGVEDRFNA SLGTYHDLLK
IIKDKDFLDN EENEDILEDI VLTLTLFEDR
[001650] 841 EMIEERLKTY AHLFDDKVMK QLKRRRYTGW
GRLSRKLING IRDKQSGKTI LDFLKSDGFA
[001651] 901 NRNFMQLIHD DSLTFKEDIQ KAQVSGQGDS
LHEHIANLAG SPAIKKGILQ TVKVVDELVK
[001652] 961 VMGRHKPENI VIEMARENQT TQKGQKNSRE
RMKRIEEGIK ELGSQILKEH PVENTQLQNE
[001653] 1021 KLYLYYLQNG RDMYVDQELD INRLSDYDVD
AIVPQSFLKD DSIDNKVLTR SDKNRGKSDN
[001654] 1081 VPSEEVVKKM KNYWRQLLNA KLITQRKFDN
LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK
[001655] 1141 HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK
SKLVSDFRKD FQFYKVREIN NYHHAHDAYL
[001656] 1201 NAVVGTALIK KYPKLESEFV YGDYKVYDVR
KMIAKSEQEI GKATAKYFFY SNIMNFFKTE
[001657] 1261 ITLANGEIRK RPLIETNGET GEIVWDKGRD
FATVRKVLSM PQVNIVKKTE VQTGGFSKES
[001658] 1321 ILPKRNSDKL IARKKDWDPK KYGGFDSPTV
AYSVLVVAKV EKGKSKKLKS VKELLGITIM
[001659] 1381 ERSSFEKNPI DFLEAKGYKE VKKDLIIKLP
KYSLFELENG RKRMLASAGE LQKGNELALP
[001660] 1441 SKYVNFLYLA SHYEKLKGSP EDNEQKQLFV
EQHKHYLDEI IEQISEFSKR VILADANLDK
[001661] 1501 VLSAYNKHRD KPIREQAENI IHLFTLTNLG
APAAFKYFDT TIDRKRYTST KEVLDATLIH
[001662] 1561 QSITGLYETR IDLSQLGGDG SPKKKRKV ((SEQ ID NO: 17058)
[001663] ou um ácido nucleico que compreende ou consiste na sequência:
[001664] 1 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac
[001665] 61 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct
[001666] 121 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag
[001667] 181 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt
[001668] 241 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat
[001669] 301 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga
[001670] 361 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac
[001671] 421 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg
[001672] 481 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct
[001673] 541 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat
[001674] 601 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta
[001675] 661 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca
[001676] 721 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt
[001677] 781 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg
[001678] 841 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag
[001679] 901 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag
[001680] 961 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat
[001681] 1021 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg
[001682] 1081 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc
[001683] 1141 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta
[001684] 1201 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag
[001685] 1261 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta
[001686] 1321 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca
[001687] 1381 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac
[001688] 1441 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta
[001689] 1501 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat
[001690] 1561 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac
[001691] 1621 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa
[001692] 1681 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa
[001693] 1741 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg
[001694] 1801 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc
[001695] 1861 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt
[001696] 1921 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct
[001697] 1981 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc
[001698] 2041 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa
[001699] 2101 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct
[001700] 2161 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat
[001701] 2221 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta
[001702] 2281 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt
[001703] 2341 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg
[001704] 2401 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac
[001705] 2461 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg
[001706] 2521 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa
[001707] 2581 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg
[001708] 2641 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc
[001709] 2701 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa
[001710] 2761 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt
[001711] 2821 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag
[001712] 2881 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg
[001713] 2941 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa
[001714] 3001 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag
[001715] 3061 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac
[001716] 3121 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac
[001717] 3181 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat
[001718] 3241 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg
[001719] 3301 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct
[001720] 3361 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag
[001721] 3421 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg
[001722] 3481 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat
[001723] 3541 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt
[001724] 3601 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg
[001725] 3661 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata
[001726] 3721 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa
[001727] 3781 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca
[001728] 3841 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg
[001729] 3901 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg
[001730] 3961 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa
[001731] 4021 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt
[001732] 4081 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg
[001733] 4141 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa
[001734] 4201 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc
[001735] 4261 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg
[001736] 4321 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct
[001737] 4381 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc
[001738] 4441 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa
[001739] 4501 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt
[001740] 4561 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca
[001741] 4621 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac
[001742] 4681 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga
[001743] 4741 tcccccaaga agaagaggaa agtctga (SEQ ID NO: 17059).
[001744] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, um nanotransposon compreende a composição para edição gênica que compreende uma sequência-guia e uma sequência que codifica uma proteína de fusão que compreende uma sequência que codifica uma Cas9 inativada (dCas9) e uma sequência que codifica uma nuclease Clo051 ou um domínio de nuclease.
[001745] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula expressa transitoriamente a composição para edição gênica.
[001746] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a célula é uma célula T e o RNA guia compreende uma sequência complementar a uma sequência-alvo que codifica um TCR endógeno. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende uma sequência complementar a uma sequência-alvo que codifica um polipeptídeo B2M.
[001747] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, o RNA guia compreende uma sequência complementar a uma sequência-alvo dentro de um sítio de alojamento seguro de uma sequência de DNA genômica.
[001748] Em algumas modalidades das células, células não modificadas e células modificadas da invenção, a nuclease Clo051 ou um domínio de nuclease induz a uma ruptura de fita simples ou dupla em uma sequência-alvo. Em algumas modalidades, uma sequência doadora, um plasmídeo doador ou uma sequência intra-ITR de nanotransposon doador integrada em uma posição de ruptura de fita simples ou dupla e/ou em uma posição de reparo celular dentro de uma sequência-alvo.
[001749] A invenção fornece uma composição que compreende uma célula modificada de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[001750] A invenção fornece uma composição que compreende uma pluralidade de células modificadas de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
[001751] A invenção fornece uma composição da invenção para uso no tratamento de uma doença ou transtorno.
[001752] A invenção fornece o uso de uma composição da invenção para o tratamento de uma doença ou transtorno.
[001753] A invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou transtorno que compreende administrar, a um indivíduo que precisa do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção. Em algumas modalidades, o indivíduo não desenvolve doença enxerto x hospedeiro (GvH) e/ou hospedeiro x enxerto (HvG) após administração da composição. Em algumas modalidades, a administração é sistêmica. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma via intravenosa. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma injeção intravenosa ou uma infusão intravenosa.
[001754] A invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou transtorno que compreende administrar, a um indivíduo que precisa do mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da invenção. Em algumas modalidades, o indivíduo não desenvolve doença enxerto x hospedeiro (GvH) e/ou hospedeiro x enxerto (HvG) após administração da composição. Em algumas modalidades, a administração é local. Em algumas modalidades, a composição é administrada por uma via intratumoral, uma via intraespinhal, uma via intracérebro-ventricular, uma via intraocular ou uma via intraóssea. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de uma injeção ou infusão intratumoral, uma injeção ou infusão intraespinhal, uma injeção ou infusão intra-cérebro- ventricular, uma injeção ou infusão intraocular ou uma injeção ou infusão intraóssea.
[001755] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou transtorno da invenção, a dose terapeuticamente eficaz é uma dose única e em que as células alogênicas da composição enxertam e/ou persistem por um tempo suficiente para tratar a doença ou transtorno. Em algumas modalidades, a dose única é uma de pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou qualquer número de doses intermediárias fabricadas simultaneamente.
[001756] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento de uma doença ou transtorno da invenção, a dose terapeuticamente eficaz é uma dose única e em que as células autólogas da composição enxertam e/ou persistem por um tempo suficiente para tratar a doença ou transtorno. Em algumas modalidades, a dose única é uma de pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou qualquer número intermediário de doses fabricadas simultaneamente.
[001757] Em algumas modalidades da composição e métodos da invenção, células alogênicas são células-tronco. Em algumas modalidades, as células alogênicas são derivadas de células-tronco. Células-tronco exemplificativas incluem, porém sem limitações, células- tronco embrionárias, células-tronco adultas, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco multipotentes, células-tronco pluripotentes e células-tronco hematopoéticas (HSCs).
[001758] Em algumas modalidades da composição e métodos da invenção, células alogênicas são células somáticas diferenciadas.
[001759] Em algumas modalidades da composição e métodos da invenção, células alogênicas são células imunes. Em algumas modalidades, as células alogênicas são linfócitos T (células T). Em algumas modalidades, células alogênicas são células T que não expressam um ou mais componentes de um Receptor de células T (TCR) de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as células alogênicas são células T que expressam um receptor antigênico que não ocorre naturalmente. Alternativamente, ou além disso, em algumas modalidades, as células alogênicas são células T que expressam um Receptor Estimulatório Quimérico (CSR) de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o CSR de ocorrência não natural compreende ou consiste em um receptor de permuta. Em algumas modalidades, o receptor de permuta compreende um domínio extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular. Em algumas modalidades, o domínio extracelular do receptor de permuta se liga a uma molécula coestimulatória do TCR e transduz um sinal para o espaço intracelular da célula alogênica que retoma a sinalização de TCR ou sinalização de coestimulação de TCR. Receptores Estimulatórios Quiméricos (RSC)
[001760] As composições de células adotivas que são "universalmente" seguras para administração a qualquer paciente requerem uma redução ou eliminação significativa da alorreatividade.
[001761] Para esta finalidade, as células alogênicas da invenção são modificadas para interromper a expressão ou função de um receptor de células T (TCR) e/ou uma classe do Principal Complexo de Histocompatibilidade (MHC). O TCR media as reações enxerto versus hospedeiro (GvH), enquanto que o MHC media as reações hospedeiro versus enxerto (HvG). Em modalidades preferidas, qualquer expressão e/ou função do TCR é eliminada nas células alogênicas da invenção para impedir a GvH mediada por células T que poderia causar a morte do indivíduo. Assim, em modalidades particularmente preferidas, a invenção fornece uma composição de células T alogênicas puras negativas para TCR (por exemplo, cada célula da composição expressa em um nível tão baixo que pode ser indetectável ou inexistente).
[001762] Em modalidades preferidas, a expressão e/ou função do MHC classe I (MHC-I, especificamente, HLA-A, HLA-B e HLA-C) são reduzidas ou eliminadas em células alogênicas da invenção para impedir HvG e, consequentemente, para melhorar a enxertia de células alogênicas da invenção em um indivíduo. A enxertia aprimorada das células alogênicas da invenção resulta em maior persistência das células e, portanto, uma maior janela terapêutica para o indivíduo. Especificamente, nas células alogênicas da invenção, expressão e/ou função de um elemento estrutural do MHC-I, a Beta-2-Microglobulina (B2M), é reduzida ou eliminada nas células alogênicas da invenção.
[001763] As estratégias acima para gerar uma célula alogênica da invenção induzem novos desafios. O silenciamento do receptor de células T (TCR) (KO) nas células T resulta na perda de expressão de CD3-zeta (CD3z ou CD3zeta), que faz parte do complexo TCR. A perda de CD3zeta nas células T TCR-KO reduz drasticamente a capacidade de ativar e expandir de maneira ideal estas células usando reagentes padrão de estimulação/ativação incluindo, porém sem limitações, mAb anti-CD3 agonista. Quando a expressão ou função de qualquer componente do complexo TCR é interrompida, todos os componentes do complexo são perdidos, incluindo TCR-alfa (TCRα), TCR-beta (TCRβ), CD3-gama (CD3γ), CD3-épsilon (CD3ε), CD3-delta (CD3δ) e CD3-zeta (CD3zeta). CD3ε e CD3zeta são necessários para a ativação e expansão das células T. Os mAbs anti-CD3 agonistas reconhecem, tipicamente, CD3ε e possivelmente outra proteína no complexo a qual, por sua vez, sinaliza à CD3zeta. A CD3zeta fornece o estímulo primário para a ativação das células T (juntamente com um sinal coestimulador secundário) para ativação e expansão ideais. Sob condições normais, a ativação completa das células T depende do envolvimento do TCR em conjunto com um segundo sinal mediado por um ou mais receptores coestimulatórios (por exemplo, CD28, CD2, 4-1BBL, etc.) que aumentam a resposta imune. No entanto, quando o TCR não está presente, a expansão de células T é gravemente reduzida quando estimulada usando reagentes padrão de ativação/estimulação, incluindo mAb anti-CD3 agonista. Na verdade, a expansão de células T é reduzida para apenas 20-40 % do nível normal de expansão quando estimulada usando reagentes padrão de ativação/estimulação, incluindo mAb anti-CD3 agonista.
[001764] A invenção fornece um receptor estimulador quimérico (CSR) para fornecer estimulação primária CD3zeta a células T alogênicas na ausência de um TCR endógeno (e, consequentemente, um CD3zeta endógeno) quando estimulado usando reagentes padrão de ativação/estimulação, incluindo mAb anti-CD3 agonista.
[001765] Na ausência de um TCR endógeno, os receptores estimuladores quiméricos (CSR) da invenção fornecem um estímulo de ativação CD3zeta para aumentar e expansão de células T alogênicas. Em outras palavras, na ausência de um TCR endógeno, os receptores estimuladores quiméricos (CSRs) da invenção resgatam a célula alogênica de uma desvantagem com base na ativação quando comparado com células T não alogênicas que expressam um TCR endógeno. Em algumas modalidades, os CSRs da invenção compreendem um epítopo de mAb agonista extracelularmente e um domínio estimulador de CD3zeta intracelularmente e, funcionalmente, convertem um evento de ligação anti-CD28 ou anti-CD2 na superfície em um evento de sinalização de CD3zeta em uma célula T alogênica modificada para expressar o CSR. Em algumas modalidades, um CSR compreende uma proteína CD28 ou CD2 de tipo selvagem e um domínio de estimulação intracelular de CD3zeta para produzir CD28z CSR e CD2z CSR, respectivamente. Em modalidades preferidas, o CD28z CSR e/ou CD2z CSR expressam ainda um receptor antigênico de ocorrência não natural e/ou uma proteína terapêutica. Em modalidades preferidas, o receptor antigênico de ocorrência não natural compreende um receptor antigênico quimérico.
[001766] Os dados fornecidos aqui demonstram que as células T alogênicas modificadas da invenção que compreendem/expressam um CSR da invenção melhoram ou resgatam a expansão de células T alogênicas que não expressam mais o TCR endógeno quando comparado com células que não compreendem/expressam um CSR da invenção. Silenciamento de TCR Endógeno
[001767] As composições para edição gênica da invenção incluindo, porém sem limitações, proteínas de fusão guiadas a RNA que compreendem dCas9-Clo051 podem ser usadas para direcionar e diminuir ou eliminar a expressão de um receptor de células T endógeno de uma célula alogênica da invenção. Em modalidades preferidas, as composições para edição gênica da invenção têm como alvo e eliminam um gene, uma parte de um gene ou um elemento regulador de um gene (tal como um promotor) que codifica um receptor de célula T endógeno de uma célula alogênica da invenção.
[001768] Exemplos não limitativos de iniciadores (incluindo um promotor T7, sequência genômica alvo e estrutura do gRNA) para a geração de modelos de RNA guia (gRNA) para direcionar e eliminar o TCR-alfa (TCR-α) são fornecidos na Tabela 10. Tabela 10. Sequências-alvo sublinhadas
[001769] Exemplos não limitativos de iniciadores para a geração de modelos de RNA guia (gRNA) para o direcionamento e eliminação de TCR-beta (TCR-β) são fornecidos na Tabela 11. Tabela 11. Sequências-alvo sublinhadas
[001770] Exemplos não limitativos de iniciadores para a geração de modelos de RNA guia (gRNA) para direcionar e eliminar a beta-2- microglobulina (2M) são fornecidos na Tabela 12. Tabela 12. Sequências-alvo sublinhadas Eliminação do MHC Endógeno
[001771] As composições para edição gênica da invenção incluindo, porém sem limitações, proteínas de fusão guiadas a RNA que compreendem dCas9-Clo051, podem ser usadas para direcionar e diminuir ou eliminar a expressão de um ativador endógeno do MHCI, MHCII ou MHC de uma célula alogênica da invenção. Em modalidades preferidas, as composições para edição gênica da invenção visam e eliminam um gene, uma porção de um gene ou um elemento regulador de um gene (tal como um promotor) que codifica um ou mais componentes de um ativador do MHCI, MHCII ou MHC endógeno de uma célula alogênica da invenção.
[001772] Exemplos não limitativos de RNA guia (gRNAs) para direcionar e eliminar ativadores de MHC são fornecidos nas Tabelas 13 e 14. Tabela 13. Tabela 14. Composições de HLA-E Manipuladas
[001773] O silenciamento do MHCI (KO) torna as células resistentes à morte pelas células T, mas também as torna suscetíveis à citotoxicidade mediada por células Naturais Assassinas (NK) (hipótese "Missing-self") (consulte a Figura 23). É teorizado que a rejeição de NK reduziria a eficácia e/ou persistência in vivo destas células KO em um cenário terapêutico, tal como terapia alogênica (alo) com CAR-T. A retenção de MHCI na superfície das células alo CAR-T as tornaria suscetíveis à morte pelas células T hospedeiras, conforme observado no experimento clássico de reação linfocitária mista (MLR). Estima-se que até 10 % das células T de uma pessoa sejam específicas para o MHC estranho, o que mediaria a rejeição de células e tecidos estranhos. Um KO alvo de MHCI, especificamente HLA-A, B e C, que pode ser alcançado pelo KO alvo de B2M, resulta em uma perda de moléculas adicionais de HLA, incluindo HLA-E. A perda de HLA-E, por exemplo, torna as células KO mais suscetíveis à citotoxicidade mediada por células NK em virtude da hipótese "Missing-self". A citotoxicidade mediada por NK contra células ausentes é um mecanismo de defesa contra patógenos que regulam o MHC na superfície das células infectadas para evitar a detecção e a morte pelas células do sistema imune adaptativo.
[001774] Duas estratégias são consideradas pela invenção para alo manipulação (MHCI-neg) de células T (incluindo células CAR-T) mais resistentes à citotoxicidade mediada por células NK. Em algumas modalidades, uma sequência que codifica uma molécula (tal como HLA- E com uma única cadeia) que reduz ou impede a morte de NK é introduzida ou distribuída a uma célula alogênica. Alternativamente, ou além disso, os métodos de edição gênica da invenção retêm determinadas moléculas HLA endógenas (tal como HLA-E endógena). Por exemplo, a primeira abordagem envolve a distribuição de piggyBac (PB) de uma molécula HLA-E com uma única cadeia (sc) a células T B2M KO.
[001775] A segunda abordagem usa uma composição para edição gênica com RNAs seletivos para HLA-A, HLA-B e HLA-C, mas não, por exemplo, HLA-E ou outras moléculas que são protetoras contra a citotoxicidade mediada por células destruidoras naturais para células MHCI KO.
[001776] Moléculas do HLA-E alternativas ou adicionais que são protetoras contra a citotoxicidade mediada por células NK incluem, porém sem limitações, interferon alfa/beta receptor 1 (IFNAR1), IFNAR1 humano, interferon alfa/beta 2 (IFNAR2), IFNAR2 humano, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, HLA-G7, molécula de adesão celular 1 relacionada a antígeno embrionário do carcinoma humano 1 (CEACAM1), hemaglutininas virais, CD48, LLT1 (também denominado como membro da família 2 do domínio da lectina de tipo C (CLC2D)), ULBP2, ULBP3 e sMICA ou uma variante das mesmas.
[001777] Uma proteína INFAR1 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizador, Extracelular, TM, citoplasmático):
MMVVLLGATTLVLVAVAPWVLSAAAGGK NLKSPQKVEVDIIDDNFILRWNRSDESVGNVT FSFDYQKTG M DNWIKLSGCQNITSTKCNFSSLKLNVYEEIKLRIRAEKENTSSWYEVDSF TPFRKAQIGPPEVHLEAEDKAIVIHISPGTKDSVMWALDGLSFTYSLVI WKNSSGVEERI ENIYSRHKIYKLSPETTYCLKVKAALLTSWKIGVYSPVHCIKTTVENEL PPPENIEVSVQ NQNYVLKWDYTYANMTFQVQWLHAFLKRNPGNHLYKWKQIPDCEN VKTTQCVFPQNVFQKGIYLLRVQASDGNNTSFWSEEIKFDTEIQAFLL PPVFNIRSLSDSFHIYIGAPKQSGNTP VIQDYPLIYEIIFWENTSNAERKIIEKKTDVTVPNLKPLTVYCVKARAHT MDEKLNKSSV FSDAVCEKTKPGNTSK IWLIVGICIALFALPFVIYAA KVFLRCINYVFFPSLKPSSSIDE YFSEQPLKNLLLSTSEEQIEKCFIIENISTIATVEETNQTDEDHKKYSSQ
TSQDSGNYSN EDESESKTSEELQQDFV (SEQ ID NO: 17017).
[001778] Uma proteína INFAR2 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizador, Extracelular, TM, citoplasmático):
MLLSQNAFIFRSLNLVLMVYISLVFG ISYDSPDYTDESCTFKISLRNFRSILSWELKNHS IVPTHYTLLYTIMSKPEDLKVVKNCANTTRSFCDLTDEWRSTHEAYVT VLEGFSGNTTLF SCSHNFWLAIDMSFEPPEFEIVGFTNHINVMVKFPSIVEEELQFDLSLV IEEQSEGIVKK HKPEIKGNMSGNFTYIIDKLIPNTNYCVSVYLEHSDEQAVIKSPLKCTL LPPGQESESAE SAK IGGIITVFLIALVLTSTIVTL KWIGYICLRNSLPKVLNFHNFLAWPFPNLPPLEAMD MVEVIYINRKKKVWDYNYDDESDSDTEAAPRTSGGGYTMHGLTVRP LGQASATSTESQLI DPESEEEPDLPEVDVELPTMPKDSPQQLELLSGPCERRKSPLQDPF PEEDYSSTEGSGGR ITFNVDLNSVFLRVLDDEDSDDLEAPLMLSSHLEEMVDPEDPDNVQS
NHLLASGEGTQPT FPSPSSEGLWSEDAPSDQSDTSESDVDLGDGYIMR (SEQ ID NO: 17018).
[001779] Uma proteína HLA-G1 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia alfa 1, cadeia alfa 2, cadeia alfa 3):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEP RAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA SSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAAD TAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVEL
VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRW KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD (SEQ ID NO: 17019).
[001780] Uma proteína HLA-G2 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia Alfa 1, cadeia Alfa 2, cadeia Alfa 3):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEP RAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVEL
VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRW KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD (SEQ ID NO: 17020).
[001781] Uma proteína HLA-G3 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia Alfa 1, cadeia Alfa 2, cadeia Alfa 3):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRM
EPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKS : 170.
[001782] Uma proteína HLA-G4 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia alfa 1, cadeia alfa 2, cadeia alfa 3):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEP RAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA SSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAAD
TAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA KQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD (SEQ ID NO: 17022).
[001783] Uma proteína HLA-G5 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia alfa 1, cadeia alfa 2, cadeia alfa 3, íntron 4):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEP RAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA SSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAAD TAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRA DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVEL
VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRW SKEGDGGI M SVRESRSLSEDL (SEQ ID NO: 17023).
[001784] Uma proteína HLA-G5 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia alfa 1, cadeia alfa 2, cadeia alfa 3, íntron 4):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEP RAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA DPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVEL
VETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRW SKEGDGGI M SVRESRSLSEDL (SEQ ID NO: 17024).
[001785] Uma proteína HLA-G5 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (cadeia alfa 1, cadeia alfa 2, cadeia alfa 3, íntron 2):
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWA GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRM
EPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEA SE (SEQ ID NO: 17025).
[001786] Uma proteína CEACAM1 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (Extracelular, TM, Citoplasmático):
MGHLSAPLHRVRVPWQGLLLTASLLTFWNPPTTA QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQ QLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASL LIQNVTQNDTGFY TLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAVAFTCE PETQDTTYLWWI NNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSD PVTLNVTYGPDTP TISPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPN ITVNNSGSYTCH ANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCS TNDTGISIRWF FKNQSLPSSERMKLSQGNTTLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQS DPIMLNVNYNALP QENGLSPG AIAGIVIGVVALVALIAVALACFL HFGKTGRASDQRDLTEHKPSVSNHTQDH
SNDPPNKMNEVTYSTLNFEAQQPTQPTSASPSLTATEIIYSEVKKQ (SEQ ID NO: 17026).
[001787] Uma proteína de hemaglutinina viral exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (HA para Vírus da Influenza A (A/NewCaledonia/20/1999 (H1N1); TM):
MKAKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNL LEDSHNGKLCL LKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCY PGYFADYEELRE QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWL TGKNGLYPNLSKS YVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRF TPEIAKRPKVRDQE GRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMD ECDAKCQTPQG AINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAI AGFIEGGWTGM VDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQF TAVGKEFNKLERRM ENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKS QLKNNAKEIGNGC FEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGV YQI LAIYSTVASSL
VLLVSLGAISFWM CSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 17027).
[001788] Uma proteína CD48 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizador, cadeia, peptídeo Pro removido na forma madura):
MCSRGWDSCLALELLLLPLSLLVTSI QGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLP ENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYIS KVQ KEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNC YL KLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTC
QVSN SVSSKNGTVCLSPPCTLARS FGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT (SEQ ID NO: 17028).
[001789] Uma proteína LLT1 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (Citoplásmico, TM, Extracelular):
MHDSNNVEKDITPSELPANPGCLHSKEHSIKATLIWRL FFLIMFLTIIVCGMVAALSAI R ANCHQEPSVCLQAACPESWIGFQRKCFYFSDDTKNWTSSQRFCDS
QDADLAQVESFQELNFLLRYKGPSDHWIGLSREQGQPWKWINGTE WTRQFPILGAGECAYLNDKGASSARHYTERKWICSKSDIHV (SEQ ID NO: 17029).
[001790] Uma proteína ULBP2 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (também conhecido como ligante NKG2D; número de Acesso Genbank AAQ89028):
[001791] 1 maaaaatkil lclpllllls gwsragradp hslcyditvi pkfrpgprwc avqgqvdekt
[001792] 61 flhydcgnkt vtpvsplgkk lnvttawkaq npvlrevvdi lteqlrdiql enytpkeplt
[001793] 121 lqarmsceqk aeghssgswq fsfdgqifll fdsekrmwtt vhpgarkmke kwendkvvam
[001794] 181 sfhyfsmgdc igwledflmg mdstlepsag aplamsstttt qlratattli lcclliilpc
[001795] 241 filpgi (SEQ ID NO: 17030).
[001796] Uma proteína ULBP3 exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (também conhecido como ligante NKG2D; número de Acesso Genbank NP_078794):
[001797] 1 maaaaspail prlailpyll fdwsgtgrad ahslwynfti ihlprhgqqw cevqsqvdqk
[001798] 61 nflsydcgsd kvlsmghlee qlyatdawgk qlemlrevgq rlrleladte ledftpsgpl
[001799] 121 tlqvrmscec eadgyirgsw qfsfdgrkfl lfdsnnrkwt vvhagarrmk ekwekdsglt
[001800] 181 tffkmvsmrd ckswlrdflm hrkkrlepta pptmapglaq pkaiattlsp wsfliilcfi
[001801] 241 lpgi (SEQ ID NO: 17031).
[001802] Uma proteína sMICA exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizador, porção do domínio extracelular, TM e domínio citoplasmático) (número de acesso Genbank Q29983):
[001803] 1 mglgpvflll agifpfappg aaa ephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
[001804] 61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqkegl hslqeirvce
[001805] 121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt l amnvrnflk edamktkthy
[001806] 181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrtvppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr
[001807] 241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh sthpvpsgkv
[001808] 301 lvlqshw qtf hvsavaaaai fviiifyvrc ckkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtsdhr
[001809] 361 datqlgfqpl msdlgstgst ega (SEQ ID NO: 17032).
[001810] Uma proteína sMICA exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (Alfa-1, Alfa- 2, Alfa-3):
[001811] 1 mglgpvflll agifpfappg aaaephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
[001812] 61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqke gl hslqeirvce
[001813] 121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt lamnvrnflk edamktkthy
[001814] 181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrt vppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr
[001815] 241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh st hpvpsgk v
[001816] 301 lvlqshwqtf hvsavaaaai fviiifyvr c c kkktsaaeg pelvslqvld qhpvgtsdhr
[001817] 361 datqlgfqpl msdlgstgst ega (SEQ ID NO: 17033).
[001818] Uma proteína sMICA exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizador; Alfa-1, Alfa-2, Alfa-3):
[001819] MGGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM ephslry nltvlswdgs vqsgfltevh ldgqpflrcd
[001820] 61 rqkcrakpqg qwaedvlgnk twdretrdlt gngkdlrmtl ahikdqke gl hslqeirvce
[001821] 121 ihednstrss qhfyydgelf lsqnletkew tmpqssraqt l thy
[001822] 181 hamhadclqe lrrylksgvv lrrt vppmvn vtrseasegn itvtcrasgf ypwnitlswr
[001823] 241 qdgvslshdt qqwgdvlpdg ngtyqtwvat ricqgeeqrf tcymehsgnh sthpvpsgkv
[001824] 301 lvlqshw (SEQ ID NO: 17034).
[001825] Uma proteína sMICA exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de (peptídeo sinalizadores):
MGGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQ GQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKLDLRMTLAHIKLDQKEGLHSL QEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYNGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQT LTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVDVTRSEASEGNITV
TCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWV ATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHW (SEQ ID NO: 17035).
[001826] Uma proteína bGBE trimérica (270G e 484S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
MSRSVALAVLALLSLSGLEAVMAPRTLILGGGGSGGGGSGGGGSIQ RTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDR DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPR FISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRS ARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD L RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATL RCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAA
VVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLL GSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSY S KAEWSDSAQGSESHSL * (SEQ ID NO: 16972).
[001827] Uma proteína bGBE trimérica (270G e 484S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de: g c caaggcagagtggagcgactccgcccagggctctgagagccactccctgtga (SEQ ID NO: 16973).
[001828] Uma proteína bGBE trimérica (270R e 484S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
MSRSVALAVLALLSLSGLEAVMAPRTLILGGGGSGGGGSGGGGSIQ RTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVE HSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDR DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPR FISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRS ARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD R RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATL RCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAA
VVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLL GSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSY S KAEWSDSAQGSESHSL * (SEQ ID NO: 16974).
[001829] Uma proteína bGBE trimérica (270R e 484S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de: c c caaggcagagtggagcgactccgcccagggctctgagagccactccctgtga (SEQ ID NO: 16975).
[001830] Uma proteína gBE dimérica (R e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVS GFHPSDIEV DLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNH VTLSQPKIVKWDR DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPR FISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRS ARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD R RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATL RCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAA VVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLL
GSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSY S KAEWSDSAQGSESHSL (SEQ ID NO: 16976).
[001831] Uma proteína gBE dimérica (R e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de:
CGG TTCCTGAGAGGCTATGAGCAGTTCGCCTACGACGGCAAGGACTAC CTGACAC TCT
AAGGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACAG CC TGT AGATAA (SEQ ID NO: 16977).
[001832] Uma proteína gBE dimérica (G e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
DLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNH VTLSQPKIVKWDR DMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSLKYFHTSVSRPGRGEPR FISVGYVDDTQFVRFDNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRS ARDTAQIFRVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD G RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATL RCWALGFYPAEITLTWQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAA VVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLL
GSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKGGSY S KAEWSDSAQGSESHSL (SEQ ID NO: 16978)
[001833] Uma proteína gBE dimérica (G e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
CAG TCT
AAGGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACAG CC TGT AGATAA (SEQ ID NO: 16979)
[001834] Uma proteína monomérica WT HLA-E (R e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de:
[001835] MSRSVALAVLALLSLSGLEAGSHSLKYFHTSVSRPGRGEP
RFISVGYVDDTQFVRF
[001836] DNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIF
RVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQWMHGCELGPD R RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQRAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISDHEATL RCWALGFYPAEITLT
[001837] WQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEE
QRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKPASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAV VAAVIWRKKSSGGKGGSY S KAEWSDSAQGSESHSL (SEQ ID NO: 16980)
[001838] Uma proteína monomérica WT HLA-E (R e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de:
[001839] ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCT
GTCTCTGTCTGGACTGGAAGCCGGCAGCCACAGCCTGAAGTACTT TCACACCAGCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCA TCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGAC AACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGAT GGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGACAGAGAGACAAGAAGCG CCAGAGACACAGCCCAGATCTTCAGAGTGAACCTGCGGACCCTG CGGGGCTACTACAATCAGTCTGAAGCCGGCTCTCACACCCTGCA GTGGATGCACGGATGTGAACTGGGCCCCGAC AGA TCC AAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTC
TCTGTAGATAA (SEQ ID NO: 16981).
[001840] Uma proteína monomérica WT HLA-E (G e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de:
[001841] MSRSVALAVLALLSLSGLEAGSHSLKYFHTSVSRPGRGEP
RFISVGYVDDTQFVRF
[001842] DNDAASPRMVPRAPWMEQEGSEYWDRETRSARDTAQIF
RVNLRTLRGYYNQSEAGSHTLQ
[001843] WMHGCELGPD G
RFLRGYEQFAYDGKDYLTLNEDLRSWTAVDTAAQISEQKSNDASEAE HQ
[001844] RAYLEDTCVEWLHKYLEKGKETLLHLEPPKTHVTHHPISD
HEATLRCWALGFYPAEITLT
[001845] WQQDGEGHTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEE
QRYTCHVQHEGLPEPVTLRWKP
[001846] ASQPTIPIVGIIAGLVLLGSVVSGAVVAAVIWRKKSSGGKG
GSY S KAEWSDSAQGSESHS
[001847] L (SEQ ID NO: 16982).
[001848] Uma proteína monomérica WT HLA-E (G e S) exemplificativa da invenção compreende ou consiste na sequência de ácidos nucleicos de:
[001849] ATGAGCAGATCTGTGGCCCTGGCTGTTCTGGCTCTGCT
GTCTCTGTCTGGACTGGAAGCCGGCAGCCACAGCCTGAAGTACTT TCACACCAGCGTGTCCAGACCTGGCAGAGGCGAGCCTAGATTCA TCAGCGTGGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTCAGATTCGAC AACGACGCCGCCTCTCCTCGGATGGTTCCTAGAGCACCCTGGAT GGAACAAGAGGGCAGCGAGTACTGGGACAGAGAGACAAGAAGCG CCAGAGACACAGCCCAGATCTTCAGAGTGAACCTGCGGACCCTG CGGGGCTACTACAATCAGTCTGAAGCCGGCTCTCACACCCTGCA GTGGATGCACGGATGTGAACTGGGCCCCGAC GGA TCC
AAAGCCGAGTGGAGCGATTCTGCCCAGGGCTCTGAAAGCCACTC TCTGTAGATAA (SEQ ID NO: 16983). Vetores e Células Hospedeiras
[001850] A invenção também se refere a vetores que incluem moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção, células hospedeiras que são geneticamente modificadas com os vetores recombinantes e à produção de pelo menos uma VHH ou VCAR por meio de técnicas recombinantes, conforme é bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook, et al., Supra; Ausubel, et al., Supra, cada um aqui inteiramente incorporado por referência.
[001851] Por exemplo, o vetor PB-EF1a pode ser usado. O vetor compreende a seguinte sequência de nucleotídeos: tgtacatagattaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaa ttgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatt tacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaa aaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttatcgaatacctgcagcccgggggatgcag agggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggca gcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcag cgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcg ctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaagttgactgtgcctttcgatcgaa ccatggacagttagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatg gaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacat cgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaagg tggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtggggga gaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacac aggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttga attacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggaga gttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctg gggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagcc atttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaag atctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgc acatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctca agctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaa ggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcag ggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaa ggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtcc aggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcg atggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattct ccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagttttttt cttccatttcaggtgtcgtgagaattctaatacgactcactatagggtgtgctgtctcatcattttggca aagattggccaccaagcttgtcctgcaggagggtcgacgcctctagacgggcggccgctccgg atccacgggtaccgatcacatatgcctttaattaaacactagttctatagtgtcacctaaattcccttta gtgagggttaatggccgtaggccgccagaattgggtccagacatgataagatacattgatgagttt ggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgcttt atttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggtt cagggggaggtgtgggaggttttttcggactctaggacctgcgcatgcgcttggcgtaatcatggtc atagctgtttcctgttttccccgtatccccccaggtgtctgcaggctcaaagagcagcgagaagcgt tcagaggaaagcgatcccgtgccaccttccccgtgcccgggctgtccccgcacgctgccggctc ggggatgcggggggagcgccggaccggagcggagccccgggcggctcgctgctgcccccta gcgggggagggacgtaattacatccctgggggctttgggggggggctgtccctctcaccgcggt ggagctccagcttttgttcgaattggggccccccctcgagggtatcgatgatatctataacaagaa aatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaa atcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatc agtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcct aaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtc aattttacgcagactatctttctagggttaatctagctagccttaagggcgcctattgcgttgcgctcac tgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgggg agaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcgg ctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagacccc gtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaa ctggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccactt caagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagt ggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtc gggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactga gatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacag gtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaac gcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca ggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgg ccttttgctcacatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtttta aatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagtcagaagaactcgtcaagaaggcga tagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcag cccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccg ccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcgg caagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctg gcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagacc ggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagcc ggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaag gtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcc cgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgata gccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaacc gggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgccc agtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttca atcataatattattgaagcatttatcagggttcgtctcgtcccggtctcctcccaatgcatgtcaatattg gccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgt atctatatcataata (SEQ ID NO: 17502)
[001852] Os polinucleotídeos podem, opcionalmente, ser ligados a um vetor que contém um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Em geral, um vetor de plasmídeo é introduzido em um precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídio carregado. Se o vetor for um vírus, ele pode ser empacotado in vitro usando uma linhagem de células de empacotamento apropriada e depois transduzido para células hospedeiras.
[001853] O DNA de inserção deve ser operativamente ligado a um promotor apropriado. As construções de expressão conterão ainda sítios para início, término de transcrição e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossomo para tradução. A porção de codificação dos transcritos maduros expressos pelas construções incluirá, de preferência, um códon de início de tradução e um códon de término (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) adequadamente posicionado no final do mRNA a ser traduzido, com UAA e UAG preferidos para expressão em células de mamíferos ou eucariotas.
[001854] Os vetores de expressão incluem, de preferência, mas opcionalmente, pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, porém sem limitações, ampicilina, zeocina (gene Sh bla), puromicina (gene pac), higromicina B (gene hygB), G418/Geneticina (gene neo), ácido micofenólico ou glutamina sintetase (GS, Patentes Norte-americanas Nos 5.122.464; 5.770.359;
5.827.739), blasticidina (gene bsd), genes de resistência à cultura de células eucariotas, bem como ampicilina, zeocina (gene Sh bla), puromicina (gene pac), higromicina B (gene hygB), G418/Geneticina (gene neo), canamicina, espectinomicina, estreptomicina, carbenicilina, bleomicina, eritromicina, polimixina B ou genes de resistência à tetraciclina para cultura em E. coli e outras bactérias ou procariotas (as patentes acima são inteiramente incorporadas aqui por referência). Meios de cultura apropriados e as condições para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos na técnica. Vetores adequados serão facilmente evidentes para aqueles versados na técnica. A introdução de uma construção de vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada por meio de transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção catiônica mediada por lipídios, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tais como Sambrook, supra, capítulos 1-4 e 16-18; Ausubel, supra, capítulos 1, 9, 13, 15, 16.
[001855] Os vetores de expressão incluem, de preferência, mas opcionalmente, pelo menos um marcador na superfície celular selecionável para o isolamento de células modificadas das composições e métodos da invenção. Marcadores na superfície celular selecionáveis da invenção compreendem proteínas na superfície, glicoproteínas ou grupo de proteínas que distinguem uma célula ou subconjunto de células de outro subconjunto definido de células. De preferência, o marcador na superfície celular selecionável distingue as células modificadas por uma composição ou método da invenção daquelas células que não são modificadas por uma composição ou método da invenção. Estes marcadores na superfície celular incluem, por exemplo, porém sem limitações, proteínas de "agrupamento de designação" ou "determinantes da classificação" (frequentemente abreviadas como "CD"), tal como uma forma truncada ou de comprimento total de CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52 ou qualquer combinação dos mesmos. Os marcadores na superfície celular incluem ainda o marcador do gene suicida RQR8 (Philip B. et al., Blood. 21 de agosto de 2014; 124 (8): 1277-87).
[001856] Os vetores de expressão incluirão, de preferência, mas opcionalmente, pelo menos um marcador de resistência a fármaco selecionável para isolamento de células modificadas das composições e métodos da invenção. Marcadores de resistência a fármaco selecionáveis da invenção podem compreender Neo de tipo selvagem ou mutante, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2 ou qualquer combinação dos mesmos.
[001857] Pelo menos uma VHH ou VCAR da invenção pode ser expresso em uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não apenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao N-término de uma VHH ou VCAR para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira durante a purificação ou durante subsequentes manuseio e armazenamento. Além disso, porções peptídicas podem ser adicionadas a uma VHH ou VCAR da invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final de uma VHH ou VCAR ou pelo menos um fragmento do mesmo. Tais métodos são descritos em muitos manuais padrão de laboratório, tais como Sambrook, supra, capítulos 17.29-
17.42 e 18.1-18.74; Ausubel, supra, capítulos 16, 17 e 18.
[001858] Aqueles versados na técnica são conhecedores dos inúmeros sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína da invenção. Alternativamente, os ácidos nucleicos da invenção podem ser expressos em uma célula hospedeira ao ativar (por meio de manipulação) em uma célula hospedeira que contém DNA endógeno que codifica uma VHH ou VCAR da invenção. Tais métodos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito nas Patentes Norte-americanas Nos
5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761, inteiramente incorporadas aqui por referência.
[001859] Ilustrativo de culturas celulares úteis para a produção de VHH ou VCARs, porções ou variantes especificadas dos mesmos, são células bacterianas, leveduras e de mamífero, conforme conhecido na técnica. Os sistemas de células de mamíferos geralmente estarão na forma de monocamadas de células, embora também possam ser usadas suspensões de células de mamíferos ou biorreatores. Várias linhagens de células hospedeiras adequadas, capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas, foram desenvolvidas na técnica e incluem COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e linhagens de células BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0 -Ag14, 293 células, células HeLa e assim por diante, as quais estão prontamente disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection, Manassas, Va. (Www.atcc.org). As células hospedeiras preferidas incluem células de origem linfoide, tais como células de mieloma e linfoma. Células hospedeiras particularmente preferidas são as células P3X63Ag8.653 (número de acesso ATCC CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (número de acesso ATCC CRL-1851). Em uma modalidade particularmente preferida, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou SP2/0-Ag14.
[001860] Os vetores de expressão para estas células podem incluir uma ou mais das seguintes sequências de controle de expressão tais como, porém sem limitações, uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, promotores tardios ou precoces de SV40, o promotor CMV (Patentes Norte-americanas Nos 5.116.062; 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (fosfoglicerato quinase), um promotor alfa EF-1 (Patente Norte-americana N° 5.266.491), pelo menos um promotor humano; um intensificador e/ou sítios de informação de processamento, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de emenda ao RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição de T Ag poli A grande de SV40) e sequências terminadoras de transcrição. Consulte, por exemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection Catalog Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outras fontes conhecidas ou comerciais.
[001861] Quando células hospedeiras eucariotas são empregadas, sequências de poliadenilação ou término de transcrição são, tipicamente, incorporadas ao vetor. Um exemplo de uma sequência terminadora é a sequência de poliadenilação do gene do hormônio do crescimento bovino. Também podem ser incluídas sequências para emenda (splicing) precisa da transcrição. Um exemplo de uma sequência de emenda é o íntron VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Além disso, sequências gênicas para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, conforme conhecido na técnica. Purificação de uma VH, VHH ou VCAR
[001862] Uma proteína VHH ou VCAR pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes através de métodos bem conhecidos incluindo, dentre outros, purificação de proteína A, precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de alta eficiência ("HPLC") também pode ser empregada para purificação. Consulte, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), por exemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um inteiramente incorporado aqui por referência.
[001863] VHs, VHHs e/ou VCARs da invenção incluem produtos purificados, produtos de procedimentos químicos sintéticos e produtos produzidos por meio de técnicas recombinantes de um hospedeiro procariota ou eucariota incluindo, por exemplo, E. coli, levedura, planta superior, células de insetos e mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o VCAR da invenção pode ser glicosilado ou pode não ser glicosilado. Tais métodos são descritos em muitos manuais padrão de laboratório, tais como Sambrook, supra, Seções 17.37-17.42; Ausubel, supra, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, Colligan, Protein Science, supra, capítulos 12- 14, todos inteiramente incorporados aqui por referência. Códigos de Aminoácidos
[001864] Os aminoácidos que compõem os VCARs da invenção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácidos podem ser indicadas ao designar o aminoácido por seu código de letra único, seu código de três letras, nome ou três códons de nucleotídeo, conforme é bem entendido na técnica (consulte Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Terceira Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Um VCAR da invenção pode incluir uma ou mais substituições, eliminações ou adições de aminoácidos, mutações espontâneas e/ou manipulação humana, conforme especificado aqui. Os aminoácidos em um VCAR da invenção que são essenciais para a função podem ser identificados por meio de métodos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada ao local ou mutagênese por varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supra, capítulos 8, 15; Cunningham e Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). O último procedimento introduz mutações únicas de alanina em cada resíduo da molécula. As moléculas mutantes resultantes são, então, testadas quanto à atividade biológica tal como, porém sem limitações, pelo menos uma atividade neutralizante. Os locais críticos para a ligação ao VCAR também podem ser identificados através de análise estrutural, tal como cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por fotoafinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) e de Vos, et al., Science 255: 306-312 (1992)).
[001865] Conforme aqueles versados na técnica compreenderão, a invenção inclui pelo menos um VCAR biologicamente ativo da invenção. VCARs biologicamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20 %, 30 % ou 40 % e, de preferência, pelo menos 50 %, 60 % ou 70 % e, mais preferivelmente, pelo menos 80 %, 90 % ou 95 % -99 % ou mais da atividade específica do VCAR nativo (não sintético), endógeno ou relacionado e conhecido. Métodos de ensaio e quantificação de medidas da atividade enzimática e especificidade do substrato são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[001866] Em outro aspecto, a invenção se refere a proteínas e fragmentos de VHH, conforme descrito aqui, que são modificados pela ligação covalente de uma porção orgânica. Esta modificação pode produzir um fragmento de VCAR com propriedades farmacocinéticas aprimoradas (por exemplo, meia-vida sérica aumentada in vivo). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, grupo ácido graxo ou grupo éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidrofílico pode ter um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 dáltons e pode ser um polialcanano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidratos, polímero de aminoácidos ou polivinilpirolidona, e o grupo ácido graxo ou éster de ácido graxo pode compreender a partir de cerca de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.
[001867] As proteínas VHHs modificadas e fragmentos da invenção podem compreender um ou mais radicais orgânicos que estão ligados de forma covalente, direta ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porção orgânica que está ligada a uma proteína VHH ou fragmento da invenção pode ser independentemente um grupo polimérico hidrofílico, um grupo ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Conforme usado aqui, o termo "ácido graxo" abrange ácidos mono-carboxílicos e ácidos di-
carboxílicos. Um "grupo polimérico hidrofílico", conforme o termo é usado aqui, se refere a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, a polilisina é mais solúvel em água do que em octano. Assim, uma proteína VHH modificada pela ligação covalente da polilisina é abrangida pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para modificar os VCARs da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcananos glicóis (por exemplo, PEG, monometoxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e assim por diante), carboidratos (por exemplo, dextrana, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e assim por diante), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e assim por diante), óxidos de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e assim por diante) e polivinilpirolidona. De preferência, o polímero hidrofílico que modifica o VCAR da invenção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de
150.000 dáltons como uma entidade molecular separada. Por exemplo, PEG5000 e PEG 20.000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em dáltons, pode ser usado. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos alquila, ácidos graxos ou éster de ácidos graxos. Polímeros hidrofílicos que são substituídos por um grupo de ácidos graxos ou éster de ácidos graxos podem ser preparados empregando métodos adequados. Por exemplo, um polímero que compreende um grupo amina pode ser acoplado a um carboxilato do éster de ácido graxo ou ácido graxo e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com N, N-carbonil diimidazol) em um éster de ácido graxo ou ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.
[001868] Os ácidos graxos e ésteres de ácidos graxos adequados para modificar as proteínas VHH da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Ácidos graxos que são adequados para modificar VCARs da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato)), n-docosanoato (C22, beenato), n-triacontanoato (C30), n- tetraoctanoato (C40), cis-Δ9-octadecanoato (C18, oleato), all cis- Δ5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico e assim por diante. Ésteres de ácidos graxos adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificado. O grupo alquila inferior pode compreender a partir de um a cerca de doze, de preferência um a cerca de seis, átomos de carbono.
[001869] As proteínas VHH modificadas e fragmentos podem ser preparados usando métodos adequados, tal como reação com um ou mais agentes modificadores. Um "agente modificador", conforme o termo é usado aqui, se refere a um grupo orgânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo ativador. Um "grupo ativador" é uma porção química ou grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico, deste modo, formando uma ligação covalente entre o agente modificador e o segundo grupo químico. Por exemplo, grupos de ativação reativos a amina incluem grupos eletrofílicos, tais como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), ésteres de N-hidroxissuccinimidila (NHS) e assim por diante. Grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodoacetila, acrilolila, dissulfetos de piridila, tiol de ácido 5-tiol-2- nitrobenzoico (TNB-tiol) e assim por diante. Um grupo funcional aldeído pode ser acoplado a moléculas que contêm amina ou hidrazida, e um grupo azida pode reagir com um grupo fosforoso trivalente para formar ligações de fosforamidato ou fosforimida. Métodos adequados para introduzir grupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Califórnia (1996)). Um grupo ativador pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo) ou através de uma porção ligante, por exemplo, um grupo C1-C12 divalente em que um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo, tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções ligantes adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, —(CH2)3—, —NH—(CH2)6— NH—, —(CH2)2—NH— e —CH2—O—CH2—CH2—O—CH2—CH2— O—CH—NH—. Os agentes modificadores que compreendem uma porção ligante podem ser produzidos, por exemplo, por meio de reação de uma mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc- etilenodiamina, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diamino-hexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar uma ligação de amida entre a amina livre e o carboxilato do ácido graxo. O grupo de proteção Boc pode ser removido do produto através de tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato, conforme descrito, ou pode ser reagida com anidrido maleico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado ativo de maleimida do ácido graxo. (Consulte, por exemplo, Thompson et al., documento WO 92/16221, cujos ensinamentos completos são aqui incorporados por referência).
[001870] As proteínas VHHs modificadas e fragmentos da invenção podem ser produzidos por meio de reação de uma proteína VHH ou fragmento com um agente de modificação. Por exemplo, porções orgânicas podem ser ligadas à proteína VHH de uma maneira não específica para local empregando um agente modificador reativo a amina, por exemplo, um éster NHS de PEG. As proteínas VHHs modificadas e fragmentos que compreendem uma porção orgânica que está ligada a locais específicos de uma proteína VHH da invenção podem ser preparadas usando métodos adequados, tal como proteólise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3: 147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10): 2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24 (1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4): 456-463 (1997)) e os métodos descritos em Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Califórnia (1996). Composições de Proteínas VHs ou VHH Que Compreendem Outros Ingredientes Terapeuticamente Ativos
[001871] Os compostos, composições ou combinações de proteína VHH ou VCAR ou da presente invenção podem compreender ainda pelo menos um dentre qualquer auxiliar adequado tal como, porém sem limitações, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similar. Auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferidos. Exemplos não limitativos e métodos de preparação de tais soluções estéreis são bem conhecidos na técnica tais como, porém sem limitações, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser rotineiramente selecionados, os quais são adequados para o modo de administração, solubilidade e/ou estabilidade da composição de proteína VHH ou VCAR, fragmento ou variante, bem conhecidos na técnica ou conforme descrito aqui.
[001872] Excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente composição incluem, porém sem limitações, proteínas, peptídeos, amino ácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados, tais como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e assim por diante; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), os quais podem estar presentes isoladamente ou em combinação e compreendem, isoladamente ou em combinação, 1-99,99 % em peso ou volume. Excipientes proteicos exemplificativos incluem albumina sérica, tal como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e assim por diante. Componentes representativos de aminoácidos/proteínas, os quais também podem funcionar em uma capacidade de tamponamento, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e assim por diante. Um aminoácido preferido é glicina.
[001873] Excipientes de carboidratos adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e assim por diante; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose e assim por diante; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranas, amidos e assim por diante; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e assim por diante. Os excipientes de carboidratos preferidos para uso na presente invenção são manitol, trealose e rafinose.
[001874] As composições de proteína VH, VHH ou VCAR também podem incluir um tampão ou um agente para ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de um ácido ou base orgânica. Os tampões representativos incluem sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Os tampões preferidos para uso nas presentes composições são sais de ácidos orgânicos, tal como citrato.
[001875] Além disso, as composições de proteína VH, proteína VHH ou VCAR da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, como polivinilpirrolidonas, ficóis (açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoativos (por exemplo, polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol) e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).
[001876] Estes e outros excipientes e/ou aditivos adequados para uso em composições de proteína VH farmacêuticas conhecidas, composições de proteína VHH. VCAR, parte ou variante de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme listado em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19ª ed., Williams & Williams, (1995) e "Physician's Desk Reference", 52ª ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), cujas descrições são inteiramente incorporadas aqui por referência. Materiais carreadores ou excipientes preferidos são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Uma molécula carreadora exemplificativa é o mucopolissacarídeo ácido hialurônico, o qual pode ser útil para distribuição intra-articular. Isolamento de Células T de um Produto de Leucaferese
[001877] Um produto de leucaferese ou sangue pode ser coletado de um indivíduo no local clínico usando um sistema fechado e métodos padrão (por exemplo, um COBE Spectra Apheresis System). De preferência, o produto é coletado de acordo com procedimentos hospitalares ou institucionais padrão de leucaferese em sacos de coleta padrão para leucaferese. Por exemplo, em modalidades preferidas dos métodos da invenção, nenhum anticoagulante ou aditivo sanguíneo adicional (heparina, etc.) são incluídos além daqueles normalmente usados durante a leucaferese.
[001878] Alternativamente, os glóbulos brancos (WBCs)/células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) (usando Biosafe Sepax 2 (fechado/automatizado)) ou células T (usando o CliniMACS Prodigy (fechado/automatizado)) podem ser isolados diretamente do sangue total. No entanto, em determinados indivíduos (por exemplo, aqueles diagnosticados e/ou tratados para câncer), o rendimento de leucócitos/PBMCs pode ser significativamente menor quando isolados a partir de sangue total do que isolados por leucaferese.
[001879] O procedimento de leucaferese e/ou o procedimento de isolamento direto de células podem ser usados para qualquer indivíduo da invenção.
[001880] O produto de leucaferese, sangue, composição de leucócitos/PBMCs e/ou composição de células T devem ser embalados em recipientes isolados e devem ser mantidos em temperatura ambiente controlada (+ 19 °C a + 25 °C) de acordo com os procedimentos institucionais e hospitalares padrão de coleta de sangue aprovados para uso com o protocolo clínico. O produto de leucaferese, sangue, composição de leucócitos/PBMC e/ou composição de células T não devem ser refrigerados.
[001881] A concentração de células do produto de leucaferese, sangue, WBC/CMSP composição e/ou composição de células T não deve exceder 0,2x109 células por ml durante o transporte. Deve-se evitar a mistura intensa do produto de leucaferese, sangue, composição de leucócitos/PBMC e/ou composição de células T.
[001882] Se o produto de leucaferese, sangue, WBC/CMSP composição e/ou composição de células T tem de ser armazenado, por exemplo, durante a noite, ele deve ser mantido em temperatura ambiente controlada (a mesma conforme acima). Durante o armazenamento, a concentração do produto de leucaferese, sangue,
composição de leucócitos/PBMC e/ou composição de células T nunca deve exceder 0,2x109 células por mL.
[001883] De preferência, as células do produto de leucaferese, sangue, WBC/CMSP composição e/ou composição de células T deve ser armazenado em plasma autólogo. Em determinadas modalidades, se a concentração de células do produto de leucaferese, sangue, composição de WBC/PBMC e/ou composição de células T for maior do que 0,2 x 109 células por mL, o produto deve ser diluído com plasma autólogo.
[001884] De preferência, o produto de leucaferese, sangue, composição de leucócitos/PBMC e/ou composição de células T não deve ter mais de 24 horas ao iniciar o procedimento de marcação e separação. O produto de leucaferese, sangue, composição de leucócitos/PBMC e/ou composição de células T podem ser processados e/ou preparados para marcação celular usando um sistema fechado e/ou automatizado (por exemplo, CliniMACS Prodigy).
[001885] Um sistema automatizado pode executar isolamento adicional da camada leucocitária, possivelmente através de ficolação e/ou lavagem do produto celular (por exemplo, o produto de leucaferese, sangue, composição de WBC/PBMC e/ou composição de células T).
[001886] Um sistema fechado e/ou automatizado pode ser usado para preparar e marcar células para o isolamento de células T (a partir, por exemplo, do produto de leucaferese, sangue, composição WBC/PBMC e/ou composição de células T).
[001887] Embora WBC/PBMCs possam ser diretamente afetadas pela nucleofecção (o que é mais fácil e poupa etapas adicionais), os métodos da invenção podem incluir primeiro isolamento de células T antes de nucleofecção. A estratégia mais fácil para atingir diretamente PBMCs requer a expansão seletiva de células VCAR+ que é mediada por meio de sinalização ao VCAR a qual, por si só, provou ser um método de expansão inferior que reduz diretamente a eficiência in vivo do produto, tornando as células T funcionalmente esgotadas. O produto pode ser uma composição heterogênea de células VCAR+, incluindo células T, células NK, células NKT, monócitos ou qualquer combinação dos mesmos, o que aumenta a variabilidade do produto de paciente para paciente e dificulta a distribuição e administração de CRS. Uma vez que se acredita que as células T são os efetores primários na supressão e morte de tumores, o isolamento das células T para a fabricação de um produto autólogo pode resultar em benefícios significativos em relação a uma outra composição mais heterogênea.
[001888] As células T podem ser isoladas diretamente, através de um enriquecimento de células marcadas ou depleção de células marcadas em um procedimento de marcação ou de uma maneira indireta em um processo de marcação em duas etapas. De acordo com determinadas estratégias de enriquecimento da invenção, as células T podem ser coletadas em um saco de coleta de células e as células não marcadas (células não alvo) em um saco de coleta de frações negativas. Em contraste com uma estratégia de enriquecimento da invenção, as células não marcadas (células alvo) são coletadas em um saco de coleta de células e as células marcadas (células não alvo) são coletadas em um saco de coleta de fração negativa ou saco de coleta de células não alvo, respectivamente. Os reagentes de seleção podem incluir, porém sem limitações, esferas revestidas com anticorpo. As esferas revestidas de anticorpo podem ser removidas antes de uma modificação e/ou uma etapa de expansão ou retidas nas células antes de uma etapa de modificação e/ou expansão. Um ou mais dos seguintes exemplos não limitativos de marcadores celulares podem ser usados para isolar células T: CD3, CD4, CD8, CD25, antibiotina, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-gama, TCR alfa/beta e/ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos para o isolamento de células T podem incluir um ou mais reagentes que se ligam especificamente e/ou marcam de forma detectável um ou mais dos seguintes exemplos não limitativos de marcadores celulares que podem ser usados para isolar células T: CD3, CD4, CD8, CD25, antibiotina, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-gama, TCR alfa/beta e/ou qualquer outra combinação dos mesmos. Estes reagentes podem ou não ser de tipo "Boas Práticas de Fabricação" ("GMP"). Os reagentes podem incluir, porém sem limitações, produtos Thermo DynaBeads e Miltenyi CliniMACS. Os métodos de isolamento de células T da invenção podem incluir diversas iterações de etapas de marcação e/ou isolamento. Em qualquer ponto dos métodos de isolamento de células T da invenção, células indesejadas e/ou tipos de células indesejados podem ser eliminados de uma composição de produto de células T da invenção ao selecionar positiva ou negativamente as células indesejadas e/ou tipos de células indesejados. A composição do produto de células T da invenção pode conter tipos de células adicionais que podem expressar CD4, CD8 e/ou outro(s) marcador(es) de células T.
[001889] Métodos da invenção para nucleofecção de células T podem eliminar a etapa de isolamento de células T, por exemplo, através de um processo para nucleofecção de células T em uma população ou composição de WBC/PBMCs que, após a nucleofecção, inclui uma etapa de isolamento ou uma etapa de expansão seletiva via sinalização ao TCR.
[001890] Determinadas populações de células podem ser esgotadas por meio de seleção positiva ou negativa, antes ou após o enriquecimento de células T e/ou classificação. Exemplos de composições de células que podem ser esgotadas de uma composição de produto celular podem incluir células mieloides, células T reguladoras
CD25+ (T Regs), células dendríticas, macrófagos, glóbulos vermelhos, mastócitos, células T gama-delta, células Naturais Assassinas (NK), uma célula de tipo Natural Assassina (NK) (por exemplo, uma célula Natural Assassina induzida por citocinas (CIK)), células T Natural Assassina induzidas (iNK), células T NK, células B ou qualquer combinação das mesmas.
[001891] As composições de produtos de células T da invenção podem incluir células T CD4+ e células T CD8+. As células T CD4+ e CD8+ podem ser isoladas em sacos de coleta separados durante um procedimento de isolamento ou seleção. As células T CD4+ e as células T CD8+ podem ser posteriormente tratadas separadamente ou tratadas após reconstituição (combinação na mesma composição) em uma proporção específica.
[001892] A proporção específica na qual células T CD4+ e células T CD8+ podem ser reconstituídas pode depender de tipo e eficácia da tecnologia de expansão usada, meio celular e/ou condições de crescimento usadas para expansão das composições de produtos de células T. Exemplos de possíveis proporções de CD4+ : CD8+ incluem, porém sem limitações, 50 % : 50 %, 60 % : 40 %, 40 % : 60 % 75 % : 25 % e 25 % : 75 %.
[001893] As células T CD8+ apresentam uma capacidade potente de matar células tumorais, enquanto que as células T CD4+ fornecem muitas das citocinas necessária para suportar capacidade proliferativa e função de células T CD8+. Uma vez que as células T isoladas de doadores normais são predominantemente CD4+, as composições de produtos de células T são artificialmente ajustadas in vitro em relação à proporção de CD4+ : CD8+ para melhorar a proporção de células T CD4+ para células T CD8+ as quais, de outra forma, estariam presentes in vivo. Uma proporção otimizada também pode ser usada para a expansão ex vivo da composição do produto de células T autólogas. Em vista da proporção de CD4+ : CD8+ ajustada artificialmente da composição do produto de células T, é importante observar que as composições de produtos da invenção podem ser significativamente diferentes e conferir vantagens significativamente maiores do que qualquer população de células T de ocorrência endógena.
[001894] Os métodos preferidos para o isolamento de células T podem incluir uma estratégia de seleção negativa para produzir células T pan intocadas, o que significa que a composição resultante de células T inclui células T que não foram manipuladas e que contêm uma variedade/proporção de ocorrência de células T endógenas.
[001895] Os reagentes que podem ser usados para seleção positiva ou negativa incluem, porém sem limitações, esferas de separação de células magnéticas. As esferas de separação de células magnéticas podem ou não ser removidas ou esgotadas de populações selecionadas de células T CD4+, células T CD8+ ou uma população mista de células T CD4+ e CD8+ antes de executar a próxima etapa em um método de isolamento de células T da invenção.
[001896] As composições de células T e composições de produtos de células T podem ser preparadas para criopreservação, armazenamento em meio de cultura de células T padrão e/ou modificação genética.
[001897] As composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer parte das mesmas podem ser criopreservadas usando um método de criopreservação padrão otimizado para armazenar e recuperar células humanas com alta recuperação, viabilidade, fenótipo e/ou capacidade funcional. Meios e/ou protocolos de criopreservação disponíveis no mercado podem ser usados. Os métodos de criopreservação da invenção podem incluir um crioconservante isento de DMSO (por exemplo, meio de criopreservação isento de DMSO CryoSOfree™) que reduz a toxicidade relacionada ao congelamento.
[001898] As composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer parte das mesmas podem ser armazenadas em um meio de cultura. O meio de cultura de células T da invenção pode ser otimizado para armazenamento celular, modificação genética celular, fenótipo celular e/ou expansão celular. O meio de cultura de células T da invenção pode incluir um ou mais antibióticos. Uma vez que a inclusão de um antibiótico em um meio de cultura celular pode diminuir a eficiência da transfecção e/ou o rendimento celular após modificação genética via nucleofecção, os antibióticos específicos (ou combinações dos mesmos) e suas respectivas concentrações podem ser alterados para otimizar a eficiência da transfecção e/ou rendimento celular após modificação genética via nucleofecção.
[001899] O meio de cultura de células T da invenção pode incluir soro e, além disso, a composição e a concentração séricas podem ser alteradas para obter resultados celulares ideais. O soro AB humano é preferido em relação ao FBS/FCS para a cultura de células T porque, embora considerado para uso em meios de cultura de células T da invenção, o FBS/FCS pode introduzir xeno-proteínas. O soro pode ser isolado a partir do sangue do indivíduo ao qual a composição de células T em cultura é destinada à administração, assim, um meio de cultura de células T da invenção pode compreender soro autólogo. Meios isentos de soro ou substitutos séricos também podem ser usados nos meios de cultura de células T da invenção. Em determinadas modalidades do meio de cultura de células T e métodos da invenção, o meio isento de soro ou o substituto sérico pode conferir vantagens em relação à suplementação do meio com xeno-soro incluindo, porém sem limitações, células saudáveis que têm maior viabilidade, nucleofectadas com maior eficiência, exibem maior viabilidade pós-nucleofecção,
exibem um fenótipo celular mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão.
[001900] O meio de cultura de células T pode incluir um meio de crescimento de células comercialmente disponível. Exemplos de meios de crescimento de células comercialmente disponíveis incluem, dentre outros, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium ou qualquer combinação dos mesmos.
[001901] As composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer porção das mesmas podem ser preparadas para modificação genética. A preparação de composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer parte das mesmas para modificação genética pode incluir lavagem e/ou ressuspensão de células em um tampão de nucleofecção desejado. As composições de células T criopreservadas podem ser descongeladas e preparadas para modificação genética por meio de nucleofecção. As células criopreservadas podem ser descongeladas de acordo com protocolos padrão ou conhecidos. O descongelamento e a preparação de células criopreservadas podem ser otimizados para produzir células que têm maior viabilidade, são nucleofectadas com maior eficiência, exibem maior viabilidade pós-nucleofecção, exibem um fenótipo celular mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão. Por exemplo, Grifols Albutein (albumina humana a 25 %) pode ser usada no processo de descongelamento e/ou preparação. Modificação Genética de uma Composição de Produto de Célula T Autóloga
[001902] As composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer parte das mesmas podem ser geneticamente modificadas usando, por exemplo, uma estratégia de nucleofecção, tal como eletroporação. O número total de células a serem nucleofectadas, o volume total da reação de nucleofecção e o tempo preciso de preparação da amostra podem ser otimizados para produzir células com maior viabilidade, que são nucleofectadas com maior eficiência, que exibem maior viabilidade pós-nucleofecção, exibem um fenótipo de célula mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão.
[001903] A nucleofecção e/ou eletroporação pode ser realizada usando, por exemplo, Lonza Amaxa, MaxCyte PulseAgile, Harvard Apparatus BTX e/ou Invitrogen Neon. Sistemas de eletrodos não metálicos incluindo, dentre outros, eletrodos de polímero plástico, podem ser preferidos para nucleofecção.
[001904] Antes da modificação genética por nucleofecção, composições de células T, composições de produtos de células T, composições de células T não estimuladas, composições de células T em repouso ou qualquer porção das mesmas podem ser ressuspensas em um tampão de nucleofecção. Os tampões de nucleofecção da invenção incluem tampões de nucleofecção comercialmente disponíveis. Os tampões de nucleofecção da invenção podem ser otimizados para produzir células que têm maior viabilidade, são nucleofectadas com maior eficiência, exibem maior viabilidade pós- nucleofecção, exibem um fenótipo celular mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão. Os tampões de nucleofecção da invenção podem incluir, porém sem limitações, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM,
TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult- XF T Cell Expansion Medium e qualquer combinação dos mesmos.
Os tampões de nucleofecção da invenção podem compreender um ou mais fatores suplementares para produzir células que têm maior viabilidade, são nucleofectadas com maior eficiência, exibem maior viabilidade pós- nucleofecção, exibem um fenótipo celular mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida após adição de expansão tecnologias.
Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, citocinas humanas recombinantes, quimiocinas, interleucinas e qualquer combinação das mesmas.
Citocinas, quimiocinas e interleucinas exemplificativas incluem, porém sem limitações, IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16., IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-gama, IL-1 alfa/IL- 1F1, IL-1 beta/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL- 17/IL-17A, Heterodímero IL-17A/F, IL-17F, IL- 18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 beta, IL-32 gama, IL-33, LAP (TGF-beta 1), Linfotoxina alfa/TNF-beta, TGF- beta, TNF-alfa, TRANCE/TNFSF11/RANK L e qualquer combinação dos mesmos.
Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, sais, minerais, metabólitos ou qualquer combinação dos mesmos.
Exemplos de sais, minerais e metabólitos incluem, porém sem limitações, HEPES, Nicotinamida, Heparina, Piruvato de Sódio, L-Glutamina, Solução de Aminoácido Não Essencial MEM, Ácido Ascórbico, Nucleosídeos, FBS/FCS, Soro humano, substituto sérico, antibióticos, reguladores de pH, sais de Earle, 2-mercaptoetanol, transferrina humana, insulina humana recombinante, albumina sérica humana, suplemento Nucleofector PLUS, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, lactobionato de sódio, manitol, succinato de sódio, cloreto de sódio CINa, Glicose, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, Polietilenimina, Polietileno glicol, Poloxâmero 188, Poloxâmero 181, Poloxâmero 407, Polivinilpirrolidona, Pop313, Crown-5 e qualquer combinação dos mesmos. Fatores complementares exemplificativos incluem, dentre outros, meios tais como PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium e qualquer combinação dos mesmos. Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, inibidores da detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, via apoptótica e combinações dos mesmos. Inibidores exemplificativos incluem, porém sem limitações, inibidores de TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF- 7, NF-B, interferons de tipo 1, citocinas pró-inflamatórias, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase 1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, inibidores da quinase-3β de glicogênio sintase (GSK-3 β) (por exemplo,, TWS119), Bafilomicina, Cloroquina, Quinacrina, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z- IETD-FMK e qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de fatores suplementares incluem, dentre outros, reagentes que modificam ou estabilizam um ou mais ácidos nucleicos de maneira a melhorar a distribuição celular, melhorar o transporte nuclear, aprimorar o transporte facilitado de ácidos nucleicos para o núcleo, melhorar a degradação de ácido nucleico cromossômico e/ou diminuir a toxicidade mediada por DNA. Reagentes exemplificativos que modificam ou estabilizam um ou mais ácidos nucleicos incluem, dentre outros, modificadores de pH, proteínas de ligação a DNA, lipídios, fosfolipídios, CaPO4, peptídeos de ligação a DNA com carga neutra com ou sem sequências NLS, enzima TREX1 e qualquer combinação dos mesmos.
[001905] Reagentes de transposição, incluindo um transposon e uma transposase, podem ser adicionados a uma reação de nucleofecção da invenção antes, simultaneamente ou após uma adição de células a um tampão de nucleofecção (opcionalmente, contido em um frasco ou cubeta de reação de nucleofecção)). Os transposons da invenção podem compreender DNA de plasmídeo, DNA de plasmídeo linearizado, um produto de PCR, DOGGYBONE™ DNA, um modelo de mRNA, um DNA fita simples ou dupla, uma combinação de proteína- ácido nucleico ou qualquer combinação dos mesmos. Os transposons da invenção podem compreender uma ou mais sequências que codificam um ou mais sítios TTAA, uma ou mais repetições terminais invertidas (ITRs), uma ou mais repetições terminais longas (LTRs), um ou mais isolante(s), um ou mais promotor(es), um ou mais genes completos ou truncados, um ou mais sinais poliA, um ou mais sítios de clivagem peptídica 2A autocliváveis, um ou mais sítios de entrada interna em ribossomas (IRES), um ou mais intensificadores, um ou mais reguladores, uma ou mais origem(ens) de replicação e qualquer combinação dos mesmos.
[001906] Os transposons da invenção podem compreender uma ou mais sequências que codificam um ou mais genes completos ou truncados. Genes completos e/ou truncados introduzidos pelos transposons da invenção podem codificar um ou mais peptídeos sinalizadores, um VCAR, um fragmento variável com uma única cadeia (scFv), uma dobradiça, um domínio transmembrana, um domínio coestimulatório, um receptor antigênico quimérico (CAR), um VCAR, um receptor de células T quimérico (CAR-T ou VCAR-T), um receptor, um ligante, uma citocina, um gene de resistência a fármaco, um antígeno tumoral, um alo ou auto antígeno, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína fluorescente, uma muteína ou qualquer combinação dos mesmos.
[001907] Os transposons da invenção podem ser preparados em água, TAE, TBE, PBS, HBSS, meios, um fator suplementar da invenção ou qualquer combinação dos mesmos.
[001908] Os transposons da invenção podem ser concebidos para otimizar a segurança clínica e/ou melhorar a capacidade de fabricação. Como um exemplo não limitativo, os transposons da invenção podem ser concebidos para otimizar a segurança clínica e/ou melhorar a capacidade de fabricação, eliminando sequências ou regiões desnecessárias e/ou incluindo um marcador de seleção não antibiótico. Os transposons da invenção podem ou não ser de tipo GMP.
[001909] As enzimas transposase da invenção podem ser codificadas por uma ou mais sequências de combinação de DNA de plasmídeo, mRNA, proteína, proteína-ácido nucleico ou qualquer combinação dos mesmos.
[001910] As enzimas transposase da invenção podem ser preparadas em água, TAE, TBE, PBS, HBSS, meios, um fator suplementar da invenção ou qualquer combinação dos mesmos. As enzimas transposase da invenção ou as sequências/construções que as codificam ou distribuem podem ou não ser de qualidade GMP.
[001911] Os transposons e enzimas transposase da invenção podem ser distribuídos a uma célula através de qualquer meio.
[001912] Embora as composições e métodos da invenção incluam a distribuição de um transposon e/ou transposase da invenção a uma célula pelo DNA do plasmídeo (pDNA), o uso de um plasmídeo para distribuição pode permitir que o transposon e/ou transposase sejam integrados no DNA cromossômico da célula, o que pode levar à expressão contínua da transposase. Consequentemente, o transposon e/ou as enzimas transposase da invenção podem ser distribuídos a uma célula como mRNA ou proteína para remover qualquer possibilidade de integração cromossômica.
[001913] Os transposons e transposases da invenção podem ser pré- incubados individualmente ou em combinação entre si antes da introdução do transposon e/ou transposase em uma reação de nucleofecção. As quantidades absolutas de cada um do transposon e da transposase, bem como as quantidades relativas, por exemplo, uma proporção de transposon para transposase, podem ser otimizadas.
[001914] Após a preparação da reação de nucleofecção, opcionalmente, em um frasco ou cubeta, a reação pode ser carregada em um dispositivo Nucleofector e ativada para a distribuição de um pulso elétrico de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de pulso elétrico usadas para distribuição de um transposon e/ou transposase da invenção (ou uma sequência que codifica um transposon e/ou transposase da invenção) a uma célula podem ser otimizadas para produzir células com viabilidade aprimorada, maior eficiência de nucleofecção, maior viabilidade pós-nucleofecção, fenótipo celular desejável e/ou expansão maior/mais rápida mediante adição de tecnologias de expansão. Ao usar a tecnologia Nucleofector Amaxa, são considerados cada um dos vários programas de nucleofecção para o Nucleofector Amaxa 2B ou 4D.
[001915] Após uma reação de nucleofecção da invenção, as células podem ser adicionadas suavemente a um meio celular. Por exemplo, quando as células T sofrem a reação de nucleofecção, as células T podem ser adicionadas a um meio de células T. Os meios celulares pós- nucleofecção da invenção podem compreender qualquer um ou mais meios comercialmente disponíveis. Os meios celulares pós- nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) podem ser otimizados para produzir células com maior viabilidade, maior eficiência de nucleofecção, que exibem maior viabilidade pós-nucleofecção, exibem um fenótipo celular mais desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão. O meio celular pós-nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) pode compreender PBS,
HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium e qualquer combinação dos mesmos.
O meio celular pós- nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) pode compreender um ou mais fatores suplementares da invenção para melhorar a viabilidade, eficiência da nucleofecção, viabilidade pós-nucleofecção, fenótipo celular e/ou maior/expansão mais rápida com a adição de tecnologias de expansão.
Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, citocinas humanas recombinantes, quimiocinas, interleucinas e qualquer combinação das mesmas.
Citocinas, quimiocinas e interleucinas exemplificativas incluem, porém sem limitações, IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16., IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-gama, IL-1 alfa/IL- 1F1, IL-1 beta/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL- 17/IL-17A, Heterodímero IL-17A/F, IL-17F, IL- 18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 beta, IL-32 gama, IL-33, LAP (TGF-beta 1), Linfotoxina alfa/TNF-beta, TGF- beta, TNF-alfa, TRANCE/TNFSF11/RANK L e qualquer combinação dos mesmos.
Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, sais, minerais, metabólitos ou qualquer combinação dos mesmos.
Exemplos de sais, minerais e metabólitos incluem, porém sem limitações, HEPES, Nicotinamida, Heparina, Piruvato de Sódio, L-Glutamina, Solução de Aminoácido Não Essencial MEM, Ácido Ascórbico, Nucleosídeos, FBS/FCS, Soro humano, substituto sérico, antibióticos, reguladores de pH, sais de Earle, 2-mercaptoetanol, transferrina humana, insulina humana recombinante, albumina sérica humana, suplemento Nucleofector PLUS, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, lactobionato de sódio, manitol, succinato de sódio, cloreto de sódio CINa, Glicose, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, Polietilenimina, Polietileno glicol, Poloxâmero 188, Poloxâmero 181, Poloxâmero 407, Polivinilpirrolidona, Pop313, Crown-5 e qualquer combinação dos mesmos.
Fatores complementares exemplificativos incluem, dentre outros, meios tais como PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium e qualquer combinação dos mesmos.
Fatores suplementares exemplificativos incluem, porém sem limitações, inibidores da detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal, via apoptótica e combinações dos mesmos.
Inibidores exemplificativos incluem, porém sem limitações, inibidores de TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF- 7, NF-B, interferons de tipo 1, citocinas pró-inflamatórias, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase 1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, inibidores da quinase-3β de glicogênio sintase (GSK-3 β) (por exemplo,, TWS119), Bafilomicina, Cloroquina, Quinacrina, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z- IETD-FMK e qualquer combinação dos mesmos.
Exemplos de fatores suplementares incluem, dentre outros, reagentes que modificam ou estabilizam um ou mais ácidos nucleicos de maneira a melhorar a distribuição celular, melhorar a distribuição ou o transporte nuclear, aprimorar o transporte facilitado de ácido nucleico para o núcleo, melhorar a degradação de ácido nucleico cromossômico e/ou diminuir a toxicidade mediada por DNA.
Reagentes exemplificativos que modificam ou estabilizam um ou mais ácidos nucleicos incluem, dentre outros, modificadores de pH, proteínas de ligação a DNA, lipídios, fosfolipídios, CaPO4, peptídeos de ligação a DNA com carga neutra com ou sem sequências NLS, enzima TREX1 e qualquer combinação dos mesmos.
[001916] O meio celular pós-nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) pode ser usado em temperatura ambiente ou pré-aquecido, por exemplo, entre 32 °C e 37°C, inclusive os pontos finais. O meio celular pós-nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) pode ser pré-aquecido para qualquer temperatura que mantenha ou melhore a viabilidade celular e/ou expressão de um transposon ou porção da invenção.
[001917] O meio celular pós-nucleofecção da invenção (incluindo o meio celular pós-nucleofecção da invenção) pode estar contido em frascos ou discos de cultura tecidual, frascos G-Rex, biorreator ou sacos de cultura celular ou qualquer outro receptáculo padrão. As culturas de células pós-nucleofecção da invenção (incluindo culturas de células T pós-nucleofecção da invenção) podem ser mantidas paradas ou, alternativamente, elas podem ser agitadas (por exemplo, sacudidas ou agitadas).
[001918] As culturas de células pós-nucleofecção podem compreender células geneticamente modificadas. As culturas de células T pós-nucleofecção podem compreender células T geneticamente modificadas. As células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso durante um período de tempo definido ou estimuladas para expansão, por exemplo, mediante adição de uma tecnologia T Cell Expander. Em determinadas modalidades, as células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso durante um período de tempo definido ou imediatamente estimuladas para expansão, por exemplo, através da adição de uma tecnologia T Cell Expander. As células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso para permitir um tempo suficiente para aclimatação, tempo para que a transposição ocorra e/ou tempo para seleção positiva ou negativa, resultando em células com viabilidade aprimorada, maior eficiência de nucleofecção, maior viabilidade pós-nucleofecção, fenótipo celular desejável e/ou expansão maior/mais rápida mediante adição de tecnologias de expansão. As células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais horas. Em determinadas modalidades, as células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, por uma noite. Em determinados aspectos, uma noite é de cerca de 12 horas. As células geneticamente modificadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais dias.
[001919] As células geneticamente modificadas da invenção podem ser selecionadas após uma reação de nucleofecção e antes da adição de uma tecnologia expansora. Para seleção ideal de células geneticamente modificadas, as células podem ser deixadas em repouso em um meio celular pós-nucleofecção durante pelo menos 2-14 dias para facilitar a identificação de células modificadas (por exemplo, diferenciação de células modificadas de não modificadas).
[001920] Tão cedo quanto 24 horas após a nucleofecção, a expressão de um CAR/VCAR e o marcador de seleção da invenção pode ser detectável em células T modificadas após nucleofecção bem sucedida de um transposon da invenção. Em virtude da expressão epicromossômica do transposon, a expressão de um marcador de seleção isoladamente pode não diferenciar células T modificadas (aquelas nas quais o transposon foi integrado com sucesso) das células T não modificadas (aquelas nas quais o transposon não foi integrado com sucesso). Quando a expressão epicromossômica do transposon obscurece a detecção de células modificadas pelo marcador de seleção,
as células nucleadas (células modificadas e não modificadas) podem ficar em repouso durante um período de tempo (por exemplo, 2-14 dias) para permitir que as células cessem a expressão ou percam toda a expressão do transposon epicromossômico. Após este período de repouso prolongado, apenas as células T modificadas devem permanecer positivas para a expressão do marcador de seleção. A duração deste período de repouso prolongado pode ser otimizada para cada reação de nucleofecção e processo de seleção. Quando a expressão epicromossômica do transposon obscurece a detecção de células modificadas pelo marcador de seleção, a seleção pode ser realizada sem este período de repouso prolongado; no entanto, uma etapa de seleção adicional pode ser incluída em um momento posterior (por exemplo, durante ou após o estágio de expansão).
[001921] A seleção de células geneticamente modificadas da invenção pode ser realizada através de qualquer meio. Em determinadas modalidades dos métodos da invenção, a seleção de células geneticamente modificadas da invenção pode ser realizada ao isolar células que expressam um marcador de seleção específico. Os marcadores de seleção da invenção podem ser codificados por uma ou mais sequências no transposon. Os marcadores de seleção da invenção podem ser expressos pela célula modificada como um resultado de uma transposição bem-sucedida (isto é, não codificados por uma ou mais sequências no transposon). Em determinadas modalidades, as células geneticamente modificadas da invenção contêm um marcador de seleção que confere resistência a um composto deletério no meio celular pós-nucleofecção. O composto deletério pode compreender, por exemplo, um antibiótico ou um fármaco o qual, na ausência da resistência conferida pelo marcador de seleção às células modificadas, resultaria em morte celular. Marcadores de seleção exemplificativos incluem, porém sem limitações, tipo selvagem (WT) ou formas mutantes de um ou mais dos seguintes genes: neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS e NKX2.2. Marcadores de seleção exemplificativos incluem, porém sem limitações, um marcador de seleção expresso na superfície ou uma etiqueta (tag) expressa na superfície pode ser direcionada pela tecnologia de esferas magnéticas revestidas com Ab ou seleção de coluna, respectivamente. Uma etiqueta clivável, tal como aquelas usadas na purificação de proteínas, pode ser adicionada a um marcador de seleção da invenção para seleção, lavagem e eluição eficientes da coluna. Em determinadas modalidades, os marcadores de seleção da invenção não são expressos pelas células modificadas (incluindo células T modificadas) endogenamente e, portanto, podem ser úteis no isolamento físico de células modificadas (por exemplo, através de técnicas de classificação celular). Marcadores de seleção exemplificativos da invenção que não são expressos pelas células modificadas (incluindo células T modificadas) endogenamente incluem, porém sem limitações, formas de comprimento total, mutantes ou truncadas de CD271, CD19 CD52, CD34, RQR8, CD22, CD20, CD33 e qualquer combinação dos mesmos.
[001922] As células geneticamente modificadas da invenção podem ser expandidas seletivamente após uma reação de nucleofecção. Em determinadas modalidades, as células T modificadas que compreendem um VCAR podem ser seletivamente expandidas por meio de estimulação de VCAR. As células T modificadas que compreendem um VCAR podem ser estimuladas através de contato com um reagente coberto pelo alvo (por exemplo, uma linhagem tumoral ou uma linhagem de células normais que expressa um alvo ou esferas expansoras cobertas por um alvo). Alternativamente, as células T modificadas que compreendem um VCAR podem ser estimuladas através de contato com uma célula tumoral irradiada, uma célula normal alogênica irradiada, uma PBMC autóloga irradiada. Para minimizar a contaminação das composições de produtos celulares da invenção com uma célula que expressa o alvo usada para estimulação, por exemplo, quando a composição do produto celular pode ser administrada diretamente a um indivíduo, a estimulação pode ser realizada usando esferas expansoras revestidas com a proteína-alvo do VCAR. A expansão seletiva de células T modificadas que compreendem um estímulo de VCAR pelo VCAR pode ser otimizada para evitar o esgotamento funcional das células T modificadas.
[001923] As células geneticamente modificadas selecionadas da invenção podem ser criopreservadas, deixadas em repouso durante um período de tempo definido ou estimuladas para expansão mediante adição de uma tecnologia Cell Expander. Quando as células geneticamente modificadas selecionadas são células T, as células T podem ser estimuladas para expansão mediante adição de uma tecnologia T Cell Expander. As células geneticamente modificadas selecionadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais horas. Em determinadas modalidades, as células geneticamente modificadas selecionadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, por uma noite. Em determinados aspectos, uma noite é de cerca de 12 horas. As células geneticamente modificadas selecionadas da invenção podem ser deixadas em repouso, por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais dias. As células geneticamente modificadas selecionadas da invenção podem ser deixadas em repouso durante qualquer período de tempo, resultando em células com viabilidade aprimorada, maior eficiência de nucleofecção, maior viabilidade pós- nucleofecção, fenótipo de célula desejável e/ou expansão maior/mais rápida com a adição de tecnologias de expansão.
[001924] As células geneticamente modificadas selecionadas
(incluindo células T selecionadas geneticamente modificadas da invenção) podem ser criopreservadas usando qualquer método de criopreservação padrão que possa ser otimizado para armazenar e/ou recuperar células humanas com alta recuperação, viabilidade, fenótipo e/ou capacidade funcional. Os métodos de criopreservação da invenção podem incluir meios de criopreservação e/ou protocolos comercialmente disponíveis.
[001925] A eficiência de transposição de células selecionadas geneticamente modificadas (incluindo células T selecionadas geneticamente modificadas da invenção) pode ser avaliada através de qualquer meio. Por exemplo, antes da aplicação de uma tecnologia expansora, a expressão do transposon por células geneticamente modificadas selecionadas (incluindo células T geneticamente modificadas selecionadas da invenção) pode ser medida através de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). A determinação de uma eficiência de transposição de células selecionadas geneticamente modificadas (incluindo células T selecionadas geneticamente modificadas da invenção) pode incluir determinar uma porcentagem de células selecionadas que expressam o transposon (por exemplo, um VCAR). Alternativamente, ou além disso, a pureza das células T, a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de expressão do transposon (por exemplo, expressão de CAR), a capacidade de um VCAR (distribuído no transposon) de mediar a degranulação e/ou morte de uma célula alvo que expressa o ligante VCAR e/ou um fenótipo de células selecionadas geneticamente modificadas (incluindo células T selecionadas geneticamente modificadas da invenção) podem ser avaliados através de qualquer meio.
[001926] As composições de produtos celulares da invenção podem ser liberadas para administração a um indivíduo após o cumprimento de determinados critérios de liberação. Critérios de liberação exemplificativos podem incluir, porém sem limitações, uma porcentagem específica de células T modificadas, selecionadas e/ou expandidas que expressam níveis detectáveis de um VCAR na superfície da célula. Modificação Genética de uma Composição de Produto de Célula T Autóloga
[001927] Células geneticamente modificadas (incluindo células T geneticamente modificadas) da invenção podem ser expandidas usando uma tecnologia expansora. As tecnologias expansoras da invenção podem compreender uma tecnologia expansora disponível no mercado. Tecnologias expansoras exemplificativas da invenção incluem estimulação de uma célula T geneticamente modificada da invenção via TCR. Embora todos os meios para a estimulação de uma célula T geneticamente modificada da invenção sejam considerados, a estimulação de uma célula T geneticamente modificada da invenção via TCR é um método preferido, produzindo um produto com um nível superior de capacidade de matar.
[001928] Para estimular uma célula T geneticamente modificada da invenção por meio do TCR, o Thermo Expander DynaBeads pode ser usado na proporção de esferas para células T de 3:1. Se as esferas expansoras não forem biodegradáveis, as esferas podem ser removidas da composição expansora. Por exemplo, as esferas podem ser removidas da composição expansora após cerca de 5 dias. Para estimular uma célula T geneticamente modificada da invenção por meio do TCR, um T Cell Activation/Expansion Reagent da Miltenyi pode ser usado. Para estimular uma célula T geneticamente modificada da invenção por meio do TCR, pode ser usado o ImmunoCult Human CD3/CD28 ou CD3/CD28/CD2 T Cell Activator Reagent da StemCell Technologies. Esta tecnologia pode ser preferida, uma vez que os complexos de anticorpos tetraméricos solúveis degradariam após um período e não requereriam remoção do processo.
[001929] Células apresentadoras de antígeno (APCs) artificiais podem ser concebidas para coexpressar o antígeno alvo e podem ser usadas para estimular uma célula ou célula T da invenção através de um TCR e/ou VCAR da invenção. As APCs artificiais podem compreender ou podem ser derivadas de uma linhagem de células tumorais (incluindo, por exemplo, a linhagem de leucemia mieloide imortalizada K562) e podem ser concebidas para coexpressar várias moléculas ou tecnologias coestimulatórioas (tais como CD28, 4-1BBL, CD64, mbIL- 21, mbIL-15, molécula alvo do CAR, etc.). Quando APCs artificiais da invenção são combinadas com moléculas coestimulatórias, as condições podem ser otimizadas para impedir o desenvolvimento ou surgimento de um fenótipo indesejável e capacidade funcional, isto é, células T efetoras terminalmente diferenciadas.
[001930] PBMCs irradiadas (auto ou alo) podem manifestar alguns antígenos alvo, tal como CD19, e podem ser usadas para estimular uma célula ou de células T da invenção por meio de um TCR e/ou VCAR da invenção. Alternativamente, ou além disso, as células tumorais irradiadas podem expressar alguns antígenos alvo e podem ser usadas para estimular uma célula ou célula T da invenção através de um TCR e/ou VCAR da invenção.
[001931] O estímulo anti-CD3, anti-CD2 e/ou anti-CD28 solúvel e ligado à placa pode ser usado para estimular uma célula ou célula T da invenção através de um TCR e/ou VCAR da invenção.
[001932] As esferas revestidas de antígeno podem exibir a proteína- alvo e podem ser usadas para estimular uma célula ou célula T da invenção através de um TCR e/ou VCAR da invenção. Alternativamente, ou além disso, esferas expansoras revestidas com uma proteína-alvo de VCAR podem ser usadas para estimular uma célula ou célula T da invenção através de um TCR e/ou VCAR da invenção.
[001933] Métodos de expansão são concebidos para estimulação de uma célula ou célula T da invenção através do TCR ou VCAR e das vias de CD2, CD3, CD28, 4-1BB e/ou outros marcadores na superfície expressos em células T geneticamente modificadas.
[001934] Uma tecnologia de expansão pode ser aplicada a uma célula da invenção imediatamente após nucleofecção até aproximadamente 24 horas após nucleofecção. Embora vários meios celulares possam ser usados durante um procedimento de expansão, um meio de expansão de células T desejável da invenção pode produzir células, por exemplo, com maior viabilidade, fenótipo celular, expansão total ou maior capacidade de persistência, enxertia e/ou morte mediada por CAR. O meio celular da invenção pode ser otimizado para melhorar/aprimorar a expansão, fenótipo e função das células geneticamente modificadas da invenção. Um fenótipo preferido de células T expandidas pode incluir uma mistura de células T -tronco de memória, células T centrais e células T efetoras. O expansor Dynabeads pode produzir principalmente células T de memória central, o que pode levar a um desempenho superior na clínica.
[001935] Os meios de expansão de células T exemplificativos da invenção podem incluir, parcial ou totalmente, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, CellGro DC Medium, CTS OpTimizer T Cell Expansion SFM, TexMACS Medium, PRIME-XV T Cell Expansion Medium, ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium ou qualquer combinação dos mesmos. O meio de expansão de células T da invenção pode incluir ainda um ou mais fatores suplementares. Os fatores suplementares que podem ser incluídos em um meio de expansão de células T da invenção aumentam a viabilidade, o fenótipo celular, a expansão total ou aumentam a capacidade de persistência in vivo, enxertia e/ou morte mediada por VCAR. Fatores suplementares que podem ser incluídos em um meio de expansão de células T da invenção incluem, porém sem limitações, citocinas humanas recombinantes, quimiocinas e/ou interleucinas, tais como IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-gama, IL-1 alfa/IL-1F1, IL-1 beta/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL -17/IL-17A, Heterodímero IL-17A/F, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 beta, IL-32 gama, IL- 33, LAP (TGF-beta 1), Linfotoxina alfa/TNF-beta, TGF-beta, TNF-alfa, TRANCE/TNFSF11/RANK L ou qualquer combinação dos mesmos.
Fatores suplementares que podem ser incluídos em um meio de expansão de células T da invenção incluem, porém sem limitações, sais, minerais e/ou metabólitos, tais como HEPES, Nicotinamida, Heparina, Piruvato de Sódio, L-Glutamina, Solução de Aminoácidos Não Essencial MEM, ácido ascórbico, nucleosídeos, FBS/FCS, soro humano, substituto sérico, antibióticos, reguladores de pH, sais de Earle, 2-mercaptoetanol, transferrina humana, insulina humana recombinante, albumina sérica humana, suplemento Nucleofector PLUS, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, Lactobionato de sódio, Manitol, Succinato de sódio, Cloreto de sódio, CINa, Glicose, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, Polietilenimina, Polietileno glicol, Poloxâmero 188, Poloxâmero 188, Poloxâmero 188 Poloxâmero 407, Polivinilpirrolidona, Pop313, Crown-5 ou qualquer combinação dos mesmos.
Os fatores suplementares que podem ser incluídos em um meio de expansão de células T da invenção incluem, porém sem limitações, inibidores da detecção de DNA celular, metabolismo, diferenciação, transdução de sinal e/ou via apoptótica, tais como inibidores de TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF- B, interferons de tipo 1, citocinas pró-inflamatórias, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, Caspase 1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, inibidores da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3 β) (por exemplo, TWS119), Bafilomicina, cloroquina, quinacrina, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z- IETD-FMK ou qualquer combinação dos mesmos.
[001936] Os fatores suplementares que podem ser incluídos em um meio de expansão de células T da invenção incluem, porém sem limitações, reagentes que modificam ou estabilizam os ácidos nucleicos de maneira a melhorar a distribuição celular, melhorar a distribuição ou transporte nuclear, melhorar a facilidade transporte de ácido nucleico para o núcleo, aumentar a degradação do ácido nucleico epicromossômico e/ou diminuir a toxicidade mediada por DNA, tais como modificadores de pH, proteínas de ligação a DNA, lipídios, fosfolipídios, CaPO4, peptídeos de ligação a DNA com carga neutra e com ou sem sequências NLS, enzima TREX1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[001937] As células geneticamente modificadas da invenção podem ser selecionadas durante o processo de expansão mediante uso de fármacos ou compostos selecionáveis. Por exemplo, em determinadas modalidades, quando um transposon da invenção pode codificar um marcador de seleção que confere resistência às células geneticamente modificadas a um medicamento adicionado ao meio de cultura, a seleção pode ocorrer durante o processo de expansão e pode requerer aproximadamente 1-14 dias de cultura para que a seleção ocorra. Exemplos de genes de resistência a fármacos que podem ser usados como marcadores de seleção codificados por um transposon da invenção incluem, porém sem limitações, tipo selvagem (WT) ou formas mutantes dos genes neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS, NKX2.2 ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos de fármacos ou compostos correspondentes que podem ser adicionados ao meio de cultura ao qual um marcador de seleção pode conferir resistência incluem, porém sem limitações, G418, Puromicina,
Ampicilina, Canamicina, Metotrexato, Mefalano, Temozolomida, Vincristina, Etoposídeo, Doxorrubicina, Bendamustina, Fludarabina, Aredia (Pamidronato Dissódico), Becenum (Carmustina), BiCNU (Carmustina), Bortezomibe, Carfilzomibe, Carmubris (Carmustina), Carmustina, Clafen (Ciclofosfamida), Ciclofosfamida, Darfuma (Ciclofosfamida), Dartoxuma (Ciclofosfina) Doxil (Lipossoma de Cloridrato de Doxorrubicina), Dox-SL (Lipossoma de Cloridrato de Doxorrubicina), Elotuzumabe, Empliciti (Elotuzumabe), Evacet (Lipossoma de Cloridrato de Doxorrubicina), Farydak (Panobinox), Farydak (Panobinox), Farydak (Panobin) (Lipossoma de Cloridrato de Doxorrubicina), Mozobil (Plerixafor), Neosar (Ciclofosfamida), Ninlaro (Citrato de Ixazomibe), Pamidronato dissódico, Panobinostat, Plerixafor, Pomalidomida, Pomalyst (Pomalidomida), Revlimide (Lenalidomida), Synovir (Talidomida), Talidomida, Talomida (Talidomida), Velcade (Bortezomibe), Ácido Zoledrônico, Zometa (Ácido Zoledrônico) ou qualquer combinação dos mesmos.
[001938] Um processo de expansão de células T da invenção pode ocorrer em um saco de cultura de células em um biorreator WAVE, um balão G-Rex ou em qualquer outro recipiente e/ou reator adequados.
[001939] Uma cultura de células ou células T da invenção pode ser mantida estável, agitada, em agitação ou sacudida.
[001940] Um processo de expansão de células ou células T da invenção pode otimizar determinadas condições incluindo, porém sem limitações, duração da cultura, concentração celular, cronograma para adição/remoção de meio de célula T, tamanho da célula, número total de células, fenótipo celular, pureza da população de células, porcentagem de células geneticamente modificadas quando de crescimento da população de células, uso e composição de suplementos, adição/remoção de tecnologias expansoras ou qualquer combinação dos mesmos.
[001941] Um processo de expansão de célula ou célula T da invenção pode continuar até um ponto final predefinido antes da formulação da população de células expandida resultante. Por exemplo, um processo de expansão de célula ou célula T da invenção pode continuar por um período de tempo predeterminado: pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 horas; pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 dias; pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 semanas; pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, meses ou pelo menos 1 ano. Um processo de expansão de células ou células T da invenção pode continuar até que a cultura resultante atinja uma densidade celular total predeterminada: 1, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 células por volume (μl, ml, L) ou qualquer densidade intermediária. Um processo de expansão de célula ou célula T da invenção pode continuar até que as células geneticamente modificadas de uma cultura resultante demonstrem um nível predeterminado de expressão de um transposon da invenção: 1 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % ou qualquer porcentagem entre um nível limite de expressão (um nível mínimo, máximo ou médio de expressão que indica que as células geneticamente modificadas resultantes são clinicamente eficazes). Um processo de expansão de células ou células T da invenção pode continuar até que a proporção de células geneticamente modificadas de uma cultura resultante e a proporção de células não modificadas atinja um limite predeterminado: pelo menos 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 2:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 10:1 ou quaisquer proporções entre as mesmas. Análise de Células T Autólogas Geneticamente Modificadas Para Liberação
[001942] Uma porcentagem de células geneticamente modificadas pode ser avaliada durante ou após um processo de expansão da invenção. A expressão celular de um transposon por uma célula geneticamente modificada da invenção pode ser medida através de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Por exemplo, FACS pode ser usado para determinar uma porcentagem de células ou células T que expressam um VCAR da invenção. Alternativamente, ou além disso, a pureza de células ou células T geneticamente modificadas, a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de um VCAR expresso por uma célula ou célula T geneticamente modificada da invenção, a capacidade do VCAR de mediar a degranulação e/ou a morte de uma célula alvo que expressa o ligante VCAR e/ou um fenótipo de células T VCAR+ podem ser avaliados.
[001943] Pode ser necessário que as composições da invenção destinadas à administração a um indivíduo atendam a um ou mais "critérios de liberação" que indicam que a composição é segura e eficaz para formulação como um produto farmacêutico e/ou administração a um indivíduo. Os critérios de liberação podem incluir um requisito de que uma composição da invenção (por exemplo, um produto de células T da invenção) compreenda uma porcentagem específica de células T que expressam níveis detectáveis de um VCAR da invenção em sua superfície celular.
[001944] O processo de expansão deve ser continuado até que um critério específico seja atendido (por exemplo, atingir um determinado número total de células, atingir uma população específica de células de memória, atingir uma população de um tamanho específico).
[001945] Determinados critérios sinalizam um ponto no qual o processo de expansão deve terminar. Por exemplo, as células devem ser formuladas, reativadas ou criopreservadas quando atingirem um tamanho de célula de 300 fL (caso contrário, as células que atingirem um tamanho acima deste limite poderão começar a morrer). A criopreservação imediatamente quando uma população de células atinge um tamanho médio de célula menor do que 300 fL pode gerar uma melhor recuperação celular após descongelamento e cultura, uma vez que as células ainda não atingiram um estado totalmente inativo antes da criopreservação (um tamanho totalmente inativo é de aproximadamente 180 fL). Antes da expansão, as células T da invenção podem ter um tamanho de célula de cerca de 180 fL, mas podem mais do que quadruplicar seu tamanho de célula para aproximadamente 900 fL em 3 dias após a expansão. Nos próximos 6 a 12 dias, a população de células T diminuirá lentamente o tamanho das células até quiescência completa a 180 fL.
[001946] Um processo para preparar uma população de células para formulação pode incluir, porém sem limitações, etapas de concentração das células da população de células, lavagem das células e/ou seleção adicional das células via classificação pela resistência a medicamentos ou esferas magnéticas contra um marcador expresso na superfície específico. Um processo para preparar uma população de células para formulação pode ainda incluir uma etapa de classificação para garantir a segurança e pureza do produto final. Por exemplo, se uma célula tumoral de um paciente tiver sido usada para estimular uma célula T geneticamente modificada da invenção ou que foi geneticamente modificada para estimular uma célula T geneticamente modificada da invenção que está sendo preparada para a formulação, é essencial que nenhuma célula tumoral do paciente seja incluída no produto final. Infusão de Produtos Celulares e/ou Criopreservação Para Infusão
[001947] Uma formulação farmacêutica da invenção pode ser distribuída em sacos para infusão, criopreservação e/ou armazenamento.
[001948] Uma formulação farmacêutica da invenção pode ser criopreservada usando um protocolo padrão e, opcionalmente, um meio de criopreservação infusível. Por exemplo, um crioconservante isento de DMSO (por exemplo, meio de criopreservação isento de DMSO CryoSOfree™) pode ser usado para reduzir a toxicidade relacionada ao congelamento. Uma formulação farmacêutica criopreservada da invenção pode ser armazenada para infusão em um paciente em uma data posterior. Um tratamento eficaz pode exigir várias administrações de uma formulação farmacêutica da invenção e, portanto, as formulações farmacêuticas podem ser embaladas em "doses" de pré- alíquotas que podem ser armazenadas congeladas, mas separadas para descongelar doses individuais.
[001949] Uma formulação farmacêutica da invenção pode ser armazenada em temperatura ambiente. Um tratamento eficaz pode exigir várias administrações de uma formulação farmacêutica da invenção e, portanto, as formulações farmacêuticas podem ser embaladas em "doses" de pré-alíquotas que podem ser armazenadas juntas, mas separadas para administração de doses individuais.
[001950] Uma formulação farmacêutica da invenção pode ser guardada para subsequente re-expansão e/ou seleção para a geração de doses adicionais para o mesmo paciente no caso onde uma terapia alogênica pode requerer uma administração em uma data futura, por exemplo, uma remissão e recaída de uma condição. Formulações
[001951] Conforme observado acima, a invenção fornece formulações estáveis as quais compreendem, de preferência, um tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido, bem como soluções e formulações preservadas que contêm um conservante, bem como formulações preservadas multiuso adequadas para uso de produtos farmacêuticos ou veterinários, as quais compreendem pelo menos um VCAR em uma formulação farmaceuticamente aceitável. As formulações preservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa-hidrato), alquilparabeno (metil, etil, propil, butil e assim por diante), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, polímeros ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Qualquer concentração ou mistura adequada pode ser usada conforme conhecido na técnica, tal como cerca de 0,0015 % ou qualquer faixa, valor ou fração no mesmo. Exemplos não limitativos incluem, sem conservante, cerca de 0,1-2 % de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3. 0,4, 0,5, 0,9, 1,0 %), cerca de 0,1-3 % de álcool benzílico (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5 %), cerca de 0,001-0,5 % de timerosal (por exemplo, 0,005, 0,01), cerca de 0,001-2,0 % de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0 %), 0,0005-1,0 % de alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0 %) e assim por diante.
[001952] Conforme observado acima, a invenção fornece um artigo de manufatura que compreende um material de embalagem e pelo menos um frasco que compreende uma solução de pelo menos um VCAR com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, em que o dito material de embalagem compreende um rótulo que indica que esta solução pode ser mantida durante um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou mais. A invenção compreende ainda um artigo de manufatura que compreende material de embalagem, um primeiro frasco que compreende pelo menos um VCAR liofilizado e um segundo frasco que compreende um tampão diluente aquoso ou conservante prescrito, em que o dito material de embalagem compreende um rótulo que instrui um paciente a reconstituir o pelo menos um VCAR no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser mantida durante um período de vinte e quatro horas ou mais.
[001953] O pelo menos um VCAR usado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por meios recombinantes, inclusive a partir de células de mamíferos ou preparações transgênicas, ou pode ser purificado a partir de outras fontes biológicas, conforme descrito aqui ou conhecido na técnica.
[001954] A faixa de pelo menos um VCAR no produto da presente invenção inclui quantidades produzidas as quais, quando de reconstituição, quer em um sistema úmido/seco, geram concentrações a partir de cerca de 1,0 μg/ml a cerca de 1000 mg/ml, embora concentrações mais baixas e mais altas sejam operáveis e dependam do veículo de distribuição pretendido, por exemplo, as formulações de solução diferem dos métodos de adesivo transdérmico, pulmonar, transmucosal ou osmótico ou com microbomba.
[001955] De preferência, o diluente aquoso compreende ainda opcionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Conservantes preferidos incluem aqueles selecionados a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil e assim por diante), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usada na formulação é uma concentração suficiente para produzir um efeito antimicrobiano. Tais concentrações dependem do conservante selecionado e são prontamente determinadas por aqueles versados na técnica.
[001956] Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes, conservantes e intensificadores, podem ser opcionalmente e preferencialmente adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para permitir um melhor controle do pH. As formulações podem abranger uma ampla faixa de pHs, tal como um pH de cerca de 4 a cerca de 10, e faixas preferidas de um pH de cerca de 5 a um pH de cerca de 9 e uma faixa mais preferida de um pH de cerca de 6,0 a um pH de cerca de 8,0. De preferência, as formulações da presente invenção têm um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Tampões preferidos incluem tampões de fosfato, mais preferivelmente fosfato de sódio, particularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[001957] Outros aditivos, tais como solubilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tal como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (monopalmitato de polioxietileno (20) sorbitano), Tween 80 (polioxietileno (20) sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros em blocos de polioxietileno e polioxipropileno) e tensoativos não iônicos de PEG (polietileno glicol) ou polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, Pluronic, outros copolímeros em bloco e quelantes, tais como EDTA e EGTA, podem opcionalmente ser adicionados às formulações ou composições para reduzir a agregação. Estes aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente de plástico for usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável atenua a propensão da proteína de agregar.
[001958] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um VCAR e um conservante selecionado a partir do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metil, etil, propil, butil e assim por diante), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. A mistura de pelo menos um VCAR e conservante em um diluente aquoso é realizada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um VCAR em solução tamponada é combinada com o conservante desejado em uma solução tamponada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o conservante nas concentrações desejadas. Variações deste processo serão reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.
[001959] As formulações reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes como soluções límpidas ou como frascos duplos que compreendem um frasco de pelo menos um VCAR liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco que contém água, um conservante e/ou excipientes, de preferência um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Um frasco de solução única ou um frasco duplo que requeira reconstituição pode ser reutilizado várias vezes e pode ser suficiente para um ou vários ciclos de tratamento do paciente e, portanto, pode fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.
[001960] Os artigos de manufatura presentemente reivindicados são úteis para administração ao longo de um período que varia a partir de imediatamente a vinte e quatro horas ou mais. Consequentemente, os artigos de manufatura presentemente reivindicados oferecem vantagens significativas para o paciente. As formulações da invenção podem, opcionalmente, ser armazenadas com segurança em temperaturas a partir de cerca de 2 °C a cerca de 40 °C e reter a atividade biológica da proteína por longos períodos de tempo, deste modo, tendo um rótulo na embalagem que indica que a solução pode ser mantida e/ou usada durante um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ou 96 horas ou mais. Se um diluente conservado for usado, este rótulo poderá incluir o uso em até 1 a 12 meses, 6 meses, um ano e meio e/ou dois anos.
[001961] As soluções de pelo menos um VCAR da invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um VCAR em um diluente aquoso. A mistura é realizada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um VCAR em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e, opcionalmente, um conservante ou tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo serão reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.
[001962] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos aos pacientes como soluções límpidas ou como dois frascos que compreendem um frasco de liofilizado de pelo menos um VCAR que é reconstituído com um segundo frasco que contém o diluente aquoso. Um frasco de solução única ou um frasco duplo que requeira reconstituição pode ser reusado várias vezes e pode ser suficiente para um ou vários ciclos de tratamento do paciente e, portanto, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.
[001963] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente aos pacientes, fornecido a farmácias, clínicas ou outras instituições e instalações, como soluções límpidas ou frascos duplos que compreendem um frasco de pelo menos um VCAR liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco que contém a solução diluente aquosa. A solução límpida, neste caso, pode ter até um litro ou até mesmo um tamanho maior, fornecendo um grande reservatório a partir do qual porções menores da pelo menos uma solução VCAR podem ser recuperadas uma ou várias vezes para transferência para frascos menores e fornecidas pela farmácia ou clínica para seus clientes e/ou pacientes.
[001964] Dispositivos reconhecidos que compreendem sistemas de frasco único incluem dispositivos injetores de caneta para a distribuição de uma solução, tais como as canetas BD Pens, BD Autojector, Humaject, NovoPen, B-DPen, AutoPen e OptiPen, GenotropinPen, Genotronorm Pen, Humatro Pen, Reco-Pen, Roferon Pen, Biojector, Iject, J-tip Needle-Free Injector, Intraject, Medi-Ject, por exemplo, conforme fabricado ou desenvolvido pela Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suíça, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oreg. (Www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido, www. weston-medical.com), Medi-Ject Corp. (Minneapolis, Minn., www.mediject.com) e dispositivos apropriados similares. Dispositivos reconhecidos que compreendem um sistema de frasco duplo incluem os sistemas de caneta injetora para reconstituir um medicamento liofilizado em um cartucho para a distribuição da solução reconstituída, tal como HumatroPen. Exemplos de outros dispositivos adequados incluem seringas pré-enchidas, autoinjetores, injetores sem agulha e conjuntos de infusão IV sem agulha.
[001965] Os produtos presentemente reivindicados incluem um material de embalagem. O material de embalagem fornece, além das informações exigidas pelas agências reguladoras, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material de embalagem da presente invenção fornece instruções ao paciente para reconstituir pelo menos um VCAR no diluente aquoso para formar uma solução e usar a solução por um período de 2-24 horas ou mais para os dois frascos de produtos úmidos/secos. Para o frasco único, produto em solução, o rótulo indica que esta solução pode ser usada durante um período de 2-24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para o uso de produtos farmacêuticos humanos.
[001966] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um VCAR e um tampão selecionado, de preferência, a partir de um tampão que contém solução salina ou um sal de fosfato escolhido. A mistura de pelo menos um VCAR e tampão em um diluente aquoso é realizada usando procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um VCAR em água ou tampão é combinada com o agente tampão desejado em água em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.
[001967] Formulações estáveis ou preservadas reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes como soluções límpidas ou como frascos duplos que compreendem um frasco de VCAR liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco que contém um conservante ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Um frasco de solução única ou um frasco duplo que requeira reconstituição pode ser reutilizado várias vezes e pode ser suficiente para um ou vários ciclos de tratamento do paciente e, portanto, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.
[001968] Outras formulações e métodos de estabilização do VCAR podem resultar onde não haja uma solução límpida de pó liofilizado que compreende o VCAR.
Entre soluções não límpidas estão formulações que compreendem suspensões de partículas, as ditas partículas sendo uma composição que contém o VCAR em uma estrutura de dimensão variável e conhecida de vários formatos, tais como microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanoesfera ou lipossoma.
Tais formulações em partículas relativamente homogêneas, essencialmente esféricas que contêm um agente ativo podem ser formadas ao contatar uma fase aquosa que contém o agente ativo e um polímero e uma fase não aquosa, seguido por evaporação da fase não aquosa para causar coalescência das partículas da fase aquosa, conforme ensinado na Patente Norte-americana N° 4.589.330. As micropartículas porosas podem ser preparadas ao usar uma primeira fase que contém agente ativo e um polímero disperso em um solvente contínuo e remover o dito solvente da suspensão através de liofilização ou precipitação por extração através de diluição, conforme ensinado na Patente Norte- americana N° 4.818.542. Polímeros preferidos para estas preparações são copolímeros ou polímeros naturais ou sintéticos selecionados a partir do grupo que consiste em ágar de gelatina, amido, arabinogalactana, albumina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicolídeo-L(-)lactídeo, poli(épisilon-caprolactona, ácido (poli)láctico-co-épsilon-caprolactona, ácido (poli)glicólico-co-épsilon- caprolactona, ácido (poli)β-hidroxi-butírico, óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(metacrilato de hidroxietila), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster ureia), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/1,6-di-isocianato- hexano) e poli(metacrilato de metila). Solventes para dissolver o polímero e/ou o ingrediente ativo incluem: água, hexafluoroisopropanol, cloreto de metileno, tetra-hidrofurano, hexano, benzeno ou sesqui-
hidrato de hexafluoroacetona. O processo de dispersão da fase ativa que contém uma segunda fase pode incluir pressão que força a dita primeira fase através de um orifício em um bico para afetar a formação de gotículas.
[001969] As formulações de pó seco podem resultar de outros processos que não liofilização, tal como através de secagem por pulverização ou extração por solvente através de evaporação ou precipitação de uma composição cristalina, seguido por uma ou mais etapas para remover o solvente aquoso ou não aquoso. A preparação de uma preparação de VCAR seca por pulverização é ensinada na Patente Norte-americana N° 6.019.968. As composições de pó seco com base em VCAR podem ser produzidas através de secagem por pulverização de soluções ou suspensões do VCAR e, opcionalmente, excipientes, em um solvente sob condições para fornecer um pó seco respirável. Solventes podem incluir compostos polares, tais como água e etanol, os quais podem ser facilmente secos. A estabilidade do VCAR pode ser melhorada ao executar os procedimentos de secagem por pulverização na ausência de oxigênio, tal como sob uma manta de nitrogênio ou usando o nitrogênio como gás de secagem. Outra formulação relativamente seca é uma dispersão de uma pluralidade de microestruturas perfuradas dispersas em um meio de suspensão o qual compreende, tipicamente, um propelente de hidrofluoroalcano, conforme ensinado no documento WO 9916419. Dispersões estabilizadas podem ser administradas ao pulmão de um paciente usando um inalador de dose medida. Equipamentos úteis na fabricação comercial de medicamentos secos por pulverização são fabricados pela Buchi Ltda. ou Niro Corp.
[001970] Pelo menos um VCAR em qualquer estável ou formulações ou soluções conservadas descritas aqui pode ser administrado a um paciente, de acordo com a presente invenção através de uma variedade de métodos de distribuição, incluindo injeção SC ou IM; transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba ou outros meios apreciados por aqueles versados na técnica bem conhecidos. Aplicações Terapêuticas
[001971] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar uma doença, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, conforme conhecido na técnica ou descrito aqui, usando pelo menos um VCAR da presente invenção, por exemplo, administrar ou contatar com a célula, tecido, órgão, animal ou paciente com uma quantidade terapêutica eficaz de VCAR. A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar uma doença, em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, porém sem limitações, uma doença maligna.
[001972] A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente incluindo, dentre outros, pelo menos um dos seguintes: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica aguda, ALL de células B, células T ou FAB, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células ciliadas, síndrome mielodoplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplásica/tumoral sólida, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hereditário não polipose, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de células não pequenas, câncer ovariano, câncer de pâncreas, câncer de próstata, carcinoma de células renais, câncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, reabsorção óssea relacionada a câncer, dor óssea relacionada a câncer e assim por diante.
[001973] Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um VCAR a uma célula, tecido, animal ou paciente que precisa de tal modulação, tratamento ou terapia. Tal método pode, opcionalmente, compreender ainda a coadministração ou terapia combinada para o tratamento de tais doenças ou transtornos, em que a administração do dito pelo menos um VCAR, porção especificada ou variante do mesmo compreende ainda administrar, antes e simultaneamente e/ou após, pelo menos um agente selecionado a partir de pelo menos um dentre um agente alquilante, um inibidor mitótico e um radiofármaco. Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Wells et al., Eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a. Edição, Appleton e Lange, Stamford, Conn. (2000); PD Farmacopeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21ª edição, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, cada um dos quais são aqui inteiramente incorporados por referência.
[001974] Doses preferidas podem incluir, opcionalmente, cerca de 0,1- 99 e/ou 100-500 mg/kg/administração ou qualquer faixa, valor ou fração do mesmo para atingir uma concentração sérica de cerca de 0,1-5000 μg/ml de soro por administração única ou múltipla ou qualquer faixa, valor ou fração do mesmo. Uma faixa de dosagem preferida para o VCAR da presente invenção é cerca de 1 mg/kg, até cerca de 3, cerca de 6 ou cerca de 12 mg/kg de peso corporal do paciente.
[001975] Alternativamente, a dosagem administrada pode variar dependendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas de um agente específico e seu modo e via de administração; idade, saúde e peso do destinatário; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento simultâneo, frequência do tratamento e efeito desejado. Normalmente, uma dosagem de ingrediente ativo pode ser a partir de cerca de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Comumente, 0,1 a 50 e, de preferência, 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração ou na forma de liberação sustentada são eficazes para obter os resultados desejados.
[001976] Como exemplo não limitativo, o tratamento de seres humanos ou animais pode ser fornecido como uma dose única ou periódica de pelo menos um VCAR da presente invenção a cerca de 0,1 a 100 mg/kg ou qualquer faixa, valor ou fração do mesmo por dia, em pelo menos um dos dias 1-40, ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos uma da semana 1-52, ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos um de 1-20 anos ou qualquer combinação dos mesmos, usando uma única infusão ou doses repetidas.
[001977] As formas de dosagem (composição) adequadas para administração interna contêm, em geral, a partir de cerca de 0,001 miligramas a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nestas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo normalmente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5- 99,999 % em peso, com base no peso total da composição.
[001978] Para administração parentérica, o VCAR pode ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão, partícula, pó ou pó liofilizado fornecido separadamente ou em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana a cerca de 1-10 %. Lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada através de técnicas conhecidas ou adequadas.
[001979] Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão neste campo. Administração Alternativa
[001980] Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um VCAR de acordo com a presente invenção. Embora administração pulmonar seja usada na descrição a seguir, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção com resultados adequados. Os VCARs da presente invenção podem ser distribuídos em um carreador, tal como uma solução, emulsão, coloide ou suspensão, ou como um pó seco usando qualquer um de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para administração através de inalação ou outros modos descritos aqui ou conhecido na técnica. Administração Parentérica e Formulações
[001981] As formulações para administração parentérica podem conter, como excipientes comuns, água ou solução salina estéril, polialquileno glicóis, tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e assim por diante. As suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas usando um emulsificante ou umidificante apropriado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Os agentes para injeção podem ser um diluente não tóxico e não administrável por via oral, tal como solução aquosa, solução injetável estéril ou suspensão em um solvente. Como veículo ou solvente utilizável, são permitidos água, solução de Ringer, solução salina isotônica etc. Como solvente comum ou solvente de suspensão, pode ser usado óleo não volátil estéril. Para estas finalidades, qualquer tipo de óleo não volátil e ácido graxo podem ser usados, incluindo óleos graxos naturais ou ácidos graxos sintéticos ou semissintéticos; mono- ou di- ou tri-glicerídeos naturais ou sintéticos ou semissintéticos. A administração parentérica é conhecida na técnica e inclui, porém sem limitações, meios de injeção convencionais, um dispositivo de injeção sem agulha com pressão de gás, conforme descrito na Patente Norte- americana N° 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser, conforme descrito na Patente Norte-americana N° 5.839.446 inteiramente incorporada aqui por referência. Distribuição Alternativa
[001982] A invenção se refere ainda à administração de pelo menos um VCAR através das vias parentérica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular, intra-brônquica, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracérebro-ventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra- hepática, intra-miocárdico, intra-óssea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intra-espinhal, intrassinovial, intratorácica, intra- uterina, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, bucal. Pelo menos uma composição de VCAR pode ser preparada para uso para administração parentérica (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outra administração particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas; para uso na administração vaginal ou retal, particularmente em formas semissólidas tais como, dentre outros, cremes e supositórios; para administração bucal ou sublingual tal como, porém sem limitações, na forma de comprimidos ou cápsulas; ou intranasalmente tal como, porém sem limitações, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis ou determinados agentes; ou transdermicamente tal como, porém sem limitações, um sistema de distribuição de gel, pomada, loção, suspensão ou adesivo com intensificadores químicos, tal como sulfóxido de dimetila, para modificar a estrutura da pele ou aumentar a concentração do medicamento no adesivo transdérmico (Junginger, et al. em "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D.S., Eds., páginas 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, inteiramente incorporado aqui por referência) ou com agentes oxidantes que permitem a aplicação de formulações que contêm proteínas e peptídeos na pele (documento WO 98/53847) ou aplicações de campos elétricos para criar vias de transporte transitórias, tal como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade dos medicamentos carregados através da pele, tal como iontoforese ou aplicação de ultrassom, tal como sonoforese (Patentes Norte-americanas Nos 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima sendo inteiramente incorporadas aqui por referência). Administração Pulmonar/Nasal
[001983] Para administração pulmonar, de preferência, a pelo menos uma composição VCAR é distribuída em um tamanho de partícula eficaz para atingir as vias respiratórias inferiores do pulmão ou seios nasais. De acordo com a invenção, pelo menos um VCAR pode ser administrado através de qualquer uma de uma variedade de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administração de um agente terapêutico por meio de inalação. Estes dispositivos capazes de depositar formulações em aerossol na cavidade sinusal ou alvéolos de um paciente incluem inaladores de dose medida, nebulizadores, geradores de pó seco, pulverizadores e assim por diante. Outros dispositivos adequados para dirigir a administração pulmonar ou nasal de VCARs também são conhecidos na técnica. Todos estes dispositivos podem usar formulações adequadas para administração para a distribuição de VCAR em um aerossol. Estes aerossóis podem ser constituídos por soluções (aquosas e não aquosas) ou partículas sólidas.
[001984] Dosadores inaladores, tal como o inalador de dose medida Ventolin usam, tipicamente, um propelente e requerem acionamento durante a inspiração (consulte, por exemplo, documentos WO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó seco, tais como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler (Glaxo), Diskus (Glaxo), inalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics e o inalador de pó Spinhaler (Fisons), usam a respiração de um pó misto (Patente Norte-americana N° 4.668.218 Astra, documento EP 237507 Astra, documento WO 97/25086 Glaxo, documento WO 94/08552 Dura, Patente Norte-americana N° 5.458.135 Inhale, documento WO 94/06498 Fisons, aqui inteiramente incorporados por referência). Nebulizadores tais como o AERx™ Aradigm, o nebulizador Ultravent (Mallinckrodt) e o nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products) (Patente Norte-americana N° 5.404.871 Aradigm, documento WO 97/22376), as referências acima inteiramente incorporadas aqui por referência, produzem aerossóis de soluções, enquanto que inaladores de dose medida, inaladores de pó seco, etc. geram pequenos aerossóis de partículas. Estes exemplos específicos de dispositivos de inalação disponíveis no mercado se destinam a ser um representante de dispositivos específicos adequados para a prática da presente invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
[001985] De preferência, uma composição que compreende pelo menos um VCAR é fornecida através de um inalador de pó seco ou um pulverizador. Há várias características desejáveis de um dispositivo de inalação para administrar pelo menos um VCAR da presente invenção. Por exemplo, a distribuição pelo dispositivo de inalação é, vantajosamente, confiável, reproduzível e precisa. O dispositivo de inalação pode opcionalmente fornecer pequenas partículas secas, por exemplo, menores do que cerca de 10 μm, de preferência cerca de 1-5 μm, para uma boa capacidade de aspiração. Administração de Composições VCAR Como uma Pulverização
[001986] Uma pulverização que inclui a composição de VCAR pode ser produzida ao forçar uma suspensão ou solução de pelo menos um VCAR através de um bico sob pressão. O tamanho e a configuração do bico, a pressão aplicada e a taxa de alimentação de líquido podem ser escolhidos para atingir a saída e o tamanho de partícula desejados. Um eletropulverizador pode ser produzido, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com uma alimentação capilar ou de bico. Vantajosamente, as partículas da pelo menos uma composição de VCAR distribuídas através de um pulverizador têm um tamanho de partícula menor do que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, mais preferivelmente, 2 μm a cerca de 3 μm.
[001987] As formulações de pelo menos uma composição de VCAR adequada para uso com um pulverizador incluem, tipicamente, uma composição de VCAR em uma solução aquosa em uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma composição de VCAR por ml de solução ou mg/gm ou qualquer faixa, valor ou fração na mesma. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição de VCAR, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína a granel ou um carboidrato. Proteínas a granel úteis na formulação de composições de VCAR incluem albumina, protamina ou similar. Carboidratos típicos úteis na formulação de composições de VCAR incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similar. A formulação da composição de VCAR também pode incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou impedir a agregação induzida pela superfície da composição de VCAR causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres e álcoois de ácidos graxos de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol. As quantidades geralmente variam entre 0,001 e 14 % em peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para fins da presente invenção são mono- oleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80, polissorbato 20 ou similar. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tais como VCARs ou porções ou variantes especificadas, também podem ser incluídos na formulação. Administração de Composições VCAR Através de Nebulizador
[001988] As composições de VCAR da invenção podem ser administradas através de um nebulizador, tal como nebulizador a jato ou um nebulizador ultrassônico. Normalmente, em um nebulizador a jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar de alta velocidade através de um orifício. À medida que o gás se expande para fora do bico, é criada uma região de baixa pressão que extrai uma solução da composição de VCAR através de um tubo capilar conectado a um reservatório de líquido. A corrente de líquido do tubo capilar é cortada em filamentos e gotículas instáveis quando sai do tubo, criando o aerossol. Uma variedade de configurações, vazões e tipos de defletores pode ser empregada para atingir as características de desempenho desejadas de um determinado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultrassônico, energia elétrica de alta frequência é usada para criar energia mecânica vibracional, normalmente empregando um transdutor piezoelétrico. Esta energia é transmitida para a formulação da composição de VCAR diretamente ou através de um fluido de acoplamento, criando um aerossol que inclui a composição de VCAR. Vantajosamente, as partículas da composição de VCAR distribuídas através de um nebulizador têm um tamanho de partícula menor do que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, mais preferivelmente, 2 μm a cerca de 3 μm.
[001989] As formulações de pelo menos um VCAR adequado para uso com um nebulizador, jato ou ultrassônico incluem, tipicamente, uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos um VCAR por ml de solução. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização da pelo menos uma composição de VCAR, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína a granel ou um carboidrato. As proteínas a granel úteis na formulação de pelo menos uma composição de VCAR incluem albumina, protamina ou similar. Carboidratos típicos úteis na formulação de pelo menos uma VCAR incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similar. A pelo menos uma formulação de VCAR também pode incluir um tensoativo, o qual pode reduzir ou impedir a agregação induzida pela superfície de pelo menos um VCAR causada por atomização da solução quando de formação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tais como ésteres e álcoois de ácidos graxos de polioxietileno e ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol. As quantidades geralmente variam entre cerca de 0,001 e 4 % em peso da formulação. Tensoativos especialmente preferidos para fins da presente invenção são mono-oleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80, polissorbato 20 ou similar. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tal como VCAR, também podem ser incluídos na formulação. Administração de Composições de VCAR Através de Inalador de Dose Medida
[001990] Em um inalador de dose medida (MDI), um propelente, pelo menos um VCAR e quaisquer excipientes ou outros aditivos estão contidos em uma lata como uma mistura que inclui um gás comprimido liquefeito.
O acionamento da válvula dosadora libera a mistura como um aerossol que contém, de preferência, partículas na faixa de tamanho de menos de cerca de 10 μm, de preferência cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, mais preferivelmente, 2 μm a cerca de 3 μm.
O tamanho de partícula de aerossol desejado pode ser obtido ao empregar uma formulação da composição de VCAR produzida através de vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo moagem a jato, secagem por pulverização, condensação em ponto crítico ou similar.
Inaladores de doses medida preferidos incluem aqueles fabricados pela 3M ou Glaxo e que empregam um propelente de hidrofluorocarboneto.
As formulações de pelo menos um VCAR para uso com um dispositivo inalador de dose medida geralmente incluem um pó finamente dividido que contém pelo menos um VCAR como uma suspensão em um meio não aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo.
O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para esta finalidade, tal como clorofluorocarboneto, hidroclorofluorocarboneto, hidrofluorocarboneto ou hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2- tetrafluoroetano, HFA-134a (HFA-134a)), HFA-227 (hidrofluoroalcano- 227) ou similar.
De preferência, o propente é um hidrofluorocarboneto.
O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um VCAR como uma suspensão no propelente, proteger o agente ativo contra degradação química e assim por diante.
Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido oleico ou similar.
Em alguns casos, os aerossóis da solução preferidos usam solventes, tal como etanol.
Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína também podem ser incluídos na formulação.
Aqueles versados na técnica reconhecerão que os métodos da presente invenção podem ser alcançados através de administração pulmonar de pelo menos uma composição de VCAR por meio de dispositivos não descritos aqui. Administração Oral e Formulações
[001991] As formulações para administração oral dependem da coadministração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não iônicos, tais como éter oleílico de polioxietileno e éter oleílico de n- hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a coadministração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, di- isopropilfluorofosfato (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. Formulações para administração de agentes hidrofílicos incluindo proteínas e VCARs e uma combinação de pelo menos dois tensoativos destinados à administração oral, bucal, mucosal, nasal, pulmonar, através da membrana vaginal ou retal são ensinadas na Patente Norte-americana N° 6.309.663. O composto constituinte ativo da forma de dosagem de tipo sólido para administração oral pode ser misturado com pelo menos um aditivo, incluindo sacarose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafinose, maltitol, dextrana, amidos, ágar, alginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma tragacanta, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semissintético e glicerídeo. Estas formas de dosagem também podem conter outros tipos de aditivos, por exemplo, diluente inativo, lubrificante, tal como estearato de magnésio, parabeno, conservante, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante, tal como cisteína, desintegrante, aglutinante, espessante, agente de tamponamento, adoçante, aromatizante, flavorizante, etc.
[001992] Os comprimidos e pílulas podem ser posteriormente processados em preparações com revestimento entérico. As preparações líquidas para administração oral incluem preparações de emulsão, xarope, elixir, suspensão e solução permitidas para uso médico. Estas preparações podem conter agentes diluentes inativos normalmente usados no dito campo, por exemplo, água. Lipossomas também foram descritos como sistemas de administração de fármaco para insulina e heparina (Patente Norte-americana N° 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos mistos (proteinoides) foram usadas para fornecer produtos farmacêuticos (Patente Norte-americana N° 4.925.673). Além disso, os compostos carreadores descritos na Patente Norte-americana N°
5.879.681 e Patente Norte-americana N° 5.871.753 usados para administrar oralmente agentes biologicamente ativos são conhecidos na técnica. Administração Mucosal e Formulações
[001993] Uma formulação para administração por via oral de um agente bioativo encapsulado em um ou mais excipientes poliméricos ou copoliméricos biocompatíveis, de preferência um polímero ou copolímero biodegradável, fornece microcápsulas as quais, em virtude do tamanho adequado das microcápsulas resultantes, resultam no alcance e na tomada do agente pelos folículos linfáticos agregados, também conhecido como "adesivo de Peyer" ou "GALT" do animal sem perda de eficácia em virtude da passagem do agente pelo trato gastrintestinal. Agregados linfáticos foliculares similares podem ser encontrados nos tubos bronquiais (BALT) e no intestino grosso. Os tecidos descritos acima são, em geral, denominados como tecidos linforreticulares associados à mucosa (MALT). Para absorção através de superfícies mucosais, composições e métodos de administração de pelo menos um VCAR incluem uma emulsão que compreende uma pluralidade de partículas submicrônicas, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase contínua aquosa, a qual promove a absorção pelas superfícies mucosais, alcançando a mucoadesão do partículas na emulsão (Patente Norte-americana N°
5.514.670). Superfícies mucosais adequadas para aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir vias de administração corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. As formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau e assim por diante. As formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para administração bucal, os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e assim por diante (Patente Norte- americana N° 5.849.695). Administração Transdérmica e Formulações
[001994] Para administração transdérmica, o pelo menos um VCAR é encapsulado em um dispositivo de distribuição, tal como um lipossoma ou nanopartículas poliméricas, micropartícula, microcápsula ou microesferas (denominadas coletivamente como micropartículas, a menos que indicado de outra forma). São conhecidos vários dispositivos adequados, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos, tais como poli-hidroxiácidos, como ácido polilático, ácido poliglicólico e copolímeros dos mesmos, poliortoésteres, polianidretos e polifosfazenos e polímeros naturais,tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos e combinações dos mesmos (Patente Norte-americana N° 5.814.599). Administração Prolongada e Formulações
[001995] Pode ser desejável distribuir os compostos da presente invenção ao indivíduo durante períodos prolongados de tempo, por exemplo, durante períodos de uma semana a um ano a partir de uma única administração.
Podem ser usadas várias formas de dosagem de liberação lenta, depósito ou implante.
Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que tem um baixo grau de solubilidade em fluidos corporais, por exemplo, (a) um sal de adição de ácido com um ácido polibásico, tal como ácido fosfórico, sulfúrico ácido, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftaleno mono- ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico e assim por diante; (b) um sal com um cátion metálico polivalente, tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e assim por diante, ou com um cátion orgânico formado, por exemplo, com N,N′-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo, um sal de tanato de zinco.
Além disso, os compostos da presente invenção ou, de preferência, um sal relativamente insolúvel, tal como aqueles que acabamos de descrever, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio, por exemplo, com óleo de gergelim, adequado para injeção.
Sais particularmente preferidos são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato e assim por diante.
Outro tipo de formulação de depósito de liberação lenta para injeção conteria o composto ou sal disperso para encapsulamento em um polímero de degradação lenta, não tóxico e não antigênico, tal como um polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-americana N° 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, sais relativamente insolúveis, tais como aqueles descritos acima, também podem ser formulados em pastilhas silásticas de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais.
Formulações adicionais de liberação lenta, depósito ou implante, por exemplo, lipossomos gasosos ou líquidos, são conhecidas na literatura (Patente Norte-americana N° 5.770.222 e "Sustained e Controlled
Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978). Infusão de Células Modificadas Como Terapia Celular Adotiva
[001996] A invenção fornece células modificadas que expressam um ou mais CARs e/ou VCARs da invenção que foram selecionadas e/ou expandidas para administração a um indivíduo que precisa do mesmo. As células modificadas da invenção podem ser formuladas para armazenamento em qualquer temperatura, incluindo temperatura ambiente e temperatura corporal. As células modificadas da invenção podem ser formuladas para criopreservação e subsequente descongelamento. As células modificadas da invenção podem ser formuladas em um carreador farmaceuticamente aceitável para administração direta a um indivíduo a partir de embalagem estéril. As células modificadas da invenção podem ser formuladas em um carreador farmaceuticamente aceitável com um indicador de viabilidade celular e/ou nível de expressão de CAR/VCAR para assegurar um nível mínimo de função celular e expressão de CAR/VCAR. As células modificadas da invenção podem ser formuladas em um carreador farmaceuticamente aceitável em uma densidade prescrita com um ou mais reagentes para inibir a expansão adicional e/ou impedir a morte celular. Polipeptídeos Pró-apoptóticos Indutíveis
[001997] Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção são superiores aos polipeptídeos indutíveis existentes porque os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção são muito menos imunogênicos. Embora polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção sejam polipeptídeos recombinantes e, portanto, não naturais, as sequências que são recombinadas para produzir os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção que não compreendem sequências não humanas que o sistema imune humano hospedeiro poderia reconhecer como "Não Próprio" e, consequentemente, induzir a uma resposta imune no indivíduo que recebe um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção, uma célula que compreende o polipeptídeo pró-apoptótico indutível ou uma composição que compreende o polipeptídeo pró-apoptótico indutível ou a célula que compreende o polipeptídeo pró-apoptótico indutível.
[001998] A invenção fornece polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis que compreende uma região de ligação de ligante, um ligante e um peptídeo pró-apoptótico, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades, a sequência não humana compreende um sítio de restrição. Em determinadas modalidades, o peptídeo pró-apoptótico é um polipeptídeo de caspase. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de caspase é um polipeptídeo de caspase 9. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de caspase 9 é um polipeptídeo de caspase 9 truncado. Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção podem não ocorrer naturalmente.
[001999] Os polipeptídeos de caspase da invenção incluem, porém sem limitações, caspase 1, caspase 2, caspase 3, caspase 4, caspase 5, caspase 6, caspase 7, caspase 8, caspase 9, caspase 10, caspase 11, caspase 12 e caspase 14. Os polipeptídeos de caspase da invenção incluem, entre outros, os polipeptídeos de caspase associados à apoptose, incluindo caspase 2, caspase 3, caspase 6, caspase 7, caspase 8, caspase 9 e caspase 10. Polipeptídeos de caspase da invenção incluem, porém sem limitações, polipeptídeos de caspase que iniciam apoptose, incluindo caspase 2, caspase 8, caspase 9 e caspase
10. Os polipeptídeos de caspase da invenção incluem, porém sem limitações, os polipeptídeos de caspase que executam apoptose, incluindo caspase 3, caspase 6 e caspase 7.
[002000] Os polipeptídeos de caspase da invenção podem ser codificados por uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos com uma ou mais modificações comparado com uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem. A sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de caspase da invenção pode ter códons otimizados. As uma ou mais modificações em uma sequência de aminoácidos e/ou ácidos nucleicos de um polipeptídeo de caspase da invenção podem aumentar uma interação, uma reticulação, uma ativação cruzada ou uma ativação do polipeptídeo de caspase da invenção comparado com uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem. Alternativamente, ou além disso, as uma ou mais modificações em uma sequência de aminoácidos e/ou ácidos nucleicos de um polipeptídeo de caspase da invenção podem diminuir a imunogenicidade do polipeptídeo de caspase da invenção comparado com uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem.
[002001] Os polipeptídeos de caspase da invenção podem ser truncados comparado com um polipeptídeo de caspase de tipo selvagem. Por exemplo, um polipeptídeo de caspase pode ser truncado para eliminar uma sequência que codifica um Domínio de Ativação e Recrutamento de Caspase (CARD) para eliminar ou minimizar a possibilidade de ativar uma resposta inflamatória local, além de iniciar a apoptose na célula que compreende um polipeptídeo de caspase indutível da invenção. A sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de caspase da invenção pode ser unida para formar uma sequência de aminoácidos variante do polipeptídeo de caspase da invenção comparado com um polipeptídeo de caspase de tipo selvagem. Os polipeptídeos de caspase da invenção podem ser codificados por sequências recombinantes e/ou quiméricas. Os polipeptídeos de caspase recombinantes e/ou quiméricos da invenção podem incluir sequências de um ou mais polipeptídeos de caspase diferentes. Alternativamente, ou além disso, os polipeptídeos de caspase recombinantes e/ou quiméricos da invenção podem incluir sequências de uma ou mais espécies (por exemplo, uma sequência humana e uma sequência não humana). Os polipeptídeos de caspase da invenção podem não ocorrer naturalmente.
[002002] A região de ligação de ligante de um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção pode incluir qualquer sequência de polipeptídeos que facilite ou promova a dimerização de um primeiro polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção com um segundo polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção, cuja dimerização ativa ou induz à reticulação dos polipeptídeos pró-apoptóticos e o início de apoptose na célula.
[002003] A região de ligação de ligante ("dimerização") pode compreender qualquer polipeptídeo ou domínio funcional que permita a indução usando um ligante endógeno ou de ocorrência não natural (isto é, agente de indução), por exemplo, um agente não natural ligante sintético recorrente. A região de ligação de ligante pode ser interna ou externa à membrana celular, dependendo da natureza do polipeptídeo pró-apoptótico indutível e da escolha do ligante (isto é, agente de indução). É conhecida uma grande variedade de polipeptídeos de ligação de ligantes e seus domínios funcionais, incluindo receptores. As regiões de ligação de ligante da invenção podem incluir uma ou mais sequências de um receptor. De particular interesse são as regiões de ligação de ligante para as quais ligantes (por exemplo, pequenos ligantes orgânicos) são conhecidos ou podem ser facilmente produzidos. Estas regiões ou receptores de ligação de ligantes podem incluir, porém sem limitações, receptores de FKBPs e ciclofilina, receptores de esteroides, receptores de tetraciclina e assim por diante, bem como receptores de ocorrência "não natural", os quais podem ser obtidos a partir de anticorpos, particularmente a subunidade de cadeia pesada ou leve, suas sequências mutantes, sequências aleatórias de aminoácidos obtidas por meio de procedimentos estocásticos, sínteses combinatórias e assim por diante. Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante é selecionada a partir do grupo que consiste em uma região de ligação de ligante FKBP, uma região de ligação de ligante de receptores de ciclofilina, uma região de ligação de ligante de receptores de esteroides, uma região de ligação de ligante de receptores de ciclofilina e uma região de ligação de ligante de receptores de ciclofilina e uma região de ligação de ligante de receptores de tetraciclina.
[002004] As regiões de ligação de ligante que compreendem um ou mais domínios receptores podem ter pelo menos cerca de 50 aminoácidos e menos de cerca de 350 aminoácidos, geralmente menos de 200 aminoácidos, tal como um domínio endógeno ou porção ativa truncada do mesmo. A região de ligação pode, por exemplo, ser pequena (< 25 kDa, para permitir uma transfecção eficiente em vetores virais), monomérica, não imunogênica, ter ligantes não tóxicos sinteticamente acessíveis, permeáveis às células, os quais podem ser configurados para dimerização.
[002005] As regiões de ligação de ligante que compreendem um ou mais domínios receptores podem ser intracelulares ou extracelulares, dependendo do design do polipeptídeo pró-apoptótico indutível e da disponibilidade de um ligante apropriado (isto é, agente de indução). Para ligantes hidrofóbicos, a região de ligação pode estar em ambos os lados da membrana, porém, para ligantes hidrofílicos, particularmente ligantes de proteínas, a região de ligação geralmente será externa à membrana celular, a menos que exista um sistema de transporte para internalizar o ligante em uma forma na qual ele está disponível para ligação. Para um receptor intracelular, o polipeptídeo pró-apoptótico indutível ou um transposon ou vetor que compreende o polipeptídeo pró- apoptótico indutível pode codificar um peptídeo sinalizador e domínio transmembrana 5' ou 3' da sequência do domínio receptor ou pode ter uma sequência sinalizadora de ligação lipídica 5' da sequência do domínio receptor. Onde o domínio receptor está entre o peptídeo sinalizador e o domínio transmembrana, o domínio receptor será extracelular.
[002006] Anticorpos e subunidades de anticorpos, por exemplo, cadeia pesada ou leve, particularmente fragmentos, mais particularmente toda ou parte da região variável ou fusões de cadeias pesada e leve para criar ligação de alta afinidade, podem ser usados como região de ligação de ligante da invenção. Os anticorpos considerados incluem aqueles que são um produto humano expresso ectopicamente, tal como um domínio extracelular que não desencadeia uma resposta imune e geralmente não é expresso na periferia (isto é, fora da área do SNC/cérebro). Tais exemplos incluem, porém sem limitações, receptor de fator de crescimento de nervo de baixa afinidade (LNGFR) e proteínas da superfície embrionária (isto é, antígeno carcinoembrionário). Além disso, os anticorpos podem ser preparados contra moléculas haptênicas, as quais são fisiologicamente aceitáveis, e as subunidades de anticorpos individuais pesquisadas quanto à afinidade de ligação. O cDNA que codifica as subunidades pode ser isolado e modificado por meio de eliminação da região constante, partes da região variável, mutagênese da região variável ou similar para obter um domínio de proteína de ligação que tem a afinidade apropriada pelo ligante. Deste modo, quase qualquer composto haptênico fisiologicamente aceitável pode ser empregado como ligante ou constituir um epítopo para o ligante. Em vez de unidades de anticorpo, podem ser usados receptores endógenos, onde a região ou domínio de ligação é conhecida e existe um ligante útil ou conhecido para ligação.
[002007] Para a multimerização do receptor, o ligante para os domínios receptor/região de ligação de ligante dos polipeptídeos pró- apoptóticos indutíveis pode ser multimérico no sentido de que o ligante pode ter pelo menos dois sítios de ligação, com cada um dos sítios de ligação capazes de se ligar a uma região receptora de ligante (isto é, um ligante com um primeiro sítio de ligação capaz de se ligar à região de ligação de ligante de um primeiro polipeptídeo pró-apoptótico indutível e um segundo sítio de ligação capaz de se ligar à região de ligação de ligante de um segundo polipeptídeo pró-apoptótico indutível, em que as regiões de ligação de ligante dos primeiro e segundo polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis são idênticas ou distintas). Assim, conforme usado aqui, o termo "região de ligação de ligante multimérica" se refere a uma região de ligação de ligante de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção que se liga a um ligante multimérico.
Ligantes multiméricos da invenção incluem ligantes diméricos.
Um ligante dimérico da invenção pode ter dois sítios de ligação capazes de se ligar ao domínio receptor de ligante.
Em determinadas modalidades, os ligantes multiméricos da invenção são um oligômero de ordem dimérica ou mais alto, geralmente não superior a cerca de tetramérica, de pequenas moléculas orgânicas sintéticas, as moléculas individuais tendo, tipicamente, pelo menos cerca de 150 Da e menos de cerca de 5 kDa, geralmente menos de cerca de 3 kDa.
Uma variedade de pares de ligantes e receptores sintéticos pode ser empregada.
Por exemplo, em modalidades envolvendo receptores endógenos, o FK506 dimérico pode ser usado com um receptor FKBP12, a ciclosporina A dimerizada pode ser usada com o receptor de ciclofilina, estrogênio dimerizado com um receptor de estrogênio, glicocorticoides dimerizados com um receptor de glicocorticoide, tetraciclina dimerizada com o receptor de tetraciclina, vitamina D dimerizada com o receptor de vitamina D e assim por diante.
Alternativamente, podem ser usadas ordens mais elevadas dos ligantes, por exemplo, triméricos. Para modalidades que envolvem receptores de ocorrência não natural, por exemplo, subunidades de anticorpos, subunidades de anticorpos modificadas, anticorpos com uma única cadeia que compreendem regiões variáveis de cadeia pesada e leve em tandem separadas por um ligante flexível ou receptores modificados, e suas sequências mutante e assim por diante, qualquer um de uma grande variedade de compostos pode ser usado. Uma característica significativa das unidades que compreendem um ligante multimérico da invenção é que cada sítio de ligação é capaz de se ligar ao receptor com alta afinidade e, de preferência, podem ser dimerizados quimicamente. Além disso, estão disponíveis métodos para equilibrar a hidrofobicidade/hidrofilicidade dos ligantes para que eles possam dissolver no soro em níveis funcionais e difundir-se pelas membranas plasmáticas para a maioria das aplicações.
[002008] A ativação de polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção pode ser realizada, por exemplo, através de dimerização quimicamente induzida (CID) mediada por um agente de indução para produzir uma proteína ou polipeptídeo condicionalmente controlado. Os polipeptídeos pró-apoptóticos da invenção não são apenas indutíveis, mas a indução destes polipeptídeos também é reversível em virtude da degradação do agente dimerizante lábil ou à administração de um inibidor competitivo monomérico.
[002009] Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em determinadas modalidades, a região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de FKBP12 que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V). Em determinadas modalidades, nas quais a região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de FKBP12 que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V), o agente de indução pode compreender AP1903, um fármaco sintético (Nome no Índice CAS: 2-Piperidinocarboxílico, 1-[(2S)-1-oxo-2-(3,4,5-trimetoxifenil)butil]-1,2- etanodiilbis[imino(2-oxo-2,1-etanodiil)oxi-éster 3,1-fenileno[(1R)-3-(3,4- dimetoxifenil)propilideno]], [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) Número de Registro CAS: 195514-63-7; Fórmula molecular: C78H98N4O20; Peso molecular: 1411,65)). Em determinadas modalidades nas quais a região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de FKBP12 que tem uma substituição de valina (V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V), o agente de indução pode compreender AP20187 (número de Registro CAS: 195514-80- 8 e Fórmula Molecular: C82H107N5O20). Em determinadas modalidades, o agente de indução é um análogo de AP20187 tal como, por exemplo, AP1510. Conforme usado aqui, os agentes de indução AP20187, AP1903 e AP1510 podem ser usados de forma alternada.
[002010] O API AP1903 é fabricado pela Alphora Research Inc. e o fármaco AP1903 para injeção é fabricado pela Formatech Inc. Ele é formulado como uma solução a 5 mg/mL de AP1903 em uma solução a 25 % do solubilizante não iônico Solutol HS 15 (250 mg/mL, BASF). Em temperatura ambiente, esta formulação é uma solução clara, ligeiramente amarela. Sob refrigeração, esta formulação passa por uma transição de fase reversível, resultando em uma solução leitosa. Esta transição de fase é revertida após o reaquecimento para a temperatura ambiente. O enchimento é de 2,33 mL em um frasco de vidro de 3 mL (aproximadamente 10 mg de AP1903 por injeção total por frasco). Ao determinar a necessidade de administrar o AP1903, os pacientes podem receber, por exemplo, uma dose fixa única de AP1903 para injeção (0,4 mg/kg) através de infusão intravenosa durante 2 horas usando um conjunto de infusão esterilizado não DEHP e óxido de etileno. A dose de AP1903 é calculada individualmente para todos os pacientes e não deve ser recalculada, a menos que o peso corporal flutue em ± 10 %. A dose calculada é diluída em 100 mL em solução salina a 0,9 % antes de infusão. Em um estudo anterior de Fase I do AP1903, 24 voluntários saudáveis foram tratados com doses únicas de AP1903 para injeção em níveis de dose de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 e 1,0 mg/kg com infusão IV durante 2 horas. Os níveis plasmáticos de AP1903 foram diretamente proporcionais à dose, com valores médios de Cmax variando a partir de cerca de 10-1275 ng/mL na faixa de doses de 0,01-1,0 mg/kg. Após o período inicial de infusão, as concentrações sanguíneas demonstraram uma fase de distribuição rápida, com os níveis plasmáticos reduzidos para aproximadamente 18, 7 e 1 % da concentração máxima em 0,5, 2 e 10 horas após a dose, respectivamente. Foi mostrado que o AP1903 para injeção é seguro e bem tolerado em todos os níveis de dose e demonstrou um perfil farmacocinético favorável. Iuliucci J.D., et al., J. Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001.
[002011] A dose fixa de AP1903 para injeção usada, por exemplo, pode ser de 0,4 mg/kg por infusão intravenosa ao longo de 2 horas. A quantidade de AP1903 necessária in vitro para sinalização eficaz das células é 10-100 nM (1600 Da MW). Isto equivale a 16-160 μg/L ou −0,016-1,6 μg/kg (1,6-160 μg/kg). Doses de até 1 mg/kg foram bem toleradas no estudo de fase I de AP1903 descrito acima. Portanto, 0,4 mg/kg pode ser uma dose segura e eficaz de AP1903 para este estudo de fase I em combinação com as células terapêuticas.
[002012] A sequência de aminoácidos e/ou de ácidos nucleicos que codifica a ligação de ligante da invenção pode conter a sequência uma ou mais modificações comparado com uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos de tipo selvagem. Por exemplo, a sequência de aminoácidos e/ou sequência de ácidos nucleicos que codifica a região de ligação de ligante da invenção pode ser uma sequência com códons otimizados. As uma ou mais modificações podem aumentar a afinidade de ligação de um ligante (por exemplo, um agente de indução) pela região de ligação de ligante da invenção comparado com um polipeptídeo de tipo selvagem. Alternativamente, ou além disso, as uma ou mais modificações podem diminuir a imunogenicidade da região de ligação de ligante da invenção comparado com um polipeptídeo de tipo selvagem. As regiões de ligação de ligante da invenção e/ou agentes de indução da invenção podem não ocorrer naturalmente.
[002013] Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção compreendem uma região de ligação de ligante, um ligante e um peptídeo pró-apoptótico, em que o polipeptídeo pró-apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em determinadas modalidades, a sequência não humana compreende um sítio de restrição. O ligante pode compreender qualquer material orgânico ou inorgânico que permita, mediante dimerização da região de ligação de ligante, interação, reticulação, ativação cruzada ou ativação dos polipeptídeos pró-apoptóticos, de modo que a interação ou ativação dos polipeptídeos pró-apoptóticos inicie a apoptose na célula. Em determinadas modalidades, o ligante é um polipeptídeo. Em determinadas modalidades, o ligante é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos rica em G/S (um ligante "GS"). Em determinadas modalidades, o ligante é um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 18024). Em modalidades preferidas, o ligante é um polipeptídeo e o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo não contém um sítio de restrição para uma endonuclease de restrição. Os ligantes da invenção podem não ocorrer naturalmente.
[002014] Os polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção podem ser expressos em uma célula sob a regulação transcricional de qualquer promotor capaz de iniciar e/ou regular a expressão de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção nesta célula.
O termo "promotor", conforme usado aqui, se refere a um promotor que atua como o sítio de ligação inicial para que a RNA polimerase transcreva um gene.
Por exemplo, polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção podem ser expressos em uma célula de mamífero sob a regulação transcricional de qualquer promotor capaz de iniciar e/ou regular a expressão de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção em uma célula de mamífero incluindo, porém sem limitações, promotores nativos, endógenos, exógenos e heterólogos.
As células de mamífero preferidas incluem células humanas.
Assim, polipeptídeos pró-apoptóticos indutíveis da invenção podem ser expressos em uma célula humana sob a regulação transcricional de qualquer promotor capaz de iniciar e/ou regular a expressão de um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção em uma célula humana incluindo, porém sem limitações, um promotor humano ou um promotor viral.
Exemplos de promotores para expressão em células humanas incluem, porém sem limitações, um promotor genético precoce imediato de citomegalovírus humano (CMV), um promotor precoce de SV40, uma repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous, um promotor de β-actina, um promotor de insulina de rato e um promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, cada um dos quais pode ser usado para obter uma expressão em alto nível de um polipeptídeo pró- apoptótico indutível da invenção.
O uso de outros promotores de fagos bacterianos ou celulares de mamíferos ou virais que são bem conhecidos na técnica para alcançar a expressão de um polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção também é considerado, contanto que os níveis de expressão sejam suficientes para iniciar a apoptose em uma célula.
Ao empregar um promotor com propriedades bem conhecidas, o nível e padrão de expressão da proteína de interesse após a transfecção ou transformação podem ser otimizados.
[002015] A seleção de um promotor que é regulado em resposta a sinais fisiológicos ou sintéticos específicos pode permitir a expressão indutível do polipeptídeo pró-apoptótico indutível da invenção.
O sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) é um destes sistemas.
Este sistema foi concebido para permitir a expressão regulada de um gene de interesse em células de mamíferos.
Ele consiste em um mecanismo de expressão rigidamente regulado que não permite praticamente nenhuma expressão ao nível basal de um transgene, mas tem uma capacidade de indução de mais de 200 vezes.
O sistema se baseia no receptor heterodimérico ecdisona de Drosophila e, quando a ecdisona ou um análogo, tal como muristerona A, se liga ao receptor, o receptor ativa um promotor para ativar a expressão do transgene a jusante e altos níveis de transcritos de mRNA são obtidos.
Neste sistema, ambos os monômeros do receptor heterodimérico são expressos constitutivamente a partir de um vetor, enquanto que o promotor responsivo à ecdisona, o qual controla a expressão do gene de interesse, está em outro plasmídeo.
A engenharia deste tipo de sistema em um vetor de interesse pode, portanto, ser útil.
Outro sistema indutível que pode ser útil é o sistema Tet-Off™ ou Tet-On™ (Clontech, Palo Alto, Califórnia), originalmente desenvolvido por Gossen e Bujard (Gossen e Bujard, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
EUA, 89 : 5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268: 1766-1769, 1995). Este sistema também permite que altos níveis de expressão gênica sejam regulados em resposta à tetraciclina ou derivados de tetraciclina, tal como doxiciclina.
No sistema Tet-On™, a expressão gênica é ativada na presença de doxiciclina enquanto que, no sistema Tet-Off™, a expressão gênica é ativada na ausência de doxiciclina.
Estes sistemas se baseiam em dois elementos reguladores derivados do óperon de resistência à tetraciclina de E. coli: a sequência do operador de tetraciclina (à qual o repressor de tetraciclina se liga) e a proteína repressora de tetraciclina.
O gene de interesse é clonado em um plasmídeo atrás de um promotor que tem elementos responsivos à tetraciclina presentes no mesmo. Um segundo plasmídeo contém um elemento regulador denominado transativador controlado por tetraciclina, o qual é composto, no sistema Tet-Off™, do domínio VP16 do vírus herpes simplex e do repressor de tetraciclina de tipo selvagem. Assim, na ausência de doxiciclina, a transcrição é constitutivamente ativada. No sistema Tet-On™, o repressor de tetraciclina não é de tipo selvagem e, na presença de doxiciclina, ativa a transcrição. Para a produção do vetor de terapia genética, o sistema Tet-Off ™ pode ser usado para que as células produtoras possam crescer na presença de tetraciclina ou doxiciclina e impedir a expressão de um transgene potencialmente tóxico, mas quando o vetor é introduzido no paciente, a expressão gênica seria constitutivamente ativada.
[002016] Em algumas circunstâncias, é desejável regular a expressão de um transgene em um vetor de terapia genética. Por exemplo, diferentes promotores virais com diferentes níveis de atividade são usados dependendo do nível de expressão desejado. Nas células de mamíferos, o promotor imediato do CMV é frequentemente usado para conferir forte ativação transcricional. O promotor de CMV é revisto em Donnelly, J.J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15: 617-48. Também foram usadas versões modificadas do promotor de CMV que são menos potentes quando se deseja níveis reduzidos de expressão do transgene. Quando se deseja a expressão de um transgene nas células hematopoiéticas, são frequentemente usados promotores retrovirais, tais como LTRs de MLV ou MMTV. Outros promotores virais que são usados dependendo do efeito desejado incluem SV40, RSV LTR, HIV- 1 e HIV-2 LTR, promotores de adenovírus, tais como nas regiões E1A, E2A ou MLP, AAV LTR, HSV-TK e vírus do sarcoma aviário.
[002017] Em outros exemplos, podem ser selecionados promotores que são regulados pelo desenvolvimento e são ativos em determinadas células diferenciadas. Assim, por exemplo, um promotor pode não ser ativo em uma célula-tronco pluripotente, mas, por exemplo, onde a célula-tronco pluripotente se diferencia em uma célula mais madura, o promotor pode, então, ser ativado.
[002018] Do mesmo modo, os promotores específicos para tecido são usados para realizar a transcrição em tecidos ou células específicas de modo a reduzir o potencial de toxicidade ou efeitos indesejáveis para tecidos não alvo. Estes promotores podem resultar em expressão reduzida quando comparado com um promotor mais forte, tal como o promotor do CMV, mas também podem resultar em expressão mais limitada e imunogenicidade (Bojak, A., et al., 2002. Vaccine. 20: 1975- 79; Cazeaux, N. et al., 2002. Vaccine 20: 3322-31). Por exemplo, promotores específicos para tecido, tal como o promotor associado ao PSA ou a calicreína glandular específica para próstata ou o gene da creatina quinase muscular podem ser usados quando apropriado.
[002019] Exemplos de promotores específicos para tecido ou específicos para diferenciação incluem, porém sem limitações, os seguintes: B29 (células B); CD14 (células monocíticas); CD43 (leucócitos e plaquetas); CD45 (células hematopoiéticas); CD68 (macrófagos); desmina (músculo); elastase-1 (células acinares pancreáticas); endoglina (células endoteliais); fibronectina (células diferenciadoras, tecidos cicatrizadores); e Flt-1 (células endoteliais); GFAP (astrócitos).
[002020] Em determinadas indicações, é desejável ativar a transcrição em momentos específicos após a administração do vetor de terapia genética. Isto é feito com promotores tais como aqueles que são reguláveis por hormônios ou citocinas. Os promotores responsivos a citocinas e proteínas inflamatórias que podem ser usados incluem o quininogênio K e T (Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-
2351), c-fos, TNF-alfa, proteína C reativa (Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16 (8), 3195-3207), haptoglobina (Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), amiloide sérico A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli e Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), Complemento C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL- 8, glicoproteína ácida alfa-1 (Prowse e Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipase (Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), angiotensinogênio (Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), fibrinogênio, c-jun (indutível por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiação UV, ácido retinoico e peróxido de hidrogênio), colagenase (induzida por ésteres de forbol e ácido retinoico), metalotioneína (indutível por metais pesados e glicocorticoides), estromelisina (indutível por éster de forbol, interleucina-1 e EGF), macroglobulina alfa-2 e anti-quimiotripsina alfa-1. Outros promotores incluem, por exemplo, SV40, MMTV, Vírus da Imunodeficiência Humana (MV), vírus Moloney, ALV, vírus de Epstein Barr, vírus do Sarcoma de Rous, actina humana, miosina, hemoglobina e creatina.
[002021] Considera-se que qualquer um dos promotores acima, individualmente ou em combinação entre si, pode ser útil, dependendo da ação pretendida. Os promotores e outros elementos reguladores são selecionados de modo a funcionarem nas células ou tecidos desejados. Além disso, esta lista de promotores não deve ser interpretada como exaustiva ou limitativa; outros promotores são usados em conjunto com os promotores e métodos descritos aqui. Estratégia de "Silenciamento" de Células T Armadas
[002022] As células T da invenção podem ser geneticamente modificadas para aumentar o seu potencial terapêutico. Alternativamente, ou além disso, as células T da invenção podem ser modificadas para torná-las menos sensíveis aos pontos de verificação imunes e/ou metabólicos. Modificações deste tipo "armam" as células T da invenção as quais, após a modificação, podem ser denominadas aqui como células T "armadas". As células T armadas da invenção podem ser produzidas, por exemplo, ao bloquear e/ou diluir sinais específicos do ponto de verificação distribuídos às células T (isto é, inibição do ponto de verificação) naturalmente, dentro do microambiente imunossupressor de tumor, por exemplo.
[002023] Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção é derivada de uma célula T, uma célula NK, uma célula progenitora hematopoiética, uma célula T derivada de sangue periférico (PB) (incluindo uma célula T isolada ou derivada de sangue periférico mobilizado com G-CSF) ou uma célula T derivada de sangue do cordão umbilical (UCB). Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção compreende um ou mais de um receptor antigênico quimérico (CLR que compreende um anticorpo com um único domínio)/receptor antigênico quimérico (CAR que compreende um suporte de proteína, um anticorpo, um ScFv ou um anticorpo mimético), uma CARTirina (um CAR que compreende uma Centirina) e/ou um VCAR (um CAR que compreende uma VHH de camelídeo ou uma VH com um único domínio) da invenção. Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção compreende um polipeptídeo pró-apoptótico indutível que compreende (a) uma região de ligação de ligante, (b) um ligante e (c) um polipeptídeo de caspase 9 truncado, em que o polipeptídeo pró- apoptótico indutível não compreende uma sequência não humana. Em algumas modalidades, a sequência não humana é um sítio de restrição. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de caspase indutível da região de ligação de ligante compreende um polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de proteína 12 de ligação a FK506 (FKBP12) compreende uma modificação na posição 36 da sequência. Em algumas modalidades, a modificação é uma substituição da valina
(V) por fenilalanina (F) na posição 36 (F36V). Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção compreende uma sequência exógena. Em algumas modalidades, a sequência exógena compreende uma sequência que codifica uma proteína terapêutica. Proteínas terapêuticas exemplificativas podem ser proteínas nucleares, citoplasmáticas, intracelulares, transmembranas, ligadas à superfície celular ou secretadas. Proteínas terapêuticas exemplificativas expressas pela célula T armada podem modificar uma atividade da célula T armada ou podem modificar uma atividade de uma segunda célula. Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção compreende um gene de seleção ou um marcador de seleção. Em algumas modalidades, uma célula T armada da invenção compreende um cassete de expressão gênica sintético (também denominado aqui como uma construção de transgene indutível).
[002024] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam receptor(es) de sinais inibidores do ponto de verificação para produzir uma célula T armada da invenção. Exemplos de sinais inibidores do ponto de verificação incluem, porém sem limitações, uma ligação do ligante PD-L1 a um receptor de PD-1 em uma célula CAR-T da invenção ou uma ligação da citocina TGF a um receptor TGFRII em uma célula CAR-T. Os receptores dos sinais inibidores do ponto de verificação são expressos na superfície celular ou no citoplasma de uma célula T. O silenciamento ou redução da expressão do gene que codifica o receptor do sinal do ponto de verificação inibidor resulta em uma perda de expressão proteica dos receptores do ponto de verificação inibidor na superfície ou no citoplasma de uma célula T armada da invenção. Assim, as células T armadas da invenção que têm expressão silenciada ou reduzida de um ou mais genes que codificam um receptor inibidor do ponto de verificação são resistentes, não receptivas ou insensíveis aos sinais do ponto de verificação. A resistência das células T armadas ou a diminuição da sensibilidade aos sinais inibidores do ponto de verificação aumentam o potencial terapêutico das células T armadas na presença destes sinais inibidores do ponto de verificação. Sinais do ponto de verificação inibidores incluem, porém sem limitações, os exemplos listados na Tabela 1. Os sinais do ponto de verificação inibidores exemplificativos que podem ser silenciados em uma célula T armado da invenção incluem, porém sem limitações, PD-1 e TGFRII. Tabela 1. Sinais inibidores do ponto de verificação (e proteínas que induzem à imunossupressão) exemplificativos
[002025] Um CSR da invenção pode compreender um endodomínio de qualquer uma das proteínas desta tabela.
[002026] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas intracelulares envolvidas na sinalização do ponto de verificação para produzir uma célula T armada da invenção. A atividade de uma célula T da invenção pode ser aumentada ao direcionar qualquer proteína de sinalização intracelular envolvida em uma via de sinalização do ponto de verificação, deste modo, alcançando inibição ou interferência dos pontos de verificação em uma ou mais vias do pontos de verificação. As proteínas de sinalização intracelular envolvidas na sinalização do ponto de verificação incluem, porém sem limitações, as proteínas de sinalização intracelular exemplificativas listadas na Tabela 2. Tabela 2. Proteínas sinalizadoras intracelulares exemplificativas
[002027] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam um receptor de morte celular ou apoptose celular para produzir uma célula T armada da invenção. A interação de um receptor de morte e seu ligante endógeno resulta em início da apoptose. A interrupção de uma expressão, uma atividade ou uma interação de um receptor e/ou ligante de morte celular e/ou apoptose celular torna uma célula T armada da invenção menos receptiva a sinais de morte, consequentemente, tornando a célula T armada da invenção mais eficaz em um ambiente tumoral. Um receptor de morte celular exemplificativo que pode ser modificado em uma célula T armada da invenção é Fas (CD95). Exemplos de receptores e ligantes de morte celular e/ou apoptose celular da invenção incluem, porém sem limitações, os receptores e ligantes exemplificativos fornecidos na Tabela 4. Tabela 4. Receptores e ligantes de morte celular e/ou apoptose celular exemplificativos
[002028] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam uma proteína de detecção metabólica para produzir uma célula T armada da invenção. A interrupção da detecção metabólica do microambiente tumoral imunossupressor (caracterizado por baixos níveis de oxigênio, pH, glicose e outras moléculas) por uma célula T armada da invenção leva à retenção prolongada de função das células T e, consequentemente, mais células tumorais mortas pela célula T armada. Por exemplo, HIF1a e BVS desempenham um papel na função das células T enquanto estiverem em um ambiente hipóxico. Uma célula T armada da invenção pode ter a expressão de um ou mais genes que codificam HIF1a ou VHL silenciada ou reduzida. Os genes e proteínas envolvidos na detecção metabólica incluem, dentre outros, os genes e proteínas exemplificativos fornecidos na Tabela 5. Tabela 5. Genes de detecção metabólica (e proteínas codificadas) exemplificativos
[002029] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que conferem sensibilidade a uma terapia para o câncer, incluindo um anticorpo monoclonal, para produzir uma célula T armada da invenção. Assim, uma célula T armada da invenção pode funcionar e pode demonstrar função ou eficácia superior enquanto estiver na presença de uma terapia para o câncer (por exemplo, uma quimioterapia, uma terapia com anticorpo monoclonal ou outro tratamento antitumoral). As proteínas envolvidas na conferência de sensibilidade a uma terapia para o câncer incluem, porém sem limitações, as proteínas exemplificativas fornecidas na Tabela 6. Tabela 6. Proteínas que conferem sensibilidade a um tratamento terapêutico contra o câncer exemplificativas
[002030] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para silenciar ou reduzir a expressão de um ou mais genes que codificam um fator de vantagem de crescimento para produzir uma célula T armada. Silenciar ou reduzir a expressão de um oncogene pode conferir uma vantagem de crescimento para uma célula T armada da invenção. Por exemplo, silenciar ou reduzir a expressão (por exemplo, interromper a expressão) de um gene TET2 durante um processo de produção de um CAR-T resulta na geração de um CAR-T armado com uma capacidade significativa de expansão e subsequente erradicação de um tumor quando comparado com um CAR-T não armado sem tal capacidade de expansão. Esta estratégia pode ser acoplada a um permutador de segurança (por exemplo, um permutador de segurança iC9 da invenção) que permite a interrupção direcionada de uma célula CAR-T armada no caso de uma reação adversa em um indivíduo ou crescimento descontrolado do CAR-T armado. Exemplos de fatores de vantagem de crescimento incluem, dentre outros, os fatores fornecidos na Tabela 7. Tabela 7. Fatores de vantagem de crescimento exemplificativos Estratégia de "Receptor Nulo ou de Permuta" em Células T Armadas
[002031] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para expressar um receptor do ponto de verificação quimérico/modificado para produzir uma célula T armada da invenção.
[002032] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação modificado/quimérico compreende um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante. Um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante da invenção pode ser um receptor/proteína modificado/quimérico. Um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante da invenção pode ser truncado para expressão do domínio de sinalização intracelular. Alternativamente, ou além disso, um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante da invenção pode ser mutante dentro de um domínio de sinalização intracelular em uma ou mais posições de aminoácidos que são determinantes ou necessárias para a sinalização eficaz. O truncamento ou mutação de receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante da invenção pode resultar em perda da capacidade do receptor de transmitir ou transduzir um sinal do ponto de verificação para a célula ou dentro da célula.
[002033] Por exemplo, uma diluição ou um bloqueio de um sinal do ponto de verificação imunossupressor de um receptor PD-L1 expresso na superfície de uma célula tumoral pode ser alcançado ao expressar um receptor nulo de PD-1 modificado/quimérico na superfície de uma célula T armada da invenção que concorre efetivamente com os receptores de PD-1 endógenos (não modificados) também expressos na superfície da célula T armada para reduzir ou inibir a transdução do sinal do ponto de verificação imunossupressor através de receptores de PD-1 endógenos da célula T armada. Nesta modalidade exemplificativa, a competição entre os dois receptores diferentes pela ligação ao PD-L1 expressos na célula tumoral reduz ou diminui um nível de sinalização eficaz do ponto de verificação, deste modo, aumentando o potencial terapêutico da célula T armada que expressa o receptor nulo de PD-1.
[002034] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação modificado/quimérico compreende um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante que é um receptor transmembrana.
[002035] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação modificado/quimérico compreende um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante que é um receptor/proteína associado à membrana ou ligado à membrana.
[002036] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação modificado/quimérico compreende um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante que é um receptor/proteína intracelular.
[002037] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação modificado/quimérico compreende um receptor nulo, receptor de chamariz (decoy) ou receptor negativo dominante que é um receptor/proteína intracelular. Exemplos de receptores/proteínas intracelulares nulos, de chamariz (decoy) ou dominantes negativos da invenção incluem, porém sem limitações, componentes de sinalização a jusante de um sinal do ponto de verificação inibidor (conforme fornecido, por exemplo, nas Tabelas 1 e 2), um fator de transcrição (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 3), uma citocina ou um receptor de citocina, uma quimiocina ou um receptor de quimiocina, um receptor/ligante de morte celular ou apoptose (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 4), uma molécula de detecção metabólica (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 5), uma proteína que confere sensibilidade a uma terapia para o câncer (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 6) e um oncogene ou um gene supressor de tumor (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 7). Citocinas,
receptores de citocina, quimiocinas e receptores de quimiocina exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, receptores de citocinas e citocinas, bem como receptores de quimiocinas e quimiocinas fornecidos na Tabela 8. Tabela 8. Citocinas, receptores de citocinas, quimiocinas e receptores de quimiocina exemplificativos
[002038] Em algumas modalidades, o receptor do ponto de verificação quimérico/modificado compreende um receptor de permuta. Exemplos de receptores de permuta podem compreender um receptor/proteína modificada/quimérica da invenção em que um domínio de sinalização intracelular de tipo nativo ou selvagem é trocado ou substituído por um domínio de sinalização intracelular diferente que não é nativo da proteína e/ou não é um domínio de tipo selvagem. Por exemplo, a substituição de um domínio de sinalização inibidor por um domínio de sinalização estimulador trocaria um sinal imunossupressor por um sinal imunoestimulador. Alternativamente, a substituição de um domínio de sinalização inibidor por um domínio inibidor diferente pode reduzir ou aumentar o nível de sinalização inibidora. A expressão ou superexpressão de um receptor de permuta pode resultar na diluição e/ou bloqueio de um sinal do ponto de verificação cognato através da competição com um receptor do ponto de verificação de tipo selvagem endógeno (não um receptor de troca) pela ligação ao receptor do ponto de verificação de cognato expresso dentro do microambiente tumoral imunossupressor. As células T armadas da invenção podem compreender uma sequência que codifica os receptores de permuta da invenção, levando à expressão de um ou mais receptores de permuta da invenção e, consequentemente, alterando uma atividade de uma célula T armada da invenção. As células T armadas da invenção podem expressar um receptor de troca da invenção que tem como alvo uma proteína expressa intracelularmente a jusante de um receptor do ponto de verificação, um fator de transcrição, um receptor de citocinas, um receptor de morte, uma molécula de detecção metabólica, uma terapia para o câncer, um oncogene e/ou uma proteína supressora de tumor ou gene da invenção.
[002039] Receptores de permuta exemplificativos da invenção podem compreender ou podem ser derivados de uma proteína incluindo, porém sem limitações, os componentes de uma sinalização inibidora a jusante de um sinal do ponto de verificação (conforme fornecido, por exemplo, nas Tabelas 1 e 2), fator de transcrição (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 3), uma citocina ou um receptor de citocina, uma quimiocina ou um receptor de quimiocina, um receptor/ligante de morte celular ou apoptose (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 4), uma molécula de detecção metabólica (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 5), uma proteína que confere sensibilidade a uma terapia para o câncer (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 6) e um oncogene ou um gene supressor de tumor (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 7). Citocinas, receptores de citocina, quimiocinas e receptores de quimiocina exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, receptores de citocinas e citocinas, bem como receptores de quimiocinas e quimiocinas fornecidos na Tabela 8. Células T Armadas - Sistema de Expressão Gênica Condicional
[002040] Em algumas modalidades, uma célula T da invenção é modificada para expressar o receptor do ligante quimérico (CLR) ou um receptor antigênico quimérico (CAR) que media a expressão gênica condicional para produzir uma célula T armada da invenção. A combinação do CLR/CAR e o sistema de expressão gênica condicional no núcleo da célula T armada constitui um sistema de expressão gênica sintético que é ativado condicionalmente quando de ligação do(s) ligante(s) cognato(s) ao CLR ou antígeno(s) cognato(s) ao CAR. Este sistema pode ajudar a 'armar' ou aprimorar o potencial terapêutico das células T modificadas, reduzindo ou limitando a expressão genética sintética no local da ligação de ligante ou antígeno, em ou dentro do ambiente do tumor, por exemplo. Receptores Exógenos
[002041] Em algumas modalidades, a célula T armada compreende uma composição que compreende (a) uma construção de transgene indutível que compreende uma sequência que codifica um promotor indutível e uma sequência que codifica um transgene e (b) uma construção de receptor que compreende uma sequência que codifica um promotor constitutivo e uma sequência que codifica um receptor exógeno, tal como um CLR ou CAR, em que, após integração da construção de (a) e da construção de (b) em uma sequência genômica de uma célula, o receptor exógeno é expresso e em que o receptor exógeno, ao se ligar a um ligante ou antígeno, transduz um sinal intracelular que tem como alvo direta ou indiretamente o promotor indutível que regula a expressão do transgene indutível (a) para modificar a expressão gênica.
[002042] Em algumas modalidades de um sistema de expressão gênica sintético da invenção, a composição modifica a expressão gênica ao reduzir a expressão gênica. Em algumas modalidades, a composição modifica a expressão gênica ao modificar transitoriamente a expressão gênica (por exemplo, pela duração da ligação do ligante ao receptor exógeno). Em algumas modalidades, a composição modifica acentuadamente a expressão do gene (por exemplo, o ligante se liga reversivelmente ao receptor exógeno). Em algumas modalidades, a composição modifica a expressão do gene cronicamente (por exemplo, o ligante se liga irreversivelmente ao receptor exógeno).
[002043] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor endógeno em relação à sequência genômica da célula. Receptores exemplificativos incluem,
porém sem limitações, receptores intracelulares, receptores na superfície celular, receptores transmembrana, canais de íons dependentes de ligantes e receptores acoplados à proteína G.
[002044] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o receptor que não ocorre naturalmente é um receptor sintético, modificado, recombinante, mutante ou quimérico. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende uma ou mais sequências isoladas ou derivadas de um receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende uma ou mais sequências isoladas ou derivadas de uma proteína de armação. Em algumas modalidades, incluindo aquelas em que o receptor não natural não compreende um domínio transmembrana, o receptor não natural interage com um segundo receptor transmembrana, ligado à membrana e/ou intracelular o qual, após contato com o receptor não natural, transduz um sinal intracelular.
[002045] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o receptor que não ocorre naturalmente é um receptor sintético, modificado, recombinante, mutante ou quimérico. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende uma ou mais sequências isoladas ou derivadas de um receptor de células T (TCR). Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende uma ou mais sequências isoladas ou derivadas de uma proteína de armação. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural interage com um receptor intracelular que transduz um sinal intracelular. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor de ocorrência não natural é um receptor antigênico quimérico (CLR). Em algumas modalidades, o CLR é um receptor antigênico quimérico (CAR).
[002046] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o CLR é um receptor antigênico quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o receptor antigênico quimérico compreende (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de ligantes, em que a região de reconhecimento de ligantes compreende pelo menos proteína de armação; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o ectodomínio de (a) compreende ainda um peptídeo sinalizador. Em algumas modalidades, o ectodomínio de (a) compreende ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento do ligante e o domínio transmembrana.
[002047] Em algumas modalidades dos CLR/CARs da invenção, o peptídeo sinalizador compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana. Em algumas modalidades, o peptídeo sinalizador compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD8α humana. Em algumas modalidades, o peptídeo sinalizador compreende uma sequência de aminoácidos que compreende MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 17503). Em algumas modalidades, o peptídeo sinalizador é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca (SEQ ID NO: 17504).
[002048] Em algumas modalidades dos CLR/CARs da invenção, o domínio transmembrana compreende uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD8α humana. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende uma sequência de aminoácidos que compreende: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 17505). Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgt actgc (SEQ ID NO: 17506).
[002049] Em algumas modalidades dos CLR/CARs da invenção, o endodomínio compreende um endodomínio de CD3 humana. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio coestimulatório compreende um segmento intracelular de 4-1BB, CD28, CD3zeta, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 humana ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio coestimulatório compreende um domínio coestimulatório de CD3zeta e/ou 4-1BB humana. Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de CD3zeta compreende uma sequência de aminoácidos que compreende:
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM
GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 17507).
[002050] Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de CD3zeta é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtata acgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgac cccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgc agaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagagg caaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctct gcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 17508).
[002051] Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de 4- 1BB compreende uma sequência de aminoácidos que compreende: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 17509). Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de 4-1BB é codificado por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactac ccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 17510).
[002052] Em algumas modalidades, o domínio coestimulatório de 4- 1BB está localizado entre o domínio transmembrana e o domínio coestimulatório de CD3.
[002053] Em algumas modalidades dos CLR/CARs da invenção, a dobradiça compreende uma sequência derivada de uma sequência de CD8α, IgG4 e/ou CD4 humana. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende uma sequência derivada de uma sequência de CD8α humana. Em algumas modalidades, a dobradiça compreende uma sequência de aminoácidos que compreende:
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 17511).
[002054] Em algumas modalidades, a dobradiça é codificada por uma sequência de ácidos nucleicos que compreende: actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagt ctgagacctgaggcctgcgggggggctctgcggggggctgtgcacggggggggcggggggg gggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
[002055] Em algumas modalidades, a dobradiça é codificada por:
ACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCAT
CGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAG CTGCAGGAGGCCGGGCTCTGTGCACCAGGGGGCCTGGACTTC13.
[002056] Em algumas modalidades, o pelo menos um suporte de proteína se liga especificamente ao ligante.
[002057] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o CLR é um receptor antigênico quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o receptor antigênico quimérico compreende (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de ligantes, em que a região de reconhecimento de ligantes compreende pelo menos proteína de armação; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o pelo menos um suporte de proteína compreende um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um anticorpo com um único domínio, um anticorpo com uma única cadeia, um mimético de anticorpo ou uma Centirina (denominada aqui como CARTirina). Em algumas modalidades, a região de reconhecimento de ligantes compreende um ou mais de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um anticorpo com um único domínio, um anticorpo com uma única cadeia, um mimético de anticorpo e uma Centirina. Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende ou consiste em uma VHH ou uma VH (denominado aqui como um VCAR). Em algumas modalidades, o anticorpo com um único domínio compreende ou consiste em uma VHH ou uma VH que compreende regiões determinantes da complementaridade (CDRs) humanas. Em algumas modalidades, a VH é uma proteína recombinante ou quimérica. Em algumas modalidades, a VH é uma proteína humana recombinante ou quimérica. Em algumas modalidades, o mimético de anticorpo compreende ou consiste em um aficorpo, uma aflilina, um afímero, uma afitina, um alfacorpo, uma anticalina, um avímero, uma DARPina, um Fynomer, um peptídeo com domínio Kunitz ou um monocorpo. Em algumas modalidades, a Centirina compreende ou consiste em uma sequência de consenso de pelo menos um domínio de fibronectina de tipo III (FN3).
[002058] Em algumas modalidades das composições da invenção, o receptor exógeno de (b) compreende um receptor de ocorrência não natural. Em algumas modalidades, o CLR é um receptor antigênico quimérico (CAR). Em algumas modalidades, o receptor antigênico quimérico compreende (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de ligantes, em que a região de reconhecimento de ligantes compreende pelo menos proteína de armação; (b) um domínio transmembrana e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, a Centirina compreende ou consiste em uma sequência de consenso de pelo menos um domínio de fibronectina de tipo III (FN3). Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio de fibronectina de tipo III (FN3) é derivado de uma proteína humana. Em algumas modalidades, a proteína humana é Tenascina-C. Em algumas modalidades, a sequência de consenso compreende:
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 17514).
[002059] Em algumas modalidades, a sequência de consenso compreende:
MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINL TVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 17515).
[002060] Em algumas modalidades, a sequência de consenso é modificada em uma ou mais posições dentro de (a) uma alça A-B que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos TEDS (SEQ ID NO: 17516) nas posições 13-16 da sequência de consenso; (b) uma alça B-C que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos TAPDAAF (SEQ ID NO: 17517) nas posições 22-28 da sequência de consenso; (c) uma alça C-D que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos SEKVGE (SEQ ID NO: 17518) nas posições 38 a 43 da sequência de consenso; (d) uma alça D-E que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos GSER (SEQ ID NO: 17519) nas posições 51-54 da sequência de consenso; (e) uma alça E-F que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos GLKPG (SEQ ID NO: 17520) nas posições 60-64 da sequência de consenso; (f) uma alça F-G que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos KGGHRSN (SEQ ID NO: 17521) nas posições 75-81 da sequência de consenso; ou (g) qualquer combinação de (a) - (f). Em algumas modalidades, a Centirina compreende uma sequência de consenso de pelo menos 5 domínios de fibronectina de tipo III (FN3). Em algumas modalidades, a Centirina compreende uma sequência de consenso de pelo menos 10 domínios de fibronectina de tipo III (FN3). Em algumas modalidades, a Centirina compreende uma sequência de consenso de pelo menos 15 domínios de fibronectina de tipo III (FN3). Em algumas modalidades, a armação se liga a um antígeno com uma afinidade pelo menos selecionada a partir de uma KD de menos do que ou igual a 10-9 M, menos do que ou igual a 10-10 M, menos do que ou igual a 10-11 M, menos do que ou igual a 10-12 M, menos do que ou igual a 10-13 M, menos do que ou igual a 10-14 M e menos do que ou igual a 10-15 M. Em algumas modalidades, a KD é determinada por meio de ressonância plasmônica de superfície. Promotores Indutíveis
[002061] Em algumas modalidades das composições da invenção, a sequência que codifica o promotor indutível de (a) compreende uma sequência que codifica um promotor de NFB. Em algumas modalidades das composições da invenção, a sequência que codifica o promotor indutível de (a) compreende uma sequência que codifica um promotor de interferon (IFN) ou uma sequência que codifica um promotor de interleucina-2. Em algumas modalidades, o promotor de interferon (IFN) é um promotor de IFNγ. Em algumas modalidades das composições da invenção, o promotor indutível é isolado ou derivado do promotor de uma citocina ou quimiocina. Em algumas modalidades, a citocina ou quimiocina compreende IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, fator de crescimento transformador beta (TGFβ), fator estimulador de colônia 2 (GM-CSF), interferon gama (IFNγ), fator de necrose tumoral (TNFα), LTα, perforina, Granzyme C (Gzmc), Granzyme B (Gzmb), ligante 5 de quimiocina com motivo CC (CCL5), ligante 4 de quimiocina com motivo CC (Ccl4), ligante 3 de quimiocina com motivo CC (Ccl3), ligante 1 de quimiocina com motivo XC (Xcl1) e citocina da família de interleucina 6 LIF (Lif).
[002062] Em algumas modalidades das composições da invenção, o promotor indutível é isolado ou derivado do promotor de um gene que compreende uma proteína na superfície envolvida na diferenciação, ativação, exaustão e função celular. Em algumas modalidades, o gene compreende CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL e 4-1BB.
[002063] Em algumas modalidades das composições da invenção, o promotor indutível é isolado ou derivado do promotor de um gene envolvido no metabolismo e diferenciação de CD. Em algumas modalidades das composições da invenção, o promotor indutível é isolado ou derivado do promotor Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9 (4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 e Neto2. Transgene Indutível
[002064] Em algumas modalidades, a construção de transgene indutível compreende ou controla a expressão de um componente de sinalização a jusante de um sinal do ponto de verificação inibidor (conforme fornecido, por exemplo, nas Tabelas 1 e 2), um fator de transcrição (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 3), uma citocina ou um receptor de citocina, uma quimiocina ou um receptor de quimiocina, um receptor/ligante de morte celular ou apoptose (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 4), uma molécula de detecção metabólica (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 5), uma proteína que confere sensibilidade a uma terapia para o câncer (conforme fornecida, por exemplo, na Tabela 6 ou 9) e um oncogene ou um gene supressor de tumor (conforme fornecido, por exemplo, na Tabela 7). Citocinas, receptores de citocina, quimiocinas e receptores de quimiocina exemplificativos da invenção incluem, porém sem limitações, receptores de citocinas e citocinas, bem como receptores de quimiocinas e quimiocinas fornecidos na Tabela 8. Tabela 9. Proteínas terapêuticas exemplificativas (e proteínas para melhorar a eficácia do CAR-T) Cas-Clover
[002065] A invenção fornece uma composição que compreende um RNA guia e uma proteína de fusão ou uma sequência que codifica a proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma dCas9 e uma endonuclease Clo051 ou um domínio de nuclease. Cas9 pequena (SaCas9)
[002066] A invenção fornece composições que compreendem uma Cas9 pequena (Cas9) operativamente ligada a um efetor. Em determinadas modalidades, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um componente de localização de DNA e uma molécula efetora, em que o efetor compreende uma Cas9 pequena (Cas9). Em determinadas modalidades, uma construção de Cas9 pequena da invenção pode compreender um efetor que compreende uma endonuclease de tipo IIS.
[002067] Sequência de aminoácidos de Cas9 de Staphylococcus aureus com um sítio catalítico ativo.
[002068] 1 mkrnyilgld igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
[002069] 61 rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
[002070] 121 vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
[002071] 181 kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
[002072] 241 peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
[002073] 301 keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
[002074] 361 sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
[002075] 421 lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
[002076] 481 eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
[002077] 541 ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeen skkgnrtpfq ylsssdskis
[002078] 601 yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
[002079] 661 rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
[002080] 721 ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
[002081] 781 relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
[002082] 841 klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
[002083] 901 rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
[002084] 961 efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
[002085] 1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg (SEQ ID NO: 18040). Cas9 pequena e inativada (dSaCas9)
[002086] A invenção fornece composições que compreendem uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9) operativamente ligada a um efetor. Em determinadas modalidades, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um componente de localização de DNA e uma molécula efetora, em que o efetor compreende uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9). Em determinadas modalidades, uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9) da invenção pode compreender um efetor que compreende uma endonuclease de tipo IIS. Cas9 pequena e inativada (dSaCas9)
[002087] A invenção fornece composições que compreendem uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9) operativamente ligada a um efetor. Em determinadas modalidades, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um componente de localização de DNA e uma molécula efetora, em que o efetor compreende uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9). Em determinadas modalidades, uma Cas9 pequena e inativada (dSaCas9) da invenção pode compreender um efetor que compreende uma endonuclease de tipo IIS.
[002088] Sequência dSaCas9: as mutações D10A e N580A (negrito, maiúsculo e sublinhado) inativam o sítio catalítico.
[002089] 1 mkrnyilgl A igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
[002090] 61 rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
[002091] 121 vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
[002092] 181 kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
[002093] 241 peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
[002094] 301 keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
[002095] 361 sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
[002096] 421 lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
[002097] 481 eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
[002098] 541 ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqee A skkgnrtpfq ylsssdskis
[002099] 601 yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
[002100] 661 rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
[002101] 721 ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
[002102] 781 relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
[002103] 841 klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
[002104] 901 rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
[002105] 961 efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
[002106] 1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg (SEQ ID NO: 18041). Cas9 inativada (dCas9)
[002107] A invenção fornece composições que compreende uma Cas9 inativada (dCas9) operativamente ligada a um efetor. Em determinadas modalidades, a invenção fornece uma proteína de fusão que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um componente de localização de DNA e uma molécula efetora, em que o efetor compreende uma Cas9 inativada (dCas9). Em determinadas modalidades, uma construção Cas9 (dCas9) inativada da invenção pode compreender um efetor que compreende uma endonuclease de tipo IIS.
[002108] Em determinadas modalidades, a dCas9 da invenção compreende uma dCas9 isolada ou derivada de Staphyloccocus pyogenes. Em determinadas modalidades, a dCas9 compreende uma dCas9 com substituições nas posições 10 e 840 da sequência de aminoácidos da dCas9 que inativam o sítio catalítico. Em determinadas modalidades, estas substituições são D10A e H840A. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos da dCas9 compreende a sequência de:
[002109] 1 XDKKYSIGL A IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK
KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
[002110] 61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM
AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG
[002111] 121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD
LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
[002112] 181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA
ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN
[002113] 241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT
YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI
[002114] 301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ
DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
[002115] 361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL
VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH
[002116] 421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY
YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE
[002117] 481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK
HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL
[002118] 541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK
KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
[002119] 601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE
MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
[002120] 661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN
RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
[002121] 721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV
MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER
[002122] 781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK
LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVD A
[002123] 841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV
PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL
[002124] 901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH
VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS
[002125] 961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN
AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK
[002126] 1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI
TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF
[002127] 1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI
LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
[002128] 1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME
RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
[002129] 1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS
KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
[002130] 1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV
LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA
[002131] 1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD (SEQ ID NO: 18042).
[002132] Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos de dCas9 compreende a sequência de:
[002133] 1 MDKKYSIGL A IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK
KFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
[002134] 61 ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM
AKVDDSFFHR LEESFLVEED KKHERHPIFG
[002135] 121 NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD
LRLIYLALAH MIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
[002136] 181 VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA
ILSARLSKSR RLENLIAQLP GEKKNGLFGN
[002137] 241 LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT
YDDDLDNLLA QIGDQYADLF LAAKNLSDAI
[002138] 301 LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ
DLTLLKALVR QQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
[002139] 361 GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL
VKLNREDLLR KQRTFDNGSI PHQIHLGELH
[002140] 421 AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY
YVGPLARGNS RFAWMTRKSE ETITPWNFEE
[002141] 481 VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK
HSLLYEYFTV YNELTKVKYV TEGMRKPAFL
[002142] 541 SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK
KIECFDSVEI SGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
[002143] 601 IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE
MIEERLKTYA HLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
[002144] 661 RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN
RNFMQLIHDD SLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
[002145] 721 HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV
MGRHKPENIV IEMARENQTT QKGQKNSRER
[002146] 781 MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK
LYLYYLQNGR DMYVDQELDI NRLSDYDVD A
[002147] 841 IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV
PSEEVVKKMK NYWRQLLNAK LITQRKFDNL
[002148] 901 TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH
VAQILDSRMN TKYDENDKLI REVKVITLKS
[002149] 961 KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN
AVVGTALIKK YPKLESEFVY GDYKVYDVRK
[002150] 1021 MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI
TLANGEIRKR PLIETNGETG EIVWDKGRDF
[002151] 1081 ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI
LPKRNSDKLI ARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
[002152] 1141 YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME
RSSFEKNPID FLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
[002153] 1201 YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS
KYVNFLYLAS HYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
[002154] 1261 QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV
LSAYNKHRDK PIREQAENII HLFTLTNLGA
[002155] 1321 PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRI DLSQLGGD (SEQ ID NO: 18043).
Endonuclease Clo051
[002156] Um domínio de nuclease Clo051 exemplificativo pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir n a sequência de aminoácidos de:
EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLV NEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQ ADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGK
FEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFN NSEFILKY (SEQ ID NO: 18044). Proteína de fusão Cas-Clover
[002157] Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão dCas9-Clo051 exemplificativa (modalidade 1) pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir na sequência de aminoácidos de (sequência Clo051 sublinhada, ligante em negrito itálico, sequência dCas9 (Streptoccocus pyogenes) em itálico):
MAPKKKRKV EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLV NEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQ ADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGK
FEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFN NSEFILKY GGGGS GSPKKKRKVSS (SEQ ID NO: 18045).
[002158] Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 1) pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir na sequência de ácidos nucleicos de (sequência dCas9 derivada de Streptoccocus pyogenes):
[002159] 1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa
[002160] 61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg
[002161] 121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac
[002162] 181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac
[002163] 241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc
[002164] 301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat
[002165] 361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa
[002166] 421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga
[002167] 481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc
[002168] 541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac
[002169] 601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga
[002170] 661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca
[002171] 721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt
[002172] 781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct
[002173] 841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac
[002174] 901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag
[002175] 961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat
[002176] 1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag
[002177] 1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt
[002178] 1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg
[002179] 1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca
[002180] 1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag
[002181] 1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg
[002182] 1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa
[002183] 1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac
[002184] 1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg
[002185] 1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac
[002186] 1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag
[002187] 1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc
[002188] 1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa
[002189] 1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga
[002190] 1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac
[002191] 1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc
[002192] 1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag
[002193] 2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca
[002194] 2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg
[002195] 2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag
[002196] 2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc
[002197] 2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat
[002198] 2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac
[002199] 2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac
[002200] 2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat
[002201] 2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg
[002202] 2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat
[002203] 2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc
[002204] 2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc
[002205] 2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc
[002206] 2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc
[002207] 2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag
[002208] 2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc
[002209] 3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat
[002210] 3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg
[002211] 3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag
[002212] 3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat
[002213] 3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat
[002214] 3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg
[002215] 3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact
[002216] 3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag
[002217] 3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag
[002218] 3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac
[002219] 3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc
[002220] 3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa
[002221] 3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc
[002222] 3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag
[002223] 3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc
[002224] 3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag
[002225] 3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc
[002226] 4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag
[002227] 4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt
[002228] 4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa
[002229] 4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac
[002230] 4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg
[002231] 4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc
[002232] 4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag
[002233] 4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat
[002234] 4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat
[002235] 4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac
[002236] 4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc
[002237] 4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat
[002238] 4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa (SEQ ID NO: 18046).
[002239] Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 1) da invenção pode compreender um DNA. Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 1) da invenção pode compreender um RNA.
[002240] Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão dCas9-Clo051 exemplar (modalidade 2) pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em, a sequência de aminoácidos da (sequência Clo051 sublinhada, ligante em negrito itálico, sequência dCas9 (Streptoccocus pyogenes) em itálico):
[002241] 1 MPKKKRKV EG IKSNISLLKD ELRGQISHIS
HEYLSLIDLA FDSKQNRLFE MKVLELLVNE
[002242] 61 YGFKGRHLGG SRKPDGIVYS TTLEDNFGII
VDTKAYSEGY SLPISQADEM ERYVRENSNR
[002243] 121 DEEVNPNKWW ENFSEEVKKY YFVFISGSFK
GKFEEQLRRL SMTTGVNGSA VNVVNLLLGA
[002244] 181 EKIRSGEMTI EELERAMFNN SEFILKY GGG GS
DKKYSIGL AIGTNSVGWA VITDEYKVPS
[002245] 241 KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA
EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSNE
[002246] 301 MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF
GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA
[002247] 361 DLRLIYLALA HMIKFRGHFL IEGDLNPDNS
DVDKLFIQLV QTYNQLFEEN PINASGVDAK
[002248] 421 AILSARLSKS RRLENLIAQL PGEKKNGLFG
NLIALSLGLT PNFKSNFDLA EDAKLQLSKD
[002249] 481 TYDDDLDNLL AQIGDQYADL FLAAKNLSDA
ILLSDILRVN TEITKAPLSA SMIKRYDEHH
[002250] 541 QDLTLLKALV RQQLPEKYKE IFFDQSKNGY
AGYIDGGASQ EEFYKFIKPI LEKMDGTEEL
[002251] 601 LVKLNREDLL RKQRTFDNGS IPHQIHLGEL
HAILRRQEDF YPFLKDNREK IEKILTFRIP
[002252] 661 YYVGPLARGN SRFAWMTRKS EETITPWNFE
EVVDKGASAQ SFIERMTNFD KNLPNEKVLP
[002253] 721 KHSLLYEYFT VYNELTKVKY VTEGMRKPAF
LSGEQKKAIV DLLFKTNRKV TVKQLKEDYF
[002254] 781 KKIECFDSVE ISGVEDRFNA SLGTYHDLLK
IIKDKDFLDN EENEDILEDI VLTLTLFEDR
[002255] 841 EMIEERLKTY AHLFDDKVMK QLKRRRYTGW
GRLSRKLING IRDKQSGKTI LDFLKSDGFA
[002256] 901 NRNFMQLIHD DSLTFKEDIQ KAQVSGQGDS
LHEHIANLAG SPAIKKGILQ TVKVVDELVK
[002257] 961 VMGRHKPENI VIEMARENQT TQKGQKNSRE
RMKRIEEGIK ELGSQILKEH PVENTQLQNE
[002258] 1021 KLYLYYLQNG RDMYVDQELD INRLSDYDVD
AIVPQSFLKD DSIDNKVLTR SDKNRGKSDN
[002259] 1081 VPSEEVVKKM KNYWRQLLNA KLITQRKFDN
LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK
[002260] 1141 HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK
SKLVSDFRKD FQFYKVREIN NYHHAHDAYL
[002261] 1201 NAVVGTALIK KYPKLESEFV YGDYKVYDVR
KMIAKSEQEI GKATAKYFFY SNIMNFFKTE
[002262] 1261 ITLANGEIRK RPLIETNGET GEIVWDKGRD
FATVRKVLSM PQVNIVKKTE VQTGGFSKES
[002263] 1321 ILPKRNSDKL IARKKDWDPK KYGGFDSPTV
AYSVLVVAKV EKGKSKKLKS VKELLGITIM
[002264] 1381 ERSSFEKNPI DFLEAKGYKE VKKDLIIKLP
KYSLFELENG RKRMLASAGE LQKGNELALP
[002265] 1441 SKYVNFLYLA SHYEKLKGSP EDNEQKQLFV
EQHKHYLDEI IEQISEFSKR VILADANLDK
[002266] 1501 VLSAYNKHRD KPIREQAENI IHLFTLTNLG
APAAFKYFDT TIDRKRYTST KEVLDATLIH
[002267] 1561 QSITGLYETR IDLSQLGGD G SPKKKRKV (SEQ ID NO: 18047).
[002268] Em determinadas modalidades, uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 2) pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir na sequência de ácidos nucleicos de (sequência dCas9 derivada de Streptoccocus pyogenes):
[002269] 1 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac
[002270] 61 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct
[002271] 121 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag
[002272] 181 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt
[002273] 241 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat
[002274] 301 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga
[002275] 361 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac
[002276] 421 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg
[002277] 481 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct
[002278] 541 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat
[002279] 601 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta
[002280] 661 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca
[002281] 721 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt
[002282] 781 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg
[002283] 841 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag
[002284] 901 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag
[002285] 961 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat
[002286] 1021 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg
[002287] 1081 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc
[002288] 1141 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta
[002289] 1201 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag
[002290] 1261 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta
[002291] 1321 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca
[002292] 1381 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac
[002293] 1441 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta
[002294] 1501 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat
[002295] 1561 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac
[002296] 1621 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa
[002297] 1681 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa
[002298] 1741 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg
[002299] 1801 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc
[002300] 1861 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt
[002301] 1921 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct
[002302] 1981 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc
[002303] 2041 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa
[002304] 2101 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct
[002305] 2161 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat
[002306] 2221 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta
[002307] 2281 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt
[002308] 2341 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg
[002309] 2401 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac
[002310] 2461 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg
[002311] 2521 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa
[002312] 2581 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg
[002313] 2641 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc
[002314] 2701 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa
[002315] 2761 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt
[002316] 2821 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag
[002317] 2881 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg
[002318] 2941 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa
[002319] 3001 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag
[002320] 3061 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac
[002321] 3121 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac
[002322] 3181 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat
[002323] 3241 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg
[002324] 3301 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct
[002325] 3361 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag
[002326] 3421 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg
[002327] 3481 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat
[002328] 3541 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt
[002329] 3601 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg
[002330] 3661 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata
[002331] 3721 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa
[002332] 3781 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca
[002333] 3841 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg
[002334] 3901 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg
[002335] 3961 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa
[002336] 4021 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt
[002337] 4081 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg
[002338] 4141 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa
[002339] 4201 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc
[002340] 4261 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg
[002341] 4321 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct
[002342] 4381 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc
[002343] 4441 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa
[002344] 4501 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt
[002345] 4561 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca
[002346] 4621 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac
[002347] 4681 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga
[002348] 4741 tcccccaaga agaagaggaa agtctga (SEQ ID NO: 18048).
[002349] Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 2) da invenção pode compreender um DNA. Em determinadas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína de fusão dCas9-Clo051 (modalidade 2) da invenção pode compreender um RNA.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Eficiência de silenciamento das proteínas de sinalização do ponto de verificação em células T armadas
[002350] Para criar células T armadas que têm potencial terapêutico aprimorado, modificações genéticas podem ser feitas para tornar as células T menos sensíveis aos pontos de verificação imunes e/ou metabólicos. Um mecanismo para produzir células T armadas é inibir a sinalização do ponto de verificação e eliminar diversos receptores do ponto de verificação. A plataforma Cas-CLOVER™ foi usada para direcionar e eliminar os receptores PD-1, TGF  R2, LAG-3, Tim-3 e CTLA-4 em células T primárias em repouso (ou quiescentes). Conforme medido por citometria de fluxo, a edição gênica resultou em perda de 30 a 70 % da expressão da proteína na superfície da célula (Figura 11). Estes resultados mostram que Cas-CLOVER™ é capaz de atingir com eficiência o silenciamento destes genes, resultando na perda da expressão da proteína-alvo na superfície das células T. A eficiência de silenciamento pode ser significativamente aumentada pela otimização adicional dos pares de RNA guia ou pelo uso de pares de RNA guia adicionais direcionados ao mesmo gene e/ou reguladores ou promotores do gene alvo. Exemplo 2: Estratégias para expressão de proteínas de sinalização intracelular nulas ou de permuta em células T armadas
[002351] Outra estratégia para produzir células T armadas é reduzir ou inibir a sinalização ao ponto de verificação endógena ao expressar vários receptores do ponto de verificação modificados/quiméricos que têm um domínio de sinalização intracelular alterado ou ausente. Os sinais do ponto de verificação que poderiam ser direcionados usando esta estratégia incluem PD-1 ou TGFβRII de células T, os quais se ligam ao ligante PD-L1 e citocina TGFβ, respectivamente. A Figura 12 mostra um diagrama esquemático de várias estratégias para a produção de receptor negativo chamariz (decoy)/nulo/dominante (receptores nulos)
para dois receptores inibidores diferentes (PD-1 (painel superior) e TGFRII (painel inferior)). Para conceber os receptores nulos, o domínio intracelular (ICD) de PD1 ou TGFRII pode sofrer mutação (mutante nulo) ou suprimido (Nulo Truncado). Como um resultado, a ligação do(s) ligante(s) cognato(s) do receptor nulo não resulta na distribuição do sinal do ponto de verificação às células T.
Além disso, uma vez que o receptor Nulo compete com os receptores de tipo selvagem pela ligação do(s) ligante(s) endógeno(s), qualquer ligação pelo receptor nulo evita a ligação do(s) ligante(s) endógeno(s) ao receptor de tipo selvagem.
Isto resulta em diluição do nível geral de sinalização do ponto de verificação efetivamente distribuído à célula T, deste modo, reduzindo ou bloqueando a inibição do ponto de verificação.
A Figura 12 também mostra estratégias de concepção de receptores de permuta para os receptores inibidores de PD-1 (painel superior) e TGFRII (painel inferior). Nos receptores de permuta, o ICD de tipo selvagem é substituído pelo ICD de uma molécula imunoestimulatória (permuta coestimulatória) ou uma molécula inibidora diferente (permuta inibidora). Moléculas imunoestimulatórias incluem, porém sem limitações, CD3z, CD28, 4-1BB e os exemplos listados na Tabela 1. Moléculas inibidoras incluem, porém sem limitações, CTLA4, PD1, Lag3 e os exemplos listados nas Tabelas 1 e 9. No primeiro caso, a ligação do ligante endógeno pelo receptor de permuta modificado resulta na distribuição de um sinal positivo às células T, deste modo, ajudando a aumentar a estimulação da célula T, facilitando a continuação de direcionamento e morte do tumor.
Neste último caso, a ligação do ligante endógeno pelo receptor de permuta modificado resulta na distribuição de um sinal negativo às células T, deste modo, ajudando a reduzir a estimulação e a atividade da célula T.
Exemplo 3: Aumento de expressão na superfície de proteínas de sinalização intracelular PD1 e TGFβRII nulo ou de permuta em células T armadas
[002352] Para criar células T armadas, um determinado número de receptores truncados nulos que expressam peptídeos de sinalização de permuta (SP) e os domínios transmembrana (TM) concebidos e testados para expressão máxima na superfície de células T modificadas. A Figura 13 mostra diagramas esquemáticos de várias construções de receptor nulo para PD-1 (parte superior) e TGFRII (parte inferior). Os domínios extracelulares (ECD) destas proteínas foram modificados de modo que o peptídeo sinalizador de tipo selvagem (SP) e/ou os domínios transmembrana (TM) fossem substituídos por aqueles do receptor de CD8a de células T humanas (setas vermelhas). Cada uma das seis construções nulas truncadas mostradas na Figura 13 foi sintetizada em DNA e subclonada em um vetor de mRNA IVT DNA (pRT). O mRNA de alta qualidade foi produzido via IVT para cada um. A transfecção do mRNA que codifica cada uma das seis moléculas foi realizada usando a distribuição por eletroporação (EP) em células T humanas primárias e a análise de FACS foi realizada 24 horas após a EP para avaliar o nível e expressão de cada construção na superfície celular (Figura 14). Através de citometria de fluxo, a substituição do WT SP por uma CD8a de permuta (02.8aSP-PD-1 e TGF-02.8aSPRII) resultou no maior nível de expressão na superfície da célula T. O receptor nulo 02.8aSP-PD-1 exibiu uma MFI de 43.680, a qual é 177 vezes maior do que a expressão de PD-1 de células T endógenas e 2,8 vezes maior do que o receptor nulo WT PD-1. O receptor nulo 02.8aSP- TGFRII exibiu uma MFI de 13.809, a qual é 102 vezes maior do que a expressão de TGFRII em células T endógenas e 1,8 vezes maior do que o receptor nulo WT TGFRII. Estes resultados mostram que a substituição de SP de tipo selvagem por uma SP de CD8a de permuta para ambas as proteínas inibidoras PD1 e TGFRII leva a uma expressão aprimorada na superfície do receptor nulo ou de permuta.
Por sua vez, isto maximizará a inibição ou coestimulação do ponto de verificação, respectivamente, quando de ligação do(s) ligante(s) natural(is). Exemplo 4: Concepção de vetores indutíveis por NF-B para expressão em células T modificadas
[002353] Dois vetores indutíveis por NF-B para ativação de células T foram desenvolvidos (Figuras 15A e 15B); um com o sistema de expressão gênica (GES) na orientação direta (A) e o outro na direção complementar (B), ambos precedendo o promotor constitutivo de EF1a. Estes vetores também controlam a expressão de uma molécula CAR e um gene de seleção de DHFR, separados por uma sequência T2A. Tanto o sistema indutível por NF-B condicional quanto os genes direcionados a EF1a fazem parte de um transposon piggyBac, o qual pode ser permanentemente integrado às células T usando EP. Uma vez integradas ao genoma, as células T expressam constitutivamente o CAR na superfície da membrana e o DHFR dentro da célula, enquanto que a expressão do gene indutível por NF-B, GFP, será expressa no nível mais alto somente quando de ativação das células T. Exemplo 5: Vetores indutíveis por NF-B para expressão de GFP em células T modificadas
[002354] As células T foram nucleofectadas com um vector piggyBac que expressa um CAR anti-BCMA e um gene de DHFR muteína sob controle de um promotor EF1a juntamente com a ausência (sem controle de sistema de expressão gênica (GES)) ou na presença de uma sistema de expressão indutível por NF-B que controla a expressão de GFP na direção direta (pNFKB-GFP direto) ou na orientação reversa (pNFKB-GFP reverso). As células foram cultivadas na presença de seleção com metotrexato até que as células estivessem quase completamente em repouso (dia 19) e a expressão de GFP foi avaliada no dia 5 e no dia 19. No dia 5, todas as células T estão proliferando e altamente estimuladas, com as células que abrigam o cassete de expressão indutível por NF-B produzindo altos níveis de GFP em virtude da forte atividade de NF-B (consulte Figura 16). As células de controle Sem GES não expressaram níveis detectáveis de GFP. No dia 19, as células T GES estavam quase totalmente em repouso e a expressão de GFP era significativamente menor do que no dia 5 (~ 1/8 MFI), uma vez que a atividade de NF-B é menor. Expressão de GFP ainda é observada no dia 19, o que pode em virtude da meia-vida longa da proteína GFP (~ 30 horas) ou o nível basal da atividade de NF-B, por exemplo, através de um TCR, um CAR, um receptor de citocinas ou um sinal do receptor de fator de crescimento. Exemplo 6: Vetores indutíveis por NF-B para expressão de GFP mediada por CAR anti-BCMA em células T modificadas
[002355] As células T foram modificadas (células t Simuladas ("mock")) não modificadas ou nucleadas com um vetor piggyBac que expressa um CAR anti-BCMA e um gene de muteína DHFR sob controle de um promotor EF1a, juntamente com a ausência (sem controle GES) ou a presença de um sistema de expressão indutível por NF-B que controla a expressão de GFP na orientação direta (pNFKB-GFP direta) ou reversa (pNFKB-GFP reversa). Todas as células foram cultivadas durante 22 dias, com ou sem seleção com metotrexato (células T Simuladas ("mock")), até que as células estivessem quase completamente em repouso. As células foram, então, estimuladas durante 3 dias na ausência (Sem estimulação) ou na presença de BCMA- (K562), BMCA+ (RPMI 8226) ou reagente de ativação anti-CD3 anti-CD28 de controle positivo (estimulação de CD3/28). A expressão de GFP foi indetectável sob todas as condições com o controle Sem GES ou células T Simuladas ("mock"). No entanto, enquanto que as células transpostas com pNFKB-GFP direto e reverso exibem pouca expressão de GFP em relação ao controle sem estimulação, quando cultivadas com células BCMA-K562, ambas demonstraram um aumento dramático da expressão gênica na presença de células tumorais BCMA+ ou sob condições de controle positivo (Figura 17). Pouca diferença na expressão de GFP foi observada entre as células transpostas com pNFKB-GFP diretoe reverso que foram cocultivadas com células tumorais BCMA+. Exemplo 7: Controle da expressão mediada por CAR anti-BCMA em células T modificadas
[002356] O nível de expressão do gene indutível pode ser regulada pelo número de elementos de resposta a montante ou que precedem o promotor indutível. As células T foram nucleofectadas com um vetor piggyBac que codifica uma CARTirina anti-BCMA seguida de um gene de seleção, ambos sob controle de um promotor EF1a humano (Figura 18). Além disso, os vetores codificaram adicionalmente o sistema de expressão gênica condicional indutível por NF-B, que controla a expressão de uma proteína CD19 truncada (dCD19) e incluíam vários elementos de resposta NFKB (RE) variando de 0 a 5, sem GES (sem GES) ou receberam um pulso de eletroporação, mas nenhum ácido nucleico piggyBac (Simulado ("mock")). Os dados são mostrados apenas para o GES na direção/orientação reversa (oposta). Todas as células foram cultivadas durante 18 dias e incluíam a seleção de células T por piggyBac modificada usando adição de metotrexato. As células foram, então, estimuladas durante 3 dias usando reagente de ativação de esferas anti-CD3 anti-CD28 e a expressão na superfície de dCD19 foi avaliada por FACS nos dias 0, 3 e 18, e os dados são mostrados como histogramas de FACS e MFI da coloração da proteína-alvo. A expressão de dCD19 na superfície foi detectada em níveis baixos no dia 0 em todas as células T transpostas com vetores que codificam o GES. Em 3 dias após a estimulação, foi observada uma regulação negativa dramática da expressão de dCD19 para todas as células T que expressam o GES, com um aumento maior na expressão na superfície naquelas com maior número de ERs. Assim, a expressão na superfície de dCD19 foi diretamente proporcional ao número de REs codificados no GES. Não foi detectada dCD19 na superfície das células T que não abrigavam os controles GES: Sem GES e Simulado ("mock").
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[002357] Todo documento citado aqui, incluindo qualquer patente ou pedido relacionado ou de referência remissiva, é aqui incorporado por referência na íntegra, a menos que expressamente excluído ou de outra forma limitado. A citação de qualquer documento não é uma admissão de que ele é o estado da técnica em relação a qualquer invenção descrita ou reivindicada aqui ou que, individualmente ou em qualquer combinação com qualquer outra referência, ensine, sugira ou descreva qualquer invenção. Além disso, na medida em que qualquer significado ou definição de um termo aqui esteja em conflito com qualquer significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado por referência, o significado ou definição atribuído a este termo aqui prevalecerá.
OUTRAS MODALIDADES
[002358] Embora modalidades particulares da invenção tenham sido ilustradas e descritas, várias outras alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. O escopo das reivindicações anexas inclui todas estas alterações e modificações que estão dentro do escopo da presente invenção.

Claims (5)

REIVINDICAÇÕES
1. Receptor antigênico quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ectodomínio que compreende uma região de reconhecimento de antígeno, em que a região de reconhecimento de antígeno compreende pelo menos uma VH que se liga especificamente ao Antígeno de Maturação de Células B (BCMA); (b) um domínio transmembrana, e (c) um endodomínio que compreende pelo menos um domínio coestimulatório.
2. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende ou consiste em uma sequência recombinante ou quimérica.
3. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende ou consiste em uma sequência humana ou humanizada.
4. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ectodomínio de (a) compreende ainda um peptídeo sinalizador.
5. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ectodomínio de (a) compreende ainda uma dobradiça entre a região de reconhecimento de antígeno e o domínio transmembrana.
6. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinalizador compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-28B ou GM-CSFR humana.
7. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinalizador compreende uma sequência que codifica um peptídeo sinalizador de CD8α humana.
8. (Atualmente Alterada) Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinalizador de CD8α humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18012.
9. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3zeta, CD4, CD8 α, CD19, CD28, 4-1BB ou GM-CSFR humana.
10. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende uma sequência que codifica um domínio transmembrana de CD8α humana.
11. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana de CD8α humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18014.
12. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o endodomínio compreende um endodomínio de CD3zeta humana.
13. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio coestimulatório compreende um segmento intracelular de 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 humana ou qualquer combinação dos mesmos.
14. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio coestimulatório compreende um domínio coestimulatório de CD28 e/ou
4-1BB humana.
15. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o emdodomínio de CD3zeta humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18016.
16. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio coestimulatório de 4-1BB compreende uma sequência de SEQ ID NO:
18018.
17. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dobradiça compreende uma sequência derivada de CD8α, IgG4, CD4 ou qualquer combinação das mesmas.
18. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dobradiça compreende uma sequência derivada de CD8α humana.
19. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sequência derivada de uma CD8α humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18020.
20. Composição, caracterizada por compreender o CAR como definido na reivindicação 1, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
21. Transposon, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR como definido na reivindicação 1.
22. Composição caracterizada por compreender o transposon como definido na reivindicação 21.
23. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR como definido na reivindicação 1.
24. Composição caracterizada por compreender o vetor como definido na reivindicação 23.
25. Célula caracterizada por compreender o CAR como definido na reivindicação 1.
26. Célula caracterizada por compreender o transposon como definido na reivindicação 21.
27. Célula caracterizada por compreender o vetor como definido na reivindicação 23.
28. Célula, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula imune.
29. Célula, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T, uma célula Natural Assassina (NK), uma célula de tipo Natural Assassina (NK), uma célula Natural Assassina induzida por Citocinas (CIK), uma célula progenitora hematopoiética, uma célula T derivada de sangue periférico (PB) ou uma célula T derivada de sangue do cordão umbilical (UCB).
30. Célula, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a célula é autóloga.
31. Célula, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a célula é alogênica.
32. Composição caracterizada por compreender a célula como definida na reivindicação 25.
33. Composição que compreende uma população de células, caracterizada pelo fato de que uma pluralidade de células da população compreende a célula como definida na reivindicação 25.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a pluralidade das células da população compreende pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %,
65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou qualquer porcentagem intermediária da célula como definida na reivindicação 25.
35. Método de produção de uma população de células T modificadas caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir, em uma pluralidade de células T, uma composição que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR como definido na reivindicação 1, deste modo, gerando uma população de células T modificadas; (b) cultivar a população de células modificadas sob condições adequadas para integração da sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR; (c) expandir e/ou selecionar pelo menos uma célula a partir da população de células T modificadas que expressam o CAR na superfície celular.
36. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 18056, 18057 e 18058; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18059, 18060, 18061, 18062 e 18063; e uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
37. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18056; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18059; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
38. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18056; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18060; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
39. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18057; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18061; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
40. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18057; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18061; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
41. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18058; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18062; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
42. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende: uma CDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18056; uma CDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18063; e uma CDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18064.
43. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de um grupo que consiste em SEQ ID NOS: 18050, 18051, 18052, 18053, 18053, 18054 e 18055.
44. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18050.
45. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18051.
46. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18052.
47. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18053.
48. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18054.
49. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18055.
50. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18000.
51. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18002.
52. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18004.
53. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18006.
54. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18008.
55. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18010.
56. Receptor antigênico quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ectodomínio que compreende um peptídeo sinalizador de CD8α humano e uma região de reconhecimento antigênica, em que a região de reconhecimento antigênica compreende pelo menos uma VH que se liga especificamente a BCMA; (b) um domínio de dobradiça que tem um domínio de dobradiça de CD8α humana; (c) um domínio transmembrana que compreende um domínio transmembrana de CD8α humana; e (d) um endodomínio que compreende um domínio coestimulatório de 4-1BB humana e um endodomínio de CD3zeta humana.
57. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 56 , caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 18050, 18051, 18052, 18052, 18053, 18054 e 18055, em que o peptídeo sinalizador de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18012, em que o domínio de dobradiça de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18020, em que o domínio transmembrana de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17505, em que o domínio coestimulatório de 4-1BB humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17509 e em que o endodomínio de CD3zeta humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17507.
58. Receptor antigênico quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18051, em que o peptídeo sinalizador de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18012, em que o domínio de dobradiça de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18020, em que o domínio transmembrana de CD8α humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17505, em que o domínio coestimulatório de 4-1BB humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17509 e em que o endodomínio de CD3zeta humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17507.
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 503/543 Alteração de peso
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 1/28
% de peso corporal inicial Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 504/543 Carga de tumor
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 2/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 505/543 Sobrevida
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 3/28
Sobrevida percentual Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 506/543 Cópias da carga tumoral VH-A
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 4/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 507/543 Cópias da carga tumoral VH-B
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 5/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 508/543 Cópias da carga tumoral VH-C
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 6/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 509/543 Cópias da carga tumoral VH-D
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 7/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 510/543 Cópias da carga tumoral VH-E
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 8/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 511/543 Cópias da carga tumoral VH-F
Sem tumor/Sem CAR-T CAR irrelevante 9/28
Sinal de bioluminescência +/- SE (fótons/seg.) Dias pós-tratamento
Consenso_seq_aa_FR1_FR4
KO em células T primárias
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 515/543 Sinalização Sinalização inibidora estimuladora
PD-1 de comprimento total (WT) PD-1 mutante (Nulo) PD-1 truncado (Nulo) PD-1 coestimulatório (de permuta) PD-1 inibidor (de permuta) 13/28
TGFRII de comprimento total (WT) TGFRII mutante (Nulo) TGFRII truncado (Nulo) TGFRII coestimulatório (de permuta) TGFRII inibidor (de permuta)
TGFRII  nulo Pd1 nulo
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 517/543 Normalizado para modo Normalizado para modo Sem RNA
Sem RNA
Normalizado para modo Normalizado para modo Normalizado Normalizadopara paramodo modo Normalizado para modo Normalizado para modo
Secundário apenas Normalizado para modo Pd1 Isotipo de 15/28
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 518/543 Resistência Isolante Sinal poli(A) sintético/pa transcricional Elemento de resposta NF-B
Promotor mínimo
PBv6-NFKBP-GFP.EF'a-CAR.DR Direto-ND 16/28
Sinal poli(A) tardio de SV40 7899 pb
Isolante Ef1alfa pNFKB-GFP & EF1a-CAR na mesma direção
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 519/543 Resistência Isolante Sinal poli(A) tardio de SV40
Promotor mínimo Elemento de resposta NF-B PBv6-NFKBP-GFP.EF'a-CAR.DR Reverso-ND Sinal poli(A) sintético/pa transcricional 7899 pb 17/28
Isolante Ef1alfa pNFKB-GFP & EF1a-CAR na direção oposta
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 520/543 pNFB-GFP reverso Dia 5 Dia 19 pNFB-GFP direto Sem controle GES 18/28
No Dia 5 pós-ativação de células T (Dia 5), as células T estão proliferando e são altamente estimuladas; expressão de GFP é forte, uma vez que a atividade de NFB é alta No Dia 19, as células T estão quase totalmente em repouso; expressão de GFP é significativamente menor do que no Dia 5 (~1/8 MFI), uma vez que atividade de NFB é baixa Expressão de GFP ainda é observada no Dia 19, a qual pode ser em virtude da meia-vida longa da proteína GFP (~30 horas) ou o nível basal de atividade de NFB através de TCR, CAR, citocinas, fatores de crescimento, etc.
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 521/543 Sem estimulação Estimulação de CD3/28 19/28
Células no dia 22 pNFB-GFP reverso Sem controle de GES Dia 3 pós-estimulação pNFB-GFP direto Células T simuladas (mock)
Células T CD4+ Células T CD8+ Nome da amostra Média Nome da amostra Média Dia 0 Sem GES Sem GES Simulado Simulado Nome da amostra Média Nome da amostra Média Dia 0 Sem GES Sem GES Simulado Simulado Nome da amostra Média Nome da amostra Média Dia 18 Sem GES Sem GES Simulado Simulado Direção oposta (células T CD4+) Direção oposta (células T CD8+) Expressão na superfície Expressão na superfície de cDC19 (MFI) de cDC19 (MFI) Sem GES Sem GES Simulado Simulado 18 0 18 0 3 3 ia ia ia ia ia ia
D
D
D
D
D
D Dias pós-estimulação de células T Dias pós-estimulação de células T poliA tardio de SV40 Ligante G4S Promotor CAG
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 524/543 Promotor SP6
Promotor T7 Ligante G4S 22/28
NLS Duplo pRT1-Clo51-dCas9 6767 pb
Comparação da proteína de fusão Cas-CLOVER Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 525/543 Modalidade 1 vs. Modallidade 2 Células Pan T Células Jurkat KO de B2M KO % de TCRa 23/28 KO % de TCRa KO % de B2M do 2 1 do 10 10 20 20 la de a 2 1 2 1 u a de a ul de e m id id m a ade e l l Si id id ad ad Si da da al al lid lid o o a M M od od o da od
M M M M 20 ug de cada mRNA, 5 ug de cada gRNA mRNA conforme indicado, 5 ug de cada gRNA
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 526/543 Comparação da proteína de fusão Cas-CLOVER Modalidade 1 vs. Modalidade 2
1. 1 kb + ladder 24/28
2. Modalidade 1 mRNA
3. Modalidade 2 mRNA
4. Modalidade 2 versão antiga em mRNA de pRT (sem atividade)
5. 1 kb + ladder
(V-D-J)s humanas CCH1 de rato
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 527/543 Montagem 25/28
Purificação
Integração
Liberação de diversos repertórios de HCAb humana
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 528/543 SEQ.
PROFUNDO ANÁLISE EXPRESSÃO 26/28
Imunização Isolamento Sequenciamento Análise Montagem Expressão de células B profundo bioinformática de vetor e triagem e purificação de regiões de elevado de elevado de mRNA VH rendimento rendimento
Cada coluna é uma amostra independente
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 529/543 27/28
Cada linha é uma sequência VH única Expansão de linhagem
Baixa Alta
Petição 870200076748, de 19/06/2020, pág. 530/543 Sem tumor através do paquímetro (Dias 20-26) Pré- infusão Dia 20 Dia 27 Dia 41 28/28
Simulado
Células T sanguíneas)
BR112020012555-5A 2017-12-20 2018-12-20 composições de vcar e métodos para uso BR112020012555A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762608571P 2017-12-20 2017-12-20
US62/608,571 2017-12-20
US201762608894P 2017-12-21 2017-12-21
US62/608,894 2017-12-21
PCT/US2018/066936 WO2019126574A1 (en) 2017-12-20 2018-12-20 Vcar compositions and methods for use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020012555A2 true BR112020012555A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=65241306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020012555-5A BR112020012555A2 (pt) 2017-12-20 2018-12-20 composições de vcar e métodos para uso

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210139557A1 (pt)
EP (1) EP3728305A1 (pt)
JP (2) JP2021507703A (pt)
KR (1) KR20200116917A (pt)
CN (1) CN112218885A (pt)
AU (2) AU2018393110B2 (pt)
BR (1) BR112020012555A2 (pt)
CA (1) CA3086187A1 (pt)
IL (1) IL275311A (pt)
MX (1) MX2020006689A (pt)
SG (1) SG11202005750TA (pt)
WO (1) WO2019126574A1 (pt)
ZA (1) ZA202003849B (pt)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109803978B (zh) * 2016-09-07 2022-07-01 武汉华大吉诺因生物科技有限公司 多肽及其应用
AU2018234810B2 (en) 2017-03-15 2023-05-11 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
US11851659B2 (en) 2017-03-22 2023-12-26 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
SG11201909949XA (en) 2017-05-24 2019-11-28 Pandion Therapeutics Inc Targeted immunotolerance
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
EP3802825A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
TW202110885A (zh) 2019-05-20 2021-03-16 美商潘迪恩治療公司 靶向ＭＡｄＣＡＭ之免疫耐受性
EP4107187A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector
CN115996747A (zh) 2020-04-14 2023-04-21 波赛达治疗公司 用于治疗癌症的组合物和方法
TWI828126B (zh) * 2021-04-27 2024-01-01 中央研究院 用以治療高三酸甘油脂血症或其相關疾病的方法
WO2022272292A2 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 Editas Medicine, Inc. Engineered cells for therapy
CN113528437B (zh) * 2021-07-07 2023-08-25 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 一种增强基因编辑效率的试剂盒及其应用
WO2023178297A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Obsidian Therapeutics, Inc. Compact drug responsive domains for regulation of function/abundance and delivery of polypeptide payloads
WO2024030214A2 (en) * 2022-08-02 2024-02-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Brinp2-derived peptide compositions for treating obesity and weight management

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
SG89295A1 (en) 1991-03-15 2002-06-18 Amgen Inc Pegylation of polypeptides
JP3230056B2 (ja) 1991-07-02 2001-11-19 インヘイル・インコーポレーテッド 薬剤のエーロゾル化服用量を形成する装置
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
SK279327B6 (sk) 1992-10-19 1998-10-07 Dura Pharmaceuticals Zariadenie na vytváranie aerosolu z práškového lie
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
EP0680451B1 (en) 1993-01-19 1998-11-04 Glaxo Group Limited Aerosol dispenser and method of manufacture
CN1119876A (zh) 1993-02-12 1996-04-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 被调节的靶向基因转录及其他生物学过程
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
EA001237B1 (ru) 1996-01-03 2000-12-25 Глаксо Груп Лимитед Ингаляционное устройство
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
EP1019023B1 (en) 1997-09-29 2003-05-07 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Stabilized preparations for use in nebulizers
US6309663B1 (en) 1999-08-17 2001-10-30 Lipocine Inc. Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents
SG11201406414WA (en) * 2012-04-11 2014-11-27 Us Health Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
US10344285B2 (en) 2014-04-09 2019-07-09 Dna2.0, Inc. DNA vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification
KR102612313B1 (ko) * 2014-07-21 2023-12-12 노파르티스 아게 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
KR102523934B1 (ko) * 2014-07-24 2023-04-20 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 Bcma 키메릭 항원 수용체
EP3227317A4 (en) * 2014-12-02 2018-04-25 Roger Williams Hospital Methods and compositons for treating cancer
IL296340A (en) * 2015-10-05 2022-11-01 Prec Biosciences Inc Genetically modified cells containing a modified human t cell receptor alpha constant region gene
AU2017224843A1 (en) * 2016-02-25 2018-08-23 Cell Medica Switzerland Ag Binding members to PD-L1
IL267485B2 (en) * 2016-12-21 2024-01-01 Teneobio Inc Antibodies against BCMA containing only heavy chains and their uses
SG11201913175TA (en) * 2017-06-30 2020-01-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Anti-b-cell maturation antigen chimeric antigen receptors with human domains

Also Published As

Publication number Publication date
US20210139557A1 (en) 2021-05-13
AU2018393110B2 (en) 2023-04-27
AU2018393110A1 (en) 2020-07-02
EP3728305A1 (en) 2020-10-28
SG11202005750TA (en) 2020-07-29
AU2018393110A2 (en) 2020-07-23
CA3086187A1 (en) 2019-06-27
KR20200116917A (ko) 2020-10-13
MX2020006689A (es) 2020-11-06
JP2023154083A (ja) 2023-10-18
JP2021507703A (ja) 2021-02-25
ZA202003849B (en) 2021-07-28
WO2019126574A1 (en) 2019-06-27
CN112218885A (zh) 2021-01-12
RU2020123705A (ru) 2022-01-20
IL275311A (en) 2020-07-30
AU2023208176A1 (en) 2023-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018393110B2 (en) VCAR compositions and methods for use
JP7399866B2 (ja) ＣＡＲＴｙｒｉｎ組成物とその利用方法
CN113383018A (zh) 同种异体细胞组合物和使用方法
WO2019051424A9 (en) Compositions and methods for chimeric ligand receptor (clr)-mediated conditional gene expression
US20190177421A1 (en) Chimeric antigen receptors and methods for use
KR20180133480A (ko) 표적화 핵산 나노수송체를 이용하여 치료 세포를 프로그램화하기 위한 조성물 및 방법
US20220042038A1 (en) Nanotransposon compositions and methods of use
WO2021183795A1 (en) Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
RU2792187C2 (ru) Композиции cart-иринов и способы их применения
WO2023060088A1 (en) Transposon compositions and methods of use thereof
JP2022547866A (ja) 同種異系細胞組成物と使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]