CZ20003705A3 - DNA konstrukt, ovlivňující expresi endogenního IFNA2 genu, izolovaná nukleová kyselina, homologně rekombinantní savčí buňka, způsob ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu, způsob dodání IFNA2 živočichoví a způsob produkce IFNA2 - Google Patents

Description

DNA konstrukt, ovlivňující expresi endogenního IFNA2 genu, izolovaná nukleová kyselina, homologně rekombinantní savčí buňka, způsob ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu, způsob dodání IFNA2 živočichovi a způsob produkce IFNA2.

Oblast techniky

Navrhovaný vynález se zabývá genomovou DNA.

Dosavadní stav techniky

Navrhované postupy léčby onemocnění s pomocí terapeutických proteinů zahrnují jak podání proteinů připravených in vitro, tak i genovou terapii. Příprava proteinu in vitro se obecně týká vnesení exogenní DNA kódující odpovídající protein do vhodné hostitelské buňky v buněčné kultuře. Metody genové terapie naopak představují podání buněk, plazmidu nebo virů s obsahem sekvence kódující odpovídající terapeutický protein pacientu.

Některé terapeutické proteiny mohou být produkovány také vhodným ovlivněním exprese jejich endogenních genů s použitím cílených technik genového inženýrství. Viz například U.S. patenty č. 5,641,670; 5,733,761 a 5,272,071; dále U.S. patentová přihláška s pořadovým číslem 08/406,030 a dále WO 91/06666, WO 91/06667 a WO 90/11354, které jsou zde všechny v celém rozsahu zahrnuty odkazem.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález je založen na identifikaci a sekvenaci genomové 5’ DNA předcházející kódující sekvenci genu pro lidský interferon-a 2 („IFNA2“). TAto DNA může být použita například v DNA konstruktu, který, po integraci do genomu buňky cestou homologni rekombinace, upravuje (například zvyšuje) expresi endogenního genu pro IFNA2 v savčích buňkách. Termínem „endogenní gen pro IFNA2“ označujeme genomový (tj. chromozomální) gen kódující IFNA2. Konstrukt obsahuje směrující sekvenci zahrnující nebo odvozenou od nově objevené nekódující 5’ a dále sekvenci pro regulaci transkripce. Sekvence genové oblasti pro regulaci transkripce se s výhodou liší od transkripční regulační sekvence endogenního genu pro IFNA2. Směrující sekvence zajišťuje integraci ··· ·· ··· ···· ·· ·· regulační sekvence do oblasti proti směru transkripce endogenní IFNA2 kódující sekvence tak, aby byla regulační sekvence operativně připojena k endogenní kódující sekvenci. Termínem „operativně připojena“ označujeme skutečnost, že regulační sekvence může řídit expresi endogenní IFNA2 kódující sekvence. Konstrukt může dále obsahovat selekční znak, tj. genovou oblast usnadňující selekci buněk se stabilně integrovaným konstruktem a/nebo další kódující sekvenci připojenou k promotoru.

V jednom z provedení vynálezu DNA konstrukt zahrnuje: (a) směrující sekvenci, (b) regulační sekvenci, (c) exon, (d) donorové místo sestřihu, (e) intron a (f) akceptorové místo sestřihu, kde směrující sekvence zajišťuje integraci sebe sama a elementů (b) - (f), kde elementy (b) - (f) jsou integrovány do nebo proti směru transkripce endogenního genu. Regulační sekvence potom řídí produkci transkriptu, který zahrnuje nejen elementy (c) až (f), ale i endogenní IFNA2 kódující sekvenci. Nejraději jsou intron a akceptorové místo sestřihu umístěny v konstruktu po směru transkripce od donorového místa sestřihu.

Směrující sekvence je homologní s předem zvolenou cílovou sekvencí v genomu. Mezi těmito dvěma homologními sekvencemi proběhne homologní rekombinace. Tato směrující sekvence obsahuje nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100 nebo 1000) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:11 a dále může obsahovat nejméně 20 (například nejméně 30, 50 nebo 100) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:7, nejméně 20 (například nejméně 30 nebo 50) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:8, nebo nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100 nebo 1000) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO: 12. Kromě toho může směrující sekvence dále obsahovat nejméně 20 (například nejméně 30, 50 nebo 100) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:15, nejméně 20 po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:16, nejméně 20 (například nejméně 30 nebo 50) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:17, nebo nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100 nebo 1000) po sobě následujících nukleotidů sekvence SEQ ID NO:18. SEQ ID NO:7 odpovídá nukleotidům 1 až 278 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:8 odpovídá nukleotidům 3492 až 3564 SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12 odpovídá nukleotidům 279 až 3491 SEQ ID NO:11. Termín „homologní“ znamená, že směrující sekvence je identická nebo dostatečně podobná svému cílovému místu v genomu, takže mezi směrující sekvencí a cílovým místem v lidské buňce může dojít k homologní rekombinaci. Malé procento párů baží, které spolu navzájem nepárují, je přijatelné, pokud k homologní rekombinaci dochází v dostatečné frekvneci. Pro usnadnění homologní rekombinace je s výhodou, pokud je směrující sekvence

I • ···· · · · ·· ·· ·· · · · · · ···· _ · · · ····· · · · · ······ ··· ·· ···· ··· ·· ··· ··«· ·· ·· dlouhá nejméně 20 (např. nejméně 50, 100, 250, 400 nebo 1000) párů baží („bp“). Směrující sekvence může zahrnovat také genomové sekvence nacházející se vně oblasti zahrnuté v SEQ ID NO: 12, pokud kromě toho obsahuje nejméně 20 nukleotidů nacházejících se uvnitř zmíněné oblasti. Doplňující směrující sekvence může být například odvozena od sekvence ležící mezi SEQ ID NO:8 a endogenní transkripční iniciační sekvencí genu IFNA2.

Vzhledem k polymorfismu genového lokusu IFNA2 může docházet k minoritním změnám v nukleotidovém složení kteréhokoliv daného cílového místa v genomu u kteréhokoliv existujícího savčího druhu. Navrhovaný vynález se vztahuje i na směrující sekvence, které odpovídají zmíněným polymorfním variantám SEQ ID NO:7, 8, 11, 12, 15, 16, 17 a 18 (především pak variantám odpovídajícím polymorfismu lidského IFNA2 genu).

Homologní rekombinací se regulační sekvence konstruktu integruje do chromozómu v předem vybrané oblasti proti směru transkripce od kódující sekvence genu IFNA2. Výsledná nová transkripční jednotka obsahující regulační sekvenci pocházející z konstruktu ovlivňuje expresi cílového genu IFNA2. Takto produkovaný protein IFNA2 může mít sekvenci identickou se sekvencí IFNA2 proteinu, který je kódován nezměněným endogenním genem, nebo může následkem záměn vnesených homologní rekombinací obsahovat navíc oproti divokému typu IFNA2 proteinu doplňující, substituované nebo řídce se vyskytující aminokyselinové zbytky.

Ovlivnění genové exprese zahrnuje aktivaci (nebo zapříčinění exprese) genu, který je za normálního stavu v původní buňce tichý (tj. není exprimován), zvýšení nebo snížení úrovně exprese genu a změnu způsobu regulace genu tak, že je tento způsob odlišný od způsobu regulace v původní buňce. Termínem „původní buňka“ označujeme buňku před homologní rekombinací.

Předmětem navrhovaného vynálezu je dále způsob použití navrhovaného DNA konstruktu za účelem ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu v savčích buňkách. Tento způsob zahrnuje následující kroky: i) vnesení DNA konstruktu do savčích buněk, ii) udržování buněk v podmínkách, které umožňují homologní rekombinací mezi konstruktem a cílovým místem v genomu (tj. místem v genomu, které je homologní ke směrující sekvenci DNA konstruktu), a tím také umožňují vznik homologně rekombinantních buněk a iii) udržování homologně rekombinantních buněk v podmínkách, které umožňují expresi IFNA2 kódující sekvence, která je pod kontrolou regulační sekvence pocházející z DNA konstruktu. Alespoň část cílového místa v genomu je situována v pozici 5‘ vzhledem ke kódující sekvenci endogenního IFNA2 genu. To znamená, že cílové místo v genomu může obsahovat kódující sekvenci, stejně jako i 5’ nekódující sekvenci.

Vynález dále zahrnuje také transfektované nebo infikované buňky, ve kterých proběhla homologní rekombinace mezi konstruktem a genomovou DNA v místě proti směru transkripce od endogenního ATG iniciačního kodonu, a to v jedné nebo v obou alelách endogenního IFNA2 genu. Takové transfektované nebo infikované buňky, nazývané také homologně rekombinantní buňky, mají pozměněný způsob exprese IFNA2 genu. Takové buňky jsou zvláště vhodné pro in vitro produkci IFNA2 a pro přenos IFNA2 metodou genové terapie. Způsoby přípravy a použití takových buněk jsou také předmětem navrhovaného vynálezu. Buňky bývají obratlovčího původu, nejčastěji se jedná o buňky savčího původu (například lidského, dále mohou být odvozeny od buněk primátů, buněk kravských, prasečích, koňských, kozích, ovčích, kočičích, psích, králičích, myších, morčecích, křeččích nebo krysích).

Vynález se dále týká způsobu produkce savčího proteinu IFNA2 in vitro nebo in vivo metodou vnesení výše zmíněného konstruktu do hostitelské buňky a inzerce tohoto konstruktu do genomu zmíněné buňky cestou homologní rekombinace. Homologně rekombinantní buňka je dále udržována v podmínkách, které umožňují transkripci, translaci a případně i sekreci proteinu IFNA2.

Předmětem vynálezu je dále izolovaná nukleová kyselina obsahující sekvenci nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100, 200 nebo 1000) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO: 11 nebo odpovídající komplementární sekvence nebo sekvence idenitcké se sekvencí SEQ ID NO:11 s výjimkou polymorfních variací nebo dalších minoritních variací (například méně než 5 % sekvence), které nebrání homologní rekombinaci s cílovou sekvencí. Izolovaná DNA může například obsahovat nejméně 20 (například nejméně 30, 50 nebo 100) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:7 nebo odpovídající komplementární sekvence, nejméně 20 (například nejméně 30 nebo 50) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:8 nebo odpovídající komplementární sekvence, nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100 nebo 1000) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:12 nebo odpovídající komplementární sekvence, nejméně 20 (například nejméně 30, 50 nebo 100) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:15 nebo odpovídající komplementární sekvence, nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO: 16 nebo odpovídající komplementární sekvence, nejméně 20 (například nejméně 30 nebo 50) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:17 nebo odpovídající komplementární sekvence nebo nejméně 20 (například nejméně 30, 50, 100 nebo • · · ·

1000) po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:18 nebo odpovídající komplementární sekvence.

V jednom z provedení navrhovaného vynálezu obsahuje nukleová kyselina podle vynálezu blok 100 po sobě následujících párů baží SEQ ID NO:11. Izolovaná DNA tedy může obsahovat například nukleotidy 1 až 100, 101 až 200, 201 až 300, 301 až 400, 401 až 500, 501 až 600, 601 až 700, 701 až 800, 801 až 900, 901 až 1000, 1001 až 1100, 1101 až 1200, 1201 až 1300, 1301 až 1400, 1401 až 1500, 1501 až 1600, 1601 až 1700, 1701 až 1800, 1801 až 1900, 1901 až 2000, 2001 až 2100, 2101 až 2200, 2201 až 2300, 2301 až 2400, 2401 až 2500, 2501 až 2600, 2601 až 2700, 2701 až 2800, 2801 až 2900, 2901 až 3000, 3001 až 3100, 3101 až 3200, 3201 až 3300, 3301 až 3400, 3401 až 3500 nebo 3465 až 3564 SEQ ID NO:11 nebo odpovídající komplementární sekvence. Zmíněné bloky SEQ ID NO: 11 nebo odpovídající komplementární sekvence jsou vhodné i jako směrující sekvence pro konstrukty podle vynálezu.

Jako izolovaná DNA, není sekvence odvozená od SEQ ID NO: 11 spojena se sekvencí kódující intaktní IFNA2, nebo přinejmenším není spojena ve stejné konfiguraci (tj. oddělena stejnou nekódující sekvencí) jako je tomu v genomu divokého typu. Termínem „izolovaná DNA“ tak jak je použit zde tedy neoznačujeme chromozóm nebo velké části genomové DNA (které by mohly být zainkorporovány do kosmidu nebo umělého kvasničného chromozómu) zahrnující nejen částečnou nebo celou SEQ ID NO: 11, ale i intaktní sekvenci kódující IFNA2 a celou sekvenci ležící mezi sekvencí kódující IFNA2 a sekvencí odpovídající SEQ ID NO: 11 tak jak se vyskytuje v genomu intaktní buňky. Tento termín zahrnuje (ale není omezen na) DNA, která i) je zainkorporována do plazmidu nebo viru, nebo ii) existuje jako samostatná molekula nezávisle na dalších sekvencích, například fragment připravený polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) nebo fragment připravený štěpením restrikčními endonukleázami. Izolovaná DNA nejraději neobsahuje sekvenci kódující prekursor intaktního 1FNA2 (tj. kompletní IFNA2 spolu s endogenním signálním sekrečním peptidem).

Předmětem vynálezu je dále izolovaná DNA zahrnující řetězec, který obsahuje nejméně 100 (například nejméně 200, 400 nebo 1000) nukleotidů dlouhou sekvenci, hybridizující za mírně nebo velmi přísných (stringentních) podmínek se SEQ ID NO:7, 8, 11, 12, 15, 16, 17 a/nebo 18 nebo se sekvencemi komplementárními k SEQ ID NO:7, 8, 11, 12, 15, 16, 17 a/nebo 18. Sekvence není spojena s IFNA2 kódující sekvencí, nebo přinejmenším není spojena ve stejné konfiguraci jako je tomu v genomu divokého typu. Mírně přísnými (stringentními) podmínkami označujeme hybridizaci při 50 °C v Churchově pufru (7% SDS, 0,5%

NaHPOzi, 1 M EDTA, 1% hovězí sérový albumin) a promývání při 50 °C v 2x SSC.

Vysoce stringentní podmínky jsou definovány jako: hybridizace při 42 °C v přítomnosti 50% formamidu; první promytí při 65 °C v 2x SSC s přídavkem 1%

SDS a druhé promytí při 65 °C v 0,lx SSC.

Dále je předmětem vynálezu izolovaná DNA zahrnující řetězec se sekvencí která (1) je nejméně 50 (například nejméně 70 nebo 100) nukleotidů dlouhá a (2) je nejméně z 80 % (například nejméně z 85 %, 90 %, 95 % nebo 98 %) identická se sekvencí fragmentu nebo celé SEQ ID NO: 11 nebo s odpovídající komplementární sekvencí. Tento fragment může zahrnovat například část nebo celou SEQ ID NO:7, 8, 12, 15, 16, 17, 18 nebo 19. Sekvence není spojena s intaktní IFNA2 kódující sekvencí, nebo přinejmenším není spojena ve stejné konfiguraci jako je tomu v genomu divokého typu.

Hovoříme-li o určitém procentu identity nebo konzervovanosti konkrétního polypeptidů nebo molekuly nukleové kyseliny vzhledem k referenčnímu polypeptidů nebo nukleové kyselině, je toto procento identity nebo konzervovanosti stanoveno pomocí algoritmu, definovaého Myersem a Milllerem, CABIOS (1989), který je součástí programu ALIGN (verze 2.0), nebo ekvivalentním způsobem s použitím následujících parametrů (pokud jsou takové parametry vyžadovány): „gap length penalty“ (tj. postih za délku mezery) 12 a „gap penalty“ (tj. postih za existenci mezery) 4. U všech ostatních parametrů byly použity předvolené výchozí hodnoty. Program ALIGN je snadno přístupný. Viz. například internetová adresa: http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-quess.cgi.

Vynález se dále zabývá způsobem doručení IFNA2 do těla živočicha (například savce jako jsou kupříkladu člověk, ostatní primáti, kráva, prase, kůň, koza, ovce, kočka, pes, králík, myš, morče, křeček nebo krysa), a to tak, že jsou předem připravené buňky, jejichž endogenní IFNA2 gen byl aktivován tak jak to bylo popsáno výše, implantovány do těla zmíněného živočicha. Takto implantované buňky potom v těle živočicha produkují a vylučují IFNA2. Předmětem vynálezu je také způsob produkce IFNA2 tak, že jsou předem připravené buňky, jejichž endogenní IFNA2 gen byl aktivován tak jak to bylo popsáno výše, kultivovány in vitro v podmínkách, které umožňují buňkám exprimovat a vylučovat IFNA2. Vynález dále zahrnuje izolovanou DNA, která je nejméně z 80 % (například nejméně 85 %, 90 % nebo 95 %) identická nebo hybridizuje za vysoce nebo mírně stringentních podmínek s částí (například nejméně 20, 50, 100, 400 nebo 1000 párů baží dlouhou) HindlII-BamHI inzertu plazmidu pA2HB (popsaného níže). 3’ konec zmíněné části tohoto inzertu je lokalizován nejméně 511 pb proti směru »··· ·· 4 44 44 « · · · _ ·4 4 4···· · ··· ·4··4·

4 4 4 4 444»

4 ·4 ··· 4··· ·· ·« transkripce od translačního iniciačního kodonu ATG kódující sekvence IFNA2, která je součástí zmíněného inzertu v plazmidu.

Izolovaná DNA podle vynálezu může být použita například jako zdroj PCR primerů proti směru transkripce. Tyto primery mohou být použity (v kombinaci s vhodnými primery po směru transkripce) pro získání sekvence regulační oblasti a/nebo kompletní kódující sekvence endogenního IFNA2 genu. Dále může být tato DNA použita jako hybridizační sonda pro důkaz přítomnosti chromozómu 9 ve vzorku lidských chromozómů, nebo, jak je to popsáno v dalším textu, může být použita pro ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu v buňkách obratlovců. Pokud není definováno jinak, mají všechny technické a vědecké termíny, použité v textu, stejný význam, v jakém jsou používány odborníky z odpovídajících oborů. Příklady použitých způsobů a materiálů jsou uvedeny níže, avšak způsoby a materiály podobné nebo ekvivalentní těm popsaným mohou být při praktickém použití vynálezu nebo jeho testování použity také. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a další uvedené odkazy jsou zde v celém svém rozsahu zahrnuty pouze formou odkazu. V případě konfliktu je rozhodujícím prvkem specifikace navrhovaného vynálezu včetně definic. Materiály, metody a příklady jsou pouze ilustrativní a v žádném případě rozsah vynálezu nikterak nelimitují.

Další vlastnosti a výhody navrhovaného vynálezu vyplývají z následujícího detailního popisu vynálezu a z patentových nároků.

Navrhovaný vynález je založen na objevu nukleotidového složení sekvence proti směru transkripce vzhledem ke kódující sekvenci lidského IFNA2 genu.

Interferon-α tvoří komplexní genovou rodinu tvořenou shlukem 14 genů na krátkém rameni 9. chromozómu. Žádný z těchto genů, včetně genu IFNA2, neobsahuje introny. Interferon-α je produkován makrofágy, B a T buňkami a celou řadou dalších buněk. Interferon-α má významné protivirové účinky a bylo prokázáno, že je účinný při léčbě infekcí způsobených papilloma virem, viry hepatitidy B a C a vakcinie, virem herpes simplex, virem herpes zoster varicellosus a rhinovirem.

Lidský IFNA2 gen kóduje 188 aminokyselin dlouhý prekurzorový protein (SEQ ID NO:2) obsahující 23 aminokyselin dlouhý signální peptid. Genomová mapa lidského IFNA2 genu je znázorněna na obrázku 1. Mapa je zkonstruována na základě publikované 1733 pb dlouhé sekvence (HUM1FNAA, GenBank, přístupové číslo J00207 a V00544; SEQ ID NO:1), která začíná v pozici -510 vzhledem k translačnímu startu (pokud není uvedeno jinak, všechny pozice uváděné zde, ♦ · · · jsou číslovány vzhledem k místu translačního startu) a končí v pozici +1223. CAP místo je lokalizovánao v pozici -67.

Specifické sekvence lokalizované ve směru 5’ vzhledem k IFNA2 genu ajejich použití pro ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu.

Genomová DNA obsahující sekvenci proti směru transkripce vzhledem k IFNA2 genu byla získána následujícím způsobem: lidská leukocytová genomová knihovna v lambda EMBL3 (Clontech katalog #HL1006d) byla testována s pomocí 332 pb dlohé sondy připravené PCR. Tato sonda odpovídá genomové oblasti -263 až +69 a byla amplifikována z lidské genomové DNA s použitím oligonukleotidových primerů IFN7 a IFN6. Oba zmíněné primery byly navrženy na základě dostupné sekvence IFNA2 genomové DNA (obr. 1). 5’ konec primeru IFN7 odpovídá pozici -263 a sekvence tohoto primeru je 5'-AGTTTCTAAAAAGGCTCTGGGGTA-3’ (SEQ ID NO:3). 5’ konec primeru IFN6 odpovídá pozici +69 a sekvence tohoto primeru je 5’-GCCCACAGAGCAGCTTGAC-3’ (SEQ ID NO:4).

Přibližně jeden milion rekombinantních fágů byl testován s pomocí radioaktivně značené 322 pb dlouhé sondy. Z primárních testovacích misek bylo izolováno 60 pozitivních plaků.DNA fága lambda byla vyizolována ze třiceti z těchto pozitivních plaků. Vyizolovaná DNA byla templátem v PCR reakci s oligonukleotidovými primery IFN1 a IFN2. Oba primery IFN1 i IFN21 jsou odvozeny od 3’ nepřekládané oblasti IFNA2 genu; jejich sekvence lze najít na internetové adrese „http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbSTS“ podle identifikačního kódu „NCBIID: 42433“. 5’ konec primeru IFN1 odpovídá pozici +639 a sekvence primeru je 5’-AAAGACTCATGTTTCTGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO:5). 5’ konec primeru IFN2 odpovídá pozici +853 a sekvence primeru je 5’GGTGCACATGACATAATATGAACA-3’ (SEQ ID NO:6). Ze třiceti testovaných fágových klonů dva tvořili očekávaný PCR produkt o velikosti 215 pb. Jeden z těchto dvou fágových plaků byl dále purifikován v dalších dvou kolech hybridizačních pokusů. Takto byl získán fágový klon 4-4-1. 8,3 kb dlouhý HindlII-BamHI fragment fága 4-4-1 byl subklonován do plazmidu pBluescript II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) za vzniku pA2HB. Konstrukt pA2HB nese přibližně 4,3 kb dlouhou část netranskribované sekvence proti směru transkripce, oblast kódující protein (1,1 kb) a přibližně 2,8 kb dlouhý úsek sekvence po směru transkripce od IFNA2 genu. Restrikční mapa 8,3 kb dlouhého HindlII-BAmHI fragmentu je znázorněna na obrázku 2.

• 9999 9 9· ·· 99 ♦ · 9 9999 9999 • 9 9 99999

99 9 999999

9 9 99 9999 ·*· 99 999 9999 99 99

Plazmid pA2HB byl sekvenován Sangerovou metodou. 278 pb dlouhá sekvence, jejíž 5’ konec je zároveň 5’ konec HindlII restrikčního místa je znázorněna níže (viz také obr. 3):

AAGCTTTTATAGTTGTAAATTTTCCACTTAGTACTGCTTTTGTAATGTTGTCTT

TTTATTTTCATTTATCTCAAGATGTTTTCTAATTTCTCTTGACTTCCTTCTTAA

ATTCTTACCTCATGTAGACATACATTTTTGGCCCTATGCATTGGGATGCAAAA

CCAGACTAATTTACTTTGTACAAAAAGAAAAATGAGAAAGAAATATATTTGG

TCTTGTGAGCACTATATGGAAATACTTTATATTCCATTTGTTTCATCATATTCA

TATATCCCTTT (SEQ ID NO:7)

HindlII místo je lokalizováno v pozici -4,073. Dříve nepublikovaná sekvence mezi pozicemi -583 a -511 byla uřčena také a je znázorněna níže a dále je zvýrazněna podtržením na obrázku 4.

CATTGGATACTCCATCACCTGCTGTGATATTATGAATGTCTGCCTATATAAAT ATTCACTATTCCATAACACA (SEQ ID NO:8)

Sekvence (SEQ ID NO: 12) nacházející se mezi oblastmi SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:8 byla určena také.

Genomová sekvence, nacházející se v pozici -4,074 až -511 (SEQ ID NO: 11) je ta sekvence, která na obrázku 6 není podtržena. Sekvence SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:8 odpovídají nukleotidům 1-278 a 3492-3564 SEQ ID NO: 11 resp.

Za účelem ovlivnění exprese endogenního IFNA2 genu byl DNA fragment obsahující nukleotidy 279-331 1 SEQ ID NO:12 nakloňován do plazmidů za vzniku směrujícího konstruktu pGA402. Nukleotidová sekvence 279-331 1 SEQ ID NO: 11 byla nazvána SEQ ID NO: 13. Fragment byl do vektoru vložen v místě proti směru transkripce od CMV promotoru a genu kódujícího rezistenci vůči neomycinu (viz schéma na obr. 5). Druhá směrující sekvence (viz obr. 5), obsahující DNA fragment genu IFNA2 -68 až 69 (viz obr. 1), byla klonována do plazmidů v místě po směru transkripce od CMV promotoru a genu kódujícího rezistenci vůči neomycinu.

Část nukleotidová sekvence genu IFNA2 vymezená nukleotidy -68 až 69 byla nazvána SEQ ID NO: 14. Plazmid pGA402 byl vnesen do lidských fibroblastových buněk, vykazujících nízkou nebo žáznou expresi genu IFNA2, tak aby byla umožněna homologní rekombinace s endogenním IFNA2 genem. Buňky, které byly po transformaci plazmidem rezistentní vůči G418, byly dále testovány za účelem identifikace buněk se zvýšenou expresí IFNA2 genu. Tato zvýšená exprese byla to ·<<

• ·· <

·· ·« <

• toto 4 a · a · očekávána v případě, že proběhla homologní rekombinace mezi pGA402 a genomovou DNA v těsné blízkosti endogenního IFNA2 genu.

Obecná metodologie:

Ovlivnění endogenní exprese IFNA2 genu

S použitím výše popsaných sekvencí proti směru transkripce od IFNA2 genu je možné ovlivňovat expresi endogenního lidského IFNA2 genu způsobme, který je popsán v U.S. patentu 5,641,670. Jedna ze strategií je znázorněna na obr. 5 V tomto případě je směrující konstrukt navržen tak aby obsahoval první směrující sekvenci homologní k prvnímu cílovému místu lokalizovanému proti směru transkripce genu, gen pro amplifikovatelný znak, gen pro selekční znak, regulační oblast, CAP místo, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhou směrující sekvenci homologní ke druhému cílovému místu lokalizovanému po směru transkripce od prvního cílového místa a končící buď v, nebo proti směru transkripce od IFNA2 kódující sekvence. V souladu s touto strategií je 5’ konec druhého cílového místa nejraději umístěn proti směru transkripce méně než 107 pb daleko od normálního ranslačního iniciačního místa IFNA2. Tak se lze vyhnout nežádoucím ATG startovacím kodonům uvnitř transkribované sekvence. Transkript lokusu, připraveného popsanou homologní rekombinací, obsahuje exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu (vše původem z konstruktu), dále jakoukoliv sekvenci mezi těmito elementy a dále sekvenci od akceptorového místa sestřihu přes celou endogenní kódující sekvenci až po transkripční terminační místo IFNA2 genu. Sestřihem takových transkriptů vzniká mRNA, která je překládána za vzniku prekurzoru lidského IFNA2, obsahujícího, v závislosti na charakteristice konstruktem kódovaného exonu, buď normální sekreění signální sekvenci, nebo geneticky upravenou sekreění signální sekvenci. Velikost exogenního intronu a tudíž i pozice exogenní regulační oblati vzhledem ke kódující oblasti genu je variabilní a jejími změnami lze optimalizovat funkci regulační oblasti.

Pro kteroukoliv aktivační strategii není nutné, aby byla obě cílová místa těsně přilehlá nebo blízce sousedící. Pokud spolu tato místa těsně nesousedí, je část oblasti proti směru transkripce normálního IFNA2 genu a/nebo část kódující oblasti homologní rekombinací odstraněna.

Metodou homologní rekombinace mohou být do chromozómové DNA vneseny mutace usnadňující ovlivnění exprese endogenního IFNA2. Například může být žádoucí zrušit nevhodný a nežádoucí ATG iniciační kodon umístěný proti směru transkripce od správného ATG iniciačního kodonu a mezi exogenní regulační • ·· · •· ·· ·· ·· · φφ · φ · « · · • · · φφφφφ · · · · ······ ¹ φ ♦ * φ φ «φφφ • ΦΦ φφ φφφ φφφφ φφ φφ oblastí a endogenní IFNA2 kódující oblastí v homologně rekombinantním lokusu. Za tímto účelem lze využít směrující konstrukt mající směrující sekvenci homologní s místem v genomu, které zahrnuje i nežádoucí ATG iniciační kodon. Tato směrující sekvence obsahuje nukleotidy, které nesou požadovanou mutaci, například ATT místo ATG. Směrující konstrukt může obsahovat jeden nebo více selekčních znaků pro usnadnění selekce homologně rekombinantních buněk. Exogenní regulační oblast může být poté vnesena do homologně rekombinantních buněk proti směru transkripce vzhledem k pozměněným místům s použitím metody ovlivnění exprese podle vynálezu.

Alternativně mohou být exogenní regulační oblast a požadovaná(é) mutovaná(é) sekvence vneseny do genomu v jediném kroku. DNA konstrukt použitý pro tento typ aplikace obsahuje jak exogenní regulační oblast, tak i směrující sekvenci, která obsahuje požadovanou mutaci (mutace). Dalším způsobem je kotransfekce nebo koinfekce cílových buněk dvěma různými konstrukty, kde jeden konstrukt obsahuje regulační oblast a druhý konstrukt nese požadovanou mutaci.

Pokud je to žádoucí, může být podobným způsobem do genomu vneseno také savčí akceptorové místo sestřihu, například do oblasti mezi nežádoucí ATG iniciační kodon a správný ATG iniciační kodon. DNA konstrukt pro tento účel obsahuje směrující sekvenci homologní s genomovou oblastí proti směru transkripce od správného IFNA2 iniciačního kodonu a dále sekvenci odpovídající požadovanému akceptorovému místu sestřihu, která je přímo součástí homologní oblasti, nebo která je k ní přilehlá. Buňky obsahující správný rekombinovaný IFNA2 lokus jsou poté transfektovány nebo infikovány druhým konstruktem, který obsahuje exogenní regulační oblast a exon s nespárovaným donorovým místem sestřihu na svém 3’ konci spolu se směrující sekvencí (nebo sekvencemi), jež směrují druhý konstrukt do genomové oblasti proti směru transkripce vzhledem k předem vnesenému akceptorovému místu sestřihu. Primární transkript, produkovaný pod kontrolou exogenní regulační oblasti, zahrnuje exogenní exon, exogenní donorové místo sestřihu, exogenní akceptorové místo sestřihu, jakoukoliv sekvenci mezi těmito elementy, a dále sekvenci mezi exogenním akceptorovým místem sestřihu a transkripčním terminačním místem endogenního IFNA2 genu. Sestřihem se donorové místo sestřihu v transkriptu a akceptorové místo sestřihu přiblíží a mezi nimi ležící intronová RNA, která může obsahovat nežádoucí AUG iniciační kodony, bude vystřižena. Všechny problémy, spojené s existencí nežádoucích AUG translaěních iniciačních kodonů v transkriptu v oblasti mezi transkripčním startem a IFNA2 kódující sekvencí jsou takto odstraněny. Samozřejmě mohou být regulační oblast, exon, donorové místo sestřihu i akceptorové místo sestřihu

• · • · vneseny do genomu v jediném kroku. DNA konstrukt, použitý pro tuto aplikaci, obsahuje regulační oblast, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, směrující sekvenci homologní s genomovou oblastí mezi správným IFNA2 iniciačním kodonem a nežádoucím ATG kodonem a volitelně také jeden nebo více selekčních znaků. Alternativně mohou být vhodné i dva nezávislé směrující konstrukty, kde jeden obsahuje regulační oblast, exon a donorové místom sestřihu a druhý obsahuje akceptorové místo setřihu. Oba konstrukty mohou být vneseny do cílových buněk v jediném kroku.

DNA konstrukt.

DNA konstrukt podle vynálezu obsahuje přinejmenším směrující sekvenci a regulační sekvenci. Kromě toho může volitelně obsahovat exon; nebo exon a donorové místo sestřihu; nebo exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu. Je-li součástí konstruktu exon, je umístěn na 3’ konci regulační oblasti a je-li součástí konstruktu donorové místo sestřihu, je lokalizováno na 3’ konci exonu. Intron a akceptorové místo sestřihu jsou, pokud jsou v konstruktu přítomny, lokalizovaány na 3’ konci donorového místa sestřihu. Dále může konstrukt obsahovat více exonů a intronů (s odpovídajícími donorovými a akceptorovými místy sestřihu). DNA v konstruktu je označována jako exogenní, neboť tato DNA není originální součástí genomu hostitelské buňky. Exogenní DNA může obsahovat sekvence identické nebo odlišné od endogenní genomové DNA, přítomné v buňce před transfekci nebo infekcí virovým vektorem. Tak jak je použit zde, termín „transfekce“ označuje vnesení plazmidu do buňky nevirovou (tj. chemickou nebo fyzikální) metodou jako je například koprecipitace s fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, lipofekce, elektroporace, mikroinjekce, mikroprojektily a podobně. Termínem „infekce“ označujeme vnesení virového vektoru do buňky metodou virové infekce. Nejrůznější elementy, které jsou součástí DNA konstruktu podle vynálezu, jsou detailněji popsány v následujícím textu.

DNA konstrukt může dále obsahovat cis- nebo /ra«.s-působící virové sekvence (například obalovací signály), umožňující dopravení konstruktu do jádra buňky metodou infekce virovým vektorem. Pokud je to nutné, může být DNA konstrukt odpřažen od některých částí virového životního cyklu, jako je například integrace retroviru do genomu s pomocí integrázy nebo udržování epizómu v buňce. Tohoto odpřažení může být dosaženo odpovídajícími delecemi nebo mutacemi virových sekvencí, například delecí oblasti kódující integrázu u retrovirových vektorů.

···· ·· ·· ·· • · · · · · » · · · ·

Další detaily týkající se konstrukce a použití virových vektorů jsou uvedeny například v Robbins et al., Pharmacol. Ther. 80: 35-47, 1998 a Gunzburg et al.,

Mol. Med. Today 1: 410-417, 1995, které jsou zde zahrnuty odkazem.

Směrující sekvence.

Směrující sekvence umožňují homologní rekombinaci požadované sekvence do vybrané oblasti hostitelského genomu. Směrující sekvence jsou homologní (tj. schopné homologní rekombinace) s jejich odpovídajícími cílovými místy v hostitelském genomu.

Cirkulární DNA konstrukt může obsahovat jedinou směrující sekvenci, nebo dvě či více oddělených směrujících sekvencí. Lineární DNA konstrukt může obsahovat dvě nebo více oddělených směrujících sekvencí. Cílové místo, se kterým je daná směrující sekvence homologní, se může nacházet uvnitř kódující oblasti IFNA2 genu, proti směru transkripce a těsně přilehlé ke kódující oblasti nebo proti směru transkripce ale vzdálené od kódující oblasti.

První ze dvou směrujících sekvencí v konstruktu (nebo celá směrující sekvence, pokud konstrukt obsahuje jen jednu směrující sekvenci) je odvozena od nově popsaných genomových oblastí proti směru transkripce od IFNA2 kódující oblasti. Tato směrující sekvence obsahuje část (například 20 nebo více po sobě následujících nukleotidů) SEQ ID NO:11, například část SEQ ID NO:7, 8 nebo 12. Druhá ze dvou směrujících sekvencí v konstruktu může být namířena proti genomové oblasti proti směru transkripce vzhledem ke kódující sekvenci, nebo může být namířena proti části nebo proti celé kódující sekvenci. Například může druhá směrující sekvence obsahovat na svém 3’ konci „exogenní“ kódující oblast identickou s několika prvními kodony IFNA2 kódující sekvence. Homologní rekombinaci rekombinuje exogenní kódující oblast s částí endogenní IFNA2 kódující sekvence. Pokud je to žádoucí, může exogenní kódující oblast kódovat heterologní aminokyselinovou sekvenci, pokud zůstává tato exogenní kódující oblast dostatečně homologní s endogenní kódující sekvencí, kterou nahrazuje, aby mezi nimi mohla proběhnout homologní rekombinace.

Směrující sekvence může kromě toho zahrnovat také sekvence odvozené od dříve popsané oblasti IFNA2 genu včetně těch, které jsou popsány zde, stejně jako od oblasti lokalizované ještě dále proti směru transkripce, jejíž struktura dosud nebula popsána, ale která může být zkušenými odborníky charakterizována. Genomové fragmenty, vhodné pro použití ve funkci směrujících sekvencí, mohou být identifikovány na základě jejich schopnosti hybridizovat se sondou obsahující ·»·· φ

Φ φ · ·«· φ φ · φ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ

ΦΦ ΦΦ celou nebo část sekvence SEQ ID NO:11. Taková sonda může být připravena metodou PCR s použitím primerů odvozených od SEQ ID NO:11.

Regulační sekvence.

Regulační sekvence DNA konstruktu může obsahovat jeden nebo více promotorů (například konstitutivní, tkáňově specifický nebo inducibilní promotor), zesilovače, oblasti zajišťující vazbu na smyčkovité struktury chromozomální DNA (tzv. „scaffold-attachment regions“) nebo matrix-vazebná místa, elementy negativní regulace, vazebná místa pro transkripční faktory nebo kombinaci těchto elementů.

Regulační sekvence může být odvozena od eukaryotického (například savčího) nebo virového genomu. Mezi vhodné regulační sekvence patří například (ale nikoliv výhradně) sekvence které regulují expresi SV40časných nebo pozdních genů, genů cytomegaloviru a hlavních pozdních genů adenovirů. Do této skupiny patří také regulační oblasti odvozené od genů kódujících myší metalothionein-I, elongační faktor-ία, kolagen (například kolagen Ial, kolagen Ia2 a kolagen IV), aktin (například γ-aktin), imunoglobulin, HMG-CoA reduktázu, glyceraldehyd fosfát dehydrogenázu, 3-fosfoglycerátkinázu, kolagenázu, stromelyzin, fibronektin, vimentin, inhibitor aktivátoru plazminogenu I, thymosin β4, tkáňové inhibitory metaloproteinázy, ribozomální proteiny, molekuly hlavního histokompatibilitního komplexu a lidské leukocytární antigeny.

Regulační sekvence s výhodou obsahují vazebné místo pro transkripční faktory jako například TATA box, CCAAT box, API, Spi nebo NF-κΒ vazebné místo.

Indikátorové geny.

Pokud je to žádoucí, může konstrukt obsahovat sekvenci kódující požadovaný polypeptid, operativně spojenou se svým vlastním promotorem. Příkladem může být gen pro selekční znak, který se používá pro usnadnění identifikace spojení směrující sekvence s její cílovou sekvencí. Gen pro amplifikovatelný znak může být také součástí konstruktu a používá se pro usnadnění selekce buněk s koamplifikovanými přilehlými DNA sekvencemi. Buňky obsahující amplifikované kopie amplifikovatelného znaku jsou rozpoznány na základě růstu v přítomnosti látky, která odlišuje buňky exprimující amplifikovatelný gen. Aktivovaný endogenní IFNA2 gen je amplifikován v tandemu spolu s amplifikovatelným selekčním znakem. Buňky obsahující více kopií aktivovaného endogenního genu mohou produkovat velmi vysoké koncentrace IFNA2 a jsou tudíž vhodné pro in vitro produkci proteinu nebo genovou terapii.

• · to e

• toto ···♦ •to «· *· • »· ·· «ι··· • · ·«··· ·· · to···· « • ·· ···· ·· >·« *··· ·· «»

Geny pro selekční a amplifikovatelný znak nemusí nutně ležet v těsné blízkosti. Gen pro selekční znak může být shodný s genem pro amplifikovatelný znak. Jeden nebo oba identifikační geny mohou být součástí intronu DNA konstruktu. Vhodné identifikační geny obou typů jsou popsány v U.S. patentu 5,641,670.

Donorové místo sestřihu a akceptorové místo sestřihu.

DNA konstrukt může dále obsahovat exon, donorové místo sestřihu na 3’ konci exonu, intron a akceptorové místo sestřihu.

Donorové místo sestřihu je sekvence, která řídí sestřih jednoho exonu RNA transkriptu k akceptorovému místu dalšího exonu transkriptu. Výsledkem sestřihu je odstranění intronu mezi těmito dvěma místy. Typicky leží první exon ve směru 5’ vzhledem ke druhému exonu a donorové místo sestřihu, lokalizované na 3’ konci prvního exonu, se páruje s akceptorovým místem sestřihu, ležícím těsně vedle druhého exonu na jeho 5’ konci. Donorová místa sestřihu mají charakteristickou konzervovanou sekvenci (A/C)AGGURAGU (kde R představuje purinový nukleotid), kde GU v pozici 4 a 5 jsou nezbytná (Jackson, Nucleic Acids Research 19: 3715-3798, 1991). První tři nukleotidy konzervovaného donorového místa sestřihu jsou zároveň poslední tři nukleotidy exonu: tj. nejsou odstřiženy. Donorová místa sestřihu jsou funkčně definována na základě své schopnosti uskutečnit odpovídající reakci v rámci mRNA sestřihové dráhy.

Akceptorové místo sestřihu v konstruktu podle vynálezu zajišťuje spolu s donorovým místem sestřihu sestřih intronu mezi dvěma exony. Akceptorové místo sestřihu má charakteristickou sekvenci (Y)i₀NYAG (SEQ ID NO: 19) kde Y představuje jakýkoliv pyrimidin a N představuje jakýkoliv nukleotid (Jackson, Nucleic Acids Research 19: 3715-3798, 1991).

CAP místo.

DNA konstrukt může volitelně obsahovat také CAP místo. CAP místo je specifický transkripční start, který je asociovaný s a využívaný regulační oblastí. CAP místo je v konstruktu lokalizováno vzhledem k regulační sekvenci tak, že po proběhlé homologní rekombinaci řídí regulační sekvence syntézu transkriptu, který začíná v CAP místě. Alternativně nemusí být CAP místo součástí konstruktu a pak transkripční aparát implicitně lokalizuje odpovídající místo v cílovém genu a to je pak použito jako CAP místo.

······· ·· · ·

Další DNA elementy.

Konstrukt může dále obsahovat sekvence, které ovlivňují strukturu nebo stabilitu

RNA nebo proteinu, připraveného homologní rekombinací.

Volitelně může DNA konstrukt obsahovat bakteriální počátek replikace ori a některý bakteriální selekční znak, například gen nesoucí rezistenci vůči antibiotiku. To umožňuje množení plazmidu v bakteriích nebo jiném vhodném klonovacím/hostitelském systému ve velkém měřítku.

Všechny výše popsané elementy DNA konstruktu jsou operativně spojeny nebo funkčně umístěny v konstruktu s ohledem na vzájemné vazby. To znamená, že následkem homologní rekombinace mezi konstruktem a cílovým místem v genomu, může regulační sekvence řídit produkci primárního RNA transkriptu, který začíná v CAP místě (voliteně může být CAP místo součástí konstruktu) a zahrnuje sekvenci ležící mezi CAP místem a endogením STOP-kodonem IFNA2 genu.

V závislosti na lokalizaci CAP místa může tato sekvence zahrnovat i část endogenní regulační oblasti IFNA2 genu, stejně jako sekvence, které s touto oblastí sousedí a normálně nejsou přepisovány. Pokud konstrukt obsahuje exon a donorové a akceptorové místo sestřihu, pak i primární transkript obsahuje exon, dvě místa sestřihu a intron ležící mezi těmito dvěma místy.

Pořadí jednotlivých elementů v DNA konstruktu může být variabilní. Pokud je konstruktem cirkulární plazmid nebo virový vektor, je relativní pořadí jednotlivých elementů ve výsledné struktuře například: směrující sekvence, plazmidová DNA (obsahující sekvence použité pro selekci a/nebo replikaci směrujícího plazmidu v mikrobiálním nebo jiném vhodném hostiteli), sekvence usnadňující selekci (tzv. selekční znak), regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu.

Je-li konstrukt lineární, je pořadí jednotlivých elementů například následující: první směrující sekvence, selekční znak, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhá směrující sekvence, nebo, alternativně, první směrující sekvence, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, selekční znak, případně interní ribozom-vazebné místo a nakonec druhá směrující sekvence.

Alternativně může být pořadí následující: první směrující sekvence, první selekční znak, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, druhá směrující sekvence a druhý selekční znak; nebo první směrující sekvence, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu, první selekční znak, druhá směrující sekvence a druhý selekční znak.

• · ·· 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0 • 0 0 0 0

00000 00 00

Rekombinace mezi směrujícími sekvencemi sousedícími s prvním selekčním znakem a homologními sekvencemi v hostitelském genomu má za následek směrovanou intergraci prvního selekčního znaku, zatímco druhý selekční znak není integrován. Žádoucí transfektované nebo infikované buňky jsou takové, které jsou stabilně transfektovány nebo infikovány prvním, ale nikoliv druhým selekčním znakem. Takové buňky mohou být selektovány na základě růstu v médiu s obsahem látky, která zvýhodňuje buňky exprimující první selekční znak a druhé látky, která selektuje pro buňky exprimující druhý selekční znak. Transfektované nebo infikované buňky s nesprávně integrovaným směrujícím konstruktem (tj. buňky u nichž došlo k integraci konstruktu jiným mechanizmem než homologní rekombinaci) budou exprimovat i druhý selekční znak a tudíž budou v selekčním médiu zabity.

V některých případech je součástí konstruktu i znak umožňující pozitivní selekci, tj. takový, který umožňuje selekci buněk obsahujících amplifikované kopie tohoto znaku. V takovém případě je pořadí jednotlivých elementů v konstruktu například následující: první směrující sekvence, amplifikovatelný znak pro pozitivní selekci, (volitelně) druhý selekční znak, regulační sekvence, exon, donorové místo sestřihu, intron, akceptorové místo sestřihu a druhá směrující sekvence.

Jednotlivé elementy DNA konstruktu mohou být získány buď z přirozených zdrojů (např. genomová DNA), nebo mohou být získány metodami genového inženýrství a nebo mohou být připraveny synteticky. Regulační oblast, CAP místo, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu mohou být izolovány ve formě kompletní jednotky například z genu pro lidský elongační faktor-ία (Genbank, sekvence HUMEF1A) nebo z oblasti velmi časných genů cytomegaloviru (Genbank, sekvence HEHCMVP1). Tyto komponenty ovšem mohou být izolovány i z jednotlivých genů.

Transfekce nebo infekce a homologní rekombinace.

DNA konstrukt podle vynálezu může být vnesen do buňky, například primární, sekundární nebo nesmrtelné buněčné linie, jako jediný DNA konstrukt nebo ve formě oddělených DNA sekvencí, které se inkorporují do chromozomální nebo jaderné DNA transfektované nebo infikované buňky. Termínem „transfektované buňka“ označujeme buňku, do které (nebo do jejíhož předka) byla vnesena molekula DNA nebo RNA jiným způsobem než s použitím virového vektoru. Termínem „infikovaná buňka“ označujeme buňku, do které (nebo do jejíhož předka) byla vnesena molekula DNA nebo RNA s použitím virového vektoru. Mezi viry, vhodné pro použití ve funkci vektorů, patří adenoviry, adeno-asociované víry, Herpes virus, virus příušnic, poliovirus, lentivirus, retroviry, Sindbis virus a viry vakcinie jako například virus ptačích neštovic. DNA může být do buněk vnesena ve formě lineární, dvouřetězcové (s nebo bez jednořetězcových oblastí na obou koncích), jednořetězcové nebo cirkulární molekuly. Je-li konstrukt vnesen do hostitelských buněk ve formě dvou oddělených DNA fragmentů, pak oba tyto fragmenty sdílejí určitou sekvenční homologii (překryv) na 3’ konci jednoho fragmentu a na 5’ konci fragmenty druhého, přičemž jeden z fragmentů nese první směrující sekvenci zatímco druhý fragment nese druhou směrující sekvenci. Po vnesení do buňky může mezi oběma fragmenty proběhnout homologni rekombinace za vzniku jediné molekuly nesoucí první i druhou směrující sekvenci, které ohraničují oblast překryvu mezi dvěma původními fragmenty. Výsledná molekula se potom nachází ve formě, schopné homologni rekombinace s cílovými místy v buněčném genomu. Může být použito i více fragmentů než zmíněné dva, přičemž každý z fragmentů je navržen tak, že mezi jednotlivými fragmenty dochází k homologni rekombinací, jejímž produktem může být jedině DNA fragment schopný homologni rekombinace s cílovými místy v buňce tak jak to bylo popsáno výše.

Pokud DNA konstrukt podle vynálezu nenese selekční znak sám o sobě, může být ko-transfektován nebo ko-infikován společně s jiným konstruktem, který takový znak nese. Směrující plazmid může být před transfekcí nebo infekcí štěpen restrikčním enzymem na jednom nebo více místech za vzniku lineární nebo přerušené molekuly. Takto vzniklé volné konce DNA zvyšují frekvenci vzniku požadované homologni rekombinace. Kromě toho mohou být volné konce DNA opracovány exonukleázou za vzniku přesahujících 3’ nebo 5’ jednořetězcových DNA konců (dlouhých například nejméně 30 nukleotidů, nejraději pak dlouhých 100 až 1000 nukleotidů. Takové konce opět zvyšují frekvenci vzniku požadované homologni rekombinace. V tomto případě vznikají následkem homologni rekombinace mezi směrující sekvencí a její cílovou sekvencí v genomu dvě kopie směrujících sekvencí, které ohraničují elementy obsažené v nveseném plazmidu. Buňky mohou být transfektovány DNA konstrukty (nejraději in vitro) celou řadou fyzikálních nebo chemických metod včetně například elektroporace, mikroinjekce, bombardování mikroprojektily, precipitace fosforečnanem vápenatým, transfekce pomocí lipozómů, nebo transfekce zprostředkované DEAE-dextranem.

Transfektované nebo infikované buňky jsou kultivovány za podmínek, které umožňují proběhnutí homologni rekombinace, tak jak je to popsáno v odborné literatuře (viz např. Capecchi, Science 24: 1288-1292, 1989). Pokud jsou homologně rekombinantní buňky kultivovány za podmínek umožňujících • · · » · · · • · · ······

9 9 9 9 9 9 9

99 999 9999 99 99 transkripci DNA, regulační oblast vnesená DNA konstruktem ovlivní transkripci

IFNA2 genu.

Homologně rekombinantní buňky (tj. buňky ve kterých proběhla požadovaná homologní rekombinace) mohou být identifikovány na základě posouzení jejich fenotypu nebo analýzou supernatantu z buněčné kultury, kde je metodou ELISA (enzymová imunanalýza) stanovena přítomnost IFNA2 v médiu. Komerční ELISA soupravy pro stanovení IFNA2 jsou dostupné od firmy Biosource International (CAmarillo, CA). Homologně rekombinantní buňky mohou být identifikovány také Southern nebo Northern analýzou nebo metodou PCR (polymerázová řetězová reakce).

Tak jak je použit zde, termín „primární buňky“ označuje i) buňky přítomné v suspenzi buněk izolovaných přímo z tkáně obratlovců (před jejich vysetím, tj. před jejich navázáním na substrát pro tkáňové kultury jako je například Petriho miska nebo kultivační láhev), ii) buňky přítomné v kultuře přímo odvozené od tkáně, iii) buňky vyseté v kultuře poprvé a iv) buněčné suspenze odvozené těchto vysetých buněk. Primárními buňkami mohou být také buňky tak jak se přirozeňe vyskytují v lidském nebo živočišném těle.

Sekundární buňky jsou buňky ve všech následujících krocích kultivace. To znamená, že od okamžiku kdy jsou vyseté primární buňky poprvé odloučeny z kultivačního substrátu a znovu vysety (pasážovány), jsou v tomto textu označovány jako buňky sekundární. Stejně tak jsou jako sekundární označovány všechny následující pasáže. Kmeny sekundárních buněk se sestávají ze sekundárních buněk, které byly pasážovány jednou nebo vícekrát. Sekundární buňky typicky vykazují konečný počet průměrných počtů zdvojení v kultuře a kontaktní inhibici růstu a růst závislý na přichycení k substrátu (růst závislý na přichycení k substrátu se nevyskytuje u buněk, které se kultivují v suspenzní kultuře). Primární ani sekundární buňky nejsou nesmrtelné.

Nesmrtelné buňky jsou buněčné linie (v protikladu k buněčným kmenům, kde je název „kmen“ rezervován pro primární a sekundární buňky), které podle všeho vykazují v kultuře nelimitovaný růst.

Buňky vybrané pro transfekci nebo infekci mohou spadat do čtyř typů nebo kategorií: (i) buňky které samy o sobě netvoří nebo neobsahují více než stopové množství IFNA2 proteinu, (ii) buňky které tvoří nebo obsahují protein, ale v jiném než požadovaném množství (například v množství menším než je fyziologická hranice pro daný typ buněk), (iii) buňky které tvoří protein v množství, které je pro daný typ buněk fyziologicky normální, ale u kterých je žádoucí produkci proteinu rozšířit nebo zvýšit a (iv) buňky, u kterých je žádoucí • 4

Οβ 4 ·· * 4444

4 4 4 4 4 4 • 44 44 4444444 44 změnit charakter produkce proteinu nebo regulaci indukce genu kódujícího protein.

Primární, sekundární i nesmrtelné buňky, vybrané pro transfekci nebo infekci navrhovanými způsoby mohou být získány z nejrůznějších tkání a zahrnují všechny příslušné buněčné typy, které lze pěstovat v kultuře. Mezi vhodné primární a sekundární buňky patří například fibroblasty, keratinocyty, epiteliální buňky (například epiteliální buňky mléčné žlázy, buňky střevního epitelu), endoteliální buňky, gliové buňky, nervové buňky, krevní elementy (například lymfocyty, buňky kostní dřeně), svalové buňky a prekurzory těchto somatických buněčných typů. Pokud zamýšlíme použít homologně rekombinantní buňky v genové terapii, jsou primární buňky nejraději získány z jedince, kterému budou transfektované nebo infikované primární nebo sekundární buňky aplikovány. Ovšem primární buňky mohou být získány i z donora (tj. jedince různého od recipienta) stejného druhu.

Mezi vhodné příklady nesmrtelných buněčných linií, vhodných pro produkci proteinu nebo genovou terapii patří například (ale nikoliv výhradně) buňky karcinomu vaječníků 2780AD (Van der Blick et al., Cancer. Res. 48: 5927-5932, 1988), A549 (American Type Culture Collection („ATCC“) CCL 185), BeWo (ATCC CCL 98), buňku Bowesova melanomu (ATCC CRL 9607), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1), COLO201 (ATCC CCL 224), COLO205 (ATCC CCL 222), COLO 320DM (ATCC CCL 220), COLO 320HSR (ATCC CCL 220.1), Daudi buňky (ATCC CCL 213), Detroit 562 (ATCC CCL 138), HeLa buňky a jejich deriváty (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), HTC 116 (ATCC CCL 247), HL-60 (ATCC CCL 240), HT 1080 (ATCC CCL 121), IMR-32 (ATCC CCL 127). buňky Jurkat (ATCC TIB 152), leukemické buňky K-562 (ATCC CCL 243), buňky karcinomu KB (ATCC CCL 17), KG-1 (ATCC CCL 246), KG-la (ATCC CCL 246.1), LS123 (ATCC CCL 255), LS174T (ATCC CCL CL-188), LS180 (ATCC CCL CL-187), buňky karcinomu prsu MCF-7 (ATCC BTH 22), buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), buňky Namalwa (ATCC CRL 1432), NCI-H498 (ATCC CCL 254), NCI-H508 (ATCC CCL 253), NCI-H548 (ATCC CCL 249), NCI-H716 (ATCC CCL 251), NCI-H747 (ATCC CCL 252), NCI-H1688 (ATCC CCL257), NCI-H2126 (ATCC CCL 256), buňky Ráji (ATCC CCL 86), RD (ATCC CCL 136), RPMI 2650 (ATCC CCL 30), RPMI 8226 (ATCC CCL 155), SNU-C2A (ATCC CCL 250.1), SNU-C2B (ATCC CCL 250), SW-13 (ATCC CCL 105), SW48 (ATCC CCL 231), SW403 (ATCC CCL230), SW480 (ATCC CCL 227), SW620 (ATCC CCL 227), SW837 (ATCC CCL 235), SW948 (ATCC CCL 237), SW1116 (ATCC CCL 233), SW1417 (ATCC CCL 238), SW1463 (ATCC CCL 234), T84 (ATCC CCL 248), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), WiDr (ATCC CCL 218), WI38VA13 odvozená linie 2R4 (ATCC CCL 75.1), dále heterohybridomové buňky připravené fúzí lidských buněk a buněk jiných druhů. Dále mohou být použity sekundární lidské fibroblastové buňky jako WI-38 (ATCC CCL 75) a MRC-5 (ATCC CCL 171). Pro in vitro produkci proteinu stejně jako genovou terapii mohou být kromě toho použity i další primární, sekundární nebo nesmrtelné buňky lidské nebo jiných živočišných druhů.

Buňky exprimující IFNA2.

Homologně rekombinantní buňky podle navrhovaného vynálezu exprimují IFNA2 v požadovaném množství a jsou vhodné jak pro produkci IFNA2 in vitro tak pro genovou terapii.

Produkce proteinu.

Homologně rekombinantní buňky podle navrhovaného vynálezu mohou být použity pro produkci IFNA2 in vitro. Buňky jsou kultivovány v podmínkách, které, tak jak je to popsáno v odborné literatuře, mají za následek expresi proteinů. Protein IFNA2 může být poté purifikován buď z buněčných lyzátů, nebo z buněčných supernatantů. Farmaceutický prostředek obsahující protein IFNA2 může být dopraven do lidského nebo zvířecího organizmu způsoby běžnými ve farmacii a známými v oboru (například orálně, intravenózně, intramuskulárně, intranasálně, pulmonárně, transmukózní cestou, intradermálně, rektálně, intratekálně, transdermálně, subkutánně, intraperitoneálně nebo intralézní cestou). Orální podání může vyžadovat použití strategie na ochranu proteinu před jeho degradací v gastrointestinálním traktu, například zapouzdřením v polymemích mikrokapslích.

Genová terapie.

Homologně rekombinantní buňky podle navrhovaného vynálezu jsou vhodné pro použití jako populace homologně rekombinantních buněčných linií, jako populace homologně rekombinantních primárních nebo sekundárních buněk, jako populace homologně rekombinantních buněčných klonů nebo linií, jako homologně rekombinantní heterogenní buněčné kmeny nebo linie a jako buněčné směsi ve kterých je přítomna nejméně jedna reprezentativní buňka jedné ze čtyř předchozích kategorií homologně rekombinantních buněk. Takové buňky mohou být použity ve vhodném systému a při vhodném způsobu podání k léčbě (i) infekcí způsobených viry jako jsou například papiloma virus, viry hepatitidy B a C, virus ···«· * ·· · · ·· • · · · · · · · · · « • · · · · · · · • ♦· · ······ • · · · · · · · · ··· ·· »·· ·*·· ·· «· vakcinie, virus herpes simplex, virus herpes zoster varicellosus a rhinovirus a (ii) jakýchkoliv jiných stavů, které lze léčit pomocí IFNA2.

Homologně rekombinantní primární buňky, klonální buněčné kmeny nebo heterologní buněčné kmeny jsou podány jedinci, jehož nenormální nebo nežádoucí stav vyžaduje pro léčbu nebo prevenci v dostatečném množství a odpovídajícím způsobem podaný exprimovaný nebo jinak tělu zpřístupněný protein nebo exogenní DNA ve fyziologicky relevantním množství. Fyziologicky relevantní množství je takové množství, které se buď blíží běžné úrovni produkce proteinu v těle, nebo je zvýšeno v důsledku abnormálního nebo nežádoucího stavu. Jsou-li buňky vzhledem k imunokompetentnímu recipientu syngenní, mohou být podány nebo implantovány intravenózně, intraarteriálně, subkutánně, intraperitoneálně, intraomentálně, subrenálně kapsulárně, intratekálně, intrakraniálně nebo intramuskulárně.

Pokud buňky nejsou syngenní a recipient je imunokompetentní, lze homologně rekombinantní buňky před podáním uzavřít v prostředku s jednou nebo více polopropustnými bariérami. Propustnost daného prostředku je taková, že buňky nemohou po implantaci do subjektu prostředek ve kterém jsou podány opustit, ale pro terapeutický protein je bariéra volně propustná a protein tudíž může difundovat do prostoru obklopujícího implantát nebo může vstoupit do systémového oběhu. Viz například US patenty č. 5,641,670; 5,470,731;

5,620,883; 5,487,737 a společně vlastněná US patentová přihláška nazvaná „Delivery of Therapeutic Proteins“ (navrhovatelé: Justin C. Lamsa a Douglas A Treco), 16. dubna 1999; které jsou zde všechny zahrnuty odkazem. Prostředek opatřený bariérou může být implantován do jakéhokoliv vhodného místa: například intraperitoneálně, intratekálně, subkutánně, intramuskulárně, v ledvinové kapsli nebo v omentu.

Prostředky opatřené bariérou jsou zvláště vhodné a umožňují implantaci homologně rekombinantních nesmrtelných buněk, homologně rekombinantních buněk z jiných druhů (homologně rekombinantních xenogenních buněk), nebo buněk pocházejících z donora který není s akceptorem histokompatibilitní (homologně rekombinantních allogenních buněk) za účelem léčby daného subjektu. Tyto prostředky udržují buňky in vivo ve fixované pozici a chrání tyto buňky před hostitelským imunitním systémem. Prostředky opatřené bariérou také umožňují výhodnou krátkodobou (přechodnou) terapii, neboť umožňují rychlé odstranění buněk v případě, kdy je z nějakého důvodu nutné léčebný režim přerušit. Transfektované nebo infikované xenogenní a alogenni buňky mohou být pro krátkodobou genovou terapii použity i bez prostředku opatřeného bariérou.

• · • ·

V takovém případě je IFNA2 produkovaný buňkami uvolňován in vivo dokud nejsou buňky hostitelským imunitním systémem odvrhnuty.

Pro tento účel může být použita celá řada syntetických, semisyntetických nebo přirozených filtračních membrán včetně (ale nikoliv výhradně) celulózy, acetátu celulózy, nitrocelulózy, polysulfonu, polyvinylidendifluoridu, polyvinylchloridových polymerů a polymerů derivátů polyvinylchloridu. Prostředky opatřené bariérou umožňují využití primárních, sekundárních nebo nesmrtelných buněk v genové terapii u člověka.

Dalším typem prostředku pro použití v genové terapii podle vynálezu je implantovatelná kolagenová matrice ve které jsou buňky ukotveny. Takový prostředek, který může obsahovat kuličky ke kterým jsou buňky navázány, je popsán v WO 97/15195, který je zde zahrnut odkazem, tento prostředek může být implantován tak jak bylo popsáno výše.

Množství buněk, nezbytné pro odpovídající dávku nebo implantaci závisí na množství faktorů včetně úrovně exprese proteinu, velikosti a stavu hostitelského živočicha a nejrůznějších omezení spojených s procesem implantace. Obvykle je množství buněk, implantované dospělému člověku nebo jinému podobně velkému živočichu je v rozmezí od 1 χ 10⁴ do 5 x 10 ’°, nejraději pak 1 χ 10⁸ až 1 χ 10⁹. Je-li to nutné, mohou být buňky pacientu implantovány na více místech, a to buď jedenkrát nebo opakovaně v průběhu měsíců nebo let. Dávka může být podle potřeby opakována.

Depozit.

Podle pravidel Budapešťské dohody o mezinárodním uznání depozitu mikroorganizmů pro účely patentového řízení byl plazmid pH2AB uložen v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA dne 12. května 1998. Plazmid je k dispozici pod přístupovým kódem 209872.

Zástupce přihlašovatele, Transkaryotic Therapies, lne. garantuje, že ATCC je depozitář, zajišťující konstantnost depozitu a v případě udělení patentu jeho snadnou dostupnost veřejnosti. Veškerá omezení dostupnosti daného materiálu pro veřejnost budou neodvolatelně zrušena v okamžiku udělení patentu. Materiál bude během patentového řízení dostupný osobám oprávněným k tomuto členem komise podle 37 CFR 1.14 a 35 U.S.C. §122. Uložený materiál je udržován s veškerou péčí, nezbytnou pro zachování životnosti materiálu a zabránění jeho kontaminaci po dobu nejméně pěti let od poslední žádosti o dodání vzorku uloženého materiálu a v každém případě po dobu nejméně třiceti (30) let od data uložení nebo po dobu vynutitelné existence patentu (podle toho, který časový údaj je nejdelší). Zástupce fc ···· ···· • · · · · · · • · · ······ • · · · ···· fc fcfc ····*·· fcfc · · přihlašovatele uznává svou povinnost nahradit depozit v případě, kdy depozitář (ATCC) není schopen díky stavu depozitu na vyžádání poskytnout vzorek.

Další provedení.

Je nutné zde uvést, že přestože byl vynález vysvětlen a doložen detailním popisem, je tento předcházející popis vynálezu pouze ilustrativní a v žádném případě nelimituje rozsah navrhovaného vynálezu. Ten je vymezen rozsahem následujících patentových nároků.

Další aspekty, výhody a modifikace jsou obsaženy v následujících patentových nárocích.

Přehled obrázků na výkresech ♦ Na obrázku 1 je uvedena publikovaná sekvence (SEQ ID NO:1) kódující oblasti lidského IFNA2 genu a přilehlých 5’a 3’ nekódujících sekvencí (GenBank HUMIFNAA). Sekvence PCR primerů IFN1, IFN2, IFN6 a IFN7 jsou označeny šipkami, ♦ Na obrázku 2 je schematický diagram znázorňující lidskou genomovou oblast IFNA2, jako inzert v plazmidu pA2HB.

♦ Na obrázku 3 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:7) oblasti proti směru transkripce od kódující sekvence lidského IFNA2 genu. Tato nukleotidová sekvence nebyla dříve publikována.

♦ Na obrázku 4 je znázorněna nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:9) kódující oblasti lidského IFNA2 genu a přilehlých 5’a 3’ nekódujících sekvencí. Podtržená sekvence (SEQ ID NO:8) dosud nebyla publikována. Dále je znázorněna polypeptidová sekvence (SEQ ID NO:2), kódovaná zmíněným genem. N-konec maturovaného polypeptidu je označen jako „Maturovaný“.

♦ Na obrázku 5 je znázorněn schematický diagram konstruktu podle vynálezu. Konstrukt obsahuje první směrující sekvenci (1); amplifikovatelný znak (AM); selekční znak (SM); regulační sekvenci; CAP místo; exon; donorové místo sestřihu (SD); intron; akceptorové místo sestřihu (SA) a druhou směrující sekvenci (2). Černými obdélníky je označena kódující DNA a tečkovanými obdélníky jsou označeny transkribované, ale nepřekládané oblasti.

♦ Na obrázku 6 je znázorněna sekvence (SEQ ID NO:10) ve směru 5’ vzhledem ke kódující sekvenci lidského IFNA2 genu včetně části kódující sekvence. Podtržená sekvence již byla dříve publikována, zatímco ostatní sekvence ··♦·

· 9 9 · 9

999 99

999 99 9999999 (-4074 až -511 SEQ ID NO:11) je nová. Orámována je sekvence SEQ ID NO:12. Sekvence v pozici 5’ vzhledem k sekvenci SEQ ID NO:12 je SEQ ID NO:7. Sekvence mezi orámovanou oblastí a podtrženou sekvencí je SEQ ID NO:8. Nukleotidy -4074 až -3270 označujeme jako SEQ ID NO:15. Nukleotidy -3267 až -3239 označujeme jako SEQ ID NO:16. Nukleotidy -3241 až -3137 označujeme jako SEQ ID NO: 17. Nukleotidy -3139 až -511 označujeme jako SEQ ID NO:18.

♦ Na obrázku 7 je znázorněna první směrující sekvence (SEQ ID NO: 13) použitá v konstruktu podle vynálezu.

♦ Na obrázku 8 je znázorněna druhá směrující sekvence (SEQ ID NO: 14) použitá v konstruktu podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce proteinu.

Homologně rekombinantní buňky podle navrhovaného vynálezu mohou být použity pro produkci IFNA2 in vitro. Buňky jsou kultivovány v podmínkách, které, tak jak je to popsáno v odborné literatuře, mají za následek expresi proteinů. Protein IFNA2 může být poté purifikován buď z buněčných lyzátů, nebo z buněčných supernatantů. Farmaceutický prostředek obsahující protein IFNA2 může být dopraven do lidského nebo zvířecího organizmu způsoby běžnými ve farmacii a známými v oboru (například orálně, intravenózně, intramuskulárně, intranasálně, pulmonárně, transmukózní cestou, intradermálně, rektálně, intratekálně, transdermálně, subkutánně, intraperitoneálně nebo intralézní cestou). Orální podání může vyžadovat použití strategie na ochranu proteinu před jeho degradací v gastrointestinálním traktu, například zapouzdřením v polymerních mikrokapslích.

Příklad 2: Genová terapie.

Homologně rekombinantní buňky podle navrhovaného vynálezu jsou vhodné pro použití jako populace homologně rekombinantních buněčných linií, jako populace homologně rekombinantních primárních nebo sekundárních buněk, jako populace homologně rekombinantních buněčných klonů nebo linií, jako homologně rekombinantní heterogenní buněčné kmeny nebo linie a jako buněčné směsi ve kterých je přítomna nejméně jedna reprezentativní buňka jedné ze čtyř předchozích kategorií homologně rekombinantních buněk. Takové buňky mohou být použity ve vhodném systému a při vhodném způsobu podání k léčbě (i) infekcí

• 9 • 9 • « • · · · · · · · • · · · · způsobených viry jako jsou například papiloma virus, viry hepatitidy B a C, virus vakcinie, virus herpes simplex, virus herpes zoster varicellosus a rhinovirus a (ii) jakýchkoliv jiných stavů, které lze léčit pomocí IFNA2.

Příklad 3:

Dalším typem prostředku pro použití v genové terapii podle vynálezu je implantovatelná kolagenová matrice ve které jsou buňky ukotveny. Takový prostředek, který může obsahovat kuličky ke kterým jsou buňky navázány, je popsán v WO 97/15195, který je zde zahrnut odkazem, tento prostředek může být implantován tak jak bylo popsáno výše.

Množství buněk, nezbytné pro odpovídající dávku nebo implantaci závisí na množství faktorů včetně úrovně exprese proteinu, velikosti a stavu hostitelského živočicha a nejrůznějších omezení spojených s procesem implantace. Obvykle je množství buněk, implantované dospělému člověku nebo jinému podobně velkému živočichu je v rozmezí od 1 χ 10⁴ do 5 x 10 ^l0, nejraději pak 1 χ 10⁸ až 1 χ 10⁹. Je-li to nutné, mohou být buňky pacientu implantovány na více místech, a to buď jedenkrát nebo opakovaně v průběhu měsíců nebo let. Dávka může být podle potřeby opakována.

Claims (40)

1. DNA konstrukt ovlivňující, po integraci do genomu savčích buňek cestou homologní rekombinace, expresi endogenního genu pro interferon-a 2 v těchto buňkách, vyznačující se tím, že zahrnuje (i) směrující sekvenci obsahující nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO: 11 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

2. DNA konstrukt podle nároku lvyznačující se tím, že zmíněný konstrukt dále obsahuje exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu.

3. DNA konstrukt podle nároku lvyznačující se tím, že zmíněný konstrukt dále obsahuje selekční znak.

4. DNA konstrukt podle nároku lvyznačující se tím, že zmíněná směrující sekvence obsahuje nejméně 50 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:11.

5. DNA konstrukt ovlivňující, po integraci do genomu buňky cestou homologní rekombinace, expresi endogenního genu pro interferon-a 2 v savčích buňkách, vyznačující se tím, že zahrnuje (i) směrující sekvenci obsahující nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:7 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

6. DNA konstrukt podle nároku 5 vyznačující se tím, že zmíněný konstrukt dále obsahuje exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu.

7. DNA konstrukt ovlivňující, po integraci do genomu buňky cestou homologní rekombinace, expresi endogenního genu pro interferon-a 2 v savčích buňkách, vyznačující se tím, že zahrnuje (i) směrující sekvenci obsahující nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:8 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

8. DNA konstrukt podle nároku 7 vyznačující se tím, že zmíněný konstrukt dále obsahuje exon, donorové místo sestřihu, intron a akceptorové místo sestřihu.

9. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nejméně 50 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO.ll nebo sekvence k SEQ ID NO:11 komplementární vyznačující se tím, že zmíněná izolovaná nukleová kyselina nekóduje plnou délku interferonu-a 2.

• ··*· · ·· * · ·« · ·· ♦ · φ « * • · · 9 9 9 9

9 9 9 · 9 9 9 ··

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99

10. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 vyznačující se tím, že obsahuje nejméně 100 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:11 nebo sekvence k SEQ ID NO.ll komplementární.

11. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 vyznačující se tím, že obsahuje nejméně 200 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:11 nebo sekvence k SEQ ID NO: 11 komplementární.

12. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 v y z n a č u j í c í s e tím, že obsahuje SEQ ID NO:7 nebo sekvenci k SEQ ID NO:7 komplementární. 13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 v y z n a č u j í c í s e tím, že obsahuje SEQ ID NO:8 nebo sekvenci k SEQ ID NO: 8 komplementární. 14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 v y z n a č u j í c í s e tím, že obsahuje SEQ ID NO:11 nebo sekvenci k SEQ ID NO: 11 komplementární. 15. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 v y z n a č u j í c í s e

tím, že obsahuje nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:7 nebo sekvence k SEQ ID NO:7 komplementární.

16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 9 vyznačující se tím, že obsahuje nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů SEQ ID NO:8 nebo sekvence k SEQ ID NO:8 komplementární.

17. Izolovaná nukleová kyselina vyznačující se tím, že obsahuje řetězec obsahující nukleotidovou sekvenci, která (i) je nejméně 200 nukleotidů dlouhá a (ii) hybridizuje za vysoce přísných podmínek se SEQ ID NO: 11 nebo se sekvencí která je k SEQ ID NO: 11 komplementární.

18. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 17 vyznačující se tím, že zmíněná nukleotidová sekvence je nejméně 400 nukleotidů dlouhá.

19. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 17 vyznačující se tím, že zmíněná nukleotidová sekvence je nejméně 1000 nukleotidů dlouhá.

20. Izolovaná nukleová kyselina vyznačující se tím, že obsahuje řetězec obsahující nukleotidovou sekvenci, která (i) je nejméně 100 nukleotidů dlouhá a (ii) hybridizuje za vysoce přísných podmínek se SEQ ID NO:7 nebo se sekvencí která je k SEQ ID NO:7 komplementární.

21. Izolovaná nukleová kyselina vyznačující se tím, že obsahuje řetězec obsahující nukleotidovou sekvenci, která (i) je nejméně 50 nukleotidů • ·

9 9

9 · • 99

9 9999 dlouhá a (ii) hybridizuje za vysoce přísných podmínek se SEQ ID NO:8 nebo se sekvencí která je k SEQ ID NO:8 komplementární.

22. Izolovaná nukleová kyselina vyznačující se tím, že obsahuje řetězec obsahující nukleotidovou sekvenci, která (i) je nejméně 50 nukleotidů dlouhá a (ii) vykazuje nejméně 80% identitu s fragmentem SEQ ID NO: 11 o stejné délce jako je zmíněná nukleotidová sekvence.

23. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 22 vyznačující se tím, že zmíněná nukleotidová sekvence je nejméně 100 nukleotidů dlouhá.

24. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 22 vyznačující se tím, že zmíněný fragment tvoří část nebo celá SEQ ID NO:7.

25. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 22 vyznačující se tím, že zmíněný fragment tvoří část nebo celá SEQ ID NO:8.

26. Homologně rekombinantní savčí buňka vyznačující se tím, že je stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 1, kde mezi zmíněným DNA konstruktem a genomovou DNA proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu (ATG) endogenní sekvence kódující interferon-a 2 proběhla homologní rekombinace.

27. Homologně rekombinantní savčí buňka vyznačující se tím, ž e je stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 2, kde mezi zmíněným DNA konstruktem a genomovou DNA proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu (ATG) endogenní sekvence kódující interferon-a 2 proběhla homologní rekombinace.

28. Homologně rekombinantní savčí buňka vyznačující se tím, že je stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 3, kde mezi zmíněným DNA konstruktem a genomovou DNA proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu (ATG) endogenní sekvence kódující interferon-a 2 proběhla homologní rekombinace.

29. Homologně rekombinantní savčí buňka vyznačující se tím, ž e je stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 4, kde mezi zmíněným DNA konstruktem a genomovou DNA proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu (ATG) endogenní sekvence kódující interferon-a 2 proběhla homologní rekombinace.

30. Způsob ovlivnění exprese endogenního genu pro interferon-a 2 v savčí buňce in vitro vyznačující se tím, že zahrnuje vnesení DNA konstruktu podle nároku 1 do buňky a dále udržování buněk v podmínkách, které umožňují proběhnutí homologní rkombinace mezi konstruktem a cílovým

4 44 4444

44 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

444 4444 4 4 4 4 místem umístěným ve směru 5’ vzhledem ke kódující sekvenci endogenního genu pro interferon-a 2.

31. Použití buňky podle nároku 26 pro přípravu léčiva, určeného pro dodání interferonu-a 2 živočichovi metodou implantace buňky do těla živočicha, kde tato buňka vylučuje interferon-a 2.

32. Použití buňky podle nároku 27 pro přípravu léčiva, určeného pro dodání interferonu-a 2 živočichovi metodou implantace buňky do těla živočicha, kde tato buňka vylučuje interferon-a 2.

33. Použití buňky podle nároku 28 pro přípravu léčiva, určeného pro dodání interferonu-a 2 živočichovi metodou implantace buňky do těla živočicha, kde tato buňka vylučuje interferon-a 2.

34. Použití buňky podle nároku 29 pro přípravu léčiva, určeného pro dodání interferonu-a 2 živočichovi metodou implantace buňky do těla živočicha, kde tato buňka vylučuje interferon-a 2.

35. Způsob produkce interferonu-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu buněk podle nároku 26 a dále kultivaci těchto buněk in vitro za podmínek, které buňkám umožňují exprimovat a vylučovat interferon-a 2.

36. Způsob produkce interferonu-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu buněk podle nároku 27 a dále kultivaci těchto buněk in vitro za podmínek, které buňkám umožňují exprimovat a vylučovat interferon-a 2.

37. Způsob produkce interferonu-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu buněk podle nároku 28 a dále kultivaci těchto buněk in vitro za podmínek, které buňkám umožňují exprimovat a vylučovat interferon-a 2.

38. Způsob produkce interferonu-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu buněk podle nároku 29 a dále kultivaci těchto buněk in vitro za podmínek, které buňkám umožňují exprimovat a vylučovat interferon-a 2.

39. DNA konstrukt ovlivňující, po integraci do buněčného genomu cestou homologní rekombinace, expresi endogenního genu pro interferon-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje (i) směrující sekvenci obsahující nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů jedné nebo několika ze sekvencí SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:18 a (ii) transkripční regulační sekvenci.

40. Izolovaná nukleová kyselina vyznačující se tím, že obsahuje nejméně 20 po sobě jdoucích nukleotidů jedné nebo několika ze sekvencí SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:18 nebo sekvencí, které jsou k sekvencícm SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 a SEQ • ···· · ·· ·« · ···· ·«·· to* ····<·

31 · to········ ········· «·· ·· ··· to··· ·· ··

ID NO: 18 komplementární, kde zmíněná izolovaná nukleová kyselina nekóduje plnou délku interferonu-a 2.

41. Homologně rekombinantní savčí buňka vyznačující se tím, ž e je stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 39, kde mezi zmíněným DNA konstruktem a genomovou DNA proti směru transkripce vzhledem k iniciačnímu kodonu (ATG) endogenní sekvence kódující interferon-a 2 proběhla homologní rekombinace.

42. Způsob ovlivnění exprese endogenního genu pro interferon-a 2 v savčí buňce in vitro vyznačující se tím, že zahrnuje vnesení DNA konstruktu podle nároku 39 do buňky a dále udržování buněk v podmínkách, které umožňují proběhnutí homologní rkombinace mezi konstruktem a cílovým místem umístěným ve směru 5’ vzhledem ke kódující sekvenci endogenního genu pro interferon-a 2.

43. Použití buňky podle nároku 41 pro přípravu léčiva, určeného pro dodání interferonu-a 2 živočichovi metodou implantace buňky do těla živočicha, kde tato buňka vylučuje interferon-a 2.

44. Způsob produkce interferonu-a 2 vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu buněk podle nároku 41 a dále kultivaci těchto buněk in vitro za podmínek, které buňkám umožňují exprimovat a vylučovat interferon-a 2.