JP2003525592A - インターフェロンタウ変異体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、動物及びヒトの健康に関し、更に、特に、改良された生物学的活性を与える、ＩＦＮ−τ分枝のアミノ末端の近くのアミノ酸を置換するので、原ＩＦＮ−τとは異なるインターフェロン−タウ（ＩＦＮ−τ）の類似体或いは変異体を製薬学的な用途に関する。開示されたＩＦＮ−τ変異体は、低い毒性で、高い効果のあるＩＦＮ−アルファと比べて、同じか或いは少し低い抗−ウイルス活性を有し、そして、原ＩＦＮ−タウに比べて高い抗−増殖活性を有し、ウイルス性感染、癌及び自己免疫性疾病を含む免疫システム疾病を処置するに有用にするものである。本発明は、新規な組換え蛋白質、特に、インターフェロン、インターロイキン及びシトキン、ポリペプチドホルモン並びに、既知の蛋白質よりも改良された生物学的活性を有し、及び／或いは低い毒性及び／或いは高められた安定性を有する他の生物学製薬剤を作成する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、動物及びヒトの健康の分野に関し、更に、原ＩＦＭ−τとは異なる
インターフェロン−タウ（ＩＦＮ−τ）の類似体或いは変異体の製薬学上の用途
に関しており、それは、改良された生物学的活性を与えるＩＦＭ−τ分子のアミ
ン末端に近いアミノ酸を置換したものであるからである。ここで開示するＩＦＮ
−τ変異体は、低い毒性でありながら、高い効果のあるＩＦＮ−アルファに比べ
て、同じ或いは少し低い抗−ウイルス活性を保持しており、そして、原ＩＦＮ−
タウに比べて高い抗−増殖活性を有し、ウイルス感染や癌及び免疫疾病（自己免
疫病を含めて）の処置に有用にするものである。本発明は、既知の蛋白質よりも
改良された、生物学的活性を有し、及び／或いは低い毒性及び／或いは増加した
安定性を有する、新規な組換え蛋白質、特に、インターフェロン、インターロイ
キン及びシトキン、ポリペプチドホルモン類及び他の生物学的製薬学物を作成す
る方法に関する。

【０００２】 参照文献 １．Pestka,S.,Langer,J.A.,Zoon,K.C.,及びSamuel,C.E.(1987) Ann.Rev.Bioche
m.56,727〜777. ２．Spencer,T.E.,Becker,W.C.Georger,P.Mirando,M.A.Ogle,T.F.及びBazer,F.W
.(1995) Endocrin.136,4932〜4944. ３．Bazer,F.W.,Spencer.T.E.,及びOtt,T.L.(1996) American J.Reprod.Immunol
.35,297〜308. ４．Imakawa,K.,Anthony,R.V.,Kazemi,M.,Marotti,K.R.,Polites,H.G.及びRober
ts,R.M.(1987) Nature.330,377〜379.

【０００３】

【従来の技術】

用語”インターフェロン”は、種々の生物学的活性、例えば、抗−ウイルス性
、抗−増殖性及び、そのような物質が誘導され、ある場合には、インターフェロ
ンがクロス特定活性を有するように、少なくとも動物の種での、免疫調節特性を
有するものと知られる、脊椎動物の糖蛋白質及び蛋白質の群を一般的に示すもの
である。インターフェロンノ以下の定義は、公式のインターフェロンの用語につ
いてのシステムを作る国際委員会で認められたものである。”インターフェロン
と定量する為には、ファクタが、ウイルスが不特定であり、少なくとも、均質性
細胞において、ＲＮＡ及び蛋白質の両方の合成を含む細胞代謝過程を通して抗−
ウイルス活性を有する蛋白質でなければならない。”インターフェロン研究のジ
ャーナル、１，ｐｐ．ｖｉ（１９８０）。”本発明を説明するための使用される
”インターフェロン”は、その定義のものと認めることができる。タイプＩイン
ターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−ω及び−τ）は、ウイルス複製を抑制し、
そして、細胞増殖を低下させることにより、細胞を防御するために、身体により
製造される蛋白質の群である。

【０００６】

【発明の概略】

本発明の目的は、既知の生物学的活性を有する第１の蛋白質の１以上のアミノ
酸を変えることにより、改良された生物学的活性を有する組換え蛋白質を作る方
法であり、そのアミノ酸は、所望の生物学的活性を有する第２の蛋白質と構造的
に類似である相当するアミノ酸とは異なるものであり、第２の蛋白質に見いださ
れた、１以上の異なるアミノ酸に変えられ、それは、改良された生物学的活性を
有する化合物を製造するためである。組換え蛋白質は、特に、インターフェロン
、インターロイキン、シトキン、ポリペプチドホルモン或いは他の生物学製薬剤
のような蛋白質にできる。１つの具体例においては、第１及び第２の蛋白質は、
タイプＩのインターフェロン、例えば、インターフェロンタウ、アルファ及びベ
ーター及びオメガを含むものである。他の具体例においては、第１の蛋白質は、
インターフェロン−タウであり、第２の蛋白質が、インターフェロン−アルファ
である。

【０００７】 更なる本発明の目的は、高められた抗ウイルス活性及び／或いは抗増殖活性或
いは低い細胞毒性を有する組換え蛋白質を提供するである。

【０００８】

【詳細な説明】

本発明の好適な１具体例によれば、本発明の戦略は、成熟羊インターフェロン
−タウ １モード（ＩＦＮ−τ）のアミノ末端の近くのアミノ酸を、ヒトＩＦＮ
−αＡに見出されたアミノ酸に、変えることであり、そのインターフェロン−タ
ウ １モードは、溶媒に晒されたもので、且つヒトＩＦＮ−αＡ（或いは他のイ
ンターフェロンアルファ類）の同じ位置に見出される相当のアミノ酸（ＩＦＮ−
τ）と異なるものである。それは、ヒトＩＦＮ−αＡ或いは羊ＩＦＮ−τ １モ
ードのいずれかに見出されるものよりも、治療活性対毒性の比率が、より良い化
合物を製造するためである。

【０００９】 本発明の種々の面を更に、詳細に以下説明するが、制限する実施例ではない。

【００１０】

【実施例１】 材料と製法 バクテリア及びイースト菌 用いられるエシェリシア コリ(大腸菌)は、ＤＨ５α及びＸＬ−１（ストラタ
ジン:Stratagene）及びＩＮＶαＦ（ストラタジン）であった。ピチア パスト
リス(Pichia pichia)株ＳＭＤ１１６８を用いた。ＩＦＮ−τ遺伝子を、株ＧＳ
１１５中のピチア パストリス構成から増幅した。

【００１１】 メヂア バクテリア媒体は、ＬＢ（１０ｇのバクト−トリプトン(Difco)、５
ｇのバクト−イースト抽出物(Difco)及び９５０ｍｌの水中の１０ｇのＮａＣｌ(
Sigma)を、１５ｇのアガー(Fisher)で皿に補充したもの、或いは、低い塩のＬＢ
（１０ｇに代えて５ｇのＮａＣｌを有する同じＬＢ）であった。抗生物質を、６
０μｇ／ｍｌの濃度で、アンピシリン(Sigma)、５０ｇ／ｍｌのカナマイシン(Si
gma)或いは５０μｇ／ｍｌのゼオシン(Invitrogen)で添加した。

【００１２】 イースト媒体は、ＹＰＤ（１％イースト抽出物、２％ペプトン(Difco)、２％
デキストローゼ(J.T.Baker)を２％アガーで皿に補充したもの）、ＢＮＧＹ（１
％イースト、２％ペプトン、１００ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ６．０(Fisher)、１
．３４％イースト窒素ベース(Difco)、４×１０^-5％ビオチン(Biotin)(Sigma)、
１％グリセロール(Fisher)を、２％アガーで皿に供給されたもの）．ゼオシン(Z
eocin)をイースト媒体に、１００μｇ／ｍｌの濃度で添加された。 細胞ライン−ＭＤＢＫ細胞は、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含有
する、最小エッセンス媒体（ＭＥＭ）中で培養された。全てのヒト腫瘍細胞ライ
ンが、ＡＴＣＣ（ロックビル，メリーランド州）から得られる。ＭＣＦ−７細胞
は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、抗生物質及び１０％ＦＢ
Ｓを含有するイ−グル(Eagle)のＭＥＭ中で成長された。ＨＴ−２９細胞は、０
．１ｍＭの非エッセンシャルアミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｐ
ｇ／ｍｌの牛インシュリン、Ｌ−グルタミン、抗生物質及び１０％ＦＢＳを含有
するイ−グル(Eagle)のＭＥＭ中で成長された。ダウジ(Daudi)細胞は、２０％の
ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０中で成長された。 インターフェロン−ｏｖＩＦＮ−タウ１モードをコード化する遺伝子は、メチ
ルプロピックイーストPichia pastoris(Invitrogen,カルフォルニア州、サンデ
イアゴ）中に、アルコールオキシダーゼ プロモータ（１９）の制御下でクロー
ン化された。メタノールで誘導された後に、ｏｖＩＦＮ−タウ１モードは、分泌
された蛋白質として作成された。それは、硫酸アンモニウム沈殿化とその後の、
ジエチルアミノエチルセルロース(Sigma,St.Lois,MO)を用いた、アニオン交換ク
ロマトグラフィにより精製された。精製された蛋白質の特定の活性は、１×１０ ⁸ 単位／ｍｇであった。組換えヒトＩＦＮ−アルファＡは、インテルゲンInterge
n(Purchase,NY)及びＰＢＬ(New Brunswick,NJ)で調査され、各々、３×１０⁸単
位／ｍｇ及び１×１０⁸単位／ｍｇであった。

【００１３】 羊ＩＦＮ １モード Mutageneisi/Expressionベクトルは、ovlＦＮ−タウ
１モードMutageneisi/Expressionの構成のために、羊ＩＦＮ タウ１モードの遺
伝子を、ＰＣＲにより、タクポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて、
増幅し、そして、究極的にＥ．コリ イーストシャトルベクトルｐＰＩＣＺａｌ
ｐｈａ(Invitrogen)のＫｐｎ Ｉサイトにクローン化される前に、Ｅ．コリ ベ
クトルｐＣＲ２．１（ストラタジンＴＡクローン化キット）にクローン化した。

【００１４】イーストからＩＦＮ−τの遺伝子を増幅する。 ＩＦＮ−τ １モード遺伝子は、Pichia pastorisのイースト ゲノムから直
接に増幅された。ゲノムＤＮＡは、コロニイからＰＣＲのために直接に製造され
、バイオテクニク(Ward,1996)中のプロトコールに従う。

【００１５】 遺伝子の適用は、ＰＣＲにより達成できる。イースト中の原遺伝子は、二重再
結合発生(Ott,1991)の間の損失のために、制限サイトはないので、新規な制限サ
イトが、プライマに添加された。

【００１６】ｐＰＩＣＺαの使用 他のベクターも用いられ、インビストロゲン(Invistrogen)からｐＰＩＣＺα
ベクトルになる。異なるプライマが必要である。プライマは、 Primer 1(Ｋｐｎｌ（ＧＧＴＡＣＣ）を有するコード化ストランドの５’−末端
と同じで、そしてＳｎａＢ（ＴＡＣＧＴＡ）サイトを添加し、下線で示されるよ
うになる）を有するコード化ストランドの５’−末端と同じであり、そして、下
線により示された（ＴＡＣＧＴＡ）サイトに添加した。 5’-TAGGTACCACTACGGTAGGTGCTACCTGTCG-3’

【００１７】 Primer 2(重複Ｋｐｎｌ（ＧＧＴＡＣＣ）を有する非コード化ストランドの３
’−末端に同じであり、そして、（ＣＣＧＣＧＧ）サイトを添加し、以下の下線
により示される。 5’-TAGGTACCACTACGGTTACGGAGAATTCAGG-3’

【００１８】 ゲノムＤＮＡは、高い忠実性のポリメラーゼ：ＰＦＵ（ストラタジン）による
ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用できる。イースト遺伝子から取り出
した変異体タウ遺伝子を取り、ベクトル中に入れることを行う他の方法は、ゲノ
ムＤＮＡを取り出し、ＰＣＲで増幅し、そして、増幅した遺伝子を、ＰＣＲ２．
１大腸菌ベクトル中に入れ、そして、ＰＣＲ２．１からｐＰＩＣＺアルファベク
トルに入れることによる。ＰＣＲ２．１は、プライマの異なるセットを用いる。

【００１９】 ＰＣＲ生成物は、アガローゼ ゲル 電気泳動法上で可視化され、GENECLEAN(
登録商標）を用いて精製された。次に、ＰＣＲ生成物を、ベクトルｐＰＩＣＺα
の場合と同様に、Ｋｐｎｌ(Promega)により消化せしめる。 詳細：使用されたプライマは次のようである。

【００２０】

【表１】 変異位置は下線で示される。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年４月２日（２００１．４．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の名称】 インターフェロン タウ変異体及びその製法

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、動物及びヒトの健康の分野に関し、更に、原ＩＦＭ−τとは異なる
インターフェロン−タウ（ＩＦＮ−τ）の類似体或いは変異体の製薬学上の用途
に関しており、それは、改良された生物学的活性を与えるＩＦＭ−τ分子のアミ
ン末端に近いアミノ酸を置換したものであるからである。ここで開示するＩＦＮ
−τ変異体は、低い毒性でありながら、高い効果のあるＩＦＮ−アルファに比べ
て、同じ或いは少し低い抗−ウイルス活性を保持しており、そして、原ＩＦＮ−
タウに比べて高い抗−増殖活性を有し、ウイルス感染や癌及び免疫疾病（自己免
疫病を含めて）の処置に有用にするものである。本発明は、既知の蛋白質よりも
改良された、生物学的活性を有し、及び／或いは低い毒性及び／或いは増加した
安定性を有する、新規な組換え蛋白質、特に、インターフェロン、インターロイ
キン及びシトキン、ポリペプチドホルモン類及び他の生物学的製薬学物を作成す
る方法に関する。

【０００２】 参照文献 １．Pestka,S.,Langer,J.A.,Zoon,K.C.,及びSamuel,C.E.(1987) Ann.Rev.Bioche
m.56,727〜777. ２．Spencer,T.E.,Becker,W.C.Georger,P.Mirando,M.A.Ogle,T.F.及びBazer,F.W
.(1995) Endocrin.136,4932〜4944. ３．Bazer,F.W.,Spencer.T.E.,及びOtt,T.L.(1996) American J.Reprod.Immunol
.35,297〜308. ４．Imakawa,K.,Anthony,R.V.,Kazemi,M.,Marotti,K.R.,Polites,H.G.及びRober
ts,R.M.(1987) Nature.330,377〜379. ５．Roberts,R.M.,Cross,J.S.及びLeaman,D.W.(1992) Endocr.Rev.13,432〜452. ６．Alexenko,A.P.,Leaman,D.W.,Li,J.,及びRoberts,R.M.(1997) J.Interferon
Cytokine Res.17,769〜799. ７．Alexenko,A.P.,Ealy,A.D.及びRoberts,R.M.(1999) J.Interferon Cytokine
Res.19,1335〜1341. ８．Subramaniam.P.S.,Khan,S.A.,Pontzer,C.H.及びJohnson,H.M.(1997) Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.92,12270〜12274. ９．Pontzer,C.H.,Yamamoto,J.K.,Bazer,F.W.,Ott,Ta.L.,及びJohnson,H.M.(199
7) J.Immunol.158,4351〜4357. 10．Soos,J.M.,Subramaniam,P.S.,Hobeika,A.C.,Schiffenbauer,J.及びJohnson,
H.M.(1995) J.Immunol.155,2747〜2753.

【０００３】 参照文献 11．Radhakrishnan,R.,Walter,L.J.,Hruza,A.,Reichert,P.,Trotta,P.P.,Magabh
ushan,T.L.,及びWalter,M.R.(1996) Structure.4,1453〜1463. 12．Senda,T.,Saitoh,及びMitsui,Y.(1995) J.Mol.Biol.253,187〜207. 13．Karpusas,M.,Nolte,M.,Benton,C.B.,Meiser,W.,Lipscomp.W.N.及びGoets,S.
(1997) Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94,11813〜11818. 14．Radhakrishna,R.,Walter,L.J.,Subramanian,P.S.,Johnson,H.M.,及びWalter
,M.R.(1999) J.Mol.Biol.286,151〜162. 15．Mitsui,Y.,Senda,T.,Shimazu,T.Matsuda,S.,及びUtsumi,J.(1993) Phamacol
.Ther.58,93〜132. 16．Runkel,L.,Pfeffer,L.,Lewerenz,M.,Monneron,D.,Yang,C.H.,Murti,A.,Pell
egrini,S.,Geolz,S.,Uze,G.及びMorgensen,K.(1998) J.Biol.Chem.273,8003〜80
08. 17．Pontzer,C.H.,Ott,T.L.,Barer,F.W.及びJohnson,H.M.(1990) Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.87,5945〜5949. 18．Li,J.及びRobert,R.M.(1994) J.Biol.Chem.269,24826〜24833. 19．Van Heeke,G.,Ott,T.L.,Strauss,A.,Ammaturo,D.,及びBazer,F.W.(1996) J.
Interferon Cytokine Res.16,119〜126. 20．Swann,S.L.,Bazer,F.W.Villarette,L.H.,Chung,A.,及びPontzer,C.H.(1999)
Hybridoma.18,399〜405.

【０００４】 参照文献 21．Li,J.,及びzRobert,R.M.(1994) J.Biol.Chem.269,13544〜13550. 22．Pontzer,C.H.,及びJohnson,H.M.(1995) Meth.Neurosci.24,3〜9. 23．Zoon,K.C.,Miller,D.M.,Bekisz,J.,zur Nedden,D.,Enterline,J.C.Nguyen.N
.Y.,及びHu,R-Q.(1992) J.Biol.Chem.267,15210〜15219. 24．Johnson,J.A.,Hochkeppel,H-K.,及びGangemi,J.D.(1999) J.Interferon Cyt
okine Res.19.1109〜1116. 25．Aguet,M.,Grobke,M.,及びDreiding,P.(1984) Virol.132,211〜316. 26．Mogensen,K.E.,Lewerenz,M.,Reboul,J.,Lutfalla,G.,及びUze,G.(1999) J.I
nterferon Cytokine Res.19,1069〜1098. 27．Syed.R.S.,Reid,S.W.,Li,C.,Cheetham,J.C.,Aoki,K.H.et al.(1998) Nature 395 ,511〜516. 28．Domanski,P.,Nadeau,W.W.,Platanias,L.C.,Fish,E.,Kellum,M.,Pitha,P.,及
びColamonici,O.R.(1998) J.Biol.Chem.273,3144〜3147. 29．Harada,H.,Taniguchi,T.,及びTanaka,N.(1998) Biochimie.80,641〜650. 30．Stanto,L.F.,Yu,C.R.,Petricoin,III,E.F.,及びLarmer,A.C.(1998) J.Biol.
Chem.273,18701〜18704. 31．Petricoin,III,E.F.,Ito,S.,Williams,B.,Audet,S.,Stancato,L,F.et al.(1
997) Nature 390,629〜632. 32．Uddin,S.,Fish,E.N.,Sher,D.A.,Gardziola,C.,White,M.F.,及びPlatanias,L
.C.(1997) J.Immunol.158,2390〜2397. 33．Barasoain,I.,Portoles,A.,Aramburu,J.F.,及びRojo,J.M.(1989) J.Immunol
.143,507〜512. 34．Arora,T.,Floyd-Smith,G.,Espy,M.J.,及びJelinek,D.F.(1999) J.Immunol.1 62 ,3289〜3297. 35．Waine,G.J.,Tymms,M.J.,Brandt,E.R.,Cheertham,B.F.及びLinnane,A.W.(199
2) J.Interferon Cytokine Res.12,43〜48.

【０００５】

【従来の技術】 用語”インターフェロン”は、種々の生物学的活性、例えば、抗−ウイルス性
、抗−増殖性及び、そのような物質が誘導され、ある場合には、インターフェロ
ンがクロス特定活性を有するように、少なくとも動物の種での、免疫調節特性を
有するものと知られる、脊椎動物の糖蛋白質及び蛋白質の群を一般的に示すもの
である。インターフェロンノ以下の定義は、公式のインターフェロンの用語につ
いてのシステムを作る国際委員会で認められたものである。”インターフェロン
と定量する為には、ファクタが、ウイルスが不特定であり、少なくとも、均質性
細胞において、ＲＮＡ及び蛋白質の両方の合成を含む細胞代謝過程を通して抗−
ウイルス活性を有する蛋白質でなければならない。”インターフェロン研究のジ
ャーナル、１，ｐｐ．ｖｉ（１９８０）。”本発明を説明するための使用される
”インターフェロン”は、その定義のものと認めることができる。タイプＩイン
ターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−ω及び−τ）は、ウイルス複製を抑制し、
そして、細胞増殖を低下させることにより、細胞を防御するために、身体により
製造される蛋白質の群である。

【０００６】 ＩＦＮ−アルファは、種々のタイプの細胞増殖を抑制することが示される。Ｉ
ＦＮ−アルファは、毛細胞白血病のような血液悪性疾患に対して特に有効である
(Quesada等，1984)。更に、これらの蛋白質は、多重骨髄腫、慢性リンパ球白血
病、低級のリンパ腫、カポシ肉腫、慢性脳脊髄白血病、腎−細胞癌、膀胱腫瘍及
び卵巣癌(Bonnen,et al.,J.Biol.Response MOdifiers 3:580(1984);Oldham,Hosp
ital Practice 20:71(1985)に対して活性があると証明されていた。ある種の自
己免疫性及び炎症性の疾病でのインターフェロン及びインターフェロンリセプタ
ーの役目も、また研究されていた(Benoit,et al.,J.Immunol 150(3):707(1993)
。

【０００７】 ＩＦＮ−アルファも、種々のタイプのウイルス感染に対して有用である(Finde
r,et.al.,Drugs 42(5);749(1991)。アルファ インターフェロンは、ヒト乳頭腫
ウイルス(papillonmavisus)感染症、肝炎(Hepatitis)Ｂ及び肝炎(Hepatitis)Ｃ
感染症(Finder,et al.,1991;Kashima,et al.,(Laryngoscope 98:334(1988);Dush
eiko,et al.J.Hematology 3 (suppl.2);S199(1986);Davis,et al.,N.England J.
Med.321:1501(1989)に対して活性を有する。本願明細書にリストされた雑誌記事
は、すべて本明細書に含有されるものである。

【０００８】 アルファ タイプのインターフェロン（ＩＦＮ−αｓ）は、慢性肝炎(Hepatit
is)Ｂ及びＣ、生殖器疣、毛髪細胞白血病及びカポシ肉腫などを含むいくつかの
疾病の処置のためにＦＤＡで認証されたものである。それらは、非ホジキンリン
パ腫及び悪性黒腫(Marino,T.M.,Interferons;Principles and MedicalApplicati
ons, 1992,129〜138(1992)、慢性脳脊髄白血病、皮膚扁平細胞癌及び喉頭乳頭腫
症(Baron,S.,JAMA 10,1375〜83(1991)などを含む、エイズ（ＡＩＤＳ）及び癌
の 治療に試みたものである。

【０００９】 ＩＦＮも、免疫性変調の役目に作用することにより身体を助けることができる
ものである。例えば、タイプＩのＩＦＮは、マクロファージ食細胞活性及び亜酸
化窒素媒介殺菌性並びにＩＦＮ−γ生成性(Reder,A.,Interferon Therapy of Mu
ltiple Sclerosis. 61〜647,485〜492(1992)を高めることが証明された。他のタ
イプＩインターフェロンのように、ＩＦＮ−τ生成もまた、自然キラー細胞活性
を高めることが証明されている(Tuo,W.,American Journal of Reproductive Imm
unology,29,26〜34(1993)。

【００１０】 然し乍ら、ＩＦＮ−αは、欠点を有し、患者が、厳しすぎる処置副作用になる
。副作用は、投与量依存性を有し、低い投与量の副作用は、通常の活性でよく干
渉することのあるインフルエンザ様の症状を含むが、高い投与量では、吐気、嘔
吐、食欲不振及び発疹を含むものである(Pontzer,et al.,Cancer Res.51:5304(1
991))。非常に高い投与量では、末梢性神経障害及び血小板減少症を起こすよう
である。ヒト及び動物において、ＩＦＮ−β及びＩＦＮαで生体処置すると、熱
症、嗜眠、頻脈、体重減少及び白血球減少を含む多数の副作用として示される毒
性を起こすものである。

【００１１】 これらの副作用は、よく、(i)処置の効果を制限するレベルにインターフェロ
ン投与量を減少させること、或いは(ii)処置を終了させることを要する。従って
、アルファインターフェロンで処置することが、患者の順応と、持続された形で
の高い投与量を使用することが不可能であることの両方により、抑制される。Ｉ
ＦＮ−ベーターの悪い効果は、ＩＦＮ−アルファで見られるものと同様である。
ＩＦＮ−ベーターは、多重の硬化症の処置に用いられてきた。

【００１２】 より最近に発見されたタイプ１インターフェロン、インターフェロン−タウ（
ＩＦＮ−τ）は、ＩＦＮ−αよりも低い毒性であるのに、抗ウイルス活性及び抗
増殖活性を示す。ヒツジＩＦＮ−τは、羊の母性認識の臨界器官の間に、ツエエ
ムブリオニック トロフェクトデルムにより生成された主な受胎産物分泌蛋白質
である。それは、生成され、そして、内移植の前に短時間で多量に分泌される。
羊及び他の反芻動物での、その基本的な役目は、エストロゲンリセプターアップ
レギュレイションを抑制し、そして、プロスタグランジンＦ２アルファの拍動分
泌をブロックすることにより、黄体の後退を防止することである。

【００１３】 他のインターフェロンに比して、ヒツジＩＦＮ−タウは、インターフェロン−
アルファを有する約４５〜６８％のアミノ酸同類体、及び約６８％インターフェ
ロン−オメガ−ｓ（ＩＦＮオメガ−ｓ）を有する最も大きな同様な配列を分担し
ている。ヒツジＩＦＮ−τは、インターフェロンαに同類の約５０％の配列を有
し、それは、分子のカルボキシ末端領域に非常に近い同類体を有する。ＩＦＮ−
アルファと同様に、ＦＮ−τは、５つのヘリックスを有する。ヒトＩＦＮαＡの
ためのアミノ酸配列は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．１とされる。ネイテイブ ヒツジ
ＩＦＮτ１ｍｏｄのためのアミノ酸配列は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．２とされ、そ
して、その核酸配列は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．３である。

【００１４】 タイプ１ ＩＦＮ上の機能的に重要なサイトを見出すに、そして、免疫疾病及
び癌の治療に臨床的に有用であるために、改良された生物学的活性、著しく近い
種活性及び低い毒性を有する新規なＩＦＮを開発するに、著しい関心があった。

【００１５】

【発明の概略】 本発明の目的は、既知の生物学的活性を有する第１の蛋白質の１以上のアミノ
酸を変えることにより、改良された生物学的活性を有する組換え蛋白質を作る方
法であり、そのアミノ酸は、所望の生物学的活性を有する第２の蛋白質と構造的
に類似である相当するアミノ酸とは異なるものであり、第２の蛋白質に見いださ
れた、１以上の異なるアミノ酸に変えられ、それは、改良された生物学的活性を
有する化合物を製造するためである。組換え蛋白質は、特に、インターフェロン
、インターロイキン、シトキン、ポリペプチドホルモン或いは他の生物学製薬剤
のような蛋白質にできる。１つの具体例においては、第１及び第２の蛋白質は、
タイプＩのインターフェロン、例えば、インターフェロンタウ、アルファ及びベ
ーター及びオメガを含むものである。他の具体例においては、第１の蛋白質は、
インターフェロン−タウであり、第２の蛋白質が、インターフェロン−アルファ
である。

【００１６】 更なる本発明の目的は、高められた抗ウイルス活性及び／或いは抗増殖活性或
いは低い細胞毒性を有する組換え蛋白質を提供するである。

【００１７】 他の本発明の目的において、アミノ酸置換体は、第１及び第２の蛋白質での溶
媒−露出のアミノ酸を同定し、そして、第２蛋白質内で同定された、拡散する溶
媒−露出のアミノ酸を挿入することにより、第１蛋白質のアミノ酸置換体を作成
することにより、選択される。本発明の方法での、第１及び第２の蛋白質は、同
じ或いは異なる種からのもので、天然に産するもの或いは非天然に産するもので
ある。

【００１８】 本発明の他の目的は、癌；タイプＩ真性糖尿病、リウマチ性関節炎、エルテマ
トーマス狼瘡及び乾癬のような自己免疫疾病を含む、感染システム疾病、及びウ
イルス感染の処置及び防止のための用途、或いは一般的にインターフェロンを使
用する他の用途のための、低い毒性の新規なインターフェロン−タウ変異体蛋白
質を提供することである。本発明の新規なインターフェロン−タウ変異体は、ア
ミノ酸ＳＥＱ．ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定される。

【００１９】 他の目的は、（ａ）癌や腫瘍を処置する方法で、そのような処置を必要とする
動物に、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．４〜１０及び１８〜２０により同定されたアミノ
酸よりなる群から選択された、組換インターフェロンタウ蛋白質の治療的に効果
のある量を投与することによる。癌の処置に十分な量、ヒト腺癌、乳癌、前立腺
癌、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、皮膚癌、膀胱癌
、腎臓癌、脳癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮癌、骨癌、直腸癌、頚癌及び神経外胚葉
癌を処置し、そして、前悪性条件、例えば、モノクロナール ガンマポチス、形
成異常症を含むが、それに限定しなく、頚部及び口部の形成異常症を含むが、そ
れに限定しない。 （ｂ）ウィルス病の処置方法であって、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．４〜１０及び１８
〜２０により同定された、アミノ酸配列から選択された組換インターフェロンタ
ウ蛋白質を治療的な効果のある量、そのような処置の必要のある動物に、本発明
の詳細な説明に列挙されるような、特に、ＲＮＡ及びＤＮＡウィルス、ＨＩＶ及
び肝炎Ｂ及びＣを含む、ウィルス病を処置するに十分な量、投与することであり
；（ｄ）腫瘍細胞ウィルスを低減する方法であって、生体内或いは試験管内の腫
瘍細胞を、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．４〜１０及び１８〜２０により同定された、ア
ミノ酸配列よりなる群から選択された組換ＩＦＮ−タウ蛋白質に、腫瘍細胞の成
長を低減させるに効果的な濃度で接せしめることによる。

【００２０】

【発明の詳細な説明】定義： インターフェロン： インターフェロンは、ウィルスに非特定で、少なくとも相似
の細胞で、ＲＮＡ及び蛋白質の両方の合成を介する、細胞代謝過程を通して、抗
ウイルス活性を奏する蛋白質である。

【００２１】構造同様性： 本発明の明細書の目的のために、第１の蛋白質と第２の蛋白質とは
、（１）同じリセプターと結合する場合、或いは、（２）第１の蛋白質と第２の
蛋白質とは、同じ或いは同様の生物学的活性を有する場合か、或いは（３）それ
らのＸ−線結晶学的構造が、分子の一部で、３オングストローム以下の平方平均
二乗差で外挿できる場合、或いは、（４）２つの蛋白質が、ここで定義されるよ
うに、少なくとも２５％同定である場合において、リセプターとの親和性が異な
るが、第１の蛋白質は、第２の蛋白質と構造的には同様のものと考えられる。

【００２２】インターフェロン−タウ（ＩＦＮ−タウ） は、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ所用
と同族アミノ酸配列を７０％以上有するインターフェロン蛋白質族の１つである
。アミノ酸同族体は、例えば、デフォルトパラメータを有するＬＡＬＩＧＮプロ
グラムを用いて、決めることができる。このプログラムは、配列比較プログラム
(Pearson,et al.,1988;Pearson,1990;William R.Pearson, Department of Biolo
gical Chemistry,Box 440,Jordan Hall, Charlottesville,VAから入手できるプ
ログラム）のＦＡＳＴＡバ−ジョン１．７版に見られる。典型的には、ＩＦＮ−
タウは、次の特長から少なくとも１つを有する：（ａ）栄養外胚葉／胎盤による
胚芽／胎児の段階で発現された、（ｂ）抗−黄体効果特性、（ｃ）抗ウイルス特
性、（ｄ）抗−細胞増殖特性。

【００２３】 ヒツジ インターフェロン−タウ（ヒツジＩＦＮ−タウ）は、胚芽の栄養外胚葉
により、ヒツジの母性認識の臨界期間に作られた、主な受胎分泌物蛋白質である
。インターフェロン−タウの１つの形は、長さ１７２アミノ酸（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）である、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
１で示される核酸配列を有する。遺伝子コードの重複のために、インターフェロ
ン−タウ１ｍｏｄの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の１７２のアミノ酸を
コード化する塩基配列にできる。

【００２４】 本発明の変異体（例えば、再結合体：リコンビナント）インターフェロン タウ
蛋白質は、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．２及び４〜１０に示されるアミノ酸配列の１つ
を有する蛋白質を含むが、それに限定されない。本発明の変異体インターフェロ
ン タウＤＮＡは、本発明の変異体インターフェロンタウ蛋白質を生成する核酸
配列であり、そして、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．１１〜１７を含むが、それに限定さ
れないものである。

【００２５】 ２つのアミノ酸配列［或いは核酸配列］に関して、パーセント（％）同定は、
その配列が任意に配置され、そして、罰が”ｇａｐｓ”に配置されていない場合
、２つの配列で同じであるものの％を示すものである。換言すると、ｇａｐは、
第２の配列に任意に配列するための第１の配列に挿入される必要がある場合、相
当するアミノ酸部分と結合される部分のみを用いて、％同定が計算される（即ち
、計算は、第１の配列の”ｇａｐ”にある第２の配列中の部分と考えられる）。
臨界的配列は、最高の％同定スコアを与える配列と定義される。このような配列
は、”ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ”プログラムを用いて得られることができる。代替的
に、配列は、１．デフォルトパラメータとデフォルトＰＡＭのｋｔｕｐを有する
局部配列プログラムＬＡＬＩＧＮを用いて、得ることができる。

【００２６】 疾病を処置することは、疾病の症状を低下させるに、及び／或いは疾病の深刻
さを減らすに、効果的な治療的物質を投与することであり、そして、患者によい
他の効果を有することである。

【００２７】 −詳細な説明− 本発明の好適な１具体例によれば、本発明の戦略は、成熟羊インターフェロン
−タウ １モード（ＩＦＮ−τ）のアミノ末端の近くのアミノ酸を、ヒトＩＦＮ
−αＡに見出されたアミノ酸に、変えることであり、そのインターフェロン−タ
ウ １モードは、溶媒に晒されたもので、且つヒトＩＦＮ−αＡ（或いは他のイ
ンターフェロンアルファ類）の同じ位置に見出される相当のアミノ酸（ＩＦＮ−
τ）と異なるものである。それは、ヒトＩＦＮ−αＡ或いは羊ＩＦＮ−τ １モ
ードのいずれかに見出されるものよりも、治療活性対毒性の比率が、より良い化
合物を製造するためである。

【００２８】 以下に説明される特定の具体例において、ヒツジＩＦＮ−τ イソフォルム１
ｍｏｄ(GenBank accession number P08316)は、ヒトＩＦＮ−αタイプ２であっ
たが、タイプＡ或いは白血球インターフェロン(GenBank accession number IVBH
UA2)として知られる。然し乍ら、ＩＦＮ−τのいかなるクラスの、或いはイソフ
ォルムの、溶媒−露出のアミノ酸を、ＩＦＮ−αのいかなるクラスの、或いはイ
ソフォルムに見られる相当するアミノ酸に変えることは、本発明のものである。
更に、本発明は、ＩＦＮ−τ中の多重アミノ酸を、ＩＦＮ−αに見られるものに
、変えることでもあり、そして、その変化のすべての可能な変化の組合せ及びサ
イトカイン、ポリペプチドホルモン及びそのタイプの生物学製薬学的なものであ
る。

【００２９】 サイトカインは：モノサイト ケモアトラクタン(Monocyt Chemoattractant)
蛋白質、インターロイキン−１逆Ａ、インターロイキン１逆Ｅ、（１Ｌ−１逆Ａ
）、１Ｌ−１逆Ｅ及び１Ｌ−１ｒａ）、インターロイキン−８（１Ｌ−８）、イ
ンターロイキン−９（１Ｌ−９）、インターロイキン−２（１Ｌ−２）、インタ
ーロイキン−１０（１Ｌ−１０）、インターロイキン−３（１Ｌ−３）、インタ
ーロイキン−１１（１Ｌ−１１）、インターロイキン−１２（１Ｌ−１２）、イ
ンターロイキン−４（１Ｌ−４）、インターロイキン−１３（１Ｌ−１３）、高
分子量Ｂ細胞成長ファクター（インターロイキン−１４）、インターロイキン−
５（１Ｌ−５）、ヒトＢ細胞成長ファクター１２ｋＤａ（ＢＣＧＦ−１２ｋＤａ
）、インターロイキン−６（１Ｌ−６）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、腫
瘍ネクロシスファクター（ＴＮＦ）、インターロイキン−７（１Ｌ−７）、腫瘍
ネクロシスファクター逆Ｅを含む、マクロファージ コロニイ刺激ファクター（
Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロン−ガンマー（ＩＦＮγ）、グナヌロサイト−マ
クロファージ コロニイ刺激ファクター（ＧＭ−ＣＳＦ）、白血病抑制ファクタ
ー（ＬＩＦ）、オノコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ステム 細胞ファクター（ＳＣＦ
）、ヘパトシステス成長ファクター、繊毛状神経親和性ファクター（ＣＮＴＦ）
、ニュウロトロフィン、エピデルマル成長ファクター（ＥＧＦ）、神経差動化フ
ァクター（ＮＤＦ）、ニュレグリン(Neuregulin(NRG)族、Neu/ErbB-2レセプター
、プレイトレット−誘導成長ファクター（ＰＤＧＦ）、エリツロポエチン(Eryth
ropoientin)、顆粒球コロニイ−刺激ファクター、繊維芽細胞成長ファクター（
ＦＧＦ）、コロニイ−刺激ファクター−１（ＣＳＦ−１）、血管内皮成長ファク
ター、変換成長ファクター−逆Ｅ（ＴＧＦ逆Ｅ）、エンドセリンを含む。

【００３０】 本発明の具体例は、抗−増殖効果及び／或いは抗ウイルス効果を高め、ネイテ
イブＩＦＮ−τと比べて、細胞毒性の増加がない、ＩＦＮ−τの新規な変異体を
含む。これらの新規なインターフェイスン変異体は、従って、現在入手できる、
インターフェロン処置と比べて、改良された治療効率を有する。本発明の特定の
具体例は、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄの変異体に関するが、ヒトＩＦＮ−αＡ
或いは他のＩＦＮ−アルファから、アミノ酸の同じ置換で、ヒトＩＦＮ−タウに
することも意図される。ヒトＩＦＮ−タウの同族体の変異は、ヒツジＩＦＮ−タ
ウを変異するに、より少ない抗原である利点がある。

【００３１】 本発明は、ＩＦＮ−τに限定されない。本発明の方法は、インターフェロン、
インターロイキン、サイトキン、ケモキン、ホルモン、蛋白質或いはペプチドの
生物学的活性を、改良し、アミノ酸配列が既知であり、天然産或いは組換蛋白質
を含む、所望の生物学的活性を有する他の構造的に同様な分子があるものである
。構造的に同様な分子は、修正すべき、第１の蛋白質として、同じリセプター或
いは薬剤に結合する、或いは生物学的な活性が同じか同様の、関連の蛋白質或い
はペプチドであることができる。

【００３２】 本発明は、生物学的活性が改良されるべき、アミノ酸配列が知られる、第１の
蛋白質を選択し；所望の生物学的活性を有し、アミノ酸配列が既知であり、第１
の蛋白質と同様な構造である第２の蛋白質を同定し；第２の蛋白質上の相当する
アミノ酸と異なる、第１蛋白質上の１以上のアミノ酸を同定し；第１の蛋白質の
相当する１以上のアミノ酸で、第２蛋白質上で同定された、相当する、異なるア
ミノ酸の１以上に置換することを特徴とする、改良された生物学的活性を有する
組換蛋白質を作製する方法を含む。

【００３３】 他の具体例において、本発明は、生物学的活性が改良されるべきもので、アミ
ノ酸が既知である、（ヒツジＩＦＮ−タウのような）第１蛋白質を選択し；そし
て、アミノ酸配列は既知であり、所望の生物学的活性を有し、第１蛋白質と構造
的に同様である、第２蛋白質（ＩＦＮ−アルファのような）を同定することを特
徴とする、改良された生物学的活性を有する変異体を設計する方法を含む。次に
、第２蛋白質上の相当するアミノ酸と異なる、第１蛋白質上のこれらのアミノ酸
を同定することが必要である。好適な具体例において、これらのアミノ酸は、知
られているか、或いは、所望の生物学的特性に伴うと思われる、第１蛋白質及び
第２蛋白質の領域にある（例えば、インターフェロンアルファのアミノ端末領域
のように）。異なるアミノ酸を一度同定すると、第２蛋白質（例えば、インター
フェロンアルファ）で同定された異なるアミノ酸の１以上が、第１蛋白質（例え
ば、インターフェロンタウ）の相当するアミノ酸の１以上を置換する。アミノ酸
置換は、例えば、第１蛋白質の核酸配列を１以上置換し、それにより、１以上の
置換アミノ酸のコドンを含む変異された組換え核酸配列を作ることにより、作成
される。遺伝子コードの重複性のために、所定アミノ酸配列の多重核酸配列が、
不当な実験を行うことなく、容易に同定できる。本発明は、所望蛋白質をコード
化する核酸配列を用いることができる。この組換え核酸が、従って、改良された
生物学的活性を有する組換え蛋白質をコード化する。組換え核酸は、生体内或い
は試験管内で、改良された生物学的活性を有する組換え蛋白質を得るために、当
業者に知られた方法を用いて、翻訳されることができる。本発明は、第１蛋白質
の１つのアミノ酸或いは多重アミノ酸のみ、第２蛋白質中に見られるものに変え
ることにより、そして、全ての可能な変化の組合せにより変えることをも、カバ
ーするものである。同様に、本発明は、その相対処理法により、望ましくない生
物学的特性を低減するための方法をも含むものである。例えば、インターフェロ
ンタウからの１以上の特定のアミノ酸で、インターフェロンアルファの毒性部分
を置換することである。

【００３４】 好適な具体例では、サイト向き変異が、修正すべき蛋白質と構造的に同様の蛋
白質の生物学的に活性な領域との間の差異に基づいて、修正すべき、第１の蛋白
質の既知の生物学的に活性な領域中に、作成される。

【００３５】 本発明の他の具体例において、第１及び第２の構造的に同様な蛋白質が、改良
された生物学的活性或いは低い毒性或いは、変異していない各々の同族体以上の
改良された安定性を有し、そして、互いに異なるアミノ酸を有する、両方の変異
体蛋白質である。これらの変異体は、上記の本発明に従って、作成される必要は
ないが、例えば、相当のネイテイブ蛋白質以上の改良された生物学的活性を有す
る融合蛋白質にできるものである。更に、第１変異蛋白質の所望の生物学的活性
を改良するために、生物学的に目的とされた核酸置換物が、第１変異蛋白質に作
られ、新規なコドンが、異なる第２変異蛋白質中の１以上の相当するアミノ酸を
コード化し、それにより、第１蛋白質の生物学的活性を改良するものである。

【００３６】 他の具体例においては、第１の或いは第２の蛋白質或いはその両方が、融合蛋
白質である。他の具体例では、融合蛋白質は、ヒト／動物のキメラである。

【００３７】 サイト向け免疫化現象は、第１蛋白質の所望の特定のアミノ酸置換をするよう
に、ネガテイブヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄＤＮＡに変異を行う方法である。当
業者に知られる他の方法は、所望のアミノ酸を発現するコドンを作成するに必要
な核酸変化を行うことに用いられる。更に、本発明は、また、アミノ酸合成或い
は核酸合成により、所望の組換蛋白質を合成することで、得られる最終組換蛋白
質を得るように、生体内或いは試験管内の翻訳を行うことである。これらの及び
他の目的は、以下の本発明の説明から明らかである。

【００３８】 得られた最終組換蛋白質は、従って、融合蛋白質ではない。第１蛋白質の所望
の部分と、１以上の他の蛋白質の所望部分を組合せた、融合蛋白質は、当業界に
開示されているものである。融合蛋白質の長所は、融合部分の１以上が、与えら
れた所望の生物学的効果に加えて、構築物に、高めた抗原性或いは細胞毒性のよ
うな望ましくない効果を与え得ることである。融合蛋白質中に為されたように、
一度に分子の大きな部分を変えることにより、分子の構造集合性を破壊し、或い
は失わせしめ、生物学的活性を同様に低下させるようなことが、よくあることで
ある。

【００３９】 改良された生物学的活性を有する組換蛋白質を作製する本発明方法の長所は、
それが、融合蛋白質と比べて、改良された生物学的活性を有する組換蛋白質を作
成する、より精緻な方法を提供することであるが、第１の蛋白質に、非常に特定
された生物学的な指向性のあるアミノ酸変化をもたらすものである。

【００４０】 本明細書に説明された、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ変異体（ＩＦＮ−タウ変
異体或いはＩＦＮ−タウ組換蛋白質或いはタウ変異体とされる）は、ネイテイブ
ＩＦＮ−タウの低い毒性を有し、そして、ヒト細胞ラインに対して、高められた
抗増殖活性を有することである。従って、好適な具体例において、インターフェ
ロンタウ変異体は、この明細書の利用性の項目で詳細されるように、癌及び腫瘍
を処置するために有用である。ＩＦＮ−タウ変異体も、インターフェロンアルフ
ァ、ベーター、オメガ及びタウを含む、いかなるタイプＩのインターフェロンに
反応する病気を処置するために有用である。それは、本発明の変異体は、タイプ
Ｉリセプターに対する結合能力を有し、そして、他のインターフェロンにも同様
の活性を有するからである。これらの用途は、以下の利用性の項目に、より完全
に説明されており、そして、一般的に、免疫システム及び特に自己免疫病気を有
する。他のインターフェロンと比べてインターフェロンタウ変異体の毒性は低い
ために、変異体は、選択薬剤である。インターフェロンタウ変異体の低い毒性は
、変異体を、他の非−タウのインターフェロンよりも高い投与量で投与できるこ
とを意味しており、それは、タウ変異体の不可的な長所である。

【００４１】 インターフェロンタウ変異体は、試験管中で、Madin Darby Bovine Kidney(MD
BK)細胞での抗ウイルス活性に対して、古典的なアッセイでテストされた。すべ
ての変異体は、このアッセイで抗ウイルス活性を示した。これらは、ヒトウィル
ス感染の処置に効果的であり、そのすべては、ネイテイブのヒツジＩＦＮ−τ１
ｍｏｄの毒性が低いものであり、そして、ウシ細胞ライン上に抗ウイルス活性が
同じか或いは少し低いものである。

【００４２】 ＩＦＮ−τ、タイプＩ ＩＦＮ族に比較的最近に付加されたものは、多重硬化
症の処置する、相Ｉの臨床的な方法でヒトにおいて、顕著な副作用のないものの
ようである(J.M.Soos,Harvard Univ.,personal communication)。従って、ＩＦ
Ｎ−τは、ＩＦＮ−α治療法と比べて、低い毒性の代替法である。ＩＦＮ−αに
伴う毒性は、ＩＦＮ−τでは、ヒトＷＩＳＨ細胞、マウスＬ９２９細胞、ヒト末
梢リンパ球及びＨＩＶ感染ヒト末梢リンパ球を含む、種々の異なる細胞ラインの
上では見られない。更に、マウスの生体内研究により、リンパ球低下及び体重低
下を含む、ＩＦＮ−α随伴の毒性が、ＩＦＮ−τでは、見られないことが証明さ
れた(Reder,1997)。

【００４３】 ＩＦＮ−アルファについて観察されるように、異なるＩＦＮ−タウ サブタイ
プは、異なる比抗ウイルス活性及び抗増殖活性を示す（６）。いくつかのサブタ
イプのヒツジＩＦＮ−タウは、ヒトＩＦＮ−アルファＢ／Ｄに見られるように、
種クロス反応性をいくらか有することを示した（７）。更に、ヒツジＩＦＮ−タ
ウ１ｍｏｄ サブタイプは、試験管中、高濃度で、使用されて、Madin Darbyウ
シ腎臓（ＭＤＢＫ）或いは末梢血液細胞種の低下をもたらさない。生体中で、ヒ
ツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄは、ネズミの実験的アレルギー エンセフィロマイエ
リチス(experimental allergic encephylomyelitis:EAE)の出現率及び深刻さを
、動物体重低減なしで、白色血液細胞数或いはリンパ球機能を低減させることな
く、効率的に低下させた、そして、ネズミＩＦＮ−アルファの同じ抗ウイルス投
与量で観察された合併症なしである（１０）。ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄは、
多重硬化症の処置のためのフェースＩの治療において、ヒトに、顕著な副作用が
ないように見える。従って、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄは、細胞毒性を起こす
ことなく、可能性のある種バリアに対する、ヒトでの抗ウイルス活性を保持して
いる。ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄは、乳頭ウィルスＥ７腫瘍蛋白質発現を抑制
し、ヒトＩＦＮ−アルファＡ或いはハイブリッドＩＦＮ−アルファＢ／Ｄが奏し
たよりも、より効果的に、ｐ５３を高めることが、示された。本発明のすべての
タウ変異体は、抗ウイルス活性、抗−増殖活性、低毒性及びタイプＩリセプター
との結合能力を保持するので、上記に挙げた病気の処置に使用できる。

【００４４】 その低い細胞毒性のために、多くの感心が、ＩＦＮ−τの、ヒト状態に使用す
るについて、医学界に生じた。抗腫瘍薬剤としての、ヒツジ及びウシＩＦＮ−τ
の使用は、米国特許第５，９５８，４０２号に開示される。抗ウイルス剤として
の、ヒツジ及びウシＩＦＮ−τの使用は、米国特許第５，９４２，２２３号に開
示される。ヒトＩＦＮ−τの組換え生成及びそれを使用してウィルス状態及び腫
瘍を処置する方法は、米国特許第５，７０５，３６３号及び同第５，７３８，８
４５号に開示される。多重硬化症を含む、自己免疫疾病を処置するためのＩＦＮ
−τを使用する方法は、米国特許第５，９０６，８１６号及び同第６，０６０，
４５０号に開示される。ヒトの筋肉痛を処置するためにインターフェロンを使用
することは、米国特許第６，０３６，９４９号に開示される。更に、非−ＩＦＮ
−τタイプのカルボキシ末端配列に結合した、ヒトＩＦＮ−τのアミノ末端領域
を有するハイブリッドＩＦＮ−τ／ＩＦＮ−α分子は、米国特許第５，９３９，
２８６号に開示される。これらのすべての特許は、本明細書に含有される。すべ
ての本発明のタウ変異体は、それらが抗ウイルス活性、抗増殖活性、低い毒性及
びタイプＩレセプターとの結合力を有するので、以上の病気の処置に使用できる
。

【００４５】Ａ．構造 タイプＩのインターフェロンの活性は、一般的に、構造により決められる。全
てのタイプＩ ＩＦＮは、同じ一般構造を有するようであるが、大きな配列変化
が、ヒトのＩＦＮ−αｓ内に見られる(Lee,1995)。これらの配列差異は、マイナ
ー構造差に多分責任があり、従って、活性の変化は、異なるＩＦＮの間で見られ
る。ヒツジＩＦＮ−τの第１次のアミノ酸配列は、ヒト、ヒツジ、マウス、ラッ
ト及びブタのＩＦＮ−αｓの領域で、４５〜５５％の同族体を有し、ヒトＩＦＮ
−βで３０％の同族体であり、そして、ヒツジＩＦＮ−ωと同族体を有する(Rob
erts,1991)。ＩＦＮ−τの少なくとも２０個の異なる形があり(Johnson,1994)、
そして、ＩＦＮ−τの少なくとも５個のイソフォルムがある(Imakawa,1987)。す
べてのＩＦＮ−α、−β、及び−ωの間に保存された、１９個のアミノ酸部分を
有し、そして、これらのアミノ酸は、ＩＦＮ−τでも同じである(Roberts,1992)
。

【００４６】 ＩＦＮ−τの構造は、５つのヘリックス（螺旋）束を示す、他のタイプＩ Ｉ
ＦＮと同様の立体形であると仮定された。ヒトＩＦＮ−アルファ（２６）、ムリ
ンＩＦＮ−β(Senda,t.,EMBO Journal 11,3193〜3201(1992)及びヒツジＩＦＮ−
τ（１４）が、結晶化され、そして、その構造が決められた。ヒツジＩＦＮ−
τの構造は、Ｈｅｌｉｘ Ａ（部分４−２４）とされる５つのα−ヘリックスＡ
（部分４−２４）、Ｂ（５３−７４）、Ｃ（８０−１００）、Ｄ（１１６−１３
３）及びＥ（１３５−１７２）よりなり、それらは、結合したヘリックスの名前
で、ループ部分ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ及びＤＥにより分離される。ヘリックスＡ及び
Ｂは、互いに平行であるが、残りのヘリックスは、隣接のヘリックスと逆平行に
ある(Radhakrishnan,1999)。これらの掲示法は、ＩＦＮ−βのものと少し異なる
。異なるＩＦＮの間の、最も大きな差は、ループ部分及びアミノ端末にある。

【００４７】 タイプ１ ＩＦＮの間の総合的な構造類似性にもかかわらず、著しい差異もあ
る。最も大きな差は、Ｎ−端末にあり（ａａ６−７）、ヘリックスＡ及びＡＢ１
ループ（ａａ ２３−３２）、ＡＢ３ループ（ａａ４９−５２）、ヘリックスＢ
及びＢＣループ（ａａ７１−７７）にある。これらの部分は、分子の１面に位置
し、そして、リセプター結合に直接関連していると考えられる。

【００４８】 ＩＦＮは、応答を引き出すために、その細胞表面リセプターと干渉しなければ
ならない。２つのタイプのＩＦＮリセプターがあり、その１つは、タイプＩ Ｉ
ＦＮと干渉し、そして、他の１つは、タイプII ＩＦＮと干渉する(Mariano,199
2)。両方のリセプタータイプは、サイトカインリセプターのタイプII族の膜内外
蛋白質である。すべてのタイプＩ ＩＦＮが、同様にすべてのリセプターと結合
しない。ＩＦＮ−αは、ＩＦＮ−τよりも、著しく大きな親和力を有するタイプ
Ｉリセプターと結合し；この大きな結合親和力は、最大のリセプター占有率を伴
う。この高められた占有率は、更に、高められた毒性を伴う。この関係は、ＩＦ
Ｎ−τに見られた、低下された細胞毒性を説明するものである。

【００４９】 ＩＦＮ−タウについての以前の変異化研究は、Ｃ−端末に集中されていた（１
８）。Ｃ−端末１１の削除は、著しく低下した抗ウイルス活性と抗増殖活性をも
たらすが、レセプター結合性への少し負の影響のみを与えた。リシン１６０での
１１アミノ酸Ｃ−端末の直角切断及び置換により、子宮内膜のレセプター結合性
の大きな変化を与えないが、ヒト細胞ラインに対する、抗ウイルス活性をなくし
、そして、抗増殖活性を低下する。同じ研究により、ヘリックス（螺旋）Ｅでの
イソロイシンの置換が、レセプター結合親和性を、９５％低下させること、抗ウ
イルス活性を８７％低下させること、そして、抗増殖活性を完全に無くすことが
明らかになった。(Li,,J.,The Journal of Biological Chemistry, 269:40,2482
6〜24833(1994)。

【００５０】 詳細な構造機能研究が、タイプＩ ＩＦＮに対して為され、分子の形体と活性
の間の関係を同定した。合成ペプタイドの研究により、ＩＦＮ−τ分子での、配
列向性アミノ酸１〜３７、６２〜９２及び１３９〜１７２が、抗ウイルス活性で
重要であることが分かった(Pontzer,C.,Journal of Interferon Research 14,13
3〜41(1994)。このデータは、アミノ及びカルボキシ端末基が、両方、レセプタ
ー結合性に重要であり、そして、アミノとカルボキシ端末基であり、物理的に、
非常に近接である、ＩＦＮ−τの３次元構造に相当していることが明らかにする
（１４）。

【００５１】 種々のＩＦＮの可能性は、リセプター結合親和力に関連すると示唆されたもの
である（２５）。差のあるリセプター結合性は、タイプＩ ＩＦＮの異なる生物
学的特性で、顕著な役割をしている。ＩＦＮ−アルファ及びＩＦＮ−タウの、以
前の構造−機能の研究により、これらの領域が、インターフェロン活性に重要で
あるという仕事仮説が明らかにされた。

【００５２】 詳しい変異化研究から、レセプター結合性と生物学的機能のための”ホットス
ポット”の１つとして、ループＡＢが指摘された。ヒトＩＦＮ−ベーター及びＩ
ＦＮ−アルファの、位置２７と３５並びに１２３での変異化したことが、抗ウイ
ルス活性を低下させたことが分かった（１６）。ＩＦＮ−タウの種々の領域に相
当するペプチドを用いた研究により、部分１〜３７が、ヒツジＩＦＮ−タウの、
ＭＤＢＫ細胞に対する、抗ウイルス活性を抑制するが、ヒトＩＦＮ−アルファ２
で、その活性の抑制を補完しないことが明らかにされた（１７）。ＩＦＮ−α及
びＩＦＮ−τのアミノ端末基が、構造において、非常に大きな配列非同様性及び
非常に大きな変動を示し（１４）、そして、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−τ上の以前
の構造−機能性の研究により、これらの領域が、インターフェロン活性に重要で
あることが、はっきりと示唆されている。タイプＩ ＩＦＮレセプターが明確に
され、いくらかのＩＦＮ−τの独特の活性に責任があることが、はっきりと示唆
されている（８，１７）。

【００５３】Ｂ．改良された生物学的活性を有するインターフェロン変異体の選択及び設計 カルボキシル末端での以前研究が示したサイト向け変異体は、抗ウイルス活性
或いは抗増殖活性で見かけ上効果がなかった(Li.1994)が、ヒツジＩＦＮ−タウ
１ｍｏｄのアミノ末端での、ある種注意深く選択された、単一の、生物学的に向
けられた置換体は、ヒト細胞上の相当する変異蛋白質の抗増殖活性を予期しない
ように上昇させたが、以下に検討されるように、細胞毒性の上昇がなくて、抗ウ
イルス活性を保持することが、見出された。以下の例は、Ｎ−末端での６つの非
保持残基に向けられたものである。実験の戦略は、よく特長ずけられたネイテイ
ブヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ（ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤ ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．２
，及びＮＵＣＬＥＡＩＣ ＡＣＩＤ ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ．１を有する）を、ヒ
ト インターフェロンアルファＡ（ＩＦＮ−αＡ）の相当する位置にあるこれら
のものに変えることである。１度にヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ アミノ酸の構造
を、個々のアミノ酸のＩＦＮ−τ活性に対する貢献性を評価することを容易にで
きるように、変えること、そして、ヒトＩＦＮ−αＡでのよりも、高められた抗
ウイルス活性及び抗増殖活性を有する変異体インターフェロンタウを作成する部
分置換を評価する比較である。同様の観察が、１以上のアミノ酸部分を一度に置
換し、インターフェロンアルファとの比較を行うことにより、行うことができる
。同様に、同様なサイト向けの変異体が、比較分子と比較される他の変異体の、
構造体及び／或いは生物学的活性と比較せしめることができる。例えば、ｏｖＩ
ＦＮ−τ１ｍｏｄが、インターフェロンベーター或いはインターフェロンオメガ
及び他のアルファインターフェロンの構造的に同様な部分に参照で変異させるこ
とができる。

【００５４】 このような変異体は、広い領域の癌及び自己免疫を含む、免疫疾病の処置に臨
床的に著しく治療用途があるので、それは、本発明のインターフェロンタウ−１
ｍｏｄと構造的に同様である、インターフェロンタウ、インターフェロンアルフ
ァ、インターフェロンベーター及び他のインターフェロンによる、処置に対する
応答の前の研究に示された。それは、細胞毒性のなく、所望の生物学的活性を有
するインターフェロンを使用することが、明らかに好適である。

【００５５】 ６つのＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ変異体が、構築された。置換のために、ヒトイン
ターフェロンアルファ上の相当する溶媒−露出のアミノ酸とは異なる、溶媒ＡＮ
Ｄに露出されるネイテイブヒツジＩＦＮ−タウのＮ端末領域でのこれらのアミノ
酸を選択することが決められた。溶媒に露出された各分子のＮ−端末領域でのこ
れらのアミノ酸は、構造（予想され、或いは結晶化された構造）に基づいて同定
された。６つの変異体が、インターフェロン タウに作成され、ＩＦＮ−タウ及
びＩＦＮ−アルファの間で異なる、溶媒−露出のアミノ酸から１度に選択された
１つのアミノ酸に作成された。変異体は、ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの１つの特
定のアミノ酸を、特定して、ＤＮＡコドンを変えることにより、ヒトＩＦＮαＡ
での相当する位置でのアミノに変換するサイト向け変異誘発因子を用いて、作成
された。当業者に既知のタウ変異体のために適するＤＮＡを作る他の方法が、使
用できた。３つの変異体が、ヘリックスＡ内でのサイト及びＡＢループ内の３つ
のサイトにあり、ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの、溶媒露出のアミノ酸配列が、ヒ
トＩＦＮαＡの相当する位置でのアミノ酸と異なることが証明された。

【００５６】 それらのアミノ酸配列により想定された変異体は、 １３Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．４ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１１． １６Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．５ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１２． １９Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．６ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１３． ２４Ｌ：Ｉ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．７ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１４． ２６Ｐ：Ｌ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．８ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１５． ３１Ｑ：Ｋ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．９ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１６． ３４Ｋ：Ｈ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１０． 核酸配列．ＩＤＮＯ．１７． ５Ｒ：Ｑ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１８． ６Ｋ：Ｔ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１９．及び ２０Ｒ：Ｑ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．２０．

【００５７】 遺伝子コードの重複部にために、上記に示される核酸配列は、各々の変異体の
ための多くの核酸配列の１つのみである。同定されたが、作られていない、他の
ＩＦＮ−タウ変異体は、５Ｒ：Ｒであり、それは、配列ＩＤＮｏ．２のネイテイ
ブＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと、位置６のリシンの代わりにツレオニン基を有するこ
と以外、同じアミノ酸配列を有し、そして、２０Ｒ：Ｑであり、それは、配列Ｉ
ＤＮｏ．２のネイテイブＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと、位置２０のアルギニンの代わ
りにグリシン基を有すること以外、同じアミノ酸配列を有するものである。５，
６及び２０ＩＦＮ−タウ変異体もまた本発明の範囲内のものである。

【００５８】 抗増殖活性及び／或いは抗ウイルス活性に悪影響するヘリックスＡ及びＡＢル
ープ内の特定部分が、各変異されたＩＦＮ−タウをテストすることにより同定さ
れる。抗増殖活性及び／或いは抗ウイルス活性は、以下に説明されるように、６
つの特定の変異体により、等しく悪影響を受けるものではない。抗増殖活性での
変化は、細胞タイプ特定である。従って、本発明は、正常な或いは悪性の細胞の
タイプに特にターゲットする新規な蛋白質を設計することも含む。ターゲットさ
れた正常細胞は、炎症細胞、性細胞或いは過剰に分割する或いは過剰機能の細胞
であるが、それに限定されるものではない。１つの変異体、２６Ｐ：Ｌは、ヒト
ＩＦＮ−αと等価の、抗増殖及び／或いは抗ウイルスの可能性を示したが、ヒツ
ジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの試験管細胞毒性のないことを保持している。検査された
Ｎ−端末変異体は、変えられた細胞毒性プロフィルはなく、これらの変異体が、
非常時に優れた治療的活性を有することを示唆している。

【００５９】 本発明は、上記のＩＦＮ−タウ変異体を含むだけでなく、更に、インターフェ
ロンベーター或いはインターフェロンオメガを含む、インターフェロンアルファ
或いは他のタイプ１インターフェロンの領域での異なるアミノ酸から、選択され
た変異体に置換するものも含む。本発明は、更に、生物学的活性の領域として、
分子の適切な折り曲げ或いは構造的集積性をも、或いはリセプター結合或いは活
性化をも含まれる、分子の結合サイト及び他の領域を含むものである。

【００６０】Ｃ．インターフェロン タウ変異体の組換え生成体 リコンビナント ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ変異体蛋白質は、バクテリア及び
イースト細胞を用いて、作製された。詳細は、実施例に示される。ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ変異誘発因子／発現 ベクターの構築 ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ変異誘発因子／発現ベクターの構築のために、ヒツジ
ＩＦＮ− １ｍｏｄの遺伝子が、Ｔａｑ ポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,C
A)を用いて、増幅され、そして、大腸菌ベクターpCR2.1(Stratagene TAクローン
化キット）にクローン化され、究極的には、大腸菌−イーストシャットルベクタ
ーｐＰＩＣＺアルファ(Invitrogen)のＫｐｎ Ｉサイトにクローン化された［実
施例１］。

【００６１】 組換インターフェロンポリペプチドの発現のために、テチメリック(thechimer
ic)コード化配列は、多数のバクテリア発現ベクター；例えば、ランブダ(lambda
)gt11(Promega,Madison,Wils.);pGEX(Smith,D.B.,et al.,1988);pGEMEX(Promega
);及びbBS(Stratagene,La Jolla,Calif.)ベクターの中で、置換できる。Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ プロモータ或いはｔａｃプロモータのような、適切なプロモ
ータを含有する、他のベクテリア発現ベクターを用いることができる。ヒツジＩ
ＦＮ−タウ．ポリヌクレオチドを、修正されたｐＩＮ ＩＩＩｏｍｐ−Ａ発現ベ
クター中に、クローン化することも可能である。

【００６２】 他のイーストベクターは、本発明の実施に用いることができる。それらは、２
ミクロンのプラスミドベクター、イースト集積プラスミド、ＹＥＰベクター、イ
ーストセントロメルプラスミド、及び当業者に知られる同様なものである。ＡＯ
Ｘプロモータは、ピシアパストリス(Pichia pastoris)ホスト細胞に実際的に有
用である（例えば、ＡＯＸプロモータは、インビトロゲン(Invitrogen, San Dia
go,Calif)から入手されるピシア(Pichia)発現キットに含有された、ｐＨＩＬ及
びｐＰＩＣベクターに使用される。

【００６３】 本発明に使用するに適する付加的なイーストベクターは、調整できる表示を有
する他のベクターを含み、そして、それに限定されない。イースト変換ホストは
、典型的には、サッカロマイセス(Saccharomyces)セレビシエ(cerevisiae)であ
るが、然し乍ら、変換に適する他のイーストは、同様に使用できる（例えば、シ
ゾサカロマイセス(Schizosaccharomyces)プロンベ(pombe)、ピシア(Pichia)パス
トリス(pastoris)等）。

【００６４】 ＩＦＮ−タウ、ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、多数の市販のベクター
中にクローン化でき、適当なホストシステム中のポリペプチドの発現を生成でき
る。これらのシステムは、次のものを含む：バキュロウィルス(baculovirus)発
現；植物細胞発現、トランジェニック植物及び哺乳動物細胞での発現(Clontech,
Palo Alto Calif.;Gibco-BRL,Gaithersburg Md.)。多数の特長が、発現された配
列の分泌を培養媒体中に促進する、リーダー配列のような、発現ベクター中に計
画できる。組換え生成されたぷ；ポリペプチドは、溶解された細胞から典型的に
分離でき、或いは培養媒体精製が、塩区分法、イオン交換クロマトグラフィ及び
親和力クロマトグラフィを含む、当業界で既知の方法により行うことができ、或
いは免疫親和力クロマトグラフィが、ＩＦＮ−タウ ポリペプチドに一般的に基
づいた、抗体を用いて、使用できる。

【００６５】 サイトに向いた突然変異誘発は、必要条件のアミノ酸置換を行うに、必要な変
異を、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄＤＮＡに導入する１つの方法である。他の方
法も、当業者に既知である。６つの変異が、製造者指示書に従って、クイックチ
ェンジ サイト 向き変異化キット(Quickchange Site Directed Mutagenesis k
it(Stratagene)を用いて導入される。簡単に言うと、所望の塩基変化を含有する
プライマが、Ｂｉｏｓｅｒｂｅ(Laurel,MD)或いは集積化ＤＮＡ技術(Coralville
,IA)により合成された。それらを、５０マイクロリットルの反応液中のPfuター
ボ ポリメラーゼ(Stragene)を有し、所望の塩基変化を包含するようにサイクル
される、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄの遺伝子を含有する、５０〜１００ｎｇの
ｐＰＩＺａｌｐｈａに添加した。各反応を各セットのプライマで最適化した。５
マイクロリットルのＰＣＲ反応が、１％アガロースゲル上で行い、生成物を可視
化した。残りの反応を、Ｄｐｎで１時間消化し、精製し、そして、ＸＬ−１ブル
ーウルトラコンピテント細胞(Strategene)に変換するに使用する。変換体（トラ
ンスフォーマント）を、ゼオシン(Invitrogen)の存在下で低い塩ＬＢ上で選択さ
れた。トランスフォーマントからのプラスミドＤＮＡを、フェノール−クロロフ
ォルムで抽出し、エタノールで沈殿化した。正確な変異体を含有することは、ジ
デオキシ配列により、証明された。

【００６６】Ｐ．パストロイス−大腸菌での変異ＩＦＮ−タウ蛋白質の生成 変異体ＩＦＮ−タウ蛋白質は、組換えプラスミドを有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ−大腸菌中で生成された。プラスミドＤＮＡは線状化されそして、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓを変換するに用いられた。所望の遺伝子を含有するイーストコロニイ
が、選択され、成長せしめた。蛋白質が媒体中に分泌され、そして、硫酸アンモ
ニウム沈殿とアニオン交換カラムクロマトグラフィにより精製された。ＩＦＮ−
タウと変異ＩＦＮ−タウ蛋白質の濃度を、ＢＣＡ蛋白質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ
）を用いて、測定した。蛋白質は更に、サイズ区分化（カラムクロマトグラフィ
或いは予備操作ゲル電気泳動法）、或いは親和力クロマトグラフィ（例えば、抗
−ヒツジＩＦＮ−タウ、抗体（Pharmacia,Piscataway.N.J.から入手される、固
体支持体）を含む標準方法により、更に、精製された。蛋白質生成物も、例えば
、(Amicon,Danvets,Mass.)、ＨＰＬＣ、毛細管電気泳動法或いは使用の知られた
他の蛋白質精製法により、濃縮することができる。精製された蛋白質は、ヒツ
ジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ変異体蛋白質免疫ブロットを用いて、分析した。すべて
の免疫ブロットは、１７２アミノ酸蛋白質の生成を示すシングル１９ＫＤバンド
を有した。

【００６７】Ｅ．インターフェロン タウ変異体の毒性 ＩＦＮ−タウ変異体処置された細胞の多種−末梢血液リンパ球により、予備的
に示されたように、Ｕ９３７細胞は、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと比較して、
ヒトＩＦＮ−αＡで処置されたときの、著しく低い成育力を示した。すべてのＩ
ＦＮ−タウ変異体蛋白質は、親系のヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄのものと同様な
細胞毒性が試験管中で低いことを示しており、それは、この領域が、ヒツジＩＦ
Ｎ−タウ１ｍｏｄの低下した細胞毒性には関係ないことを示唆している。すべて
の変異体が、非修正のヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄの同じ低い毒性プロフィルを
ほとんど示すために、そして、点変異化が、分子のすべてのＮ−末端領域にある
ために、その結果が、この領域は、多分、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄの低下し
た細胞毒性中に、関与していなく、むしろ、可能性に悪影響を与えていることを
示唆している。

【００６８】Ｆ．インターフェロン タウ変異体の抗−増殖活性 細胞増殖性を低下させるＩＦＮの能力は、重要なものであり、多くのヒト及び
動物細胞ラインでテストされた、よく資料にされた現象である。Ｎ−端末領域で
のヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄへの種々に変異体は、抗増殖活性についての、細
胞タイプ−特定の効果である。それでもなお、各々の変異体は、親系のＩＦＮ−
τに関する、少なくとも１つの細胞ライン上の、抗増殖活性が等価であることを
維持していた。抗増殖活性は、ＩＦＮのないで成長された細胞数により割った、
ＩＦＮ存在で成長された細胞数のパーセントとして、測定された。本発明に従っ
て、製造された、変異体蛋白質をテストすることは、種々の既知の細胞ラインに
対して、ルーチンスクリーニングのみ、或いは、所定の患者に対して、当業者に
既知の方法を用いて、確立した細胞ラインのみである。

【００６９】 ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの３３単位（０．０６ｎＭ）により、ダウジ細胞の
増殖の５４％低下が生じた。ＩＦＮ−αが、６９％の非常に大きな増殖低下を生
じた。４つの変異体が、ダウジ細胞でテストされた。これらは、１３Ｅ：Ｒ、１
６Ｋ：Ｍ、２６Ｐ：Ｌ及び３４Ｋ：Ｈである。重要なことには、これら４つのす
べてのタウ変異体は、細胞数を低減し、そして同様に、非常に大きな抗増殖活性
を示す２６Ｐ：Ｌ変異体を有する、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄでのものである
。この変異体は、媒体のみの細胞と比較して、細胞数の８１％低下をもたらし、
細胞毒性のないＩＦＮαのものと、同様な活性プロフィルは、２６タウ変異体に
、癌及び腫瘍を処置するための高い治療係数をもたらす。

【００７０】 １６Ｋ：Ｍ及び３４Ｋ：Ｈ変異体も、腫瘍細胞増殖の統計的に著しい低下をも
たらし、それは、ネイテイブＩＦＮ−タウと比べて、抗増殖活性の統計的に著し
い上昇となり、高い治療比率を有する、有用な、抗癌及び抗腫瘍の治療的な薬剤
にすることを示唆している。１６及び３４変異体の両方が、ネイテイブＩＦＮτ
よりも、著しく効果的であった。そして、毒性なしで、ＩＦＮαとほとんど同じ
効果があった。

【００７１】 ２つの付加的な接着細胞ライン、ＨＴ−２９及びＭＣＦ−７が、同じ特性をテ
ストするために用いられた。これらの細胞ラインは、タイプＩ ＩＦＮに鋭敏で
なく、細胞成長を抑制するためには非常に大きな投与量を必要とする。変異体の
すべてだが１つは、対照に比べて、ＨＴ−細胞の数を著しく低下させた。２６Ｐ
；Ｌ変異体は、ワイルドタイプＩＦＮ−τに比べて、細胞毒性の増加なしで、抗
増殖活性を著しく上昇せしめた、これは、この位置が、ＩＦＮ−τの総合的な機
能に貢献していることを示唆している。

【００７２】 対照に比べて、すべての変異体は、ＭＣＦ−７細胞の増殖を抑制するが、然し
乍ら、変異体の活性は、ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄのものと著しく差異があるも
のではない。前記のように、ＩＦＮ−τ２６Ｐ：Ｌ変異体は、非常に大きな抗増
殖活性を有した。

【００７３】Ｇ．インターフェロン タウ変異体とタイプ１リセプターとの結合 タイプＩ ＩＦＮリセプタの結合性−¹²⁵Ｉ−ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの通常
タイプＩ ＩＦＮリセプタへの結合は、ヒトＩＦＮαＡにより、最も効率的に置
換された（図１）。ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ自体は、ＩＦＮαＡでの半分の置
換のみを作った。ＩＦＮ−τ変異体を作るために導入されたＡＭＩＮＯ ＡＣＩ
Ｄアミノ酸の大部分は、変異体蛋白質のラベルのヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄを置
換する能力を低下した：この低下は、２４Ｌ：Ｉ及び３４Ｋ：Ｈ変異体で統計的
に顕著なものであった。それに対して、部分２６でのＰ：Ｌ置換は、ラベルされ
た、ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ結合の競争力を著しく高めるが、ヒトＩＦＮαＡ
と同程度にはしないものである。

【００７４】 種々のＩＦＮの可能性は、リセプタ結合親和力と関連されて、示唆された（２
５）。ＭＤＢＫ細胞上のヒトＩＦＮτに関する、ｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄの低下
された抗増殖可能性及び低下した毒性は、各々、ＩＦＮ−τ及びαについて、Ｋ
ｄ ３．９０×１０^-10及び４．４５×１０^-11の反射係数として見られる。そし
て、親ＩＦＮ−τに関する、ＩＦＮ−τ２６：Ｐ：Ｌ変異体の高められたリセプ
タ結合性は、高められた生物学的活性及び可能性から予想できるものである。

【００７５】Ｈ．インターフェロン タウ変異体の抗−ウイルス特性 ６つのＩＦＮ−ｔ変異体の抗ウイルス活性は、ＭＤＢＫ細胞と小胞口内炎ウィ
ルス（ＶＳＶ；２２）を用いる、標準的毒性効果抑制アッセイを用いて、測定さ
れた。抗ウイルス活性は、参照ＩＦＮ−アルファＧｘａ０１−９０１−５３５に
基づいて、正規化された。抗ウイルス活性の１単位が、ＶＳＶの５０％による毒
性効果を抑制するに必要な蛋白質量として、定義される。すべての変異体は、い
くらかの抗ウイルス活性を有した。ＩＦＮ−ｔ ２６Ｐ：Ｌ変異体の活性が、９
．５×１０⁷Ｕ／ｍｇであり、ヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ及びＩＦＮ−アルフ
ァの両方と同じ程度である。

【００７６】 ４つの他の変異体；１６Ｋ：Ｍ、１９Ｄ：Ａ、２４Ｌ：Ｉ及び３４Ｋ：Ｈの活
性は、非経口的ＩＦＮτ対照に比較して、著しく低下された抗ウイルス活性であ
ることを証明した。最小の活性変異体は、３．２×１０⁴Ｕ／ｍｇを有する１３
Ｅ：Ｒであった。

【００７７】 好適な具体例において、改良された抗ウイルス活性を有するＩＦＮ−ｔ２６Ｐ
：Ｌ変異体が、肝炎Ｂ及びＣ、生殖器疣、サイトメガウィルス感染等を含む、ウ
ィルス感染を処置するに治療的に効果のある量、投与される。

【００７８】 本発明は、第１の蛋白質のアミノ酸置換に限定されなく、それは、抗増殖活性
及び抗ウイルス活性を上げるが、感知できる生物学的受容性を改良し、例えば、
改良されたリセプター結合、低減された毒性、改良された分子安定性或いは改良
された抗体親和性を有する。改良された生物学的活性は、その環境でのリセプタ
ー結合で低下できる。

【００７９】Ｉ．利用性 Ａ．再製性 ＩＦＮ−タウは、構造に基づいた、ＩＦＮ−アルファ族といくらか同様なもの
であり、その潜在的な抗ウイルス特性を有するが、ＩＦＮ−アルファは、ＩＦＮ
−タウに伴う再製性特性を有しない。例えば、組換ヒトＩＦＮ−アルファは、投
与が２回で投与した場合でも、ＩＦＮ−タウと比べて、インテレストロウス(int
erestrous)間隔に効果がない(Davis,et al.,1992)。

【００８０】 従って、ＩＦＮ−タウは、他のインターフェロンと構造的に類似性を持つが、
それは、自身のものの非常に顕著な特性を有し、例えば、発情期サイクルの生物
化学的なものに著しく影響を与える能力を有する。

【００８１】 本発明のＩＦＮ−タウ変異体は、一般的にハンセン等が、１９９１年に書かれ
た、本明細書で参照文献にされるものにあるように、メス哺乳動物の黄体の、受
胎能を高め、そして、その活性寿命期間を伸ばす方法に使用できるものである。
更に、本発明の変異体は、動物の、成長を調整し、その子宮及び／或いは胎児−
胎盤の発達を調整するために用いられた。

【００８２】Ｂ．抗−ウイルス剤 タイプＩインターフェロンは、潜在的に抗ウイルス特性を示す。ネイテイブＩ
ＦＮ−タウの抗ウイルス活性は、ＩＦＮ−アルファに通常伴う毒性効果なしで、
広い範囲の治療的適用を示す。本発明のＩＦＮ−タウ変異体は、ヒト細胞ライン
に対して、悪の毒性効果なしで、抗ウイルス活性を奏することが分かった。この
毒性のないことが、ＩＦＮ−タウとその変異ＩＦＮ−タウ蛋白質を、他のほとん
どの既知の抗ウイルス剤及び他のすべての既知のインターフェロンと異なるもの
にしている。本発明にＩＦＮ−タウ変異体を含む処方物は、従って、肝炎Ｂ及び
Ｃ、エイズ、髄膜炎、ＴＢ、肝炎Ｂ及びＣ、ＨＩＶ、皮膚ウィルス感染症（水痘
、ヘルペス帯状疱疹、麻疹）、呼吸性ウィルス感染症、中枢神経系のウィルス疾
病、肝臓のウィルス疾病、唾液腺のウィルス性疾病、感染性単核細胞症及び性器
疣などを含む、ウイルス性感染症を処置するため、或いは予防するために、使用
できるものである。インターフェロンは、マクロファージ活性を高めるために、
それらは、また、付加的なバクテリア、フンガル及び寄生虫病の処置に有用でも
ある。

【００８３】 ＩＦＮ−タウ変異体は、特に、ヒト乳頭腫感染症、肝炎Ｂ及び肝炎Ｃ感染症に
対して有用であり、その場合、ＩＦＮ−タウと同じリセプターに結合するインタ
ーフェロンアルファは、効果的であることが知られている(Finte等、1991;Kashi
ma,et al,(Laryngoscope 98:334(1988);Dusheiko,et al.J.Hematology 3(suppl.
2):S199(1986):Davis,et al.,N.England J.Med.321:1501(1989)。この明細書に
挙げた雑誌記事はすべて明細書の内容である。

【００８４】Ｃ．抗−細胞増殖特性 タイプＩインターフェロンは、潜在的な抗細胞増殖活性を有する。ここで説明
されるＩＦＮ−τ変異体は、他のインターフェロンに伴う負の副作用なしで、細
胞成長を抑制するために使用できる。本発明の変異体インターフェロン−τ化合
物を有する処方組成物は、腫瘍或いは癌成長を抑制し、予防し或いは遅くするた
めに使用できる。

【００８５】 ある種の腫瘍が発展するのは、エストロゲンにより仲介されるものである。以
前の研究では、ＩＦＮ−タウは、エストロゲンリセプター数を抑止できる。米国
特許第５，９３９，２８６号．従って、ＩＦＮ−タウ変異体−含有の組成物は、
エストロゲン−依存の腫瘍の処置或いは予防にも使用できる。

【００８６】 その低い毒性を持つＩＦＮ−タウ変異体の抗増殖活性特性は、癌、悪性腫瘍及
び、予癌腫瘍の処置に有用にされる。新形成処置に関して、本発明の化合物は、
両のソフト（例えば、血管リンパ球）及びソリッドの腫瘍（例えば、癌及び肉腫
）を含む、種々の予新形成及び新形成状況を処置するために、用いることができ
る。更に特定すると、本発明の化合物は、乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、黒色
腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、腎臓癌、骨癌、直腸癌
、頚癌及び神経外胚葉癌を処置するために用いられ、モノクロナール ガンマポ
チス、形成異常症を含むが、それに限定しなく、頚部及び口部の形成異常症を含
むが、それに限定しない。インターフェロン類は、毛髪細胞白血病の処置に特に
効果的であることが知られる(Quesada,J.R.et al.,N.England J.Med.310:15(198
4)。更に、これらの蛋白質は、多重骨髄腫、慢性リンパ腺白血病、低級リンパ腫
、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、尿膀胱腫瘍及び卵巣癌に対して活性を有するこ
とが示された。

【００８７】 インターフェロン−タウ変異体は、特に、カポシ肉腫、ホジキンリンパ腫及び
悪性黒腫(Mariano,T.M.,Interferons;Principles and Medical Applications,19
92,129〜138(1992)、慢性脳脊髄白血病、皮膚鱗状細胞癌及び喉頭乳頭腫症を処
置するに、特に有用である。

【００８８】 本発明の変異体で処置できる他の癌には、次のものがある：接眼網膜芽腫、眼
内黒色腫、口腔喉頭、鼻腔洞、及び鼻癌、下喉頭、咽頭、唾液腺、不顕性１次中
皮腫（鱗状細胞）、非−小細胞の肺癌、小−細胞肺癌、悪性胸腺腫、悪性中皮腫
、食道癌、胃癌、１次肝臓癌、肝臓内胆汁塵癌、肝臓外胆汁塵癌、及び胆嚢の癌
、膵臓癌、小腸管、胃腸癌、結腸、直腸、肛門管、直腸骨盤の移行細胞、及び尿
管、膀胱、尿道、前立腺、陰茎、精巣、外生殖腺及び生殖腺胚芽細胞腫瘍、卵巣
上皮、卵巣低部悪性潜在性腫瘍、卵巣胚芽細胞、子宮内膜、子宮肉腫、妊娠栄養
膜、頚部、膣、黒色種、皮膚、大人ソフト組織肉腫、エンドロクトリン(Endroct
rine)（甲状腺を含む）、島細胞新形成、アドレナリンコルチカル(Adrencortica
l)、フェクロモシトーマ(Phechromocytoma)、未知の１次源の癌、血液性新生物
（急性骨髄腫、慢性骨髄種を含む）、毛細胞及びホジキン病がある。

【００８９】Ｄ．免疫システム疾病 本発明の方法を用いて処置される病気は、自己免疫病、炎症、増殖及びハイパ
ー増殖病並びに免疫学的に関係する病気の皮膚発現を含むものである。特に、本
発明の方法は、免疫システム過敏症に関する状況を処置するに有利である。免疫
システム過敏症には４つのタイプがある。タイプＩ或いは中間／アナフィラキシ
過敏症は、アレルゲン（例えば、花粉）に反応してのマスト 細胞劣化性による
ものであり、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、ジンマシン（じんま疹）、ア
ナフィラキシショック、及び他のアレルギー性の病気を含む。タイプII、即ち、
自己免疫性過敏症は、身体自体の細胞の、知覚する”抗原”に対して直接反応す
る抗体によるものである。タイプIII過敏症は、種々の組織に現れ、更なる免疫
反応を活性化する、抗原／抗体免疫複合体の形成によるものであり、血清病、ア
レルギー歯槽膿漏炎及びブースターワクチン投与後に形成された大きな膨潤のよ
うな状況に責務がある。タイプIV過敏症は、感応したＴ−細胞からのリムポキン
類の解放によるものであり、炎症反応になるものである。その例は、接触皮膚炎
、麻疹の皮膚疹及びある種の薬剤に対する”アレルギー性”反応がある。

【００９０】 ＩＦＮ−τ変異体で処置できる自己免疫性疾病もそれに限定しないが、多重硬
変症、システム性紅斑性狼瘡及びタイプＩ真性糖尿病のみ、或いは、自己免疫疾
病を処置するに効果的であると知られる他の処置法と組合せて用いられるが、コ
ルチコステロイドを含むが、それに限定されないものである。更に、ＩＦＮ−τ
変異体は、グラフト対ホストの反応を防止するために用いられ、グラフト対ホス
トの反応を防止するに有用である知られる他の製薬学的な製造方法と組合せられ
るが、シクロスポリン及びコルチコステロイドを含むが、それに限定されない。

【００９１】 自己免疫性疾病は、特定の臓器或いは組織に第１義的に限定されたもの及び全
身体に悪影響を与えるものに緩く群分けできる。臓器特定の疾病（悪影響された
臓器で）の例は、多重硬変症（神経過程上のミエリン被覆）、タイプＩ真性糖尿
病（膵臓）、ハシモト氏甲状腺炎（甲状腺）、悪性貧血（胃）、アジソン氏病（
アドレナール腺）、重症筋無力症（神経筋肉接合でのアセチルコリンリセプタ）
、リウマチ性関節炎（接合ライニング）、ブドウ膜炎（眼）、乾癬（皮膚）、グ
イライン−バーレ(Guillain-Barre)シンドローム（神経細胞）及びグラブ(Grave
)病（甲状腺）を含む。全身系の自己免疫性疾病は、全身系狼瘡性エリテマトー
デス及び皮膚筋腫を含む。

【００９２】 過敏症疾病の他の例には、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、他
の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、鼻炎、扁平苔癬、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症
、尿炎症、血管性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、アテロ
ーム性動脈硬化症、１次胆汁性肝硬変及びネフローゼ性シンドロームがある。関
連の疾病には、コエリアック病、直腸炎、好酸球胃腸炎、肥満細胞症、炎症性胃
腸病、クローン(Chrohn’s)病及び潰瘍性大腸炎、及び食物−関連のアレルギー
症のような腸管炎がある。

【００９３】 自己免疫疾病、特に、本発明の方法を用いて処置して特に治療できる疾病には
、多重硬変症、タイプＩ（インシュリン依存性）真性糖尿病、狼瘡性エリテマト
ーサス、筋萎縮性側方硬変症、結合性組織疾病、クローン(Chrohn’s)病、リウ
マチ性関節炎、口内炎、喘息、ブドウ膜炎、アレルギー及び乾癬がある。

【００９４】Ｅ．製薬学的な組成物 本発明のＩＦＮ−タウ変異体は、製薬学的な処方物中、或いは、治療的適用に
おいて、使用する場合、より毒性のあるインターフェロンの毒性を低減するため
に、より毒性のあるインターフェロンと一緒に投与することができる。そのよう
なＩＦＮ−タウ変異体は、例えば、ＩＦＮ−アルファの毒性を低減するが、ＩＦ
Ｎ−アルファ、抗ウイルス特性と干渉することはない。ＩＦＮ−τは、当業者に
知られており、そして、薬学文献に説明されているように、経腸的に（経口的投
与）或いは粘膜的に（眼、鼻、口、バギナ及び肛門）、非経口的に投与され得る
。変異体は、皮膚或いは粘膜の浸透が可能にする薬剤と組合せることができる。

【００９５】 ＩＦＮ−タウ蛋白質は、製薬学的に有用な組成物を製造する既知の方法に従っ
て、処方することができる。インターフェロン或いはインターフェロン様の化合
物を有する処方物は、前記のような（例えば、Martin,1976)ものである。一般的
には、本発明の組成物は、ＩＦＮ−タウの効果的な量が、適切な担体と組合され
て、組成物が効果的に投与されるようにしたものである。

【００９６】 これらの治療に使用される組成物も、種々の形式にできる。これらは、例えば
、固体、半固体、及び液体投与形、例えば、錠剤、ピル、粉末、液溶液或いは懸
濁物、リポゾーム、乳液、マイクロエマルジョン、坐薬、注射液及び融合溶液或
いは既知の、或いは、投与蛋白質のために開発された方法のものを含む。ＩＦＮ
−タウ変異体は、ポリエチレングリコール、或いは他のポリマー或いは薬剤と組
合せて、毒性を低減し、或いは、薬物速度論的或いは薬理学的特性を改良するで
きるものである。好適な形は、投与及び治療の適用の意図するモードに依存して
いる。組成物は、好適には、通常の製薬上許容され、当業者に知られる、担体及
びアジュバント（助剤）も含有する。好適には、本発明の組成物は、単位投与量
の形にあり、通常、患者に１日当り一回以上投与するものである。

【００９７】 ＩＦＮ−タウ変異体は、経口的摂取、吸入、坐下的スプレイ、腹腔内、静脈内
、筋肉内、病巣内或いは皮下注射を含む、製薬上許容される投与形で患者に投与
され得る。特に、他のインターフェロン化合物のために使用される組成物及び方
法は、これらの化合物の分配に使用できるものである。

【００９８】 然し乍ら、本発明の化合物の第１の長所は、ＩＦＮ−タウ変異体の非常に低い
細胞毒性である。この低い細胞毒性のために、一般的に他のインターフェロン（
例えば、ＩＦＮ−アルファ）のために利用されているよりも、大きな濃度で、Ｉ
ＦＮ−タウ変異体を投与することも可能である。従って、ＩＦＮ−タウ変異体は
、約５倍、１０．ｓｕｐ．４から１０倍．１０．ｓｕｐ．６単位／日から５００
倍．１０．ｓｕｐ．６単位／日以上の投与量で、投与され得る。好適な具体例で
は、投与量は、約２０倍１０．ｓｕｐ．６単位／日である。高い投与量は、シス
テマテック投与法に好適である。勿論、本発明の組成物及び方法は、他の治療法
と組合せて使用することができる。更に、疾病の間で効果的な投与量は、変え、
そして、患者間でも変え、そして、最適な投与量と投与スケジュールは、当業者
に既知の方法で決めることができる。

【００９９】 患者の状態が一旦改善されると、必要により、維持投与量が投与される。従っ
て、投与の投与量或いは度数またはその両者を、改善された状態を維持するレベ
ルにまで、症状の関数として、削減することができる。症状が望ましいレベルま
で低下すると、症状が再び生じることない場合、処置を止め得る。然し乍ら、患
者は、病気の症状が再び生じたら、長期間のベースでは、間欠的な処置が必要で
ある。

【０１００】 本発明の組成物が、他のインターフェロンが従来でも活性を有すると証明され
た、種々の癌及びウイルス疾病を処置するための標準的な方法により投与できる
。例えば、Finter,et al.,Drugs 42(5);749(1991);Dianzani,et al.,Interferon
Res.,Special Issue, 5/92;109(1992);Fransis,et al.,AIDS Res.及びHuman Re
troviruses 8(2):199(1992)及びU.S.Pat.Nos.4,885,166及び4,975,276を参照。
然し乍ら、上記で検討したように、本発明の組成物は、毒性なしで、これらの状
態を処置する能力を含んで、独特の特長と長所を有するものである。

【０１０１】Ｆ．皮膚疾病の処置 皮膚の疾病が、ＩＦＮ−タウ変異体を用いて、病巣内で処置することができる
が、処方及び投与量は、投与方法及び処置すべき病巣のサイズと深刻さに依存し
ている。好適な方法は、種々の担体で、内皮的に、及び、皮下的な注射法を含む
ものである。大きい病巣に多重に注射することも可能であり、単一な患者の皮膚
にいくつかの内皮的に、一度に処置することができる。投与のスケジュールは、
当業者により決めることができる。保持された解放のための処方により、投与回
数を減らすことができる。

【０１０２】Ｇ．全身系処置 多重の静脈内、皮下及び／或いは筋肉内の投与は可能であり、処置のための植
え込み法の場合、持続する注入のための処方法が、特に有用である。患者は、植
え込みの皮下門、リザーバー或いはポンプを用いて、処置され得る。

【０１０３】Ｈ．局所的処置 本発明のＩＦＮ−タウ変異体で局所的に処置することは、特定の器官の癌の処
置に有用である。処置は、動脈内注入により行われる。カテーテルは、感染した
器官を直接処置するために、外科的に或いは脈管的に植え込まれることができる
。カテーテルに結合された、皮下門が、慢性処置のために、或いは植え込みのた
めに使用することができ、再充填ポンプを、使用できる。

【０１０４】Ｉ．獣医学的な疾病 次のウイルス疾病：即ち、猫科白血病ウイルス、羊科の進行性肺炎ウイルス、
羊科レンチウイルス、馬科感染性貧血症ウイルス、牛科免疫不全症、ビスナマエ
ジ(visnamaedi)ウイルス及び山羊関節炎脳炎の処置を含むが、それに限定されな
いものに、他のインターフェロンが使用されるので、ＩＦＮ−タウ変異体は、獣
医学的適用にも使用できる。

【０１０５】 本発明の種々の面を更に、詳細に以下説明するが、制限する実施例ではない。

【０１０６】

【実施例１】 材料と製法 バクテリア及びイースト菌 用いられるエシェリシア コリ(大腸菌)は、ＤＨ５α及びＸＬ−１（ストラタ
ジン:Stratagene）及びＩＮＶαＦ（ストラタジン）であった。ピチア パスト
リス(Pichia pichia)株ＳＭＤ１１６８を用いた。ＩＦＮ−τ遺伝子を、株ＧＳ
１１５中のピチア パストリス構成から増幅した。

【０１０７】媒体 バクテリア媒体は、ＬＢ（１０ｇのバクト−トリプトン(Difco)、５ｇの
バクト−イースト抽出物(Difco)及び９５０ｍｌの水中の１０ｇのＮａＣｌ(Sigm
a)を、１５ｇのアガー(Fisher)で皿に補充したもの、或いは、低い塩のＬＢ（１
０ｇに代えて５ｇのＮａＣｌを有する同じＬＢ）であった。抗生物質を、６０μ
ｇ／ｍｌの濃度で、アンピシリン(Sigma)、５０ｇ／ｍｌのカナマイシン(Sigma)
或いは５０μｇ／ｍｌのゼオシン(Invitrogen)で添加した。

【０１０８】イースト媒体 は、ＹＰＤ（１％イースト抽出物、２％ペプトン(Difco)、２％デ
キストローゼ(J.T.Baker)を２％アガーで皿に補充したもの）、ＢＮＧＹ（１％
イースト、２％ペプトン、１００ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ６．０(Fisher)、１．
３４％イースト窒素ベース(Difco)、４×１０^-5％ビオチン(Biotin)(Sigma)、１
％グリセロール(Fisher)を、２％アガーで皿に供給されたもの）．ゼオシン(Zeo
cin)をイースト媒体に、１００μｇ／ｍｌの濃度で添加された。細胞ライン −ＭＤＢＫ細胞は、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を含有
する、最小エッセンス媒体（ＭＥＭ）中で培養された。全てのヒト腫瘍細胞ライ
ンが、ＡＴＣＣ（ロックビル，メリーランド州）から得られる。ＭＣＦ−７細胞
は、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、抗生物質及び１０％ＦＢ
Ｓを含有するイ−グル(Eagle)のＭＥＭ中で成長された。ＨＴ−２９細胞は、０
．１ｍＭの非エッセンシャルアミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｐ
ｇ／ｍｌの牛インシュリン、Ｌ−グルタミン、抗生物質及び１０％ＦＢＳを含有
するイ−グル(Eagle)のＭＥＭ中で成長された。ダウジ(Daudi)細胞は、２０％の
ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０中で成長された。インターフェロン −ｏｖＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ（モード）をコード化する遺伝子
は、メチルプロピックイーストPichia pastoris(Invitrogen,カルフォルニア州
、サンデイアゴ）中に、アルコールオキシダーゼ プロモータ（１９）の制御下
でクローン化された。メタノールで誘導された後に、ｏｖＩＦＮ−タウ１モード
は、分泌された蛋白質として作成された。それは、硫酸アンモニウム沈殿化とそ
の後の、ジエチルアミノエチルセルロース(Sigma,St.Lois,MO)を用いた、アニオ
ン交換クロマトグラフィにより精製された。精製された蛋白質の特定の活性は、
１×１０⁸単位／ｍｇであった。組換えヒトＩＦＮ−アルファＡは、インテルゲ
ンIntergen(Purchase,NY)及びＰＢＬ(New Brunswick,NJ)で調査され、各々、３
×１０⁸単位／ｍｇ及び１×１０⁸単位／ｍｇであった。

【０１０９】羊ＩＦＮ １ｍｏｄ Mutageneisi/Expression ベクター−ovlＦＮ−タウ １モ
ードMutageneisi/Expressionの構成のために、羊ＩＦＮ タウ１ｍｏｄの遺伝子
を、ＰＣＲにより、タクポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて、増幅
し、そして、究極的にＥ．コリ イーストシャトルベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈ
ａ(Invitrogen)のＫｐｎ Ｉサイトにクローン化される前に、Ｅ．コリ ベクタ
ーｐＣＲ２．１（ストラタジンＴＡクローン化キット）にクローン化した。

【０１１０】イーストからＩＦＮ−τの遺伝子を増幅する ＩＦＮ−τ １ｍｏｄ遺伝子は、Pichia pastorisのイースト ゲノムから直
接に増幅された。ゲノムＤＮＡは、コロニイからＰＣＲのために直接に製造され
、バイオテクニク(Ward,1996)中のプロトコールに従う。

【０１１１】 遺伝子の適用は、ＰＣＲにより達成できる。イースト中の原遺伝子は、二重再
結合発生(Ott,1991)の間の損失のために、制限サイトはないので、新規な制限サ
イトが、プライマに添加された。

【０１１２】ｐＰＩＣＺαの使用 他のベクターも用いられ、インビストロゲン(Invistrogen)からｐＰＩＣＺα
ベクターになる。異なるプライマが必要である。プライマは、 Primer 1(Ｋｐｎｌ（ＧＧＴＡＣＣ）を有するコード化ストランドの５’−末端
と同じで、そしてＳｎａＢ（ＴＡＣＧＴＡ）サイトを添加し、下線で示されるよ
うになる）を有するコード化ストランドの５’−末端と同じであり、そして、下
線により示された（ＴＡＣＧＴＡ）サイトに添加した。 5’-TAGGTACCACTACGGTAGGTGCTACCTGTCG-3’

【０１１３】 Primer 2(重複Ｋｐｎｌ（ＧＧＴＡＣＣ）を有する非コード化ストランドの３
’−末端に同じであり、そして、（ＣＣＧＣＧＧ）サイトを添加し、以下の下線
により示される。 5’-TAGGTACCACTACGGTTACGGAGAATTCAGG-3’

【０１１４】 ゲノムＤＮＡは、高い忠実性のポリメラーゼ：ＰＦＵ（ストラタジン）による
ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用できる。イースト遺伝子から取り出
した変異体タウ遺伝子を取り、ベクター中に入れることを行う他の方法は、ゲノ
ムＤＮＡを取り出し、ＰＣＲで増幅し、そして、増幅した遺伝子を、ＰＣＲ２．
１大腸菌ベクター中に入れ、そして、ＰＣＲ２．１からｐＰＩＣＺアルファベク
ターに入れることによる。ＰＣＲ２．１は、プライマの異なるセットを用いる。

【０１１５】 ＰＣＲ生成物は、アガローゼ ゲル 電気泳動法上で可視化され、GENECLEAN(
登録商標）を用いて精製された。次に、ＰＣＲ生成物を、ベクターｐＰＩＣＺα
の場合と同様に、Ｋｐｎｌ(Promega)により消化せしめる。二重消化ベクターは
、アガロースゲル電気泳動上で可視化され、カットオフされ、そして、ゲノクリ
ン(GENECLEAN(登録商標))を用いて、精製され、アルカリホスファターゼ（上記
）を用いて、脱燐酸化された。インサート及びベクターは、ラピッドＤＮＡリゲ
イションキットから方向として、溶離された。リゲイション混合物の半分は、１
３０μｌのＸＬ−１ブルーウルトラコンピテント大腸菌中に転換された。トラン
スフォーマントが、ゼオシン（インビトロゲン）を有する低塩ＬＢ皿上で選択さ
れた。クローンが、サイズで同定され、そして、Hind III(Promega)による消化
により同定され、方向性がチェックされた。pPICZα中の構成分は、挿入された
遺伝子の５’−末端で、ＤＮＡコード化の７つの過剰アミノ酸を含有していた。
これらのアミノ酸は、第１に、３７℃で一昼夜でPml I(New England Biolabs)に
よる消化により抹消された。Pml I消化体を次にアガロースゲル上で可視化され
、 切削され、そして、ゲノクリン(GENECLEAN(登録商標))を用いて、精製された
。 精製されたＤＮＡ試料は、次に、SnaBlにより消化された。ブラントな末端は
、 共に溶離され、ラピッドＤＮＡリゲイションキットを用いて、供給されたプ
ロトコル当りに、プラスミドにリサイクルされた。半分のリゲイション混合物（
１０μｌ）を、７５μｌのＸＬ−ブルーウルトラコンピテント中に、製造者方向
当りとして転換された。トランフォーマントは、Pml Iによる消化の抵抗により
スク リーンされた。欠損は、コード化しないストランドの塩基３１２〜３３５
と同じインタナルＩＦＮ−τプライマを用いて、ヂデオキシ鎖ターミネイター配
列により保証された。

【０１１６】 変異体が配列により保証されると、プラスミドＤＮＡは、Pichia pastorisに
転換された。続く転換体が、４つの変異体：１３Ｅ→Ｒが４つのトランスフォマ
ントになり、１６Ｋ→Ｍが５つのトランスフォマントになり、２６Ｐ→Ｌが３つ
のトランスフォマントになり、そして、３４Ｋ→Ｈが９つのトランスフォマント
になる。

【０１１７】サイト方向突然変異誘発 −６つの核酸変異体が、クイックチェンジサイト向け突然変異誘発キット(Strat
agen)をもちいて、製造者指示書に従って、羊ＩＦＮ−タウmodＤＮＡに導入され
た。概略すると、所望のベース変化を含むプライマが、バイオサーブ(Bioserve)
(Laurel,MD)或いはインテグレイトＤＮＡテクノロジ(Integrated DNA Technolog
ies(Coralville,IA)により合成された。これらは、５０μｌの反応液中に、ovlI
FN-τImodの遺伝子を、Pfuタ−ボポリメラーゼ(Stragene)とともに含有するｐＰ
ＩＣＺα ５０〜１００ｎｇに添加され、そして、所望のベース変化物を含有
せしめるようにサイクルされた。各反応物は、各々のプライマセットに対して最
適にされた。５μｌのＰＣＲ反応を、１％アガロースゲル上で行わしめ、生成物
を可視化せしめる。残りの反応物を、Ｄｐｎで、１時間消化せしめ、精製し、そ
して、使用され、ＸＬ−１ブルーウルトラコンピテント細胞(Stratagene)に変換
せしめる。変換子は、ゼオシン(zeocin)(Invitrogen)の存在下で、低塩ＬＢ上で
選択された。変換子からのプラスミドＤＮＡは、フェノール−クロロフォルムで
抽出され、エタノールで沈殿化された。収集した変異体の含有物は、ジデオキシ
配列により証明された。

【０１１８】 詳細：使用されたプライマは次のようである。

【表１】 変異位置は下線で示される。

【０１１９】 ＰＣＲ反応は、各対のプライマに対して最適化された。例えば、各対のプライ
マに対する最適な反応条件は、以下に概略される。

【０１２０】

【表２】

【０１２１】 これらの反応は、全部で２５サイクル繰り返された。ストランド解離温度は、
サイクルの後に、９４℃３０秒間であった。各反応は４℃に保持された。 ＰＣＲ反応の一部（５μＬ）が、アガロースゲル電気泳動法により分析された
。そして、生成物が可視化されたときに、１２単位のＤｐｎｌで、最低２時間、
消化せしめた。消化物を、GENECLEAN(登録商標）を用いて精製し、そして、６μ
ｌのＴＥ中に再懸濁させた。その全てを、ＸＬ−１ブルーウルトラコンピテント
細胞（７５μｌ）中に変換した。 変換子は、ゼオシン含有の低塩ＬＢ皿上で選択された。プラスミドＤＮＡを、
ミニプレプ スケールで製造され、そして、配列のためにフェノール−クロロフ
ォルム精製された(Maniatis)。配列プライマは、アルファ因子プライマ(Invitro
gen)であって、ｐＰＩＣＺα中のＩＦＮ−τ遺伝子の直接の上流にある配列の非
コード化のストランドの一部を補完するものである。配列プライマは、次の核酸
配列を有する。 配列プライマは、次の核酸配列を有する。 5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’

【０１２２】 変異体ＩＮＦ−τ蛋白質の生成−再結合プラスミドを有する、Ｐ.パストリス(
pastoris)-大腸菌は、低塩のＬＢ中で、ゼロシンとプラスミドＤＮＡ抽出分によ
り一昼夜培養された。プラスミドＤＮＡは、一昼夜ＳａｃＩによる消化により線
状化されえ、精製され、そして、５〜１０μｌの水に再懸濁された。このＤＮＡ
を使用し、Ｐ．パストリスを、電極化或いはピキア イージイコンポ(Pichia Ea
syComp)キットにより化学的に、のいずれかにより、転換させた。１００μｌの
イースト菌転換混合物を、ゼオシン含有のＹＰＤ（１％イースト抽出物、２％ペ
プトン、２％デキストロース）上に置く、そして、３０℃で３日間培養し、所望
の遺伝子を含有するイーストを選択することができる。個々のコロニイを選択し
、２５ｍｌのＢＭＧＹ媒体（１％イースト抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭの
燐酸カリウム、ｐＨ６．０、１．３４％イースト窒素ベース、４×１０^-5ビオシ
ン、１％グリセロール）中で成長せしめる。変異体蛋白質の生成のために、培養
物を、３０℃で、２〜６のＯＤ₆₀₀に光の存在下で強く撹拌した。それらは、２
５００×ｇの遠心力で５分間で収穫し、そのペレットを、ＢＭＭＹ媒体（１％イ
ースト抽分、２％ペプトン、１００ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ６．０，１．３４％
イースト窒素塩基、４×１０^-5％ビオシン、１％メタノール）中に再懸濁させ、
そして、再び、３０℃で、１〜２日間強く撹拌し、蛋白質の発現を誘導する。蛋
白質は、媒体中に分泌させ、次に、硫酸アンモニウム沈殿物により精製し、そし
て、アニオン交換カラムクロマトグラフィにより精製する。ＩＦＮ−τ及び、変
異体ＩＦＮ−τ蛋白質の濃度を、ＢＣＡ蛋白質アッセイ(Piece)により測定した
。

【０１２３】 プロトコールは、６０℃で３０分間の培養時間を用いて、低い蛋白質濃度に対し
て最適化された。

【０１２４】 詳細：イースト菌への変換 変異が一旦配列により証明されると、プラスミドＤＮＡが、Matrix(Bio101)、
各試料について、３つのミニプレプ、を用いて、ミニプレプスケールで作成され
た。プラスミドは、Sacl(Stratagen)を用いて線状化された。酵素６０単位以上
が、２７０μｌ中の、約５μｇのＤＮＡを切断するために必要であった。この反
応は一昼夜放置され行われた。約１０μｌの反応物を次に、アガロースゲル電気
泳動法により、分析し、消化が行われたことを確認した。反応物の残りは、GENE
CLEAN(登録商標）により精製され、１０μｌの容量減少になる。１０μｌのすべ
てを、電解成分Pichia pastorisに添加した。イーストは、インビトロゲンから
の修正プロトコルにより適応性であり、特に、ＯＤ₆₀₀は、１．３〜１．５に代
えて、２〜３に到達し、そして、細胞は、抗生的な選択性がなく、ソルビトール
及びゼオシン(Pichia expression kit,Invitron)を有するＹＰＤ皿上に拡散され
る前６時間で回収された。電極化は、大腸菌パルサ(Biora)を用いて、行れた。
氷−冷却された（１ｍｌ、１Ｍ）のソルビトールが、細胞に添加され、それらは
、皿に置かれる前に回収された。

【０１２５】変異ＩＦＮ生成のスクリーニング 各々の変換体トランスフォーマントの個々の培養液は、ＢＭＧＹ媒体（２５ｍ
ｌ）中で成長された。光の存在下で３０℃で強く撹拌しながら、２日間成長せし
めた後に、培養物を、２５００×ｇの遠心力で５分間遠心分離にかけた。ペレッ
トをＢＭＭＹ媒体（２５ｍｌ）中に再懸濁せしめ、ＩＦＮ生成させた。ＩＦＮ−
τは、イースト株Pichia pastorisにより分泌された。１〜３日後に、媒体試料
を、１５％非−変性のポリアクリルアミドゲル上で分析し、１９ｋＤ蛋白質の存
在を捜した。そのような蛋白質が存在した場合、化学的螢光ウエスタンブロット
が成された(Amersham)。ブロットは、プライマリ抗体として、ウサギ抗−ＩＦＮ
抗体(HL-98)を用いて可視化された、そして、アルカリフォスフォターゼにマウ
ス抗−ウサギ結合された。検知は、５０ｎｇの蛋白質に感度がある。変異ＩＦＮ
が存在することが見いだされたとき、培養体を、１０，０００×ｇで、５分間遠
心分離にかけ、上澄み液を除去した。

【０１２６】変異ＩＦＮの精製 変異ＩＦＮを含有する媒体を次に４℃で一昼夜、飽和硫酸液(Harlowe,1988)の
等量中で撹拌し、蛋白質を沈殿させた。次に、硫酸アンモニウム−ＩＦＮ混合物
を、２５００×ｇで、３０分間遠心分離にかけた。ペレットを、１０ｍＭのトリ
スｐＨ７．５中に再懸濁させた。次に、蛋白質を、ＤＥＡＥ（Whatman)イオン交
換カラムに入れた。勾配を、１０ｍＭトリスｐＨ７．５から塩なしで、６００ｍ
ｌ中の５００ｍＭＮａＣｌにまで作成した。塩濃度が上がるにつれ、蛋白質が溶
離され、そして、溶離液が、３ｍｌのアリコットに回収された。各アリコットを
次に、２８０ｎｍ波長で吸収があるスペクトロフォトメトリイによりテストした
。高い吸収率を持つ部分をプールし、濃縮した。濃縮された蛋白質溶液を次に、
１５％非−変性のポリアクリルアミドゲル上で可視化し、ゲージ精度にまでにし
た。それを純粋物と見ると、蛋白質を滅菌濾過し、−８０℃で２００ｍｌのアリ
コット中で凍結させた。１つのアリコットを、−２０℃に、アッセイのために保
管した。

【０１２７】 蛋白質は、標準的な方法（サイズフラクション（カラムクロマトグラフィ或い
はプレオペラチブ ゲル 電気泳動法）或いは親和性クロマトグラフィ（例えば
、抗−ヒツジＩＦＮ−タウ、抗体（Pharmacia,Piscatawa,N.J.から入手できる固
体サポート）を用いて）を含む）により精製することができる。蛋白質生成物は
、例えば、濾過(Amicon,Danvers,Mass)により濃縮することができる。ＩＦＮ−
タウの量は、当業界に知られる標準的なアッセイ（当業者に知られる、放射線免
疫アッセイ及びエリザ及びバイオアッセイを含む）を用いて、定性することがで
きる。

【０１２８】蛋白質アッセイ ＩＦＮ濃度は、ＢＣＡ蛋白質アッセイ(Pierce)により測定された。吸収率は、
５６０ｎＭで測定し、２０μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍｌの範囲にあるウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）標準物と比較した。プロトコルは、６℃で３０分間培養を
用いて、低い蛋白質濃度で最適化された。

【０１２９】ＩＦＮ−τ変異体の構造的な決定−サ−キュラジクロイズム(CD) が、室温でＪＡ
ＳＣＯ５００Ｃスペクトロポーラリメーターで、測定された。スキャンは、０．
１mm経路長細胞で、２の感度で、８秒の時間定数で為された。測定された波長領
域は、０．１６〜０．５ｍｇ／分のスキャン速度で、２５０ｎｍから１８４〜１
８８ｎｍであった。スキャンは、水中のＩＦＮ−τ変異体について、０．１６〜
０．５ｍｇ／ｍｌで行った。ＣＤスペクトラは、楕円性θに関して、各ＩＦＮ−
τ変異体について、平均残渣分子量に関して表示された。次の式は、θ（ヤング
）：平均残渣楕円性［θ］＝１００×［θ］（観察）／ｃ×Ｉを計算するために
用いられる。但し、［θ］（観察）は、度で表示され、ｃは、モル／リットルで
の平均残渣濃度であり、Ｉは、ｃｍでの細胞の経路長である。

【０１３０】 羊ＩＦＮ−τ１ｍｏｄ 変異蛋白質イムノブロット−精製された蛋白質は、１
５％ポリアクリルアミドゲル上で操作され、ハイボンド隔膜(Amersham,Piscataw
ay,NJ)に変換された。隔膜は、１：５００のモノクロナール抗体ＨＬ−９８（ｏ
ｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄのＣ−端末領域のペプチドに対する作成された）希釈液で
培養された。抗体により、ナイテイブ及び変性されたｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄの
両方を認識することは、立体的決定因子（２０）に依存していない。２次的抗体
は、パーオキシダーゼ−結合羊抗−マウス抗体であった。蛋白質は、ＥＣＬを用
いて、製造者指示書(Amersham)に従って、検知された。１９ＫＤでの単一バンド
は、各レーンで可視化された。１つの変異体ＩＦＮ−タウ蛋白質が、各レーンで
行われた。従って、この結果が、タウ変異体の分子量が、ネイテイブ牛ＩＦＮ−
タウと正確に同じであることを確認する。

【０１３１】 ヒツジＩＦＮ−τの、ＭＤＢＫ細胞−ＯｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄ上のリセプター への競合的な結合性 が、ボルトン−ハンタ試薬（モノ[¹²⁵Ｉ]ヨード誘導体，２
，０００Ｃｉ／ミリモル、Amersham;1Ci=37GBq)説明の通りであ（８））により
、ラベルされた。ラベルされたｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄは、ＭＤＢＫ細胞に対し
て完全抗ウイルス活性を保持していた。結合のために、３ｎＭの¹²⁵Ｉ−ｏｖＩ
ＦＮ−τ１ｍｏｄは、５００マイクロリットルのＭＥＭ１０％ＦＢＮ−タウ中の
、３００ｎＭラベルされていないｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄ、ＩＦＮ−アルファ或
いはＩＦＮ−タウ変異体の不在或いは存在の下に、４℃で１２〜１４時間培養さ
れた（２１）。細胞は、ＰＢＳ（２．５ｍｌ）中の１０％（ｗ／ｖ）サックロー
ス上に層状化され、１２，０００×ｇで、３０分間４℃で遠心分離にかけ、そし
て、ペレットを計数した。特定の結合性は、ラベルされていないＩＦＮ−アルフ
ァＡの１００倍モルの過剰量の存在下で、全結合マイナス非特定結合性として規
定された。

【０１３２】 抗ウイルスアッセイ抗ウイルス活性は、ＭＤＢＫ細胞と小胞口内炎ウイルス（
ＶＳＶ；２２）を用いて、標準的な細胞障害効果を用いて測定される。抗ウイル
ス活性は、参照ＩＦＮ−アルファＧｘａ０１−９０１−５３５に基づいて、標準
化される。

【０１３３】 詳細： Madin Darby Bovine Kidney(MDBK)細胞(ATCC).MDBK細胞を、６×１０⁵細胞／
ｍｌの濃度で、ポリスチレン被覆９６−ウエル皿の上に広げ、３７℃で５％ＣＯ ₂ ／９５％空気の中で一昼夜成長させた。次に、細胞は、４０×倍下で可視化さ
れ、融合性を確認された。媒体を除去し、２％ＦＢＳで補充されたＭＥＭで置換
され、ＩＦＮの順次の希釈液で置換された。各ＩＦＮは２重にアッセイされた。
最も低い希釈度は１：１０であった。皿の残りは、１：３希釈からなる。１つの
カラムは、対照として媒体のみを受ける。各ＩＦＮの第１のアッセイは、上記の
ように為された。ＩＦＮが高い活性か或いは高い蛋白質濃度を有する場合、最初
の希釈液で１：１００に希釈された。次の希釈度は常に１：３であった。細胞を
、ＩＦＮで、２４時間３７℃で、５％ＣＯ₂／９５％空気で培養された。

【０１３４】 次に、細胞は、１：５００の、２％ＦＢＳで補充された、ＭＥＭ中の小胞口内
炎ウイルス（ＶＳＶ）希釈液で攻撃された。４つの対照ウエルは媒体のみを受け
た、そして、４つの対照ウエルは媒体＋ウイルスを受けた。各々ＩＦＮ処置され
たウエルは媒体＋ウイルスを受けた。細胞は、ウイルスとともに、更に２４時間
、３７℃で、５％ＣＯ₂／９５％空気で培養された。次に、細胞は、クリスタル
バイオレッド（１００μｌ；３０％メタノール中の０．５％；Sigma)で５分間、
染色され、そして、蒸留水で洗浄された。１つの抗ウイルス単位は、モノレイヤ
ーの５０％破壊が観察された濃度として定義された。

【０１３５】抗−増殖活性 抗−増殖活性は、次に、２つの接着細胞ライン、ＭＣＦ−７（ブリ−スト ア
デノカルシノマ）及びＨＴ−２９（コロン アデノカルシノマ）、及び、１つの
懸濁細胞ラインDaudi(Bukitt lymphoma)上で測定された。接着細胞ラインに対し
て、１０００細胞／ｍｌが、２４ウエルのポリスチレン皿中にプレイトされた。
１０，０００単位のヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄを添加し、或いは、等量モル濃
度（１７ｎＭ）のアルファＡ（３２，０００Ｕ／ｍｌ−１０，０００Ｕ／ｍｌを
、用いて、３つの繰り返し実験のセットで、効果に差異はなかった）或いはＩＦ
Ｎ−タウ変異体を用いた。細胞を、３７℃で５％ＣＯ₂で９日間培養された。細
胞は、０．２５％トリプシンでデタッチされ、ヘモシトメーターで計数された。
変化は、トリパンブルー染色により測定された。Daudi細胞に対して、１０００
細胞／ｍｌを、３３単位のＩＦＮ−タウで培養し、或いは、５ｍｌのポリプロピ
レン管中の、等量濃度（０．０６ｎＭ）のＩＦＮアルファ或いはＩＦＮ−タウ変
異体とともに培養された。細胞は、３７℃でＣＯ₂中で３〜４日間培養され、５
分間、３００×ｇで遠心分離され、そして、ペレットが、燐酸緩衝生理的塩液中
の１％トリパンブルー中に再懸濁されて、計数された。

【０１３６】細胞毒性アッセイ −８０，０００Ｕ／ｍｌのヒツジＩＦＮ−タウ１ｍｏｄ、ＩＦ
Ｎ−アルファＡ、或いはＩＦＮ−タウ変異体が、トリプリケイト（３つに別れた
）の、ポリプロピレン管中の２×１０⁵Ｕ９３７細胞に添加された。対照細胞は
、媒体のみで処置された。細胞は、トリパンブルーの添加の後に、ヘモシトメー
ターで計数された。

【０１３７】統計学的な分析 −実験平均値の間の統計学的に顕著な差異（ｐ＜０．０５）は、
変数の分析により決められ、最小顕著差異によって決められる。

【０１３８】

【実施例ＩＩ】 −６つのインターフェロン タウ １ｍｏｄ変異体の同定 ＩＦＮ−タウ１ｍｏｄの６０００異体を構築した。置換のために、ヒトインタ
ーフェロンアルファ上の相当する溶媒−露出のアミノ酸とは違う溶媒ＡＮＤに露
出された、ネイテイブ ヒツジＩＦＮ−タウのＮ端領域中のこれらのアミノ酸を
選択することが決められた。溶媒に露出した各分子のＮ−端領域のこれらのアミ
ノ酸が、ＩＦＮ−タウの結晶学的な構造に基づいて決定された。結晶構造が未知
の場合、溶媒−露出のアミノ酸は、分子データから蛋白質について予想できた。
溶媒に露出されたアミノ酸が、比較された、そして、インターフェロン タウと
アルファの間で異なるこの群でのアミノ酸が同定された。６つの変異体が、イン
ターフェロンタウ中に、作られた、そして、ＩＦＮ−タウとＩＦＮ−アルファと
の間で異なる溶媒−露出のアミノ酸から一時、選択された、１つのアミノ酸中に
、作成された。変異体が、サイト直接の変異形成を用いて、作られ、特定して、
ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ中の１つ特定のアミノ酸を、ＤＮＡコドンを変えるこ
とにより、ヒトＩＦＮ−アルファＡの相当する位置でのアミノ酸に変換した。当
業者に既知のタウ変異体のために適切なＤＮＡを作る１つの方法が用いられる。
３つの変異体が、ヘリックスＡ内のサイトにあり、３つが、ＡＢループ内にあり
、ヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの溶媒−露出のアミノ酸配列が、ヒトＩＦＮ−アル
ファＡ内の相当位置のアミノ酸とは異なるように示された。

【０１３９】 ＩＦＮ−τの６つの溶媒−露出のアミノ酸が、ＩＦＮ−αに見られる相当する
異なるアミノ酸で置換された。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−τとの間で異なり、そして
、溶媒に露出される、９つのアミノ酸は、太字及び下線により、以下示される。
３４番は溶媒に露出されなかったが、これは、当業者には、生物学的活性に顕著
であると認められ、従って、以下に示される３４Ｋ：Ｈ置換体が作成された。６
つのこれらの異なるアミノ酸は、変異のターゲットにされた。

【０１４０】

【０１４１】 −τと−αの間の差異は太字で示す。溶媒−露出のものは下線で示す。 ６つの変異体は、次の通りである。

【０１４２】

【表３】

【０１４３】 アミノ酸配列により同定された変異体及び可能性のある核酸配列は： アミノ酸配列により同定された変異体は： １３Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．４ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１１． １６Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．５ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１２． １９Ｅ：Ｒ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．６ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１３． ２４Ｌ：Ｉ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．７ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１４． ２６Ｐ：Ｌ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．８ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１５． ３１Ｑ：Ｋ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．９ 核酸配列．ＩＤＮＯ．１６． ３４Ｋ：Ｈ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１０． 核酸配列．ＩＤＮＯ．１７． ５Ｒ：Ｑ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１８． ６Ｋ：Ｔ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．１９．及び ２０Ｒ：Ｑ変異体 アミノ酸配列．ＩＤＮＯ．２０．

【０１４４】 遺伝子コードの重複部にために、上記に示される核酸配列は、各々の変異体の
ための多くの核酸配列の１つのみである。同定されたが、作られていない、他の
ＩＦＮ−タウ変異体は、５Ｒ：Ｒであり、それは、配列ＩＤＮｏ．２のネイテイ
ブＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと、位置６のリシンの代わりにツレオニン基を有するこ
と以外、同じアミノ酸配列を有し、そして、２０Ｒ：Ｑであり、それは、配列Ｉ
ＤＮｏ．２のネイテイブＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと、位置２０のアルギニンの代わ
りにグリシン基を有すること以外、同じアミノ酸配列を有するものである。５，
６及び２０ＩＦＮ−タウ変異体もまた本発明の範囲内のものである。

【０１４５】 各変異体を含有する再結合体ＩＦＮ−τは、上記説明のように、発現され、そ
して、精製された。すべてのＩＦＮ−タウ蛋白質は、免疫ブロットで、ＩＦＮ−
タウ１ｍｏｄに対しての抗−Ｃ末端モノクロナール抗体により、認識された。１
３Ｅ：Ｒ変異体のみが、サ−キュラ−ジクロイスム（データなし）により評価さ
れたように、アルファ−ヘリカル含有率を減少させた。

【０１４６】

【実施例ＩＩＩ】 変異インターフェロンタウ蛋白質のタイプＩ ＩＦＮへの結合 ¹²⁵ I-oviIFN-τ1modの共通タイプI ＩＦＮリセプターへのリセプター−結合 変異体インターフェロンタウ蛋白質を、タイプＩのＩＦＮリセプターとの結合
すること−¹²⁵Ｉ−ｏｖｎＩＦＮ−τ１ｍｏｄを、共通タイプのＩＦＮリセプタ
ーとの結合することは、ヒトＩＦＮ−アルファＡ（図１）により、最も効率的に
置き替わった。ＯｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄ自体は、ＩＦＮτで見られる置換の半分
だけであった。導入されたアミノ酸置換物の多くは、ラベルされたｏｖＩＦＮ−
τ１ｍｏｄをリセパターから外す、変異体蛋白質の能力を低下したが、然し乍ら
、この低下は、２４Ｌ：Ｉ及び３４Ｋ：Ｈ変異体で著しかった。然し乍ら、番号
２６のＰ：Ｌ置換物は、ラベルされたｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄの結合性の競合性
を増加し、また、ＩＦＮ−アルファＡが為したと同じ程度にはならない。

【０１４７】 種々のＩＦＮの可能性は、リセプター親和性（２５）に関連するものと示唆さ
れていた。低下した抗−増殖性及び、ＭＤＢＫ細胞についての、ヒトＩＦＮ−τ
に関するｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄの低下した毒性が、各々、ＩＦＮ−τ及びαに
ついて、Ｋｄ，３．９０×１０^-10及び４．４５×１０^-10の反射率として、見ら
れた（８）。従って、ＩＦＮ−τ２６Ｐ：Ｌ変異体と非経口的なＩＦＮ−τに関
する高められたリセプター結合性が、高められた生物学的活性或いは可能性から
予想できるものである。

【０１４８】

【実施例ＩＶ】 インターフェロン タウ変異体の抗−増殖活性 細胞増殖性を低下するＩＦＮの能力は、よく報告されてきた現象である。以下
に示される結果は、Ｎ−末端置換物が、抗増殖活性への細胞タイプ特定の効果を
有するが、各々の変異体は、少なくとも１つの細胞に対する、非経口的なＩＦＮ
−τについての抗増殖活性を等量で維持していたことを証明している。抗増殖活
性は、２つの接着細胞ライン、ＭＣＦ−７（ブリースト アデノカルシノマ）及
びＨＴ−２９（コロン アデノカルシノマ）、及び１つの懸濁細胞ライン、ダウ
ジ(Burkitt lymphoma)について測定された。抗増殖活性は、ＩＦＮの存在下で成
長された細胞の数を、ＩＦＮの不存在下で成長された細胞の数で割ったパーセン
トとして測定される。

【０１４９】ダウヂ(Daudi)細胞(Burkitt lymphoma) ＩＦＮ−τで処置されたときの著しく、細胞抑制を起こしたと等価の濃度での
、ダウヂ(Daudi)細胞への種々のＩＦＮ−τ変異体の抗増殖活性を評価した。３
３単位のｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄ（０．６ｍＭ）は、ダウヂ(Daudi)細胞増殖を
、５４％低下させた（表４）。同じ濃度のヒトＩＦＮ−アルファＡは、６９％の
増殖性の、より大きな低下を起こした。テストされたすべての変異体が、細胞数
を低下させ、更に、ｏｖＩＦＮ−τ１ｍｏｄよりも良好である。２６Ｐ：Ｌ変異
体は、ダウヂ(Daudi)細胞に対して、より大きな抗増殖活性を示した。この変異
体は、細胞数において、媒体のみの細胞と比較して、８１％低下を起こし、活性
プロフィルは、ヒトＩＦＮ−アルファＡよりも良好であった。従って、２６Ｐ：
Ｌ変異体は、抗ウイルス活性が高いレベルと、ダウヂ(Daudi)細胞の増殖性を抑
制するに高い活性を有するものである。

【０１５０】 １６Ｋ：Ｍ及び３４Ｋ：Ｍ変異体も、癌処置において、抗増殖剤として、治療
的に、顕著である。その理由は、その両者ともに、毒性がなくて、ＩＦＮαとほ
とんど同じ効果性であり、両者ともに、インターフェロン−タウより効果が高い
からである。これは、上記の、２６、１６及び３４の変異体すべてが、癌及び腫
瘍の処置するときに、ヒトＩＦＮ−アルファＡ及びネイテイブ ヒツジＩＦＮ−
タウよりも、著しく良好な治療性を有することを意味している。

【０１５１】MCF-7（ブレスト アデノカルシノマ）及びＨＴ−２９（コロン アデノカルシ ノマ） ＨＴ−２９とＭＣＦ−７も、インターフェロン−タウ変異体の抗−増殖活性を
テストするために用いた。これらの細胞ラインは、ダウヂ(Daudi)細胞ほど、タ
イプＩ ＩＦＮに鋭敏でなく、従って、細胞成長を抑制するには、非常に多くの
投与量を必要とする。１０，０００単位（１７ｎＭ）のｏｖＩＦＮ−タウ１ｍｏ
ｄをＨＴ−２９細胞に添加すると、対照と比較すると、細胞数の４４％低下を起
こした（１．６１×１０⁶c/ml対２．８５×１０⁶c/ml）。１０，０００単位（１
７ｎＭ）のｏｖＩＦＮ−タウ１ｍｏｄをＭＣＦ−７細胞に添加すると、対照と比
較すると、細胞数の５４％低下を起こした。

【０１５２】 ６つのＩＦＮ−タウ変異体のうちの５つが、ＨＴ−２９とＭＣＦ−７の両方の
細胞の細胞数を、１７Ｎｍのときと比較して、著しく低下した。ＨＴ−２９細胞
については、２４Ｌ：Ｉ変異体のみが、この変異体が保存性であるにもかかわら
ず、抗増殖活性の上昇を示さなかった。２６Ｐ：Ｌ変異体は、抗増殖活性の著し
い上昇（細胞成長は対照に比較して６３％低下）を示したが、一方、ワイドタイ
プのＩＦＮ−τは、より低い抗増殖活性（細胞成長は対照に比較して４４％低下
）であった。

【０１５３】 すべての変異体は、１７ｎＭに使用した場合、対照と比較して、ＭＣＦ−７細
胞の増殖を抑制したが、然し乍ら、変異体の抗増殖活性（６２〜９０％）は、ヒ
ツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄの活性（８６％）と著しく異なるものではなかった。Ｉ
ＦＮ−τ２６Ｐ：Ｌ変異体は、非常に高い抗増殖活性（９０％）であったが、一
方、非経口的なヒツジＩＦＮ−τ１ｍｏｄ或いはヒトＩＦＮ−αＡのいずれから
も、著しく異なるものではなかった。

【０１５４】表４：ＩＦＮ−タウ Ｎ−末端変異体の抗−増殖活性

【表４】

【０１５５】 各ＩＦＮの１７ｎＭを、１０００ＭＣＦ−７或いはＨＴ−２９細胞に添加して
、９日間培養せしめた。各ＩＦＮの０．０６ｎＭを、１０００ダウジ細胞に添加
して、３日間培養せしめた。対照細胞は、ＩＦＮを受けなかった。結果は、平均
細胞数×１０⁴±３つの繰り返し実験のＳＥとして表される。ＮＤは、ないこと
を示す。Ａ”＋”は、ＩＦＮ−τ変異体による成長抑制性が、ヒツジＩＦＮ−τ
１ｍｏｄのものと比較して、著しく高いことを示す。

【０１５６】

【実施例Ｖ】 インターフェロン タウ変異体の毒性 ＩＦＮ−タウ変異体−処理細胞の生存性 ヒツジＩＦＮ−タウｉｍｏｄ，ＩＦＮ−アルファＡ或いはＩＦＮ−タウ変異体
のいずれか ８０，０００Ｕ／ｍｌを、３倍にして、７２時間培養されたポリプ
ロピレン管中の２×１０⁵Ｕ９３７細胞に添加した。対照細胞は、媒体のみで処
理された。細胞は、トリパンブルーの添加後に、ヘモシトメーターにより計数さ
れた。

【０１５７】 末梢血液リンパ球により、Ｕ９３７細胞は、ヒトＩＦＮ−アルファＡで処理さ
れたときに、著しく低下した生存率を示し；それに対して、対照の生存率は約９
７．５％であり、ＩＦＮ−アルファＡ処理の細胞は約８３％である。それに対し
て、ネイテイブｏｖｉｎｅＩＦＮ−タウ１ｍｏｄで処理された細胞の生存率は約
９６％である。ＩＦＮ−タウ変異体蛋白質のすべては、非常に高い生存率であり
、本質的に、細胞毒性がないものである。第１の生存率研究において、百分率生
存率は、１３Ｅ：Ｒ変異体に対して９４．７５％であり、１６Ｋ：Ｍ変異体に対
して９７．２５％であり、２６Ｐ：Ｌ変異体に対して９５．７５％であり、そし
て、１３Ｋ：Ｄ変異体に対して９５．５％である。表５参照。第２の生存率研究
では、１９Ｄ：Ａ変異体及び２４Ｌ：Ｉ変異体を含み、その生存率は、対照で、
９８．９％であり、ネイテイブＩＦＮ−タウで、９７％であり、ヒトＩＦＮ−ア
ルファで８０．２５％で、１３Ｅ：Ｒ変異体に対して９６％であり、１６Ｋ：Ｍ
変異体に対して９７％であり、１９Ｄ：Ａ変異体に対して９７％であり、そして
、２４Ｌ：Ｉ変異体に対して９６．５％である。表６参照。

【０１５８】 表５：Ｕ９３７細胞の可変性

【０１５９】

【０１６０】

【０１６１】 表６：Ｕ９３７細胞の可変性

【０１６２】

【０１６３】

【０１６４】

【実施例ＶＩ】 抗−ウイルス活性 ＩＦＮは、歴史的には、その抗ウイルス活性により説明され、それにより、こ
れは、ＩＦＮ−τ変異体の活性のための論理的なスクリーンであった。ＭＤＢＫ
細胞をＶＳＶから保護するための６つの変異体の能力を、テストし、そして、そ
の抗ウイルス活性を、ワイルドタイプのｏｖｌＦＮ−τ１ｍｏｄ及びヒトＩＦＮ
−αＡと比較する。抗ウイルス活性の１つの単位は、ＶＳＶの細胞障害効果を、
５０％抑制するに必要な蛋白質の量として定義される。

【０１６５】 すべての変異体は、ある程度は抗ウイルス活性を有した。ＩＦＮ−タウ２６Ｐ
：Ｌ変異体の活性は、９．５×１０⁷Ｕ／ｍｇであった。それは、ヒツジＩＦＮ
−タウ及びヒトＩＦＮ−アルファの両方と同じものであった。２６Ｐ：Ｌ変異体
が、ヒツジＩＦＮ−タウ及びヒトＩＦＮ−アルファの両方と同じ抗ウイルス活性
を有するインターフェロン−タウを与え、そして、ネイテイブＩＦＮタウ（下記
参照）以上の多く改良されて、低い毒性を有する抗−増殖活性を有するインター
フェロン−タウを与えるので、これは、特に有意義なものである。治療的に有意
義なことは、この変異体がヒトＩＦＮアルファよりも非常にすぐれた治療効果を
有することである。

【０１６６】 ４つの変異体；１６Ｋ：Ｍ，１９Ｄ：Ａ，２４Ｌ：Ｉ及び３４Ｋ：Ｎの活性は
、親ＩＦＮ対照に対して抗ウイルス活性を著しく低下させることを示している。
最低の活性変異体は、３．２×１０⁴単位の活性／ｍｇ蛋白質を有する１３Ｅ：
Ｒであった。これは、ワイルドタイプｏｖｌＩＦＮ−τ１ｍｏｄ（６．４×１０ ⁷ Ｕ／ｍｇ）或いはＩＦＮ−アルファ（８×１０⁷Ｕ／ｍｇ）よりも，著しく低い
抗ウイルス活性である。１３Ｅ：Ｒの結合性が、ｏｖｌＩＦＮ−タウ１ｍｏｄと
同等であるので、１３Ｅ：Ｒの低下された抗ウイルス活性が、レセプター結合を
校正していなかった。種々の変異体の抗ウイルス活性は、以下に概略される。

【０１６７】 インターフェロンに対する認められたスクリーン方法であるので、ウシＭＤＢ
Ｋ細胞に対する抗ウイルス活性をテストしたことは強調されるべきである。この
アッセイの抗ウイルス活性の高いレベルは、ヒトでの、例外的に高い抗ウイルス
活性を必然的に校正しなく、或いは逆も真なりに必然的になる。抗増殖活性のよ
うな抗ウイルス活性は、ウィルス性及びホスト−特定性のものと理解される。本
発明の発見及び具体例は、生物活性を評価するための、特定の細胞ラインとウィ
ルスを用いており、各ウイルス／ホストの免疫タイプに対する最適の薬剤を作成
するものである。最適の薬剤は、ホストＨＬＡ或いは他の免疫タイプに依存する
ものである。

【０１６８】表７：インターフェロン タウ 変異体の抗−ウイルス活性 表７：ＩＦＮ変異体のＭＤＢＫ細胞上での抗ウイルス活性。抗ウイルス活性は、
ＩＦＮの一連の希釈液：１：１００〜１：５．９×１０⁷ を用いて測定された
。攻撃性は、ストックＶＳＶの１：５００希釈液で行われた。平均値は、２〜１
５のレプリカに基づいて決められた。ＡＮＯＶＡは、５つのレプリカに基づいた
。

【０１６９】 上記で引用したすべての文献は、参照のために明細書中に入れられたものであ
る。１９９９年６月２２日に出願された、米国仮出願６０／１４０，４１１の全
内容であり、参照物とされる。 当業者が、この開示を詠んだことから、形式と詳細な種々の変化が、本発明の
範囲を離れることなく、成されることができるものと理解される。 欠落部分があったので、訂正致します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 31/12 29/00 １０１ 31/14 31/12 31/18 31/14 35/00 31/18 37/02 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/555 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/555 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ショーツ，レイネッテ，エイチ アメリカ合衆国，メリーランド州 20906， シルバー スプリング，カトクチン コー ト 60 (72)発明者 クラーク，クリスティーナ，ダンツ アメリカ合衆国，マサチューセッツ州 02141，ケンブリッジ，ジェファーソン ストリート ＃２ 34 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA22 BA23 CA02 DA12 FA15 HA01 HA17 4B064 AG08 CA19 DA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA44 DA21 NA05 NA14 ZA752 ZA892 ZB022 ZB072 ZB152 ZB262 ZB332 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA15 EA29 FA74

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）生物学的活性が明らかにされ、そして、アミノ酸配列が既
   知である第１の蛋白質を選択し； ｂ）第１の蛋白質と構造的に類似であり、所望の生物学的活性を有し、そして、
   アミノ酸配列が既知である第２の蛋白質を同定し； ｃ）第２の蛋白質上の相当するアミノ酸とは異なる第１の蛋白質上の１以上のア
   ミノ酸を同定し； ｄ）ｃ）工程での第２の蛋白質で同定された異なるアミノ酸を１以上、第１の蛋
   白質の１以上の相当するアミノ酸と置換し、改良された生物学的活性を有する組
   換え蛋白質を得ることを特徴とする、改良された生物学的活性を有する組換え蛋
   白質の製法。
2. 【請求項２】 ａ）生物学的活性が明らかにされ、そして、核酸配列とアミノ
   酸配列が既知である第１の蛋白質を選択し； ｂ）第１の蛋白質と構造的に類似であり、所望の生物学的活性を有し、そして、
   アミノ酸配列が既知である第２の蛋白質を同定し； ｃ）第２の蛋白質上の相当するアミノ酸とは異なる第１の蛋白質上の１以上のア
   ミノ酸を同定し； ｄ）第１の蛋白質の核酸配列に１以上の変異を行い、１以上の置換アミノ酸のた
   めのコドン体を有する組換え核酸配列を作ることにより、ｃ）工程での第２の蛋
   白質で同定された異なるアミノ酸を１以上、第１の蛋白質の１以上の相当するア
   ミノ酸と置換し、そして； ｅ）生体内或いは試験管内での、組換え核酸配列を処理して、改良された生物学
   的活性を有する組換え蛋白質を得ることを特徴とする、改良された生物学的活性
   を有する組換え蛋白質の製法。
3. 【請求項３】 第１の蛋白質は、インターフェロン タウである請求項１に記
   載の製法。
4. 【請求項４】 第２の蛋白質は、インターフェロン アルファである請求項１
   に記載の製法。
5. 【請求項５】 インターフェロン タウ オヴン（羊痘）は、アミノ酸配列Ｉ
   ＤＮｏ．２により同定されたインターフェロン タウ １モードである請求項３
   に記載の製法。
6. 【請求項６】 インターフェロン アルファは、アミノ酸配列ＩＤＮｏ．３に
   より同定されたヒト インターフェロン アルファＡである請求項３に記載の製
   法。
7. 【請求項７】 生物学的活性は、抗−ウィルス活性である請求項１に記載の製
   法。
8. 【請求項８】 生物学的活性は、抗−増殖活性である請求項１に記載の製法。
9. 【請求項９】 １以上のアミノ酸が、既知の生物学的活性の結合位或いは領域
   に位置していることを特徴とする請求項１に記載の製法。
10. 【請求項１０】 抗−ウィルス活性は、ウィルス複製を阻止するものであるこ
    とを特徴とする請求項９に記載の製法。
11. 【請求項１１】 前記のｃ）工程が、更に、ａ）−第１の蛋白質中で、どのア
    ミノ酸が、溶媒中にさらされるかを決め； ｂ）−第２の蛋白質中で、どのアミノ酸が、溶媒中にさらされるかを決め； ｃ）−第２の蛋白質上で、どの溶媒−露出されたアミノ酸が、原蛋白質上の相当
    する溶媒−露出アミノ酸と異なるか、を、決定するサブ工程を更に、有すること
    を特徴とする請求項１に記載の製法。
12. 【請求項１２】 第１の及び第２の蛋白質は、同じ種からのものであることを
    特徴とする請求項１に記載の製法。
13. 【請求項１３】 第１の及び第２の蛋白質は、異なる種からのものであること
    を特徴とする請求項１に記載の製法。
14. 【請求項１４】 第１の及び第２の蛋白質は、天然産蛋白質であることを特徴
    とする請求項１に記載の製法。 【請求項１４】 第１の及び第２の蛋白質は、非−天然産蛋白質であることを
    特徴とする請求項１に記載の製法。
15. 【請求項１５】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質。
16. 【請求項１６】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質を、
    治療効果のあり、癌処置に十分な量、投与することを特徴とする癌或いは腫瘍を
    処置するための方法。
17. 【請求項１７】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質を、
    治療効果のあり、ウイルス疾病の処置に十分な量、投与することを特徴とするウ
    イルス疾病を処置するための方法。
18. 【請求項１８】 該ウイルスが、ヒトの免疫欠乏ウイルス或いは肝炎ウイルス
    であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 該ウイルスが、ＲＮＡウイルスであることを特徴とする請求
    項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質で、
    生体内或いは試験管内の腫瘍細胞に、該腫瘍細胞の成長を阻止するに効果的な濃
    度で、接しめることを特徴とする腫瘍細胞成長を低減するための方法。
21. 【請求項２１】 前記の癌或いは腫瘍は、ヒト 腺癌、処置乳癌、前立腺癌、
    膠芽腫、黒腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、腎臓癌、脳
    癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮癌、骨癌、結腸直腸癌、頚管癌及び神経外胚葉癌、モ
    ノクロナール ガンマポチエス及び頚部及び口部形成障害からなる群から選択さ
    れたものである請求項１６に記載の方法。
22. 【請求項２２】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質を、
    効果的量、自己免疫疾病を処置するに十分な量、動物に投与することを特徴とす
    るそのような処置が必要な動物の自己免疫疾病を処置する方法。
23. 【請求項２３】 前記の自己免疫疾病は、タイプＩの糖尿病、リウマチ、紅斑
    性狼瘡及び乾癬からなる群から選択されたものである請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 配列ＩＤ Ｎｏ．４〜１０及び１８〜２０により同定された
    アミノ酸からなる群から選択された、組換えインターフェロン タウ蛋白質を、
    効果的量、自己免疫疾病の処置に十分な量、動物に、投与することを特徴とする
    そのような処置に必要に動物中の多重硬化症を処置する方法。