CN104761645A - α干扰素融合蛋白制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α干扰素融合蛋白的水溶液制剂,包括α干扰素融合蛋白;L-半胱氨酸;甘露糖醇;海藻糖;组氨酸;泊洛沙姆188以及NaCl。此外,本发明还公开了上述α干扰素融合蛋白的水溶液制剂在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。与现有技术相比,本发明的水溶液制剂不仅在长时间保存后仍然保持足够的活性,而且明显减少了药品长期放置后产生的颗粒,稳定性很好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种α干扰素融合蛋白制剂和应用。
技术背景:
众所周知,尽管很多功能性蛋白具有很好的生物学功能,但在成药性方面往往存在着缺陷,如稳定性差、体内容易降解等。因此,增强蛋白药物的稳定性和延长其体内半衰期是改善功能性蛋白成药性的重要手段。这方面的技术主要有聚乙二醇化(PEGylation)和融合蛋白技术。蛋白药物经过聚乙二醇化后,分子量大大增加,可溶性和稳定性显著增强,从而使体内的半衰期显著延长;然而聚乙二醇往往改变蛋白的空间结构,降低其生物学活性,或引起不可预测的特异性或功能改变。
融合蛋白技术可以避免聚乙二醇化的上述缺点。融合蛋白(Fusion Protein)是指两个或两个以上、相同或不同的蛋白或肽通过肽键连接而形成的一个完整新分子,各个蛋白或肽之间可以添加柔性接头以保证蛋白的正确空间结构。通常,融合蛋白的制备是通过基因工程技术,即将编码各个蛋白或肽的核苷酸序列经基因重组而形成编码融合蛋白的序列,再通过表达载体,将此序列导入宿主细胞内,使之在细胞内合成融合蛋白,最后经各种分离、纯化技术获得目的融合蛋白。目前融合蛋白技术已经成为生物医药的一个重要技术平台,多种融合蛋白药物已经应用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤等,取得了重大的社会和经济效益。
融合蛋白药物中最成功的典范是用人IgG抗体Fc片段作为载体。Fc融合蛋白不仅可以改善功能性蛋白的稳定性,而且可以有效地延长其体内半衰期,达到临床上长效药物的目的。Fc融合蛋白技术已经成功地应用于IFN-2b,TNF-Rc和LFA-3等功能性蛋白的药物化。
虽然Fc融合蛋白技术得到了成功的应用,但制备和生产方面也存在着一些问题,如这样的融合蛋白必需在哺乳动物细胞内重组表达、生产工艺复杂、生产周期过长、生产成本过高等。为弥补Fc融合蛋白的不足,发明人筛选到能和人抗体IgG Fc片段结合的十肽,然后将功能性蛋白与此十肽融合,形成新的α干扰素融合蛋白。所述融合蛋白包括α干扰素和ABP,所述ABP为上述能与人IgG抗体Fc片段结合的十肽,所述α干扰素由序列表SEQ ID NO.5所示;所述ABP由序列表SEQ ID NO.1所示,所述α干扰素的C末端与ABP的N末端直接连接,或α干扰素的C末端与ABP的N末端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接,所述n为1-100。这种融合蛋白进入人体后,通过上述十肽片段作为“肽桥”,将功能性蛋白与内源性IgG抗体结合,这样通过增大分子量,可以避免功能性蛋白在体内的肾脏过滤,延长其体内循环时间而达到长效的目的。
然而,作为蛋白药物,这种α干扰素融合蛋白的稳定性无法与常规化学药物相比,其活性在长期贮存时还是会受到多种环境因素的影响。例如,对温度、氧气和紫外线高度敏感。由于这些因素的作用,可能发生多种物理或化学变化,例如结合、聚集、氧化和构象改变,从而使α干扰素融合蛋白大大丧失活性。因此,如果贮存期间α干扰素融合蛋白的稳定性不能保证,会导致给药剂量的变化从而影响疗效。
因此,本领域迫切需要开发一种稳定化的α干扰素融合蛋白制剂,这将十分有利于该种新型药物制剂在临床上的应用推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种α干扰素融合蛋白的水溶液制剂,该水溶液可稳定保存α干扰素融合蛋白制剂,能够充分防止α干扰素融合蛋白的结合、聚集、氧化和构象改变等理化性质的变化,从而保持其有效组分的生物学活性。
为了实现上述目的,本发明采用下列技术方案:一种α干扰素融合蛋白的水溶液制剂,包括α干扰素融合蛋白;L-半胱氨酸;甘露糖醇;海藻糖;组氨酸;泊洛沙姆188以及NaCl。
其中,所述α干扰素融合蛋白包括α干扰素和ABP,所述ABP为能与人IgG抗体Fc片段结合的十肽,由序列表SEQ ID NO.1所示;所述α干扰素由序列表SEQ ID NO.5所示。在一个实施方式中,所述α干扰素的C末端与ABP的N末端直接连接。在另一个实施方式中,α干扰素的C末端与ABP的N末端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接,所述n为1-100。
α干扰素包括α2a干扰素、α1b干扰素、α2b干扰素或者αcon干扰素。在一个优选的实施方式中,α干扰素为α2b干扰素,即IFN2b。
α干扰素融合蛋白的浓度为0.1-10wt%,进一步优选为0.5-5wt%,最优选为2-4wt%。
L-半胱氨酸的浓度为0.5-5wt%,进一步优选为1-4wt%,最优选为2-3wt%。
甘露糖醇的浓度为0.5-5wt%,进一步优选为1-4wt%,最优选为2-3wt%。
海藻糖的浓度为0.5-5wt%,进一步优选为0.5-3wt%,最优选为0.5-1wt%。
组氨酸的浓度为0.5-5wt%,进一步优选为0.5-2wt%,最优选为0.5-1wt%。
泊洛沙姆188的浓度为0.1-5wt%,进一步优选为0.2-2wt%,最优选为0.3-1wt%。
NaCl的浓度为0.01-0.5wt%,进一步优选为0.02-0.4wt%,进一步优选为0.05-0.2wt%。
另一方面,本发明还提供了上述α干扰素融合蛋白的水溶液制剂在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物的应用。
与现有技术相比,本发明的水溶液制剂不仅在长时间保存后仍然保持足够的活性,而且明显减少了药品长期放置后产生的颗粒,稳定性很好。
附图说明
图1为转入pYW-2载体的大肠杆菌工程菌YW-IFNa2-ABP-E001的诱导表达的SDS-PAGE检测结果。M为Marker,1泳道为诱导表达前全菌,2泳道为诱导表达后全菌。
图2为由SEQ ID NO.7所表达的α干扰素融合蛋白——IFNa2-ABP蛋白变性复性及纯化后的SDS-PAGE检测结果。M为Marker,1泳道为诱导表达前全菌,2泳道为诱导表达后全菌,3泳道为融合蛋白变性复性后上清,4泳道为纯化后的融合蛋白——IFNa2-ABP。其中,序列表SEQ ID NO.7是指IFNa2b与ABP基因之间通过表达(Gly-Gly-Gly-Ser)3的基因融合。
图3为由SEQ ID NO.7所表达的α干扰素融合蛋白——IFNa2-ABP蛋白的Western Blot分析结果。M为Marker,1为融合蛋白的Western Blot结果,2为负对照。
图4为由SEQ ID NO.6所表达的α干扰素融合蛋白的Western Blot分析结果。M为Marker,1、2为融合蛋白的Western Blot结果。其中,序列表SEQ ID NO.6是指IFNa2b及ABP基因直接融合。
具体实施方式
本发明所述的目的/或方案将以优选实施方式的形式给出。对这些实施方式的说明是用于对本发明的理解,而非限制可行的其他方式,这些可行的其他实施方式可由对本发明的实践得知。
下面通过实施例对本发明做进一步阐述,但显然本发明的范围并不仅限于以下实施例。
实施例1α干扰素融合蛋白——IFNa2-ABP的制备、鉴定和纯化
A.人抗体IgG Fc片段结合肽的筛选。包括如下步骤:
(1)包被:将人抗体IgG Fc蛋白溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3溶液中,制成100μg/ml的靶分子溶液,直接包被于聚苯乙烯微孔中,4℃孵育过夜;次日倒掉包被液,除去残夜,加入封阻液,4℃作用1h;去除封阻液,用TBST缓冲液洗涤6次。
(2)一轮淘选:用100μl TBST缓冲液稀释10μl噬菌体文库,加入到已经包被好的微孔中,室温温和摇动1h;去除未结合的噬菌体,TBST洗涤10次;加入100μl0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)缓冲液分离已经结合的分子,加入15μl 1M Tris-HCl中和,得到一轮淘选噬菌体洗脱溶液。
(3)滴度测定:按照常规M13方法测定步骤(2)所得到的洗脱物的滴度。
(4)一轮扩增:将剩余洗脱物加入到20ml ER2738培养物种,37℃剧烈培养4.5h;将培养物转入离心管中4℃10000rpm离心10min,取上清,再离心;将上清的80%转移至新的离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,4℃沉淀至少1h;4℃10000rpm离心15min,去除上清,短暂离心,去除残夜;用1ml TBS重悬沉淀,4℃10000rpm离心5min;取上清,加入1/6体积的PEG/NaCl,冰上孵育15-60min,4℃10000rpm离心10min,弃上清,再短暂离心,去除残夜;沉淀物重悬于200μl TBS缓冲液中,离心1min,转移上清,即为一轮扩增后的洗脱物。
(5)滴度测定:按照常规M13方法测定步骤(4)所得到的一轮扩增后洗脱物的滴度。
(6)根据步骤(1)~(5)的方法进行第二轮和第三轮淘选,并将逐步增加洗涤用TBST中Tween-20的含量。
(7)第三轮淘选所得洗脱物进行滴度测定,挑选噬菌斑数目在100左右的平板,从中随机挑选噬菌斑进行测序。
(8)分析测序结果,筛选得到的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示。
B.人抗体IgG Fc片段结合肽的鉴定
包括如下步骤:
(1)按照实例1步骤(4)所述方法将待鉴定的噬菌体克隆进行扩增,获得噬菌体洗脱物,按照常规M13方法测定滴度,其余4℃短时间保存。
(2)将人抗体IgG Fc蛋白溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3溶液中,制成终浓度为100μg/ml的靶分子溶液,100μl/孔包被于96孔板中,每个待检噬菌体克隆需要包被8个微孔,4℃孵育过夜,同时设置人抗体IgG Fab和鼠抗体IgG Fc蛋白的对照;次日倒掉包被液,除去残夜,加入封阻液,4℃作用1~2h,此外还需要封阻未包被的一排微孔以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力;去除封阻液,用TBST缓冲液洗涤6次。
(3)在单独的封阻板中每孔预先加入200μl TBST,由每排第一孔加入1012个噬菌体开始对其进行5倍系列稀释。
(4)将稀释好的噬菌体加入到包被有靶分子的微孔板中,常温震荡1~2h;去除液体,用TBST缓冲液洗涤6次。
(5)用封阻液按1:5000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体(Pharmacia#27-9411-01),每孔加入200μl稀释抗体,室温震荡作用1h;去除液体,用TBST缓冲液洗涤6次。
(6)每孔加入200μl准备好的底物溶液,室温作用10-60min。
(7)加入2M H2SO4终止反应,用酶标仪记录420nm处的吸光值。
(8)结果证明序列表SEQ ID NO.1所示小肽能与人抗体IgG Fc片段结合,并与其亲和力呈现较明显的浓度依赖性,见表1。
表1
C.融合基因IFN2b-ABP(SEQ ID NO.7)的构建。
包括如下步骤:
(1)以pBV-IFN为模板,通过PCR(用高保真Taq酶),获得IFN2b-ABP基因的前一部分片段。实验所用的PCR引物是根据IFNa2b及ABP的序列设计的:
P1:5′-ATGGGATCCATGTGTGATCTGCCGCAAAC-3′(SEQ ID NO.7)
下划线部分为BamHⅠ酶切位点。
P2:5′-ACCGGAGCCACCGCCAGAACCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3′(SEQID NO.8)
(2)采用重组PCR的方法,获得IFN2b-ABP基因片段。所需要的引物序列如下:
P3:5′-GGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTTCTGTTCCGTCT-3′(SEQ ID NO.9)
P4:5′-GCTCTGCAGTTACTGTTCCCAGGTTTTCAGAGACGGAACAGAAGCA-3′(SEQ ID NO.10),其中下划线部分为PstⅠ酶切位点。
将步骤(1)中得到的IFN2b-ABP基因的前一部分片段做为模板,用P1、P2、P3、P4四条引物进行重组PCR,反应过程中使用高保真Taq酶。体系为50μL。体系液中包含2μL步骤(1)中的IFN2b-ABP基因的前端片段,P1、P3和P4引物各1μL,5μL 10×buffer,1μLTaq酶,1μL 10mmol/L dNTP,38μL ddH2O。PCR反应条件为:94℃预变性5分钟;94℃30秒,61℃30秒,72℃1分钟,循环30次;72℃延伸10分钟,4℃保温。获得少量融合基因IFN2b-ABP。
用上述融合基因IFN2b-ABP继续进行2次PCR反应。此PCR反应过程中使用P1和P4引物。反应体系为50μL。混合液中包含上一步骤中获得的融合基因IFN2b-ABP 2μL,5μL 10×buffer,1μL Taq酶,1μL 10mmol/L dNTP,1μL P1引物,1μL P4引物,39μL ddH2O。PCR反应条件为:94℃预变性5分钟;94℃30秒,60℃30秒,72℃1分钟,循环30次;72℃延伸10分钟,4℃保温。获得融合基因IFN2b-ABP(SEQ ID NO.7)。
D.含有IFN2b-ABP融合基因的大肠杆菌表达载体pYW-2的构建。
用BamHⅠ和PstⅠ消化IFN2b-ABP基因片段。质粒pBV亦用BamHⅠ和PstⅠ双酶切得到载体大片段。将酶切后的载体大片段和基因片段进行连接。挑取阳性转化子即为本发明中所用的表达载体——含有IFN2b-ABP(SEQ ID NO.7)融合基因的大肠杆菌表达载体pYW-2。
E.大肠杆菌工程菌YW-IFN2b-ABP-E001的诱导表达及IFN2b-ABP的纯化。
将前述含有IFN2b-ABP(SEQ ID NO.7)融合基因的大肠杆菌表达载体pYW-2转入大肠杆菌DH5α中,得到YW-IFN2b-ABP-E001菌株,30℃、200r摇瓶培养到OD600为0.6时瞬间升温至42℃,然后200r诱导表达4小时。离心取菌体,SDS-PAGE电泳检测证明成功表达IFN2b-ABP(图1)。菌体进行超声破碎,得到沉淀进行包涵体变性复性处理,复性后的上清液进行疏水层析和离子交换层析纯化处理,获得高纯度的IFN2b-ABP(图2)。Western blot结果(图3)表明,构建的大肠杆菌已成功表达IFN2b-ABP。
实施例2Western Blot实验
该实验的目的是证实本发明的α干扰素融合蛋白能和人IgG抗体的Fc片段结合。
将经过疏水层析和离子交换层析纯化得到的高纯度IFN2b-ABP进行WesternBlot实验。15%SDS-PAGE电泳结束后,将蛋白转移至PVDF膜(200mA,40min),脱脂奶粉封闭1小时,加入人免疫球蛋白IgG作为一抗4℃孵育过夜。一抗处理结束后,加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗室温处理1.5小时,DAB显色液进行显色反应。结果(图4)显示,膜上的IFN2b-ABP融合蛋白处有明显的颜色反应,即该蛋白与人免疫球蛋白IgG的Fc片段产生特异性结合反应。
实施例3抗肿瘤细胞增殖实验
将DAUDI细胞以适当浓度接种于含有10%灭活小牛血清的细胞培养液中(180μL),在37℃,5%CO2,饱和湿度下培养一天,第二天在细胞培养液中加入纯化后的INF2b-ABP蛋白及对照样品(从原液开始用PBS缓冲液以10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍稀释),37℃,5%CO2,饱和湿度下培养六天,然后加入20μL浓度为5mg/mL的MTT,37℃孵育4小时,继而加入三联液,37℃过夜,用酶标仪测A570nm吸光值来表示细胞增殖水平。结果证明INF2b-ABP蛋白可以有效抑制肿瘤细胞的增值,见表2。
表2
在本实验中,a干扰素与ABP可以直接连接(无连接肽),也可以通过单个的甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸二肽、甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸三肽、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸四肽单体或者多聚体作为铰链区连接,这些方法都能产生相似的结果。利用ABP肽和IFN融合表达,不影响IFN的活性,同时又延长IFN在人体内的半衰期,实验证明,本发明的α干扰素融合蛋白可以作为一种新型的长效干扰素而用于相关疾病的治疗。
实施例4制备α干扰素融合蛋白的水溶液制剂
按照下列表3的配方分别配制不同的α干扰素融合蛋白的水溶液制剂,获得半成品产品。
表3
将半成品无菌分装入西林瓶中,加盖橡胶塞和铝塑盖,获得成品。
实施例5α干扰素融合蛋白的水溶液制剂稳定性和相对活性测定。
按照《中华人民共和国药典》2005年版第三部,附录XC记载的细胞病变抑制法(WISH/VSV系统)检测保存一定时间后α干扰素融合蛋白的水溶液制剂的活性,将不同保存时间的产品活性与保存时间为0天的产品活性的百分比值定义为保存后产品的相对活性值。将实施例4的样品1-5在25℃条件下存放6个月,分别于0天、1个月、3个月和6个月取样检测。结果如下表4所示。
表4
按照《中华人民共和国药典》2005年版第三部,附录VB记载的可见异物检检查法检测保存一定时间后α干扰素融合蛋白的水溶液制剂的外观。经过检测,即使在包括6个月后,本发明的α干扰素融合蛋白的水溶液制剂仍然为无色澄清溶液形式,明显减少了药品长期放置后产生的颗粒,稳定性很好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种α干扰素融合蛋白的水溶液制剂,包括α干扰素融合蛋白;L-半胱氨酸;甘露糖醇;海藻糖;组氨酸;泊洛沙姆188以及NaCl。
2.根据权利要求1所述的水溶液制剂,其中,所述α干扰素融合蛋白包括α干扰素和ABP,所述ABP为能与人IgG抗体Fc片段结合的十肽,由序列表SEQ IDNO.1所示;所述α干扰素由序列表SEQ ID NO.5所示;所述α干扰素的C末端与ABP的N末端直接连接;或者,α干扰素的C末端与ABP的N末端之间通过(Gly-Gly-Gly-Ser)n连接,所述n为1-100。
3.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述α干扰素融合蛋白的浓度为0.1-10wt%。
4.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述L-半胱氨酸的浓度为0.5-5wt%。
5.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述海藻糖的浓度为0.5-5wt%。
6.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述甘露糖醇的浓度为0.5-5wt%。
7.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述组氨酸的浓度为0.5-5wt%。
8.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述泊洛沙姆188的浓度为0.1-5wt%。
9.根据权利要求1或2所述的水溶液制剂,其中,所述NaCl的浓度为0.01-0.5wt%。
10.权利要求1-9任一项所述的α干扰素融合蛋白的水溶液制剂在制备抗病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。
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