CN102686216A - 包含抗cd20抗体的高度浓缩的药物配制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及供皮下注射用的，药学活性抗CD20抗体（诸如例如利妥昔单抗、Ocrelizumab或HuMab<CD20>、或此类抗体分子的混合物）的高度浓缩的稳定的药物配制剂。特别地，本发明涉及作为组合配制剂或以共配制剂形式使用的，在合适量的抗CD20抗体外包含有效量的至少一种透明质酸酶酶的配制剂。所述配制剂另外包含至少一种缓冲剂（诸如例如组氨酸缓冲剂）、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物（例如糖类，诸如例如α,α-海藻糖二水合物或蔗糖，和任选地作为第二稳定剂的甲硫氨酸）、非离子型表面活性剂和有效量的至少一种透明质酸酶酶。还提供了用于制备此类配制剂的方法及其用途。
Description
本发明涉及供皮下注射用的，药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂。在较高量的抗CD20抗体或其混合物外，此类配制剂包含缓冲剂、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物、非离子型表面活性剂和有效量的至少一种透明质酸酶酶。本发明还涉及用于制备所述配制剂的方法及此类配制剂的用途。
发明背景
抗体的药学用途在过去数年里已经增加。在许多情况中，经由静脉内(IV)路径注射或输注此类抗体。不幸地，可以经由静脉内路径施用的抗体量受限于抗体的物理-化学特性，特别地受限于其在合适的液体配制剂中的溶解度和稳定性及受限于输注液体的体积。备选的施用途径是皮下或肌肉内注射。这些注射途径要求要注射的最终溶液中的高蛋白质浓度[Shire,S.J.,Shahrokh,Z.等,“Challenges in the development of high protein concentrationformulations”,J.Pharm.Sci.2004;93(6):1390-1402;Roskos,L.K.,Davis C.G.等,“The clinical pharmacology of therapeutic antibodies”,Drug DevelopmentResearch 2004;61(3):108-120]。为了增加体积，及由此增加治疗剂量（其可以安全且舒适地皮下施用），已经提出了使用糖胺聚糖酶酶以增加可以注射抗体配制剂的间质空间[WO2006/091871]。
目前出售的治疗用途的药学活性抗体的稳定的配制剂的例子如下：（利妥昔单抗(Rituximab)）是一种结合B细胞上的CD20抗原的嵌合抗体。商业配制剂是供静脉内(IV)施用的无菌的、澄清的、无色的、无防腐剂的液体浓缩物。利妥昔单抗以10mg/mL的浓度在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用管形瓶中供应。在9mg/mL氯化钠、7.35mg/mL脱水柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨酯80、和注射用水中配制该产品。将pH调节至6.5。利妥昔单抗的适合于IV施用的一种备选液体配制剂披露于美国专利No.6,991,790中。
HERCEPTINTM（曲妥单抗(Trastuzumab)）是一种针对HER2受体的单克隆抗体（抗HER2），其目前在欧洲以150mg冻干粉末（含有抗体、二水合α,α-海藻糖、L-组氨酸和盐酸L-组氨酸和聚山梨酯20）形式销售，所述冻干粉末应当为了输注用注射用水重建以产生约21mg/ml的注射剂量。在美国和许多其它国家，销售装有440mg曲妥单抗的多剂量管形瓶。
AVASTINTM（贝伐单抗(Bevacizumab)）是一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，其目前在欧洲以两类管形瓶中的液体配制剂销售：分别为a)4ml中的100mg贝伐单抗和b)16ml中的400mg贝伐单抗，提供含有下列赋形剂的注射用水中的25mg/ml终浓度：二水合海藻糖、磷酸钠和聚山梨酯20。
虽然已经发现了上述抗体配制剂适合用于静脉内施用，但是期望提供供皮下注射用的，治疗活性抗体的高度浓缩的稳定的药物配制剂。皮下注射的优点在于它容许医学从业人员相当短的干预中在对患者将其实施。此外，可以训练患者自己实施皮下注射。通常，经由皮下路径的注射限于约2ml。对于需要多剂的患者，可以在身体表面的多个部位注射多个单位剂量配制剂。
皮下施用的下列两种抗体产品已经出售。
HUMIRATM（阿达木单抗(Adalimumab)）是一种针对肿瘤坏死因子α(TNFα)的单克隆抗体，其目前在欧洲以用于皮下应用的，0.8ml注射体积中的40mg剂量形式销售（浓度：50mg抗体/ml注射体积）。
XOLAIRTM（奥马珠单抗(Omalizumab)）是一种针对免疫球蛋白E的单克隆抗体（抗IgE），其目前以150mg冻干粉末（含有抗体、蔗糖、组氨酸和一水合盐酸组氨酸和聚山梨酯20）形式销售，所述冻干粉末应当用皮下注射用水重建以产生125mg/ml注射剂量。
目前在市场上不可购得适合于皮下施用的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂。因此，期望提供治疗活性抗体的此类高度浓缩的稳定的药物配制剂供皮下注射。
对下皮注射胃肠外药物一般限于小于2ml的体积，这是由于皮下(SC)组织中对水力传导的此粘弹性阻力和注射后产生的反压力[Aukland K.和ReedR.,“Interstitial-Lymphatic Mechanisms in the control of Extracellular FluidVolume”,Physiology Reviews,1993;73:1-78]，及由于疼痛的感觉所致。
高浓度蛋白质配制剂的制备是非常有挑战性的，并且需要使每种配制剂适合于所使用的特定蛋白质，因为每种蛋白质具有不同的聚集行为。怀疑聚集体至少在一些情况中引起治疗性蛋白质的免疫原性。针对蛋白质或抗体聚集体的免疫原性反应可以导致中和性抗体，其可以使治疗性蛋白质或抗体无效。似乎蛋白质聚集体的免疫原性在与皮下注射的关联时最成问题，由此重复施用增加免疫应答的风险。
虽然抗体具有非常相似的总体结构，但是此类抗体在氨基酸组成（特别是在负责结合抗原的CDR区中）和糖基化样式方面有所不同。此外，另外可以有翻译后修饰，诸如电荷和糖基化变体。
发明概述
本发明提供了药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂，优选地供皮下注射用。
更具体地，本发明的药学活性抗CD20抗体配制剂的高度浓缩的稳定的药物配制剂包含：
-约20至350mg/ml抗CD20抗体；
-约1至100mM缓冲剂，其提供pH 5.5±2.0；
-约1至500mM稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物，其中任选地，甲硫氨酸作为第二稳定剂使用，优选地浓度为5至25mM；
-约0.01至0.1%非离子型表面活性剂；和
-优选地，有效量的至少一种透明质酸酶酶。
发明详述
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且明确涵盖全长抗体、遗传工程抗体如单克隆抗体、或重组抗体、多克隆抗体、自至少两种全长抗体形成的多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以在单克隆抗体的生成期间生成的可能的变体（此类变体一般以少量存在）外，构成群体的抗体个体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在其特异性外，单克隆抗体的有利之处在于它们不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体为自基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不应解释为要求通过任何特定的方法生成抗体。例如，可以通过第一次由等,Nature,256:495(1975)描述的杂
交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法（见例如美国专利No.4,816,567）来生成要依照本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clarkson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所描述的技术自噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的，展现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤生成的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的自具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠获得的B细胞。本文中的术语“单克隆抗体”明确包括所谓的嵌合抗体，其中重和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性（美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)）。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primatized)”抗体，其包含自非人灵长类（例如旧世界猴(OldWorld Monkey)、猿等）衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般至少包含其抗原结合部分或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体、单链抗体分子、免疫毒素、和自抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含具有VH链特征，即能够与VL链装配在一起，结合CD20抗原的单链多肽。“抗体片段”还包含此类如下的片段，其本身不能提供效应器功能(ADCC/CDC)，但是在与合适的抗体恒定域组合后以依照本发明的方式提供此功能。
“全长抗体”是包含抗原结合可变区及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域（例如人天然序列恒定域）或其氨基酸序列变体。优选地，全长抗体具有一种或多种效应器功能。
本文中的“氨基酸序列变体”抗体是具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体会与主要种类抗体拥有至少约70%的同源性，且优选地，它们会与主要种类抗体至少约80%，更优选地至少约90%同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置拥有替代、删除、和/或添加。本文中的氨基酸序列变体的例子包括酸性变体（例如脱酰胺化的抗体变体）、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基端前导延伸（例如VHS-）的抗体、在其一条或两条重链上具有C端赖氨酸残基的抗体等，并且包括对重和/或轻链的氨基酸序列的改变的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是相对于主要种类抗体，在其一条或两条轻链上包含氨基端前导延伸，任选地进一步包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异的抗体。
本文中的“糖基化变体”抗体是附着有与附着于主要种类抗体的一个或多个碳水化合物模块不同的一个或多个碳水化合物模块的抗体。本文中的糖基化变体的例子包括具有附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构，而不是G0寡糖结构的抗体、具有附着于其一条或两条轻链的一个或两个碳水化合物模块的抗体、没有附着于抗体的一条或两条重链的碳水化合物的抗体等，及糖基化变化的组合。此外，术语“糖基化变体”还包括糖工程化改造抗体诸如那些记载于WO 1’331‘266和USP 7’517’670的。
抗体“效应器功能”指那些可归因于抗体的Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）的下调，等等。
根据重链恒定域的氨基酸序列，全长抗体可以归入不同“类”。存在着5类主要的全长抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，这些中的几种可以进一步分成“亚类”（同种型），例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定域分别称作α[阿尔法]、δ[德耳塔]、ε[厄普西隆]、γ[伽马]、和μ[谬]。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维结构是公知的。
在本文中，单克隆抗体的“生物学活性”指抗体结合抗原，并且产生可以在体外或在体内测量的可测量生物学应答的能力。此类活性可以是拮抗的（例如在抗体是CD20抗体的情况中）或激动的。
术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(CDR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。特别优选的CDR对应于那些代表下文对嵌合和双功能性抗体所记录的识别抗原的序列的。大体上，人源化抗体指来自接受体高变区的残基用来自具有期望特异性、亲和力和性能的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区的残基替换的人免疫球蛋白（接受体抗体）。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般地，人源化抗体会包含至少一个、通常为两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区（见例如Riechmann,L.等,Nature 332(1988)323-327;及Neuberger,M.S.等,Nature 314(1985)268-270）。
术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。此类鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发明所涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已经自初始抗体的类或亚类修饰或改变的。此类“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术（见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238和US5,204,244）。
如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374)。基于此类技术，可以生成针对极其多种靶物的人抗体。人抗体的例子记载于例如Kellermann,S.A.等,Curr.Opin.Biotechnol.13(2002)593-597。
如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物（例如小鼠）分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但在体内可以不天然存在于人抗体种系全集内的序列。
如本文中所使用的，“特异性结合”指特异性结合CD20抗原的抗体。优选地，结合亲和力是10-9mol/l或更低（例如10-10mol/l）的Kd值的，优选地具有10-10mol/l或更低（例如10-12mol/l）的Kd值。用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术
来测定结合亲和力。
如本文中所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。
“恒定域”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是牵涉效应器功能（ADCC、补体结合、和CDC）。
如本文中所使用的，“可变区”（轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)）意为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链对之每种。人轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”（或互补决定区，CDR）连接的，其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采用β-片层构象，而CDR可以形成连接b-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的又一个目的。
术语“抗体的抗原结合部分”或“高变区”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区。CDR和FR区依照Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。
术语“CD20”和“CD20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同等型和物种同系物。本发明的抗体对CD20抗原的结合通过灭活CD20而介导对表达CD20的细胞（例如，肿瘤细胞）的杀伤。可以通过下列一项或多项机制而发生对表达CD20的细胞的杀死：细胞依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导细胞死亡和/或凋亡、同型聚集等。
如本领域中认可的，CD20的同义词包括B淋巴细胞抗原CD20、B淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、和Bp35。
依照本发明的术语“抗CD20抗体”是特异性结合CD20抗原的抗体。根据针对CD20抗原的抗CD20抗体的结合特性和生物学活性，两种类型的抗CD20抗体（I型和II型抗CD20抗体）可以依照Cragg,M.S.等,Blood 103(2004)2738-2743;及Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1051区别，见表1。
表1：I型和II型抗CD20抗体的特性
I型和II型抗CD20抗体的一种至关重要的特性是其结合模式。如此，可以通过与利妥昔单抗相比所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率来分类I型和II型抗CD20抗体。
如本文中所使用的，“抗CD20抗体”可以是I型或II型抗体。优选地，它是I型抗体，最优选地，它是利妥昔单抗。
I型抗CD20抗体具有0.8至1.2，优选地0.9至1.1的与利妥昔单抗相比所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率。此类I型抗CD20抗体的例子包括例如EP2000149B1（Anderson等，见例如图4和5）中的利妥昔单抗、1F5IgG2a（ECACC，杂交瘤；Press等,Blood 69/2:584-591(1987)）、HI47IgG3（ECACC，杂交瘤）、2C6IgG1（如WO2005/103081中所披露的）、2F2IgG1或ofatumumab（如WO 2004/035607和WO2005/103081所披露的）和2H7IgG1（如WO 2004/056312中所披露的）和WO 2006/084264（例如，表1和2中所披露的变体）。优选地，所述I型抗CD20抗体是一种与利妥昔单抗结合相同表位的单克隆抗体。
II型抗CD20抗体具有0.3至0.6，优选地0.35至0.55，更优选地0.4至0.5的与利妥昔单抗相比所述抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率。此类II型抗CD20抗体的例子包括例如托西莫单抗(tositumomab)(B1 IgG2a)、人源化B-Ly1抗体IgG1（一种嵌合的人源化IgG1抗体，如WO2005/044859中所披露的）、11B8 IgG1（如WO 2004/035607中所披露的）、和AT80 IgG1。优选地，所述II型抗CD20抗体是一种与人源化B-Ly1抗体（如WO2005/044859中所披露的）结合相同表位的单克隆抗体。
在用Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)的FACSArray(Becton Dickinson)中使用与Cy5缀合的所述抗CD20抗体和与Cy5缀合的利妥昔单抗通过直接免疫荧光测量（测量均值荧光强度(MFI)）来测定“与利妥昔单抗相比抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率”），并如下计算：
对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率=
MFI指均值荧光强度。如本文中所使用的，“Cy5标记比率”意指每分子抗体的Cy5标记物分子的数目。
通常，所述I型抗CD20抗体具有0.8至1.2，优选地0.9至1.1的与利妥昔单抗相比所述第一抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率。
通常，所述II型抗CD20抗体具有0.3至0.6，优选地0.35至0.55，更优选地0.4至0.5的与利妥昔单抗相比所述第二抗CD20抗体对Raji细胞(ATCC-No.CCL-86)上CD20的结合性能的比率。
在一个优选的实施方案中，所述II型抗CD20抗体，优选地人源化B-Ly1抗体具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
“具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的抗体”意指如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的，具有升高的ADCC的抗体，如该术语在本文中所定义的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达被抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞；
3)依照下列方案来实施测定法：
i)使用标准的密度离心规程来分离PBMC，并将其以5X 106个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮；
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养，自具有高于90%的存活力的指数生长期收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里51CI标记，用细胞培养基清洗两次，并以105个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬浮；
iii)将100微升上述最终靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每个孔；
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将50微升所得的抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的多种抗体浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，平板中装有经标记的靶细胞的3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2%(VN)水溶液，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vi)对于自发释放(SR)对照，平板中装有经标记的靶细胞的3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，代替抗体溶液（上述第iv点）；
vii)然后，将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟，并于4°C温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬浮液（上述第i点）添加至每个孔以产生效应与靶细胞比率25:1，并将平板在培养箱中在5%CO2气氛下于37°C放置4小时；
ix)收获来自每个孔的无细胞上清液，并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100对每个抗体浓度计算比裂解的百分比，其中ER是对所述抗体浓度量化（参见上述第ix点）的平均放射性，MR是对MR对照（参见上述第v点）量化（参见上述第ix点）的平均放射性，而SR是对SR对照（参见上述第vi点）量化（参见上述第ix点）的平均放射性；
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
可以通过所述抗体的糖工程来获得所述“升高的ADCC”，其意味着通过工程化改造其寡糖组分来增强单克隆抗体的所述天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999)及美国专利No.6,602,684的。
术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指在存在补体的情况中依照本发明的抗体对人肿瘤靶细胞的裂解。优选地，通过在存在补体的情况中用依照本发明的抗CD20抗体处理表达CD20的细胞的制备物来测量CDC。若抗体在浓度100nM时在4小时后诱导20%或更多的肿瘤细胞溶解（细胞死亡），则发现CDC。优选地，用经51Cr或Eu标记的肿瘤细胞及释放的51Cr或Eu测量来实施测定法。对照包括将肿瘤靶细胞与补体但不与抗体一起温育。
通常，IgG1同种型的I型和II型抗CD20抗体显示特征性的CDC特性。彼此相比，I型抗CD20抗体具有升高的CDC（若IgG1同种型），而II型抗CD20抗体具有降低的CDC（若IgG1同种型）。优选地，I型和II型抗CD20抗体两者都是IgG1同种型抗体。
“利妥昔单抗”抗体是一种针对人CD20抗原的遗传工程嵌合含有人γ1鼠恒定域的单克隆抗体。此嵌合抗体含有人γ1恒定域，并且以EP2000149B1（Anderson等，见例如图4和5）中的名称“C2B8”鉴定。利妥昔单抗批准用于治疗复发性或顽固性低级或滤泡性、CD20阳性、B细胞非何杰金氏淋巴瘤患者。体外作用机制研究已经显示了利妥昔单抗展现出人补体依赖性细胞毒性(CDC)（Reff等,Blood 83(2):435-445(1994)）。另外，它在测量抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定法中展现出显著的活性。
术语“人源化B-Ly1抗体”指如WO2005/044859中所披露的人源化B-Ly1抗体，其通过用来自IgG1的人恒定域嵌合化及接着的人源化自鼠单克隆抗CD20抗体B-Ly1（鼠重链可变区(VH)：SEQ ID NO:1；鼠轻链可变区(VL)：SEQ ID NO:2；参见Poppema,S.和Visser,L.,Biotest Bulletin 3:131-139(1987)）获得（参见WO2005/044859）。这些“人源化B-Ly1抗体”详细披露于WO2005/044859中。
优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有选自下组的重链可变区(VH)：SEQ IDNo:3至SEQ ID No:20（WO2005/044859的B-HH2至B-HH9和B-HL8至B-HL17）。特别优选的是Seq.ID No:3、4、7、9、11、13和15（WO2005/044859的B-HH2、B-HH3、B-HH6、B-HH8、B-HL8、B-HL11和B-HL13）。最优选地，所述VH是BHH6。优选地，“人源化B-Ly1抗体”具有WO2005/044859的轻链可变区(VL)SEQ ID No:20(B-KV1)。此外，优选地，人源化B-Ly1抗体是IgG1抗体。优选地，依照记载于WO2005/044859、WO 2004/065540、Umana,P.等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999)及WO 99/154342中的规程在Fc区中糖工程化改造(GE)此类人源化B-Ly1抗体。大多数糖工程人源化B-Ly1抗体在Fc区中具有改变的糖基化样式，优选地具有降低的岩藻糖残基水平。优选的，至少40%或更多（在一个实施方案中，在40%和60%之间，在另一个实施方案中，至少50%，且在又一个实施方案中，至少70%或更多）的Fc区寡糖是非岩藻糖基化的。此外，优选地，Fc区寡糖是两分型的。最优选地，“人源化B-Ly1抗体”包含WO2005/044859的VH B-HH6和VL B-KV1。如本文中所使用的，所述抗体又称为“HuMab<CD20>”。所述抗体命名为INN阿夫土珠(Afutuzumab)。在另一个最优选的实施方案中，所述抗体具有降低水平的岩藻糖残基，如上文所限定的，和/或最优选地，Fc区的寡糖是两分型的。在又一个最优选的实施方案中，所述抗体展现出升高的ADCC，如本文中所限定的。
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定(specific)生物学活性。此类特性可能不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡糖的具体结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用而介导糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并触发不想要的免疫反应。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。
由于哺乳动物细胞以对于人应用最相容的形式糖基化蛋白质的性能，它是用于生成治疗性糖蛋白的优选的宿主(Cumming等,Glycobiology 1:115-30(1991);Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-81(1996))。细菌糖基化蛋白质非常罕见，并且与其它类型的常见宿主，诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样，其产生与自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和（在一些特定的情况中）降低的生物学活性有关的糖基化样式。在哺乳动物细胞中，在过去二十年期间最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在给予合适的糖基化样式外，这些细胞容许遗传稳定的、高生产性克隆细胞系的一致生成。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度，并容许开发安全且可再现的生物工艺。其它通常使用的动物细胞包括幼仑鼠肾(BHK)细胞、NS0-和SP2/0小鼠黑素瘤细胞。新近，还已经测试了自转基因动物的生成。(Jenkins等,Nature Biotechnol.14:975-981(1996))。
所有抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物结构，其中每种同种型拥有独特的一批N连接的碳水化合物结构，其易变地影响蛋白质装配、分泌或功能性活性(Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotech.15:26-32(1997))。根据加工程度，附着的N连接的碳水化合物结构变化得相当大，并且可以包括高甘露糖的、多分支的及双触角的复合寡糖。通常，存在着特定糖基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，使得甚至单克隆抗体以多种糖形存在。同样地，已经显示了细胞系间存在抗体糖基化的重大差异，而且甚至对不同培养条件下培养的给定细胞系看到轻微差异(Lifely,M.R.等,Glycobiology 5(8):813-22(1995))。
一种在维持简单的生产工艺并潜在地避免显著的、不想要的副作用的情况中获得效力大幅升高的方式是通过工程化改造单克隆抗体的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umana,P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999)及美国专利No.6,602,684的。IgG1型抗体（即在癌症免疫疗法中最常使用的抗体）是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely，M.R.等,Glycobiology 5:813-822(1995);Jefferis,R.等,Immunol.Rev.163:59-76(1998);Wright,A.和Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15:26-32(1997))。
先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)（一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶）在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高由工程化改造的CHO细胞生成的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。（见Umana,P.等,Nature Biotechnol.17:176-180(1999);及WO99/154342，在此通过提及而收录其全部内容）。抗体chCE7属于具有高肿瘤亲和力和特异性，但是在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中生产时具有太少的效力以致在临床上无用的一大类未缀合的单克隆抗体(
P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999))。所述研究第一次显示了可以通过工程化改造抗体生成细胞以表达GnTIII来获得ADCC活性的大幅升高，其还导致恒定区(Fc)结合的两分型寡糖（包括两分型非岩藻糖基化寡糖）比例的增加，高于天然存在的抗体中找到的水平。
术语“CD20抗原的表达”意图指示细胞中，优选地在B细胞，更优选地分别来自肿瘤或癌症，优选地非实体瘤的B细胞的细胞表面上的CD20抗原的显著水平的表达。可以通过本领域中已知的标准测定法来确定患有“表达CD20的癌症”的患者。优选地，“CD20抗原的表达”还意图指示细胞中，优选地在B细胞，更优选地自身免疫性疾病的B细胞的细胞表面上的CD20抗原的显著水平的表达。使用例如免疫组织化学(IHC)检测、FACS或者经由相应mRNA的基于PCR的检测来测量CD20抗原表达。
“患者”或“受试者”指患有依照本发明的状况或疾病的任何哺乳动物，且优选的是人。
如本文中所使用的，优选地，术语“表达CD20的癌症”指淋巴瘤（优选地B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)）和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如：(a)滤泡性淋巴瘤、(b)小无核裂细胞淋巴瘤(Small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤（包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤）、(c)边缘区淋巴瘤（包括结外边缘区B细胞淋巴瘤（粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT）、结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤）、(d)套细胞淋巴瘤(MCL)、(e)大细胞淋巴瘤（包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、成免疫细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤）、(f)毛细胞白血病、(g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症、(h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、(i)浆细胞新生物、浆细胞骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和(j)何杰金氏病。
优选地，表达CD20的癌症是B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。表达CD20的癌症的其它例子包括：套细胞淋巴瘤(MCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤、毛细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、边缘区淋巴瘤、移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、HIV相关淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、或原发性CNS淋巴瘤。
如本文中所使用的，“自身免疫性疾病”指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(arthritis)（类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、幼年型类风湿关节炎(juvenile rheumatoid arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)）、银屑病(psoriasis)、皮炎(dermatitis)、多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis)、全身性硬皮病和硬化(systemic scleroderma and sclerosis)、与炎性肠病有关的应答、克罗恩(Crohn)氏病、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome)、成人型呼吸窘迫综合征(adult respiratorydistress syndrome,ARDS)、脑膜炎(meningitis)、脑炎(encephalitis)、葡萄膜炎(uveitis)、结肠炎(colitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、变应性状况、湿疹(eczema)、哮喘(asthma)、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis)、白细胞粘附缺陷(leukocyte adhesion deficiency)、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)、幼发型糖尿病(juvenile onset diabetes)、多发性硬化(multiple sclerosis)、变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病(tuberculosis)、结节病(sarcoidosis)、肉芽肿病(granulomatosis)，包括韦格纳(Wegener)氏肉芽肿病、粒细胞缺乏(agranulocytosis)、血管炎(vasculitis)（包括ANCA）、再生障碍性贫血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血、免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症(autoimmune neutropenia)、全血细胞减少症(pancytopenia)、白细胞减少症(leukopenia)、涉及白细胞渗出的疾病，中枢神经系统(CNS)炎性病症，多器官损伤综合征(multiple organ injury syndrome)、重症肌无力(myastheniagravis)、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病(anti-glomerularbasement membrane disease)、抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibodysyndrome)、变应性神经炎(allergic neuritis)、贝切特(Bechet)病，卡斯尔曼(Castleman)氏综合征，古德帕斯丘(Goodpasture)氏综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、雷诺(Reynaud)氏综合征，斯耶格伦氏(Sjorgen)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，大疱性类天疱疮(pemphigoid bullous)、天疱疮(pemphigus)、自身免疫性多内分泌病(autoimmune polyendocrinopathies)、肾病(nephropathy)、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic throbocytopenic purpura,TTP)、自身免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)、自身免疫性睾丸和卵巢疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症(primary hypothyroidism)；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)、慢性甲状腺炎(chronic thyroiditis)（桥本甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis)）、亚急性甲状腺炎(subacute thyroiditis)、特发性甲状腺功能减退症(idiopathichypothyroidism)、阿狄森(Addison)氏病、格雷夫斯(Graves)氏病、自身免疫性多内分泌腺综合征(autoimmune polyglandular syndromes)（或多腺性I内分泌病综合征）、I型糖尿病，又称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和席汉(Sheehan)氏综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(lymphoid interstitialpneumonitis,HIV)、梗阻性细支气管炎(bronchiolitis obliterans)（非移植物）对NSIP、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre’syndrome)、大血管血管炎(largevessel vasculitis)（包括风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)和巨细胞性（高安(Takayasu)氏）动脉炎）、中血管血管炎(medium vessel vasculitis)（包括川畸(Kawasaki)氏病和结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)）、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、贝格尔(Berger)氏病（IgA肾病）、急进性肾小球肾炎(rapidly progressive glomerulonephritis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliarycirrhosis)、口炎性腹泻(Celiac sprue)（麸质肠病(gluten enteropathy)）、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,AL S)、冠状动脉疾病等。
“生长抑制剂”在本文中使用时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达CD20的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达CD20的细胞的百分比的。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类（长春新碱和长春碱）、紫杉烷(taxane)、和拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷、和博来霉素。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可见“The Molecular Basis ofCancer”，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation,oncogenes,andantineoplastic drugs”，Murakami等(WB Saunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页。
“治疗/处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者。需要治疗的对象包括那些已经患有疾病的对象及那些要预防疾病的对象。因此，本文中要治疗的患者可以已经诊断为患有疾病或者可以有疾病的素因或者对疾病易感。
如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素（例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素）、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烃基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol)，MARINOLTM）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTINTM)、CPT-11（伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSARTM）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1l和加利车霉素ω11（见例如Angew，Chemie Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括ADRIAMYCINTM、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXILTM)、脂质体多柔比星TLC D-99(MYOCETTM)、PEG化的脂质体多柔比星(CAELYXTM)、和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZARTM)、替加氟(tegafur)(UFTORALTM)、卡培他滨(capecitabine)(XELODATM)、埃博霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOLTM)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERETM)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)（其阻止微管蛋白聚合形成微管），包括长春碱(vinblastine)(VELBANTM)、长春新碱(vincristine)(ONCOVINTM)、长春地辛(vindesine)(ELDISINETM)、FILDESINTM)、和长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINETM))；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovovin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)(TARGRETINTM)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如BONEFOSTM或OSTACTM）、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCALTM)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETATM)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAJXTM)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIATM)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELIDTM)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONELTM)；曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPETM疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTINTM疫苗、LEUVECTINTM疫苗和VAXIDTM疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如LURTOTECANTM）；rmRH（例如ABARELIXTM）；BAY439006（索拉非尼(sorafenib)；Bayer）；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂（例如塞来考昔(celecoxib)或依托昔布(etoricoxib)）、蛋白体抑制剂（例如PS341）；保特佐米(bortezomib)(VELCADETM)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(Rl 1577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂诸如奥利默森钠(oblimersen sodium)(GENASENSETM)；pixantrone；EGFR抑制剂（见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（见下文定义）；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法（任选地进一步包含干扰素-
（CHVP/干扰素-
））的缩写）、FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATINTM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）、CVP（环磷酰胺、长春新碱、和泼尼松龙）、MCP（米托蒽醌、苯丁酸氮芥和泼尼松龙）、FC（氟达拉滨和环磷酰胺）、ICE（异环磷酰胺、卡铂、和依托泊苷）、和地塞米松、阿糖胞苷、和顺铂(DHAP)，地塞米松、多柔比星脂质体、和长春新碱(DVD)等。
“抗血管生成剂”指阻断或以一定程度干扰血管形成的化合物。抗血管生成因子可以例如是结合牵涉促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。本文中优选的抗血管生成剂是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如贝伐单抗(AVASTINTM)。
术语“细胞因子”指由一种细胞群体释放的作为细胞间介导物对另一细胞起作用的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素、甲状旁腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素；松弛素原、糖蛋白激素诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和黄体生成素(LH)、肝生长因子；成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子α和β、Mullerian抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素；激活蛋白、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子诸如NGF-β、血小板生长因子；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子-I和-II、红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ、集落刺激因子(CSF)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、和粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素(IL)诸如IL-1,IL-lα,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12，肿瘤坏死因子诸如TNF-α或TNF-β，及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文中所使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
术语“有效量”指提供期望效果的量。在配制剂成分诸如依照本发明的透明质酸酶酶的情况中，有效量是以如下方式提高共施用的抗CD20抗体的分散和吸收，使得抗CD20抗体能以治疗有效方式起作用必需的量，如上文所概述的。在药用药物物质的情况中，它是活性成分有效治疗患者中的疾病的量。在疾病是癌症的情况中，有效量的药物可以降低癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制（即以某种程度减缓且优选地停止）癌细胞浸润入周围器官中；抑制（即以某种程度减缓且优选地停止）肿瘤转移；以某种程度抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻一种或多种与癌症有关的症状。就药物可以阻止生长和/或杀死存在的癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制的和/或细胞毒性的。有效量可以延长无进展存活，产生客观响应（包括部分响应PR或完全响应CR)，增加总体存活时间，和/或改善一种或多种癌症症状。
术语“药物配制剂”指处于使得容许活性成分的生物学活性有效的形式，且不含对于会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。此类配制剂是无菌的。
“无菌”配制剂是无菌的或没有所有活的微生物及其孢子。
“稳定的”配制剂是其中的所有蛋白质在于预期的贮存温度，例如2-8°C贮存后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的配制剂。优选地，配制剂在贮存后基本上保留其物理和化学稳定性，及其生物学活性。一般地，基于配制剂的预期保存期选择贮存期。此外，优选地，配制剂在冷冻（至例如-20°C）和融化配制剂后，例如1或多个循环的冷冻和融化后是稳定的。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述见例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,New York,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.DrugDelivery Rev.10:29-90(1993)。可以于选定的温度对稳定性测量选定的时间段。可以以多种不同方式定性和/或定量评估稳定性，包括评估聚集体形成（例如使用大小排阻层析，通过测量浊度，和/或通过目视检查进行）；使用阳离子交换层析或毛细管区带电泳，评估电荷异质性；SDS-PAGE分析以比较缩小的和完整的抗体；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可以牵涉下列任何一项或多项：聚集、脱酰胺化（例如Asn脱酰胺化）、氧化（例如Met氧化）、异构化（例如Asp异构化）、剪裁(clipping)/水解/片段化（例如铰链区片段化）、琥珀酰亚胺形成、不成对的半胱氨酸等。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合以冻干配制剂或水溶液形式为贮存制备依照本发明使用的抗体的治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对于接收者无毒。
如本文中所使用的，术语“表面活性剂”意指药学可接受表面活性剂。在本发明的配制剂中，表面活性剂的量以重量/体积表述的百分比描述。最常使用的重量/体积单位是mg/mL。药学可接受表面活性剂的合适的例子包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween)、聚乙烯-聚丙二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烃基醚，例如聚氧乙烯单月桂基醚、烃基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer,Pluronic)、和十二烷基硫酸钠(SDS)。最合适的聚氧乙烯山梨聚糖-脂肪酸酯是聚山梨酯20（以商标Tween 20TM出售）和聚山梨酯80（以商标Tween 80TM出售）。最合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是那些以名称
F68或Poloxamer 188TM出售的。优选的聚氧乙烯-硬脂酸酯是那些以商标MyrjTM出售的。最合适的聚氧乙烯烃基醚是那些以商标BrijTM出售的。最合适的烃基酚聚氧乙烯醚以商标Triton-X出售。
如本文中所使用的，术语“缓冲液”意指药学可接受缓冲液。如本文中所使用的，术语“提供pH 5.5±2.0的缓冲剂”指通过其酸/碱共轭组分的作用提供包含其的溶液抵抗pH变化的试剂。依照本发明的合适的药学可接受缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、葡糖酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液、和磷酸盐缓冲液。优选的缓冲液包含L-组氨酸或L-组氨酸与盐酸L-组氨酸的混合物，其具有等张剂和用本领域中已知的酸或碱的潜在pH调节。最优选的是L-组氨酸。
“组氨酸缓冲液”是包含氨基酸组氨酸的缓冲液。组氨酸缓冲液的例子包括盐酸组氨酸、乙酸组氨酸、磷酸组氨酸、硫酸组氨酸。发现本文中的例子中鉴定的优选组氨酸缓冲液是盐酸组氨酸。在一个优选的实施方案中，通过用稀释的氢氯酸滴定L-组氨酸（游离碱，固体）或者通过以限定的量和比率溶解L-组氨酸和盐酸L-组氨酸（例如以一水合物形式）来制备盐酸组氨酸缓冲液。
“等张的”意指感兴趣的配制剂与人血液具有基本上相同的渗透压。等张配制剂一般会具有约300mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。可以使用蒸汽压或凝固点降低型渗压计来测量等渗压性。
如本文中所使用的，术语“等张剂”意指药学可接受等张剂。使用等张剂来提供等张配制剂。等张配制剂是液体或自固体形式，例如冻干形式重建的液体，并且意指与其比较的一些其它溶液，诸如生理盐溶液和血清具有相同张力的溶液。合适的等张剂包括但不限于盐，包括但不限于氯化钠(NaCl)或氯化钾、糖类和糖醇，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、海藻糖或甘油和来自下组的任何组分：氨基酸、糖类、盐和其组合。等张剂一般以约5mM至约350mM的总量使用。
如本文中与依照本发明的配制剂结合使用的术语“液体”意指温度为至少约2至约8°C时为液体的配制剂。
如本文中与依照本发明的配制剂结合使用的术语“冻干的”意指如下干燥的配制剂，即冷冻配制剂，然后通过本领域中已知的任何冷冻-干燥方法，例如商品化的冷冻-干燥装置自冷冻内容物升华冰。
如本文中所使用的，“盐”意指约1mM至约500mM量的盐。盐的非限制性例子包括阳离子钠、钾、钙或镁与阴离子氯、磷酸根、柠檬酸根、琥珀酸根、硫酸根的任何组合的盐或其混合物。
如本文中所使用的，术语“氨基酸”意指约1至约100mg/mL量的氨基酸，包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和脯氨酸。
本文中的“糖类”包含通用组成(CH2O)n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原糖、非还原糖等。本文中糖类的例子包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、右旋糖苷、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇(sylitol)、山梨糖醇、甘露糖醇、蜜二糖(mellibiose)、松三糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖(stachyose)、麦芽糖、乳酮糖(lactulose)、麦芽酮糖(maltulose)、葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异麦芽酮糖等。依照本发明的定义中还包括葡糖胺、N-甲基葡糖胺（所谓的“甲葡胺”）、半乳糖胺和神经氨酸及依照本发明的糖类的组合。本文中的优选的糖类是非还原性二糖类，诸如海藻糖或蔗糖。依照本发明的最优选的糖类是海藻糖。
术语“稳定剂”指药学可接受稳定剂，如例如但不限于如上文部分中所描述的氨基酸和糖及如本领域中已知的任何种类和分子量的商品化右旋糖苷。
术语“抗氧化剂”意指药学可接受抗氧化剂。这可以包括赋形剂诸如甲硫氨酸、苯甲醇或用于使氧化最小化的任何其它赋形剂。
术语“治疗方法”或其等同用语在应用于例如癌症时指为了减少或消除患者中癌细胞数目，或为了减轻癌症症状而设计的规程或作用过程。“治疗癌症或另一种增殖性病症的方法”不必意指癌细胞或其它病症实际上会得到消除，细胞数目或病症实际上会得到降低，或癌症或其它病症的症状实际上会得到减轻。经常，即使成功概率较低也会实施治疗癌症的方法，但是鉴于患者的医学史和估计的存活期望，其仍然被认为诱导总体有益的作用过程。
因此，本发明要解决的问题是提供药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的供皮下注射的新颖的高度浓缩的稳定的药物配制剂。在较高量的抗CD20抗体或其混合物外，此类配制剂包含缓冲剂、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物、非离子型表面活性剂和优选地有效量的至少一种透明质酸酶酶。高度浓缩的抗体配制剂的制备是有挑战性的，这是由于较高蛋白质浓度的粘性的潜在升高和蛋白质聚集的潜在升高，即一种本质上浓度依赖性的现象。高粘性负面地影响抗体配制剂的工艺能力（例如，抽吸和过滤步骤）和施用（例如注射器能力）。通过添加赋形剂，可以在一些情况中降低高粘性。对蛋白质聚集的控制和分析越来越多有挑战。在制造工艺的各个步骤（其包括发酵、纯化、配制）期间和贮存期间潜在地遇到聚集。不同因素，诸如温度、蛋白质浓度、搅动应力、冷冻和融化、溶剂和表面活性剂效应、和化学修饰可以影响治疗性蛋白质的聚集行为。在高度浓缩的抗体配制剂的开发期间，必须监测蛋白质的聚集趋势，并通过添加各种赋形剂和表面活性剂来控制[Kiese S.等,J.Pharm.Sci.,2008;97(10);4347-4366]。
在第一方面，本发明提供了药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的供胃肠外应用的高度浓缩的稳定的药物配制剂。优选地，应用的路径是静脉内施用，作为推注或者通过在一段时间里连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、或鞘内路径。抗体的静脉内或皮下施用是优选的；皮下注射是最优选的。如上文所列出的，生成CD20抗体的高度浓缩的、稳定的药物配制剂（其基本上不含颗粒）是很不平凡的。若所述配制剂意图进行皮下应用，则在一个优选的实施方案中，所述配制剂与透明质酸酶酶组合。
更特别地，本发明的药学活性抗CD20抗体配制剂的高度浓缩的、稳定的药物配制剂包含：
-约20至350mg/ml抗CD20抗体；
-约1至100mM提供pH 5.5±2.0的缓冲剂；
-约1至500mM稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物，其中任选地，使用甲硫氨酸作为第二稳定剂，优选地，浓度为5至25mM；
-0.01至0.1%非离子型表面活性剂；和
-优选地，有效量的至少一种透明质酸酶酶。
本发明的药学活性抗CD20抗体配制剂的高度浓缩的、稳定的药物配制剂可以以液体形式提供或者可以以冻干形式提供。可以通过重建冻干配制剂以提供比冻干步骤前的混合物中的蛋白质浓度大大约2-40倍的重建配制剂中的蛋白质浓度来提高重建的配制剂中的抗体浓度。
优选的抗CD20抗体浓度是50至150mg/ml，更优选的是75至150mg/ml，甚至更优选的是120±20mg/ml，最优选的是约120mg/ml。
缓冲剂的优选的浓度是1至50mM，更优选的是10至30mM；最优选的浓度是约20mM。各种缓冲剂是本领域技术人员已知的，如上文所概述的。优选的缓冲剂选自下组：组氨酸缓冲液、乙酸缓冲液、和柠檬酸缓冲液，最优选的是L-组氨酸/HCl缓冲液。以约1mM至约50mM，优选地约10mM至约30mM，且还更优选地约20mM的量使用依照本发明的组氨酸缓冲液。依照本发明的乙酸缓冲液优选的是约10mM至约30mM，且最优选的是约20mM。依照本发明的柠檬酸缓冲液优选的是约10mM至约30mM，且最优选的是约20mM。
与所使用的缓冲液无关，会以某个数值调节pH，所述数值包含约4.5至约7.0，且优选地，约5.5至约6.5，还优选地选自下组：5.5、6.0、6.1和6.5。可以通过用本领域中已知的酸或碱调节或者通过使用适当的缓冲液组分的混合物或这两者来获得此pH。
优选地，稳定剂（在本专利说明书中与术语“稳定化剂”同义使用）选自下组：盐、碳水化合物、糖类和氨基酸，更优选地碳水化合物或糖类，更优选地权力机构准许作为药物配制剂中的合适添加剂或赋形剂的糖，最优选地选自下组：二水合α,α-海藻糖、NaCl和甲硫氨酸。稳定剂的优选浓度是15至250mM，或更优选地150至250mM。最优选的是约210mM的浓度。配制剂可以含有第二稳定剂，其中优选地，此第二稳定剂是甲硫氨酸，优选地浓度为5至25mM，更优选地浓度为5至15mM。最优选的甲硫氨酸浓度是约10mM。
优选地，非离子型表面活性剂是聚山梨酯，更优选地，其选自下组：聚山梨酯20、聚山梨酯80和聚乙烯-聚丙烯共聚物。非离子型表面活性剂的浓度是0.01至0.1%(w/v)、或0.02至0.08%(w/v)，且优选地0.02至0.06%(w/v)、最优选地约0.06%(w/v)。
如本文中所使用的，术语“糖”意指以约25mM至约500mM的量使用的药学可接受糖。优选的是100至300mM。更优选的是180至240mM。最优选的是210mM。
透明质酸酶酶的浓度取决于依照本发明的配制剂的制备中使用的实际透明质酸酶酶。基于下文进一步的公开内容，本领域技术人员可以容易地确定透明质酸酶酶的有效量。它应当以足够量提供，使得共施用的抗CD20抗体的分散和吸收升高是有可能的。优选地，透明质酸酶酶的有效量是约1’000至16’000个U/ml，其中基于假定的比活性100’000个U/mg，所述量对应于约0.01mg至0.15mg蛋白质。透明质酸酶酶的优选浓度是约1’500至12’000个U/ml。最优选的是约2’000个U/ml或约12’000个U/ml的浓度。前文规定的量对应于最初对配制剂添加的透明质酸酶酶量。透明质酸酶酶以组合的最终配制剂存在或者供共施用使用，例如作为如下文进一步概述的共配制剂。所要求保护的配制剂的重要问题是在它准备好使用和/或注射时，它具有所要求保护的组成。
透明质酸酶酶可以自动物、人样品衍生或者基于重组DNA技术来制造，如下文进一步描述的。
更特别地，依照本发明的高度浓缩的、稳定的药物配制剂具有下列优选的组成之一：
a)100至150mg/ml抗CD20抗体，其中优选地，此抗体是利妥昔单抗、Ocrelizumab或HuMab<CD20>；1至50mM组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl（pH为约5.5）；15至250mM稳定剂，其优选的是二水合α,α-海藻糖和任选地浓度5至25mM的甲硫氨酸作为第二稳定剂；选自下组的非离子型表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80，优选地0.02至0.06%(w/v)，和任选地1’000至16’000个U/ml透明质酸酶酶，优选的是rHuPH20，最优选的是浓度为2’000个U/ml或12’000个U/ml。
b)120±20mg/ml抗CD20抗体，其中优选地，此抗体是利妥昔单抗、Ocrelizumab或HuMab<CD20>；10至30mM，优选地20mM组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl（pH为约5.5）；150至250mM，优选地210mM稳定剂，其优选的是二水合α,α-海藻糖和任选地浓度5至25mM，优选地5至15mM，最优选地10mM的甲硫氨酸作为第二稳定剂；选自下组的非离子型表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80，优选地0.02至0.06%(w/v)，和任选地1’000至16’000个U/ml，优选地1’500至12’000个U/ml，最优选地2’000个U/ml或12’000个U/ml透明质酸酶酶，优选的是rHuPH20。
c)120mg/ml抗CD20抗体，其中优选地，此抗体是利妥昔单抗、Ocrelizumab或HuMab<CD20>；10至30mM，优选地20mM组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl（pH为约5.5）；150至250mM，优选地210mM稳定剂，其优选的是二水合α,α-海藻糖和任选地浓度5至25mM，优选地5至15mM，最优选地10mM的甲硫氨酸作为第二稳定剂；选自下组的非离子型表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80，优选地0.02至0.06%(w/v)，和任选地1’000至16’000个U/ml，优选地1’500至12’000个U/ml，最优选地2’000个U/ml或12’000个U/ml透明质酸酶酶，优选的是rHuPH20。
d)120mg/ml抗CD20抗体，优选地利妥昔单抗；20mM组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl（pH为约5.5）；210mM二水合α,α-海藻糖和任选地10mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；选自下组的非离子型表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80，优选地0.02至0.06%(w/v)，和任选地2’000个U/ml或12’000个U/ml透明质酸酶酶，优选的是rHuPH20。
e)冻干配制剂，其包含120mg/ml抗CD20抗体，优选的是利妥昔单抗；20mM组氨酸缓冲液，优选地L-组氨酸/HCl（pH为约5.5）；210mM二水合α,α-海藻糖和任选地10mM甲硫氨酸作为第二稳定剂；选自下组的非离子型表面活性剂：聚山梨酯20和聚山梨酯80，优选地0.02至0.06%(w/v)，和任选地2’000个U/ml或12’000个U/ml透明质酸酶酶，优选的是rHuPH20。
提供了药学活性抗CD20抗体的稳定的药物配制剂，其包含约30mg/ml至350mg/ml，例如约30mg/ml至100mg/ml（包括约30mg/ml、约50mg/ml或约100mg/ml）Ocrelizumab（例如人源化2H7.v16）；约1至100mM提供pH 5.5±2.0（例如pH 5.3）的缓冲剂（例如乙酸钠）；约15至250mM稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物（包括海藻糖，例如约8%二水合海藻糖）；约0.01至0.1%(w/v)非离子型表面活性剂；和任选地有效量的至少一种透明质酸酶酶（例如rhHUPH20），优选地其量为约1,500个U/ml至约12,000个U/ml。
实施例中给出了优选的配制剂的备选组成。
已经提出了通过使用少量可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)来促进治疗性蛋白质和抗体的皮下注射；见WO2006/091871。已经显示了，此类可溶性透明质酸酶糖蛋白（作为组合的配制剂或者通过共施用）的添加促进对下皮施用治疗性药物。通过快速解聚胞外空间中的乙酰透明质酸HA，sHASEGP降低间质的粘性，由此提高水力传导，并且容许安全且舒适地将较大体积施用入皮下组织中。经由降低的间质粘性由sHASEGP诱导的升高的水力传导容许更大的分散，这潜在地提高SC施用的治疗性药物的系统生物利用度。
因此，包含可溶性透明质酸酶糖蛋白的本发明的高度浓缩的稳定的药物配制剂特别适合于皮下注射。本领域技术人员清楚地理解，可以提供包含抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白的此类配制剂来以一种单一组合配制剂形式或备选地以可以在临皮下注射前混合的两种分开的配制剂形式施用。或者，可以将抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白以分开注射在身体的不同部位，优选地在彼此紧密相邻的部位施用。也有可能以连续注射形式注射依照本发明的配制剂中存在的治疗剂，例如首先是可溶性透明质酸酶糖蛋白，接着注射抗CD20抗体配制剂。这些注射也可以以相反的次序实施，即通过首先注射抗CD20抗体配制剂，接着注射可溶性透明质酸酶糖蛋白来进行。在以分开注射施用抗CD20抗体和可溶性透明质酸酶糖蛋白的情况中，必须给蛋白质中的一种或两者提供如所附权利要求书中所规定浓度的缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂，但是排除透明质酸酶酶。然后，可以在例如L-组氨酸/HCl缓冲液（pH为约6.5）、100至150mM NaCl和0.01至0.1%(w/v)聚山梨酯20或聚山梨酯80中提供透明质酸酶酶。在一个优选的实施方案中，以如所附权利要求书中规定的浓度给抗CD20抗体提供缓冲剂、稳定剂和非离子型表面活性剂。
如上文记录的，可以认为可溶性透明质酸酶糖蛋白是抗CD20配制剂中的别的赋形剂。可溶性透明质酸酶糖蛋白可以在制造抗CD20配制剂时添加至抗CD20配制剂或者可以在注射前不久添加。或者，可以以分开注射提供可溶性透明质酸酶糖蛋白。在后一种情况中，可溶性透明质酸酶糖蛋白可以在分开的管形瓶中冻干形式提供，在皮下注射发生前必须用合适的稀释剂重建，或者可以由制造商以液体配制剂提供。抗CD20配制剂和可溶性透明质酸酶糖蛋白可以以分开的实体获得或者也可以以包含注射组分两者和关于其皮下施用的指令的试剂盒提供。还可以提供适合于重建和/或施用配制剂中的一种或两者的合适指令。
因此，本发明还以包含注射组分两者和关于其皮下施用的合适指令的试剂盒形式提供了药物组合物，其由药学活性抗CD20抗体或此类抗体的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂和合适量的至少一种透明质酸酶酶组成。
本发明的又一方面涉及包含依照本发明的高度浓缩的稳定的药物配制剂的注射装置。此类配制剂可以由药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物和如下文所概述的合适的赋形剂组成，并且另外可以包含可溶性透明质酸酶糖蛋白作为组合配制剂或作为共施用的分开配制剂。
多种抗CD20抗体是现有技术中已知的。优选地，此类抗体是单克隆抗体。它们可以是所谓的嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。它们可以是全长抗CD20抗体；具有相同生物学活性的抗CD20抗体片段；包括此类抗体或片段的氨基酸序列变体和/或糖基化变体。人源化抗CD20抗体的例子以INN名称利妥昔单抗、Ocrelizumab和阿夫土珠(Afutuzumab)(HuMab<CD20>)已知。最成功的治疗性抗CD20抗体是由Genentech Inc.和F.Hoffmann-La RocheLtd以商品名MABTHERATM或RITUXANTM出售的利妥昔单抗。
优选地，如本文中所限定的抗CD20抗体选自下组：利妥昔单抗（见例如Anderson等的美国专利No.7,381,560和EP2000149B1，见例如图4和5）、Ocrelizumab（如WO 2004/056312中所披露的）和WO 2006/084264（例如表1和2中所披露的变体），优选的是变体v.16或v.114或v.511和阿夫土珠（HuMab<CD20>；见WO2005/044859）。最优选的抗CD20抗体是利妥昔单抗。术语“利妥昔单抗”、“Ocrelizumab”和“阿夫土珠”(HuMab<CD20>)涵盖满足在选自美国、欧洲和日本的国家或地区中获得作为相同或生物相似产品的销售授权必需的要求的所有相应抗CD20抗体。利妥昔单抗具有美国专利No.7,381,560和EP2000149B1中限定的CDR区。
许多可溶性透明质酸酶糖蛋白是现有技术中已知的。为了进一步限定此类可溶性透明质酸酶糖蛋白的功能、作用机制和特性，提供了以下背景信息。
SC（皮下）间质基质由糖胺聚糖的粘弹性凝胶内包埋的纤维状蛋白质的网络构成。乙酰透明质酸(HA)，即一种非硫酸化重复线性二糖是SC组织的主要糖胺聚糖。HA由成纤维细胞以一种高分子量兆道尔顿粘性聚合物分泌入间质中，随后，其局部地，在淋巴中、及在肝中经由溶酶体透明质酸酶和外切糖苷酶的作用降解。身体中的约50%乙酰透明质酸是由SC组织生成的，其中它以约0.8mg/gm湿重组织找到[Aukland K.和Reed R.,“Interstitial-Lymphatic Mechanisms in the control of Extracellular Fluid Volume”,Physiology Reviews”,1993;73:1-78]。估计平均70kg成人含有15克HA，其中每天周转（合成和降解）30%[Laurent L.B.等,“Catabolism of hyaluronan inrabbit skin takes place locally,in lymph nodes and liver”,Exp.Physiol.1991;76:695-703]。作为皮下基质的凝胶样组分的主要成分，HA显著促成其粘性。
糖胺聚糖(GAG)是胞外基质(ECM)的复杂线性多糖。GAG以N-取代的己糖胺和糖醛酸（在乙酰透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、软骨素(C)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、和肝素(H)的情况中），或半乳糖（在硫酸角质素(KS)的情况中）的重复二糖结构为特征。除了HA外，所有都以与核心蛋白共价结合方式存在。GAG及其核心蛋白在结构上称为蛋白聚糖(PG)。
在哺乳动物中，主要在结缔组织、皮肤、软骨中，及在滑液中找到乙酰透明质酸(HA)。乙酰透明质酸也是眼的玻璃体的主要组分。在结缔组织中，与乙酰透明质酸有关的水合水产生组织间的水合基质。乙酰透明质酸在与细胞运动性有关的生物学现象，包括快速发育、再生、修复、胚胎发生、胚胎学发育、伤口愈合、血管发生、和肿瘤发生中发挥关键的作用(Toole,Cell Biol.Extracell.Matrix,Hay(编),Plenum Press,New York,1991;第1384页-第1386页;Bertrand等,Int.J.Cancer 1992;52:1-6;Knudson等,FASEB J.1993;7:1233-1241]。另外，乙酰透明质酸水平与肿瘤攻击性相关联[Ozello等,CancerRes.1960;20:600-604;Takeuchi等,Cancer Res.1976;36:2133-2139;Kimata等,Cancer Res.1983;43:1347-1354]。
在许多细胞的胞外基质中，特别地在软结缔组织中找到HA。已经给HA分配各种生理学功能，诸如在水和血浆蛋白质稳态中[Laurent T.C.等,FASEBJ.,1992;6:2397-2404]。HA生成在增殖细胞中增加，并且可以在有丝分裂中发挥作用。它还已经牵涉移动和细胞迁移。HA似乎在细胞调节、发育、和分化中发挥重要的作用[Laurent等,见上文]。
已经在临床医学中广泛使用HA。其组织保护和流变学特性已经证明为可用于眼科手术（例如以在白内障手术期间保护角膜内皮）。血清HA是肝疾病和各种炎性状况，诸如类风湿性关节炎的诊断。由HA积累引起的间质水肿可以引起各个器官的功能障碍[Laurent等,见上文]。
乙酰透明质酸蛋白质相互作用也牵涉胞外基质或“基质”的结构。
透明质酸酶是遍及动物界找到的一组一般中性或酸性活性酶。透明质酸酶就底物特异性和作用机制而言有所变化(WO 2004/078140)。存在着三大类透明质酸酶：
1.哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，其是以四糖和六糖作为主要终产物的内切-β-N-乙酰基己糖胺酶。它们具有水解和转糖苷酶活性两者，并且可以降解乙酰透明质酸和硫酸软骨素(CS)，一般地C4-S和C6-S。
2.细菌透明质酸酶(EC 4.2.99.1)降解乙酰透明质酸及以各种程度降解CS和DS。它们是内切-β-N-乙酰基己糖胺酶，其通过主要生成二糖终产物的β消除反应运行。
3.来自水蛭、其它寄生物、和甲壳动物的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)是经由水解β1-3连接生成四糖和六糖终产物的内切-β-葡糖醛酸糖苷酶。
哺乳动物透明质酸酶可以进一步分成两组：中性活性和酸性活性酶。人基因组中存在着6种透明质酸酶样基因，即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是一种假基因，并且尚未显示HYAL3拥有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4是一种软骨素酶，并且展现出很少的针对乙酰透明质酸的活性。HYAL1是原型酸性活性酶，而PH20是原型中性活性酶。一般地，酸性活性透明质酸酶，诸如HYAL1和HYAL2在中性pH（即pH 7）缺乏催化活性。例如，HYAL1在体外超过pH 4.5具有很少的催化活性[Frost I.G.和Stern,R.,“A microtiter-based assay for hyaluronidase activity notrequiring specialized reagents”,Anal.Biochemistry,1997;251:263-269]。HYAL2是一种在体外具有非常低的比活性的酸性活性酶。
透明质酸酶样酶也可以以那些一般经由糖基磷脂酰肌醇锚锁定质膜的酶，诸如人HYAL2和人PH20[Danilkovitch-Miagkova等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003;100(8):4580-4585;Phelps等,Science 1988;240(4860):1780-1782]，和那些一般可溶的酶，诸如人HYAL1[Frost,I.G.等,“Purification,cloning,andexpression of human plasma hyaluronidase”,Biochem.Biophys.Res.Commun.1997;236(l):10-15]为特征。然而，存在着物种间的变化：例如牛PH20非常松散地附着于质膜，并且没有经由磷脂酶敏感性锚来锚定[Lalancette等,Biol.Reprod.,2001;65(2):628-36]。牛透明质酸酶的此独特特征已经容许使用可溶性牛睾丸透明质酸酶酶作为临床使用的提取物(WydaseTM,HyalaseTM)。其它PH20种类是脂质锚定的酶，其一般在不使用去污剂或脂肪酶的情况中是不可溶的。例如，人PH20经由GPI锚而锚定于质膜。尝试生成人PH20，不会将脂质锚引入多肽中的DNA构建体生成无催化活性的酶，或不溶性的酶[Arming等,Eur.J.Biochem.,1997;1;247(3):810-4]。以可溶性和膜结合形式两者找到天然存在的弥猴精子透明质酸酶。虽然64kDa膜结合形式在pH 7.0拥有酶活性，但是54kDa形式仅在pH 4.0有活性[Cherr等,Dev.Biol.,1996;10;175(l):142-53]。如此，PH20的可溶性形式经常在中性条件下缺乏酶活性。
如上文所记录的且依照WO2006/091871和美国专利No.7,767,429中的教导，可以将少量可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)引入配制剂中以便于将治疗性药物施用入下皮中。通过快速解聚胞外空间中的HA，sHASEGP降低间质的粘性，由此提高水力传导，并且容许安全且舒适地将较大体积施用入SC组织中。经由降低的间质粘性由sHASEGP诱导的升高的水力传导容许更大的分散，这潜在地提高SC施用的治疗性药物的系统生物利用度。
在下皮中注射时，sHASEGP对HA的解聚定位于SC组织中的注射部位。实验证据显示sHASEGP在小鼠中以半衰期13至20分钟在间质空间中局部失活，在CD-1小鼠中静脉内单剂后在血液中没有可检出的系统吸收。在血管区室内，sHASEGP在多至0.5mg/kg剂量的情况中在小鼠和猕猴中分别表明2.3和5分钟的半衰期。与HA底物在SC组织中的连续合成组合，sHASEGP快速清除导致其它共注射分子的瞬时的且局部有活性的渗透增强，该效应在施用后24至48小时内完全可逆[Bywaters G.L.等,“Reconstitution of the dermalbarrier to dye spread after Hyaluronidase injection”,Br.Med.J.,1951;2(4741):1178-1183]。
在其对局部液体分散的影响外，sHASEGP还充当吸收增强剂。大于16千道尔顿(kDa)的大分子大多排除在经由扩散通过毛细管的吸收之外，并且大多经由引流淋巴结吸收。因此，皮下施用的大分子，诸如例如治疗性抗体（分子量约150kDa）必须穿过间质基质，之后到达引流淋巴系统，随后吸收入血管区室中。通过提高局部分散，sHASEGP增加许多大分子的吸收速率(Ka)。相对于在没有sHASEGP的情况中的SC施用，这导致升高的峰血液水平(Cmax)，而且潜在地导致升高的生物利用度[Bookbinder L.H.,等,“Arecombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics”,J.Control.Release 2006;114:230-241]。
动物起源的透明质酸酶产品已经在临床上使用超过60年，主要用于提高其它共施用的药物的分散和吸收及用于皮下输液（大体积的流体的SC注射/输注）[Frost G.I.,“Recombinant human hyaluronidase(rHuPH20):an enablingplatform for subcutaneous drug and fluid administration”,Expert Opinion onDrug Delivery,2007;4:427-440]。关于透明质酸酶作用机制的详情已经详细记载于下列出版物：Duran-Reynolds F.，“A spreading factor in certain snakevenoms and its relation to their mode of action”,CR Soc Biol Paris,1938;69-81;Chain E.,“A mucolytic enzyme in testes extracts”,Nature 1939;977-978;Weissmann B.,“The transglycosylative action of testicular hyaluronidase”,J.Biol.Chem.,1955;216:783-94;Tammi,R.,Saamanen,A.M.,Maibach,H.I.,Tammi M.,“Degradation of newly synthesized high molecular mass hyaluronanin the epidermal and dermal compartments of human skin in organ culture”,J.Invest.Dermatol.1991;97:126-130;Laurent,U.B.G.,Dahl,L.B.,Reed,R.K.,“Catabolism of hyaluronan in rabbit skin takes place locally,in lymph nodes andliver”,Exp.Physiol.1991;76:695-703;Laurent,T.C.和Fraser,J.R.E.,“Degradation of Bioactive Substances:Physiology and Pathophysiology”,Henriksen,J.H.(Ed)CRC Press,Boca Raton,FL;1991.第249页-第265页;Harris,E.N.等,“Endocytic function,glycosaminoglycan specificity,and antibodysensitivity of the recombinant human 190-kDa hyaluronan receptor forendocytosis(HARE)”,J.Biol.Chem.2004;279:36201-36209;Frost,G.I.,“Recombinant human hyaluronidase(rHuPH20):an enabling platform forsubcutaneous drug and fluid administration”,Expert Opinion on Drug Delivery,2007;4:427-440。在EU国家得到批准的透明质酸酶产品包括
“Dessau”和
在美国得到批准的动物起源的透明质酸酶产品包括VitraseTM、HydaseTM、和AmphadaseTM。
已经广泛建立了透明质酸酶产品的安全性和功效。所鉴定的最重大的安全性风险是超敏感性和/或变应原性，认为其与动物衍生的制备物的纯度缺乏相关[Frost,G.I.,“Recombinant human hyaluronidase(rHuPH20):an enablingplatform for subcutaneous drug and fluid administration”,Expert Opinion onDrug Delivery,2007;4:427-440]。应当注意，在英国、德国与美国间就动物衍生的透明质酸酶的批准剂量而言有差异。在英国，作为皮下或肌肉内注射佐剂的常用剂量是对注射直接添加的1500个单位。在美国，出于此目的使用的常用剂量是150个单位。在皮下输液中，使用透明质酸酶来帮助相对大体积的流体的皮下施用。在英国，一般以皮下使用的每500至1000ml流体给予1500个单位的透明质酸酶。在美国，认为150个单位对于每升皮下输液溶液是足够的。在德国，认为150至300个单位对于此目的是足够的。在英国，通过添加1500个单位来加速局部麻醉剂的扩散。在德国和美国，认为150个单位对于此目的是足够的。虽然有剂量差异（在英国的剂量比在美国高10倍），但是尚无报告分别在美国和英国销售的动物衍生的透明质酸酶产品的安全性概况明显差异。
在2005年12月2日，Halozyme Therapeutics Inc.收到来自FDA的关于重组人透明质酸酶rHuPH20(HYLENEXTM)的可注射配制剂的批准。FDA批准150个单位的剂量的HYLENEXTM用于下列适应症的SC施用：
-作为佐剂以提高其它注射药物的吸收和分散
-用于皮下输液
-作为SC尿路造影术中的辅助物以改善不透射线剂的吸收。
作为所述管理审阅的一部分，建立的是，rHuPH20拥有与先前批准的动物衍生的透明质酸酶制备物相同的增强其它注射药物分散和吸收的特性，但是具有改善的安全性概况。具体地，与动物衍生的透明质酸酶相比，重组人透明质酸酶(rHuPH20)的使用使被动物病原体污染和传染性海绵状脑病的潜在风险最小化。
可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、其制备方法及其在药物组合物中的用途已经记载于WO 2004/078140。
如下文进一步概述的详细实验工作已经显示了，令人惊讶地，所要求保护的配制剂具有有利的贮存稳定性，而且满足健康权力机构批准的所有必需要求。
认为依照本发明的配制剂中的透明质酸酶酶增强抗CD20抗体对系统循环的投递，例如通过增加活性物质的吸收来实现（它充当渗透增强剂）。认为透明质酸酶酶还通过可逆水解乙酰透明质酸（即SC间质组织的一种胞外组分）来提高治疗性抗CD20抗体经由皮下应用路径对系统循环的投递。下皮中的乙酰透明质酸水解暂时打开SC组织的间质空间中的通道，并且由此改善治疗性抗CD20抗体对系统循环的投递。另外，施用显示了人的疼痛降低和SC组织的体积衍生的肿胀较小。
透明质酸酶在局部施用时在局部具有其全部效应。换言之，透明质酸酶在数分钟中局部失活并代谢，而且尚未注意到具有系统或长期效应。在透明质酸酶进入血流时它在数分钟内快速失活排除在不同透明质酸酶产品间实施可比较的生物分布研究的实际能力。此特性还使任何潜在的系统安全性忧虑最小化，这是因为透明质酸酶产品不能在远离的部位起作用。
依照本发明的所有透明质酸酶酶的统一特征是其解聚乙酰透明质酸的能力，不管化学结构、物种来源、组织来源、或源自相同物种和组织的药物产品的批次的差异。它们的与众不同之处在于如下的实情，尽管具有不同结构，它们的活性是相同的（除了效力外）。
依照本发明的配制剂的透明质酸酶酶以对本文中所描述的稳定的药物配制剂中的抗CD20抗体的分子完整性没有不利影响为特征。此外，透明质酸酶酶仅仅修饰抗CD20抗体对系统循环的投递，但是不拥有可以提供或促成系统吸收的抗CD20抗体的治疗效果的任何特性。透明质酸酶酶不是可系统性生物利用的，并且在依照本发明的稳定的药物配制剂的推荐贮存条件没有不利地影响抗CD20抗体的分子完整性。因此，它被认为是依照本发明的抗CD20抗体配制剂中的赋形剂。因为它不施加治疗效果，所以它代表除治疗活性抗CD20抗体外的药学形式组分。
依照本发明的许多合适的透明质酸酶酶自现有技术已知。优选的酶是人透明质酸酶酶，最优选地称为rHuPH20的酶。rHuPH20是通过水解N-乙酰基葡糖胺的C1位置与葡糖醛酸的C4位置间的β-1,4连接来解聚乙酰透明质酸的中性和酸性活性β-1,4糖基水解酶家族成员。乙酰透明质酸是一种在结缔组织，诸如皮下间质组织，和某些特化组织，诸如脐带和玻璃体液的胞内基质中找到的多糖。乙酰透明质酸的水解暂时地降低间质组织的粘性，并且促进注射流体或局部漏出液或渗出物的分散，如此便于其吸收。透明质酸酶的效果是局部的，并且在24至48小时内发生的组织乙酰透明质酸完全重建的情况中可逆[Frost,G.I.,“Recombinant human hyaluronidase(rHuPH20):an enablingplatform for subcutaneous drug and fluid administration”,Expert Opinion onDrug Delivery,2007;4:427-440]。经由水解乙酰透明质酸的结缔组织渗透性升高与透明质酸酶在其提高共施用分子的分散和吸收能力方面的功效相关联。
人基因组含有数种透明质酸酶基因。仅PH20基因产物拥有生理学胞外条件下的有效透明质酸酶活性，并且充当铺展剂，而酸性活性透明质酸酶没有此特性。
rHuPH20是目前可用于治疗用途的第一种且唯一的重组人透明质酸酶酶。人基因组含有几种透明质酸酶基因；仅PH20基因产物拥有生理学胞外条件下的有效透明质酸酶活性，并且充当扩散剂。天然存在的人PH20蛋白具有将其锚定于质膜的附着于羧基端氨基酸的脂质锚。由Halozyme开发的rHuPH20酶是一种截短的删除变体，其缺乏负责脂质附着的羧基端的此类氨基酸。这生成与牛睾丸制备物中找到的蛋白质相似的可溶性中性pH活性酶。rHuPH20蛋白与35个氨基酸的信号肽一起合成，所述信号肽在分泌过程期间自N端除去。成熟的rHuPH20蛋白含有与一些牛透明质酸酶制备物中找到的N端氨基酸序列直向同源的真实N端氨基酸序列。
PH20透明质酸酶（包括动物衍生的PH20和重组人rHuPH20）通过水解N-乙酰基葡糖胺的C1位置与葡糖醛酸的C4位置间的β-1,4连接来解聚乙酰透明质酸。四糖是最小的消化产物[Weissmann,B.,“The transglycosylative actionof testicular hyaluronidase”,J.Biol.Chem.,1955;216:783-94]。此N-乙酰基葡糖胺/葡糖醛酸结构未在重组生物学产物的N连接的聚糖中找到，并且因此，rHuPH20不会影响与其一起配制的抗体，诸如例如利妥昔单抗的糖基化。rHuPH20酶自身拥有每个分子6个N连接的聚糖，其中核心结构与单克隆抗体中找到的核心结构相似。如预期的，这些N连接的结构不随时间变化，确认rHuPH20对这些N-连接的聚糖结构的酶活性的缺乏。rHuPH20的短半衰期和乙酰透明质酸的持续合成导致酶对组织的短的且局部的作用。
优选地，通过使用重组DNA技术来制备作为依照本发明的皮下配制剂中的赋形剂的透明质酸酶酶。因此，确保始终获得相同蛋白质（相同的氨基酸序列），并且避免由自组织提取期间共纯化的污染性蛋白质引起的变应性反应。优选地，依照本发明的配制剂中使用的透明质酸酶酶是人酶，最优选的是rHuPH20。
rHuPH20(HYLENEXTM)的氨基酸序列是公知的，并且以CAS登记号75971-58-7可获得。近似的分子量是61kDa（还可见美国专利No.7,767,429）。
已经在天然来源的哺乳动物透明质酸酶与来自人和其它哺乳动物的PH-20cDNA克隆间实施多重结构和功能比较。PH-20基因是重组产物rHuPH20使用的基因；然而，重组药物产物是一种由PH-20基因编码的完整蛋白质的447个氨基酸的截短型式。就氨基酸序列而言的结构相似性在任何比较中很少超过60%。功能比较显示rHuPH20的活性与先前批准的透明质酸酶产品的活性非常相似。此信息与过去50年期间的临床发现一致，即不管透明质酸酶来源，透明质酸酶的临床安全性和单位功效是等同的。
rHuPH20在依照本发明的抗CD20抗体SC配制剂中的使用容许施用较高体积的药物产品，并且潜在地增强皮下施用的CD20抗体，优选地利妥昔单抗吸收入系统循环中。
依照本发明的稳定的药物配制剂的摩尔渗透压浓度是350±50mOsm/kg。
优选地，依照本发明的稳定的药物配制剂基本上没有可见的（人眼检查）颗粒。亚-可见的颗粒（如通过光遮蔽测量的）应当满足下列标准：
-每个管形瓶≥10μm颗粒的最大数目->6000
-每个管形瓶≥25μm颗粒的最大数目->600
在又一方面，本发明提供了配制剂用于制备可用于治疗受试者中适合于用抗CD20抗体治疗的疾病或病症，诸如优选地，癌症或非恶性疾病的药物的用途，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对受试者施用本文中所描述的配制剂。优选地，与化疗剂伴随或序贯共施用抗CD20抗体。
在又一方面，本发明提供了治疗受试者中适合于用抗CD20抗体治疗的疾病或病症（例如癌症（优选的）或非恶性疾病）的方法，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对受试者施用本文中所描述的配制剂。癌症或非恶性疾病一般会牵涉CD20表达细胞，使得依照本发明的治疗性药物SC配制剂中的CD20抗体能够结合受影响的细胞。优选地，癌症是CD20表达癌症。优选地，可以用依照本发明的组合物治疗的非恶性疾病是自身免疫性疾病，如本文中限定的。优选地，与化疗剂伴随或序贯共施用抗CD20抗体。
对配制剂添加透明质酸酶容许增加可以安全且舒适地皮下施用的注射体积。优选的注射体积是1至15ml。已经观察到依照本发明的配制剂的施用提高治疗性抗体的分散、吸收和生物利用度。经由SC路径施用的大分子（即大于16kDa）经由引流淋巴液优先吸收入血管区室中[Supersaxo,A.等,“Effectof Molecular Weight on the Lymphatic Absorption of Water-Soluble CompoundsFollowing Subcutaneous Administration”,1990;2:167-169;Swartz,M.A.,“Advanced Drug Delivery Review，The physiology of the lymphatic system”,2001;50:3-20]。如此，这些大分子引入系统循环的速率相对于静脉内输注是减缓的，因此潜在地导致输注相关反应的频率/强度降低。
依照本发明的皮下CD20抗体（优选地利妥昔单抗）配制剂的生成要求制造工艺的最终纯化步骤中的高抗体浓度（约120mg/ml）。因此，将额外的工艺步骤（超滤/渗滤）添加至CD20抗体，优选地利妥昔单抗的常规制造工艺。依照本发明的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂也可以以稳定化的蛋白质配制剂提供，所述稳定化的蛋白质配制剂可以用合适的稀释剂重建以生成高抗CD20抗体浓度重建的配制剂。
优选地，使用依照本发明的CD20抗体SC配制剂来治疗癌症，优选地CD20表达癌症。
如本专利说明书中所使用的，术语“约”意指规定所提供的特定数值可以以某种程度变化，诸如例如意指给定数值中包括范围为±10%，优选地±5%，最优选地±2%的变化。
除了上述测定法外，各种体内测定法是熟练从业人员可用的。例如，可以将患者身体内的细胞暴露于任选地用可检测标记物，例如放射性同位素标记的抗体，并且可以例如通过外部扫描放射性或者通过分析自先前暴露于抗体的患者采集的活组织检查来评估抗体对患者中的细胞的结合。
涵盖的是，也可以使用依照本发明的CD20抗体SC配制剂来治疗各种非恶性疾病或病症，其包括如本文中所限定的自身免疫性疾病；子宫内膜异位症；硬皮病；再狭窄；息肉，诸如结肠息肉、鼻息肉或胃肠息肉；纤维腺瘤；呼吸系统疾病；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊肾病；炎性疾病；皮肤病症，包括银屑病和皮炎；血管疾病；牵涉血管上皮细胞的异常增殖的状况；胃肠溃疡；门内特里埃(Menetrier)氏病、分泌型腺瘤或蛋白质损失综合征(proteinloss syndrome)；肾病症；血管生成性病症(angiogenic disorder)；眼病，诸如年龄相关黄斑变性、推测的眼组织胞浆菌病综合征、来自增殖性糖尿病视网膜病变的视网膜新血管化、视网膜血管化、糖尿病视网膜病变、或年龄相关黄斑变性；骨相关病理学，诸如骨关节炎、佝偻病和骨质疏松；脑缺血事件后的损伤；纤维变性或水肿疾病，诸如肝硬变、肺纤维化、结节病(carcoidosis)、甲状腺炎(throiditis)、系统性高粘滞综合征(hyperviscosity syndrome systemic)、Osier Weber-Rendu疾病、慢性阻塞性肺疾病(occlusive pulmonary disease)、或烧伤、创伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿；皮肤的超敏感性反应；糖尿病视网膜病和糖尿病肾病；格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)；移植物抗宿主病或移植排斥；佩吉特(Paget)氏病；骨或关节炎症；光老化（例如由对人皮肤的UV辐射引起的）；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括选自下组的微生物病原体：腺病毒、汉坦病毒、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、耶尔森氏菌(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)；由血小板聚集引起的血栓；生殖状况，诸如子宫内膜异位症、卵巢过度刺激综合征、先兆子痫、功能障碍性子宫出血、或月经频多；滑膜炎；粥样斑；急性和慢性肾病（包括增殖性肾小球肾炎和糖尿病诱导的肾病）；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤病息肉病；神经变性性疾病（例如阿耳茨海默(Alzheimer)氏病、AIDS相关痴呆、帕金森(Parkinson)氏病、肌萎缩侧索硬化、视网膜色素变性、脊柱性肌萎缩(spinalmuscular atrophy)和小脑变性）；骨髓增生异常综合征；再生障碍性贫血；缺血性损伤；肺、肾或肝的纤维化；T细胞介导的超敏感性疾病；婴儿肥大性幽门狭窄；泌尿阻塞综合征(urinary obstructive syndrome)；银屑病关节炎；和桥本(Hasimoto)氏甲状腺炎。疗法优选的非恶性适应症如本文中所限定的。
在适应症是癌症的情况中，可以用抗体配制剂和化疗剂的组合治疗患者。联合施用包括共施用或同时施用（其使用分开的配制剂或单一药物配制剂进行）和以任意次序的连续施用，其中优选地，存在着所有活性剂同时施加其生物学活性的时间段。如此，可以在施用依照本发明的抗体配制剂之前、或之后施用化疗剂。在此实施方案中，化疗剂的至少一次施用与依照本发明的抗体配制剂的至少一次施用间的时机优选地是约1个月或更小，且最优选地约2周或更小。或者，可以在单一配制剂或分开的配制剂中对患者同时施用化疗剂和依照本发明的抗体配制剂。
用所述抗体配制剂的治疗会导致癌症或疾病的体征或症状的改善。例如，在所治疗的疾病是癌症的情况中，此类疗法可以导致存活（总体存活和/或无进展存活）的改善和/或可以导致客观临床响应（部分的或完全的）。此外，用化疗剂和抗体配制剂的组合治疗可以对患者产生协同或大于叠加的治疗益处。
优选地，所施用配制剂中的抗体是裸抗体。然而，所施用的抗体可以与细胞毒剂缀合。优选地，免疫缀合物和/或其结合的抗原被细胞内在化，导致免疫缀合物在杀死其结合的癌细胞方面的治疗功效升高。在一个优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的例子包括美登木素生物碱类、加利车霉素(calioheamicin)、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。优选的免疫缀合物是与曲妥单抗-DM1(T-DM1)，如它们记载于WO2003/037992的，更优选的是免疫缀合物T-MCC-DM1类似的利妥昔单抗-美登木素生物碱类免疫缀合物。
对于皮下投递，可以经由合适的装置，诸如（但不限于）注射器；注射装置（例如INJECT-EASETM和GENJECTM装置）；输注泵（诸如例如Accu-ChekTM）；注射笔（诸如GENPENTM；无针装置（例如MEDDECTORTM和BIOJECTORTM）；或者经由皮下贴片投递系统来施用配制剂。
用于预防或治疗疾病的所述抗CD20抗体配制剂的施用量和施用时机会取决于所治疗患者的类型（物种、性别、年龄、重量，等等）和状况和所治疗的疾病或状况的严重性。对于合适的剂量确定也重要的是疾病过程、抗体是为了预防还是治疗目的施用、先前的疗法、患者的临床史和他对抗体的响应。最后的剂量确定凭主治内科医生决断。在一次或一系列治疗里对患者适当地施用抗体。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg（例如，0.1-20mg/kg）的所述抗CD20抗体是对患者施用的候选初始剂量。
所述抗CD20抗体的优选剂量范围会是约0.05mg/kg至约30mg/kg体重。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg或30mg/g（或其任何组合）的一剂或多剂。根据患者的类型（物种、性别、年龄、重量，等等）和状况及抗CD20抗体的类型，所述第一剂量可以与抗CD20抗体的第二剂量不同。可以每日或间歇地，例如每三至六天或甚至每一至三周施用此类剂量。可以施用初始的较高加载剂量，接着是较低的一剂或多剂。基于临床研究（还可见关于利妥昔单抗的非限制性例证的实施例3和4），优选的剂量范围是300mg/m2至900mg/m2。更优选地，所述抗CD20抗体的优选剂量范围是约375mg/m2至约800mg/m2。所述抗CD20抗体的优选特定剂量是约375mg/m2、约625mg/m2和约800mg/m2的剂量。还优选的是固定剂量的所述抗CD20抗体。
在一个实施方案中，B细胞淋巴瘤，优选地非何杰金氏淋巴瘤的固定剂量如下。优选的是每剂约1200mg至约1800mg所述抗CD20抗体。更优选的是选自下组的剂量：每剂约1300mg、约1500mg、约1600mg和约1700mg所述抗CD20抗体。最优选地，用于B细胞淋巴瘤患者，优选地非何杰金氏淋巴瘤患者的固定剂量是每剂约1400mg所述抗CD20抗体（例如利妥昔单抗），其可以依照多种日程表施用，包括约每2个月（包括约每8周）、约每3个月（包括约每12周）、约2年（或更多），等等（还可见关于利妥昔单抗的非限制性例证的实施例3和4）。
在另一个实施方案中，用于白血病患者，优选地慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的固定剂量如下。优选的是每剂约1600mg至约2200mg所述抗CD20抗体。更优选的是选自下组的剂量：每剂约1700mg、约1800mg、约1900mg、和约2100mg所述抗CD20抗体。在一个实施方案中，用于白血病患者，优选地CLL患者的固定剂量是每剂约1870mg所述抗CD20抗体（例如利妥昔单抗）。
在又一个实施方案中，用于自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、狼疮肾炎、糖尿病、ITP、和血管炎患者的固定剂量如下。优选的是每剂约1200mg至约2200mg所述抗CD20抗体，例如每剂约1500mg所述抗CD20抗体（例如利妥昔单抗）。
若施用化疗剂，它通常以其已知的剂量施用，或者任选地由于药物的组合作用或可归因于化疗剂施用的负面副作用而降低。可以依照制造商的指令或如熟练从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程表。此类化学疗法的制备和剂量给药日程表也记载于Chemotherapy ServiceEd.,M.C.Perry,Williams & Wilkins,Baltimore,MD(1992)。
优选地，以皮下注射施用依照本发明的药学活性抗CD20抗体的稳定的药物配制剂，其中优选地，以3周的时间间隔(q3w)将施用重复几次。最优选地，在1至10分钟，优选地2至6分钟，最优选地3±1分钟的时段内施用注射流体的全部体积。最优选地，施用2ml/分钟，即例如约240mg/分钟。对于许多没有给予其它静脉内(IV)化疗剂的患者，此类皮下施用导致患者便利增加及在家自己施用的潜力。这导致改善的顺从性，并且会降低/消除与IV施用有关的成本（即，IV施用的护理成本、躺椅租费、患者出行等）。依照本发明的皮下施用最可能会与输注相关反应的频率和/或强度降低有关。
在一个优选的实施方案中，药物可用于预防或降低患有表达CD20的癌症的此类患者中的转移或进一步扩散。药物可用于延长此类患者的存活持续时间，延长此类患者的无进展存活，延长响应的持续时间，导致经治疗的患者的统计学显著的且临床上有意义的改善，如通过存活的持续时间、无进展存活、响应率或响应的持续时间所测量的。在一个优选的实施方案中，药物可用于提高患者组中的响应率。
在本发明的上下文中，可以在表达CD20的癌症的抗CD20抗体治疗中使用一种或多种额外的其它生长抑制剂、细胞毒剂、化疗剂、抗血管生成剂、抗癌剂或细胞因子、或增强此类药剂的效果的化合物。优选地，抗CD20抗体治疗不与所述额外的细胞毒剂、化疗剂或抗癌剂、或增强此类药剂的化合物一起使用。
此类药剂包括例如：烷化剂或具有烷基化作用的药剂，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)（CTX；例如）、苯丁酸氮芥(chlorambucil)（CHL；例如瘤可宁
顺铂(cisplatin)（CisP；例如
）、白消安(busulfan)（例如，马利兰
）、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、链脲菌素(streptozotocin)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)(TEM)、丝裂霉素C(mitomycin C)，等等；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(MTX)、依托泊苷(etoposide)（VP16；例如凡毕士
）、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6-thiocguanine)(6TG)、阿糖胞苷(cytarabine)(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)（例如，希罗达）、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)，等等；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin)（DXR；例如阿霉素）、柔红霉素(daunorubicin)（道诺霉素(daunomycin)）、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)等；生物碱，诸如长春花生物碱诸如长春新碱(vincristine)(VCR)、长春碱(vinblastine)，等等；及其它抗肿瘤剂，诸如帕西他赛(paclitaxel)（例如泰素
）和帕西他赛衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素诸如地塞米松(dexamethasone)（DEX；例如地卡特隆
）和皮质类固醇诸如泼尼松(prednisone)、核苷酶抑制剂诸如羟基脲、氨基酸消减酶(amino acid depleting enzyme)诸如天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)和其它叶酸衍生物、和相似的多种多样的抗肿瘤剂。也可以使用下列药剂作为额外的药剂：氨磷汀(arnifostine)（例如
）、更生霉素(dactinomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)（氮芥）、链佐星(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星脂质体(doxorubicin lipo)（例如，
）、吉西他滨(gemcitabine)（例如健择
）、柔红霉素脂质体(daunorubicin lipo)（例如）、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素(mitomycin)、多西他赛(docetaxel)（例如泰索帝
）、阿地白介素(aldesleukin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT 11（伊立替康(irinotecan)）、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素β、干扰素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾内酪(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)。优选地，抗CD20抗体治疗不与此类额外的药剂一起使用。
上文所描述的细胞毒剂和抗癌剂及抗增殖性靶物特异性抗癌药物，如蛋白质激酶抑制剂在化学疗法方案中的使用一般在癌症疗法领域中得到充分表征，并且其在本文中的使用归入关于监测耐受性和效力及关于控制施用路径和剂量的相同考虑，伴有一些调整。例如，细胞毒剂的实际剂量可以随通过使用组织培养方法测定的患者的培养细胞应答而变化。一般地，与在没有额外的其它药剂的情况中使用的量相比，剂量会是降低的。
有效细胞毒剂的典型剂量可以在制造商推荐的范围中，并且在通过体外应答或动物模型中的应答指示的情况中，可以降低多至约一个数量级的浓度或量。如此，实际剂量会取决于内科医生的判断、患者的状况、和治疗方法的效力，其基于原代培养的恶性细胞或组织培养组织样品的体外响应性，或合适的动物模型中观察到的响应。
在本发明的上下文中，在表达CD20的癌症的抗CD20抗体治疗外，可以实施有效量的电离辐射和/或可以使用放射性药物。放射源可以是在所治疗的患者外部或内部。在来源在患者外部时，已知疗法为外部束放射疗法(EBRT)。在放射源在患者内部时，治疗称作近程治疗(BT)。本发明的上下文中使用的放射性原子可以选自下组，包括但不限于镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131、和碘-111。也有可能用此类放射性同位素标记抗体。优选地，抗CD20抗体治疗不与此类电离辐射一起使用。
放射疗法是一种用于控制不可切除的或不能手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗。已经在组合放射疗法与化学疗法时看到改善的结果。放射疗法基于如下的原则，即对靶区域投递的高剂量放射会导致肿瘤和正常组织两者中的繁殖性细胞(reproductive cell)死亡。放射剂量方案一般在放射吸收剂量(Gy)、时间和分级方面限定，并且必须由肿瘤学家仔细限定。患者接受的放射量会取决于各种考虑因素，但是两项最重要的是肿瘤相对于身体的其它重要结构或器官的位置和肿瘤已经扩散的程度。经历放射疗法的患者的典型治疗过程会是在1至6周时段里的治疗日程表，以单一每日分数约1.8至2.0Gy一周5天对患者施用10-80Gy的总剂量。在本发明的一个优选的实施方案中，在用本发明和放射的联合治疗来治疗人患者中的肿瘤时存在着协同。换言之，在与放射，任选地有额外的化学治疗剂或抗癌剂组合时，依靠包含本发明的CD20抗体配制剂的药剂对肿瘤生长的抑制得到增强。例如，辅助放射疗法的参数包含在WO 99/60023中。
其它治疗方案可以与抗体组合，包括但不限于第二（第三、第四等）化疗剂（换言之，不同化疗剂的“混合物(cocktail)”）；另一种单克隆抗体；生长抑制剂；细胞毒剂；化疗剂；抗血管生成剂；和/或细胞因子等；或其任何合适的组合。
在上述治疗方案外，患者可以进行癌细胞的手术除去和/或放射疗法。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，其含有本发明的药物配制剂且提供其使用指令。此制品包含容器。合适的容器包括例如瓶、管形瓶（例如多或双室管形瓶）、注射器（诸如多或双室注射器）和试管。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳配制剂，并且容器上或与容器结合的标签可以指示使用指导。容纳配制剂的容器可以是多次使用管形瓶，其容许重建配制剂的重复施用（例如2至6次施用）。制品可以进一步包括从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用指令的包装插页。
依照本发明配制的抗体优选是基本上纯的，且期望地基本上同质的（即没有污染性蛋白质等，其中认为依照本发明的配制剂中的透明质酸酶酶不是依照本发明的抗CD20单克隆抗体的污染性蛋白质）。
本发明通过参照以下实施例会得到更完整的理解。然而，它们不应解释为限制本发明的范围。通过提及而将所有文献和专利引用收入本文。
实施例
使用如下文所概述的通用制备和分析方法和测定法，基于如下文所提供的实验结果开发依照本发明的供皮下施用的抗CD20配制剂。
实施例1：高度浓缩的液体配制剂的制备
通过一般自重组蛋白生成已知的技术来制造利妥昔单抗。自母细胞库将如在EP-B-2000149中所描述的那样制备的经遗传工程改造的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)在细胞培养物中扩充。自细胞培养物流体收获利妥昔单抗单克隆抗体，并使用固定化的蛋白A亲和层析、阳离子交换层析、除去病毒污染的过滤步骤，接着进行阴离子交换层析和超滤/渗滤步骤来纯化。
通过一般自重组蛋白生成已知的技术来制造rHuPH20。该工艺始于自工作细胞库(WCB)或母细胞库(MCB)融化细胞，并经由一系列转瓶中的细胞培养来扩充。使用多至6升的细胞培养物来提供在甲氨蝶呤的选择性压力下维持的细胞的连续来源。在扩充至约36升时，将培养物转移至400升生物反应器以得到约300升的最后批体积。以补料-分批模式在没有选择压力的情况中操作生产生物反应器，并且生产期的持续时间是约2周。rHuPH20被分泌入培养物流体中。也可以使用1000升生物反应器来得到500升的最后批体积。在完成生产阶段后，通过过滤使收获物澄清，然后用溶剂/去污剂处理以使病毒灭活。然后，通过一系列的四个柱层析工艺来纯化蛋白质以除去工艺和产品相关杂质。实施病毒过滤步骤，然后将过滤后的散剂浓缩，配制入最终的缓冲液：20mM L-组氨酸/HCl缓冲液，pH 6.5、130mM NaCl、0.05%(w/v)聚山梨酯80中的10mg/mL rHuPH20。将rHuPH20散剂在-70°C之下贮存。
依照本发明的配制剂的其它赋形剂在实践中广泛使用，并且是本领域技术人员已知的。因此，不需要在这里详细解释它们。
如下开发依照本发明的供皮下施用的液体药物产品配制剂。
为了制备液体配制剂，将利妥昔单抗针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，通过渗滤浓缩成约200mg/ml的抗体浓度。完成渗滤操作后，将赋形剂（例如海藻糖、rHuPH20，表面活性剂）以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用缓冲液将蛋白质浓度调节至约120mg/ml的最终利妥昔单抗浓度。
将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌6ml玻璃管形瓶中，用经ETFE（乙烯和四氟乙烯的共聚物）包被的橡胶塞和Alucrimp帽密封。填充体积是约3.0ml。将这些配制剂在不同气候条件（5°C、25°C和40°C）贮存不同时间间隔，并通过摇动（于5°C和25°C以200rpm的摇动频率持续1周）和冷冻-融化压力法来施压。在应用压力测试之前和之后通过下列分析方法来分析样品：
1)UV分光光度法；
2)大小排阻层析(SEC)；
3)通过离子交换层析(IEC)；
4)通过溶液的浊度；
5)在可见颗粒方面；及
6)在rHuPH20活性方面。
在Perkin Elmerλ35UV分光光度计上以240nm至400nm的波长范围实施用于测定蛋白质含量的UV分光光度术。用相应的配制缓冲液将纯的蛋白质样品稀释至约0.5mg/ml。依照等式1计算蛋白质浓度。
等式1：
针对320nm的光散射校正280nm的UV光吸收，并乘以稀释因子（其自纯样品和稀释缓冲液的加权质量和密度确定）。用分子除以比色皿的路径长度d和消光系数ε的乘积。
使用大小排阻层析(SEC)来检测配制剂中的可溶性高分子量种类（聚集体）和低分子量水解产物(LMW)。该方法使用装备有UV检测器（检测波长280nm）和TosoHaas TSK G3000SWXL柱（7.8x300mm）的合适的HPLC仪。使用0.2M磷酸氢二钾、025M氯化钾，pH 7.0以0.5ml/分钟的流速通过等度洗脱概况来分开完整的单体、聚集体和水解产物。
实施离子交换层析(IEC)以检测配制剂中改变利妥昔单抗的净电荷的化学降解产物。出于此目的，用木瓜蛋白酶消化利妥昔单抗。该方法使用装备有UV检测仪（检测波长280nm）和Polymer Labs PL-SCX 1000A分析用阳离子交换柱的合适的HPLC仪。分别使用10mM MES,pH 6.0和10mM MES,0.2M氯化钠,pH 6.0作为流动相A和B，流速为1ml/分钟。
为了测定浊度，于室温使用HACH 2100AN浊度计以FTU（浊度单位）测量乳光。
通过使用Seidenader V90-T目视检查仪对样品分析可见颗粒。
使用rHuPH20作为透明质酸酶的体外酶测定法作为活性测定法。该测定法基于在乙酰透明质酸（透明质酸钠）结合阳离子沉淀剂时形成不溶性沉淀物。通过将rHuPH20与乙酰透明质酸底物一起温育，然后用酸化的血清清蛋白（马血清）沉淀未消化的乙酰透明质酸来测量酶活性。以640nm的波长测量浊度，并且源自对乙酰透明质酸底物的酶活性的浊度降低是酶活性的测量。使用用rHuPH20测定参照标准品的稀释液产生的标准曲线运行该规程，并自曲线读出样品活性。
下文添加的表中提供了配制剂A至J的稳定性测试的结果。
实施例2：人源化2H7抗CD20液体配制剂的制备
为了制备液体配制剂，将重组人源化2H7抗CD20抗体（2H7.v16，如WO2006/084264中所披露的）针对含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液进行缓冲液交换，并且在需要的情况中，浓缩成约60和120mg/ml的抗体浓度。在达到目标浓度后，然后，将赋形剂（例如海藻糖、rHuPH20，聚山梨酯20）以储备溶液添加至抗体溶液。最后，用最终配制缓冲液将蛋白质浓度调节至约30、50、和100mg/ml的人源化2H7浓度。
将所有配制剂无菌过滤通过0.22μm低蛋白质结合滤器，并在无菌条件下填充入无菌3ml玻璃管形瓶中，用氟树脂层状丁基橡胶塞子加塞并用铝/塑料掀开型(flip-off)封条加帽。填充体积是约1.2ml。将这些配制剂在不同温度（5°C、25°C和40°C）贮存不同时间间隔。通过以下分析方法在每个稳定性时间点分析样品：
1)UV分光光度法；
2)大小排阻层析(SEC)；
3)离子交换层析(IEC)；
4)人源化2H7活性的补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法
5)rHuPH20活性的浊度计量测定法。
1).使用Agilent 8453分光光度计在波长范围240nm至400nm中通过紫外吸收光谱学来测定蛋白质浓度。用相应的配制缓冲液将样品按重量稀释至约0.5mg/ml。使用等式1来计算蛋白质浓度：
蛋白质浓度=((Amax-A320)x DF)/(ε(cm2/mg)x d(cm)) （等式1）其中DF是稀释因子，d是比色皿路径长度，而ε是消光系数，其在Amax时对于2H7是1.75(cm2/mg-1)。针对320nm的光散射校正在Amax（通常278至280nm）的UV光吸收，并乘以稀释因子（其自纯样品和稀释缓冲液的加权质量和密度确定）。用分子除以比色皿的路径长度d和消光系数ε的乘积。
2).使用大小排阻层析(SEC)来检测配制剂中的可溶性高分子量种类（聚集体）和低分子量水解产物（片段）。在装备有UV检测仪（检测波长280nm）和TSK G3000SWXL柱(7.8x300mm)的Agilent Technologies,Inc.1100系列HPLC上实施SEC。使用0.20M磷酸钾和0.25M氯化钾(pH 6.2)以0.3ml/分钟的流速通过等度洗脱概况来分开完整的单体、聚集体和水解产物。
3).实施离子交换层析(IEC)以检测配制剂中改变抗CD20抗体的净电荷的化学降解产物。出于此目的，将抗CD20抗体与羧肽酶B一起温育以催化碱性氨基酸的水解。在具有UV检测仪（检测波长280nm）和Dionex ProPacWCX-10(4x 250mm)柱的Agilent Technologies,Inc.1100系列HPLC上实施离子交换层析。使用25mM磷酸钾(pH 6.9)（流动相A）和25mM磷酸钾中溶解的120mM氯化钾（流动相B）的线性梯度以0.5mL/分钟的流速分开酸性和碱性变体。
4).实施补体依赖性细胞毒性测定(CDC)测定法以测定抗CD20抗体的体外活性。使用补体依赖性细胞毒性(CDC)效力测定法来测量抗体在存在人补体的情况中裂解人B类淋巴母细胞(WIL2-S)细胞的能力。在96孔组织培养微量滴定板中实施该测定法。在此测定法中，将在测定稀释剂中稀释的不同浓度的抗CD20抗体参照物质、对照、或样品在存在固定量的人补体的情况中与WIL2-S细胞（50,000个细胞/孔）一起温育。将板于37°C/5%CO2在湿润的培养箱中温育1至2小时。在温育期结束时，将50μL氧化还原染料ALAMARBLUETM添加至每孔，并将板温育15至26小时。ALAMARBLUETM是一种在被活细胞还原时以530nm的激发波长和590nm的发射波长发荧光的氧化还原染料。因此，颜色和荧光的变化与活细胞数目成比例。针对抗CD20抗体浓度将以相对荧光单位(RFU)表述的结果绘图，并使用平行线程序来相对于参照材料评估抗CD20抗体样品的活性。
5).使用浊度计量测定法来测定透明质酸酶活性和酶浓度。此方法基于当透明质酸结合酸化的血清清蛋白时形成不溶性沉淀物。简言之，在酶稀释剂（70mM NaCl、25mM PIPES，pH 5.5，0.66mg/ml明胶水解物、0.1%人血清清蛋白）中制备rhuPH20透明质酸酶(Halozyme,Inc.)工作参照标准品的连续稀释液，范围为2.5个U/ml至0.25个U/ml。将测试样品在酶稀释剂中稀释至终浓度1.5个U/ml。将30μl标准品和样品稀释液转移入“黑色清洁底”96孔板(Nunc)。然后，将该板覆盖，并于37°C预热5分钟。然后，通过添加30μl预热的0.25mg/ml透明质酸底物溶液（70mM NaCl、25mM PIPES,pH 5.5，0.25mg/ml干透明质酸钠，Lifecore Biomedical）启动反应。将板短暂摇动，并于37°C温育10分钟。此温育步骤后，通过添加240μl血清工作溶液（2.5%马血清、500mM乙酸钾，pH 4.25）来停止反应。于室温的30分钟显现期后，在微板读板仪上以波长640nm测量反应的浊度。源自对透明质酸底物的酶活性的浊度降低是透明质酸酶活性的测量。相对于用rhuPH20工作参照标准品的稀释液产生的校准曲线测定样品活性。
下表中显示了用各种人源化2H7抗体配制剂获得的结果：
实施例3：用配制剂治疗患者
含有利妥昔单抗的方案已经变为患有各种CD20阳性B细胞恶性肿瘤的患者的护理标准。目前，利妥昔单抗以静脉内(IV)输注在几小时内施用。这些长输注时间和与输注有关的副作用被一些患者列举为目前治疗性处理的不适后果。此外，认为建立静脉内入口需要的规程是侵入性的，并且特别在重复治疗的恶性疾病患者中可以是疼痛的。皮下(SC)施用可以显著简化处理，将施用缩短成小于10分钟，并改善患者经历。已经开发并批准重组人透明质酸酶(rHuPH20)来改善共施用药物的分散和吸收。已经将其与利妥昔单抗组合以容许大于10mL的注射体积安全且舒适地SC施用。此治疗的目的是选出给出与IV利妥昔单抗相当的暴露的如实施例1中所描述的那样制备的具有rHuPH20的SC利妥昔单抗配制剂（配制剂A）的剂量，并评估其在维持治疗期间在男性和女性滤泡性淋巴瘤(FL)患者中的安全性和耐受性。
此实施例提供了来自一项随机化的、开放标签的、多中心适应性Ib期研究的1期数据。将124名患者随机化成4个利妥昔单抗维持处理组之一：16名患者IV对照、34名患者SC剂量1(375mg/m2)、34名患者SC剂量2(625mg/m2)和40名患者SC剂量3(800mg/m2)。在随机化前，在维持背景中以375mg/m2用至少一剂IV利妥昔单抗处理合格的患者。对于随机化至SC分组之一的患者，用SC剂量替换单一IV剂量。患者按照当地实践按每2个月(q2m)或每3个月(q3m)方案接受利妥昔单抗。自总共119名患者可获得安全性数据。一般地，利妥昔单抗SC是耐受良好的。尚未报告临床上显著的观察结果或处理相关的严重不利事件。在46名患者(39%)中报告了总共95个不利事件(AE)。最常记录的AE是“施用相关反应”（AAR，包括皮疹、红斑和轻度不适）。这些AAR是可逆的，在强度上主要为轻度，并且仅1个事件需要任何治疗（用于恶心的甲氧氯普胺(metoclopramide)）。总体上，AE概况没有与在用利妥昔单抗IV处理的患者中预期的AE概况（在AAR后，最常见的事件是胃肠病症和轻度感染）显著不同。在4名不同患者中报告了4个严重不利事件(SAE)，均报告为与研究药物无关。不存在导致死亡、退出或治疗中断的AE。
每名患者中SC施用的总体积范围为4.4-15.0mL。平均注射持续时间是2mL/分钟。第2天和第8天（48小时和168小时）间发生SC分组中的利妥昔单抗最大血清浓度。药动学参数就施用的SC剂量范围里的剂量（375、625和800mg/m2）而言是线性的。SC施用625mg/m2利妥昔单抗的患者中的第28天的利妥昔单抗浓度(C28)和血清暴露的程度(AUC0-57)与SC施用375mg/m2标准利妥昔单抗IV剂量的患者中的相当。
总之，可以快速地、舒适地且安全地投递皮下利妥昔单抗，同时维持在治疗期间在FL患者中达到与批准的静脉内配制剂相当的血清暴露。患者经历是有利的。这些结果支持皮下利妥昔单抗的进一步测试，并且已经为试验2期中的正式C谷非劣性测试选择固定剂量1400mg利妥昔单抗SC。
实施例4：滤泡性非何杰金氏淋巴瘤患者中的利妥昔单抗SQ对利妥昔单抗IV
用(a)与CHOP或CVP组合的利妥昔单抗SC配制剂（依照实施例1制备的，配制剂A），或(b)与CHOP或CVP组合的利妥昔单抗IV用维持治疗处理患有先前未处理的滤泡性（低级）淋巴瘤的患者。
将患者随机化以接受作为静脉内输注的375mg/m2利妥昔单抗或皮下给予的1400mg利妥昔单抗。另外，患者会接受标准的化学疗法（CVP或CHOP）。在8个治疗周期后实现完全或部分响应的患者会再接受维持治疗达最大数目12个周期。每8周会重复维持治疗周期。研究处理上的预期时间是96周。
每8周以维持处理用1400mg SQ利妥昔单抗抗CD20抗体处理多至12个周期在治疗滤泡性淋巴瘤中是安全且有效的，任选地与化学疗法（包括CHOP或CVP）组合。
Claims (28)
1.药学活性抗CD20抗体的高度浓缩的稳定的药物配制剂，其包含：
a.约50至350mg/ml抗CD20抗体；
b.约1至100mM缓冲剂，其提供pH 5.5±2.0；
c.约1至500mM稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物；
d.约0.01至0.1%非离子型表面活性剂；和
e.任选地，有效量的至少一种透明质酸酶酶。
2.依照权利要求1的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述抗CD20抗体浓度是100至150mg/ml，优选地120±20mg/ml。
3.依照权利要求1或2的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其包含约1’000至16’000个U/ml、优选地约2’000个U/ml或12’000个U/ml透明质酸酶酶。
4.依照权利要求1至3中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述缓冲剂的浓度为1至50mM。
5.依照权利要求1至4中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述缓冲剂提供pH 5.5至6.5，优选地选自下组：5.5、6.0、6.1和6.5。
6.依照权利要求1至5中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述缓冲剂是组氨酸缓冲剂。
7.依照权利要求1至6中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述稳定剂是糖类，诸如例如α,α-海藻糖二水合物或蔗糖。
8.依照权利要求1至7中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述稳定剂的浓度是15至250mM。
9.依照权利要求7或8的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中甲硫氨酸作为第二稳定剂使用。
10.依照权利要求9的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中甲硫氨酸以5至25mM的浓度存在。
11.依照权利要求1-10中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨酯，优选地选自下组：聚山梨酯20、聚山梨酯80、和聚乙烯-聚丙烯共聚物。
12.依照权利要求11的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述聚山梨酯的浓度是0.02%(w/v)至0.08%(w/v)。
13.依照权利要求1至12中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述透明质酸酶酶是rHuPH20。
14.依照权利要求1至13中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗(Rituximab)。
15.依照权利要求1至13中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述抗CD20抗体是Ocrelizumab。
16.依照权利要求1至13中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其中所述抗CD20抗体是HuMab<CD20>。
17.依照权利要求1至16中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其在冷冻和融化后是稳定的。
18.依照权利要求1至17中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其用于皮下或肌肉内施用。
19.依照权利要求1至18中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其为液体形式。
20.依照权利要求1至19中任一项的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂，其为冻干形式。
21.依照权利要求1至20中任一项的配制剂用于制备可用于治疗受试者中适合于用抗CD20抗体治疗的疾病或病症，优选地癌症或非恶性疾病的药物的用途，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对受试者施用本文中所描述的配制剂。
22.依照权利要求21的用途，其中与化学疗法伴随或序贯共施用所述配制剂。
23.依照权利要求21或22的用途，其中对有此需要的受试者施用固定剂量1200mg至约2200mg抗CD20抗体。
24.依照权利要求21或22的用途，其中对有此需要的受试者施用固定剂量约1200mg至约1800mg抗CD20抗体。
25.依照权利要求21或22的用途，其中对有此需要的受试者施用固定剂量1600mg至约2200mg抗CD20抗体。
26.一种治疗受试者中适合于用抗CD20抗体治疗的疾病或病症，诸如癌症或非恶性疾病的方法，包括以有效治疗所述疾病或病症的量对受试者施用依照权利要求1至25中任一项的配制剂。
27.依照权利要求26的方法，其中与化疗剂伴随或序贯共施用所述配制剂。
28.如本文中所描述的发明。
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