CN102512675A

CN102512675A - 用于治疗多发性硬化的方法

Info

Publication number: CN102512675A
Application number: CN2011104417566A
Authority: CN
Inventors: 保罗·A·弗罗纳
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2005-06-02
Publication date: 2012-06-27
Also published as: US20120199516A1; SV2006002132A; CA2566979A1; KR20150092374A; AU2005249566A1; US20060051345A1; KR20130099228A; ZA200610158B; MY194883A; TW200610537A; RU2384345C2; CN1993143A; NZ604082A; TW201422238A; SG183012A1; US20100233121A1; TWI433682B; AR049200A1; KR20070029733A; MXPA06014069A

Abstract

本申请涉及用于治疗多发性硬化的方法。本发明描述了通过特殊的给药方案用CD20抗体治疗多发性硬化(MS)的方法及方案。还描述了用于所述方法的制品。

Description

用于治疗多发性硬化的方法

本申请是申请日为2005年6月2日、中国申请号为200580026602.3、发明名称为“用于治疗多发性硬化的方法”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及利用特殊的剂量给药方式治疗受试者的多发性硬化(MS)的方法和流程，以及附有所述应用之说明书的制品。

发明背景

多发性硬化

多发性硬化(multiple sclerosis)(MS)是人中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘退行性疾病。它是一种世界范围的疾病，在美国影响约300,000名患者；它是一种年轻成人的疾病，70％-80％在20至40岁之间发病(Anderson et al.，Ann.Neurology 31(3)：333-6(1992)；Noonan et al.，Neurology 58：136-8(2002))。MS是基于临床发病病程、磁共振成像(MRI)扫描评估以及活组织切片检查和尸检材料的病理分析的异质性病变(Lucchinetti et al.，Ann.Neurol.47：707-17(2000))。该疾病自身表现为缺陷的许多可能组合，包括脊髓、脑干、颅神经、小脑、大脑和认知综合征。进行性伤残是大多数MS患者的命运，尤其是在包括25年前景时。一半患者在发病后的15年内行走需要拐杖。MS是年轻和中年成人中神经性伤残的主要原因，直至过去十年，仍未有已知的有效治疗方法。由于非特异性临床发现，MS难以诊断，这导致了包含数种技术进步在内的高度组织化诊断标准的开发，包括MRI扫描、诱发电位和脑脊液(CSF)研究。所有诊断标准依赖不同时间发生在中心白质内的离散损伤的普遍原理，而不是从诸如感染、血管疾患或自身免疫性疾患等其它病因方面来解释(McDonald et al.，Ann.Neurol.50：121-7(2001))。MS有四种疾病样式：复发缓和型MS(RRMS；发病案例的80％-85％)、原发进行型MS(PPMS；发病案例的10％-15％)、进行性复发型MS(PRMS；发病案例的5％)；以及继发进行型MS(SPMS)(Kremenchutzky et al.，Brain 122(Pt10)：1941-50(1999)；Confavreux et al.，N.Engl.J.Med.343(20)：1430-8(2000))。估计50％的RRMS患者将在10年内发展成SPMS，而高达90％的RRMS患者最终将发展成SPMS(Weinshenker et al.，Brain 112(Pt1)：133-46(1989))。

目前，四类六种药物在美国批准用于治疗RRMS，而没有药物批准用于治疗PPMS。RRMS治疗包括：干扰素类，IFN-β-1a(REBIF

和AVONEX)和IFN-β-1b(BETASERON)；醋酸格拉默(COPAXONE

)，一种多肽；natalizumab(TYSABRI

)；以及米托蒽醌(NOVANTRONE

)，一种胞毒剂。其它药物也已不同程度的成功应用，包括皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤和静脉内(IV)免疫球蛋白。正如最近两次事后分析(meta-analysis)所显示的，目前已批准的治疗方法对于RRMS的复发率以及防止致残的益处是相对适度的(约30％)(Filippini et al.，Lancet 361：545-52(2003))。

其它临床研究评价了MS中的其它免疫调节剂，包括肿瘤坏死因子-α抑制剂和改变的肽配基，它们使MS加重而不是改善(Lenercept MultipleSclerosis Study Group and the University of British Columbia MS/MRI，Neurology 53：457-65(1999)；Bielekova et al.，Nat.Med.6：1167-75(2000)，勘误见Nat.Med.6：1412(2000))。

MS病理生理学的主要观点认为炎症主要是由CD4⁺Th1 T细胞介导的。基于此理论的治疗方法，诸如IFN-β和醋酸格拉默降低但未完全阻止恶化的发生或伤残的累积。

正如MS诊断标准中CSF寡克隆带的包含以及鞘内IgG合成增加所证实的，人MS中体液组分的存在已无疑公认了数十年(SidenA.，J.Neurol.221：39-51(1979)；McDonald et al.，Ann.Neurol.50：121-7(2001)；Andersson et al.，Eur.J.Neurol.9：243-51(2002)；O′Connor，P.，Neurology 59：S1-33(2002))。寡克隆带的存在、游离轻链的增加以及鞘内IgM合成的增加与MS病情相关，并且可以作为更严重后果的预示(Rudick et al.，Mult.Scler.1：150-5(1995)；Zeman et al.，Acta Cytol.45：51-9(2001)；Izquierdo et al.，Acta Neurol.Scand.105：158-63(2002)；Wolinsky J.，J.Neurol.Sci.206：145-52(2003)；Villar et al.，Ann.Neurol.53：222-6(2003))。

在进行型和复发型MS患者的血清中检测到抗髓磷脂抗体(髓磷脂碱性蛋白(MBP)和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG))(Reindl et al.，Brain 122：2047-56(1999)；Egg et al.，Mult.Scler.7(5)：285-9(2001))。在MS患者的CSF中也检测到抗髓磷脂抗体(Reindl et al.，Brain 122：2047-56(1999)；Egg et al.，Mult.Scler.7(5)：285-9(2001)；Andersson et al.，Eur.J.Neurol.9：243-51(2002))。在MS患者中还观察到别的抗体类型，诸如抗神经节苷脂抗体或抗神经丝抗体(Mata et al.，Mult.Scler.5：379-88(1999)；Sadatipour et al.，Ann.Neural.44：980-3(1998))。最近的一份报告表明，血清抗MOG和抗MBP抗体的存在是从临床上分离的脱髓鞘活动进展到明确的RRMS的强预示信号(Berger et al.，N.Engl.J.Med.349：139-45(2003))。发生病情恶化的校准比率对于两种抗体都呈血清阳性的患者而言是76.5，而对于只对抗MOG抗体呈血清阳性的患者而言是31.6。

国际病理学协会发现结合髓磷脂的抗体存在于大多数MS患者中，此外在MS损伤中还发现了浆细胞和B细胞，这为MS中的体液作用提供了另外的证据(Prineas and Wright，Lab.Invest.38：409-21(1978)；Esiri M.，Neuropathol.Appl.Neurobiol.6：9-21(1980)；Genain et al.，Nat.Med.5：170-5(1999)；Lucchinetti et al.，Ann.Neurol.47：707-17(2000)；Wingerchuk et al.，Lab.Invest.81：263-81(2001))。B细胞在MS患者的CSF中也是可检测到的，而存在相对高比例的B细胞可能预示着更严重的致残进程(Cepok et al.，Brain 124(Pt 11)：2169-76(2001))。

在患RRMS或视性眼阵挛-肌阵挛综合征的受试者中，据报道Rituximab消减所有受试者中的外周B细胞，并降低了有些患者中的CSF B细胞数目(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl 1)PO5.128：A395(2003)；Cross et al.，“Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS”(abstract)EighthAnnual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment inMultiple Sclerosis ACTRIMS，20-1(October，2003))。还可参阅Cree et al.，“Tolerability and Effects of Rituximab″Anti-CD20Antibody″in NeuromyelitisOptica and Rapidly Worsening Multiple Sclerosis”，Meeting of the Am.Acad.Neurol.(April，2004)。

CD20抗体及使用它的疗法

淋巴细胞是在造血过程中在骨髓中生成的多种类型白细胞之一。有两种主要的淋巴细胞群：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。

B细胞在骨髓中成熟，然后离开骨髓并在它们的细胞表面表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遇到其膜结合抗体特异性的抗原时，细胞开始快速分裂，且其后代分化成为记忆B细胞和称做“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命，并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。

CD20抗原(也称做人B淋巴细胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B(pre-B)淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上、分子量约35kD的疏水性跨膜蛋白质(Valentine et al.，J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287(1989)；及Einfeld et al.，EMBO J.7(3)：711-717(1988))。该抗原也在超过90％的B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson et al.，Blood 63(6)：1424-1433(1984))，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B)、正常浆细胞或其它正常组织上没有发现(Tedder et al.，J.Immunol.135(2)：973-979(1985))。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程的早期步骤(Tedder et al.，见上文)，并可能作为钙离子通道起作用(Tedder et al.，J.Cell.Biochem.14D：195(1990))。

假如CD20在B细胞淋巴瘤中表达，则该抗原可用做“靶向”此类淋巴瘤的候选者。本质上，这种靶向作用可概括如下：对患者施用对B细胞CD20表面抗原特异的抗体。这些抗CD20抗体特异结合正常和恶性B细胞的CD20抗原(表面上)；抗体与CD20表面抗原结合可导致赘生性B细胞的破坏和消减。此外，可将具有破坏肿瘤潜力的化学试剂或放射性标记物与抗CD20抗体偶联，使得该试剂特异“投递”至赘生性B细胞。不考虑方法，首要目标是破坏肿瘤；具体方法可根据所使用的具体抗CD20抗体来决定，因此可利用的靶向CD20抗原的方法可能变化相当大。

Rituximab(利妥昔单抗，RITUXAN

)抗体是针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体。Rituximab就是1998年4月7日发布的美国专利5,736,137(Anderson等人)中称为“C2B8”的抗体。RITUXAN

指示用于治疗患有复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用机制的体外研究表明RITUXAN

结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系(Reff et al.，Blood 83(2)：435-445(1994))。此外，它在抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)测定法中具有显著活性。最近，RITUXAN

在氚标记胸苷掺入测定法中显示出具有抗增殖效果，并直接诱导凋亡，而其它抗CD19和CD20抗体则不然(Maloney et al.，Blood88(10)：637a(1996))。在试验中还观察到RITUXAN

与化学疗法和毒素之间的协同作用。具体而言，RITUXAN

使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星(doxorubicin)、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒性作用敏感(Demidem et al.，Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)：177-186(1997))。体内临床前研究显示RITUXAN

可能通过补体和细胞介导的过程从猕猴的外周血、淋巴结和骨髓中消减B细胞(Reff et al.，Blood 83(2)：435-445(1994))。

美国在1997年11月批准将Rituximab用于治疗患有复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者，每周一剂375mg/m²，共四剂。2001年4月，食品和药品管理局(FDA)批准了用于治疗低级NHL的额外要求：复治(每周一次，共四剂)和额外的给药方案(每周一次，共八剂)。已经有超过300,000名患者暴露于Rituximab，或是作为单一疗法或是联合免疫抑制剂或化疗药物。还已经作为维持疗法用Rituximab治疗患者，可长达2年(Hainsworth et al.，J.Clin.Oncol.21：1746-51(2003)；Hainsworth et al.，J.Clin.Oncol.20：4261-7(2002))。

也已在B细胞和自身抗体表现出在疾病病理生理学中发挥作用的多种非恶性自身免疫性紊乱中研究了Rituximab(Edwards et al.，Biochem.Soc.Trans.30：824-828(2002))。已有报导，Rituximab潜在减轻类风湿性关节炎(RA)(Leandro et al.，Ann.Rheum.Dis.61：883-888(2002)；Emery et al.，Arthritis Rheum.48(9)：S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis Res.Ther.5：157-159(2003)；Leandro et al.，Arthritis Rheum.46：2673-2677(2002))、免疫性血小板减少症(D′Arena et al.，Leuk.Lymphoma 44：561-562(2003))、自身免疫性贫血(Zaja et al.，Haematologica 87：189-195(2002)，勘误见Haematologica 87：336(2002))、自身免疫性神经病(Pestronk et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74：485-489(2003))、副肿瘤性视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128：A395(2003))、以及复发缓和型多发性硬化(RRMS)(Cross et al.，(abstract)，Eighth Annual Meeting ofthe Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis，20-21(2003))的征候和症状。

已在类风湿性关节炎(RA)患者中进行了II期研究(WA16291)，提供了有关Rituximab的安全性和功效的48周跟踪数据(Emery et al.，ArthritisRheum.48(9)：S439(2003)；Szczepanski et al.，Arthritis Rheum.48(9)：S121(2003))。将总共161名患者随机平分为四个治疗组：甲氨蝶呤、仅Rituximab、Rituximab加甲氨蝶呤、以及Rituximab加环磷酰胺(CTX)。Rituximab治疗摄生法为第1天和第15天静脉内施用1克。大多数RA患者对输注Rituximab有很好的耐受，而36％的患者在其首次输注期间发生至少一种不良后果(与30％接受安慰剂的患者相比)。总而言之，认为大多数不良后果在严重程度上是温和至中度的，而且所有处理组之间很平衡。在48周中四个组共有19件严重的不良事件，其中Rituximab/CTX组稍多一些。所有组之间的感染发生率很平衡。该RA患者群体中严重感染的平均比率为每100患者-年4.66，低于基于社会的流行病学研究中所报告的RA患者中需要住院治疗的感染比率(每100患者-年9.57)(Doran et al.，Arthritis Rheum.46：2287-2293(2002))。

所报导的Rituximab在少数神经学紊乱患者中的安全谱，包括自身免疫性神经病(Pestronk et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74：485-489(2003))、视性眼阵挛/肌阵挛综合征(Pranzatelli et al.，Neurology 60(Suppl.1)PO5.128：A395(2003))、和RRMS(Cross et al.，Preliminary Results from aphase II trial of rituximab in MS(abstract)Eighth Annual Meeting of theAmericas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis，20-21(2003))，与在肿瘤学或RA中所报导的类似。正在RRMS受试者中进行的Rituximab联合干扰素-β(IFN-β)或醋酸格拉默的研究者发起试验(IST)(Crosset al.，见上文)中，接受治疗的10名受试者中有1个在首次输注Rituximab后发生中度发烧和打寒战，之后入院彻夜观察，而其他9名受试者完成了四次输注摄生法，没有报告任何不良事件。

关注CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734，以及US 2002/0197255、US 2003/0021781、US 2003/0082172、US 2003/0095963、US 2003/0147885(Anderson等人)；美国专利6,455,043、US 2003/0026804和WO 2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 2000/27428(Grillo-Lopez和White)；WO 2000/27433和US 2004/0213784(Grillo-Lopez和Leonard)；WO 2000/44788(Braslawsky等人)；WO2001/10462(Rastetter，W.)；WO 2001/10461(Rastetter和White)；WO2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US 2001/0018041、US 2003/0180292、WO 2001/34194(Hanna和Hariharan)；US 2002/0006404和WO 2002/04021(Hanna和Hariharan)；US 2002/0012665和WO 2001/74388(Hanna，N.)；US 2002/0058029(Hanna，N.)；US 2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 2001/97858(White，C.)；US 2002/0128488和WO 2002/34790(Reff，M.)；WO 2002/060955(Braslawsky等人)；WO 2002/096948(Braslawsky等人)；WO 2002/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586和WO 1998/56418(Lam等人)；WO1998/58964(Raju，S.)；WO 1999/22764(Raju，S.)；WO 1999/51642、美国专利6,194,551、美国专利6,242,195、美国专利6,528,624和美国专利6,538,124(Idusogie等人)；WO 2000/42072(Presta，L.)；WO 2000/67796(Curd等人)；WO 2001/03734(Grillo-Lopez等人)；US 2002/0004587和WO 2001/77342(Miller和Presta)；US 2002/0197256(Grewal，I.)；US 2003/0157108(Presta，L.)；WO 04/056312(Lowman等人)；US 2004/0202658和WO2004/091657(Benyunes，K.)；WO 2005/000351(Chan，A.)；US 2005/0032130A1(Beresini等人)；US 2005/0053602A1(Brunetta，P.)；美国专利6,565,827、6,090,365、6,287,537、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等人)；美国专利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767和6,652,852(Robinson等人)；美国专利6,410,391(Raubitschek等人)；美国专利6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；US2005/0079174A1(Barbera-Guillem，E.)；WO 2000/67795(Goldenberg)；US2003/0133930和WO 2000/74718(Goldenberg和Hansen)；US 2003/0219433和WO 2003/68821(Hansen等人)；WO 2004/058298(Goldenberg和Hansen)；WO 2000/76542(Golay等人)；WO 2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596(Ghetie等人)；美国专利6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg，D.)；US 2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO 2002/102312(Engleman，E.)；US 2003/0068664(Albitar等人)；WO 2003/002607(Leung，S.)；WO 2003/049694、US 2002/0009427和US 2003/0185796(Wolin等人)；WO 2003/061694(Sing和Siegall)；US 2003/0219818(Bohen等人)；US 2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen等人)；US 2003/0219818(Bohen等人)；US 2002/0136719(Shenoy等人)；WO 2004/032828(Wahl等人)；以及WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。还可参见美国专利5,849,898和EP 330,191(Seed等人)；EP 332,865 A2(Meyer和Weiss)；美国专利4,861,579(Meyer等人)；US 2001/0056066(Bugelski等人)；WO 1995/03770(Bhat等人)；US 2003/0219433 A1(Hansen等人)；WO 2004/035607(Teeling等人)；US 2004/0093621(Shitara等人)；WO 2004/103404(Watkins等人)；WO 2005/000901(Tedder等人)；US 2005/0025764(Watkins等人)；WO2005/016969和US 2005/0069545 A1(Carr等人)；WO 2005/014618(Chang等人)。其中某些格外包括狼疮的治疗。

关注使用Rituximab的疗法的出版物包括：Perotta and Abuel，“Responseof chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”，Abstract#3360Blood 10(1)(part 1-2)：88B(1998)；Stashi et al.，“Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura”，Blood 98(4)：952-957(2001)；Matthews，R.，“Medical Heretics”，New Scientist(7 April，2001)；Leandro et al.，“Clinicaloutcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocytedepletion”，Ann Rheum Dis，61：833-888(2002)；Leandro et al.，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritis：early evidence for safety，efficacy and doseresponse”，Arthritis and Rheumatism44(9)：S370(2001)；Leandro et al.，“Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis and Rheumatism 46：2673-2677(2002)；Edwards and Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes”，Rhematology 40：205-211(2001)；Edwards et al.，“B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmunedisorders”，Biochem.Soc.Trans.，30(4)：824-828(2002)；Edwards et al.，“Efficacy and safety of Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonalantibody：A randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoidarthritis”，Arthritis and Rheumatism 46(9)：S197(2002)；Levine and Pestronk，“IgM antibody-related polyneuropathies：B-cell depletion chemotherapy usingRituximab”，Neurology 52：1701-1704(1999)；DeVita et al.，“Efficacy ofselective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis”，Arthritis &Rheum.46：2029-2033(2002)；Hidashida et al.，“Treatment ofDMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab”，Presented at the AnnualScientific Meeting of the American College of Rheumatology，Oct 24-29，NewOrleans， LA 2002；Tuscano，J.，“Successful treatment of Infliximab-refractoryrheumatoid arthritis with Rituximab”， Presented at the Annual Scientific Meetingof the American College of Rheumatology， Oct 24-29， New Orleans， LA 2002；Specks et al.，“Response of Wegener’s granulomatosis to anti-CD20 chimericmonoclonal antibody therapy”，Arthritis & Rheumatism 44(12)： 2836-2840(2001)；Anolik et al.，“B lympocyte Depletion in the Treatment of SystemicLupus(SLE)： Phase I/II Trial of Rituximab(RITUXAN

)in SLE”，Arthritis AndRheumatism 46(9)： S289-S289，Abstract 717(October，2002)； Albert et al.， “APhase I Trial of Rituximab(Anti-CD20)for Treatment of Systemic LupusErythematosus”，Arthritis And Rheumatism 48(12)： 3659-3659， Abstract LB9(December，2003)；Martin and Chan，“Pathogenic Roles of B cells in HumanAutoimmunity：Insights from the Clinic”，Immunity 20：517-527 (2004)。

发明概述

本发明至少部分涉及CD20抗体剂量的选择，以便在诸如PPMS或RRMS等多发性硬化患者中提供安全有效的治疗摄生法。

因此，本发明涉及在受试者中治疗多发性硬化的方法，包括对受试者施用有效量的CD20抗体，以提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才提供的，且每次抗体暴露是作为一剂或两剂(two doses)抗体提供给受试者的。

此外，本发明涉及包括以下各项的制品：(a)装有CD20抗体的容器；及(b)附有关于在受试者中治疗多发性硬化的说明书的包装插页，其中所述说明书指出对受试者施用一定量的抗体，它有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才提供的，且每次抗体暴露是作为单剂或两剂抗体(as one or two doses of antibody)提供给受试者的。

本发明涉及下述各项。

1.在受试者中治疗多发性硬化的方法，包括对受试者施用有效量的CD20抗体，以提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才提供的，且每次抗体暴露是以一剂或两剂向受试者提供抗体。

2.项1的方法，其中所述第二次暴露是直到距初次暴露约20至30周时才提供的。

3.项1或2的方法，其中所述初次和第二次抗体暴露是各自以约1.5至2.5克的量提供的。

4.项2-3任一项的方法，还包括对所述受试者施用有效量的所述CD20抗体，以提供约0.5至4克的第三次抗体暴露，所述第三次暴露是直到距初次暴露约46至60周时才提供的。

5.项4的方法，其中所述第三次抗体暴露是以约1.5至2.5克的量提供的。

6.项4或5的方法，其中所述第三次暴露是直到距初次暴露约46至55周时才提供的。

7.项4-6任一项的方法，其中直到距初次暴露至少约70-75周时没有提供再次的抗体暴露。

8.项1的方法，其中所述第二抗体暴露是直到距初次暴露约46至60周时才提供的。

9.项1-8任一项的方法，其中每次抗体暴露是作为单剂抗体提供给受试者的。

10.项1-8任一项的方法，其中每次抗体暴露是作为两剂抗体提供给受试者的，其中所述两剂包括第一剂和第二剂。

11.项10的方法，其中所述第二剂是在距施用第一剂约3至17天时施用的。

12.项11的方法，其中所述第二剂是在距施用第一剂约6至16天时施用的。

13.项12的方法，其中所述第二剂是在距施用第一剂约13至16天时施用的。

14.项10-13任一项的方法，其中所述第一剂和第二剂抗体是各自约0.5至1.5克。

15.项10-14任一项的方法，其中所述第一剂和第二剂抗体是各自约0.75至1.3克。

16.项1-15任一项的方法，其中对受试者施用三次或更多次抗体暴露。

17.项1-16任一项的方法，其中对受试者施用四次或更多次抗体暴露。

18.项1-17任一项的方法，其中伴随着初次暴露或稍后暴露，施用第二药物，其中所述CD20抗体是第一药物。

19.项18的方法，其中所述第二药物选自：干扰素、醋酸格拉默、胞毒剂、化疗剂、米托蒽醌、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙种球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈滨、皮质类固醇、霉酚酸吗乙酯(MMF)、环孢菌素、抑制素类降低胆固醇的药物、雌二醇、睾酮、激素代替药物、TNF抑制剂、减轻疾病的抗风湿药(DMARD)、非类固醇抗炎药(NSAID)、左旋甲状腺素、环孢菌素A、促生长素抑制素类似物、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂、抗代谢物、免疫抑制剂、整联蛋白拮抗剂或抗体、LFA-1抗体、efalizumab、α4整联蛋白抗体、natalizumab及其它B细胞表面标志抗体。20.项1-19任一项的方法，其中所述多发性硬化是复发缓和型多发性硬化(RRMS)。

21.项1-19任一项的方法，其中所述多发性硬化是原发进行型多发性硬化(PPMS)。

22.项1-21任一项的方法，其中所述受试者先前从未用CD20抗体治疗过。

23.项1-22任一项的方法，其中所述抗体是裸抗体。

24.项1-22任一项的方法，其中所述抗体与另一分子偶联。

25.项24的方法，其中所述另一分子是胞毒剂。

26.项1-25任一项的方法，其中所述抗体是静脉内施用的。

27.项26的方法，其中每次抗体暴露的所述抗体是静脉内施用的。

28.项1-25任一项的方法，其中所述抗体是皮下施用的。

29.项1-25任一项的方法，其中所述抗体是鞘内施用的。

30.项1-29任一项的方法，其中所述CD20抗体是施用于所述受试者以治疗多发性硬化的唯一药物。

31.项1-30任一项的方法，其中所述抗体是Rituximab。

32.项1-30任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO：2和8中可变区序列的人源化2H7。

33.项1-30任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO：23和24中可变区序列的人源化2H7。

34.项1-33任一项的方法，其中所述受试者具有升高的抗髓磷脂碱性蛋白(MBP)、抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、抗神经节苷脂和/或抗神经丝抗体水平。

35.项1-34任一项的方法，其中所述受试者的脑脊液(CSF)、多发性硬化损伤或血清中存在升高的B细胞水平。

36.制品，其包括：

(c)装有CD20抗体的容器；和

(d)附有关于在受试者中治疗多发性硬化的说明书的包装插页，其中所述说明书指出对受试者施用一定量的抗体，它有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才施用的，且每次抗体暴露是作为单剂或两剂抗体提供给所述受试者的。

37.项36的制品，还包括装有第二药物的容器，其中所述CD20抗体是第一药物，且还包括包装插页上关于用所述第二药物治疗受试者的说明书。

38.项37的制成品，其中所述第二药物选自：干扰素、醋酸格拉默、胞毒剂、化疗剂、米托蒽醌、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙种球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈滨、皮质类固醇、霉酚酸吗乙酯(MMF)、环孢菌素、抑制素类降低胆固醇的药物、雌二醇、睾酮、激素代替药物、TNF抑制剂、减轻疾病的抗风湿药(DMARD)、非类固醇抗炎药(NSAID)、左旋甲状腺素、环孢菌素A、促生长素抑制素类似物、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂、抗代谢物、免疫抑制剂、及其它B细胞表面标志抗体。

附图简述

图1A是比较鼠源2H7(SEQ ID NO：1)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO：2)和人κ轻链亚组I(SEQ ID NO：3)每种的轻链可变区(V_L)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的V_L的CDR如下：CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)和CDR3(SEQ ID NO：6)。

图1B是比较鼠源2H7(SEQ ID NO：7)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO：8)和人重链亚组III共有序列(SEQ ID NO：9)每种的重链可变区(V_H)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的V_H的CDR如下：CDR1(SEQID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)和CDR3(SEQ IDNO：12)。

在图1A和图1B中，每条链中的CDR1、CDR2和CDR3都包括在括号内，侧翼为框架区FR1-FR4，如图所示。2H7指鼠源2H7抗体。两行序列之间的星号指示这两种序列之间不同的位置。残基编号依照Kabat等人，《Sequences of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1991，插入显示为a、b、c、d和e。

图2显示了成熟2H7.v16轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。

图3显示了成熟2H7.v16重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

图4显示了成熟2H7.v31重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。2H7.v31的轻链与2H7.v16相同。

图5显示了成熟2H7.v16和2H7.v511轻链(分别是SEQ ID NO：13和16)的对比，采用Kabat可变区残基编号和Eu恒定区残基编号。

图6显示了成熟2H7.v16和2H7.v511重链(分别是SEQ ID NO：14和17)的对比，采用Kabat可变区残基编号和Eu恒定区残基编号。

优选实施方案详述

I.定义

“B细胞”是在骨髓中成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。

“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达的、可用能结合它的抗体靶向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志(描述参见《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等人编，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标志包括RP105、FcRH2、B细胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287。本文中特别感兴趣的B细胞表面标志较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先在B细胞上表达，且可在前体B细胞和成熟B细胞二者上表达。优选的B细胞表面标志在本文中是CD20。

“CD20”抗原或“CD20”是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的一种约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上，但在干细胞上不表达。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。例如，Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：1766(1985)中描述了CD20抗原。

“抗体拮抗剂”在本文中指在结合B细胞上的B细胞表面标志后破坏或消减哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过降低或阻止由B细胞引发的体液反应)的抗体。优选的是，抗体拮抗剂能够在用其处理的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环中的B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖、和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。

术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见

Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所描述的。

“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合的抗原的细胞增殖的抗体。例如，抗体可在体外和/或在体内阻止或降低B细胞增殖。

“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，诱导例如B细胞的程序性细胞死亡的抗体。

术语“抗体”在本文中使用其最广的含义，具体覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展示所需生物学活性。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

为了本文的目的，“完整抗体”指包含重链和轻链可变区及Fc区的抗体。

“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的分子量约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在具有不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(V_H)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(V_L)，而另一端是一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。

术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在V_H-V_L二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外，这种变体通常以极少量存在。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术由噬菌体抗体库分离。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。

非人(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR，除了上文所述的FR替代。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones etal.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。

“裸抗体(naked antibody)”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体(本文所定义的)。

结合CD20抗原的抗体的实例包括：“C2B8”，现在称作“Rituximab”(利妥昔单抗，“RITUXAN”)(美国专利5,736,137)；钇[90]标记的2B8鼠源抗体，称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN

)，可从IDECPharmaceuticals，Inc.购买(美国专利5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠源IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”(托西莫单抗)，任选用¹³¹I标记以产生“¹³¹I-B1”抗体或“I131-tositumomab”抗体(BEXXAR^TM)，可从Corixa购买(还可见美国专利5,595,721)；鼠源单克隆抗体“1F5″(Press et al.，Blood 69(2)：584-591(1987)及其变体，包括“框架修补”或人源化1F5(WO 03/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠源2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180)；人源化2H7；HuMax-CD20(Genmab，丹麦，WO 2004/035607)；AME-133(Applied MolecularEvolution)；A20抗体或其变体，诸如嵌合或人源化A20抗体(分别是cA20或hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433，Immunomedics)；结合CD20的抗体，包括表位消减的Leu-16、1H4或2B8，任选与IL-2偶联，见US2005/0069545 A1和WO 2005/16969(Carr等人)；结合CD22和CD20的双特异性抗体，例如hLL2xhA20(WO 2005/14618，Chang等人)；单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte Typing Workshop)获得(Valentine等人，在《LeukocyteTyping III》中，McMichael编，第440页，Oxford University Press，1987)；1H4(Haisma et al.，Blood 92：184(1998))；抗CD20 auristatin E偶联物(SeattleGenetics)；抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)；抗CD20MAb疗法(EpiCyte)；及抗CD20抗体TRU 015(Trubion)。

术语“Rituximab”或“RITUXAN

”在本文中指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137中称作“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。Rituximab可从Genentech购买。

纯粹为了本文的目的且除非另有说明，“人源化2H7”指结合CD20的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效消减灵长类B细胞，该抗体在其重链可变区(V_H)中至少包含来自抗人CD20抗体的CDR H3序列SEQ ID NO：12(图1B)和基本上人重链亚组III(V_HIII)的人共有框架(FR)残基。在一个优选的实施方案中，该抗体还包含重链CDR H1序列SEQ ID NO：10和CDR H2序列SEQ ID NO：11，更优选还包含轻链CDR L1序列SEQ IDNO：4、CDR L2序列SEQ ID NO：5、CDR L3序列SEQ ID NO：6和基本上人轻链κ亚组I(VκI)的人共有框架(FR)残基，其中V_H区可连接人IgG链恒定区，其中所述区可以是例如IgG1或IgG3。在一个优选的实施方案中，此类抗体包含V_H序列SEQ ID NO：8(v16，如图1B所示)，任选还包含V_L序列SEQ ID NO：2(v16，如图1A所示)，它可在重链中具有氨基酸替代D56A和N100A以及在轻链中具有S92A(v96)。优选的是，所述抗体是包含轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：13和14(如图2和3所示)的完整抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是包含轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：13和15(如图2和4所示)的2H7.v31。本文中的抗体还可在Fc区中包含至少一个改进ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，诸如其中氨基酸替代是S298A/E333A/K334A的抗体，更优选具有重链氨基酸序列SEQ ID NO：15(如图4所示)的2H7.v31。任何这些抗体还可在Fc区中包含至少一个降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。见美国专利6,528,624B1(Idusogie等人)。

优选的人源化2H7是如下完整抗体或抗体片段，其包含轻链可变区序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：2)；

和重链可变区序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)。

当人源化2H7抗体是完整抗体时，优选的是，它包含轻链氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：13)；

和重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：14)

或重链氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：15)。

在本发明的优选实施方案中，基于2H7型式16的变体的可变区将具有v16的氨基酸序列，除了下表指出的氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的轻链。

“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“受试者”在本文中指人类受试者。通常，此类受试者符合接受多发性硬化治疗的条件。为了本文的目的，此类符合条件的受试者是正在发生、已经发生、或有可能发生多发性硬化的一种或多种征候、症状或其它指标；已经诊断有多发性硬化，无论是例如最近诊断(具有“新发作”的MS)，先前诊断有新的复发或加剧，先前诊断并处于消退期等；和/或有风险形成多发性硬化的受试者。患有或有风险患上多发性硬化的受试者可任选作为已经对血清、脑脊液(CSF)和/或MS损伤中CD20阳性B细胞水平升高筛选的受试者或者使用检测诸如下述自身抗体的测定法筛选的受试者而得到鉴定，其中定性且优选定量评估自身抗体生成。与多发性硬化有关的例示性此类自身抗体包括抗髓磷脂碱性蛋白(MBP)、抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、抗神经节苷脂和/或抗神经丝抗体。可在受试者的血清、脑脊液(CSF)和/或MS损伤中检测此类自身抗体。“升高的”自身抗体或B细胞水平在本文中意指所述自身抗体或B细胞水平显著超过未患MS的个体的水平。

“治疗”受试者在本文中指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有多发性硬化的受试者以及要预防多发性硬化的受试者。因此，受试者可能已经诊断为患有多发性硬化或者可能有患上多发性硬化的倾向或易感性。

MS的“症状”指受试者所发生的且指示MS的结构、功能或感觉方面的任何病态现象或偏离正常。

“多发性硬化”指以髓磷脂的进行性破坏为特征且常致残的中枢神经系统的慢性疾病。国际上公认有四种形式的MS，即原发进行型多发性硬化(primary progressive multiple sclerosis)(PPMS)、复发缓和型多发性硬化(relapsing-remitting multiple sclerosis)(RRMS)、继发进行型多发性硬化(SPMS)和进行性复发型多发性硬化(PRMS)。

“原发进行型多发性硬化”或“PPMS”的特征为从发作开始病情渐进性的发展，而根本没有重叠的复发和缓和。可能有病情稳定的时期，可能有较好和较坏的某些天或某些周。PPMS与RRMS和SPMS的区别在于其发作多在三十多岁后期或四十多岁早期，男性与女性同样有可能患此病，而且最初的病情常常在脊髓而不是脑。PPMS经常转移入脑部，但较RRMS或SPMS而言损伤脑区的可能性较小；例如，PPMS患者产生认知问题的可能性较小。PPMS是MRI扫描显示炎性(钆增强)损伤的可能性最小的MS亚型。该疾病的原发进行形式影响所有多发性硬化患者的10-15％。可依照McDonald etal.，Ann.Neurol.50：121-7(2001)的标准确定PPMS。本文中所治疗的患PPMS的受试者通常是可能或确定诊断患有PPMS的人。

“复发缓和型多发性硬化”或“RRMS”的特征在于复发(也称为病情加重)，在此期间新症状可能出现而老症状重新出现或恶化。复发之后是病情缓和期，在此期间患者完全或部分从复发期间所造成的缺陷中恢复。复发可持续数天、数周或数月，而恢复则可能是缓慢和逐步的，或者几乎是瞬间的。绝大部分MS患者首先诊断为RRMS。这通常是在他们二十多岁或三十多岁的时候，尽管诊断要知道的早得多或晚得多。表现出此MS亚型的女性患者是男性的两倍。在复发期间，髓磷脂，中枢神经系统(CNS)白质区中神经纤维(神经元)周围的保护性隔离鞘，可能被身体自身免疫系统的炎性反应所损伤。这引起许多神经学症状，根据CNS的哪个区域损伤而变化相当大。在复发后，炎性反应立即逐渐变弱，且CNS中一种特殊类型的神经胶质细胞(称为少突胶质细胞)发起髓鞘重新形成-轴突周围的髓鞘可被修复的过程。很可能是此髓鞘重新形成造成了病情缓和。大约50％的RRMS患者在发病10年内转变成SPMS。30年后，此数字升高至90％。在任何时间，此疾病的复发缓和形式占所有MS患者的55％。

“继发进行型多发性硬化”或“SPMS”的特征在于临床神经学损伤的稳定发展，具有或没有叠加的复发及较小的缓和和平稳状态。发生SPMS的人先前将经历过RRMS时期，此时期可能已持续了2至40年或更长时间的任何时长。存在的任何叠加的复发和缓和都倾向于随着时间的过去逐渐变少。从所述疾病的继发进行阶段开始，致残开始发展得比其在RRMS期间快得多，尽管这样的发展在某些个体中仍然可以是相当缓慢的。10年后，50％的RRMS患者将发展成SPMS。到25至30年，此数字将上升至90％。SPMS倾向于与较RRMS而言较低水平的炎性损伤形成相关，但病情继续发展。在任一时间，SPMS都占全部多发性硬化患者的30％左右。

“进行性复发型多发性硬化”或“PRMS”的特征在于临床神经学损伤的稳定发展及重叠的复发和缓和。在某次复发后会立即有显著的恢复，但在两次复发之间症状逐渐恶化。PRMS占全部多发性硬化患者的5％左右。有些神经学家认为PRMS是PPMS的一种变体。

表述“有效量”指有效预防、改善或治疗多发性硬化的抗体(或其它药物)的量。这样的有效量通常将导致MS的征候、症状或其它指标有所改善，诸如降低复发率、防止劳动能力丧失、减少脑MRI损伤的数目和/或体积、提高定时25步走、延长到达疾病发展情形的时间(例如使用扩展的能力丧失标度(Expanded Disability Status Scale，EDSS))等。

“抗体暴露”指接触或暴露于在约1-20天的一段时间里施用的一个或多个剂量中的本文抗体。所述剂量可以一次性给予，或者在该暴露期内以固定的或无规律的间隔给予。正如本文详述的，初次和稍后(如第二次或第三)的抗体暴露彼此在时间上隔开。

术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素(glucocorticoid)诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺(cyclophosphamide)；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(如美国专利4,120,649中所述，它掩盖MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，如泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T(pan-T)抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen等人，美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature341：482(1989)；及WO 91/01133)；及T细胞受体抗体(EP 340,109)，诸如T10B9。

术语“胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))、苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)))；蒽环类(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸盐类(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN

多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurinA、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacyto sine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，如TAXOL

紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANE^TM紫杉醇的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE

多西他塞(doxetaxel)(

-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR

吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE

长春瑞宾(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。

该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN

依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR

伏罗唑(vorozole)、FEMARA

来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX

阿纳托唑(anastrozole)；及抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及粘着性细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID

疫苗；PROLEUKIN

rIL-2；LURTOTECAN

拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX

rmRH；及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。

术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。

术语“激素”指多肽激素，通常由具有导管的腺器官分泌。激素包括例如生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；促乳素；胎盘催乳激素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素(activin)；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；及血小板生成素。在用于本文时，术语激素包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列激素的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。

术语“生长因子”指促进生长的蛋白质，包括例如肝生长因子；成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、和粒细胞CSF(G-CSF)。在用于本文时，术语生长因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列生长因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。

术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且涉及多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡的受体蛋白质。它们是涉及细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞黏附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成，称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性，β亚基也是如此。受体总是含有一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1、α4整联蛋白等。在用于本文时，术语整联蛋白包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列整联蛋白的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。

本文中“整联蛋白拮抗剂或抗体”的例子包括LFA-1抗体，诸如可从Genentech购买的efalizumab(RAPTIVA

)；α4整联蛋白抗体，诸如可从Biogen购买的natalizumab(TYSABRI)；二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO2003/89410)；苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO2002/16329和WO 2003/53926)；苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)；烯胺衍生物(WO 2001/79173)；丙酸衍生物(WO 2000/37444)；链烷酸衍生物(WO 2000/32575)；取代苯基衍生物(美国专利6,677,339和6,348,463)；芳香胺衍生物(美国专利6,369,229)；及ADAM解联蛋白结构域多肽(US2002/0042368)；针对αvβ3整联蛋白的抗体(EP 633945)；氮桥二环氨基酸衍生物(WO 2002/02556)等。

为了本发明的目的，“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”指包含Pennica et al.，Nature 312：721(1984)或Aggarwal et al.，JBC 260：2345(1985)中所述氨基酸序列的人TNF-α分子。

“TNF-α抑制剂”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物学功能的药剂，通常通过结合TNF-α和中和其活性。本文具体涵盖的TNF抑制剂的例子是依那西普(etanercept)(ENBREL

)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE

)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA^TM)。

“减轻疾病的抗风湿药”或“DMARD”的例子包括羟氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗(加上口服和皮下甲氨喋呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附，包括其盐和衍生物等。

“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子是乙酰水杨酸、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物等。

“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构，模拟或提高天然存在皮质类固醇的效果的数种合成的或天然存在的物质的任一种。合成的皮质类固醇的例子包括泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)(包括甲泼尼龙(methylprednisolone))、地塞米松(dexamethasone)、糖皮质激素(glucocorticoid)和倍他米松(betamethasone)。

“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗性产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗性产品、和/或警告的信息。

II.治疗

本发明提供了在患有多发性硬化的受试者中治疗该病的方法，包括对受试者施用有效量的结合B细胞表面标志的抗体(优选CD20抗体)。本文中待治疗的MS包括原发进行型多发型硬化(PPMS)、复发缓和型多发性硬化(RRMS)、继发进行型多发性硬化(SPMS)和进行性复发型多发性硬化(PRMS)，但PPMS或RRMS的疗法是本文中的优选实施方案。

依照一个优选的剂量给药方案，所述方法包括对MS受试者施用有效量的CD20抗体，以提供约0.5至4克(优选约1.5至2.5克)的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克(优选约1.5至2.5克)的第二次抗体暴露，其中所述第二次暴露是直到距初次抗体暴露约16至60周时才提供的。为了本发明的目的，第二次抗体暴露指在初次抗体暴露后下次用CD20抗体处理受试者，其中在初次和第二次暴露之间没有居间的CD20抗体处理或暴露。

初次和第二次或后续抗体暴露之间的间隔可以从初次抗体暴露的第一剂或第二剂测起，但优选从初次抗体暴露的第一剂算起。

在本文的优选实施方案中，抗体暴露间隔约24周或6个月；或者间隔约48周或12个月。

在一个实施方案中，所述第二次抗体暴露是直至距初次暴露约20至30周时才提供的，任选后续约0.5至4克(优选约1.5至2.5克)的第三次抗体暴露，所述第三次抗体暴露是直至距初次暴露约46至60周(优选约46至54周)时才施行的，然后，优选直至距初次暴露至少约70-75周是也没有提供更多的抗体暴露。

在一个替代的实施方案中，所述第二次暴露是直至距初次暴露约46至60周时才提供的，且后续抗体暴露，若有的话，是直至距先前的抗体暴露约46至60周时才提供的。

可以作为单剂量的抗体或者作为两个分开剂量(separate doses)的抗体(即包括第一剂和第二剂(a first dose and a second dose))给受试者提供本文中的任何一次或多次抗体暴露。每次抗体暴露所采用的具体剂数(无论是一剂或两剂)取决于例如所治疗MS的类型、所采用抗体的类型、是否采用第二药物或采用哪种类型、及施用的方法和频率。在施用两个分开剂量时，优选第二剂在距施用第一剂的时间约3-17天、更优选约6-16天、且最优选约13-16天时施用。在施用两个分开剂量时，优选第一剂和第二剂抗体为约0.5-1.5克，更优选约0.75-1.3克。

在一个实施方案中，给受试者提供至少约3次、或至少约4次抗体暴露，例如约3-60次暴露，且更特别的是约3-40次暴露，最特别的是约3-20次暴露。优选的是，此类暴露以每个约24周或6个月或者48周或12个月的间隔施用。在一个实施方案中，每次抗体暴露是作为单一剂量的抗体提供的。在一个替代的实施方案中，每次抗体暴露是作为两个分开剂量的抗体提供的。然而，不是每次抗体暴露都需要作为单一剂量或两个分开剂量提供的。

抗体可以是裸抗体，或者可以偶联另一分子，诸如胞毒剂，诸如放射性化合物。本文中优选的抗体是Rituximab、人源化2H7(例如包含SEQ ID NO：2和8中的可变区序列)或包含SEQ ID NO：23和24中的可变区序列的人源化2H7、或HuMax-CD20(Genmab)。

在一个实施方案中，受试者先前从未用诸如免疫抑制剂等药物处理以治疗多发性硬化和/或先前从未用针对B细胞表面标志的抗体治疗过(例如先前从未用CD20抗体治疗过)。

所述抗体以任何合适方式施用，包括肠胃外、局部、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还设想了鞘内施用(参阅例如美国专利申请2002/0009444，Grillo-Lopez，A concerning intrathecal delivery of a CD20antibody)。此外，还可合适的通过脉冲输注来施用抗体，例如用剂量逐渐减少的抗体。优选静脉内、皮下或鞘内给药，最优选静脉内输注。

虽然CD20抗体可以是为了治疗多发性硬化而施用于受试者的唯一药物，但是可任选伴随着结合B细胞表面标志的抗体(例如伴随着CD20抗体)，施用第二药物，诸如胞毒剂、化疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂或抗体、生长因子、激素、整联蛋白、整联蛋白拮抗剂或抗体(例如LFA-1抗体，诸如可从Genentech购得的efalizumab(RAPTIVE

)或α4整联蛋白抗体，诸如可从Biogen购得的natalizumab(TYSABRI

))等。

在联合疗法的优选实施方案中，抗体可联合以下药物：干扰素类药物，诸如IFN-β-1a(REBIF

和AVONEX

)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，诸如醋酸格拉默(glatiramer acetate)(COPAXONE

)；胞毒剂，诸如米托蒽醌(NOVANTRONE

)、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞消减性疗法(例如米托蒽醌、环磷酰胺、Campath、抗CD4、克拉屈滨(cladribine)、全省照射、骨髓移植)；皮质类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松、地塞米松或糖皮质激素)，包括系统皮质类固醇疗法；非淋巴细胞消减性免疫抑制性疗法(例如霉酚酸吗乙酯(MMF)或环孢菌素)；“抑制素(statin)”类降低胆固醇的药物，包括西立伐他汀(cerivastatin)(BAYCOL^TM)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOL^TM)、阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITOR^TM)、洛伐他汀(lovastatin)(MEVACOR^TM)、普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOL^TM)、辛伐他汀(simvastatin)(ZOCOR^TM)；雌二醇；睾酮(任选提高的剂量；Stuve et al.，Neurology 8：290-301(2002))；激素代替疗法；MS继发的或相关的症状(例如痉挛、失禁、疼痛、疲劳)的治疗；TNF抑制剂；减轻疾病的抗风湿药(DMARD)；非类固醇抗炎药(NSAID)；血浆去除术；左旋甲状腺素；环孢菌素A；促生长素抑制素类似物；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂；抗代谢物；免疫抑制剂；康复性手术；放射碘；甲状腺切除术；其它B细胞表面标志拮抗剂/抗体；等。

第二药物伴随着CD20抗体的初次暴露和/或稍后暴露施用，此类联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，以及任一次序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。

除对受试者施用抗体外，本申请设想了通过基因疗法来施用抗体。表述施用“有效量”的抗体涵盖编码抗体的核酸的此类施用。参见例如1996年3月14日出版的WO 96/07321，它关注通过基因疗法来生成胞内抗体。

有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入受试者的细胞，即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到受试者体内。对于回体治疗，采集受试者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入受试者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；及Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)中描述了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因疗法方案的综述参见Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。

III.抗体的生产

本发明的方法和制品使用或掺入结合B细胞表面标志的抗体，尤其是结合CD20的抗体。因此，本文将描述用于生成此类抗体的方法。

将用于生成或筛选抗体的B细胞表面标志可以是例如包含所需表位的可溶形式的所述标志或其部分。或者/另外，在其细胞表面表达所述标志的细胞可用于生成或筛选抗体。可用于生成抗体的其它形式的B细胞表面标志对本领域熟练技术人员是显而易见的。

下面的描述例示了用于生产依照本发明使用的抗体的方法。

(i)多克隆抗体

多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔

血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将该溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行强化。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。

(ii)单克隆抗体

单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了在生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外，这种变体通常以很少量存在。由此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征，即不是分立的或多克隆的抗体的混合物。

例如，单克隆抗体可以通过最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，以及可从American Type Culture Collection(Rockville，Maryland，USA)购得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法进行培养(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。

编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如不另外产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。

在另一个实施方案中，可从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson etal.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。由此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。

通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

(iii)人源化抗体

本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

(iv)人抗体

作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。

或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。

还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。

(v)抗体片段

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)₂片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

(vi)双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合B细胞表面标志的两种不同表位。其它此类抗体可结合B细胞表面标志且还结合第二种不同的B细胞表面标志。或者，抗B细胞表面标志结合臂可与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，使得细胞防御机制聚焦于B细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于B细胞。这些抗体拥有B细胞表面标志结合臂以及结合胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)₂双特异性抗体)。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。

根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。

在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh et al.，Methodsin Enzymology 121：210(1986)。

根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分C_H3抗体恒定区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。

文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L区与另一个片段上的互补V_L和V_H区配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。

设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。

IV.抗体的偶联物和其它修饰

任选将本文方法中所使用的或制品中所包含的抗体与胞毒剂偶联。例如，可将抗体与WO 2004/032828中描述的药物偶联。

上文已经描述了可用于生成此类抗体-胞毒剂偶联物的化疗剂。

本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素形成的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。在本发明的一个实施方案中，将抗体与一个和多个美登素分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体偶联物。

或者，将抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。

可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日出版的WO 1993/21232。

本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)偶联的抗体。

有多种放射性同位素可用于生成放射性偶联抗体。例子包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992))。

或者，可例如通过重组技术或肽合成法来制备包含抗体和胞毒剂的融合蛋白。

在另一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联，用于肿瘤的预定位，其中对受试者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与胞毒剂(例如放射性核苷)偶联的“配体”(例如亲合素)。

还可将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联，后者将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。

此类偶联物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。

可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。

可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.，Nature 312：604-608(1984))。

本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。与一个和多个PEG分子连接的抗体片段，诸如Fab’是本发明尤其优选的实施方案。

本文公开的抗体还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO 97/38731中所述。美国专利5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。

可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，以产生具有所需直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)：1484(1989)。

设想了抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸或通过肽合成法来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可能改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。由此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变，并对所表达的抗体变体筛选所需活性。

氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基到包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或提高抗体血清半衰期的多肽。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣在抗体中进行替代诱变的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。保守替代在表1中显示在“优选替代”标题下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。

表1

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys

Asn(N)	Gln；His；Asp，Lys；Arg	Gln
			Asp(D)	Glu；Asn	Glu
Cys(C)	Ser；Ala	Ser
			Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
Glu(E)	Asp；Gln	Asp
			Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val；Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，在《Biochemistry》中，第2版，73-75，Worth Publishers，New York，1975)：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，根据共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。

任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。

特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。此类改变包括删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。

多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上文描述的三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。

在抗体包含Fc区时，可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请2003/0157108 A1(Presta，L.)中描述了具有成熟碳水化合物结构的抗体，所述结构缺乏附着于抗体Fc区的岩藻糖。还可参见US 2004/0093621 A1(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.)，它关注CD20抗体组合物。WO 03/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利6,602,684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO97/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。关于附着于其Fc区的碳水化合物更改了的抗体还可参见WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。

本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：美国专利申请US 2003/0157108 A1，Presta，L.；WO2000/61739 A1；WO 2001/29246 A1；US 2003/0115614 A1；US 2002/0164328A1；US 2004/0093621 A1；US 2004/0132140 A1；US 2004/0110704 A1；US2004/0110282 A1；US 2004/0109865 A1；WO 2003/085119 A1；WO2003/084570 A1；WO 2005/035778；WO 2005/035586(描述岩藻糖化的RNA抑制(RNAi))；Okazaki et al.，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；及Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87：614(2004))。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，并因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson etal.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

WO 00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334包含替代。优选的是，改变的Fc区是在一个、两个或三个这些位置处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。

WO 99/51642、美国专利6,194,551B1、美国专利6,242,195B1、美国专利6,528,624B1和美国专利6,538,124(Idusogie等人)中描述了具有改变的C1q结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。这些抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一个或多个处包含氨基酸替代。

为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。WO 00/42072(Presta，L.)中也描述了在其Fc区中具有替代且血清半衰期提高了的抗体。

还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的改造抗体(美国专利申请US 2002/0004587 A1，Miller等人)。

V.药用配制剂

制备依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂，即将具有所需纯化程度的抗体与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以冻干配制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

例示性抗CD20抗体配制剂描述于WO 98/56418。该出版物描述了液体多剂量配制剂，其中含有40mg/mL Rituximab，25mM醋酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨醇酯20，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20配制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用无菌水，pH6.5中包含10mg/mL Rituximab。

适于皮下施用的冻干配制剂描述于美国专利6,267,958(Andya等人)。此类冻干配制剂可用合适的稀释剂重建成高蛋白质浓度，且重建后的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。

还设想了结晶形式的抗体。参见例如US 2002/0136719A1(Shenoy等人)。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能还希望在配制剂中提供胞毒剂；化疗剂；免疫抑制剂；细胞因子；细胞因子拮抗剂或抗体；生长因子；激素；整联蛋白；整联蛋白拮抗剂或抗体(例如LFA-1抗体，诸如可从Genentech购得的efalizumab/RAPTIVE或α4整联蛋白抗体，诸如可从Biogen购得的natalizumab/ANTEGREN

)；干扰素类药物，诸如IFN-β-1a(REBIF

和AVONEX

)或IFN-β-1b(BETASERON

)；寡肽，诸如醋酸格拉默(COPAXONE)；胞毒剂，诸如米托蒽醌(NOVANTRONE

)、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或硫唑嘌呤；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞消减性药物，例如米托蒽醌、环磷酰胺、Campath、抗CD4或克拉屈滨；非淋巴细胞消减性免疫抑制性药物，例如霉酚酸吗乙酯(MMF)或环孢菌素；“抑制素(statin)”类降低胆固醇的药物；雌二醇；睾酮；激素代替疗法；治疗MS继发的或相关的症状(例如痉挛、失禁、疼痛、疲劳)的药物；TNF抑制剂；减轻疾病的抗风湿药(DMARD)；非类固醇抗炎药(NSAID)；皮质类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松、地塞米松或糖皮质激素)；左旋甲状腺素；环孢菌素A；促生长素抑制素类似物；细胞因子拮抗剂；抗代谢物；免疫抑制剂；整联蛋白拮抗剂或抗体(例如LFA-1抗体，诸如efalizumab或α4整联蛋白抗体，诸如natalizumab)；或其它B细胞表面标志拮抗剂/抗体等。此类其它药剂的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的抗体的量、所治疗多发性硬化的类型、及受试者的临床参数。这些通常以与上文所用相同的剂量和施用途径或者迄今所用剂量的大约1-99％使用。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。

可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

VI.制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了装有可用于治疗上文所述多发性硬化的物质的制品。优选的是，该制品包含：(a)装有包含结合B细胞表面标志的抗体(如CD20抗体)和制药学可接受载体或稀释剂的组合物的容器；及(b)附有说明书的包装插页，关于对患有多发性硬化的受试者施用所述组合物，以提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才提供的；或是关于对患有PPMS的受试者施用所述组合物。

所述制品包括容器和贴在所述容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效治疗多发性硬化的组合物，且可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。所述组合物中的至少一种活性剂是抗体。所述标签或包装插页表明该组合物用于在含有多发性硬化的受试者中治疗该病，所述治疗遵循关于所提供的抗体和任何其它药物的剂量给药数量和间隔的具体指示。该制品还可包括第二容器，其中装有制药学可接受的稀释缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。该制品还可包括商业和使用者立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

任选的是，本文中的制品还包括装有除抗体之外用于治疗的药剂，且还包括用所述药剂治疗哺乳动物的说明书，所述药剂优选是化疗剂；免疫抑制剂；干扰素类药物，干扰素类药物，诸如IFN-β-1a(REBIF

和AVONEX

)或IFN-β-1b(BETASERON

)；寡肽，诸如醋酸格拉默(COPAXONE

)；胞毒剂，诸如米托蒽醌(NOVANTRONE

)、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和硫唑嘌呤；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞消减性药物，例如米托蒽醌、环磷酰胺、Campath、抗CD4或克拉屈滨；非淋巴细胞消减性免疫抑制性药物，例如霉酚酸吗乙酯(MMF)或环孢菌素；“抑制素(statin)”类降低胆固醇的药物；雌二醇；激素代替疗法；治疗MS继发的或相关的症状(例如痉挛、失禁、疼痛、疲劳)的药物；TNF抑制剂；减轻疾病的抗风湿药(DMARD)；非类固醇抗炎药(NSAID)；皮质类固醇，例如甲泼尼龙、泼尼松、地塞米松或糖皮质激素；左旋甲状腺素；环孢菌素A；促生长素抑制素类似物；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂；抗代谢物；免疫抑制剂；整联蛋白拮抗剂或抗体，例如LFA-1抗体，诸如efalizumab或α4整联蛋白抗体，诸如natalizumab；其它B细胞表面标志拮抗剂/抗体；等等。

下面的非限制性实施例阐明了本发明的更多细节。将说明书中所有引用的公开内容明确引入本文作为参考。

实施例

实施例1：原发进行型多发性硬化(PPMS)的治疗

在此实施例中用CD20抗体治疗诊断患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50：121-7(2001)定义的PPMS的受试者。

Rituximab，可从Genentech购买，配制用于静脉内施用，即9.0mg/mL氯化钠，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，7.35mg/mL无水柠檬酸钠和注射用无菌水(pH 6.5)中的无菌产品。

第一个疗程将包括在第1天和第15天各自静脉内(IV)施用一剂1gRituximab。受试者在每次输注开始之前30-60分钟将经口腔接受醋氨酚(1g)和盐酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)(50mg)或等效物。

后续疗程将在第24周(第169天)、第48周(第337天)和第72周(第505天)开始施用。后续疗程的第二次输注将在第一次输注后的第14±1天。

发生第一次复发的受试者可通过静脉内或口服皮质类固醇接受补救治疗。可用不超过MS复发治疗适合的暴露量或持续时间的摄生法施用系统皮质类固醇。复发定义为以下所有各项：

●持续至少24小时的神经学异常的急性发作；

●不可归因于发热、感染、外伤、伴随的药物治疗或其它病因的变化；

●在不知情检测人员所进行的检查中具有客观变化的结果，包括下列一项或多项FS衡量标准最小1个点的变化：锥体、颅神经、小脑、感觉、视觉或步态。

可使用以下皮质类固醇摄生法：每日静脉内施用1克甲泼尼龙，持续3天，随后每日60mg泼尼松，持续5天，之后以每天10mg的降幅减少施用量。如果不能施用静脉内甲泼尼龙，那么可用持续3天每日静脉内150mg地塞米松替代。对于病情恶化只应施用一个疗程的皮质类固醇。皮质类固醇摄生法完成后至少4周，应进行后续免疫学研究和MRI扫描。可使用皮质类固醇吸入器(通过口和鼻)或关节内注射。

任选与CD20抗体组合的其它治疗方法包括IFN-β、醋酸格拉默、甲氨喋呤、环磷酰胺或米托蒽醌。

主要功效结果测量是证实疾病发展的时间。疾病发展定义为：如果基线扩展的伤残状态标准(Expanded Disability Status Scale，EDSS)(Kurtzke J.，Neurology 33(11)：1444-52(1983))在2.0和5.5点之间(含)，则距基线EDSS有≥1.0个点的增加，或者如果基线EDSS≥5.5个点(含)，则增量≥0.5个点，且有关变化不可归因于别的病因(例如发热、并发疾病、MS复发或恶化、或伴随的药物治疗)。可在初次病情发展后至少12周(84天)时进行有规律的定期巡诊，证实疾病的发展。

次要功效结果测量包括：

-脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的T2损伤总体积的变化；

-脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的脑体积的变化。

任选的是，以下任何一项或多项的改善：

-多发性硬化功能综合标准(Multiple Sclerosis Functional CompositeScale，MSFCS)；

-EDSS；

-根据EDSS的测定，在第96周时证实疾病有发展的受试者比例；

-上肢功能，根据9孔栓测试法(9-Hole Peg Test)(MSFCS的子标准)测量；

-走动，根据定时25步行走法(Timed 25-Foot Walk)(MSFCS的子标准)测量；

-认知，根据步调听觉连续增加测试(Paced Auditory Serial Addition Test)(只有3秒；MSFCS的子标准)；

-MRI扫描中脑T2损伤的总体积(第48周和第122周)；

-MRI扫描中脑T1损伤的总体积；

-MRI扫描中颈部脊髓的横切面；

-MRI扫描的脑体积(第48周和第122周)。

依照以上任何一项或多项效果测量，如本文所述用Rituximab治疗的受试者将显示出PPMS的征候、症状或其它指标的改善。

实施例2：复发缓和型多发性硬化的治疗

在此实施例中用CD20抗体治疗患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50：121-7(2001)定义的RRMS的受试者，其中抗体暴露相隔约6个月。

第一个疗程将包括在第1天和第15天各自静脉内(IV)施用一剂1gRituximab。受试者在每次输注开始之前30-60分钟将经口腔接受醋氨酚(1g)和盐酸苯海拉明(50mg)或等效物。

优选的是，Rituximab是为治疗RRMS而施用的唯一药剂。然而，受试者可任选接受静脉内或口服皮质类固醇、IFN-β、醋酸格拉默、甲氨喋呤、环磷酰胺或米托蒽醌。

发生第一次复发的受试者可通过静脉内或口服皮质类固醇接受补救治疗。可用不超过MS复发治疗适合的暴露量或持续时间的摄生法施用系统皮质类固醇。复发在此实施例中定义为：

在神经学状态已相对稳定或改善至少30天的受试者中，符合MS的新的或复发的神经学症状持续超过48小时。神经学症状的改变必须伴随着符合如下标准的客观神经性恶化：EDSS增加至少半级，或者恰当的功能体系评分(functional system scores，FSS)之一增加至少两个点，或者两项或多项适当的FSS增加1个点。所述变化必须由检查的调查人员证实，且必须影响选定的FS标准(即锥体、步态、小脑、脑干、感觉或视觉)。症状必须持续≥24小时，且应不可归因于混杂的临床因素(例如发热、感染、受伤、对伴随的药物治疗的不良反应)。突发症状的单一事件(例如强直性痉挛)不是复发，但突发症状多次出现的新发作超过至少24小时，如果伴随着新的、相应的客观表现，则可能是复发。没有临床检查变化的感觉症状、疲乏、情绪变化、或膀胱或肠急迫或失禁都不足以确定为复发。

主要功效结果测量是钆增强性损伤的MRI终点，或者证实疾病有发展(定义为比基线扩展的伤残状态标准(EDSS)增加≥1.0个点；Kurtzke J.，Neurology 33(11)：1444-52(1983))的时间。主要功效终点可以是第12、16、20和24周时在脑部连续MRI扫描上观察到的钆增强性T1损伤的总数。

次要功效结果测量包括复发的频率；脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的T2损伤总体积的变化(例如从筛选至第24和36周脑部MRA扫描呈现的T2损伤总体积的变化)；脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的脑体积的变化；多发性硬化功能综合标准(MSFCS)及其子标准；上肢功能，根据9孔栓测试法(MSFCS的子标准)测量；走动，根据定时25步行走法(MSFCS的子标准)测量；认知，根据步调听觉连续增加测试(MSFCS的子标准)；多发性硬化生活质量-54(Multiple Sclerosis Quality of Life-54，MSQOL-54)调查表；MRI扫描中脑T1损伤的总体积(例如第20、28和36周时脑部连续MRA扫描中钆增强性T1损伤的总数)；MRI扫描中颈部脊髓的横切面；到第24周(即在第0周和第24周之间)和第36周(即在第0周和第36周之间)复发受试者的比例；第24周和第36周时的综合单项活动测量(CombinedUnique Activity Measure，CUAM)。

如上所述用Rituximab治疗的受试者将在以上任何一项或多项效果测量中呈现出有改善。

实施例3：复发缓和型多发性硬化的治疗

在此实施例中用CD20抗体治疗患有McDonald et al.，Ann.Neurol.50：121-7(2001)所定义的RRMS的受试者，其中抗体暴露相隔约1年。

后续疗程将在第48周和第96周开始施用。后续疗程的第二次输注将在第一次输注后的第14±1天。

在神经学状态已相对稳定或改善至少30天的受试者中，符合MS的新的或复发的神经学症状持续超过48小时。神经学症状的改变必须伴随着符合如下标准的客观神经性恶化：EDSS增加至少半级，或者恰当的功能体系评分(FSS)之一增加至少两个点，或者两项或多项适当的FSS增加1个点。所述变化必须由检查的调查人员证实，且必须影响选定的FS标准(即锥体、步态、小脑、脑干、感觉或视觉)。症状必须持续≥24小时，且应不可归因于混杂的临床因素(例如发热、感染、受伤、对伴随的药物治疗的不良反应)。突发症状的单一事件(例如强直性痉挛)不是复发，但突发症状多次出现的新发作超过至少24小时，如果伴随着新的、相应的客观表现，则可能是复发。没有临床检查变化的感觉症状、疲乏、情绪变化、或膀胱或肠急迫或失禁都不足以确定为复发。

次要功效结果测量包括复发的频率；脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的T2损伤总体积的变化(例如从筛选至第24和36周脑部MRA扫描呈现的T2损伤总体积的变化)；脑部MRI扫描呈现的基线至第96周的脑体积的变化；多发性硬化功能综合标准(MSFCS)及其子标准；上肢功能，根据9孔栓测试法(MSFCS的子标准)测量；走动，根据定时25步行走法(MSFCS的子标准)测量；认知，根据步调听觉连续增加测试(MSFCS的子标准)；多发性硬化生活质量-54(MSQOL-54)调查表；MRI扫描中脑T1损伤的总体积(例如第20、28和36周时脑部连续MRA扫描中钆增强性T1损伤的总数)；MRI扫描中颈部脊髓的横切面；到第24周(即在第0周和第24周之间)和第36周(即在第0周和第36周之间)复发受试者的比例；第24周和第36周时的综合单项活动测量(CUAM)。

实施例4：人源化2H7变体

此实施例描述了可用于本文所公开的方法的人源化2H7抗体变体。人源化2H7抗体优选包含一个、两个、三个、四个、五个或六个下列CDR序列：

CDR L1序列RASSSVSYXH，其中X是M或L(SEQ ID NO：18)，例如SEQID NO：4(图1A)，

CDR L2序列SEQ ID NO：5(图1A)，

CDR L3序列QQWXFNPPT，其中X是S或A(SEQ ID NO：19)，例如SEQID NO：6(图1A)，

CDR H1序列SEQ ID NO：10(图1B)，

CDR H2序列AIYPGNGXTSYNQKFKG，其中X是D或A(SEQ ID NO：20)，例如SEQ ID NO：11(图1B)，及

CDR H3序列VVYYSXXYWYFDV，其中位置6的X是N、A、Y、W或D，而位置7的X是S或R(SEQ ID NO：21)，例如SEQ ID NO：12(图1B)。

上述CDR序列通常存在于人源轻链和重链可变区框架序列内，诸如主要是人轻链κ亚类I(VκI)的人共有FR残基，和主要是人重链亚类III(V_HIII)的人共有FR残基。还可参见WO 2004/056312(Lowman等人)。

重链可变区可连接人IgG链恒定区，其中所述区可以是例如IgG1或IgG3，包括天然序列和变体恒定区。

在一个优选的实施方案中，此类抗体包含SEQ ID NO：8的重链可变区序列(v16，如图1B所示)，任选还包含SEQ ID NO：2的轻链可变区序列(v16，如图1A所示)，它任选在重链可变区的位置56、100和/或100a处包含一个或多个氨基酸替代，如D56A、N100A或N100Y、和/或S100aR，及在轻链可变区的位置32和/或92处包含一个或多个氨基酸替代，如M32L和/或S92A。优选的是，所述抗体是包含SEQ ID NO：13或16的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：14、15、17、22或25的重链氨基酸序列的完整抗体。

一种优选的人源化2H7抗体是ocrelizumab(Genentech)。

本文中的抗体还可在Fc区中包含至少一个改进ADCC活性的氨基酸替代，诸如在位置298、333和334处的氨基酸替代，优选S298A、E333A和K334A，使用Eu重链残基编号。还可参见美国专利6,737,056 B1(Presta)。

任何这些抗体可在Fc区中包含至少一个改进FcRn结合或血清半衰期的替代，例如在重链位置434处的替代，诸如N434W。还可参见美国专利6,737,056 B1(Presta)。

任何这些抗体还可在Fc区中包含至少一个提高CDC活性的氨基酸替代，例如在位置326处包含至少一个替代，优选K326A或K326W。还可参见美国专利6,528,624 B1(Idusogie等人)。

有些优选的人源化2H7变体是那些包含SEQ ID NO：2的轻链可变区和SEQ ID NO：8的重链可变区的抗体，包括那些在Fc区(如果存在的话)中具有或没有替代的抗体，和那些包含在SEQ ID NO：8中具有改变N100A；或是D56A及N100A；或是D56A、N100Y及S100aR的重链可变区和在SEQID NO：2中具有改变M32L；或是S92A；或是M32L及S92A的轻链可变区的抗体。

2H7.v16重链可变区中的M34已经鉴定为抗体稳定性的潜在来源，且是替代的另一个潜在候选位置。

在本发明的一些各种优选实施方案的总结中，基于2H7.v16的变体的可变区包含v16的氨基酸序列，除了下表所示氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的轻链。

例示性人源化2H7抗体变体

一种优选的人源化2H7包含2H7.v16轻链可变区序列：

和2H7.v16重链可变区序列：

若人源化2H7.v16抗体是完整抗体，则它可包含轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：13)；

和重链氨基酸序列SEQ ID NO：14或：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：22)。

另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7.v511轻链可变区序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：23)；

和2H7.v511重链可变区序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：24)。

若人源化2H7.v31抗体是完整抗体，则它可包含轻链氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：16)；

和重链氨基酸序列SEQ ID NO：17或：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：25)。

Claims

2.权利要求1的方法，还包括对所述受试者施用有效量的所述CD20抗体，以提供约0.5至4克的第三次抗体暴露，所述第三次暴露是直到距初次暴露约46至60周时才提供的。

3.权利要求1或2的方法，其中伴随着初次暴露或稍后暴露，施用第二药物，其中所述CD20抗体是第一药物。

4.权利要求3的方法，其中所述第二药物选自：干扰素、醋酸格拉默、胞毒剂、化疗剂、米托蒽醌、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙种球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈滨、皮质类固醇、霉酚酸吗乙酯(MMF)、环孢菌素、抑制素类降低胆固醇的药物、雌二醇、睾酮、激素代替药物、TNF抑制剂、减轻疾病的抗风湿药(DMARD)、非类固醇抗炎药(NSAID)、左旋甲状腺素、环孢菌素A、促生长素抑制素类似物、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂、抗代谢物、免疫抑制剂、整联蛋白拮抗剂或抗体、LFA-1抗体、efalizumab、α4整联蛋白抗体、natalizumab及其它B细胞表面标志抗体。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述抗体是Rituximab。

6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO：2和8中可变区序列的人源化2H7。

7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO：23和24中可变区序列的人源化2H7。

8.制品，其包括：

(a)装有CD20抗体的容器；和

(b)附有关于在受试者中治疗多发性硬化的说明书的包装插页，其中所述说明书指出对受试者施用一定量的抗体，它有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至60周时才施用的，且每次抗体暴露是作为单剂或两剂抗体提供给所述受试者的。

9.权利要求8的制品，还包括装有第二药物的容器，其中所述CD20抗体是第一药物，且还包括包装插页上关于用所述第二药物治疗受试者的说明书。

10.权利要求9的制成品，其中所述第二药物选自：干扰素、醋酸格拉默、胞毒剂、化疗剂、米托蒽醌、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、丙种球蛋白、Campath、抗CD4、克拉屈滨、皮质类固醇、霉酚酸吗乙酯(MMF)、环孢菌素、抑制素类降低胆固醇的药物、雌二醇、睾酮、激素代替药物、TNF抑制剂、减轻疾病的抗风湿药(DMARD)、非类固醇抗炎药(NSAID)、左旋甲状腺素、环孢菌素A、促生长素抑制素类似物、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂、抗代谢物、免疫抑制剂、及其它B细胞表面标志抗体。