KR20070086218A - 자가면역 질환에 대한 이전 요법에 실패했던 환자에서의,자가면역 질환의 항-혈관신생 요법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 혈관신생 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체를 사용한 요법을 기재한다. 특히, 본 발명은 예를 들어 DMARD 또는 TNFα-억제제를 사용한 이전 치료에 실패했던 환자에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 상기 길항제의 용도에 관해 기재한다.

혈관신생 길항제, 자가면역 질환, 항-VEGF 항체, DMARD제, TNFα-억제제, 류마티스성 관절염

Description

자가면역 질환에 대한 이전 요법에 실패했던 환자에서의, 자가면역 질환의 항-혈관신생 요법 {ANTIANGIOGENESIS THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASE IN PATIENTS WHO HAVE FAILED PRIOR THERAPY}

관련 출원

본 출원서는 37 CFR §1.53(b)하의 정식 출원으로서, 35 U.S.C. §119(e)하에 2004년 12월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60/637,169호를 우선권으로 청구하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 항-VEGF 항체와 같은 혈관신생 길항제를 사용한 요법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 자가면역 질환에 대한 이전 요법에 실패했던 환자에서 자가면역 질환을 치료하는데 있어서의 상기 길항제의 용도에 관한 것이다.

류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 혈관염, 및 루푸스 등과 같은 자가면역 질환은 여전히 인간에서 임상적으로 특히 중요한 질환이다. 통칭하여 자가면역 질환은 북미인과 유럽인의 약 5％에 영향을 미치며 이들 중 2/3가 여성이다. 그 명칭이 암시하는 바와 같이, 자가면역 질환은 신체의 고유 면역계를 통해 파괴력을 발휘한다. 면역계는, 정상적으로는 미생물 세계로부터의 외부 위협을 방어하는데 효율적이지만, 때로는 신체의 자가-구성성분에 대한 강력한 공격을 감행하여 자가면역성을 일으킨다. 병리적 메카니즘은 자가면역 질환의 개개의 유형마다 다르지만, 한가지 일반적 메카니즘은 존재하는 특정 항체 (본원에서는 자가반응성 항체 또는 자가항체라고 지칭함)의 결합을 수반한다. 상기 질환은 종종 해부학적으로 별개의 영역을 포함한다. 예를 들어, 면역계는 류마티스성 관절염 (RA)에서는 관절의 활막 내층을 공격하고, 갑상선염에서는 갑상선을 공격하고, 제1형 진성당뇨병 (T1DM)에서는 췌장의 인슐린-분비 베타 세포를 공격하며, 다발성 경화증 (MS)에서는 뇌의 수초와 척수를 공격한다. 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)에서는 피부, 신장, 관절 및 뇌와 관련있는 프로테안 증세가 있다.

류마티스성 관절염 (RA)은 병인이 알려져 있지 않은 만성 자가면역 장애로서, 전형적으로는 대칭적인 통증 및 손발 소관절(small joint)의 팽윤을 특징으로 한다. 실제로, 대관절(large joint), 예를 들어 어깨, 무릎, 및 둔부, 턱, 및 경추 등을 비롯한 신체의 임의의 다른 관절에서는 염증이 일어나게 될 수 있다. 지속적인 관절 염증은 종종 관절의 연골 및 뼈의 파괴 뿐만이 아니라 영구 변형까지도 일으킨다. 질환의 천연 병력은 수년에 걸쳐 기재되는데, 관절 손상은 발병 후 불과 3개월 내지 6개월만에 발생할 수 있다. RA는 주로 관절에 영향을 주지만, 이것은 전신성 질환이며 피로, 미열을 일으킬 수 있고, 눈, 폐 및 혈관 등을 비롯한 다른 장기 시스템에도 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, RA는 공막염 (염증성 눈 질환), 흉막염, 간질성 폐 섬유증 및 혈관염을 초래할 수 있다. RA는 통증, 및 가족, 친척 및 오락 활동에서의 제약과 관련한 기능적 활동장애를 초래하여 환자의 삶의 질에 상당한 부담을 준다. 작업 능력의 제한 및 일부 경우에서의 실직은 개인과 사회 모두에게 상당한 경제적 손실일 수 있다.

RA 진단은 임상적 증세 및 선택된 실험적 평가 결과를 기초로 한다. 환자의 대략 75％가 류마티드양 인자 (이뮤노글로불린 G [IgG]의 Fc 부분에 반응성인 자가항체)에 양성으로 시험되겠지만, 질환의 첫 1년 동안에는 이러한 사항이 발견되지 않을 수 있다. 추가로, 류마티드양 인자는 류마티스성 관절염에 특이적이지 않고, 건강한 개인의 5％에서 발견된다. 대부분의 RA 환자에는 적혈구 침강 속도가 증가하고, 또다른 급성기 반응물질인 C-반응성 단백질은 활동성 질환 환자에서 전형적으로 증가한다. 일부 경우에는 관절주위 뼈의 광물질 소실, 관절 공간의 협소화 및 뼈 미란(靡爛)(erosion)을 입증하는, 손과 발 또는 가능하게는 다른 관절의 X선 촬영이 유용할 수 있다.

현재로는 RA의 치유법이 없다. 상기 질환의 원인이 알려져 있지 않기 때문에, 현행 요법은 염증성 반응의 저해를 목표로 하고 있다. 대부분의 만성 관절염과 마찬가지로, 치료 목적은 관절 기능을 보존하고 질환 진행을 제한하는 것이다. 활동성 RA 환자의 투약 리스트는 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID), 저-용량 프레드니손, 및 1종 이상의 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD, Disease-Modifying Antirheumatic Drug)을 포함할 수 있다. 문헌 ["Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheumatism 46(2):328-346 (February, 2002)]을 참조한다. 새로 RA로 진단된 대다수의 환자에게는 진단 3개월 이내에 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD) 요법 처치가 시작된다. RA에 보편적으로 사용되 는 DMARD는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트 (MTX), 레플루노미드, 아자티오프린, D-페니실라민, 골드(Gold) (경구), 골드 (근육내), 미노사이클린, 시클로스포린 및 포도상구균(Staphylococcal) 단백질 A 면역흡착제이다. 최근의 연구는, 활동성 RA 환자에서 질환의 처음 수 년 동안에 유의한 관절 손상이 진행됨을 지시한다. 이러한 지식에 기초하여, DMARD들의 조합물을 사용한 보다 적극적인 치료 접근법이 이용되어 왔다. 그러나, 조합 DMARD 요법은 질환 활성을 완전히 없애지 못하며, 심각한 약물-관련 합병증을 초래할 수 있다. 또한, 대부분의 환자에서는 적극적인 치료에도 불구하고 여전히 관절 미란이 발생한다.

사이토카인 종양 괴사 인자 (TNF)의 과활성은 윤활막세포 증식, 신혈관신생, 염증성 세포의 동원, 및 분해 효소의 생성과 관련이 있었다. 이러한 발견은 항-사이토카인 요법의 개발을 자극해왔다. 추가의 조사로부터, 특정 프로염증성 사이토카인, 예를 들어 TNF 및 IL-1이 모노클로날 항체, 자연 발생 사이토카인 길항제, 또는 사이토카인 수용체 차단제에 의해 중화되는 경우에는 RA의 징후와 증상이 중단될 수 있는 것으로 나타났다.

에타네르셉트(엔브렐(ENBREL)^®)는 미국에서 활동성 RA의 요법에 승인된 주사용 약물이다. 에타네르셉트는 TNFα에 결합하고 관절과 혈액으로부터 대부분의 TNRα를 제거하여, TNFα가 염증, 및 류마티스성 관절염의 기타 증상을 촉진하는 것을 방지한다. 에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 결합된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 "이뮤노어 드헤신" 융합 단백질이다. 상기 약물은 심각한 감염과 패혈증, 다발성 경화증 (MS) 등과 같은 신경계 장애를 비롯한 유해한 부작용과 관련이 있었다.

상표명 레미케이드(REMICADE)^®로 시판되는 인플릭시맵은 RA와 크론병의 치료에 처방되는 면역-저해 약물이다. 인플릭시맵은 TNFα에 결합하고 염증을 일으키는 TNFα를 표적화하여 그에 결합함으로써 체내에서 염증을 감소시키는 키메라 모노클로날 항체이다. 인플릭시맵은 심부전 및 결핵 등을 비롯한 감염과 같은 치명적인 반응 뿐만이 아니라 MS를 초래하는 수초탈락과 관련이 있었다.

2002년 12월에, 애보트 래보러토리즈(Abbott Laboratories)는 기존에 D2E7로 알려져 있던 아달리무맵(adalimumab)(휴미라(HUMIRA)™)의 시판에 대하여 FDA의 승인을 받았다. 아달리무맵은 TNFα에 결합하는 인간 모노클로날 항체이고 1종 이상의 전통적인 질환 변형 DMARD에 불충분한 반응을 나타내었던 중간 내지 심각한 활동성 RA에 걸린 성인에서 징후와 증상을 감소시키고 구조적 손상의 진행을 억제하는데 사용하도록 승인되어 있다.

혈관신생은 혈관 내피 세포가 증식하고 제거되고 재조직화되어 기존의 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 중요한 세포내 사건이다. 혈관 공급원의 발생이 정상적인 증식 과정과 병리적인 증식 과정에 필수적이라는 강력한 증거가 있다 [Folkman and Klagsbrun (1987) Science 235:442-447]. 산소와 영양분의 전달 및 또한 이화작용 생성물의 제거는 다세포 유기체에서 일어나는 대다수의 성장 과정에서 속도-제한 단계를 대표한다. 따라서, 일반적으로 혈관 구획은 (충분하지 는 않지만) 배형성 동안의 장기 발생 및 분화 뿐만이 아니라 성인에서도 창상 치유 및 생식 기능에 필요하다고 여겨져 왔다.

혈관신생은 또한 증식성 망막병증, 노인성 황반 변성, 종양, 자가면역 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염 (RA), 및 건선 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 장애의 발병과도 연관되어 있다. 혈관신생은 1) 프로테아제 방출 후, 국소 부위의 세포외 매트릭스 분해, 2) 모세혈관 내피 세포의 증식, 및 3) 혈관신생 자극쪽으로의 모세혈관 이동으로 이루어진 과정의 캐스케이드이다 [Ferrara et al. (1992) Endocrine Rev. 13:18-32].

혈관신생이 생리적 및 병리적으로 매우 중요하다는 관점에서, 이 과정을 조절할 수 있는 인자를 규명하기 위한 수많은 작업이 이루어져 왔다. 혈관신생 과정은 프로-혈관신생 분자와 항-혈관신생 분자 사이의 균형에 의해 조절되며, 각종 질환, 특히 암에서 조절이 되지 않는다는 것이 제안되었다. 문헌 [Carmeliet and Jain (2000) Nature 407:249-257]을 참조한다.

혈관 내피 세포에 대한 강력한 유사분열촉진인자인 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)는 정상 혈관신생과 비정상 혈관신생 둘다의 중추 조절자로서 보고된 바 있다 ([Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25], [Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543]). 혈관 형성 과정에 기여하는 다른 성장 인자와 비교할 때, VEGF는 혈관계 내의 내피 세포에 고도로 특이성을 갖는다는 점에서 독특하다. 최근의 증거는 VEGF가 배아 혈관형성 및 혈관신생에 필수적임을 지시한다 ([Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439], [Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442]). 추가로, VEGF는 여성 생식관에서의 주기적인 혈관 증식 및 뼈 성장과 연골 형성에도 필요하다 ([Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340], [Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628]).

VEGF는 혈관신생 및 혈관형성에서의 혈관신생 인자일 뿐만이 아니라, 다면성 성장 인자로서 다른 생리적 과정, 예를 들어 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵구 주화성 및 칼슘 유입 등에 여러가지 생물학적 영향을 발휘한다 [Ferrara and Davis-Smyth (1997), 상기 문헌]. 또한, 최근의 연구들은 몇가지 비-내피 세포형, 예를 들어 망막 색소 상피 세포, 췌관 세포 및 쉬반 세포에 대한 VEGF의 유사분열촉진 효과를 보고한 바 있다 ([Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394], [Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132], [Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740]).

또한, 실질적 증거는 병리적 혈관신생을 포함하는 상태 또는 질환의 발생에 있어서 VEGF의 중대한 역할을 암시한다. VEGF mRNA는 시험된 대다수의 인간 종양에서 과발현된다 ([Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993)], [Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995)], [Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)], [Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)] 및 [Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)]). 또한, 눈의 유체 중 VEGF 농도는 당뇨성 및 다른 허혈-관련 망막병증 환자 혈관의 활성 증식 존재와 높은 관련성이 있다 [Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)]. 추가로, 최근의 연구는 AMD 환자의 맥락막 신혈관막에서 VEGF의 국소화를 입증한 바 있다 [Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)].

VEGF를 병리적 상태에서의 혈관신생에 대한 주요 조절자로서 인식함으로써, VEGF 활성을 차단하기 위한 수많은 시도가 이어졌다. 억제성 항-VEGF 수용체 항체, 가용성 수용체 구조물, 안티센스 전략, VEGF에 대한 RNA 아프타머(aptamer) 및 저분자량 VEGF 수용체 티로신 키나제 (RTK) 억제제 모두가 VEGF 신호전달을 방해하는데 사용되도록 제안된 바 있다 [Siemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17:241-248 (1998)]. 사실, 항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 각종 인간 종양 세포주의 성장을 저해하고 ([Kim et al. Nature 362:841-844 (1993)], [Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)], [Borgstroem et al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)] 및 [Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)]), 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내(眼內) 혈관신생을 억제하는 것으로 나타난 바 있다 [Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]. 따라서, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 작용의 다른 억제제는 충실성 종양 및 다양한 안내 신혈관 장애의 치료용으로 유망한 후보이다. VEGF 분자는 종양 세포에서 상향조절되고 이의 수용체는 종양 침윤된 혈관 내피 세포에서 상향조절되지만, 혈관신생과 관련이 없는 정상 세포에서는 VEGF 및 그의 수용체의 발현이 낮은 상태로 유지된다. 따라서, 종양 혈관신생을 억제하고 이에 따라 종양 성장 및 암 전이가 억제되도록 VEGF와 그의 수용체 사이의 상호작용을 차단하여도 이러한 정상 세포는 영향을 받지 않는다.

이제 모노클로날 항체는 재조합 DNA 기술을 이용하여 통상적으로 제조된다. 모노클로날 항체, 특히 설치류에서 유래된 모노클로날 항체의 용도는 광범위하다. 그러나, 비-인간 항체는 인간에서 항원성인 경우가 빈번하다. 당업계에는, 비-인간 항원-결합 도메인이 인간 불변 도메인에 커플링된 "키메라" 항체를 구축함으로써 이러한 문제를 해결하고자 하는 시도가 있었다 (카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호). 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존적 세포독성에 관여하는 키메라 항체 제조에 인간 불변 도메인의 이소형(isotype)이 선택될 수 있다. 항체의 항원 결합 기능을 분석하고 인간 항체에서 이종 서열의 사용을 최소화하기 위한 추가의 노력에서, 다양한 항원에 대하여 실질적으로 더 적은 무손상 인간 가변 도메인을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환시킨, 예를 들어 설치류 (CDR) 잔기를 사용하여 인간 항체의 상응하는 절편 대신 치환시킨 인간화 항체가 제조되었다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 몇개의 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기가 설치류 항체 중의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)]).

여러가지 인간화 항-인간 VEGF (hVEGF) 항체가 성공적으로 생성된 바 있고, 시험관내 및 생체내 둘다에서 유의한 hVEGF-억제 활성을 나타내었다 ([Presta et al. (1997) Cancer Research 57:4593-4599], [Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]). 특이적 인간화 항-VEGF 항체 중 하나인 베바시주맵 (아바스틴 (Avastin)^®, 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.))은 미국에서 전이성 직장결장암 (CRC)의 치료용 화학요법제와의 병용에 대한 승인을 받았다. 현재, 상기 약물은 각종 다른 암을 치료하기 위한 여러가지 임상 시험에 사용되고 있다. 현재, 인간화 항-VEGF 항체의 또다른 고친화도 변이체가 노인성 황반 변성 (AMD)의 치료에 대하여 임상 시험 중이다.

VEGF가 염증성 관절 질환, 예를 들어 RA의 발병과 관련이 있음을 시사하는 증거가 늘어나고 있다. VEGF는, RA 환자에서 염증이 있는 관절에 존재하는 활액 조직, 예를 들어 활액 내층 세포, 활액 내층 대식세포, 혈관주위 섬유아세포, 및 혈관 평활근 세포에서 동정된 바 있다 [Nagashima et al (1995) J. Rheumatol. 22:1624-1630]. 활액 및 혈청에서의 VEGF 수준은 성인형 RA와 유년형 RA 둘다에서 유의하게 상승되며 질환 활성과 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다 [Koch et al. (1994) J. Immunol. 152:4149-4156]. 최근, VEGF의 중화가 콜라겐-유도된 관절염을 예방하고 마우스에서 수립된 RA를 완화시킬 수 있음이 입증된 바 있다 [Sone et al. (2001) Bioch. Bioph. Res. Comm. 281:562-568].

이러한 개발에도 불구하고, 자가면역 질환의 효과적인 요법, 특히 혈관신생 길항제를 사용한 요법은 여전히 요구된다.

발명의 요약

제1 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환에 대한 이전 치료법에 실패했던 포유동물에게 치료 유효량의 혈관신생 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환에 대한 이전 치료법에 실패했던 포유동물에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 MTX 또는 TNFα-억제제와 같은 DMARD 요법에 실패했거나 부적절한 반응을 보이는 포유동물에게 VEGF에 결합하여 VEGF를 차단하는 치료 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는, MTX 또는 TNFα-억제제와 같은 DMARD 요법에 실패했거나 부적절한 반응을 보이는 포유동물에서 류마티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 자가면역 질환에 걸린 포유동물에게 치료 유효량의 혈관신생 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 감염, 심부전 및 수초탈락으로 이루어진 군에서 선택된 유해한 부작용의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 RA와 같은 자가면역 질환에 대한 이전 요법에 실패했던 환자에서의 상기 질환 치료용 약제의 제조에 있어서, 항-VEGF 항체와 같은 혈관신생 길항제의 용도를 제공한다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

I. 정의

본원의 목적상, "혈관신생 길항제"는 질환 또는 장애와 관련된 병리적 혈관신생을 차단하거나 억제하거나 중단시키거나 방해하거나 또는 감소시킬 수 있는 조성물이다. 문헌 [Carmeliet and Jain (2000)]에 열거된 것들을 비롯한 많은 혈관신생 길항제가 동정되었고, 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 혈관신생 길항제는 특정 혈관신생 인자 또는 혈관신생 경로를 표적으로 하는 조성물이다. 일부 측면에서, 혈관신생 길항제는 예를 들어 혈관신생 인자를 표적으로 하는 항체 등의 단백질 조성물이다. 가장 잘 알려진 혈관신생 인자 중 하나가 VEGF이고, 가장 강력한 혈관신생 길항제 중 하나가 중화 항-VEGF 항체이다.

용어 "VEGF" 및 "VEGF-A"는 문헌 ([Leung et al. Science, 246:1306 (1989)] 및 [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)])에 기재된 바와 같은 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189-, 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 또한 자연 발생 대립유전자 및 그의 프로세싱(processing)된 형태를 지칭하는데 구별없이 사용된다. 용어 "VEGF"는 또한 165개 아미노산의 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 중 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는, 상기 폴리펩티드의 말단절단(truncated) 형태를 지칭하는데도 사용된다. 본 출원서에서 VEGF의 이러한 임의의 형태에 대한 언급은 예를 들어 "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"로 구별될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF의 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에서와 같이 번호를 매긴다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 천연 VEGF에서도 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도가 천연 VEGF와 유사하다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 방해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 항-VEGF 항체는 다른 VEGF 동족체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않으며 다른 성장 인자, 예를 들어 PIGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않는다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 항-VEGF 항체는 베바시주맵 (BV; 아바스틴^®)으로 공지된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 제조된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체인 것이 더욱 바람직하다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴^®"이라고도 알려져 있는 항-VEGF 항체 "베바시주맵 (BV)"은 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이것은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린(murine) 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맵의 아미노산 서열 중 프레임워크 영역의 대부분을 포함하는 대략 93％가 인간 IgG1에서 유래된 것이고, 상기 서열의 약 7％가 뮤린 항체 A4.6.1에서 유래된 것이다. 베바시주맵은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화되어 있다.

"VEGF 길항제"는 1종 이상의 VEGF 수용체에 결합하는 것을 포함하는, VEGF 활성을 중화하거나 차단하거나 억제하거나 중단시키거나 감소시키거나 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF 길항제는, VEGF에 특이적으로 결합하여 이것이 1종 이상의 수용체, 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 VEGFR 티로신 키나제의 소분자(samll molecule) 억제제에 대해 결합하는 것을 격리시키는 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, 수용체 분자 및 유도체를 포함한다.

본원에서, "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직 또는 동시분리물(co-segregate)로부터 유발된 그에 대한 질환 또는 장애, 또는 그러한 증세 또는 그로 인한 상태이다. 자가면역 질환 또는 질병의 예로는, 관절염 (류마티스성 관절염, 유년발병형 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 및 강직성 척추염), 건선, 아토피성 피부염을 비롯한 피부염, 만성 자가면역 두드러기를 비롯한 만성 특발성 두드러기, 다발성근염/피부근염, 독성 표피 괴사용해, 공피증 (전신성 공피증 포함), 경화증, 예를 들어 진행성 전신 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (예컨대, 크론병, 궤양성 대장염, 자가면역 염증성 장 질환), 괴저 농피증, 결절 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염), 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)을 비롯한 호흡 곤란 증후군, 수막염, IgE-매개 질환, 예를 들어 뇌막염 및 알러지성 비염 및 아토피성 비염, 뇌염, 예를 들어 라스무센 뇌염, 포도막염 또는 자가면역 포도막염, 대장염, 예를 들어 미세 대장염 및 콜라겐성 대장염, 사구체신염 (GN), 예를 들어 막성 GN (막성 신장병증), 특발성 막성 GN, 제I형 및 제II형을 비롯한 막성 증식성 GN (MPGN), 및 급속 진행성 GN, 알러지성 상태, 알러지성 반응, 습진, 천식, T-세포 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 상태, 아테롬성경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 (신염, 뇌수염, 소아, 비-신장, 원판상, 탈모성 포함), 소아 인슐린-의존적 진성당뇨병 (IDDM)을 비롯한 유년발병형 (제I형) 진성당뇨병, 성인 발병형 진성당뇨병 (제II형 당뇨병), 다발성 경화증 (MS), 예를 들어 척수-시각(spino-optical) MS, 사이토카인과 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 림프종양 육아종증, 베게너 육아종증을 비롯한 육아종증, 무과립구증, 혈관염 (대형 혈관 혈관염 (류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포 (다카야수) 동맥염 등), 중간 혈관 혈관염 (가와사키병 및 결절다발동맥염 포함), CNS 혈관염, 전신성 괴사 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어 처크-스트라우스 혈관염 또는 증후군 (CSS)), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 쿰즈 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 비롯한 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진정 적혈구계 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출성출혈을 비롯한 질환, CNS 염증성 장애, 다중 장기 상해 증후군, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알러지성 신경염, 베세트병 또는 베체트병, 캐슬맨 증후군, 굿파스튜어 증후군, 레이나우드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 유천포창, 예를 들어 수포성 유천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 및 천포창 점막 유천포창), 자가면역 다내분비질환, 라이터병, 면역 복합체 신염, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개된 신경병증, 혈전증 혈소판감소성자반병 (TTP) 및 자가면역 또는 면역-매개된 혈소판감소증, 예를 들어 만성 또는 급성 특발성 혈소판감소성자반병 (ITP)을 비롯한 ITP를 비롯한 혈소판감소증 (예를 들어 심근경색 환자에서 발생하는 것과 같은 혈소판감소증), 자가면역 고환염 및 난소염을 비롯한 고환과 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능감퇴증, 자가면역 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들어 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염 (하시모도 갑상선염), 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 애디슨병, 그레이브병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 방종양성 증후군, 예를 들어 신경계 방종양성 증후군, 예를 들어 램버트-이튼 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군, 근육강직(stiff-man 또는 stiff-person) 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알러지성 뇌척수염, 중증근무력증, 소뇌 변성, 연뇌염 및/또는 뇌간 뇌염, 신경근긴장증, 안간대 증후군 또는 안간대 근간대 증후군 (OMS), 및 감각성 신경병증, 쉬한 증후군, 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스양 간염, 만성 활동성 간염 또는 자가면역 만성 활동성 간염, 림프양 간질성 폐렴, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식) vs NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르게르병 (IgA 신장병증), 원발성 담즙성 간경변, 복강 스프루우 (글루텐 장병증), 난치성 스프루우, 포진상 피부염, 한성글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 내이 질환 (AIED), 또는 자가면역 청각 상실, 안간대 근간대 증후군 (OMS), 다발연골염, 예를 들어 난치성 다발연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 거대 세포 간염, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증, 예를 들어 모노클로날 B-세포 림프구증가증 (예컨대, 양성 모노클로날 감마글로불린장애 및 미결정 유의성의 모노클로날 감마글로불린장애, MGUS), 말초 신경병증, 방종양성 증후군, 채널병증(channelopathies), 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비증, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근장애, 국소 분절 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안질, 포도막망막염(uveoretinitis), 자가면역 간장 장애, 섬유근육통, 다중 내분비 기능부전, 쉬미트 증후군, 부신염, 위 위축, 초로성 치매, 탈수초 질환, 드레슬러 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화증, 및 모세혈관확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직성 척추염, 혼합 결합 조직 질환, 샤가스병, 류마티스성 열, 재발성 유산, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류 사육자 폐, 알포트 증후군, 폐포염, 예를 들어 알러지성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 키파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르질루스증, 샘터 증후군, 카플란 증후군, 뎅그열, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 플라리아시스(flariasis), 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 이시성(異時性) 섬모체염, 또는 푸시 섬모체염, 헤노흐-쇤라인 자반병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근증, 알쯔하이머병, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신화후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스테인-바르 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군, 자가면역 생식선 기능부전, 시덴함 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐색성 혈전혈관염(thromboangitis ubiterans), 갑상선기능항진증, 척수 매독, 및 거대 세포 다발성근육통 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"종양 괴사 인자 알파 (TNFα)"는 문헌 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) 또는 [Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNFα 분자를 지칭한다.

본원에서, "TNFα 억제제"는 일반적으로 TNFα에 결합하고 그의 활성을 중화시키는 것을 통해, TNFα의 생물학적 기능을 감소시키거나 억제하거나 차단하거나 없애거나 또는 방지하는 작용제이다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (엔브렐^®), 인플릭시맵 (레미케이드^®) 및 아달리무맵 (휴미라™)이다.

용어 "TNFα-억제제에 대한 부적절한 반응"은 TNFα-억제제를 사용한 이전 치료법 또는 현재 치료법에 대하여 독성 및/또는 부적절한 효능으로 인해 나타내는 부적절한 반응을 지칭한다. 부적절한 반응은 해당 질환의 치료에 능숙한 임상의에 의해 평가될 수 있다.

TNFα-억제제를 사용한 이전 치료법 또는 현재 치료법으로 인한 "독성"을 보이는 포유동물은 그와 관련된 하나 이상의 유해한 부작용, 예를 들어 감염 (특히 심각한 감염), 울혈성 심부전, 수초탈락 (다발성 경화증에 이르게 함), 과민증, 신경계 사건, 자가면역, 비-호지킨 림프종, 결핵 (TB), 자가항체 등을 보인다.

"이전 치료법에 실패했던" 또는 "부적절한 효능"을 보이는 포유동물은 DMARD 또는 TNFα-억제제와 같은 약물을 사용한 이전 치료법 또는 현재 치료법 후에 계속해서 활동성 질환을 갖는다. 예를 들어, 상기 환자는 DMARD (예컨대 MTX) 또는 TNFα-억제제를 사용한 1개월 또는 3개월의 요법 후에 활동성 질환 활성을 보일 수 있다.

본원에서, "B-세포 표면 마커"는 그에 결합하는 길항제로 표적화될 수 있는, B-세포의 표면 상에서 발현되는 항원이다. 예시적인 B-세포 표면 마커로는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커 등이 있다. 특히 관심있는 B-세포 표면 마커는 포유동물의 다른 비-B-세포 조직에 비해 B-세포 상에서 우선적으로 발현되고 전구 B-세포와 성숙 B-세포 둘다에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 마커는 CD20이나 CD19와 같이 줄기 세포 단계로부터 혈장 세포로의 최종 분화 직전의 시점까지 계통의 분화기간 전체에 걸쳐 B-세포 상에서 발견되는 것이다. 본원에서 바람직한 B-세포 표면 마커는 CD20이다.

"CD20" 항원은 말초혈이나 림프양 기관에서 유래된 B-세포의 90％ 초과의 표면 상에서 발견되는, 약 35 kDa의 글리코실화되지 않은 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B-세포 발생 동안에 발현되고 혈장 세포 분화시까지 남아있다. CD20은 정상 B-세포 뿐만이 아니라 악성 B-세포에도 존재한다. 문헌에서 CD20에 대해 사용되는 다른 명칭으로는 "B-림프구-국한된 항원" 및 "Bp35" 등이 있다. CD20 항원은 예를 들어 문헌 [Clark et al., PNAS (USA) 82:1766 (1985)]에 기재되어 있다.

"성장 억제" 길항제는 그 길항제가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지하거나 감소시키는 것들이다. 예를 들어, 길항제는 시험관내 및/또는 생체내에서 B-세포의 증식을 방지하거나 감소시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편까지도 포함한다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체 등이 있다.

"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유결합성 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 디술피드 연결부의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 다르다. 각각의 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적인 간격을 두고 배치된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄에는 한쪽 말단에 하나의 가변 도메인 (V_H)이 있고 그 뒤에는 여러개의 불변 도메인이 있다. 각 경쇄에는 한쪽 말단에 가변 도메인 (V_L)이 있고 다른쪽 말단에는 불변 도메인이 있다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계를 형성한다고 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열 차이가 크고 각각의 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 가변성은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘다에는 초가변 영역이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 각각은, 주로 β-시트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-시트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 서로 근접하게 위치되어 있고, 다른쪽 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에의 항체 관여 등과 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다.

항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각은 단일 항원-결합 부위를 보유함) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 교차-결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 강력하게 비-공유결합으로 결합된 이량체로 구성된다. 이것은, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정하는 구조이다. 총괄적으로, 상기 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도, 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은, 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 1개 이상의 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명명이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래가 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, 상기 Fab' 단편들의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종에서 유래된 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 이것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ)와 람다(λ)라고 불리는 2개의 분명하게 구별되는 유형 중 하나로 정해질 수 있다.

항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 여러가지 부류로 정해질 수 있다. 무손상 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있고, 이중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다. 항체의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 여러 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조와 3차원 형상은 잘 알려져 있다.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 영역을 포함하며, 이때 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. sFv에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 중쇄 가변 도메인 (V_H)이 동일 폴리펩티드 쇄 (V_H-V_L)로 연결된 것을 포함한다. 동일 쇄에 존재하는 2개 도메인 사이에 쌍이 형성되기에는 지나치게 짧은 링커를 사용하여, 상기 도메인들이 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하도록 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097, WO 93/11161 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 등에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단에 포함된 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 여러가지 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 여러가지 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양을 통해 이들이 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 채로 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 가리키며, 임의의 특정 방법을 통한 항체 생성이 요구된다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수도 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있으며, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래된 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)가 포함될 뿐만이 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편까지도 포함된다 (미국 특허 제4,816,567호, [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서의 관심 키메라 항체로는 비-인간 영장류 (예컨대, 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이 등의 구세계 원숭이(Old World Monkey))로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체 등이 있다 (미국 특허 제5,693,780호).

비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종의 초가변 영역 (공여 항체)에서 유래된 잔기로 대체된다. 몇몇 예에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 증진시키기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 초가변 루프의 전체 또는 실질적으로 전체는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린에서의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 사항에 대하여는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

용어 "초가변 영역"이 본원에서 사용된 경우, 이것은 항체에서 항원-결합을 담당하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3) [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

관심 항원, 예를 들어 VEGF에 "결합하는" 길항제는, 이것이 상기 항원 또는 그 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화도 및/또는 결합력으로 그 항원에 결합할 수 있는 것이다.

"단리된" 길항제는 자연계 환경 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연계 환경의 오염 성분은 상기 길항제가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 길항제는 (1) 라우리법으로 측정시에 길항제 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과인 것으로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시에 블루(Coomassie Blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE를 실시할 때 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제된다. 단리된 길항제에는 재조합 세포 내의 계내(in situ) 길항제가 포함되는데, 이는 길항제 자연계 환경 성분은 1종 이상이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나 통상적으로는, 단리된 길항제는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조된다.

치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경주용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

"치료"는 치유적 처치와 예방적 또는 방지적 처치 둘다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 그 질환 또는 장애에 걸린 대상체들 뿐만이 아니라 그 질환 또는 장애가 예방될 대상체들도 포함된다. 따라서, 포유동물은 질환 또는 장애가 있는 것으로 진단되었거나 또는 그 질환에 걸리기 쉽거나 그에 대한 감수성이 있을 수 있다.

표현 "치료 유효량"은 해당 자가면역 질환을 예방, 완화 또는 치료하는데 효과적인 길항제의 양을 지칭한다.

보조 요법을 위해 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역저해제"는 본원에서 치료되는 포유동물의 면역계를 저해하거나 차단하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이것은 사이토카인 생성을 저해하거나, 자가-항원 발현을 하향조절 또는 저해하거나, MHC 항원을 차단하는 물질을 포함한다. 이러한 작용제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 제4,665,077호, 상기 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 도입됨); 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID); 아자티오프린; 시클로포스프아미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드 (미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차단함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오형(idiotype) 항체; 시클로스포린 A; 글루코코르티코이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손과 같은 스테로이드; 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 항-인테페론-γ, -β 또는 -α 항체, 항-종양괴사인자-α 항체 (인플릭시맵 또는 아달리무맵), 항-TNFα 이뮤노어드헤신 (에타네르셉트), 항-종양괴사인자-β 항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체 등을 비롯한 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체 등을 비롯한 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 팬(pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (90년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (코헨(Cohen) 등의 미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편 ([Offner et al., Science, 251:430-432 (1991)], WO 90/11294, [Ianeway, Nature, 341:482 (1989)] 및 WO 91/01133); 및 T10B9와 같은 T-세포 수용체 항체 (EP 340,109) 등이 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예컨대, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물에서 기원된 소분자 독소 또는 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함한다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 티오테파 및 시클로스포스프아미드 (시톡산(CYTOXAN)™)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 등을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로포스프아미드, 에스트라무스틴, 이포스프아미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스프아미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스프아미드 글리코시드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라뷰실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 시클로포스프아미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)^®, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재) 및 도세탁셀 (탁소티어(TAXOTERE)^®, 롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스프아미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체 등이 있다. 또한, 상기 정의에는 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston)) 등을 비롯한 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기한 것 중 임의의 것의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체 등과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제도 포함된다.

용어 "사이토카인"은 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어로서 또다른 세포에 대한 세포간 매개자로서 작용한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상의 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인으로는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 종양 괴사 인자-β; 뮬러리안-억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전이 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 인슐린-유사 성장 인자-II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 및 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드 (KL) 등을 비롯한 기타 폴리펩티드 인자 등이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.

본 출원서에서 사용된 용어 "전구약물"은 모(母) 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소에 의해 더 활성적인 모 형태로 활성화되거나 전환될 수 있는 제약 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985)]을 참조한다. 본 발명의 전구약물은 더 활성적이며 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물, 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 기타 5--플루오로유리딘 전구약물을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기 위해 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기된 화학요법제를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다.

"리포좀"은 포유동물에게 약물 (예컨대, 본원에 개시된 길항제, 및 임의로는 화학요법제)을 전달하는데 유용한 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 소형 소포이다. 통상적으로, 리포좀의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열된다.

용어 "정맥내 주입"은 대략 5분이 넘는 시간에 걸쳐, 바람직하게는 대략 30분과 90분 사이의 시간에 걸쳐 동물 또는 인간 환자의 정맥 내로 약물을 도입하는 것을 지칭하는데, 본 발명에 따라서는 대안적으로 10시간 이하 동안 투여된다.

용어 "정맥내 볼루스(bolus)" 또는 "정맥내 푸쉬(push)"는 동물 또는 인간의 정맥 내로 약물을 투여하여 신체가 대략 15분 이하, 바람직하게는 5분 이하 이내에 약물을 수용하도록 하는 것을 지칭한다.

용어 "피하 투여"는 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물을 도입하는 것을 지칭하며, 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에서 약물 리셉터클(receptacle)로부터 비교적 서서히 지속적으로 전달하는 것이 바람직하다. 상기 포켓은 피부를 하부 조직으로부터 들어올리거나 당겨서 만들어질 수 있다.

용어 "피하 주입"은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물을 도입하는 것을 지칭하며, 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에서 30분 이하 또는 90분 이하 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 시간 동안에 약물 리셉터클로부터 비교적 서서히 지속적으로 전달하는 것이 바람직하다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물 전달 펌프를 피하 이식하여 이루어질 수 있고, 여기서 상기 펌프는 소정 기간 동안, 예를 들어 30분, 90분 동안 또는 처치 요법 기간에 걸쳐 소정량의 약물을 전달한다.

용어 "피하 볼루스"는 동물 또는 인간 환자의 피부 바로 아래에 약물을 투여하는 것을 지칭하며, 볼루스 약물 전달은 바람직하게는 대략 15분 미만, 더욱 바람직하게는 5분 미만, 가장 바람직하게는 60초 미만에 이루어진다. 상기 투여는 피부와 하부 조직 사이의 포켓 내에서 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 포켓은 예를 들어 피부를 하부 조직으로부터 들어올리거나 당겨서 만들어진다.

II . 길항제의 생성

본 발명의 방법 및 제조 용품은 혈관신생 길항제를 사용하거나 혼입한다. 따라서, 본원에서는 이러한 길항제의 생성 방법을 기재할 것이다.

혈관신생 길항제는 혈관신생 인자의 단백질 길항제일 수 있다. 상기 길항제는 VEGF 길항제인 것이 바람직하다. 본 발명의 목적에 바람직한 VEGF 길항제인 항-VEGF 항체 이외의 다른 VEGF 길항제로는, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 아프타머, 중화 항-VEGFR 항체, 및 VEGFR 티로신 키나제의 저분자량 억제제 등이 있다.

이하에는, 본 발명에 따라 사용되는 항체 길항제를 생성하기 위한 기술을 예로 들어 설명한다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 관련 항원과 아쥬반트를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 여러회 주사함으로써 동물에서 생성되도록 하는 것이 바람직하다. 이관능성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제 등과 같이 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어, 상기 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대해)을 3배 부피의 프로인트(Freund's) 완전 아쥬반트와 배합한 후에 상기 용액을 동물에게 여러 부위에서 피내 주사하여, 동물을 상기 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 상기 펩티드 또는 접합체를 프로인트 완전 아쥬반트에 포함되었던 원래 양의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스팅한다. 7일 내지 14일 후에는 상기 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 검정한다. 역가가 안정화될 때까지 동물을 부스팅한다. 동물을 부스팅할 때, 항원은 동일하지만 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교 시약을 통해 접합된 접합체를 사용하는 것이 바람직하다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 제조될 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

( ii ) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되며, 즉, 이러한 집단에 포함된 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 별개의 항체들의 혼합물이 아님을 가리킨다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 본원에서 상기한 바와 같이 면역화시켜서, 면역화에 사용될 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수도 있다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)].

이로써 생성된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장이나 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 전형적으로 상기 하이브리도마용 배양 배지는 HGPRT-결핍 세포의 성장을 저해하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다 (HAT 배지).

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하는 세포이며, HAT 배지 등과 같은 배지에 민감하다. 이들 중에서도 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 설크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능함) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능함)이다. 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 문헌 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)])에 기재되어 있다.

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 상기 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법으로 측정하거나, 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들어 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)으로 측정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 분석법(Scatchard analysis)으로 측정할 수 있다.

원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후에는, 상기 클론을 제한 희석 절차로 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지의 예로는 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지 등이 있다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수도 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스(Sepharose), 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피 등을 통해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적합하다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)를 이용하여 쉽게 단리하여 서열결정한다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. DNA가 일단 단리되면, 이것을 발현 벡터 내로 위치시킨 후에 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포를 형질감염시켜서, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현하는 것에 관한 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 검토한다.

추가의 실시양태에서, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 제조한 항체 파지 라이브러리로부터 항체 또는 항체 단편을 단리할 수 있다. 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)])에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 항체와 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재되어 있다. 이후에 간행된 문헌에는 체인 셔플링(chain shuffling)에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 제조 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)] 뿐만이 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서의 생체내 재조합과 조합 감염법이 기재되어 있다 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 이용가능한 대안이다.

상기 DNA는 또한 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄의 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 대체하거나 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수도 있다.

전형적으로, 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 치환시키거나, 또는 항체의 1개의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 치환시켜서, 항원에 대해 특이성을 나타내는 1개의 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대해 특이성을 나타내는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 제조한다.

( iii ) 인간화 항체

비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있는 것이 바람직하다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기라고 지칭되며, 전형적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻는다. 본질적으로, 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 윈터(Winter) 등의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사 부위로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘다에서 인간화 항체 제조에 사용하고자 하는 인간 가변 도메인을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트(best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열과 가장 유사한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 수용한다 ([Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에 속하는 모든 인간 항체의 컨센서스(consensus) 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크 영역을 사용하는 것이다. 이와 동일한 프레임워크를 여러가지 상이한 인간화 항체를 만드는데 사용할 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).

또한, 항원에 대한 고친화도 및 기타 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 항체를 인간화하는 것도 중요하다. 이 목적을 달성하기 위한 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물의 분석 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 당업자에게 이용되고 있고 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원적 입체 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이의 정밀검사는, 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능수행에 있어서 잔기가 기여할 수 있는 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방법을 통해, FR 잔기는 원하는 항체 특성이 얻어지도록, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도가 증가되도록 수용 서열과 임포트 서열로부터 선별 및 조합될 수 있다. 통상적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 있어서 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.

( iv ) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역화시킬 때, 내생성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 전체 레파토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예컨대, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주(germ-line) 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자를 모두 결실시키면 내생성 항체 생성이 완전히 억제됨이 기재된 바 있다. 인간 생식세포주 이뮤노글로불린 유전자 배열을 이러한 생식세포주 돌연변이 마우스에 도입하면, 항원이 들어왔을 때 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)], 미국 특허 제5,591,669호, 동 제5,589,369호 및 동 제5,545,807호를 참조한다.

대안으로, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 이용하여 면역화되지 않은 공여자의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 제조할 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝하여 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성을 기초로 한 선별도 이러한 성질을 보이는 항체를 코딩하는 유전자를 선별할 수 있게 한다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행할 수 있고, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조하여 이에 대하여 검토해 볼 수 있다. V-유전자 절편의 여러가지 공급원이 파지 디스플레이에 이용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 배열체가 단리되었다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터 유래된 V 유전자의 레파토리를 제작할 수 있고, 다양한 항원 배열체 (자가 항원을 포함함)에 대한 항체를 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다.

인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B-세포에 의해서도 생성될 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조).

(v) 항체 단편

항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도된 것이었다 (예컨대, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 위에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜서 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수도 있다. 항체 단편의 다른 생성 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185, 미국 특허 제5,571,894호, 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호 등에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있다.

( vi ) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 제조법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 상이한 10종의 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키며, 이 중 오직 1종만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계를 통해 수행되는데, 이것은 다소 번거롭고 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합인 것이 바람직하다. 융합체 중 적어도 하나에는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 동시 형질감염시킨다. 이것은 제작에 사용되는 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 우수한 융통성을 제공한다. 그러나, 동일 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄가 높은 수율로 발현되거나 상기 비율이 별다른 유의성을 갖지 않는 경우에는, 2종 또는 3종 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암(arm)에 있는, 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하면 쉽게 분리되기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 쉽게 분리할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 이 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)]을 참조한다. 미국 특허 제5,731,168호에 개시된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(％)을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 경계면으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 측쇄 (예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계면에 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공동(cavity)"을 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체 등과 같은 다른 원치않는 최종-생성물의 수율보다 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체에는 가교된 항체 또는 "이종접합" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링시키고 다른 하나는 바이오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체들은 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키는데 사용하도록 제안된 바 있고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료용으로도 제안된 바 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 당업계에 공지되어 있고, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술 역시 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질 가수분해로 절단시켜서 F(ab')₂ 단편을 제조하는 절차가 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세니트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. Fab' 단편이 생성되면, 이것을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로 사용될 수 있다.

최근의 기술적 진보에 의해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접 회수하여 화학적으로 커플링시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있는 것이 용이해졌다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 제조에 대해 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도 분비되었으며 시험관내 지정된 화학적 커플링 방법을 통해 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T-세포와 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수도 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접 만들고 단리하는 다양한 기술도 기재된 바 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 이용하여 이중특이적 항체가 제조되었다 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. 또한, 유전자 융합을 통해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후에 이것을 재산화시켜서 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이 방법은 항체 동종이량체 제조에 이용할 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 대안적 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄에 존재하는 2개 도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용하여, 상기 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 또다른 단편의 상보적인 V_H 및 V_L 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.

항체가가 2를 초과하는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체도 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

III . 길항제의 접합체 및 기타 변형

본원에서의 방법에 사용되거나 또는 본원에서의 제조 용품에 포함되는 길항제는 임의로 세포독성제에 접합시킬 수 있다.

이러한 길항제-세포독성제 접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 앞서 기재한 바 있다.

길항제, 및 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020), 트리코텐 및 CC1065와 같은, 1종 이상의 소분자 독소의 접합체 또한 본원에서 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 길항제는 1개 이상의 메이탄신 분자 (예컨대, 길항제 분자 1개 당 약 1개 내지 약 10개의 메이탄신 분자)와 접합된다. 메이탄신은 예를 들어 May-SH3으로 환원되고 변형 길항제와 반응하여 메이탄시노이드-길항제 접합체를 생성할 수 있는 May-SS-Me로 전환될 수 있다 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)].

대안으로, 길항제는 1개 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된다. 칼리케아미신 족의 항생제는 피코몰 이하 농도에서 이중 가닥 DNA 파괴를 생성할 수 있다. 사용될 수 있는, 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁ 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다 ([Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]).

사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래함), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨락카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센 등이 있다. 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.

추가로, 본 발명은 핵용해 활성을 갖는 화합물 (예컨대, 리보뉴클레아제, 또는 데옥시리보뉴클레아제와 같은 DNA 엔도뉴클레아제; DNase)과 접합된 길항제도 고려한다.

각종 방사성 동위원소가 방사성접합된 길항제의 생산에 이용가능하다. 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소 등이 있다.

길항제와 세포독성제의 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 길항제에 방사성핵종을 접합하기 위한 예시적 킬레이팅제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-감수성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131(1992)]가 사용될 수 있다. 대안으로, 길항제와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이, 예를 들어 재조합 기술이나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 길항제는 전구약물 (예컨대, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소와 접합시킬 수도 있다. 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호를 참조한다.

이러한 접합체의 효소 성분은 그것을 그의 더 활성적인 세포독성 형태로 전환할 수 있는 방식으로 전구약물 상에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소로는, 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 카텝신 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-갈락토시다제와 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 대안으로, 당업계에 "애브자임(abzyme)"이라고 공지되어 있기도 한, 효소 활성을 갖는 항체가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)] 참조).

본 발명의 효소는 예를 들어 앞서 논의한 헤테로이관능성 가교 시약의 사용과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 길항제에 공유 결합될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 효소에서 적어도 기능적으로 활성인 부분에 결합된 본 발명의 길항제의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질이 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 구축될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984)] 참조).

길항제의 다른 변형이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 길항제는 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다.

또한, 본원에 개시된 길항제는 리포좀으로 제제화될 수도 있다. 길항제를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)], [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)], 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일자로 공개된 WO 97/38731에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법으로 생성될 수 있다. 리포좀은 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀이 생성된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)]을 참조한다.

본원에 기재된 단백질 또는 펩티드 길항제의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 길항제의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 길항제의 아미노산 서열 변이체는 길항제 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하여 제조하거나, 펩티드 합성을 통해 제조한다. 이러한 변형의 예로는 길항제의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조물이 원하는 특성을 갖는 범위 내에서, 결실과 삽입과 치환의 임의의 조합이 가해져서 최종 구조물이 생성된다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치 변화 등과 같이 길항제의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다.

돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 길항제의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발법"이라 불린다. 본원에서는, 표적 잔기의 잔기 또는 기 (예컨대, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 대전된 잔기)를 동정하여 중성이거나 음으로 대전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌이나 폴리알라닌)으로 대체시켜서, 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 이들 아미노산 위치가 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 추가의 변이체 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 이처럼, 아미노산 서열 변이를 도입할 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이의 성질 자체가 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이 성능을 분석하기 위해서는, 표적 코돈 또는 표적 영역에서 ala 스캐닝이나 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 길항제 변이체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입로는, 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노-말단 및/또는 카르복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입 등이 있다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 길항제 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제 등이 있다. 길항제 분자의 다른 삽입성 변이체는 효소 또는 길항제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 길항제의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킨 것을 포함한다.

또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체에서는 길항제 분자에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 대체되어 있다. 항체 길항제의 치환 돌연변이유발에 가장 관심이 있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변형 또한 고려된다. 하기 표 1에서 "바람직한 치환"이라는 제목 하에 보존적 치환을 나타내었다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 일으키면, 표 1에서 "예시적 치환"으로 나타내거나 아미노산 부류에 관하여 아래에서 더 설명한 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하여 생성물을 스크리닝할 수 있다.

길항제의 생물학적 성질의 실질적 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시이트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 분자가 표적 부위에서 그의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 미치는 효과가 유의하게 다른 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질에 따라 다음과 같은 군으로 나뉜다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile,

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr,

(3) 산성: asp, glu,

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg,

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro, 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환시키는 것이다.

길항제의 적당한 형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기 또한 일반적으로는 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 길항제에 부가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 길항제가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

치환 변이체의 특히 바람직한 유형은 모 항체의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택되어 생성된 변이체(들)은 이들이 생성된 모 항체보다 개선된 생물학적 성질을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다. 간략하게 설명하면, 몇몇 초가변 영역 부위 (예컨대, 6개 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜서 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 팩키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 섬유상 파지 입자에 1가 양식으로 디스플레이된다. 이후, 상기 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 동정하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에서 연구된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기재한 바와 같이 스크리닝하고 1종 이상의 관련 검정으로 우수한 성질을 갖는 항체가 추가 개발을 위해 선별될 수 있다.

길항제의 아미노산 변이체의 또다른 유형은 길항제의 원래 글리코실화 양상을 변경시키는 것이다. 변경이라는 것은, 길항제에 존재하는 1개 이상의 탄수화물 부분을 제거하고/하거나 길항제에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 아스파라진 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라진 측쇄에 탄수화물 부분이 효소적으로 부착되기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중에 이들 트리펩티드 서열 중 하나가 존재하는 것은 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 보편적으로는 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나가 부착된 것을 지칭지만, 세린 또는 트레오닌 대신에 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.

길항제에 글리코실화 부위를 부가하는 것은, 이것이 1개 이상의 상기 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-결합 글리코실화 부위의 경우). 상기 변형은 또한 원래 길항제의 서열에 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 치환에 의해 가해질 수도 있다 (O-결합 글리코실화 부위의 경우).

길항제의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법으로는, 자연 공급원으로부터의 단리 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 길항제의 먼저 제조된 변이체나 비변이체 버전의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어 길항제의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 증진시키기 위하여, 본 발명의 길항제를 이펙터 기능에 관하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체 길항제의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안으로 또는 부가하여, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역에 도입되어, 이 영역에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 ([Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)])을 참조한다. 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체 또한 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로이관능성 가교제를 이용하여 제조될 수 있다. 대안으로, 이중적 Fc 영역을 갖고 그에 의해 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 조작될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.

길항제의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 길항제 (특히 항체 단편)에 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 혼입할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기 증가를 담당하는 IgG 분자 (예컨대, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

IV . 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 길항제의 치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 길항제를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)], 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로서 저장용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤즈알코니움 클로라이드, 벤즈에토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 알콜 또는 벤질 알콜; 메틸 파라벤 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

피하 투여용으로 채택 동결건조 제제가 WO 97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적당한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료될 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.

본원에서의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요한 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역저해제 (예컨대, 시클로스포린이나 T-세포에 결합하는 항체와 같은, T-세포 상에 작용하는 것, 예를 들어 LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 중에 존재하는 길항제의 양, 질환이나 장애 또는 치료의 유형, 및 앞서 논의한 기타 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 앞서 이용된 것과 동일한 투여량과 동일한 투여 경로로 이용되거나, 또는 앞서 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.

활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예컨대, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 기술이나 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 등에 각각 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는, 매트릭스가 성형 용품, 예를 들어 필름 형태로 된, 고체 소수성 중합체의 길항제-함유 반투과성 매트릭스 또는 마이크로캡슐 등이 있다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예컨대, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)나 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌 비닐 아세테이트, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 등이 있다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균된 것이어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

V. 길항제를 사용한 치료

본 발명은 자가면역 질환에 대한 이전 치료법 또는 현재 치료법에 실패했거나 부적절한 반응을 보이는, 자가면역 질환에 걸렸거나 자가면역 질환에 걸리기 쉬운 포유동물의 하위집단, 특히 인간에서의 요법에 관한 것이다. 일반적으로, 본원에서 치료될 포유동물은 1종 이상의 DMARD 또는 1종 이상의 TNFα-억제제(들)로 1회 이상 처치하는 요법 후에 독성 및/또는 부적절한 효능으로 인해 이전 치료법 또는 현재 치료법에 대해 부적절한 반응을 보이는 것으로서 확인될 것이다. 그러나, 본 발명은 이러한 치료법을 사용한 이전 요법 단계로 제한되지 않는다. 예를 들어, 환자는 DMARD 또는 TNFα-억제제를 사용한 치료가 시작되기 전에 DMARD 또는 TNFα-억제제 사용에 대한 독성, 예를 들어 심장 독성을 경험하기 쉬운 것으로 간주될 수도 있고, 또는 이러한 요법에 반응하지 않을 것 같은 사람으로 결정될 수 있다.

본원에서 치료되는 다양한 자가면역 질환은 위 정의 단락에 열거되어 있다. 본원에서의 바람직한 증상은 류마티스성 관절염, 루푸스, 건선성 관절염, 다발성 경화증 또는 크론병이다.

질환을 예방하거나 치료하기 위한 길항제의 적절한 투여량은 상기 정의한 바와 같은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과상태, 길항제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 치료되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 병력 및 길항제에 대한 환자 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 길항제는 한번에 또는 일련의 처치에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 병용 요법에서, 본 발명의 조성물은 치료 유효량 또는 상승작용량으로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 치료 유효량은 길항제 및 1종 이상의 다른 치료제의 동시투여 또는 본 발명의 조성물의 투여로 인해 표적으로 하는 질환 또는 상태가 감소 또는 억제되는 양이다. 치료 상승작용량은 특정 질환의 상태 또는 증상을 상승작용적으로 또는 유의하게 감소시키거나 없애는데 필요한, 길항제 및 1종 이상의 다른 치료제의 양이다.

질환의 유형 및 중증도에 따라, 길항제 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예컨대 0.1 내지 20 mg/kg)이 환자에게 예를 들어 1회 이상의 별도 투여 또는 연속 주입으로 투여될 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여를 하는 경우, 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 처치를 지속한다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 바람직한 측면에서, 상기 길항제를 매 2주 내지 3주마다 약 1.5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 범위의 투여량으로 투여한다. 이러한 투약법은 자가면역 질환을 위한 또다른 치료제와 병용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 요법의 진행 상황은 통상적인 기술 및 검정법으로 쉽게 모니터링된다.

그러나, 앞서 주지한 바와 같이, 이들 제안된 길항제 양은 많은 치료적 판단을 받는다. 앞서 기재한 바와 같이, 적절한 투여량과 스케쥴을 선택하는데 있어서의 핵심 인자는 얻어지는 결과이다. 예를 들어, 진행 중인 급성 질환의 치료시에 처음에는 상대적으로 더 높은 투여량이 요구될 수 있다. 가장 효능있는 결과를 얻기 위해서는, 질환이나 장애에 따라 길항제를 해당 질환이나 장애의 첫번째 징후, 진단, 출현 또는 발생 시기에 되도록 빨리 또는 해당 질환이나 장애가 완화되는 동안에 투여된다.

길항제는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비측, 및 국소 면역저해 치료를 위해 원한다면 병변내 투여 등을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 길항제는 예를 들어 길항제 투여량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 적합하게 투여될 수도 있다. 부분적으로는 투여가 단기인지 또는 장기인지 여부에 따라, 주사로 투여되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 정맥내 주사 또는 피하 주사로 투여된다.

본원에서의 길항제는 다른 화합물, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제, 면역저해제 및/또는 사이토카인과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는 2가지 둘다 (또는 모든)의 활성 작용제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타내는 동안의 시기가 있도록, 병용 투여는 개개의 제제 또는 단일 제약 제제를 이용하는 공동투여 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다. RA 및 다른 자가면역 질환에 대해, 길항제 (예컨대 항-VEGF 항체)는 질환-변형 항류마티스 약물 (DMARD), 예를 들어 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 아자티오프린, D-페니실라민, 골드 (경구), 골드 (근육내), 미노사이클린, 시클로스포린, 포도상구균 단백질 A 면역흡착제; 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG); 비스테로이드성 소염 약물 (NSAID); 글루코코르티코이드 (예컨대 관절 주사로 투여함); 코르티코스테로이드 (예컨대 메틸프레드니솔론 및/또는 프레드니손); 폴레이트 등 중의 임의의 1종 이상과 병용될 수 있다. 가장 바람직한 DMARD는 MTX이다. 매주 투여되는 저투여량의 MTX 요법은 이의 항-증식 효과로 인해 DNA와 RNA의 합성을 억제하고, 소염 활성을 갖는 매개자인 아데노신의 방출을 자극한다. MTX의 부작용으로는 구역, 설사, 피로, 구강 궤양 및 혈액계 저해 등이 있다. 드물게는, 환자에서 폐렴-유사 반응 또는 경변이 발생하는 경우가 있다. 메토트렉세이트는 일반적으로 1주 당 7.5 내지 10 mg의 투여량으로 시작된다. 허용되는 경우에는 상기 투여량이 이후 수개월 동안 1주 당 20 내지 25 mg까지로 증가된다. 그러나, 노인 환자와 경미한 신장 기능장애가 있는 환자에게는 더 낮은 투여량의 MTX가 처방되어야 하고, 혈청 크레아티닌 수준이 2.5 mg/dL를 넘는 환자에게는 MTX이 투여되어선 안된다. ACR은 MTX 투여 환자를 모니터링하는 지침을 수립하였고, 혈액 세포수 및 간 효소를 4주 내지 8주 간격으로 평가할 것을 권고한다.

또다른 실시양태에서, 혈관신생 길항제는 자가면역 질환 치료에 효과적인 다른 길항제 생물학적 물질과 병용된다. 예를 들어, 혈관신생 길항제는 TNFα-억제제, B-세포 길항제, 또는 이들 둘다와 병용될 수 있다. TNFα-억제제는 TNFα의 생물학적 기능을 감소시키거나 억제하거나 차단하거나 중단시키거나 또는 방해하는 임의의 작용제일 수 있다. TNFα-억제제는 TNFα에 결합하여 그의 활성을 중화시키는 것이 바람직하다. 본원에서 구체적으로 고려되는 TNF 억제제의 예는 에타네르셉트 (엔브렐^®), 인플릭시맵 (레미케이드^®) 및 아달리무맵 (휴미라™)이다. B-세포 길항제는 B-세포 표면 마커, 예를 들어 CD20, CD22, CD19 및 CD40에 결합하는 길항제 항체일 수 있다. CD20 항원에 결합하는 항체의 예는 다음과 같다: 현재 "리툭시맵" ("리툭산(RITUXAN)^®")이라고 불리는 "C2B8" (미국 특허 제5,736,137호, 본원에 명시적으로 참조로 도입됨); "Y2B8"이라고 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 (미국 특허 제5,736,137호, 본원에 명시적으로 참조로 도입됨); "¹³¹I-B1" 항체를 생성하기 위하여 임의로 ¹³¹I로 표지된 뮤린 IgG2a "B1" (벡사르(BEXXAR)™) (미국 특허 제5,595,721호, 본원에 명시적으로 참조로 도입됨); 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" [Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)]; "키메라 2H7 항체" (미국 특허 제5,677,180호, 본원에 명시적으로 참조로 도입됨); "인간화 2H7 v16" (하기 참조); huMax-CD20 (젠맵(Genmab), 덴마크 소재); AME-133 (어플라이드 몰레큘라 에볼루션(Applied Molecular Evolution)); 및 인터내셔널 류코사이트 타이핑 워크샵(International Leukocyte Typing Workshop)에서 구할 수 있는 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 [Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press (1987)]. CD19 항원에 결합하는 항체의 예로는 항-CD19 항체 ([Hekman et al. Cancer Immunol. Immunother. 32:364-372 (1991)] 및 [Vlasveld et al. Cancer Immunol. Immunother. 40:37-47 (1995)]) 및 B4 항체 [Kiesel et al. Leukemia Research II, 12:1119 (1987)] 등이 있다.

환자에게 단백질 길항제를 투여하는 것과는 별도로, 본 출원은 유전자 요법에 의한 길항제의 투여를 고려한다. 길항제를 코딩하는 핵산의 이러한 투여는 "치료 유효량의 길항제 투여"라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 1996년 3월 14일자로 공개된, 세포내 항체 생성을 위한 유전자 요법의 이용에 관한 WO 96/07321을 참조한다.

환자의 세포에 핵산 (임의로는 벡터에 함유된 핵산)을 도달시키는 2가지 주요 접근법은 생체내 및 생체외 방법이다. 생체내 전달을 위해서는, 일반적으로 길항제가 요구되는 부위에서 핵산을 환자에게 직접 주사한다. 생체외 치료를 위해서는, 환자의 세포를 취하여 이들 단리된 세포에 핵산을 도입하고, 상기 변형된 세포를 환자에게 직접 투여하거나 또는 변형된 세포를 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화시켜 투여한다 (예컨대, 미국 특허 제4,892,538호 및 동 제5,283,187호 참조). 살아있는 세포에 핵산을 도입하는데 이용할 수 있는 기술은 다양하다. 상기 기술은, 핵산이 배양된 세포에 시험관내 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포에서 생체내 전달되는지에 따라 달라진다. 포유동물 세포에 핵산을 시험관내 전달하는데 적당한 기술로는, 리포좀의 사용, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 있다. 유전자의 생체외 전달에 보편적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 선호되는 생체내 핵산 전달 기술로는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재의 시스템 (유전자의 지질-매개된 전달에 유용한 지질의 예는 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 이용한 형질감염 등이 있다. 일부 상황에서는, 예를 들어 세포 표면 막 단백질이나 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 같이 표적 세포를 표적으로 하는 작용제를 핵산 공급원에게 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 예를 들어 특정 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화되는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증진시키는 단백질을 표적화하고/하거나 이의 획득을 용이하게 하기 위해서 세포내이입(endocytosis)과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입 기술은 예를 들어 문헌 ([Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)])에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜을 검토하기 위해서는 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673과 상기 문헌에서 인용된 참조문헌을 참조한다.

본 발명의 추가 상세사항은 하기하는 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서의 모든 인용문헌의 개시내용은 본원에 참조로 도입된다.

실시예 1

MTX를 이용한 이전 요법에 실패하고 현재 MTX에 부적절한 반응을 보이는 활 동성 류마티스성 관절염 환자에게 항-hVEGF 모노클로날 항체, 예를 들어 아바스틴^®을 처치하였다.

본 실시예에 따른 요법을 실시한 후보자들은 개정된 1987년 ACR 기준에 따라 6개월 이상 동안 RA로 진단을 받은 사람들을 포함하였다. 환자들에게는 MTX를 12주 이상 동안 1주 당 10 내지 25 mg의 투여량으로 경구 또는 비경구 투여했고, 스크리닝하기 이전의 마지막 4주 동안에는 일정 투여량으로 투여하였다. 또한, 환자들은 5종 이하의 DMARD 또는 생물학적 물질 (MTX 포함함)을 사용한 치료에 실패했던 (효능이나 허용성이 없음) 사람들이었다.

환자들은 스크리닝 및 무작위화시에 SJC (Swollen Joint Count)가 6 이상이고 (관절수 66), TJC (Tender Joint Count)가 6 (관절수 68) 이상일 수 있다: 1.2 mg/dl (12 mg/L) 이상의 CRP 또는 28 mm/시간 이상의 ESR. 환자들은 RA 진단 이후 5년 미만인 18세와 64세 (포괄적)인 것이 바람직하였다. 생식 가능한 남성은 확실한 피임 수단 (예컨대, 물리적 장벽)을 사용하는 것이 바람직하였고, 여성은 폐경기이거나 불임 수술을 받은 사람인 것이 바람직하였다. 주요 제외 기준은 예를 들어 심혈관 질환, 신경계, 폐, 신장, 간, 내분비계 또는 위장 장애 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 제어되지 않는 유의한 부수적 질환이 입증되어 일반적인 안전성이 염려되는 지를 기준으로 하였다. 또한, PE, DVT 또는 CVA 등을 비롯한 혈전색전성 질환의 병력이 있거나 진성당뇨병의 병력이 있거나 제어되지 않는 고혈압의 병력이 있거나 또는 단백뇨의 병력이 있는 환자들도 처치에서 제외시켜야 했다.

요법에 사용되는 항-VEGF 항체는 베바시주맵 (아바스틴^®, 제넨테크, 인크.에서 시판함) 또는 결합 친화도, 억제 효능 또는 약력학적 성질이 개선된 그의 변이체인 것이 바람직하다.

환자에게는 항체를 치료 유효 투여량으로, 예를 들어 매 2주 마다 1 내지 2.5 mg/kg i.v. (1.0 mg/kg/주)의 단일 투여량으로 처치하였다. 환자에게는 또한 상기 항-VEGF 항체 주입 30분 이전에 메틸프레드니솔론 100 mg i.v. 투여, 및 제2일 내지 제7일에는 60 mg p.o.의 프레드니손 투여, 제8일 내지 제14일에는 30 mg p.o.의 프레드니손 투여, 제16일에는 다시 기저 투여량의 프레드니손 투여로 구성된 코르티코스테로이드 요법을 병용하면서 MTX (1주 당 10 내지 25 mg 경구 (p.o.) 또는 비경구 투여)를 동시에 투여할 수도 있다. 환자에게는 또한 폴레이트 (5 mg/주)를 단일 투여량 또는 1일 분할 투여량으로 투여할 수도 있다. 환자들에게는 임의로 처치 기간 전체에 걸쳐 임의의 배경 코르티코스테로이드 (10 mg/일 프레드니손 또는 균등물)를 계속 투여한다.

1차 종점(endpoint)은 류마티드양 인자 및 영역을 위해 조정된, 군 차이를 비교하기 위한 코크란-만텔-핸스젤(Cochran-Mantel-Haenszel (CMH)) 시험을 이용하여 제24주에 ACR20 반응을 갖는 환자의 비율이다.

추가의 2차 종점은 하기를 포함한다:

1. 제24주에 ACR50과 ACR70 반응을 갖는 환자의 비율. 이들은 1차 종점과 관련하여 명시한 바와 같이 분석될 수 있다.

2. 스크리닝시부터 제24주까지 질환 활성 스코어(Disease Activity Score, DAS)에 있어서의 변화. 이들은 기저선 DAS, 류마티드양 인자 및 모델 관점에서의 치료 상태를 이용한 ANOVA 모델을 이용하여 평가될 수 있다.

3. 제24주에서의 분류별 DAS 반응자 (EULAR 반응). 이들은 류마티드양 인자에 대하여 조정된 CMH 시험으로 평가될 수 있다.

4. 스크리닝시부터 ACR 코어 세트 (SJC, TJC, 환자와 의사의 전반적 평가, HAQ, 통증, CRP 및 ESR)에 있어서의 변화. 이들 파라미터에 대한 기술적 통계치가 보고될 수 있다.

5. 스크리닝시부터 SF-36에 있어서의 변화. 8 도메인 스코어와 정신적 및 육체적 성분 스코어에 대한 기술적 통계치가 보고될 수 있다. 또한, 정신적 및 육체적 성분 스코어는 추가로 분류되어 분석될 수 있다.

6. 변형된 샤프(Sharp) 방사선촬영 총 스코어, 미란 스코어, 및 관절 공간 협착 스코어에서의 변화. 적절하다면, 연속적 또는 분류적 방법으로 이것을 분석한다.

예비 종점 및 분석은 하기를 포함한다:

적절하다면, 제8주, 제12주, 제16주, 제20주, 제24주에 걸친 ACR (20/50/70 및 ACR n) 및 DAS 반응에서의 변화가 2진 또는 연속적 반복 측정 모델을 이용하여 평가될 것이다. 미란 진행이 없는 환자의 비율을 포함하는 예비 방사선촬영 분석이 제24주 및 그 이후에 평가될 수 있다.

추가의 예비 종점 (예를 들어 완전 임상 반응, 질환이 없는 기간)이 연장된 관찰 기간의 일부로서 기술적으로 분석될 것이다. FACIT-F 피로 스크린으로부터의 변화가 기술적 통계치으로 분석될 것이다. 상기한 바와 같이 DMARD 또는 TNFα 억제제 요법에 부적절한 반응을 보이는 환자에서 항-VEGF 항체를 사용한 RA 요법은, 앞서 주지한 종점 중 어느 하나 이상에 따라 유익한 임상적 반응을 나타낼 것이다.

Claims (20)

1. 자가면역 질환에 대한 이전 요법에 실패했던 포유동물에서의 자가면역 질환 치료용 약제의 제조에 있어서, 혈관신생 길항제의 용도.
2. 제1항에 있어서, 혈관신생 길항제가 VEGF 길항제인 용도.
3. 제1항에 있어서, 길항제가 항체를 포함하는 것인 용도.
4. 제3항에 있어서, 항체가 항-VEGF 항체인 용도.
5. 제4항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맵인 용도.
6. 제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 용도.
7. 제1항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년발병형 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염으로 이루어진 군에서 선택된 것인 용도.
8. 제1항에 있어서, 이전 요법이 1종 이상의 DMARD (질환-변형 항류마티스 약물 (Disease-Modifying Antirheumatic Drug))제의 투여를 포함하는 것인 용도.
9. 제8항에 있어서, 이전 요법이 메토트렉세이트 (MTX)의 투여를 포함하는 것인 용도.
10. 제1항에 있어서, 이전 요법이 1종 이상의 TNFα-억제제의 투여를 포함하는 것인 용도.
11. 제1항에 있어서, 혈관신생 길항제가 일련의 DMARD제와 병용 투여되거나 또는 일련의 DMARD제 중에서 투여되는 것인 용도.
12. 제11항에 있어서, DMARD제가 MTX인 용도.
13. 제1항에 있어서, 혈관신생 길항제가 일련의 TNFα-억제제와 병용 투여되거나 또는 일련의 TNFα-억제제 중에서 투여되는 것인 용도.
14. 제13항에 있어서, TNFα-억제제가 에타네르셉트, 인플릭시맵 및 아달리무맵으로 이루어진 군에서 선택된 것인 용도.
15. 제1항에 있어서, 혈관신생 길항제가 B-세포 표면 항원에 결합하는 일련의 B- 세포 길항제와 병용 투여되거나 또는 B-세포 표면 항원에 결합하는 일련의 B-세포 길항제 중에서 투여되는 것인 용도.
16. 제15항에 있어서, B-세포 표면 항원이 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86으로 이루어진 군에서 선택된 것인 용도.
17. 제15항에 있어서, B-세포 길항제가 CD20에 대한 항체를 포함하는 것인 용도.
18. 제17항에 있어서, CD20에 대한 항체가 리툭시맵인 용도.
19. 제17항에 있어서, CD20에 대한 항체가 인간화 2H7 v16인 용도.
20. 이전의 DMARD 요법 또는 TNFα-억제제 요법에 실패하고 현재 MTX에 부적절한 반응을 보이는 환자에서의 류마티스성 관절염 치료용 약제의 제조에 있어서, 항-VEGF 항체의 용도.