JP6974874B2

JP6974874B2 - ヒトｐｄ−ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチド及びその使用

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Publication number: JP6974874B2
Application number: JP2019546150A
Authority: JP
Inventors: 朱乃碩; 劉宝修
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Current assignee: Individual
Priority date: 2017-02-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2021-12-01
Anticipated expiration: 2038-01-25
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Description

本発明は、生物工学の分野に属し、具体的にはヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチド及びその使用に関する。

腫瘍は人間の健康を脅かす重要な疾患であり、かつ効果的な予防が困難である。現在腫瘍を治療する方法は主に放射線療法、化学療法及び手術治療等があるが、効果は不十分であり、手術後の５年間の生存率が低い。腫瘍を効果的に治療する薬物を開発することは現在の腫瘍研究のホットな課題である。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１に代表される免疫チェックポイント療法は近年盛んに行われており、ＦＤＡによって臨床治療用に承認されたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体類薬物は３つがあり、これらは一定の効果があるが、低効率、副作用及びオフ・ターゲットの表現も伴うのである。したがって、効率的で、持続性であり、広い治療作用を有する薬物の開発が迫っている。

化学的方法で合成し、精製した後に目的のポリペプチドを得る。ＥＬＩＳＡの方法でポリペプチドとＰＤ−Ｌ１タンパク質の解離定数を検出し、かつ該ポリペプチドのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１信号経路に対するインビトロ遮断作用を検出する。フローサイトメーターで該ポリペプチドの細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質への親和性を検出する。最後にマウスの腫瘍動物モデルに注射し、マウスの腫瘍の大きさの変化及び生存時間の変化を観察することにより該ポリペプチドが腫瘍を治療する潜在的価値を推測する。

本発明の目的は、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチド及びその腫瘍治療における使用を提供することである。

本発明が提供されるヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチド（ＰＰＬＣと記す）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、次のような機能的な特徴を有する：(1)ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に対して、測定される解離定数が０．７５μＭ（Ｋｄ値は、レセプターの半分がリガンドによって結合されたときのリガンドの濃度を示し、Ｋｄ値が小さければ小さいほど、リガンドに対するレセプター親和性が高くなる。）に達することができる。(2)ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を効果的に阻害することができる。(3)細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質と効果的に結合することができる。(4)腫瘍に感染した動物に注射することで、腫瘍の成長を効果的に抑制し、動物生存時間を延長することができる。

さらに、本発明は前記ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドをコードする遺伝子（対応するアミノ酸の縮重コドンからなる）を提供し、そのヌクレオチド配列が配列番号２に示す。

さらに、生物工学的修飾により、本発明は一連の配列が異なるが、配列番号１に示すペプチドと同じ機能を有するペプチド配列が得られ、その配列が主に、配列番号３、配列番号４を含む。

さらに、本発明は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドのアミノ酸配列が配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示すペプチド配列を同時に含み、単一リピート又は複数リピートを有するタンデム又は分岐ペプチド分子配列であり、及びこれらのコア配列特徴（相同性が７０％以上）を含む分子を提供し、そのペプチドアミノ酸の配列が、配列番号５に示す。

さらに、本発明は、コア配列としてＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドを含み、そのＣ末端（又はＮ末端、又は側鎖）基においてＰＥＧによって修飾されたか又は他の分子基で共有結合によって修飾された構造的に特徴のある分子である、生物的に修飾された又は化学基によって修飾されたペプチドを提供する。

さらに、本発明は、上記各種のＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドを含み、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドをＦＩＴＣなどの蛍光性基で修飾され、またはアイソトープでラベル化され、或いは化学発光基又は酵素標識試薬で修飾された分子であり、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の検出に適用可能な修飾されたポリペプチドを提供する。

さらに、本発明は、上記各種のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドの、ＰＤ−Ｌ１タンパク質アンタゴニストを製造するための使用を提供する。

さらに、本発明は、上記各種のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドの、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の検出薬剤及び臨床検出試薬を製造するための使用を提供する。

さらに、本発明は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有するペプチド遺伝子の、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現のアンタゴニストの製造及びトレーサー検出のための使用を提供する。

本発明の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアンタゴニストとすることができる。該ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質と強い親和性を有し、ヒト免疫の負の調節信号経路ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を遮断して免疫を活性化させ、腫瘍に対するＴ細胞の殺傷を開始し、潜在的な腫瘍標的治療の薬物とすることができる。本発明の配列番号３、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドは、同様にＰＤ−Ｌ１タンパク質のアンタゴニストとすることができる。この２本のペプチドも、ＰＤ−Ｌ１タンパク質と高親和性を有し、かつＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合を阻害でき、免疫による腫瘍細胞への殺傷を発動することができる。

ＰＤ−Ｌ１タンパク質への該ペプチドの親和性アッセイの結果
９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、２μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１タンパク質でコートし、異なる濃度のＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、１時間インキュベーションした後、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を加え、１時間インキュベーションし、次に、ＡＢＴＳ着色溶液を加え、Ｍ５マイクロプレートリーダーでＯＤ４１０数値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６でプロットして分析した。この結果は、ＰＰＬＣがＰＤ−Ｌ１タンパク質と極めて強い親和性を有することを立証し、解離定数が０．７５μＭであった（図１）。

ＰＤ−Ｌ１タンパク質への該ペプチドとＰＤ−１競合結合の実験結果
２μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１タンパク質を４℃で９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに一晩コートし、異なる濃度のＰＰＬＣと１μｇ／ｍｌのＰＤ−１タンパク質を混合し、インキュベーションした後、ウサギ抗ヒトＰＤ−１のモノクローナル抗体を一次抗体とし、ＨＲＰ標識のヤギ抗ウサギＩＧｇのモノクローナル抗体を二次抗体として加え、ＡＢＴＳ発色した後にＭ５マイクロプレートリーダーでＯＤ４１０を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６でプロットして分析した。結果は、ＰＰＬＣがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合を効果的に阻害できることを示した（図２）。

該ペプチドと細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質との結合の実験結果
組換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質組換えプラスミドをＣＨＯ細胞株にトランスフェクションし、３６時間培養後、ＰＤ−Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体又はＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、４℃で、３０分間インキュベーションし、フローサイトメーターで検出を行った（図３）。プラスミドをトランスフェクションした後、３６時間培養を続け、ＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、蛍光共焦点検出を行った（図４）。結果は、ＰＰＬＣペプチドが細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質と効果的に結合できることを示した（図３／図４）。

該ペプチドの腫瘍動物モデルにおける腫瘍体積の大きさへの影響
実験動物をＰＢＳ群とＰＰＬＣ群に分け、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃに腫瘍を皮下注射し、２週間後に腫瘍が１００ｍｍ^３になると、ＰＰＬＣ薬の治療を行った。マウス腫瘍の大きさを毎日秤量し、差異を記録した。その結果は、当該ペプチドが、マウス腫瘍の成長速度を顕著に低下させ（図５）、マウスの生存時間を延長できる（図６）ことを見出した。

以上より、該ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対して極めて強い親和性を有し、該ペプチドよりヒト体内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を阻害し、腫瘍の免疫寛容を破壊し、免疫を活性化し、腫瘍治療の目的を達成することが分かった。したがって、該ペプチドを腫瘍標的治療の薬物とすることができる。ＰＰＬＣペプチドは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するため、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を検出するためのプローブの調製に使用でき、ＰＰＬＣペプチドをＦＩＴＣなどの蛍光性基、アイソトープ、化学発光基又は酵素試薬でラベルされた分子は、様々な生体試料や細胞ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在を定量、定性、位置決めの検出に応用できる。

図１はＰＤ−Ｌ１タンパク質へのＰＰＬＣの結合親和性を示す。図２はＰＰＬＣがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を阻害することを示す。図３はフローサイトメトリーの結果を示す。ここで、左図はＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ＰＤ−Ｌ１−Ａｂ）の検出結果を示し、右図はポリペプチドＰＬ−Ｃの検出結果を示す。灰色の影はＰＤ−Ｌ１陰性対照の細胞を表し、赤色及び青色の線はＰＤ−Ｌ１陽性のＣＨＯ−ＰＤＬ１発現細胞を表す。図４は蛍光共焦点試験の結果を示す。ここで、右上図は共焦点顕微鏡によって観察されたＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドとＣＨＯ細胞表面で発現したＰＤ−Ｌ１との高親和性を立証する検出の結果を示す。図５はＰＰＬＣがマウス腫瘍の成長を抑制することを示す。図６はＰＰＬＣがマウスの生存時間を延長することを示す。

１．ポリペプチド配列の取得及び修飾

化学的方法によって人工的に合成した所望のポリペプチド配列は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に親和性を有し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を阻害することができる。

２．ポリペプチドの合成及び精製

ＬＹＳ（Ｄｄｅ）ワングレジンをＤＣＭ中に１０分間浸潰し、ＤＣＭを排出した後、３倍の樹脂体積の２５％ピぺリジン（ピペリジン／ＤＭＦ）を加え、２０分間窒素を通気した後にピぺリジンを排出した。ＤＭＦを加え、１分間パージした。６サイクル後、ＤＭＦを排出し、樹脂を取ってニンヒドリンによって青であることが検出された。この生成物は、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）ワングレジンである。樹脂に対する３倍当量のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡをＤＭＦに加えた。窒素で２０分間パージした後、ＤＭＦ反応溶液を排出した。ＤＭＦを加え、窒素で１分間パージした。３サイクル後、樹脂をニンヒドリンによって青であることが検出された。この製品は、Ｆｍｏｃ−Ｖａ１−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）ワングレジンである。同様の方法によって粗製品を得た。アセトニトリル及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いるハンバン（Ｈａｎｂａｎｇ）ＹＣＭＣｌ８カラムで精製を行った。このように、高特異性及び高活性を有する目的のポリペプチドを得た。

３．ＰＤ−Ｌ１タンパク質へのＰＰＬＣの親和性及び動物実験結果

（１）ＰＤ−Ｌ１タンパク質への該ペプチドの親和性アッセイの結果
９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、２μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１タンパク質でコートし、異なる濃度のＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、１時間インキュベーションした後、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を加え、１時間インキュベーションし、次に、ＡＢＴＳ着色溶液を加え、Ｍ５マイクロプレートリーダーでＯＤ４１０数値を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６でプロットして分析した。この結果は、ＰＰＬＣがＰＤ−Ｌ１タンパク質と極めて強い親和性を有することを立証し、解離定数が０．７５μＭであった。

（２）ＰＤ−Ｌ１タンパク質への該ペプチドとＰＤ−１競合結合の実験結果
２μｇ／ｍｌのＰＤ−Ｌ１タンパク質を４℃で９６ウエルＥＬＩＳＡプレートに一晩コートし、異なる濃度のＰＰＬＣと１μｇ／ｍｌのＰＤ−１タンパク質を混合し、インキュベーションした後、ウサギ抗ヒトＰＤ−１のモノクローナル抗体を一次抗体とし、ＨＲＰ標識のヤギ抗ウサギＩＧｇのモノクローナル抗体を二次抗体として加え、ＡＢＴＳ発色した後にＭ５マイクロプレートリーダーでＯＤ４１０を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６でプロットして分析した。結果は、ＰＰＬＣがＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の結合を効果的に阻害できることを示した。

（３）該ペプチドと細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質との結合の実験結果
組換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質組換えプラスミドをＣＨＯ細胞株にトランスフェクションし、３６時間培養後、ＰＤ−Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体又はＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、４℃で、３０分間インキュベーションし、フローサイトメーターで検出を行った。プラスミドをトランスフェクションした後、３６時間培養を続け、ＦＩＴＣでラベルしたＰＰＬＣペプチドを加え、３７℃で３０分間インキュベーションし、蛍光共焦点検出を行った。結果は、ＰＰＬＣペプチドが細胞表面で発現されたＰＤ−Ｌ１タンパク質と効果的に結合できることを示した。

（４）該ペプチドの腫瘍動物モデルにおける腫瘍体積の大きさへの影響
実験動物をＰＢＳ群とＰＰＬＣ群に分け、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃに腫瘍を皮下注射し、２週間後に腫瘍が１００ｍｍ３になると、ＰＰＬＣ薬の治療を行った。マウス腫瘍の大きさを毎日秤量し、差異を記録した。その結果は、当該ペプチドが、マウス腫瘍の成長速度を顕著に低下させ、マウスの生存時間を延長できることを見出した。

その結果（図１〜図６に示す）から、ＰＰＬＣはＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有し、かつＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を分子レベルで阻害できることがわかった。動物実験結果によると、ＰＰＬＣペプチドで治療された後のマウスの腫瘍体積は対照群より明らかに小さいことが示された。上記の結果は、ＰＰＬＣが腫瘍免疫寛容を破壊し、Ｔ細胞の腫瘍細胞への殺傷を向上させて腫瘍治療の目的を達成できたことを立証した。

４．産業適用性

腫瘍免疫療法は近年盛んになって腫瘍を治療する新たな手段であり、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質に代表される免疫チェックポイント阻害療法はその中で重要な構成部分である。現在ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体類薬物は米国食品医薬品局によって承認されており、臨床使用及びメラノーマなどの疾患で優れた効果を示す。しかし、これと同時に、抗体治療は、高い免疫原性、高費用、大きな副作用、やオフ・ターゲット効果などの問題にも直面している。ターゲティングと小さな免疫原性の両方を備えた抗腫瘍薬の開発は、現在の免疫学の発展における一つの重要な方向である。本発明が提供するヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を阻害し、腫瘍の免疫寛容を破壊し、腫瘍細胞の成長を顕著に抑制できるため、潜在的な腫瘍標的治療の薬物として有用である。また修飾されたＰＰＬＣペプチドを介して、ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を検出し、検出試薬として用いることができる。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチド。
請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドをコードするコード遺伝子であって、
配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるコード遺伝子。
コア配列として請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドを含み、そのＣ末端、Ｎ末端又は側鎖基においてＰＥＧによって修飾されていることを特徴とする修飾されたペプチド。
請求項１に記載のＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドが蛍光性基で修飾され、またはアイソトープでラベル化され、或いは化学発光基又は酵素標識試薬で修飾された分子であり、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の検出に適用可能であることを特徴とする修飾されたポリペプチド。
蛍光性基がＦＩＴＣである、請求項４に記載の修飾されたポリペプチド。
請求項１に記載のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドの、ＰＤ−Ｌ１タンパク質アンタゴニストを製造するための使用。
請求項１に記載のヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドの、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の検出薬剤及び臨床検出試薬を製造するための使用。
請求項２に記載のＰＤ−Ｌ１タンパク質に高親和性を有するペプチドのコード遺伝子の、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアンタゴニスト及びトレーシング・検出薬剤を製造するための使用。