CN117700493A - 一种kk-lc-1靶向结合蛋白及其衍生物、试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种KK‑LC‑1靶向结合蛋白及其衍生物、试剂盒和应用，其中：KK‑LC‑1靶向结合蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5之一所示；本发明中KK‑LC‑1靶向结合蛋白的分子量仅有17Kd左右，约为抗体的十分之一，具有良好的组织穿透性，并且生产工艺简单，产量高。本发明的靶向结合蛋白对KK‑LC‑1表达阳性的肿瘤体内外均具有良好的靶向性，可以用于肿瘤靶向给药，是肿瘤免疫治疗的潜在药物。同时利用靶向结合蛋白研发了KK‑LC‑1血清检测试剂盒，可定量检测出人体内KK‑LC‑1含量。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种KK-LC-1靶向结合蛋白、衍生物和试剂盒及其应用。
背景技术
KK-LC-1（Kita-Kyushu lung cancer antigen-1，也称CT83或cxorf61），位于Xq22染色体上，由556bp组成，为癌睾抗原家族成员，蛋白质分子量为12.784Kd,细胞亚定位于细胞膜和细胞质。据报道，KK-LC-1可以调节ALDH1的表达从而间接介导三阴乳腺癌的进展，而靶向KK-LC-1的小分子化合物可以下调ALDH1的表达从而实现肿瘤消退，这表明，KK-LC-1或在肿瘤的发生发展中起着重要调控作用。
生理情况下，KK-LC-1表达谱极窄，仅在睾丸组织中表达，在其它健康组织中不表达，而在肿瘤组织中，其在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等多种癌种中均被检测出高表达率，这使其成为靶向治疗的潜力靶点。以胃癌为例，KK-LC-1在近80%的胃癌组织中表达，在正常胃组织中不表达，且高表达KK-LC-1的胃癌患者预后较差，提示KK-LC-1是治疗胃癌的一个潜在靶标。现已有研究证明，以KK-LC-1为靶点的多肽偶联药物经尾静脉回输荷瘤小鼠后，皮下接种高表达KK-LC-1的胃癌细胞的荷瘤鼠的瘤体积增长明显被抑制，生存期明显延长。
鉴于以KK-LC-1为靶点的靶向治疗效果明显，毒副作用低，以KK-LC-1为靶点的治疗方案可向多个方向展开发展，包括光敏疗法、抗体偶联药物、疫苗、CAR-T、TCR-T、单克隆抗体药等，其中由美国国家癌症研究所研发的TCR-T正在进行I期临床试验。
总之，KK-LC-1是抗肿瘤药物研发中的潜力靶点，但是目前针对KK-LC-1的抗体多存在分子量大、实体瘤渗透性差、免疫原性强需人源化改造、生产工艺复杂、稳定性差运输和保存要求高，研发和使用费用高的问题，因此研发具备高亲和力、高渗透性的低分子量靶向结合蛋白尤为关键。
同时，现已有文献证实，肺腺癌患者血清KK-LC-1表达水平与肿瘤负荷成正相关，这提示其或可成为良好的肿瘤血清标志物，但目前临床上尚无KK-LC-1体外诊断检测试剂。因此开发一种能够快速、准确、高灵敏的检测人体内KK-LC-1含量的检测试剂盒，以用于对KK-LC-1阳性肿瘤的预测、诊断与预后监测具有重要的临床应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种KK-LC-1靶向结合蛋白，该蛋白可与KK-LC-1蛋白特异性结合，体内外实验均可高效靶向KK-LC-1阳性肿瘤，在此基础上，本发明提供了一种KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物、一种用于定量检测KK-LC-1的CBA试剂盒以及KK-LC-1靶向结合蛋白的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种KK-LC-1靶向结合蛋白， KK-LC-1靶向结合蛋白是对KK-LC-1蛋白能特异性结合的蛋白，KK-LC-1靶向结合蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5之一所示。
优选地，KK-LC-1靶向结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：其中，第30位、第32位、第33位、第35位、第41位、第42位、第63位、第65位、第66位、第68位、第74位、第75位、第96位、第98位、第99位、第101位、第107位和第108位的X为任意氨基酸。
一种KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物，包括噬菌体、荧光染料偶联产物、螯合物、放射性核素络合物偶联产物。
一种KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒，KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒为CBA试剂盒。
进一步的，所述CBA试剂盒包括荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白和生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白。
进一步的，所述荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白的制备方法为：将EDC、NHS加入化学发光磁珠终，混匀，活化结束后用磁力架分离磁珠，向磁珠中加入KK-LC-1靶向结合蛋白，混匀,标记反应结束后，磁力架分离磁珠，加入封闭剂，封闭后磁力架分离，得终产物；
进一步的，所述生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白的制备方法为：将KK-LC-1靶向结合蛋白加入到生物素溶液中，混匀，标记反应结束后，利用PD-10柱纯化分离，得终产物。
一种KK-LC-1靶向结合蛋白的应用， KK-LC-1靶向结合蛋白用于制备KK-LC-1靶向结合蛋白试剂盒，所述KK-LC-1靶向结合蛋白试剂盒用于定量检测KK-LC-1。
进一步的，所述CBA试剂盒定量检测检测KK-LC-1的方法包括以下步骤：将待检测的血清或血浆样本，以及生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白加入荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白中，震荡混匀；反应结束后磁分离；加入SA-PE抗体，震荡混匀，反应结束后磁分离，检测荧光强度，绘制标准曲线，计算得出待测血清或血浆样本中KK-LC-1的浓度。
一种KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，所述KK-LC-1靶向结合蛋白用于制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物。
进一步的，所述KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物包括：
蛋白偶联细胞毒性药物，如MMAE、PE、美登素、喜树碱类化合物、卡奇霉素类化合物等；
融合免疫细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、TNF-α等；
免疫细胞结合蛋白如融合CD3结合肽、蛋白或抗体，CD28结合肽、蛋白或抗体，CD16A结合肽、蛋白或抗体，NKp46结合肽、蛋白或抗体；
以及含KK-LC-1靶向结合蛋白基因及KK-LC-1靶向结合蛋白序列的转基因修饰的免疫细胞如CAR-T、CAR-NK等。
进一步的，所述KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物及含KK-LC-1靶向结合序列的各种衍生产物在制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新型、高亲和力的KK-LC-1特异性靶向结合蛋白，其分子量仅有17Kd左右，约为抗体的十分之一，具有良好的组织穿透性，并且生产工艺简单，产量高。本发明的靶向结合蛋白对KK-LC-1表达阳性的肿瘤体内外均具有良好的靶向性，可以用于肿瘤靶向给药，是肿瘤免疫治疗的潜在药物。同时利用靶向结合蛋白研发了KK-LC-1血清检测试剂盒，可定量检测出人体内KK-LC-1含量。
附图说明
图1是实施例1中靶向结合蛋白1,2,3,4,5的吸光度图；
图2是实施例2中在共聚焦显微镜下观察细胞板荧光图；
图3是实施例3中靶向结合蛋白靶向富集在肿瘤组织中的图；
图4是实施例4中标准曲线图；
图5是实施例4中10名病人血清中KK-LC-1含量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
本发明所涉及的KK-LC-1特异性靶向结合蛋白通过大肠杆菌表达体系合成，合成简便，产量高，成本低廉。
实施例1
ELISA检测靶向结合蛋白对KK-LC-1分子的结合：
1、使用大肠杆菌表达系统合成编码如下的靶向结合蛋白2,3,4,5，并表达阴性对照靶向结合蛋白1，使用镍柱纯化，用金斯瑞内毒素去除试剂盒去除内毒素至<0.1EU/ug:
靶向结合蛋白1（N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.1）
靶向结合蛋白2（N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.2）
靶向结合蛋白3（N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.3）
靶向结合蛋白4（N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.4）
靶向结合蛋白5（N端含有组氨酸标记的SEQ ID No.5）
2、将KK-LC-1蛋白包被平底96孔板，封闭后与同等浓度靶向结合蛋白1,2,3,4,5共孵育2h，使用含有0.5%吐温20的PBS（0.5% PBST）洗去各组靶向结合蛋白后，加入稀释的anti-His 二抗，继续孵育1h。使用0.5% PBST洗去 anti-His 二抗后，加入TMB溶液。室温，避光反应2-5min，溶液由无色变为蓝色。加入1M稀盐酸终止反应。溶液由蓝变黄。
3、使用酶标仪，以OD450测量吸光度；
如图1所示，对比阴性对照组，靶向结合蛋白2,3,4,5与KK-LC-1蛋白有明显结合。
所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5的具体蛋白序列如下：
SEQ ID No.1：
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGAPFTADAAGATPLHLAAAAGHLEIVEVLLKYGADVNAADAAGATPLHLAAAAGHLEIVEVLLKYGADVNAADAAGATPLHLAAAAGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKSGKTSADLAADAGHEDIAEVLQKAA
SEQ ID No.2：
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGAPFTFDLFGLTLHLAAQWGHLEIVEVLLKYGADVNADDDWGDTPLHLAAQDGHLEIVEVLLKYGADVNAWDMFGITPLHLAATLGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKYGKTPADMAADAGHEDIAEVLQKAA
SEQ IDNo.3：
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGAPFTEDAYETPLHLAAYWGHLEIVEVLLKYGADVNARDFWGFTPLHLAAYLGHLEIVEVLLKYGADVNAWDSFGITPLHLAAAQGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKSGKTPADLAADAGHEDIAEVLQKAA
SEQ ID No.4：
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGAPFTEDWVDTPMHLAAFSGHLEIVEVLLKYGADVNAYDAEGITPLHLAARAGHLEIVEVLLKYGADVNADDMLGFTPLHLAAIDGHLEIVEVLLKYGADVNAHDKSGKTPADLAADAGHEYIAEVLQKAA
SEQ ID No.5：
DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGAPFTDDIKGVTPLHLAAIMGHLEIVEVLLKYGADVNAMDLLGHTPLHLAALQGHLEIVEVLLKYGADVNADDWQGKTPLHLAAVMGHLEIVEVLLKYGADVNAQDKSGKTSADLAADAGHEDIAEVLQKAA
实施例2
靶向结合蛋白在细胞表面结合验证：
1、将表达KK-LC-1阳性细胞株MKN45和阴性细胞株SK-HEP-1在实验室培养并贴壁，铺于共聚焦小皿上。封闭后与靶向结合蛋白1孵育1h，之后洗去未结合的蛋白,加入稀释的anti-His 二抗，继续孵育1h。洗去后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料进行细胞核染色。
2、在共聚焦显微镜下观察细胞板荧光情况。
如图2所示，对比阴性细胞，靶向结合蛋白对MKN45细胞有显著性结合。
实施例3
靶向结合蛋白在小鼠体内靶向验证
1、将靶向结合蛋白1与荧光染料cy5混合孵育，获得带荧光的靶向结合蛋白1。
2、将MKN45细胞株培养至贴壁，选取5周龄裸鼠，于腹股沟出皮下接种106以上细胞，并观察数日，直到肿瘤生长成团块状。
3、以尾静脉注射的方式为荷瘤鼠注射带荧光的靶向结合蛋白，使用近红外活体拍摄成像。
如图3所示，靶向结合蛋白可以靶向富集在肿瘤组织中。
实施例4
KK-LC-1检测CBA试剂盒的制备及应用
1、将EDC、NHS加入APC荧光磁珠中，混匀，活化结束后用磁力架分离磁珠，向磁珠中加入KK-LC-1靶向结合蛋白，标记反应结束后，磁力架分离磁珠，加入封闭剂，混匀后封闭，封闭后磁力架分离，得荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白，4℃保存。
2、将KK-LC-1靶向结合蛋白加入到生物素溶液中（投料比为30:1），混匀，标记反应结束后，利用PD-10柱纯化分离，得生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白，4℃保存。
3、检测步骤均需避光下进行, 将荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白1:500稀释，生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白1:1000稀释，将KK-LC-1蛋白标准品、稀释后生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白及稀释后荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白按照1:1:1体积比混合（各50ul），震荡混匀，室温下反应1小时；反应结束后磁分离；加入SA-PE抗体，震荡混匀，室温下反应30min~1h,反应结束后磁分离，上流式机检测荧光强度，根据荧光强度绘制标准曲线。
标准曲线如图4所示，R2为0.99，证明了该试剂盒可定量检测出不同浓度的KK-LC-1蛋白。
4、检测步骤均需避光下进行, 共选取10名肿瘤患者血清样品（其中2名患者病理结果提示KK-LC-1阳性表达，8名患者为阴性表达）。将待检测的血清或血浆样本、生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白及荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白按照1:1:1体积比混合（各50ul），震荡混匀，室温下反应1小时；反应结束后磁分离；加入SA-PE抗体，震荡混匀，室温下反应30min~1h,反应结束后磁分离，上流式机检测荧光强度，根据标准曲线计算血清中蛋白含量。
10名病人血清中KK-LC-1含量如图5所示，其中病理阳性患者相较于阴性患者血清蛋白含量明显升高，提示该试剂盒可检测出患者血清中KK-LC-1表达含量。
所述KK-LC-1靶向结合蛋白在任何血清（浆）检测试剂盒中的应用，如CBA试剂盒、化学发光试剂盒等。本实施例以CBA试剂盒为例，作重点阐述。
所述CBA试剂盒定量检测检测KK-LC-1的方法包括以下步骤：将待检测的血清或血浆样本，以及生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白加入荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白中，震荡混匀；反应结束后磁分离；加入SA-PE抗体，震荡混匀，反应结束后磁分离，检测荧光强度，绘制标准曲线，计算得出待测血清或血浆样本中KK-LC-1的浓度。
本发明的定量检测KK-LC-1的CBA试剂盒的检测原理为：本发明采用基于双抗体夹心法的化学发光免疫分析技术，将生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白、待检测的人的血清或血浆样本加入到APC荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白溶液中，待检样品中的KK-LC-1蛋白会与两个靶向结合蛋白充分结合，形成抗体-抗原-抗体APC磁微粒复合物；磁分离并清洗磁微粒后加入SA-PE荧光抗体，形成PE荧光-抗体-抗原-抗体-磁微粒复合物；磁分离并清洗后上流式机检测磁珠中PE荧光强度。样本中KK-LC-1浓度与PE荧光成正比，通过绘制标准曲线便可计算出样本中KK-LC-1的浓度。
实施例5
一种KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，所述KK-LC-1靶向结合蛋白用于制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物。
所述KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物包括：
蛋白偶联细胞毒性药物，如MMAE、PE、美登素、喜树碱类化合物、卡奇霉素类化合物等；
融合免疫细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、TNF-α等；
免疫细胞结合蛋白如融合CD3结合肽、蛋白或抗体，CD28结合肽、蛋白或抗体，CD16A结合肽、蛋白或抗体，NKp46结合肽、蛋白或抗体；
以及含KK-LC-1靶向结合蛋白基因及KK-LC-1靶向结合蛋白序列的转基因修饰的免疫细胞如CAR-T、CAR-NK等。
所述KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物及含KK-LC-1靶向结合序列的各种衍生产物在制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物中的应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种KK-LC-1靶向结合蛋白，其特征在于，KK-LC-1靶向结合蛋白是对KK-LC-1蛋白能特异性结合的蛋白，KK-LC-1靶向结合蛋白的蛋白序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5之一所示。
2.根据权利要求1所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物，其特征在于，包括噬菌体、荧光染料偶联产物、螯合物、放射性核素络合物偶联产物。
3.根据权利要求1所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒为CBA试剂盒。
4.根据权利要求3所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述CBA试剂盒包括荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白和生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的试剂盒，其特征在于，所述荧光磁珠标记的靶向KK-LC-1靶向结合蛋白的制备方法为：将EDC、NHS加入化学发光磁珠终，混匀，活化结束后用磁力架分离磁珠，向磁珠中加入KK-LC-1靶向结合蛋白，混匀,标记反应结束后，磁力架分离磁珠，加入封闭剂，封闭后磁力架分离，得终产物；
所述生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白的制备方法为：将KK-LC-1靶向结合蛋白加入到生物素溶液中，混匀,标记反应结束后，利用PD-10柱纯化分离，得终产物。
6.根据权利要求4所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，其特征在于，KK-LC-1靶向结合蛋白用于制备KK-LC-1靶向结合蛋白试剂盒，所述KK-LC-1靶向结合蛋白试剂盒用于定量检测KK-LC-1。
7.根据权利要求3所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，其特征在于，CBA试剂盒定量检测检测KK-LC-1的方法包括以下步骤：将待检测的血清或血浆样本，以及生物素标记的KK-LC-1靶向结合蛋白加入荧光磁珠标记的KK-LC-1靶向结合蛋白中，震荡混匀；反应结束后磁分离；加入SA-PE抗体，震荡混匀，反应结束后磁分离，检测荧光强度，绘制标准曲线，计算得出待测血清或血浆样本中KK-LC-1的浓度。
8.根据权利要求2所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，其特征在于，所述KK-LC-1靶向结合蛋白用于制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物。
9.根据权利要求8所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，其特征在于，所述KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物包括：蛋白偶联细胞毒性药物、融合免疫细胞因子、免疫细胞结合蛋白以及含KK-LC-1靶向结合蛋白基因及KK-LC-1靶向结合蛋白序列的转基因修饰的免疫细胞。
10.根据权利要求2所述的KK-LC-1靶向结合蛋白的应用，其特征在于，所述KK-LC-1靶向结合蛋白的衍生物及含KK-LC-1靶向结合序列的各种衍生产物在制备KK-LC-1阳性肿瘤靶向药物中的应用。
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