DE3788170T2

DE3788170T2 - Methode zur Reinigung und Isolierung von zwei ionischen Formen von Somatomedin.

Info

Publication number: DE3788170T2
Application number: DE87306961T
Authority: DE
Inventors: Bruce D Burleigh; Darla S Murphy
Original assignee: International Minerals and Chemical Corp
Current assignee: International Minerals and Chemical Corp
Priority date: 1986-08-07
Filing date: 1987-08-06
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2007-08-07
Also published as: EP0257873A3; DE3788170D1; AU7671087A; EP0257873B1; ATE97449T1; JP2677795B2; US4769361A; EP0257873A2; ES2059385T3; JPS63109794A; AU599404B2; NZ221346A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung und Isolierung von zwei verschiedenen ionischen Formen des Polypeptid-Hormons Somatomedin C und Präparationen, die jede der reinen, ionischen Formen enthalten.
Die Somatomedine sind eine Familie von Polypeptid-Hormonen, die die Aktivität von Wachstumshormonen vermitteln, und die außerdem Insulin-ähnliche biologische Aktivitäten zeigen. Die ersten Polypeptide dieser Familie, die aus Plasma bis zur Homogenität gereinigt werden konnten, wurden als Insulinähnliche Wachstumsfaktoren 1 und 2 (IGF-1 und IGF-2) bezeichnet. Über die vollständige Aminosäuresequenz von aus Plasma isoliertem IGF-1 wurde von Rinderknecht und Humbel berichtet, und es wurde gezeigt, daß sie homolog zu Proinsulin ist (J. Biol. Chem., 253 : 2769 [1980]). Es wurde gezeigt, daß aus Plasma isoliertes Somatomedin C (SmC) in seiner Aminosäuresequenz identisch zu IGF-1 ist (Klapper et al., Endocrinology, 112 : 6, 2215 [1983]). SmC/IGF-1 ist ein Polypeptid mit einer Länge von 70 Aminosäureresten, das Disulfid-Brücken an den Positionen 6-48, 18-61 und 47-52 besitzt. Der vorhergesagte pI von SmC/IGF-1, basierend auf dessen Aminosäuresequenz, beträgt etwa 8,6.
Svoboda und Mitarbeiter berichteten über ein Verfahren zur Reinigung von SmC aus der Cohn-Fraktion IV von Humanplasma (Biochemistry, 19 : 790-797 [1980]). Das Verfahren umfaßte Säure- Extraktion; Kationenaustauscher-Chromatographie an SP-Sephadex C-25 unter Elution mit 0,2 M NaCl, 0,4 N NaCl und abschließend einem pH-Stufengradienten mit pH-Werten von 5,0, 6,0 und 9,0; Größenausschluß-Chromatographie an einer Sephadex-G-50-Säule; Flachbett-Isofokussierung; und Umkehrphasen- Flüssigkeitschromatographie. Das auf diese Weise präparierte SmC soll einen pI-Wert von 8,1-8,5 besitzen.
Cornell und Boughdady berichteten über die Ergebnisse von verschiedenen Verfahren zur Reinigung von IGF-1 und IGF-2 aus Plasma (Prep. Biochem., 12(1):57 [1982]; Prep. Biochem., 14(2):123 [1984]). Bei mehreren dieser Verfahren wurde ein Kationenaustauscher-Chromatographieschritt an SP-Sephadex C-25 verwendet. Die Elution von der Säule erfolgte durch einen Stufengradienten unter Verwendung von 0,05 M Ammoniumacetat- Puffer mit pH 6,8, gefolgt von 0,06 M Ammoniumacetat, enthaltend 0,12 M NH&sub3; (pH 9,6). Es wurde berichtet, daß das aktive Material in den pH 9,6-Fraktionen eluiert wurde.
Keines der vorangegangenen Schriftstücke, die über Reinigungsverfahren unter Anwendung eines SP-Sephadex C-25- chromatographieschrittes berichteten, wies darauf hin, daß verschiedene ionische Formen von SmC/IGF-1 erhalten wurden.
Enberg und Mitarbeiter berichteten über die Reinigung von SmA durch ein Verfahren, das Affinitäts-Chromatographie an CM- Affigel blue; Größenausschluß-Chromatographie an SP-Sephadex G-50; Kationenaustauscher-Chromatographie an SP-Sephadex C-25; und Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie umfaßte (Eur, J. Biochem., 143 : 117 [1984]). Bei dem Kationenaustauscherchromatographieschritt wurde die Elution von der Säule unter Verwendung eines kombinierten pH/Salz-Gradienten mit Natriumacetat in drei Schritten mit pH/Molaritäten von 4,9/0,14, 5,3/0,17 und 7,8/0,20 durchgeführt. Von dem durch dieses Verfahren erhaltenen SmA wurde berichtet, daß es identisch mit IGF-1 sei, mit der möglichen Ausnahme eines deamidierten Glutamin-Restes an Position 40.
Kürzlich haben zwei Gruppen über die Synthese von SmC in mikrobiellen Transformanten berichtet, welche synthetische Gene trugen, die für humanes SmC codierten (Buell et al., Nuc. Acids Res., 13(6) :1923 [1985]; Europäische Patent Veröffentlichungs- Nr. 0 123 228). Keine der Veröffentlichungen berichtet über die Isolierung von verschiedenen ionischen Formen von SmC.

Kurzfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Trennung und Isolierung von zwei ionischen Formen von Somatomedin C bereit. Erfindungsgemäß wird eine wäßrige Lösung von gereinigtem oder partiell gereinigtem Somatomedin C auf eine Säule mit einem starken Kationenaustauscher bei einem pH, bei dem das SmC stabil ist, appliziert. Das SmC wird dann von der Säule bei einem konstanten pH-Wert eluiert, indem ein wäßriger Salz Gradient auf die Säule appliziert wird. Die zwei ionischen Formen (pI-Werte 8,3-8,6 und 6,7-7,0) werden dann in verschiedenen Eluenten-Fraktionen gewonnen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die DNA-Sequenz des synthetischen SmC- Geninserts in pGB725 und die davon codierte Aminosäure-Sequenz dar.
Fig. 2 ist eine partielle Restriktions-Karte von pGB725.
Fig. 3 ist ein Chromatogramm, das durch Chromatographie von SmC an SP-Sephadex C-25 erhalten wurde.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Feststellung, daß Somatomedin C als zwei unterschiedliche, ionische Formen isoliert werden kann, wovon die eine einen pI-Wert von etwa 8,3 bis 8,6 und die andere einen pI-Wert von etwa 6,7 bis 7,0 besitzt. Die zwei ionischen Formen können aus SmC isoliert werden, das aus natürlichen Quellen, z. B. aus Plasma, stammt, oder sie können aus SmC isoliert werden, das in mikrobiellen Transformanten synthetisiert wird, die ein exprimierbares, rekombinantes Gen, das für SmC codiert, tragen. Bevor das SmC dem erfindungsgemäßen Isolierungsverfahren unterzogen wird, wird es wenigstens partiell von Ursprungssubstanzen gereinigt, vorzugsweise fast bis zur Homogenität. Die Bedeutung des hier Ausdrucks "SmC" wird als identisch zu IGF-1 betrachtet.
SmC, das als Ausgangs-Material erfindungsgemäß brauchbar ist, kann aus der Cohn-Fraktion IV von humanem Plasma unter Verwendung bekannter Proteinreinigungs-Verfahren gereinigt werden (siehe Z.B. Svoboda et al., Biochemistry, 19 : 790 [1980]; Cornell, H.J. und Boughdady, N. M., Prep. Biochem., 14(2):123 [1984]).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem in Verbindung mit SmC angewendet werden, das in einem mikrobiellen Wirt synthetisiert wird, der mit einem Expressions-Vektor transformiert worden ist, der ein experimierbares Gen, das für SmC codiert, trägt. Die unten beschriebene Arbeit wurde mit humanem SmC (rhSmC) durchgeführt, das in E. coli HB101-Zellen synthetisiert wurde, die mit pGB725 transformiert wurden, einem Plasmid-Vektor, der ein synthetisches Gen (210-b.p.), das für die genaue Sequenz der 70-Aminosäuren des Somatomedin C codiert, und ein ATG-Startcodon am 5'-Ende trägt, das für einen zusätzlichen Methionin-Rest codiert. Das synthetische Gen enthält ein modifiziertes 5'-Ende, bei dem andere Codons als die der nativen DNA-Sequenz zur effizienten Expression in E. coli ausgewählt wurden. Das Plasmid wurde durch das in Buell et al., Nuc. Acids Res., 13(6):1923 [1985] beschriebene Verfahren konstruiert. Das Gen steht unter der Kontrolle des starken linken Promotors (PL) des Bakteriophagen λ und enthält eine Ribosomen-Bindungsstelle, die vom ner-Gen des Bakteriophagen mu hergeleitet ist. Die Wirtszelle enthält außerdem ein Plasmid, pC1857, das für ein temperatur-sensitives Repressorprotein codiert, so daß die Gen-Expression durch Erhöhung der Temperatur des Kulturmediums über etwa 42ºC, wobei der Repressor inaktiviert wird, induziert werden kann.
Die DNA-Sequenz des synthetischen SmC-Geninserts in pGB725 und die codierte Aminosäuresequenz von rhSmC sind in Fig. 1 dargestellt. Eine partielle Restriktions-Karte von pGB725 ist in Fig. 2 dargestellt. E. coli HB 101 [hsd, recA, ara, proA, lacY, galK, rpsL, xyl, mtl, supE], transformiert mit pGB725 lacY, galK, rpsL, xyl, mtl, supE], transformiert mit pGB725 und pC1857, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden.
Das rhSmC kann aus E. coli-Zellen gewonnen und durch ein konventionelles Verfahren der Proteinreinigung gereinigt werden, bevor es dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen wird. In einem bevorzugten Verfahren wird die Fermentations- Brühe, die die Zellen enthält, zentrifugiert und die Zellen werden als naße Zellmasse gewonnen. Die Zellen werden dann in einem zum Zellaufbruch geeigneten Puffer resuspendiert, wie einem Lysozym-Puffer (0,1 M Tris-HCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM EDTA, 5 mM Benzamidine-HCl, 0,2 mg/ml Lysozym, pH 7,5). Die resuspendierten Zellen werden dann mechanisch lysiert, z. B. mit einem Manton-Gaulin-Homogenisator. Die Zellen werden zentrifugiert, und ein Einschluß-Pellet, das das rhSmC enthält, wird gewonnen. Das Einschluß-Pellet wird einmal mit 0,1 M Tris- HCl pH 7,5, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM EDTA gewaschen. Das rhSmC wird dann extrahiert und in 6 M Guanidin-Hydrochlorid gelöst (denaturiert). Die Guanidin-Lösung wird dann mit kaltem Puffer 10-fach verdünnt, wodurch sich das gelöste rhSmC in seine lösliche, native Konfiguration zurückfaltet. Die Lösung wird zentrifugiert, und das präzipitierte Pellet wird verworfen. Das rhSmC wird durch Ammoniumsulfat-Präzipitation zurückgewonnen. Nach Entfernung des Salzes durch Dialyse gegen salzfreien Puffer wird das rhSmC durch Anionenaustauscher- Chromatographie an einer DEAE-Sepharose CL6B-Säule, gefolgt von Gelfiltrations-Chromatographie an einer Sephadex G-50-Säule gereinigt. Das durch die Gelfiltrations-Säule erhaltene gereinigte rhSmC ist zur Auflösung in zwei ionische Formen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet. Es ist jedoch klar, daß das Reinigungs-Schema vorbereitend für das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren ist, und daß an dessen Stelle ein anderes Reinigungs-Schema eingesetzt werden kann.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird eine wäßrige Lösung von gereinigtem SmC auf eine Säule mit einem starken Kationenaustauscher appliziert. Starke Kationenaustauscher- Säulen sind allgemein diejenigen, die an dem festen Träger einen Liganden mit einem pKa-Wert von weniger als oder gleich etwa 2 gebunden haben. Bevorzugte Kationenaustauscher-Säulen zur erfindungsgemäßen Verwendung sind solche, bei denen die funktionelle Gruppe des Liganden eine Sulfonsäuregruppe ist. Eine besonders bevorzugte Kationenaustauscher-Säule ist als SP- Sephadex C-25 bekannt, und ist kommerziell erhältlich von Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey. SP-Sephadex C-25 enthält Sulfopropylgruppen, die an einen Dextran-Träger gebunden sind.
Das SmC wird in einer gepufferten Lösung bei einem pH-Wert, bei dem das Protein stabil ist, d. h., bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 6,5, auf die Kationenaustauscher-Säule geladen. Das SmC, das an die Säule gebunden wird, wird dann bei einem im wesentlichen konstanten pH-Wert von der Säule eluiert, indem man einen wäßrigen Salzgradienten auf die Säule appliziert. Mit "im wesentlichen konstant" ist gemeint, daß man den pH-Wert nicht mehr als 0,2 während der Elution variieren läßt. Der pH- Wert der Elution ist bevorzugt der gleiche pH-Wert wie der der SmC-Lösung, die auf die Säule geladen wird, d. h., er beträgt etwa 4,5 bis 6,5, und am meisten bevorzugt etwa 5,5.
Ein bevorzugtes Salz zur Verwendung in dem Elutionspuffer ist Ammoniumacetat, da Ammoniumacetat zur Entfernung aus dem SmC leicht verdampft werden kann. Zu anderen Salzen, die eingesetzt werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumformiat, Natriumformiat und Kaliumformiat. Der Konzentrations-Gradient kann durch kontinuierliche Graduierung oder durch stufenweise Graduierung der Salzkonzentration des Elutionspuffers erhalten werden. Vorzugsweise wird das SmC von der Säule eluiert, indem man einen Salz-Konzentrationsgradienten, der bei einer Konzentration von etwa 10 mM beginnt und bei etwa 200 mM endet, appliziert. Das Eluat wird so, wie es die Säule verläßt, in Fraktionen gesammelt. Die SmC-Aktivität der verschiedenen Eluentenfraktionen kann durch eine geeignete Methode, wie durch Radioimmunoassay oder Radiorezeptorassay, bestimmt werden.
Die zwei ionischen Formen des SmC eluieren in verschiedenen Eluatfraktionen. Wenn die Säule mit Ammoniumacetat (pH 5,5) eluiert wurde, wurde eine erste ionische Form des SmC in den Eluatfraktionen gewonnen, die Ammoniumacetat-Konzentrationen von etwa 50 mM bis etwa 60 mM besaßen, und eine zweite ionische Form des SmC wurde in den Eluatfraktionen gewonnen, die Ammoniumacetat-Konzentrationen von etwa 90 mM bis etwa 110 mM besaßen. Die zuerst genannte ionische Form besaß einen pI-Wert von 6,7-7,0, und die letztgenannte einen pI-Wert von 8,3-8,6. Jede der ionischen Formen kann aus ihren jeweiligen Elutionspuffer-Fraktionen durch Entfernung des Salzes zurückgewonnen werden, indem man geeignete Mittel wie Dialyse verwendet. Im Fall des Ammoniumacetates kann das Elutionspuffer-Salz leicht durch Verdampfung entfernt werden. Falls gewünscht, kann jede der zwei ionischen Formen durch geeignete Verfahren lyophilisiert werden, um sie im Zeitpunkt der Anwendung zu rekonstituieren.
Das SmC mit einem pI-Wert von 8,3-8,6, das durch das erfindungsgemäße Verfahren frei von der anderen ionischen Form gewonnen wurde, entspricht dem SmC mit der nativen Sequenz (vorausgesagter pI-Wert 8,6). Es ist nicht sicher, ob die Form mit dem niedrigen pI-Wert aus der Substanz mit der nativen Sequenz in vivo oder als Reinigungs-Artefakt produziert wurde. Man nimmt an, daß die Substanz mit dem niedrigeren pI-Wert sich von der mit dem höheren pI-Wert (native Sequenz) durch eine Deamidierung an Aminosäureposition 26 unterscheidet, wodurch der normalerweise vorhandene Asparagin-Rest in einen Asparaginsäure-Rest überführt wird. Die Substanz mit dem niedrigeren pI-Wert unterscheidet sich von der möglicherweise deamidierten Form, die von Enberg und Mitarbeitern, supra, identifiziert wurde, welche eine mögliche Deamidierungsstelle an dem Glutamin-Rest an Position 40 enthielt. Die Amidgruppe des Asparagin-Restes an Position 26 ist wegen der Nachbarschaft der &epsi;-Aminogruppe des Lysin-Restes an Position 27 WR Größenordnungen labiler, und somit anfälliger für eine Deamidierung, als die entsprechenden Gruppen der Glutamin-Reste an Positionen 15 und 40.
Beide ionischen Formen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurden, zeigen biologische Aktivität in vitro in den Placenta-Radiorezeptor- und Fibroblasten- Wachstums-Essays. Jedoch kann die spezielle ionische Form, die als wachstumsförderndes Agenz verabreicht wird, von der einzelnen Anwendung oder der Verabreichungsart abhängen. Man nimmt an, daß die Deamidierung bei Asn (26) in vivo geschieht, und daß dieser Vorgang mit der Freisetzung von SmC von seinem assoziierten Trägerprotein verbunden ist. SmC wird im Plasma in Verbindung mit einem Trägerprotein transportiert und muß am Ort seiner Zielzellen von dem Trägerprotein freigesetzt werden.
Falls das SmC auf eine Verabreichungsart verabreicht werden soll, die einen Transport durch das Blutsystem erfordert, kann es bevorzugt sein, die Substanz mit nativer Sequenz (höherer pI-Wert) im wesentlichen frei von der deamidierten Form zu verabreichen. Wenn das SmC direkt am Ort des Zielgewebes verabreicht werden soll, kann die deamidierte Form mit einem niedrigeren pI-Wert im wesentlichen frei von der Substanz mit nativer Sequenz, die ein Asparagin an Position 26 besitzt, bevorzugt sein.
Die zwei ionischen Formen des SmC können als wachstumsfördernde Agenzien verabreicht werden, z. B. bei der Behandlung-von hypophysischem Zwergwuchs oder um die Wundheilung zu erleichtern. Bei veterinären Anwendungen kann das SmC verabreicht werden, um die Wachstumsrate und die Futterverwertung von Rindern zu erhöhen. Das SmC kann allein oder in Verbindung mit anderen wachstumsfördernden Substanzen wie dem humanen Wachstumshormon, dem epidermalen Wachstumsfaktor und ähnlichem verabreicht werden. Das SmC wird in einer wachstumsfördernden Menge in einer zur Verabreichung geeigneten Form an ein Tier oder ein menschliches Individuum verabreicht.
Die folgenden Beispiele illustrieren weiterhin die Anwendung der Erfindung, und es ist nicht beabsichtigt, den Umgang auf irgendeine Weise einzuschränken.

BEISPIEL 1

E. coli HB 101 (pGB725 und PC1857), ATCC 33694 wurde in einem 10-Liter Fermenter in einem Medium kultiviert, das 4% Glycerin, 2% Casaminosäuren, 0,3% Hefeextrakt und Salze, pH 7,0, und Sauerstoff bei 30%iger Sättigung enthielt. Nach der Beimpfung wurden die Zellen für 24 Stunden bei 28ºC fermentiert, währenddessen die Expression des rhSmC-Gens durch das von dem Plasmid pC1857 codierte Repressorprotein reprimiert wurde. Die Temperatur wurde dann auf 42ºC erhöht, um das Repressorprotein zu inaktivieren, wobei die Expression des auf dem pGB725 gelegenen rhSmC-Gens induziert wurde. Die Induktion wurde von einer 10%igen Zugabe von Wachstumsmedium begleitet. Nach 3- stündiger Kultivierung bei 42ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Die naße Zellmasse (280 g) wurde in Lysozym-Puffer (pH 7,5, 1200 ml) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Passage durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator lysiert und bei 6000 · g zentrifugiert. Das Pellet (30 g) wurde in 0,1 M Tris, pH 7,5 gewaschen und in 300 ml 6 M Guanidin-HCl (pH 7,5) extrahiert. Nach 60 Minuten wurde das denaturierte Protein renaturiert, indem das Guanidin-HCl durch Zugabe von 3500 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 10 mM β-Mercaptoethanol, 50 g/l (NH&sub4;)&sub2;)SO&sub4;-Puffer (oºC) verdünnt wurde. Die Lösung des renaturierten Proteins wurde bei 5000 · g zentrifugiert, und das Präzipitat wurde verworfen. Das rhSmC wurde durch Präzipitation mit 3,0 M Ammoniumsulfat zurückgewonnen. Das gewonnene Protein (0,42 g) wurde 2· gegen 10 Volumina 0,1 Tris-HCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 6 M Harnstoff pH 8,4 dialysiert. Das Protein wurde dann auf eine 25 cm · 1200 cm DEAE-Sepharose CL6B Anionenaustauscher-Säule geladen.
Daraufhin folgte eine Gelfiltrations-Chromatographie an Sephadex G-50 5 · 100 cm. Die Säulen wurden mit 0,85 M Ammoniumacetat, pH 5,5, eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und 2· gegen 2 l Wasser dialysiert und daraufhin lyophilisiert.
Das rhSmC wurde dann auf einer mit Protein vorbehandelten 0,7 cm · 10 cm SP-Sephadex C-25-Säule chromatographiert.
Das rhSmC (1,08 mg) wurde zu 1 mg/ml in 10 mM Ammoniumacetat, pH 5,56, gelöst und auf die Säule geladen. Das rhSmC wurde dann von der Säule eluiert, indem ein linearer Gradient von Ammoniumacetat von 10 mM bis 200 mM bei einer Rate von 0,34 mM/Min. appliziert wurde. Der pH-Wert blieb während des Elutionsverfahrens konstant. 11-minütige Fraktionen /3,96 ml) wurden gesammelt. Die Elution wurde bei der Endpufferkonzentration, 200 mM Ammoniumacetat, pH 5,5 isokratisch über Nacht fortgesetzt. Fig. 3 stellt ein Chromatogramm dar, das vier sichtbare Peaks zeigt. Die folgenden Fraktionen wurden zur Analyse vereinigt und konzentriert. Pool Nr. Fraktionen im Poolo Beschreibung Peak 1 Peak 2 Peak 3 vorgelagerte Schulter Peak 4 Peak 4 verschleppte Schulter Peak 4 Peak 5
Eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der vereinigten Fraktionen zeigte, daß alle Fraktionen mit Ausnahme von Nr. 1 und 7 eine vorherrschende Bande enthielten, die dem rhSmC entsprach. Aliquote Teile von jeder vereinigten Fraktion wurden für 24 Stunden für eine Aminosäureanalyse hydrolisiert. Ein Vergleich der Ergebnisse mit den theoretischen Molverhältnissen der Aminosäuren in SmC zeigte, daß die hauptsächlichen vereinigten Fraktionen Nr. 4, 5 und 6 mit den erwarteten Werten stark übereinstimmten, und daß die vereinigte Fraktion Nr. 3 mit SmC übereinstimmte, obwohl dort eine leichte Variation von ± 1-3-Resten bestand. Die Daten der vereinigten Fraktionen Nr. 1, 2 und 7 zeigten, daß diese Fraktionen in der Hauptsache Peptide enthielten, die nicht rhSmC waren.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 3 bis 7 wurden auf SmC-Aktivität mittels Radiorezeptor-Assay des plazentalen SmC-Rezeptor-Assays (Marshall, R. N. et al., 1974 Characterization of the Insulin and Somatomedin-C-Receptors in Human Placental Cell Membranes, J. Clin. Endoc. and Mitab., 39 : 283-292) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die vereinigten Fraktionen Nr. 3 bis 6 alle mit einer hohen Affinität an den plazentalen Rezeptor banden. Die pI-Werte der SmC-Arten in allen eluierten Fraktionen wurden mittels IEF-Analyse der vereinigten Peak- Fraktionen bestimmt. Pool Nr. 3 bildet SmC mit einem pI-Wert von 6,7-7,0, und Poole Nr. 4-6 SmC mit einem pI-Wert von 8,3- 8,6.

Claims

1. Verfahren, bei dem im wesentlichen frei von der jeweils anderen Form eine oder beide von zwei ionischen Formen des Somatomedin C isoliert werden, das umfaßt (i) Aufbringen einer wäßrigen Lösung von gereinigtem oder teilweise gereinigtem Somatomedin C, das beide ionischen Formen enthält, bei einem pH-Wert von ca. 4,5-6,5 auf eine Kationenaustauscher-Säule, bei der ein Ligand mit einer ionisierenden Gruppe mit einem pka-Wert ≤ 2 an einen festen Träger gebunden ist; (ii) Eluieren des Somatomedin C von der Säule bei einem im wesentlichen konstanten pH- Wert, indem ein wäßriger Salz-Gradient auf die Säule aufgebracht wird; und (iii) Gewinnung einer oder beider ionischer Formen des Somatomedin C, im wesentlichen frei von der jeweils anderen Form.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die ionisierende Gruppe des Liganden eine Sulfonsäuregruppe ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Kationenaustauscher-Säule eine SP-Sephadex C-25-Säule ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die wäßrige Lösung von gereinigtem oder teilweise gereinigtem Somatomedin C auf die Kationenaustauscher-Säule bei einem pH-Wert von etwa 5,5-5,6 aufgebracht wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Somatomedin C von der Säule eluiert wird, indem ein Konzentrations-Gradient von wäßrigem Ammoniumacetat auf die Säule aufgebracht wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei ein kontinuierlicher Konzentrations-Gradient von wäßrigem Ammoniumacetat auf die Säule aufgebracht wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei ein Konzentrationsgradient von wäßrigem Ammoniumacetat stufenweise auf die Säule aufgebracht wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Konzentrationsgradient von wäßrigem Ammoniumacetat von 10 mM bis 200 mM reicht.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei eine erste ionische Form von Somatomedin C in den Eluenten- Fraktionen gewonnen wird, die eine Ammoniumacetat- Konzentration von etwa 50 mM bis 60 mM besitzen und/oder eine zweite ionische Form von Somatomedin C in den Eluenten-Fraktionen gewonnen wird, die eine Ammoniumacetat-Konzentration von etwa 90 mM bis 110 mM besitzen.