JPS63109794A - 二つのイオン形式から成るソマトメジンｃの精製および単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は二つの異なったイオン形式から成るポリペプチ
ドホルモンソマトメジンＣｆｔ精製および単離する方法
ならびに純粋々イオン形式のそれぞｔ″Ｌ、金含有する
配合物に関する。

ソマトメジンは成長ホルモンの作用を仲介するポリペプ
チドホルモンの一つの科に属し、そしてこれらはまたイ
ンシュリン様の生物学的作用を示すものである。血漿か
ら同種性に関し精製すべきこの科における第一のポリペ
プチドはインシュリン様成長因子１および２（ＩＧＦ−
１およびＩＧＦ−２）と祢さｎた。

血漿から単離され念ＩＧＦ−１の完全なアミノ酸配列順
序はリンダークネヒト（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　）
およびハンベル（Ｈｕｍｂｅ　１　）により報告され、
そしてプロインシュリンに相応するものであることが示
された（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３　：２７
６９（１９８０年〕）。

血漿から単離されたソマトメジンＣ（ＳｍＣ）はＩＧＦ
−１に対するアミノ酸配列順序において同一であること
が示された〔クラッパ−他（Ｋｌａｐｐｅｒｅｔ　ａｌ
、）の「内分泌学（ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＹ　）　
Ｊ　１１２：６，２２１５（１９８３年〕〕。

ＳｍＣ／　Ｉ　ＧＦ　−１は位置６−４８．１Ｂ−６１
および４７−５２においてジスルフィド架橋を有する長
さく　ｌｅｎｇｔｈ　）　　におけるポリペプチドフロ
アミノ酸残基である。そのアミノ酸配列順序に基づ＜　
ＳｍＣ／Ｉ　ＧＦ−１の予測ｐＩ　Ｉｒｅ約８．６でお
る。

スボボダ（５ｖｏｂｏｄａ　）およびその共同研死者は
ヒト血漿のコーン（Ｃｏｈｎ　）フラクション■から５
ｒｒＣを精製する手順を報告した〔「生化学（Ｂｉ　。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｊ　１９　：　７９０−７９
７　（１９８０年〕０この平頭ハ、酸−抽出：　０．２
　Ｍ　ＮａＣ１ｓ　０−４Ｍ　ＮａＣ！および最終的な
ｐＨ［５，０，６，０および９．０を有するｐＨ段階勾
配（５ｔｅｐ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　）　　を伴う「ＳＰ
−セフアデツクスＣ−２５Ｊに対するカチオン−交換ク
ロマトグラフフィー；「セファデックスＧ−５０４カラ
ムに対するサイズ排除クロマトグラフィー：フラットペ
ッド−アイソフォーカシング（ｆｌａｔｂｅｄ　ｉｓｏ
ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）　　ならびに逆相液体クロマトグ
ラフィーを包含していｔｏこの方法によｔ）調製さｎた
ＳｍＣはｐＩ８．１−８．５を有するものと報告さｎた
。

コーネル（Ｃｏｒｎｅｌｌ　）およびパウダディ（Ｂｏ
ｕｇｈｄａｄｙ　）は血漿からＩＧＦ−１およびＩＧＦ
−２を精製するための各種手順の結果について報告した
（　Ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＊　１２　（１）　
：　５７　（１９８２年）　ｐ　Ｐｒｅｐ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、ｓ　１４　（２）　：　１２３　（１９８４年
〕）Ｏこれら方法の数種のものは「ＳＰ−化ファデツク
スＣ−２５Ｊに対するカチオン−交換クロマトグラフフ
ィー工程を用いていた。カラムからの溶離［、ｐＨ６，
８の０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液を、引き続いて０
．１２　Ｍ　ＮＨｓ　（ｐＨ９゜６）を含有する０、０
６Ｍ酢酸アンモニウムを用いる段階的勾配によって行わ
れた。活性物質はｐＨ９，６のフラクション中に溶離し
ていると報告された０ 前述のいずれの文書も、ＳｍＣ／　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１の
異なりたイオン形式が得られたということを示した「Ｓ
Ｐ−セフアデツクスＣ−２５」クロマトグラフフィー工
程を用いる精製手順を報告するものではなかつ友。

エンベルブおよび共同研究者は、ｒＣＭ−アフィゲル・
ブｋ　（Ａｆｆｉｇｅｌ　ｂｌｕｅ　）　Ｊ　　に対す
る親和クロマトグラフィー；「セファデックスＧ−５０
」に対するサイズ排除クロマトグラフィー；「ＳＰ−セ
フアデツクスＣ−２５４に対するカチオン−交換クロマ
トグラフフィー；および逆相液体クロマトグラフィーを
包含した手順によるＳｍＡの精製を報告しｆｅ、　（Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｔ　１４３　：　１１
７ｒ１９８４年〕０カチオンー交換クロマトグラフフイ
ー工程において、カラムからの溶＊はｐＨ１モル濃度４
．９１０．１４．５．３１０．１？および７．８７０．
２０を伴う三工程において酢酸ナトリウムの組合わせｐ
Ｈ／塩勾配を用いて行われ念。この方法により得られた
ＳｍＡは位置４０におけるアミド分解グルタミン残基に
ついての例外を伴うこともあるが、ＩＧＦ−１と同一で
あることが報告された。

最近、二つのグループがヒ）　ＳｍＣについて合成遺伝
子コーディング（５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｃ
ｏｄｉｎｇ）を伴う微生物形質転換細胞におけるＳｍＣ
の合成を報告している〔ビュエル他（Ｂｕｅｌｌ　ｅｔ
　ａｌ、　）Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１３（６）：１９２３（１９８５
年〕：年回：許公告番号０　１２３　２２８号〕０いず
れの刊行物もＳｍＣの異なったイオン形式の単離につい
ては報告していない。

本発明は二つのイオン形式を有するソマトメジンＣを分
離および単離する方法を提供するものである。本発明の
教示によ１ば、精製または部分的に精製され九ソマトメ
ジンＣの水溶液を試が安定であるｐＨにおいて強力カチ
オン−交換カラムに適用する。次いで、このＳｍＣはカ
ラムに対し塩水勾配を付することにより一定のｐＨにお
いてカラムから溶離される。次に、この二種類のイオン
形式のもの（ｐＩの８．３−８．６および６．７−７．
０）は異なった溶離剤フラクション中で回収される。

更に本発明によってｐＩ工約、　３−８．６を有するソ
マトメジンＣを含み、本質的にアミノ数位１１２６にお
いてアミド分解残基を伴わない成長促進組成物と、薬学
的に受容可能な担体ビヒクルとを含んで成る組成物が提
供さ詐る〇 本発明の他の実施態様においては、ｐＩ工約、７−７．
０を有し、かつ位置２６においてアミド分解残基を有し
、また位置２６におけるアスパラギン酸残基を有するソ
マトメジンＣを本質的に含まないソマトメジンＣと、薬
学的に受容可能な担体物質とを含んで構成される成長促
進組成物が提供される０ 本発明は、ソマトメジンＣが二つの明瞭なイオン形式、
すなわち−万はｐ１約８．３乃至８．６を有するもの、
そして他方はＥ）Ｉ約６．７乃至７．０を有するものに
おいて単離可能であるという発見に基づいている。この
二つのイオン形式のものは天然供給源、すなわち血漿か
ら得られ九ＳｍＣからも単離可能であり、あるいはそ１
らはＳｍＣに関する発現可能な組換え体遺伝子コーディ
ングを伴う微生物形質転換細胞中で合成されｆｔ−Ｓｍ
Ｃからも単離することができる。本発明の単離工程にか
けるに先立つて、ＳｍＣはその供給源物質から少なくと
も部分的に、好ましくは略同質性となるように精製する
ものとする。本明細書中で用いられるように、用語ｒ　
ＳｍＣＪ　ｕその意味においてＩＧＦ−１と同一である
ものと考えられる。

本発明方法において出発原料として有用な試は、既知の
蛋白質精製手順を用いてヒト血漿のコーン・フラクショ
ン■から精製することができる（九とえば、スボボダ他
の「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ１９ニア９
０［１９８０年〕；コーネル、エッチ、ジエー、および
パウダディ、エヌ、エム、のＰｒｅｐ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、＊　１４　（２）　：　１２３　（１９８３年〕参
照）０ 本発明の方法はま九、ＳｍＣについて発現可能な遺伝子
コーディングを伴う発現ベクターによシ形質転換された
微生物宿主内で合成さｎた減と関連して実施することも
可能である。以下に説明する作業は、ヒトＳｍＣ（ｒｈ
ｓｍｃ　）であって、ｐＧＢ７２５により形質転換され
几Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１細胞、ソマトメジンＣ
の正確な７０−アミノ酸配列に関してコーディングする
合成遺伝子（２１０−ｂ、ｐ、）　　を伴うプラスミド
ベクター、および付加的なメチオニン残基に関してコー
ディングする５争端におけるＡＴＧ出発コドンから合成
されたものと共に実施した。この合成遺伝子は変性５）
端を有しており、ここにおいて天然ＤＮＡのコドン以外
のコドンがＥ、　ｃｏｌｉ、における有効な発現に関し
て選択された。このプラスミドはビュエル他のＮｕｃ、
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＊　１３　（６）　：　１９２
３　［１９８５年］により説明される方法によって構成
された。

この遺伝子はバクテリオファージλの強力な左方向プロ
モーター（ＰＬ）の制御下にあり、かつバクテリオファ
ージｍｕ　Ｏｎｅｒ遺伝子から誘導されたリポソーム結
合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ　）　　を含んでい
る。宿主細胞はまｔプラスミドりＣＩ　８５７であって
、温度感受性リプレッサー蛋白質についてコーディング
するものを有しているので、遺伝子発現は培養基の温度
を約４２℃以上に高めることにより誘導することができ
、それによってリプレッサーを不活性化する０ ｐＧＢ　７２５中の合成ＳｍＣ遺伝子インサートのＤＮ
Ａ配列およびｒｈｓｍｃのエンコードしたアミノ酸配列
は第１図中に示されている。ｐＧＢ　７２５の部分的制
限マツプは第２図中に示されている０ｐＧＢ７２５およ
びｐＣＩ　８５７　Ｋよ〕形質転換されたＥ。

ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１　（ｈｓｄ、ｒｅｃＡ＊ａｒａ
参ｐｒｏＡ＊１ａｃＹｓｇａｌＫｔｒｐｓＬｎｘｙＩｏ
ｍｔｌ、５ｕｐＥ　）は受入４ＡＴＣＣ３３６９４をも
ってメリーランド州、ロックヴイルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃｓｉｎ　
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）
　　に寄託され７’ｔＯこのｒｈｓｍｃはＥ、　ｃｏｌ
ｉ、細胞から回収可能であ久かりそれを本発明方法に適
用する前に、従来の蛋白質精製方法のいずれかによって
精製することができる。

好ましい方法において、それらの細胞を含有する発酵ブ
イヨンは遠心分離され、セして細胞は湿潤細胞ペースト
として回収される。次に、これらの細胞は細胞切断用の
適切な緩衝液、九とえばりゾチーム緩衝液（０，１Ｍ）
リス−ＨＣｌ、５ｒｒＭｌ？−メルカプトエタノール、
１０ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭペンズアミジｙ−ＨＣ１、０
，２ｍｇ／ｍｌ　　リゾチーム、ｐＨ７，５）中に再懸
濁させる。次いで、再懸濁させ九細胞を機械的に、たと
えばマントンーゴーリｙ　（Ｍａｎｔｏｎ　−Ｇａｕｌ
ｉｎ　）ホモジナイザー内で溶解させる。溶解させた細
胞は遠心分離され、そしてｒ　ｈＳｍＣを含む封入ベレ
ットが回収される。この封入ベレットはｐＨ７，５の０
．１　Ｍ　トリス−ＨＣｌ　。

５ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ
中で一度洗浄する。久に、このｒｈｓｍｃは６Ｍのグア
ニジ／ヒドロクロリド内に抽出され、かつ溶解（変性）
される。

次いで、このグアニジン溶液を冷緩衝液中で１０倍に稀
釈すると、溶解ｒｈｓｍｃは可溶性の天然の配置のもの
に再生される。この溶液を遠心分離し、かつ沈殿し几ペ
レットは廃棄する。このｒｈｓｍｃは硫酸アンモニウム
沈殿によシ回収される。非塩含有緩衝液に対する透析に
よる塩除去の後、ｒｈｓｍｃはＤＥＡＥ−ｒセファロー
ス（５ｅｐｈａｒｏｓａ　）　ＣＬ６ＢＪカラムに対す
るアニオン交換クロマトグラフィーおよび引き続く「セ
ファデックスＧ−５０」カラムに対するゲル濾過クロマ
トグラフィーにより精製される。ゲル濾過カラムから得
られた精製ｒｈ＆ｒｙＣは本発明方法による二つのイオ
ン形式に再溶解させるのに適している。しかしながら、
精製の成型は本発明の単離手順に対し予備的なものであ
ること、ま九その代わりに各種の他の精製式型のいずれ
もが使用可能であることを理解すべきである。

本発明の方法によれば、精製ＳｍＣの水溶液は強力なカ
チオン−交換カラムに適用さする。強力カチオン−交換
カラムは一般に固体サポートに結合されているものであ
り、配位子は２よりも小さいか、あるいは略２に等しい
ｐＫａ　［ｔ−有している。

本発明の実施に際して利用するのに好ましいカチオン−
交換カラムは、配位子上の官能基がスルホン酸基である
ものである。特に好ましいカチオン−交換カラムｒｚ、
ｒｓｐ−セフアデツクスＣ−２５」として知られており
、かつニューシャーシー州ピスキャタウエイのファーマ
シアＯインコーボレーテツド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　
Ｉｎｃ、ｅ　）　　より市販されている。「ＳＰ−セフ
アデツクスＣ−２５Ｊはデキストラン−サポートに結合
されたスルホプロピル基を含んでいる。

このＳｍＣは緩衝液中で、蛋白質が安定なｐＬすなわち
Ｅ）Ｈ約４．５乃至６．５においてカチオン−変換カラ
ムに対し充填される。次に、このカラムに対し結合する
ことになるＳｍＣは、カラムに対し塩水勾配（ａｑｕｅ
ｏｕｓ　５ａｌｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　）を適用するこ
とによシ、本質的に一定のｐＨにおいてカラムから溶離
される。「本質的に一定」とは、そのＤＨが溶離中に約
０．２を超えて変動することを許容しないことを意味す
るものとする。溶ＲｐＨは、カラムに充填されるＳｍＣ
溶液のｐＨと同一、すなわち４．５乃至６．５が好まし
く、最も好ましいのは約５．５である０溶離緩衝液中で
使用するのに好ましい塩は酢酸アンモニウムであυ、そ
れは酢酸アンモニウムがＳｍＣからの除去に関して容易
に揮発するからである。しかし、限定されるものではな
いが、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ギ酸アンモニウ
ム、ギ酸ナトリウムおよびギ酸カリウムを含む他の塩類
を用いてもよい。

濃度勾配は溶離緩衝液塩濃度の連続的な漸次的変化ま７
ｔは段階的な漸次的変化によって得ることができる。好
ましいのは濃度的１０ｒｒＭで開始さｊへかつ約２００
ｒｒＭで終結する塩濃度勾配を適用することによりＳｍ
Ｃがカラムから溶離されることである。ｌ！！！離剤は
、それがカラムを去るときフラクション中に収集される
０各種溶離フラクション中のＳｍＣ活性は如何なる便利
な方法、九とえはラジオイムノアッセイｔｅｈラジオレ
セプターアッセイにより決定することができる。

ＳｍＣの二種類のイオン形式は異なった溶離剤フラクシ
ョ／で溶離する。カラムを酢酸アンモニウム（ｐＨ５，
５）で溶離したとき、冠の第一イオン形式のものは約５
０ｍＭ乃至約６０ｍＭの酢酸アンモニウム濃度を有する
溶離剤フラクション中に回収さｎ、一方ＳｍＣの第二イ
オン形式のものは約９０ｍＭ乃至１−１０ｍＭ　の酢酸
アンモニウム濃度を有する溶離剤フラクション中に回収
される。前者のイオン形式はｐＨ６，７−７，０を有し
、ま死後者はｐＨ８，３−８，６を有してい友。各イオ
ン形式のものは従来の手段、九とえば透析を利用する塩
除去によりそれらの各溶離緩衝液フラクションから回収
することができる。酢酸アンモニウムの場合、ＭＩｑ！
緩衝液塩は揮発により容易に回収可能である。所望によ
り、二種のイオン形式のいずれをも使用時の再構成の大
めの従来方法によ）凍結乾燥させることもできる。

ｐＨ８，３−８，６のＳｍＣであって、本発明方法に！
シ他のイオン形式を含まないで回収されるものは天然の
配列ＳｍＣ（予測ｐＩ８．６）に対応する。低級（１ｏ
ｖｅｒ　）−ｐＩ形式は、生体内の天然配列物質から生
成されたものか、あるいは精製の人工物として生成さｆ
Ｌ友ものか確認されていない。低級−ｐ工物質は、通常
存在するアスパラギン残基金アスパラギン酸残基に変換
するアミノ酸位置２６におけるアきド分解により、高級
（ｈｉｇｈｅｒ　）−ｐ工（天然配列）物質とは異なっ
ているものと考えられる。

この低級−ｐＩ物質に、有り得べきアミド分解形式テア
って、二ンベルグおよび共同研死者（上記参照）により
同定され、グルタミンの位置４０における推定上のアミ
ド分解部位を含んでいたものから構成される装 装置２６におけるアスパラギン残基のアミド基はより不
安定な量のオーダーであり、従って位置２７におけるリ
ジン残基のＣ−アミノ基の並列に起因する位置１５およ
び４０におけるグルタミン残基の対応グループよりもア
ミド分解しがちであるＯ 本発明方法により単離された両イオン形式のものは胎盤
ラジオレセプターおよび繊維芽細胞成長アッセイにおい
て生体内の生物学的活性を示す。

しかし、成長促進剤として投与されることになる特定の
イオン形式は特定の適用ま友は投与のモードに依存して
もよい。Ａｓｎ　（２６）においてアミド分解が生体内
で生ずること、およびこの事象はその会合担体蛋白質か
らの誠の解放に関連するものであることが考えられる。

ＳｍＣは担体蛋白質に関連して血漿中に運搬され、かつ
その標的細胞のその部位における担体蛋白質から解放さ
れねばならない。

従って、もしＳｍＣが、血管系を経由する運搬を必要と
する投与のモードによって投与すべきである場合には、
本質的にアミド分解形式を含まない天然配列（高級ｐＩ
）物質を投与することが好ましいかも知れない０まｔ％
５ｒｒＩｃｆ：標的組織の部位に直接投与すべき場合は
、アミド分解形式の低級ｐＩであって、位置２６にアス
パラギンを有する天然配列物質を本質的に含壇ないもの
が好ましいかも知ｎない。

二種類のイオノ形式のＳｍＣは成長促進剤として、九と
えば下垂体前葉体温の処置または創傷の治癒を容易にす
る友めに投与することができる。獣医学の用途において
ｕ、ＳｍＣをウシ類の成長速度および飼料の利用を増加
させるために投与することもできる。このＳｍＣは単独
まｔは他の成長促進物質、たとえばヒト成長ホルモン、
上皮成長因子等と関連させて投与することも可能である
。

ＳｍＣは動物ｔ７？、はヒト被験者への投与のために凡
ゆる適切な形式において、成長促進量をもって投与され
る。

本発明の一実施態様において、ｐ１約８．３−８．６を
有し、アミノ酸位置２６においてアミド分解残基金有す
るソマトメジンＣを本質的に含まないツマトメジンＣの
成長促進量と、薬学的に受容可能な担体ビヒクルとを含
んで構成される成長促進組成物が提供される。この薬学
的担体は、たとえばｐＨ約４．５乃至６．５を有する滅
菌緩衝水溶液である０担体物質はまた、局所施用に関し
ては従来のクリームｔたは軟膏ベースのものであっても
よい。

本発明の他の実施態様において、ｐＩ工約、７−７．０
ｌ−ＶＬ、かつアミノ酸位置２６においてアミド分解残
基を有する天然配列のソマトメジンＣ本質的に含まない
ソマトメジ／Ｃの成長促進量と、薬学的に受容可能な担
体物質とを含んで構成される成長促進組成物が提供され
る。薬学的担体は、たとえばｐＨ約４．５乃至６．５を
有する滅菌緩衝水溶液であればよい。その担体物質はま
な１局所施用に関しては従来のクリームまたは軟膏ペー
スのものであればよい。

以下の実施例は本発明の別の実施を例示するものである
が、どのような形においてもその範囲の限定を意図する
ものではない。

実施例　Ｉ Ｅ、ｃｏｌｉＨＢｌｏｌ　（ｐＧＢ７２５およびｐＣＩ
　８５７）、ＡＴＣＣ３３６９４ｔ−４チグリセロール
、２％カサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　）
、０，３％酵母エキストラクトおよび塩（ｐＨ７，０）
ならびに３０％飽和とする酸素を含む培地における１　
０−　ＩＪットル発酵槽内で培養した０接種に引き続き
、細胞’１ｉ−２４ｒｆ間２８℃−ｅ　’Ｍ　酵すセ、
そ（Ｃ１関Ｋ　ｒｈｓｍｃ遺伝子の時間発現（ｔｉｍｅ
　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）　ｔｓプラスミミドＣＩ　
８５７についてコード化し九リプレッサー蛋白質によっ
て抑制した。久いで、温度を４２℃に上昇させて、リプ
レッサー蛋白質を不活性化し、それによりｐＧＢ　７２
５に対するｒ　ｈＳｍＣ遺伝子の発現全誘導した。誘導
には増殖培地の１０％添加を伴った。４２℃における培
養３時間後に、これらの細胞を遠心分離により採取し九
〇湿潤細胞ペースト（２８０ｇ）をリゾチーム緩衝液（
ｐＨ７，５，１２００ｍ１）中に再懸濁させた。

次いで、細胞上してマントン−ゴーリン・ホモジナイザ
ーを通過することにより溶解し、そして６０００ｘｇで
遠心分離した。ベレツ）（３０ｇ）をｐＨ７，５の０．
１Ｍトリス−ＨＣｌ中で洗浄し、そして６Ｍのグアニジ
７−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　３００ｍ１中に抽出した。

６０分後、変性蛋白質は、グアニジン−ＨＣｌにｐＨ７
，５の０．１　Ｍ　）リスＨＣＩ、１０ｍＭのβ−メル
カプトエタノール、５０ｇ／Ｌ（ＮＨ。

）１８０４緩衝液（０℃）の３５００ｍｌ　　ｔ−添加
スルことによって再生させ念。再生蛋白質の溶液ｔ−５
０００ｘｇで遠心分離し、そして析出物を廃棄し友。

このｒｈＳｍＣは３．０ｍＭの硫酸アンモニウムを用い
る沈殿によって回収さｆ′Ｌ念。回収された蛋白質（０
゜４２ｇ）は１０容量の０．１　Ｍ　トリス−ＨＣｌ、
５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、６Ｍの尿素（８゜
４）に対し２ｘ透析し友。次に、この蛋白質ヲ２５ｍＸ
１００ｃｌＩＬのｒＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６ＢＪ
アニオンー交換カラムに充填した。

こｎに「セファデックスＧ−５０Ｊ　５　ｘ　１００ｃ
ｍに対するゲル漬過クロマトグラフィーが引き続いた。

これらのカラムはｐＨ５，５の０．８５Ｍ酢酸アンモニ
ウムによって溶離され友。ピーク令フラクショ／が収集
され、かつ２リツトルの水に対し２ｘ透析し、次いで凍
結乾燥した。

次に、このｒｈｓｍｃについて蛋白質前処理した０゜７
ｃＩＩＬＸ　１０ｃＩＬｒ　Ｓ　Ｐ−セフアデツクスＣ
−２５」カラム上でクロマトグラフを行った。

このｒｈｓｒｎｃ　（１，０８ｍｇ　）をｐＨ５，５６
の１０ｍＭ酢駿ア酢酸アンモニウム中して１ｍｇ／ｍｌ
とし、そしてカラム上に充填した。次いで、速度０．３
４　ｍＭ／分における酢酸アンモニウム１０ｍＭから２
００ｍＭの線状勾配を適用することによってｒｈｓｍｃ
　ｆ：カラムから溶離させ九。そのｐＨは溶離工程の間
中一定のままであった。１１分のフラクション（３，９
６ｍ１）ｔ−収集しｔｏ溶離は最終緩衝液濃度、酢酸ア
ンモニウム２００　ｍＭ％ｐＨ５，５において一晩中全
てに平等に継続し九。第３図は４個の明白なビークを示
すクロマトグラフである◇下記のフラクションを分析の
几めにプールし、かつ濃縮した０−２−＝シ１Ｚ極−プ
ール　のフラクション　　　　　　種目１　　　　　　
　　　　２　　　　　　　　　　　ビーク１２　　　　
　　　　３−４　　　　　　　　　ビーク２３８−１７
　　　　　　　　　　ビーク３４１８−２１　　　　　
　リーディング・ショルダビーク４ ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ビー
ク４６　　　　　　　２６−３４　　　　　　トレーリ
ング・ショルダビーク４ ７　　　　　　　　　３５　　ＴＯピー、５プールした
７ラクシヨンの５ＤＳ−ポリアクリルアミド６ゲル電気
泳動は／Ｉ６１および７を除き、全ての７ラクシヨンが
ｒｈｓｍｃに対応する主バンドを含むことを示した。各
プール拳フラクションからのアリコートはアミノ酸分析
のために２４時間加水分解した。Ｓに中のアミノ酸の理
論モル比と、これらの結果の比較は主要プール・フラク
ション７ｇ６４．５および６が期待値と非常に一致して
いること、そしてプール・フラクション鷹３は残基子１
−３の僅かな変動［を伴うが、５ｒｒＬＣとに一致する
ことを示し九。プール・フラクションＡ６１．２および
７に関するデータは、こｎらのフラクションがｒ　ｈ　
ＳｍＣではない主要ペプチド含んでいることを示しｔ。

）”−ルーフラクション／１６３乃至７は、胎盤ＳｍＣ
レセプターアッセイに関するラジオレセプター・アッセ
イによりＳｍＣ活性を検定し文〔マーシャル、アール、
エヌ、他（Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｒ，Ｎ、　ｅｔ　ａｔ
、　）１９７４年「ヒト胎盤細胞膜内のインシュリンお
よびソマトメジンＣレセプターの特性（Ｃｂａｒａｃｔ
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃ、　ａｎｄ　Ｍｉｔａｂ
、、　３９　：　２８３−２９２〕。結果はプール・フ
ラクション屑３乃至６が高い緩和性をもって、全て胎盤
レセプターに結合すること全示し友〇 全ての溶離されたフラクション中のＳｍＣＷについての
ｐＩ［は、プールさｔｌ、ｔビーク会７ラクシヨンのＩ
ＥＦ分析により確認された。プール／１６３はＳｍＣｔ
−ｊｇ成し、ｐＩｉ６．７−７．０であり、ま之ブー＃
　、％　４−６　ｕ　ＳｍＣであって、ｐＩは８．３−
８．６である０

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＧＢ　７２５における合成ＳｍＣ遺伝子イン
サートのＤＮＡ配列およびそのエンコードしたアミノ酸
配列金示す図、第２図はｐＧＢ　７２５の部分的制限マ
ツプ図、そして第３図は「ＳＰ−セフアデツクスＣ−２
５」に対するＳｍＣのクロマトグラフィーにより得らｆ
′Ｌ７ｔクロマトグラフ図である。 特許出願人　　インターナショナルーミネラルズΦアン
ド・ケミカル・コーボレイション 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨ約４．５乃至約６．５において、精製もしく
   は部分的に精製したソマトメジンＣの水溶液を、固体サ
   ポートであつて、配位子がｐｋａ≦２を有するイオン化
   基を含むものに結合されているカチオン−交換カラムに
   適用する工程と、塩水勾配を前記カラムに施用すること
   により本質的に一定のｐＨにおいて該カラムからソマト
   メジンＣを溶離する工程と、異なつた溶離剤フラクシヨ
   ンにおいてソマトメジンＣの二種類のイオン形式のもの
   を回収する工程とを備えた、二つのイオン形式のソマト
   メジンＣを分離および単離する方法。
2. （２）配位子のイオン化基がスルホン酸である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）カチオン−交換カラムが「ＳＰ−セフアデツクス
   ｃ−２５」カラムである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
4. （４）精製ソマトメジンＣの水溶液がｐＨ約５．５にお
   いてカチオン−交換カラムに適用される特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
5. （５）カラムに対し、酢酸アンモニウム水溶液の濃度勾
   配を適用することにより前記カラムからソマトメジンＣ
   が溶離される特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）濃度勾配がカラムに対し連続的に適用される特許
   請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）濃度勾配がカラムに対し段階的方法により適用さ
   れる特許請求の範囲第５項記載の方法。
8. （８）酢酸アンモニウムの濃度勾配が１０ｍＭから２０
   ０ｍＭである特許請求の範囲第５項記載の方法。
9. （９）第一のイオン形式のソマトメジンＣが酢酸アンモ
   ニウム濃度約５０ｍＭ乃至約６０ｍＭを有する溶離剤フ
   ラクシヨン中から回収され、また第二のイオン形式のソ
   マトメジンＣが酢酸アンモニウム濃度約９０ｍＭ乃至約
   １１０ｍＭを有する溶離剤フラクシヨン中から回収され
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。
10. （１０）ｐＩ約８．３−８．６を有し、またアミノ酸位
    置２６においてアミド分解残基を有するソマトメジンＣ
    を本質的に伴わないソマトメジンＣと、薬学的に受容可
    能な担体物質とを含んで構成される成長促進組成物。
11. （１１）約８．３−８．６を有し、またアミノ酸位置２
    ６においてアミド分解残基を有するソマトメジンＣを本
    質的に伴わないソマトメジンＣの水溶液を含んで成り、
    前記溶液が酢酸アンモニウム約９０ｍＭ乃至約１１０ｍ
    Ｍを含んでいる組成物。
12. （１２）ｐＩ約６．７−７．０を有し、かつアミノ酸位
    置２６においてアミド分解残基を有し、また位置２６に
    おけるアスパラギン酸残基を有するソマトメジンＣを本
    質的に伴わないソマトメジンＣと、薬学的に受容可能な
    担体とを含んで構成される成長促進組成物。
13. （１３）ｐＩ約６．７−７．０を有し、かつ位置２６に
    おいてアミド分解残基を有し、またアミノ酸位置２６に
    おけるアスパラギン酸残基を有するソマトメジンＣを本
    質的に伴わないソマトメジンＣの水溶液を含んで成り、
    前記溶液が酢酸アンモニウム約５０ｍＭ乃至６０ｍＭを
    含んでいる組成物。