JPH01144981A

JPH01144981A - 蛋白質の製造

Info

Publication number: JPH01144981A
Application number: JP30493787A
Authority: JP
Inventors: Fusakazu Misoka; 房和晦日; Tetsuo Miyake; 哲雄三宅; Takanori Oka; 孝紀岡
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-12-02
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1989-06-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕技術分野本発明は、成長ホルモンもしくは成長ホルモン由来ポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする構造遺伝子を含を
する新規融合発現ベクター及びこれを用いた蛋白質の製
造法に関するものである。

先行技術ここ数年来、遺伝子工学的手法により微生物にペプチド
ないしタンパク質（以下「タンパク質等」という）を生
産させる技術が一般化されつつある。

そして現在、この技術を駆使してタンパク質等を生産す
るにあたりその生産効率を向上させるべく種々の改良が
なされているところである。ここで遺伝子工学的手法に
よるタンパク質等の生産とは、所望タンパク質等に対応
するＤＮＡ遺伝子をベクターに組込み組換えＤＮＡとし
、ついでこれを宿主微生物に組込んで宿主の形質転換を
行なって形質転換体を得、これを適当な条件で培養する
ことによって所望タンパク質を産生させ、ついでこの所
望タンパク質等を回収する工程よりなるのがふつうであ
る。

このような遺伝養的手法をもってペプチドの合成を行な
う場合には、具体的な下記のような方法が知られている
。

■　目的ペプチドの構造遺伝子を翻訳開始信号下流に直
結して発現を行なう直接発現法、■　分泌性蛋白のシグ
ナルペプチドを利用して目的産物を細胞質外へ分泌させ
る分泌法、■　他の蛋白と融合させることにより細胞質
内での安定性を高め、これによって収量の増大を計る融
合法（特開昭５６−８４６０３号、同５６−１４５２２
１号各公報）。

このうち融合法は一連の手法のうち最も早く実用化され
た方法であり（Ｋ、Ｉｔａｋｕｒａら５ｃｉｅｎｃｅす
８１０５６　（１９７７）　）　、特に宿主菌内におい
て不安定な外来性蛋白を生産させる場合に有効な手段と
して今日なお汎用されている。融合の目的に用いられる
蛋白としては、ラクタマーゼ、−一ガラクトシダーゼな
どが一般的であるが、常に高収量で目的蛋白が得られる
わけではなく（特開昭５８−１３４９９８号、特開昭６
０−２８９９４号各公報参照）、シたがって、いかなる
外来性蛋白であっても、容易にかつ安定して所望の蛋白
の得られる製造方法の確立が望まれるところであった。

〔発明の概要〕

要旨本発明は、本発明者らが遺伝子工学的手法により蛋白質
等を高収量で生産するに際し、有用な融合発現ベクター
を開発すべく鋭意研究を行ったところ、成長ホルモンも
しくは成長ホルモン由来ポリペプチドが、これと所望の
蛋白を結合させて得られる融合蛋白を宿主菌内において
著しく安定化させること、しかもこの融合蛋白を処理し
て得られる所望蛋白の回収率および精製率が他の蛋白を
用いる融合法に比べて非常に良好であることを見出し、
この新知見を基になされたものである。

従って、本発明による組換えベクターは、成長ホルモン
もしくは成長ホルモン由来ポリペプチドが切断可能アミ
ノ酸配列からなる連結部を介して外来性蛋白質のＮ末端
またはＣ末端と結合して成る融合蛋白のアノミ酸をコー
ドする構造遺伝子をプロモーターの下流に含有してなる
、ものである。

また、本発明による蛋白質の製造法は、成長ホルモンも
しくは成長ホルモン由来ポリペプチドが切断可能アミノ
酸配列からなる連結部を介して外来性蛋白質のＮ末端と
結合して成る融合蛋白のアミノ酸配列をコードする構造
遺伝子をプロモーターの下流に含有する組換えベクター
を用意し、この組換えベクターを用いて微生物を形質転
換し、この微生物を培養し、得られる菌体から該融合蛋
白を分離し、連結部を切断することにより、上記融合蛋
白から目的の外来性蛋白質を得ること、を特徴とするも
のである。

効果前記したように、本発明のベクターに含まれる成長ホル
モンもしくは成長ホルモン由来ポリペプチドは、これを
所望蛋白と連結させて融合蛋白とさせた場合にその宿主
内での安定性を著しく増大させる作用があり、したがっ
て、他の蛋白を用いる融合法に比べ高収量である。

成長ホルモンを外来性遺伝子として常法に従ってそれを
宿主菌内で発現させると、宿主菌内で非常に安定な不溶
性の蛋白塊を形成しやすく、そのため高収率で成長ホル
モンを得ることができる、ことが報告されている（Ｍ、
　Ｉｋｅｈａｒａ　　ら：Ｐｒｏｃ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、−
り、５９５Ｂ（１９８４））。成長ホルモンのこの性質
が成長ホルモンをそれと他の外来性蛋白との融合蛋白と
して発現させた場合にも認められるということ、ひいて
は当該外来性蛋白が高収率で得られるということ、は本
発明者らのはじめて見出した知見であって、上記の報告
からは予想されなかったことというべきである。

また、融合蛋白を切断する場合に切断部位となるアミノ
酸又はペブタイド、例えばＣＮＢ　ｒで処理する場合の
メチオニン残基の数、を目的外来性遺伝子のそれとの対
比において必要に応じて適宜選択することにより、融合
蛋白切断後の所望蛋白の回収・精製が容易となる。した
がって、本発明は蛋白質等を遺伝子工学的手法により生
産する際にＨ用である（後記実施例参照）。

まなお本発明の一実施態様では、ヒト成長ホルモンの１
４位のメチオニン残基をロイシンに置換したヒト成長ホ
ルモン由来ポリペプチド（ＧＩ（）（１−１２１）に対
応する遺伝子にＡＴＧ　（メチオニン）を介して所望の
外来性遺伝子を連結して発現させているが、生成融合蛋
白をＣＮＢｒ処理して得られたものは所望の蛋白と成長
ホルモン由来の蛋白のみであり、したがって分子量ない
し物性の違いを利用して容易に所望蛋白を回収・精製す
ることができる。例えば、後に示す神経成長因子の場合
は、その等重点（ｐｌ）は１０．０であり、一方成長ホ
ルモンＧＨ（１−１２１）のｐＩは４．６である。した
がって両者の分子量は近似しているものの、その物性の
違いから容易に分離精製することができる。

成長ホルモンは勿論、これに連結させる蛋白も生理活性
ペプタイドであることが多いから、生成融合蛋白そのも
のが新規活性ベプタイドとして有効である可能性も充分
にある。

〔発明の詳細な説明〕

ベクターここでベクターとは、予定した宿主に導入され、宿主内
で複製可能であり、またマーカーとしてたとえば薬剤耐
性遺伝子を持ち、かつ所望の構造遺伝子を発現させるた
めの機能を有する運搬体ＤＮＡのことをいう。

遺伝子発現のための機能は、プロモーター、オペレータ
ー、転写開始領域、リポソーム結合領域（ＲＢＳ）等を
具備することによって実現されることがふつうであり、
これらの個々の調製およびコレラノベクターへの導入な
いしこれらを有するベクターの調製はいまや周知である
。本発明の実施例においては、ｐＢＲ３２２を基準とし
構造遺伝子の発現に融合型ｔｒ、ｐプロモーター（特願
昭６１−１２８５４９号参照）を用いたが、当然ながら
これに限定されるものではない。

成長ホルモン説明の簡略化のため、本発明において「成長ホルモン」
という場合は、特にこれを成長ホルモン由来ポリペプチ
ドを排除する意味で使用したのでない限り、成長ホルモ
ン由来ポリペプチドを包含するものとして考慮するもの
とする。

今日までに多くの種の成長ホルモンの遺伝子ないしアミ
ノ酸配列が解明されているが（Ｌ、Ｂ。

Ａｇｃｌ　Ｉｏｕら、ＤＮＡ、　５．４０３　（１９８
８））　、本発明はそれらのうちの何れか１種に限定さ
れるものではない。これらの成長ホルモンの構造の類似
性から考えて、本発明の上記のような効果が特定の成長
ホルモンについてのみ詔められるとは考えられないから
である。

また、本発明でいう成長ホルモン由来ポリペプチドとは
、成長ホルモンを構成するアミノ酸またはアミノ酸配列
を一部欠失させ、変換させ、あるいは新たにアミノ酸ま
たはアミノ酸配列を挿入し、しかも成長ホルモンとして
の特性を少なくとも部分的に保有しているものを意味す
る。これもまた他の蛋白と結合させて得られる融合蛋白
を著しく安定化させる能力を保持している。

従って、成長ホルモンまたは成長ホルモン由来ポリペプ
チドを切断可能なアミノ酸配列を介して外来性蛋白質の
Ｎ末端またはＣ末端と連結することにより、本来、宿主
菌内で不安定な所望の蛋白質を融合蛋白として高収量で
回収することができる。

なお、成長ホルモンに認められるこのような安定化能力
を持つ蛋白であればそのような蛋白を成長ホルモンの代
りに使用することが可能であろうことは容易に推ｎ１で
きるところである。

組換えベクター本発明による組換えベクターは、少なくともプロモータ
ーを含むベクターと融合蛋白質をコードする構造遺伝子
からなる所謂パッセシジャーとからなるものであって、
本発明の特徴によれば、この融合蛋白質が成長ホルモン
と外来性遺伝子とが切断可能なアミノ酸配列からなる連
結部を介して結合してなるものである。ここで、成長ホ
ルモンは、該連結部を介して、外来性蛋白質のＮ末端に
、すなわち対応遺伝子配列でいえば上流側に、結合して
いてもよいし、Ｃ末端に、すなわち同様に下流側に、結
合していてもよい。なお、この組換えベクターにおいて
融合蛋白質をコードする遺伝子がプロモーターの下流側
に在ることはいうまでもない。

融合蛋白から所望蛋白を切り出す方法としては、ＣＮＢ
　ｒで処理するのが一般的である（　Ｉｔａｋｕｒａら
、５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　、１０５Ｂ、　（１９７７
す。すなわち、融合蛋白の連結部分にメチオニンを挿入
しておき、得られた融合蛋白をＣＮＢｒで処理すれば、
この部分が特異的に切断されて所望の蛋白が回収できき
る。このとき、成長ホルモン蛋白内部のメチオニンも切
断されていくつかのフラグメントに細分される。そこで
、成長ホルモンの前記の安定化効果が過度に損なわれな
いことを条件として、成長ホルモン蛋白内部のメチオニ
ン残基を欠失させ、変換させ、あるいは新たにメチオニ
ン残基を挿入することにより、切断操作ののち得られる
成長ホルモン又はその断片と発現させた所望蛋白との間
の分子量ないし物性などを大きく違えることができ、こ
れにより所望蛋白の精製が容易となる。

本発明の一実施態様では、ヒト成長ホルモンの１４位の
メチオニンをロイシンに変換させているが、例えば成長
ホルモン蛋白と所望の蛋白との分子量が近似している場
合には逆にメチオニン残基を多く持たせることにより、
切断操作後の精製が容易になる。

最近にいたり、所望する蛋白の切り出しに酵素を用いる
方法が提示されているが（地厚ら、第９回日本分子生物
学会３Ａ−３５１９８６年名古屋）、連結部位に当該酵
素の認識するアミノ酸配列をまた成長ホルモン蛋白部に
該アミノ酸配列を創出あるいは欠失させることにより、
この手法に従って本発明の目的は達成される。

成長ホルモン蛋白の遺伝子を上記目的のために一部改変
する方法は周知であって、点突然変異法その他公知の手
段を用いればよい（特開昭６１−１４９０８号公報参照
）。また、成長ホルモン蛋白に対応する遺伝子も、ｃＤ
ＮＡ、合成、半合成など公知の方法に従って取得すれば
よく、さらに読み取り枠をずらすことなく外来性遺伝子
を連結させる方法も当業者においては公知である（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｒｌｎｇ　４．　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＬｏｎｄｏｎ　１９８３）。また融
合蛋白に対応する遺伝子全体を合成してもかまわない。

さらに、所望する蛋白の遺伝子は安定化遺伝子の５′側
、３′側又は中にあってもよい。

組換えベクターの利用本発明の組換えベクターは、目的とする蛋白質等の構造
遺伝子を所定の位置に組込んだのち、所与の遺伝子工学
的手法に従って、目的物質の生産工程に使用することが
できる。本発明の実施例においては、ヒトセクレチン様
ベプタイド、ヒトトランスフォーミンググロースファク
ター（ｈＴＧＦα）　、ヒト２１Ｌｅｕ−上皮成長因子
（Ｌｅｕ”−ｈＥＧＦ）　、ヒト神経成長因子誘導体（
ｈＮＧＦ）の構造遺伝子を本発明に係るベクターを用い
て発現させた。その例の詳細については後記実施例をツ
照されたい。

実施例 ■、一般的実験法遺伝子フラグメントは、すべて、ＤＮＡ合成装置Ｎ５−
１（品性製作所）を用いて操作マニュアルに従って合成
・精製した。また、各種酵素反応を、それぞれの試薬に
添付の納置に従って行った。

宿主の形質転換、プラスミド遺伝子調製、遺伝子塩基配
列の確認などは公知の手法に従った（特開昭６０−２８
９９４号公報）。

■、安定化遺伝子の調製ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子はそのｃＤＮＡより
調製できるが、有効に利用できる制限酵素サイトの設置
なども考慮して、゛地厚らの報告に従って合成した（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、　８１．５９５Ｂ　（１９８４））。第１図
参照。なお、報告では開始コドン　ＡＴＧの上流がＣｌ
ａｌ部位となっているが、ここで合成したものはこれを
ＥｃｏＲ１部位に変更したものである。

プラスミドｐＦＭ（特願昭６１−１２８５４９号。詳細
後記）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に上記合成ｈＧＨ遺
伝子を挿入し、上記と同様にして、ｈＧＨ発現ベクター
ｐ　ＡＭ４１０を得た。ついで同様に大腸菌株ＨＢ　１
０１の形質転換株ＨＢ１０１　（ｐＡＭ４１０）を得た
。

また、第１図に示す合成フラグメントＵ−２およびＬ−
２のかわりに、Ｕ−２’　　：ＡＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧ
ＣＴＧＣＧＴおよびＬ−２’　：ＧＡＴＧＣＧＣＡＣＧ
ＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＴＴＡＴを用い、１４位メチオニ
ンをロイシンに変換したヒト成長ホルモン由来ポリペプ
チド遺伝子を同様に合成し、これをプラスミドｐＦＭに
挿入して、ヒト成長ホルモン誘導体発現ベクターｐＡＭ
４２０とした。

第２図はｐＡＭ４１０およびｐ　ＡＭ４２０を示すもの
であって、右上のｒＭｅｔ、ＬｅｕＪがＭｅｔであるも
のがｐＡＭ４１０であり、これがＬｅｕであるものがｐ
　ＡＭ４２０である。

■、ヒトセクレチン様ベブタイドの生産１）　発現プラ
スミドの構築すでに本発明らは、遺伝子操作の手法によるブタ２７−
ジスアミドセクレチンの製造方法を特開昭５８−１３４
９９８号公報において提案しているが、同様の方法によ
りヒトセクレチン様ペプタイドに対応する遺伝子を設計
・合成した（第３図）。ここで合成した遺伝子は、ヒト
セクレチンの端にグリシン−リジン−アルギニン、グリ
シン−リジン又はグリシン−アルギニンを付加したベプ
タイドに対応しており、融合発現ベクターのｐ　ＡＭ４
２０に挿入するための制限酵素サイトとして５′側にＢ
ａｍＨＩサイト、３′側に５ａｌＩサイトを付加したも
のである。各々の遺伝子を融合発現ベクターｐＡＭ４２
０に組み込み、セクレチン−グリシン−リジン−アルギ
ニンをｐＡＭ４２６と、セクレチン−グリシン−リジン
を発現ベクターｐ　ＡＭ４２５と、セクレチン−グリシ
ン−アルギニンを発現ベクターｐ　ＡＭ４２７と命名し
た。

２）　発現及び精製（１）融合蛋白の発現ｐＡＭ４２６、ｐ　ＡＭ４２５およびｐＡＭ４２７を持
つ大腸菌ＨＢ１０１を、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ　　９リツトル中で、３７℃で培養する
。培養はＫｌｅｔｔ　（濁度計）の値が５０を示すまで
行い、その後集菌する。

集菌した閑をＭ９−１％カザミノ酸を含む培地９リツト
ルに移し、最終濃度８μｇ　／　ｍｌになる樺にｔｒｐ
プロモーターのインデューサーである３β−インドール
アクリル酸（ＩＡＡ）を加えて、３７℃で一夜、培養し
た。

（２）精製発現させた菌体は遠心して回収後、２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ８，０の８０ｍ１に懸濁させる。それをソ
ニケーターで処理して菌体を破壊し、８０００回転、４
℃の遠心を１０分間行い、沈殿した不溶性画分を回収す
る。不溶性画分を５０ｍ１の７Ｍ尿素含有２０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８゜０に溶かし、１８０００ｒ
ｐｍおよび４℃で２０分間遠心して上澄を得る。これを
２０ｍＭ酢酸（５ΩＸ３）に対して透析を行う。

この透析中に白色の沈殿が出てくるので、これを遠心（
９０００ｒｐｍ、４℃、１０分）シ゛で回収する。

そして、２０ｍ１の７０％ギ酸に沈殿物を溶かし、臭化
シアン１．２ｇを加え、振盪しながら一夜室温で反応さ
せる。

反応後、ギ酸を留去したのち、凍結乾燥を行う。

３００ｍ１の６％酢酸で抽出して上澄を取り、すぐに３
００ｍ１の水を加え希釈する。

そして、クロマトグラフ管（フィルター付き）に逆相の
Ｃ−１８の樹脂（約３００ｍ１）をつめ、酢酸抽出物を
吸着させ、３８％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含
む溶媒で溶出後、凍結乾燥する。これをセクレチ画分と
して以降使用する。

セクレチン画分を２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６，
３に溶かし、０Ｍトヨパール６５０Ｓ（東洋ソーダ）イ
オン交換クロマトグラフィーにかけ、ＮａＣ１の０から
０．３Ｍの直線勾配で溶出した。溶出させたメインビー
クを脱塩後、逆相Ｃ−１８（ＲＰ−Ｃ１ｇ）高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）で精製した（第４図
）。ＨＰＬＣは０．１％トリフルオロ酢、酸を含むアセ
トニトリルの直線勾配で行い、メインピークを回収して
アミノ酸分析および生物学的活性測定に用いた。

なお、このＨＰＬＣの条件は、下記の通りである。

３２％ＣＨ３ＣＮ−η】４４２．５％ＣＨ３ＣＮ０１１
％　ＴＦＡ　　　　　　　　０．１％　ＴＦＡＡｂｓｏ
ｒｐｔｉｏｎ；　　　２２０ｎｍＲａｎｇｅ：　　　　
　　　０．３２Ｃｈａｒｔ　　５ｐｅｅｄ：　　３０ｃ＋ｎ／ｈｒ。

アミノ酸分析の結果、ＨＢＩＯＩ（ｐ　ＡＭ４２６）からはヒトセクレチンのＣ端にグリ
シン−リジン−アルギニンの付加したものが、ＨＢＩＯ
Ｉ　（ｐＡＭ４２５）からはグリシン−リジンの付加し
たものが、ＨＢＩＯＩ　（ｐＡＭ４２７）からはグリシ
ン−アルギニンの付加したもの（ペプタイド）が、それ
ぞれ得られたことが確認された。

３）　生物学的活性前日より絶食としておいたＳＤ系ラットをウレタン（０
，７５ｇ／ｋｇ（ｉ、ｐ、）麻酔し、部位に固定した。

開腹後、胆管に胆管カニュレーションを施こして胆汁を
分泌させ、直後の胆管を結紮した。

次に、その結紮した部位より末端側に膵管カニュレーシ
ョンを施こし、かつ十二指腸開口部直前を結紮して膵液
を分泌させた。胆汁は採取する必要はないけれども、手
技上カニユーレを挿入して体外に排出させた。

膵液分泌瓜は、カニュレーションしたチューブ中に分泌
された液量を、チニーブに一定時間（２０分）間隔で印
を付けてその移動距離を測定することによって求めた。

被検薬液の投与は、大腿静脈内に挿入固定したカニュレ
ーションチューブを介して注入した。

ＨＢＩＯＩ　（ｐＡＭ４２６）由来のベブタイドについ
て得られた結果は、第５図に示す通りである。なお、コ
ントロールとして合成ブタセクレチン及びヒトセクレチ
ン（大阪府箕面市稲４−１−１２■ペプチド研究所より
人手）を使用したーＨＢＩＯＩ　（ｐＡＭ４２５）及び
ＨＢＩＯＩ（ｐＡＭ４２７）由来のベプタイドでも、同
様の結果が得られた。

■、ヒトＴＧＦ−αの生産ＴＧＦ−αはレトロウィルス形質転換細胞の培養上清、
腫瘍由来細胞、胎児胎盤等に見出される成長促進因子の
一種である。そして、このものは上皮細胞成長促進因子
（ＥＧＦ）レセプターへの結合をＥＧＦと競合し、単独
でも軟寒天培地中でＮ　ＲＫ細胞のコロニーを形成させ
る能力を持つ（梅１）誠、日本臨床、４４巻１号、１６
３−１６８．１９８６年）。しかしながら、このＴＧＦ
−αも単離精製は非常に困難であり、そのため量産化の
望まれているところである。

１）　ヒトＴＧＦα遺伝子の合成及びプラスミドの調製ｈＴＧＦ−α遺伝子の塩基配列を第６図に示す。

なお、この図ではＴＧＦ−αのＮ端２アミノ酸Ｖａｌ−
Ｖａｌをコードする遺伝子が欠失しており、この領域は
リンカ−（第６ｂ図）に含まれている。合成した遺伝子
をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−３ａ１１部位に挿入して
サブクローニングを行った。挿入された合成遺伝子が設
計どうりの塩基配列を持ったことを上記実験１．と同様
にして確認したのち、ＥｃｏＲＩ、Ｓａ　ｌ　Ｉで水解
しＴＧＦ−α遺伝子を切出し、ついでＨｉｎｆｌで水解
して、長い方のフラグメントを調製した。

ここで得たフラグメントとリンカ−（第６ｂ図）とを混
合し、上記実験■、と同様の手法によりプラスミドｐ　
ＡＭ４２０のＢａｍＨＩ−Ｓａ１１部位に組み込んで、
ｈＧＨ−ＴＧＦａ融合遺伝子の発現ベクターを調製した
（得られたベクターをｐＡＭ４２４と命名した）。

２）培養、精製、確認セクレチンの場合と同様の操作を行ったのち、ＣＮＢ　
ｒ処理後に溶媒を減圧上留去し、残渣を１０％酢酸で抽
出した。抽出物を逆相Ｃ−１８に吸着させたのち、０．
１％トリフルオロ酢酸を含む３５％アセトニトリルで溶
出させた。次に、希酢酸中でセファデックスＧ−５０カ
ラム（ファルマシア社）を通して、粗ＴＧＦ−α画分を
得た。

そして５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，０）
としたのち、還元型グルタチオン１．５ｍＭおよび酸化
型グルタチオン０．２５ｍＭを加えて、４℃で２０放置
した。透析ののち、同様に逆相カラムで精製して、ＴＧ
Ｆ−α画分を得た。ここで得られたＴＧＦ−αは、アミ
ノ酸組成、アミノ酸配列、ＳＳ結合の位置、生物活性な
どがすべて天然のヒトＴＧＦ−αと一致した。

このようにして得られたＴＧＦ−αについて、ヨードラ
ベルのマウスＥＧＦとＫＢ細胞とを用い定量したところ
（詳細は特開昭６するラジオレセプターアッセイ法で一
３７０９９号公報参照）、マウスＥＧＦに換算して３．
４ｍｔｒ／ＤのＴＧＦ−αを確認した。

Ｖ、Ｌｅｕ”　ＥＧＦの生産すでに本発明者らは特開昭６０−２８９９４号公報中で
遺伝子の合成方法を提示している。ここで用いたプラス
ミドｐＬＥ６５２７をＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで水解
してＬｅｕ２１−ＥＧＦ部分を取り出しく第７ａ図）、
これに第７ｂ図に示すリンカ−を用いてｐ　ＡＭ４２０
のＢａｍＨＩ−５ａｉｌサイトに挿入し、得られたベク
ターをｐＡＭ４２Ｂとした。

同様にして培養・精製を行って、最終的にＬｅｕ２１−
ＥＧＦ　　３．８＋ｎｇ／Ｎを得た。またここで得られ
たＬｅｕ２１−ＥＧＦは、特開昭６０−２８９９４号公
報で示すＬｅｕ”’−ＥＧＦとまったく同等であること
が確認された。

■、ヒト神経成長因子β（ｈＮＧＦ−β）誘導体の生産１）　ヒト及びマウス（ｍ）ＮＧＦのアミノ酸配列は非
常に類似しており、１１８アミノ酸残基のうち、違いは
わずかに１２残基である（Ａ、ＵＩ　Ｉ　ｒｉｃｈ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０３
．８２１　（１９８３））　、　　しかも、ｈＮＧＦ−
βの３７位及び９２位に存在するメチオニンはｍＮＧＦ
−βではスレオニンであり、またｍＮＧＦ−β９位のメ
チオニンはｈＮＧＦ−βではアルギニンとなっており、
これ以外にメチオニンは両者とも存在しない。このこと
から本発明者らは、ｈＮＧＦ−βの３７位及び９２位の
メチオニンをスレオニンに変換しても活性は大きく変ら
ないと確信するに至った。

そこで本発明者らは、Ｔｈｒ　　、Ｔｈｒ”９゜ＮＧＦ
−βに対応する遺伝子を同様に設計・合成した（第８図
）。実際には、５′側にＥｃｏＲＩリンカ−を付け、ｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−３ａｌＩサイトでサブクロー
ニングを行い、構造確認ののち、ＢａｍＨＩ−Ｓａｌ！
で水解してｈＮＧＦ−β遺伝子部分を取り出Ｉ２、これ
をｐ　ＡＭ４２０のＢａｍＨＩ−５ａ　１１サイトに挿
入してＴｈ　ｒ３７．Ｔｈ　ｒ３９−　ｈＮＧＦ−β発
現ベクターｐ　ＡＭ４２２を得た。

同様の操作を行って得られたＮＧＦ画分でＰＣ１２細胞
（ラットクロモサイトーマＰＣｉ２゜古川昭栄ら二日本
臨床　４４　（１）、１６−２８（１９８Ｂ）　）を処
理すると、神経突起の伸長してくるのが認められた。

２）１）で述べた方法によれば、成長ホルモン由来のフ
ラグメントは１３３アミノ酸残基、ＮＧＦ−Ｂは１１８
アミノ酸残基であり、両者の分子量は近似している。す
でに述べたように両者のｐ■は大きく異るため、その分
離は容易である。

しかしながら、両者の分子量が大きく異れば、ゲル濾過
、限外か過、透析等によりより容易な精製が可能である
。そこで、合成フラグメントを用いる点突然変異法によ
り４５位ＬｅｕＣＴＴ→ＡＴＣ，７３位ＬｅｕＣＴＴ−
ＡＴＧ、８７位Ｌｅｕｃ’ｒＧ−ＡＴＧ、１０１位Ｌ　
ｅ　ｕ　ＣＴＧ→ＡＴＧの変換をそれぞれ行った成長ホ
ルモン誘導体を本発明用成長ホルモン蛋白として用い、
同様にＮＧＦとの融合遺伝子を作製した。同様の処理の
のち、セファデックスＧ−５０のゲル？濾過でＮＧＦ活
性を持つ両分（２５０Ｐｇ／Ω）を回収した。

■、ベクターｐＦＭの調製１、ベクターの調製（第１０図参照） ■）トリプトファン由来プロモーター／オペレーター領
域の調製ｐＤＲ７２０（ファルマシア社）１０μｇを１００ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）ｐＨ７，５，７
ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２および１００ｍＭＮａＣ１の混合
物（全量２０μｍ）に加え、１１限酵素ＥｃｏＲ１１０
単位および制限酵素５ａ１１１０　ｔ−１を位を用いて
３７℃、２時間反応を行なった。

ついで１％アガロース電気泳動によ’）１００ｂｐのＤ
ＮＡ断片（以下「フラグメント」）を得た（第１０図■
）。

２）転写開始領域／ＲＢＳの調製（リンカ−Ａ；第９図
）次に、転写開始領域およびＲＢＳを含むフラグメントを
以下のようにして化学合成した。まず下記６本（Ｒ−１
〜Ｒ−６）のフラグメントをＮｕｃ−Ｉｃｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８．５４９（１９８０）に従
って合成した。

塩　　基　　配　　列Ｒ−Ｉ　ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＲ−
２ＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＲ−３ＴＴＴＧＡＡ
ＴＴＣＧＲ−４ＧＣＧＴＡＣＴＡＧＴＴＲ−５ＴＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＡＴＴＲ−６ＴＣ
ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＴＣＣＧついでこれら合
成フラグメントのＩｌｌ離精製は以下に示す方法で行な
った。

すなわち、まず、各々のフラグメント合成終了後の樹脂
２００ｍｇに対し、０．５Ｍαピコリンアルドキシムテ
トラメチルグアニジン、およびジオキサン：水（１：　
１）混合物２００μｇを加え、室温−夜装置し、ついで
濃アンモニア水２ｍｌを加え、密栓して一夜５５℃で放
置した。これを濾過して樹脂を分離し、消液を濃縮しゲ
ル濾過を行なった。ついで５０ｍＭＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ
７，５で溶出を行ない、ボイドボリュームに溶出してく
るものを集めた。これを濃縮し、逆相カラムＣ−１８（
ウォーターズ「ラジアルパックＡ」径８■Ｘ１０ｃｍ）
の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にかけ
、０．０１ＭエチレンジアミンジアセテートｐＨ７，８
の緩衝液中、アセトニトリルの１０％から３２％までの
濃度勾配、２ｍ１Ｚ分の流速で１６分かけて溶出を行な
った。ついで１１〜１２分で溶出されるものを集めた（
このとき、トリチル基のないオリゴヌクレオチドはイン
ジェクションビークとして溶出される）。ついで溶出液
を濃縮し、８０％酢酸１　ｍｌを加え、室温で１５分間
放置したのち、トリタノールを抽出除去し、水層を濃縮
し、再び逆相カラムにかけた。

先と同じ条件下にアセトニトリルの０％から２０％まで
の濃度勾配で溶出を行ない、１２〜１３分で溶出される
もの（すなわちフラグメント）を集めた。次にこのフラ
グメント１０ｐｍｏｌ（０，００１Ａ２６ｏ）を２０ｆ
ｆ１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭ
ｇＣ１２，１０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰの混合物
に溶解し、（７３２Ｐ：ｌ　ＡＴＰ　１０μｃｉ　（３
，３ｐｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１
μＲ（４，５１１１位）を加え、全量を２０μｇとし、
３７℃で２０分加温した後、１００℃で２分加熱して反
応を止めた。

以上のようにして精製された各フラグメントＲ−１〜Ｒ
−６は、２０９６ゲル電気泳動及び２次元ホモクロマト
グラフィー塩基配列決定法（Ｎｕｃｌ。

＾ｃＩｄｓ　Ｒｅｓ、＋　１．３３１（１９７４）、Ｎ
ｕｃｌ、Ａｃ４ｄｓ　Ｒｅｓ、、８　。

２００９　（１９７９））によりその配列を確認した。

上記合成したフラグメントのうちＲ−２、Ｒ−３、Ｒ−
４、Ｒ−５の４本のフラグメント各１００ｐＩｎｏｌ　
（０，０１Ａ２１３０　）を２０ｍＭトリス塩基緩衝液
（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇ　Ｃ１つ、１０ｍＭＤ
ＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰの混合液に溶解し全量を５０μ
ｇとしＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（８単位）を加え
て３７℃で１時間反応を行なった後、リン酸化を行ない
、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼ（９００単位）　、Ｒ−＝
　１　（１００ｐｍｏｌ）及びＲ−６（１００ｐｍｏｌ
）を加え１４℃で一夜結合反応を行なった。反応終了後
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）を１／１０容および
３倍容のエタノールを加え一７０℃で１５分間冷却した
のち１２０Ｏｒｐｍで遠心を行ない沈澱を得た。この沈
澱について１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
ない常法により目的のＤＮＡ遺伝子フラグメントを得た
（リンカ−Ａ；第９図参照）。同図中、（１）〜（１３
）は各々下記を意味する。

（１）ニトリブトファン由来プロモーター／オペレータ
ーの一部、（２）；リポプロティン遺伝子、（３）；Ｒ
ＢＳ、（４）；Ｈｐａ　Ｉ認識部位、（５）；ＸｂａＴ
認識部位、（８）；ＥｃｏＲＩ認識部位、（７）；５ａ
ｉｌ認識部位、（８）；Ｒ−１７ラグメント、（９）；
Ｒ−２フラグメント、（１０）、Ｒ−３７ラグメント、
（１１）；Ｒ−４７ラグメント、（１２）；Ｒ−５７ラ
グメント、（１３）；Ｒ−６フラグメント３）ベクター
の調製（第１０図参照）第１０図のフローチャートに従ってベクターｐＦＭの調
製を行なった。

ｐＢＲ３２２（■）１０μｇをＥｃｏＲＩ（１０単位）
、５ａｉｌ（１０単位）で処理したのち大きいフラグメ
ント（３７１０ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動に
より回収・精製した。

これと先に調製したトリプトファン由来プロモーター／
オペレーター領域を含むフラグメント（■）とを混合し
、これに５０１１Ｍトリス塩基緩衝液ｐＨ７，８，１０
ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２，２０ａＭＤＴＴ、および１　ｍ
ＭＡ　Ｔ　Ｐの混合物（全量１０μｇ）及びＴ４ＤＮＡ
リガーゼ３０単位を用いて１４℃、２４時間反応を行な
った。ついでこの反応混合液を用いて大腸菌株ＨＢ　１
０１　（Ｊ、Ｍｏ１ｅｅ、Ｂｉｏｌ、、４１，４５９（
１９（ｉ９）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ＥｎＺｙｍｏ！、、
　８８，２４５（１９７９））の形質転換をクシュナー
の方法［Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１
９７８．１７（１９７８）　）に従って行なった。つい
で目的とする形質転換株をアンピシリン（４ｍ　ｐ）２
０μｇ　／　ｍｌを含有するし一プレート（１％バクト
ドリプトン、０．５％バクトイ−スト抽出物、０、　５
％Ｎａ　Ｃ１，１，５％バクトアガー）上で選択した。

なお、得られた形質転換株のうち任意の株についてプラ
スミドを調製（特開昭６０−３０６８７号公報参照）し
たのち、このプラスミドの制限酵素地図を作製すること
により本発明のベクター（プラスミド）が得られている
ことを確認した（■）。

このプラスミドをＥｃｏＲｌで処理後、エタノール沈澱
し、６７ｍＭｈリス塩酸緩衝液、６．　７ｍＭＭｇＣｌ
、、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、６、　７ＺＺ
ＭＥＤＴＡ’、　１６．６ｍＭ（Ｎ　Ｈ４）　２　Ｓ　
０４．０．０１６７９６ウシ血清アルブミン、０．　２
ｍｇ／ｍｌ熱変性仔牛胸腺ＤＮＡ。

３３０μＭｄＡＴＰ、３３０μＭｄＴＴＰＳＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ１０単位（全量２０μｇ）を加え２５℃で
１時間放置した。ついでＴ４ＤＮＡリガーゼ３０単位、
１１ｍＭＡ　Ｔ　Ｐを加えて１４℃１２時間放置し反応
混液を用いて同様に大腸菌株に１２ｃ６００の形質転換
を行ない目的のＥｃｏＲＩ部位の欠失したプラスミド（
■）を得た。

このプラスミド１０μｇをＨｐａｌ（１０単位）Ｓ’ａ
ｌｌ（１０単位）を用いて同様に処理し、得られた大き
いフラグメントと先に合成したリボプロティン転写開始
領域及びＲＢＳを含むＤＮＡ遺伝子フラグメント〔リン
カ−Ａ（■）〕とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て同様に結合させ、大腸菌株に１２ｃ６００の形質転換
を行ない上記と同様の操作を行なったのち目的のプラス
ミドｐＦＭ（■）を得た。なお、ここで得られたプラス
ミドの構造の確認は制限酵素地図及び塩基配列を調べる
ことにより行なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で使用するヒト成長ホルモンの塩基配
列およびアミノ酸配列を示す説明図である。第２図は、プラスミドｐＡＭ４１０および４２０の説明
図である。第３図は、ヒトセクレチン様ベブタイドに対応する遺伝
子の塩基配列およびアミノ酸配列を示す説明図である。第４図は、実験■、でのセクレチン画分の精製したピー
クＡのＨＰＬＣパターンを示す説明図である。第５図は、実験■、でのＨＢＩＯＩ　（ｐＡＭ４２６）
由来のベブタイドの生物的活性を示す説明図である。◎
：ｈ−セクレチンーＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ　ｒ　ｇ、・：
ｈ：セクレチン、ｏ：ｐ−セクレチン第６図（ａ）は、ｈＴＧＦ−α遺伝子の塩基配列および
アミノ酸配列を示す説明図である。第６図（ｂ）は、リ
ンカ−を示す説明図である。第７図（ａ）は、実験Ｖ、でのＬｅｕ”−ＥＧＦ部分の
塩基配列およびアミノ酸配列を示す説明図である。第７
図（ｂ）は、リンカ−を示す説明図である。第８図は、実験■、でのＴｈｒ　　、Ｔｈｒ３９−ｈＮ
ＧＦ−βに対応する遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配
列を示す説明図である。第９図は、実験■でのリンカ−Ａの塩基配列を示す説明
図である。第１０図は、プラスミドｐＦＭ調製のフローチャートで
ある。出願人代理人　　佐　　藤　　−雄ＥｃｏＲＩ（ｂＭｅｔ　　Ｖａｌ氾６ＶａｌＴＧＣＡＣＴＣ八図（ｂ）Ｍｅｔ　　ＡｓｎＧＡＴＣＣＡＧ　　ＡＴＧＧＴＣＴＡＣＴＴＡ　　ＡＢａｍＨＩ　　　　　　　ＥｃｏＲＩ（ａＡｓｎ　　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　ＧｌｕＡＡＴ　
　ＴＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＧ　　ＣＴＧ　　Ｔ’ＣＧ　　ＣＴＣｃｏＲＩＴｙｒ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ
　Ｍａｌ　　ＣｙｓＬｙｓ　　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ
　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｍａｌ　　ＭａｌＡＡＡ　　
ＴＡＣＧＣＴ　　ＴＧＴ　　ＡＡＣＴＧＴ　　ＧＴＴ　
ＧＴＴ　　１ＴＴＴ　　ＡＴＧ　　ＣＧＡ　　ＡＣＡ　
　ＴＴＧ　　ＡＣＡ　　ＣＡＡ　　ＣＡＡ　　・Ｃｙｓ
　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ　　
ＧｌｙＴＧＴ　　ＣＣＧ　　ＴＴＧ　　ＡＧＴ　　ＣＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＡＣＡ　ＧＧＣＡＡＣＴＣＡ　ＧＴＧ　
ＣＴ、Ｇ　ＣＣＧＬｅｕ　Ｔｙｒ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　
Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＧｌｙ　ＴＹｒ　　Ｉｌｅ　　
Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　ＣｙｓＧＧＣＴＡＣＡＴＣ
ＧＧＴ　　ＣＡＡ　ＣＧＣＴＧＣＣＣＧ　　ＡＴＧ　　
ＴＡＧ　　ＣＣＡ　　ＣＴＴ　　ＧＣＧ　　ＡＣＧＧｉ
ｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　　Ｔ
ｒｐＧＴＣＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＴＴ
Ｔ　　ＡＣＣＴｒｐ　　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＥＮ
ＤＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＣＧＴ　　ＴＡＧＡＣＣＣＴＴ
　　ＧＡＣＧＣＡ　　ＡＴＣＡＧＣＴａｉｌ

Claims

【特許請求の範囲】１、成長ホルモンもしくは成長ホルモン由来ポリペプチ
ドが切断可能アミノ酸配列からなる連結部を介して外来
性蛋白質のＮ末端またはＣ末端と結合して成る融合蛋白
のアノミ酸をコードする構造遺伝子をプロモーターの下
流に含有してなる、組換えベクター。２、成長ホルモンがヒト由来のものである、特許請求の
範囲第１項記載の組換えベクター。３、成長ホルモン由来ポリペプチドが、ヒト成長ホルモ
ンの構成アミノ酸中、Ｎ末端から１４番目のメチオニン
をロイシンに換えたものである、特許請求の範囲第１項
記載の組換えベクター。４、切断可能アノミ酸配列がメチオニンを含有するもの
である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１項記載
の組換えベクター。５、成長ホルモンもしくは成長ホルモン由来ポリペプチ
ドが切断可能アミノ酸配列からなる連結部を介して外来
性蛋白質のＮ末端またはＣ末端と結合して成る融合蛋白
のアミノ酸をコードする構造遺伝子をプロモーターの下
流に含有する組換えベクターを用意し、この組換えベク
ターを用いて微生物を形質転換し、この微生物を培養し
、得られる菌体から該融合蛋白を分離し、連結部を切断
することにより、上記融合蛋白から目的の外来性蛋白質
を得ることを特徴とする、蛋白質の製造法。６、成長ホルモンがヒト由来のものである、特許請求の
範囲第５項記載の製造法。７、成長ホルモン由来ポリペプチドが、ヒト成長ホルモ
ンの構成アミノ酸中、Ｎ末端から１４番目のメチオニン
をロイシンに換えたものである、特許請求の範囲第５項
記載の製造法。８、切断可能アミノ酸配列がメチオニンを含有するもの
である、特許請求の範囲第５〜７項のいずれか１項記載
の製造法。