DE69029615T2 - Protein- und Polypeptidvarianten mit erhöhter Affinität für metallgebundene Affinitätsmatrizen - Google Patents
Protein- und Polypeptidvarianten mit erhöhter Affinität für metallgebundene AffinitätsmatrizenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Protein- und Polypeptid- Varianten, die erhöhte Affinität für Affinitätsmatrizen mit imobilisiertem Metall aufweisen. Insbesondere betrifft die vor-. liegende Erfindung Proteine und Polypeptide mit zumindest einer darin eingebauten Metall-chelatisierenden Aminosäuresequenz.
- Wenn rekombinante Proteine oder Polypeptide in Bakterienzellen exprimiert und anschließend in Fermentationstanks gezüchtet werden, bleibt das Problem der Gewinnung des gewünschten Produkts in reiner Form. Die Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall oder Ligandenaustauschchromatographie ist eine wohlbekannte Technik zur Aminosäure- und Protein-Reinigung. F. Heifferich, Nature 189, S. 1001 (1961); H.F. Walton et al., Recent Developments in Separation Science, Bd. VI, Kapitel 5, 1981. Porath et al., Nature (London) 258, S. 598 (1975); Biochemistry 22, S. 1625 (1975), und Sulkowski, Trends in Biotechnology 3, S. 1 (1985), haben gezeigt, daß diese Technik zur selektiven Fraktionierung nativer Proteine gemäß ihrem Gehalt an exponierten Histidin-Resten gut geeignet ist. Die chelatisierenden Liganden, wie Iminodiessigsäure, wurden kovalent an Oxiranaktivierte Agarose gebunden, und die erhaltene Gele wurden mit Metallionen, wie Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, Ni²&spplus; oder Co²&spplus;, geladen. Derartige Salze wurden seither zur Reinigung einiger nativer Peptide und Proteine verwendet; siehe beispielsweise Nilsson et al., Embo J. 4, S. 1075 (1985).
- Es wurde jedoch gewünscht, ein Verfahren zur Reinigung aller rekombinanten Proteine und Polypeptide zu entwickeln, und nicht nur jener, die inhärent eine oder mehrere exponierte Histidin-Seitenketten oder -Reste enthalten. Zu diesem Zweck wurden hybride Proteine entwickelt, in denen die Codiersequenz eines Proteins von Interesse mit der Codiersequenz eines kleinen, Histidin enthaltenden Peptids fusioniert wurde. Die Codiersequenz des Affinitätspeptids wird mit dem Protein von Interesse zusammen mit der Sequenz einer spezifischen Spaltstelle fusioniert. Derartige Fusionsproteine können dann gereinigt werden, indem die Bindung des Histidin enthaltenden Peptids, oder des Affinitätsschwanzes, an die Affinitätsmatrix ausgenützt wird. Nach der Reinigung des Fusionsproteins wird der Affinitätsschwanz an der bezeichneten Spaltstelle abgespaltet, was ein sehr schwieriges und teures Verfahren ist, und das Protein von Interesse wird in einem abschließenden Schritt gereinigt; siehe beispielsweise Smith et al., Biol. Chem. 263, 7211 (1988). Im allgemeinen ist diese Technik zur Trennung des gewünschten Proteins von anderen Proteinen nicht geeignet, die inhärent eine oder mehrere Metall-bindende Aminosäuren enthalten, insbesondere da viele Proteinverunreinigungen wahrscheinlich mehrfache exponierte Histidine enthalten. Wenn jedoch der Affinitätsschwanz 6 bis 8 oder mehr Histidine enthält, kann dieses Verfahren nützlich sein; siehe Hochuli et al., Biotechnology 6, 1321 (1988).
- Daher wäre es zweckmäßig, ein Verfahren zur Protein- und Polypeptidreinigung zu haben, das bei allen rekombinanten Proteinen und Polypeptiden verwendbar ist, und das bei der Trennung des gewünschten Proteins von anderen Proteinen wirksam ist, die inhärent eine oder mehrere Metall-bindende Aminosäuren enthalten.
- Nun wurde gefunden, daß die Bindung eines Proteins oder Polypeptids an eine Affinitätsmatrix mit immobilisiertem Metall in einem Ausmaß verstärkt werden kann, daß sie signifikant größer ist als jene von nativen Proteinen und Polypeptiden, die inhärent eine oder mehrere Metall-bindende Aminosäuren enthalten, sowie von Fusionsproteinen und -polypeptiden. Eine derartige verstärkte Affinität wird bewirkt, indem in ein derartiges Protein oder Polypeptid eine Metall-chelatisierende Aminosäuresequenz innerhalb der Primärsequenz hievon und an einem spezifischen Segment der Sekundärstruktur eingebaut wird.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Protein- und Polypeptid- Varianten mit verstärkter Affinität, d.h. größerer Bindungsstärke, für Metall-Affinitätsmatrizen. Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Einbau, vorzugsweise unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodologie, einer oder mehrerer spezifischer Metall-chelatisierender Aminosäuren in ein Protein oder Polypeptid, wobei die spezifische Sequenz von den bestimmten Metallbindenden Aminosäuren, die in der Sequenz enthalten sind, und der Sekundärstruktur, die mit dem eine derartige Sequenz enthaltenden Teil des Proteins oder Polypeptids assoziiert ist, abhängig ist.
- Fig.1 veranschaulicht das Elutionsprofil einer rohen Ruckfaltungsmischung von A_&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2; Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF1), der gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde.
- Fig.2 veranschaulicht das Elutionsprofil einer Mischung gefalteter Arten von A_&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2; Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF1), der gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung modifiziert wurde.
- Der hier verwendete Ausdruck "Metall-chelatisierende Aminosäuresequenz" bedeutet eine Aminosäuresequenz, die zumindest zwei derart stereochemisch angeordnete Metall-bindende Aminosäuren enthält, daß eine gleichzeitige Bindung an zwei Stellen mit einem immobilisierten Metall gebildet werden kann. Wenn eine Aminosäuresequenz eine Metall-bindende Aminosäure enthält, bildet eine derartige Aminosäure eine Koordinationsbindung mit dem immobilisierten Metall der Affinitätsmatrix mit immobilisiertem Metall, wodurch ein ternärer "Metall-Komplex" erhalten wird (immobilisierender Ligand + Metall + Peptid). Wenn eine derartige Sequenz jedoch zwei oder mehrere Metall-bindende Aminosäuren enthält, die richtig orientiert sind, führt eine gleichzeitige Koordination mit dem übergangsmetall durch beide Aminosäuren zu einem "Metall-Chelat". Eine derartige Chelatisierung ergibt sich nur, wenn geeignete stereochemische Faktoren und Konformationseinschränkungen zu vorteilhaften Enthalpie- und Entropie-Effekten führen. Die vorliegende Erfindung sieht Protein- und Polypeptid-Varianten vor, die eine Metall-chelatisierende Aminosäuresequenz enthalten, und daher verstärkte Affinität für Harze aufweisen.
- Die Metall-chelatisierende Sequenz kann durch die Formel -A-Bx-Cy-Dz-E dargestellt werden, worin A und E unabhängig Metall-bindende Aminosäuren sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Histidin und Aspartat, mit der Maßgabe, daß zumindest eines von A oder E Histidin bedeutet, B, C und D Aminosäuren darstellen, und x, y und z ganze Zahlen von 0 bis 3 sind, in Abhängigkeit von der Sekundärstruktur des an der Oberfläche exponierten Teils des Protein- oder Polypeptidmoleküls, das die Metall-chelatisierende oder die Sequenz enthaltende Stelle und die bestimmten in der Metall-chelatisierenden Sequenz verwendeten Metall-bindenden Aminosäuren enthält. Die Summe von x, y und z in Kombination mit der Sekundärstruktur der die Sequenz enthaltenden Stelle bestimmt, ob die stereochemischen Anforderungen erfüllt werden, damit A und E gleichzeitig an das immobilisierten Metall binden, und so ein Chelat bilden. Wenn die Metall-bindenden Aminosäuren unabhängig Histidin oder Aspartat sind, und die Metall-chelatisierende Sequenz in ein α-Helix- Segment des Proteins oder Polypeptids einzubauen ist, ist x + y + z gleich 3. Wenn ein derartiges Segment eine β-Haarnadelschleife ist, ist x + y + z gleich 2, und wenn ein derartiges Segment ein β-Strang ist, ist x + y + z gleich 1.
- Wenn dem nativen Protein oder Polypeptid eine zugängliche oder verfügbare Metall-bindende Aminosäure an der geeigneten Position fehlt, muß die gesamte Sequenz in eine derartiges Protein oder Polypeptid an einer derartigen Position eingebaut werden. Wenn das Protein oder Polypeptid jedoch eine zugängliche Metallbindende Aminosäure an der geeigneten Position enthält, z.B. an einer α-Helix, muß nur eine zusätzliche Metall-bindende Aminosäure in ein derartiges Protein oder Polypeptid eingebaut werden, um die geeignete Sequenz herzustellen.
- Die geeignete Position zur Anordnung der Metall-bindenden Aminosäuren wird für Proteine und Polypeptide mit bekannten Strukturen leicht bestimmt. Wenn die Struktur nicht bestimmt ist, kann die Primärsequenz durch wohlbekannte Verfahren bestimmt werden, und die Sekundärstruktur kann vorteilhaft wie nachstehend gezeigt unter Verwendung wohlbekannter Verfahren vorhergesagt werden.
- Die geeignete Positionierung kann beispielsweise wie nachstehend definiert bestimmt werden. Die Berechnungen basieren auf den folgenden Tatsachen für ein gewünschtes Metall-Chelat: 1) daß die Donor-Atome in den Protein-Liganden an das bestimmte Metallion oder den Metall-Komplex angepaßt sind; 2) daß die zwei oder mehreren Metall-bindenden Atome die spezifischen geometrischen Anforderungen des Metalls leicht erfüllen; 3) daß die Chelatisierungsform des Protein-Liganden in der Konformation eingeschränkt ist (relativ unflexibel oder starr).
- Von den natürlichen Aminosäuren haben nur die Seitenketten von Cystein, Histidin, Aspartat und Glutamat signifikante Bindungsstärke in wässerigen Lösungen für divalente Übergangsmetalle der ersten Reihe bei neutralem pH. Daher gilt:
- Cys > His » Asp, Glu > andere Aminosäuren
- Für eine cis-Anordnung von an Cu²&spplus; bindenden Liganden (ähnlich für Ni²&spplus;, VO²&spplus;, und Zn²&spplus;) zeigen Röntgen-Kristallographiedaten für Metall-Komplexe, daß typische Kupfer-Stickstoff-Bindungsparamter Cu-N = 1,98 bis 2,02 Å und N-Cu-N = 80º-100º sind. Röntgen-Kristallographiedaten für Proteine zeigen drei gemeinsam festgestellte sekundäre Strukturmerkmale: α-Helices, β-Stränge und β-Haarnadelschleifen. Diese strukturierten Regionen erfüllen zumindest teilweise die Anforderungen einer Konformationseinschränkung. Typische Konformationswerte für α-Helices (φ = -57º C, ψ = -47ºC, ω = 180º), β-Stränge (φ = -139ºC, ψ = +135ºC, ω = 180º) und β-Haarnadelschleifen (Typ I', Typ II') wurden verwendet. Geometrische Suchen nach energetisch annehmbaren Seitenketten-Konformationen für His- und Asp-Reste wurden durchgeführt, um herauszufinden, welche mit entsprechenden Sekundärstrukturen gekoppelten Aminosäuresequenzen eine zweizähnige Chelatisierungsstelle für Cu²&spplus; mit den obigen Distanz- und Winkeleinschränkungen vorsehen konnten. Nur Chelatisierungswechselwirkungen mit kurzer Reichweite wurden in Betracht gezogen; d.h. die Anzahl zwischen den Bindungsresten angeordneter Reste betrug Null bis 4. Die Ergebnisse der Berechnungen sind in der folgenden Tabelle gezeigt; (+) zeigt an, daß eine Chelatisierung auftreten kann, und (-) zeigt an, daß keine Chelatisierung auftreten kann. Die Beschaffenheit der dazwischenliegenden Reste ("X") ist relativ unwichtig; der Modellversuch zeigte, daß die sterische Größe, die Hydropathie und die Ladung der Seitenketten dieser Reste nur eine geringe oder sekundäre Rolle bei der Bestimmung der Stärke der Metall-chelatisierenden Peptid- Wechselwirkungen spielen.
- Sobald Regionen mit regelmäßiger Sekundärstruktur identifiziert wurden, ist es notwendig zu bestimmen, welche Reste in diesen Regionen an der Oberfläche des Proteins ausreichend exponiert sind, so daß sie leicht an immobilisierte Metalle binden könnten. Die Periodizität der Hydropathie über die Region von Interesse wurde als Hilfe beim Auffinden der exponierten Reste verwendet. Obwohl eine Reihe von Hydropathie-Maßstäben definiert wurde, ist der in der vorliegenden Anmeldung nützlichste der Maßstab auf der Basis des Grades, in dem ein bestimmter Aminosäurerest eingebettet oder exponiert ist, bezogen auf Proteine, deren Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt werden; siehe (Kideva et al., J. Protein Chem. 4, 23 (1985); Tabelle III, Eigenschaft 4).
- α-Helix: Für die gesamte Helix-Region von Interesse wurde das hydropathische Moment (Richtung und Größe) unter Verwendung eines Abstands von 18 Resten pro 5 Schleifen (100º/Rest) berechnet. Wenn das hydropathische Moment ausreichend groß war (> 0,3 ), wurden die Reste dann in drei Kategorien mit gleichmäßiger Population eingeteilt: exponiert, eingebettet und grenzwertig.
- β-Strang: Für die gesamte β-Strang-Region von Interesse wurde das hydropathische Moment unter Verwendung eines Abstands von 2 Resten pro Schleife (180ºRest) berechnet. Dies ist eine einfache Berechnung für β-Strukturen, da jeder Rest entweder "oben" oder "unten" ist. In diesem Fall wurden die Reste in zwei Kategorien mit gleichmäßiger Population eingeteilt: exponiert und eingebettet.
- Da diese Schleifen mit zwei Resten supersekundäre Strukturen sind, sind weitere Berechnungen kaum notwendig, sobald die Reste in der Schleife identifiziert wurden. Die für eine Metall-Chelatisierung geeigneten Reste sind die beiden Reste an jeder Seite der Haarnadelschleife. Diese Schleifen treten am häufigsten an exponierten Oberflächen von Proteinen auf, wobei die Schleifen-Reste und benachbarten Reste exponiert sind.
- Nach der Bestimmung der geeigneten Position zur Anordnung der Metall-bindenden Aminosäuren können die Protein- und Polypeptid-Varianten gemäß Fachleuten wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Derartige Varianten können in Abhängigkeit von der gewünschten Affinität für ein bestimmtes Harz mit immobilisiertem Metall eine einzelne Metall-chelatisierende Stelle sowie eine Vielzahl derartiger Stellen enthalten.
- Die Protein- und Polypeptid-Varianten dieser Erfindung können durch chemische Synthese hergestellt werden. Da diese Proteine und Polypeptide mit Sekundärstrukturen jedoch im allgemeinen große Moleküle sind, wird es bevorzugt, sie durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen. Dies kann unter Verwendung herkömmlicher Mittel zur Konstruktion eines Gens durchgeführt werden, das für die gewünschte Protein- und Polypeptid-Variante mit der gewünschten Metall-chelatisierenden Sequenz in der geeigneten Position codiert. Ein zweckmäßiges Verfahren zur Konstruktion der Protein- und Polypeptid-Varianten ist gemäß herkömmlicher Oligonucleotid-gerichteter ortsspezifischer Mutagenese des Ausgangs-Gens. Das mutierte Gen wird dann in einen geeigneten Vektor kloniert, welcher Vektor anschließend zur Transformation eines geeigneten Expressionswirts, wie Bakterien (z.B. E. coli oder Pseudomonas), Hefe (z.B. S. cerevisiae) oder Säugerzellen (z.B. C127 oder CHO), verwendet wird. Die Proteinoder Polypeptid-Variante wird dann auf herkömmliche Weise exprimiert und wie nachstehend beschrieben gewonnen.
- Die so erzeugten Protein- und Polypeptid-Varianten weisen typischerweise nur ein bis zwei Modifikationen in der Primärsequenz auf. Derartige kleine Modifikationen führen erwartungsgemäß und typischerweise zu einer Protein- oder Polypeptid- Variante, welche die biologischen Eigenschaften des nativen Proteins oder Polypeptids beibehält. Ferner beeinflussen derartige Modifikationen erwartungsgemäß und typischerweise nicht die Antigen-Charakteristika hievon.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die vorliegende Erfindung, wie sie bei einem Protein, nämlich Somatotropin, verwendet wird, das zwei verfügbare Metall-bindende Aminosäuren aufweist, wobei zumindest eine zusätzliche Metall-bindende Aminosäure darin eingebaut wird, um eine Metall-chelatisierende Sequenz zu erzeugen. Dieses Beispiel zeigt auch die Verwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Protein mit bekannter Struktur.
- Somatotropine sind natürlich vorkommende Proteine, die bei Tieren zu finden sind, und werden aufgrund ihrer Wirkung auf das Tierwachstum allgemein als "Wachstumshormone" bezeichnet. Native Rinder- und Schweine-Somatotropine schließen Histidin-Reste an den Positionen 19, 21 und 169 ein. His&sub1;&sub0; und His&sub1;&sub6;&sub9; sind beide auf α-Helix-Segmenten und exponiert. His&sub2;&sub1; ist eingebettet. Metall-bindende Aminosäuren wurden gemäß dem folgenden Verfahren in Rinder- und Schweine-Somatotropine eingebaut, um Somatotropin-Varianten mit einer Metall-chelatisierenden Stelle herzustellen. Die verstärkte Affinität für Affinitätsmatrizen mit immobilisiertem Metall ist für die gemäß dieser Erfindung erzeugten Varianten in Tabelle 1 gezeigt.
- Die Reste an den in Tabelle 1 angegebenen Positionen des BGH- und PGH-Strukturgens, die in Seeburg et al., DNA 2, S. 37 (1983), beschrieben sind, werden durch Oligonucleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese geändert. Oligonucleotid-Mutagenese- Primer werden auf einem Applied Biosystems DNA-Synthesizer gemäß den vom Hersteller, Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), angegebenen Verfahren synthetisiert. Die Sequenzen der Mutagenese-Primer sind:
- BST TTTGAAGGTGTCA AGCCAGCTGAT
- BST TGCCCAGC GGGGGGTG
- BST AAGATGCTGAGCA GAAGAACAGCG
- BST GTCGTCACT GCATGTTTGTG
- ABST TGCCCAGC GGGGGGTG
- ABST GTCGTCACT GCATGTTTGTG
- BST CTGAGCACGA GAACAGCGT
- BST GTTGGTGAAGAC GCTGAGGAACTG
- ABST CTGAGCACGA GAACAGCGT
- ABST CTGAGCACGA GAACAGCGT
- PST GCTAACGCTGTTC TCGGGCCCAGCAC
- ABST ATGAACAGCGTTA GAATAGACCAGA
- ABST ACCGTAGTT T GAGCAGCGCGTGGTCACTGCG
- ABST GGTGCGCTCAAA T TTTGAAGGTGTGAGCAGCCAGCTG
- ABST ATGCAGGTCCTT GGGAGCAGGAGA
- ABST GACCCTCAGGTA CTCCGTCTTATG
- PST AAGAAGGACCTG CAAGGCTGAGACA
- Die unterstreichungen bezeichnen das Codon, das den nativen Rest zum gewünschten Rest verändert.
- Das als DNA-Matrize verwendete BGH-Gen bestand aus dem in Seeburg et al. beschriebenen BGH-Gen, das in den M13mp18-Vektor (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) als EcoRI/HindIII-Fragment kloniert wurde. Auch als Matrize wird das N-Alanyl, Valin (126) BGH-Gen verwendet, das in der EP-193 515-A, veröffentlicht am 3. September 1986, beschrieben ist, und das in den M13mp18-Vektor als EcoRI/HindIII-Fragment kloniert wurde. Das als DNA-Matrize verwendete PHG-Gen war das N-Alanyl PGH-Gen, das in der EP-193 515-A beschrieben ist, und das in den M13mp18-Vektor (BRL) als EcoRI/HindIII-Fragment kloniert wurde. Vor der Mutagenese des PGH-Gens an der gewünschten Position wurde das 5'-Ende des Gens zur Erzeugung einer NcoI- Stelle mutagenisiert, um eine spätere Subklonierung in das Expressionsplasmid zu erleichtern. Der für diese Mutagenese verwendete Primer wurde wie die obigen synthetisiert und hat die Struktur:
- 5'-CAGTGAATTCTCCATGGCCTTCCCAGC-3'
- Das Mutagenese-Verfahren für die Addition der NcoI-Stelle wird von Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. 82, S. 422 [1985)) beschrieben. Alle Restriktionsenzyme und Modifikationsenzyme (T4-DNA- Ligase und Polynucleotidkinase) wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) erworben und gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.
- Die Mutagenese wird unter Verwendung des Amersham (Arlington, Heights, IL) Oligonucleotid-gerichteten in vitro-Mutagenese-Systems gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Nach der Mutagenese werden positive Gen-Mutanten durch DNA-Sequenzanalyse unter Verwendung des SequenaseTM DNA-Sequenzierungssystems von United States Biochemical Corporation (Cleveland, Ohio) gemäß den Empfehlungen des Herstellers identifiziert. Die Gen-Mutanten werden dann als EcoRI/HindIII-Fragmente in den E. coli-Expressionsvektor pMON2534 kloniert. Das Plasmid pMON2534 ist ein Derivat von pBGHex-1 (Seeburg et al.) mit einem Tandem-lacUV5-Promotor, der an der HindIII-Stelle von pBGHex-1 als Transkriptionsterminator insertiert ist. Die Sequenz des Tandem-lacUV5-Promotors als EcoRI-Fragment ist in Bogosian et al. (Nucleic Acid Research 15, 7185 [1987]) beschrieben. Das EcoRI-Fragment wird in ein HindIII-Fragment umgewandelt, indem die EcoRI-Überhänge aufgefüllt und HindIII-Linker angefügt werden. Diese Manipulationen ergeben die Sequenzen, die an den Enden des HindIII-Fragments zu finden sind. Am stromaufwärtigen Ende ergibt der HindIII-Linker (AAGCTT), der an das aufgefüllte EcoRI-Ende (AATTCT...) ligiert ist, die Sequenz AAGCTTAATTCT...; CT an den Positionen 11 und 12 repräsentiert die rechte Hälfte der AluI-Stelle vom ursprünglichen lacUV5-Promotorfragment. Am stromabwärtigen Ende ist die erzeugte Sequenz ..AGAATTAAGCTT; AG an den Positionen -12 und -11 repräsentiert die linke Hälfte der AluI-Stelle vom ursprünglichen lacUV5-Promotorfragment. Zusätzlich sind beim pM0N2534 die EcoRI-Stelle am 5'-Terminus des ptrp-Fragments von pBGHex-1 und die HindIII-Stelle am 3'-Terminus des Tandem-lacUV5-Promotor/Operator-Fragments durch den Verdau des überhängenden EcoRI- und HindIII-Endes unter Verwendung von S1-Nuclease und stumpfendiger Ligation mit T4-DNA- Ligase deletiert. Das Plasmid pM0N5585 ist ein pBR237-Plasmid, das den E. coli-recA-Promotor, eine G10L-Sequenz und eine T7- Transkriptionsterminationssequenz enthält, wie in der EP-241 446-A, veröffentlicht am 14. Oktober 1987, beschrieben. Die in die Expressionsplasmide klonierten BGH- und PHG-Gen-Mutanten werden in den E. coli-Stamm W3110 (ATCC Nr. 39936) insertiert.
- Nach dem Auftauen der geeigneten Menge gefrorener Zellpaste bei 5ºC wurden 120 g der Zellpaste vorsichtig in 480 ml kaltem Wasser suspendiert, wobei ein Ultra Turrax-Rührer verwendet wurde. Die gekühlte Zellsuspension wurde 4 x durch einen vorgekühlten Manton Gaulin-Homogenisator geführt, der auf einen Druck von 420 bis 560 kg/cm² eingestellt war. Die erhaltene Suspension lysierter Zellen wurde 35 min lang einer Ultrazentifugation bei 50 000 x g (25 000 UpM in einem 45TI-Rotor) ausgesetzt, wobei eine Beckman Modell L8-Zentrifuge verwendet wurde. Die klare Überstandsflüssigkeit wurde abgegossen und das verbleibende bräunliche Pellet mit einem kleinen Wasserstrom heftig gewaschen, um die obere Schleimschicht unerwünschter Zelltrümmer zu entfernen. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und ein zweites Mal einer Ultrazentifugation und Waschen unterzogen. Das verbleibende Material wurde mechanisch aus den Zentrifugenröhrchen gekratzt und kombiniert, wobei 4,7 g feuchte Einschlußkörper erhalten wurden, die zur Weiterverwendung bei -80ºC gelagert wurden.
- Eine 4,0 g Masse von Einschlußkörpern wurde in 300 ml kaltem Wasser suspendiert, wobei ein Ultra Turrax-Rührer verwendet wurde. Das Volumen der Suspension wurde durch den Zusatz von weiterem Wasser auf 375 ml erhöht. Dann wurden 425 ml kalte, frisch hergestellte entionisierte Harnstoff-Lösung (7,5 M) der Suspension zugesetzt, wobei eine Mischung von etwa 4 M Harnstoff erhalten wurde. Unter sorgfältigem Rühren wurde der pH durch den tropfenweisen Zusatz von 2,5 M NaOH-Lösung auf 11,3 eingestellt. Während des NaOH-Zusatzes lösten sich die meisten der suspendierten Einschlußkörper, wobei eine hellgelbe Lösung erhalten wurde. Diese Lösung wurde in einem offenen Behälter 48 bis 72 h lang bei 5ºC heftig gerührt, um die Rückfaltung des gewünschten Proteins zu bewirken. Einige Male wurden 9,7 mg (0,1 mM) Cystein der Mischung zugesetzt, was die Rückfaltungszeit um etwa die Hälfte verkürzte. Zur Entfernung verbleibender unlöslicher Stoffe wurde die rückgefaltete Mischung einer Ultrazentrifugation bei 50 000 x g (25 000 UpM in einem Beckman 45TI-Rotor) unterworfen. Die klare gelbe Überstandsflüssigkeit wurde abdekantiert und dann zur Reinigung vorbereitet oder bei -20ºC gelagert. Eine 2 ml Probe der rohen Rückfaltungsmischung wurde auf einer kleinen, mit Kupfer beladenen Metall-Affinitätssäule getestet, um zu bestimmen, ob die Bindung stark genug war, um nützlich zu sein. Wenn ja, wurde eine präparative Metall-Affinitätssäule zur Reinigung verwendet, ansonsten wurde eine Ionenaustauschchromatographie eingesetzt.
- Trisacryl GF2000M wurde wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um alle Puffer und Konservierungsmittel zu entfernen, und dann sauggetrocknet. Etwa 100 g ( 100 ml) dieser etwas feuchten Matrix wurden in einer Lösung suspendiert, die 80 ml Diglyme und 100 ml frisch hergestellte 1,4 M NaOH-Lösung enthielt. Schließlich wurden 100 ml Diethylenglykoldiglycidylether zugesetzt, und die Mischung wurde 16 h lang bei 35ºC sanft gerührt. Gereinigter Diethylenglykoldiglycidylether wurde gemäß dem Literaturverfahren von Gu, Ideda und Okahara (Synthesis 649, [1985]) hergestellt. Die aktivierte Matrix wurde mit 50/50 Diglyme/H&sub2;O gewaschen, und dann wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Epoxid- und Basen-Überschuß zu entfernen. Es wurde gezeigt, daß die gewaschene, sauggetrockente Matrix 70 µmol aktive Epoxid-Gruppen pro ml Harz aufwies. Das aktivierte Harz wurde bei 4ºC gelagert und im allgemeinen innerhalb von 24 h nach der Herstellung verwendet.
- Das aktivierte Transacryl wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und sauggetrocknet. Etwa 100 g ( 100 ml) dieses aktivierten Gels wurden in 100 ml 1,0 M Na&sub2;NH(CH&sub2;CO)&sub2;-Lösung suspendiert, die auf pH = 10,5 bis 11,0 eingestellt wurde. Diese Mischung wurde 24 h lang bei 65ºC sanft gerührt und dann wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Liganden-Überschuß zu entfernen. Das funktionalisierte Harz wurde in 25/75 (V/V) Ethanol/Wasser bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert. Titration mit Thiosulfat zeigte das Fehlen von Epoxid-Gruppen, daher wurde ein Pfropfen mit Ethanolamin für unnötig gehalten. 10 ml sauggetrocknetes Gel wurden mit 50 mM Cu(ClO&sub4;)&sub2;-Überschuß gesättigt und dann vorsichtig mit 100 ml destilliertem Wasser, 100 ml 50 mM Imidazol (pH = 7,0) und schließlich 100 ml H&sub2;O gewaschen. Dann wurde das gebundene Kupfer mit einem 50 mM Na&sub2;H&sub2;EDTA-Überschuß (pH = 7,0) entfernt. Unter Verwendung standardisierter Kupfer-EDTA-Lösungen zum Vergleich wurde der gesamte Kupfergehalt photometrisch mit 0,43 mmol bestimmt.
- Eine Glassäule (2,2 x 21 cm, 80 ml) wurde mit sorgfältig gewaschenem IDA-Trisacryl-Gel gepackt und dann mit 400 ml 50 mM Cu(ClO&sub4;)&sub2; (pH = 4,5) beladen. Das funktionalisierte Gel absorbierte die Kupferionen nahezu quantitativ. Diese Kupfersäule wurde mit 100 mM NaCl gewaschen, und dann wurde sie mit dem Freisetzungspuffer (100 mM Nα-Acetylhistidin, 500 mM NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0) äquilibriert, und schließlich mit dem Ladepuffer (1 mM Nα-Acetylhistidin, 500 mM NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0) äquilibriert. Die filtrierte rohe Rückfaltungsmischung ( 800 ml) wurde bei 5 ml/min auf die Säule gepumpt und dann die Säule mit 240 ml Ladepuffer gewaschen. Die Säule wurde 500 min lang bei einer Durchflußrate von 2,5 ml/min bei Umgebungstemperatur (23ºC) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Nα-Acetylhistidin (1 T 100 mM) entwickelt. Das Eluat von der Säule wurde kontinuierlich bei 280 nm (0,2 bis 2,0 AUFS) unter Verwendung eines Kratos Modell 757-Spektrometers, ausgestattet mit einer Zelle mit einer Weglänge von 3 mm, überwacht. 25 ml Fraktionen wurden unter Verwendung eines Gilson Modell 202-Fraktionskollektors gesammelt. Nachdem der Lauf vollendet war, wurde die Säule mit 50 mM Na&sub2;H&sub2;EDTA (pH = 7,0) und dann 50 mM NaOH abgezogen. Nach Waschen mit 100 mM (240 ml) NaCl, 240 ml Ladepuffer und schließlich 100 mM (240 ml) NaCl war die Säule zur Regeneration bereit. Die das Somatotropin enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und kombiniert, wobei 250 ml Lösung erhalten wurden, die 1,7 mg/ml Protein enthielt. Typische Analysen von His&sub1;&sub5;avbST in diesem Stadium durch analytische Umkehrphasen-HPLC (Vydac C18-Säule, H&sub2;O/CH&sub3;CN + 0,1 % CF&sub3;CO&sub2;H) zeigten das folgende Ergebnis (Spalte A).
- Das Verwerfen der rückwärtigen 15 bis 20 % des Somatotropin-Peaks reduzierte den Oligomer-Gehalt auf 1,0 bis 1,5 %. Durch Konzentrieren des gereinigten Somatotropins und erneutes Laden desselben auf die gleiche Säule (gereinigt und regeneriert) wurde ein etwas reineres Produkt (obige Spalte B) mit einer Gewinnung von 94 % erhalten.
- Variationen dieses Elutionsprotokolls wurden verwendet. In unseren frühen Versuchen wurde Pharmacia Chelating Sepharose 6B eingesetzt; dieses Gel war schwer zu reinigen, und die Durchflußraten waren begrenzt. Für größere Säulen (0,5 bis 2,0 1) verwendeten wir auch Pharmacia Chelating Sepharose Fast Flow. Obwohl die chromatographische Trennung etwas reduziert war, hielten wir es manchmal für zweckmäßig, Imidazol (0,5 T45 mM) als Freisetzungspuffer zu verwenden, oder 1,0 M NaCl anstelle von 0,5 M NaCl einzusetzen. Die stärker bindenden Varianten, His&sub2;&sub6;His&sub3;&sub0;-avbST und His&sub1;&sub1;His&sub1;&sub5;-avbST, waren unter Verwendung von 100 mM Imidazol als Freisetzungsmittel leichter zu reinigen.
- Die gereinigte Somatotropin-Lösung (250 bis 500 ml) wurde auf ein Volumen von 30 bis 40 ml konzentriert, wobei eine 400 ml gerührte Amicon-Ultrafiltrationszelle, ausgestattet mit einer YM10-Membran, verwendet wurde. Wenn die Metall-Affinitätssäule eingesetzt wurde, wurden vor dem Konzentrieren 40 mg festes Na&sub2;H&sub2;EDTA.2H&sub2;O im Protein-Pool gelöst. Unter Verwendung von 5 mM NA&sub2;CO&sub3; (pH = 10,0) wurde die Protein-Lösung auf ein Volumen von 400 ml verdünnt und dann erneut unter N&sub2;-Druck auf 30 bis 40 ml konzentriert. Drei weitere Zyklen von Verdünnung und erneuter Konzentration wurden durchgeführt, wobei etwa 30 ml gereinigtes Somtotropin in Carbonatpuffer erhalten wurden. Die Flüssigkeit wurde zusammen mit ausreichend Wasser, um das Volumen auf 100 ml zu erhöhen, in einen Lyophilisationskolben gegeben. Die Lösung wurde eingefroren und über Nacht auf einen Virtis-Lyophilisator (Freezemobile 12) gegeben. Der erhaltene weiße flockige Feststoff wurde abgewogen und in einem versiegelten Behälter bei -20ºC gelagert. TABELLE 1 BINDUNG VON PROTEINEN AN IMMOBILISIERTES KUPFER TABELLE 1 (FORTS.) BINDUNG VON PROTEINEN AN IMMOBILISIERTES KUPFER
- a Das Numerierungssystem ist jenes von Seeburg et al., DNA 2, S, 37 (1937); avbST ist Rinder-Ala&submin;&sub1;Val&sub1;&sub2;&sub6;-Somatotropin, mlbST ist Rinder-Met-&sub1;Leu&sub1;&sub2;&sub6;-Somatotropin, und pST ist Schweine-Ala&submin;&sub1;-Somatotropin. Wenn nichts anderes angegeben ist, ist die Aminosäure in der Position -1 der erste Rest im Protein.
- b Nicht-bindendes Referenz-Protein. His&sub1;&sub5; ist blockiert durch -Ru(NH&sub3;)5³&spplus; in Ru&sub1;&sub5;Ser&sub1;&sub6;&sub9;-pST; fur das Ruthenisierungsverfahren siehe A.W. Axup et al., J. Amer. Chem. Soc. 110, Sa. 435, (1988).
- c Erworben von Sigma Chemical Company.
- d 1T200 mM linearer Gradient von Nα-Acetylhistidin während 1000 min. Imidazol ist ein besseres Freisetzungsmittel fur diese Proteine.
- e 2,0 mg Protein, aufgebracht auf eine mit Kupfer beladene 10 ml Säule (1,0 x 13,0 cm), Pharmacia Chelating Sepharose 6B. Eluiert mit einem linearen Gradienten (1 T 100 mM) Nα-Acetylhistidin während 500 min bei einer Durchflußrate von 0,5 ml.min. Puffer enthielten auch 1000 mM NaCl und 50 mM Na&sub2;PO&sub4;, pH, 7,0.
- Dieses Beispiel erläutert die Verwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Protein, nämlich Somatomedin C, das keine verfügbare Metall-bindende Aminosäure enthält, wobei zwei Metall-bindende Aminosäuren darin eingebaut werden, um eine Metall-chelatisierende Sequenz zu erzeugen. Dieses Beispiel veranschaulicht auch die Verwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Protein, dessen dreidimensionale Struktur nicht bestimmt ist.
- Das hier verwendete Somatomedin C, oder "Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1", bezieht sich auf IGF1. Es ist vorgesehen, daß IGF2, sowie Proinsulin und Insulin, auf im wesentlichen die gleiche Weise mit im wesentlichen ähnlichen Ergebnissen modifiziert werden kann. Beispielsweise wurden Ala&sub8; und Asp&sub1;&sub2;, von denen gemäß den oben angegebenen Verfahren vorhergesagt wird, daß sie an einem α-Helix-Segment von IGF1 lokalisiert sind, beide durch Histidin gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren ersetzt. Die verstärkte Affinität für die His&sub8;His&sub1;&sub2;-IGF1- Variante ist in Tabelle 2 gezeigt. Der Rückstand an Position 16, anstelle von Position 8, kann auch durch ein Histidin ersetzt werden, da vorhergesagt wird, daß das α-Helix-Segment bis zur Position 17 reicht.
- Die verwendeten Stämme waren JM1O1 (supe, thi, (lac-proAB), [F', traD36, proAB, lacIqZ M15)) (C. Yanisch-Perron, J. Vieira, J. Messing, Gene 33, 103 [1985]) und BW313 (dut, ung, thi-1, relA, spoT/F' lysA). (T.A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 488 [1985]) Das Plasmid PM0N2464 besteht aus dem Replikon von pBR327 (L. Covarrubias, L. Cervantes, A. Covarrubias, X. Soberon, A. Blanco, Y.M. Kupersztoch-Portnoy, F. Bolivar, Gene 13, 25 [1981]), in das eine Expressionskassette anstelle eines Teils des Tetracyclin-Gens insertiert wurde. Der verwendete Promotor stammt vom recA-Gen von E. coli; die verwendete Ribosomenbindungsstelle ist vom Gen 10 des Phagen T7; (P.O. Olins, C.S. Devine, S.H. Rangwala, K.S. Kavka, Gene 73, 227 [1988)) das Gen codiert für Alanyl-IGF1 mit Histidin-Substitutionen an den Positionen 8 und 12. Stromabwärts vom Gen liegt eine Sequenz mit etwa 500 bp von pEMBL18. (L. Dente, C. Cesareni, R. Cortese, Nucleic Acid Res. 11, [1983]). Diese Sequenz enthält den Replikationsursprung des einzeisträngigen Phagen f1. In mit dem Phagen R408 infizierten Zellen ist einzeisträngige Plasmid-DNA in Phagentelichen gepackt. Im pMON2464 wurden die EcoRI-Stelle und die PstI-Stelle in der Sequenz des β-Lactamase-Gens durch in vitro-Verfahren eliminiert.
- Es wurde gefunden, daß Alanyl-IGF1 von pM0N2446 in einem Ausmaß von etwa 10 % des gesamten Zellproteins erzeugt wurde. Das Protein konnte leicht aus unlöslichen Einschlußkörpern gewonnen werden, und konnte in seine aktive Konformation rückgefaltet werden. Die Produktion von IGF1-Varianten, die Metallbindende Stellen enthielten, erfolgte durch die Konstruktion von Alanyl-IGF1-Varianten, die sich in der Codiersequenz von pM0N2446 nur in den zur Spezifikation der Aminosäureänderungen notwendigen Codons unterschieden.
- Nun wird die Konstruktion von pMON2464, das für Alanyl-IGF1 codiert, mit Histidin-Ersetzungen in den Positionen 8 und 12 beschrieben. Die DNA zwischen der NcoI- und PstI-Stelle in pMON2363 wurde durch komplementäre synthetische Oligomere ersetzt, die für die N-terminalen 16 Codons des Alanyl-IGF1-Gens codieren. Die DNA von pMON2363 wurde verwendet, da sie das Gen für eine IGF1-Variante enthält, die verglichen mit pMON2446 neun weitere DNA-Basen zwischen der NcoI- und PstI- Stelle aufweist. Die Substitution der DNA von pMON2363 zwischen der NcoI- und PstI-Stelle durch synthetische DNA, die eine kürzere Länge aufweist, ermöglichte die Identifikation rekombinanter Plasmide, die für die gewünschten Alanyl-IGF1-Varianten codieren. 1 µg DNA von pMON2363 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und PstI bei 37ºC während zumindest 2 h im folgenden Puffer behandelt: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl. Der Restriktionsenzym-Reaktionsmischung wurde NaOAc auf eine End-Konzentration von 300 mM in einem End-Volumen von 0,3 ml zugesetzt. Diese Probe wurde jeweils mit 0,1 ml mit Wasser gesättigtem Phenol und Chloroform extrahiert. Die wässerige Phase wurde entfernt, und 0,7 ml 95 % Ethanol wurden zugesetzt und gemischt.
- Synthetische Oligonudeotide wurden durch Phosphodiester- Chemie unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthesizers erzeugt. Die Sequenz dieser Oligonudeotide ist nachstehend gezeigt.
- Diese Oligonucleotide wurden durch eine DuPont Nensorb- Säule geführt, um die Salze zu entfernen. Die Reinigung der Oligonudeotide aus einem Polyacrylamid-Gel war nicht notwendig. Etwa 1000 pmol der Oligonudeotide wurden in Wasser resuspendiert. 100 pmol jeder der komplementären Oligonucleotide wurden in einem Volumen von 50 µl im folgenden Puffer gemischt: 6,6 mM Tris (pH 7,4), 6,6 mM MgCl&sub2;, 6,6 mM NaCl und 5 mM Dithiothreitol. Die Probe wurde in siedendes Wasser gegeben, das auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde, um eine Anelierung der Oligonucleotide zu ermöglichen. 10 pmol der anelierten Oligonucleotid-Mischung wurden einer aliquoten Menge der Hälfte der mit NcoI und PstI behandelten pMON2363-DNA in Ethanol zugesetzt. Sowohl diese Probe als auch die andere Hälfte der pMON2363-DNA wurden gekühlt, und die DNA wurde durch Ausfällung gesammelt. Die getrockneten Pellets wurden in 20 µl Ligationspuffer resuspendiert: 25 mM Tris (pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM Spermidin, 1 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP. Diesem wurden 10 Einheiten T4-DNA-Ligase zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 15ºC inkubiert.
- Einzelsträngige DNA von pMON2464 wurde isoliert. Eine Kultur des E. coli-Stamms BW313 mit pMON2464 wurde in 2XYT-Medium (16 g Trypton, 10 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl pro l) gezüchtet, wobei 200 µg/ml Ampicillin zugesetzt wurden. Bei einem Klett-Wert von 110 wurde der Phage R408 (Stratagene) auf eine End-Konzentration von 10(9) Phage/ml zugesetzt. Gleichzeitig wurde Uridin auf eine End-Konzentration von 0,25 µg/ml zugesetzt. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 37ºC über Nacht wachsen gelassen. 4 bis 6 ml Kultur wurden einer Zentrifugation unterworfen, um Zellen zu entfernen. Den Überständen wurde ¼ Volumen Phagen-Ausfällungspuffer (2,5 M NaCl, 10 % M/sV Polyethylenglykol M6000, 0,15 mM EDTA (pH 7,0), 10 µg/ml Pankreas- RNase) zugesetzt. Diese Proben wurden über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Die Phagen von 1 ml Kulturüberstand wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 50 µl Protease K-Verdaupuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 0,2 % Sarkosyl und 0,05 mg/ml Protease K) resuspendiert. Die Proben wurden 1 h lang bei 65ºC inkubiert und dann auf Eis gekühlt. NaCl wurde auf eine End-Konzentration von 400 mM zugesetzt. Die Proben wurden in Anwesenheit jeweils des halben Volumens von gesättigtem Phenol und Chloroform verwirbelt. Die wässerige Phase wurde entfernt und die Nudeinsäure mit zwei Volumina kaltem Ethanol ausgefällt. Die getrockneten Pellets wurden in 10 µl Wasser pro 4 ml ursprünglicher Kulturüberstand resuspendiert.
- Die einzeisträngige DNA stammte hauptslchlich vom Plasmid anstelle vom Phagen R408. Ein geringes Ausmaß an Uracil-Einschluß resultiert aus dem Wachstum des Plasmids im Stamm BW313. Dies ermöglichte eine Selektion zugunsten eines in vitro-synthetisierten komplementären Strangs, der kein Uracil enthält. Um die Synthese dieses Strangs zu starten, wurde ein synthetisches DNA-Oligonucleotid verwendet. Die Sequenz dieses Oligonucleotids (5'GCAAACGTGCTGCAGAGCATGAACAAG 3') unterscheidet sich vom Komplement der Sequenz der einzeisträngigen Matrize an der Position des Codons 16 des IGF1-Gens. Die Sequenz des Oligonucleotids spezifiziert Histidin, während die Matrize an dieser Position Phenylalanin spezifiziert.
- 50 pmol dieses Oligonucleotids wurden mit Polynucleotidkinase in Anwesenheit von 25 mM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM Spermidin, 1 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP 30 min lang bei 37ºC und dann 5 min lang bei 65ºC behandelt. 10 pmol des Oligonucleotids wurden mit 4 µl der wie oben hergestellten Matrize gemischt. Diese wurden auf ein End-Volumen von 10 µl in Hin-Puffer gebracht: 6,6 mM Tris (pH 7,4), 6,6 mM MgCl&sub2;, 6,6 mM NaCl, 5 mM Dithiothreitol. Die Proben enthaltende Röhrchen wurden in einem Becherglas Wasser suspendiert, das zum Sieden gebracht und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen wurde. Dies ermöglichte die Anelierung des Oligonucleotids an die Matrize. Der gekühlten Mischung wurden 9 µl NTP-Mischung zugesetzt: Hin- Puffer, jeweils 1 mM der vier Desoxynucleotidtriphosphate und 1 mM rATP. Diesen Proben wurden jeweils 3 Einheiten T4-DNA- Ligase und des Klenow-Fragments von E. coli-DNA-Polymerase 1 zugesetzt. Beide dieser Enzyme wurden von Boehringer Mannheim erhalten. Dann wurden die Proben über Nacht bei 15ºC inkubiert.
- Eine Kultur von E. coli-JM1O1-Zellen wurde kompetent gemacht, um exogene DNA zu entnehmen. Die Zellen wurden von einer bei 37ºC in LB-Medium wachsenden Kultur gesammelt. Dann wurden sie in ½ Kulturvolumen mit 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Nach 30 min Lagerung auf Eis wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, und die Zell-Pellets wurden in 1/10 Kulturvolumen in 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Nach 0,5 h Inkubation bei 4ºC wurden die Proben 1 min lang bei 42ºC inkubiert. 1 ml L-Brühe wurde zugesetzt, und dann wurden die Proben 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und auf Agar- Platten, die 200 mg/ml Ampicillin enthielten, ausgestrichen. Kolonien, die nach Inkubieren über Nacht bei 37ºC wuchsen, wurden in flüssiger Brühe aufgenommen, die auch 200 mg/ml Ampicillin enthielt. Plasmid-DNA wurde aus den Zellen in diesen Kulturen durch Standard-Verfahren isoliert und einer Analyse durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese der DNA unterworfen, die mit Restriktionsendonucleasen behandelt worden war. Jene Plasmid-DNAs, von denen gefunden wurde, daß sie DNA-Restriktionsfragmente enthielten, deren Größe die Anwesenheit der synthetischen DNA anstelle der Eltern-DNA anzeigte, wurden als Kandidaten für die gewünschte Rekombinante ausgewählt. Die DNA dieser Plasmide wurde einer DNA-Sequenzanalyse durch Standard- Verfahren unterworfen, um die Anwesenheit der gewünschten Sequenz zwischen der NcoI- und PstI-Restriktionsstelle zu bestätigen.
- Der E. coli-Stamm W3110 II-4 mit dem Plasmid pMON2464 wurde zur Produktion einer Alanyl-IGF1-Variante verwendet, die Histidin-Substitutionen an den Positionen 8 und 12 enthält. Eine Transformante von W3110 II-4 mit dem Plasmid pMON2464 wurde verwendet, um eine Kultur über Nacht in L-Brühe, die 200 mg/ml Ampicillin enthält, zu starten. Diese wurde zum Beimpfen einer Fermenterkultur verwendet. Das Wachstumsmedium enthielt folgendes: KOH, H&sub3;PO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, MgSO&sub4;, Spurenmetalle und Alimet. Flüssige Dextrose wurde als Kohlenstoff-Quelle verwendet, und die verbleibende Dextrose-Konzentration im Fermenter wurde unter Verwendung einer konzentrierten Dextrose-Zufuhrstrategie zwischen 0,05 % und 0,25 % gehalten. Dem Fermenter wurde kein Antibiotikum zugesetzt. Die Fermentationslauf-Parameter waren wie folgt: 37ºC, 100 UpM Rühren, Luftspülrate 10 l/min, 0,35 kg/cm² Gegendruck und pH-Einstellpunkt gesteuert auf 7,0 mit Ammoniumhydroxid. Als die Kultur auf eine optische Dichte (550 nm) von 20 gewachsen war, wurde die Temperatur von 37ºC auf 33ºC verschoben und während der Dauer des Laufs aufrechterhalten. Als die Kultur eine optische Dichte (550 nm) von 42 erreicht hatte, wurde Nalidixinsäure auf eine End-Konzentration von 25 ppm zugesetzt, um eine Expression der IGF1-Gen-Variante vom reca-Promotor am pMON2464 zu induzieren. Dann wurde die Zellen geerntet, eingefroren und bei -80ºC gelagert.
- Nach dem Auftauen der geeigneten Menge gefrorener Zelipaste bei 5ºC wurden 110 g der Zelipaste vorsichtig in 480 ml kaltem Wasser suspendiert, wobei ein Ultra Turrax-Rührer verwendet wurde. Die gekühlte Zellsuspension wurde 4 x durch einen vorgekühlten Manton Gaulin-Homogenisator geführt, der auf einen Druck von 420 bis 560 kg/cm² eingestellt war. Die erhaltene Suspension lysierter Zellen wurde 35 min lang einer Ultrazentifugation bei 50 000 x g (25 000 UpM in einem 45TI-Rotor) ausgesetzt, wobei eine Beckman Modell L8-Zentrifuge verwendet wurde. Die klare Überstandsflüssigkeit wurde abgegossen und das verbleibende bräunliche Pellet mit einem kleinen Wasserstrom heftig gewaschen, um die obere Schleimschicht unerwünschter Zelltrümmer zu entfernen. Das Pellet wurde in Wasser resuspendiert und ein zweites Mal einer Ultrazentifugation und Waschen unterzogen. Das verbleibende Material wurde mechanisch aus den Zentrifugenröhrchen gekratzt und kombiniert, wobei 2,6 g feuchte Einschlußkörper erhalten wurden, die zur Weiterverwendung bei -80ºC gelagert wurden.
- Eine 1,3 g Masse von Einschlußkörpern wurde in 80 ml kaltem Puffer (6 M Harnstoff + 25 mM Tris, pH = 9,0) suspendiert, wobei ein Ultra Turrax-Rührer verwendet wurde. 120 mg Dithiothreitol wurden der Mischung zugesetzt, um die Einschlußkörper zu reduzieren und zu solubilisieren. Diese Mischung wurde 10 min lang bei 5 bis 10 ºC gerührt, und dann wurden 160 ml kalter Tris-Puffer (25 mM, pH 9,0) zugesetzt. Der pH dieser Mischung wurde durch den tropfenweisen Zusatz von 2,5 M NaOH rasch erhöht. Die Mischung wurde etwa 1 min lang gerührt, und dann wurde der pH durch den tropfenweisen Zusatz von 6 M HCl rasch verringert. Diese Lösung wurde in einem offenen Behälter 16 h lang bei 5ºC gerührt, um den Faltungsprozeß zu vollenden. Zur Entfernung verbleibender unlöslicher Stoffe wurde die rückgefaltete Mischung einer Ultrazentrifugation bei 50 000 x g (25 000 UpM in einem Beckman 45TI-Rotor) unterworfen. Die klare blaßgelbe überstandsflüssigkeit wurde abdekantiert und dann durch den Zusatz von 1,4 g NaCl und Einstellen des pH auf 8,5 zur Reinigung vorbereitet.
- Eine 2,6 g Masse von Einschiußkörpern wurde in 100 ml kaltem Puffer (6 M Harnstoff + 25 mM Tris, pH = 9,5) suspendiert, wobei ein Ultra Turrax-Rührer verwendet wurde. 150 mg Dithiothreitol wurden der Mischung zugesetzt, um die Einschlußkörper zu reduzieren und zu solubilisieren. Diese Mischung wurde bei 10ºC gerührt, bis sich die meisten Einschlußkörper gelöst hatten ( 10 min), und dann wurden 1100 ml kalter Borat-Puffer (25 mM, pH 9,5) zugesetzt. Der pH dieser Mischung wurde überprüft, um sicherzugehen, daß er 9,5 betrug. Diese Lösung wurde bei 5ºC in einem offenen Behälter heftig gerührt, bis die Oxidation abgeschlossen war (10 bis 48 h). 7,0 g Natriumchlorid wurden in der Rückfaltungsmischung gelöst, gefolgt vom tropfenweisen Zusatz von Eisessig, bis der pH 4,5 betrug. Dann wurde die Mischung einer Ultrazentrifugation bei 50 000 x g (25 000 UpM in einem Beckman 45TI-Rotor) unterworfen. Die klare Überstandsflüssigkeit wurde abdekantiert, der pH wurde unter Verwendung von 2 M NaOH auf 8,5 eingestellt, und dann wurde die Protein-Lösung bis zur weiteren Reinigung bei 4ºC gelagert.
- Trisacryl GF2000M wurde wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um alle Puffer und Konservierungsmittel zu entfernen, und dann sauggetrocknet. Etwa 100 g ( 100 ml) dieser etwas feuchten Matrix wurden in einer Lösung suspendiert, die 80 ml Diglyme und 100 ml frisch hergestellte 1,4 M NaOH-Lösung enthielt. Schließlich wurden 100 ml Diethylenglykoldiglycidylether zugesetzt, und die Mischung wurde 16 h lang bei 35ºC sanft gerührt. Gereinigter Diethylenglykoldiglycidylether wurde gemäß einem Literaturverfahren hergestellt (X. Gu, I. Ideda, M. Okahara, Synthesis 649, [1985]). Die aktivierte Matrix wurde mit 50/50 Diglyme/H&sub2;O gewaschen, und dann wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Epoxid- und Basen-Überschuß zu entfernen. Es wurde gezeigt, daß die gewaschene, sauggetrockente Matrix 70 µmol aktive Epoxid-Gruppen pro ml Harz aufwies. Das aktivierte Harz wurde bei 4ºC gelagert und im allgemeinen innerhalb von 24 h nach der Herstellung verwendet.
- Das aktivierte Transacryl wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und sauggetrocknet. Etwa 100 g ( 100 ml) dieses aktivierten Geis wurden in 100 ml 1,0 M Na&sub2;NH(CH&sub2;CO)&sub2;-Lösung suspendiert, die auf pH = 10,5 bis 11,0 eingestellt wurde. Diese Mischung wurde 24 h lang bei 65ºC sanft gerührt und dann wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Liganden-Überschuß zu entfernen. Das funktionalisierte Harz wurde in 25/75 (V/V) Ethanol/Wasser bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert. Titration mit Thiosulfat zeigte das Fehlen von Epoxid-Gruppen, daher wurde ein Pfropfen mit Ethanolamin für unnötig gehalten. 10 ml sauggetrocknetes Gel wurden mit 50 mM Cu(ClO&sub4;)&sub2;-Überschuß gesättigt und dann vorsichtig mit 100 ml destilliertem Wasser, 100 ml 50 mM Imidazol (pH = 7,0) und schließlich 100 ml H&sub2;O gewaschen. Dann wurde das gebundene Kupfer mit einem 50 mM Na&sub2;H&sub2;EDTA-Überschuß (pH = 7,0) entfernt. Unter Verwendung standardisierter Kupfer-EDTA-Lösungen zum Vergleich wurde der gesamte Kupfergehalt photometrisch mit 0,43 mmol bestimmt.
- Eine Glassäule (1,6 x 13 cm, 26 ml) wurde mit sorgfältig gewaschenem IDA-Trisacryl-Gel gepackt und dann mit 130 ml 50 mM Cu(ClO&sub4;)&sub2; (pH = 4,5) beladen. Das funktionalisierte Gel absorbierte die Kupferionen nahezu quantitativ. Diese Kupfersäule wurde mit 100 mM NaCl gewaschen, und dann wurde sie mit dem Freisetzungspuffer (50 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0) äquilibriert, und schließlich mit dem Ladepuffer (0,5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,0) äquilibriert Die geklärte rohe Rückfaltungsmischung ( 1200 ml) wurde auf pH = 8,5 eingestellt und dann bei 4 ml/min auf die Säule gepumpt; dann wurde die Säule mit 80 ml Ladepuffer gewaschen. Die Säule wurde 500 min lang bei einer Durchflußrate von 1,3 ml/min bei Umgebungstemperatur (23ºC) unter Verwendung eines linearen Imidazol- Gradienten (0,5 T 50 mM) entwickelt. Das Eluat von der Säule wurde kontinuierlich bei 280 nm (0,05 bis 0,5 AUFS) unter Verwendung eines Kratos Modell 757-Spektrometers, ausgestattet mit einer Zelle mit einer Weglänge von 3 mm, überwacht. 13 ml Fraktionen wurden unter Verwendung eines Gilson Modell 202-Fraktionskollektors gesammelt. Nachdem der Lauf vollendet war, wurde die Säule mit 50 mM Na&sub2;H&sub2;EDTA (pH = 7,0) und dann 50 mM abgezogen. Nach Waschen mit 100 mM (240 ml) NaCl, 240 ml Ladepuffer und schließlich 100 mM (240 ml) NaCl war die Säule zur Regeneration bereit. Zwei stark bindende Protein-Peaks eluierten von der Kupfersäule. Die den zweiten Peak enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und kombiniert, wobei 80 bis 100 ml Lösung erhalten wurden, die 30 bis 40 mg Protein enthielt. Eine typische Analyse durch analytische Umkehrphasen-HPLC (4,6 x 250 mm, Brownlee C8-Säule, H&sub2;O/CH&sub3;CN + 0,1 % CF&sub3;CO&sub2;H, 210 nM) von A&submin;&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1 in diesem Stadium zeigte die folgenden Ergebnisse.
- Zusätzlich zu unserem Trisacryl-Gel wurde Pharmacia Chelating Sepharose Fast Flow mit annehmbar guten Ergebnissen verwendet.
- Die gereinigte Somatomedin-Lösung ( 100 ml/ 36 g Gesamtprotein) wurde unter Verwendung einer gerührten 100 ml Amicon- Ultrafiltrationszelle, ausgestattet mit einer YM2-Membran, auf eine Protein-Konzentration von 1,5 mg/ml konzentriert. Ein Teil der konzentrierten Probe (12 ml) wurde filtriert (0,2 µm) vor der Injektion in die Umkehrphasensäule, und der Rest der Probe wurde zur Weiterverwendung eingefroren. Die verwendete Säule war eine Aquapore R-300 C8-Umkehrphasensäule (7,0 x 250 mm), vertrieben von Brownlee Labs. Die Säule wurde mit einer 10/90 Mischung von Acetonitril-Wasser (0,1 % CF&sub3;CO&sub2;H) äquilibriert, und dann wurde die Protein-Lösung injiziert. Die Säule wurde 50 min lang bei einer Durchflußrate von 3,0 ml/min bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten entwickelt, bis die End-Lösungsmittelzusammensetzung 60/40 Acetonitril/Wasser (0,1 % CF&sub3;CO&sub2;H) betrug. Das Eluat von der Säule wurde kontinuierlich bei 280 nm (0,2 bis 2,0 AUFS) unter Verwendung eines Kratos Modell 757-Spektrometers, ausgestattet mit einer 8 mm Zelle, überwacht. 0,9 ml Fraktionen wurden unter Verwendung eines Gilson Modell 202-Fraktionskollektors gesammelt. Richtig gefalteter A&submin;&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1 eluierte von der Säule nach 22 min ( 32 % MeCN), seine begleitende Iso-Form kam nach 25 min ( 35 % MeCN), und einige Oligomer-Peaks kamen in der Zeitspanne von 27 bis 35 min. Die IGF1 enthaltenden relevanten Fraktionen wurden unter Verwendung analytischer Umkehrphasen- HPLC analysiert. 8 Fraktionen, die den Haupt-Peak enthielten, wurden vereinigt, und es wurde gezeigt, daß sie 13 mg bei einer Reinheit von 98+% enthielten. 3 Fraktionen, welche die Iso-Form enthielten, wurden vereinigt, und es wurde gezeigt, daß sie 1,6 mg bei einer Reinheit von 95 % enthielten. Die Säule wurde durch Waschen mit 90/10 MeCN-H&sub2;O gereinigt und dann mit dem Ausgangspuffer 10/90 MeCN-H&sub2;O (0,1 % CF&sub3;CO&sub2;H) reäquilibriert. Die verbleibende Probe wurde aufgetaut und ähnlich unter Verwendung desselben Verfahrens gereinigt.
- Erforderliche Volumina (0,1 bis 1,5 ml) der gereinigten IGF1-Lösungen wurden in 2 ml Eppendorf-Röhrchen pipettiert und in einen Savant-Vakuumkonzentrator (Speedvac, SVC 200H) gegeben, um die Lösungsmittel zu entfernen (H&sub2;O, CH&sub3;CN, CF&sub3;CO&sub2;H). Die gereinigten Proteine wurden als flockige weiße Festtoffe erhalten und bei -80ºC gelagert. Die Gesamtausbeute an gereinigtem A&submin;&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1 betrug 26,4 mg; es wurden auch 3,2 mg der begleitenden Iso-Form erhalten.
- Etwa 1,5 mg A&submin;&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1 (falsch oder richtig gefaltet) wurden in 1,5 ml Sulfonierungspuffer gelöst, der 125 mM Na&sub2;SO&sub3;, 25 mM Na&sub2;SO&sub4;O&sub6;.2H&sub2;O, 25 mM H&sub3;BO&sub3; und 6 M Harnstoff (pH 8,5) enthielt. Die Reaktion wurde 3 h lang bei 25ºC oder 12 h lang bei 5ºC fortschreiten gelassen, wonach die Reaktionsmischung filtriert (0,2 µm) und in die Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert wurde (siehe oben). Trotz der Bildung von 6 zusätzlichen negativen Ladungen war das Protein hydrophober und eluierte von der Säule nach 29 min ( 39 % MeCN). Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden auf die gleiche Weise wie das native Protein behandelt, wobei 1,3 mg reines A&submin;&sub1;H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1(SO&sub3;)&sub6; erhalten wurden.
- Die gleichzeitige Wechselwirkung von zwei oder mehreren Metall-bindenden Stellen eines einzelnen vielzähnigen Liganden und eines einzelnen Metalls oder einzelnen Clusters starr gebundener Metalle wird als Metall-Chelatisierung bezeichnet. Es ist bekannt, daß geeignet ausgebildete Chelate stärker an ein bestimmtes Metall binden als analoge nicht-chelatisierende Liganden. (A.E. Martell, R.M. Smith, Critical Stability Constants; Plenum Press: New York, 4 Bd. [1975]) "Geeignet ausgebildet" bedeutet, (1) daß die chemische Beschaffenheit der Donor-Atome in den Liganden an das bestimmte Metallion oder den Metall-Komplex angepaßt ist; (2) daß die zwei oder mehreren Metall-bindenden Atome leicht die spezifischen geometrischen Anforderungen des Metalls erfüllen; (3) daß die chelatisierende Form des Liganden in ihrer Konformation eingeschränkt ist (relativ unflexibel, starr).
- Von den natürlichen Aminosäuren haben nur die Seitenketten von Cystein, Histidin, Aspartat und Glutamat eine signifikante Bindungsstärke in wässerigen Lösungen für divalente Übergangsmetalle der ersten Reihe bei neutralem pH (A.E. Martell, R.M. Smith, Critical Stability Constants; Plenum Press: New York, 4 Bd. [1975])
- Cys > His » Asp, Glu > andere Aminosäuren
- Für eine cis-Anordnung von Liganden, die an Cu²&spplus; binden (ähnlich für VO²&spplus;, Ni²&spplus; und Zn²&spplus;), zeigen Röntgen-Kristallographiedaten für Metall-Komplexe, daß typische Kupfer-Stickstoff- Bindungsparameter Cu-N = 1,98 bis 2,02 Å und N-Cu-N = 80º bis 100º sind. (G. Nardin, L. Randaccio, R.P. Bonomo und E. Rizzarelli, J. Chem. Soc., Dalton Trans. 369, (1980]. A. Podder, J.K. Dattagupta, N.N. Saha und W. Saenger, Acta Cryst., B35, 53 [1979]). Röntgen-Kristallographiedaten für Proteine zeigen drei allgemein festgestellte sekundäre Strukturmerkmale: α-Helices, β-Stränge und Schleifen. Diese strukturierten Regionen erfüllen zumindest teilweise die Anforderungen der Konformationseinschränkung. Typische Konformationswerte für α-Helices (φ = -57ºC, ψ = -47ºC, ω = 180º) (S. Arnott, A.J. Wonacott, J. Mol. Biol. 21, 371 [1966]). T. Blundell, D. Barlow, N. Borkatakoti, J. Thornton, Nature 306, 281 [1983]), β-Stränge (φ = -139ºC, ψ = +135ºC, ω = 180º) (C. Chotis, J. Mol. Biol. 75, 295 [1973]), und β-Haarnadelschleifen (Typ I', Typ II') (B.L. Sibanda, J.M. Thornton, Nature 316, 170 [1985]) wurden verwendet. Geometrische Suchen nach energetisch annehmbaren Seitenketten-Konformationen (J.W. Ponder, F.M. Richards, J. Mol. Biol. 193, 775 [1987]) für Histidin- und Aspartat-Reste wurden durchgeführt, um herauszufinden, welche mit entsprechenden Sekundärstrukturen gekoppelten Aminosäuresequenzen eine zweizähnige Chelatisierungsstelle für Cu²&spplus; mit den obigen Distanz- und Winkeleinschränkungen vorsehen konnten. Nur Chelatisierungswechselwirkungen mit kurzer Reichweite wurden in Betracht gezogen; d.h. die Anzahl zwischen den Bindungsresten angeordneter Reste betrug Null bis 4. Die Ergebnisse der Berechnungen sind in der folgenden Tabelle gezeigt; (+) zeigt an, daß eine Chelatisierung auftreten kann, und (-) zeigt an, daß keine Chelatisierung auftreten kann. Die Beschaffenheit der dazwischenliegenden Reste ("x") ist relativ unwichtig; der Modellversuch zeigte, daß die sterische Größe, die Hydropathie und die Ladung der Seitenketten dieser Reste nur geringe oder sekundäre Rollen bei der Bestimmung der Stärke der Metall-chelatisier enden Peptid-Wechselwirkungen spielen.
- Da zuverlässigere Strukturinformationen fehlten, wurden eine signifikante Sekundärstruktur enthaltende Regionen aus Aminosäure-Sequenzinformationen unter Verwendung der Vorhersage- Algorithmen von Nagano (K. Nagano, J. Mol. Biol. 109, 251 [1977]), Chou (P.Y. Chou, G.D. Fasman, Adv. Enzymol. 47, 45 [1978]), Garnier (J. Garnier, D.J. Osguthorpe, B. Robson, J. Mol. Biol. 120, 97 [1978]) und Wako (H. Wako, N. Waito, H.A. Scheraga, J. Protein Chem. 2, 221 [1983]) bestimmt; es wurde auch ein fünftes Verfahren unter Verwendung von Homologien zu Sequenzen in bekannten Strukturen verwendet. Diese fünf Vorhersageverfahren wurden für jedes Protein einer Serie ausgerichteter, homologer Proteine eingesetzt. Nur wenn eine wesentliche übereinstimmung zwischen allen Vorhersagen bestand, wurde eine gemeinsame Prädiktion für zuverlässig gehalten. Die nachstehende Tabelle zeigt die gemeinsame Vorhersage für Promsulin von acht Säugerarten (Menschen, Schweinen, Meerschweinchen, Ratten, Mäusen, Pferden, Rindern, Hunden) und die gemeinsame Vorhersage für Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 von vier Säugerarten (Menschen, Rindern, Ratten, Mäusen). Die zusammengesetzten Prädiktionen für Promsulin und IGF1 zeigen, daß keine β-Struktur zuverlässig vorhergesagt wird. Zwei Schleifen enthaltende Regionen (19-23, 39-42) werden jedoch moderat vorhergesagt, und eine Helix-Region (8-17) wird stark vorhergesagt. TABELLE
- ¹ Zusammengesetztes Ergebnis von 40 Prädiktionen für 8 Arten (Menschen, Schweinen, Meerschweinchen, Ratten, Mäusen, Pferden, Rindern, Hunden). H = starke Helix-Prädiktion, h = moderate Helix-Prädiktion, b = moderate β-Struktur-Prädiktion, t = moderate Schleifen-Prädiktion, C = weder Helix noch β-Struktur.
- ² Zusammengesetztes Ergebnis von 20 Prädiktionen für 4 Arten (Menschen, Rindern, Ratten, Mäusen)
- ³ Zusammengesetztes Ergebnis aller einzelnen Proinsulin- und IGF1-Prädiktionen.
- &sup4; Exponiert (+), eingettet (-), dazwishenliegende Region (0).
- Sobald Regionen mit regelmäßiger Sekundärstruktur identifiziert wurden, ist es notwendig zu bestimmen, welche Reste in diesen Regionen an der Oberfläche des Proteins ausreichend exponiert sind, so daß sie leicht an Metalle binden könnten. Die Periodizität der Hydropathie über die Region von Interesse wurde als Hilfe beim Auffinden der exponierten Reste verwendet. Obwohl eine Reihe von Hydropathie-Maßstäben definiert wurde, ist der in der vorliegenden Anmeldung nützlichste der Maßstab auf der Basis des Grades, in dem ein bestimmter Aminosäurerest eingebettet oder exponiert ist, wie bei Proteinen bestimmt, deren Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt werden. (A. Kidera, Y. Konishi, M. Oka, T. Ooi, H.A. Scheraga, J. Protein Chem., 2, 221 [1983]).
- Für die gesamte Helix-Region von Interesse wurde das hydropathische Moment (Richtung und Größe) unter Verwendung eines Abstands von 18 Resten pro 5 Schleifen (100º/Rest) berechnet. Wenn das hydropathische Moment ausreichend groß war (> 0,3 ), wurden die Reste dann in drei Kategorien mit gleichmäßiger Population eingeteilt: exponiert (+), eingebettet (-) und grenzwertig (0).
- Die Berechnungen für die Reste 8-17 in IGF1 und für die analoge Region in Promsulin zeigten, daß der Rest 12 (Asp/Glu) die beste Exposition für das Lösungsmittel hatte. Ähnlich waren die Reste 8, 15 und 16 (Ala/Ser, Gln/Tyr, Phe/Leu) exponiert, und die Reste 10, 14 und 17 (Leu/Leu, Leu/Leu, Val/Val) waren eingebettet. Es wurde berechnet, daß die Reste 9, 11 und 13 in einer dazwischenliegenden Region angeordnet waren, die weder völlig exponiert noch völlig eingebettet war; von diesen drei Resten ist E&sub9;/H&sub9; exponierter, und sind L&sub1;&sub1;/L&sub1;&sub1; und A&sub1;&sub3;/A&sub1;&sub3; eingebetteter. Mit Ausnahme des Restes 16 hat die Helix einen guten amphiphilen Charakter. Auf der Basis dieser Berechnungen wurde beurteilt, daß H&sub8;H&sub1;&sub2;-IGF1 und H&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;-IGF1 die besten Metall-bindenden Stellen enthielten. Wir haben einige mögliche Probleme vernachlässigt; (1) die Nähe der Reste 8 und 16 zu den Enden der berechneten Helix, (2) das Ersetzen eines hydrophoben Rests (Phe&sub1;&sub6;) durch ein hydrophiles Histidin, (3) die Möglichkeit, daß der Rest 8 ein Teil einer G&sub7;A&sub8;-Schleife war.
- Für die gesamte β-Strang-Region von Interesse wurde das hydropathische Moment unter Verwendung eines Abstands von 2 Resten pro Schleife (180º/Rest) berechnet. Dies ist eine einfache Berechnung für β-Strukturen, da jeder Rest entweder "oben" oder "unten" ist. In diesem Fall wurden die Reste in zwei Kategorien mit gleichmäßiger Population eingeteilt: exponiert (+) und eingebettet (-).
- Da diese Schleifen mit zwei Resten supersekundäre Strukturen sind, sind weitere Berechnungen kaum notwendig, sobald die Reste in der Schleife identifiziert wurden. Die für eine Metall-Chelatisierung geeigneten Reste sind die beiden Reste an jeder Seite der Haarnadelschleife. Diese Schleifen treten am häufigsten an exponierten Oberflächen von Proteinen auf, wobei die Schleifen-Reste und unmittelbar benachbarten Reste exponiert sind.
- Aufgrund des Vorliegens benachbarter Cystein-, Glycin- oder Prolinreste zeigte keine vorhergesagte Schleifen-Region (19-23, 39-42) in IGF1 eine klar definierte, einzelne Schleife mit 2 Resten, und es wurde festgestellt, daß keine guten Metall-bindenden Stellen vorhanden waren.
- Die biologische Aktivität der IGF1-Varianten wurde durch die Messung der Verstärkung der Myoblastenproliferation in vitro getestet. Myogene Ratten-L6-Zellen (D. Yaffe, Proc. Natl. Acad. Sci. 61, 477 [1968]) wurden in einem Zellproliferationstest verwendet. (C.E. Kotts, M.E. White, C.E. Allen, F. Martin, W.R. Dayton, J. Animal Sci. 64, 615 [1987]). Frühere Arbeiten haben gezeigt, daß nativer IGF1 auf diesen Test anspricht. (C.E. Kotts, C.A. Baue, Fed. Proc. 44, 484 [1985]). Dieser Test wurde mit geringen Modifikationen verwendet, die kurz beschrieben werden.
- Zellen wurden auf 2 cm² Vertiefungen (Platten mit 24 Vertiefungen, Corning) bei 1000 Zellen/cm² in 10 % fötales Kälberserum (FBS, Gibco) enthaltendem Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM, Dibco Laboratories, Grand Island, N.Y.) plattiert. Nach 24 h wurde das die IGF1-Variante (0,1 bis 50 nM) in DMEM plus 2 % FBS enthaltende Testmedium aufgebracht (1 ml/Vertiefung). Vorratslösungen von Fragmenten wurden in 10 mM HCl bei einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt. Frisches Testmedium wurde 24 h danach erneut aufgebracht. Nach weiteren 48 h wurde die Zellzahl geschätzt, indem der DNA-Gehalt jeder Vertiefung gemessen wurde. Der DNA-Gehalt wurde unter Verwendung einer Standard-Kurve, die aus bekannten L6-Zellzahlen bestand, wie mit einem Coulter-Zähler (Modell ZM, Coulter Electonics, Hileah, Florida) gemessen, mit der Zellzahl korreliert. Kontrollen erhielten DMEM mit 2 % FBS und geeigneten Volumina von 10 mM HCl. Positive Kontrollen erhielten verschiedene Konzentrationen (0,1 bis 50 mM) von rekombinantem Human/Rinder-IGF1 (Monsanto Co. Charge S105, St. Louis, MO.) in DMEM plus 2 % FBS. Alle Inkubationen wurden bei 37ºC, 10 % CO&sub2; und 100 % Feuchtigkeit durchgeführt. Die Ergebnisse sind als prozentuelle Erhöhung der Zellzahl gegenüber Kontrollen (DMEM + 2 % FBS) in jedem Test ausgedrückt und als Stimulation definiert. Die Variation innerhalb des Tests betrug durchschnittlich 5,1 % (± 1,2 %), und die Variation zwischen den Tests betrug 22,2 % unter den in dieser Untersuchung verwendeten Versuchen.
- Einzelpunkt-Tests bei IGF1-Konzentrationen von 0,1, 1 und 10 nM zeigten die folgenden Aktivitäten:
- Eine vollständige kinetische Analyse der von der Konzentration abhängigen Proliferationsraten für zwei der obigen Proteine führte zu den folgenden Ergebnissen:
- Die effektiven Km-Werte sind gleich innerhalb des Versuchsfehlers (± Faktor 2). Der Wert von Vmax für die IGF1- Variante zeigte eine gute maximale Aktivität, obwohl er etwas niedriger ist als das native Protein (±20 % Fehler). BINDUNG VON IGF1-VARIANTEN AN IMMOBLISIERTES KUPFER BINDUNG VON IGF1-VARIANTEN AN IMMOBILISIERTES KUPFER a 50 µg Protein, aufgebracht auf mit Kupfer-beladene 3,9 ml Säule (8 x 78 mm), Chelating 5PW (Toyo Soda), eluiert mit linearem Gradienten (1 bis 128 mM) von Nα-Acetylhistidin wärhend 160 min bei einer Durchflußrate von 0,98 ml/min; Puffer enthielten auch 500 mM NaCl und 50 mM Na&sub2;PO&sub4; (pH = 7,0). Einheiten sind Säulenvolumina.
- Durch rekombinante DNA-Technologie in Bakterien hergestellte Proteine akkumulieren allgemein in unlöslichen lichtbrechenden Körpern im Cytoplasma der Wirtszelle. Um die Proteine in ihrer aktiven Form zu gewinnen, ist eine Renaturierung erforderlich. Die Renaturierung bringt eine Solubilisation, Faltung und manchmal Oxidation des Proteins zu seiner nativen Konfiguration mit sich. Als Folge eines derartigen Renaturierungsprozesses sind verschiedene Oligomere, Iso-Formen und fehlgefaltete Monomere sowie eine Vielzahl von Bakterienproteinen in der rohen Rückfaltungsmischung zu finden. Dieses Beispiel erläutert ein Verfahren zur Reinigung gewünschten Proteine direkt aus einer rohen Rückfaltungsmischung in einem Metall-Affinitätsreinigungsschritt.
- Da IGF1 keine endogenen Histidin-Reste aufweist, wurden zwei Änderungen im nativen Protein vorgenommen und gemäß dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren gereinigt. Das Elutionsprofil ist in Fig.1 gezeigt. Zusätzlich zu IGF1 und verschiedensten Bakterienproteinen in der rohen Rückfaltungsmischung liegen ein fehlgefaltetes Haupt-IGF1-Monomer, mit IGF verwandte Oligomere und zumindest eine Haupt-IGF-Iso-Form vor. Bei der Reinigung der rohen Rückfaltungsmischung auf einer Metall-Affinitätssäule wurden praktisch alle Bakterienproteine entfernt, und wurden die meisten IGF-oligomere entfernt (verbleibender Oligomer-Gehalt 4 % bis 8 %). Gewöhnlich ist es schwierig, den richtig gefalteten IGF1 vom fehlgefalteten IGF1 zu trennen; vorteilhaft erkannte jedoch das Metall die beiden verschieden gefalteten Formen deutlich und trennte sie sauber. Wie in Fig.2 veranschaulicht, bindet der richtig gefaltete IGF1 am stärksten an die Säule. Der fehlgefaltete IGF1 bindet auch annehmbar gut an die Metallsäule, die Fehlfaltung stört jedoch anscheinend die Helix, wodurch seine Bindung verringert wird. Die richtig gefaltete IGF1-Iso- Form wird durch die Metalisäule leicht vom fehlgefalteten Isomer getrennt, co-eluiert jedoch mit dem richtig gefalteten IGF1 selbst. Ein zweiter Reinigungsschritt (Umkehrphasen-HPLC oder Größenausschlußchromatographie) entfernte leicht das verbleibende IGF1-Oligomer, und entfernte auch (Umkehrphasen-HPLC) die Iso-Form.
Claims (14)
1. Variante eines natürlichen Proteins mit einem
Metallbindenden Aminosäurerest an jeder von einer oder mehreren
Positionen, die im natürlichen Protein von anderen
Aminosäureresten besetzt sind, so daß die Protein-Variante eine
Metallchelatisierende Aminosäuresequenz, dargestellt durch die Formel
-A-Bx-CyDz-E enthält, worin A und E unabhängig voneinander
Histidin oder Asparaginsäure bedeuten, B, C und D Aminosäuren
sind und x, y und z unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0
bis 3 sind, mit der Maßgabe, daß x + y + z in Kombination mit
der sekundären Struktur des Segments des Proteins, das die
Metall-chelatisierende Sequenz enthält, eine stereochemische
Anordnung von A und E ergibt, die zur Bildung eines Chelats mit
einem immobilisierten Metall ausgelegt ist.
2. Proteinvariante nach Anspruch 1, worin A und E Histidin
sind und x + y + z gleich 3 ist, wobei diese Sequenz in einem
α-Helix-Segment des Proteins eingebaut ist.
3. Protein nach Anspruch 2, welches eine Somatotropin-Variante
ist.
4. Somatotropin-Variante nach Anspruch 3, welche einen
Histidinrest an einer der Positionen 15 und 173 aufweist.
5. Somatotropin-Variante nach Anspruch 4, welche eine Rinder-
Somatotropin-Variante ist.
6. Somatotropin-Variante nach Anspruch 4, welche eine
Schweine-Somatotropin-Variante ist.
7. Protein nach Anspruch 2, welche eine Somatomedin-C-Variante
ist.
8. Somatomedin-Variante nach Anspruch 7, mit Histidinresten
sowohl an Position 8 als auch an Position 12, wobei das
natürliche Somatomedin Ala&sub8; und Asp&sub1;&sub2; aufweist.
9. Somatomedin-Variante nach Anspruch 7, mit Histidinresten
sowohl an Position 12 als auch an Position 16, wobei das
natürliche Somatomedin Asp&sub1;&sub2; und Phe&sub1;&sub6; aufweist.
10. DNA-Sequenz, die für eine Somatotropin-Variante codiert
und ein Codon für Histidin anstelle eines Codons in der für
natives Somatotropin codierenden DNA-Sequenz aufweist, wobei das
Codon in der DNA-Sequenz, die für natives Somatotropin codiert,
ausgewählt ist aus den Codons für Leu&sub1;&sub5; und Thr&sub1;&sub7;&sub3;.
11. DNA-Sequenz nach Anspruch 10, welche für eine Rinder-
Somatotropin-Variante codiert.
12. DNA-Seqeunz nach Anspruch 10, welche für eine Schweine-
Somatotropin-Variante codiert.
13. DNA-Sequenz, die für eine Somatomedin-Variante codiert und
Codons für Histidin anstelle jener Codons aufweisen, die in der
DNA-Sequenz, die für natives Somatomedin codiert, für Ala&sub8; und
Asp&sub1;&sub2; oder für Asp&sub1;&sub2; und Phe&sub1;&sub6; codieren.
14. Verfahren zur Fraktionierung von Proteinen oder
Polypeptiden mit einer Protein-Variante nach einem der Ansprüche 1
bis 9, welches die Fraktionierung der Proteine oder Polypeptide
unter Verwendung einer Affinitätschromatographie mit
imobilisiertem Metall aufweist.
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