JPH03101693A - 固定化金属アフィニティ担体に対して増強されたアフィニティを有する変異蛋白質類およびポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、同定化金属アフィニティ担体に対して増強ざ
れたアフィニティを表わ１変異伽白質類およびポリベブ
ヂド類に１３ｆｌ−！Ｊるものである。史に特定的には
、木允明は少なく１個の金属４−レー１・性アミノ酸配
列が組込まれた蛋白質類ｄメよびボリベプチド類に関づ
るものである。

先行技術 組換え蛋白質類またはポリペプチド類が、細菌細胞内で
発現され、次いで発酵槽内で成ｎされた際に、所望の生
成物を純粋な形態で回収１Ｊることが、問題として残さ
れる。固定化金属アノイニフイクロマトグラフィまたは
リガンド交換ク１１マトグラフィは、アミノ酸および蛋
白質精製において、周知の技術である。Ｆ．ｌｌｃｌＨ
ｅｒｉｃｈのＮａｔｕｒｅ　　１　８９、１００１頁（
　１　９　６　１　）　：　ｌＩ．Ｆ．Ｗａｌｔｏｎら
のＲｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｓ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　，■１巻、５章
１　９　８　１　　：　ＰｏｒａｔｈらのＮａｔｕｒｅ
（　Ｌｏｎｄｏｎ）　、２　５　８、５９８貝（１９７
５）：８ｉｏｃｈｅｎ＋ｉｓｔｒｙ、２２、１　６　２
　５　Ｎ　（　１　９　７　５　）　ｒ３よびＳｕ　ｌ
　ｋｏｗｓｋ　ｉのＴｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ＢｉｏＬｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　，　３、１頁（　１　９　８　５　）
　Ｇ．ｉ、この技術が露出したヒスチジン残基の含有績
に応じて天然蛋白質を選択的に分画するために適したも
のであることを示している。イミノジ酢酸等のキレート
性リガンドが、オキシランー活性化アガロースに共有的
に結合され、２＝　　　　２＋　　　．２＋ ｛ｑられたグルがＣｕ　　，，７ｎ　　，Ｎｌ　　また
はＣＯ２＋等の金属イオンで飽和される。このような樹
脂は、これまである秤の天然ベブチド類および蛋白質類
の精製のために使用されてきた。例えば、Ｎ　ｉ　ｌ　
ｓｓｏｎらのＥｍｂｏ　Ｊ．　　４、１　０７５ｍ　（
１　９８５）を参照。

しかしながら、本来的に１個以上の露出されたヒスチジ
ン側鎖または残基を含むものに限らず、全ての組換え乾
１３質ａ３Ｊ、びボリベブチドを粘ｙＪ１１るための方
法が聞允されるこ゛とが望まれていた。

ここにＪタいて、目的とする（Ｈ白質の］一ド配列が、
小型のヒスブージンー含有ペブチドのコード配列と融合
された融合蛋白質がＦｄ允された。アフイニティベブチ
ドのコード配列は、目的とする蛋白質に、特異的な切断
部位と共に融合される。次いで、このような融合蛋白質
は、ヒスブ〜ジン含右ベプチドまたはアフィニティ端部
のアフィニティ担体に対する結合の優位竹により精製さ
れ得る。該融合蛋白質のＶｉ製後、該アフイニティ端部
は、設定された切断部位にＪ３いて極めて困難かつ高価
な方法で分離され、該目的とする蛋白質が最終工程で精
製される。例えば、Ｓｎ＋ｉｔｈらのＢｉｏｌ．Ｃｔ＋
ｃｔ　２　６　３、７２１１　（１９８８）参照のこと
。一般的に、この技術は特に多くの蛋白質不純物が複数
の露出したヒスチジンを含むであろう為に、本来的に１
ｇ以上の金属一結合性アミノ酸類を含む他の蛋白質から
所望の蛋白質を分離−４６ために（よ適していない。し
かしながら、アフィニティ端部が６〜８またはそれ以上
のヒスチジンを含Ｉｆする場合に番よ、このｈ法は４丁
川でありｔ９る。例えばｌｌｏｃｈｕｌらのＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　、６、１３２１　（１９８８）岑照
のこと。

しかして、全ての組換え蛋自等Ｊ；　Ｊ、びボリベブチ
ドに対して適用可能であり、所望の蛋白質を本来的に１
個以上の金属一結合性アミノ酸を含む他の蛋白質から効
果的に分離する蛋白質およびポリペプチドＶｉ製方法が
望ましい。

ここに、固定化金属アフィニテイ担休に対する張白質ま
たはポリペプチドの結合が、本来的に１個以上の金属一
結合性アミノ酎を含む天然蛋白質およびボリベブＦド、
ならびに融合張白質およびポリベブヂドよりち明かに人
きくなるまでに増強され得ることが発見された。このよ
うな増強されたアフィニティ１よ、このような蛋白質ま
たはポリペプチドの一次Ｍ４造中および二次構造の特定
の部分において金属−１レートｔ！ｌアミノ酸配列を組
込むことによって達成され得る。

発明の要約 本発明は、金屁アフィニアイ担体に対して増強されたア
フィニティ、ずなわらより強い結合強度を有する変異所
白賀類およびポリベプヂド類に関するものである。本発
明ｌよ、好ましくは組換えＤＮＡ技南を使川して蛋白質
またはポリペプチド中に１Ｍ以上の特定の金属１−レー
ト性アミノ酸を組込むことにあり、該特定の配列は、こ
の配列に含まれる特定の金属一結合アミノ酸およびこの
ような配列を含むであろう蛋白質またはボリベブチドの
部分に伴われた二次構造に依ｂ　Ｌ／でいる。

図面の簡単な記述 第１図は、本発明の教示に従って修篩したＡ−１口８’
−’１２インシュリン様成長囚子−１（ＩＧＦＩ）の不
純なＮＩ瓜たたみ込まれた混合物のＦＲＩｌｆｌ形態を
示す。

第２図は、本発明の教示に従って修飾したＡ−，ト１８
１−１１２インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦＩ）の
たたみ込まれた種の混合物の？？？離形態を示す。

発明の詳細な記述 ここで使用されているように、′金属キレート性アミノ
酸配列“なる用語番よ、固定化金属と向時的２部位結合
が形成され冑るように立体化学的に配１９ざれた少なく
とも２個の金属一結合姓アミノ酸を含有リるアミノ酸の
配列を息味りる。アミノ酸配列が、１個の金属一結合性
アミノ酸を含右する場合にＧよ、このようなアミノ酸は
固定化金属アフィニティ担体の固定化金属と配位結合を
形成し、これによって三次的゛金ｍ複合体“（固定化リ
ガンド＋金ｍ＋ペブチド）を生じるであろう。しかしな
がら、このような配列が適切に配向ずる２個以上の金属
一結合性アミノ酸を含有寸る場合には、両７ミノ酸によ
る遷移金属との同時的配位は“金属キレート“を生じる
。このようなキレート形成Ｕ、適切な立体化学的因子お
よび配置的拘束が好ましいエンタルピーおよびエント［
ｌビー効果を導く場合にのみ生じるであろう。本発明は
、金属キレート竹アミノ酸配列を含有し、従って４Ｈ脂
に対して増強されたアフィニティを有する変異蛋白質類
およびポリペプチド類を捉供りるものである。

金属１レート性配ダ１は、式：一八−１３ｘ−Ｃ，−１
）７−Ｅで表わされ、式中、ＡおよびＥは、独立的にヒ
スチジンおよびアスパルテートかうなる市から選択され
る金属一結合性アよノ醇であり、ただし、ＡまたはＥの
いずれかの少なくとも一方がヒスチジンであり、Ｂ，Ｃ
およびＤはアミノ酸類であり、ならびにｘ１ｙおよびＺ
は、金属キレート性もしくは配列含有部位および該金属
キレート性配列中で使用される特定の金属一結合性アミ
ノ酸を含む蛋白質よたはポリベブヂド分子の表面露出品
分の二次構造に依存するＯ〜３の整数を独立的に表わり
゛。ｘ１ｙおよび２の合計は、該配列含ｔｇ部位の二次
構造との組合せにおいて立体化学的葭求が、ＡとＢとが
同時に固定化金属に結合して−Ｅレート形成を起こすた
めに満足されるかどうかを決定する。金属一結合竹アミ
ノ酸が、独立的にヒスチジンまたはアスパルテー１〜で
あり、かつ金属ギレート性配列が蛋自″ｆｌｊｔ　／ｊ
　４よボリベブヂドのα−ヘリックス部分に組込まれる
場合に（よ、Ｘ＋ｙ＋ｚは３である。このような部分が
、β−ヘアピンターンである場合には、ｘ　＋　ｙ　＋
　ｚは２であり、またこのような部分が、β一鎖である
璧合には、ｘ＋ｙ＋ｚは１である。

天然の蛋白質またはポリペプチドが、適切な荀胃に入手
可能または利用可能な金属一粘合性アミノ酸を欠いてい
る鴇合には、全配列が、このような蛋白質またはポリペ
プチドの適切な佇圃に組込まれな番ノればならない。し
かしながら、＠蛋白質またはポリベプヂドが、人手１リ
能な金属一，結合Ｆ１アミノ酸を適切な位置、例えばα
−へリツクスに有づる場介には、中に１個の付加的な金
属一結合性アミノ酸を、このような蛋白質またｌよボリ
ペブヂドに、適切な配列が生じるように組込むことが必
讐である。

該金属〜結合性アミノ酸を配Ｆｉｌするために適ψｔＩ
−位置は、既知の構造を有する蛋白質類およびポリペプ
チド類については容易に決定される。構造が決定されて
いない場合に番ユ、一次構造が周知の方法により決定さ
れ、二次Ｉ１４迄がこの分野で周知の方法を用いて下記
に示されるように右効に予測されｙ１る。

適切な位置は、例えば下記に定義されるように決定して
もよい。計紳は、所望の金属ギレートについての次の事
実に単づいている： １）蛋白質リガンド中の供与Ｂ；１子が、特定の金属イ
オンまたは金属錯休に適合りること：２）２個以上の金
属一結合性原子が、該金届の特異的な幾何学的要求を容
易に満足すること＝３）蛋白質リガンドの主レート形態
が、配置的に強制的（相対的に不変的または固定的）で
あること。

天然のアミノ酸において、システイン、ヒスチジン、ア
スバルテー１・およびグルクメートの側鎖のみが、中性
のｐｌｌにおいて２価の第一列遷移金属に対して水溶液
中で明らかな結合強度を有している。かくして、 ＣｙＳ＞ｉｌ　ｉｓ＞＞ａｓＤ，Ｑｌυ〉他のアミノ酸 である。

Ｃｕ２＋に結合するリガンドのシス配慟について．　　
２＋　　　　　　２＋ （同様にＮｌ　　、ＶＯ　　およびＺｎ”’ｋ：．つい
ｒ）、金属錯体のＸ線結晶学的データは、典型的な銅一
窒索結合パラメータが、Ｃｌ−Ｎ＝１．９８−２．０２
入およびＮ−ＣｔＪ−Ｎ＝８０゜−１００゜であること
を示している。偵白賀についてのＸ線結晶学的データは
、３種の一般的に１Ａ察される二次構造の特徴：α−へ
リックス、β一鎮およびβ−ヘアピンターンを示してい
る。これらの構造化領域ｕ１少なくとも部分的に配首的
な強制の要求を満足づる。典型的な配蘭の値として、α
ーヘリックス（φ＝−５７゜、ψ＝−４７゜、ω一１８
０”）、β一鎮（φ一−１３９゜、ψ一＋１３５゜、ω
＝１８０”）Ｊ３よびβ−ヘアピンターン（タイブｌ　
ｌ、タイブｌ’　）を使用した。

ｈｉｓＪ３よびａｓｐ残駐についてエネルギー的に許′
ｆＩされる側鎖配ｄの幾何学的調査を、対応する二次構
造と結合ずるいずれのアミノ酸配ダ１が、上記の距離お
よび角度のυ１限のもとにＣｕ２＋に対して二歯のキレ
ート形成部位を与え得るかを見出すために行なった。知
距離の範囲内のキレート形或相Ｂ作用のみについてκ慮
した。すなわら、結合性残基間の介在ｆ５基の数は、Ｏ
〜４ぐあった。計幹の結果は、次の表に示してあり、（
＋）（ま、キレート形成が生じ得る場合、（一〉は、キ
レート形成を生じ得ない場合を示している。介在残基（
Ｘ）の性質は、比較的に重要ではなく、模型的に、これ
らの残基の側鎖の立体的大きさ、親水性および電荷は、
金属キレート性ベプチド相ｑ作用の強度の決定において
単に串要でないか、または二次的投割をはたすのみであ
ることが示された。

ｌ１１１ ＩＩ　ｘ　ｌ！ ｌ１ｘｘｌｌ Ｈｘｘｘｌｌ ＩＩ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　ＩＩ ＤＩ＋ Ｏｘ１１ Ｄ　ｘ　ｘ　ｔｌ Ｄ　ｘ　ｘ　ｘ　Ｉｔ Ｄ　ｘ　ｘ　ｘ　ｘ　Ｈ ＨＤ １１ｘＤ Ｉｆ　ｘ　ｘ　Ｄ ＨｘｘｘＤ ＨｘｘｘｘＤ ＋ 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 十 十 一旦、正規の二次構造のｆｆｌ域が同定された後は、こ
れらの領域内のいずれの残基が該蛋白質の表面に露出し
、従って固定化金属に容易に結合し得るかを決定する必
要がある。圓味ある領域にわたっての親水性の周期性が
、露出残基を見出す指針として使用された。多くの親水
性の物指が定義されているが、本出願において最も便利
なものの一つ（，Ｌ，構込がＸ線結晶学により決定され
ている蛋白質に基づいた特定のアミノ酸残基が内在する
か、あるいは露出づる程度に阜づく物指である（Ｋｉｄ
ｅｖａら、Ｊ．Ｐｒｏｔｃｉｎ　Ｃｈｅ＋ｇ．　　、４
、２３（１９８５）第ｍ表、特＋！Ｕ４参照）。

α−へリツクス　０１＋味ある全ヘリツクス領域につい
て、親水性モメント（方向および強度〉を５回転あたり
１８残軍のピッチ（１００゜／残襲）を用いてＢｌ　ｆ
７　Ｌた。親水性モメントが充分に大きい場合（＞１０
．３１）、残基は、３種類の等しく分布する類別、露出
、内在おＪ：び境界に分類された。

Ｂｘ−ｇｌｌＪＱ味ある令β一鎖領域について、親水性
モメントを１回転あたり２残基のピッチ（１８０゜／残
も＜）を用いて計のした。これ１よ、各残旦が゛ゝアッ
プ″またＵ″ダウン″のいずれかであるために計粋が容
易である。この場合、残基は２種類の等しく分布する類
別、露出および内在に分類された。

β−ヘアピンターン　これらの２　−　＋ｘ　ｓ．ｔ回
転ｋｌ，超二次構造であるため、一旦回転内の残Ｌ（が
同定された後に更に計算を行なう必要性はほとんどない
。金属キレート形成に適した残１．１は、ヘアピンター
ンのいずれかの側の２Ｍの残基である。これらのターン
は、蛋白質の露出表面−１二におい（、回転残基および
最隣接残基の露出を什って最も頻繁に起こる。

金属一結合性アミノ酸を配欝するための適切な位置を決
定した後、該変！４蛋白質およびポリペブチドは、当業
者に周知の方法によりＳｇｌ幣され得る。

このような変異体は、特定の固定化金属！Ｍ脂に対する
所望のアフィニティに応じて甲一の金１ｉｉ４−レート
性部位あるいは複数のそのような部位を含んでもよい。

本発明の変異蛋白質またはポリベＩチドは、化学合成に
より調製してもよい。しかしながら、二次構造を有する
伍白賀およびポリペプチドは、一般に大分子であるため
、それらを組換えＤＮＡ技術により調製することが好ま
しい。このことは、適切なｔｒｔに所望の金属ギレート
性配列を有する所望の変′Ａ偵白質およびポリペブヂド
をコードする遺伝子を構築するための常法を用いて行な
い青る。変異蛋自質およびポリペプチドを構築するため
の常法ｑ．通常のオリゴヌクレＡチド指向性部位特異的
変異生成の出允遺伝子への利用である。

次いで、変異遺Ｌ了を適切なベクターにクローン化し、
引続きこのベクターを適当な発現宿ｔ．例えば細菌（例
えばＥ．ｃｏｔ　ｒまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
　、Ｈｆｎ　（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｔｓａａ　）、ま
たは哺乳動物ｍ胞（例えばＣ１２７またはＣ　Ｉ−１　
０　）の形質転換に使用ざれる。次いで、変異Φ白質ま
たはポリペプチドが常法により発現され、下記のように
して回収される。

かくしてｙＪ，Ｑされた食異蛋白質Ｊ３よびボリベプチ
ドは、典型的には一次配列中に１〜２の修飾を右するに
すぎない。このような僅かな修飾は、天然の蛋白質また
はポリペプチドが有づる生物学的活性を保持した変異蛋
白質またはポリペブヂドを生ずることが期待ざれ、また
典型的に１よそれをζｌずる。更には、このような修飾
は、抗原的な特竹に影響しないことが用持され、また典
型的には影響しない。

好ましい実ｆＭ　（ＰＡ様の記述 例１ 変異ソマトトロピン この例は、本発明を２個の利川再能な金属一枯合性アミ
ノ酸を有する蛋白質、すなわちソマ１〜トロビンに適川
した例を示すもので、ここにおいては、少なくとも１明
の付加的な金属一粘合性アミノ酸が組込まれ、金属キレ
ート性配列を隼じＣいる。また、この例は、構造既知の
蛋白質への本発明の適用を例示するーｂのである。

ソマトトロピンは、動物中に見出される天然に産生ずる
蛋白質で、それらの＃Ｊ物成長にスＪｔｊる効果の為に
一般に′成長ボルモン類″と称されている。天然のウシ
および／タソマトトロピン類は、ヒスチジン残３１を１
９、２１および１６９位に含／υでいる。ｌ−１ｉｓ　
　！３よび口ｉｓ　　　は、両者と１９　　　　　　　
１６’） もにα−へリックス部分にあり、露出されている。

ト１１Ｓ２１４よ、匈在化している。金属一Ｖ．合性ア
ミノ酸は、以下の方法に従ってウシおよびブタソマ１〜
１・［）ビン類に組込まれ、金属キレート性部位をイｊ
−４６変異ソマトトロピンをごト成した。固定化金属ア
フィニティ担休に対する増強ざれた？フイニティを、本
発明に従って１成された変異体について第１表に示して
ある。

変異遭伝了 ＳｅＯｂＵｒｏらのＤＮＡ，２、３７頁（１９８３）に
記載されている１３　Ｇ　＋−１およびＰ　Ｇ　Ｉ−１
構造遺伝子の第１表中に示した位ｄの残基を、オリゴヌ
クレオブードー指向竹、部位一特異的変異生成により変
史した。オリゴヌクレオチド変異〈Ｆ或ブライマーは、
ｖＪ造名テある八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
，　Ｉｎｃ．（ｒｏｓｔｅｒ　ｃｉｔｙ，　Ｃ＾）によ
り与えられた方法に従つてアブライドバイオシステムズ
ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。該変異生成ブラ
イマーの配列は次のとおりである。

下線は、天然の残基を所望の残基に変更ずるコドンを示
す。

テンプレートＤＮＡとして使用するＢ　Ｇ　Ｈ　ｍ伝子
は、Ｍ１　３ｍｌ）１　８ベクター（　８ｅｔｈｅｓｄ
ａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｇａｉ
ｔｈｅｒｂｕｒｇ，　ＨＤ）中にＥｃｏＲＩ／ｌ−１ｉ
ｎｄｌｌ［断片としてクローン化されたＳｅｃｂａｒｇ
らに記載ざれているＢｘ　Ｇ　ｌ−１　ｍ伝子からなる
。また、同様にテンプレートとして用いたちのｑ、１９
８６年９月３日発行のヨーロッパ特め出願第１９３，５
１５弓に記載のＮ−アラニル、バリン（１２６＞１３Ｇ
Ｈ遺伝子であり、ＪＥ　Ｃ　Ｏ尺１／｝ＩｉｎｄｌＵ断
片としてＭ１３ｍｐ１８ベクター中にクローン化されて
いた。テンプレートＤＮＡとして使用されたＰ　Ｇ　Ｈ
　ｍ伝了は、ヨーロッパ特許出願第１　９　３　．　ｂ
　１　５　Ｆｉに記載されたＮ−アラニルＩ”　Ｇ　ｌ
−１遺伝子であり、ＥｃｏＲＩ／口ｉｎｄ［［［断片と
してＭｌ　３ｍｐ１　９　（ＢＲＬ）中にクローン化さ
れていた。Ｐ　Ｇ　ｌ−１　ｍ伝子の所望の位置での変
異生成に先立って、後の発現プラスミドへのナブクロー
ン化を容易にするために、遺伝子の５′末端を変異さｉ
ｉてＮｃｏ　Ｉ部位を創成した。この変異生成のために
使用したプライマーは、上記と１１１１様に合或し、次
の構造を右している。

ＮＣＯ　Ｉ部｛＆｛Ｊ加のための変異生成方法は、Ｋｕ
ｎｋｃｌ　（　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．ｓｃｉ
．　　、８　２、４２２頁［１９８５］）により記載さ
れている。すべての！，ＩＩ限Ｍ索および修ｆｓ酵素は
、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｔａｂｓ　（Ｂｃｖ
ｃｒｌｙ，　ＨＡ　）から購入し、Ｍ造者のｍ針に従っ
て使用した。

該変異生成は、八ｍｃｒｓｈａｍ　（八ｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ　ｌｌｅｉｇｈｔｓＩＬ）のオリゴヌクレオチドー指
向インビトロ変異生成システム（　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｉｎ　ｖｉｔｏｒｏ　
Ｈｕｔａｇｃｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｃａ＋）を、製造省
の指示に従って使用することにより実施した。変異生成
に続いて、正の変異遺伝子を、ＩＪｎｉｔｅｄ　Ｓｔａ
ｔｅｓＢｉｏｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ　（Ｃｌｅｖｃｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）のＳｅｑｕｃｎ
ａｓｅ　”Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定シスデムを製造老の指示
に従って使用してＤＮＡ配列分析により同定した。次い
で、変異遺伝了を、Ｆ　Ｃ　Ｏ　Ｒ　Ｔ　／１−１　ｉ
　ｎ　ｄ　１１断片としてＥ．ＣＯＪ！　＋発現ベクタ
ー１）ＭＯＮ２５３４中にクローン化した。ブラスミド
ＤＭＯＮ２５３４は、転写停止因子としてタンデム１ａ
ＣＵ■５プロモータがｐＢ　Ｇ　＋１　ａｘ−１のＨｉ
ｎｄｌｌ１部位に挿入ざれたｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈ　ｅｘ−１
（　ｓｅｅｂｕｒｇら）のＥｌ体である。タンデム／ａ
ｃＬＩＶ５ブロモータのＥＣＯＲＩ断片としての配＋１
１は、Ｂｏｇｏｓｉａｎら（Ｎｕｄｃｉｃ　Ａｃｉｄ　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１５、７１８５　［１９８７］）に
記載されている。

該ＩＥ　ｃ　ｏ　ｒ＜　Ｉ断片を、該ＥｃｏＲＩ突出部
分を埋め、ｌｌｉｎｄ［［リンカーを結合リることによ
り１ｉｎｄｌｌｌ断片に変換した。これらの操作は、１
−１　ｒ　ｎ　ｄ　Ｉ［［断ｊ１の末端に見出される配
列を生戒した。上流側の末端においては、埋込まれたＥ
　Ｃ　Ｏ　Ｒ　Ｉ末端（Ａ八ＴＴＣＴ−−−）に連結す
６Ｈｉｎｄｌｌリンカー（　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　−ｒ
　）は、配列Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｔ’　ｒ　Ａ　Ａ　Ｔ’
　Ｔ　Ｃ　Ｔ　−−一を生戒し、１１および１２イＱの
ＣＴ番よ、元のｊａｃＵＶ５ブロモータ断片由来のＡｆ
ｕＩ部位の右半分を示している。下流側末端において、
生成した配列は−−ＡＧＡＡ丁Ｔ−　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　
Ｔ　Ｔであり、−１２および−１１位のＡＧは、元のＪ
ａｃｔＪＶ５プロモータ断片のＡｊ！ｕＩ部位の左半分
を示している。

更に、ｏＭＯＮ　２　５　３　４は、Ｓ１ヌクレアーゼ
を用いた突出［：ｃｏＲＩおよび口ｉｎｄｌｌｌ末端の
消化ならびに１−４０ＮＡリガゼによる平滑末端の連結
により除去されたＥｃｏＲＩ部位を ｐ　Ｐ　Ｇ　１１ｏｘ−１のｐｔｒｐｌｉ片５′末端に
、およびｔ−１　ｉ　ｎ　ｄ　［１部位をタンデムＩａ
ＣＵｖ５ブロ〔−タ／オペレータ断片の３′未端に有し
ている。プシスミドｐＭＯＮ５５８５は、１９８７年１
０月１４日発行のヨーロッパ特許出願番号第２４１．４
４６号に記械ざれているようにＦ．Ｇｏ１ｉｒｅＣＡブ
ロモータ、Ｇ１０Ｌ配列および丁，転写停止配列を含む
ｐ　Ｂ　Ｒ　３　２　７　７ラスミドである。

発現プラスミド中にクローン化された変異Ｒ　Ｇ　Ｈお
よびＰＧＩ−｛遺伝子は、Ｅ．ｃｏｔ　ｔ株Ｗ３１１０
　（ＡＴＣＣ＃３９９３６）内に挿入される。

細胞破壊および包接休の単離 適当な猷の凍結細胞ペーストを５℃に解凍させた後、１
２０ｇの細胞ベース１〜をＵｌｔｒａ　Ｔｕｒｒａｘｌ
ｌ痒器を用いて注意深＜４８０ｍの冷水中に懸濁した。

冷却した細胞懸濁を、４２０−５６０Ｋ！Ｉ／α２圧に
設定し、あらかじめ冷却した｝ｌａｎｔｏｎＧａｕｌｉ
ｎホモジナイザーに４回通した。得られた破＃ＩＩＩＩ
胞の懸濁液をＢｅｃｌｖａｎ　Ｍｏｄｅｌ　Ｌ　８遠心
分離器を使用して、５０，ＯＯＯＸ（１（４　５Ｔ　Ｉ
ローター中で２５．ＯＯＯｒｐｍ　）にて３５分間遠心
分離にかけた。透明な上澄液を流出させ、残留づる褐色
のベレットを細い水流で勢いよく洗浄して不要な細胞破
砕物の上部粘性病を除去した。該ベレットを水中に懸濁
し、２１ｉ１目の遠心分離および洗浄を行なった。残留
する物質を遠心管から機械的にかき集め、合せて４．７
ｇの湿った包接体を１ク、これを後の使用のために−８
０℃で保存した。

ソマトトロピンの酸化およびたたみ込み４．０ｇの枳の
包接体を３００ｍＬの冷水中に旧Ｅｒａ　Ｔｕｒｒａｘ
ｔ！ｉ　ｆｆ器を川いて懸濁した。該懸濁液の体積を、
更に水を加えて３７５１１１に増した。次いで、新たに
調製した冷たい脱イオン化尿素溶液（７．５Ｍ）４２５
ｓｌｆ懸濁液に加えて尿素約４Ｍの混合物を冑た。よく
攪拌しなからｐｌｌを２．５Ｍ　　ＮａＯＨ溶液の滴下
により１１．３に調整した。Ｎ　ａ　Ｏ　Ｈを添加する
間にほとんどの懸濁された包接体が溶解し、淡黄色の溶
液を得た。この溶液を、開放容器中で５℃にて４８−７
２時間勢いよ＜　ｌ　４Ｙシ、所望の伍白！１の再たた
み込みを起こさせた。数回シスデイン（９．７ＩＩｇ、
０．１＊Ｈ）を混合物に添加し、これにより再たたみ込
みの時間を約半分に短縮した。残留する不溶物を除去す
るために、再たたみ込みされた混合物を５０，００　０
Ｘ（１　（Ｂｅｃｋｍａｎ　４　５　Ｔ　Ｉローター中
で２５，０００ｒｐｍ）にて超遠心分離にか番ノた。透
１φｌな黄色上澄液をデカン１−シて取出し、次いで粘
Ｕのために′ｇＡ製するか、あるいは−２０℃にて保１
７　Ｌた。

不純な再たたみ込みされた混合物の試料２Ｉｔ１を、有
川性をもつに充分な稈度に強く結合寸るか否かを測定す
るために小型の銅一負荷金属−アフイニティ力ラム上で
試験した。そうである場合には、調製用金戊アフィニテ
ィカラムを精製に使用し、そうでない場合にはイオン交
換クロマトグラフィを使用する。

官能化’Ｍ　Ｊｉｆｆ　（７）　ｉｌｌ　！！１トリス
アクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　）　Ｇ　Ｆ　２　０　
０　０Ｍを蒸留水で繰返し洗浄して緩衝剤および保存剤
をすべて除去し、次いでサクションにより乾燥させた。

このわずかに湿った担休約１００ｇ（〜１０Ｑｌ）を、
８０ｌしのジクリムおよび１００ｍｌの新たに［１した
ｌ．／ＩＭ　　ＮａＯｒ−ＩＭ液を含む溶液中に懸濁し
た。ＩＱ後に１００１１１１のジエチレングリ」一ルジ
グリシジルエーテルを添加し、該混合物を３５℃にて１
６時間ゆるやかに１！２拝した。′Ｉ？Ｉ製ジエチレン
グリコールジグリシジルエーテルは、ＧＬＪ．　Ｉｄｅ
ｄａおよびＯｋａｈａｒａ　　（　Ｓｔ／ｎｔｌｌＱｓ
ｉｓ　，　６　４　９［１９８５］）の文献方法により
調製した。該活性化担体をジグリム／　Ｈ２　０　（　
ｂ　Ｏ／　５　０　）により洗浄し、次いで蒸留水にて
過剰のエボキシドおよびＰＡＭを除去した。洗浄し、サ
クションにより乾燥された旧体は、ＩＬｉｔ　Ｊｕｔ　
Ｉ１１５たり７０ピコモルの活性エボキシド基を右づる
ことが示された。活性化レジンは４℃にて保存し、通常
は、調製後２４時間以内に使用した。

４二レートの固定化 活性化トリスアクリルを蒸留水で洗浄し、サクションに
より乾燥さぜた。この活性化ゲル約１００ｇ（〜１００
＋ａＬ）を、ρＨ　＝１０．　５−１　１．　０に調製
した１．ＯＨＮａ　　ＮＨ（ＣＩ−Ｉ２Ｃｏ）２１００
１１中に懸濁した。この混合物を６５℃にて２４時間ゆ
るやかに１！！痒し、次いで蒸留水にて繰返し洗浄して
過剰のりガンドを除去した。該官能化＆ｌ脂をエタノー
ル／水（２５／７５ｖ／ｖｌ中にｎ℃にてりぐに使用で
きるように保在した。チオサルフエー１・を用いた滴定
は、エボキシド込の不在を示し、従ってエタノールアミ
ンによるキャツビングは不要とみなされた。サクション
により乾燥したゲル１０ｍを、過剰ｈ｝の５ＱｍＨＣｕ
　＜Ｃ；ｔｏ４）２で飽和し、次いでＩＯＯＩＬの蒸留
水、１００１１１の５０＋｝ｌイミダゾール（ｐｌ＋＝
７．０＞，Ｊ３よび最後にて１００ｅＬの１−１２０に
て注愚深く洗浄した。次いで、結合した銅を過剰Ｍの５
０ｉＨ　　Ｎ８２Ｈ２ＥＤ丁Ａ（１）ＩＩ−７．０）に
て除去した。比較のために銅一Ｅ　Ｉ）　Ｔ　Ａのａ準
化ＷＪ液を仙川して、金銅組成を分光学的に測定して０
．４３ミリモルを拐た。

金属アフィニテイカラムの溶出プロトコールガラス力ラ
ム（２．２Ｘ２１ｚ、８０１１１＞に洗浄したＩＤＡ−
トリスアクリルゲルを注ａ深く充填し、次いで４００ｉ
Ｌの５０−Ｈ Ｃｕ　（Ｃ１０４）２　　（ｐｌｌ＝＝４．５）をｔ１
荷した。

該官能化ゲル昏よ、銅イＡンをほぼ定ｆｉｌ的に吸着し
た。この銅カラムを１００ｍｌ４　　ＮａＣＩにて洗浄
し、次いで解放緩衝液（１００＋＋Ｈ　　Ｎａ−７セチ
ルヒスチジン、５００ｍＨ　　ＮａＣ！、５０ｌＨＮａ
Ｈ，，ＰＯ４、ＤＩＩ＝７．０）にてＩＴＩＩＩｉ化し
、最終的にｆ〕荷緩衝液（１１１ＨＮａ−７セチルヒス
チジン、５００ｓＨ　　ＮａＣ１、５Ｑｉ｝ｌＮａｐ２
ＰＯ４、Ｉ）ｌｌ＝７．０）にて平衡化した。

ろ過を行なった不純な再たたみ込み混合物（〜８００ｉ
Ｌ）をカラムに５　ｍｌ／分で送り、次いで該力ラムを
２４０ｔＬの負荷緩ＩＩ液で洗浄した。該カラムを２．
５ａＬ／分の流速で環境温度〈２３゜〉にてＮｃＸ−ア
セチルヒスチジンの線形勾配（１−＞１００ａｌｌ）を
使用して５００分間で展開した。

カラムからの溶出液は、３ａｍの透過長セルを備えたκ
ｒａｔｏｓ　Ｈｏｃｌｅｌ　７　５　７分光光度計を使
用して２８ＯｎＩ１（０．２−２．０ＡＬＪＦＳ）にて
連続的に監視した。分画（　２　５　ｍｌ）は、Ｇｉｌ
ｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　　２　０２フラクションコレクタ
を使用して集めた。操作完了後、該カラムを５０＋ｉＨ
　　Ｎａ２ＩＩ２ＥＤｒＡ（ｐｌ＋＝７．０＞、次いで
５　０　ｍＨ　　Ｎ　ａ　０　１−１を用いて洗い出し
た。該カラム仙、１００＋Ｈ　　ＮａＣ１（　２　４　
０ｇ＋Ｉ．）　、負荷緩衝液（２４０１Ｌ）および最終
的に１００１８　　ＮａＣ１　（２４０１１）ｌ，：よ
る洗浄の後にただちに再生される。ソマトトロピンを含
右する分画を集めて合せ、１．７ａｗ／ａＬの山自質を
含む溶液２５０１１を得た。この段階における口ｉｓ，
，，−ａｖｂ３７の分析川逆相ｔｌ　Ｐ　ｌ−　Ｃ（Ｖ
ｙｄａｃ　　ＣｔＢカラム、 ト１　２　　０　／　Ｃ　口　３　　　０Ｎ＋０．　　
　１　　％　Ｃ　「　３　　Ｃ　Ｏ　２　　ｌ１　）に
よる典型的な分析は、次のとおりに示される（カラムＡ
）。

蛋白￥ｆｌ　　　　　　　　　　　　　　　Ａ　　　１
１Ｊソマトトロビンｔｔｘ措体十異性形態　９Ｇ．６％
　９８．２％ソマトトロピン関連オリゴマ−　　　２．
５χ　１，５ｘ外来蛋白ｆｆｉｌ　　　　　　　　　　
　　　０．９Ｘ　　Ｏ．３Ｘソマトトロピンビークの後
方１　５−２　０％を犠牲にずると、オリゴマー含有量
は１．０−１．５％に但減された。ｇ製ソマトトロピン
を＊ｍｂ、同様なカラム（Ｆｒ４浄化され再生ざれてい
る）に再負荷し、若干純粋化した生成物（上記のカラム
Ｂ）を９４％の収率で得た。

この溶出１ロトコールの変法を使用した。我々の先の′
３：験においては、ＰｈａｒｌｌａＣｉａのキレーティ
ングヒファ口−ス６　Ｂを仙川し、このゲルは洗浄が困
難であり、かつ流速がυ１限されている。より大聖カラ
ム（０．５−２．０１）用に、我々はＰｈａｒｉａｃｌ
ａの１レーティングセフ７ロースフ７ストノ０ウも使用
した。クロマ］一グラフィ的な分解能は若干低下したが
、溶離ｍ衝液としてのイミダゾール（０．５−一→４５
１Ｎ）の使用、または０．５Ｍ　　ＮａＣ１に代えての
１．０ＭＮａＣＩの使用が、ある場合にはより釘都合で
あることが見出された。より強く結合する変異体、ＩＩ
　ｉ　ｓ，，６１ｆ　ｉ　ｓ３ｏ−ａｂｖ３７および口
ｒ　ｓ　　ｌ−｛　ｉ　ｓ１５−ａｖｂｓＴは、溶離剤
としてイミダゾール（１０ｏｍＨ）を使用してより容易
に精製された。

限外ろ過、濃縮および凍結乾燥 精製ソマトトロピン溶液（２５０−５００ｍｌ−）をＹ
Ｍ１０膜を［した４００ｓ＋Ｉ−１１拌＾−ｉｃｏｎ限
外ろ過セルを使用して休積３０−４０一Ｌに濃縮した。

金属アフィニティ力ラムを使用した場合には、濃縮に先
立って蛋白質貯留物中に４０＃ｇの固体Ｎ　ａ　２　Ｈ
　２　Ｅ　ｌ）　ＴΔ−２１２０を溶解させた。５ｍＨ
　　Ｎ　ａ２，　ｃｏ３（Ｄ’＝　１　０　．　０　＞
を使ｍし−’ｃ蛋白質溶液を体拍’１００ｍＬに希釈し
、乙いもでＮ２辻下で３０−４０ｓＬに角濃縮した。希
釈および再濃縮を更に３回繰返し、力〜ボネート緩ｗｉ
液中の精製ンマトトロビン約３０ｌ［を得た。該溶液を
、体８！ｉ１００ｍｌにまで増大させるに充分な水と共
に凍結乾燥用フラスコ中に入れた。該溶液を凍結させ、
Ｖｉｒｔｉｓ凍結乾燥装Ｅ　（　Ｆｒｅｃｚｅａ＋ｏｂ
ｉｌｃｌ　２　）に一夜設評した。得られた綿毛状白色
固体の重徂測定し、密封容器中にて−２０℃で保存した
。

匙二Ｌ１ ｐＳＴ ａｖｂＳＴ ｍｌｂｓｒ ６．２ ６．３ ６．４ ＩＩ　ｉ　ｓ２６Ｈ　ｉ　ｓ３ｏ−ａｖｂｓＴｄ４９．
９ ４０−旧キレート＋２〉 ａ　番号付けは、ＳｅｅｂＵｒＯらのＤＮ八、２、３７
頁（１９８３）のものである；　ａ　ｖ　ｂ　Ｓ　Ｔ　
Ｇ；ｔウシＡｌａ　　Ｖａ！　　　−ソマトトロピン、
ｍ　１　ｂ　Ｓ　Ｔは、ウシＭｅｔ　　ｌｅｕ　　　−
ソマトトロビンおよびｐＳＴはブタ八Ｉａ−１ソマトト
ロピンである。別途特定しない限り１位のアミノ酸は、
該蛋白質の第１の残基である。

ｂ　ノｒ結合性比較蛋白質。｝−１　ｉ　ｓ　，５は、
Ｒｕ　　Ｓｅｒ　　　−ｐＳＴにおいて３＋ −Ｒｕ　（Ｎ口　）　　によりブロックされている。ル
テニウム化法は、＾』．ＡｘｕｐらのＪ．＾ｍｅｒ．ｃ
ｈｅｍ．ｓｏｃ．　１ｉ　Ｑ、４３５ｒ４（１９８８〉
を参照。

ｃ　　Ｓｉｕａ　Ｃｈｏｓｉｃａｌ　Ｃｏｌｐａｎｙよ
り購入した。

ｄ　　１０００分間のＮａ−アヒチルヒスチジンの１−
一→２００ＩＩ８線形勾配。イミダゾール（よ、これら
の蛋白質に対してより良好な溶離剤である。

ｅ２．Ｏｔｔｙの蛋白質をＰｈａｒｌａＣｉａのキレー
ティングセファロース６Ｂの銅一負荷１０ｇ＋Ｌカラム
（１．ＯＸ１３．Ｏｃｔ＞にかけた。Ｎ（ｘアセチルヒ
スチジンの線形勾配（１−一→１００ｉＨ）により、０
．５１１／分の流速で５００分間でＦＢ離した。Ｉ！衝
液は、１０００ｓＮＮａＣ！および５　０１８　　Ｎ　
ａ　Ｈ　　Ｐ　０４も含み、ａｌｌ＝７．０であった。

例２ 変異ソマトメジン この例は、利用ｉＩＴ能な金属一結合性アミノ酸を含有
しない蛋白質、すなわらソマトメジンＣに対する本発明
の適用を例示するもので、これに２個の金属一結合性ア
ミノ酸を組込み金属キレート性配列を生じせしめた。ま
た、この例は、３次元構造が決定されていない蛋白質に
対する本発明の適用をも例示するものである。

ここにおいて使用されたソマトメジンＣまたは６インシ
ュリン様成長囚子−１“を、ＩＧＦＩと称する。プロイ
ンシュリンおよびインシュリンに加えＩＧＦ２は、実質
的に同じ方法で修Ｓされ臀、実質的にＪｒ．Ｊじ結果を
得られるものと］１　ｔ！＋される。

例えば、前述の方法に従ってｒａＦｔのび−ヘリックス
部分に局右するものと予想されるＡｌａ８および八Ｓｐ
１２は、両者ともに以Ｆの方広に従ってヒスチジンにａ
換される。Ｈ　ｔ　ｓＢ　ＩＩ　Ｉ　Ｓ　１２］Ｇ１１
変異体の増強ざれたアフィニＴイは、第２ａに示してあ
る。α−ヘリックス部分が１７位までｉるものと予Ｗ！
されることから、８位よりむしろ１６位の残基がヒスチ
ジンでｆｉｌされる。

細菌　の選択および出発プラスミド 使用した金株は、ＪＭＩＯＩ　（Ｓｔｌｐ　Ｅ，ｔｈ　
ｉ、（　１　ａ　ｃ　−　ｐｒ　ｏ　Ａ　Ｂｘ　）、［
Ｆ’　　　ｔ．ｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ，ＪａｃｌａＺ
　　Ｍ１５］（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ１Ｊ
．Ｖｉｅｉｒａ１Ｊ．ＨｃｓｓｉｎｇのＧｅｎｅ，　３
　３、１０３　［１９８５１　）および８Ｗ３１３　（
ｄｕｔ，ｕｎｇ、ｔｈ　ｉ−１、ｒｅＩＡ１ｓｐｏＴ１
／Ｆ’　　　　ＩＶｓＡ）　　（ｒ．八．Ｋｕｎｋｃｌ
の、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　　　８
　２、４８８　［．１９８５１）であった。プラスミド
ρＭＯＮ２４６４は、ｐＢ　Ｒ　３　２　７　（　１．
．ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ　，　Ｌ．Ｃｃｒｖａｎｔｃ
ｓ　１八．Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ　　，　　Ｘ．Ｓｏ
ｂｅｒｏｎ　　，　　＾．Ｂｌａｎｃｏ、Ｙ．Ｈ．κｕ
ｐｅｒｓｚｔｏｃｈ−Ｐｏｒｔｎｏｙ　，　Ｆ．Ｂｏｌ
ｉｖａｒのＧａｎａ、１３、２５［１９８１］）のレブ
リコンを含右し、テトラサイクリン遺伝子の部分に代え
て発現力セッ１−が仲人された。使用したブロモータ６
よ、［Ｅ．ｃｏｆｉのｒａｃＡ遺伝子から誘導され、使
用したリポソーム結合部位は、ファージＴ７の遺伝子１
０山来であり（Ｐ．０．０１ｉｎｓ　，　Ｃ．Ｓ．Ｄｅ
ｖｌｎｅ，ｓ．＋＋．　ＲａｎＯＷａｌａ，κ．Ｓ．κ
ａｖｋａ　，　Ｇｅｎｅ．　７　３、２２７［１９８８
］）、遺伝子は、８および１２イＱにおいてヒスチジン
首換を伴うアラニルーＩＧＦ１をコードしている。遺伝
子の下流側は、 ｐＥＭＢ１１８山来の約５００ＰＡ基対の配列（Ｌ．Ｄ
ｅｎｔｅ　，　Ｃ．Ｃｃｓａｒｃｎｉ，　Ｒ．Ｃｏｒｔ
ｅｓｅ　，　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１
ユ［１９８３］）である。この配列は、ｌｉ鎖ファージ
ｆ１の複製起点を含んでいる。

フ７−ジＲ４０Ｂに感染したｌｌＩ胞内で、単鎖゛ゾラ
スミドＤＮＡをファージ粒子内にパッケージした。

１）ＭＯＮ２４６４において、ベーターラクタマーＩ！
遺伝子の配列中のＥｃｏＲＩ部位およびｐｓｔｆｉ部位
は、インピト０法により除去されている。

ブラスミドの構築 ｊ′ラニ／Ｌ，ｉＧＦ１は、ｌ）ＭＯＮ２４４６がら全
［胞蛋白質の約１０バーセン１−の水準で産生されるこ
とが見出ざれた。該蛋白質は、不溶性の包接体から容易
に回収され得、また活性な配置に再たたみ込みされ稈る
。金属結合部位を含むＩＧＦＩ変異体の産生（よ、アミ
ノ酸の変史を特定ために必要なコドンにおいてのみ、］
一ト配列でＤＭＯＮ　２　４　４　６とは異なるアラニ
ルーＩＧＦ１変異体の構築により行なった。

方法Ａ ８および１２位におけるヒスチジン置換を伴うアラニル
ーＩＧＦ１をフードするρＭＯＮ　２　４　６４のＪＩ
４築をここに記述する。ｐＭＯＮ２３６３中のＮｃｏＴ
およびＰｓ　ｔ　Ｉｆｆ位間のＤＮＡを、アフニルーＩ
ＧＦ１３１ｉ伝子のＮ末端１６〕ドンをコードする相補
的な合成オリゴマーで置換した。これがＮｃｏＩおよび
ＰＳｔＩｉ’！ＩＩの間のＤＮＡにρＭＯＮ　２　４　
４　６が看するより９ｌｌ！Ｉ多い塩基を有するＩ　Ｇ
　Ｆ　１変異体の遺伝子を含むためｐＭＯＮ２３６３の
Ｄ　Ｎ　Ａを使用した。ＮｃｏｌおよびＰｓｔ１部位間
におけるＤＭＯＮ２３６３のＩ）　Ｎ　Ａのより短かい
合成１）　Ｎ　Ａによる煽換は、所ＴのアラニルーｒＧ
Ｆ１変異体をコードする組換えブラスミドの１６１定を
許容した。ｐＭＯＮ２３６３のＩ）ＮＡ　１マイクログ
ラムを制限酵素ＮＣＯ■およびＰｓｔＩにより３７℃に
て少なくとも２時間次のＭ衝液中で処理した：１０ｍＮ
トリス・ｌｌＣｊ　（ｐｌｌ７．　５）、５ｍＨ　　Ｍ
ａＣＪ　　、１５（ＣＭ　　ＮａＣｊ！．該ｉｌｌ限酵
素反応混合物にＮａＯＡＣを最終体積がＱ．３ｌＬで最
終１ｉｆｆｌｔ３０ＱｍＨとなるよう添加した。該試料
を、それぞれ０．Ｌｄの水飽和フェノールおよびクロロ
ホルムＣ抽出した。水性相を除ムし、これにＱ．７ｍｌ
−の９５％エタノールを加えて混合した。

合成オリゴヌクレオチドは、＾ｐｐｌｉＯｄＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｓｓ　　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装直を使用してホスホジ
エステル化学により’ＩＪＴｉした。これらのオリゴヌ
クレオチドの配列を下記に示す： これらのオリゴヌクレオチドをＩｌ！２塩のためにｄｕ
Ｐｏｎｔ　Ｎｅｎｓｏｒｂ力ラムに通した。ポリアクリ
ノレアミドグルからのオリゴヌクレオチドの精製は不要
であった。約１　０００ピコモルのオリゴヌクレオチド
を水中に再懸濁させた。それぞれ”１００ピコモルの相
補的オリゴヌクレオチドを、次の緩衝液中で体積５０マ
イクロリットル中で混合した：６．６ｍＨトリス（１）
ｌ｛７．　４）　、６．　６ｍＨＶＱＣＪ　　、６．６
ｍＨ　　ＮａＣｊおよび５＋ａＨジチオスレイトール．
該試料を沸騰水中に置き、室温まで冷却してオリゴヌク
レＡチドのア二一リングを行なわせた。アニール化オリ
ゴヌクレオチド混合物１０ピコモルを、エタノール中の
Ｎｅｏ　ＩおよびＰｓｔＩ処理ｐＭＯＮ２３６３ＤＮＡ
の半分の分別量に加えた。この試料と、ｐＭＯＮ２３６
３ＤＮＡの他の半分との両者を冷却し、ＤＮＡを沈殿に
より集めた。乾燥させたベレットを２０マイクロリット
ルの連結ｍ＊液中に再懸濁した＝２５−Ｈトリス（１）
１１８．０）、１０＊Ｈ　　Ｍｒ；ＪＣＩ２　、０．２
１スペルミシン、１１Ｈジチオスレイトールおよび１ｍ
Ｈ　　ＡＭＰ．これに１０１Ｉ１位のＴ　４　Ｄ　Ｎ　
Ａリガーゼを加え、該反応混合物を１５℃にて一夜熟或
した。

方法１３ ｐＭＯＮ２４６４の単鎖化ＤＮＡを単鰭した。

ｐＭＯＮ２４６４を保有するｒ＝，ｃｏｔ　ｉ株ＢＷ３
　１　３の培養物を、１ミリリットルあたり２００マイ
クログラムのアンビシリンを添加した２ＸＹＴ培地《１
６グラムのトリプトン、１０グラムの鮮母抽出物、５グ
ラムのＮａＣＪを１リットルあたりに含む）中で成育さ
せた。Ｋｌｅｔｔ　４１　１１０において、フ７−ジＲ
　４　０　Ｂ　（　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｃ）を最終！１
１度が１ミリリットルあたり１０（９）個のファージと
なるように加えた。同時に、ウリジンを最ｎ濃度が−１
あたり０．２５マイクログラムとなるように加えた。該
培養物を３７℃にて一夜振とう培養した。培養物４−６
ミリリットルを、Ｉｔ胞除去のために遠心分離にかけた
。上澄液にフ？−ジ沈殿用Ｉ１衝液（２．５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊ！、１０％Ｗ／ＶポリエチレングリコールＭ６００
０、０．　１　５＋＊Ｈ　　ＥＤＴＡ　（ｐｌｌ７、Ｏ
）、１ミリリットルあたり１０マイクログラムのすい臓
ＲＮａＳｅ）を４分の１休栢加えた。これらの試料を４
℃にて一夜保存した。１ｔ％養物の上澄液１ミリリット
ルからフ７−ジを遠心分離により集め、５０マイクロリ
ットルのブＯテアーゼＫｉｔ’化緩衝液（１０ｓＭトリ
ス−ＨＣＪ　　ｐｌｌ７．　／Ｉ，　０．　　１ｎＨＥ
ｌ）ＴＡ，０．２％サルコシルおよび０．０５■／ｓＬ
プロテアーゼＫ）に再懸濁した。該試料を６５℃にて１
時間熟成し、次いで氷上で冷却した。

最終澹度が４００１８となるようにＮａＧ１を加えた。

該試料をそれぞれ２分の１体積の水飽和フェノールおよ
びクロロホルムの存往下で回転隨１￥した。水性相を取
り、核酸を２体積の冷エタノールにより沈殿させた。乾
燥させたペレットを、元の培養物上澄液４ｉＬあたり１
０マイクロリットルの水に再懸濁させた。

単ｇｌＤＮＡは、フ７−ジＲ４０８よりも主としてブラ
スミドから誘導された。株ＢＷ３　１　３内でのプラス
ミドの成育によるウラシルの取込み昧低い水準であった
。このことは、ウラシルを含有しないインどト［１合Ｊ
［補鎖の好適な選択を可能とした。この鎖の合成１用始
のために合成ＤＮＡオリゴヌクレオブドを使用した。こ
のオリゴヌクレオチド（　５　’　Ｇ　Ｃ　Ａ　Ａ　Ａ
　Ｃ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　ＧＣ
ＡＴＧＡＡＣＡＡＧ３’　）の配列は、単銀テンプレー
トの配グ１の相Ｍ鎖とはＩＧＦ１１ｆ伝子のコドン１６
の位叙において異なっている。このオリゴヌクレオチド
の配列はヒスチジンを特定し、一方テンプレートはその
位訂において７エニルアラニンを特定している。

このオリゴヌクレオチド５０ビコ七ルを、２５ｌｌＨト
リス（ＤＨ８．０）　、１　ｏｓｌ’ｌ　　ＭｇＣＪ２
、０．２Ｍスペルミシン、ｌ　ｓＭジチオスレイトール
および１１ＨＡＴＰの存在下で、ポリヌクレオヂドキナ
ーゼにより３７℃にて３０分間、次いで６５℃にて５分
間処理した。１０ピコモルのＡリゴヌクレオチドを上記
のように［１した４マイクロリットルのデンプレートと
混合した。これらをＨｉｎ！ｍｌ液：６．６１Ｈｌ−リ
ス（１１１１７　．　　４　＞　　、６．６ｌＨ　　ｆ
ｖｌｃ！　　、６．６ｍＨ　　ＮａＣ１、５ｍＭジチオ
スレイトールで最終体積１０マイクロリットルとした。

試別を入れた試験管を沸騰させたビ一力−の水中につる
し、室温まで冷却させた。

これによりオリゴヌクレオヂドをデンプレートにアニー
ルさせた。該冷加混合物に９マイクロリットルのＮ丁Ｐ
混合物：Ｈｉｎ１１１１ｉ液、各１ｚ　１　１Ｈ（７）
４種のデオキヌクレＡチド三リン酸、および１ｌＨのｒ
ＡＴＰを添加した。これらの試料に、それぞれ３単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーピおよび Ｅ，ｃｏｔ　ｔのＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片
を添加した。これらのＭ素は両省ともにＢｏｅｈｒｉｎ
ｇｃｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｍから入手した。次いでこれら
の試料を１５℃にて一夜熟成ざ吐た。

プラスミドの１１胞への導　およびｔ！ａ胞のスクリ−
ニング １：．ｃｏ７ｉ　　ＪＭ１０１１１ｆ！Ｔの培養物を外
来ＤＮＡの取込みに有能とした。該細胞を３７℃にてＬ
Ｂ１８地中で育成した培養物から選択した。次いでそれ
らを、培養物の係積の１／２の５ＱＩＨＣａＣｊ２に再
懸濁した。氷上に３０分間保存した後、ａｌｌ胞を遠心
分離により集め、細胞ペレットをｅｉ物体積（７）　１
／　１０（７）　５　０　ｍＨ　　Ｃ　ａ　Ｃ　１　２
に再懸濁した。４℃にて半時間ｉＦ！養後、該試料を４
２℃にて１分間培養した。１ｅのＬブロスを加え、次い
で該試料を３７℃にて２時間培養した。該細胞を遠心分
離により集め、２００１！Ｆ／Ｉｔのアンビシリンを含
む寒天プレート上に展ＩＦｉｌシた。３７℃での一夜の
１８Ｋ＆後生育したコロニーを、やはり２００ＩＩｇ／
ＩＩＬのアンビシリンを含む液体培地に摘み取った。プ
ラス互ドＯＮＡをこれらの培養物中の細胞から標準方法
により単離し、制限エンドヌクレアーゼにより処理した
ＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析に
かけた。親ＤＮＡに代えて合成ＤＮＡの存在を示す大き
さのＤＮＡ＆ＩＩ限断片を含むことが見出されたプラス
ミドＤＮＡを、所望の組換え体の候補として選択した。

これらのブラスミドのＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびｐｓｔ
Ｊυ１限部位間に所望の断片が存在することを確認する
ために標準方法によりＤＮＡ配列分析にかけた。

細薗培養 プラスミドｐＭＯＮ２４６４を有する Ｅ，ｃｏｎ　ｉ株Ｗ３１１０Ｉ−４を、８および１２位
にヒスチジン置換を含むアラニルーＩＧＦＩの変異体を
製造するために使用した。ブラスミドｐＭＯＮ２４６４
を有するＷ３１１０ｍ−４の形質転換体を、２００Ｊｌ
！Ｆ／１１のアンビシリンを含むしブロス中での一夜培
養を聞始リるために使用した。これは、発酵槽培養に接
種するために使用した。生育』８地は、以下を含右した
＝ＫＯ口、トＩ　　　　　ＰＯ　　　　　１　　　（Ｎ
Ｈ　　　　　）　　　　　Ｓｏ　　４　　、　　Ｍ　　
Ｑ　ｓｏ　　４　　、微猷金属およびアリメット。液状
デクスト【］一スを炭素源として使用し、発醇槽中の残
留デクストロース濃度を、濃縮デクストロース供給法に
より０．０５％と０．２５％との間に保持した。抗生物
質の売Ｍ檜への添加は行なわなかった。発醇槽の操作パ
ラメータは次のとおりである：３７℃、１　０　０　ｒ
ｐｍ攪拌、瞑気速度１０リットル／分、背月二〇．３５
／（ｇ／平方α、およびρ１１設定点７．０を水酸化ア
ンモニウムで２１節。培養物が光学密度（５５０ｒｖ）
２０まで或育した際に、温度を３７℃から３３℃に変位
させ、運転ｍ間保持した。培養物が光学密度（５５０ｎ
ｗ）４２に達した際に、ナリジクス醒を最終漠度２　５
　１）ｌ）ｍとなるように加えてｐＭＯＮ２４６４上の
ｒｅｃＡプＤ　−Ｅ　−　夕カらのＩＧＦ１変異体遺伝
子の発現をＭｌした。次いで細胞を集収し、凍結させて
−８０℃で保存した。

ｌｉ＋胞融解Ｊヌよび包接体の単頗 適当なｍの凍結ｍ胞ペーストを５℃にて解凍した後、１
００ｇの細胞ペーストを４８０ｍｌの冷水中にυｌｔｒ
ａ　Ｔｕｒｒａｘｌｌｔ拌忍を用いて注意深く懸濁した
。冷却したｍ胞懸濁物を、あらかじめ冷がシ４２０−５
６０Ｋ！ｌ／平方ｃｘＤ−に設定したＨａｎｔＯｎＧａ
ＬＩｌｉｎホモジナイプ一に４回通した。得られた破壊
ａＵａの懸濁液を、Ｂｅｃｋｖａｎ　｝ｌｏｄｅｌ　　
Ｌ　８遠心分離装四を用いて５０．０００Ｘｏ（４５−
ｒＩロータ中で２５．０００ｒｌ）Ｉ１　）にて３５分
間超遠心分離にかけた。透明な上澄液を流出させ、残留
号る褐色のペレットを細い水流で勢いよく洗浄して不賛
な細胞破砕物の上部粘性層を除去した。該ベレットを水
中に懸濁し、２回目の遠心分離および洗浄を行なった。

残留する物質を遠心管から機械的にかき集め、合せて２
．６ｒＪの湿った包接体を得、これを後の使用のために
−８０℃で保存した。

（　Ｇ　Ｆ　１の酸化およびたたみ込み１　　１　．　
３　９の船の包接体を、ＬｌｌｔｒａＴｕｒｒａｘｌｔ
！拌器を用いて８０１Ｆの冷［ｉｉ液（６Ｍ尿素４・２
５ｌＨトリス、ｐＨ＝９．０＞に懸濁した。該混合物に
ジチオスレイトール（１２０＊）を加えて包接体を還元
し、可溶化した。該混合物５−１０℃にて１０分間攪拌
し、次いで１６０ｍｌ−の冷トリス！！ＩＷＲ　（２　
５ｓＮＭ，　ｐｌｌ−９．　０）　ヲ加エタ。この混合
物のｐｌｌを２．５Ｍ　　ＮａＯＨの滴下により急速に
１１．０まで上昇させた。該混合物を約１分間｝！Ｉｌ
ｌ￥し、次いでＩ）Ｈを６Ｍ　　ｌ−ＩＣ７の滴下によ
り急速に９．５まで飢下させた。この溶液を開放容４中
で５℃にて１６時間勢いよく攪拌し、たたみ込みを完全
に行なわじた。残留ずる不溶物を除去するために、該内
たたみ込み混合物を５０．００　０ＸｉＪ　（Ｂｃｃ）
ｖａｎ　４　５　７　１　Ｄ−夕で２５．００Ｏｒｐｍ
　）にて超遠心分離にか１１だ６透明な淡黄色のｉＫ７
ｉ６をデカントで取出し、次いで１．４ｇＮａＣＩを加
えＤＩ＋を８．５に調整して精製のために調製した。方
法Ｂ ２．６ｇｍの包接体をＩｌｌｔｒａ　Ｔｕｒｒａｘｌｌ
拌装直を使用して１００ｌＬの冷緩衝液（　６　Ｍ　ｌ
，Ｒ素＋２５ｅＨＮａ３ＲＯ３、ｐｌｌ＝９．５）に懸
濁した。この混合物に、包接体の還元および可溶化のた
めにジブオスレイトール（１５０■〉を加えた。この混
合物を１０℃にてほとんどの包接休が溶Ｗ？するまで（
〜１０分間＞ｉ拌し、次いで１１００ｎｌの冷ボレー口
■液（２５ａ＋Ｈ，　ｐｔｌ　＝９．５）を加えた。

該混合物のｐｌ１を検査して９．５であることをＭ１認
した。この溶液を開放容器中で５℃にて酸化が完全に行
なわれるまで（　１　０　−　４　８　Ｉ＋５間）勢い
よく攪拌した。塩化ナトリウム（７．０ｇ）を該青たた
み込み混合物中に溶解し、続いて氷ｌｌｌＩ酸をｐｌ１
４．５となるまで嫡々加えた。次いで該混合物を５０．
　０００ｘｇ（Ｂｅｃｌｖａｎ　４　５Ｔ　Ｉ　Ｏ−夕
にて２５．００Ｏｒｌ１ｍ　＞で超遠心分離にか番プだ
。透明な上澄液をデカントで取出し、２　Ｍ　　Ｎ　ａ
　Ｏ　ｆｉを用いてｐｌ＋を８．５に調節し、次いで該
蛋白質溶液を更に精製するまで４℃で保存した。

官能化樹脂の調製 トリスアクリルＧＦ２０００Ｍをすべての［１剤および
保存剤を除去するために蒸留水にて繰返し洗浄し、次い
でサクシ３ンにより乾燥さ０゛た。

約１００ｇ（〜１００ａ＋Ｌ）の若干湿った担休を、８
０ｍｌのジグリムＪ３よび１００ｌＩの新たに調製した
１．４Ｍ　　ＮａＯＨ溶液を含む溶液中に！１！！濁し
た。最後に１００ＩＬのジエチレングリコールジグリシ
ジルエーテルを加え、該混合物を３５℃にて１６時間ゆ
るやかに攪拌しｌご。粘製ジエヂレングリコールジグリ
シジルエーテルは、文献方法《ｘ．Ｇｕ１［．Ｉｋｅｄ
ａ　，　Ｈ．Ｏｋａｈａｒａ　，　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
　，　６　４　９［１９８５］）にＪ、り調製した。該
活例化担体をジグリム／Ｉ−１２０　（５　０／５　０
　）により洗浄し、次いで過剰のエボキシドおよび塩基
を除去するために蒸『ｌ水により繰返し洗浄した。洗浄
し、ザクシＥ｛ンで乾燥さＵだ担体は、１１Ｌの４Ｎ脂
あたりに７０−／イク１」モルの活性エボキシド基を有
することが示された。該活竹化樹脂を４℃にて保存し、
通常は調製ｈ１ら２４時間以内に使用した。

４レートの固定化 活性化トリスアクリルをＡ留水で洗浄し、リクションに
より乾燥さ吐た。約１００ｇ（〜１００Ｉ１）の同活性
化ゲルを、ｐｌｌ＝１０．５−１１．０に調節したＩＯ
ＯＩＬの１．ＯＭ　　Ｎａ２Ｎ口（Ｃ口，ＣＯ２）２溶
液に懸濁した。この混合物を６５℃にて２４時間ゆるや
かに攪拌し、次いで過剰のリガンドを除去σるために蒸
留水で繰返し洗浄した。該官能化樹脂を４℃にてエタノ
ール／水（２５／７５ｖ／ｖ）中に使用に備えて保存し
た。

チオリールフエートによる滴定は、エボ」−シド単が存
在しないことを示し、従ってエタノールアミンによる４
．Ｐツビングは不要とみなされた。１０ｄのり−クショ
ンで乾燥したゲルを過剰の５０１ＣＵ　（０１０４）２
　で飽和′．：５げ、次いＦ１００ｍｌの蒸留水、１０
０ｉＬの５０１Ｈイミダゾール（ｐｌ１＝７．０〉およ
び最終的にＩＯＯＩＩＩＬの口，Ｏにより住意深く洗浄
した。次いで、結合した銅を過剰の５０ｎＨ　　Ｎａ２
Ｈ２ＥＤＴＡ　（ａｌｌ＝７．０）により除去した。ｌ
！Ａ準化鋼−ＥＤ丁Ａ溶液を比較のために使用して、全
銅組成を分光学的に測定して０．４３ミリモルをｉＪだ
。

金属アフィニティ力ラムの溶出プロト〕−ル万ラスカラ
ム（１．６Ｘ１３ａｍ、２　６　ｍｌ）　ｌ．：　ｔＪ
：息深く洗浄したＩ　Ｄ　Ａ　−　ｈリスアクリルグル
を充填し、次いで１３０＋Ｌの５０ｍＨ Ｑｕ　（ＧＩ０４　）２　　（ｐＨ４．５＞　を負ｒ４
シタ．ＨＴｊ能化ゲル番よ、銅イオンをほぼ定階的に吸
着した。

この銅カラムを１００ａ＋Ｈ−のＮａＣｊ！で洗浄し、
次いでこれを溶ＩＩｔｌｍｍ液（　５　０　ｍＮイミダ
ゾール、５００ｍＨ　　ＮａＣ１、５　０ｍＨ　　Ｎ　
ａ　１２　ＰＯ４　、ｐＨ−７．０）により平衡化し、
そして最終的に負荷緩衝液（０．５１１８　　イミダゾ
ール、５００■ＨＮａ　　Ｃ　！　、　　５０ｍ｝Ｉ　
　　　Ｎａ｝Ｉ　　　　ＰＯ，　　、　ａｌｌ＝７　　
、　　Ｏ　）により平劇化した。清澄化した不純な再た
たみ込み混合物〈〜１２００ｍｌ）をｐｌｌ＝８．５に
調節し、次いでカラムに４．０＋Ｌ／分で注入し、該カ
ラムを８０１１の負荷緩衝液で洗浄した。該カラムをイ
ミダゾールの線形勾配（０．５−−一→５０１Ｎ＞を用
いて１．３ｌ［／分の流速で環境温度（２３゜）にて５
００分間でＩ！ｊ　ＩＦｔｆ　Ｌｉた．該カラムからの
溶出液を、３　ｒａｍ　ｌ路長のヒルを備えたＫｒａｔ
ｏｓ　Ｍｏｄｅｌ　７５７分光光度計を用いて２８０ｎ
ｓ（０．０５−０．５ＡＬＩｌ′−Ｓ）にて連続的に監
視した。分画（１３ｍＬ）を、ＧｉｌｓＯｎ　　Ｍｏｄ
ｅｌ　２　０　２フラクションコレクターを用いて集め
た。操作完了後、該力ラムを５ＱＩＨ　　Ｎａ２目２　
ＥＤＴＡ　（ｐＨ７．０）および次いで５０ａＨ　　Ｎ
ａＯｌ−１にて洗い出した。

該カラムは、１００ｗ＋Ｈ　　ＮａＣＪ（２４０ｓＬ）
、負殉緩衝液（２４ＣＨＬ）および最後に１００１８Ｎ
ａＣ１　（２４０ｍｌ）による洗浄の後にただちに再生
される。２つの強い結合蛋白質のピークが該カラムから
溶出ざれた。第２のピークを含む分画を集め、合して３
０−４０Ｍｇ蛋白質を含む８０１００１１の溶液を得た
。この段階におＧＪるＡ，８８口，２−ＩＧＦ１の分析
用逆相ＬＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（　　４　　．　　６　　Ｘ　
　２　　５　　０ｒｍ，　　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　　　ｃ
８　八ｑｕａｒｏｒｅ力ラム、トｌ　　Ｏ／Ｃ目３０Ｎ
１０．１％ＣＦ３Ｃ０２Ｈ、２１Ｏｎ｝ｔ）による典型
的分析は、次の結果を与えた。

蛋　　白　　質　　　　　　　　　　　　　　　分　　
　　　　析ＩＧＦ１　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　７３％１ＧＦ１単量体異性形態　　　　　１
６％Ｉ　Ｇ　Ｆ　１関連オリゴマ−　　　　　１０％外
来蛋白質　　　　　　　　　　　　　１％我々のトリス
アクリルゲルに加えて、Ｐｌ１ａｒｌａＣｌａキレーテ
イングフ？ストフロウを用いて充分満足な結果を得た。

逆相ＨＰＬＣの溶出プロトコール １ｉｆＩ！Ｊソマトメジン溶液（〜ｔｏｏｍｌ．／〜３
６■全蛋白質）を、ＹＭ２膜を装着した１００ＩＩＬＷ
ｉ拌式アミコン限外ろ過ヒルを用いて１．５＃Ｆ／１１
の７４２　１′Ｊ　Ｙｉ　１７１度まで濃縮した。逆相
カラムへの注入に先）゛ｔつで、濃縮試料（１２ｓＬ）
の一部をろ過し（０．２μｍ）、試料の残部は後の使用
のために凍結した。使用したカラムは、ＢｒＯＷｎｌ（
！（！　ｃａｂｓ．により提供ざれている＾ｑｕａｏｏ
ｒａ　　Ｒ−３００　　Ｃｇ逆相カラム（７．Ｏｘ２５
０ａｍ＋）である。該カラｌ１を、アヒトニ１・リルー
水（０．１％ＣＦ　　ＣＯ２１−Ｈの１０／９０混合物
で平衡化し、次いでこれに蛋白質溶液を注入した。該カ
ラムを、線形のアセトニトリル勾配で最終溶媒組成が６
０／４０アヒトニ１・リルー水（０．１％ＣＦ　　Ｃ，
０２Ｈ）に至るまで適用して流速３．０−１／分にて環
ｆ１温度で５０分間展間した。該カラムからの溶出液を
、８＃Ｉセルを装着したκｒａｔｏｓＨｏｃｆｅｌ　７
　５　７分光光度計を用いて２８０ｎｍ（０．２−２、
ＯＡＩＪＦＳ＞にて連続的に監視した。分画（０．９ｍ
ｌ−）は、Ｇｉｌｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　７　５　７フラ
クシコンコレクタを使用して集めた。適切にだたみ込ま
れたＡ，ｌ−１８Ｈ１２−　Ｉ　Ｇ　Ｆ　１　＃ｔ、該
カラムから２２分（〜３２％ＭｅＣＮ）で溶出し、その
イ・Ｊ隨貰竹形態は、２５分（〜３５％ＭｅＣＮ）で溶
出し、および数個のオリゴマーのピークは、２７〜３５
分の範聞内に溶出した。ＪＧＦＩを含む閏連する分画を
、分析用逆相１−１　ｒ’　Ｌ　Ｃを用いて分析した。

主ピークを含む８分画を貯留し、これは９８十％の純度
で１３＃Ｆを含むことが示された。

異性形態を含む３分画を貯溜し、これは９５％の純度で
１３Ｊ１９を含むことが示された，，該カラムを９０／
１　０ＭｅＣＮ一口，Ｏにより洗浄して漬浄化し、次い
で出Ｒｆｆｉ衝液１０／９０ＭｅＣＮＨＯ（０．１％Ｃ
「３Ｃ０２Ｈ）に上りｒｌｃ　）Ｖ衡化した。残る試料
を解凍し、同じ方法を用いて同様にＴＩ製した。

凍結乾燥 必要な体積（０．１−１．５一［）の粘製ＩＧＦ１溶液
を、２■Ｌエツベンドルノ試！ｖｉ管にビベットで取り
、ＳａｖａｎｔＪｉ空濃縮装ＰＩ（　ＳｐｅＣ！ｄＶａ
Ｃ，ＳＶＣ　　２００＋４）に取付けて溶媒（口，Ｏ１
ＣＩｌ　　ＣＮ，ＣＦ　　Ｇｏ，，Ｈ）を除去した。精
製張白質が綿毛様白色固体として得られ、これを−８０
℃にて保仔した。精製Ａ−１１」８１−１，，，−　Ｉ
　Ｇ　Ｆ１の全収酔は２６．４Ｇであり、また３．２ｍ
ｇのイ・１鋤光性形態も｛９られた。

Ｓ−スルホン化法 約１．５句のＡ−１］１８口，，，−ＩＧＦＩ（たたみ
込まれていないか、または適切にたたみ込まれている）
を、１　２５ｗＨ　　Ｎａ　　８０　　、２５ｍｌＮａ
　　　　　Ｓ　　　　Ｏ　　　　　−２　　１１　　　
　　０，　　　２５ｍ　　　　　Ｈ　　３　　８０　　
３および６Ｍ尿素を含む１，５１１スルホン化緩衝液（
　１１１１８　．　５　＞に溶解させた。該反応は、２
５℃にて３時間、または５℃にて１２蒔間行なわじ、そ
の後、反応混合物をろ過（０．２μ）し、逆相Ｈ｝−’
ＬＣ（上記参照）に注入した。６個の付加的な負電荷形
成にもかかわらず、該蛋白質はより疎水性であり、該カ
ラムから２９分（〜３９％ＭｃＣＮ）で溶出した。生或
物を含む分画を天然蛋白質と同様に処理して１．３ｊｌ
！Ｊの純粋な八　Ｈ　　Ｈ　　−ＩＧＦＩ（ＳＯ３）６
を得た。

白　における金属キレート部位の模型化単一の複歯リガ
ンドの２個以上の金属一結合部位における、単一の金属
または強固に結合した金属に対する同時的な相互作用を
、金属キレート形成と称している。適切に設計された↑
レートは、類似する非キレート性リガンドよりも特定の
金属に対してより強く結合することが知られている（＾
．Ｅ．Ｈａｒｔｃｌｌ　、Ｒ．｝ｌ．ｓｉｉｔｈ　，　
ＣｒｉｔｉｃａＳｔａｂｉｌｉｔｙ　　Ｃｏｎｓｔａｎ
ｔｓ；　Ｐｌｃｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ，４巻［１９７５］）。適切な設計とは、（１）リガ
ンドにおける供与原子の性質が、特定の金属イオンまた
は金属銘体に適合ずること；（２１２個以上の金属一結
合原子が、金属の特異的な幾河学的公求を満足すること
；（３）リガンドのキレート形態が配ｄ的に拘束されて
いること（相対的に１可動的、堅固〉を意味する。

天然のアミノ酸類においては、シスアイン、ヒスチジン
、アスバルテートおよびグルタメートの側鎖のみが、２
価の第１列遷移金属に対して中性のｐｌ１における水溶
液中で重要な結合力を有りる（＾、Ｅ．Ｈａｒｔｅｌｌ
　　、Ｒ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ　　，　　Ｃｒｉｔｉｃａｌ
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　　Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ：　Ｐｌｅ
ｎｕｇｉ　Ｐｒｅｓｓ１Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，４巻　［１
９７５］）　　。

ｃｙｓ＞ｈ　ｉ　ｓ＞＞ａｓｐ，ｇＪｕ＞他のアミノ酸 Ｃ（Ｊ２＋に結合するリガンドのｃｉｓＦｉｌ！置につ
いて（同様にｖＯ２＋、Ｎ　＋　２＋およびＺｎ２＋に
ツイて）、金属銘休に対タるＸ線結晶学的データは、典
型的な銅一窒素結合パラメータが、Ｃｕ−Ｎ＝１．９８
−２．０２入およびＮ−Ｃｕ−Ｎ＝８０’−１００”で
あることを示している（Ｇ．Ｎａｒｄｉｎ１Ｌ．ｆｌａ
ｎｄａｃｃｉｏ　、Ｒ．Ｐ．Ｂｏｎｏｍｏおよび［．旧
ｚｚａｒｅｌｌｉＳ　Ｊ．Ｃｈｃｓ．Ｓｏｃ．　　、　
ロａｌｔｏｎ　　Ｔｒａｎｓ．　　、　３６９　［１　
９８０１　、Ａ．Ｐｏｄｄｅｒ、Ｊ，κ、ｏａｔｔａｇ
ｕｐｔａ，Ｎ．Ｎ．ＳａｈａおよびＷ．Ｓａｅｎｇｅｒ
　、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．　、Ｂ　３５、５３　［１
９７９］　）。蛋白質についてのＸ線結晶学的データは
、３種類の通常に観察される二次構造：α−へリックス
、β一罰およびターンを示す。これらの構造領域は、少
なくとも部分的に配ｄ的拘束の要求を満足する。！ｌ１
！型的な配ｅｆｌとして、α−ヘリックスについて（φ
一−５７゜ψ　＝−４　　７’　　、　ω＝　　１　　
８０＠　＞　　（Ｓ．Ａｒｎｏｔｔ，　　八．ＪＷｏｎ
ａｃｏｔｔ１Ｊ．Ｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．　　　２　１　、
３　７　１　［　１　９　６６　［　、　丁．Ｂｌｕｎ
ｄｅｌ　ｌ、　Ｄ．Ｂａｒｌｏｗ，　　Ｎ．Ｂｏｒｋａ
Ｌａｋｏｔｉ　　、Ｊ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，　Ｎａｔｕ
ｒｅ，　３　０　６、２８１　　［１９８３］）、β一
鎖について（φ一−１３９゜、ψ一＋１３５＠、ω−１
　８　０”　＞　　（Ｃ．Ｃｈｏｔｉｓ，　Ｊ．ＨｏＲ
ｉｏｔ．　　　７　５、２　９　５　［　１　９　７　
３　’．１　）　、Ｊ３よびβヘアピンターン（タイ１
■′、タイプＩＩ’　＞（Ｂ．Ｌ．Ｓｉｂａｎｄ，　　
Ｊ．Ｈ．丁ｈｏｒｎｔＯｎ、　Ｎａｔｕｒｅ，　　３　
　１　　６　　、１　７０　［１９８５］　）を使用し
た。ヒスＴジンおよびアスバルテーＩ一残基についての
エネルギー的に許容ざれる側鎖配ｅ　（Ｊ．ｌ４．Ｐｏ
ｎｄｅｒ，Ｆ．Ｈ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，　Ｊ．Ｈｏｌ．
Ｂｉｏｌ．　　　１　９　３、７７５［１９８７］）の
幾何学的研究を、対応する二次構造に結合するどのアミ
ノ酸配列がＣｕ２＋に対する２歯キレート部位を与える
か特定するために、．Ｌ記の距離および角度制限を用い
て行なった。短距細キレート相互作用のみ、すなわち結
合残Ｉ．！間の介在残基数をＯ〜４とするもののみ考慮
した。

計棹結果は、下記の表に示してあり、（＋）はキレート
形成可能である場合を示し、〈−）は、キレート形成が
起こらない場合を示している。介在残縫《″Ｘ“〉の性
質は、相対的に重要でＧよない。

該模型化番よ、これらの残基側鎮の立体的大きさ、親水
性Ｊ３よび′Ｆｉ荷が、金属キレート性ベブチド相互作
用において単に非主費、または、二次的な役割をするの
みであることを示した。

１■ Ｉｆ　ｘ　ＩＩ ＩＩ　ｘ　ｘ　ＩＩ ＩＩ　ｘ　ｘ　ｘ　Ｉｔ １１ＸＸＸＸＩＩ ＤＸＩ＋ Ｏ　ｘ　ｘ　Ｉｔ ＤＸＸＸＩＩ ＤＸＸＸＸＩ＋ Ｈｘロ ＩＩ　ｘ　ｘ　Ｄ ＩＩ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｄ ＋ 十 ＋ ト ｌ− ＋ ＋ ＋ ＋ より信頼できる構造の情報がない場合に、重聾な二次構
造を含む領域を、Ｎａｇａｎｏ　（κＮａｇａｎｏ、Ｊ
Ｈｏｌ．８ｉｏ１．　　、１　０　９、２５１　　［１
９７７］）　　、Ｃｈｏｕ　　（Ｐ．Ｙ．Ｃｈｏｕ，　
　Ｇ．０．Ｆａｓｍａｎ，　　八ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ．
　　、　４ヱ、４　５　［　１　９　７　８　］　）　
、Ｇａｒｎｉｅｒ　（　Ｊ．Ｇａｒｎｉｅｒ　，Ｄ．Ｊ
．Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｈｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．　　　１　　２０、９７［１９７８１）
およびーａｋｏ　（　ｌｌ．Ｗａｋｏ、Ｎ．Ｗａｉｔｏ
　、ｌＩ．Ａ．ｓｃｈｃｒａｇａ，　Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｃｈｅｗ．　　、２　，２２１　［１９８３Ｆ）の
予測アルゴリズムを用いてアミノ酸配列の情報から決定
し、また既知の構造にＪ３ける配列の類似性を用いた第
５の方法も使用した。これらの５＋！類の方法を一連の
列挙した類似蛋白質のそれぞれに適用した。全ての予測
が実質的に一致した場合にのみ共同の予測を信頼竹ある
ものとした。下記の表は、８秤の啼乳動物種（ヒト、ブ
タ、モルモット、ラット、マウス、ウマ、ウシ、イメ）
由来のプロインシュリンについての九ｒＭｌ予測、およ
び４種の啼乳動物種（ヒト、ウシ、ラット、マウス）由
来のインシュリン様成長因子−１についての共同予測を
示している。プロインシュリンおよびＩＧＦＩについて
の混戒予測は、β一構造が信頼竹をもつて予測できない
ことを示している。しかしながら、ターンを含む２つの
領域（１９−２３、３９−４２＞は、かなり良く予測さ
れ、１個のヘリックスｆｆｉ域は、はっきり予測された
。

蓬ｆｉＪ３ｉり先Ｍ塞 −ａ、正規の二次４１造が同定されたならば、これらの
領域内のどの残駐が金属に対して容易に結合するために
充分に伍白！！ｉ表而に露出しているかを決定すること
が必聾である。興味ある領域にＢる親水性の周ｍ性を、
露出残基を見出すにあたっての指針として用いた。多く
の親水性の物指が定ａ′ｃ８れているが、本出願にＪメ
いて最も便利なものの一つは、構造がＸ線結晶学により
決定ざれている蛋白質に基づいた特定のアミノ酸残基が
１４在づるか、あるいは露出する程度に基づく物指であ
る（八．Ｋｉｄｃｒａ，　　Ｙ．Ｋｏｎｉｓｂｉ　　１
　Ｈ、Ｏｋａ　　，　　丁．Ｏｏｉ　　，　　Ｈ．＾Ｓ
ｃｈｅｒａｏａ，　Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅａｐ．
　　　２、２２１　［１９８３Ｊ）。

α−ヘリックス　　圓味ある全ヘリックスｆｔＩ域につ
いて、親水性モメント（方向および強度）を、５回転あ
たり１８残基のピッチ（１００゜／残阜｝を用いて計粋
した。親水性モメントが充分に大きい場合（＞１０．３
１＞、残基は、３種類の等しく分布する類別、露出（十
）、内在（一）および境界（０）に分類ざれた。

ＩＧＦ１における残基８−１７、およびプロインシ］リ
ンにおける類似の領域についての計算は、残７．！　１
　２　（　ａ　Ｓ　ｐ／（Ｊ　Ｉ　ＬＪ　）　カａ４［
ＪｔＬ，Ｔｊｌ露’Ｊｌされていることを示した。同椹
にして、残基８、１５、；Ｊ３よび１　６　（ａＪ！ａ
／Ｓｅｒ、ｇｌｎ／ｔｙｒ，ｐｈｅ／Ｉｅｕ）は露出さ
れ、残基１０１１４および１７（Ｉｅｕ／Ｉｅｕ，Ｉｅ
ｕ／ｅｕ、Ｖａｔ／Ｖａｔ＞は内在していた。残基９、
１１および１３は、中間領域にあるものと計算され、完
全に露出されず、また完全に内在化してはＪ３らず；こ
れらの３ｒＩ４の残阜のうち、Ｅ９／口。はより露出さ
れ、Ｌ１１／Ｌ１１およびＡ１３／Ａ１３１よより内在
化している。残基１６を除いて、該ヘリックスは両好な
両Ｉ！媒性を右している。これらの計算に基づいて、口
．口ｕｌＧＦ１および口，２口，６−　１　Ｇ　Ｆ　１
は、最良の金属結合部位を含むものと！＋１定された。

いくつかの起こり冑る問題；｛１｝計のざれたヘリック
スの端部への残ｌ３８および１６の近接、（２）疎水性
残Ｍ（ｐｈｅ１６）の親水性ヒスチジンによる直換、（
３）残皇８がＧ，Ａ８ターンの部分である可能性を概観
した。

β一鎖　　興味ある全β一鎖領域について、親水竹モメ
ントを１回転あたり２残も（のピッチ（１８０゜／残基
）を用いて計算した。これは各残基が”アップ“または
”ダウン″のいずれかであるために計算が容易である。

この場合、残１ｑ２秒類の苦しく介布する類別、露出（
十）、および内ｒＥ（−）に分類された。

β−ヘアピンターン　　これらの２−残も（同転は、超
二次Ｉｓ造であるため、一〇回転内の残りが同定された
後に更に計粋を行なう必飲竹ｑほと／Ｖどない。金属キ
レート形成に適した残阜は、ヘアピンターンのいずれか
の側の２個の残基である。

これらのターンは、蛋白質の露出表面上において、回転
残基および最ｖＪ接残基の露出を伴って最も頻繁に起こ
る。

隣接づるシステイン、グリシンまたは１ロリン残基の存
在のために、［ＧＦ１において予測されたいずれのター
ン領域（１９−２３、３９−／１２）も明確に定義され
た単一の２一残基ターンを示さず、適当な金属結合部位
が存在４るとは判定されなかった。

／ｔ物学的アッセイ ＩＧＦ１変異体の生物学的活性を、インビト口における
筋芽ｍ胞増殖の増強の測定によりアツセイを行なった。

細胞増殖アッセイにおいては、ラット１６筋原細胞（Ｄ
．ＹａＨｅ　，　ＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄＳｃｉ
．、６１．４７７　［１９６８］）を使用した（　Ｃ．
　Ｅ．κＯｔｔＳ　，　Ｈ．Ｅ．一旧ｔｃ　，　Ｃ、Ｅ
．ＡＩｌｅｎ　，Ｆ．ＨａｒｔｉｎＳＷ．Ｒ．Ｄａｙｔ
ｏｎＳＪ．Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉ．　、６　４、６１　
５　［１９８７１　）。先の研究【よ、天然Ｉ　Ｇ　Ｆ
　１がこのアッセイに応答づることを示している（Ｃ．
Ｅ．κｏｔｔｓ　，　ｃ．＾．Ｂａｉｌｅ　，　ｒｅｏ
ｌ．Ｐｒｏｃ．、４ぺ、４８４Ｉ１９８５］）。このア
ツセイを、概略を記述するように若干の修飾を加えて使
用した。

細胞を、１０％の胎児性ウシ血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ
　）を含むＤｔｌｌｂｅＣＣＯの最少必須培地（　Ｄ　
Ｍ　Ｅ　Ｍ　，　Ｄｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）において
、ｉｏｏｏｍ胞／α２をもって２α２ウエル（２４−ウ
エルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ　）に塗布した。２４時
間後、２％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中の変異ＩＧＦ１　
（０．１−ｂＯｎＨ）を含有１゜る試ｌｌ４１８地を適
用した（　１　ｓＬ／ウエル〉。

断片の保存溶液は、１０ｍＨ　　口ＣＩ中で１ＯｒＩｇ
／ｍｌの濃度で調製した。新釘な試験培地を、２４時間
後に再度適用した。更に４８時間後、各ウエルのＤＮＡ
含有邑を測定することにより細胞数を評価した。ＤＮＡ
含右昂は、Ｃｏｕ　ｌ　ｔａｒ計数器（Ｍｏｄｅｌ　Ｚ
Ｍ，　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　、ｌ
ｌｉｌｅａｈ、Ｎｏｒｉｄａ　）上で計数されたｌ−６
１１１胞の既知数からなる標準曲線を用いて細胞数と相
関をもたせた。

対照は、２％ＦＢｘＳを含むＤＭＥＭｄ上び適当な体積
の１０１８ＨＣ１を受けた。正の対照は、秤種の濃度（
０．　１−５０ｎＨ）の相換えヒト／ウシＩ　Ｇ　Ｆ　
１　（　Ｈｏｎｓａｎｔｏ　Ｃｏ．、ＬＯｔＳ１０５、
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，　Ｎｏ．　）を２％ＦＢＳを加えた
ＤＭＥＭ中で受けた。熟或は、すべて３７℃、ＣＯ２１
０％および湿度１００％にて行なった。結果番よ、各ア
ッセイにおいて対Ｉ’ｌｌ　（ＤＭＥＭ→２％「８Ｓ）
にスＪずる細胞数の増加の百分率として表わされ、刺激
として定義された。アツセイ内の偏差は平均して５．１
％〈±１．２％〉であり、アッセイ間の偏差はこの研究
で用いた実験の間で２２．２％であった。

Ｉ　Ｇ　Ｉ：１の０．１、ＩＪｉよび１０ｎＨでの単一
点アッセイは、次の活性を示した。

０．　１開　１開　１０Ｎ 天然　ＩＧ＋−１　　　　　　　　　　　　　　　　−
　　　　＋　　　　＋Ａ，Ｉ＋８１１１２　１ＧＦＩ一
非たたみ込みＡ−１口ｓ　ｔ−１ｔ２Ｉ　ＧＦ　１　ｋ
？性形態一非たたみ込み　−である。ＩＧＦＩ変異体に
ついてのｖｌａｘ値は、天然蛍白質より若干低いが、良
好な最大活性を示したく±２０％〉誤差〉。

上記蛋白！１中の２＋４についてのａ度依存性の増殖速
度の完全な動力学的分析は、次の結果を与えた。

蛋白質　　　　　　　　　Ｋ，　　　　Ｖ−　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−１　ａ　Ｘ天然　ＩＧＦ１　　　　　　２．９ｎ８
　　１６８％Ａ　　　Ｉ１　　　１１　　　　　１ＧＦ
１　　　１．５ｎ８　　　１３８％一１８１２ ｈ効Ｋｌ１１ｌｉ′ｉは、尖験誤差（±２の因子）内で
同じ彌唖　誓己　ａ 例３ 組換えＤＮＡ技術により細菌内に産ご１される蛋自ｚ′
１は、通常宿主細胞のＩＩＩ胞質中の不溶性ｐＩ分画体
中に蓄積される。蛋白質類を活性形囚で回収するために
は、再生が必及である。再生は、可溶化し、たたみ込み
、および場合により酸化して該蛋白質を天然配置とする
ことが必要である。このようなｊリ１工程の結果として
、種々の細菌姓蛋白質に加え、種々のオリゴマー、異性
形Ｂおよび非たたみ込み単立体が、不純な再たたみ込み
混合物中に見出される。この例は、１つの金属アノイニ
ティ粕駒工程において、不純な再たたみ込み混合物から
屑望の蛋白質を直接私製する方法を例示している。

ＩＧＦＩは、内在性ヒスチジン残基を有していへいため
、天然蛋白質に２つの変史を加え、例２に示した方法に
より精製した。溶出の形態を第１図に示してある。不純
な再たたみ込み混合物中のＩＧＦＩおよび種々の［ｌ薗
性蛋白質に加え、１個の主要な非たたみ込みＩＧＦＩ単
削休、ＩＧＦ−ｍ連オリゴマー類および少なくとも１個
の主要なＩＧＦ異性形因が存７〔する。金属−アフィニ
ティ力ラム上での不純な１４たたみ込み混合物の精製に
おいて、実質的に全てのＩＮ＋菌性蛋白質が除去され、
またほとんどのＩＧＦオリゴマーが除去された（残沼オ
リゴマー含右ｈ１）４％−８％）。通常は、適切にたた
み込まれたｒＧＦ１をノ［たたみ込みＩＧＦＩから分ｌ
１１゛ることは困ガであるが、該金属は特別に２つの異
なってたたみ込まれた形態を明確に識別し、それらをき
れいに分離した。第２図に示されるように、適切にたた
み込まれたＩＧＦ１は、カラムに最も強く結合した。非
たたみ込みＩＧＦＩもまた金属カラムにある程度結合す
るが、非たたみ込みは明らかにヘリックスをゆがめ、そ
の結合性を低下させた。適切にたたみ込まれたＩＧＦ１
異性形態は、非たたみ込み異性体から容易に金属力ラム
により分離されるが、適切にたたみ込まれたＩＧＦＩ自
体と共に溶出寸る。

第二のＭ製工程（逆相１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ　，または大
きさ排除ク０マトグラフィー）は、残留するＩＧＦＩオ
４， リゴマーを容易に除し、また異性形態も除去した（逆相
｝ＩＰＬＣ）。

図面の簡単な説明 第１図は、Ａ，ＩＩ８Ｌｌ　，２−　Ｉ　Ｇ　Ｆ　１の
不純混合物の溶離形態を示すクロマトグラム、および弟
２図１よ、Ａ−１１−１８１〜１，２−ＩＧＦ１の種の
混合物（示されていないが、不たたみ込み天然ＩＧＦ１
へ１サヂオスルホネートは金属力ラムに結合しない）の
溶離形態を示すクロマトグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）固定化金属アフィニティクロマトグラフィを用い
   て蛋白質類またはポリペプチド類を分画する方法におい
   て、該蛋白質またはポリペプチドの固定化金属に対する
   アフィニティを、分画に先立って該蛋白質またはポリペ
   プチドを金属キレート性アミノ酸配列で加工することに
   より増強することを特徴とする方法。 （２）前記金属キレート性アミノ酸配列が、式：−Ａ−
   Ｂ＿ｘ−Ｃ＿ｙ−Ｄ＿ｚ−Ｅにより表わされ、式中、Ａ
   およびＥは、独立的にヒスチジンおよびアスパルテート
   からなる群から選択される金属−結合付アミノ酸であり
   、Ｂ、ＣおよびＤは、アミノ酸であり、ならびにｘ、ｙ
   およびｚは、前記配列中に存在する金属キレート性もし
   くは配列含有部位および特定の金属−結合性アミノ酸を
   含む蛋白質またはポリペプチド分子の表面露出部分の二
   次構造に依存する０〜３の整数を独立的に表わし、ただ
   し、ｘ＋ｙ＋ｚおよび前記配列を含む蛋白質またはポリ
   ペプチドの部分の二次構造の組合せは、固定化金属とキ
   レート形成すべく適合されたＡおよびＥの立体化学的配
   置を与えることを特徴とする請求項１に記載の方法。 （３）ＡおよびＥが共にヒスチジンであり、ｘ＋ｙ＋ｚ
   が３に等しい場合であつて、前記配列が前記蛋白質また
   はポリペプチドに、そのα−ヘリックス部分において組
   込まれてなる請求項２に記載の方法。 （４）該蛋白質が、ソマトメジンＣである請求項３に記
   載の方法。 （５）該蛋白質が、ソマトトロピンである請求項３に記
   載の方法。 （６）１個以上のアミノ酸残基が金属キレート性アミノ
   酸配列をもたらす金属−結合性アミノ酸により置換され
   、該金属−結合性アミノ酸がヒスチジンおよびアスパル
   テートからなる群から選択されることを特徴とする変異
   蛋白質。 （７）該金属キレート性アミノ酸配列が、式−Ａ−Ｂ＿
   ｘ−Ｃ＿ｙ−Ｄ＿ｚ−Ｅにより表わされ、式中、Ａおよ
   びＥは、独立的に金属−結合性アミノ酸類であり、Ｂ、
   ＣおよびＤは、アミノ酸類であり、ならびにｘ、ｙおよ
   びｚは、０〜３の整数を独立的に表わし、ただし、ｘ＋
   ｙ＋ｚは、金属キレート性配列を含む該蛋白質の部分の
   二次構造との組合せにおいて、固定化金属とキレート形
   成すべく適合されたＡおよびＥの立体化学的配置を与え
   る請求項６に記載の変異蛋白質。 （８）ＡおよびＥが共にヒスチジンであり、ならびにｘ
   ＋ｙ＋ｚが３に等しく、前記配列が前記蛋白質のα−ヘ
   リックス部分に組込まれてなる請求項７に記載の変異蛋
   白質。 （９）前記蛋白質がソマトトロピンである請求項８に記
   載の変異物。 （１０）１個のアミノ酸残基がヒスチジンで置換され、
   該残基が１５および１７３位の残基からなる群から選択
   される請求項９に記載の変異ソマトトロピン。 （１１）前記ソマトトロピンが、ウシソマトトロピンで
   ある請求項１０に記載の変異体。 （１２）前記ソマトトロピンが、ブタソマトトロピンで
   ある請求項１０に記載の変異体。 （１３）前記蛋白質が、ソマトメジンＣである請求項８
   に記載の変異体。 （１４）Ａｌａ＿８およびＡｓｐ＿１＿２が、共にヒス
   チジンで置換されている請求項１３に記載の変異ソマト
   メジン。 （１５）Ａｓｐ＿１＿２およびＰｈｅ＿１＿６が、共に
   ヒスチジンで置換されている請求項１３に記載の変異ソ
   マトメジン。 （１６）雌の哺乳動物に、Ｌｅｕ＿１＿５がヒスチジン
   で置換されている哺乳類ソマトトロピンの有効量を投与
   することからなる哺乳動物における乳産生の増加方法。 （１１）該ソマトトロピンが、ウシソマトトロピンであ
   り、該哺乳類が乳牛である請求項１６に記載の方法。 （１８）天然ソマトトロピンに対するコドンがヒスチジ
   ンに対するコドンで置換され、前記コドンがＬｅｕ＿１
   ＿５およびＴｈｒ＿１＿７＿３に対するコドンからなる
   群から選択されるソマトトロピンをコードするＤＮＡ配
   列。 （１９）該ソマトトロピンが、ウシソマトトロピンであ
   る請求項１８に記載のＤＮＡ配列。 （２０）該ソマトトロピンが、ブタソマトトロピンであ
   る請求項１８に記載のＤＮＡ配列。 （２１）天然ソマトメジンに対するコドンがヒスチジン
   に対するコドンで置換され、前記コドンがＡｌａ＿８お
   よびＡｓｐ＿１＿２、またはＡｓｐ＿１＿２およびＰｈ
   ｅ＿１＿６に対するコドンからなる群から選択されるソ
   マトメジンをコードするＤＮＡ配列。