KR20170131433A - 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 친화성 담체 - Google Patents

이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 친화성 담체 Download PDF

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KR20170131433A
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Abstract

높은 이뮤노글로불린 결합능 및 알칼리 내성을 유지한 친화성 크로마토그래피용 담체의 제공. 이뮤노글로불린 결합 단백질이며, 적어도 하나의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하고, 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 황색 포도상구균 단백질 A의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.

Description

이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 친화성 담체
본 발명은, 이뮤노글로불린 결합 단백질, 그것을 사용한 친화성 담체, 및 해당 친화성 담체를 사용한 이뮤노글로불린의 단리 방법 및 항체 의약의 제조 방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는, 분리 또는 정제를 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질(리간드)을 불용성 담체에 고정화한 리간드 고정화 담체가 충전된 칼럼을 사용하는 크로마토그래피이다. 친화성 크로마토그래피는, 예를 들어 단백질, 핵산 등의 생체 관련 물질의 분리·정제에 사용되고 있다(특허문헌 1). 친화성 크로마토그래피용 담체로서는, 예를 들어 아가로오스 겔로 대표되는 당쇄의 가교 입자나, 합성 중합체를 주성분으로 하는 입자가 사용되고 있다.
친화성 크로마토그래피용 담체의 제조에 있어서는, 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질인 리간드를 담체에 고정화할 필요가 있다. 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA) 및 그의 변이체는, 이뮤노글로불린에 대하여 특이적인 결합능을 갖는 대표적인 친화성 크로마토그래피 리간드로서 알려져 있다. SpA는, 항원에 대한 이뮤노글로불린의 높은 선택성에 대하여 현저한 영향을 주는 일이 없고, 이뮤노글로불린의 Fc 영역과 결합하는 능력을 갖기 때문에, 이뮤노글로불린 및 Fc 영역 함유 단백질을 효율적으로 포착 및 정제할 수 있다.
천연형의 SpA에는, 이뮤노글로불린에 대하여 결합능을 갖는 도메인으로서, N 말단으로부터 순서대로 E, D, A, B 및 C의 5개의 도메인이 포함된다. 이들 도메인, 및 B 도메인의 개변형 도메인인 Z 도메인은, 친화성 크로마토그래피 리간드로서 사용되고 있다. 또한, 이뮤노글로불린 결합능을 높일 목적에서, 상기 도메인을 2개 이상 연결시킨 것을 리간드로서 사용하는 것도 일반적이다.
상기의 SpA의 이뮤노글로불린 결합 도메인에는, 각각 3개의 α-헬릭스 구조가 포함되고, 이들 중 N 말단측의 2개의 α-헬릭스 부위가 이뮤노글로불린과의 결합에 기여하고 있는 것이 알려져 있다. 또한, 상기의 도메인 중 B 및 C 도메인에 있어서는, N 말단 3위치의 Asn 및 4위치의 Lys에 의해 턴 구조가 형성되어 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 따라서, B 도메인, C 도메인 또는 B 도메인의 개변형 도메인인 Z 도메인이 복수개 연결된 리간드에 있어서는, 상기의 턴 구조에 기인하여 각 도메인은 서로 굴곡한 배치로 연결되고, 이 굴곡한 배치에 기인하는 입체 장해를 야기하고 있다고 추측된다. 이 입체 장해는 B 도메인, C 도메인 또는 Z 도메인의 반복 구조를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피용 담체를 제조함에 있어서, 심각한 문제이다. 즉, 상기 입체 장해에 기인하여 리간드의 이뮤노글로불린 결합능이 낮게 머물러, 결과로서 일정량의 이뮤노글로불린을 정제하기 위하여 많은 담체량이 요구되게 된다. SpA를 리간드로 하는 친화성 크로마토그래피용 담체는 많은 경우 매우 고가여서, 많은 담체량이 요구되는 것은, 제조 비용의 관점에서 바람직하지 않다.
친화성 크로마토그래피용 담체는, 바이오세퍼레이션에 있어서의 용도에서는, 통상 반복 사용된다. 그 때문에 통상, 클리닝·인·플레이스(CIP)로서 알려진 협잡물을 제거하여 담체를 원래의 상태로 되돌리기 위한 세정 공정이, 반복 사용의 사이에 행해진다. CIP를 위한 시약으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 등의 알칼리성 액이 사용된다. 그러나, 리간드로서 단백질을 사용한 친화성 크로마토그래피용 담체에 있어서, 이러한 알칼리성 조건은 가혹하여, 리간드의 실활 또는 절단에 수반하여, 표적 분자에 대한 결합능을 상실하는 경우가 있다. 이러한 알칼리성 조건 하에 있어서의 리간드의 실활에 대해서는, 그 주요인으로서 Asn 및 Gln 잔기의 탈아미드화가 널리 알려져 있다. 특히, Asn은 알칼리 조건에 대한 감수성이 높고, 또한 그의 탈아미드화는 구조 의존적이고, Asn-Gly 또는 Asn-Ser로 표시되는 아미노산 서열 부위에서 종종 발생하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2).
상기의 알칼리성 조건 하에 있어서의 리간드의 실활을 회피하기 위한 종래 기술로서는, Asn 잔기의 결실이나 개변에 의해 알칼리에 대한 감수성을 저하시킨 리간드를 얻는 것을 들 수 있다. 이러한 리간드를 사용함으로써, 알칼리성 용액을 사용한 CIP를 복수회 실시한 후라도, 그 이뮤노글로불린 결합능을 유지할 수 있는 친화성 크로마토그래피 담체가 제공되고 있다. 예를 들어, 특허문헌 2에 있어서는, SpA의 B 도메인, C 도메인 또는 Z 도메인을 포함하는 친화성 크로마토그래피용 담체의 리간드이며, 적어도 하나의 도메인의 1위치 또는 2위치로부터 시작되는 N 말단측의 적어도 3개의 연속한 아미노산의 결실을 포함하는 리간드가 제공되어 있다. 또한, 특허문헌 3에 있어서는, N 말단측 3위치에서 6위치까지의 연속한 아미노산이 결실된 SpA의 C 도메인을 포함하는 친화성 크로마토그래피 담체용의 리간드가 제공되어 있다. 또한, 특허문헌 4에 있어서는, SpA의 Z 도메인이나 B 도메인 중의 Asn 잔기를 수식한 친화성 크로마토그래피 담체용의 리간드가 제공되어 있다. 그러나, 상기의 종래 기술은, 담체의 알칼리 내성을 높이는 것을 주목적으로 하고 있고, 담체의 이뮤노글로불린 결합능을 높이는 것은 언급하고 있지 않다.
일본 특허 공개 평6-281638호 공보 일본 특허 공개 제2012-254981호 공보 일본 특허 제5345539호 공보 일본 특허 공표 제2002-527107호 공보
Structure, 2014, 22:1467-1477 Journal of Biotechnology, 2000, 80:169-178
높은 이뮤노글로불린 결합능 및 알칼리 내성을 유지한, 효율적이고 또한 경제적 가치가 높은 친화성 담체가 요구되고 있다. 본 발명의 일 형식은, 이뮤노글로불린에 대한 결합능을 높인, 신규인 친화성 담체용 리간드를 제공하는 것이다. 또한 본 발명이 다른 형식은, 알칼리성 용액을 사용한 CIP를 반복하여 실시한 경우에 있어서도, 상술한 높은 이뮤노글로불린 결합능을 유지할 수 있는 친화성 담체를 제공하는 데 있다.
따라서 일 형태에 있어서, 본 발명은 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제공한다. 해당 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 적어도 하나의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하고, 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA)의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 일 실시 형태에 있어서, 상기 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이들과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 일 실시 형태에 있어서, 상기 적어도 하나의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은 이하로 이루어지는 군에서 선택된다:
서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 일 실시 형태에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기는, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 일 실시 형태에 있어서, 상기 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인은 Val1/Ala29 변이체이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 2 내지 12개의 상기 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함한다.
별도의 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
별도의 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
별도의 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 재조합체를 제공한다.
또한 별도의 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를, 무세포 단백질 합성계에 의해 발현시키거나, 또는 상기 재조합체에 있어서 발현시키는 것을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
추가적인 일 형태에 있어서, 본 발명은 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 해당 방법은, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 포함하는 방법이다.
추가적인 일 형태에 있어서, 본 발명은 이뮤노글로불린 결합 단백질의 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법을 제공한다. 해당 방법은, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 포함하는 방법이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법 및 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법의 일 실시 형태에 있어서, 상기 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이들과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법 및 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법은, 이하:
서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것;
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것; 또는
서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것
을 포함한다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법 및 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법의 일 실시 형태에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기는, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나이다.
본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법 및 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법의 일 실시 형태에 있어서, 상기 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인은 Val1/Ala29 변이체이다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법 및 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법은, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2 내지 12개 연결하는 것을 더 포함한다.
추가적인 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 이뮤노글로불린 결합 단백질이, 물에 대하여 불용성인 기재에 고정화되어 있는, 친화성 담체를 제공한다.
추가적인 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 친화성 담체를 사용하는, 이뮤노글로불린의 단리 방법을 제공한다.
추가적인 일 형태에 있어서, 본 발명은 상기 친화성 담체를 사용하는, 항체 의약의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 친화성 크로마토그래피용 담체용의 리간드로서 유용하다. 당해 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 해당 단백질 중에 포함되는 아미노기, 티올기 또는 카르복실기 등의 반응성 측쇄가 불용성 담체의 표면에 존재하는 관능기와 화학 결합함으로써, 해당 담체에 고정화될 수 있다. 당해 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 이뮤노글로불린 결합능이 높고, 또한 알칼리성 용액을 사용한 CIP를 반복하여 실시한 후에 있어서도 높은 이뮤노글로불린 결합능을 유지할 수 있다. 따라서, 당해 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 리간드로서 사용한 친화성 크로마토그래피용 담체는, 예를 들어 이뮤노글로불린의 정제에 사용한 경우, 일정량의 담체로 보다 많은 이뮤노글로불린을 정제할 수 있고, 또한 반복 사용해도 이뮤노글로불린의 동적 결합 용량이 저하되기 어렵기 때문에, 결과로서 이뮤노글로불린 정제의 프로세스를 저비용으로 실시하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서 중에서 인용된 모든 특허문헌, 비특허문헌 및 기타의 간행물은, 그 전체가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 동일성은, 립맨-피어슨법(Lipman-Pearson법; Science, 227, 1435-41, 1985)에 의해 계산된다. 구체적으로는, 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-Win(Ver. 5.1.1; 소프트웨어 개발)의 호몰로지 해석(Search homology) 프로그램을 사용하여, Unit size to compare(ktup)을 2로 하여 해석을 행함으로써 산출된다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 관한 「적어도 70％의 동일성」이란, 70％ 이상의 동일성, 바람직하게는 80％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 85％ 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 동일성, 보다 더 바람직하게는 95％ 이상의 동일성, 한층 바람직하게는 98％ 이상의 동일성, 한층 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 말한다.
본 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 상의 「상당하는 위치」는, 목적 서열과 참조 서열(예를 들어, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)을 각 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중에 존재하는 보존 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 최대의 상동성을 부여하도록 정렬(얼라인먼트)시킴으로써 결정할 수 있다. 얼라인먼트는, 공지된 알고리즘을 사용하여 실행할 수 있고, 그 수순은 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 얼라인먼트는, 상술한 립맨-피어슨법 등에 기초하여 수작업으로 행할 수도 있지만, Clustal W 멀티플 얼라인먼트 프로그램(Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680)을 디폴트 설정으로 사용함으로써 행할 수 있다. 또는, Clustal W의 개정판인 Clustal W2나 Clustal omega를 사용할 수도 있다. Clustal W, Clustal W2 및 Clustal omega는, 예를 들어 유럽 바이오 인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute: EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])나, 일본 국립 유전학 연구소가 운영하는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])의 웹 사이트 상에서 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「이뮤노글로불린 결합 단백질」이란, 이뮤노글로불린에 대한 결합능을 갖는 단백질을 말한다. 본 명세서에 있어서 「이뮤노글로불린 결합 도메인」이란, 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는, 이뮤노글로불린 결합에 관계되는 도메인을 말하고, 그 예로서는, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A(SpA)의 A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인, E 도메인, 및 B 도메인의 개변형 도메인인 Z 도메인을 들 수 있다.
1. 친화성 크로마토그래피용 담체
1.1. 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은 SpA의 B 도메인, C 도메인 또는 Z 도메인에서 유래되는, 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 적어도 하나 포함한다. 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치의 Asn 잔기와 4위치에 상당하는 위치의 Lys 잔기 사이에, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 친화성 담체의 리간드로서 사용할 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인의 친도메인으로서는, SpA의 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 도메인인 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체를 들 수 있다. 이 중, B 도메인, Z 도메인 및 C 도메인이 바람직하다. SpA의 B 도메인, Z 도메인 및 C 도메인은, 각각 서열 번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 도메인은, 그의 아미노산 서열 중의 3위치에 Asn 잔기, 4위치에 Lys 잔기를 갖고, 이들 아미노산 잔기로 구성되는 턴 구조를 갖는다.
상기 친도메인으로서 사용될 수 있는 상기 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 변이체로서는, 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 이뮤노글로불린 결합능을 갖고 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 또한, 해당 변이체는 그의 아미노산 서열 중의, 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3 내지 4위치에 상당하는 위치에, 연속하는 Asn 잔기와 Lys 잔기를 갖고, 이들 아미노산 잔기로 구성되는 턴 구조를 갖는다. 상기 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 변이체의 예로서는, 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 Val1/Ala29 변이체를 들 수 있다.
상기 변이체는 SpA의 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인에 대하여 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환 또는 결실이나, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등의 개변을 실시함으로써 제조할 수 있다. 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환 또는 결실의 수단으로서는, 상기 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 부위 특이적 돌연변이(Site-specific mutation) 등의 공지된 수단을 들 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 상기 친도메인의 아미노산 서열에 대하여, 상기 B, Z 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치에 상당하는 위치의 Asn 잔기와 4위치에 상당하는 위치의 Lys 잔기 사이에, 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열이 대하여, 그 3위치의 Asn 잔기와 4위치의 Lys 잔기 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 또는, 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖고, 또한 서열 번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3 내지 4위치에 상당하는 위치에 연속하는 Asn 잔기와 Lys 잔기를 갖는 이뮤노글로불린 결합 도메인 변이체의 아미노산 서열에 대하여, 당해 Asn 잔기와 Lys 잔기 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 이들 폴리펩티드는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖고, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능한다.
상기 친도메인에 삽입되는 적어도 하나의 아미노산 잔기로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 이들 중, Phe, Leu, Ile 및 Pro가 보다 바람직하고, 이어서 His, Tyr, Trp가 바람직하고, 이어서 Arg, Gln, Glu, Asp, Val, Met가 바람직하고, 이어서 Thr, Ala가 바람직하다. 따라서, 상기 친도메인에 삽입되는 아미노산 잔기는, 적합하게는 Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개이고, 보다 적합하게는 His, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개이고, 더욱 적합하게는 Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개이다. 상기 아미노산 잔기가 바람직한 이유로서는, 3위치의 Asn 잔기와 4위치의 Lys 잔기로 구성되는 턴 구조를 변화시킴과 함께, Asn-Gly 및 Asn-Ser로 표시되는 알칼리 감수성이 높은 아미노산 서열을 회피할 수 있기 때문이라고 추정된다. 삽입되는 아미노산 잔기의 수가 2개 이상인 경우, 그들은 모두 상이한 종류의 아미노산 잔기이거나 또는 동일한 종류의 아미노산 잔기를 복수 포함하고 있어도 된다. 더욱 바람직하게는, 상기 B, Z 또는 C 도메인 또는 그들의 변이체에 삽입되는 아미노산 잔기는 Phe, Leu, Ile 및 Pro로부터 선택되는 어느 하나이다.
상기 친도메인에 아미노산 잔기를 삽입하는 수단으로서는, 해당 친도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한, 상기의 삽입해야 하는 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입을 들 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 삽입을 위한 구체적인 방법으로서는, 부위 특이적 돌연변이, 상동 재조합법, SOE(splicing by overlap extension)-PCR법(Gene, 1989, 77:61-68) 등을 들 수 있고, 이들의 상세한 수순은 당업자에게 주지이다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 상술한 Asn과 Lys 사이에 아미노산 잔기가 삽입된 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하고 있으면 되지만, 바람직하게는 해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2개 이상 포함하고, 보다 바람직하게는 2 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개 포함한다. 개개의 도메인은, 서로 연결되어 있다. 보다 상세하게는, 어떤 도메인의 C 말단과 이웃 도메인의 N 말단이 연결되거나, 또는 그 반대이다. 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 복수의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인이 직선 형상으로 배치된 영역을 갖기 때문에, 도메인의 굴곡한 배치에 기인하는 입체 장해나 이뮤노글로불린 결합 저해를 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 높은 이뮤노글로불린 결합능을 갖는다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, B, Z 및 C 도메인 이외의 SpA의 이뮤노글로불린 결합 도메인(예를 들어, A 도메인, D 도메인 또는 E 도메인) 또는 그의 변이체를 포함하고 있어도 된다. 별도의 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 상술한 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에 아미노산 잔기가 삽입되어 있지 않은 B, Z 또는 C 도메인 또는 그들의 변이체를 포함하고 있어도 되지만, 바람직하게는 이들 도메인 또는 변이체를 포함하지 않는다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 모두는, 상술한 Asn과 Lys 사이에 아미노산 잔기가 삽입된 B, Z 또는 C 도메인 또는 그들의 변이체에서 유래되는 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인이다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 1로 표시되는 B 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 1로 표시되는 B 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 1로 표시되는 B 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 1의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 1로 표시되는 B 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 1의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 보다 한층 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 서열 번호 1로 표시되는 B 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 Val1/Ala29의 변이를 갖는 아미노산 서열이다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 Z 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 2의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 Z 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 2의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 보다 한층 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 Z 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 Val1/Ala29의 변이를 갖는 아미노산 서열이다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 3으로 표시되는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 3으로 표시되는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 3으로 표시되는 C 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 3의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 다른 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 서열 번호 3으로 표시되는 C 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열에 있어서, 서열 번호 3의 3 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys 사이에, Phe, Leu, Ile 및 Pro로 이루어지는 군에서 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서 기능하는 폴리펩티드를 포함한다. 보다 한층 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 서열 번호 3으로 표시되는 C 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열에 대하여 Val1/Ala29의 변이를 갖는 아미노산 서열이다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 상기 폴리펩티드는, 바람직하게는 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 3위치 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asn-Lys를 보존한 상태에서, 그들 잔기 사이에 아미노산이 삽입되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 2 내지 4위치에 상당하는 위치의 Asp-Asn-Lys 또는 Gln-Asn-Lys를 보존한 상태에서, 당해 Asn과 Lys 사이에 아미노산이 삽입되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 1 내지 4위치에 상당하는 위치의 Ala-Asp-Asn-Lys, Gln-Gln-Asn-Lys 또는 Val-Asp-Asn-Lys를 보존한 상태에서, 당해 Asn과 Lys 사이에 아미노산이 삽입되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 상기 3위치에 상당하는 위치의 Asn을 결실 또는 변이시키면, 상기 폴리펩티드의 당해 알칼리 내성은 향상되지만, 이뮤노글로불린 결합능이 저하되는 경우가 있다.
바람직하게는, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에 포함되는 상기 폴리펩티드는, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 1위치에 상당하는 위치에 Val 잔기를 갖고/갖거나, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 29위치에 상당하는 위치에 Ala 잔기를 갖는다.
바람직한 일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 상기 폴리펩티드를 2 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개 포함한다. 당해 폴리펩티드의 각각은, 동일한 것이거나 상이한 것이어도 된다. 바람직하게는, 당해 폴리펩티드의 각각은 그의 N 말단이, 인접하는 폴리펩티드의 C 말단에 연결되어 있다. 각 폴리펩티드는, 인접하는 폴리펩티드와 직접 연결해도 되고, 또는 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 통하여 연결해도 된다. 당해 펩티드의 예로서는, EF로 표시되는 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질의 바람직한 예로서는, 서열 번호 4 내지 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 4 내지 19로 표시되는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 1위치 Ala를 Val로, 29위치 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열에 대하여 3위치의 Asn과 4위치의 Lys 사이에 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기가 삽입된 C 도메인의 변이체를 4개 연결한 아미노산 서열이다. 서열 번호 20으로 표시되는 아미노산 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 1위치 Ala를 Val로, 29위치 Gly를 Ala로 치환한 아미노산 서열에 대하여 3위치의 Asn과 4위치의 Lys 사이에 Ile이 삽입된 Z 도메인의 변이체를 4개 연결한 아미노산 서열이다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질의 다른 바람직한 예로서는, 서열 번호 4 내지 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖고, 또한 서열 번호 4 내지 18의 4위치 내지 6위치, 63위치 내지 65위치, 122위치 내지 124위치 및 181위치 내지 183위치에 상당하는 위치에, 각각 Asn-X-Lys(X는 Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 또는 Tyr)가 배치된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드는 서열 번호 3의 1위치에 상당하는 위치에 Val을, 29위치에 상당하는 위치에 Ala를 갖는다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질의 다른 바람직한 예로서는, 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖고, 또한 서열 번호 19의 4위치 내지 7위치, 64위치 내지 67위치, 124위치 내지 127위치 및 184위치 내지 187위치에 상당하는 위치에, 각각 Asn-Ile-Thr-Lys가 배치된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드는 서열 번호 3의 1위치에 상당하는 위치에 Val을, 29위치에 상당하는 위치에 Ala를 갖는다.
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질의 다른 바람직한 예로서는, 서열 번호 20으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖고, 또한 서열 번호 20의 4위치 내지 6위치, 63위치 내지 65위치, 122위치 내지 124위치 및 181위치 내지 183위치에 상당하는 위치에, 각각 Asn-Ile-Lys가 배치된 아미노산 서열을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드는 서열 번호 2의 1위치에 상당하는 위치에 Val을, 29위치에 상당하는 위치에 Ala를 갖는다.
1.2. 폴리뉴클레오티드, 벡터
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA 등)를 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에 관한 폴리뉴클레오티드는, 상기 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질 또는 그의 등기능 변이체를 코딩한다. 본 명세서에 있어서, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 「등기능 변이체(functional variant)」란, 부분적인 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등에 의해 개변된 이뮤노글로불린 결합 단백질이며, 개변 전의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 유지하고, 상술한 Asn-Lys 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 구조를 유지하고, 또한 이뮤노글로불린 결합 활성에 있어서, 개변 전의 이뮤노글로불린 결합 단백질과 동등한 것으로서 취급할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 상술한 바와 같이, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질에는, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 1개 이상, 바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 3 내지 8개 갖는 단백질이 포함된다. 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 발현 플라스미드는 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
일 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 1 내지 20 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드를 코딩한다. 별도의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 1 내지 20 중 어느 하나로 표시되는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 등기능 변이체를 코딩한다. 또한 별도의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 23 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 또한 별도의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 23 내지 39 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또한 서열 번호 4 내지 20 중 어느 하나로 표시되는 이뮤노글로불린 결합 단백질의 등기능 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
1.3. 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조
상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로부터 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 제조하기 위한 표준 기술로서는, 예를 들어 Frederick M. Ausbel 등에 의한 Current Protocols In Molecular Biology나 Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(DNA 등)를 함유시킨 발현 벡터를 대장균 등의 숙주에 형질 전환하여, 얻어진 재조합체를 적절한 액체 배지에서 배양함으로써, 배양 후의 세포로부터, 목적으로 하는 개변 단백질을 대량 또한 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로서는, 숙주 세포 내에서 복제 가능한 기지의 벡터 어느 것도 사용할 수 있지만, 예를 들어 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나, Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 형질 전환을 위한 숙주로서는, 특별히 한정되지 않지만, 대장균 등의 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 포유류 세포 등의 재조합 단백질을 발현시키기 위하여 사용되는 공지된 숙주를 사용할 수 있다. 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질 전환시키기 위해서는, 각 숙주에 따라서 당해 기술 분야에 알려진 어느 방법을 사용해도 되고, 예를 들어 Sambrook 등 편집의 Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001) 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질 전환한 재조합체(세균 등)를 배양하여, 발현된 단백질을 회수하는 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 실시예에도 예시되어 있다.
또는, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질은, 무세포 단백질 합성계를 사용하여 발현시켜도 된다.
1.4. 담체
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질이 물에 대하여 불용성인 기재(담체)에 고정화된 친화성 담체를 제공한다. 해당 담체의 형상으로서는, 입자의 형태일 수 있고, 이러한 입자는 다공성이어도 비다공성이어도 된다. 입자상의 담체는 충전층으로서 사용할 수도 있고, 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순수한 현탁물로서 알려진 것이 포함되고, 그 중에서는 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모놀리스, 충전층 및 유동층의 경우, 분리 수순은 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법을 따른다. 순전한 현탁물의 경우에는, 회분법이 사용된다. 바람직하게는, 당해 담체는 충전제이다. 또는, 담체는 칩, 모세관 또는 필터와 같은 형태여도 된다. 또한, 담체로서 자성 입자를 사용해도 된다. 자성 입자로서는, 자기 유도에 의해 용이하게 자화될 수 있는 것이면 특별히 제한은 되지 않고, 예를 들어 사산화삼철(Fe3O4), 삼산화이철(γ-Fe2O3), 각종 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬 등의 금속이나, 코발트, 니켈, 망간 등의 합금을 포함하는 자성체 미립자, 또는 이들 자성체를 내부에 포함한 소수성 중합체, 친수성 중합체 등을 들 수 있다. 적합한 예로서는, 일본 특허 공개 제2008-32411호 공보에 기재된, 초상자성 미립자를 포함하는 모입자의 표면에, 소수성의 제1 중합체층이 형성되고, 당해 제1 중합체층 상에, 적어도 표면에 글리시딜기를 갖는 제2 중합체층이 형성되고, 당해 글리시딜기를 화학 수식함으로써, 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종의 원자를 1개 이상 포함하는 극성기가 도입된 자성 입자를 들 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 친화성 담체는, 친화성 크로마토그래피용 담체이다.
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체는, 바람직하게는 10 내지 500㎛, 보다 바람직하게는 20 내지 200㎛, 담체가 합성 중합체인 경우, 더욱 바람직하게는 20 내지 100㎛, 한층 바람직하게는 30 내지 80㎛, 담체가 다당인 경우, 더욱 바람직하게는 50 내지 200㎛, 한층 바람직하게는 60 내지 150㎛의 입경을 갖는다. 입경이 10㎛ 미만이면, 고유속 하에서 칼럼 압력이 높아져, 실용에 견디지 못한다. 입경이 500㎛를 초과하면, 이뮤노글로불린이 친화성 담체에 결합하는 양(결합 용량)이 떨어지는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 부피 평균 입경이다.
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체는, 바람직하게는 다공질이고, 50 내지 150㎡/g, 보다 바람직하게는 80 내지 130㎡/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 50㎡/g 미만이면, 결합 용량이 떨어지는 경우가 있고, 한편 150㎡/g를 초과하면, 담체의 강도가 떨어지기 때문에 고유속 하에서 담체가 파괴되어, 칼럼 압력이 상승하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 중량으로 나눈 값이다.
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체는, 바람직하게는 100 내지 1400nm, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 100 내지 400nm, 더욱 바람직하게는 200 내지 300nm, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 500 내지 1400nm, 더욱 바람직하게는 800 내지 1200nm의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기서, 부피 평균 세공 직경이 100nm 미만이면, 고유속 하의 결합 용량 저하가 현저해지는 경우가 있고, 한편 1400nm를 초과하면, 유속에 관계없이 결합 용량이 저하하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
담체가 상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 충족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로가 되는 입자 간의 간극 및 입자 내의 비교적 큰 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 밸런스가 최적화되어, 고유속 하의 결합 용량이 높은 레벨로 유지된다.
담체의 재질로서는, 예를 들어 친수성 표면을 갖는 중합체이고, 예를 들어 외표면에(그리고 존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH2 또는 N 치환형), 아미노기(-NH2 또는 치환형), 올리고 또는 폴리에틸렌옥시기를 갖는 중합체이다. 일 실시 형태에 있어서, 중합체는 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알코올계 등의 합성 중합체일 수 있고, 바람직하게는 다관능 (메트)아크릴레이트, 디비닐벤젠 등의 다관능 단량체로 가교된 공중합체와 같은 합성 중합체이다. 이러한 합성 중합체는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어, J. MATER. CHEM 1991, 1(3), 371-374에 기재된 방법을 참조하라). 또는, 도요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에 있어서의 중합체는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로오스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들어 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조하라). 또는, 세파로스(GE 헬스케어 바이오 사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 담체여도 된다.
본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체에 있어서, 담체로서 사용되는 다공성 입자의 일 구체예로서는, 예를 들어 10 내지 50질량％의 가교성 비닐 단량체와 3 내지 90질량％의 에폭시기 함유 비닐 단량체를 함유하고, 입경이 20 내지 80㎛이고, 비표면적이 50 내지 150㎡/g이고, 부피 평균 세공 직경이 100 내지 400nm인 다공성 유기 중합체 입자를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시 형태에 관한 친화성 담체를 수은 포로시미터로 측정한 경우의 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공의 침입 부피(세공 부피)는, 바람직하게는 1.3 내지 7.0mL/g, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 1.3 내지 2.5mL/g, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 3.0 내지 6.0mL/g이다.
1.5. 담체에 대한 리간드의 고정화
본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질(리간드)과 상기 담체의 결합 방법으로서는, 단백질을 담체에 고정화하는 일반적 방법을 사용하여 행할 수 있다. 고정화의 수단으로서는, 예를 들어 담체에 대한 리간드의 물리적 흡착, 담체와 리간드의 화학적 결합 등을 들 수 있다. 담체와 리간드의 화학적 결합을 위한 방법으로서는, 예를 들어 카르복시기를 갖는 담체를 사용하여, 이 카르복시기를 N-히드록시숙신산이미드에 의해 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 담체를 사용하여, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재 하에서 리간드의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법, 수산기를 갖는 담체를 사용하여, 브롬화시안 등의 할로겐화시안으로 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 또는 담체의 수산기를 토실화 또는 트레실화하여 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 담체에 도입하고, 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법, 및 에폭시기를 갖는 담체를 사용하여, 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다. 상기 중, 반응을 실시하는 수용액 중에서의 안정성의 관점에서는, 에폭시기를 통하여 리간드를 도입하는 결합 방법이 바람직하다.
에폭시기가 개환하여 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는, 담체 표면을 친수화하고, 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 함께, 수중에서 담체의 인성을 향상시켜, 고유속 하의 담체 파괴를 방지하는 역할을 한다. 따라서, 리간드를 고정화시킨 후의 담체 중에 리간드와 결합하고 있지 않은 잔여의 에폭시기가 존재하고 있는 경우, 당해 잔여의 에폭시기를 개환시키는 것이 바람직하다. 담체 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들어 수용매 중에서, 산 또는 알칼리에 의해, 가열 또는 실온 하에서 해당 담체를 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 갖는 블로킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블로킹제로, 에폭시기를 개환시켜도 된다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는, 담체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은, 원료로서 머캅토에탄올 등보다도 독성이 낮고, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는, 아미노기를 갖는 블로킹제에 의한 개환기보다도 비특이 흡착이 낮은데다, 담체의 동적 결합량이 높아진다고 하는 이점을 갖는다.
또한, 필요에 따라 담체와 리간드 사이에 임의의 길이의 분자(스페이서)를 도입해도 된다. 스페이서의 예로서는 폴리메틸렌쇄, 폴리에틸렌글리콜쇄, 당류 등을 들 수 있다. 스페이서에는, 예를 들어 담체 표면에 화학 결합할 수 있고, 또한 리간드와도 결합하는 2관능의 화합물을 사용할 수 있다.
1.6. 작용 효과
본 발명의 일 실시 형태에 따른, 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화한 친화성 담체는, 초기의 이뮤노글로불린 동적 결합 용량(DBC)이 높고, 또한 알칼리성 조건 하에서의 세정(예를 들어 0.01 내지 0.8M 수산화나트륨 등의 알칼리성 액을 사용한 세정)에 대해서도 성능의 현저한 저하가 없다.
2. 이뮤노글로불린을 단리하는 방법
본 발명의 일 실시 형태에 따른 이뮤노글로불린을 단리하는 방법을 설명한다. 본 실시 형태에 따른 이뮤노글로불린을 단리하는 방법은, 상기 본 발명의 변이 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화한 친화성 담체에, 이뮤노글로불린을 함유하는 시료를 접촉시켜, 해당 담체에 이뮤노글로불린을 흡착시키는 공정(제1 공정), 및 해당 담체로부터 해당 이뮤노글로불린을 용출시키는 공정(제2 공정)을 포함하고, 바람직하게는 해당 제2 공정 후에, 해당 담체를 알칼리성 액으로 세정하는 공정(제3 공정)을 더 포함한다. 본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법에 사용되는 본 발명의 친화성 담체는, 현탁 형태여도 되고, 칼럼에 충전된 상태여도 되고, 또는 칩, 모세관, 필터 또는 자성 입자와 같은 형태여도 된다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 제1 공정에서는, 상기 본 발명의 친화성 담체에, 이뮤노글로불린을 함유하는 시료를, 리간드에 이뮤노글로불린이 흡착하는 조건에서 접촉시킨다. 이 제1 공정에서는, 시료 중의 이뮤노글로불린 이외의 물질의 대부분은, 리간드에 흡착되지 않고 담체 상에 잔류하지 않는다. 이 후, 필요에 따라, 리간드에 약하게 유지된 일부의 물질을 제거하기 위해서, 담체를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액으로 세정해도 된다.
제2 공정에서는, pH2 내지 5의 적절한 완충액을 흘려, 리간드에 흡착된 이뮤노글로불린을 용출시킨다. 이 용출액을 회수함으로써, 시료로부터 이뮤노글로불린을 단리할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 이뮤노글로불린을 단리하는 방법에 있어서는, 바람직하게는 상기 제2 공정에 이어 제3 공정이 행해진다. 제3 공정에서는, 알칼리성 용액으로 담체를 세정(CIP 세정)한다. 제3 공정에 사용되는 알칼리성 액으로서는, 예를 들어 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다.
본 발명의 친화성 담체는, 단백질 리간드의 알칼리 내성 향상에 의해 상기 제3 공정에서의 세정 후에도 이뮤노글로불린 결합능을 안정적으로 유지하고 있기 때문에, 본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법에 반복하여 사용할 수 있다.
본 발명의 이뮤노글로불린 단리 방법의 일 실시 형태에 있어서, 단리해야 할 이뮤노글로불린은, 항체 또는 그것을 포함하는 의약일 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 친화성 담체를 사용하는 항체 의약의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법의 수순은, 목적으로 하는 항체 의약을 함유하는 시료를 사용하는 것 이외에는, 기본적으로 상술한 이뮤노글로불린 단리 방법의 수순과 동일하다.
실시예
이하, 본 발명을, 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 형태를 개괄적으로 나타내는 것이고, 특별한 이유 없이, 이러한 기재에 의해 본 발명은 한정되지 않는다.
참고예 1 다공질 입자의 합성
글리시딜메타크릴레이트(미쓰비시 레이온사제) 8.2g, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토마사제) 65.9g 및 글리세린모노메타크릴레이트(니치유사제) 90.6g을 2-옥타논(도요 고세이 고교사제) 245.8g 및 아세토페논(와코 쥰야꾸 고교사제) 62g에 용해시켜, 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야꾸 고교사제) 2g을 첨가하여, 유기 단량체 용액을 제조하였다.
이어서, 4240g의 순수에 폴리비닐알코올(구라레사제 PVA-217) 8.5g, 도데실황산나트륨(가오사제 에말 10G) 0.43g 및 황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교사제) 21.3g을 첨가하고, 밤새 교반하여 수용액을 제조하였다.
계속해서, 얻어진 수용액을 7L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하고, 온수 배스에 세팅하고, 질소 분위기 하에서, 600rpm으로 교반을 개시하였다. 계속해서, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하고, 수용액의 온도가 85℃가 되었을 때, 이 수용액에 적하 깔때기를 사용하여 상기 유기 단량체 용액을 첨가하고, 5시간 교반을 행하였다.
계속해서, 반응액을 냉각한 뒤, 이러한 반응액을 5L의 폴리프로필렌제 빈에 옮겨, 입자가 부유할 때까지 정치하고, 하방으로부터 여분의 물을 빨아내어 폐기하였다. 또한, 이 반응액에 아세톤을 첨가하여 입자를 침강시켰다. 이어서, 반응액을 3분간 정치하고, 데칸테이션에 의해 아세톤을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복한 뒤 물을 첨가하여, 입자를 침강시켰다. 또한, 3분간 정치하여 데칸테이션을 행하였다. 이 조작을 2회 반복하여 입자를 세정하였다. 또한, 입자의 분산액을 아세톤으로 다시 치환하고, 밤새 풍건한 뒤, 진공 건조기에서 건조를 행하여, 다공질 입자(이하, PB라고 기재함) 90g을 얻었다. PB의 평균 입경은 53㎛, 비표면적은 95㎡/g이었다.
실시예 1 C 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 1(IgGBPC1)의 제조
서열 번호 4에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 또한 이것을 사용하여 대장균 적격 세포 BL21(DE3)(STRATAGENE제)을 형질 전환하여 재조합체를 얻었다. 얻어진 재조합체를, 흡광도(OD600)가 약 10에 도달할 때까지 37℃에서 인큐베이트하였다. 그 후, 최종 농도에서 1mM이 되도록 IPTG(Sigma-Aldrich제)를 첨가하고, 추가로 4시간 37℃에서 인큐베이트하여, 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 단백질 발현 후, 세포를 회수하고, pH9.5의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다. 얻어진 세포 파쇄액으로부터, 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오 사이언스사제) 및 양이온 교환 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오 사이언스사제)에 의해 이뮤노글로불린 결합 단백질을 정제하였다. 정제한 이뮤노글로불린 결합 단백질을, 10mM 시트르산 완충액 pH6.6에 대하여 16시간 투석하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 이뮤노글로불린 결합 단백질의 순도는 95％ 이상이었다. 정제된 이뮤노글로불린 결합 단백질을, C 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 1(IgGBPC1)로 하였다. 이 단백질은, C 도메인(서열 번호 3)의 변이체를 4개 포함하고, 각 변이체 도메인에 있어서의 서열 번호 3의 3위치 내지 4위치에 대응하는 위치의 Asn-Lys 사이에는 Phe가 삽입되어 있다. 또한 IgGBPC1 중의 각 도메인은, 알칼리 내성 향상 변이 A1V/G29A(Protein Science, 2013, 22, 1230-1238)를 갖는다.
실시예 2 내지 16 C 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 2 내지 16(IgGBPC2 내지 IgGBPC16)의 제조
서열 번호 5 내지 19에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드를 각각 제조하고, 이후는 실질적으로 실시예 1과 동일한 공정으로 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 2 내지 16(IgGBPC2 내지 IgGBPC16)을 제조하였다. 이들 단백질은, C 도메인(서열 번호 3)의 변이체를 4개 포함하고, 각 변이체 도메인에 있어서의 서열 번호 3의 3위치 내지 4위치에 대응하는 위치의 Asn-Lys 사이에는 후술하는 표 1에 나타내는 아미노산이 삽입되어 있다. 또한 IgGBPC2 내지 16 중의 각 도메인은, 알칼리 내성 향상 변이 A1V/G29A를 갖는다.
실시예 17 Z 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 1(IgGBPZ1)의 제조
서열 번호 20에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 이후는 실질적으로 실시예 1과 동일한 공정으로 Z 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 1(IgGBPZ1)을 제조하였다. 이 단백질은, Z 도메인(서열 번호 2)의 변이체를 4개 포함하고, 각 변이체 도메인에 있어서의 서열 번호 2의 3위치 내지 4위치에 대응하는 위치의 Asn-Lys 사이에는 Ile가 삽입되어 있다. 또한 IgGBPZ1 중의 각 도메인은, 알칼리 내성 향상 변이 A1V/G29A를 갖는다.
비교예 1 C 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 0(IgGBPC0)의 제조
서열 번호 21에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 이후는 실질적으로 실시예 1과 동일한 공정으로 C 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 0(IgGBPC0)를 제조하였다. 이 단백질은, C 도메인(서열 번호 3)의 변이체를 4개 포함하지만, 각 변이체 도메인의 서열 번호 3의 3위치 내지 4위치에 대응하는 위치의 Asn-Lys 사이에 아미노산 잔기는 삽입되어 있지 않다. 또한 IgGBPC0는, 알칼리 내성 향상 변이체 도메인 A1V/G29A(Protein Science, 2013, 22, 1230-1238)를 갖는 알칼리 내성이 높은 이뮤노글로불린 결합 단백질이다.
비교예 2 Z 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 0(IgGBPZ0)의 제조
서열 번호 22에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드를 제조하고, 이후는 실질적으로 실시예 1과 동일한 공정으로 Z 도메인 재조합형 이뮤노글로불린 결합 단백질 0(IgGBPZ0)를 제조하였다. 이 단백질은, Z 도메인(서열 번호 2)의 변이체를 4개 포함하지만, 각 변이체 도메인의 서열 번호 2의 3위치 내지 4위치에 대응하는 위치의 Asn-Lys 사이에 아미노산 잔기는 삽입되어 있지 않다. 또한 IgGBPZ0는, 알칼리 내성 향상 변이체 도메인 A1V/G29A(Protein Science, 2013, 22, 1230-1238)를 갖는 알칼리 내성이 높은 이뮤노글로불린 결합 단백질이다.
실시예 1 내지 17 및 비교예 1 내지 2의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 표 1에 나타내었다.
Figure pct00001
시험예 1 친화성 크로마토그래피용 담체의 이뮤노글로불린 결합능
1) 담체에 대한 이뮤노글로불린 결합 단백질의 고정화
참고예 1에서 제조한 PB를 8mg 포함하도록 150μL의 순수에 현탁시키고, 필터 튜브(Millipore사)에 옮겨 원심하여 순수를 제거하였다. 여기에 1mg의 실시예 1에서 제조한 이뮤노글로불린 결합 단백질 1(IgGBPC1)을 용해한 450μL의 0.85M 황산나트륨을 포함하는 0.1M 탄산 완충액 pH9.8을 첨가하고, 25℃에서 5시간 진탕시켜, 이뮤노글로불린 결합 단백질을 PB에 결합시켰다. 생성한 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 450μL와 혼합하여 25℃에서 16시간 반응시켜, 잔여의 에폭시기를 블로킹하고, 0.5M NaOH로 세정 후, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH3.2), 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH7.6)로 세정하여, 450μL의 결합 다공질 입자(IgGBPC1/PB)를 얻었다. 동일한 수순으로, IgGBPC0, IgGBPC2 내지 16 및 IgGBPZ0 내지 1 중 어느 것이 결합한 다공질 입자(IgGBPC1 내지 16/PB 및 IgGBPZ0 내지 1/PB)를 얻었다.
2) 담체에 대한 이뮤노글로불린 결합 단백질 도입량의 측정
1mg의 IgGBPC1 내지 16/PB 및 IgGBPZ0 내지 1/PB 중 어느 것을 포함하는 150μL의 현탁액의 각각에 대해서, BCA Assay 키트(PIERCE사)를 사용하여, 담체에 결합한 이뮤노글로불린 결합 단백질의 도입량을 측정하였다.
3) IgG 동적 결합 용량의 측정
IgGBPC0 내지 16/BP 및 IgGBPZ0 내지 1/PB의 각각을 내경 0.5cm의 칼럼에 층 높이 20cm까지 충전하였다. 칼럼을 20mM 인산 버퍼(pH7.5)로 평형화한 후, 인간 폴리클로날 IgG(5mg/mL)를 포함하는 20mM 인산 버퍼(pH7.5)를 선 유속 300cm/시간으로 흘리고, 흡광도 모니터에서 용출액 중의 인간 폴리클로날 IgG 농도가 10％ 브레이크 스루(파과)일 때의 인간 폴리클로날 IgG 흡착량과 담체 부피로부터 동적 결합 용량(DBC)을 구하였다.
4) 내알칼리성 시험
3)에서 사용한 담체 충전 칼럼을 AKTAprime plus에 세팅하고, 0.5M 수산화나트륨 20mL를 칼럼 내에 흘렸다. 칼럼을 장치로부터 떼어 내고, 밀폐한 후 실온에서 일정 시간(15, 30, 45시간) 방치한 후, 3)과 동일한 수순으로, 선 유속 300cm/시간에 있어서의 인간 폴리클로날 IgG의 DBC를 측정하였다. 0.5M 수산화나트륨으로 처리하기 전의 DBC를 100％로 했을 때의 결합 용량 유지율(％DBC)을 구하였다.
각 친화성 크로마토그래피용 담체의 이뮤노글로불린 결합 단백질 도입량, DBC, 내알칼리성 시험의 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
담체에 대한 실시예 1 내지 17 및 비교예 1 내지 2의 이뮤노글로불린 결합 단백질의 결합량은 거의 동등하였다. 한편으로, 실시예 1 내지 17의 이뮤노글로불린 결합 단백질을 고정화한 담체(IgGBPC 1 내지 16/PB 및 IgGBPZ1/PB)는 비교예 1 또는 2의 단백질을 고정화한 담체(IgGBPC0/PB 및 IgGBPZ0/PB)와 비교하여, DBC가 향상되었다. 또한, IgGBPC1 내지 16/PB 및 IgGBPZ1/PB는, 0.5M 수산화나트륨에 최대 45시간 폭로한다고 하는 극히 가혹한 알칼리 조건 하에서도, 알칼리 내성 향상 변이를 갖는 IgGBPC0/PB 또는 IgGBPZ0/PB와 동등한 높은 알칼리 내성을 갖고, 비교적 높은 DBC를 유지할 수 있었다. 따라서, SpA 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열의 3위치 Asn과 4위치 Lys 사이에 아미노산 잔기를 삽입한 개변 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 단백질을 리간드로서 사용함으로써, 높은 DBC와 알칼리 내성을 갖는 친화성 크로마토그래피용 담체를 얻을 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> JSR Corporation JSR Life Sciences Corporation <120> Immunoglobrin Binding Protein and Affinity Support using the same <130> JSR0071 <150> JP2015-063519 <151> 2015-03-26 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, B domain <400> 1 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, Z domain <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> Protein A, C domain <400> 3 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC1 <400> 4 Met Val Asp Asn Phe Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Phe 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Phe Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Phe Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC2 <400> 5 Met Val Asp Asn Leu Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Leu 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Leu Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Leu Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 6 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC3 <400> 6 Met Val Asp Asn Ile Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Ile 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Ile Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Ile Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC4 <400> 7 Met Val Asp Asn Pro Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Pro 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Pro Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Pro Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 8 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC5 <400> 8 Met Val Asp Asn Gln Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Gln Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Gln Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 9 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC6 <400> 9 Met Val Asp Asn His Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn His 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn His Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 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Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Arg Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Arg Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 11 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC8 <400> 11 Met Val Asp Asn Thr Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Thr 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Thr Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Thr Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 195 200 205 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 210 215 220 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 235 <210> 12 <211> 237 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus 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<213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC14 <400> 17 Met Val Asp Asn Glu Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 20 25 30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Glu 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Glu Lys Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Asn Glu Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 180 185 190 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 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cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 24 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC2 <400> 24 atggtggata acctgaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacc tgaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacctga aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacctgaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg 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agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacc ataaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataaccata aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aaccataaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 29 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC7 <400> 29 atggtggata accgcaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacc gcaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataaccgca aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aaccgcaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 30 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC8 <400> 30 atggtggata acaccaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataaca ccaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacacca aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacaccaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 31 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC9 <400> 31 atggtggata actataaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataact ataaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataactata aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aactataaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 32 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC10 <400> 32 atggtggata acgcgaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacg cgaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacgcga aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacgcgaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 33 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC11 <400> 33 atggtggata acatgaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataaca tgaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacatga aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacatgaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 34 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC12 <400> 34 atggtggata acgataaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacg ataaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacgata aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacgataaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 35 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC13 <400> 35 atggtggata actggaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataact ggaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataactgga aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aactggaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 36 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC14 <400> 36 atggtggata acgaaaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacg aaaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacgaaa aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacgaaaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 37 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC15 <400> 37 atggtggata acgtgaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaccgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agcgtgagca aagaaattct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataacg tgaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga ccgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 gtgagcaaag aaattctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacgtga aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaccg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagcgtg 480 agcaaagaaa ttctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacgtgaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaccgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc 660 aaagaaattc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711 <210> 38 <211> 723 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPC16 <400> 38 atggtggata acattaccaa atttaacaaa gaacagcaga acgcgtttta tgaaattctg 60 catctgccga acctgaccga agaacagcgc aacgcgttta ttcagagcct gaaagatgat 120 ccgagcgtga gcaaagaaat tgcggaagcg aaaaaactga acgatgcgca ggcgccgaaa 180 taagtggata acattaccaa atttaacaaa gaacagcaga acgcgtttta tgaaattctg 240 catctgccga acctgaccga agaacagcgc aacgcgttta ttcagagcct gaaagatgat 300 ccgagcgtga gcaaagaaat tgcggaagcg aaaaaactga acgatgcgca ggcgccgaaa 360 taagtggata acattaccaa atttaacaaa gaacagcaga acgcgtttta tgaaattctg 420 catctgccga acctgaccga agaacagcgc aacgcgttta ttcagagcct gaaagatgat 480 ccgagcgtga gcaaagaaat tgcggaagcg aaaaaactga acgatgcgca ggcgccgaaa 540 taagtggata acattaccaa atttaacaaa gaacagcaga acgcgtttta tgaaattctg 600 catctgccga acctgaccga agaacagcgc aacgcgttta ttcagagcct gaaagatgat 660 ccgagcgtga gcaaagaaat tgcggaagcg aaaaaactga acgatgcgca ggcgccgaaa 720 taa 723 <210> 39 <211> 711 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <223> IgGBPZ1 <400> 39 atggtggata acattaaatt taacaaagaa cagcagaacg cgttttatga aattctgcat 60 ctgccgaacc tgaacgaaga acagcgcaac gcgtttattc agagcctgaa agatgatccg 120 agccagagcg cgaacctgct ggaagcgaaa aaactgaacg atgcgcaggc gccgaaataa 180 gtggataaca ttaaatttaa caaagaacag cagaacgcgt tttatgaaat tctgcatctg 240 ccgaacctga acgaagaaca gcgcaacgcg tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc 300 cagagcgcga acctgctgga agcgaaaaaa ctgaacgatg cgcaggcgcc gaaataagtg 360 gataacatta aatttaacaa agaacagcag aacgcgtttt atgaaattct gcatctgccg 420 aacctgaacg aagaacagcg caacgcgttt attcagagcc tgaaagatga tccgagccag 480 agcgcgaacc tgctggaagc gaaaaaactg aacgatgcgc aggcgccgaa ataagtggat 540 aacattaaat ttaacaaaga acagcagaac gcgttttatg aaattctgca tctgccgaac 600 ctgaacgaag aacagcgcaa cgcgtttatt cagagcctga aagatgatcc gagccagagc 660 gcgaacctgc tggaagcgaa aaaactgaac gatgcgcagg cgccgaaata a 711

Claims (20)

  1. 이뮤노글로불린 결합 단백질이며,
    적어도 하나의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하고,
    해당 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인은, 황색 포도상구균 단백질 A의 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인,
    이뮤노글로불린 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인이, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이들과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인인,
    이뮤노글로불린 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인이, 이하로 이루어지는 군에서 선택되는, 이뮤노글로불린 결합 단백질:
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인이 Val1/Ala29 변이체인, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2 내지 12개의 상기 개변 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 기재된 벡터를 포함하는 재조합체.
  10. 제7항에 기재된 폴리뉴클레오티드를, 무세포 단백질 합성계에 의해 발현시키거나, 또는 제8항에 기재된 재조합체에 있어서 발현시키는 것을 포함하는, 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법.
  11. 이뮤노글로불린 결합 단백질의 제조 방법이며,
    황색 포도상구균 단백질 A에서 유래되는 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 포함하는,
    방법.
  12. 이뮤노글로불린 결합 단백질의 이뮤노글로불린 결합능의 향상 방법이며,
    황색 포도상구균 단백질 A에서 유래되는 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인의 아미노산 서열에 대하여, 해당 B 도메인, Z 도메인 또는 C 도메인의 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 포함하는,
    방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 B 도메인, Z 도메인, C 도메인 및 그들의 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 이뮤노글로불린 결합 도메인이, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이들과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는,
    방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것;
    서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것; 또는
    서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이것과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인에 대하여, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 3위치와 4위치에 상당하는 위치 사이에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하는 것
    을 포함하는, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, His, Met, Thr, Val, Phe, Leu, Ile, Pro, Trp 및 Tyr로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 결합 도메인이 Val1/Ala29 변이체인, 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입된 이뮤노글로불린 결합 도메인을 2 내지 12개 연결하는 것을 더 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 이뮤노글로불린 결합 단백질이, 물에 대하여 불용성인 기재에 고정화되어 있는, 친화성 담체.
  19. 제18항에 기재된 친화성 담체를 사용하는, 이뮤노글로불린의 단리 방법.
  20. 제18항에 기재된 친화성 담체를 사용하는, 항체 의약의 제조 방법.
KR1020177026578A 2015-03-26 2016-03-24 이뮤노글로불린 결합 단백질 및 그것을 사용한 친화성 담체 KR102577963B1 (ko)

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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020198783A (ja) * 2017-08-24 2020-12-17 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィーリガンド
WO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
KR20210122788A (ko) * 2019-02-01 2021-10-12 나피고 프로타인스 게엠베하 친화도 정제를 위한 면역글로불린 결합 단백질
GB201904125D0 (en) 2019-03-26 2019-05-08 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for sanitization of a chromatography column
CN112940090B (zh) * 2021-03-18 2023-02-24 广州康盛生物科技股份有限公司 耐受辐照灭菌及高效消毒的蛋白a免疫吸附介质
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides
CN114409801B (zh) * 2021-12-22 2023-04-18 苏州赛分科技股份有限公司 基于重组蛋白a的亲和层析介质及其制备方法和应用
CN113999294B (zh) * 2021-12-30 2022-03-29 苏州纳微科技股份有限公司 免疫球蛋白结合蛋白及其应用
GB202203478D0 (en) 2022-03-14 2022-04-27 Cytiva Bioprocess R & D Ab Vh3 binding polypeptides
CN114605508B (zh) * 2022-05-11 2022-07-29 北京达成生物科技有限公司 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用
CN116217680B (zh) * 2023-01-10 2024-02-02 珠海冀百康生物科技有限公司 碱稳定性高的免疫球蛋白结合蛋白及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5345539U (ko) 1976-09-22 1978-04-18
JPH06281638A (ja) 1993-03-25 1994-10-07 Ngk Insulators Ltd アフィニティクロマトグラフィー用充填剤
JP2002527107A (ja) 1998-10-21 2002-08-27 アフィボディ・テクノロジー・スウェーデン・アーベー アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド
EP2495253A1 (en) * 2008-08-11 2012-09-05 EMD Millipore Corporation Novel immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
EP2532672A2 (en) * 2011-06-08 2012-12-12 EMD Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
EP2690173A1 (en) * 2011-03-25 2014-01-29 Kaneka Corporation Protein for affinity-separation matrix
EP2728000A1 (en) * 2011-06-03 2014-05-07 National Institute of Advanced Industrial Science And Technology Protein a mutant protein having reduced affinity in acidic region, and antibody capture agent
WO2015005859A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
JP2006304633A (ja) * 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
EP1933883B1 (en) * 2005-08-03 2015-10-07 Rq Bioscience, Inc. Methods and compositions for diagnosis of iga-and igm-mediated kidney diseases
JP4179517B2 (ja) * 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
WO2007097361A1 (ja) * 2006-02-21 2007-08-30 Protenova Co., Ltd. イムノグロブリン親和性リガンド
CA2648849A1 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding proteins comprising immunoglobulin hinge and fc regions having altered fc effector functions
CN101522278B (zh) 2006-09-29 2016-08-10 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于抗体分离的包含来自金黄色葡萄球菌a蛋白的结构域c的层析配体
JP5522723B2 (ja) * 2007-05-21 2014-06-18 ノマディックバイオサイエンス株式会社 新規ポリペプチド，アフィニティークロマトグラフィー用材，及びイムノグロブリンの分離及び／又は精製方法
AU2011274367B2 (en) * 2010-07-02 2015-04-23 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) variants
CN103270044B (zh) * 2010-12-21 2016-03-09 Jsr株式会社 亲和色谱用载体和分离免疫球蛋白的方法
JP5933526B2 (ja) 2011-03-25 2016-06-08 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
JP6456831B2 (ja) * 2013-09-04 2019-01-23 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン結合ドメイン多量体
EP3255058B1 (en) * 2015-02-05 2021-03-24 Mitsubishi Chemical Corporation Protein having affinity to immunoglobulin, and affinity separation medium and column for liquid chromatography using same

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5345539U (ko) 1976-09-22 1978-04-18
JPH06281638A (ja) 1993-03-25 1994-10-07 Ngk Insulators Ltd アフィニティクロマトグラフィー用充填剤
JP2002527107A (ja) 1998-10-21 2002-08-27 アフィボディ・テクノロジー・スウェーデン・アーベー アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド
EP2495253A1 (en) * 2008-08-11 2012-09-05 EMD Millipore Corporation Novel immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
EP2690173A1 (en) * 2011-03-25 2014-01-29 Kaneka Corporation Protein for affinity-separation matrix
EP2728000A1 (en) * 2011-06-03 2014-05-07 National Institute of Advanced Industrial Science And Technology Protein a mutant protein having reduced affinity in acidic region, and antibody capture agent
EP2532672A2 (en) * 2011-06-08 2012-12-12 EMD Millipore Corporation Chromatography matrices including novel Staphylococcus aureus protein A based ligands
JP2012254981A (ja) 2011-06-08 2012-12-27 Emd Millipore Corp 新規なスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）プロテインＡベースのリガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス
WO2015005859A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Biotechnology, 2000, 80:169-178
Structure, 2014, 22:1467-1477

Also Published As

Publication number Publication date
TWI709571B (zh) 2020-11-11
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