TW201704252A - 免疫球蛋白結合蛋白質及使用此之親和性載體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供保持高的免疫球蛋白結合能及鹼耐性之親和性層析法用載體。一種免疫球蛋白結合蛋白質，其含有至少一個變性免疫球蛋白結合區域，該變性免疫球蛋白結合區域係對於自金黃色葡萄球菌蛋白質A之B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成之群選出之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於相當於該B區域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。

Description

免疫球蛋白結合蛋白質及使用此之親和性載體
本發明有關免疫球蛋白結合蛋白質、使用此之親和性載體、以及使用該親和性載體之免疫球蛋白之單離方法及抗體醫藥之製造方法。
親和性層析係使用填充有可與成為分離或純化目的之物質特異結合之物質(配位體)固定化於不溶性載體之配位體固定化載體的管柱之層析。親和性層析係用於例如蛋白質、核酸等之生物相關物質之分離/純化(專利文獻1)。作為親和性層析用載體係使用例如以瓊脂膠體為代表之糖鏈之交聯粒子或以合成聚合物為主成分之粒子。
親和性層析用載體之製作中，有必要將與目的物質特異結合之物質的配位體固定化於載體上。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A(SpA)及其變異體已知作為對於免疫球蛋白具有特異結合能之代表性親和性層析配位體。SpA對於免疫球蛋白對於抗原之高選擇性並未帶來顯著影響，由於具有與免疫球蛋白之Fc區 域結合之能力，故可有效地捕捉及純化免疫球蛋白及含Fc區域之蛋白質。
天然型之SpA自N端起依序含有E、D、A、B及C之5個區域作為對於免疫球蛋白具有結合能之區域。該等區域以及B區域之改性型區域的Z區域係作為親和性層析配位體使用。且，基於提高免疫球蛋白結合能之目的，一般亦使用連結2個以上上述區域者作為配位體。
於上述之SpA之免疫球蛋白結合區域分別含有3個α-螺旋構造，已知該等中N末端側之2個α-螺旋部位有助於與免疫球蛋白之結合。再者，已報導上述區域中之B及C區域中，由N末端3位之Asn及4位之Lys形成彎折(turn)構造(非專利文獻1)。因此，連結複數個B區域、C區域或B區域之改性型區域的Z區域而成之配位體中，推測會引起起因於上述彎折構造、各區域相互彎曲配置地連結並起因於該彎曲配置之立體障礙。該立體障礙在製作以B區域、C區域或Z區域之重複構造作為配位體之親和性層析用載體時為嚴重問題。亦即，起因於上述立體障礙之配位體之免疫球蛋白結合能侷限於較低，結果為了純化一定量之免疫球蛋白而要求較多載體量。以SpA為配位體之親和性層析用載體大多情況下非常昂貴，於要求較多載體量時基於製造成本之觀點並不期望。
親和性層析用載體在生物分離之用途中通常 重複使用。因此通常於反覆使用之間進行作為定位清洗(cleaning in place；CIP)而已知之去除夾雜物使載體恢復至原狀態之洗淨步驟。用於CIP之試藥係使用例如氫氧化鈉等之鹼性液。然而，對使用蛋白質作為配位體之親和性層析用載體而言，此種鹼性條件過於嚴苛，伴隨著配位體之失活或切斷，有失去對標的分子之結合能之情況。該鹼性條件下之配位體之失活中，其主要原因廣泛已知係Asn及Gln殘基之脫醯胺化。尤其已報導，Asn對於鹼性條件之感受性高，且該脫醯胺化係構造依存性，經常發生於以Asn-Gly或Asn-Ser表示之胺基酸序列部位(非專利文獻2)。
作為避免在上述鹼性條件下之配位體失活之先前技術，舉例為藉由使Asn殘基缺失或變性而獲得對於鹼之感受性降低之配位體。藉由使用該配位體，於使用鹼性溶液實施複數次CIP後，仍可提供可維持該親和性結合能之親和性層析載體。例如，專利文獻2中，提供含SpA之B區域、C區域或Z區域之親和性層析用載體之配位體，且係包含自至少1個區域之1位或2位開始之N末端側之至少3個連續胺基酸之缺失之配位體。又，專利文獻3中，提供包含自N末端側3位至6位之連續胺基酸缺失之SpA之C區域的親和性層析用載體用之配位體。且，專利文獻4中，提供SpA之Z區域或B區域中之Asn殘基經修飾之親和性層析用載體之配位體。然而，上述先前技術主要目的係提高載體之耐鹼性，並未提及提高載體之 免疫球蛋白結合能。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開平6-281638號公報
[專利文獻2]日本特開2012-254981號公報
[專利文獻3]日本專利第5345539號公報
[專利文獻4]日本特表2002-527107號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Structure, 2014, 22:1467-1477
[非專利文獻2]Journal of Biotechnology, 2000, 80:169-178
要求能保持高的免疫球蛋白結合能及耐鹼性，且有效率且經濟價值高的親和性載體。本發明之一形式係提供提高對於免疫球蛋白之結合能之新穎親和性載體用配位體。又本發明另一形式係提供於使用鹼性溶液反覆實施CIP時，仍可維持上述高的免疫球蛋白結合能之親和性載體。
因此一樣態中，本發明提供免疫球蛋白結合蛋白質。該免疫球蛋白結合蛋白質含有至少一個變性免疫球蛋白結合區域，該變性免疫球蛋白結合區域係由胺基酸序列所成之聚胜肽，該聚胜肽係對於選自由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A(SpA)之B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於相當於該B區域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列者。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之一實施形態中，選自前述B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域係由以序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列、或與該等具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之一實施形態中，前述至少一個變性免疫球蛋白結合區域係選自由以下所成群者：對於由序列編號1所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號1所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽； 對於由序列編號2所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號2所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽；及對於由序列編號3所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號3所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之一實施形態中，前述至少一個胺基酸殘基係選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之至少一者。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之一實施形態中，由與前述序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域係Val1/Ala29變異體。
一實施形態中，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含2~12個前述變性免疫球蛋白結合區域。
另一樣態中，本發明提供一種編碼上述變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸。
另一樣態中，本發明提供一種包含上述聚核苷酸之媒劑(vector)。
另一樣態中，本發明提供一種包含上述媒劑之重組體。
又另一樣態中，本發明提供一種免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法，其包含藉由無細胞蛋白質合成系使上述聚核苷酸表現或於上述重組體中表現。
進而一樣態中，本發明提供免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法。該方法係包含對於選自由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A之B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於相當於該B區域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之方法。
進而一樣態中，本發明提供免疫球蛋白結合蛋白質之免疫球蛋白結合能之提高方法。該方法係包含對於選自由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A之B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於相當於該B區域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之方法。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法及免疫球蛋白結合能之提高方法之一實施形態中，選自前述B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域係由以序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列、或與該等具有至少70%之相同性之胺基酸序列所 成之免疫球蛋白結合區域。
一實施形態中，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法及免疫球蛋白結合能之提高方法包含以下：對於由序列編號1所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號1所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基；對於由序列編號2所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號2所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基；或對於由序列編號3所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號3所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法及免疫球蛋白結合能之提高方法之一實施形態中，前述至少一個胺基酸殘基係選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之至少一者。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法及免疫球蛋白結合能之提高方法之一實施形態中，由與前述序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列具有至少70% 之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域係Val1/Ala29變異體。
一實施形態中，本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法及免疫球蛋白結合能之提高方法進而包含使2~12個插入有前述至少1個胺基酸殘基之免疫球蛋白結合區域連結。
進而一樣態中，本發明提供一種親和性載體，其係將上述免疫球蛋白結合蛋白質固定化於對水不溶性之基材者。
進而一樣態中，本發明提供一種免疫球蛋白之單離方法，其係使用上述親和性載體。
進而一樣態中，本發明提供一種抗體醫藥之製造方法，係使用上述之親和性載體。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質於作為親和性層析用載體用之配位體有用。該變異免疫球蛋白結合蛋白質藉由使該蛋白質中所含之胺基、硫醇基或羧基等之反應性側鏈與不溶性載體表面上存在之官能基化學鍵結，可固定化於該載體上。該變異免疫球蛋白結合蛋白質之免疫球蛋白結合能高，且即使使用鹼性溶液反覆實施CIP之後仍可維持高的免疫球蛋白結合能。因此，使用該變異免疫球蛋白結合蛋白質作為配位體之親和性層析用載體使用於例如免疫球蛋白之純化時，可藉一定量載體純化 更多免疫球蛋白，且即使重複使用亦不易使免疫球蛋白之動態結合容量降低，故結果可以低成本實施免疫球蛋白純化之製程。
本說明書中引用之所有專利文獻、非專利文獻及其他發行物，其全體於本說明書中作為參考加以援用。
本說明書中，胺基酸序列及核苷酸序列相同性係藉由Lipman-Pearson法(Science,227,1435-41,1985)計算而得。具體而言，使用基因資訊處理軟體Genetyx-Win(Ver.5.1.1；軟體開發)之同源性解析(Sear homology)程式，將比較單位大小(ktup)作為2進行解析而算出。
本說明書中，關於胺基酸序列及核苷酸序列之「至少70%相同性」意指70%以上相同性，較好80%以上相同性、更好85%以上相同性，又更好90%以上相同性，再更好95%以上相同性，又再更好為98%以上相同性，又較好為99%以上相同性。
本說明書中，胺基酸序列及核苷酸序列上之「相當位置」可藉由使目的序列與參考序列(例如以序列編號3表示之胺基酸序列)於各胺酸序列或核苷酸序列中存在之保存胺基酸殘基或核苷酸殘基賦予最大相同性之方式排列(alignment)而決定。排列可使用習知演算法執 行，其順序為本技藝者所習知。例如排列亦可藉由基於上述之Lipman-Pearson法等之手工操作進行，但可藉由以默認設定(default setting)使用Clustal W多重排列程式(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res.,22：4673-4680)而進行。或者亦可使用Clustal W之修訂版的Clustal W2或Clustal omega。Clustal W、Clustal W2及Clustal omega可於歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])或國立基因研究所營運之日本DNA資料庫(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])之網站上加以利用。
本說明書中所謂「免疫球蛋白結合蛋白質」意指對於免疫球蛋白具有結合能之蛋白質。本說明書中所謂「免疫球蛋白結合區域」意指免疫球蛋白結合蛋白質中所含之與免疫球蛋白結合相關之區域，作為其例，舉例為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A(SpA)之A區域、B區域、C區域、D區域、E區域及B區域之變性型區域的Z區域。
1.親和性層析用載體
1.1.變異免疫球蛋白結合蛋白質
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含至少1個源自SpA之B區域、C區域或Z區域之變性免疫球蛋白結合區域。該變性免疫球蛋白結合區域係對於相當於該B區 域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位之位置的Asn殘基與相當於4位之位置之Lys殘基之間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質可使用作為親和性載體之配位體。
作為本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質中所含之變性免疫球蛋白結合區域之母區域舉例有具有SpA之免疫球蛋白結合能之區域的B區域、Z區域、C區域及該等之變異體。其中較好為B區域、Z區域及C區域。SpA之B區域、Z區域及C區域分別為由序列編號1、2及3所示之胺基酸序列所成之聚胜肽。該等區域於其胺基酸序列中之3位具有Asn殘基，於4位具有Lys殘基，具有由該等胺基酸殘基所構成之彎折構造。
可作為上述母區域使用之上述B區域、Z區域或C區域之變異體，舉例為與序列編號1、2或3所示之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列所成且具有免疫球蛋白結合能之作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。再者，該變異體於其胺基酸序列中之相當於以序列編號1、2或3所示之胺基酸序列之3~4位相當之位置具有連續之Asn殘基與Lys殘基，具有由該等胺基酸殘基構成之彎折構造。作為上述B區域、Z區域或C區域之變異體之例，舉例為由以序列編號1、2或3所示之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域之Val1/Ala29變異體。
上述變異體可藉由對SpA之B區域、Z區域 或C區域實施胺基酸殘基之附加、刪除、取代或缺失、或胺基酸殘基之化學修飾等變性而製作。作為胺基酸殘基之附加、刪除、取代或缺失之手段，舉例有對於編碼上述區域之聚核苷酸之部位特異之突然變異(Site-specific mutation)等之習知手段。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質中所含之變性免疫球蛋白結合區域可藉由對上述母區域之胺基酸序列，於上述B、Z或C區域之胺基酸序列之相當於3位的位置之Asn殘基與相當於4位的位置之Lys殘基之間插入至少1個胺基酸殘基而獲得。例如，該變性免疫球蛋白結合區域係由對於以序列編號1、2或3所示之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於其3位之Asn殘基與4位之Lys殘基之間插入至少1個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。或者，該變性免疫球蛋白結合區域與以序列編號1~3所示之胺基酸序列具有至少70%之相同性且係由對於相當於序列編號1~3所示之胺基酸序列之3~4位之位置具有連續之Asn殘基與Lys殘基之免疫球蛋白結合區域變異體之胺基酸序列，於該Asn殘基與Lys殘基之間插入至少1個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。該等聚胜肽具有免疫球蛋白結合能，係作為免疫球蛋白結合區域發揮功能。
作為插入上述母區域之至少1個胺基酸殘基並未特別限定，但舉例為例如選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、 Trp及Tyr所成群之至少一者，較好為1~4個，更好1~2個胺基酸殘基。該等中，更好為Phe、Leu、Ile及Pro，其次較好為His、Tyr、Trp，其次較好為Arg、Gln、Glu、Asp、Val、Met，其次較好為Thr、Ala。然而插入上述母區域之胺基酸殘基較好為選自Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之至少一者，較好為1~4個，更好1~2個，更佳為選自His、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之至少一者，較好為1~4個，更好1~2個，又更好為選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之至少一者，較好為1~4個，更好1~2個。作為上述胺基酸殘基較好之理由，推定為可使由3位之Asn殘基與4位之Lys殘基所構成之彎折構造產生變化，且可避免以Asn-Gly及Asn-Ser表示之鹼感受性高的胺基酸序列之故。所插入之胺基酸殘基之數為2個以上時，該等可為完全不同種類之胺基酸殘基，或亦可包含複數之相同種類之胺基酸殘基。進而較好上述B、Z或C區域、或插入於該等變異體之胺基酸殘基係選自Phe、Leu、Ile及Pro之任一者。
作為對上述母區域插入胺基酸殘基之手段，舉例為對於編碼該母區域之核苷酸序列插入編碼上述應插入之胺基酸殘基之核苷酸序列。核苷酸序列插入之具體手法可舉例部位特異之突然變異、相同重組法、SOE(splicing by overlap extension，重疊拼接延伸)-PCR法(Gene,1989,77：61-68)等，該等之詳述順序為本技藝周 知。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質若為含有1個以上之於上述Asn與Lys之間插入有胺基酸殘基之變性免疫球蛋白結合區域即可，但較好含有2個以上之該變性免疫球蛋白結合區域，更好含有2~12個，再更好含有3~8個。各個區域係相互連結。更詳細而言，某區域之C末端與相鄰之區域之N末端連結或相反。本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質由於具有複數之變性免疫球蛋白結合區域配置為直線狀之區域，故可防止起因於區域彎曲配置之立體障礙或免疫球蛋白結合阻礙。因此，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質具有高的免疫球蛋白結合能。
一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質亦可含有B、Z及C區域以外之SpA之免疫球蛋白結合區域(例如A區域、D區域或E區域)或其變異體。另一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質亦可含有於上述3位Asn與4位Lys之間未插入胺基酸殘基之B、Z或C區域或該等之變異體，但較好不含該等區域或變異體。較佳實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質中所含之免疫球蛋白結合區域全部為源自於上述Asn與Lys之間插入有胺基酸殘基之B、Z或C區域或該等之變異體之變性免疫球蛋白結合區域。
較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號1所示之B區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Ala、 Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號1所示之B區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號1所示之B區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號1之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號1所示之B區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號1之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，與序列編號1所示之B區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列係對於以序列編號1所示之胺基酸序列具有Val1/Ala29變異之胺基酸序列。
較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號2所示之Z區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號2所示之Z區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號2所示之Z區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號2之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號2所示之Z區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號2之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，與序列編號2所示之Z區域之胺 基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列係對於以序列編號2所示之胺基酸序列具有Val1/Ala29變異之胺基酸序列。
較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號3所示之C區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於以序列編號3所示之C區域之胺基酸序列中，於3位Asn與4位Lys之間插入有選自Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號3所示之C區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號3之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個、2個、3個或4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含於與序列編號3所示之C區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列中，於相當於序列編號3之3~4位之位置之Asn-Lys之間插入有選自 Phe、Leu、Ile及Pro所成群之1~4個胺基酸殘基之胺基酸序列所成且作為免疫球蛋白結合區域發揮功能之聚胜肽。進而其他較佳一實施形態中，與序列編號3所示之C區域之胺基酸序列具有至少70%相同性之胺基酸序列係對於以序列編號3所示之胺基酸序列具有Val1/Ala29變異之胺基酸序列。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質中所含之上述聚胜肽較好具有以保存序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列之相當於3位~4位之位置的Asn-Lys之狀態，於該等殘基之間插入胺基酸之胺基酸序列。更好，具有以保存相當於2位~4位之位置的Asp-Asn-Lys或Gln-Asn-Lys之狀態，於該Asn與Lys之間插入胺基酸之胺基酸序列。更好，具有以保存相當於1位~4位之位置的Ala-Asp-Asn-Lys、Gln-Gln-Asn-Lys、或Val-Asp-Asn-Lys之狀態，於該Asn與Lys之間插入胺基酸之胺基酸序列。使相當於上述3位之位置之Asn缺失或變異時，雖可提高上述聚胜肽之該耐鹼性，但有降低免疫球蛋白結合能之情況。
較好，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質中所含之上述聚胜肽於以序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列之相當於1位之位置具有Val殘基、及/或於以序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列之相當於29位之位置具有Ala殘基。
較佳一實施形態中，本發明之變異免疫球蛋 白結合蛋白質包含2~12個，更好3~8個上述聚胜肽。該聚胜肽之各者可相同亦可不同。較好，該聚胜肽之各者其N末端連接於鄰接之聚胜肽之C末端。各聚胜肽亦可與鄰接之聚胜肽直接連結，或者經由具有1~10個胺基酸殘基之胜肽連結。作為該胜肽之例舉例為以EF表示之胜肽。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之較佳例舉例為由以序列編號4~20所示之胺基酸序列所成之聚胜肽。以序列編號4~19所示之胺基酸序列分別為對於將以序列編號3所示之胺基酸序列之1位Ala取代為Val、29位Gly取代為Ala之胺基酸序列，於3位之Asn與4位之Lys之間插入有選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之1個或2個胺基酸殘基之C區域之變異體4個予以連結之胺基酸序列。以序列編號20所示之胺基酸序列為對於將以序列編號2所示之胺基酸序列之1位Ala取代為Val、29位Gly取代為Ala之胺基酸序列，於3位之Asn與4位之Lys之間插入有Ile之Z區域之變異體4個予以連結之胺基酸序列。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之其他較佳例舉例為與序列編號4~18之任一者所示之胺基酸序列具有至少70%相同性且於序列編號4~18之相當於4位~6位、63位~65位、122位~124位及181位~183位之位置分別配置有Asn-X-Lys(X為Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp或 Tyr)之胺基酸序列所成且具有免疫球蛋白結合能之聚胜肽。較好，該等聚胜肽於序列編號3之相當於1位之位置具有Val，於相當於29位之位置具有Ala。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之其他較佳例舉例為與序列編號19所示之胺基酸序列具有至少70%相同性且於序列編號19之相當於4位~7位、64位~67位、124位~127位及184位~187位之位置分別配置有Asn-Ile-Thr-Lys之胺基酸序列所成且具有免疫球蛋白結合能之聚胜肽。較好，該等聚胜肽於序列編號3之相當於1位之位置具有Val，於相當於29位之位置具有Ala。
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之其他較佳例舉例為與序列編號20所示之胺基酸序列具有至少70%相同性且於序列編號20之相當於4位~6位、63位~65位、122位~124位及181位~183位之位置分別配置有Asn-Ile-Lys之胺基酸序列所成且具有免疫球蛋白結合能之聚胜肽。較好，該等聚胜肽於序列編號2之相當於1位之位置具有Val，於相當於29位之位置具有Ala。
1.2.聚核苷酸、媒劑
本發明又提供編碼上述本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸(DNA等)。本發明一實施形態之該聚核苷酸可編碼上述本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質或其之等機能變異體。本說明書中，所謂免疫球蛋白結合蛋白質之「等機能變異體(functional variant)」意指藉 由部分胺基酸之附加、消除、取代、胺基酸殘基之化學修飾等而變性之免疫球蛋白結合蛋白質，與變性前之免疫球蛋白結合蛋白質之胺基酸序列保持至少70%之相同性，維持於上述之Asn-Lys間插入至少1個胺基酸殘基之構造，且關於免疫球蛋白結合活性，可作為與變性前之免疫球蛋白結合蛋白質同等者予以處理者。
又，如上述，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質包含具有1個以上，較好2~12個，更好3~8個免疫球蛋白結合區域之蛋白質。編碼此種蛋白質之聚核苷酸及包含該聚核苷酸之媒劑所成之表現質體可藉習知方法製作。
一實施形態中，編碼本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸可編碼序列編號1~20之任一者所示之聚胜肽。其他實施形態中，編碼本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸可編碼序列編號1~20之任一者所示之免疫球蛋白結合蛋白質之等機能變異體。且另一實施形態中，編碼本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸可編碼序列編號23~39之任一者所示之核苷酸序列所成之聚核苷酸。且另一實施形態中，編碼本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸係由與序列編號23~39之任一者所示之核苷酸序列具有至少70%相同性之核苷酸序列所成且可編碼序列編號4~20之任一者所示之免疫球蛋白結合蛋白質之等機能變異體之聚核苷酸。
1.3.變異免疫球蛋白結合蛋白質之製造
作為用以自上述聚核苷酸或媒劑製造本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之標準技術可利用例如Frederick M.Ausbel等人之Current Protocols In Molecular Biology或由Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(冷泉港實驗室出版，第3版，2001)等所記載之習知基因重組技術。亦即，將含有編碼本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之聚核苷酸(DNA等)之表現媒劑轉形於大腸菌等之宿主中，將所得之重組體於適當之液體培養基培養，而可自培養後之細胞，大量且經濟地取達目的之變性蛋白質。作為較佳之表現媒劑可使用可於宿主細胞內複製之已知媒劑之任一者，舉例為例如美國專利第5,151,350號說明書中記載之質體或由Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(冷泉港實驗室出版，第3版，2001)等所記載之質體。又，作為用於轉形之宿主並未特別限制，可使用大腸菌等之細菌、真菌類、昆蟲細胞、哺乳類細胞等之用以表面重組蛋白質之習知宿主。於宿主中導入核酸而使宿主轉形時，亦可使用對應各宿主之該技術領域悉知之任一種方法，例如可利用由Sambrook等人編輯之Molecular Cloning(冷泉港實驗室出版，第3版，2001)等所記載之公知方法。培養經轉形之重組體(細菌等)，並回收所表現之蛋白質之方法為本技藝充分悉知，亦於本發明之實施例中例示。
或者，本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質 亦可使用無細胞蛋白質合成系表現。
1.4.載體
本發明又提供親和性載體，其係將上述本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質固定化於對水不溶性之基材(載體)者。作為該載體之形狀可為粒子形態，該粒子可為多孔性亦可為非多孔性。粒子狀之載體亦可做為填充床而使用，亦可以懸浮形態使用。懸浮形態包含作為流動層(expanded bed)及純然懸浮物而已知者，其中粒子可自由運動。單塊、填充床及流動層時，分離順序一般係依循利用濃度梯度之以往層析法。純然之懸浮物時係使用批式法。較好該載體為填充劑。或者，載體亦可為晶粒、毛細管或過濾器般之形態。又，作為載體亦可使用磁性粒子。作為磁性粒子，若為可藉由導磁而容易磁化者則為特別限制，舉例為例如，四氧化三鐵(Fe3O4)、三氧化二鐵(γ-Fe2O3)、各種鐵氧體、鐵、錳、鎳、鈷、鉻等之金屬、或由鈷、鎳、錳等之合金所成之磁性體微粒子，或於內部包含該等磁性體之疏水性聚合物、親水性聚合物等。作為較佳者，舉例為日本特開2008-32411號公報所記載之於包含超常磁性微粒子之母粒子表面形成疏水性之第1聚合物層，於該第1聚合物層上形成至少表面上具有縮水甘油基之第2聚合物層，藉由化學修飾該縮水甘油基，而導入包含1個以上之選自氧原子、氮原子及硫原子所成群之至少一種原子之極性基之磁性粒子。較佳實施形態中， 本發明之親和性載體為親和性層析用載體。
本發明一實施形態之該親和性載體較好具有10~500μm，更好20~200μm之粒徑，載體為合成聚合物時，進而較好具有20~100μm，又較好30~80μm之粒徑，載體為多糖時，進而較好具有50~200μm，又較好60~150μm之粒徑。粒徑未達10μm時，在高流速下管柱壓力變高而不耐於實用。粒徑超過500μm時，有免疫球蛋白結合於親和性載體之量(結合容量)差之情況。又，本說明書中所謂「粒徑」意指藉由雷射繞射散射式粒度分佈測定裝置所得之體積平均粒徑。
本發明一實施形態之該親和性載體較好為多孔質，且具有50~150m2/g，更好80~130m2/g之比表面積。此處，比表面積未達50m2/g時，有結合容量差之情況，另一方面，超過150m2/g時，由於載體強度差故在高流速下載體被破壞，而有管柱壓力上升之情況。又，本說明書中所謂「比表面積」意指藉由水銀細孔計所得之具有細孔徑10~5000nm之細孔之表面積除以粒子乾燥重量之值。
本發明一實施形態之該親和性載體較好具有100~1400nm之體積平均細孔徑，載體為合成聚合物時，更好具有100~400nm，又更好200~300nm之體積平均細孔徑，載體為多糖時，更好具有500~1400nm，又更好800~1200nm之體積平均細孔徑。此處，體積平均細孔徑未達100nm時，有在高流速下之結合容量降低變顯著之 情況，另一方面，超過1400nm時，有與流速無關地結合容量降低之情況。又，本說明書中所謂「體積平均細孔徑」意指藉由水銀細孔計所得之具有細孔徑10~5000nm之細孔之體積平均細孔徑。
載體滿足上述範圍之粒徑、比表面積及細孔徑分佈時，可使成為純化對象溶液之流路之粒子間間隙及粒子內比較大之細孔徑與純化對象分子之結合表面積之均衡最適化，並將高流速下之結合容量維持在較高等級。
作為載體材質為例如具有親水性表面之聚合物，例如於外表面(及存在有內表面時於該內表面)具有羥基(-OH)、羧基(-COOH)、胺基羰基(-CONH2或N取代型)、胺基(-NH2，或取代型)、寡聚或聚伸乙氧基之聚合物。一實施形態中，聚合物可為聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇系等之合成聚合物，較好為以多官能(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯等之多官能單體交聯而成之共聚物般之合成聚合物。該合成聚合物可藉由習知方法容易地製造(請參考例如J.MATER.CHEM1991,1(3),371-374中記載之方法)。或者，亦可使用如TOYOPEARL(TOSOH公司)之市售品。其他實施形態之聚合物為葡聚糖、澱粉、纖維素、普魯藍多糖、瓊脂等之多糖類。該多糖類可藉由習知方法容易地製造(請參考例如日本專利第4081143號所記載之方法)。或者亦可使用Sepharose(GE Healthcare Bioscience公司)之市售品。其他實施形態中，亦可為氧化矽、氧化鋯等之 無機載體。
本發明一實施形態之該親和性載體中，作為載體使用之多孔性粒子之一具體例舉例為例如含有10~50質量%之交聯性乙烯基單體與3~90質量%之含環氧基之乙烯基單體，粒徑為20~80μm，比表面積為50~150m2/g，體積平均細孔徑為100~400nm之多孔性有機聚合物粒子。
本發明一實施形態之該親和性載體以水銀細孔計測定時之細孔徑10~5000nm之細孔之浸入體積(細孔體積)較好為1.3~7.0mL/g，載體為合成聚合物時，更好為1.3~2.5mL/g，載體多糖時，更好為3.0~6.0mL/g。
1.5.配位體對載體之固定化
本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質(配位體)與上述載體之結合方法可使用將蛋白質固定化於載體之一般方法進行。固定化之手段舉例為例如配位體對載體之物理吸附、載體與配位體之化學鍵結等。用於使載體與配位體化學鍵結之方法舉例為下述方法，例如使用具有羧基之載體，藉由N-羥基琥珀酸醯亞胺使該羧基活化而與配位體之胺基反應之方法，使用具有胺基或羧基之載體，在水溶性碳二醯亞胺等之脫水縮合劑存在下與配位體之羧基或胺基反應而形成醯胺鍵之方法，使用具有羥基之載體，以溴化氰等之鹵化氰活化而與配位體之胺基反應之方法，或使載體之羥基予以對甲苯磺醯化或三氟乙磺醯化 (tresylated)並與配位體之胺基反應之方法，藉由雙環氧化物、表氯醇等於載體中導入環氧基，並與配位體之胺基或羥基或硫醇基反應之方法，及使用具有環氧基之載體，與配位體之胺基或羥基或硫醇基反應之方法等。上述中，基於實施反應之水溶液中之安定性之觀點，期望為經由環氧基導入配位體之結合方法。
使環氧基開環生成之開環環氧基的醇性羥基係發揮使載體表面親水化，防止蛋白質等之非特異吸附，並且提高水中之載體韌性，防止高流速下之載體破壞之角色。因此，固定化配位體後之載體中存在未與配位體結合之剩餘環氧基時，較好使該剩餘環氧基開環。作為載體中之環氧基之開環方法，可舉例為例如於水溶劑中，藉由酸或鹼，於加熱或室溫下攪拌該載體之方法。又，亦可藉由巰基乙醇、硫代甘油等之具有巰基之封端劑或單乙醇胺等之具有胺基之封端劑，使環氧基開環。最好的開環環氧基為藉由硫代甘油使載體中所含之環氧基開環而得之開環環氧基。硫代甘油具有如下優點：毒性比作為原料之巰基乙醇等更低，加成有硫代甘油之環氧開環基之非特異吸附亦比利用具有胺基之封端劑之開環基更低，此外載體之動態結合量變高。
又，亦可根據需要於載體與配位體之間導入任意長度之分子(間隔基)。作為間隔基之例，舉例為聚亞甲基鏈、聚乙二醇鏈、糖類等。間隔基可使用可化學鍵結於例如載體表面且亦與配位體鍵結之二官能化合物。
1.6.作用效果
本發明之一實施形態之固定化本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之親和性載體之初期免疫球蛋白之動態結合容量(DBC)高，且對於在鹼性條件下洗淨(例如使用0.01~0.8M氫氧化鈉等之鹼性液的洗淨)性能亦不會顯著降低。
2.單離免疫球蛋白之方法
說明本發明一實施形態之單離免疫球蛋白之方法。本實施形態之單離免疫球蛋白之方法包含使含有免疫球蛋白之試料與固定化有上述本發明之變異免疫球蛋白結合蛋白質之親和性載體接觸，而於該載體上吸附免疫球蛋白之步驟(第一步驟)，及自該載體溶出該免疫球蛋白之步驟(第二步驟)，較好於該第二步驟後，進而包含以鹼性液洗淨該載體之步驟(第三步驟)。本發明之免疫球蛋白單離方法所用之本發明之親和性載體可為懸濁形態，亦可為填充於管柱之形態，或者可為如晶粒、毛細管、過濾器或磁性粒子之形態。
較佳之實施形態中，第一步驟中，使含有免疫球蛋白之試料與上述本發明之親和性載體以使免疫球蛋白吸附於配位體之條件接觸。於該第一步驟中，試料中之免疫球蛋白以外之物質幾乎不吸附於配位體而不殘留於載體上。隨後根據需要，為了去除較弱地保持於配位體之一 部分物質，亦可以包含NaCl等之鹽之中性緩衝液洗淨載體。
第二步驟中，流入pH2~5之適當緩衝液，將吸附於配位體之免疫球蛋白溶出。回收該溶出液，可自試料單離免疫球蛋白。
本實施形態之單離免疫球蛋白之方法中，較好於上述第二步驟後接續進行第三步驟。第三步驟係以鹼性溶液洗淨載體(CIP洗淨)。第三步驟中使用之鹼性液舉例為例如氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、三乙胺、氫氧化四丁基銨等。
本發明之親和性載體因提高蛋白質配位體之耐鹼性而於上述第三步驟之洗淨後亦能安定地保持免疫球蛋白結合能，故可重複地使用於本發明之免疫球蛋白單離方法。
本發明之單離免疫球蛋白之方法之一實施形態中，應單離之免疫球蛋白可為抗體或包含期之醫藥。因此，一實施形態中，本發明提供使用本發明之親和性載體之抗體醫藥之製造方法。該方法之順序除了使用含有目的之抗體醫藥之試料以外，基本上與上述免疫球蛋白單離方法之順序相同。
[實施例]
以下列舉實施例進一步具體說明本發明。又，以下之記載係概括顯示本發明之樣態者，無特別理 由，不因該記載而限定本發明。
參考例1 多孔質粒子之合成
將甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)8.2g、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SARTOMER公司製)65.9g及甘油單甲基丙烯酸酯(日油公司製)90.6g溶解於2-辛酮(東洋合成工業公司製)245.8g及苯乙酮(和光純藥工業公司製)62g中，添加2,2’-偶氮異丁腈(和光純藥工業公司製)2g，調製有機單體溶液。
其次於4240g純水中添加聚乙烯醇(KURARAY公司製，PVA-217)8.5g、十二烷基硫酸鈉(花王公司製EMAL10G)0.43g及硫酸鈉(和光純藥工業公司製)21.3g，攪拌一夜調製水溶液。
其次將所得水溶液投入7L可分離燒瓶中，安裝溫度計、攪拌翼及冷卻管，設於溫水浴中，在氮氣氛圍下，以600rpm開始攪拌。接著，藉由溫水浴加溫可分離燒瓶，使水溶液溫度成為85℃後，使用滴加漏斗於該水溶液中添加上述有機單體溶液，進行5小時攪拌。
其次，於冷卻反應液後，將該反應液移至5L聚乙烯製瓶中，靜置直至粒子浮游，自下方吸出多餘水並廢棄。進而於該反應液中添加丙酮使粒子沉降。其次，反應液靜置3分鐘，藉由傾析去除丙酮。該操作重複2次後添加水，使粒子沉降。進而靜置3分鐘進行傾析。該操作重複2次洗淨粒子。進而，粒子分散液再次以丙酮置換， 風乾一晚後，以真空乾燥機進行乾燥，獲得多孔質粒子(以下記為PB)90g。PB之平均粒徑為53μm，比表面積為95m2/g。
實施例1 C區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質1(IgGBPC1)之製作
調製編碼序列編號4所示之胺基酸序列的質體，進而使用其對大腸菌勝任細胞(competent cells)BL21(DE3)(STRATAGENE製)進行轉形獲得重組體。所得重組體於37℃培育直至吸光度(OD600)達到約10。隨後，以終濃度成為1mM之方式添加IPTG(Sigma-Aldrich製)，進而在37℃培育4小時，使重組型免疫球蛋白結合蛋白質表現。蛋白質表現後，回收細胞，於pH9.5之Tris緩衝液中破碎。藉由陰離子交換層析(Q-Sepharose FF，GE HEATHCARE BIOSCIENCE公司製)及陽離子交換層析(SP-Sepharose FF，GE HEATHCARE BIOSCIENCE公司製)自所得細胞破碎液，純化免疫球蛋白結合蛋白質。純化之免疫球蛋白結合蛋白質對於10mM檸檬酸緩衝液pH6.6進行透析16小時。利用SDS-PAGE確認之免疫球蛋白結合蛋白質之純度為95%以上。純化之免疫球蛋白結合蛋白質為C區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質1(IgGBPC1)。該蛋白質包含4個C區域(序列編號3)之變異體，於各變異體區域中之對應於序列編號3之3位~4位之位置的Asn-Lys之間插入Phe。且IgGBPC1 中之各區域具有耐鹼性提高變異A1V/G29A(Protein Science,2013,22,1230-1238)。
實施例2~16 C區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質2~16(IgGBPC2~IgGBPC16)之製作
分別調製編碼序列編號5~19所示之胺基酸序列的質體，之後以實質上與實施例1同樣之步驟製造重組型免疫球蛋白結合蛋白質2~16(IgGBPC2~IgGBPC16)。該等蛋白質包含4個C區域(序列編號3)之變異體，於各變異體區域中之對應於序列編號3之3位~4位之位置的Asn-Lys之間插入後述表1所示之胺基酸。且IgGBPC2~16中之各區域具有耐鹼性提高變異A1V/G29A。
實施例17 Z區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質1(IgGBPZ1)之製作
調製編碼序列編號20所示之胺基酸序列的質體，之後以實質上與實施例1同樣之步驟製造Z區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質1(IgGBPZ1)。該蛋白質包含4個Z區域(序列編號2)之變異體，於各變異體區域中之對應於序列編號2之3位~4位之位置的Asn-Lys之間插入Ile。且IgGBPZ1中之各區域具有耐鹼性提高變異A1V/G29A。
比較例1 C區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質0 (IgGBPC0)之製作
調製編碼序列編號21所示之胺基酸序列的質體，之後以實質上與實施例1同樣之步驟製造C區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質0(IgGBPC0)。該蛋白質包含4個C區域(序列編號3)之變異體，於各變異體區域中之對應於序列編號3之3位~4位之位置的Asn-Lys之間未插入胺基酸殘基。且IgGBPC0係具有耐鹼性提高變異體區域A1V/G29A(Protein Science,2013,22,1230-1238)之耐鹼性高的免疫球蛋白結合蛋白質。
比較例2 Z區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質0(IgGBPZ0)之製作
調製編碼序列編號22所示之胺基酸序列的質體，之後以實質上與實施例1同樣之步驟製造Z區域重組型免疫球蛋白結合蛋白質0(IgGBPZ0)。該蛋白質包含4個Z區域(序列編號2)之變異體，於各變異體區域中之對應於序列編號2之3位~4位之位置的Asn-Lys之間未插入胺基酸殘基。且IgGBPZ0係具有耐鹼性提高變異體區域A1V/G29A(Protein Science,2013,22,1230-1238)之耐鹼性高的免疫球蛋白結合蛋白質。
實施例1~17及比較例1~2之免疫球蛋白結合蛋白質示於表1。
試驗例1 親和性層析用載體之免疫球蛋白結合能
1)免疫球蛋白結合蛋白質對載體之固定化
將參考例1調製之PB以含8mg之方式懸濁於150μL純水中，移至過濾管(Millipore公司)進行離心而去除純水。於其中添加溶解有1mg實施例1製作之免疫球蛋白結合蛋白質1(IgGBPC1)之含450μL之0.85M硫酸鈉之0.1M碳酸緩衝液pH9.8，於25℃振盪5小時，使免疫球蛋白結合蛋白質結合於PB。過濾生成之粒子後，與1M硫代甘油450μL混合，於25℃反應16小時，使剩餘環氧基封端，以0.5M NaOH洗淨後，以0.1M檸檬酸鈉緩衝液 (pH3.2)、0.1M磷酸鈉緩衝液(pH7.6)洗淨，獲得450μL之結合多孔質粒子(IgGBPC1/PB)。以同樣順序獲得分別結合IgGBPC0、IgGBPC2~16及IgGBPZ0~1之多孔質粒子(IgGBPC1~16/PB及IgGBPZ0~1/PB)。
2)免疫球蛋白結合蛋白質對載體之導入量測定
於分別含1mg之IgGBPC1~16/PB及IgGBPZ0~1/PB之150μL之懸濁液各者，使用BCA分析套組(PIERCE公司)，測定結合於載體之免疫球蛋白結合蛋白質之導入量。
3)IgG動態結合容量之測定
將IgGBPC0~16/PB及IgGBPZ0~1/PB各者填充於內徑0.5cm之管柱中直至床高20cm。管柱以20mM磷酸緩衝液(pH7.5)平衡化後，以線流速300cm/小時流入人類多株(human polyclonal)IgG(5mg/mL)之20mM磷酸緩衝液(pH7.5)，自以吸光度監視器之溶出液中人類多株IgG濃度為10%突破(breakthrough)時之人類多株IgG吸附量及載體體積求出動態結合容量(DBC)。
4)耐鹼性試驗
將3)所用之載體填充管柱設於AKTAprim plus，於管柱內流入0.5M氫氧化鈉20mL。自裝置卸下管柱，密閉後於室溫放置一定時間(15、30、45小時)後，以與3) 同樣順序測定線流速300cm/小時之人類多株IgG之DBC。求出0.5M氫氧化鈉處理前之DBC為100%時之結合容量維持率(%DBC)。
各親和性層析用載體之免疫球蛋白結合蛋白質導入量、DBC、耐鹼性試驗之結果示於表2及表3。
實施例1~17及比較例1~2之免疫球蛋白結合蛋白質對載體之結合量大致相等。另一方面，固定化有實施例1~17之免疫球蛋白結合蛋白質之載體(IgGBPC1~16/PB及IgGBPZ1/PB)與比較例1或2之固定化蛋白質之載體(IgGBPC0/PB及IgGBPZ0/PB)比較，DBC提高。且，IgGBPC1~16/PB及IgGBPZ1/PB即使在0.5M氫氧化鈉暴露最多45小時之極嚴苛之鹼條件下，亦具有與具有鹼耐性提高變異之IgGBPC0/PB或IgGBPZ0/PB同等高的耐鹼性，可維持比較高的DBC。因此，藉由使用包含於SpA免疫球蛋白結合蛋白質之胺基酸序列之3位Asn 與4位Lys之間插入胺基酸殘基之變性區域的免疫球蛋白結合蛋白質作為配位體，可獲得具有高的DBC與耐鹼性之親和性層析用載體。
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<213> Staphylococcus aureus
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<223> IgGBPZ1
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Claims (13)

  1. 一種免疫球蛋白結合蛋白質，其含有至少一個變性免疫球蛋白結合區域，該變性免疫球蛋白結合區域係由胺基酸序列所成之聚胜肽，該聚胜肽係對於選自由金黃色葡萄球菌蛋白質A之B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域之胺基酸序列，於相當於該B區域、Z區域或C區域之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列者。
  2. 如請求項1之免疫球蛋白結合蛋白質，其中選自前述B區域、Z區域、C區域及該等之變異體所成群之免疫球蛋白結合區域係由以序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列、或與該等具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域。
  3. 如請求項1之免疫球蛋白結合蛋白質，其中前述至少一個變性免疫球蛋白結合區域係選自由以下所成群者：對於由序列編號1所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號1所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽；對於由序列編號2所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號2所示之胺基酸序列之3位與4位之 位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽；及對於由序列編號3所示之胺基酸序列或與其具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域，於相當於以序列編號3所示之胺基酸序列之3位與4位之位置間插入至少一個胺基酸殘基之胺基酸序列所成之聚胜肽。
  4. 如請求項1~3中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中前述至少一個胺基酸殘基係選自Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、His、Met、Thr、Val、Phe、Leu、Ile、Pro、Trp及Tyr所成群之至少一者。
  5. 如請求項2或3之免疫球蛋白結合蛋白質，其中由與前述序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域係Val1/Ala29變異體。
  6. 如請求項4之免疫球蛋白結合蛋白質，其中由與前述序列編號1~3之任一者所示之胺基酸序列具有至少70%之相同性之胺基酸序列所成之免疫球蛋白結合區域係Val1/Ala29變異體。
  7. 如請求項1~3中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質，其中包含2~12個前述變性免疫球蛋白結合區域。
  8. 如請求項4之免疫球蛋白結合蛋白質，其中包含2~12個前述變性免疫球蛋白結合區域。
  9. 如請求項5之免疫球蛋白結合蛋白質，其中包含 2~12個前述變性免疫球蛋白結合區域。
  10. 如請求項6之免疫球蛋白結合蛋白質，其中包含2~12個前述變性免疫球蛋白結合區域。
  11. 一種親和性載體，其係將如請求項1之免疫球蛋白結合蛋白質固定化於對水不溶性之基材者。
  12. 一種免疫球蛋白之分離方法，係使用如請求項11之親和性載體。
  13. 一種抗體醫藥之製造方法，係使用如請求項11之親和性載體。
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