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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Affinitätstrennung und Liganden zur
pertinenten Verwendung.
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Affinitätstrennungen
finden im Allgemeinen auf Affinitätschromatographiesäulen statt
und nutzen die potentiell hohe Spezifität der Wechselwirkungen mit
Biomolekülen,
insbesondere von Proteinen. Andere mögliche Trennverfahren umfassen
Membranfiltration, Zweiphasenextraktion, Fließbetten, aufgelockerte Betten (expanded
beds) und Trennung mit Magnetperlen (magnetic beads) (Scopes, R.
K., Protein Purification, Principles and Practice, 3. Auflage, ISBN
0-387-94072-3). Die Wechselwirkungen umfassen solche zwischen Protein-Protein,
Protein-Nukleinsäure,
Enzym-Substrat,
Rezeptor-Ligand (z. B. Hormone), Protein-Kohlenhydrat und Protein-Metall.
Allgemein beruht die Affinitätstrennung
auf biologisch wichtigen Bindungswechselwirkungen, die auf Proteinoberflächen stattfinden,
wie solche zwischen einem Enzym und seinem Substrat, zwischen Nukleinsäuren und
einem DNA-bindenden Protein oder zwischen Antigen und Antikörper. Der
eine oder andere der beiden bindenden Partner kann immobilisiert
werden, beispielsweise durch kovalente Bindung an eine unlösliche Matrix
in einer Affinitätssäule, um
seinen Bindungspartner zu bestimmen oder zu reinigen. Die sehr selektive
Natur der Wechselwirkung zwischen den bindenden oder diese einbeziehenden
Molekülen,
insbesondere Proteinen, macht sie ideal für Reinigungs/Trennmethoden
und für
viele Anwendungen, wobei die Affinitätschromatographie unter Einbeziehung
eines immobilisierten Proteinliganden gegenüber Ionenaustausch- oder Gelfiltrati onschromatographie
bevorzugt wird.
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Wenn
eine Probe auf eine Säule
aufgetragen wird, die einen für
ein Zielmolekül
der Probe spezifischen Bindungspartner immobilisiert auf einer festen
Matrix enthält,
wird das Zielmolekül
in der Säule
zurückgehalten,
während
die Mehrzahl der Nichtzielmoleküle
einfach hindurchläuft.
Um zunächst
alle nicht spezifisch gebundenen Moleküle auszuwaschen und danach
das Zielmolekül
zu eluieren, kann eine Lösung
mit typischerweise stufenweise abnehmendem pH auf die Säule aufgetragen
werden. Das Zielmolekül,
das die höchste
Affinität
zum immobilisierten Liganden hat, wird als letztes ausgewaschen
und daher enthalten die Schlußfraktionen
die höchste
Konzentration an Zielmolekül
und können
dann in einem weiteren Reinigungs/Anreicherungsschritt oder zur
direkten oder indirekten Bestimmung der Anwesenheit des Zielmoleküls verwendet
werden.
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Die
Medizin und allgemein die biologische und biotechnologische Forschung
haben ein Bedürfnis nach
immer reineren Proben organischer und biologischer Moleküle und somit
nach Strategien, die Proben hoher Reinheit so schnell und billig
wie möglich
liefern, entwickelt.
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Die
Affinitätstrennung
ist wichtig sowohl zur Befriedigung des Bedürfnisses nach reinen Proben
von Proteinen und anderen Molekülen
als auch für
Nachweis und quantitative Bestimmung eines Zielmoleküls. Das kann
wichtig sein, wenn beispielsweise Blut- und Urinproben auf Moleküle, die
eine Erkrankung wie eine Stoffwechselstörung anzeigen oder auch nur
auf Anwesenheit von nicht natürlich
vorkommenden Stoffen, Narkotika, Steroidabkömmlinge usw. untersucht werden.
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Eine
Affinitätschromatographiesäule, komplett
mit der festen Affinitätsmatrix,
kann teuer sein und es ist offensichtlich wünschenswert, die Säule mehrmals
wiederverwenden zu können,
d. h. eine Anzahl von Durchläufen
ausführen
zu können,
bevor sie wegen der verminderten Fähigkeit des immobilisierten
Liganden zur Bindung eines Zielmoleküls oder einer verminderten
Spezifität
der Bindung verworfen werden muß.
Um eine Reihe von Ergebnissen zu erhalten, die direkt miteinander
verglichen werden können,
und um vor dem nächsten
Durchlauf nichtspezifisch und spezifisch gebundenen Moleküle aus der
Säule zu
entfernen, muß die Säule gereinigt
werden. Der anerkannte Standard zur Reinigung und Sterilisierung
von Trennmedien und -systemen ist NaOH, häufig in Kombination mit NaCl.
Eine aufgetragene 0,1- bis 1,0-molare
Lösung
von NaOH kann Viren, Bakterien, Nukleinsäuren, Proteine, Hefen, Endotoxine,
Prionen und andere kontaminierende Agenzien entfernen. Die Kontaktzeit
mit dem NaOH kann variieren, zwischen 30 min und 1 h ist typisch,
und die Entfernung aus dem System wird durch einfache Inline-Messung
von pH und Leitfähigkeit
verfolgt.
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Die
Fähigkeit
der Trennmedien, diesen ziemlich harten Sterilisierungsbedingungen
widerstehen zu können,
hängt jedoch
von den funktionellen Gruppen der anhängenden Liganden (Bindungspartner),
dem Chemismus der Bindung und der Stabilität der Basismatrizen gegenüber alkalischen
Bedingungen ab. Proteine sind empfindlich gegenüber extremen pH-Werten, wie
sie bei der Reinigung mit NaOH auftreten, und allgemein gesagt beeinträchtigt dies
die Wirksamkeit der Affinitätsmedien
auf Proteinbasis. Obwohl die Affinitätstrennung auf Proteinbasis
wegen ihrer guten Spezifität
Vorteile gegenüber
Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographie hat, werden daher
diese anderen weniger spezifischen Techniken nicht durch die Standard-Reinigungsverfahren
nachteilig beeinflußt.
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Die
Empfindlichkeit der Proteine gegen alkalischen pH ist in erster
Linie auf die Deamidierung der Asparagin- und Glutaminreste, insbesondere
der Asparaginreste, zurückzuführen. Die
Deamidierung des Asparagins führt über ein
zyklisches Imid-Zwischenprodukt
zur Bildung von Isoaspartat und Aspartat, gewöhnlich im Verhältnis 3:1
bis 4:1. Diese Reaktion findet bei physiologischem pH statt, ist
jedoch bei alkalischem pH, wie er in einer mit NaOH-Lösung gereinigten
Chromatographiesäule
vor kommt, viel schneller. Die Isoaspartylform ist durch eine atypische
Amidbindung zwischen dem β-Carboxyl
des Aspartats und dem α-Stickstoff
der C-flankierenden Aminosäure
gekennzeichnet. Dies führt
zu einem zusätzlichen
-CH2- im Proteingerüst und zu einer freien α-Carboxylgruppe.
Als Folge der Deamidierung kann eine Spaltung des Proteingerüsts stattfinden und
das Protein kann durch die Strukturänderung des ganzen Proteins
oder auch nur durch eine kleine Veränderung im empfindlichen Bereich,
wie an der aktiven oder der Bindungsstelle, seine Aktivität verlieren.
Die Empfindlichkeit des Asparaginrests für Deamidierung hängt von
Sequenz und Konformation ab, wobei Asn-Reste an Asn-Gly- und Asn-Ser-Stellen
besonders anfällig
sind.
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Es
ist ein ernstes Problem, wenn eine Affinitätschromatographiesäule mit
einem an einem unlöslichen Träger immobilisierten
Protein erstellt wurde und das notwendige Reinigungsverfahren zwischen
den Durchläufen
zu verminderter Wirksamkeit des Systems führt. Wenn aufeinanderfolgende
Waschungen die Fähigkeit des
immobilisierten Proteins zum Einfangen seines Bindungspartners aus
einer Probe vermindern, wird nicht nur das Ende der absolut nützlichen
Lebensdauer beschleunigt, sondern es werden auch Vergleiche zwischen Durchläufen, bei
denen die Konzentration des Analyten in einer Reihe von Proben gemessen
wird, sinnlos. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren
der Affinitätstrennung,
bei dem das immobilisierte Protein gegenüber Standard-Reinigungsverfahren,
insbesondere gegenüber
alkalischem pH, weniger empfindlich ist.
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Daher
gibt die vorliegende Erfindung nach einer Ausführung ein Verfahren zur Affinitätstrennung
an, bei dem der Affinitätsligand
ein immobilisierter proteinartiger Ligand ist, wobei das Verfahren
den Anfangsschritt der Modifikation einer oder mehrerer Asparaginreste
(Asn) im Affinitätsliganden
umfaßt,
um die Stabilität des
Proteins unter alkalischen Bedingungen zu erhöhen.
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Der
Begriff "modifiziert" schließt die Entfernung
des Aspara ginrests oder seinen Ersatz durch eine weniger alkaliempfindliche
Aminosäure
ein, oder dass der Asparaginrest durch Substitution (d. h. chemische
Substitution einer oder mehrerer Gruppen) oder durch andere chemische
Derivatisierung, z. B. durch eine Schutzgruppe, modifiziert wurde.
Der Ersatz eines oder mehrerer Asparaginreste durch eine weniger
alkaliempfindliche Aminosäure
ist bevorzugt.
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Mit "Affinitätstrennung" ist jedes Reinigungs-
oder Bestimmungsverfahren gemeint, welches das Auftragen einer Probe
mit einem Zielanalyten auf einen Festkörper umfaßt, der einen für den Analyten
spezifischen Bindungspartner trägt.
Die Probe wird durch Schwerkraft oder andere Mittel durch oder über den
Feststoff geführt
und Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem auf dem Feststoff
immobilisierten spezifischen Bindungspartner bedeutet, dass der
Analyt auf dem Feststoff zurückgehalten
wird, während
der Rest der Probe oder das meiste davon durch das System hindurchläuft. Die
Trennung kann geeignet auf einer Affinitätschromatographiesäule ausgeführt werden.
Der Feststoff ist bevorzugt so in einer Säule angeordnet, dass die Probe
oben aufgetragen wird und der Nichtzielanteil der Probe abläuft. Um
den spezifisch gebundenen Analyten zu entfernen, kann ein Eluens
wie eine Salzlösung
oder eine pH-Änderung
angewendet werden. Der Analyt kann dann in einer Anzahl Aliquote
in kontrollierter Weise aufgefangen werden.
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Ein "Affinitätsligand" ist also ein zielspezifischer
Bindungspartner, der in einem Affinitätstrennverfahren verwendet
werden kann.
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"Analyt" wird verwendet,
um jegliches proteinartige oder andere Molekül oder Molekülfragment
in einer Probe zu bezeichnen, das spezifisch an den immobilisierten
Liganden binden kann.
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Der
Begriff" "spezifischer Bindungspartner" kann ein Molekül oder eine
Gruppe von Molekülen
einschließen,
und jedes dieser Moleküle
kann auch "spezifisch" an eines oder mehrere
andere Moleküle
binden. Dieser Begriff impliziert also nicht, dass jeglicher immobilisierte
Ligand oder Analyt nur einen Bindungspartner hat, vielmehr, dass
die Bindung solcherart spezifisch ist, dass die meisten anderen
Moleküle
nicht mit derselben Affinität
oder Festigkeit binden, insbesondere dass andere Nichtzielmoleküle in einer
gegebenen Probe wesentlich geringere Affinität haben. Die Reinigung durch
Affinitätstrennung
ist wegen der hohen Affinität
zwischen biologisch spezifischen Bindungspartnern häufig größenordnungsmäßig mehrtausendfach.
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Alle
einen immobilisierten proteinartigen Liganden einschließenden Typen
der Affinitätstrennung
können
beim erfindungsgemäßen Verfahren
angewendet werden, und zur Verwendung mit besonderen Liganden bekannte
geeignete Matrizes (z. B. ein fester Träger) sind im Stand der Technik
bekannt. Sie basieren typischerweise auf der Chromatographie mit
Agarose, Polyacrylamid, Siliciumdioxid, Polyvinylstyrol, Dextran
oder anderen Polymeren. Jeder in der Technik für Trennungs- oder Immobilisierungsprozesse
bekannte feste Träger
kann verwendet werden, wie auch jedes zum Anheften von Molekülen wie
Affinitätsliganden
bekannte Verfahren angewendet werden kann. Die proteinartigen Liganden
werden gewöhnlich
an die Matrix durch ein Kupplungsreagenz wie Cyanbromid, Epichlorhydrin,
Bisoxirane, Divinylsulfon, Carbonyldiimidazol, N-Hydroxysuccinimid,
Tosyl/Tresylchlorid, Epichlorhydrin, Carbodiimid, Glutaraldehyd,
Hydrazin, Oxiran und auch mit Carboxyl oder Thiol aktivierte Matrizes.
Wiederum sind solche Kupplungsreagenzien und -verfahren im Stand der
Technik bekannt und ausführlich
in der Literatur beschrieben (Jansson, J. C. und Rydén, L.,
Protein Purification, 2. Auflage, Seiten 375–442, ISBN 0-471-18626-0).
Verschiedene Matrixderivate, die eine direkte Immobilisierung ermöglichen,
umfassen CNBr-aktivierte Sepharose 4B, AH-Sepharose 4B und CH-Sepharose 4B und
epoxyaktivierte Sepharose 6B (Pharmacia).
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Der
proteinartige Affinitätsligand
kann ein Molekül
mit einem Proteinbestandteil sein, der als "spezifischer Bindungspartner" wie oben definiert
wirken kann. So können
Glycoproteine oder Protein-Lipid-Komplexe oder auch Proteine mit
prosthetischen Gruppen als Affinitätsligand, der erfindungsgemäß modifiziert
wird, verwendet werden. Jedoch sind Proteinmoleküle bevorzugt. Der Begriff "Protein" wird hier im weiten
Sinn benutzt und schließt
jedes Molekül
mit einer Polypeptid- oder Peptidstruktur ein. Mit anderen Worten
besteht ein "Protein", wie es hier verwendet
wird, aus einer Aminosäurekette
und der Begriff umfaßt
keine besondere, die Konformation (d. h. Tertiärstruktur) oder anderes betreffende
Anforderung.
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Die
zum Ersatz des Asparagins geeigneten Aminosäuren umfassen alle anderen
der 19 natürlich
vorkommenden Standard-Aminosäuren, obwohl
Cystein und Glutamin nicht bevorzugt werden. Bevorzugte ersetzende
Aminosäuren
umfassen Lysin, Asparaginsäure
und Leucin. Auch dem Fachmann bekannte nicht natürlich vorkommende Aminosäuren und
-derivate können
zum Ersetzen der Asparaginreste verwendet werden. Bedeutende Verbesserungen
der Stabilität
des immobilisierten Protein und daher der Wirksamkeit der Säule nach
der Reinigung können
beobachtet werden, wenn nur ein Asparagin durch einen weniger alkaliempfindlichen
Rest ersetzt wird. Bevorzugt werden aber 2, 3 oder mehr oder sogar
alle Asparaginreste ersetzt.
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Eine "weniger alkaliempfindliche
Aminosäure" ist eine, die gegen
Abbau unter alkalischen Bedingungen weniger empfindlich als Asn
ist, wenn man unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten
Techniken, Verfahren und Bedingungen vergleicht. Solche Bedingungen
können
beispielsweise die oben erwähnten
Bedingungen für
das Waschen der Säule
sein, oder jegliche anderen im Stand der Technik zur Untersuchung
der Proteinstabilität
oder des Proteinabbaus, z. B. der oben besprochenen Deamidierung,
angewendeten alkalischen Bedingungen. Eine "weniger alkaliempfindliche Aminosäure" kann daher jede
andere Aminosäure
als Asn und mehr bevorzugt auch als Gln und Cys sein. Die Alkaliempfindlichkeit
kann geeignet durch Austausch eines gegebenen Asn-Rests im Proteinmolekül gegen
eine Ersatzaminosäure
oder durch chemische Abwandlung oder Derivatisierung dieses Asn-Rests und nachfolgenden
Vergleich der Stabilität
unter alkalischen Bedingungen (z. B. des Säulenwaschens) mit dem unmodifizierten
Protein verglichen werden.
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Wie
oben bemerkt hängt
die Empfindlichkeit eines bestimmten Asparaginrests für die Deamidierung von
der Konfiguration des Proteins ab, wobei es besonders wichtig ist,
jene Reste zu ersetzen, die sich auf der Oberfläche der dreidimensionalen Proteinstruktur
befinden und daher den alkalischen Bedingungen besonders ausgesetzt
sind. Am wichtigsten ist die Gesamtstabilität des Liganden und es ist wünschenswert,
die Spezifität
der Wechselwirkung zwischen immobilisiertem Liganden und Bindungspartner
aufrechtzuerhalten. Daher sind die zu ersetzenden Asparaginreste
bevorzugt nicht an der Wechselwirkung Ligand-Analyt beteiligt.
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Der "asparaginmodifizierte" proteinartige Ligand
(nachfolgend das "modifizierte
Protein") kann mit
jedem dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Standardtechniken
zur ortsgerichteten Mutagenese von Nukleinsäuren sind beispielsweise im
Laborhandbuch mit dem Titel Molecular Cloning von Sambrook, Fritsch
und Maniatis beschrieben. Eine bevorzugte Technik schließt die PCR-Mutagenese
ein, wobei im ersten PCR-Zyklus Primer verwendet werden, welche
die zur Erzeugung der gewünschten
Mutation benötigten
unpassenden Basenpaare (mis-match base pairs) einbauen. Im zweiten
Zyklus werden die Fragmente des ersten Zyklus gemischt und die Polymerase
kann die Stränge
ausfüllen.
Das resultierende doppelsträngige Fragment
kann in ein Plasmid ligasiert werden, das dann zur Transformation
von E. coli verwendet wird. Das Protein kann in vitro ohne Verwendung
eines biologischen Wirts synthetisiert und dabei können nicht
natürlich vorkommende
Aminosäuren
eingeführt
werden.
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Im
vorliegenden Fall wie auch für
die vielen vorerwähnten
allgemeinen Anwendungen der Affinitätstrennung ist von besonderem
Interesse die Anwendung der Affinitätstrennung mit Liganden, die
durch Randomisierung (zufällige
Mutagenese) eines bestimmten Proteins zur Erzeugung von Liganden
mit neuen, abgewandelten oder verstärkten Bindungseigenschaften
erzeugt wurden. Diese Proteine werden als kombinatorische Proteine
bezeichnet. Eine solche Technik umfaßt typischerweise die zufällige Mutagenese
eines Zielproteins, die Expression der gesamten Bibliothek dieser
Varianten, z. B. auf der Oberfläche
von filamentösen
Bakteriophagen, gefolgt von der Selektion eines Proteins, das die
gewünschten
Bindungseigenschaften zeigt, wobei diese Selektion typischerweise
eine Bindungsreaktion zwischen dem variierten Protein und einem
immobilisierten Liganden (Bindungspartner), d. h. Zielmolekül für das Protein,
z. B. Zielanalyt, umfaßt.
Die Mutagenese ist in dem Sinn zufällig, als die von einem bestimmten
Kodon kodierte resultierende Aminosäure nicht allgemein vorherbestimmt
ist, aber die Stellen, an denen Mutationen eingeführt werden
sollen, im allgemeinen vorher festgelegt werden. Die Mutagenese
kann Substitution, Entfernung oder Zufügen (d. h. Insertion) einer Aminosäure einschließen.
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Die
Anwendung eines Expressionssystems wie Oberflächenpräsentation auf Phagen liefert
ein kritisches Bindeglied zwischen Genotyp und Phänotyp; es
gibt eine abgeschlossene Einheit, die aufgrund ihrer spezifischen
Bindungseigenschaften selektiert werden kann und die auch den Nukleinsäurecode
für das
die beobachteten Bindungseigenschaften verursachende Protein trägt. Dies
ermöglicht
Expression in brauchbaren Mengen des wegen seiner Bindungseigenschaften
selektierten Proteins. Eine solche Expression findet typischerweise
in einem transformierten Bakterienwirt statt.
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Das
wegen seiner Fähigkeit,
an einen immobilisierten Liganden (d. h. ein gewünschtes Zielmolekül (Analyt))
zu binden, ausgewählte
Protein wird dann selbst bei der Affinitätstrennung (d. h. als Affinitätsligand) benutzt.
Es wird immobilisiert und zur Reinigung oder Bestimmung eines Zielmoleküls in einer
Probe verwendet, typischerweise derselbe Ligand, der zunächst zur
Selektion des Proteins verwendet wurde. So kann ein Protein aus einer
Variantenbibliothek wegen seiner Fähigkeit, z. B. Insulin zu binden,
selektiert werden, wobei eine Säule
mit auf einer Matrix immobilisiertem Insulin verwendet wird, und
das selektierte Protein kann dann zum Testen von Proben auf Anwesenheit
von Insulin verwendet werden.
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Neben
dem Testen auf Anwesenheit eines Zielmoleküls liefern die erfindungsgemäßen Affinitätstrennverfahren
hervorragende Reinigungsverfahren, die Zielmolekülproben von guter Reinheit
ergeben. Insbesondere ergeben die erfindungsgemäßen Verfahren auch nach vielen
Zyklen des Trennsystems noch reine Proben, d. h. nach vielen Durchläufen mit
Waschen der Säule.
Solche mit den erfindungsgemäßen Verfahren
erzeugten Proben bilden weitere Ausführungen der Erfindung.
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Wenn
ein Protein vor den oben beschriebenen Randomisierungs- und Selektionsschritten
durch Ersatz eines oder mehrerer seiner Asparaginreste stabilisiert
wird, ist seine brauchbare Lebensdauer als Affinitätsligand
wegen seiner Fähigkeit,
harten Bedingungen wie hohem pH zu widerstehen, die auftreten, wenn eine
Affinitätssäule zwischen
den Durchläufen
gewaschen wird, verlängert.
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Die
Verfahren der Erfindung wenden also bevorzugt ein kombinatorisches
Protein an, wobei in einem vom Randomisierungsschritt (d. h. der
zur Erzeugung des kombinatorischen Proteins durch Randomisierung eines "Original-", "Quell-" oder "Startproteins" angewendete Schritt)
getrennten Schritt die Stabilität
des Proteins unter alkalischen Bedingungen durch Modifizierung eines
oder mehrerer seiner Asparaginreste gesteigert wurde (bevorzugt
durch Ersetzten eines oder mehrerer seiner Asparaginreste durch
eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure).
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Die
Randomisierung selbst kann zur Substitution von Asparaginresten
führen,
jedoch betrifft die Erfindung Proteine, die zur Erhöhung der
Stabilität
auch besonders modifiziert wurden, um einen oder mehrere Asparaginreste
zu ersetzen. Das Protein kann vor, gleichzeitig mit oder nach der
Randomisierung stabilisiert werden, jedoch werden die stabilisierenden
Abwandlungen bevorzugt vor der Randomisierung eingeführt. Wenn die
Stabilisierung vor der Randomisierung stattfindet, braucht sie nur
einmal durchgeführt
zu werden, und durch Selektion aus der Bibliothek der randomisierten
Varianten mittels einer Anzahl von Liganden können mehrere stabilisierte
Proteine mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften erhalten werden.
Wird die Stabilisierung nach der Selektion für eine bestimmte Bindungsaffinität durchgeführt, besteht
die Gefahr, dass durch die Stabilisierungssubstitutionen etwas Affinität verlorengeht.
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Techniken
zum Aufbau einer kombinatorischen Bibliothek von Proteinmolekülen und
nachfolgende Selektion, um proteinartige Liganden mit den gewünschten
Bindungseigenschaften zu erhalten, sind bekannt (Nygren, P. und
Uhlén,
M., Current Opinion in Structural Biology (1997) 7 463–469). Allgemein
verwendet man ein Proteinmolekül,
das vielleicht bereits in sich vorteilhafte Eigenschaften wie Unempfindlichkeit
gegen pH und Temperatur hat, als Gerüst und baut dann über zufällige, aber
gezielte Aminosäuresubstitution
(oder andere Mutationen) des Proteinmoleküls eine kombinatorische Bibliothek
auf, um eine Bibliothek von Molekülen mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften
zu erzeugen. Im allgemeinen zielt die zufällige Mutagenese auf Reste
an der Oberfläche.
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Geeignete
Proteingerüste
können
einfach lineare Peptide sein, jedoch besitzt das Gerüst bevorzugt eine
gefaltete dreidimensionale Struktur, die das Potential zu höherer Affinität hat und
weniger anfällig
für proteolytischen
Abbau ist. Man wählt
gewöhnlich
eher natürlich
vorkommende Proteine oder Domänen
für die
weitere Bearbeitung aus, als dass man ein Gerüst de novo entwirft. Um Zweifel
auszuschließen
sei angemerkt, dass in dieser Beschreibung das Wort "Protein" sich sowohl auf
ganze Proteinmoleküle
als auch auf deren Fragmente und Domänen, Polypeptide oder Peptide
bezieht.
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Die
Auswahl des Proteingerüsts
hängt von
mehreren Parametern ab, darunter die Fähigkeit, wirksam in einem gewünschten
Wirtsorganismus, z. B. E. coli, exprimierbar zu sein, wenn das randomisierte
Protein als Fusionsprotein mit einem Hüllprotein eines filamentösen Phagen
präsentiert
werden soll. Das Protein sollte auch auf seiner Oberfläche hinreichend
große
Regionen aufweisen, die gegen Substitution (oder Insertion oder
Deletion) tolerant sind, ohne die dreidimensionale Gesamtstruktur
zu verlieren. Wenn die Bibliothek synthetisch erzeugt werden soll,
ist eine kleine Gesamtgröße Vorbedingung.
Wo das gewählte
Gerüstprotein
eine Bindungsfunktion hat, können
die in diese Wechselwirkung eingebundenen Aminosäurereste ein Ziel für die Randomisierung
sein. Die Randomisierung kann durchgeführt werden, um die bekannten
Bindungseigenschaften zu verstärken
oder Liganden mit neuen Spezifitäten
zu entwickeln.
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Geeignete
Gerüstmoleküle werden
von Nygren et al. (1997) diskutiert und umfassen zyklische Peptide mit
40 oder mehr Resten in zwangsweiser Sequenz, immunglobulinartige
Gerüste
mit Fv- oder Einzelkettendomänen
(scFv), Bakterienrezeptoren wie das Analogon Z des Eindomänen-Staphylokokkenproteins
A (SPA) mit 58 Resten (wobei die Z-Domäne ein Derivat der B-Domäne im SPA
ist), oder andere Domänen
oder Analoga des SPA, DNA bindende Proteine, insbesondere Zinkfinger,
und Proteaseinhibitoren. Alle diese Moleküle können durch Substitution eines
oder mehrerer nativer Asparaginreste durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure stabilisiert
werden, bevor eine kombinatorische Bibliothek des prästabilisierten
Proteins angefertigt wird.
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Von
besonderem Interesse ist die Bakterienrezeptordomäne Z (Nord,
K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlén, M. und Nygren, P., Protein
Engineering (1995) 8, 6, 601–608).
Diese Arbeit von Nord et al. beschreibt ein geeignetes Verfahren
zum Aufbau einer kombinatorischen Bibliothek von Proteinmolekülen, die
auf einen Bereich von Gerüstmolekülen angewendet
werden kann. Das beschriebene Verfahren ist festphasengestützt und beruht
auf stufenweisem Zusammenbau randomisierter einsträngiger Oligonukleotide.
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Die
Selektion aus einer erzeugten Proteinbibliothek kann auf mehreren
verschiedenen bekannten Wegen durchgeführt werden, darunter auf Perlen
(beads) immobilisierte Bibliotheken (McBride, J. D., Freeman, N.,
Domingo, G. J. und Leatherbarrow, R. J., J. Mol. Biol. [1996] 259:
819–827),
Fusionen an DNA bindende Proteine (Schatz, P. J., Biotechnology
[1993] 11: 1138–1143),
und nach Präsentieren
auf Bakterien (Lu, Z., Murray, K. S., Van Cleave, V., LaVallie,
E. R., Ståhl,
M. L. und McCoy, J. M., Biotechnology [1995] 13: 366–372) und
Phagen (Clackson, T. und Wells, J., TIBTECH (1994) 12, 173–183) wie
auch Hefezellen (Boder, E. T. und Wittrup, K. D., Nature Biotechnology
(1997) 15, 553–557)
und in viralen Systemen (Ernst, W., Grabher, R., Wegner, D., Borth,
N, Graussauer, A, und Katinger, H., Nucleic Acid Research (1998)
26, 1718–1723
und Grabher, R., Ernst, W., Doblhoff-Dier, O., Sara, M. und Katinger,
H., BioTechniques (1997) 22, 730–735).
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Die
Internationale Anmeldung WO 95/19374 beschreibt die Erzeugung einer
kombinatorischen Bibliothek von Z-Varianten, siehe insbesondere
Beispiel 4. Diese Anmeldung diskutiert auf Seite 12 die Vorteile
der Z-Domäne
als Affinitätsligand
bei der Reinigung von rekombinaten Proteinen, weil sie in der rauhen
Umgebung einer Affinitätssäule während der
Reinigung relativ stabil ist. Die vorliegende Erfindung bietet dadurch
weitere Vorteile, dass die Z-Domäne
durch Ersatz der Asparaginreste gegen alkalischen pH stabilisiert
werden kann. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen,
die Z-Domäne
zu stabilisieren, bevor die kombinatorische Bibliothek hergestellt
wird.
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Zur
Auswahl geeigneter Liganden für
die erfindungsgemäßen Affinitätsverfahren
kann ein Verfahren der Präsentation
auf Phagen durchgeführt
werden, wobei bei einem auf der Phagen-Oberfläche exprimierten Protein in
einem von jeglichen Modifikationen zur Abwandlung der Bindungseigenschaften
getrennten Schritt einer oder mehrere Asparaginreste modifiziert
wurden (bevorzugt durch Ersatz durch einen weniger alkaliempfindlichen
Rest).
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Ein
geeignetes Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten kombinatorischen
Proteins umfaßt
die Schritte
- a) Modifizieren von Asparaginresten
in einem Proteinmolekül
zur Erhöhung
der Stabilität
des Proteins in alkalischen Bedingungen und
- b) Randomisierung des Proteinmoleküls zur Modifizierung seiner
Bindungseigenschaften.
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Die
Modifizierung im Schritt a) umfaßt bevorzugt das Ersetzen von
Asparaginresten durch andere weniger alkaliempfindliche Aminosäuren; Schritt
a) wird bevorzugt vor Schritt b) ausgeführt.
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Die
vorliegende Erfindung benutzt, ebenso wie ein randomisiertes und
stabilisiertes Proteinmolekül, auch
Fusionsproteine mit einem stabilisierten und einem randomisierten
Teil, wobei solche Proteine für
gewisse Anwendungen brauchbar sind. Insbesondere ermöglicht diese
Technik, ein stabiles Gerüst
zu entwickeln, an das eine variable Region mit spezifischen Bindungseigenschaften
angehängt
sein kann. Die variable Region kann wie oben besprochen durch Randomisierungstechniken
hergestellt werden und aus der Variantenbibliothek kann ein Proteinmolekül mit den
gewünschten
Bindungseigenschaften ausgewählt
werden, beispielsweise durch Phagenpräsentation und Affinitätschromatographie.
Dieses randomisierte Protein kann dann als ein Fusionsprotein exprimiert
werden, z. B. in E. coli, und zwar zusammen mit einem Proteinmolekül, das bereits
zur Verbesserung seiner Stabilität
unter alkalischen Bedingungen durch Ersatz eines oder mehrerer seiner
Asparaginreste durch andere weniger alkaliempfindliche Reste bearbeitet
wurde.
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Das
Fusionsprotein kann als immobilisierter Ligand bei der Affinitätschromatographie
verwendet werden, wobei es sowohl die Vorteile eines vom Gerüstteil her
allgemein stabilen Moleküls als
auch eine vom randomisierten Teil bereitgestellte vorgewählte Bindungsaffinität gewährt. Ein
solches System kann die Verwendung von kleinen Proteinmolekülen während des
Randomisierungs- und Selektionsstadiums ermöglichen, weil wichtige proteinartige
Eigenschaften (im Gegensatz zu Peptideigenschaften) vom stabilisierten
Teil beigestellt werden. Der gleiche stabilisierte Teil kann mit
einer Vielzahl von verschiedenen randomisierten Molekülen verwendet
werden und umgekehrt. Geeignete Proteinmoleküle, die als stabilisierter
Gerüstteil
der Fusionsproteine dienen, umfassen Albumin bindendes Protein (ABD);
die Bakterienrezeptordomäne
Z ist in diesem Zusammenhang ein geeignetes Molekül für die Randomisierung.
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Ein
solches Protein kodierende Nukleinsäuremoleküle wie auch das Protein exprimierende
Zellen bilden weitere Ausführungen
der vorliegenden Erfindung.
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Ein
bevorzugter Affinitätsligand
zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ist Albumin bindendes
Protein (ABD), eine Proteindomäne
mit Affinität
für humanes
Serumalbumin (HSA). Es ist von einem in der Zellwand verankerten
Bakterienrezeptorprotein aus Streptococcus G148 abgeleitet. Es wird
insbesondere als Affinitätsligand
zur Reinigung von humanem Serumalbumin (HSA) verwendet. Die Wildtypsequenz dieses
Proteins hat vier Asparaginreste. Man beobachtet erhöhte Stabilität, wenn
nur einer dieser Reste substituiert wird. Bevorzugt werden aber
alle vier Reste durch weniger alkaliempfindliche Reste ersetzt.
Die Aminosäuresequenz
des ABD-Wildtyps ist:
LAEAKVLANRELDKYGV-SDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP
wobei
die Asparaginreste durch Fettdruck bezeichnet sind. Der Bindestrich
zeigt lediglich an, dass andere Moleküle derselben Familie an dieser
Stelle eine zusätzliche
Aminosäure
aufweisen. Diese Sequenz schließt
den in 3 gezeigten N-terminalen "Schwanz" mit 19 Aminosäuren aus. Im Text werden besondere
Aminosäuren des
ABD durch ihre Position in der Gesamtsequenz (einschließlich der
19 "Schwanz"aminosäuren) identifiziert,
wie in 3 dargestellt. So ist der erste Asparaginrest
des ABDwt, der stabilisiert werden kann, in Position 28 (Asn28). Stabilisierte Versionen des ABD zur
Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren
können einige,
alle oder keine der 19 Aminosäuren
des N-terminalen Schwanzes enthalten.
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Stabilisiertes
ABD kann, wie oben besprochen, weiter der Randomisierung unterworfen
werden, um ein Protein (d. h. ein kombinatorisches Protein) mit
beispielsweise modifizierter Bindungseigenschaft für HSA zu
schaffen, und/oder eines, das an jegliches gewählte Ziel binden und auch Affinität zu HSA
beibehalten kann. Die Randomisierung kann Mutagenese derselben oder
bevorzugt anderer Reste als die in der Stabilisierung modifizierten
einschließen.
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So
ist eine weitere Ausbildung der vorliegenden Erfindung Albumin bindendes
Protein oder ein Fragment oder Derivat davon, worin ein oder mehrere
native Asn-Reste entfernt oder durch eine weniger alkaliempfindliche
Aminosäure
ersetzt wurden, wobei dieses Molekül Affinität zu humanem Serumalbumin behält.
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In
einer anderen Ausbildung stellt die Erfindung Albumin bindendes
Protein oder ein Fragment oder Derivat davon wie oben definiert
bereit, welches ferner der Randomisierung unterworfen wurde, um
ein Protein zu schaffen, das an einen Zielliganden binden kann und
Affinität
zu humanem Serumalbumin behält.
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In
noch einer anderen Ausbildung stellt die Erfindung ein Fusionsprotein
bereit, das einen ersten Teil, der ABD oder ein Fragment oder Derivat
davon wie oben definiert ist, und einen zweiten Teil, der ein von
einem Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon, Staphylokokkenprotein
A oder einem Fragment, einer Domäne
oder einem Derivat davon oder einem DNA bindenden Protein oder Fragment
oder Derivat davon abgeleitet ist.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist Asn28 durch Leucin, Asn42 durch
Asparaginsäure, Asn45 durch Asparaginsäure und Asn46 durch
Lysin ersetzt (hier als ABDmut bezeichnet). Mit 'ABDmut' werden Proteine bezeichnet, die einige,
alle oder keine der 19 Aminosäuren
des N-terminalen Schwanzes enthalten. Typischerweise ist nur ein
Teil oder nichts vom N-terminalen Schwanz vorhanden, wenn ABDmut
Teil eines Fusionsproteins, z. B. mit Domäne Z, ist. Asparagin ist die
alkaliempfindlichste Aminosäure
und daher kann jeder andere Aminosäurerest zu seinem Ersatz verwendet
werden und eine Zunahme der Stabilität ist zu erwarten. Es könnte helfen,
die Sequenzen anderer homologer Proteine zu vergleichen, die in
anderen Spezies zu finden sind oder die gleiche Rolle ausfüllen, um
geeignete Aminosäuren
zur Verwendung bei der Substitution zu identifizieren.
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Bei
einem zur Stabilisierung anderer Affinitätsliganden geeigneten Verfahren
wurden die Modifikationen durch PCR-Mutagenese eingeführt. Zunächst werden
fehlerhafte (mismatched) Primer zum Einführen der Mutationen verwendet
und dann werden die Fragmente des ersten PCR-Zyklus gemischt und
man läßt die Polymerase
die Stränge
auffüllen.
Das die Modifikationen enthaltende doppelsträngige Fragment des ABD wird mit
Restriktionsenzymen gespalten und in ein mit denselben Enzymen geschnittenes
Plasmid ligasiert, welches dann zur Transformation von E. coli,
dem Expressionssystem für
das Protein, benutzt wird.
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Bevorzugt
behält
der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
gereinigte (d. h. erhaltene) Affinitätsligand nach 20 Zyklen einer
Behandlung mit 0,5 molarer NaOH mehr als 80%, bevorzugt mehr als
95%, seiner normalen Bindungskapazität.
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Die
Erfindung wird eingehender in den folgenden, nicht beschränkenden
Beispielen beschrieben, worin
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1 eine
schematische Beschreibung des erfindungsgemäßen PCR-Mutageneseschritts
ist;
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2 das
Klonen des Genkonstrukts zeigt;
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3 die
Aminosäuresequenz
des Wildtyp-ABD und einer mutierten alkalibeständigen Variante davon ist,
wobei die volle Sequenz der mutierten Variante hier als SEQ ID NO.
1 bezeichnet wird;
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4 ein
SDS-PAGE (4–20%)
unter reduzierenden Bedingungen zeigt. Die dritte Spur zeigt einen
Molekulargewichtsmarker (von oben 94, 67, 43, 40, 20,2 bzw. 14,4
kDa). Um die Selektivität
des mutierten ABD zu prüfen,
wurde ein Disintegrat von E. coli mit HSA geimpft (Spur 4) und auf
die Säule
gegeben. Die Spuren 5, 6 und 7 zeigen das eluierte Material nach
2, 8 und 15 Zyklen der Behandlung mit NaOH. Spur 8 zeigt einen HSA-Vergleich;
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5 zeigt
Sensorgramme vom BIACore, welche die Bindungseigenschaften von (A)ABDwt
bzw. (B)ABDmut vor und nach mehreren Behandlungszyklen mit 0,5 molarer
NaOH zeigen;
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6 ist
ein Graph, der die Kapazität
von zwei Affinitätsmatrizes,
ABDwt bzw. ABDmut, nach mehreren Behandlungszyklen mit 0,5 molarer
NaOH zeigt;
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7 zeigt
Sensorgramme vom in Beispiel 10 beschriebenen Biacore-Versuch und
zeigt die Bindungseigenschaften von ABDmut und seinen drei Dreifachmutanten,
Responseeinheiten (RU) über
Zeit (S); Δ ABDmu;
29-30-33A; ☐ 54-57-58A;
22-25-26A.
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Innerhalb
der Beispiele werden ABDstab und ABDmut synonym benutzt.
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Beispiel 1 – Klonieren
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Als
Schablone für
die PCR-Mutagenese wurde pTrpABDT1T2 (Kraulis et al., (1996) FEBS
Lett. 378, 190–194)
benutzt. Das Plasmid kodiert das Gen für ABDwt unter Steuerung durch
den Tryptophan-Promotor. Die
PCR-Mutagenese wurde in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten PCR wurde die
Mutation eingeführt
und im zweiten PCR-Zyklus wurden die Fragmente aus dem ersten Zyklus
ge mischt und man ließ die
Polymerase die Stränge
auffüllen
(1). Die in der ersten PCR benutzten Primer waren:
-
-
Das
doppelsträngige
Fragment wurde mit Xba I und Pst I gespalten und in mit denselben
Enzymen geschnittenes pTrpABDT1T2 ligasiert (2). Das
Ligationsgemisch wurde zur Transformation. von E. coli, Stamm RRIΔMI5, verwendet.
Nach Bestätigung
der Insertgröße durch
PCR wurde die Sequenz mit Zyklussequenzierung gesichert (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Das resultierende Plasmid
wurde mit pTrpABDmutT1T2 bezeichnet.
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Beispiel 2 – Expression
und Reinigung
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E.
coli-Zellen, die das ABDmut und auch den Wildtyp ABD als Vergleich
kodierende Plasmid enthielten, wurden über Nacht in Schüttelflaschen
mit 500 ml Tryptic Soy Broth (30 g/l), ergänzt durch Hefeextrakt (Difco,
USA, 5 g/l), und Kanamycinmonosulfat (50 mg/l) gezüchtet. Da
das ABD-Gen vom Tryptophanpromotor gesteuert wird, beginnt die Erzeugung
von m-RNA, wenn die Aminosäure
im Kulturmedium fehlt. Nach 20 h wurden die Zellen durch Zentrifugieren,
4000 g in 10 min, geerntet. Nach Wiederaufschlämmen der Zellen in 30 ml TST
(25 mmol/l Tris-HC1, pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 0,05% Tween 20) wurden
sie durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Danach wurde zentrifugiert,
etwa 40000 g in 20 min. Der Überstand
wurde filtriert (0,49 μm).
Das lösliche
Protein wurde mit Affinitätschromatographie
auf Sepharose mit humanem Serumalbumin (HSA) isoliert, wie von Stahl
et al., (1989) J. Immunol. Meth. 124, 43–52, beschrieben. Der Proteingehalt der
eluierten Fraktionen wurde anhand der Extinktion bei 280 nm gemessen
und die relevanten Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Beide Proteine sind nach einem einzigen Reinigungsschritt hochrein und
wandern entsprechend ihren Molmassen.
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Beispiel 3 – Bindungseigenschaften
vor und nach NaOH-Behandlung
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Um
die Stabilität
von ABDwt und ABDmut zu untersuchen, wurden die Bindungseigenschaften
vor und nach Behandlung mit 0,5 molarer NaOH bei Raumtemperatur über 24 h
analysiert. Sowohl ABDwt als auch ABDmut wurden in 1 × HBS (10
mmol/l HEPES, pH 7,4, 150 mmol/l NaCl, 3,4 mmol/l EDTA, 0,005 P20)
zu einer Konzentration von 800 nmol/l gelöst und auf dem BIAcore 2000
(Biacore AB, Uppsala, Schweden) analysiert. Um die Aktivitätsänderung
nach Einwirken einer hochalkalischen Umgebung zu bestimmen, wurden
die Proteine in 0,5 molarer NaOH gelöst. Nach 24 h Inkubieren in
NaOH wurden die Proben durch eine NAP-10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Schweden) geleitet, die mit 30 mmol/l NH4Ac äquilibriert
war. Die proteinhaltigen Proben wurden gefriergetrocknet und für die Analyse
im BIAcore 2000 in 1 × HBS
zu einer Konzentration von 800 nmol/l wieder gelöst.
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BIAcore-Analyse
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Zur
Echtzeit-Affinitätsanalyse
wurde ein Gerät
BIAcore 2000 (Biacore AB) verwendet. HSA und IgG wurden auf zwei
verschiedenen Oberflächen
eines CM5-Sensorchips durch Aminkupplung an die carboxylierte Dextranschicht
immobilisiert. Diese Kupplung erfolgte nach Empfehlungen des Herstellers
(Biacore AB). Die IgG-Oberfläche
diente als Vergleich. Die Proben wurden durch ein 0,45 μm-Filter
gegeben und in zufälliger Reihenfolge
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 5 μl/min über die
Oberfläche
injiziert. Die Ergebnisse zeigen klar, dass ABDwt während der
Einwirkung der alkalischen Lösung
seine Affinität
für HSA
verliert, während
die mutierte Variante, der vier Asparaginreste fehlen, die Affinität bewahrt.
Die Sensorgramme sind in 5 gezeigt.
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Für die noch
aktiv gebliebenen Proteine wurde auch eine Analyse der kinetischen
Parameter ausgeführt.
Dies erfolgte durch Analyse des Bindungsverhaltens bei verschiedenen
Konzentrationen und nachfolgende Berechnung der Bindungskonstanten
unter Anwendung der BIAevaluation 2.1-Software (BIAcore AB). Die
angewendeten Konzentrationen waren 40–220 nmol/l für ABDwt,
200–600
nmol/l für
ABDmut und 800–1250
nmol/l für
das mit NaOH behandelte ABDmut. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle
1 gezeigt.
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Kon stellt die Geschwindigkeit dar, mit der
sich das Protein assoziiert, Koff die Dissoziationsgeschwindigkeit
und Kaff ist die Affinitätskonstante, berechnet als
Verhältnis
zwischen Kon und Koff.
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Beispiel 4 – Herstellung
von Affinitätsmatrizes
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Um
die Brauchbarkeit des stabilisierten HSA bindenden Proteins in der
Biotechnologie zu beurteilen, wurden zwei Affinitätsmatrizes
hergestellt, eine mit dem unmutierten Protein (ABDwt) als Vergleich
und die andere mit dem mutierten ABD (ABDmut). Als Matrix wurde
Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) mit
Carbodiimid CMC (Sigma Aldrich, Schweden) als Kupplungsreagenz verwendet.
ABDwt (4,5 mg) und ABDmut (8,5 mg) wurden getrennt in 9 ml Wasser
gelöst.
Zu den Lösungen
von ABDwt und ABDmut wurden 3,5 bzw. 5,0 ml Gel zugefügt. Schließlich wurden
den Lösungen
0,38 g CMC zugefügt
und sie wurden bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Gele
wurden in HR-Säulen (d
= 5 mm, h = 43 mm) und mit 0,5 mol/l Ethanolamin, 0,5 mol/l NaCl,
pH 8,3, zur Inaktivierung der Matrix und mit 0,1 mol/l NaAc, 0,5
mol/l NaCl, pH 4, zum Auswaschen ungebundenen Proteins beaufschlagt.
Danach waren die Säulen
gebrauchsfertig zur Affinitätsreinigung
von HSA.
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Beispiel 5 – Erhaltene
Selektivität
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Um
zu untersuchen, ob die Selektivität des mutierten Proteins für HSA nach
Ersatz von vier Aminosäuren
erhalten bleibt, wurde ein Einfangversuch durchgeführt. Ein über Nacht
gezüchtete
Kultur von E. coli-Zellen wurde mit Ultraschall aufgebrochen, bei
40000 g zentrifugiert und durch ein 0,45 μm-Filter filtriert. Die lösliche Fraktion
des E. coli-Lysats wurde mit reinem HSA gemischt, und die Mischung
wurde auf die ABDmut-Affinitätssäule aufgetragen.
Nach Waschen der Säule
wurde das gebundene Material durch pH-Erniedrigung auf 2,8 eluiert,
wie von Stahl et al., (1998), a.a.O., beschrieben. Wie man in 4 sieht,
bleibt die Selektivität
in der mutierten Variante des ABD erhalten.
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Beispiel 6 – Alkalibeständige Affinitätssäulen
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Um
den Unterschied zwischen der ABDwt- und ABDmut-Säule hinsichtlich der Stabilität gegen
Alkalibehandlung zu untersuchen, wurden beide Säulen wiederholt mit 0,5 molarer
NaOH gewaschen. Die Säulen wurden
unter Anwendung des AKTA Explorers mit HSA beladen, das Protein
wurde durch pH-Erniedrigung eluiert (Ståhl et al., (1998), a. a. O.)
und schließlich
wurden beide Säulen
mit NaOH gewaschen. Dieser Zyklus wurde 15 mal wiederholt und die
Gesamteinwirkungszeit überschritt
6 h. Die angewendete Fließgeschwindigkeit
war 60 cm/h und das eluierte Material wurde bei jedem Zyklus gesammelt
und analysiert. In 6 ist die Kapazitätsabnahme über der
NaOH-Einwirkungszeit aufgetragen. Wie man in der Figur sieht, verliert
ABDwt seine Aktivität
sehr schnell, während
die mutierte Variante die Aktivität während des Versuchs behält. Diese Ergebnisse
bestätigen
die BIAcore-Daten; die mutierte Variante ist viel stabiler gegenüber der
cleaning-in-place-Behandlung (CIP) als das Molekül des Wildtyps.
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Beispiel 7 – Herstellung
und Reinigung von Z-ABDstab
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Eine
gefrorene Kultur von E. coli RRIΔMl5,
welche den Expressionsvektor pTrpZABDstabT1T2 (siehe Beispiel 8)
enthielt, wurde zum Impfen von 20 ml Tryptic Soy Broth (30 g/l)
(Difco, Dtroit, MI, USA), ergänzt durch
5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 50 mg/l Kanamycinmonosulfat (Labkemi,
Stockholm, Schweden) verwendet. 10 ml der Übernacht-Kultur wurden zum
Impfen von 500 ml frischem Medium verwendet. Man ließ die Zellen
bei 37°C
wachsen und in der mid-log-Phase (A600nm =
1) wurde durch Zusatz von 3-β-Indolacrylsäure (SIGMA-Aldrich,
Stockholm, Schweden) zu einer Endkonzentration von 25 mg/l die Expression
eingeleitet. Nach 24 h wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei
etwa 5000 g über
10 min und nachfolgendes Resuspendieren in TST-Puffer (25 mmol/l
Tris-HCl, pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 1,25 mmol/l EDTA, 0,05% Tween
20) geerntet. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung (Vibracell,
Sonics & Materials,
Danbury, CT, USA) zerlegt und bei 30000 g 20 min zentrifugiert.
Der Überstand
wurde durch 0,45 μm-Filter
(Millipore Corp., Bedford, MA, USA) filtriert und der HSA-Affinitätschromatographie
(Nygren et al., 1988) unterworfen. Die Menge des eluierten Proteins
wurde durch Extinktionsmessung unter Anwendung der spezifischen
Absorptionskonstante a (L/g·cm)
geschätzt,
und relevante Fraktionen wurden gefriergetrocknet.
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Beispiel 8 – Genetischer
Aufbau des Fusionsproteins Z-ABDstab
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Aus
pTrpABDmutT1T2 wurde das Plasmid pTrpZABDstabT1T2 aufgebaut. Ein
die Z-Domäne
kodierendes Genfragment von 233 Basenpaaren wurde aus pRIT45 (Nilsson
et al., (1994) Eur. J. Biochem. 224, 1038–108) durch Digestion mit XbaI-EcoRI
isoliert und in pTrpABDmutT1T2, das zuvor mit denselben Restriktionsendonukleasen
geschnitten worden war, ligasiert. Das Ligationsgemisch wurde zur
Transformation von E. coli, Stamm RRIΔMl5, verwendet. Das resultierende
Plasmid enthielt ein Gen, welches das Fusionsprotein Z-ABDstab kodiert
und wurde mit pTrpZABDstabT1T2 bezeichnet.
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Die
DNA-Sequenzen von ABDstab und Z-ABDstab (einschließlich des
Bereichs, der den N-terminalen Schwanz mit 19 Aminosäuren kodiert)
sind folgende:
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Z-ABDstab
(SEQ ID NO. 12)
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Beispiel 9 – Genetischer
Aufbau der drei Dreifachmutanten der ABDmut-Domäne
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Beispiele
9 und 10 zeigen, dass es möglich
ist, eine Oberfläche
eines bereits stabilisierten ABD-Moleküls zu randomisieren, beispielsweise
eine Oberfläche,
die nicht an der HSA-Bindung teilnimmt, und so ein Molekül zu schaffen,
das jedes gewählte
Ziel binden kann und auch Affinität zu HSA behält.
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Auf
der Basis der Ergebnisse eines Scanversuchs mit Alanin zur Kartierung
der Bindungsstelle für HSA
wurden Genkonstrukte hergestellt, die Domänen von ABDmut (siehe Beispiel
1) mit weiteren Alaninsubstitutionen kodieren. Diese wurden an Positionen
in der Domäne
eingeführt,
die vom identifizierten HSA bindenden Motiv wegweisen, das auf der
ersten und zweiten Helix und in der Schleife dazwischen lokalisiert
wurde. Durch PCR-basierte
Mutagenese wurden drei verschiedene Plasmidgenkonstrukte zusammengestellt,
von denen jedes Varianten des ABDmut-Proteins mit drei Alaninsubstitutionen
kodiert: pTrpABDmut22-25-26 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen
22, 25 und 26 der ABDmut-Domäne,
pTrpABDmut29-30-33 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen 29,
30 und 33 der ABDmut-Domäne
und pTrpABDmut54-57-58 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen
54, 57 und 58 der ABDmut-Domäne.
Als Schablone für
die PCR-Mutagenese wurde das Plasmid pTrpABDmutT1T2 benutzt (siehe
Beispiel 1). Das Plasmid kodiert das Gen für ABDmut unter Steuerung der
Transkription durch den Tryptophanpromotor. Der Ersatz der Aminosäuren 22,
25 und 26 durch Alanin wurde durch gewöhnliche PCR-Mutagenese mit
den Primern T1T2 (siehe Beispiel 1) und LIMA 12:
5'-GTAGACGCGA ATTCATTAGC
TGCTGCTAAA GCAGCTGCTC TG-3' (LIMA12)
(SEQ ID NO.6) ausgeführt.
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Die
PCR-Mutagenese für
die anderen beiden Konstrukte wurde in zwei Schritten durchgeführt. In
der ersten PCR-Amplifikation wurden die Mutationen eingeführt und
in der zweiten PCR wurden die Fragmente der ersten PCR-Amplifikation
gemischt und einer von Taq-DNA-Polymerase unterstützten Doppelstrang-DNA-Synthese
unterworfen (dieselbe Strategie wie in Beispiel 1), gefolgt von
einer Amplifikation unter Verwendung von flankierenden Primern (SOHO8
und T1T2 (siehe Beispiel 1)). Die in der PCR zum Ersatz der Aminosäuren 29,
30 und 33 verwendeten Primer waren: 5'-actccatatg cgtcgagcgc tqccagagct-3' (LIMA13)(SEQ ID
NO. 7), 5'-agcgctcgac
gcatatggag taagtgact-3' (LIMA14)(SEQ
ID NO. 8). Für
den Ersatz der Aminosäuren
54, 57 und 58 wurden LIMA15 und LIMA16 verwendet:
5'-gtqtagcagc actqgcagct
gaaatttta-3' (LIMA15)(SEQ
ID NO. 9) 5'-aaaatttcag
ctgccagtgc tgctacacct tcaac-3' (LIMA16)(SEQ
ID NO. 10).
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Zum
Aufbau des Plasmids pTrpABDmut22-25-26 wurde das doppelsträngige PCR-Produkt
mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI gespalten und für die anderen
beiden Mutanten wurde XbaI und PstI benutzt. Die verschiedenen Fragmente
wurden in pTrpABDT1T2 ligasiert, das mit denselben Enzymen geschnitten
worden war, was zu einem Ersatz des Gens für die Wildtyp-ABD-Domäne für die drei
verschiedenen ABDmut-Dreifachmutanten führte. Die entsprechenden Mischungen
wurden zur Transformation von E. coli, Stamm RRIΔM15, verwendet. Nach Bestätigung der
Insertgröße wurden
die Sequenz durch Zyklussequenzierung geprüft (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Schweden). Die resultierenden Plasmide wurden mit pTrpABDmut22-25-26,
pTrpABDmut29-30-33
bzw. pTrpABDmut54-57-58 bezeichnet.
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Die
DNA-Sequenzen der drei Dreifachmutanten sind wie folgt:
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ABDmut22-25-26
(SEQ ID NO. 13)
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ABDmut29-30-33
(SEQ ID NO. 14)
-
ABDmut54-57-58
(SEQ ID NO. 15)
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Beispiel 10 – HSA-Bindungsanalyse
der Proteine ABDmut22-25-26, ABDmut29-30-33 und ABDmut54-57-58
-
ABDmut22-25-26,
ABDmut29-30-33 und ABDmut54-57-58 wurden hergestellt und gereinigt
wie in Beispiel 2 beschrieben. Um das Bindungsverhalten der verschiedenen
Dreifachmutanten zu analysieren, wurde ein Gerät BIAcore 2000 verwendet. Auf
der Sensorchipoberfläche
eines CM5-Sensorchips wurde HSA durch Aminkupplung an die carboxylierte
Dextranschicht immobilisiert. Als Vergleich wurde eine Sensorchipoberfläche mit
IgG benutzt. Die Kupplung erfolgte nach Empfehlungen des Herstellers
(Biacore AB). Proben der drei Proteine wurden durch ein 0,45 μm-Filter
gegeben und in Zufallsreihenfolge mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl/min über die
Oberfläche
injiziert. Die angewendete Konzentration war 200 nmol/l und alle
Proben wurden dreimal untersucht. Die resultierenden Sensorgramme
zeigen, dass alle drei Dreifachmutanten ihre Bindungsfähigkeit
für HSA
behalten (7). Diese Ergebnisse zeigen,
dass die in dieser Studie untersuchten neun Positionen (22, 25,
26, 29, 30, 33, 54, 57, 58) entweder gleichzeitig oder in verschiedenen
Kombinationen entweder einer gerichteten oder einer zufälligen Mutation
unterworfen werden können,
um neue HSA bindende ABDwt- oder
ABDmut-Domänen
mit einer zweiten Aktivität,
wie Bindung, Katalyse oder Verwendung als Substrat, zu identifizieren.
Außerdem
kann auch der Rest 62 für
Substitutionen verwendet werden.
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