DE69927598T2

DE69927598T2 - Verfahren zur Affinitätstrennung und Liganden zur pertinenten Verwendung

Info

Publication number: DE69927598T2
Application number: DE69927598T
Authority: DE
Inventors: Mathias Uhlen; Sophia Hober
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: EP1123389B1; JP2002527107A; US6831161B1; NO20011969D0; DE69927598D1; ATE305970T1; CA2347960A1; JP4801258B2; NO323994B1; CA2633345C; GB9823071D0; NO20011969L; CA2347960C; AU773368B2; EP1672068A1; AU6353299A; CA2633345A1; WO2000023580A1; US20050100970A1; DK1123389T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Affinitätstrennung und Liganden zur pertinenten Verwendung.
Affinitätstrennungen finden im Allgemeinen auf Affinitätschromatographiesäulen statt und nutzen die potentiell hohe Spezifität der Wechselwirkungen mit Biomolekülen, insbesondere von Proteinen. Andere mögliche Trennverfahren umfassen Membranfiltration, Zweiphasenextraktion, Fließbetten, aufgelockerte Betten (expanded beds) und Trennung mit Magnetperlen (magnetic beads) (Scopes, R. K., Protein Purification, Principles and Practice, 3. Auflage, ISBN 0-387-94072-3). Die Wechselwirkungen umfassen solche zwischen Protein-Protein, Protein-Nukleinsäure, Enzym-Substrat, Rezeptor-Ligand (z. B. Hormone), Protein-Kohlenhydrat und Protein-Metall. Allgemein beruht die Affinitätstrennung auf biologisch wichtigen Bindungswechselwirkungen, die auf Proteinoberflächen stattfinden, wie solche zwischen einem Enzym und seinem Substrat, zwischen Nukleinsäuren und einem DNA-bindenden Protein oder zwischen Antigen und Antikörper. Der eine oder andere der beiden bindenden Partner kann immobilisiert werden, beispielsweise durch kovalente Bindung an eine unlösliche Matrix in einer Affinitätssäule, um seinen Bindungspartner zu bestimmen oder zu reinigen. Die sehr selektive Natur der Wechselwirkung zwischen den bindenden oder diese einbeziehenden Molekülen, insbesondere Proteinen, macht sie ideal für Reinigungs/Trennmethoden und für viele Anwendungen, wobei die Affinitätschromatographie unter Einbeziehung eines immobilisierten Proteinliganden gegenüber Ionenaustausch- oder Gelfiltrati onschromatographie bevorzugt wird.
Wenn eine Probe auf eine Säule aufgetragen wird, die einen für ein Zielmolekül der Probe spezifischen Bindungspartner immobilisiert auf einer festen Matrix enthält, wird das Zielmolekül in der Säule zurückgehalten, während die Mehrzahl der Nichtzielmoleküle einfach hindurchläuft. Um zunächst alle nicht spezifisch gebundenen Moleküle auszuwaschen und danach das Zielmolekül zu eluieren, kann eine Lösung mit typischerweise stufenweise abnehmendem pH auf die Säule aufgetragen werden. Das Zielmolekül, das die höchste Affinität zum immobilisierten Liganden hat, wird als letztes ausgewaschen und daher enthalten die Schlußfraktionen die höchste Konzentration an Zielmolekül und können dann in einem weiteren Reinigungs/Anreicherungsschritt oder zur direkten oder indirekten Bestimmung der Anwesenheit des Zielmoleküls verwendet werden.
Die Medizin und allgemein die biologische und biotechnologische Forschung haben ein Bedürfnis nach immer reineren Proben organischer und biologischer Moleküle und somit nach Strategien, die Proben hoher Reinheit so schnell und billig wie möglich liefern, entwickelt.
Die Affinitätstrennung ist wichtig sowohl zur Befriedigung des Bedürfnisses nach reinen Proben von Proteinen und anderen Molekülen als auch für Nachweis und quantitative Bestimmung eines Zielmoleküls. Das kann wichtig sein, wenn beispielsweise Blut- und Urinproben auf Moleküle, die eine Erkrankung wie eine Stoffwechselstörung anzeigen oder auch nur auf Anwesenheit von nicht natürlich vorkommenden Stoffen, Narkotika, Steroidabkömmlinge usw. untersucht werden.
Eine Affinitätschromatographiesäule, komplett mit der festen Affinitätsmatrix, kann teuer sein und es ist offensichtlich wünschenswert, die Säule mehrmals wiederverwenden zu können, d. h. eine Anzahl von Durchläufen ausführen zu können, bevor sie wegen der verminderten Fähigkeit des immobilisierten Liganden zur Bindung eines Zielmoleküls oder einer verminderten Spezifität der Bindung verworfen werden muß. Um eine Reihe von Ergebnissen zu erhalten, die direkt miteinander verglichen werden können, und um vor dem nächsten Durchlauf nichtspezifisch und spezifisch gebundenen Moleküle aus der Säule zu entfernen, muß die Säule gereinigt werden. Der anerkannte Standard zur Reinigung und Sterilisierung von Trennmedien und -systemen ist NaOH, häufig in Kombination mit NaCl. Eine aufgetragene 0,1- bis 1,0-molare Lösung von NaOH kann Viren, Bakterien, Nukleinsäuren, Proteine, Hefen, Endotoxine, Prionen und andere kontaminierende Agenzien entfernen. Die Kontaktzeit mit dem NaOH kann variieren, zwischen 30 min und 1 h ist typisch, und die Entfernung aus dem System wird durch einfache Inline-Messung von pH und Leitfähigkeit verfolgt.
Die Fähigkeit der Trennmedien, diesen ziemlich harten Sterilisierungsbedingungen widerstehen zu können, hängt jedoch von den funktionellen Gruppen der anhängenden Liganden (Bindungspartner), dem Chemismus der Bindung und der Stabilität der Basismatrizen gegenüber alkalischen Bedingungen ab. Proteine sind empfindlich gegenüber extremen pH-Werten, wie sie bei der Reinigung mit NaOH auftreten, und allgemein gesagt beeinträchtigt dies die Wirksamkeit der Affinitätsmedien auf Proteinbasis. Obwohl die Affinitätstrennung auf Proteinbasis wegen ihrer guten Spezifität Vorteile gegenüber Ionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographie hat, werden daher diese anderen weniger spezifischen Techniken nicht durch die Standard-Reinigungsverfahren nachteilig beeinflußt.
Die Empfindlichkeit der Proteine gegen alkalischen pH ist in erster Linie auf die Deamidierung der Asparagin- und Glutaminreste, insbesondere der Asparaginreste, zurückzuführen. Die Deamidierung des Asparagins führt über ein zyklisches Imid-Zwischenprodukt zur Bildung von Isoaspartat und Aspartat, gewöhnlich im Verhältnis 3:1 bis 4:1. Diese Reaktion findet bei physiologischem pH statt, ist jedoch bei alkalischem pH, wie er in einer mit NaOH-Lösung gereinigten Chromatographiesäule vor kommt, viel schneller. Die Isoaspartylform ist durch eine atypische Amidbindung zwischen dem β-Carboxyl des Aspartats und dem α-Stickstoff der C-flankierenden Aminosäure gekennzeichnet. Dies führt zu einem zusätzlichen -CH₂- im Proteingerüst und zu einer freien α-Carboxylgruppe. Als Folge der Deamidierung kann eine Spaltung des Proteingerüsts stattfinden und das Protein kann durch die Strukturänderung des ganzen Proteins oder auch nur durch eine kleine Veränderung im empfindlichen Bereich, wie an der aktiven oder der Bindungsstelle, seine Aktivität verlieren. Die Empfindlichkeit des Asparaginrests für Deamidierung hängt von Sequenz und Konformation ab, wobei Asn-Reste an Asn-Gly- und Asn-Ser-Stellen besonders anfällig sind.
Es ist ein ernstes Problem, wenn eine Affinitätschromatographiesäule mit einem an einem unlöslichen Träger immobilisierten Protein erstellt wurde und das notwendige Reinigungsverfahren zwischen den Durchläufen zu verminderter Wirksamkeit des Systems führt. Wenn aufeinanderfolgende Waschungen die Fähigkeit des immobilisierten Proteins zum Einfangen seines Bindungspartners aus einer Probe vermindern, wird nicht nur das Ende der absolut nützlichen Lebensdauer beschleunigt, sondern es werden auch Vergleiche zwischen Durchläufen, bei denen die Konzentration des Analyten in einer Reihe von Proben gemessen wird, sinnlos. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Verfahren der Affinitätstrennung, bei dem das immobilisierte Protein gegenüber Standard-Reinigungsverfahren, insbesondere gegenüber alkalischem pH, weniger empfindlich ist.
Daher gibt die vorliegende Erfindung nach einer Ausführung ein Verfahren zur Affinitätstrennung an, bei dem der Affinitätsligand ein immobilisierter proteinartiger Ligand ist, wobei das Verfahren den Anfangsschritt der Modifikation einer oder mehrerer Asparaginreste (Asn) im Affinitätsliganden umfaßt, um die Stabilität des Proteins unter alkalischen Bedingungen zu erhöhen.
Der Begriff "modifiziert" schließt die Entfernung des Aspara ginrests oder seinen Ersatz durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure ein, oder dass der Asparaginrest durch Substitution (d. h. chemische Substitution einer oder mehrerer Gruppen) oder durch andere chemische Derivatisierung, z. B. durch eine Schutzgruppe, modifiziert wurde. Der Ersatz eines oder mehrerer Asparaginreste durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure ist bevorzugt.
Mit "Affinitätstrennung" ist jedes Reinigungs- oder Bestimmungsverfahren gemeint, welches das Auftragen einer Probe mit einem Zielanalyten auf einen Festkörper umfaßt, der einen für den Analyten spezifischen Bindungspartner trägt. Die Probe wird durch Schwerkraft oder andere Mittel durch oder über den Feststoff geführt und Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem auf dem Feststoff immobilisierten spezifischen Bindungspartner bedeutet, dass der Analyt auf dem Feststoff zurückgehalten wird, während der Rest der Probe oder das meiste davon durch das System hindurchläuft. Die Trennung kann geeignet auf einer Affinitätschromatographiesäule ausgeführt werden. Der Feststoff ist bevorzugt so in einer Säule angeordnet, dass die Probe oben aufgetragen wird und der Nichtzielanteil der Probe abläuft. Um den spezifisch gebundenen Analyten zu entfernen, kann ein Eluens wie eine Salzlösung oder eine pH-Änderung angewendet werden. Der Analyt kann dann in einer Anzahl Aliquote in kontrollierter Weise aufgefangen werden.
Ein "Affinitätsligand" ist also ein zielspezifischer Bindungspartner, der in einem Affinitätstrennverfahren verwendet werden kann.
"Analyt" wird verwendet, um jegliches proteinartige oder andere Molekül oder Molekülfragment in einer Probe zu bezeichnen, das spezifisch an den immobilisierten Liganden binden kann.
Der Begriff" "spezifischer Bindungspartner" kann ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen einschließen, und jedes dieser Moleküle kann auch "spezifisch" an eines oder mehrere andere Moleküle binden. Dieser Begriff impliziert also nicht, dass jeglicher immobilisierte Ligand oder Analyt nur einen Bindungspartner hat, vielmehr, dass die Bindung solcherart spezifisch ist, dass die meisten anderen Moleküle nicht mit derselben Affinität oder Festigkeit binden, insbesondere dass andere Nichtzielmoleküle in einer gegebenen Probe wesentlich geringere Affinität haben. Die Reinigung durch Affinitätstrennung ist wegen der hohen Affinität zwischen biologisch spezifischen Bindungspartnern häufig größenordnungsmäßig mehrtausendfach.
Alle einen immobilisierten proteinartigen Liganden einschließenden Typen der Affinitätstrennung können beim erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden, und zur Verwendung mit besonderen Liganden bekannte geeignete Matrizes (z. B. ein fester Träger) sind im Stand der Technik bekannt. Sie basieren typischerweise auf der Chromatographie mit Agarose, Polyacrylamid, Siliciumdioxid, Polyvinylstyrol, Dextran oder anderen Polymeren. Jeder in der Technik für Trennungs- oder Immobilisierungsprozesse bekannte feste Träger kann verwendet werden, wie auch jedes zum Anheften von Molekülen wie Affinitätsliganden bekannte Verfahren angewendet werden kann. Die proteinartigen Liganden werden gewöhnlich an die Matrix durch ein Kupplungsreagenz wie Cyanbromid, Epichlorhydrin, Bisoxirane, Divinylsulfon, Carbonyldiimidazol, N-Hydroxysuccinimid, Tosyl/Tresylchlorid, Epichlorhydrin, Carbodiimid, Glutaraldehyd, Hydrazin, Oxiran und auch mit Carboxyl oder Thiol aktivierte Matrizes. Wiederum sind solche Kupplungsreagenzien und -verfahren im Stand der Technik bekannt und ausführlich in der Literatur beschrieben (Jansson, J. C. und Rydén, L., Protein Purification, 2. Auflage, Seiten 375–442, ISBN 0-471-18626-0). Verschiedene Matrixderivate, die eine direkte Immobilisierung ermöglichen, umfassen CNBr-aktivierte Sepharose 4B, AH-Sepharose 4B und CH-Sepharose 4B und epoxyaktivierte Sepharose 6B (Pharmacia).
Der proteinartige Affinitätsligand kann ein Molekül mit einem Proteinbestandteil sein, der als "spezifischer Bindungspartner" wie oben definiert wirken kann. So können Glycoproteine oder Protein-Lipid-Komplexe oder auch Proteine mit prosthetischen Gruppen als Affinitätsligand, der erfindungsgemäß modifiziert wird, verwendet werden. Jedoch sind Proteinmoleküle bevorzugt. Der Begriff "Protein" wird hier im weiten Sinn benutzt und schließt jedes Molekül mit einer Polypeptid- oder Peptidstruktur ein. Mit anderen Worten besteht ein "Protein", wie es hier verwendet wird, aus einer Aminosäurekette und der Begriff umfaßt keine besondere, die Konformation (d. h. Tertiärstruktur) oder anderes betreffende Anforderung.
Die zum Ersatz des Asparagins geeigneten Aminosäuren umfassen alle anderen der 19 natürlich vorkommenden Standard-Aminosäuren, obwohl Cystein und Glutamin nicht bevorzugt werden. Bevorzugte ersetzende Aminosäuren umfassen Lysin, Asparaginsäure und Leucin. Auch dem Fachmann bekannte nicht natürlich vorkommende Aminosäuren und -derivate können zum Ersetzen der Asparaginreste verwendet werden. Bedeutende Verbesserungen der Stabilität des immobilisierten Protein und daher der Wirksamkeit der Säule nach der Reinigung können beobachtet werden, wenn nur ein Asparagin durch einen weniger alkaliempfindlichen Rest ersetzt wird. Bevorzugt werden aber 2, 3 oder mehr oder sogar alle Asparaginreste ersetzt.
Eine "weniger alkaliempfindliche Aminosäure" ist eine, die gegen Abbau unter alkalischen Bedingungen weniger empfindlich als Asn ist, wenn man unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken, Verfahren und Bedingungen vergleicht. Solche Bedingungen können beispielsweise die oben erwähnten Bedingungen für das Waschen der Säule sein, oder jegliche anderen im Stand der Technik zur Untersuchung der Proteinstabilität oder des Proteinabbaus, z. B. der oben besprochenen Deamidierung, angewendeten alkalischen Bedingungen. Eine "weniger alkaliempfindliche Aminosäure" kann daher jede andere Aminosäure als Asn und mehr bevorzugt auch als Gln und Cys sein. Die Alkaliempfindlichkeit kann geeignet durch Austausch eines gegebenen Asn-Rests im Proteinmolekül gegen eine Ersatzaminosäure oder durch chemische Abwandlung oder Derivatisierung dieses Asn-Rests und nachfolgenden Vergleich der Stabilität unter alkalischen Bedingungen (z. B. des Säulenwaschens) mit dem unmodifizierten Protein verglichen werden.
Wie oben bemerkt hängt die Empfindlichkeit eines bestimmten Asparaginrests für die Deamidierung von der Konfiguration des Proteins ab, wobei es besonders wichtig ist, jene Reste zu ersetzen, die sich auf der Oberfläche der dreidimensionalen Proteinstruktur befinden und daher den alkalischen Bedingungen besonders ausgesetzt sind. Am wichtigsten ist die Gesamtstabilität des Liganden und es ist wünschenswert, die Spezifität der Wechselwirkung zwischen immobilisiertem Liganden und Bindungspartner aufrechtzuerhalten. Daher sind die zu ersetzenden Asparaginreste bevorzugt nicht an der Wechselwirkung Ligand-Analyt beteiligt.
Der "asparaginmodifizierte" proteinartige Ligand (nachfolgend das "modifizierte Protein") kann mit jedem dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Standardtechniken zur ortsgerichteten Mutagenese von Nukleinsäuren sind beispielsweise im Laborhandbuch mit dem Titel Molecular Cloning von Sambrook, Fritsch und Maniatis beschrieben. Eine bevorzugte Technik schließt die PCR-Mutagenese ein, wobei im ersten PCR-Zyklus Primer verwendet werden, welche die zur Erzeugung der gewünschten Mutation benötigten unpassenden Basenpaare (mis-match base pairs) einbauen. Im zweiten Zyklus werden die Fragmente des ersten Zyklus gemischt und die Polymerase kann die Stränge ausfüllen. Das resultierende doppelsträngige Fragment kann in ein Plasmid ligasiert werden, das dann zur Transformation von E. coli verwendet wird. Das Protein kann in vitro ohne Verwendung eines biologischen Wirts synthetisiert und dabei können nicht natürlich vorkommende Aminosäuren eingeführt werden.
Im vorliegenden Fall wie auch für die vielen vorerwähnten allgemeinen Anwendungen der Affinitätstrennung ist von besonderem Interesse die Anwendung der Affinitätstrennung mit Liganden, die durch Randomisierung (zufällige Mutagenese) eines bestimmten Proteins zur Erzeugung von Liganden mit neuen, abgewandelten oder verstärkten Bindungseigenschaften erzeugt wurden. Diese Proteine werden als kombinatorische Proteine bezeichnet. Eine solche Technik umfaßt typischerweise die zufällige Mutagenese eines Zielproteins, die Expression der gesamten Bibliothek dieser Varianten, z. B. auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen, gefolgt von der Selektion eines Proteins, das die gewünschten Bindungseigenschaften zeigt, wobei diese Selektion typischerweise eine Bindungsreaktion zwischen dem variierten Protein und einem immobilisierten Liganden (Bindungspartner), d. h. Zielmolekül für das Protein, z. B. Zielanalyt, umfaßt. Die Mutagenese ist in dem Sinn zufällig, als die von einem bestimmten Kodon kodierte resultierende Aminosäure nicht allgemein vorherbestimmt ist, aber die Stellen, an denen Mutationen eingeführt werden sollen, im allgemeinen vorher festgelegt werden. Die Mutagenese kann Substitution, Entfernung oder Zufügen (d. h. Insertion) einer Aminosäure einschließen.
Die Anwendung eines Expressionssystems wie Oberflächenpräsentation auf Phagen liefert ein kritisches Bindeglied zwischen Genotyp und Phänotyp; es gibt eine abgeschlossene Einheit, die aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften selektiert werden kann und die auch den Nukleinsäurecode für das die beobachteten Bindungseigenschaften verursachende Protein trägt. Dies ermöglicht Expression in brauchbaren Mengen des wegen seiner Bindungseigenschaften selektierten Proteins. Eine solche Expression findet typischerweise in einem transformierten Bakterienwirt statt.
Das wegen seiner Fähigkeit, an einen immobilisierten Liganden (d. h. ein gewünschtes Zielmolekül (Analyt)) zu binden, ausgewählte Protein wird dann selbst bei der Affinitätstrennung (d. h. als Affinitätsligand) benutzt. Es wird immobilisiert und zur Reinigung oder Bestimmung eines Zielmoleküls in einer Probe verwendet, typischerweise derselbe Ligand, der zunächst zur Selektion des Proteins verwendet wurde. So kann ein Protein aus einer Variantenbibliothek wegen seiner Fähigkeit, z. B. Insulin zu binden, selektiert werden, wobei eine Säule mit auf einer Matrix immobilisiertem Insulin verwendet wird, und das selektierte Protein kann dann zum Testen von Proben auf Anwesenheit von Insulin verwendet werden.
Neben dem Testen auf Anwesenheit eines Zielmoleküls liefern die erfindungsgemäßen Affinitätstrennverfahren hervorragende Reinigungsverfahren, die Zielmolekülproben von guter Reinheit ergeben. Insbesondere ergeben die erfindungsgemäßen Verfahren auch nach vielen Zyklen des Trennsystems noch reine Proben, d. h. nach vielen Durchläufen mit Waschen der Säule. Solche mit den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Proben bilden weitere Ausführungen der Erfindung.
Wenn ein Protein vor den oben beschriebenen Randomisierungs- und Selektionsschritten durch Ersatz eines oder mehrerer seiner Asparaginreste stabilisiert wird, ist seine brauchbare Lebensdauer als Affinitätsligand wegen seiner Fähigkeit, harten Bedingungen wie hohem pH zu widerstehen, die auftreten, wenn eine Affinitätssäule zwischen den Durchläufen gewaschen wird, verlängert.
Die Verfahren der Erfindung wenden also bevorzugt ein kombinatorisches Protein an, wobei in einem vom Randomisierungsschritt (d. h. der zur Erzeugung des kombinatorischen Proteins durch Randomisierung eines "Original-", "Quell-" oder "Startproteins" angewendete Schritt) getrennten Schritt die Stabilität des Proteins unter alkalischen Bedingungen durch Modifizierung eines oder mehrerer seiner Asparaginreste gesteigert wurde (bevorzugt durch Ersetzten eines oder mehrerer seiner Asparaginreste durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure).
Die Randomisierung selbst kann zur Substitution von Asparaginresten führen, jedoch betrifft die Erfindung Proteine, die zur Erhöhung der Stabilität auch besonders modifiziert wurden, um einen oder mehrere Asparaginreste zu ersetzen. Das Protein kann vor, gleichzeitig mit oder nach der Randomisierung stabilisiert werden, jedoch werden die stabilisierenden Abwandlungen bevorzugt vor der Randomisierung eingeführt. Wenn die Stabilisierung vor der Randomisierung stattfindet, braucht sie nur einmal durchgeführt zu werden, und durch Selektion aus der Bibliothek der randomisierten Varianten mittels einer Anzahl von Liganden können mehrere stabilisierte Proteine mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften erhalten werden. Wird die Stabilisierung nach der Selektion für eine bestimmte Bindungsaffinität durchgeführt, besteht die Gefahr, dass durch die Stabilisierungssubstitutionen etwas Affinität verlorengeht.
Techniken zum Aufbau einer kombinatorischen Bibliothek von Proteinmolekülen und nachfolgende Selektion, um proteinartige Liganden mit den gewünschten Bindungseigenschaften zu erhalten, sind bekannt (Nygren, P. und Uhlén, M., Current Opinion in Structural Biology (1997) 7 463–469). Allgemein verwendet man ein Proteinmolekül, das vielleicht bereits in sich vorteilhafte Eigenschaften wie Unempfindlichkeit gegen pH und Temperatur hat, als Gerüst und baut dann über zufällige, aber gezielte Aminosäuresubstitution (oder andere Mutationen) des Proteinmoleküls eine kombinatorische Bibliothek auf, um eine Bibliothek von Molekülen mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften zu erzeugen. Im allgemeinen zielt die zufällige Mutagenese auf Reste an der Oberfläche.
Geeignete Proteingerüste können einfach lineare Peptide sein, jedoch besitzt das Gerüst bevorzugt eine gefaltete dreidimensionale Struktur, die das Potential zu höherer Affinität hat und weniger anfällig für proteolytischen Abbau ist. Man wählt gewöhnlich eher natürlich vorkommende Proteine oder Domänen für die weitere Bearbeitung aus, als dass man ein Gerüst de novo entwirft. Um Zweifel auszuschließen sei angemerkt, dass in dieser Beschreibung das Wort "Protein" sich sowohl auf ganze Proteinmoleküle als auch auf deren Fragmente und Domänen, Polypeptide oder Peptide bezieht.
Die Auswahl des Proteingerüsts hängt von mehreren Parametern ab, darunter die Fähigkeit, wirksam in einem gewünschten Wirtsorganismus, z. B. E. coli, exprimierbar zu sein, wenn das randomisierte Protein als Fusionsprotein mit einem Hüllprotein eines filamentösen Phagen präsentiert werden soll. Das Protein sollte auch auf seiner Oberfläche hinreichend große Regionen aufweisen, die gegen Substitution (oder Insertion oder Deletion) tolerant sind, ohne die dreidimensionale Gesamtstruktur zu verlieren. Wenn die Bibliothek synthetisch erzeugt werden soll, ist eine kleine Gesamtgröße Vorbedingung. Wo das gewählte Gerüstprotein eine Bindungsfunktion hat, können die in diese Wechselwirkung eingebundenen Aminosäurereste ein Ziel für die Randomisierung sein. Die Randomisierung kann durchgeführt werden, um die bekannten Bindungseigenschaften zu verstärken oder Liganden mit neuen Spezifitäten zu entwickeln.
Geeignete Gerüstmoleküle werden von Nygren et al. (1997) diskutiert und umfassen zyklische Peptide mit 40 oder mehr Resten in zwangsweiser Sequenz, immunglobulinartige Gerüste mit Fv- oder Einzelkettendomänen (scFv), Bakterienrezeptoren wie das Analogon Z des Eindomänen-Staphylokokkenproteins A (SPA) mit 58 Resten (wobei die Z-Domäne ein Derivat der B-Domäne im SPA ist), oder andere Domänen oder Analoga des SPA, DNA bindende Proteine, insbesondere Zinkfinger, und Proteaseinhibitoren. Alle diese Moleküle können durch Substitution eines oder mehrerer nativer Asparaginreste durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure stabilisiert werden, bevor eine kombinatorische Bibliothek des prästabilisierten Proteins angefertigt wird.
Von besonderem Interesse ist die Bakterienrezeptordomäne Z (Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlén, M. und Nygren, P., Protein Engineering (1995) 8, 6, 601–608). Diese Arbeit von Nord et al. beschreibt ein geeignetes Verfahren zum Aufbau einer kombinatorischen Bibliothek von Proteinmolekülen, die auf einen Bereich von Gerüstmolekülen angewendet werden kann. Das beschriebene Verfahren ist festphasengestützt und beruht auf stufenweisem Zusammenbau randomisierter einsträngiger Oligonukleotide.
Die Selektion aus einer erzeugten Proteinbibliothek kann auf mehreren verschiedenen bekannten Wegen durchgeführt werden, darunter auf Perlen (beads) immobilisierte Bibliotheken (McBride, J. D., Freeman, N., Domingo, G. J. und Leatherbarrow, R. J., J. Mol. Biol. [1996] 259: 819–827), Fusionen an DNA bindende Proteine (Schatz, P. J., Biotechnology [1993] 11: 1138–1143), und nach Präsentieren auf Bakterien (Lu, Z., Murray, K. S., Van Cleave, V., LaVallie, E. R., Ståhl, M. L. und McCoy, J. M., Biotechnology [1995] 13: 366–372) und Phagen (Clackson, T. und Wells, J., TIBTECH (1994) 12, 173–183) wie auch Hefezellen (Boder, E. T. und Wittrup, K. D., Nature Biotechnology (1997) 15, 553–557) und in viralen Systemen (Ernst, W., Grabher, R., Wegner, D., Borth, N, Graussauer, A, und Katinger, H., Nucleic Acid Research (1998) 26, 1718–1723 und Grabher, R., Ernst, W., Doblhoff-Dier, O., Sara, M. und Katinger, H., BioTechniques (1997) 22, 730–735).
Die Internationale Anmeldung WO 95/19374 beschreibt die Erzeugung einer kombinatorischen Bibliothek von Z-Varianten, siehe insbesondere Beispiel 4. Diese Anmeldung diskutiert auf Seite 12 die Vorteile der Z-Domäne als Affinitätsligand bei der Reinigung von rekombinaten Proteinen, weil sie in der rauhen Umgebung einer Affinitätssäule während der Reinigung relativ stabil ist. Die vorliegende Erfindung bietet dadurch weitere Vorteile, dass die Z-Domäne durch Ersatz der Asparaginreste gegen alkalischen pH stabilisiert werden kann. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die Z-Domäne zu stabilisieren, bevor die kombinatorische Bibliothek hergestellt wird.
Zur Auswahl geeigneter Liganden für die erfindungsgemäßen Affinitätsverfahren kann ein Verfahren der Präsentation auf Phagen durchgeführt werden, wobei bei einem auf der Phagen-Oberfläche exprimierten Protein in einem von jeglichen Modifikationen zur Abwandlung der Bindungseigenschaften getrennten Schritt einer oder mehrere Asparaginreste modifiziert wurden (bevorzugt durch Ersatz durch einen weniger alkaliempfindlichen Rest).
Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten kombinatorischen Proteins umfaßt die Schritte

a) Modifizieren von Asparaginresten in einem Proteinmolekül zur Erhöhung der Stabilität des Proteins in alkalischen Bedingungen und
b) Randomisierung des Proteinmoleküls zur Modifizierung seiner Bindungseigenschaften.

Die Modifizierung im Schritt a) umfaßt bevorzugt das Ersetzen von Asparaginresten durch andere weniger alkaliempfindliche Aminosäuren; Schritt a) wird bevorzugt vor Schritt b) ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung benutzt, ebenso wie ein randomisiertes und stabilisiertes Proteinmolekül, auch Fusionsproteine mit einem stabilisierten und einem randomisierten Teil, wobei solche Proteine für gewisse Anwendungen brauchbar sind. Insbesondere ermöglicht diese Technik, ein stabiles Gerüst zu entwickeln, an das eine variable Region mit spezifischen Bindungseigenschaften angehängt sein kann. Die variable Region kann wie oben besprochen durch Randomisierungstechniken hergestellt werden und aus der Variantenbibliothek kann ein Proteinmolekül mit den gewünschten Bindungseigenschaften ausgewählt werden, beispielsweise durch Phagenpräsentation und Affinitätschromatographie. Dieses randomisierte Protein kann dann als ein Fusionsprotein exprimiert werden, z. B. in E. coli, und zwar zusammen mit einem Proteinmolekül, das bereits zur Verbesserung seiner Stabilität unter alkalischen Bedingungen durch Ersatz eines oder mehrerer seiner Asparaginreste durch andere weniger alkaliempfindliche Reste bearbeitet wurde.
Das Fusionsprotein kann als immobilisierter Ligand bei der Affinitätschromatographie verwendet werden, wobei es sowohl die Vorteile eines vom Gerüstteil her allgemein stabilen Moleküls als auch eine vom randomisierten Teil bereitgestellte vorgewählte Bindungsaffinität gewährt. Ein solches System kann die Verwendung von kleinen Proteinmolekülen während des Randomisierungs- und Selektionsstadiums ermöglichen, weil wichtige proteinartige Eigenschaften (im Gegensatz zu Peptideigenschaften) vom stabilisierten Teil beigestellt werden. Der gleiche stabilisierte Teil kann mit einer Vielzahl von verschiedenen randomisierten Molekülen verwendet werden und umgekehrt. Geeignete Proteinmoleküle, die als stabilisierter Gerüstteil der Fusionsproteine dienen, umfassen Albumin bindendes Protein (ABD); die Bakterienrezeptordomäne Z ist in diesem Zusammenhang ein geeignetes Molekül für die Randomisierung.
Ein solches Protein kodierende Nukleinsäuremoleküle wie auch das Protein exprimierende Zellen bilden weitere Ausführungen der vorliegenden Erfindung.
Ein bevorzugter Affinitätsligand zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren ist Albumin bindendes Protein (ABD), eine Proteindomäne mit Affinität für humanes Serumalbumin (HSA). Es ist von einem in der Zellwand verankerten Bakterienrezeptorprotein aus Streptococcus G148 abgeleitet. Es wird insbesondere als Affinitätsligand zur Reinigung von humanem Serumalbumin (HSA) verwendet. Die Wildtypsequenz dieses Proteins hat vier Asparaginreste. Man beobachtet erhöhte Stabilität, wenn nur einer dieser Reste substituiert wird. Bevorzugt werden aber alle vier Reste durch weniger alkaliempfindliche Reste ersetzt. Die Aminosäuresequenz des ABD-Wildtyps ist:
LAEAKVLANRELDKYGV-SDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP
wobei die Asparaginreste durch Fettdruck bezeichnet sind. Der Bindestrich zeigt lediglich an, dass andere Moleküle derselben Familie an dieser Stelle eine zusätzliche Aminosäure aufweisen. Diese Sequenz schließt den in 3 gezeigten N-terminalen "Schwanz" mit 19 Aminosäuren aus. Im Text werden besondere Aminosäuren des ABD durch ihre Position in der Gesamtsequenz (einschließlich der 19 "Schwanz"aminosäuren) identifiziert, wie in 3 dargestellt. So ist der erste Asparaginrest des ABDwt, der stabilisiert werden kann, in Position 28 (Asn₂₈). Stabilisierte Versionen des ABD zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren können einige, alle oder keine der 19 Aminosäuren des N-terminalen Schwanzes enthalten.
Stabilisiertes ABD kann, wie oben besprochen, weiter der Randomisierung unterworfen werden, um ein Protein (d. h. ein kombinatorisches Protein) mit beispielsweise modifizierter Bindungseigenschaft für HSA zu schaffen, und/oder eines, das an jegliches gewählte Ziel binden und auch Affinität zu HSA beibehalten kann. Die Randomisierung kann Mutagenese derselben oder bevorzugt anderer Reste als die in der Stabilisierung modifizierten einschließen.
So ist eine weitere Ausbildung der vorliegenden Erfindung Albumin bindendes Protein oder ein Fragment oder Derivat davon, worin ein oder mehrere native Asn-Reste entfernt oder durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure ersetzt wurden, wobei dieses Molekül Affinität zu humanem Serumalbumin behält.
In einer anderen Ausbildung stellt die Erfindung Albumin bindendes Protein oder ein Fragment oder Derivat davon wie oben definiert bereit, welches ferner der Randomisierung unterworfen wurde, um ein Protein zu schaffen, das an einen Zielliganden binden kann und Affinität zu humanem Serumalbumin behält.
In noch einer anderen Ausbildung stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, das einen ersten Teil, der ABD oder ein Fragment oder Derivat davon wie oben definiert ist, und einen zweiten Teil, der ein von einem Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon, Staphylokokkenprotein A oder einem Fragment, einer Domäne oder einem Derivat davon oder einem DNA bindenden Protein oder Fragment oder Derivat davon abgeleitet ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist Asn₂₈ durch Leucin, Asn₄₂ durch Asparaginsäure, Asn₄₅ durch Asparaginsäure und Asn₄₆ durch Lysin ersetzt (hier als ABDmut bezeichnet). Mit 'ABDmut' werden Proteine bezeichnet, die einige, alle oder keine der 19 Aminosäuren des N-terminalen Schwanzes enthalten. Typischerweise ist nur ein Teil oder nichts vom N-terminalen Schwanz vorhanden, wenn ABDmut Teil eines Fusionsproteins, z. B. mit Domäne Z, ist. Asparagin ist die alkaliempfindlichste Aminosäure und daher kann jeder andere Aminosäurerest zu seinem Ersatz verwendet werden und eine Zunahme der Stabilität ist zu erwarten. Es könnte helfen, die Sequenzen anderer homologer Proteine zu vergleichen, die in anderen Spezies zu finden sind oder die gleiche Rolle ausfüllen, um geeignete Aminosäuren zur Verwendung bei der Substitution zu identifizieren.
Bei einem zur Stabilisierung anderer Affinitätsliganden geeigneten Verfahren wurden die Modifikationen durch PCR-Mutagenese eingeführt. Zunächst werden fehlerhafte (mismatched) Primer zum Einführen der Mutationen verwendet und dann werden die Fragmente des ersten PCR-Zyklus gemischt und man läßt die Polymerase die Stränge auffüllen. Das die Modifikationen enthaltende doppelsträngige Fragment des ABD wird mit Restriktionsenzymen gespalten und in ein mit denselben Enzymen geschnittenes Plasmid ligasiert, welches dann zur Transformation von E. coli, dem Expressionssystem für das Protein, benutzt wird.
Bevorzugt behält der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte (d. h. erhaltene) Affinitätsligand nach 20 Zyklen einer Behandlung mit 0,5 molarer NaOH mehr als 80%, bevorzugt mehr als 95%, seiner normalen Bindungskapazität.
Die Erfindung wird eingehender in den folgenden, nicht beschränkenden Beispielen beschrieben, worin
1 eine schematische Beschreibung des erfindungsgemäßen PCR-Mutageneseschritts ist;
2 das Klonen des Genkonstrukts zeigt;
3 die Aminosäuresequenz des Wildtyp-ABD und einer mutierten alkalibeständigen Variante davon ist, wobei die volle Sequenz der mutierten Variante hier als SEQ ID NO. 1 bezeichnet wird;
4 ein SDS-PAGE (4–20%) unter reduzierenden Bedingungen zeigt. Die dritte Spur zeigt einen Molekulargewichtsmarker (von oben 94, 67, 43, 40, 20,2 bzw. 14,4 kDa). Um die Selektivität des mutierten ABD zu prüfen, wurde ein Disintegrat von E. coli mit HSA geimpft (Spur 4) und auf die Säule gegeben. Die Spuren 5, 6 und 7 zeigen das eluierte Material nach 2, 8 und 15 Zyklen der Behandlung mit NaOH. Spur 8 zeigt einen HSA-Vergleich;
5 zeigt Sensorgramme vom BIACore, welche die Bindungseigenschaften von (A)ABDwt bzw. (B)ABDmut vor und nach mehreren Behandlungszyklen mit 0,5 molarer NaOH zeigen;
6 ist ein Graph, der die Kapazität von zwei Affinitätsmatrizes, ABDwt bzw. ABDmut, nach mehreren Behandlungszyklen mit 0,5 molarer NaOH zeigt;
7 zeigt Sensorgramme vom in Beispiel 10 beschriebenen Biacore-Versuch und zeigt die Bindungseigenschaften von ABDmut und seinen drei Dreifachmutanten, Responseeinheiten (RU) über Zeit (S); Δ ABDmu;
29-30-33A; ☐ 54-57-58A;
22-25-26A.
Innerhalb der Beispiele werden ABDstab und ABDmut synonym benutzt.
Beispiel 1 – Klonieren
Als Schablone für die PCR-Mutagenese wurde pTrpABDT1T2 (Kraulis et al., (1996) FEBS Lett. 378, 190–194) benutzt. Das Plasmid kodiert das Gen für ABDwt unter Steuerung durch den Tryptophan-Promotor. Die PCR-Mutagenese wurde in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten PCR wurde die Mutation eingeführt und im zweiten PCR-Zyklus wurden die Fragmente aus dem ersten Zyklus ge mischt und man ließ die Polymerase die Stränge auffüllen (1). Die in der ersten PCR benutzten Primer waren:
Das doppelsträngige Fragment wurde mit Xba I und Pst I gespalten und in mit denselben Enzymen geschnittenes pTrpABDT1T2 ligasiert (2). Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation. von E. coli, Stamm RRIΔMI5, verwendet. Nach Bestätigung der Insertgröße durch PCR wurde die Sequenz mit Zyklussequenzierung gesichert (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Das resultierende Plasmid wurde mit pTrpABDmutT1T2 bezeichnet.
Beispiel 2 – Expression und Reinigung
E. coli-Zellen, die das ABDmut und auch den Wildtyp ABD als Vergleich kodierende Plasmid enthielten, wurden über Nacht in Schüttelflaschen mit 500 ml Tryptic Soy Broth (30 g/l), ergänzt durch Hefeextrakt (Difco, USA, 5 g/l), und Kanamycinmonosulfat (50 mg/l) gezüchtet. Da das ABD-Gen vom Tryptophanpromotor gesteuert wird, beginnt die Erzeugung von m-RNA, wenn die Aminosäure im Kulturmedium fehlt. Nach 20 h wurden die Zellen durch Zentrifugieren, 4000 g in 10 min, geerntet. Nach Wiederaufschlämmen der Zellen in 30 ml TST (25 mmol/l Tris-HC1, pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 0,05% Tween 20) wurden sie durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Danach wurde zentrifugiert, etwa 40000 g in 20 min. Der Überstand wurde filtriert (0,49 μm). Das lösliche Protein wurde mit Affinitätschromatographie auf Sepharose mit humanem Serumalbumin (HSA) isoliert, wie von Stahl et al., (1989) J. Immunol. Meth. 124, 43–52, beschrieben. Der Proteingehalt der eluierten Fraktionen wurde anhand der Extinktion bei 280 nm gemessen und die relevanten Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Beide Proteine sind nach einem einzigen Reinigungsschritt hochrein und wandern entsprechend ihren Molmassen.
Beispiel 3 – Bindungseigenschaften vor und nach NaOH-Behandlung
Um die Stabilität von ABDwt und ABDmut zu untersuchen, wurden die Bindungseigenschaften vor und nach Behandlung mit 0,5 molarer NaOH bei Raumtemperatur über 24 h analysiert. Sowohl ABDwt als auch ABDmut wurden in 1 × HBS (10 mmol/l HEPES, pH 7,4, 150 mmol/l NaCl, 3,4 mmol/l EDTA, 0,005 P20) zu einer Konzentration von 800 nmol/l gelöst und auf dem BIAcore 2000 (Biacore AB, Uppsala, Schweden) analysiert. Um die Aktivitätsänderung nach Einwirken einer hochalkalischen Umgebung zu bestimmen, wurden die Proteine in 0,5 molarer NaOH gelöst. Nach 24 h Inkubieren in NaOH wurden die Proben durch eine NAP-10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) geleitet, die mit 30 mmol/l NH₄Ac äquilibriert war. Die proteinhaltigen Proben wurden gefriergetrocknet und für die Analyse im BIAcore 2000 in 1 × HBS zu einer Konzentration von 800 nmol/l wieder gelöst.
BIAcore-Analyse
Zur Echtzeit-Affinitätsanalyse wurde ein Gerät BIAcore 2000 (Biacore AB) verwendet. HSA und IgG wurden auf zwei verschiedenen Oberflächen eines CM5-Sensorchips durch Aminkupplung an die carboxylierte Dextranschicht immobilisiert. Diese Kupplung erfolgte nach Empfehlungen des Herstellers (Biacore AB). Die IgG-Oberfläche diente als Vergleich. Die Proben wurden durch ein 0,45 μm-Filter gegeben und in zufälliger Reihenfolge mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 μl/min über die Oberfläche injiziert. Die Ergebnisse zeigen klar, dass ABDwt während der Einwirkung der alkalischen Lösung seine Affinität für HSA verliert, während die mutierte Variante, der vier Asparaginreste fehlen, die Affinität bewahrt. Die Sensorgramme sind in 5 gezeigt.
Für die noch aktiv gebliebenen Proteine wurde auch eine Analyse der kinetischen Parameter ausgeführt. Dies erfolgte durch Analyse des Bindungsverhaltens bei verschiedenen Konzentrationen und nachfolgende Berechnung der Bindungskonstanten unter Anwendung der BIAevaluation 2.1-Software (BIAcore AB). Die angewendeten Konzentrationen waren 40–220 nmol/l für ABDwt, 200–600 nmol/l für ABDmut und 800–1250 nmol/l für das mit NaOH behandelte ABDmut. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
K_on stellt die Geschwindigkeit dar, mit der sich das Protein assoziiert, K_off die Dissoziationsgeschwindigkeit und K_aff ist die Affinitätskonstante, berechnet als Verhältnis zwischen K_on und K_off.
Beispiel 4 – Herstellung von Affinitätsmatrizes
Um die Brauchbarkeit des stabilisierten HSA bindenden Proteins in der Biotechnologie zu beurteilen, wurden zwei Affinitätsmatrizes hergestellt, eine mit dem unmutierten Protein (ABDwt) als Vergleich und die andere mit dem mutierten ABD (ABDmut). Als Matrix wurde Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) mit Carbodiimid CMC (Sigma Aldrich, Schweden) als Kupplungsreagenz verwendet. ABDwt (4,5 mg) und ABDmut (8,5 mg) wurden getrennt in 9 ml Wasser gelöst. Zu den Lösungen von ABDwt und ABDmut wurden 3,5 bzw. 5,0 ml Gel zugefügt. Schließlich wurden den Lösungen 0,38 g CMC zugefügt und sie wurden bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Gele wurden in HR-Säulen (d = 5 mm, h = 43 mm) und mit 0,5 mol/l Ethanolamin, 0,5 mol/l NaCl, pH 8,3, zur Inaktivierung der Matrix und mit 0,1 mol/l NaAc, 0,5 mol/l NaCl, pH 4, zum Auswaschen ungebundenen Proteins beaufschlagt. Danach waren die Säulen gebrauchsfertig zur Affinitätsreinigung von HSA.
Beispiel 5 – Erhaltene Selektivität
Um zu untersuchen, ob die Selektivität des mutierten Proteins für HSA nach Ersatz von vier Aminosäuren erhalten bleibt, wurde ein Einfangversuch durchgeführt. Ein über Nacht gezüchtete Kultur von E. coli-Zellen wurde mit Ultraschall aufgebrochen, bei 40000 g zentrifugiert und durch ein 0,45 μm-Filter filtriert. Die lösliche Fraktion des E. coli-Lysats wurde mit reinem HSA gemischt, und die Mischung wurde auf die ABDmut-Affinitätssäule aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde das gebundene Material durch pH-Erniedrigung auf 2,8 eluiert, wie von Stahl et al., (1998), a.a.O., beschrieben. Wie man in 4 sieht, bleibt die Selektivität in der mutierten Variante des ABD erhalten.
Beispiel 6 – Alkalibeständige Affinitätssäulen
Um den Unterschied zwischen der ABDwt- und ABDmut-Säule hinsichtlich der Stabilität gegen Alkalibehandlung zu untersuchen, wurden beide Säulen wiederholt mit 0,5 molarer NaOH gewaschen. Die Säulen wurden unter Anwendung des AKTA Explorers mit HSA beladen, das Protein wurde durch pH-Erniedrigung eluiert (Ståhl et al., (1998), a. a. O.) und schließlich wurden beide Säulen mit NaOH gewaschen. Dieser Zyklus wurde 15 mal wiederholt und die Gesamteinwirkungszeit überschritt 6 h. Die angewendete Fließgeschwindigkeit war 60 cm/h und das eluierte Material wurde bei jedem Zyklus gesammelt und analysiert. In 6 ist die Kapazitätsabnahme über der NaOH-Einwirkungszeit aufgetragen. Wie man in der Figur sieht, verliert ABDwt seine Aktivität sehr schnell, während die mutierte Variante die Aktivität während des Versuchs behält. Diese Ergebnisse bestätigen die BIAcore-Daten; die mutierte Variante ist viel stabiler gegenüber der cleaning-in-place-Behandlung (CIP) als das Molekül des Wildtyps.
Beispiel 7 – Herstellung und Reinigung von Z-ABDstab
Eine gefrorene Kultur von E. coli RRIΔMl5, welche den Expressionsvektor pTrpZABDstabT1T2 (siehe Beispiel 8) enthielt, wurde zum Impfen von 20 ml Tryptic Soy Broth (30 g/l) (Difco, Dtroit, MI, USA), ergänzt durch 5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 50 mg/l Kanamycinmonosulfat (Labkemi, Stockholm, Schweden) verwendet. 10 ml der Übernacht-Kultur wurden zum Impfen von 500 ml frischem Medium verwendet. Man ließ die Zellen bei 37°C wachsen und in der mid-log-Phase (A_600nm = 1) wurde durch Zusatz von 3-β-Indolacrylsäure (SIGMA-Aldrich, Stockholm, Schweden) zu einer Endkonzentration von 25 mg/l die Expression eingeleitet. Nach 24 h wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei etwa 5000 g über 10 min und nachfolgendes Resuspendieren in TST-Puffer (25 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5, 150 mmol/l NaCl, 1,25 mmol/l EDTA, 0,05% Tween 20) geerntet. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung (Vibracell, Sonics & Materials, Danbury, CT, USA) zerlegt und bei 30000 g 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde durch 0,45 μm-Filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) filtriert und der HSA-Affinitätschromatographie (Nygren et al., 1988) unterworfen. Die Menge des eluierten Proteins wurde durch Extinktionsmessung unter Anwendung der spezifischen Absorptionskonstante a (L/g·cm) geschätzt, und relevante Fraktionen wurden gefriergetrocknet.
Beispiel 8 – Genetischer Aufbau des Fusionsproteins Z-ABDstab
Aus pTrpABDmutT1T2 wurde das Plasmid pTrpZABDstabT1T2 aufgebaut. Ein die Z-Domäne kodierendes Genfragment von 233 Basenpaaren wurde aus pRIT45 (Nilsson et al., (1994) Eur. J. Biochem. 224, 1038–108) durch Digestion mit XbaI-EcoRI isoliert und in pTrpABDmutT1T2, das zuvor mit denselben Restriktionsendonukleasen geschnitten worden war, ligasiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von E. coli, Stamm RRIΔMl5, verwendet. Das resultierende Plasmid enthielt ein Gen, welches das Fusionsprotein Z-ABDstab kodiert und wurde mit pTrpZABDstabT1T2 bezeichnet.
Die DNA-Sequenzen von ABDstab und Z-ABDstab (einschließlich des Bereichs, der den N-terminalen Schwanz mit 19 Aminosäuren kodiert) sind folgende:
ABDstab (SEQ ID NO. 11)
Z-ABDstab (SEQ ID NO. 12)
Beispiel 9 – Genetischer Aufbau der drei Dreifachmutanten der ABDmut-Domäne
Beispiele 9 und 10 zeigen, dass es möglich ist, eine Oberfläche eines bereits stabilisierten ABD-Moleküls zu randomisieren, beispielsweise eine Oberfläche, die nicht an der HSA-Bindung teilnimmt, und so ein Molekül zu schaffen, das jedes gewählte Ziel binden kann und auch Affinität zu HSA behält.
Auf der Basis der Ergebnisse eines Scanversuchs mit Alanin zur Kartierung der Bindungsstelle für HSA wurden Genkonstrukte hergestellt, die Domänen von ABDmut (siehe Beispiel 1) mit weiteren Alaninsubstitutionen kodieren. Diese wurden an Positionen in der Domäne eingeführt, die vom identifizierten HSA bindenden Motiv wegweisen, das auf der ersten und zweiten Helix und in der Schleife dazwischen lokalisiert wurde. Durch PCR-basierte Mutagenese wurden drei verschiedene Plasmidgenkonstrukte zusammengestellt, von denen jedes Varianten des ABDmut-Proteins mit drei Alaninsubstitutionen kodiert: pTrpABDmut22-25-26 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen 22, 25 und 26 der ABDmut-Domäne, pTrpABDmut29-30-33 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen 29, 30 und 33 der ABDmut-Domäne und pTrpABDmut54-57-58 mit Alaninsubstitutionen an den Positionen 54, 57 und 58 der ABDmut-Domäne. Als Schablone für die PCR-Mutagenese wurde das Plasmid pTrpABDmutT1T2 benutzt (siehe Beispiel 1). Das Plasmid kodiert das Gen für ABDmut unter Steuerung der Transkription durch den Tryptophanpromotor. Der Ersatz der Aminosäuren 22, 25 und 26 durch Alanin wurde durch gewöhnliche PCR-Mutagenese mit den Primern T1T2 (siehe Beispiel 1) und LIMA 12:
5'-GTAGACGCGA ATTCATTAGC TGCTGCTAAA GCAGCTGCTC TG-3' (LIMA12) (SEQ ID NO.6) ausgeführt.
Die PCR-Mutagenese für die anderen beiden Konstrukte wurde in zwei Schritten durchgeführt. In der ersten PCR-Amplifikation wurden die Mutationen eingeführt und in der zweiten PCR wurden die Fragmente der ersten PCR-Amplifikation gemischt und einer von Taq-DNA-Polymerase unterstützten Doppelstrang-DNA-Synthese unterworfen (dieselbe Strategie wie in Beispiel 1), gefolgt von einer Amplifikation unter Verwendung von flankierenden Primern (SOHO8 und T1T2 (siehe Beispiel 1)). Die in der PCR zum Ersatz der Aminosäuren 29, 30 und 33 verwendeten Primer waren: 5'-actccatatg cgtcgagcgc tqccagagct-3' (LIMA13)(SEQ ID NO. 7), 5'-agcgctcgac gcatatggag taagtgact-3' (LIMA14)(SEQ ID NO. 8). Für den Ersatz der Aminosäuren 54, 57 und 58 wurden LIMA15 und LIMA16 verwendet:
5'-gtqtagcagc actqgcagct gaaatttta-3' (LIMA15)(SEQ ID NO. 9) 5'-aaaatttcag ctgccagtgc tgctacacct tcaac-3' (LIMA16)(SEQ ID NO. 10).
Zum Aufbau des Plasmids pTrpABDmut22-25-26 wurde das doppelsträngige PCR-Produkt mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI gespalten und für die anderen beiden Mutanten wurde XbaI und PstI benutzt. Die verschiedenen Fragmente wurden in pTrpABDT1T2 ligasiert, das mit denselben Enzymen geschnitten worden war, was zu einem Ersatz des Gens für die Wildtyp-ABD-Domäne für die drei verschiedenen ABDmut-Dreifachmutanten führte. Die entsprechenden Mischungen wurden zur Transformation von E. coli, Stamm RRIΔM15, verwendet. Nach Bestätigung der Insertgröße wurden die Sequenz durch Zyklussequenzierung geprüft (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Die resultierenden Plasmide wurden mit pTrpABDmut22-25-26, pTrpABDmut29-30-33 bzw. pTrpABDmut54-57-58 bezeichnet.
Die DNA-Sequenzen der drei Dreifachmutanten sind wie folgt:
ABDmut22-25-26 (SEQ ID NO. 13)
ABDmut29-30-33 (SEQ ID NO. 14)
ABDmut54-57-58 (SEQ ID NO. 15)
Beispiel 10 – HSA-Bindungsanalyse der Proteine ABDmut22-25-26, ABDmut29-30-33 und ABDmut54-57-58
ABDmut22-25-26, ABDmut29-30-33 und ABDmut54-57-58 wurden hergestellt und gereinigt wie in Beispiel 2 beschrieben. Um das Bindungsverhalten der verschiedenen Dreifachmutanten zu analysieren, wurde ein Gerät BIAcore 2000 verwendet. Auf der Sensorchipoberfläche eines CM5-Sensorchips wurde HSA durch Aminkupplung an die carboxylierte Dextranschicht immobilisiert. Als Vergleich wurde eine Sensorchipoberfläche mit IgG benutzt. Die Kupplung erfolgte nach Empfehlungen des Herstellers (Biacore AB). Proben der drei Proteine wurden durch ein 0,45 μm-Filter gegeben und in Zufallsreihenfolge mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl/min über die Oberfläche injiziert. Die angewendete Konzentration war 200 nmol/l und alle Proben wurden dreimal untersucht. Die resultierenden Sensorgramme zeigen, dass alle drei Dreifachmutanten ihre Bindungsfähigkeit für HSA behalten (7). Diese Ergebnisse zeigen, dass die in dieser Studie untersuchten neun Positionen (22, 25, 26, 29, 30, 33, 54, 57, 58) entweder gleichzeitig oder in verschiedenen Kombinationen entweder einer gerichteten oder einer zufälligen Mutation unterworfen werden können, um neue HSA bindende ABDwt- oder ABDmut-Domänen mit einer zweiten Aktivität, wie Bindung, Katalyse oder Verwendung als Substrat, zu identifizieren. Außerdem kann auch der Rest 62 für Substitutionen verwendet werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Affinitätstrennung, wobei der Affinitätsligand ein immobilisierter proteinartiger Ligand ist, umfassend als ersten Schritt die Modifizierung einer oder mehrerer Asparaginreste (Asn) im Affinitätsliganden, um die Stabilität des Proteins unter alkalischen Bedingungen zu steigern.
Verfahren nach Anspruch 1, darüber hinaus umfassend die Schritte: a) Randomisierung des Affinitätsliganden, um seine Bindungseigenschaften zu verändern, und b) Selektieren des randomisierten Affinitätsliganden durch Expression in einer Oberflächendisplaybibliothek (surface display library).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der/die Asn-Rest(e) mittels Ersetzen durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure modifiziert wird/werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zwei oder mehr Asn-Reste modifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei alle Asn-Reste im Liganden oder Protein modifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der/die Asn-Rest(e) durch eine aus Lysin, Asparaginsäure und Leucin ausgewählte Aminosäure ersetzt wird/werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein oder mehrere Asn-Rest(e) auf der Oberfläche der dreidimensionalen Struktur des Liganden oder Proteins modifiziert wird/werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Affinitätsligand ein kombinatorisches Protein ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Protein oder der Ligand ein von einem Immunoglobulinmolekül oder einem Fragment oder Derivat davon, Staphylokokkenprotein A oder einem Fragment, Derivat oder einer Domäne davon oder einem DNA-bindenden Protein oder einem Fragment oder einer Domäne davon oder albuminbindendem Protein abgeleitetes kombinatorisches Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das kombinatorische Protein Domäne Z oder ein Derivat davon umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Affinitätsligand oder das Protein albuminbindendes Protein oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst.
Albuminbindendes Protein oder ein Fragment oder Derivat davon, wobei eine oder mehrere native Asn-Reste entfernt oder durch eine weniger alkaliempfindliche Aminosäure ersetzt wurden und das Molekül seine Affinität zu menschlichem Serumalbumin beibehält.
Albuminbindendes Protein oder ein Fragment oder Derivat davon nach Anspruch 12, welches darüber hinaus einer Randomisierung unterworfen wurde, um ein Protein zu schaffen, das an einen Zielliganden binden kann und seine Affinität zu menschlichem Serumalbumin beibehält.
Fusionsprotein mit einem ersten Teil, der ABD oder ein Fragment oder Derivat davon, wie in einem der Ansprüche 12 oder 13 definiert, ist und einem zweiten Teil, der ein randomisiertes kombinatorisches Molekül, abgeleitet von einem Immunglobulinmolekül oder einem Fragment oder Derivat davon, Staphylokokkenprotein A oder einem Fragment oder Derivat oder einer Domäne davon, oder einem DNA-bindenden Protein oder einem Fragment oder Derivat davon, ist.
Protein nach Anspruch 14, wobei der zweite Teil Domäne Z oder ein Derivat davon enthält.
Nukleinsäuremolekül, das ein Protein kodiert, wie es in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert ist.
Wirtszelle, die ein Protein exprimiert, wie es in einem der Ansprüche 12 bis 15 definiert ist.