DE10214653A1

DE10214653A1 - Ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen

Info

Publication number: DE10214653A1
Application number: DE10214653A
Authority: DE
Inventors: Hak Sung Kim; Geun Joong Kim; Young Hoon Cheon; Dong Eun Lee
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2002-04-03
Publication date: 2003-03-27
Also published as: KR20030022447A; JP2003102484A; US20030049686A1; KR100428998B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein sowie Mikroorganismen, die mit Plasmiden transformiert sind, enthaltend rekombinante DNAs, die durch Insertion eines genomischen DNA-Fragmentes in ein defektes Template hergestellt wurden; ein Verfahren zur Herstellung für Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, umfassend die Schritte der Kultivierung der transformierten Mikroorganismen und Erhalten der gewünschten Proteine aus der Kultur sowie Proteine, die durch diesen Prozess hergestellt wurden. Gemäß der Erfindung kann eine Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein in effizienter und einfacher Weise hergestellt werden, durch Konstruktion einer Bank von Mikroorganismen, die mit rekombinanten Plasmiden, enthaltend Fragmente genomischer E.coli-DNA, die in defekte Gene inseriert wurden, hergestellt werden, und Selektion auf Klone, die Proteine mit wiederhergestellter Aktivität oder modifizierten Eigenschaften exprimeren.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, Mikroorganismen, die mit Plasmiden transformiert sind, enthaltend rekombinante DNA, die durch Insertion eines Fragmentes genomischer DNA in ein defektes Template hergestellt wurden, ein Verfahren zur Herstellung für Proteine mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen aus einem Ausgangsprotein umfassend die Schritte der Kultivierung der transformierten Mikroorganismen und Erhalten der gewünschten Proteine aus der Kultur, und Proteine hergestellt durch dieses Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Proteine werden weithin auf pharmazeutischem, therapeutischem und industriellem Gebiet verwendet und Untersuchungen bezüglich der Modifikation ihrer Funktionen und Eigenschaften werden im Stand der Technik kontinuierlich durchgeführt. Die herkömmlichste Methode zur Herstellung einer mutanten Gen- Bank erfolgt durch künstliche Modifikation eines Gens, das für ein Protein kodiert und die Erzeugung für Proteine mit geänderten Funktionen, die aus diesem Gen hergestellt werden. Daher ist die Herstellung für Proteine mit veränderten Funktionen oder Eigenschaften hauptsächlich abhängig von der Herstellung einer Gen- Bank mutierter Proteine.
Als Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine wurde hauptsächlich das randomisierte Einfügen von Mutationen in die kodierende Region für ein Protein, sowie die Substitution, Deletion oder das Hinzufügen einer spezifischen Aminosäure in ein Ausgangsprotein auf Basis der Proteinstruktur hauptsächlich im Stand der Technik angewendet. Eine zu Fehlern neigende PCR wurde als effizienteres Verfahren angewendet. Kürzlich wurde das DNA Shuffling- Verfahren von Maxygen Co. (USA) entwickelt, welches die Besonderheit aufweist, ein Verfahren zur Herstellung einer mutanten Gen-Bank mit Zufallsmutanten für Proteine zu sein und es gab viele Berichte hinsichtlich der Anwendung dieses Verfahrens. Es hat sich jedoch gezeigt, dass dieses Verfahren wenig zufriedenstellend in der Hinsicht ist, als es basierend auf der Sequenz-Homologie, mittels einer Punktmutation oder einer Rekombination Gen-Banken für mutierte Proteine erzeugt, ohne eine Änderung der Größe der Gene zu erzielen, die für die Ausgangsproteine kodieren, was natürlicherweise die Herstellung von verschiedenartigeren Proteinen begrenzt.
Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass verschiedenartige Proteine, die während eines natürlichen Evolutionsprozesses entstanden sind, nicht nur durch die Änderung in der Nukleotidsequenz, sondern auch durch einen komplexen Prozeß, wie Substitution, Deletion oder Addition eines Genfragmentes unterschiedlicher Größe oder Nukleotidsequenz entstanden sind. Basierend auf dieser Erkenntnis wurde ein Verfahren entwickelt zur Herstellung von Proteinen mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen aus ihren Ausgangsproteinen durch Zugabe von Oligonukleotiden mit randomisierten Größen und Sequenzen in einen Genbereich, der dem Carboxyterminus eines Proteins entspricht. Zusätzlich wurde im Stand der Technik von anderen Verfahren berichtet, bei denen der Austausch von Subdomänen, das Zusammenfügen von Domänen oder Modulen und Rekombination unabhängig von der Sequenz-Homologie erfolgt. Diese früheren Verfahren tragen jedoch nicht zur Diversifikation einer Gen- Mutanten-Bank bei.
Unter diesen Umständen gibt es gewichtige Gründe zur Erforschung und Entwicklung eines effizienten und einfachen Verfahrens zur Herstellung einer diversifizierten Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein mit unterschiedlichen Funktionen und Eigenschaften.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine angestrengt mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein. Sie haben eine Bank von Mikroorganismen hergestellt, die mit einem Plasmid transformiert sind, enthaltend eine rekombinante DNA, hergestellt durch Insertion eines Fragmentes genomischer DNA in ein defektes Template, und haben gefunden, dass daraus eine Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein hergestellt werden kann.
Eine erste Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der mit einem Plasmid transformiert ist, enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch Insertion eines Fragmentes genomischer DNA in ein defektes Template hergestellt wurde.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, Proteine bereitzustellen, ausgewählt aus den Proteinen, die von den Mikroorganismen exprimiert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die obige und die anderen Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Beschreibungen ersichtlich, die in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen gegeben werden, wobei:
Fig. 1 ein schematisches Diagram ist, das ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 2 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Agarosegel- Elektrophorese von Genen von Klonen, die randomisiert aus der Mikroorganismen-Bank ausgewählt wurden, die mit dem defekten Template GFP▿176(+2) hergestellt wurde.
Die Fig. 3a und 3b stellen Aminosäuresequenzen dar, die von Fragmenten genomischer E. coli DNA hergeleitet wurden, die in die defekten Templates GFP▿176(+2) und GFP▿172-3/176(+2) eingefügt wurden, sowie die Größen der offenen Leseraster (ORF) von GFP▿176(+2) und GFP▿172-3/176(+2).

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung wendet ein defektes Template an, das durch künstliche Modifikation erhalten wurde. Die künstliche Modifikation erfolgte in einem spezifischen Bereich, dessen Mutation für die normale Funktion des Proteins kritisch ist, wobei die Funktion des Proteins zerstört wird. Die Auswahl dieses Bereiches erfolgte auf Basis der Proteinstruktur und der Sequenz-Homologie zu verwandten Proteinen. Das defekte Template, das durch eine Mutation in einem kritischen Bereich des für ein Protein kodierenden Gens hergestellt wurde, erleichtert die Selektion auf Proteine mit veränderten Eigenschaften oder mit wiederhergestellter Funktion, die von einer konstruierten Mikroorganismen-Bank exprimiert werden. Und es erleichtert die Kontrolle einer die Funktion wiederherstellenden Modifikation nur an der gewünschten Stelle. Diese Nützlichkeit des defekten Templates ergibt sich aus den folgenden Tatsachen: eine Modifikation muss erfolgen, um ein Protein mit einer neuen Sequenz und Größe zu generieren, bevor die zerstörte Funktion wiederhergestellt wird; diese Modifikation wird induziert durch Insertion eines randomisierten Oligonucleotides oder eines Fragmentes genomischer DNA, das durch die Behandlung mit Restriktionsenzymen hergestellt wurde; weiterhin kann die Stelle der Insertion künstlich ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Einzelnen wie folgt erläutert:
Das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein umfasst die Schritte: Künstliche Modifikation eines Gens, das für ein Ausgangsprotein kodiert, um ein defektes Template zu ergeben; Konstruktion einer Bank von Mikroorganismen, die mit Plasmiden transformiert sind, enthaltend rekombinante DNAs, die durch Insertion eines randomisierten Oligonucleotides oder eines mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmentes genomischer DNA in das defekte Template hergestellt wurden; und Selektion auf Proteine mit wiederhergestellter Funktion oder veränderten Eigenschaften von Proteinen, die von der Bank von Mikroorganismen, die mit den Plasmiden transformiert sind, exprimiert werden.
Zur Durchführung dieses Verfahrens schließt die künstliche Mutation ein: Deletion von Nucleotiden, die für mehrere Aminosäuren oder für eine Domäne kodieren an einer spezifischen Stelle eines Gens, das für ein Ausgangsprotein kodiert; Leserasterverschiebung und Kombination davon. Die Oligonucleotide, die in die spezifische Stelle des defekten Templates inseriert werden, werden nicht durch Zugabe von dATP, dGTP, dTTP und dCTP in einer geordneten Reihenfolge, sondern durch Zugabe von allen 4 oder weniger als 4 Nucleotiden in einer Mischung synthetisiert. Fragmente genomischer DNA werden durch Behandlung genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym (z. B. Sau3Al) hergestellt, die eine Vielzahl von Restriktionsenzym-Schnittstellen in der genomischen DNA besitzen und DNase I, gefolgt von einer Agarosegel-Elektrophorese und Extraktion einer bestimmten Größe von Fragmenten (z. B. 25-500 bp). Rekombinante DNAs werden durch Insertion eines randomisierten Oligonucleotids oder eines genomischen DNA-Fragmentes in eine spezifische Stelle eines defekten Templates hergestellt, was die folgenden beiden Verfahren einschließt: ein Verfahren ist die PCR- gekoppelte Rekombination unter Ausnutzung der Nukleodid-Sequenzhomologie; und das andere Verfahren ist die Sequenz-gerichtete Rekombination durch Ligase-gestützte direkte Ligation, die unabhängig von der Homologie der Nukleotid- Sequenz ist. Die PCR-gekoppelte Rekombination imitiert ein natürliches Rekombinations-Verfahren, das zwischen homologen Sequenzen in vivo erfolgt, wobei die PCR mit einer Mischung von DNA-Fragmenten, die in das defekte Template inseriert werden sollen, durchgeführt wird, wobei die DNA-Fragmente in die defekten Gene aufgrund ihrer Sequenzhomologie eingefügt werden. Bei der Sequenzgerichteten Rekombination werden, ungeachtet der Sequenzhomologie, DNA- Fragmente in eine spezifische Stelle des defekten Templates inseriert, nämlich durch Spalten einer bestimmten Stelle eines defekten Templates mit einem Restriktions-Enzym und Ligation eines zu inserierenden DNA-Fragmentes, mit der geschnittenen Stelle des defekten Templates unter Verwendung einer Ligase. Dieses Rekombinationsverfahren, das eine direkte Ligation anwendet, wird unabhängig von der Sequenzhomologie durchgeführt, was die Mannigfaltigkeit der Mutation gewährleistet.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, welches das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein zeigt.
Die Erfinder haben verschiedene defekte Gene hergestellt. GFP▿176(+1), GFP▿176(+2), GFP▿172-3/176(+1), GFP▿172-3/176(+2), und GFP▿129-138/176(+2) durch Deletion von Nukleodidsequenzen, die mehrere Aminosäuren des Gens GFPuv kodieren, welches ein modifiziertes GFP aus der Qualle darstellt, und haben weiterhin ein anderes defektes Gen DHO▿68-70(+1) durch die Deletion von mehreren Dutzend von Nukleotiden eines Gens, das für die Dihydroorotase kodiert, hergestellt. Danach wurden rekombinante DNAs durch Insertion von Fragmenten genomischer E.coli-DNA in die BamHI-Schnittstelle eines defekten Gens durch PCR-gekoppelte Rekombination oder sequenzgerichtete Rekombination unter Verwendung einer Ligase hergestellt und eine Bank von Mikroorganismen erzeugt, die mit Plasmiden, enthaltend die rekombinanten DNAs, transformiert sind. Danach wurde auf Proteine mit wiederhergestellter Funktion des fluoreszierenden Proteins oder mit Dihydroorotase-Aktivität der durch die Mikroorganismen exprimierten Proteine selektiert. Die Aminosäure-Sequenzen, die von den Fragmenten genomischer E.coü-DNA, hergeleitet wurden, die in GFP▿I76(+2) inseriert wurden, sind die SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7; und die Aminosäure-Sequenzen, die von den Fragmenten genomischer E.coli-DNA hergeleitet wurden, die in GFP▿172-3/176(+2) inseriert wurden, werden von den SEQ ID NOs. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 und 17 dargestellt. Die Erfinder selektierten den Klon Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpS22, der mit einem Plasmid enthaltend eine rekombinante DNA transformiert ist, die durch Insertion eines Fragmentes genomischer E.coli-DNA hergestellt wurde, die für eine Aminosäure- Sequenz kodiert, die durch die Sequenz ID No. 4 dargestellt ist, in die BamHI- Erkennungs-Sequenz eines defekten Gens GFP▿176(+2). Weiterhin wurde der Stamm Escherichia cchl JM109/pMAL-c2/gfpl5 isoliert, der mit einem Plasmid transformiert ist, enthaltend eine rekombinante DNA, die durch Insertion eines Fragmentes genomischer E.coli-DNA, kodierend für eine Aminosäure-Sequenz, dargestellt als SEQ. ID No. 8, in die BamHI-Erkennungs-Sequenz eines defekten Gens GFP▿172-31176(+2) hergestellt wurde. Beide Mikroorganismen sind bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC, #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333, Republik Korea), einer internationalen Hinterlegungsstelle, mit den Nummern KCTC 10059BP und KCTC 10058BP am 30. August 2001 hinterlegt worden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen dargestellt, die den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.

Beispiel 1

Herstellung fluoreszierender Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen durch PCR-gekoppelte Rekombinationen

Fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen wurden durch die Expression von rekombinanten DNAs hergestellt, die durch Insertion von mit Restriktions-Enzymen behandelten Fragmenten genomischer DNAs in eine spezifische Stelle eines defekten Gens hergestellt wurden, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, unter Anwendung der PCR-gekoppelten Rekombination. Zuallererst wurden zwei defekte Gene aus einem Gen, das für ein Ausgangsprotein GFPuv (Contech, Kanada), einem modifizierten Jellyfish (Qualle) GFP, wie folgt hergestellt: ein Gen wurde durch Deletion der Nukleotide hergestellt, die für die 176. Aminosäure in der 2. β-Faltblattstruktur des GFPuv kodieren und auch ein zusätzliches Nukleotid eingefügt, wobei das erzeugte Konstrukt als "GFP▿176(+1)" bezeichnet wurde. Das andere Gen wurde durch Deletion der Nukleotide konstruiert, die für die 176. Aminosäure des GFPuv sowie auch zweier weiterer Nukleotide kodieren, und das Konstrukt wurde als "GFP▿176(+2)" bezeichnet. Zusätzlich wurden Deletionen der Nukleotide, die für die 172. und 173. Aminosäure des GFPuv in den beiden defekten Genen (d. h. GFP▿176(+1) und GFPVI 76(+2) kodieren, erzeugt und die Konstrukte als "GFP▿172-3/176(+1)" beziehungsweise "GFP▿172-3/172(+2)" bezeichnet. Die Proteine, die von diesen defekten Genen exprimiert werden, zeigten keine Fluoreszenz.
Die Konstruktion und Amplifikation der obigen defekten Gene werden wie folgt dargestellt: Die N-terminal eines zu deletierenden Bereiches gelegene Sequenz in einem Gen kodierend für ein Ausgangsprotein wurde unter Verwendung eines Templates eines Gens, welches für das Ausgangsprotein kodiert, und einem Primerpaar amplifiziert. Das heißt, es wurden verwendet: ein Primer, der die Nukleotidsequenz der N-terminalen Region des Ausgangsproteins und eine EcoRI-Erkennungssequenz enthält und ein Primer mit einer Nukleotidesequenz, die komplementär zu der Region ist, die stromaufwärts von der zu deletierenden Region liegt, mit einer BamHI-Erkennungssequenz. In gleicher Weise wird der C- terminale stromabwärts von der zu deletierenden Region gelegene Bereich in einem Gen kodierend für ein Ausgangsprotein unter Verwendung eines Templates des Gens kodierend für ein Ausgangsprotein und einem Primerpaar amplifiziert. Das heißt: es wurden verwendet: ein Primer mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu der C-terminalen Region des Ausgangsproteins mit einer HindIII- Erkennungssequenz und einem Primer mit einer Nukletidsequenz, die dem stromabwärts gelegenen Bereich des zu deletierenden Bereiches entspricht mit einer BamHI-Erkennungssequenz. Danach wurde die amplifizierte DNA des stromaufwärts gelegenen N-terminalen Bereiches und ein Plasmid plrc-99A mit EcoRI und BamHI gespalten und durch Ligation mit einer Ligase verbunden. Die amplifizierte DNA für den stromabwärts gelegenen C-terminalen Teil und das verbundene Plasmid wurden einec Doppelspaltung mit BamHI und HindIII unterworfen, gefolgt von einer Ligation, um ein rekombinantes Plasmid enthaltend das defekte Gen zu erhalten. Das rekombinante Plasmid wurde danach für die Amplifikation des defekten Gens verwendet.
Das amplifizierte Gen wurde mit DNase I verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, um DNA-Fragmente mit der Größe von 50-150 bp zu extrahieren. Die zu inserierenden DNA-Fragmente wurden durch Spaltung genomischer E.coli-DNA mit Sau3AI und DNase I gefolgt von einer Extraktion von 25-500 bp DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel hergestellt. Diese randomisiert gespaltenen DNA-Fragmente des defekten Gens und der DNA-Fragmente genomischer E.coli-DNA wurden gemischt und es wurde eine PCR durchgeführt, um diese Fragmente zu rekombinieren und zu amplifizieren. Die PCR wurde mit 40 sich wiederholenden Zyklen mit jeweils 1 Minute Inkubation bei 94°C, 1 Minute Inkubation bei 45°C und 40 Sekunden Inkubation bei 72°C durchgeführt. Die amplifizierten rekombinanten Produkte wurden in ein Plasmid pTrc-99A kloniert und danach zur Transformation von E.coli JM109 verwendet, um eine Bank transformierter Mikroorganismen herzustellen. Fig. 2 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse der Agarosegel-Elektrophorese zeigt, hinsichtlich der aus der Bank der Mikroorganismen zufallsmäßig ausgewählten Gene, die unter Verwendung des defekten Templates GFP▿176(+2) hergestellt wurde. Wie in der Fig. 2 gezeigt, wurde gefunden, dass eine so hergestellte Bank von Mikroorganismen Gene mit unterschiedlichen Größen enthält, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren. Die hergestellten Mikroorganismen wurden mit einer UV-Lampe beleuchtet, um die Klone auszuwählen, die eine Fluoreszenz aufgrund der Wiederherstellung der Funktion des fluoreszierenden Protein aufweisen. Die Nukleotidsequenzen der Gene, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren, wurden entsprechend der ausgewählten Klone bestimmt und ihre Aminosäuresequenzen von diesen Nukleotidsequenzen hergeleitet. Die Fig. 3a stellt die Aminosäureasequenzen dar, die von den Fragmenten genomischer E.coli-DNA hergeleitet wurden, die in das defekte Gen GFP▿176(+2) inseriert wurden, sowie die Größen der ORF (offenen Leseraster) der betreffenden rekombinanten DNAs. Die hergeleiteten Aminosäuresequenzen werden durch die SEQ ID NOs 1 bis 7 dargestellt. Wie in Fig. 3a gezeigt, variieren die hergeleiteten Aminosäuresequenzen in der Größe und in der Sequenz, was zeigt, dass fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen durch das Verfahren hergestellt werden können. Jedes Gen aus den ausgewählten Klonen, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren, wurden an ein Gen fusioniert, welches für das Maltose-bindende Protein kodiert und die neuen rekombinanten Gene wurden in E.coli exprimiert. Die exprimierten Proteine wurden aufgereinigt, isoliert und dann mit einem Fluoreszenzdetektor untersucht, wobei gefunden wurde, dass die exprimierten Proteine 2-16% der Fluoreszenz des elterlichen fluoreszierenden Proteins aufweisen.
Einer der in der mit dem defekten Gen GFP▿176(+2) hergestellten Bank aus Mikroorganismen enthaltenen Klone Escherichia coli JM109/pMALc2/gfpS22, der mit einem Plasmid enthaltend ein rekombinantes Gen transformiert ist, welches durch die Insertion eines Fragmentes genomischer E.coli-DNA kodierend für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) in die BamHI-Erkennungsstelle des GFP▿176(+2)-Konstruktes hergestellt wurde, wurde bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC,#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333, Republic of Korea), einer internationalen Hinterlegungsstelle, mit der Nummer KCTC 10059BP am 30. August 2001 hinterlegt.

Beispiel 2

Herstellung fluoreszierender Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen durch Sequenz-gerichtete Rekombination unter Verwendung einer Ligase

Fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und unterschiedlichen Sequenzen wurden durch die Expression von rekombinanten DNAs hergestellt, die durch die direkte Ligation von Fragmenten genomischer E.coli- DNA in eine spezifische Stelle eines defekten Gens für ein fluoreszierendes Protein unter Verwendung einer Ligase konstruiert wurden: jedes der defekten Gene, die in Beispiel 1 konstruiert wurden, wurden in ein Plasmid kloniert, pTrc-99A, und das rekombinante Plasmid wurde mit dem BamHI-Restriktionsenzym linearisiert. Die genomische E.coli-DNA wurde mit Sau3AI gespalten, Fragmente der Größe 25-500 bp aus dem Agarosegel extrahiert und als DNA-Fragmente verwendet, die in das linearisierte Plasmid inseriert wurden. Die 25-500 bp-Fragmente wurden einer Ligation mit dem linearisierten Plasmid, enthaltend das defekte Gen, unterworfen. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden zur Transformation des E.coli-Stammes JM109 verwendet, um eine Bank von transformierten Mikroorganismen herzustellen. Die Mirkroorganismen, die durch die direkte Rekombination mit dem defekten Gen GFP▿172-3/176(+2) konstruiert wurden, wurden mit einer UV-Lampe beleuchtet und danach wurden daraus die Klone ausgewählt, die eine Fluoreszenz aufwiesen. Die Nukleotid-Sequenzen der Gene, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren, die in den ausgewählten Klonen enthalten waren, wurden bestimmt und ihre Aminosäure-Sequenzen wurden von den Nukleodidsequenzen hergeleitet. Fig. 3b stellt die Aminosäure-Sequenzen dar, die von den Fragmenten genomischer E.coli-DNA hergeleitet wurden, die in das defekte Gen GFP▿172-3/176(+2) inseriert wurden, bzw. die Größe der offenen Leseraster der betreffenden rekombinanten DNAs. Die hergeleiteten Aminosäure-Sequenzen werden als SEQ ID NOs 8 bis 17 dargestellt. Wie in Fig. 3b gezeigt wird, wurden fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen erzeugt, ähnlich wir in Fig. 3a. Die Intensität der Fluoreszenz wurde für die fluoreszierenden Proteine analog zu Beispiel 1 untersucht und gefunden, dass die fluoreszierenden Proteine 1-17% der Fluoreszenz der elterlichen Proteine aufweisen.
Einer der in der mit dem defekten Gen GFP▿172-3/176(+2) hergestellten Bank aus Mikroorganismen enthaltenen Klone Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpl5, der mit einem Plasmid enthaltend ein rekombinantes Gen transformiert ist, welches durch die Insertion eines Fragmentes genomischer E.coli-DNA kodierend für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 8) in die BamHI- Erkennungsstelle des GFP▿172-3/176(+2)-Konstruktes hergestellt wurde, wurde bei der Korean Colletion for Type Cultures (KCTC,#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333, Republic of Korea), einer internationalen Hinterlegungsstelle, mit der Nummer KCTC 10058BP am 30. August 2001 hinterlegt.

Beispiel 3

Herstellung von fluoreszierenden Proteinen aus Genen, die an unterschiedlichen Stellen defekt sind

Es wurden fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen durch die Expression von rekombinanten DNAs hergestellt, die durch Insertion von mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmenten genomischer E.coli DNA in zwei spezifische Stellen eines defekten Gens konstruiert wurden: Obwohl Gene, die nur in einer spezifischen Stelle defekt waren in Beispielen 1 und 2 verwendet wurden, war es möglich, fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen herzustellen unter Verwendung von Genen, die in zwei oder mehreren spezifischen Stellen defekt waren. Diesbezüglich wurden defekte Gene hergestellt durch Mutation des Proteins mit grüner Fluoreszenz an zwei oder mehreren Stellen, welche dafür bekannt sind, dass sie eine wichtige Rolle bei der Ausübung der Fluoreszenz oder bei der korrekten Faltung spielen. Insbesondere wurde ein neues defektes Gen GFP▿129-138/176(+2) durch zusätzliche Deletion der Nukleotide hergestellt, die für die Aminosäuren 129-138 in der Schleifenregion (loope region) des GFP in dem defekten GFP▿176(+2) kodieren, welches zuvor hergestellt wurde. In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde das defekte Gen GFP▿129-138/176(+2) mit DNase I verdaut und 50-150 bp Fragmente isoliert. Danach wurden die extrahierten defekten Gen-Fragmente und Fragmente genomischer E.coli-DNA gemischt und mit Hilfe der PCR-Technik rekombiniert und amplifiziert. Die amplifizierten rekombinanten Gene wurde in Plasmide kloniert und danach zur Transformation von E.coli verwendet. Die Klone mit grüner Fluoreszenz wurden aus der Bank transformierter E.coli-Klone selektiert.

Beispiel 4

Herstellung für Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen mit Dihydroorotase-Aktivität

Dihydroorotase gehört zu einer Familie von Hydrolasen zyklischer Amide zusammen mit Hydantoinase, Allantoinase und Dihydropyrimidinase und ist in vivo an Funktionen im Stoffwechsel der Purine und Pyrimidine beteiligt. Fluoreszierende Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen mit Dihydroorotase-Aktivität wurden durch Expression von rekombinanten Genen hergestellt, die durch Insertion von mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmenten genomischer E.coli-DNA in eine spezifische Stelle eines defekten Dihydroorotase-Gens konstruiert wurden: Ein Gen kodierend für die Dihydroorotase wurde aus einem abgewandelten E.coli-Stamm K12 mittels PCR kloniert. Die Sequenz-Homologie und die Struktur für verschiedene Enzyme, die zur Familie der Hydrolasen zyklischer Amide gehört, wurden analysiert. Danach wurde ein defektes Dihydroorotase-Gen, DHO▿68-70(+1) durch Deletion von 43 Nukleotiden im Bereich von Nukleotid-Positionen 213 bis 255 konstruiert. Die Proteine, die vom defekten Gen exprimiert wurden, zeigten keine Dihydroorotase-Aktivität. Das defekte Gen wurde randomisiert gespalten, mit Fragmenten genomischer E.coli-DNA gemischt und rekombiniert, und mittels PCR-Technik amplifiziert. Die amplifizierten Gene wurde in Plasmide kloniert und in den E.coli-Stamm X7014a transformiert, der in seiner Dihydrooorotase-Aktivität defekt ist, gefolgt von einer Selektion auf Klone auf Minimal-Medium in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1. Die selektierten Klone wurden hinsichtlich der Dihydroorotase-Aktivität überprüft und die Insertionsstellen der Fragmente genomischer DNA in das defekte Gen wurde durch Nukleotid- Sequenzierung bestimmt. Schließlich wurden die Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen mit Dihydroorotase-Aktivität hergestellt.
Wie oben klar beschrieben und demonstriert, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein bereit, sowie Mikroorganismen, die mit Plasmiden transformiert sind, enthaltend rekombinante DNAs, die durch Insertion eines genomischen DNA-Fragmentes in ein defektes Template hergestellt wurden: ein Verfahren zur Herstellung für Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, umfassend die Schritte der Kultivierung der transformierten Mikroorganismen und Erhalten der gewünschten Proteine aus der Kultur, sowie Proteine, die durch diesen Prozess hergestellt wurde. Gemäß der Erfindung kann eine Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein in effizienter und einfacher Weise hergestellt werden, durch Konstruktion einer Bank von Mikroorganismen, die mit rekombinanten Plasmiden, enthaltend Fragmente genomischer E.coli-DNA, die in defekte Gene inseriert wurden, hergestellt werden, und Selektion auf Klone, die Proteine mit wiederhergestellter Aktivität oder modifizierten Eigenschaften exprimeren. Die durch die Erfindung hergestellten Proteine können weiter hinsichtlich Stabilität, Aktivität, Substratspezifität usw. durch "protein engineering" verbessert werden, was die breite Anwendung der Erfindung in der Entwicklung biologischer Materialien wie Antigene und Antikörper für die klinische Verwendung und die Verbesserung industrieller Enzyme oder industriell genutzter Enzyme ermöglicht. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, umfassend die folgenden Schritte:

a) Einführen einer künstlichen Modifikation in ein Gen, das für ein Ausgangsprotein kodiert, um ein defektes Template zu ergeben;

b) Herstellung einer Bank von mit Plasmiden transformierten Mikroorganismen, wobei die Plasmide rekombinante DNA-Sequenzen enthalten, die durch Insertion eines randomisierten Oligonukleotids oder eines mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmentes genomischer DNA in das defekte Template hergestellt wurden;

c) Selektion auf Proteine mit wieder hergestellter Funktion oder mit geänderten Eigenschaften, von den Proteinen, die von der Gen-Bank von mit Plasmiden transformierten Mikroorganismen exprimiert werden.

2. Das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die künstliche Modifizierung einschließt: die Deletion von für mehrere Aminosäuren oder eine Domäne kodierende Nukleotiden, an einer spezifischen Stelle eines für das Ausgangsprotein kodierenden Gens, Leserasterverschiebung oder eine Kombination davon.

3. Das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion eines randomisierten Oligonukleotids oder eines mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmentes genomischer DNA in ein defektes Template durch PCR- gekoppelte Rekombination erfolgt.

4. Das Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion eines randomisierten Oligonukleotids oder eines mit Restriktionsenzymen behandelten Fragmentes genomischer DNA in ein defektes Template durch Sequenzgerichtete Rekombination unter Verwendung einer Ligase erfolgt.

5. Ein Mikroorganismus, der mit einem Plasmid transformiert ist, enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch die Insertion eines genomischen DNA- Fragmentes aus E.coli in die BamHI-Erkennungssequenz des GFP▿176(+2), einem defekten Gen des GFPuv, hergestellt wurde.

6. Der Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die von dem genomischen E.coli-DNA-Fragment hergeleitete Aminosäuresequenz eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 ist.

7. Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpS22 (KCTC 10059BP), transformiert mit einem Plasmid enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch Insertion eines genomischen DNA-Fragmentes aus E.coli, kodierend für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 4, in die BamHI Erkennungssequenz des GFP▿176(+2), einem defekten Gen des GFPuv, hergestellt wurde.

8. Ein Fluoreszenzprotein ausgewählt aus den Proteinen, die durch den Mikroorganismus gemäß Anspruch 5 exprimiert werden.

9. Ein Mikroorganismus, der mit einem Plasmid transformiert ist, enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch die Insertion eines genomischen DNA- Fragmentes aus E.coli in die BamHI-Erkennungssequenz des GFP▿172-3/176(+2), einem defekten Gen des GFPuv, hergestellt wurde.

10. Der Mikroorganismus nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die von dem in GFP▿172-3/176(+2) eingeführten genomischen DNA- Fragment aus E.coli hergeleitete Aminosäuresequenz eine Sequenz nach SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 ist.

11. Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpl5 (KCTC 10058BP), transformiert mit einem Plasmid enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch Insertion eines genomischen DNA-Fragmentes aus E.coli, kodierend für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 8, in die BamHI Erkennungssequenz des GFP▿172-3/176(+2), einem defekten Gen des GFPuv, hergestellt wurde.

12. Ein Fluoreszenzprotein ausgewählt aus den Proteinen, die durch den Mikroorganismus gemäß Anspruch 9 exprimiert werden.

13. Ein Mikroorganismus, der mit einem Plasmid transformiert ist, enthaltend ein rekombinantes Gen, das durch die Insertion eines genomischen DNA- Fragmentes aus E.coli in die BamHI-Erkennungssequenz des DHO▿68-70(+1), einem defekten Gen der Dihydroorotase, hergestellt wurde.

14. Ein Protein mit Dihydroorotase-Aktivität, das ausgewählt ist aus den Proteinen, die durch den Mikroorganismus gemäß Anspruch 13 exprimiert werden.

15. Ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, das die Schritte der Kultivierung von Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpS22 (KCTC 10059BP) gemäß Anspruch 7 und das Erhalten der gewünschten Proteine aus der Kultur umfasst.

16. Ein Verfahren zur Herstellung einer Gen-Bank mutierter Proteine mit unterschiedlichen Größen und Sequenzen aus einem Ausgangsprotein, das die Schritte der Kultivierung von Escherichia coli JM109/pMAL-c2/gfpl5 (KCTC 10058BP) gemäß Anspruch 11 und das Erhalten der gewünschten Proteine aus der Kultur umfasst.