JPH1014571A - 突然変異誘発方法、突然変異誘発遺伝子、トランスジェニック生物、及びその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物のゲノムＤＮＡの大きさを増加させ、対
象生物へのダメージを最小限に抑えたうえで変異に多様
性を持たせる突然変異誘発方法を提供すること。 【解決手段】 鋳型および／またはプライマーの不存在
下にて、セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼによりＤＮＡを合成せしめ、得られたＤＮＡを突然変
異誘発遺伝子として宿主細胞内の既存遺伝子に付加す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は突然変異誘発方法、
突然変異誘発遺伝子、トランスジェニック生物、及びそ
の生産方法に関し、詳しくは、蛋白質、とりわけある種
のＤＮＡポリメラーゼが、鋳型の遺伝情報を読み取る
「複製」ではなく、「創造的に」、つまり新たな遺伝情
報としてのＤＮＡを合成することができるという発見に
基づき、この新たに創られた遺伝情報を、生物個有の遺
伝情報（ゲノムＤＮＡ、例えば染色体ＤＮＡ）に付加す
ることにより生ずる形質の変異を従来の“突然変異”と
同等のものと考えることによりなされた変異種を作る方
法（突然変異誘発方法）に関する。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】一般に生
物の持つ遺伝子は主としてＤＮＡ（デオキシリボ核酸）
からなるが、これはその構成要素であるＡ（アデニ
ン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）
の四種の残基がリン酸残基とデオキシリボース残基を介
して連なった“情報”であり、これを遺伝子暗号と呼
ぶ。この遺伝子暗号は理想的には不変のまま当該生物種
の各世代に複製により伝わるべきもの、すなわち、「遺
伝」されるべきものであるが、時として自然に、あるい
は人為的に遺伝子暗号であるＤＮＡに変異が生ずること
がある。

【０００３】自然に生ずるものとしては、複製時の過
失、宇宙線や紫外線による障害等が、また、人為的に生
ずるものとしてはＸ線照射や発癌剤（例えばニトロソグ
アニジン等）処理によるもの等がある。そして、この変
異を突然変異と呼ぶ。

【０００４】これらの突然変異が生物のもつＤＮＡに生
ずると、当然それは多くの場合、当該生物の性質、つま
り形質に何らかの変化をもたらす。そして、この突然変
異により誘発された形質の多様性を利用して、人々は多
くの有用な生物亜種、例えば大量の乳を出す牛、可愛い
犬、高頻度に卵を生む鶏、耐寒性の稲等を生み出してき
た。

【０００５】短期間により多くの変異を生物のＤＮＡに
導入し、より多く多様性を持つ生物を次々に生み出せれ
ば、有用な生物亜種を短期間に作れるわけであるが、現
在の突然変異誘発の手技は既に限界のレベルに達してい
る。つまり、より長時間に亘ってＸ線や紫外線を照射し
たり、あるいは、より強力な発癌剤を投与するなど、こ
れ以上強く変異の誘発を行なおうとすると、ＤＮＡに生
ずる修復不能の化学変化により生物は死んでしまう。そ
こで、生物にとってより副作用の少ない方法で、多様性
を持つ変異を短期間に生じさせる突然変異誘発方法が望
まれていた。

【０００６】本発明者は、一般に生物の細胞内において
ＤＮＡが複製する時に、その反応の触媒として働く酵
素、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型（つまり今から複製しよ
うとする元のＤＮＡ）に全く依存せず、新規（創造的）
にＤＮＡを合成する、すなわち遺伝情報を「創造する」
ことに着目し、細胞内の既存のＤＮＡに新たな遺伝情報
を付加することにより「突然変異」がなされると考え
た。実際、自然に生ずる突然変異の中には、細胞分裂時
の過誤としてＤＮＡの一部が重複して余分なＤＮＡが付
加されることにより誘起するという変異態様がある。

【０００７】［発明の目的］本発明は、上記の実情に鑑
みてなされたものであり、その目的は、ＤＮＡポリメラ
ーゼなどの蛋白質により創造されるＤＮＡを突然変異誘
発遺伝子として細胞内の既存遺伝子に付加することによ
り、あるいは宿主細胞内において当該突然変異誘発遺伝
子を合成することにより、当該生物のゲノムＤＮＡの大
きさを増加させ、対象生物へのダメージを最小限に抑え
つつ、変異に多様性を持たせるところにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の突然変異
誘発方法は、鋳型および／またはプライマーが存在しな
い反応系において蛋白質の存在下でデオキシリボヌクレ
オチドを重合することによって得られたＤＮＡ（ライブ
ラリー）を、突然変異誘発遺伝子として細胞（生物より
取り出した細胞。生物に直接導入する場合は非ヒト。）
に導入することを特徴とする方法である。

【０００９】請求項２記載の突然変異誘発方法は、蛋白
質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子を生物Ａ
の細胞（生物Ａより取り出した細胞。生物から直接取り
出す場合は非ヒト。）より精製するとともに、前記遺伝
子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のちこ
の融合遺伝子を他の生物Ｂの細胞（生物Ｂより取り出し
た細胞。生物Ｂに直接導入する場合は非ヒト。）に導入
することを特徴とする方法である。

【００１０】請求項３記載の突然変異誘発方法は、蛋白
質をコードする遺伝子である蛋白質構造遺伝子を生物Ａ
の細胞（生物Ａより取り出した細胞。生物から直接取り
出す場合は非ヒト。）より精製するとともに、前記遺伝
子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のちこ
の融合遺伝子を他の生物Ｂの細胞（生物より取り出した
細胞。生物に直接導入する場合は非ヒト。）に導入し
て、この細胞を偽妊娠状態の仮親（非ヒト）の卵管内あ
るいは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤
胞にまで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植し、
移植後に得られたＦ１トランスジェニック生物（非ヒ
ト）に対し、あるいは少なくとも片方をＦ１トランスジ
ェニック生物とする掛け合わせによって得たＦ２トラン
スジェニック生物（非ヒト）に対し、ステロイドホルモ
ンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記プロモー
ター領域を活性化し、これによって当該生物の細胞内に
て前記蛋白質を発現せしめ、これとともに前記蛋白質の
存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重合させて突然
変異誘発遺伝子となるＤＮＡ（ライブラリー）を細胞内
にて合成することを特徴とする方法である。

【００１１】請求項４記載の突然変異誘発方法は、請求
項１〜３のいずれか１項記載の方法において、前記蛋白
質が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする
方法である。

【００１２】請求項５記載の突然変異誘発方法は、請求
項４記載の方法において、前記耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼが、セルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤ
ＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１
種であることを特徴とする方法である。

【００１３】請求項６記載の突然変異誘発方法は、請求
項１〜５のいずれか１項記載の方法において、デオキシ
リボヌクレオチドの重合を約２０〜９０℃の温度下で行
なうの方法である。

【００１４】請求項７記載の突然変異誘発方法は、請求
項１〜６のいずれか１項記載の方法において、デオキシ
リボヌクレオチドの重合を中性〜弱アルカリ性（ｐＨ約
７〜１０）の条件下で行なう方法である。

【００１５】請求項８記載の突然変異誘発遺伝子は、鋳
型および／またはプライマーが存在しない反応系におい
て、蛋白質の存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重
合することによって得られたＤＮＡよりなるもの（ライ
ブラリー）である。

【００１６】請求項９記載の突然変異誘発遺伝子は、請
求項８記載の遺伝子において、前記蛋白質が耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼであることを特徴とする遺伝子である。

【００１７】請求項１０記載の突然変異誘発遺伝子は、
請求項９記載の遺伝子において、前記耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼが、セルモコッカス属、セルマス属に属する細
菌のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれた少なく
とも１種であることを特徴とする遺伝子である。

【００１８】請求項１１記載のトランスジェニック生物
は、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子を導
入した細胞（生物より取り出した細胞。生物に直接導入
する場合は非ヒト。）を偽妊娠状態の仮親（非ヒト）の
卵管内あるいは子宮内に移植するか、または桑実胚ある
いは胚盤胞まで体外で培養し発育させたのち子宮内に移
植することにより生産されたものである。

【００１９】請求項１２記載のトランスジェニック生物
の生産方法は、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の
遺伝子を導入した細胞（生物より取り出した細胞、生物
に直接導入する場合は非ヒト。）を偽妊娠状態の仮親
（非ヒト）の卵管内あるいは子宮内に移植するか、また
は桑実胚あるいは胚盤胞まで体外で培養し発育させたの
ち子宮内に移植することを特徴とする方法である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明で使用される蛋白質として
は、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、中でも耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼが好適に使用し得る。

【００２１】前記ＤＮＡポリメラーゼは約２０℃以上、
好ましくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃以
上の温度でも失活しないものが好ましい。その例として
は、上掲したセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等のセルモコッ
カス属以外に、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する
細菌のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

【００２２】上記ＤＮＡポリメラーゼは１種を単独で使
用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用
した混合系として用いることもできる。ＤＮＡポリメラ
ーゼを２種以上併用してデオキシリボヌクレオチドを重
合する場合は、１種単独で重合する場合と比べ、一度に
合成されるＤＮＡがさらに多様化し（すなわち、塩基配
列がより様々なＤＮＡ（群・ライブラリー）が得ら
れ）、突然変異を誘発する頻度が高くなる。この場合、
同属の異なる細菌のＤＮＡポリメラーゼの併用でもよい
し、異なる属の細菌のＤＮＡポリメラーゼでもよい。

【００２３】デオキシリボヌクレオチドとしてはｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが用いられ、それら
の４種類または３種類を反応系に存在させれば反応は進
行する。上記デオキシリボヌクレオチドとＤＮＡポリメ
ラーゼとの反応はｐＨ約７またはｐＨ１０以下の弱アル
カリ性で行なうのが好ましい。反応温度と時間はＤＮＡ
ポリメラーゼが失活しない範囲で選ぶことができ、約２
０℃以上でポリメラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で
反応させることにより、反応を速やかに進行させること
ができる。たとえば、７４℃で数時間反応させてもよ
く、また通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９
５℃で１分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）
７４℃で３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応
は初期に若干の遅延時間を経たのち開始され、やがて最
大速度に達する。本発明の方法により合成されるＤＮＡ
は鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡやＲＮＡに依存せ
ずに、反応系に存在するＤＮＡポリメラーゼ（蛋白質）
そのものが持つ情報に依存して合成されると考えられ
る。

【００２４】なお、ＤＮＡポリメラーゼを用いた（デオ
キシ）リボヌクレオチドの重合において、反応温度が２
０℃未満の場合あるいは９０℃を超える場合には、反応
率が低下するので好ましくない。また、ｐＨ約７または
１０以下の弱アルカリ性条件から外れる条件、すなわち
酸性下条件及び強アルカリ性条件下でも反応率が低下す
るのでやはり好ましくない。

【００２５】本発明の突然変異誘発方法を実施するため
の具体的な技術は、ＤＮＡポリメラーゼにより新規に合
成されたＤＮＡを細胞内へ、理想的には染色体上へ導入
することよりなる。そして、その方法としては次の２つ
が挙げられる。 試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＤＮＡをＤＮＡポリ
メラーゼにより合成し、得られたＤＮＡを細胞内へ導入
する方法。 ＤＮＡポリメラーゼを作る遺伝子、すなわちＤＮＡポ
リメラーゼの構造遺伝子を細胞の中へ、理想的には染色
体上へ導入し、その細胞の中に産生されたＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下にて同細胞内にて新規にＤＮＡを作らせ
る方法。

【００２６】まず、前者の方法（上記）としては、例
えば次のような方法が挙げられる。すなわち、セルモコ
ッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ存在下に４つの
デオキシヌクレオチド５′−三燐酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）を材料として新規のＤＮＡ合
成を行い、得られたＤＮＡを常法によりフェノール処理
と塩化セシウム平衡密度勾配遠心法［分子遺伝学実験
法，小関治男ら著，共立出版（株），１９８３年発行］
により精製する。次に、得られたＤＮＡの全てあるいは
一部を、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレ
クトロポレーション法等のＤＮＡ細胞内導入法を用いて
細胞内へ導入する。対象となる細胞はその当該生物にお
いて、将来、胚芽となる細胞であれば何でもよい。その
具体例としては１〜８分割段階における受精卵、奇形腫
由来培養細胞、ＥＳ細胞等である。ＤＮＡを導入された
細胞は常法［マニプレーティング・ザ・マウス・エンブ
リオ（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ
ｅｍｂｒｙｏ），コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス，１９８６年発行］により仮親の
子宮内へ移植し、所定の妊娠期間を経た後に産仔を得
る。なお、植物等においては、成長点から無菌的に得た
細胞の中へＤＮＡを導入し、常法に従い成長点培養を行
う。

【００２７】次に、後者の方法（上記）に関し述べ
る。まず、ＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡを生物より遺伝子クローニングの常法技術［分子
遺伝学実験法，小関治男ら著，共立出版（株），１９８
３年発行］により得る。このとき、その生物は、導入し
ようとする生物とは異なる生物のものが好ましい。なぜ
ならば、同じ生物のものであれば、ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の発現等に関する調節がＤＮＡを導入された細
胞、つまり宿主により完全に制御される可能性がかなり
あるからであり、これは人為的に変異を誘発するという
観点から見れば必ずしも好ましくない。例えば、セルモ
コッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼのゲノムＤＮ
Ａを例にとって説明する。

【００２８】このＤＮＡの構造をその転写の方向より上
流から、プロモーター領域、構造遺伝子、転写終了領域
と呼ぶことにする。そして、マウスの細胞にＤＮＡを導
入することを例として考える。まず、プロモーター領域
は、転写開始点（一般に、キャップサイトと呼ぶ）ぎり
ぎりの上流部位までを取り除き、常時発現プロモーター
または誘導可プロモーター、例えば、マウス乳腺腫瘍ウ
イルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎ
ａｌ ｒｅｐｅａｔ）と置換し、その内部に存在するス
テロイドホルモン（例えば、デキサメタゾン）依存性プ
ロモーターにより、導入された遺伝子、つまりセルモコ
ッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼの発現を調節する
ことができる。次に、この遺伝子の下流に関しては、そ
の翻訳停止コドンの下流直後を宿主または宿主関連生物
から得られた転写停止信号を含むＤＮＡ断片を挿入する
とよい。例えば、サルのウイルスであるシミアンウイル
ス４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０，ＳＶ４０）
の早期遺伝子（ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）の翻訳停止コド
ン下流直後から２００〜５００塩基対のＤＮＡを用いれ
ば十分である。なお、ある種の細胞においては、ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子本体にあるイントロン１は取り除い
ておいた方がよく発現することがある。

【００２９】以上の構造を持つ一つながりのＤＮＡを燐
酸カルシウム法やエレクトロポレーション法等の方法に
て細胞に導入する。このとき、この遺伝子が導入された
細胞のみを拾い出すために、同時にネオマイシン耐性遺
伝子を発現ベクターに挿入したものを混ぜておく。その
後、Ｇ４１８を入れた細胞培養培地にてしばらく培養す
れば、当該遺伝子が導入された細胞のみを選択的に得る
ことができる。このような細胞（例えば、マウスのＥＳ
細胞）を偽妊娠状態の仮親の卵管内あるいは子宮内に移
植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培
養し発育させたのち子宮内に移植し、所定の妊娠期間を
経て産み出されたマウス個体においては、当該遺伝子を
持つ細胞はその個体の体細胞と生殖細胞においてキメラ
の形で分布しているわけであるから、適切な交配によ
り、個体の全細胞において当該遺伝子をヘテロ接合体の
形で持つ動物が得られるから、ヘテロ接合体同士をかけ
合わせてホモ接合体の形を持つ動物が得られる。無論、
前述のキメラのままで次の段階へ行ってもよい。

【００３０】次に、導入された遺伝子の誘導を行う。例
えば、ＭＭＴＶのＬＴＲを持つ場合、当該遺伝子を持つ
生物個体にステロイドホルモン（例えばデキサメタゾ
ン）を経口、筋肉注射等の方法にて投与する。これによ
り、この遺伝子はＬＴＲ内のＤＮＡ要素によりその発現
のスイッチが入り、ＬＴＲよりｍＲＮＡの転写が開始さ
れ、最終的に、導入されたＤＮＡポリメラーゼ蛋白質が
細胞内に蓄積する。この蛋白質が宿主のＤＮＡポリメラ
ーゼとある程度異なっていれば、それは宿主の調節をさ
ほど受けることなく鋳型・プライマー非依存性ＤＮＡ合
成を開始する。

【００３１】得られたＤＮＡ産物の塩基配列は多種多様
であるから、その中にはある確率で染色体ＤＮＡに高頻
度組み換え挿入するために必要な配列を持つものが生ず
る。そして、このようなＤＮＡ産物は染色体ＤＮＡへ高
頻度に挿入される。また、特別な配列を持たなくても、
低頻度ではあるが、染色体ＤＮＡに挿入されることもあ
る。また、そのように挿入されたＤＮＡの中には、ある
確率にて翻訳開始コドンと翻訳停止コドン、さらには転
写開始信号と転写停止信号を持つものがあるから、それ
らの存在により全く新しい蛋白質が細胞内に生ずる。ま
た、仮に挿入されたＤＮＡに適切な翻訳や転写に関する
塩基配列がなくとも、もし挿入された染色体上の部位が
何らかの宿主蛋白を作る遺伝子領域であれば、その宿主
遺伝子の持つ情報あるいはその転写の程度を変えること
となり、よって、従来とは少し構造の異なる蛋白質がで
きたり、あるいは仮に全く同じ蛋白質であっても、その
発現される量や時期が異なることとなる。つまり、その
生物個体の「形質」は変異したこととなる。すなわち、
突然変異が誘発されたこととなる。

【００３２】本発明の突然変異誘発方法が、生物にとっ
て副作用の少ない方法であることは下記により説明づけ
られる。すなわち、一般に、前述［従来の技術の項参
照］のＸ線照射や発癌剤を用いて人為的に突然変異を行
なう場合、生物の持つ遺伝子は特定のＤＮＡ塩基が破壊
されることにより「変異」が導入されるわけであるが、
このことは少なからず既存の遺伝子が消滅してしまうこ
とを意味する。つまり、このような突然変異誘発法は
「破壊的突然変異誘発法」ということができる。これに
対して、本発明における突然変異誘発法は、既存の遺伝
子の中へまったく新しい遺伝子を挿入することにより突
然変異を誘発するわけであり、「建設的突然変異誘発
法」と呼ぶことができるが、この方法においては多くの
場合、既存の遺伝子の機能は温存させたまま、挿入によ
り追加的に新たな遺伝子の機能を見ることができる。ま
た、明らかに、生物に対する副作用は少ない。

【００３３】本発明で用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これ
らによっても得ることができる）。特開平２−６０５８
５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４
３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７
−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公
報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１
０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平
６−７１６０号公報

【００３４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が、本発明は決して以下の実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３５】実施例１ ［セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼによ
り鋳型非依存的に合成されたＤＮＡを胚細胞内へ導入す
る方法］緩衝液Ａ［１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ （Ｎ
Ｈ_４）_２ＳＯ_４，２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８），６ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１％ トリトン Ｘ−
１００（全て最終濃度）］、デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（全て
最終濃度２００μＭ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッ
カス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｖｅｎ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ニューイングランド・バイオ
ラブス社製）を含有する１ｍｌの反応液に等量のミネラ
ルオイル（シグマ社製）を加え、７４℃で３時間反応さ
せた。その後、反応液を常法［サムロック・Ｔ等、モレ
キュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュア
ル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１９８９年発
行］に従い、フェノール処理、クロロホルム洗浄、エタ
ノール沈澱、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により精
製し、２０μｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解した。こ
の溶液のＤＮＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌとなった。また、こ
のＤＮＡは１００〜５０，０００塩基対の２本鎖直線状
であった。

【００３６】次に、このＤＮＡを、最終濃度２０μｇ／
ｍｌにて、リン酸バッファー・塩溶液（ＰＢＳ）中にお
いて対数増殖期のマウスＥＳ細胞（１０^７個，１ｍｌ）
にジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたエレ
クトロポレーション法（５００μＦ，２００Ｖの条件）
にて導入した。また、前述のＤＮＡに対し同じ質量比の
直線状の真核細胞用プロモーターとターミネーターを持
つネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ ｇｅｎｅ）を持つ
プラスミドを混ぜておき、選択マーカーとした。

【００３７】次に、このＥＳ細胞をマイトマイシン処理
後のネオマイシン耐性遺伝子を持つトランスジェニック
マウスから得られた胎児繊維芽細胞をフィーダー細胞と
してダルベッコ培地（２０％牛胎児血清，１ｍＭ ピル
ビン酸，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール，非必須ア
ミノ酸類，１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ白血病増殖阻止因
子を含む）にて２４時間培養した後、さらにＧ４１８
（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ社製）を１５０μｇ
／ｍｌにて毎日培地交換で７日間培養を継続し、出現し
たネオマイシン耐性コロニーを得た。このコロニーより
細胞クローニング、さらにＰＣＲ法により目的のＤＮＡ
が入っているものを確認した後、次に集合キメラ法（サ
ンドイッチ法，Ａ．Ｎａｇｇら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ＥＳ ｃｅｌｌ−ｄｅ
ｒｉｖｅｄ ｆｅｔｕｓｅｓ ｉｎＧｅｎｅ Ｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ． Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ著，ｐｐ１４７−
１７９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年発行）にてＥ
Ｓ細胞を持つ３．５日胚を作り、それを交尾後２．５日
の偽妊娠マウスの子宮へ移植した。このマウスより生ま
れたマウスをかけ合わせて、目的ＤＮＡをホモ接合体と
して持つ変異トランスジェニックマウスを得た。

【００３８】その結果、これらのマウス１５３匹を調べ
た結果、本来黒い体毛を持つはずのマウスにおいて、白
毛２匹、茶毛４匹、縮れ毛２匹が得られた。因みに、こ
の実験に用いたマウスの標準形質は黒色短毛である。ま
た、１５３匹中、５匹においては、標準体重（２６ｇ±
３ｇ）を大きく上まわる４９±６ｇの体重を持つ肥満マ
ウスであり、これも変異した形質のあらわれと考えられ
る。さらに、１５３匹中、４匹においては尾の長さが
３．２±０．３ｃｍと標準の５．２±０．６ｃｍより短
く、これも変異した形質である。

【００３９】実施例２ ［セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼの構
造遺伝子を持つトランスジェニック生物の作製］実施例
１と同様にして、セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポ
リメラーゼの構造遺伝子を持つトランスジェニックマウ
スを作った。但し、この遺伝子はイントロンを持ったま
まの形とし、図１に示すように、その上流には常時発現
プロモーターとして、鶏のβ−アクチンプロモーター、
さらにその上流にはｌｏｘＰ配列を挿入しておく。一
方、下流には転写終了領域と、もう１個、前述と同じ向
きにｌｏｘＰ配列を挿入しておく。ｌｏｘＰ配列を入れ
ておくのは後日、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が不要とな
ったときこれを取り除くためである。

【００４０】得られたマウスにおいては、高頻度に変異
（体毛の変異等）が出現するが、これは染色体ＤＮＡ上
に挿入されたセルモコッカス・リトラリスのＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子が発現し、そのｍＲＮＡ、そして、さら
にＤＮＡポリメラーゼ蛋白質が作られ、これが常時ＤＮ
Ａを細胞内において新規に合成し、その一部が染色体に
挿入されるためである。希望の変異マウスが得られた
後、元の正常変異頻度マウスに戻す場合には、当該マウ
スの受精卵の中へｃｒｅ遺伝子を発現ベクターの形とし
て持つ円形プラスミドをマイクロインジェクション法
［分子遺伝学実験法，小関治男ら著，共立出版（株），
１９８３年発行］にて導入した。

【００４１】その結果、受精卵の中において、プラスミ
ド上のｃｒｅ遺伝子が発現し、それが暗号するところの
蛋白（酵素）であるＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を生じた。この酵素は、セルモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流
と下流に前もって挿入していた（前述）同方向を向いた
ｌｏｘＰ配列を認識し、その部位において、それらに挟
まれた遺伝子、すなわち、鶏のβ−アクチン遺伝子プロ
モータとセルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の両者をまとめて切断し排除した。

【００４２】よって、その受精卵をマウスの子宮へ戻し
た後生まれたマウスにおいては既に誘導された変異の形
質は保ったまま、他の点においては正常のマウスと同じ
状態へ戻せたこととなる。

【００４３】この実施例においては、例えば、体毛色変
異誘発に着目して見れば、元の黒色体毛マウスにおい
て、３２４匹のトランスジェニックマウスにおいて２匹
の白色体毛マウスを得た。

【００４４】実施例３ ［ステロイドホルモンにより遺伝子発現の調節を行なう
方法］マウス乳腺腫ウイルスＬＴＲにはステロイドホル
モン依存性プロモーターがあるため、これをプロモータ
ーとして用いればステロイドホルモンにより遺伝子発現
の調節を行なうことができる。以下、その実施例を示
す。

【００４５】まず、図２に示すようなプラスミドｐＮ７
４６を作製した（この作製は、当業者であれば容易であ
る。特開平６−７１６０号公報等参照。また、下記のも
のを使用することもできる。ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＭ７４１９６、ＡＴＣＣ寄託
番号６８４８７、ＡＴＣＣ寄託番号６８４４７）。これ
は、セルモコッカス・リトラリスのＤＮＡポリメラーゼ
構造遺伝子に対し、マウス乳腺種ウイルスＬＴＲをプロ
モーター、ＳＶ４０早期遺伝子のポリＡ部位を転写終了
部位として、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し
たものであり、セルモコッカス・リトラリスのＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子の発現はステロイドホルモンにより誘
導される。このプラスミドをｐＢＲ３２２の部位におい
て制限酵素により一箇所切断することにより直線状とな
し、以後前述した実施例２と同様に行ない、これが染色
体ＤＮＡにホモ接合体の形で挿入されたトランスジェニ
ックマウスを得た。このマウスにおいては、ステロイド
ホルモンを投与しない状態においては、セルモコッカス
・リトラリスのＤＮＡポリメラーゼ蛋白は細胞内に生じ
ない。そこで、この蛋白を発現させるために、この１６
週齢マウスに対し１４日間デキサメタゾン（ステロイド
ホルモンの１種）を毎日５μｇ筋肉注射する。次にこの
マウスを普通の１６週齢メスのマウスと交配させること
により、産仔を得る。このようにして得られた産仔を多
数得てその形質を見た結果、実施例１の如く多くの変異
種を得た。具体的には、調べた３２９匹中、茶毛３匹、
黒毛１匹、縮れ毛３匹であった。因みに、この実験にお
いて使用したマウスの標準の形質は白色の直毛である。
この実施例においては、デキサメタゾン投与により、マ
ウスの生殖細胞内においてセルモコッカス・リトラリス
のＤＮＡポリメラーゼ蛋白が誘導され、その細胞内にお
いて新たに合成されたＤＮＡが染色体に挿入され、よっ
て染色体ＤＮＡに多様性が生じた精子が生まれたため、
交配の後、多くの変異種が生じたのである。

【００４６】

【発明の効果】本発明の突然変異誘発方法により、その
変異に多様性を持たせることができた。すなわち、ＤＮ
Ａポリメラーゼの存在下で得られたＤＮＡ産物の塩基配
列は多種多様であるから、その中にはある確率で染色体
ＤＮＡに高頻度組み換え挿入するために必要な配列を持
つものが生ずる。そして、このようなＤＮＡ産物は染色
体ＤＮＡへ高頻度に挿入される。また、特別な配列を持
たなくても、低頻度ではあるが、染色体ＤＮＡに挿入さ
れることもある。また、そのように挿入されたＤＮＡの
中には、ある確率にて翻訳開始コドンと翻訳停止コド
ン、さらには転写開始信号と転写停止信号を持つものが
あるから、それらの存在により、全く新しい蛋白質が細
胞内に生ずる。また、仮に挿入されたＤＮＡに適切な翻
訳や転写に関する塩基配列がなくとも、もし挿入された
染色体上の部位が何らかの宿主蛋白を作る遺伝子領域で
あれば、その宿主遺伝子の情報あるいは転写の程度を変
えることとなり、よって、従来とは少し構造の異なる蛋
白質ができたり、あるいは仮に全く同じ蛋白質であって
も、その発現される量や時期が異なることとなる。つま
り、その生物個体の「形質」は変異したこととなる。す
なわち、突然変異が誘発されたこととなる。

【００４７】本発明によれば、従来のように強い変異誘
発を行なわなくても、変異に多様性を持った突然変異誘
発を行なうことができ、これにより生物に対するダメー
ジも少なくてすむ。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で使用した導入遺伝子の構造を示す図
である。

【図２】実施例３で使用したプラスミドの構造を示す図
である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】鋳型および／またはプライマーが存在しな
   い反応系において蛋白質の存在下でデオキシリボヌクレ
   オチドを重合することによって得られたＤＮＡを、突然
   変異誘発遺伝子として細胞に導入することを特徴とする
   突然変異誘発方法。
2. 【請求項２】蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構
   造遺伝子を生物Ａの細胞より精製するとともに、前記遺
   伝子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のち
   この融合遺伝子を他の生物Ｂの細胞に導入することを特
   徴とする突然変異誘発方法。
3. 【請求項３】蛋白質をコードする遺伝子である蛋白質構
   造遺伝子を生物Ａの細胞より精製するとともに、前記遺
   伝子に対してプロモーター領域の遺伝子を配置し、のち
   この融合遺伝子を他の生物Ｂの細胞に導入して、この細
   胞を偽妊娠状態の仮親の卵管内あるいは子宮内に移植す
   るか、または桑実胚あるいは胚盤胞にまで体外で培養し
   発育させたのち子宮内に移植し、移植後に得られたＦ１
   トランスジェニック生物に対し、あるいは少なくとも片
   方をＦ１トランスジェニック生物とする掛け合わせによ
   って得たＦ２トランスジェニック生物に対し、ステロイ
   ドホルモンなどのプロモーター誘導物質を投与して前記
   プロモーター領域を活性化し、これによって当該生物の
   細胞内にて前記蛋白質を発現せしめ、これとともに前記
   蛋白質の存在下にてデオキシリボヌクレオチドを重合さ
   せて突然変異誘発遺伝子となるＤＮＡを細胞内にて合成
   することを特徴とする突然変異誘発方法。
4. 【請求項４】前記蛋白質が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで
   あることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載
   の突然変異誘発方法。
5. 【請求項５】前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、セルモ
   コッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメラ
   ーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種であること
   を特徴とする請求項４記載の突然変異誘発方法。
6. 【請求項６】デオキシリボヌクレオチドの重合を、約２
   ０〜９０℃の温度下で行なう請求項１〜５のいずれか１
   項記載の突然変異誘発方法。
7. 【請求項７】デオキシリボヌクレオチドの重合を、中性
   〜弱アルカリ性の条件下で行なう請求項１〜６のいずれ
   か１項記載の突然変異誘発方法。
8. 【請求項８】鋳型および／またはプライマーが存在しな
   い反応系において、蛋白質の存在下にてデオキシリボヌ
   クレオチドを重合することによって得られたＤＮＡより
   なる突然変異誘発遺伝子。
9. 【請求項９】前記蛋白質が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで
   あることを特徴とする請求項８記載の突然変異誘発遺伝
   子。
10. 【請求項１０】前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、セル
    モコッカス属、セルマス属に属する細菌のＤＮＡポリメ
    ラーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種であるこ
    とを特徴とする請求項９記載の突然変異誘発遺伝子。
11. 【請求項１１】請求項８〜１０のいずれか１項に記載の
    遺伝子を導入した細胞を偽妊娠状態の仮親の卵管内ある
    いは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞
    まで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植すること
    により生産されたトランスジェニック生物。
12. 【請求項１２】請求項８〜１０のいずれか１項に記載の
    遺伝子を導入した細胞を偽妊娠状態の仮親の卵管内ある
    いは子宮内に移植するか、または桑実胚あるいは胚盤胞
    まで体外で培養し発育させたのち子宮内に移植すること
    を特徴とするトランスジェニック生物の生産方法。